JPS61293400A - ポリヌクレオチド配列の測定方法 - Google Patents
ポリヌクレオチド配列の測定方法Info
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- JPS61293400A JPS61293400A JP61143122A JP14312286A JPS61293400A JP S61293400 A JPS61293400 A JP S61293400A JP 61143122 A JP61143122 A JP 61143122A JP 14312286 A JP14312286 A JP 14312286A JP S61293400 A JPS61293400 A JP S61293400A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、特定のポリヌクレオチド配列を測定するため
の核酸ハイブリダイゼーション試験方法に関する。かか
る方法は人間医学、獣医学、農業及び食品化学、その他
の分野に応用することができる。特にこの手法は細菌及
びウィルスのような病原体の検出及び同定、細菌の抗生
物質耐性についてのスクリーニング、及び癌性細胞の検
出に用いることができる。
の核酸ハイブリダイゼーション試験方法に関する。かか
る方法は人間医学、獣医学、農業及び食品化学、その他
の分野に応用することができる。特にこの手法は細菌及
びウィルスのような病原体の検出及び同定、細菌の抗生
物質耐性についてのスクリーニング、及び癌性細胞の検
出に用いることができる。
従来の核酸ハイブリダイゼーション試験技術には、標識
及び検出を目的としたプローブ核酸又は試料核酸いずれ
かの化学的変性が含まれる。核酸を化学的に変性するこ
とが必要なためにこの手法を実際に使用することは大幅
に制限されるが、これはこの手法が複雑なかつ費用のか
かる合成操作及び精製操作を含む大規模な標識化プロー
ブの調製又は標識化試料核酸の分析者によるイン・シチ
ュー（その場での）合成を必要とするからである。特に
、得られた標識化ポリヌクレオチドはその相補的試料又
はプローブと効率よ〈ハイブリダイズ（再結合）する能
力を保持していなければならない、かかる要求のために
、ハイブリダイゼーション試験に用いることを意図した
ポリヌクレオチドの標識変性のための有用な合成手段の
利用可能性は大幅に制限される。
及び検出を目的としたプローブ核酸又は試料核酸いずれ
かの化学的変性が含まれる。核酸を化学的に変性するこ
とが必要なためにこの手法を実際に使用することは大幅
に制限されるが、これはこの手法が複雑なかつ費用のか
かる合成操作及び精製操作を含む大規模な標識化プロー
ブの調製又は標識化試料核酸の分析者によるイン・シチ
ュー（その場での）合成を必要とするからである。特に
、得られた標識化ポリヌクレオチドはその相補的試料又
はプローブと効率よ〈ハイブリダイズ（再結合）する能
力を保持していなければならない、かかる要求のために
、ハイブリダイゼーション試験に用いることを意図した
ポリヌクレオチドの標識変性のための有用な合成手段の
利用可能性は大幅に制限される。
初期のハイブリダイゼーション手法には３Ｈ１３２ｐ及
び１２５ Ｈのような放射性標識が使用されていた。標
識化プローブは放射性物質で標識化されたヌクレオチド
類及びポリヌクレオチドからニック・トランスレーショ
ン、末端標識、第二鎖合成、逆転写、及び転写のような
手法により酵素の働きにより合成される。従って、かか
る酵素的方法において更に要求されることは変性又は標
識化ヌクレオチド類が標識化ポリヌクレオチドのアセン
ブリに含まれるポリメラーゼ酵素のための効果的な基質
として働かなければならないということである。ポリヌ
クレオチドを直接に化学変性させることも可能であるが
、しかしかかる方法は通常ポリヌクレオチドへ標識を組
み込むのに極めて非効率的であり、しかもポリヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションを行う能力に影響を与え
ることがある。
び１２５ Ｈのような放射性標識が使用されていた。標
識化プローブは放射性物質で標識化されたヌクレオチド
類及びポリヌクレオチドからニック・トランスレーショ
ン、末端標識、第二鎖合成、逆転写、及び転写のような
手法により酵素の働きにより合成される。従って、かか
る酵素的方法において更に要求されることは変性又は標
識化ヌクレオチド類が標識化ポリヌクレオチドのアセン
ブリに含まれるポリメラーゼ酵素のための効果的な基質
として働かなければならないということである。ポリヌ
クレオチドを直接に化学変性させることも可能であるが
、しかしかかる方法は通常ポリヌクレオチドへ標識を組
み込むのに極めて非効率的であり、しかもポリヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションを行う能力に影響を与え
ることがある。
放射性標識物質は取り扱い及び貯蔵上不利であるために
、有用な、非放射性同位元素による標識手段を開発する
ための多大な努力が継続的に行われている。かかる標識
としては、蛍光性物質及び化学発光性物質のような発光
性分子、並びに結合相手と特異的に結合することができ
、この結合相手は次に蛍光性物質及び酵素のような検出
可能な化学基で標識されているようなリガンド分子が含
まれる。リガンド標識の例としては、抗体類と特異的に
結合するハプテン類があり、及びそれに対する特異的結
合蛋白質が存在する他の小型分子、例えば、アビジンと
結合するビオチンがある。
、有用な、非放射性同位元素による標識手段を開発する
ための多大な努力が継続的に行われている。かかる標識
としては、蛍光性物質及び化学発光性物質のような発光
性分子、並びに結合相手と特異的に結合することができ
、この結合相手は次に蛍光性物質及び酵素のような検出
可能な化学基で標識されているようなリガンド分子が含
まれる。リガンド標識の例としては、抗体類と特異的に
結合するハプテン類があり、及びそれに対する特異的結
合蛋白質が存在する他の小型分子、例えば、アビジンと
結合するビオチンがある。
英国特許第２，０１９，４０８号には、チトクロームＣ
連結基を介してビオチンで標識化され、次いで酵素−標
識化アビジンにより検出可能なポリヌクレオチドプロー
ブが記載されている。ビオチンのような低分子量リガン
ドでプローブを標識化する別のアプローチはヨーロッパ
特許出願第６３．８７９号に記載されている。この手法
においては、５−アリルアミン−デオキシウリジントリ
ホスフェート（ｄＵＴＰ）！導体を所望のリガンド標識
と縮合せしめついでこのように変性されたヌクレオチド
を標準の酵素的方法により所望のプローブに組み込む。
連結基を介してビオチンで標識化され、次いで酵素−標
識化アビジンにより検出可能なポリヌクレオチドプロー
ブが記載されている。ビオチンのような低分子量リガン
ドでプローブを標識化する別のアプローチはヨーロッパ
特許出願第６３．８７９号に記載されている。この手法
においては、５−アリルアミン−デオキシウリジントリ
ホスフェート（ｄＵＴＰ）！導体を所望のリガンド標識
と縮合せしめついでこのように変性されたヌクレオチド
を標準の酵素的方法により所望のプローブに組み込む。
試料とプローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ション生成物として形成されたポリヌクレオチド２本鎖
体を直接検出し、それにより一方又は他方のポリヌクレ
オチドの化学的標識を行うことなしに済ませる方法が試
みられている。１本鎖ＤＮＡよりも２木釦ＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッドと選択的に結合する抗体の製造は成功し
ていない［パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）及びハロラン（）
ｌａｌｌｏｒａｎ）。
ション生成物として形成されたポリヌクレオチド２本鎖
体を直接検出し、それにより一方又は他方のポリヌクレ
オチドの化学的標識を行うことなしに済ませる方法が試
みられている。１本鎖ＤＮＡよりも２木釦ＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリッドと選択的に結合する抗体の製造は成功し
ていない［パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）及びハロラン（）
ｌａｌｌｏｒａｎ）。
“免疫学における核酸″（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）編集プレシア（Ｐｌｅｓ
ｃｉａ）及びブラウン（Ｂｒａｕｎ） 、スプリンガー
ーフェルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）
、 ニューヨーク（ＮＹ） （ｉ９８９）１８頁以下］
、ＤＮＡ−ＲＮＡ混合ハイブリットと結合し、１本鎖ポ
リヌクレオチドに対して親和性が低い抗体の産生におい
てはいくつかの成功例がある［ラドキン（Ｒｕｄｋｉｎ
）及びストーラー（Ｓｔｏｌｌｅｒ） 、 Ｎａｔｕｒ
ｅ２８５ ： ４７２ （ｉ９７７）；スチュアー）
（Ｓｔｕａｒｔ）等、ρＮＡＳ （ｔｌｓＡ） ７８
： ３７５１（ｉ１１８１）、レゾ４ （Ｒｅｄｄｙ）
及びソ７７− （Ｓａｆｅｒ）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 １０３ ：
９５９（ｉ９８１）、並びにナカザトＢｉｏｃｈｅｍ、
＋９ ： ２８３５（ｉ９８０）］ 。
ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）編集プレシア（Ｐｌｅｓ
ｃｉａ）及びブラウン（Ｂｒａｕｎ） 、スプリンガー
ーフェルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）
、 ニューヨーク（ＮＹ） （ｉ９８９）１８頁以下］
、ＤＮＡ−ＲＮＡ混合ハイブリットと結合し、１本鎖ポ
リヌクレオチドに対して親和性が低い抗体の産生におい
てはいくつかの成功例がある［ラドキン（Ｒｕｄｋｉｎ
）及びストーラー（Ｓｔｏｌｌｅｒ） 、 Ｎａｔｕｒ
ｅ２８５ ： ４７２ （ｉ９７７）；スチュアー）
（Ｓｔｕａｒｔ）等、ρＮＡＳ （ｔｌｓＡ） ７８
： ３７５１（ｉ１１８１）、レゾ４ （Ｒｅｄｄｙ）
及びソ７７− （Ｓａｆｅｒ）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 １０３ ：
９５９（ｉ９８１）、並びにナカザトＢｉｏｃｈｅｍ、
＋９ ： ２８３５（ｉ９８０）］ 。
ＤＮＡ″ＲＮＡハイブリッドに対する抗体が用いられる
文献記載の方法はすべて、通常イン・シチュー・ハイブ
リダイゼーション（ｉｎ ５ｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉａｎ）と呼ばれる手法に限定される・かかる手法に
おいては、通常は組織切片である試験試料からの全細胞
又はウィルス粒子を顕微鏡スライド上に固定し、核中の
ＤＮＡをエタノール、酢酸及び酵素類のような適切な試
薬で処理することにより遊離せしめる。遊離したＤＮＡ
は次にＲＮＡプローブとハイブリダイズし、ついでハイ
ブリッドは蛍光物質で標識化されたＤＮＡ・ＲＮＡに対
する抗体を用いる蛍光顕微鏡検査により検出される。細
胞ＤＮＡ又はウィルスＤＮＡは、スライドに固定された
ままに残されている種々の細胞要素又はウィルス要素に
非共有結合的に吸着されることにより、ある意味で顕微
鏡のスライド上に固定化されるようになる。イン会シチ
ュー・ハイブリダイゼーション手法が時間を要するしか
も信頼できないものであり、単一細胞について試験が行
われた場合にのみ有用であることは業界においては同大
の認めるところである（米国特許第４，４８３，９２０
号）、かかる方法に固有の細胞又はウィルスからの試料
ＤＮＡの固定化及び露出化における変動性及び非効率性
のために、その使用は定性分析に限定されている。
文献記載の方法はすべて、通常イン・シチュー・ハイブ
リダイゼーション（ｉｎ ５ｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉａｎ）と呼ばれる手法に限定される・かかる手法に
おいては、通常は組織切片である試験試料からの全細胞
又はウィルス粒子を顕微鏡スライド上に固定し、核中の
ＤＮＡをエタノール、酢酸及び酵素類のような適切な試
薬で処理することにより遊離せしめる。遊離したＤＮＡ
は次にＲＮＡプローブとハイブリダイズし、ついでハイ
ブリッドは蛍光物質で標識化されたＤＮＡ・ＲＮＡに対
する抗体を用いる蛍光顕微鏡検査により検出される。細
胞ＤＮＡ又はウィルスＤＮＡは、スライドに固定された
ままに残されている種々の細胞要素又はウィルス要素に
非共有結合的に吸着されることにより、ある意味で顕微
鏡のスライド上に固定化されるようになる。イン会シチ
ュー・ハイブリダイゼーション手法が時間を要するしか
も信頼できないものであり、単一細胞について試験が行
われた場合にのみ有用であることは業界においては同大
の認めるところである（米国特許第４，４８３，９２０
号）、かかる方法に固有の細胞又はウィルスからの試料
ＤＮＡの固定化及び露出化における変動性及び非効率性
のために、その使用は定性分析に限定されている。
他の典型的なハイブリダイゼーション試験においては、
少量の標識化プローブが、試料核酸類を固定化するのに
用いられる固相支持体に非特異的に結合する。この非特
異的に結合したプローブは、しばしばハイブリッド化プ
ローブの検出下限を決定するバックグラウンド信号を与
えることになる。パックグラウンド信号を許容しうる程
度に保持するための普通の方法はハイブリダイゼーショ
ン工程中のプローブ濃度を低く保つことである。しかし
ながらこの方法も又ハイブリダイゼーション速度を遅ら
せ試験時間を引き延ばすものである。
少量の標識化プローブが、試料核酸類を固定化するのに
用いられる固相支持体に非特異的に結合する。この非特
異的に結合したプローブは、しばしばハイブリッド化プ
ローブの検出下限を決定するバックグラウンド信号を与
えることになる。パックグラウンド信号を許容しうる程
度に保持するための普通の方法はハイブリダイゼーショ
ン工程中のプローブ濃度を低く保つことである。しかし
ながらこの方法も又ハイブリダイゼーション速度を遅ら
せ試験時間を引き延ばすものである。
従って、プローブ又は試料核酸類の標識を必要とせずし
かも効率のよい再現性のある固定化工程を提供するハイ
ブリダイゼーション法を開発する必要性がある。更にか
かる方法では種々の標識、特に非放射性同位元素型標識
が使用できるものであるべきである。又、より迅速なｌ
＼イブリゼーション動力学のために大過剰のプローブを
用いることができる方法が必要である。これら及び他の
点が本発明の目的である。
かも効率のよい再現性のある固定化工程を提供するハイ
ブリダイゼーション法を開発する必要性がある。更にか
かる方法では種々の標識、特に非放射性同位元素型標識
が使用できるものであるべきである。又、より迅速なｌ
＼イブリゼーション動力学のために大過剰のプローブを
用いることができる方法が必要である。これら及び他の
点が本発明の目的である。
他のタイプの核酸ハイブリダイゼーション試験における
Ｄ・ＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡハイブリッドに対
する抗体の使用については出願人の同時係属中の米国特
許出願第６６８．２５６号（ｉ９８４年１１月７日に出
願され、′抗ハイブリッド結合によるハイブリッドの固
定化を用いるハイブリダイゼーション試験”と標題がつ
けられている）及び第７０７．４２０号（ｉ９８５年３
月１日に出願され、′検出可能な抗−ハイブリッド抗体
を用いるハイブリダイゼーション試験”と標題がつけら
れている）に記載されている。
Ｄ・ＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡハイブリッドに対
する抗体の使用については出願人の同時係属中の米国特
許出願第６６８．２５６号（ｉ９８４年１１月７日に出
願され、′抗ハイブリッド結合によるハイブリッドの固
定化を用いるハイブリダイゼーション試験”と標題がつ
