JPH0743376B2 - 核酸配列の検定方法及び分子遺伝子プローブ - Google Patents
核酸配列の検定方法及び分子遺伝子プローブInfo
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- JPH0743376B2 JPH0743376B2 JP59112156A JP11215684A JPH0743376B2 JP H0743376 B2 JPH0743376 B2 JP H0743376B2 JP 59112156 A JP59112156 A JP 59112156A JP 11215684 A JP11215684 A JP 11215684A JP H0743376 B2 JPH0743376 B2 JP H0743376B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Description
【発明の詳細な説明】 〔概要〕 修飾遺伝子プローブにイメージ化処理を組み合わせて核
酸が存在すると考えられる試料内の存在すると考えられ
る核酸の存在とその量を検定する方法。プローブは、付
加によって修飾され、キットとして使用できる遺伝子プ
ローブを修飾し簡単で効果的な技法を提供する。遺伝子
プローブは、次に核酸が存在すると考えられる試料のDN
AまたはRNAと接触させ、それらとハイブリダイゼーショ
ンを行う。修飾プローブを使用して検定を行うキットも
開示されている。
酸が存在すると考えられる試料内の存在すると考えられ
る核酸の存在とその量を検定する方法。プローブは、付
加によって修飾され、キットとして使用できる遺伝子プ
ローブを修飾し簡単で効果的な技法を提供する。遺伝子
プローブは、次に核酸が存在すると考えられる試料のDN
AまたはRNAと接触させ、それらとハイブリダイゼーショ
ンを行う。修飾プローブを使用して検定を行うキットも
開示されている。
（１）発明の分野 本発明は、分子遺伝子プローブをDNAまたはRNAに基づく
検定技術の一部として使用し、単一または二重ストラン
ドの生物体核酸を検定する方法に関する。
検定技術の一部として使用し、単一または二重ストラン
ドの生物体核酸を検定する方法に関する。
特に、本発明の分子遺伝子プローブは存在すると考えら
れる核酸を含有する対象たる試料において、ウイルス、
遺伝子、遺伝子配列または遺伝子産物、例えば酵素コー
ドの存在を決めるための検定（アッセイ）技術として重
要であり、その検定実施の際、存在すると考えられる核
酸はこのプローブにハイブリダイズされ、標識試剤と複
合体を形成するが、複合体の存在が定量的に検定できる
のである。
れる核酸を含有する対象たる試料において、ウイルス、
遺伝子、遺伝子配列または遺伝子産物、例えば酵素コー
ドの存在を決めるための検定（アッセイ）技術として重
要であり、その検定実施の際、存在すると考えられる核
酸はこのプローブにハイブリダイズされ、標識試剤と複
合体を形成するが、複合体の存在が定量的に検定できる
のである。
（２）研究の背景と従来の技術についての説明 本発明は、ウイルス性遺伝子、遺伝子配列、酵母のコー
ドなどの遺伝子生産物が存在するかどうかを検定する技
術である。
ドなどの遺伝子生産物が存在するかどうかを検定する技
術である。
このような技術は、診断機能上の価値を有し、また、限
られた実験室的技術のみを有する研究者でも容易に実施
できるキットとして特に有用である。特殊な病原体の存
在を検査でき、特異性を有しており存在すると考えられ
る病原体に特異性をもつ核酸の存在に感作することによ
って機能するキットに適した技術が特別に要求されてい
る。このような技術は正確なだけでなく、最小限の操作
で済むことが、実験室の技術者にも、また検査に使用す
る試薬の製造にとっても望ましいことは明らかである。
られた実験室的技術のみを有する研究者でも容易に実施
できるキットとして特に有用である。特殊な病原体の存
在を検査でき、特異性を有しており存在すると考えられ
る病原体に特異性をもつ核酸の存在に感作することによ
って機能するキットに適した技術が特別に要求されてい
る。このような技術は正確なだけでなく、最小限の操作
で済むことが、実験室の技術者にも、また検査に使用す
る試薬の製造にとっても望ましいことは明らかである。
この検定の原理は、DNAやRNAの検出に基づくことが望ま
しい。なぜならこのような技術を用いると、徴候が明白
