JP2690738B2 - 核酸の検出方法および装置 - Google Patents

核酸の検出方法および装置

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物学的試料中に存在するデオキシリボ核
酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）を含む核酸配列（以
下、「目的核酸」または「目的核酸配列」という）の検
出方法および組成物に関する。本発明の方法によれば、
標識DNAまたはRNAプローブを目的核酸と溶液中でハイブ
リダイズすることにより、特定のDNAまたはRNAの生物学
的試料中での存在を速やかに検出することができる。標
識プローブを目的核酸にハイブリダイズした後、得られ
たハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズし
ていないプローブをゲル排除またはアフィニティークロ
マトグラフィーで分離する。このようなアッセイ法は、
粗製の血清、血漿、組織培養細胞または組織抽出物のよ
うな生物学的試料、または精製したもしくは部分的に精
製した試料に用いるのに適している。
［従来技術］ 核酸（DNAまたはRNA）はプリンおよびピリジン塩基の
一次配列を有しており、この塩基は水素結合を形成して
二本鎖のらせん領域を生成することができる。水素結合
した二本鎖のらせん領域を生成する過程は、ハイブリゼ
ーションまたはDNA復元と呼ばれる。このようなハイブ
リダイゼーションは、相補的な配列を有するDNAまたはR
NA試料を適当な塩、pHおよび温度条件下でインキュベー
トすると起こる。いかなる２個の核酸配列も、それらが
相補的な核酸配列を有している限りお互いにハイブリダ
イズすることができる（すなわち、DNA:DNA、RNA:RNAま
たはRNA:DNA）。二重らせんを形成する速度は、反応物
の濃度と温度の両方の関数である。２個の核酸鎖の一方
に既知の配列および標識が含まれておれば、ハイブリダ
イズとして標識を検出することによって未知の溶液中の
相補的な核酸配列の存在を決定することができる。
ゲル電気泳動で分画されたDNA制限断片の混合物から
特定の核酸配列を集める（localize）のに、放射性同位
元素で標識したDNAプローブが広く用いられている。電
気泳動かまたはブロッティングと呼ばれる方法の核酸に
より、分画DNA断片をニトロセルロース紙のシートに移
動させることによってゲル電気泳動パターンのレプリカ
をつくる。ニトロセルロース紙に吸着したDNAまたはRNA
に放射性プローブをハイブリダイズさせることによっ
て、求める特定のDNA配列とプローブとの間にハイブリ
ッドを形成させる。ハイブリダイズしなかったプローブ
は洗い落とし、ニトロセルロース紙の標識領域をオート
ラジオグラフィーなどによって検出する。
血清または血漿中のＢ型肝炎ウイルスDNAを検出する
ように適合させた他のブロッティング法が、スコットら
［Scotto et al、Hepatology、３、279〜284（1983）］
に記載されている。この方法では、真空濾過装置を用い
試料DNAを直接ニトロセルロース紙に結合させることに
よって、抽出していない血清または血漿試料を一層大き
な容積で使用することができる。
上記文献に記載された方法は、目的とする核酸配列を
ニトロセルロース紙のような固体相に結合し、ハイブリ
ダイズしなかった標識プローブを洗浄して取り除き、つ
いで固体相に結合している目的核酸配列とハイブリダイ
ズした標識プローブを検出することによっている。しか
しながら、このような固体相を用いる方法は、試料を大
量に浪費したり時間がかかるうえ、固体相の調製、結
合、ブロッキング（blocking）、および洗浄などの多く
の工程からなるという欠点を有する。
現在利用できる試料の調製法は、ハイブリダイゼーシ
ョン法、およびハイブリダイズしていないプローブやハ
イブリダイズしたプローブを分離する方法は、高度の熟
練者を要する手順の複雑さや手順に時間のかかることや
特別の装置を必要とすることなどから、一般に日常的に
使用するには適していない。このため、アッセイを行な
うのに要する時間を短縮でき、試料も最小限の量でよ
く、再現性があって信頼でき、正確な定量法を提供でき
るような簡単な方法を確立する必要があった。
ノブレガら［Nobrega et al、Analytical Biochemist
ry、131、141〜145（1983）］は、RNAのプロセッシング
のあいだに特定のRNA写しを検出する方法を記載してい
るが、この場合、目的核酸およびプローブはともに溶液
中にある。この方法では、電気泳動による移動を利用し
てアガロース上でハイブリダイズさせ、オートラジオグ
ラフィーによって視覚化したのち、DNAプローブを分離
する。
重量および／またはコンホメーションの違いに基づい
て、小さな分子を一層大きな高分子量の分子から分離す
るための原理が文献に知られている。このような方法に
は、分画遠心法、クロマトグラフ法、電気泳動法および
透析などが含まれる。
Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの配列を細菌プラスミド上に
クローニングすることにより該配列を含むDNAを製造す
る方法が、英国特許出願公開第2034323A号（1980年６月
４日公開）に記載されている。既知の量のファージベク
ターを用してＢ型肝炎ウイルスDNAのようなウイルスDNA
を定量するための試薬および方法が、PCT出願公開第85/
3951号（1985年９月12日公開）に記載されている。ハイ
ブリダイゼーションに適した標識DNAプローブととも
に、変性し固体相に付着した病原体DNAを検出するのに