けられている）及び第７０７．４２０号（ｉ９８５年３
月１日に出願され、′検出可能な抗−ハイブリッド抗体
を用いるハイブリダイゼーション試験”と標題がつけら
れている）に記載されている。
試験試料、通常は生物学的液体に含まれるウィルス又は
細胞中の特定のポリヌクレオチド配列を測定するための
核酸ハイブリダイゼーション法が本発明により提供され
る。試験試料を処理して、測定対象の細胞又はウィルス
から、有意に検出可能な量の核酸を一本鎖の形で遊離せ
しめ、ついで上記１本鎖核酸を固相支持体上に固定化す
る。この固定化核酸を、測定すべき配列に対して実質的
に相補的な塩基配列を有する可溶性ポリヌクレオチドプ
ローブと接触させる。測定すべき配列がＲＮＡの場合は
プローブは実質的にＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、
上記配列がＤＮＡの場合にはプローブは実質的にＲＮＡ
で構成される。プローブと測定対象の配列間の／＼イブ
リダイゼーションは好適条件下で進行させる。得られた
ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはかか
るハイブリッドと選択的に結合する抗体試薬を添加し、
次にかかるハイブリッドと結合した抗体試薬を従来法、
例えば、標識化された抗体試薬を用いて測定することに
より検出する。
細胞中の特定のポリヌクレオチド配列を測定するための
核酸ハイブリダイゼーション法が本発明により提供され
る。試験試料を処理して、測定対象の細胞又はウィルス
から、有意に検出可能な量の核酸を一本鎖の形で遊離せ
しめ、ついで上記１本鎖核酸を固相支持体上に固定化す
る。この固定化核酸を、測定すべき配列に対して実質的
に相補的な塩基配列を有する可溶性ポリヌクレオチドプ
ローブと接触させる。測定すべき配列がＲＮＡの場合は
プローブは実質的にＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、
上記配列がＤＮＡの場合にはプローブは実質的にＲＮＡ
で構成される。プローブと測定対象の配列間の／＼イブ
リダイゼーションは好適条件下で進行させる。得られた
ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはかか
るハイブリッドと選択的に結合する抗体試薬を添加し、
次にかかるハイブリッドと結合した抗体試薬を従来法、
例えば、標識化された抗体試薬を用いて測定することに
より検出する。
本方法の主な特徴は、試料核酸が試料中の大部分の細胞
要素又はウィルス要素から遊離され分離されることであ
る。本方法においては、測定対象の試料核酸がもし二本
鎖ＤＮＡとして存在する場合には１本鎖型に変性せしめ
られる。１本鎖核酸は次に適切な固相支持体上に直接固
定化される。従って、固定化プロセスは全般に亘って、
従来技術のイン・シチュー手法に見られるように、細胞
又はウィルス構成要素への試料核酸の固定化とは別のも
のである。固定化支持体を適切に選択することにより、
効率のよい安定した試験要素を完成して、再現性のある
定量分析を行うことを可能にすることができる。
要素又はウィルス要素から遊離され分離されることであ
る。本方法においては、測定対象の試料核酸がもし二本
鎖ＤＮＡとして存在する場合には１本鎖型に変性せしめ
られる。１本鎖核酸は次に適切な固相支持体上に直接固
定化される。従って、固定化プロセスは全般に亘って、
従来技術のイン・シチュー手法に見られるように、細胞
又はウィルス構成要素への試料核酸の固定化とは別のも
のである。固定化支持体を適切に選択することにより、
効率のよい安定した試験要素を完成して、再現性のある
定量分析を行うことを可能にすることができる。
区社支１
本発明の固定化工程を行うには様々な物質及び工程を用
いることができる。試験試料が生物学的液体試料であろ
うと組織試料であろうと先ず試験試料を処理して、試料
中の細胞又はウィルスから遊離した核酸の水溶液又は水
性懸濁液を製造し、次に、生じた細胞破片又はウィルス
破片から先ず分離して又は分離せずに、上記溶液又は懸
濁液を所望の固定化支持体と接触させる。又は試料を適
切な支持体上に採集又は固定して、次に沈殿細胞又はウ
ィルスを処理して、支持体上への直接固定化のためにそ
れらの核酸を取り出し、続いて好ましくは洗浄して細胞
破片又はウィルス破片を除去することができる。
いることができる。試験試料が生物学的液体試料であろ
うと組織試料であろうと先ず試験試料を処理して、試料
中の細胞又はウィルスから遊離した核酸の水溶液又は水
性懸濁液を製造し、次に、生じた細胞破片又はウィルス
破片から先ず分離して又は分離せずに、上記溶液又は懸
濁液を所望の固定化支持体と接触させる。又は試料を適
切な支持体上に採集又は固定して、次に沈殿細胞又はウ
ィルスを処理して、支持体上への直接固定化のためにそ
れらの核酸を取り出し、続いて好ましくは洗浄して細胞
破片又はウィルス破片を除去することができる。
試験試料中のウィルス又は細胞の核酸を、有意に検出可
能な量Ｍ離せしめることはいくつかの方法で行うことが
できる０通常、これにはアルカリ、細胞溶解性酵素類、
及び／又はこの目的に有用な界面活性剤での処理が含ま
れる。０．１から１．０のモル濃度の水酸化ナトリウム
のようなアルカリ性条件が細菌からＤＮＡｔ−遊離せし
めるのに用いられており［ムーズリ□Ｉｏｓｅｌｙ）等
（ｉ９８２）、Ｊ、 Ｉｎｆ、 Ｄｉｓ、 １４５ ：
８８３参照］、この方法でも又固定化及びハイブリダ
イゼーションのためにＤＮＡが変性される。他の方法で
は、細菌をリゾチーム又はリゾスタフィンのような細胞
溶解性酵素に、続いてドデシル硫酸ナトリウム又はトラ
イトン（Ｔｒｉｔｏｎ）のような界面活性剤にさらす、
界面活性剤だけで細胞溶解されうる細菌もある。
能な量Ｍ離せしめることはいくつかの方法で行うことが
できる０通常、これにはアルカリ、細胞溶解性酵素類、
及び／又はこの目的に有用な界面活性剤での処理が含ま
れる。０．１から１．０のモル濃度の水酸化ナトリウム
のようなアルカリ性条件が細菌からＤＮＡｔ−遊離せし
めるのに用いられており［ムーズリ□Ｉｏｓｅｌｙ）等
（ｉ９８２）、Ｊ、 Ｉｎｆ、 Ｄｉｓ、 １４５ ：
８８３参照］、この方法でも又固定化及びハイブリダ
イゼーションのためにＤＮＡが変性される。他の方法で
は、細菌をリゾチーム又はリゾスタフィンのような細胞
溶解性酵素に、続いてドデシル硫酸ナトリウム又はトラ
イトン（Ｔｒｉｔｏｎ）のような界面活性剤にさらす、
界面活性剤だけで細胞溶解されうる細菌もある。
血液細胞、例えば、リンパ球はドデシル硫酸ナトリウム
のような界面活性剤にさらすことにより細胞溶解するこ
とができる０組織試料の場合は。
のような界面活性剤にさらすことにより細胞溶解するこ
とができる０組織試料の場合は。
プロテイナーゼにのような蛋白分解酵素又は界面活性剤
及び過塩素酸ナトリウムと組み合せた蛋白分解酵素で分
解することが望ましい［リザルジ（Ｌｉｚａｒｄｉ）及
びエンゲルバーブ（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ）（ｉ１１７９
）、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８８ ： １１８
］ 、更に、細胞の溶解産物（分解物）は、特に細胞
破片が核酸の固定化を妨害するならば、フェノール−ク
ロロホルムで抽出することが出来る。ブレッサー（Ｂｒ
ｅｓｇｅｒ）等（ｉ９８３）、ＤＮＡ ２：２４３は
細胞の溶解産物を熱ヨウ化ナトリウムで処理して核酸を
溶解させてニトロセルロースへの固定化を容易にする方
法を述べている。
及び過塩素酸ナトリウムと組み合せた蛋白分解酵素で分
解することが望ましい［リザルジ（Ｌｉｚａｒｄｉ）及
びエンゲルバーブ（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ）（ｉ１１７９
）、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ８８ ： １１８
］ 、更に、細胞の溶解産物（分解物）は、特に細胞
破片が核酸の固定化を妨害するならば、フェノール−ク
ロロホルムで抽出することが出来る。ブレッサー（Ｂｒ
ｅｓｇｅｒ）等（ｉ９８３）、ＤＮＡ ２：２４３は
細胞の溶解産物を熱ヨウ化ナトリウムで処理して核酸を
溶解させてニトロセルロースへの固定化を容易にする方
法を述べている。
ウィルス核酸類は、通常、ドデシル硫酸ナトリウムのよ
うな界面活性剤にさらすことにより被膜蛋白質から解離
させることができる［ヴイルターネン（Ｖｉｒｔａｎｅ
ｎ）等（ｉ９８３）、Ｌａｎｃｅｔ ３８１；テラモト
等（ｉ９８４）、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏ ２
０ ： ３７３ ］ 、望ましい場合には、蛋白分解酵
素での分解及びフェノールでの抽出も利用することがで
きる［ウィッチエンダム（Ｗｉｃｈｅｎｄｏｍ）等（ｉ
９Ｂ５）、Ｌａｎｃｅｔ ８５Ｌ核酸類は通常アルカリ
又は高温で変性されて固定化及びハイブリダイゼーショ
ンを容易にする。
うな界面活性剤にさらすことにより被膜蛋白質から解離
させることができる［ヴイルターネン（Ｖｉｒｔａｎｅ
ｎ）等（ｉ９８３）、Ｌａｎｃｅｔ ３８１；テラモト
等（ｉ９８４）、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏ ２
０ ： ３７３ ］ 、望ましい場合には、蛋白分解酵
素での分解及びフェノールでの抽出も利用することがで
きる［ウィッチエンダム（Ｗｉｃｈｅｎｄｏｍ）等（ｉ
９Ｂ５）、Ｌａｎｃｅｔ ８５Ｌ核酸類は通常アルカリ
又は高温で変性されて固定化及びハイブリダイゼーショ
ンを容易にする。
２本鎖ＲＮＡの変性には高温が好ましいが、２本鎖ＲＮ
Ａがアルカリにより破壊されるからである。
Ａがアルカリにより破壊されるからである。
鼠定進
上述したように、固定化工程は実際には遊離化処理、及
び場合によっては変性処理と同時に又はそれに続いて行
うことができる０本質的には利用できるものならばいず
れの方法も１本鎖試料核酸を固定化するのに用いること
ができる。普通は吸着法、共有結合法、及び二重ハイブ
リダイゼーション法から選択される。
び場合によっては変性処理と同時に又はそれに続いて行
うことができる０本質的には利用できるものならばいず
れの方法も１本鎖試料核酸を固定化するのに用いること
ができる。普通は吸着法、共有結合法、及び二重ハイブ
リダイゼーション法から選択される。
固相支持体は、微粒子、ビーズ、多孔性及び不透過性細
片、並びに膜、試験管及びマイクロタイター板のような
反応器の内面等をはじめとする様々な形状及び組成をと
ることができる。試料核酸を選ばれた固相支持体に付着
させる方法は、その分野の人にとっては当りまえの技術
の事柄となるであろう。
片、並びに膜、試験管及びマイクロタイター板のような
反応器の内面等をはじめとする様々な形状及び組成をと
ることができる。試料核酸を選ばれた固相支持体に付着
させる方法は、その分野の人にとっては当りまえの技術
の事柄となるであろう。
試料核酸をニトロセルロース膜へ吸着させる１つの方法
としては、核酸溶液をヨウ化ナトリウムで飽和させその
一部を膜ににじませるかろ過させる［ブＬ／、サー（Ｂ
ｒｅｓｓｅｒ）等（ｉ９８３）ＤＮＡ ２ ：２４３
］ 、ヨウ化ナトリウムは核酸の変性を容易にし膜への
吸着を助長する。あるいは核酸を通常１モル濃度付近の
濃度でグリオキサールで処理し、ついで膜に吸着させる
こともできる。この方法はＲＮＡには特に有利である。
としては、核酸溶液をヨウ化ナトリウムで飽和させその
一部を膜ににじませるかろ過させる［ブＬ／、サー（Ｂ
ｒｅｓｓｅｒ）等（ｉ９８３）ＤＮＡ ２ ：２４３
］ 、ヨウ化ナトリウムは核酸の変性を容易にし膜への
吸着を助長する。あるいは核酸を通常１モル濃度付近の
濃度でグリオキサールで処理し、ついで膜に吸着させる
こともできる。この方法はＲＮＡには特に有利である。
核酸はほぼ８０℃真空下で２〜４時間加熱することによ
り固定される［トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、 Ｐ、 Ｓ
、、 （ｉ９８３） Ｍａｔｈ、 ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
、 ｔｏｏ ： ２５５］ 。
り固定される［トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、 Ｐ、 Ｓ
、、 （ｉ９８３） Ｍａｔｈ、 ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
、 ｔｏｏ ： ２５５］ 。
核酸の共有結合固定化も又行うことができる。
広範囲の支持体材料及びカップリング技法を採用するこ
とができる０例えば、核酸を、カルボジイミド又はカル
ボニルジイミダゾールにより活性化されたホスフェート
基を介してホスホセルロースへカップリングさせること
ができる［バウツ（Ｂａｕｔｚ） 、 Ｅ、 Ｋ、 Ｆ
、及びホール（Ｈａｌｌ）、 Ｂ、 Ｄ。
とができる０例えば、核酸を、カルボジイミド又はカル
ボニルジイミダゾールにより活性化されたホスフェート
基を介してホスホセルロースへカップリングさせること
ができる［バウツ（Ｂａｕｔｚ） 、 Ｅ、 Ｋ、 Ｆ
、及びホール（Ｈａｌｌ）、 Ｂ、 Ｄ。
（ｉ９８２）、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１． Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ４８ ： ４
００−４０８ ； シー（Ｓｈｉｈ）、 Ｔ、 Ｙ、及
びマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）。
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ４８ ： ４
００−４０８ ； シー（Ｓｈｉｈ）、 Ｔ、 Ｙ、及
びマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）。
Ｍ、 Ａ、、 （ｉ９７４） Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ
、 １３ ： ３４１ｆ−３４１８］ 、
また］１ｍ−ジアゾベンゾイルオキシメチルセルロース
のジアゾ基はポリヌクレオチドのグアニン及びチミジン
残基と反応することができる［ノイエス（Ｎｏ７ｅｓ）
、 Ｂ、 Ｅ、及びスターク （Ｓ Ｌａｒｋ） ＋
Ｇ 、Ｒ−＋（ｉ９７５） Ｃｅ１ｌ ５ ： ３０１
−３１０；ライザー（Ｒｅｉｇｅｒ）。
、 １３ ： ３４１ｆ−３４１８］ 、
また］１ｍ−ジアゾベンゾイルオキシメチルセルロース
のジアゾ基はポリヌクレオチドのグアニン及びチミジン
残基と反応することができる［ノイエス（Ｎｏ７ｅｓ）
、 Ｂ、 Ｅ、及びスターク （Ｓ Ｌａｒｋ） ＋
Ｇ 、Ｒ−＋（ｉ９７５） Ｃｅ１ｌ ５ ： ３０１
−３１０；ライザー（Ｒｅｉｇｅｒ）。
Ｊ、 Ｓ、 （ｉ９７８） Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、 Ｂｉ
ａｐｂｙｓ、、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍ＋ａｕｎ。
ａｐｂｙｓ、、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍ＋ａｕｎ。
８５ ： １１０４−１１１２］ 、ポリサッカライド
支持体も。
支持体も。
ポリヌクレオチドの末端リン酸エステルと支持体ヒドロ
キシル基との間で水溶性カルボジイミド活性化によって
形成されたホスホジエステル結合を介してカップリング
させるか［リッチウッド（Ｒｉｃｈｖｏｏｄ）、 ０．
（＋９７２） Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ＢｉｏｐｈｙＳ、
Ａｃｔａ２８９ ： ４７−５０；ギルハム（Ｇｉｌ
ｈａｓ）、 Ｐ、 Ｔ、、 （ｉ９８８）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 ７ ： ２８０９−２８１３１ 、シアノーゲン
