JPH0630637B2

JPH0630637B2 - 分離による核酸検出法

Info

Publication number: JPH0630637B2
Application number: JP63320733A
Authority: JP
Inventors: エヌ．クロニックメル; エイチ．キースダグラス; ジェイ．マックブライドリンカーン; エム．ホワイトリーノーマン; ダブリュ．ハンカピラーマイケル
Original assignee: APURAIDO BAIOSHISUTEMUZU Inc
Current assignee: APURAIDO BAIOSHISUTEMUZU Inc
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPH01289499A; US6054266A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、高感度用プローブを用いる核酸配列の検出に
関する。

〔従来の技術及び解決すべき課題〕

今日、生物学は、多くの点でタンパク質と核酸の化学と
言える。核酸は全ての生体に見出される。種又は宿主ご
とに、その特定の宿主の遺伝子型及び表現型を提供する
独特の配列が存在する。従って、特定の配列の存在を特
定の菌株又は種の目安として利用することができる。多
くの場合、数多くの菌株が他の菌株又は種と異なる共通
の配列を共有しているので、特定の菌株を検出できるだ
けでなく、必要に応じて、亜種、種又は属を検出するこ
とが可能である。更に、ＲＮＡ又はＤＮＡを識別して、
特定の遺伝子が発現するかどうか、一種以上の対立遺伝
子の存在、発現レベル等を決定することができる。Ｂ細
胞及びＴ細胞等の細胞がゲノムの組換えに関与する場
合、プローブを用いてこのような組換えの有無を検出す
ることができる。このようなことから、特定の核酸配列
を検出することは、病気の状態の診断、細胞のセット又
はサブセットの存在、バクテリア、原生生物又はビール
ス等の病原体の特定の菌株又は種等の存在等の決定の強
力な手段となる。

配列の検出分離は、分子生物学の分野においても重要で
ある。従って、構造遺伝子、調節遺伝子、イントロン、
エクソン、翻訳及び未翻訳双方のリーダー配列をはじめ
とする意図する種々の配列等の検出に、プローブを使用
することが考えられる。

又、遺伝子工学における配列の検出もかなり注目されて
いる。転写レベルの監視、造成物の完全性の検出、突然
変異、切除等のレベルの監視等により核酸のスクリーニ
ング及び検出が可能となる。

多くの場合、意図する配列は、核酸の総量のうちの非常
に小さな部分としてそして／又は微量、例えば、アトモ
ルレベルで存在する。更に、意図する配列は、それに対
して実質的に相同性を有する多数の配列が付随している
場合がある。従って、必要としないヘテロ二本鎖が確実
に存在しないようにするために比較的高いストリンジェ
ンシーが要求されることがあり、これにより、意図する
配列の有効濃度がさらに制限される場合がある。

更に、同様又は類似の配列が異なるサイズの核酸断片に
あらわれることがあり、又、特定のサイズの断片の配列
の出現は特定の表現型の存在と相互関係がある場合があ
る。このような解析には、通常の操作であるサザンブロ
ットがよく行われるが、これにはある種の固有の問題が
ある。即ち、ブロッティング工程中、脆いゲル及び膜の
取扱をはじめとして多くの手動操作が必要である。又、
サザンブロットにおいてハイブリダイゼーションがフィ
ルター上で起こり、これが、反応速度を低下させたり、
大きなバックグランドの原因となったり、又、このため
大容量のプローブ溶液（放射性が高いことが多い）や大
容量の洗浄液を必要とすることがある。

又、技術者に要求される時間及びエネルギーを最少限と
するとともに手動操作で生じる場合がある誤差を最小に
するように自動化できる分析システムの開発にも関心が
集まっている。他にも、サイズ決定、特に標準に関連す
るバンドの検出を容易するような試料を提供できること
等が望まれている。

これらに関連する技術を開示している文献としては下記
のものが挙げられる。

ヨーロッパ特許出願公開第0 237 833号には、ハイブリ
ダイゼーションアッセイが記載されている。サザン，J.
Mol.Biol.、1975年、第９８巻、第503〜527頁には、フ
ィルターに移した制限断片のハイブリダイゼーション解
析の最初の方法が記載されている。マニング等、バイオ
ケミストリー、1977年、第１６巻、第1364〜1370頁に
は、アビジン−ビオチン相互作用による遺伝子の純化法
が記載されている。トンプソン、バイオクロマトグラフ
ィー、1987年、第２巻、第68〜79頁には、核酸断片の分
離に高速液体クロマトグラフィーを使用することが記載
されている。ジョーンズ等、ジーン、1985年、第３９
巻、第77〜83頁には、RNA-DNAハイブリッドを電気泳動
後検出することが記載されている。パーソンズ及びフィ
ン、バイオテクニクス、1986年、第４巻、第404〜406頁
には、少量のポリペプチドを解析するための免疫吸着操
作が記載されている。ケンペ(Kempe)等、Nucl.Acids Re
s.、1985年、第１３巻、第45〜57頁には、リガーゼによ
りＤＮＡ断片に結合せしめたビオチニル化オリゴヌクレ
オチドが記載されている。ガンパー(Gamper)等、Nucl.A
cids Res.、1985年、第１４巻、第9943〜9954頁には、
ソラレン官能化オリゴマーを、ハイブリダイゼーション
及び光化学架橋が生じるときに標的ＤＮＡを標識するプ
ローブとして用いることが記載されている。ザポルスキ
(Zapolski)等、エレクトロフォレシス、1987年、第８
巻、第255〜261頁には、サザン型核酸ハイブリダイゼー
ション解析を自動化するための自動機械システムに関す
る記載がある。ゴールドコーン(Goldkorn)及びプロッコ
ップ(Prockop)、Nucl.Acids Res.、1986年、第１４巻、
第9171〜9191頁には、ハイブリダイゼーション・制限解
析用セルロース性支持体にＤＮＡプローブを共有結合的
に連結する技術が記載されている。シバネン(Syvanen)
等、Nucl.Acids Res.、1986年、第１４巻、第5037〜504
8頁には、親和性に基づいてハイブリッドを採取して核
酸ハイブリッドを定量化することが記載されている。フ
ォースター(Forster)等、Nucl.Acids Res.、1985年、第
１３巻、第745〜761頁には、光化学的に、ビオチンで核
酸を共有結合で標識することが記載されている。ブラケ
スレイ(Blakesley)及びトンプソン(Thompson)、PCT/US8
4/00508(W085/04674)には、核酸を固定化する新規な技
術についての記載がある。ガンパー(Gamper)等、Nucl.A
cids Res.、1986年、第１４巻、第9943〜9954頁には、
リバースサザンハイブリダイゼーションについての記載
がある。ホニクベルグ(Honigberg)等、Proc.Natl.Acad.
Sci.、米国、1986年、第８３巻、第9586〜9560頁には、
recAタンパク質を用いて少量の二本鎖ＤＮＡの配列を探
索することが記載されている。

〔課題を解決するための手段〕

固体支持体連結要素を有するプローブを用いて核酸を検
出しサイズ分離する。核酸試料が標識され、そしてこの
標識鎖は便利には一本鎖として提供され、そしてプロー
ブとハイブリダイズされる。二本鎖及び過剰のプローブ
を固体要素により、貯蔵し、そして異なるアッセイに使
用することができる液相と、例えば、電気泳動により、
二本鎖試料を検出し、分離しそしてサイズ決定するため
に使用することができる固相に分離する。