有用な方法および組成物もまた米国特許第4,358,535号
に記載されている。
［発明の構成および効果］ 本発明は、生物学的試料中に存在する目的核酸配列を
速やかに定量アッセイするための方法および組成物を提
供するものである。すなわち、本発明は、（ａ） 液体
媒質中で標識核酸プローブとハイブリダイズすることが
可能な目的核酸配列を含む生物学的試料を調製し、 （ｂ） 該生物学的試料をハイブリダイズ条件下で標識
核酸プローブと混合し、 （ｃ） ゲル排除もしくはアフィニティーカラムクロマ
トグラフィーを用いて、ハイブリダイズしなかったプロ
ーブをハイブリダイズしたプローブから分離し、ついで （ｄ） 試料中の目的核酸配列を測定するために、ハイ
ブリダイズした標識核酸プローブを検出することを特徴
とする、生物学的試料中の目的核酸配列の検出方法、さ
らにこの方法に用いるキットおよびプローブ組成物に関
する。この方法ではまず、液体媒質中で核酸プローブと
ハイブリダイズすることのできる目的核酸を含む生物学
的試料を調製する。ついで目的核酸配列を標識核酸プロ
ーブと結合させる。ハイブリダイズしたプローブおよび
ハイブリダイズしなかったプローブを、ゲル排除もしく
はアフィニティークロマトグラフィーで分離する。生物
学的試料中に存在する目的核酸の量を測定するために、
上記分離工程のあとハイブリダイズしたプローブの量を
測定する。本発明の方法に使用するためのプローブ組成
物は特定のDNAまたはRNA配列であり、これらは放射性同
位元素、酵素、放射線不透過性物質、蛍光剤、化学発光
分子、以上の物質のどれかを含むリポソーム、または特
異的結合ペアの一方のような検出可能な標識と安定に結
合している。標識核酸プローブは目的核酸配列と相補的
であり、またハイブリダイズしたプローブがゲル排除も
しくはアフィニティークロマトグラフィーによってハイ
ブリダイズしなかったプローブから容易に分離できるよ
うに、有効な分子量または特異的結合ペアの一方を有し
ている。本明細書では本発明のアッセイに用いるプロー
ブの製造方法もまた開示する。
生物学的試料中に存在する目的核酸配列の決定に使用
するキットには、検出可能な標識と安定に結合した核酸
プローブ、および目的核酸配列にハイブリダイズしたプ
ローブからハイブリダイズしなかったプローブを分離す
るために適したゲル排除またはアフィニティーカラムク
ロマトグラフィー装置が含まれる。
本発明の理解を一層容易にするために、以下に本発明
に使用する語句について説明する。
（１）ゲル排除クロマトグラフィー この方法はゲル濾過としても知られており、粒状物質
（通常はデキストラン）を使用することからなる。この
粒状物質は２相からなる媒質を形成する。このうち１相
は粒状物質内部の液体であり、他の１相は粒状物質外部
の液体物質である。溶液中にあった物質でその大きさの
ために粒状物質内に入ることを完全に排除されたものは
カラムを最初に通り抜け、このものはボイド容積として
知られる。溶液中の一層小さな分子は粒状物質中への移
動によって遅延し、有効な分子量の関数として粒状物質
により遅延される。粒状物質中に入り込んだ物質は包含
容積として知られる。それゆえ、核酸プローブとハイブ
リダイズして二本鎖を形成した大きな核酸と小さな核酸
プローブとの混合物をゲル排除クロマトグラフィーにか
けると、小さな核酸プローブは粒状物質により包含容積
中に遅延され、大きなハイブリダイズ二本鎖分子はボイ
ド容積中に排除される。上記粒状物質は、たとえばファ
ルマシア社からセファデックス（Sephadex）およびセフ
ァロース（Sepharose）の商標名で、バイオ・ラド社か
らバイオゲル（Biogel）の商標名で入手することができ
る。
（２）アフィニティークロマトグラフィー この方法は不溶性多糖類または合成樹脂の充填カラム
を利用するものである。これらの充填物は、第２の分子
と特異的に結合して特異的結合ペアを形成する分子と共
有結合している。特異的結合ペアの典型的な例しては、
抗原・抗体、基質・酵素およびビオチン・アビジンが挙
げられる。特異的結合ペアに結合した樹脂を含むカラム
は、粗製のまたは部分的に精製した抽出物または調製物
から、カラムの特異的結合ペアに特異的に結合した分子
を取り除く。カラムに付着した物質は、高いイオン強度
の溶出溶液を使用するか、pHを変えるなどして得ること
ができる。溶出させた物質は、ついで定量することがで
きる、 （３）特異的結合ペア 特異的結合ペアは二つの異なる分子からなっており、
そのうちの一方の分子の表面または空洞内には、他の分
子の特定の空間的および極性的構造と特異的に結合する
領域がある。特異的結合ペアの各部は、しばしばガンド
とレセプターまたはリガンドと抗リガンドと呼ばれる。
しばしばレセプターは抗体であり、リガントは抗原であ
る。他の特異的結合ペアとしては、ホルモン・レセプタ
ーペア、酵素・基質ペア、ビオチン・アゼジンペアおよ
び糖タンパク・レセプターペアが挙げられ、またFab断
片などの含む免疫グロブリン断片のような、結合特異性
を保持している特異的結合ペアの断片または部分もまた
含まれる。抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体のいずれであっていもよい。
（４）検出可能な標識 標識は核酸プローブに共有結合するかまたは堅固に結
合することのできる物質であって、これによってプロー
ブの量を検出し定量することができる。このような物質
としては、3H、125I、131I、32P、14Cおよび35Sのよう
な放射性同位元素；アクリジンやルミノールなような化
学発光分子；フルオレセイン、フィコビリンタンパク
（phycobiliprotein）、希土類キレート、ダンシル（da