ブロミドで活性化された支持体とポリヌクレオチド上の
親核部位をカップリングさせることにより使用すること
ができる［アーントージョーヴイン（Ａｒｎｄｔ−Ｊｏ
ｖｉｎ）、 Ｄ、 Ｊ、ら、（ｉ９８５） Ｅｕｒ、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ。
キシル基との間で水溶性カルボジイミド活性化によって
形成されたホスホジエステル結合を介してカップリング
させるか［リッチウッド（Ｒｉｃｈｖｏｏｄ）、 ０．
（＋９７２） Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ＢｉｏｐｈｙＳ、
Ａｃｔａ２８９ ： ４７−５０；ギルハム（Ｇｉｌ
ｈａｓ）、 Ｐ、 Ｔ、、 （ｉ９８８）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 ７ ： ２８０９−２８１３１ 、シアノーゲン
ブロミドで活性化された支持体とポリヌクレオチド上の
親核部位をカップリングさせることにより使用すること
ができる［アーントージョーヴイン（Ａｒｎｄｔ−Ｊｏ
ｖｉｎ）、 Ｄ、 Ｊ、ら、（ｉ９８５） Ｅｕｒ、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ。
５４ ： ４１１−４１８．リンベルブ（Ｌｉｎｂｅｒ
ｇ）、 Ｕ、及びエリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）、
Ｓ、 （ｉ９７１） Ｅｕｒ、 Ｊ。
ｇ）、 Ｕ、及びエリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）、
Ｓ、 （ｉ９７１） Ｅｕｒ、 Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １８ ： ４７４−４７９ ］ 、
さらに、ＲＮＡの３′−ヒドロキシ末端を過ヨウ素酸で
酸化し、アミン又はヒドラジド基を有する支持体とシッ
フ残基を形成させることによりカップリングさせること
ができる［ギルハム（Ｇｉｌｈａｍ）、 Ｐ、 Ｔ、。
さらに、ＲＮＡの３′−ヒドロキシ末端を過ヨウ素酸で
酸化し、アミン又はヒドラジド基を有する支持体とシッ
フ残基を形成させることによりカップリングさせること
ができる［ギルハム（Ｇｉｌｈａｍ）、 Ｐ、 Ｔ、。
（ｉ９７１） Ｍｅｔｈｏｄ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ２
１ ： １９１−１９７； ハフスケ（）ｌａｎｓｋｋ
ｅ）、 Ｈ，Ｄ、ら、（ｉ９７９） Ｍｅｔｈｏｄ、
Ｅｎｚｙ＋ｎｏｌ。
１ ： １９１−１９７； ハフスケ（）ｌａｎｓｋｋ
ｅ）、 Ｈ，Ｄ、ら、（ｉ９７９） Ｍｅｔｈｏｄ、
Ｅｎｚｙ＋ｎｏｌ。
５９ ： １７２−１８１１ 、親核性部位を有する支
持体は、シアヌール酸と反応させ、次に、ポリヌクレオ
チドと反応せしめることができる［ハンガー（Ｈｕｎｇ
ｅｒ）、 Ｈ，Ｄ、 ら、（ｉ９８１） Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｓ、 ＢｉｏｐｈｙＳ。
持体は、シアヌール酸と反応させ、次に、ポリヌクレオ
チドと反応せしめることができる［ハンガー（Ｈｕｎｇ
ｅｒ）、 Ｈ，Ｄ、 ら、（ｉ９８１） Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｓ、 ＢｉｏｐｈｙＳ。
Ａｃｔａ ８５３ ： ３４４−３４９１゜ｆｌｇＩさ
れた一木鎖試料核酸を固定化するためのもう一つの方法
は、従来公知の二重ハイブリダイイー９．フ手法である
［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、８
５ ： ４８８ （ｉ９８８）及びＧｅｎｅ ２１ ：
７７−８６ （ｉ９８３）］かかる方法によれば、分
析対象物である配列の、第１プローブに関して相互に排
除し合う部分に対して相補的な塩基配列を有する第２プ
ローブを用いる。第２プローブを先に述べたいずれかの
技法又は任意の他の有用な技法を用い、測定すべき配列
とのハイブリダイゼーションにより固相支持体上に固定
化し、それにより、第１プローブとのハイブリダイゼー
ションにより検出するために測定すべき配列を固定化す
る。
れた一木鎖試料核酸を固定化するためのもう一つの方法
は、従来公知の二重ハイブリダイイー９．フ手法である
［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、８
５ ： ４８８ （ｉ９８８）及びＧｅｎｅ ２１ ：
７７−８６ （ｉ９８３）］かかる方法によれば、分
析対象物である配列の、第１プローブに関して相互に排
除し合う部分に対して相補的な塩基配列を有する第２プ
ローブを用いる。第２プローブを先に述べたいずれかの
技法又は任意の他の有用な技法を用い、測定すべき配列
とのハイブリダイゼーションにより固相支持体上に固定
化し、それにより、第１プローブとのハイブリダイゼー
ションにより検出するために測定すべき配列を固定化す
る。
二重ハイブリダイゼーション法の特殊な変形は、その３
’−ＯＨ末端にポリ（ｒＡ）テール（尾部）を有する真
核生物細胞からのメツセンジャ（伝令）ＲＮＡ （ｍＲ
ＮＡ）の測定に応用することができる。細胞溶解産物中
のボリアデニール化ＲＮＡは、固定化されたポリ（ｒＴ
）又はポリ（ｒＵ）にハイブリダイゼーションすること
により固定化することができる０次に、特定のＤＮＡプ
ローブは固定化ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションをお
こすことができ、もし相補性配列が存在すればＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドは標識化されたＤＮＡ・ＲＮＡ抗体
を用いて検出することができる。
’−ＯＨ末端にポリ（ｒＡ）テール（尾部）を有する真
核生物細胞からのメツセンジャ（伝令）ＲＮＡ （ｍＲ
ＮＡ）の測定に応用することができる。細胞溶解産物中
のボリアデニール化ＲＮＡは、固定化されたポリ（ｒＴ
）又はポリ（ｒＵ）にハイブリダイゼーションすること
により固定化することができる０次に、特定のＤＮＡプ
ローブは固定化ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションをお
こすことができ、もし相補性配列が存在すればＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッドは標識化されたＤＮＡ・ＲＮＡ抗体
を用いて検出することができる。
プローブ
プローブは、測定すべき配列に対して実質的に相補的な
少なくとも１個の１本鎖塩基配列からなるであろう、し
かしながら、かかる塩基配列は単一の連続的ポリヌクレ
オチド・セグメントである必要はなく、非相補的配列に
より遮断された２個以上の別々のセグメントからなって
いてもよい。これらの非ハイブリダイゼーション性配列
は線状であってもよく、又は自己相補性であってヘアピ
ンループを形成するものであってもよい。
少なくとも１個の１本鎖塩基配列からなるであろう、し
かしながら、かかる塩基配列は単一の連続的ポリヌクレ
オチド・セグメントである必要はなく、非相補的配列に
より遮断された２個以上の別々のセグメントからなって
いてもよい。これらの非ハイブリダイゼーション性配列
は線状であってもよく、又は自己相補性であってヘアピ
ンループを形成するものであってもよい。
更に、プローブの相補的部分域の側には３′−及び５′
−末端において非ハイブリダイゼーション性配列が位置
していてもよく、このような非ハイブリダイゼーション
性配列は、増殖のためにその中に相補的配列が挿入され
ているベクター（媒介体）のＤＮＡ又はＲＮＡからなる
ものである。
−末端において非ハイブリダイゼーション性配列が位置
していてもよく、このような非ハイブリダイゼーション
性配列は、増殖のためにその中に相補的配列が挿入され
ているベクター（媒介体）のＤＮＡ又はＲＮＡからなる
ものである。
いずれの場合も、分析試薬として与えられたものとして
のプローブは、１又はそれ以上の点で分析対象物である
試料核酸とハイブリダイゼーションを起して検出可能と
なるであろう、厳密に同族のセグメントが１本鎖形であ
りしかも試料ＤＮＡ又はＲＮＡとのハイブリダイゼーシ
ョンに利用可能であるという条件ならば、かつプローブ
と共に用いるために選択された抗体試薬がプローブ中の
２本鎖域と有意の交叉反応をおこさない（例えば。
のプローブは、１又はそれ以上の点で分析対象物である
試料核酸とハイブリダイゼーションを起して検出可能と
なるであろう、厳密に同族のセグメントが１本鎖形であ
りしかも試料ＤＮＡ又はＲＮＡとのハイブリダイゼーシ
ョンに利用可能であるという条件ならば、かつプローブ
と共に用いるために選択された抗体試薬がプローブ中の
２本鎖域と有意の交叉反応をおこさない（例えば。
抗体試薬がＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対して特異的
であり、プローブがＲＮＡ−ＲＮＡ２本鎖域からなる場
合、又はその反対）という条件ならば、線状又は環状１
木鎖ポリヌクレオチド類をプローブ要素として使用し、
大部分又は僅かな部分を相補的ポリヌクレオチド鎖と反
応させて２本鎖にすることができる。相補的プローブ配
列は、僅か１２個の塩基からｉｏ、ｏｏｏ個という多数
の塩基数の範囲までの好都合のもしくは望ましい長さの
ものならばいずれのものでもよく、約５０個以上の塩基
を有するオリゴヌクレオチド類も包含する。
であり、プローブがＲＮＡ−ＲＮＡ２本鎖域からなる場
合、又はその反対）という条件ならば、線状又は環状１
木鎖ポリヌクレオチド類をプローブ要素として使用し、
大部分又は僅かな部分を相補的ポリヌクレオチド鎖と反
応させて２本鎖にすることができる。相補的プローブ配
列は、僅か１２個の塩基からｉｏ、ｏｏｏ個という多数
の塩基数の範囲までの好都合のもしくは望ましい長さの
ものならばいずれのものでもよく、約５０個以上の塩基
を有するオリゴヌクレオチド類も包含する。
ＲＮＡ又はＤＮＡプローブは様々な常用法で得ることが
できる。例えば、ＲＮＡプローブの場合、ＲＮＡは細胞
の自然産物として、例えＩｆ・細菌からの５ｓ、１６ｓ
及び２３ｓリポソームＲＮＡ又は細胞転移ＲＮＡとして
単離することができる。メツセンジャーがそれに対して
コード（暗号化）している蛋白質を大量に産出するのに
特異的な細胞から特異的メツセンジャーＲＮＡを単離す
ることも実用的である。
できる。例えば、ＲＮＡプローブの場合、ＲＮＡは細胞
の自然産物として、例えＩｆ・細菌からの５ｓ、１６ｓ
及び２３ｓリポソームＲＮＡ又は細胞転移ＲＮＡとして
単離することができる。メツセンジャーがそれに対して
コード（暗号化）している蛋白質を大量に産出するのに
特異的な細胞から特異的メツセンジャーＲＮＡを単離す
ることも実用的である。
試験管内においてＲＮＡプローブ合成は、極めて活性な
サルモネラ・ナイフイム１ノウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ） 、バクテリアファージＳＰ６転写プロモータ［
グリーン（Ｇｒｅｅｎ）等（ｉ９８３）、 Ｃ，ａｌ１
３２ 、 ｅａＢを含有するベクターを用（Ａて行うこ
とができる。プロモーターに隣接する多数の化１限エン
ドヌクレアーゼ部位を有するベクタ−１１プロメガ番バ
イオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）、マデイソ
ン（Ｍａｄｉｓｏｎ） 、ライスコンシン（ＷＩ）、ア
メ１ツ力合衆国（ＵＳＡ）から入手できる。ＤＮＡプロ
ーブｉｆベクグーにクローン化され、これが次に細菌宿
主内で増殖する。クローン化ＤＮＡプローブの多数のＲ
ＮＡ複製は試験管内で、バクテリアファージＳＰ６から
のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するこ
とができる。
サルモネラ・ナイフイム１ノウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ
ｕｍ） 、バクテリアファージＳＰ６転写プロモータ［
グリーン（Ｇｒｅｅｎ）等（ｉ９８３）、 Ｃ，ａｌ１
３２ 、 ｅａＢを含有するベクターを用（Ａて行うこ
とができる。プロモーターに隣接する多数の化１限エン
ドヌクレアーゼ部位を有するベクタ−１１プロメガ番バ
イオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）、マデイソ
ン（Ｍａｄｉｓｏｎ） 、ライスコンシン（ＷＩ）、ア
メ１ツ力合衆国（ＵＳＡ）から入手できる。ＤＮＡプロ
ーブｉｆベクグーにクローン化され、これが次に細菌宿
主内で増殖する。クローン化ＤＮＡプローブの多数のＲ
ＮＡ複製は試験管内で、バクテリアファージＳＰ６から
のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するこ
とができる。
ＤＮＡプローブは様々な原料から製造することができる
。完全細菌ゲノムは、典型的に無菌の試料中の細菌を検
出するように意図されたハイブリダイゼーション試験の
ために固定化することができる。この試験によれば、リ
ポソームＲＮＡ及び転移ＲＮＡのような多数の細菌ＲＮ
Ａを検出することができるであろう、又は細菌ＲＮＡに
対して相補的な特異的ＤＮＡ配列を周知のプラスミド又
はウィルスベクターにクローン化しハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用いることができる。
。完全細菌ゲノムは、典型的に無菌の試料中の細菌を検
出するように意図されたハイブリダイゼーション試験の
ために固定化することができる。この試験によれば、リ
ポソームＲＮＡ及び転移ＲＮＡのような多数の細菌ＲＮ
Ａを検出することができるであろう、又は細菌ＲＮＡに
対して相補的な特異的ＤＮＡ配列を周知のプラスミド又
はウィルスベクターにクローン化しハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして用いることができる。
ここで゛’ＲＮＡプローブ及び“ＤＮＡプローブ°”と
いう表現を用いる際には、プローブに含まれるすべての
ヌクレオチドがリボヌクレオチド又は２′−デオキシリ
ボヌクレオチドであるということを意味している訳では
ないことを理解すべきである。
いう表現を用いる際には、プローブに含まれるすべての
ヌクレオチドがリボヌクレオチド又は２′−デオキシリ
ボヌクレオチドであるということを意味している訳では
ないことを理解すべきである。
本発明の目的に適ったＲＮＡ又はＤＮＡの基本的な特徴
は、ハイブリッドを形成する個々の１本鎖と分析上有意
な程度までには交叉反応を行わないＲＮＡ又はＤＮＡか
らなるＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ −ＲＮＡハイブリッ
ドに対する抗体を刺激することができるような特徴をも
つことである。
は、ハイブリッドを形成する個々の１本鎖と分析上有意
な程度までには交叉反応を行わないＲＮＡ又はＤＮＡか
らなるＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ −ＲＮＡハイブリッ
ドに対する抗体を刺激することができるような特徴をも
つことである。
従って、本試験を実施するのに必要な抗体結合特性が実
質的程度まで維持されるならば、プローブに含まれるヌ
クレオチド上の２′−位の１又はそれ以上を化学的に変
性することができる。同様に、かかる制限された２′−
デオキシ変性に加えて、もしくはその代りに、プローブ
は一般に、２本鎖ハイブリダイゼーション生成物に対す
る抗体の特異性がその個々の１本鎖に比較して実質的な
妨害がないならば、リポースホスフェート骨格に沿って
任意の他の変性を有することができる。
質的程度まで維持されるならば、プローブに含まれるヌ
クレオチド上の２′−位の１又はそれ以上を化学的に変
性することができる。同様に、かかる制限された２′−
デオキシ変性に加えて、もしくはその代りに、プローブ
は一般に、２本鎖ハイブリダイゼーション生成物に対す
る抗体の特異性がその個々の１本鎖に比較して実質的な
妨害がないならば、リポースホスフェート骨格に沿って