又、他の態様では、プローブがrecAタンパク質と結合さ
れ、標識された標的配列を有する配列特異的な複合体が
生成される。

本発明によれば、試料中の核酸配列の存在を検出するた
めの方法及び組成物が提供される。本発明の方法は、検
出要素とカップリング要素を用いることを包含し、ここ
で試料核酸を検出要素で標識し、カップリング要素をプ
ローブに結合させる。複合体を形成した試料核酸とプロ
ーブは、固体成分により、複合体を形成していない試料
核酸から分離する。次に、試料核酸とプローブとの二本
鎖は、固体成分から分離（化学的開裂又は変性）するこ
とができ、又、標識試料核酸は、必要に応じて、例えば
サイズ分離及び検出等の操作を行うことができる。

試料源は、核酸を包含するいずれの材料又は物質でもよ
い。核酸は天然の核酸である心配がなく、化学的、酵素
的又は生物学的に合成したものでもよく、又、天然のプ
リン及びピリミジンとは異なるものを有していてもよ
い。試料源は、細胞質でも非細胞質でもよく、臨床試料
でも分離株でもよく、血液、血清、血漿、便、膿、スク
ラッピング(scrapings)、洗液、尿等の生理学的媒体由
来のものでもよく、新生物細胞、リンパ球（例えば、Ｔ
細胞若しくはＢ細胞）、単核細胞、好中球等の細胞セッ
ト又はサブセットに関連するものでもよく、ビールス、
バクテリア、マイコプラズマ、菌類、原生動物等の病原
体でもよく、又、プラスミド、ビールス又はＤＮＡ若し
くはＲＮＡ断片等を包含する造成物でもよい。この核酸
試料は、染色体性又は染色体外性でもよいＤＮＡ、例え
ば、プラスミド、ビールス、合成造成物等又はメッセン
ジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ビール
ス等のＲＮＡを包含していてもよい。核酸配列は、構造
遺伝子、未翻訳領域、調節領域、イントロン、エクソン
等を包含していてもよい。

核酸配列の検出は種々の目的に用いることができる。例
えば、核酸の検出は、新生物若しくは他の異常な細胞状
態等の植物又は動物種の病気の状態の診断、種々の分別
段階でのリンパ球等の細胞のセット又はサブセットの検
出、病原体の菌株又は種の検出、遺伝子操作の監視等に
用いられる。本発明において、試料を使用する前に、タ
ンパク質分解、抽出、沈澱、脂質若しくはタンパク質等
の他の成分からの核酸の分離、ＲＮＡの加水分解、ヌク
レアーゼの不活性化、濃縮、クロマトグラフィー、脱
水、加熱等種々の化学的又は物理的処理を施してもよ
い。試料は、妨害物質の除去、保存又は輸送準備、濃縮
等の種々の理由で処理を行ってもよい。

多くの場合、特に試料が大きな核酸分子を包含する場合
には、その組成物を通常断片化（特に制限酵素を用い
て）する。この際、一種又は複数種の制限酵素を用いる
ことができ、試料の性質に応じて断片の大きさは、５０
塩基対〜100キロ塩基対、より一般的には約0.5〜２５塩
基対の範囲とすることができる。種々の制限酵素を用い
て、平滑端又は粘着端を生成することができる。場合に
よっては、粘着端が連結に特異な部位として存在するこ
とが好ましいであろう。

又、場合によっては、混合物がＤＮＡ及びＲＮＡの比較
的小さな配列であるときには、サンプルはメッセンジャ
ーＲＮＡの逆転写生成物を含むことができる。必要に応
じて、ＲＮＡを加水分解してＤＮＡ配列のみを残すよう
にしてもよい。この方法では、一本鎖ＤＮＡだけの組成
物が得られる。

試料を予め調製した後、すぐに標識ができる。標識は、
種々の方法で行うことができる。標識の方法は特定のも
のには限定されず、多数の考慮事項により決まり、効
率、感度、経済性等の面で好ましい技術が存在する。考
慮事項の一つとして、用いる標識剤の検出感度、核酸配
列を次に処理又は解析する方法、等が挙げられる。

鎖は、一本鎖か二本鎖であるかで多少異なるが、種々の
技術により延長することができる。異なるヌクレオチド
を種々の方法、例えば、放射性物質で標識したヌクレオ
チド又は他の成分で標識したヌクレオチドを用いて標識
することのできる場合、ターミナルデオキシトランスフ
ェラーゼを用いて、鎖の３′端を延長してもよい。

二本鎖ＤＮＡの場合、相補端を有する種々の分子、例え
ば、短い二本鎖配列で特に制限酵素で生成される粘着端
又はこのような末端と同一の、例えば、平滑端を有する
ものを用いて、二本鎖に連結し一方若しくは両方の鎖を
標識することができる。過剰の標識成分を用いて、試料
ＤＮＡの連結をできるだけ少なくしてもよい。特に、T4
DNAリガーゼ等の連結酵素を用いることが非常に好まし
い。下記に示す具体例のように、その少なくとも一方が
核酸試料に付加すべき標識剤、ここでは色素、を含有す
る２つのオリゴヌクレオチドを合成する。この例では、
制限酵素HindIIIを用いて、５′端が突出している粘着
端を有する断片を生成している。

上記のオリゴヌクレオチドは、互いに相補的配列を有
し、且つ互いにハイブリダイズしたときに、標識すべき
試料核酸断片の粘着端と相補的な突出端を有するように
合成される。合成オリゴヌクレオチドは、互いにハイブ
リダイズしたとき、特定の制限酵素切断部位に適した
５′突出端又は３′突出端を有するものでよい。又、こ
れらの合成オリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイ
ズしたときに、平滑末端断片に連結できるような平滑末
端を有するものでもよい。いずれの場合でも、連結酵素
を添加すると、標識オリゴヌクレオチドが試料核酸断片
に接着末端結合するようになる。合成オリゴヌクレオチ
ドの場合には、合成片上に５′リン酸塩が存在しないの
で互いに連結しない。

上記で示した例では、オリゴヌクレオチドの配列は、正
しい連結が生じた後酵素の認識配列が破壊されるような
ものを選択した。このように選択すると、連結標識化を
用いる際に独特の利点が生じる。即ち、認識制限酵素が
存在し、それが連結時に機能的である場合、試料核酸自
体の連結のいずれもが再切断される。この特性により次
の２つの利点が生じる。第一に、制限活性と連結標識化
を同じ容器内で同時に生じさせることができ、取扱及び
操作を最少限にすることができる。第二に、大過剰モル
量の標識成分を用いて試料核酸自体の連結を防止する必
要がなくなる。上記で示した標識化の例は、制限酵素切
断部位に連結され得る合成オリゴヌクレオチドが酵素の
認識部位を破壊する配列を含有する場合のいずれの制限
酵素にも適用できる。このような配列は、例えば、シト
シンからチミジンへの塩基の変更、又はおそらく５−メ
チルシトシンのような誘導塩基の置換、又はイノリンの
ような類似体の置換によるものを含むことができる。

制限酵素が核酸鎖の特定された認識配列を切断するのに
用いられる上記及び下記の全ての例において、天然生成
物類似体、金属イオン錯体、ペプチド断片等の配列特異
的ＤＮＡ開裂分子を用いることもできる〔例えば、モサ
ー(Moser)及びダーバン(Dervan)、サイエンス、1987
年、第238巻、第645〜650頁；並びにスルカ(Sluka)等、
サイエンス、1987年、第238巻、第1129〜1132頁参
照）。