nsyl）、ローダミンなどの蛍光剤；西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコ
リンエステラーゼのような酵素基質および阻害剤；金コ
ロイドや磁性粒子のような金属粒子または他の放射線不
透過性分子；上記物質のいずれかを含むリポソーム；タ
ンパク質、炭水化物またはハプテン分子のような抗原お
よびこれらの抗原に特異的な抗体；および糖脂質または
糖タンパクが挙げられる。
（５）核酸配列 本発明の方法で検出できる核酸配列は、リボヌクレオ
キドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチ
ドの配列である。これらの核酸配列は一本鎖であっても
二本鎖であってもよく、また部分的に一本鎖で部分的に
塩基対の領域を有していてもよい。リボ核酸配列にはメ
ッセンジャーRNAおよびリボソームRNAの両方が含まれ
る。
（６）ハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションとは核酸配列間での水素結合
および積み重ね力（stacking forces）による安定な結
合の形成をいい、核酸配列は充分に結合しているのでハ
イブリダイズした配列とハイブリダイズしていない配列
とを分離することができる。ハイブリダイゼーションの
速度は、温度、塩、pHレベル、反応物の濃度、およびデ
キストラン硫酸のような他の分子の存在に依存してい
る。
（７）プロテイナーゼ プロテイナーゼとはペプチド結合を切断することので
きる酵素をいい、エキソペプチダーゼおよびエンドペプ
チダーゼの両方を含む、プロテアーゼ、プロテイナーゼ
Ｋ、プロナーゼ、トリプシン、アルカリプロテアーゼ、
サブチリシンおよびキモトリプシンなどがある。
（８）目的核酸または目的核酸配列 本明細書において、これらの語は一本鎖，二本鎖にか
かわらずDNAまたはRNAを指し、この中にはメッセンジャ
ーRNAおよびリボソームRNAが含まれる。本発明の方法で
検出できる目的核酸は、たとえばウイルス、微生物（原
核または真核）、および病気もしくは病理学的状態に関
連するあらゆる異常型細胞に見出だされる。これらの目
的核酸の中には、HIV（HTLV−IIIまたはLAV）、肝炎ウ
イルス、ヘルペスウイルス、ヒトレトロウイルス、ヒト
パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サ
イトメガロウイルス、ウイルスのRNA写し、および複製
中間体の核酸がある。またマイコプラズマ、リケッチア
およびクラミジアのような細菌；およびかび、酵母およ
び異常もしくは変異体宿主細胞（とりわけオリコジン、
遺伝欠失もしくは遺伝マーカーを含むもの）のような真
核病原体も含まれる。
（９）生物学的試料 本発明に用いる生物学的試料は、当該目的核酸を含ん
でおりさえすればどのような試料であってもよい。この
ような生物学的試料の採取源としては、植物、昆虫およ
び動物がある。好ましい生物学的試料には、血清、血
漿、滑液、生検材料、組織培養細胞もしくは組織培養細
胞からの増殖培地、組織抽出物および膜洗浄液がある。
使用方法 本発明の方法は、標識核酸プローブを利用して目的核
酸配列をすみやかに定量アッセイするためのものであ
る。この方法は、まず第１段階として液体媒質中に目的
核酸を含む生物学的試料を調製することからなる。血
清、血漿、組織切片もしくは抽出物、リンパ球、および
組織培養細胞もしくは組織培養からの増殖培地の上澄み
のような液体媒質中の粗製の生物学的試料を、前以て精
製することなくアッセイに用いることができる。そのか
わりに、精製したもしくは部分的に精製した試料も用い
ることができる。精製工程には、分離、抽出、細胞破砕
または組織もしくは生物学的流体のホモジネート化を含
めることができる。さらに、核酸の非特異的損失を減少
させるためにプローブと反応しない担体核酸を精製工程
の間に試料に加えることもできる。
ついで可溶化しアッセイ用の核酸を放出させるため
に、試料を界面活性剤またはプロテイナーゼで処理す
る。プロテイナーゼを添加することは、一層安定で可溶
化された核酸を生じるので幾分好ましいといえる。本発
明の方法で有用と思われるプロテイナーゼには、プロテ
イナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、プロナー
ゼ、アルカリプロテアーゼ、リゾチームおよびサブチリ
シンがある。目的核酸を調製するのに有用な他の酵素に
は、目的核酸配列がRNAである場合のDNAase、および目
的核酸配列がDNAである場合のRNAaseが含まれる。
目的核酸配列が一本鎖の形状で生物学的試料中に存在
していない場合には、核酸プローブとハイブリダイズす
ることができるように変性させなければならない。変性
は、水酸化ナトリウムを加えるなどのアルカリ性の条件
下で処理するか、または加熱することによって行うこと
ができる。目的核酸配列がRNAであるときは、好ましい
変性方法は熱変性であり、これによりRNAの二次構造が
破壊される。
目的核酸の二次構造を破壊して一本鎖核酸を生じさせ
たのち、標識プローブを目的核酸に選択的に結合させる
のに適した条件下で標識プローブとのハイブリダイゼー
ション反応を行う、ハイブリダイゼーション反応および
プローブ合成のための一般的な方法は、ティー・マニア
ティスらの「モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning、T.Maniatis、E.F.Fritsch and J.Sambrook,Co
ld Spring Harbor Laboratory,1982）」に開示されてい
る。ハイブリダイゼーション反応は、多くのpH、塩およ