任意の他の変性を有することができる。
かかる変性がＲＮＡ又はＤＮＡプローブ中に存在する場
合は、抗体試薬を産生ずるのに用いられるイムノゲンは
、実質的には相当する変性を有する１本鎖からなること
が好ましいであろうし、他の鎖は、試ＮＲＮＡ又はＤＮ
Ａの検出が意図されているかどうか次第で、実質的には
非変性ＲＮＡ又はＤＮＡである。好ましくは、イムノダ
ン中の変性類はＲＮＡ又はＤＮＡプローブ中の変性類と
同一であろう。イムノゲンの例としてはハイブリッドポ
リ（２’−ｏ−メチルアデニル酸）・ポリ（２′−デオ
キシチミジル酸）である。他のものとしてはポリ（２′
−ｏ−エチリノシニックアシッド）・ポリ（リポシチジ
ルｍ）もあるであろう。次は、変性プローブに含まれう
る変性ヌクレオチドの更に別の例である：２′−ｏ−メ
チルリボヌクレオチド、２′−〇−エチルリボヌクレオ
チド、２′−アジドデオキシリボヌクレオチド、２′−
クロロデオキシリボヌクレオチド、２′−〇−７セチル
リポヌクレオチド、及びリボヌクレオチド類又はデオキ
シリボヌクレオチド類のホスホロチオレート類又はメチ
ルホスホネート類、変性ヌクレオチド類は、鋳型からの
プローブの酵素性合成の際の導入の結果としてプローブ
に現われることがある０例えば、アゾ／シン５′−ｏ−
（ｉ−チオトリホスフェート）（ＡＴＰαＳ）及びｄＡ
ＴＰαＳはそれぞれＲＮＡポリメラーゼ依存ＤＮＡ及び
ＤＮＡポリメラーゼの基質である。又は化学変性はプロ
ーブが産生された後に導入することもできる０例えば、
ＲＮＡプローブを無水酢酸で緩和な条件下で水性溶媒中
で２”−ｏ−アセチル化を行うことができる［ステワー
ド（Ｓｔｅｗａｒｄ）Ｄ、 Ｌ。
合は、抗体試薬を産生ずるのに用いられるイムノゲンは
、実質的には相当する変性を有する１本鎖からなること
が好ましいであろうし、他の鎖は、試ＮＲＮＡ又はＤＮ
Ａの検出が意図されているかどうか次第で、実質的には
非変性ＲＮＡ又はＤＮＡである。好ましくは、イムノダ
ン中の変性類はＲＮＡ又はＤＮＡプローブ中の変性類と
同一であろう。イムノゲンの例としてはハイブリッドポ
リ（２’−ｏ−メチルアデニル酸）・ポリ（２′−デオ
キシチミジル酸）である。他のものとしてはポリ（２′
−ｏ−エチリノシニックアシッド）・ポリ（リポシチジ
ルｍ）もあるであろう。次は、変性プローブに含まれう
る変性ヌクレオチドの更に別の例である：２′−ｏ−メ
チルリボヌクレオチド、２′−〇−エチルリボヌクレオ
チド、２′−アジドデオキシリボヌクレオチド、２′−
クロロデオキシリボヌクレオチド、２′−〇−７セチル
リポヌクレオチド、及びリボヌクレオチド類又はデオキ
シリボヌクレオチド類のホスホロチオレート類又はメチ
ルホスホネート類、変性ヌクレオチド類は、鋳型からの
プローブの酵素性合成の際の導入の結果としてプローブ
に現われることがある０例えば、アゾ／シン５′−ｏ−
（ｉ−チオトリホスフェート）（ＡＴＰαＳ）及びｄＡ
ＴＰαＳはそれぞれＲＮＡポリメラーゼ依存ＤＮＡ及び
ＤＮＡポリメラーゼの基質である。又は化学変性はプロ
ーブが産生された後に導入することもできる０例えば、
ＲＮＡプローブを無水酢酸で緩和な条件下で水性溶媒中
で２”−ｏ−アセチル化を行うことができる［ステワー
ド（Ｓｔｅｗａｒｄ）Ｄ、 Ｌ。
等、（ｉ９７２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ａｃｔａ ２８２：２２７ ］ 。
、 Ａｃｔａ ２８２：２２７ ］ 。
ここで用いるためのＲＮＡ又はＤＮＡプローブの重要な
性質は、相補的ＲＮＡ又はＤＮＡと二本鎖を形成してい
るプローブに対して産生された抗体が、望ましくは二本
錯形プローブと１本鎖核酸をそれらの結合性において区
別するであろうということである。試験混合物中のハイ
ブリッド化プローブを、非凸イブリッド化１本鎖形プロ
ーブ又は任意の非特異的に結合した１本鎖試料核酸への
有意のバックグラウト結合なしに検出することができる
のはこの性質のためである。上述したようにリボヌクレ
オチド又はデオキシリボヌクレオチド鎖に沿ったある種
の変性を、抗体が１本鎖から２本鎖を区別することがで
きなくなることなしに許容することはできるが、試料ポ
リヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮＡである場合には全体
がリボヌクレオチドで構成されているＲＮＡプローブを
用いることが通常好ましいであろう、ＤＮＡプローブは
試料がＲＮＡの場合に有利に用いることができる。
性質は、相補的ＲＮＡ又はＤＮＡと二本鎖を形成してい
るプローブに対して産生された抗体が、望ましくは二本
錯形プローブと１本鎖核酸をそれらの結合性において区
別するであろうということである。試験混合物中のハイ
ブリッド化プローブを、非凸イブリッド化１本鎖形プロ
ーブ又は任意の非特異的に結合した１本鎖試料核酸への
有意のバックグラウト結合なしに検出することができる
のはこの性質のためである。上述したようにリボヌクレ
オチド又はデオキシリボヌクレオチド鎖に沿ったある種
の変性を、抗体が１本鎖から２本鎖を区別することがで
きなくなることなしに許容することはできるが、試料ポ
リヌクレオチドがＲＮＡ又はＤＮＡである場合には全体
がリボヌクレオチドで構成されているＲＮＡプローブを
用いることが通常好ましいであろう、ＤＮＡプローブは
試料がＲＮＡの場合に有利に用いることができる。
一ハ ブリード ゛ び
本発明の抗体試薬は、プローブと相補的試料核酸類との
間に形成されたＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ −１？ＮＡ
ハイブリツドと結合し、１本鎖ポリヌクレオチド類を有
意に排除する能力により主に特徴づけられている。抗体
試薬は全抗体、抗体フラグメント、多官能性抗体凝集体
、又は一般に場合によってはＲＮＡ ＠ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ−ＲＮＡに対する抗体からの、ｌ又はそれ以上の特異
的結合部位からなる任意のものからなることができる。
間に形成されたＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ −１？ＮＡ
ハイブリツドと結合し、１本鎖ポリヌクレオチド類を有
意に排除する能力により主に特徴づけられている。抗体
試薬は全抗体、抗体フラグメント、多官能性抗体凝集体
、又は一般に場合によってはＲＮＡ ＠ＲＮＡ又はＤＮ
Ａ−ＲＮＡに対する抗体からの、ｌ又はそれ以上の特異
的結合部位からなる任意のものからなることができる。
全抗体の形態の場合は、公知の免疫グロブリン類、例え
ば、ＩｇＧ、ＩｇＭ等の任意のクラス又はサブクラスに
属することができる。ハイブリダイズされたプローブに
対しての特異的結合親和力を保持している任意のかかる
抗体のいずれのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ （
ａｂ ”）、及びＦ（ａｂ’）２として従来公知のＩｇ
Ｇフラグメントも文月いることができる。更に、適切な
場合には、免疫グロブリン又はそれらのフラグメントの
凝集体、ポリマー、誘導体及び複合体を用いることがで
きる。
ば、ＩｇＧ、ＩｇＭ等の任意のクラス又はサブクラスに
属することができる。ハイブリダイズされたプローブに
対しての特異的結合親和力を保持している任意のかかる
抗体のいずれのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ （
ａｂ ”）、及びＦ（ａｂ’）２として従来公知のＩｇ
Ｇフラグメントも文月いることができる。更に、適切な
場合には、免疫グロブリン又はそれらのフラグメントの
凝集体、ポリマー、誘導体及び複合体を用いることがで
きる。
抗体試薬のための免疫グロブリン源は常用の抗血清及び
モノクローン手法のような任意の利用可能な方法で得る
ことができる。抗血清は、動物、例えば、マウス、ラビ
ット、モルモット又はヤギの適切な免疫原による免疫化
を含むしっかりと確立された手法により得ることができ
る。免疫グロブリン類はまた体細胞ハイブリダイゼーシ
ョン手法によっても得ることができ、その結果、また適
切な免疫原を使用してモノクローン抗体と通常呼ばれる
ものが得られる。
モノクローン手法のような任意の利用可能な方法で得る
ことができる。抗血清は、動物、例えば、マウス、ラビ
ット、モルモット又はヤギの適切な免疫原による免疫化
を含むしっかりと確立された手法により得ることができ
る。免疫グロブリン類はまた体細胞ハイブリダイゼーシ
ョン手法によっても得ることができ、その結果、また適
切な免疫原を使用してモノクローン抗体と通常呼ばれる
ものが得られる。
Ｉ）ＮＡ＠ＲＮＡハイブリッドに対して特異的な抗体を
刺激するための免疫原は、ホモポリマー性又はヘテロポ
リマー性ポリヌクレオチド二本鎖体からなることができ
る。ホモポリマー性２本鎖体として可能なもののうちで
は、ポリ（ｒＡ）・ポリ（ｄＴ）が特に好ましい［キタ
ガヮ及びスト ラ − （Ｓｔｏｌｌａｒ） （ｉ９
８２） 、 Ｍｏ１． Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １９
：４１３ ］ 、 Ｌかしながら、一般には、ヘテロ
ポリマー性２本鎖体が好ましく用いられ、ＲＮＡポリメ
ラーゼでのφｘ１７４ピリオンＤＮＡの転写をはじめと
する種々の方法で製造することができる［ナカザト（ｉ
９８０）、 Ｂｉｏｃｈｅ履、 １９ ： ２８３５］
−選択されたＲＮＡ−ＤＮＡ二木二律鎖体チル化蛋白質
に吸着するか、さもなければ常用の免疫原性担体物質、
例えば、仔ウシ血清アルブミンに連結し、望ましい宿主
動物に注入される［ストラー（Ｓｔｏｌｌａｒ） （ｉ
９８９）、 Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ７０ ：
７０参照］。
刺激するための免疫原は、ホモポリマー性又はヘテロポ
リマー性ポリヌクレオチド二本鎖体からなることができ
る。ホモポリマー性２本鎖体として可能なもののうちで
は、ポリ（ｒＡ）・ポリ（ｄＴ）が特に好ましい［キタ
ガヮ及びスト ラ − （Ｓｔｏｌｌａｒ） （ｉ９
８２） 、 Ｍｏ１． Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １９
：４１３ ］ 、 Ｌかしながら、一般には、ヘテロ
ポリマー性２本鎖体が好ましく用いられ、ＲＮＡポリメ
ラーゼでのφｘ１７４ピリオンＤＮＡの転写をはじめと
する種々の方法で製造することができる［ナカザト（ｉ
９８０）、 Ｂｉｏｃｈｅ履、 １９ ： ２８３５］
−選択されたＲＮＡ−ＤＮＡ二木二律鎖体チル化蛋白質
に吸着するか、さもなければ常用の免疫原性担体物質、
例えば、仔ウシ血清アルブミンに連結し、望ましい宿主
動物に注入される［ストラー（Ｓｔｏｌｌａｒ） （ｉ
９８９）、 Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ７０ ：
７０参照］。
ＲＮＡ −ＲＮＡ二本鎖体に対する抗体は、レオウィル
ス又はとりわけサトウキビに感染するフィシ（Ｆｉｊｉ
）疾患ウィルスのようなウィルス類からの２木鎖ＲＮＡ
に対して産生ずることができる。
ス又はとりわけサトウキビに感染するフィシ（Ｆｉｊｉ
）疾患ウィルスのようなウィルス類からの２木鎖ＲＮＡ
に対して産生ずることができる。
又、ホモポリマー性２本鎖体１例えば、とりわけポリ（
ｒＩ）・ポリ（ｒＣ）又はポリ（ｒＡ）１１ポリ（ｒＵ
）を上述のように免疫化に用いることができる。
ｒＩ）・ポリ（ｒＣ）又はポリ（ｒＡ）１１ポリ（ｒＵ
）を上述のように免疫化に用いることができる。
本発明によるハイブリダイズ化されたプローブ２本鎖体
への抗体試薬の結合は任意の常用法により検出すること
ができる。抗体試薬それ自身を検出可能な化学基で標識
化するのが有利であろう、かかる検出可能な化学基は検
出可能な物理的、化学的性質を有するいずれの物質であ
ってもよい、かかる物質は免疫試験の分野においては高
度に開発されてきており、一般にはかかる方法において
有用な任意の標識のほとんどは本発明に適用することが
できる。特に有用なものは酵素的に活性な基であり、例
えば、酵素類［Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｗ、 （ｌｌ１７Ｂ
） ２２ ： １２４３、米国再発行特許第３１．００
６号及び英国特許１，０１９，４０８号参照］ ；酵素
基質類［米国特許第４，４９２，７５１号参照］；共同
因子（コファクター）類［米国特許第４．２３０，７９
７号及び４，２３８，５６５号参照］ ；及び酵素阻害
剤［米国特許第４．１３４，７９２号参照］ ；蛍光体
類［Ｃｌ１ｎ。
への抗体試薬の結合は任意の常用法により検出すること
ができる。抗体試薬それ自身を検出可能な化学基で標識
化するのが有利であろう、かかる検出可能な化学基は検
出可能な物理的、化学的性質を有するいずれの物質であ
ってもよい、かかる物質は免疫試験の分野においては高
度に開発されてきており、一般にはかかる方法において
有用な任意の標識のほとんどは本発明に適用することが
できる。特に有用なものは酵素的に活性な基であり、例
えば、酵素類［Ｃｌ１ｎ、 Ｃｈｅｗ、 （ｌｌ１７Ｂ
） ２２ ： １２４３、米国再発行特許第３１．００
６号及び英国特許１，０１９，４０８号参照］ ；酵素
基質類［米国特許第４，４９２，７５１号参照］；共同
因子（コファクター）類［米国特許第４．２３０，７９
７号及び４，２３８，５６５号参照］ ；及び酵素阻害
剤［米国特許第４．１３４，７９２号参照］ ；蛍光体
類［Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｅｍ、 （ｉ１７９） ２５ ： ３５３参照］
：発色団類；化学ルミネッサー類及びパイオルミネッサ
ー類のようなルミネッサ−［米国特許第４，３８０，５
８０号参照］ ：ビオチン［ヨーロッパ特許明細書６３
．８７９号参照］又はハプテン［ＰＣＴ Ｐｕｂｌ。
：発色団類；化学ルミネッサー類及びパイオルミネッサ
ー類のようなルミネッサ−［米国特許第４，３８０，５
８０号参照］ ：ビオチン［ヨーロッパ特許明細書６３
．８７９号参照］又はハプテン［ＰＣＴ Ｐｕｂｌ。
８３−２２８６参照］のような特異的に結合しうるリガ
ンド類、３Ｈ１３５Ｓ、３２ｐ、 １２５１．及び１
４（のような放射性同位元素類である。かかる標識及び
標識対はそれら自身の物理的性質（例えば、蛍光体類、
発色団類及び放射性同位元素類）又はそれらの反応性も
しくは結合性（例えば、酵素類、基質類、共同因子類及
び阻害剤類）に基づいて検出゛される８例えば、共同因
子−標識化抗体は、標識がそれに対して共同因子である
ような酵素及びその酵素の基質を添加することにより検
出することができる。ハプテン又はリガンド（例えば、
ビオチン）で標識化された抗体は、検出可能な分子を付
加された、リガンドと結合する、ハプテン又は蛋白質（
例えば、アビジン）に対する抗体を添加することにより
検出することができる。かかる検出可能な分子は測定可
能な物理的性質（例えば、蛍光又は吸光度）を有するあ
る分子、又は酵素反応における関与物（例えば、上記リ
スト参照）であってもよい６例えば、基質に作用して測
定しうる物理的性質を有する生成物を生じる酵素を使用
することができる。後者の例としては、それに限定され
る訳ではないが、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ及びペルオキシダーゼが挙げられる。他の
標識法は通常の当業者には明らかであろう。
ンド類、３Ｈ１３５Ｓ、３２ｐ、 １２５１．及び１
４（のような放射性同位元素類である。かかる標識及び
標識対はそれら自身の物理的性質（例えば、蛍光体類、
発色団類及び放射性同位元素類）又はそれらの反応性も
しくは結合性（例えば、酵素類、基質類、共同因子類及
び阻害剤類）に基づいて検出゛される８例えば、共同因
子−標識化抗体は、標識がそれに対して共同因子である
ような酵素及びその酵素の基質を添加することにより検
出することができる。ハプテン又はリガンド（例えば、
ビオチン）で標識化された抗体は、検出可能な分子を付
加された、リガンドと結合する、ハプテン又は蛋白質（
例えば、アビジン）に対する抗体を添加することにより
検出することができる。かかる検出可能な分子は測定可