リン酸基が、例えば、放射活性により検出できる場合、
キナーゼを用いてリン酸化してもよい。

メチル基が放射性の場合、アルキル化、例えば、メチル
化を用いることができる。

又、個々の鎖と反応することのできる光活性化分子を用
いてもよい。このような分子の具体例としては、プソラ
レン、フェニルジアゾニウムビサルファイト、フェニル
アジド等が挙げられる。

ＤＮＡをリボヌクレオチドで延長し、そのリボヌクレオ
チドを次に酸化して、別の分子に結合するためのアルデ
ヒド官能基を生成してもよい。このアルデヒドは、還元
アミノ化条件下でアミノ含有成分と結合させるのが適当
である。

標識は、直接である必要がなく、間接的でもよい。即
ち、核酸配列は、検出信号を提供する第二分子に結合す
ることのできる分子で修飾することができる。例えば、
核酸配列をビオチンで修飾し、続いてその核酸配列を、
種々の検出可能の標識を接合することのできるアビジン
又はストレプトアビジンと結合させてもよい。又は、ビ
オチン以外の種々のリガンドを、それらの天然受容体又
は該リガンドに対して特異的なイムノグロブリンと組み
合わせて使用してもよい。

種々の検出可能な標識剤、特に簡便に検出可能な標識剤
を用いることができる。検出は、放射活性、紫外若しく
は可視範囲の光吸収、蛍光、化学発光等の電磁線、検出
可能生成物を生成するか又は検出可能な基質を破壊する
酵素、安定なフリーラジカル等によりなされる。これら
の性質を提供する種々の分子を、従来の方法により、標
識の具体的方法に応じて、直接又は間接的に配列に接合
させることができる。

標識剤として、³²P，¹²⁷I，¹⁴C，³H，³⁵S等の種々の放
射性元素；フルオレセイン、ローダミン、フィコビリ
ン、希土類キレート、それらの誘導体等の蛍光剤〔これ
らの蛍光剤は、個々の分子でもよいし、又は核酸又は非
（核酸）主鎖に縦に接合してもよい〕；ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ等の酵素（それ自体又はグレコー
スオキシダーゼ、ウレアオキシダーゼ、アルカリ性ホス
ファターゼ、グルコース−６−ホスフェートテヒドロゲ
ナーゼ等と結合状態で）、通常は基質と反応して蛍光又
は光吸収生成物を生成する酵素；ビオチンとアビジン又
はストレプトアビジン等のリガンド・受容体対；及び検
出が可能であり本発明に用いることのできる他の標識剤
も用いることができる。

標識化の具体例として、末端デオキシトランスフェラー
ゼを用いて、ビオチニル置換ヌクレオチド、例えば、Bi
o-11-dUTP〔ニューヨーク州ニューヨークにあるエンゾ
・バイオケム(Enzo Biochem)社製〕でＤＮＡ鎖を延長す
ることが挙げられる。標識された鎖は次の工程に用いら
れる。検出には、検出可能標識剤と結合したアビジンを
添加し、非特異的結合アビジンを洗い流し、検出可能標
識を検出する。複数のビオチニル化ヌクレオチドで鎖を
延長することにより、大きく増幅することができる。あ
る場合には、天然ヌクレオチドを含む混合物を用いて、
鎖中のビオチニル化ヌクレオチドを分離するようにして
もよい。

又、リガーゼを用いて、リボ核酸でＤＮＡ鎖を延長して
もよい。得られる一本鎖を、次に、過ヨウ素塩塩で酸化
してジアルデヒドを生成することができる。このジアル
デヒドは、フィコエリトリン単量体又は重合体と縮合し
て、蛍光性標識を生成することができる。又、ＤＮＡポ
リメラーゼでのニックトランスレーション又はランダム
プライミングを利用して放射性標識を導入してもよい。
更に、ポリメラーゼ連鎖反応性〔サイキ(Saiki)等、サ
イエンス、1985年、第230巻、第1350頁〕を利用して、
プライマーに又は組み込まれるヌクレオチドに放射性又
は非放射性標識を組み込んでもよい。核酸配列を標識す
る方法に関しては、例えば、マニアチス(Maniatis)等、
モレキュラークローニング(Molecular Cloning)、第109
〜132頁、コールドスプリングハーバーラボラト
リー社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、1982年を参照のこと。

ほとんどの場合、標識された試料を変性して、プローブ
と接触させるための一本鎖ＤＮＡを生成するが、下記す
るようにプローブをrec Aタンパク質、例えば、大腸菌r
ecA〔ホニクベルグ(Honingberg)等、プロクナトル
アカドサイ(Proc.Natl.Acad.Sci.）、米国、1986年、
第８３巻、第9586〜9590頁及びリガス(Rigas)等、プロ
クナトルアカドサイ(Proc.Natl.Acad.Sci.)、米
国、1986年、第８３巻、第9591〜9595頁〕と結合させる
ことにより、標識された二本鎖を用いることもできる。
ホニクベルグ等、前掲、ではrecAタンパク質を、ＡＴＰ
含有(0.5〜2.5mA)緩衝媒体(pH7〜8)（ＡＴＰ発生系、例
えば、ホスホクレアチン及びクレアチンキナーゼをも含
有）中でプローブとともにインキュベートしている。次
に、dsDNAとプローブ・recA複合体とを結合させ、そし
て塩化マグネシウム組成を約１０倍に増加する。リガス
(Rigas)等においては、ＡＴＰ発生系は利用されていな
かった。得られる二本鎖を、下記する一本鎖核酸試料に
関する操作と同様にして処理することができる。このよ
うに、recAを使用すると、標的ＤＮＡ断片を変性しなく
ともプローブの配列に対して相補的な配列を含有する２
本鎖ＤＮＡの断片を取り出すことのできる手段が提供さ
れる。

上記に示した場合以外では、標識され変性された核酸試
料をプローブと結合せしめる。プローブは、ｄｓ若しく
はssDNA,RNA又は他の天然若しくは合成核酸でよく、そ
して有機的、酵素的又は生物学的に合成してもよい。プ
ローブは、意図する試料配列に対してホモ若しくはヘテ
ロ二本鎖でハイブリダイズするための意図する配列を包
含している。あるいは、プローブは、特定の配列を認識
する非核酸分子、例えば抗体又は特異的ＤＮＡ結合タン
パク質、例えば、リプレッサー、インデューサー、制限
酵素等であってもよい〔ダーバン(Dervan)、サイエン
ス、1986年、第232巻、第464〜471頁参照〕。更に、プ
ローブは、固体要素にプローブを連結するための連結要
素（プローブ自体又は標識された試料鎖に対して２本鎖
を形成しているものの両方）を有する。連結要素は、抗
体若しくは特定の受容体に結合するリガンド若しくはエ
ピトープ、メルカプト基と反応してチオエステルを生成
することのできるマレイミド、ジアゾ官能基と反応する
ことのできるフェノール性基、特に還元性アミノ化条件
下でアミノ官能基と反応することができるアルデヒド基
等の化学反応性種の形態をとることができる。又、連結
要素は、例えば、支持体に結合する相補配列に結合する
ヌクレオチド配列であってもよい。プローブを固体要素
に連結する方法は、その後の条件下でその一体性を維持
し且つ種々の段階を妨害しない限り、特定のものには限
定されない。結合は、不都合のない限り、共有結合でも
非共有結合でもよく、必要に応じて、鎖状結合、例え
ば、固体要素−ビオチン−アビジン−ビオチン−プロー
ブ又は固体要素−アビジン−ビオチン−recA−プローブ
を包含していてもよい。