び温度条件下で行うことができる。pHは６〜９の範囲で
変化させることができるが、6.8〜8.5の範囲のpHが好ま
しい。塩濃度はナトリウム0.15M〜0.9Mの範囲で変化さ
せることができる。他のカチオンも、イオン強度がナト
リウムと等価である限りにおいて利用することができ
る。ハイブリダイゼーション反応を行なう温度は30〜80
℃の範囲で変化させることができるが、45〜70℃の範囲
であるのが好ましい。さらに、特定のハイブリダイゼー
ション反応を室温もしくはそれに近い温度のような定温
で進めるために、他の化合物をハイブリダイゼーション
反応に加えることもできる。温度要件を低下させるため
の化合物としては、ホルムアミドがある。
ハイブリダイゼーション反応に引き続き、標識プロー
ブとハイブリダイズした目的核酸をハイブリダイズしな
かった核酸プローブから分離し、ハイブリダイズしたプ
ローブ、したがって試料中に存在する目的核酸をゲル排
除もしくはアフィニティークロマトグラフィーにより定
量する。好ましい分離方法は、ゲル排除クロマトグラフ
ィーにより行うものである。上記分離方法の条件は、ハ
イブリダイズした目的核酸と検出プローブとが互いに結
合したままであるようなものでなければならない。分離
溶液は、ヌクレアーゼの阻害剤およびプローブと相互反
応しないさらなる担体核酸配列を含んでいてよい。
ハイブリダイズしなかったプローブからハイブリダイ
ズしたプローブを分離するための好ましい方法として
は、ポリアクリルアミド、セファロース、架橋セファロ
ース、アガロース、架橋アガロースまたは他の同様の物
質からできたマトリックスを用いたゲル排除クロマトグ
ラフィーがある。このようなゲル排除クロマトグラフィ
ーに適した製品としては、G50、G100、G200と表示され
たファルマシア社製の製品セファデックス、およびCL2
B、CL4B、CL6B、Ｓ−200、Ｓ−400、Ｓ−1000と表示さ
れた同じファルマシア社製の製品セファロースがある。
他の好適な製品はバイオ・ラド社製のもので、Ｐ−20、
Ｐ−60、Ｐ−100、Ｐ−200、Ａ−0.5mおよびＡ−1.5mが
ある。
分離反応の目的は、ハイブリダイズしなかったプロー
ブが過剰のバックグラウンドレベルを起こしてハイブリ
ダイズしたプローブの正確な検出を妨害することなく、
目的核酸に結合したプローブの量を差別的に検出するこ
とができるようにすることである。したがって検出プロ
ーブと結合した目的核酸は、検出プローブ単独から充分
区別でき、試料のゲル排除クロマトグラフィーでの反応
に基づいて分離を行なうことができるような大きさもし
くはコンホメーションを有していなければならない。そ
れゆえ、標識核酸の長さを以下に一層詳しく述べる方法
によって注意深く当接することは重要である。目的核酸
がゲル排除クロマトグラフィーにより分離するのに充分
な程大きくない場合は、目的核酸・プローブ複合体の大
きさを有効に増加させるために特定の非標識担体核酸を
用いることができる。
キットに含まれているような標準ゲル排除クロマトグ
ラフィー試薬を用いて分離を行うときには、カラムに流
した試料および溶出バッファーの容積を注意深く調節し
なければならない。
ハイブリダイズしなかったプローブからハイブリダイ
ズしたプローブを分離した後、ハイブリダイズしたプロ
ーブの存在もしくは量を決定する。検出方法は、プロー
ブ上に存在する標識の種類に依存する。標識が放射性同
位元素であるときは、検出方法はガンマもしくはシンチ
レーションカウントまたはオートラジオグラフィーもし
くは写真検出のような他の検出可能な方法であってよ
い。特異的結合ペアの一方の標識としてプローブ上に用
いたときは、有効な検出および定量のために該ペアの他
の一方を用いることができる。特異的結合ペアの他の一
方は、その自身酵素もしくは同位元素のような第２の検
出マーカーを有していてよい。標識が酵素または酵素阻
害剤であるときは、酵素活性の存在もしくは不存在の検
出反応を利用することができる。好ましい酵素反応は比
色変化を起こすものであって、これは比色計を用いて検
出することができる。他の標識としては、電磁放射を用
いて検出できる放射線不透過性物質；磁場を用いて検出
できる磁性粒子；特定の抗原と抗体を用いる免疫学的方
法；蛍光および化学発光マーカー；糖脂質もしくは糖タ
ンパクのようなあらゆる特異的結合ペアの一方が挙げら
れる。
未知の生物学的試料中に存在する目的核酸配列の量を
正確に決定するために、試料と平行して既知の量の目的
核酸配列を含む陽性対照および陰性対照をアッセイする
ことができ、これによりアッセイ結果を標準化すること
ができる。
本発明の方法は、生物学的試料中に存在する一本鎖も
しくは二本鎖の核酸（DNAまたはRNA）を検出するために
用いることができる。好ましい目的核酸配列には、ウイ
ルス、細菌、酵母、かび類、原生動物または真核細胞に
ような病原体と結合した核酸配列が含まれる。上記真核
細胞の分類に含まれるものとしては、形質転換した、ま
たはオンコジンもしくは既知の遺伝マーカーを有する宿
主自身が含まれる。本発明の方法により検出可能な好ま
しいウイルス性病原体の核酸は、肝炎、ヘルペス、後天
性免疫不全症候群の原因となるウイルス病原体（HIV、H
TLV IIIまたはLAV）、ヒトパピローマウイルス、エプス
タン・バーウイルス、または他のウイルスもしくは微生
物などである。
本発明の方法は、少量の目的核酸を検出するのに適し
ており、0.07ピコグラムもの少量の核酸を検出すること
ができる。本発明の方法を容易にする試薬を、手動のア
ッセイまたは自動化診断装置もしくはアナライザーに使
用するキットに含めることができる。また、たとえば組
織培養中でウイルスを増殖させたり目的核酸を増幅させ