能な物理的性質（例えば、蛍光又は吸光度）を有するあ
る分子、又は酵素反応における関与物（例えば、上記リ
スト参照）であってもよい６例えば、基質に作用して測
定しうる物理的性質を有する生成物を生じる酵素を使用
することができる。後者の例としては、それに限定され
る訳ではないが、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ及びペルオキシダーゼが挙げられる。他の
標識法は通常の当業者には明らかであろう。
また、抗体試薬をそれ自身の抗原性のような本来の性質
に基づいて検出することができる。
に基づいて検出することができる。
標識化抗−（抗体）抗体は、第２抗体のための標識が上
記のような標識である場合第１抗体試薬と結合するであ
ろう、更に、抗体は補体固定又は標識化蛋白質Ａ、並び
に抗体を検出するための従来公知の他の方法を用いて検
出することができる。
記のような標識である場合第１抗体試薬と結合するであ
ろう、更に、抗体は補体固定又は標識化蛋白質Ａ、並び
に抗体を検出するための従来公知の他の方法を用いて検
出することができる。
好ましい場合に、抗体試薬が、標識化されている場合、
標識部分と抗体試薬は、共有結合を含むような直接化学
連結により、又は標識をマイクロカプセルもしくはリポ
ソームに包含させ、次に抗体に連結させるような直接で
はない連結により。
標識部分と抗体試薬は、共有結合を含むような直接化学
連結により、又は標識をマイクロカプセルもしくはリポ
ソームに包含させ、次に抗体に連結させるような直接で
はない連結により。
互いに結合もしくは連結する。標識手法は当業界には周
知であり、いずれの常用法も本発明に使用することがで
きる。
知であり、いずれの常用法も本発明に使用することがで
きる。
区瓦Ｊ［１肋
試験すべき試験試料は興味の対象となる媒体ならいずれ
のものでもよく、通常は医学上、獣医学上、環境上、栄
養学上、又は工業上重要な液体試料であろう、特に、尿
、血液（血清又はプラスマ）、ミルク、脳を髄液、痰、
糞便物、肺吸引物、喉スワブ（綿棒で集められたもの）
、生殖器スワブ及び滲出液、直腸スワブ、並びに鼻咽頭
吸引物をはじめとするヒト及び動物の検体及び体液を本
方法により試験することができる。
のものでもよく、通常は医学上、獣医学上、環境上、栄
養学上、又は工業上重要な液体試料であろう、特に、尿
、血液（血清又はプラスマ）、ミルク、脳を髄液、痰、
糞便物、肺吸引物、喉スワブ（綿棒で集められたもの）
、生殖器スワブ及び滲出液、直腸スワブ、並びに鼻咽頭
吸引物をはじめとするヒト及び動物の検体及び体液を本
方法により試験することができる。
従来公知のように１種々のハイブリダイゼーション条件
を本試験に用いることができる。典型的には、ハイブリ
ダイゼーションは、僅かに昇温された温度１例えば、約
３５ないし７５℃で通常には６５°Ｃ付近で、約６ない
し８のＰＨで、適切なイオン強度［例えば、２ＸＳＳＣ
、、Ｚ、：テＩ Ｘ５ＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム
及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（Ｐ）１７ 、０
） ］の緩衝液、仔ウシ血清アルブミンのような蛋白質
、フィニル（Ｆｉｃｏｌｌ） ［ファルマシアｅファイ
ン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）、ビスカタウェー（Ｐｉｓｃａｔａｖ
ａｙ）、ニューシャーシー（ＮＪ） 、アメリカ合衆国
（ＵＳＡ）により市販されているサッカロース及びエビ
グロロヒドリンの共重合体を示す登録商標］、ポリビニ
ルピロリドン、例えば、子牛の胸腺又はサケの精液から
の変性異質ＤＮＡからなる溶液中で進行するであろう。
を本試験に用いることができる。典型的には、ハイブリ
ダイゼーションは、僅かに昇温された温度１例えば、約
３５ないし７５℃で通常には６５°Ｃ付近で、約６ない
し８のＰＨで、適切なイオン強度［例えば、２ＸＳＳＣ
、、Ｚ、：テＩ Ｘ５ＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム
及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム（Ｐ）１７ 、０
） ］の緩衝液、仔ウシ血清アルブミンのような蛋白質
、フィニル（Ｆｉｃｏｌｌ） ［ファルマシアｅファイ
ン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）、ビスカタウェー（Ｐｉｓｃａｔａｖ
ａｙ）、ニューシャーシー（ＮＪ） 、アメリカ合衆国
（ＵＳＡ）により市販されているサッカロース及びエビ
グロロヒドリンの共重合体を示す登録商標］、ポリビニ
ルピロリドン、例えば、子牛の胸腺又はサケの精液から
の変性異質ＤＮＡからなる溶液中で進行するであろう。
ハイブリダイゼーションがおこるのに必要な、試料とプ
ローブ鎖との相補性の程度は、従来知られているような
条件の厳密性次第である。
ローブ鎖との相補性の程度は、従来知られているような
条件の厳密性次第である。
普通には、ハイブリダイゼーションのために選択された
温度条件は、形成ハイブリッドに対する抗体試薬の結合
及び標識応答の検出とは相入れないものであろう、従っ
て、抗体試薬結合工程及び標識検出工程はハイブリダイ
ゼーション工程の完了後に進行するであろう。反応混合
物を普通、約３０℃から約４０℃の温度範囲に持ってい
き次に結合及び検出工程を行う。
温度条件は、形成ハイブリッドに対する抗体試薬の結合
及び標識応答の検出とは相入れないものであろう、従っ
て、抗体試薬結合工程及び標識検出工程はハイブリダイ
ゼーション工程の完了後に進行するであろう。反応混合
物を普通、約３０℃から約４０℃の温度範囲に持ってい
き次に結合及び検出工程を行う。
ＲＮＡプローブを用いる特定の試験状況においては、プ
ローブはホスホジエステル結合のアルカリ加水分解によ
り、又はリボヌクレアーゼの存在により部分崩壊を受け
やすいということが見出されるかもしれない、前者の場
合は、プローブを約１０より高いＰＨに露出しないよう
にすることにより加水分解を抑制することができる。ド
デシル硫酸ナトリウム、オーリントリカルボン酸、リボ
ヌクレオチド争バナジル複合体、ヘパリン、ジエチルビ
ロカルポネーｈのような物質、及び哺乳動物源から単離
された蛋白性阻害物によりリボヌクレアーゼは効果的に
阻害されうる。
ローブはホスホジエステル結合のアルカリ加水分解によ
り、又はリボヌクレアーゼの存在により部分崩壊を受け
やすいということが見出されるかもしれない、前者の場
合は、プローブを約１０より高いＰＨに露出しないよう
にすることにより加水分解を抑制することができる。ド
デシル硫酸ナトリウム、オーリントリカルボン酸、リボ
ヌクレオチド争バナジル複合体、ヘパリン、ジエチルビ
ロカルポネーｈのような物質、及び哺乳動物源から単離
された蛋白性阻害物によりリボヌクレアーゼは効果的に
阻害されうる。
本発明を今や次の実施例により説明するがそれらにより
限定されるものではない。
限定されるものではない。
実施例工
尿中バクテリアの測定用バイブリダイゼーション試験
Ａ、メチル化チログロブリンの調製
仔ウシのチログロブリン（シグマ・ケミカル・カンパニ
ー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、）、セント
−）Ｉｙイス（Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ） 、 ミズーリ
（ＭＯ）、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）１１００ミリグラ
ムを無水メタノールｌｏｗ／及び２．５５Ｍ ＨＣ立
メタノール液４００ルＬと合せた。この混合物を回転ミ
キサーを用いて室温で５日間攪拌した。沈澱物を遠心分
離により採集し、メタノールで２回エタノールで２回洗
浄した。
ー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、）、セント
−）Ｉｙイス（Ｓｔ、 Ｌｏｕｉｓ） 、 ミズーリ
（ＭＯ）、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）１１００ミリグラ
ムを無水メタノールｌｏｗ／及び２．５５Ｍ ＨＣ立
メタノール液４００ルＬと合せた。この混合物を回転ミ
キサーを用いて室温で５日間攪拌した。沈澱物を遠心分
離により採集し、メタノールで２回エタノールで２回洗
浄した。
Ｂ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対する抗体の調製
ＤＮＡΦＲＮＡハイブリッドを、ナカザト［Ｂｉｏｃｈ
ｅｏ＋、 １９； ２８３５ （ｉ９８０） ］により
記載されているようにＲＮＡポリメラーゼによるφＸ１
７４ピリオンＤＮＡの転写により調製した。２０ｍＭ）
リスー塩醜塩緩衝液（ＰＨ７，４）２５０ルし中のハイ
ブリッド１５０マイクログラムＣｇｇ）、ｌｄ エチ
レンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を水２５０
＝ｔ、中のメチル化チログロブリンｌ ５０ ルｇと
合せた。沈澱が生じトリス−緩衝液中に懸濁した。この
混合物を同量のフロイントφアジュバントで乳化させた
。ＢＡＬＢ／Ｃマウスに１注射当りバイブリッド１０ｇ
、ｇの皮下注射を行って免疫化した。免疫化を１４日目
、２１日目、２８°日目及び３５日目に繰り返して行い
、試験血液を２３日目及び３７日目に採取した。ウェル
がＤＮＡ＠ＲＮＡｚ＜イブリッドで被覆されている、イ
ムノロン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ） ＩＩマイクロタイタ
ー板（ダイナチック（Ｄｙｎａ ｔｅｃｈ）、アレクサ
ンドリア（Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ）、ヴアージニア（Ｖ
Ａ） ）を用いる酵素免疫試験により、血清を抗体につ
いて滴定した。被覆は各ウェルに、５．Ｏ，ｇＤＮＡ・
ＲＮＡ／ｍＬを含有する０、０１５クエン酸ナトリウム
（ｐＨ６，８）、０．１５Ｍ Ｎ ａｃＪｌの１００
、Ｌを入れ、それを２時間室温で放置することにより
行った０次にこのウェルを２０ｍＭ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ７，４）、０．１５ＭＮａＣ１，５Ｉ１
ｇ仔ウシ崩清アルブミン／ｍＬ及び０．５％（Ｖ／Ｖ）
）ライ−ン（Ｔｗｅｅｎ） ２０を用いて３回洗浄し
た。
ｅｏ＋、 １９； ２８３５ （ｉ９８０） ］により
記載されているようにＲＮＡポリメラーゼによるφＸ１
７４ピリオンＤＮＡの転写により調製した。２０ｍＭ）
リスー塩醜塩緩衝液（ＰＨ７，４）２５０ルし中のハイ
ブリッド１５０マイクログラムＣｇｇ）、ｌｄ エチ
レンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を水２５０
＝ｔ、中のメチル化チログロブリンｌ ５０ ルｇと
合せた。沈澱が生じトリス−緩衝液中に懸濁した。この
混合物を同量のフロイントφアジュバントで乳化させた
。ＢＡＬＢ／Ｃマウスに１注射当りバイブリッド１０ｇ
、ｇの皮下注射を行って免疫化した。免疫化を１４日目
、２１日目、２８°日目及び３５日目に繰り返して行い
、試験血液を２３日目及び３７日目に採取した。ウェル
がＤＮＡ＠ＲＮＡｚ＜イブリッドで被覆されている、イ
ムノロン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ） ＩＩマイクロタイタ
ー板（ダイナチック（Ｄｙｎａ ｔｅｃｈ）、アレクサ
ンドリア（Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ）、ヴアージニア（Ｖ
Ａ） ）を用いる酵素免疫試験により、血清を抗体につ
いて滴定した。被覆は各ウェルに、５．Ｏ，ｇＤＮＡ・
ＲＮＡ／ｍＬを含有する０、０１５クエン酸ナトリウム
（ｐＨ６，８）、０．１５Ｍ Ｎ ａｃＪｌの１００
、Ｌを入れ、それを２時間室温で放置することにより
行った０次にこのウェルを２０ｍＭ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ７，４）、０．１５ＭＮａＣ１，５Ｉ１
ｇ仔ウシ崩清アルブミン／ｍＬ及び０．５％（Ｖ／Ｖ）
）ライ−ン（Ｔｗｅｅｎ） ２０を用いて３回洗浄し
た。
ＤＮＡ＠ＲＮＡに対しては高タイターを有するが１本鎖
ＤＮＡに対しては低タイターを有するマウスからの膵臓
をＳＰ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞を用いて融解し、得
られたハイブリドーマをスクリーンにかけてＤＮＡ−Ｒ
ＮＡに対して特異的な抗体を産生ずるものを得た［スチ
ュア−）（Ｓｔｕａｒｔ）等（ｉ９８１）、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＤＮＡに対しては低タイターを有するマウスからの膵臓
をＳＰ２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞を用いて融解し、得
られたハイブリドーマをスクリーンにかけてＤＮＡ−Ｒ
ＮＡに対して特異的な抗体を産生ずるものを得た［スチ
ュア−）（Ｓｔｕａｒｔ）等（ｉ９８１）、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ７８３７５１．ガル７ Ｌ／ （Ｇａｒｆｒｅ
）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ） （ｉ９８
１） 、 Ｍｅｔｈ、 ｉｎ Ｅｎｚ２ｍｏ１．７３゜
１］。特に好ましいハイブリドーマはＡＴＣＣＨＢ
８７３０としてアメリカ型培養収集（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
ｏ−ｔクビＬ／ （Ｒｏｃｈｖｉｌｌｅ） 、 ミズ
ーリ（ＭＯ）アメリカ合衆国（ＵＳＡ）により析出する
ものである。
）及びミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ） （ｉ９８
１） 、 Ｍｅｔｈ、 ｉｎ Ｅｎｚ２ｍｏ１．７３゜
１］。特に好ましいハイブリドーマはＡＴＣＣＨＢ
８７３０としてアメリカ型培養収集（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）
ｏ−ｔクビＬ／ （Ｒｏｃｈｖｉｌｌｅ） 、 ミズ
ーリ（ＭＯ）アメリカ合衆国（ＵＳＡ）により析出する
ものである。
クローン化ハイブリドーマはマウスの腹腔中で増殖して
大量の抗体を産生ずる。抗体は、アニオン−交換カラム
、ベーカーポンド（Ｂａｋｅ、ｒｂｏｎｄ）ＭＡｂτＸ
（ジェー・ティ一番ベーカ−（Ｊ、 Ｔ、 Ｂａｋｅｒ
）・リサーチ−プロダクツ、グレン・ニリン（ＧＩｅｎ
ｎＥＩＩｙｎ）、 イリノイ（ｉ１，）、アメリカ合衆
国（ＵＳＡ））を用いた高圧液体クロマトグラフィによ
り腹水液から精製される。＊水液は１０ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）中に透析され、遠心分離
にかけられて沈澱物を除去し、ついで０．２２．騰ニト
ロセルロースフィルターを通過させる。１から２ミリリ
ツトルの腹水液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６、８４）と平衡化されている１０１０Ｘ２５０アニオ
ン−交換カラムに施す、クロマトグラフィーは６０層ｉ
ｎの１０ｍＮリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ９、８５）か
ら８５ｍＮリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６、４０）まで
直線的に変化する展開液を用いてｌ 、 ＯｍＬ／ｌ１
ｉｎの流速で展開した。流出物の２５４ｎｘにおける吸
光度を監視してＩｇＧによるピークを採集した。
大量の抗体を産生ずる。抗体は、アニオン−交換カラム
、ベーカーポンド（Ｂａｋｅ、ｒｂｏｎｄ）ＭＡｂτＸ
（ジェー・ティ一番ベーカ−（Ｊ、 Ｔ、 Ｂａｋｅｒ