ビオチンとアビジン若しくはヒトレプトアビジン、抗体
とハプテン若しくは抗原、表面膜若しくは細胞質受容体
とホルモン、酵素と基質若しくは変性基質、例えば、自
己不活性インヒビター、レクチンと糖、キレートとイオ
ン、例えば、金属イオン等の受容体とリガンドとの種々
の組み合わせを用いることができる。

プローブは、従来法のいずれで製造してもよい。即ち、
プローブは、上記したニックトランスレーション、連結
若しくはランダムプライミング法を用いるか又は市販の
核酸合成器のいずれかを使用して合成し標識される。従
って、連結用の一種以上の基を末端又は鎖の途中に導入
することができる。例えば、末端トリチル基を残して抗
体用リガンドとして機能させることができる。ＲＮＡを
添加し、上記した方法により開裂することができる。
又、ビオチル化ヌクレオチドを鎖の末端又は途中に組み
入れて、１個又は複数個のビオチンを有するプローブを
生じさせることができる。

プローブは、通常少なくとも８ヌクレオチド、より一般
的には少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なく
とも１２ヌクレオチドであるが、１０キロヌクレオチド
以上、通常約２キロヌクレオチド未満であってもよい。
プローブの大きさは、標的配列の性質、試料中の標的配
列の量及び検出工程において用いられる条件により異な
る。

プローブと試料を適当なストリンジェンシー性条件下で
混合し、相補的配列の適切な選択を許容する。この際、
水性塩溶液、水と極性有機溶媒、例えば、ジメチルホル
ムアミド、との混合溶液等を用いることができる。高温
を用いることができるが、通常、変性は110℃以下、ハ
イブリダイゼーションは８０℃以下で行う。塩濃度は、
一般的に約4.0Ｍ以下である。ストリンジェンシーは、
使用する溶液のpHにより制御することができる。このス
トリンジェンシーは、プローブと試料を接触させるため
の溶液中に提供してもよいし、又はそれに続く洗浄にお
いて提供してもよい。この際、固体要素上でも固体要素
から分離した状態であってもよい。適切な配列の相同性
を伴わないで生じる結合を減少させたり又は反応速度を
高めるために、未標識キャリマーＤＮＡ、又はポリエチ
レングリコール、ヘパリン、デキストランサルフェート
等の重合体を添加することが望ましい。

この段階で、二本鎖プローブ及び全ての未反応プローブ
を、連結基により、固体要素を含んで成る分離手段に連
結することができる。この固体要素は、多数の適当な形
態の内ののいずれの形態であってもよい。固体要素は、
天然又は合成粒子、例えば、アガロース、セルロース、
セファデックス、セファロース、ポリアクリレート、ポ
リスチレン、親水性ポリマー、調節ポアガラス、ナイロ
ン、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)等からなる
重合体粒子でよく、種々の支持体がプローブの連結要素
の性質に応じて官能化される。粒子の大きさは、一般的
に0.5〜100μｍの範囲である。粒子は、磁気手段による
分離が可能なように常磁性であるのがよい。粒子が常磁
性でない場合、遠心分離、濾過、不混和相への抽出若し
くは不混和相間の抽出、電気泳動分離、遠心分離と濾過
等の手段の組み合わせ又は他の分離手段を用いることが
できる。又、固体要素は、マイクロタイタープレートウ
エル、ミクロフュージ管、インテグラルフィルター付ミ
クロフュージ管、吸収性パッド付フィルター、毛細管、
カラム等又は固体支持体の組み合わせ等の種々の容器の
いずれか一つでよい。支持体は、誘導化若しくは誘導性
表面又は膜、例えば、ガラス；ニトロセルロース；誘導
化ナイロン、例えば、ニューヨーク州グレンコッベにあ
るポール社のバイオディン(Biodyne)（商標）；誘導化
セルロースポリマー、例えば、マサチューセッツ州のビ
レリカにあるメムテク(Memtek)社のメムテスト(Memtes
t)（商標）；又は誘導化ポリビニリデンジフロリド、例
えば、マサチューセッツ州のベッドフォードにあるミリ
ポアー社のイモビロン(Immobilon)若しくはニューヨー
ク州グレンコッベにあるポール社のイムノアフィニティ
ー(Immunoaffinikty)（商標）メンブレン等を用いるこ
とができる。固体成分の性質に応じて、媒体を固体成分
と接触させて、連結要素を固体成分に結合させる。粒子
の場合、媒体を粒子と共に攪拌し、次に粒子を分離し
て、液相上清及び固体粒子相を生成することができる。
種々の容器の場合、媒体を容器に導入し、攪拌し、上清
を容器から除去することができる。カラム又は管の場
合、媒体をカラム又は管に導入し、反応が生じるに充分
な時間接触状態を維持し、次に液相を除去する。膜又は
表面を用いるとき、媒体を膜又は表面を通すか又はそれ
に沿って通過させて反応を生じさせ、未反応物を除去す
る。この場合では、未標識ＤＮＡを添加するのが、適当
な配列の相同性なしに生じる結合をブロックするために
望ましい。

次に、固体要素を処理して、標識された核酸の非特異的
結合を除去する。洗浄は、固体要素へのプローブ及び相
同な二本鎖の保持を妨害しない種々の溶液のいずれでも
よい。従って、一般的に塩濃度が1.0Ｍ以下で、pHが約
１３〜５の範囲の種々の緩衝水溶液を80〜20℃の温度で
用いることができる。時間は、数秒〜１時間以上でよ
い。非特異的結合又はヘテロ二本鎖（部分的に相補的）
標識核酸を除去後、固体要素上の標識された核酸の存在
を検出して、試料媒体中に存在するプローブに対して相
補な配列の存在を実証する。この方法のこの時点で、支
持体に結合した標識された試料核酸は、未組み込み標識
分子を実質的に含んでいてはならない。

次の工程で、特異的に結合した標識された核酸断片を、
検出に先立ち支持体から溶離する。これにより、さらに
別のレベルの特異性が全体プロセスに加わり、プローブ
に対して所望の相同性の核酸断片だけが検出される。プ
ローブ及びその連結要素を介して支持体に結合した標識
された核酸のみを選択的に放出する溶離方法を利用す
る。

より一般的には、標識された試料核酸を支持体及びプロ
ーブから、変性により分離してもよい。この変性及び溶
離工程中の塩濃度は、通常約0.2Ｍ未満である。効率的
に溶離するには、NaOH濃度が１０mM以上、通常約50〜20
0mM、一般的には約300mM以下のNaOH溶液を使用して、pH
を通常１０以上、好ましくは約12〜13にするのがよい。
この際、ＫＯＨ又はグアニジン等の他の塩基を用いるこ
ともできる。一般的に90〜100％、通常約９９％のホル
ムアミドを使用して溶離を行ってもよい。又、高温での
変性を単独で又は上記した他の変性法との組み合わせに
より溶離を行ったりあるいは促進したりしてもよい。温
度だけで行う場合には、プローブの長さにより異なる
が、通常少なくとも６０℃の高温でなければならない。
化学変性を同時に行う場合には、より低温で充分であ
る。万一連結要素が核酸の場合には、同様な手段を利用
して標識標的を支持体から放出する。