たりして［Science、230、1350〜1354（1985）］目的核
酸の量を増加させる方法を、本発明の方法に適用するこ
ともできる。
プローブの特性 本発明に用いるプローブは、検出しようとする目的核
酸に相補的なDNAまたはRNAのいずれであってもよい。本
発明のプローブは長さが少なくとも20ヌクレオチドであ
り、天然の形で存在する目的核酸の長さの10〜20％であ
るのが好ましい。目的核酸およびプローブ分子の有効分
子量がゲル排除クロマトグラフィーでの分離を可能にす
る程大きくないときは、ゲル排除クロマトグラフィーに
よる分離を可能にするのに充分な大きさの非標識の特異
的担体DNAまたはRNAを用いることができる。担体DNAま
たはRNA分子は、プローブ分子とは異なる、すなわち部
分的に重複せずクロスハイブリダイズしないもしくはプ
ローブ分子のハイブリダイゼーションを立体的に妨害し
ないような目的核酸の領域に対し相補的な配列を含んで
いる。それゆえ担体DNAまたはRNAは比較的安価に調製で
き、標識する必要もない。別のやり方として、担体DNA
またはRNAは特異的結合ペアの一方を含む比較的短い核
酸分子であってもよく、この特異的結合ペアの一方は抗
体やアジビンのような比較的高分子量の他の分子に付着
することができるのでプローブ・目的核酸複合体の有効
分子量を増加させることができる。
検出用標識は、既に述べたように放射性同位元素、化
学発光分子、蛍光剤、酵素、抗原または特異的結合ペア
の一方であってもよい。検出用標識はプローブ合成後に
プローブに付着させることもできるし、また32P、3H、
125I、14Cまたは35Sを用いた場合のようにプローブの合
成中に組み込むこともできる。
本発明の方法には、プライマー伸張に基づくＢ型肝炎
ウイルス（HBV）DNA検出のためのプローブの調製が含ま
れる。このプローブの長さは50〜400ヌクレオチドであ
ってよく、75〜300ヌクレオチドの長さであるのが好ま
しく、150〜250ヌクレオチドの長さであるのがさらに好
ましい。鋳型はクローン化したＢ型肝炎ウイルスDNAの
挿入部を含むM13ファージDNAからなる。一本鎖鋳型は、
Ｂ型肝炎ウイルスDNA挿入部に相補的で長さが少なくと
も17ヌクレオチドのプライマーとハイブリダイズまたは
アニーリングする。プライマー配列は、チャーネイら
［Charnay, et al、Proc.Natl.Acad.Sci.、76、2222（1
979）］記載のＢ型肝炎ウイルスDNAの既知の配列から選
ぶことができる。アニーリング後、鋳型とプライマー、
ヌクレオチド（dGTP、dCTP、dATPおよびdTTPかまたはdU
TP）およびDNAポリメラーゼＩのクレノー断片を加え
る。１または２以上のヌクレオチド種は125Iのような標
識を含んでいてよい。DNAまたはRNAの合成はプライマー
の伸張によって起こり、挿入DNAが標識されてコピーさ
れるという結果になる。プローブの長さは上記ヌクレオ
チドの一種の濃度を制限することによって調節すること
ができる。
たとえば、Ｂ型肝炎ウイルスDNAの3200塩基対挿入部
を含むM13ファージの調製物から単離された一本鎖DNA72
μｇを、Ｂ型肝炎ゲノムの表面抗原領域に相補的な23塩
基プライマー分子とアニリーングさせる。アニーリング
は、10mM Tris（pH8.5）、10mM MgCl2 120μ中、65
℃で１時間加温して行なう。ヌクレオチドdGTP、dTTPお
よびdATPの各1500ピコモルを90μの容積で加える。dC
TP150ピコモルを加え、ついで125I−dCTP［NENデュポン
またはアメリシャム（Amerisham）より入手可能］のよ
うな標識dCTP150ピコモルを加える。このように反応中
でのdCTPの濃度は所定範囲にある。DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片を最終濃度0.6ユニット／μで加え、
既にアニーリングしたプライマーの伸張を15℃で２時間
進める。反応は、EDTAを最終濃度25mMで加えることによ
って停止させる。ついで3.4mlの床容積（bed volume）
のセファロース CL4Bを含むクロマトグラフィーカラム
に反応混合物を流し、組み込まれなかったヌクレオチド
を新たに合成されたコピーから分離させる。ついで鋳型
および新たに合成されたコピーDNAを含むボイド容積部
分を、最終濃度0.15NのNaOHで処理して鋳型と放射性同
位元素を含む伸張プライマーを変性させる。変性処理し
た試料を、0.03N NaOHで平衡化したセファロース CL4
Bゲルカラムに流す。これらの変性条件下でのクロマト
グラフィーによって、分子量の小さい標識伸張プライマ
ーから高分子量の鋳型を分離することができる。鋳型は
ボイド容積中に含まれ、一方、標識伸張プライマーは包
含容積中に残留する。包含容積からなるフラクションを
プールし、pHを2M NH4Acで中性に調節する。中性にし
プールしたフラクションは125I−標識プローブからな
る。ついで各ハイブリダイゼーション反応に40,000〜20
0,000dpmの125I−プローブを加え、アッセイに使用す
る。概してプローブの比活性は少なくとも109dpm/μｇ
である。
別の方法では、熱変性させ、変性条件下でゲル電気泳
動により精製して所望の長さのプローブ分子を選択する
ことによって鋳型から標識コピーを分離する。選択され
る長さは、アッセイ法で目的核酸にハイブリダイズした
プローブからハイブリダイズしなかったプローブを分離
する能力に依存する。あらゆるDNAまたはRNA配列を一本
鎖ファージまたはプラスミドベクター中にクローン化す
ることができ、適当なプライマーを用いたときには鋳型
として使用することができる。また、M13ファージ中の