）・リサーチ−プロダクツ、グレン・ニリン（ＧＩｅｎ
ｎＥＩＩｙｎ）、 イリノイ（ｉ１，）、アメリカ合衆
国（ＵＳＡ））を用いた高圧液体クロマトグラフィによ
り腹水液から精製される。＊水液は１０ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）中に透析され、遠心分離
にかけられて沈澱物を除去し、ついで０．２２．騰ニト
ロセルロースフィルターを通過させる。１から２ミリリ
ツトルの腹水液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６、８４）と平衡化されている１０１０Ｘ２５０アニオ
ン−交換カラムに施す、クロマトグラフィーは６０層ｉ
ｎの１０ｍＮリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ９、８５）か
ら８５ｍＮリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６、４０）まで
直線的に変化する展開液を用いてｌ 、 ＯｍＬ／ｌ１
ｉｎの流速で展開した。流出物の２５４ｎｘにおける吸
光度を監視してＩｇＧによるピークを採集した。
Ｃ，ＤＮＡ−ＲＮＡに対する抗体のβ−ガラクトシダー
ゼによる標識化 精製された、ＤＮＡ−ＲＮＡに対する抗体を０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，２）を用いて一晩透
析し、形成された不溶物があれば遠心分離により除去し
た。ＩｇＧＩｏ、５ｍｇを含む３．３ｍＬ量をペプシン
（５ｍｇ／ｍＬ） ６４ ｐＬ と合せ３７°Ｃで１６
蒔間インキュベートした。２．０Ｍ トリス−塩基（Ｔ
ｒｉｓ−ｂａｓｅ） ０ 、５ｍＬを添加してｐ）ｌａ
、ｏとして分解を停止した。
ゼによる標識化 精製された、ＤＮＡ−ＲＮＡに対する抗体を０．１Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，２）を用いて一晩透
析し、形成された不溶物があれば遠心分離により除去し
た。ＩｇＧＩｏ、５ｍｇを含む３．３ｍＬ量をペプシン
（５ｍｇ／ｍＬ） ６４ ｐＬ と合せ３７°Ｃで１６
蒔間インキュベートした。２．０Ｍ トリス−塩基（Ｔ
ｒｉｓ−ｂａｓｅ） ０ 、５ｍＬを添加してｐ）ｌａ
、ｏとして分解を停止した。
分解消化物を圧力透析膜上で約０．５ｍＬまで濃縮し次
に１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
、０．１５Ｍ ＮａＣｕと平衡化しているセフ７クリ
ル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） −２００［ファルマシア（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の１１．４５５７ｃｍカラムで
クロマトグラフィにかけた。２．５ｍＬの画分を採集し
ついで２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。溶離した
第１ピーク、画分１７から２０をプールして（Ｆ ａ
ｂ’）ｚ ４ 、２ｍｇを得た。
に１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
、０．１５Ｍ ＮａＣｕと平衡化しているセフ７クリ
ル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） −２００［ファルマシア（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の１１．４５５７ｃｍカラムで
クロマトグラフィにかけた。２．５ｍＬの画分を採集し
ついで２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。溶離した
第１ピーク、画分１７から２０をプールして（Ｆ ａ
ｂ’）ｚ ４ 、２ｍｇを得た。
１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
、０．１５Ｍ ＮａＣＪｌ中の、イー１１コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ ）［シグマ会ケミカル・カンパニー（Ｓｉ
ｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、 ）、セント・ルイス
（ＳＬ、 Ｌｏｕｉｓ） 、 ミズーリ（ＭＯ）、ア
メリカ合衆国（ＵＳＡ） ］からの］β−ガラクトシダ
ーゼ８ａ＋を０．１Ｍ ジチオトレイトールと合せ、
２５°Ｃで４時間放置した。混合物を同じ緩衝液と平衡
化されたバイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ） Ｐ −８ＤＧ
［バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）研究所、リッチセント
（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリ７ｔルニア（ＧＡ） 、ア
メリカ合衆国（ＵＳＡ）ＩのｌＸ２５ｃ＋ｗカラム上で
クロマトグラフィにかけた０両分１ミリリツトルを採集
し、２８０ｎｍに吸光度を有する第１ピークにおいて酵
素を回収した。蛋白質を２ 、５＋＋＋ｌまで濃縮して
７．１ｍｇを得た。この酵素はエル−ｙ ７ （ＥＩ
Ｉｍａｎ）［エルマン（Ｅｌｌｍａｎ） （ｉ９５９）
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
、０．１５Ｍ ＮａＣＪｌ中の、イー１１コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ ）［シグマ会ケミカル・カンパニー（Ｓｉ
ｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、 ）、セント・ルイス
（ＳＬ、 Ｌｏｕｉｓ） 、 ミズーリ（ＭＯ）、ア
メリカ合衆国（ＵＳＡ） ］からの］β−ガラクトシダ
ーゼ８ａ＋を０．１Ｍ ジチオトレイトールと合せ、
２５°Ｃで４時間放置した。混合物を同じ緩衝液と平衡
化されたバイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ） Ｐ −８ＤＧ
［バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）研究所、リッチセント
（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリ７ｔルニア（ＧＡ） 、ア
メリカ合衆国（ＵＳＡ）ＩのｌＸ２５ｃ＋ｗカラム上で
クロマトグラフィにかけた０両分１ミリリツトルを採集
し、２８０ｎｍに吸光度を有する第１ピークにおいて酵
素を回収した。蛋白質を２ 、５＋＋＋ｌまで濃縮して
７．１ｍｇを得た。この酵素はエル−ｙ ７ （ＥＩ
Ｉｍａｎ）［エルマン（Ｅｌｌｍａｎ） （ｉ９５９）
Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ８２ ： ７０１の方法により測定
したところスルフヒドリル基１０．４を有する。
したところスルフヒドリル基１０．４を有する。
Ｎ 、Ｎ’−ｏ−フェニレンジでレインイミド［アルド
リッヒ・ケミカル・カンパニー（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｇｏ、） 、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ）、ライスコンシン（νｌ）、アメリカ合衆
国（ｔｌｓＡ）］の１８．２ｍＭ 溶液をジメチルホ
ルムアミド中に調製し、その１２１ＪＬＬを還元化β−
ガラクトシダーゼ（２、８ｍｇ／＋ａＬ） ２ 、１−
に添加した。この混合物を室温で１．０時間反応させ次
に上記バイオゲルＰ−６ＤＧカラム上でクロマトグラフ
ィにかけ、２８０ｎｍに吸光度を有する物質の第１溶離
ピークにおいて変性酵素を回収した。
リッヒ・ケミカル・カンパニー（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｇｏ、） 、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ）、ライスコンシン（νｌ）、アメリカ合衆
国（ｔｌｓＡ）］の１８．２ｍＭ 溶液をジメチルホ
ルムアミド中に調製し、その１２１ＪＬＬを還元化β−
ガラクトシダーゼ（２、８ｍｇ／＋ａＬ） ２ 、１−
に添加した。この混合物を室温で１．０時間反応させ次
に上記バイオゲルＰ−６ＤＧカラム上でクロマトグラフ
ィにかけ、２８０ｎｍに吸光度を有する物質の第１溶離
ピークにおいて変性酵素を回収した。
上記（Ｆａｂ’）２調製物４ミリグラム（ｉ，４５ｍ１
）を１．ＯＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、０
） １４３ｇＬ 、 １００ｍＭ ジチオトレイトー
ル２００ 、Ｌ及び１００鱈 ＥＤＴＡ ２０μＬと
合せた。混合物を室温で３時間放置し次に１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７゜０）、０．１５Ｍ
ＮａＣｆＬ及び１．０＋＊Ｍ ＥＤＴＡと平衡化し
たバイオゲル Ｐ−６１）ＧのｌＸ２５ｃｍカラム上で
クロマトグラフィにかけた。２８０ｎｍに吸光度を有す
る物質の第１＃離ピークをプールし濃縮して２．５＋ｅ
Ｌにした。典型的には、この蛋白質はエルマン法（前出
）により測定するとＦａｂ’ あたりスルフィヒドリル
基を平均２．５個有する。
）を１．ＯＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、０
） １４３ｇＬ 、 １００ｍＭ ジチオトレイトー
ル２００ 、Ｌ及び１００鱈 ＥＤＴＡ ２０μＬと
合せた。混合物を室温で３時間放置し次に１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７゜０）、０．１５Ｍ
ＮａＣｆＬ及び１．０＋＊Ｍ ＥＤＴＡと平衡化し
たバイオゲル Ｐ−６１）ＧのｌＸ２５ｃｍカラム上で
クロマトグラフィにかけた。２８０ｎｍに吸光度を有す
る物質の第１＃離ピークをプールし濃縮して２．５＋ｅ
Ｌにした。典型的には、この蛋白質はエルマン法（前出
）により測定するとＦａｂ’ あたりスルフィヒドリル
基を平均２．５個有する。
活性化β−ガラクトシダーゼ４ミリリツトル（３，４ｍ
ｇ）をＦａｂ’ １ 、１ｍｇ （ｉ、４５ｍｇ）と合
せ、２２時間４℃で反応させる。
ｇ）をＦａｂ’ １ 、１ｍｇ （ｉ、４５ｍｇ）と合
せ、２２時間４℃で反応させる。
生成した不溶物を遠心分離により除去しついで上澄を１
０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、０
．１５Ｍ ＮａＣＪｌと平衡化されたバイオゲルＡ１
．５ｍ［バイオラッド研究所］の１．４Ｘ４４ｃｍカラ
ム上でクロマトグラフィにかけた０両分２ミリリツトル
を採集し２８０ｎ＋ｓにおける吸光度を測定した。また
、各画分中のβ−ガラクトシダーゼの活性を、基質とし
て０−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを用いて試験
した。
０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）、０
．１５Ｍ ＮａＣＪｌと平衡化されたバイオゲルＡ１
．５ｍ［バイオラッド研究所］の１．４Ｘ４４ｃｍカラ
ム上でクロマトグラフィにかけた０両分２ミリリツトル
を採集し２８０ｎ＋ｓにおける吸光度を測定した。また
、各画分中のβ−ガラクトシダーゼの活性を、基質とし
て０−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを用いて試験
した。
画分１４から１８は典型的に２８０ｎｍにおける強い吸
光度及び酵素活性を有しておりこれらをプールした。
光度及び酵素活性を有しておりこれらをプールした。
Ｄ、リポソームＲＮＡプローブの調製
１６及び２３ｓのリポソームＲＮＡの混合物をタカナミ
（ｉ９６７） 、 Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ７＋＊ｏ１．１
２ Ａ ：４９１の方法によりイー・コリ （Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ）から単離した。
（ｉ９６７） 、 Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ７＋＊ｏ１．１
２ Ａ ：４９１の方法によりイー・コリ （Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ）から単離した。
Ｅ、ハイブリダイゼーション試験
０．４５舊ｔｔｘ孔径のニトロセルロース膜［シュライ
バー （Ｓｃｈｌｉｅｈｅｒ）及びシュル（Ｓｃｈｕ
ｌ Ｉ ）、キーン（Ｋｅｅｎｅ） 、ニューハンプシ
ャ（ＮＨ）、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）］を複数個のウ
ェルを備えたミニホールド（ｍｉｎｉｆｏｌｄ）装置［
シュライバー及びシュル］上に取り付けついで細菌を含
むと思われる尿の１、Ｏｄ量を前記膜でろ過した０次に
この膜を０．３Ｍ ＮａＯＨで飽和したろ紙上に３時
間室温で載置した。このアルカリが膜上の細菌を破裂さ
せ存在するＲＮＡを解体させかつＤＮＡを変性させる。
バー （Ｓｃｈｌｉｅｈｅｒ）及びシュル（Ｓｃｈｕ
ｌ Ｉ ）、キーン（Ｋｅｅｎｅ） 、ニューハンプシ
ャ（ＮＨ）、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）］を複数個のウ
ェルを備えたミニホールド（ｍｉｎｉｆｏｌｄ）装置［
シュライバー及びシュル］上に取り付けついで細菌を含
むと思われる尿の１、Ｏｄ量を前記膜でろ過した０次に
この膜を０．３Ｍ ＮａＯＨで飽和したろ紙上に３時
間室温で載置した。このアルカリが膜上の細菌を破裂さ
せ存在するＲＮＡを解体させかつＤＮＡを変性させる。
０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で
飽和させたろ紙上にこの膜を３０分間載置しアルカリを
中和し次に膜を８０℃で２時間真空乾燥した。
飽和させたろ紙上にこの膜を３０分間載置しアルカリを
中和し次に膜を８０℃で２時間真空乾燥した。
この膜を、ホルムアミド４容量部及び３３ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，７）６部、０．５Ｍ Ｎａ
ＣＪＬ、 ３．３ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、０．１％（
Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム、０．５ｍｇの仔
ウシ血清アルブミン／＋ｍＬ、 ０ 、５ｍｇフィコ
ル（Ｆｉｃｏｌｌ／ｍＬ） 、 ０ 、５ｍｇのポリビ
ニルピロリドン／ｍＬ、 ０ 、２ｍｇサケ精液ＤＮ
Ａ／ｍＬ及び精製Ｅ、 ｃｏｌｉ リポソームＲＮＡ／
ｍＬを含有する溶液の０ 、２５ ｓ＋Ｊ ／ Ｃｆｆ
１”を含むプラスチック製パウチに入れることによりハ
イブリダイゼーションを行う（使用に先立ちサケ精液Ｄ
ＮＡは３７℃で１６時間０．３Ｍ ＮａＯＨ中でイン
キュベートし次に５Ｍ 酢酸で中和する）。
トリウム緩衝液（ｐＨ７，７）６部、０．５Ｍ Ｎａ
ＣＪＬ、 ３．３ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、０．１％（
Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム、０．５ｍｇの仔
ウシ血清アルブミン／＋ｍＬ、 ０ 、５ｍｇフィコ
ル（Ｆｉｃｏｌｌ／ｍＬ） 、 ０ 、５ｍｇのポリビ
ニルピロリドン／ｍＬ、 ０ 、２ｍｇサケ精液ＤＮ
Ａ／ｍＬ及び精製Ｅ、 ｃｏｌｉ リポソームＲＮＡ／
ｍＬを含有する溶液の０ 、２５ ｓ＋Ｊ ／ Ｃｆｆ
１”を含むプラスチック製パウチに入れることによりハ