又、固体要素に対して化学的に開裂可能な結合を利用す
ると、プローブ・標的複合体を固体要素から、適当な開
裂剤を用いて分離することができる〔例えば、ハーマン
(Herman)等、アナリティカルバイオケム(Analytical
Biochem.)、1986年、第156巻、第48〜55頁参照〕。又、
溶離を、リガンド・受容体相互作用を妨害する条件を用
いて、例えば、少なくとも４０℃の高温で100mM NaOH等
の変性条件を導入したり、又はリガンド結合部位に関し
てリガンドで標識されたプローブと競合する多量の化合
物を系に注ぐことにより溶離してもよい。更なる別法と
して、イオン濃度を変化して、タンパク質ＤＮＡ複合体
を放出してもよい〔ホニクベルグ(Honigberg)等、前
掲〕。又、更なる別法として、２つの核酸鎖の相補的結
合を切断したり防止したりするようにＤＮＡ又はＲＮＡ
を化学的に修飾するグリオキサル等の試薬を使用しても
よい〔例えば、カーミカエル(Carmichael)及びマックマ
スター(McMaster)、メソッズオブエンザイモロジー
(Methods of Enzymology)、1980年、第６５巻、第380〜
391頁〕。

次に、溶離した標識核酸を、従来技術により検出するこ
とができる。又、この溶離した標識された核酸を、最終
検出の前にサイズ分離してもよい。このサイズ分離工程
により、意図する断片についての具体的且つ重要な情報
がもたらされるだけでなく、支持体から溶離した非特異
的又は部分的に相同性の標識核酸に対する別のレベルの
識別をも生じる。サイズ分離は、電気泳動、密度勾配遠
心分離、液体クロマトグラフィー等により行うことがで
きる。標識が存在するとバンドの検出が可能となり、
又、標準物をサイズの比較に利用してもよい。核酸が変
性状態にある場合、このような変性をpH、グリオキサル
若しくは同様な誘導化処理、強力な水素結合剤の使用等
により行う場合には、このサイズ分離を行うことが望ま
しい。便利には、標準は、対照標識、例えば、標識され
た試料で得られる信号とは波長が異なる信号を提供する
色素又は蛍光剤で標識することができる。この方法で
は、比較が簡単で、且つ標準と試料との関係が容易に決
定できる。デンシトメータ若しくはゲルスキャナー若し
くはカルフォルニア州のフォスター市にあるアプライド
バイオシステムズ社(Applied Biosystems Inc.)の370
型ＡＢＩ等の自動化蛍光ゲル電気泳動スキャナー等の機
器を用いて、バンド強度及び位置を測定してもよい。
又、像を、適当な染料を用いて写真記録してもよい。

ここで、上記した操作により、サイズ分離、トランスフ
ァー及びその後のプロービングを包含するサザンプロッ
ト又は他の類似の手法により普通得られる全ての情報を
得ることができる。本発明により、ブロッティング工程
なしで、ゲル操作なしで、大容量のプローブ及び洗浄液
なしで且つ固体支持体上でのハイブリダイゼーションな
しでプローブが結合する核酸断片の長さを測定すること
ができる（従って、速度が早まり、そしてバックグラウ
ンド及び非特異的結合が少なくなる）。従って、本発明
は、従来のサザンブロット操作よりもはるかに自動化し
易い。

固相及び液相分離後残存する上清は、異なるプローブで
繰り返し試験して他の配列を検出することができる。こ
のようにして、対立遺伝子、擬似遺伝子(psedogene)、
マルチコピー遺伝子における障害、ジャームラインの組
換え等の存在又は完全に独立した配列でさえ検出するこ
とができる。

〔実施例〕

実施例1. 光化学駆動反応を利用してのリガンドビオチンによるプ
ローブの標識 1.製造業者記載の使用法に準じて、フォトプローブ（商
標）ビオチン（カルフォルニア州バーリンゲームにある
ベクターラボラトリーズ社）を蒸留水で１mg／mlの濃度
に溶解する。

2.フェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈澱
（マニアチス等、同書参照）後、核酸試料を0.1mM EDTA
に溶解して最終濃度を１μｇ／μとする。

3.同容量の溶解したフォトプローブ（商標）ビオチンを
前記の溶解した核酸に添加し、ゼオラルエレクトリック
社製#RSM型275ワットの太陽灯下１０cmの氷上で、１５
分間該太陽灯に照射する。

4.次に、0.1mMトリス−HCl(pH9.0)を添加して総容量100
μとする。ＤＮＡの総量が１０μｇ未満である場合、
サケの精液ＤＮＡ等のキャリヤーＤＮＡを添加する。

5.２−ブタノール（100μ）を添加し、混合物を穏や
かに攪拌し、簡単に遠心分離し、上相を捨てる。この抽
出を２回繰り返す。

6.５M NaCl（0.6μ）を及び９５％エタノール100μ
を添加し、混合物を穏やかに攪拌後、暗所に１時間放置
して沈澱を生成させる。混合物を遠心分離し、得られる
ペレットを７０％エタノールで洗浄し、残留溶媒を真空
遠心分離で除去後、ペレット緩衝液に再懸濁してその後
の標識プローブの使用に備える。

実施例2. 連結を利用してのリガンドビオチンによるプローブの標
識 1.製造業者記載の使用法に準じて、アプライドバイオ
システム381型ＤＮＡ合成装置で構造Ｉ及びIIを有する
オリゴヌクレオチドを合成する。構造Ｉを、図示した位
置ＸにＣ（シトシン）を用いて合成する。次に、このＣ
を、ドラパー(Draper)、ヌークレイックアシッドリ
サーチ(Nucleic Acids Research)、1984年、第１２巻、
第988頁以降に記載されているようにして行うアミノ基
転移反応によりＸの構造に転化後、製造業者記載の使用
法（イリノイ州のロックフォードにあるピアースケミ
カル社）に準じて長鎖アームビオチンと反応させる。

2.下記の試薬を混合して反応混合物を調製する。

・１０mMトリスHCl、１mM EDTA、pH8.0（ＴＥ）に１ピ
コモル／μのpSP64プラスミド（ウイスコン州のマデ
ィソンにあるプロメガ社製）を溶解したもの１μ ・10ｘミーディアムサルトバッファー（マニアチス
等、同書）１μ ・１０mM ATP１μ ・１単位／μＴ４リガーゼ〔インディアナ州のインデ
ィアナポリスにあるベーリンガーマンハイム(Boehrin
ger Mannheim)社製〕１μ ・ビオチニル化オリゴヌクレオチド１μ（構造体Ｉ；
ＴＥに2.5ピコモル含有）・相補オリゴヌクレオチド１μ（構造体II；ＴＥに2.
5ピコモル含有）・水３μ ・１０単位／μHind III制限酵素（インディアナ州の
インディアナポリスにあるベーリンガーマンハイム社
製） 3.混合物を３７℃にで１時間インキュベートする。

4. 0.2Ｍ EDTAを１μ添加して反応を停止する。

構造体Ｉ５′＞TXXXTTTTTTTTTTTTTAGTTATGATGTTGT＜３′ 但し、構造体II ５′−AGCTACAACATCATAACT 本実施例では、制限酵素Hind IIIを使用する。ある状況
下では、より多く切断してより短い断片からなるプロー
ブを生成してハイブリダイゼーション速度を早めるAlu
Ｉのごとき制限酵素を使用する方が有利である場合があ
る。異なった制限酵素を使用すると、通常、異なったバ
ッファー条件が必要であるばかりでなく、このような酵
素の制限認識部位と一致するオリゴヌクレオチドを使用
することが必要となる。

実施例3. ランダムプライミングを使用してのリガンドビオチンに
よるプラスミドの標識 1.ランダム配列の６量体を、製造業者記載の市鵜法に準
じて、アプライドバイオシステム381A型ＤＮＡ合成装
置により合成する。６量体は、４塩基全ての各位置が完
全な縮重の状態で合成される。これらの６量体は、次
に、製造業者記載の使用法（アプライドバイオシステ
ム）に準じて、アミノ・リンク（商標）でキャッピング
し、精製した。その後、製造業者記載の使用法（ピアー
スケミカル）に準じて、長鎖アームビオチンで標識し
て、構造体IIIを製造する。