挿入配列に隣接するプライマーのハイブリダイゼーショ
ンまたはシークエンシングを、プライマーの合成または
プローブの製造に使用することができる。
上記方法によって実質的にあらゆる長さのプローブを
製造することができる。この方法により、調節された長
さのプローブを高収率で得ることが容易になる。また少
なくとも50％の放射性同位元素標識を組み入れて、上記
本発明のアッセイ法により約4000のハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを行うに充分なプローブを生成させること
ができる。
第１図は、上記のようにして調製した125Iを用いたＢ
型肝炎ウイルスDNAの標準曲線を示す。このアッセイの
実験記録は実施例１に記載してある。第１図からわかる
ように、ハイブリダイズした標識プローブのカウントは
存在するウイルスゲノムに比例して増加する。これらの
方法は、ハイブリダイゼーションおよびゲル排除クロマ
トグラフィーに有利な特性を有する一本鎖DNAプローブ
を高収率で製造するための効率的で再現性のある方法で
ある。プローブの長さおよびプローブの比活性は、粗製
の血清もしくは血漿、他の体液および細胞もしくは組織
溶解物に有利である。これらの生物学的試料のハイブリ
ダイゼーションに続き、本発明の分離方法は目的核酸の
存在についての高度に特異的で高感度の診断アッセイと
して有用である。
プローブの別の製造方法としては、リボプローブ（Ri
boprobe）システム［プロメガ・バイオテク（Promega B
iotec）より入手可能］を用いて既知の長さのRNAプロー
ブを製造する方法、および既知の方法により末端標識し
たオリゴマーを製造する方法が含まれる。
32P−ヌクレオチドを用いた末端標識核酸の一般的な
製造法は、ティー・マニアティスらの実験室便覧「モレ
キュラー・クローニング」（前述）に記載されている。
また核酸プローブは当該技術分野で知られた方法によ
り125Iで標識することができる。標識したもしくは標識
していない特定の一本鎖（SS）DNAは、ジングツォング
ら（Jingzhong et al）記載の方法［Gene、42、113〜11
7（1986）］により製造することができる。
キット 本発明の方法に使用するのに適したキットには、標識
核酸プローブ、および該プローブに結合した目的核酸配
列をハイブリダイズしなかったプローブから分離するの
に適したゲル排除もしくはアフィニティーカラムクロマ
トグラフィー装置を含む。便利なようにこのキットはさ
らに試薬および装置を備えることができ、たとえばプロ
テイナーゼＫのような生物学的試料を調製するのに有用
な酵素；水酸化ナトリウムにような目的核酸の変性用溶
液；ゲル排除クロマトグラフィーでの分離工程に用いる
のに適したバッファー；コレクションチューブ、ハイブ
リダイゼーション反応に適したフローテーションラッ
ク；試料の希釈液；およびハイブリダイゼーション法を
行う手順に関する説明書を備えることができる。
次ぎに実施例を基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 血清および血漿中のＢ型肝炎ウイルスDNAの決定 血清または血漿の試料200μに、プロテイナーゼＫ
を10mg/mlの最小濃度で含有するバッファー10μを加
えて可溶化し変性させた。試料をプロテイナーゼＫとと
もに室温で１時間インキュベートした後、NaOH溶液20μ
を加えてNaOHの最小温度を0.1Nにした。これにより試
料中の核酸を変性した。別法として、NaOHの添加および
中和工程を省いて熱変性を利用することもできる。アル
カリ変性工程に引き続き、Tris−HClを含有する中和バ
ッファー70μを加えてpHを中性に調節するとともにNa
OHの最終濃度を0.5Mとし、既に記載したようにして調製
した標識HBVプローブを加えた。上記Tris−HClの代わり
に酢酸バッファーまたはリン酸バッファーを用いること
もできる。一本鎖HBVプローブは125Iで標識したが、
35S、3Hまたはビオチンや抗原のような他の検出マーカ
ーを用いることもできる。SDSをハイブリダイゼーショ
ン溶液中に10％まで含ませることができる。実際のハイ
ブリダイゼーション反応は、65℃で16時間行った。つい
で試料を床容積3.4mlのセファロース CL4B（カラムの
大きさ:0.5cm×20cm）に負荷させた。ゲル床容積内に試
料を入り込ませた後、10mM Tris−HCl、1mM EDTA（pH
8.0）を含む一定容量のバッファーを、加えた溶出バッ
ファーと試料との容量が1.5mlとなるように加えた。つ
いでその排除されたウイルスDNA・プローブハイブリッ
ドの溶出を行った。溶出工程は自動的に停止し、放射活
性または他の検出マーカーの存在について溶出容量を分
析することができる。
陽性対照または陰性対照（HBV DNAを含まない血清）
として既知の量のHBV DNAを含有する試料も、標準とし
て平行して行った。未知の試料を標準試料と比較するこ
とによって、各試料中のHBVの推定量を決定することが
できた。第１図は、既知量のＢ型肝炎ウイルスDNAを含
有する試料の系列希釈したものについて本発明方法によ
りアッセイした結果を示す。
実施例２ ハイブリダイズした目的DNA・標識プローブの溶出デー
タ 実施例１のカラムおよび放射活性プローブを用いて生
物学的試料中のHBV DNAを検出した。陰性対照としてＢ
型肝炎マーカーに対し陰性の血清試料を用いた。また陽
性対照としてＢ型肝炎の慢性保菌者から採った血清試料
を用いた。実施例１に記載したハイブリダイゼーション
を65℃で16時間行なった。実施例１に記載のハイブリダ
イゼーション混合物をカラムに入れ、10mM Tris（pH8.