イブリダイゼーションを行う（使用に先立ちサケ精液Ｄ
ＮＡは３７℃で１６時間０．３Ｍ ＮａＯＨ中でイン
キュベートし次に５Ｍ 酢酸で中和する）。
このプラスチック製パウチを封じ５５℃の水浴に１７時
間つける６次に膜を２回、２０ｍＭ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐ）１７．４）、０．３ＭＮａＣＪ１．０．
２ｄ ＥＤＴＡ及び１．０ｍｇのドデシル硫酸ナトリ
ウム／ｍＬ中でそれぞれ５分間ふるい洗いした０次にこ
れを５ｍＭＭｇＣ！１２ 、５ 、 Ｏｍｇ
ＢＳＡ／ｍＬ 、 ０ 、５％ （ｖ／ｖ） ト
ウィーン（〒ｗｅａｎ） ２０を含有する５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、６）の１ 、 Ｏｍ
Ｌ／ ｃ＋ｍ２中で１５分間洗浄した。β−ガラクトシ
ダーゼ−抗−ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体複合体をこのリン酸ナ
トリウム緩衝液溶液に入れて２００ ｎｇ／ ｍＬに希
釈し、０ 、２ ｍＬ／ｃｍ２の割合で膜上に均一に拡
げた。湿潤膜を室温で１時間放置し乾燥しないように注
意した。
間つける６次に膜を２回、２０ｍＭ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐ）１７．４）、０．３ＭＮａＣＪ１．０．
２ｄ ＥＤＴＡ及び１．０ｍｇのドデシル硫酸ナトリ
ウム／ｍＬ中でそれぞれ５分間ふるい洗いした０次にこ
れを５ｍＭＭｇＣ！１２ 、５ 、 Ｏｍｇ
ＢＳＡ／ｍＬ 、 ０ 、５％ （ｖ／ｖ） ト
ウィーン（〒ｗｅａｎ） ２０を含有する５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、６）の１ 、 Ｏｍ
Ｌ／ ｃ＋ｍ２中で１５分間洗浄した。β−ガラクトシ
ダーゼ−抗−ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体複合体をこのリン酸ナ
トリウム緩衝液溶液に入れて２００ ｎｇ／ ｍＬに希
釈し、０ 、２ ｍＬ／ｃｍ２の割合で膜上に均一に拡
げた。湿潤膜を室温で１時間放置し乾燥しないように注
意した。
過剰の酵素−抗体複合体を膜から、３回、各回とも０．
５Ｍ ＮａＣＪｌを含むリン酸ナトリウム緩衝液の２
、５ ｍＬ／ ｃｍ２からなるものを用いて各５分間
洗浄した。最後に、膜上のＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド
に結合した酵素−抗体複合体を、５０ｍＭ リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７、６） 。
５Ｍ ＮａＣＪｌを含むリン酸ナトリウム緩衝液の２
、５ ｍＬ／ ｃｍ２からなるものを用いて各５分間
洗浄した。最後に、膜上のＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッド
に結合した酵素−抗体複合体を、５０ｍＭ リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７、６） 。
５ａ＋Ｍ ＭｇＣｌ２及び１．ＯａＭ５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（シグマ）を施すことにより検出した。
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（シグマ）を施すことにより検出した。
乾燥しないように注意しながら、基質溶液を膜と室温で
１時間接触させたままにしておいた。４×１０’／ｍＬ
以上の細菌を含む尿をろ過した成域は青色を発し、これ
によりバックグラウンドと区別がつけられる。この試験
はダラム陰性菌に対して最も感度が高い。
１時間接触させたままにしておいた。４×１０’／ｍＬ
以上の細菌を含む尿をろ過した成域は青色を発し、これ
によりバックグラウンドと区別がつけられる。この試験
はダラム陰性菌に対して最も感度が高い。
実施例■
尿中サイトメガロウィルスのハイブリダイゼーシ罵ン試
験 Ａ、サイトメガロウィルスのためのＲＮＡプローブの調
製 サイトメガロウィルスのゲノムからのＤＮＡフラグメン
トを、 ルモ ラ フス・−フ ムリウム７ Ｌ Ｔ
２細胞に影響を与えるバクテリオファージＳＰ６から
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ（助
触媒）を含むベクター（媒介物）にクローン化した。ク
ローン化配列はポリメラーゼにより転写されてＲＮＡプ
ローブを産生ずる。
験 Ａ、サイトメガロウィルスのためのＲＮＡプローブの調
製 サイトメガロウィルスのゲノムからのＤＮＡフラグメン
トを、 ルモ ラ フス・−フ ムリウム７ Ｌ Ｔ
２細胞に影響を与えるバクテリオファージＳＰ６から
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ（助
触媒）を含むベクター（媒介物）にクローン化した。ク
ローン化配列はポリメラーゼにより転写されてＲＮＡプ
ローブを産生ずる。
サイトメガロウィルスＤＮＡはＥｃｏＲ−Ｉ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて分解され、ついでこのフラグメン
トをプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローン化した［タ
マシロ等（ｉ９８２）。
ヌクレアーゼを用いて分解され、ついでこのフラグメン
トをプラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローン化した［タ
マシロ等（ｉ９８２）。
Ｊ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４２ ： ５４？ 〜５５７
］ 、このプラスミドをＥ、 ｃｏｌｉ菌腫ＨＢ １
０１において増殖させ、タマシロ文献において定義され
ているＥｃｏＲＩ ｅフラグメントをプローブの産生の
ために用いた。
］ 、このプラスミドをＥ、 ｃｏｌｉ菌腫ＨＢ １
０１において増殖させ、タマシロ文献において定義され
ているＥｃｏＲＩ ｅフラグメントをプローブの産生の
ために用いた。
精製プラスミドをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを
用いて分解゛しついでアガロース・ゲル電気泳動により
インサートを単離した［マニアティス（Ｍａｎ ｉａ
ｔ ｉｓ）等（ｉ９８２） ”分子クローニング、コ
ールド・スプリングｅ／＼−，＜ −（ＣｏｌｄＳｐ口
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）研究所］。サイトメガロウィルス
ＥｃｏＲＩｅフラグメントをプロメガ・／くイオテク（
Ｐｒｏａ＋ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、） 、メジソン（Ｍ
ｅｄｉａｏｎ）、ライスコンシン（’ＩＩｍ）、アメリ
カ合衆国Ｃ１１ｓＡ）から入手しうるｐｓＰ６５ベクタ
ーのＥｃｏＲＩ部にクローン化した。
用いて分解゛しついでアガロース・ゲル電気泳動により
インサートを単離した［マニアティス（Ｍａｎ ｉａ
ｔ ｉｓ）等（ｉ９８２） ”分子クローニング、コ
ールド・スプリングｅ／＼−，＜ −（ＣｏｌｄＳｐ口
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）研究所］。サイトメガロウィルス
ＥｃｏＲＩｅフラグメントをプロメガ・／くイオテク（
Ｐｒｏａ＋ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、） 、メジソン（Ｍ
ｅｄｉａｏｎ）、ライスコンシン（’ＩＩｍ）、アメリ
カ合衆国Ｃ１１ｓＡ）から入手しうるｐｓＰ６５ベクタ
ーのＥｃｏＲＩ部にクローン化した。
ＥｃｏＲＩｅインサートを有するｐｓＰ６５はＥ、 ｃ
ｏｌｉ ＪＭＩ Ｏ３細胞中３７℃で増殖された。
ｏｌｉ ＪＭＩ Ｏ３細胞中３７℃で増殖された。
細胞を振り洗いし細胞ＤＮＡをフェノール／クロロホル
ム抽出液を用いて単離した。プラスミドを染色体ＤＮＡ
から、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配［マニアティ
ス（ｍａｎｉａｔｉｓ）等、前出］での遠心分離により
分離した。
ム抽出液を用いて単離した。プラスミドを染色体ＤＮＡ
から、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配［マニアティ
ス（ｍａｎｉａｔｉｓ）等、前出］での遠心分離により
分離した。
塩化セシウム及び臭化エチジウムをプラスミドから、５
０ｍＭ ＮａＣ１及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
＋ａＭ トリス−塩酸塩緩衝液（ＰＨ７，５）中のセ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ −５０［７ｙ
Ｊｌ／ −ｙシア”７ｙイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒ
＋５ａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅａ＋１ｃａｌｓ）］上で
のゲルろ化により分離した。
０ｍＭ ＮａＣ１及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
＋ａＭ トリス−塩酸塩緩衝液（ＰＨ７，５）中のセ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ −５０［７ｙ
Ｊｌ／ −ｙシア”７ｙイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒ
＋５ａｃｉａ ＦｉｎｅＣｈｅａ＋１ｃａｌｓ）］上で
のゲルろ化により分離した。
ＤＮＡを含む流出液を採集しついでこのＤＮＡを冷エタ
ノールで沈澱させた。この沈澱物を、５０ｆｆｌｌｌＩ
ＮａＣ文、１０＋ａＭ ＭｇＣ１ｘ及び１ｍＭ ジ
チオトレイトールを含むｌｏａＭ）リス−塩酸塩緩衝液
（ｐｉ４７ 、５）に溶解しついでｌ−ｆイタログラム
ＤＮＡ当り１単位のヒント（Ｈｉｎｄ）ｍ制限エンドヌ
クレアーゼを用いて１時間３７℃で分解した。この混合
物をフェノール／クロロホルムで１回抽出し、ＤＮＡを
冷エタノールで沈澱させた。沈澱物を１０１１Ｍトリス
−塩酸塩緩衝液（ｐＨ７、４）に溶解して０ 、５＋ｏ
ｇＤＮＡ／ｍｌ、を得た。
ノールで沈澱させた。この沈澱物を、５０ｆｆｌｌｌＩ
ＮａＣ文、１０＋ａＭ ＭｇＣ１ｘ及び１ｍＭ ジ
チオトレイトールを含むｌｏａＭ）リス−塩酸塩緩衝液
（ｐｉ４７ 、５）に溶解しついでｌ−ｆイタログラム
ＤＮＡ当り１単位のヒント（Ｈｉｎｄ）ｍ制限エンドヌ
クレアーゼを用いて１時間３７℃で分解した。この混合
物をフェノール／クロロホルムで１回抽出し、ＤＮＡを
冷エタノールで沈澱させた。沈澱物を１０１１Ｍトリス
−塩酸塩緩衝液（ｐＨ７、４）に溶解して０ 、５＋ｏ
ｇＤＮＡ／ｍｌ、を得た。
このＥｃｏＲＩ ｅインサートを有するｐｓＰ６５ベク
ターを、５Ｐ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用い
てプロモータで開始しついでヒント■制限エンドヌクレ
アーゼにより切断された部位で終らせて転写した。転写
域でのＤＮＡのほとんどはＥｃｏＲＩｅインサートであ
った。
ターを、５Ｐ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用い
てプロモータで開始しついでヒント■制限エンドヌクレ
アーゼにより切断された部位で終らせて転写した。転写
域でのＤＮＡのほとんどはＥｃｏＲＩｅインサートであ
った。
転写反応混合物（５００ＰＬ）は次の組成を有する：ヒ
ンドｍ分解ＤＮＡ５０ｐｇ；４０ＩＩＭトリス−塩酸塩
緩衝液（ｐＨ７、５） ： ６ｍＭＭ ｇ ＣｆＬ ２
； ２ ＩＢＭ スペルミン；０．５ｍＭＡＴＰ、
ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰ、５００単位ＲＮａｓｉｎ（
リボヌクレアーゼ）［プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）及び５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ
（プロメガ・バイオチク）の５０単位４反応は１時間室
温で進行させ次に追加のＲＮＡポリメラーゼ５０単位を
添加し１時間反応させた。
ンドｍ分解ＤＮＡ５０ｐｇ；４０ＩＩＭトリス−塩酸塩
緩衝液（ｐＨ７、５） ： ６ｍＭＭ ｇ ＣｆＬ ２
； ２ ＩＢＭ スペルミン；０．５ｍＭＡＴＰ、
ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰ、５００単位ＲＮａｓｉｎ（
リボヌクレアーゼ）［プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）及び５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼ
（プロメガ・バイオチク）の５０単位４反応は１時間室
温で進行させ次に追加のＲＮＡポリメラーゼ５０単位を
添加し１時間反応させた。
混合物中のＤＮＡはＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）を
含まないＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ）１０
ｇｇを用いて１０分間３７℃で分解することにより破壊
した０反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し
ついで１０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（ＰＨ７，４）、
０．ＩＭＮａＣＪｌ中のセファデックスＧ−５０上でク
ロマトグラフィにかけた。ＲＮＡを採集し冷エタノール
で沈澱させた。沈澱物を１ ｍＷ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを
含む５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）
に溶解させた。
含まないＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ）１０
ｇｇを用いて１０分間３７℃で分解することにより破壊
した０反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し
ついで１０ｍＭトリス−塩酸塩緩衝液（ＰＨ７，４）、
０．ＩＭＮａＣＪｌ中のセファデックスＧ−５０上でク
ロマトグラフィにかけた。ＲＮＡを採集し冷エタノール
で沈澱させた。沈澱物を１ ｍＷ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを
含む５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）
に溶解させた。
Ｂ、ハイブリダイゼーション試験
サイトメガロウィルスを遠心分離により尿から単離しつ
いでウィルスＤＮＡを変性しついでニトロセルロース膜
上に固定化した。このＤＮＡをＲＮＡプローブとハイブ
リダイズさせついで形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ッドをβ−ガラクトシダーゼ−抗−ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体
複合体を用いて検出した。
いでウィルスＤＮＡを変性しついでニトロセルロース膜
上に固定化した。このＤＮＡをＲＮＡプローブとハイブ
リダイズさせついで形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ッドをβ−ガラクトシダーゼ−抗−ＤＮＡ・ＲＮＡ抗体
複合体を用いて検出した。
細胞及び細胞破片を尿から、ソルヴオール（Ｓｏｒｖａ