構造体III 2.混合物を下記のように調製する。

・ＴＥ中１０ng／μのランダムHind III制限断片のを
１０分間煮沸後氷で急冷したもの１μ ・0.5mM dGTP,dCTP及びdTTPの１：１：１混合物1.5μ ・５ｘランダムプライミングバッファー〔フェインベル
グ(Feinberg)及びボゲルシュタイン(Vogelstein)、アナ
ルバイオケム(Anal.Biochem)、1983年第132巻、第６
〜１３頁及びフェインベルグ(Feinberg)及びボゲルシュ
タイン(Vogelstein)、アナルバイオケム(Anal.Bioche
m)、1984年、第137巻、第266〜267頁〕2.0μ ・構造体IIIのビオチン６量体（水に2.5μｇ／μ）2.
0μ ・１０μCi AT³²P（デラウエア州のウイルミントンにあ
るデュポンＮＥＮ社製）2.5μ ・水0.5μ ・ベッセスダリサーチラボラトリー(Bethesda Rese
arch Lads)から入手した７単位／μ大腸菌ポリメラー
ゼＩクレノー断片0.5μ 3.３７℃で３０分間インキュベートする。

4.過剰のランダムプライマー及びヌクレオチドを、セフ
ァデックスＧ−５０バイオスピンカラム(BioSpin colum
n)（ペンシルベニア州のパオリにある５プライム→３プ
ライム社製）を用いて、製造業者記載の使用法に準じて
除去する。

・製造混合物のアリコットを８％ポリアクリルアミドゲ
ルに付し、オートラジオグラフ分析した。

高分子量放射性物質の存在より、ランダムプライミング
がうまくいったことが確認される。

実施例4. 連結を利用して試料核酸を蛍光色素で標識する 1.アプライドバイオシステワ381型ＤＮＡ合成装置を
用いて、製造業者記載の方法に準じて、１８ヌクレオチ
ドオリゴマーを合成し、精製する。その５′端をアミノ
・リンク（商標）（アプライドバイオシステム）を用
いて、アミノ末端とする。このアミノ基を、製造業者記
載の方法（アプライドバイオシステム）に準じて、フ
ルオレセインＮ−ヒドロキシサクシンイミドに結合す
る。

2.アプライドバイオシステム381型ＤＮＡ合成装置を
用いて、製造業者記載の方法に準じて、２０ヌクレオチ
ドオリゴマーを合成し、精製する。合成した配列は下記
の通りである。

５′AGC TAC AAC GTC GTC ACT GG ３′ この配列は、最初の１４個のヌクレオチド（５′端か
ら）がフルオレセインで標識された18−merの３′端と
相補であり、18−merの３′端の４個のヌクレオチドが
制限酵素Hind IIIより生じる５′粘着末端突出部と相補
的であるように選択される。18−mer／20−mer二本鎖を
生成し制限酵素Hind IIIで切断した標的ＤＮＡの粘着末
端に連結すると、この特定の配列がHind IIIの認識配列
を破壊する。

3.下記の試薬を混合して反応混合物を調製する。

・標識ＤＮＡ１μｇの水１μ溶液・10x Hind III反応バッファー〔BRLガイザースベルグ
(Gaithersberg)、ＭＤ〕0.9μ ・18−merの水溶液3.0μ；モル数は、Hind IIIが標的
ＤＮＡ１μｇを消化するとき生じる粘着末端の推定数の
２倍でなければならない。

・20-merの水溶液2.0μ；モル数は、18−merのモル数
と等しくなければならない。

・１０mMジチオスレイトール1.0μ ・３mMリボースＡＴＰ1.0μ ・Hind III酵素（１２単位／μ）0.5μ ・リガーゼ酵素（0.5単位）0.5μ 4.３７℃で１時間インキュベートする。

5. 0.2M EDTA0.5μ及び２０μｇ／μグリコーゲン
の水溶液1.0μを添加する。

6.フェノール／クロロホルム抽出を２回行い混合物をク
リーンアップする。フェノール及びクロロホルムを各々
１０μ添加する。混合し遠心分離する。下層を除去し
捨てる。繰り返す。（マニアチス等、前掲） 7.3M NaAc(pH5.5)を１μ以下及び９５％エタノールを
２５μ添加する。混合する。３０分間放置する。遠心
分離する。

8.沈澱を７０％エタノール500μで洗浄する。

9.真空遠心分離により試料を乾燥する。

10.１０mMトリス、1mM EDTA、pH8.0 ５０μに再懸濁
する。

11.反応混合物のアリコットを、1x TBE（トリス・ボー
レートEDTA）バッファーにおいて３ボルト／cmで操作す
る0.6％アガロースゲルに附する。ゲルを通って移動す
る蛍光バンドを、水平面上のアガロースゲルを読み取れ
るようになっているアプライドバイオシステム370A D
NAシークエンサーにより検出する。ランダファージＤＮ
Ａを標的として使用するとき、Hind III切断ラムダＤＮ
Ａにおいて、560,2027,2322,4361,6557,9416及び23,130
塩基対に相当する蛍光ピークが検出される（ラムダにお
いてｃｏｓ部位が存在すると、23,130塩基対への4361塩
基対断片の連結が生じる）。

実施例５キナーゼ酵素を用いて試料核酸を放射標識するゲル電気泳動で厳密に精製した脱リン化ＤＮＡ（アルカ
リ製ホスファターゼ処理）（５′端：１〜５０ピコモ
ル）、10ｘキナーゼバッファーＩ５μ、150μＣｉ
〔γ−³²Ｐ〕ATP 50ピコモル、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ10〜20単位及び水50μを混合し、３７℃で３０
分間インキュベートする。混合物に0.5M EDTA２μ添
加し、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出後、エ
タノールでＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡをＴＥ５０μ
に再溶解し、標識ＤＮＡを未取り込み〔γ−³²Ｐ〕AT
Pから、Ｇ−２５スピンカラムクロマトグラフィーによ
り分離する（マニアチス等、同書）。

実施例6. 光ビオチニル化ＲＮＡプローブ及び放射標識試料ＤＮＡ
を用いての特定の制限断片の検出及びそれらの長さの決
定 1.ラムダＤＮＡを含んでなる試料ＤＮＡ及びpGEM-3 DNA
（ウイスコン州のマディソンにあるプロメガ社製）の両
方を、Hind III制限酵素で切断し、実施例５で述べた方
法により³²Ｐで標識する。

2.アジビン被覆磁気ビーズ〔マサチューセッツ州のケン
ブリッジにあるアドバンストマグネチクス(Advanced
Magnetics)社製〕を、0.2M NaCl 0.01Mトリス、0.001M
EDTA、pH8.0で３回洗浄後、１μｇ／μデキストラン
サルフェートを含有する洗浄バッファーに、300μ当
たり充填ビーズ１６％の濃度で再懸濁する。

3.製造業者記載の使用方法（プロメガバイオテク社）
に準じて、プローブとして使用するためのpGEM-3のＲＮ
Ａトランスクリプトを調製する。次に、プローブＲＮＡ
を、実施例１と同様の方法により光化学的にビオチンで
標識する。プローブＲＮＡを、160ng／μぎの濃度で
ＴＥに再懸濁する。

4.1.5mlポリプロピレン管において下記の成分を混合し
て調製したビオチニル化pGEM-3 RNAプローブを用いて、
試料ＤＮＡ混合物から特定のpGEM-3 DNAをプローブす
る。