0）および1mM EDTAを含むバッファーで溶出した。第２
図はゲル排除クロマトグラフィーカラムからの溶出グラ
フを示す。目的Ｂ型肝炎ウイルスDNAおよびハイブリダ
イズしたプローブはボイド容積中（フラクション１〜3
3）に含まれ、ハイブリダイズしなかったプローブはカ
ラムにより遅延された包含容積中に溶出された。
実施例３ 組織培養中のHIV特異配列のアッセイ （Ａ）組織培養上澄み液 120mMバナジル、10％SDSおよびプロテイナーゼK21mg/
mlの溶液25μを、感染させていないもしくは前以てHI
Vで感染させたリンパ球（H9細胞）の細胞培養から得た
上澄み試料200μに加えた。室温で１時間インキュベ
ートした後、0.5M NaClおよびHIV配列からの23ヌクレ
オチドを有する32P−オリゴマープローブ［Cell、401、
10（1985）に開示］を含むプローブ混合物75μを加え
た。典型的なプローブは732〜753塩基を相補的な配列を
含んでいた。45℃で16時間インキュベートしたのち試料
をセファロース CL4Bカラムに流し、10mM Tris（pH8.
0）を含むバッファー1420μで溶出した。溶出液に含
まれていた全1720μについて放射活性をカウントし
た。典型的な陰性対照は82cpmを含んでおり、一方、典
型的な陽性対照は3000cpmを含んでいた。
（Ｂ）組織培養細胞 上記（Ａ）の培養からの細胞をアッセイすることもで
きる。既知数の細胞を含む細胞ペレットを、遠心分離し
て組織培養培地を取り除くことによって調製する。細胞
を食塩水などのバッファー200μ中に再懸濁し、上記
（Ａ）記載の試料と同様にして処理する。ハイブリダイ
ゼーションを行う前にさらに試料を熱変性する工程を加
えることもできる。
（Ｃ）組織培養細胞の核酸抽出物 マニアティスら記載の方法（前述）のような当業者に
よく知られた方法により組織培養細胞もしくは上澄み液
から核酸（DNAまたはRNA）を抽出し、10mM Trisバッフ
ァー（pH8.0）200μ中に再懸濁させることもできる。
ついで試料を上記（Ｂ）に記載したようにして処理す
る。患者から直接採取したリンパ球またはマクロファー
ジ調製物を用いてもよい。第２表は、組織培養細胞から
抽出されたDNAのアッセイから得られた１分間当たりの
カウントを示す。
実施例４ ビオチン標識プローブを用いたＢ型肝炎ウイルスDNAの
アッセイ 酵素・抗体複合体を以下のようにして調製した。ウイ
ルソン［Wilson,Immunofluoresc.Relat.Staining.Tec
h.,Proc.Int.Conf.,6thedithion:Knapp,Holubar,Wick,E
lsevier,Amsterdam（1978）］記載のペンオキシダーゼ
法により、ビオチンに特異的な抗体を西洋ワサビペルオ
キシダーゼと複合させた。Ａ−50Mアガロース上でのゲ
ル排除クロマトグラフィーにより、低分子量複合体（MW
≦250,000）を調製した。カラムに保持された複合体100
μを、10mM Tris（pH8.0）100μ中のHBV挿入部含
有M13ファージDNA100ngとともに40℃で12分間インキュ
ベートした。上記HBV挿入部は、ビオチン化UTPを含むニ
ック翻訳したHBV特異的プローブ5ngと65℃で25分間前以
てハイブリダイズさせてあった。陰性対照はHBV配列を
含まない10mM Tris（pH8.0）100μからなっており、
陽性対照と同様にして処理した。ついで試料を10ml床容
積のアガロースＡ−50M（バイオ・ラド社より市販）を
含むカラムに流し、100μのフラクションを溶出し
た。22のフラクションを集めた。過酸化水素を含む酢酸
−リン酸バッファー中のOPD（オルトフェニレンジアミ
ン）の溶液250μを加えた。この混合物を室温で４分
間インキュベートし、ついで1N H2SO4 1mlを加えた。
各試料の492nmでの吸光度を読み取った。その結果を第
３表に示す。結果は陽性対照／陰性対照の吸光度比とし
て表される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、125I標識プローブを用いたＢ型肝炎ウイルス
DNAアッセイの対数−対数プロットで表示した標準曲線
を表すグラフである。第２図は、実施例２でのゲル排除
クロマトグラフィーカラムからの溶出データを表すグラ
フである。 第１図におけるデータは48アッセイの平均値±S.D.で示
し、また縦軸のS/Nは下記式で示される値を意味する。

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）液体媒質中で少なくとも１種の一本
    鎖標識核酸プローブとハイブリダイズすることが可能な
    目的核酸配列を含む未精製の生物学的試料を調製し、そ
    の際、該プローブは、該目的核酸配列にハイブリダイズ
    したときに、ハイブリダイズしたプローブ／目的核酸配
    列複合体をハイブリダイズしなかったプローブから分子
    量に基づいて分離することができるような長さを単独ま
    たは組み合わせて有しており、該長さは該目的核酸配列
    の長さの20％未満である、 （ｂ）該生物学的試料をハイブリダイズ条件下で標識核