ｌｌ） Ｇ Ｌ Ｃ−３遠心分離機中で３０００ｒｐ■
で５分間遠心分離することにより除去した。
ｌｌ） Ｇ Ｌ Ｃ−３遠心分離機中で３０００ｒｐ■
で５分間遠心分離することにより除去した。
上澄液１０ミリリツトルをポリアロマ−遠心分離機管に
入れついで２５．ＯＯＯｒｐｍでべ一／ クマン（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ） Ｔ ｉ ５０ローター中で７５分間作動
させた。上澄液を除去しついでベレー／ ）を０．１Ｍ
Ｎａｐ）（の５０ＩＬ［、に溶解しついで３７℃で２時
間インキュベートした。
入れついで２５．ＯＯＯｒｐｍでべ一／ クマン（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ） Ｔ ｉ ５０ローター中で７５分間作動
させた。上澄液を除去しついでベレー／ ）を０．１Ｍ
Ｎａｐ）（の５０ＩＬ［、に溶解しついで３７℃で２時
間インキュベートした。
１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６、０） ２０マイクロリツトルを添加
しついでこの混合物を遺伝子・スクリーン・プラス・微
孔性膜（Ｇｅｎｅ ５ｃｒｅｅｎ ＰｌｕｓＭｉｃｒｏ
ｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）［ニュー・イングラ
ンドΦヌクレア舎リサーチ・プロダクツ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ Ｒｅ５ｅａｃｈ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ） 、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、ミズーリ（
ＨＡ）、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）］上にスポットとし
て落とした。膜を熱風乾燥してＤＮＡを表面に固定した
。ハイブリダイゼーション溶液１ｍＬ当りサイトメガロ
ウィルスＲＮＡプローブ０．１ル８を用い、ハイブリダ
イゼーション温度が４０℃であった他は先の実施例工に
おいて述べたようにしてハイブリダイゼーションを行っ
た。ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドの免疫検出は実施例工
のように行った。サイトメガロウィルスに感染した尿は
膜上に青斑点を生じさせ、不感集尿は尿沈渣に露らして
いない成域上で観察されるバックグラウンドと同等色を
生じさせた。
ム緩衝液（ｐＨ６、０） ２０マイクロリツトルを添加
しついでこの混合物を遺伝子・スクリーン・プラス・微
孔性膜（Ｇｅｎｅ ５ｃｒｅｅｎ ＰｌｕｓＭｉｃｒｏ
ｐｏｒｏｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）［ニュー・イングラ
ンドΦヌクレア舎リサーチ・プロダクツ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ Ｒｅ５ｅａｃｈ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ） 、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、ミズーリ（
ＨＡ）、アメリカ合衆国（ＵＳＡ）］上にスポットとし
て落とした。膜を熱風乾燥してＤＮＡを表面に固定した
。ハイブリダイゼーション溶液１ｍＬ当りサイトメガロ
ウィルスＲＮＡプローブ０．１ル８を用い、ハイブリダ
イゼーション温度が４０℃であった他は先の実施例工に
おいて述べたようにしてハイブリダイゼーションを行っ
た。ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドの免疫検出は実施例工
のように行った。サイトメガロウィルスに感染した尿は
膜上に青斑点を生じさせ、不感集尿は尿沈渣に露らして
いない成域上で観察されるバックグラウンドと同等色を
生じさせた。
上記実施例は本発明の代表的な実施態様を提供したもの
である０本方法の発明上の特徴から逸脱することなしに
他の多くの変更が行いうることは明らかである。
である０本方法の発明上の特徴から逸脱することなしに
他の多くの変更が行いうることは明らかである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試験試料に含まれるウィルス又は細胞中に存在する
特定のポリヌクレオチド配列を測定する方法であって、 （ａ）前記試験試料を処理して前記ウィルス又は細胞か
ら有意に検出可能な量の核酸を一本鎖の形で遊離せしめ
、ついでかかる試料核酸を固相支持体上に固定する工程
、 （ｂ）固定化された１本鎖試料核酸を、少なくとも１個
の、測定すべき配列に対して実質的に相補的な１本鎖塩
基配列からなり、かつ（ｉ）測定すべき配列がＲＮＡも
しくはＤＮＡの場合には実質的にＲＮＡで構成され、又
は（ｉｉ）測定すべき配列がＲＮＡの場合には実質的に
ＤＮＡもしくはＲＮＡで構成される溶解性ポリヌクレオ
チドプローブと接触させ、かかる接触が測定すべき配列
とその相補的プローブ配列とのハイブリダイゼーション
に好ましい条件下で行われるような工程、並びに （ｃ）測定すべき配列とその相補的プローブ配列間に形
成されたＤＮＡ・ＲＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡ２本鎖体に
結合しうる抗体試薬を添加し、ついで該２本鎖体と結合
した抗体試薬を測定することにより、ハイブリダイズさ
れたプローブを測定する工程 からなることを特徴とする方法。 ２、試験試料を処理して、前記ウィルス又は細胞から有
意に検出可能な量の核酸を遊離かつ変性せしめ、ついで
得られた１本鎖核酸を固相支持体上に固定化する特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３、ウィルス又は細胞を固相支持体上に固定し、次に処
理してそれから有意に検出可能な量の核酸を遊離かつ変
性せしめ、得られた１本鎖核酸が前記支持体上に固定化
されるようになる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、試験試料が生物学的液体で、かつ支持体が前記生物
学的液体試料を通過させると前記ウィルス又は細胞を固
定化するフィルターである特許請求の範囲第３項記載の
方法。 ５、１本鎖試料核酸が固相支持体上に吸着により固定化
される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、一本鎖試料核酸を、測定すべき配列を含む核酸の相
互に排除する部分に対して相補的な塩基配列を有するポ
リヌクレオチドが結合し、かつ、プローブがハイブリダ
イズする固相支持体と接触させることにより固相支持体
上に固定化する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、抗体試薬が検出可能な化学基で標識化されている特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、検出可能な化学基が酵素活性基、蛍光体、発色団、
発光体、特異的に結合しうるリガンド、又は放射性同位
元素である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、検出可能な化学基が酵素である特許請求の範囲第７
項記載の方法。 １０、前記２本鎖体と結合された標識化抗体試薬を、そ
のように結合しなかったものから分離し、検出可能な化
学基を１つの分離フラクション中で測定する特許請求の
範囲第７項記載の方法。 １１、測定すべき特定のポリヌクレオチド配列がＲＮＡ
又はＤＮＡであり、前記プローブが実質的にＲＮＡで構
成される特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、測定すべき特定のポリヌクレオチド配列がＲＮＡ
であり、前記プローブが実質的にＤＮＡで構成される特
許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74723085A | 1985-06-21 | 1985-06-21 | |
| US747230 | 1986-06-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61293400A true JPS61293400A (ja) | 1986-12-24 |
Family
ID=25004195
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61143122A Pending JPS61293400A (ja) | 1985-06-21 | 1986-06-20 | ポリヌクレオチド配列の測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0209702A1 (ja) |
| JP (1) | JPS61293400A (ja) |
| AU (1) | AU558846B2 (ja) |
| ES (1) | ES8801375A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03130098A (ja) * | 1989-06-30 | 1991-06-03 | Sanyo Chem Ind Ltd | 核酸の検出法及びび検出試薬 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| FR2606154B1 (fr) * | 1986-11-05 | 1990-05-11 | Pasteur Institut | Procede de detection et de dosage immunologique des acides nucleiques presents dans les milieux biologiques |
| FR2606155B1 (fr) * | 1986-11-05 | 1990-07-20 | Pasteur Institut | Reactif immunologique pour la determination de la sequence d'un acide nucleique, son procede de preparation et methode immunologique de determination de la sequence d'un acide nucleique a l'aide de ce reactif |
| IL85551A0 (en) * | 1987-04-01 | 1988-08-31 | Miles Inc | Rapid hybridization assay and reagent system used therein |
| US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
| US5212059A (en) * | 1988-01-11 | 1993-05-18 | Microprobe Corporation | Oligonucleotide probes for the detection of periodontal pathogens |
| US4999290A (en) * | 1988-03-31 | 1991-03-12 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Detection of genomic abnormalities with unique aberrant gene transcripts |
| WO1993010263A1 (en) * | 1991-11-14 | 1993-05-27 | Digene Diagnostics, Inc. | Non-radioactive hybridization assay and kit |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60231693A (ja) * | 1984-01-16 | 1985-11-18 | アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル | 核酸検出用キット |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4483920A (en) * | 1982-05-17 | 1984-11-20 | Hahnemann University | Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material |
| CA1231303A (en) * | 1983-08-05 | 1988-01-12 | Robert J. Carrico | Detection of bacteria by nucleic acid hybridization |
| IL71715A0 (en) * | 1983-08-05 | 1984-09-30 | Miles Lab | Method,gene probes and test kit for detecting bacteria by nucleic acid hybridization |
| US4623627A (en) * | 1983-08-19 | 1986-11-18 | Cetus Corporation | Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same |
| GB8331071D0 (en) * | 1983-11-22 | 1983-12-29 | Karayiannis P | Assay for dna/rna |
| EP0144913A3 (en) * | 1983-12-12 | 1986-08-20 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid |
| CA1253777A (en) * | 1984-06-01 | 1989-05-09 | Robert J. Carrico | Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes |
-
1986
- 1986-05-30 AU AU58223/86A patent/AU558846B2/en not_active Ceased
- 1986-06-09 EP EP86107846A patent/EP0209702A1/en not_active Withdrawn
- 1986-06-20 ES ES556372A patent/ES8801375A1/es not_active Expired
- 1986-06-20 JP JP61143122A patent/JPS61293400A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60231693A (ja) * | 1984-01-16 | 1985-11-18 | アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル | 核酸検出用キット |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03130098A (ja) * | 1989-06-30 | 1991-06-03 | Sanyo Chem Ind Ltd | 核酸の検出法及びび検出試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0209702A1 (en) | 1987-01-28 |
| ES556372A0 (es) | 1988-01-01 |
| ES8801375A1 (es) | 1988-01-01 |
| AU558846B2 (en) | 1987-02-12 |
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