・ホルムアミド74.5μ ・5M NaCl8.0μ ・濃度160ng／μの光ビオチニル化プローブＲＮＡの
ＴＥ液2.0μ ・濃度８ng／μの³²Ｐ標識pGEM-3 DNA0.5μ ・³²Ｐ標識ラムダ（Hind III切断）DNA 3ngを含有する
ＴＥ液7.5μ ・剪断、変性及び急冷したサケの精液DNA 3.0μ（１
μｇ／μ）・シトレート・ホスフェートバッファー、pH6.4 4.0μ
・200mM EDTA 0.5μ 容量を水で100μとする。

5.混合物の入った管を沸騰水中に４分間吊るして、混合
物を変性する。

6.次に、混合物を４５℃に冷却し、４５℃に２時間保持
して培養する。

7.ハイブリダイゼーション混合物の２５μアリコット
を、200mM NaCl、１０mMトリス、１mM EDTA、pH8.0の１
mlに加えて希釈する。

8.磁気ビーズ５０μを添加して、静かに振盪し、４０
分間培養する。

9.製造業者記載の使用方法に準じて、ビーズを溶液から
分離し、上清を除去する。

10.ビーズを200mM NaClのＴＥ液で２回洗浄し、再懸濁
を繰り返し、磁気分離及び上清の除去を行って結合の弱
い物質を除去する。

11.次に、200mM NaClの100μに、ビーズを再懸濁し、
RNA・DNA二本鎖の変性及びＲＮＡの分離により標的ＤＮ
Ａを釈放する。釈放された物質を、２０μｇ／μグリ
コーゲン１μ、3.0M NaAc(pH5.5)１０μ及び９５％
エタノール250μを添加して沈澱させる。混合後、こ
の沈澱を、エッペンドルフミクロフュージ（商標）にお
いて、最大速度で１０分間回転し、７０％エタノール50
0μで洗浄し、サバントスピードバック(Savant Speed
Vac)（商標）において乾燥し、得られるペレットを、
アルカリ性ローティングバッファー（マニアティス等、
同書）に再懸濁する。

12.アルカリ性アガロースゲル、0.7％アガロース、をマ
ニアチス等、同書、第171頁以降に記載の方法により調
製する。試料混合物のアリコット、上清及び溶離液をア
ガロースゲルに３時間８ボルト／cmの条件で附する。次
に、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフ分析を行う。試
料混合物を含むレーンには、種々の断片全てが存在す
る。上清を含有するレーンでは、pGEM-3プローブが大部
分除去されている。溶離液を含有するレーンでは、2.9k
b pGEM-3 DNA、即ち、ＲＮＡプローブにより特異的に引
き出された断片のみ顕著なピークとして現れる。このよ
うにして、上記操作により、プローブと相補的な断片が
検出され且つこの断片の長さが測定できる。

実施例7. 光ビオチニル化ＲＮＡプローブの使用による連結により
蛍光標識した試料ＤＮＡの特定の断片の検出 1.ビオチンで標識したＲＮＡプローブを実施例１及び６
に記載の方法で調製する。

2.ラムダDNA６フェムトモル及びpGEM-3 DNA100アトモル
からなる試料をHind III制限酵素で切断後、適当な規模
で、実施例４に記載の方法により連結してフルオルセイ
ンで標識する。

3.試料及びプローブの変性、ハイブリダイゼーション、
分離、洗浄及び溶離操作を、下記の点を除いて実施例６
と同様の方法により行った：全溶液とも１％トゥイーン
(Tween)２０及び0.1μｇ／μデキストランサルフェー
トを含有している；最初の２回の洗浄を1M NaClのＴＥ
バッファーで行う；更なる３回の洗浄は、溶離前に0.1x
SSPEで行う；使用されるビーズは、５０％充填ビーズ
を含有するストックからのストレプトアビジン・アガロ
ース（ピアースケミカル社製）である；及びビーズは磁
性体ではないので、遠心分離を用いて分離する。

4.アルカリ性アガロースゲル、0.6％アガロース、をマ
ミアチス等、前掲、第171頁以降に記載の方法で調製す
る。試料混合物の希釈液のアリコット、上清及び溶離液
を４時間３ボルト／cmの条件でアガロースゲルに附す
る。ゲルを通って移動する蛍光バンドを、水平面上のア
ガロースゲルを読み取れるようになっているアプライド
バイオシステム370 DNAシークエンサーにより検出す
る。

5.試料混合物を含有するレーンでは、種々の断片全てが
相対的に存在する。上清を含有するレーンでは、pGEM-3
RNAプローブが、プローブに対して相補的な鎖に対応す
るpGEM-3 DNAの半分を移動させている。溶離液を含有す
るレーンでは、2.9kb pGEM-3 DNA、即ち、ＲＮＡプロー
ブに相補な断片が、最も顕著なバンドとして現れる。こ
のようにして、上記操作により、プローブと相補的な断
片が特異的に検出され且つこの断片の長さが測定でき
る。

実施例8. ビオチンで標識したＤＮＡプローブを用いての、連結に
より蛍光標識したＤＮＡの特定の断片の連結による検出 1.pGEM-3プラスミド（プロメガ社製）からなるＤＮＡプ
ローブを、実施例２に記載の方法による連結によって、
ビオチンで標識する。

2.ラムダDNA ６フェムトモル及びpGEM-3 DNA 100アト
モルからなる試料をHind III制限酵素で切断後、適当な
規模で、実施例４に記載の方法により連結してフルオル
セインで標識する。

3.試料の他にプローブDNA ２フェトモルを、１％トゥ
イーン(Tween)２０及び0.1μｇ／μデキストランサル
フェートを含有している1.5x SSPE200μ中で、９５℃
で５分間変性後、６５℃で２時間ハイブリダイゼーショ
ンを行う。５０％ストレプトアビジン・アガローズビー
ズ懸濁液を２０μ添加し、混合物を３７℃で１時間培
養する。

4.、分離、洗浄及び溶離を、実施例７に記載の方法で行
う。アルカリ性アガロースゲル、0.6％アガロース、を
マニアチス等、前掲、第171頁以降に記載の方法で調製
する。試料混合物のアリコット、上清及び溶離液を４時
間３ボルト／cmの条件でアガローズゲルに附する。ゲル
を通って移動する蛍光バンドを、水平面上のアガローズ
ゲルを読み取ることができるアプライドバイオシステ
ム370 DNAシークエンサーにより検出する。

5.試料混合物を含有するレーンでは、種々の断片全てが
適量存在する。上清を含有するレーンでは、pGEM-3 RNA
プローブが、標的pGEM-3 DNAのほとんどを除去する。溶
離液を含有するレーンでは、pGEM-3 DNA、即ち、pGEM-3
プローブにより特異的に引き出された断片が、最も顕著
なバンドとして現れる。このようにして、上記操作によ
り、プローブと相補的な断片が検出され且つこの断片の
長さが測定できる。

実施例9. 連結により蛍光標識したＤＮＡの特定の断片の、ストレ
プトアビジンで被覆した磁気ビーズ及びビオチンで標識
したＤＮＡプローブによる検出 1.Hind IIIの代わりにAlu １制限酵素を使用し、そし
てバッファー条件を適当に調製すること以外は実施例２
と同様な方法により、pSP64プラスミド（プロメガ社
製）からなるＤＮＡプローブをビオチンで標識する。１
％トゥイーン(Tween)２０を含有するＴＥを添加して、
プローブ濃度を、１０μ当たり各pSP64プラスミド断
片９フェムトモルに調整する。