    酸プローブと混合し、 （ｃ）ゲル排除クロマトグラフィーにより、ハイブリダ
    イズしなかったプローブをハイブリダイズしたプローブ
    から分離し、ついで （ｄ）試料中の目的核酸配列を測定するために、ハイブ
    リダイズした標識核酸プローブの存在を検出することを
    特徴とする、生物学的試料中の目的核酸配列の検出方
    法。
  2. 【請求項２】工程（ｂ）の前に該試料をプロテイナーゼ
    で処理する特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
  3. 【請求項３】工程（ｂ）の前に該試料を変性させる特許
    請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
  4. 【請求項４】工程（ｂ）の前または工程（ｂ）のあいだ
    に、前記標識核酸プローブがハイブリダイズする領域と
    は異なる領域で目的核酸配列とハイブリダイズする第２
    の核酸プローブを、前記目的核酸配列と混合する特許請
    求の範囲第（１）項記載の検出方法。
  5. 【請求項５】第２の核酸プローブが、一層高分子量の他
    の分子への結合を可能とする特異的結合ペアの一方を含
    むことによりプローブ／目的核酸配列複合体の有効な分
    子量を増大させる特許請求の範囲第（４）項記載の検出
    方法。
  6. 【請求項６】第２の核酸プローブがDNAである特許請求
    の範囲第（４）項記載の検出方法。
  7. 【請求項７】目的核酸配列が病原体の特性を示す配列で
    ある特許請求の範囲第（１）項記載の検出方法。
  8. 【請求項８】病原体が原核細胞または真核細胞である特
    許請求の範囲第（７）項記載の検出方法。
  9. 【請求項９】（ａ）目的核酸配列とハイブリダイズする
    ことのできる少なくとも１種の標識核酸プローブ、該プ
    ローブは、該目的核酸配列にハイブリダイズしたとき
    に、ハイブリダイズしたプローブ／目的核酸配列複合体
    をハイブリダイズしなかったプローブから分子量に基づ
    いて分離することができるような長さを単独または組み
    合わせて有している、 および （ｂ）該標識核酸プローブにハイブリダイズした該目的
    核酸配列を、ハイブリダイズしなかったプローブから分
    離するのに適したゲル排除クロマトグラフィー装置 からなる、生物学的試料中の目的核酸配列検出用キッ
    ト。
  10. 【請求項１０】標識核酸プローブの標識が、放射性同位
    元素、酵素、蛍光剤、化学発光分子、放射線不透過性物
    質および特異的結合ペアの一方よりなる群から選ばれた
    ものである特許請求の範囲第（９）項記載のキット。
  11. 【請求項１１】さらにプロテイナーゼを含む特許請求の
    範囲第（10）項記載のキット。
  12. 【請求項１２】さらに変性用溶液を含む特許請求の範囲
    第（９）項記載のキット。
  13. 【請求項１３】さらにカラムクロマトグラフィー溶出用
    バッファーを含む特許請求の範囲第（９）項記載のキッ
    ト。
  14. 【請求項１４】（ａ）目的核酸配列と同一の配列を含む
    一本鎖鋳型DNAを精製し、 （ｂ）該鋳型DNAに核酸プライマー配列をアニーリング
    し、 （ｃ）DNAポリメラーゼＩのクレノー断片、およびヌク
    レオチドdATP、dCTP、dGTPおよびdUTPまたはdTTPのいず
    れかを付加することによって該プライマー配列を伸長
    し、その際、該ヌクレオチドの少なくとも一種を標識
    し、また所望の前以て決定した範囲の長さの標識核酸プ
    ローブが得られるようにプライマー伸長を停止させるべ
    く選択した限定濃度で該ヌクレオチドの一種を加え、つ
    いで （ｄ）工程（ｃ）からの核酸プローブを変性条件下でサ
    イズに基づいて精製、単離して該前以て決定した長さの
    プローブを得る ことを特徴とする、前以て決定した所望の長さを有する
    一本鎖標識核酸プローブの製造方法。
  15. 【請求項１５】精製および単離をクロマトグラフィーに
    より行う特許請求の範囲第（14）項記載の方法。
  16. 【請求項１６】クロマトグラフィーがゲル排除クロマト
    グラフィーである特許請求の範囲第（15）項記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】標識が、放射性同位元素、酵素、蛍光
    剤、化学発光分子、放射線不透過性物質および特異的結
    合ペアの一方よりなる群から選ばれたものである特許請
    求の範囲第（14）項記載の方法。
  18. 【請求項１８】伸長工程を、使用したクレノー断片の最
    適温度以下の温度で行う特許請求の範囲第（14）項記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】伸長工程を約15℃で行う特許請求の範囲
    第（14）項記載の方法。
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