2.ラムダDNA 100フェムトモル及びpSP64 DNA100アトモ
ルからなる試料をHind III制限酵素で切断し、適当な規
模で、実施例４に記載の方法により連結してフルオルセ
インで標識後、１％トゥイーン(Tween)２０を含有する
ＴＥで希釈して総量９０μとする。

3.試料及びプローブを混合して下記のハイブリダイゼー
ション混合物とする。

上記工程２の試料……………………９０μ 上記工程１のプローブ………………１０μ ホルムアミド…………………………１４μ 2.0Mりん酸ナトリウム(pH7.0)、0.1％硫酸ラウリルナト
リウム及び１μｇ／６０μテキストランサルフェート
からなる水溶液……３７μ 4.ハイブリダイゼーション混合物を102℃で１０分間イ
ンキュベートして試料及びプローブを変性後、６５℃で
２０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを
生じさせる。次に、試料を３７℃まで冷却し、ストレプ
トアビジンで被覆した磁気ビーズ〔マサチューセッツ州
のケンブリッジにあるアドバンストマグネチクス(Adv
anced Magnetics)社製〕の５mg／ml懸濁液２０μを添
加後、混合物を３７℃で更に１５分間インキュベートし
た。（ビーズは、１％トゥイーン２０、１μｇ／６０μ
デキストランサルフェート及び0.1％硫酸ラウリルナ
トリウムを含有する0.5x SSPEで２回予め洗浄する。） 5.製造業者記載の方法により、磁気ビーズを磁気分離
し、上清を除去後、ビーズを次のようにして洗浄する。

１％トゥイーン２０、１μｇ／６０μデキストランサ
ルフェート及び0.1％硫酸ラウリルナトリウムを含有す
る0.1x SSPEで２回洗浄（各６５℃）； 0.1x SSPEで室温にて１回洗浄。

6.最終洗浄溶液を除去後、ビーズを100mM NaOH、５％フ
ィコル(Ficoll)及びデキストランサルフェート0.3μ
／μの混合物６μに再懸濁する。１０分後、ビーズ
懸濁液を直接アルカリ性アガロースゲルのくぼみ(well)
に装填する。アガロースゲルの操作及びバンド検出条件
は、実施例８と同様である。

7.ビーズを装填したゲルのレーンでは、pSP64の断片の
みが検出される。ラムダＤＮＡに相当する断片はなにも
検出されない。このように、上記操作全体により、プロ
ーブに対して構造が相補的な断片のみが特異的に検出さ
れる。

本明細書において述べた刊行物及び特許出願は、本発明
に関連する当該技術分野における技術水準を示すもので
ある。上記した刊行物及び特許出願の内容は、全て本発
明に用いることができる。

また、上記において、本発明を明瞭に理解できるよう
に、図及び実施例をもってかなり詳細に説明したが、請
求の範囲内において修正及び変更ができることは明らか
である。

〔発明の効果〕

上記の説明から明らかなように、本発明の方法によれ
ば、低レベルの核酸配列、特に複雑な混合物中の核酸配
列が感度よく且つ迅速に検出される。更に、配列のサイ
ズが重要である場合、本発明により、標識試料の単離及
びそのサイズの測定が可能である。又、本発明の方法は
非常に適応性があり、自動化が可能であるので、技術者
による誤差を実質的になくすことができる。更に、本発
明の方法は、標識及び支持体への連結の方法を変更する
ことができるので、種々の条件及び試料が可能となる。
又、本発明の工程で、全ての妨害物とともに非特異的結
合物質が実質的に除去されるので、信頼性が高く、正確
で感度の良いアッセイが提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リンカーンジェイ．マックブライドアメリカ合衆国，カリフォルニア 94062, レッドウッドシティ，アイリスストリート 311 (72)発明者ノーマンエム．ホワイトリーアメリカ合衆国，カリフォルニア 94070, サンカルロス，ハイランドアベニュ 151 (72)発明者マイケルダブリュ．ハンカピラーアメリカ合衆国，カリフォルニア 94070, サンカルロス，ペブルドライブ 1333

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】意図する配列を有すると思われる核酸を標
識剤で標識し、前記核酸を、前記の意図する配列に特異的に結合するこ
とのできる配列及び分離手段への連結のためのカップリ
ング要素を含有するプローブと、前記の意図する配列と前記相補配列との複合体を形成所
定のストリンジェンシー条件下で結合せしめ、但し該核
酸が二本鎖である場合には核酸プローブをｒｅｃタンパ
ク質と複合体化せしめ、前記プローブ及び複合体を前記分離手段により非相補配
列から分離し；前記標識された核酸を前記分離手段から解離させて結合
していない標識された核酸を生成せしめ；そして、前記結合していない標識された核酸を前記標識剤で検出
する；工程を含んで成る核酸配列の検出方法。
【請求項２】前記結合していない核酸をサイズ分離する
工程を更に含んで成る請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記サイズ分離を電気泳動により行う請求
項２に記載の方法。
【請求項４】ゲノムＤＮＡを含有する試料中の意図する
核酸配列を検出する方法であって、該ゲノムＤＮＡを断片化して約５０キロ塩基対未満の核
酸断片を生成し；標識剤で前記核酸を標識し；一本鎖形の前記核酸断片を、前記の意図する配列と相補
的な核酸配列及び粒子への連結のためのカップリング要
素を含有するプローブと、前記の意図する配列と前記相
補的配列との二本鎖を形成する所定のストリンジェンシ
ー条件下で結合せしめ；前記プローブ及び二本鎖を前記粒子により非相補的配列
から分離し；前記標識された核酸を前記分離手段から化学的及び／又
は熱的変性により解離させ；前記解離した標識された核酸をサイズ分離し；そして前記サイズ分離した核酸を検出する；ことを含んで成る
試料中の意図する核酸配列の検出方法。
【請求項５】前記サイズ分離を電気泳動で行う請求項第
４に記載の方法。
【請求項６】前記標識化が、前記ＤＮＡ断片を前記ＤＮ
Ａ断片の末端と相補的な末端を有するdsDNA標識分子と
連結することを含んで成る請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記ＤＮＡ断片の前記相補的末端が制限部
位を制限酵素で消化して生成したものであり、そして前
記相補的末端の連結により前記制限酵素により開裂する
配列以外の配列を生じる請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記ＤＮＡ断片の前記相補的末端が平滑末
端である請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記標識化が、前記ＤＮＡ断片の鎖を標識
されたヌクレオチドで延長することを含んで成る請求項
４に記載の方法。
【請求項１０】前記標識剤が放射性核種、蛍光剤、化学
発光剤、特異的結合対のリガンド又は酵素である特許請
求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項１１】連結要素に接合した核酸配列、前記連結
要素に特異的に結合することができる固体成分、核酸配
列を標識するための試薬及び核酸断片をサイズ分離する
ための手段を含んで成るキット。
【請求項１２】前記連結要素が特異的結合対の構成員で
あり、前記固体成分が前記特異的結合対の相補的構成員
を含んで成り、前記試薬が標識されたヌクレオチドを含
んで成り、そして前記サイズ分離手段が電気泳動ゲルを
含んで成る請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】特異的結合対が受容体とリガンドとの組
み合わせからなり、該記組み合わせがアビジン若しくは
ストレプトアジビンとビオチン；抗体とハプテン若しく
は抗原；核酸の相補鎖；受容体とホルモン；レクチンと
糖；又はキレートとイオン、から実質的になる請求項１
２に記載のキット。