に現れない時点でもその病気を検出することができるか
らである。これらの技術はウイルス性の病気の病原菌の
検定で、特定の組織内に特定のウイルスが存在するかど
うかを判定したい場合に特に興味深い技術である。
しい。なぜならこのような技術を用いると、徴候が明白
に現れない時点でもその病気を検出することができるか
らである。これらの技術はウイルス性の病気の病原菌の
検定で、特定の組織内に特定のウイルスが存在するかど
うかを判定したい場合に特に興味深い技術である。
この技術は、存在すると考えられるウイルス性DNAとハ
イブリダイズすることのできるプローブDNAに対して放
射性同位元素で標識化し、それを試料に加えることを内
容とするハイブリダイゼーション技術を用いることによ
って、特定のウイルス性DNA及びRNAの存在を検定するも
のである。次に、標準的な計数及びイメージ化技術を用
いることによって、存在すると考えられるDNAの存在と
その量を検定することができる。
イブリダイズすることのできるプローブDNAに対して放
射性同位元素で標識化し、それを試料に加えることを内
容とするハイブリダイゼーション技術を用いることによ
って、特定のウイルス性DNA及びRNAの存在を検定するも
のである。次に、標準的な計数及びイメージ化技術を用
いることによって、存在すると考えられるDNAの存在と
その量を検定することができる。
このような技術は、Falkow等のU.S.P.4,358,535に広く
開示されているが、そこでは、存在すると考えられる変
性DNA（またはRNA）が、標識化された単一ストランドの
DNA（RNA）プローブと接触される。特殊な変性技術もそ
こに開示されている。存在すると考えられる変性DNAと
ハイブリダイズするようにプローブが選択される。スク
リーン技術は、ウイルス（特に生殖ヘルペスがあげられ
る）菌類、原生動物、カビ等をスクリーニングするのに
適しているとされている。使用される標識は、一般に放
射性核種が勧められているが、この特許では、検出のた
めのプローブに特異的に結合する抗体を用いればよい場
合があると記述してある。このような場合には、抗体自
体に標識が付けられる。リストされた標識には、放射性
標識、標識を付けられた抗体に対して特異性を持つ結合
子として用いることのできる配位子、蛍光発生剤、化学
発光剤、酵素、標識を付された配位子との特定の結合対
として作用する抗体等が含まれる。
開示されているが、そこでは、存在すると考えられる変
性DNA（またはRNA）が、標識化された単一ストランドの
DNA（RNA）プローブと接触される。特殊な変性技術もそ
こに開示されている。存在すると考えられる変性DNAと
ハイブリダイズするようにプローブが選択される。スク
リーン技術は、ウイルス（特に生殖ヘルペスがあげられ
る）菌類、原生動物、カビ等をスクリーニングするのに
適しているとされている。使用される標識は、一般に放
射性核種が勧められているが、この特許では、検出のた
めのプローブに特異的に結合する抗体を用いればよい場
合があると記述してある。このような場合には、抗体自
体に標識が付けられる。リストされた標識には、放射性
標識、標識を付けられた抗体に対して特異性を持つ結合
子として用いることのできる配位子、蛍光発生剤、化学
発光剤、酵素、標識を付された配位子との特定の結合対
として作用する抗体等が含まれる。
ヨーロッパ特許願No.0062286は、核酸のハイブリダイゼ
ーションによってＢ型肝炎ビールスを検出するための検
査キットと方法を開示している。ハイブリダイゼーショ
ンプローブが使用されれば、これによりシンチレーショ
ン計数技術で検定が行われる。
ーションによってＢ型肝炎ビールスを検出するための検
査キットと方法を開示している。ハイブリダイゼーショ
ンプローブが使用されれば、これによりシンチレーショ
ン計数技術で検定が行われる。
ロシア特許649,751は、DNAを微生物から精製し、このDN
Aを照合菌株からのDNAとハイブリダイズさせて微生物を
同定する方法を開示している。このDNAは、放射性チミ
ンによって標識が付けられる。
Aを照合菌株からのDNAとハイブリダイズさせて微生物を
同定する方法を開示している。このDNAは、放射性チミ
ンによって標識が付けられる。
これらの方法の欠点の１つは、プローブの準備中に放射
性物質を扱わねばならず、これは明らかに満足できない
条件である。これらの技術についてのもう１つの欠点
は、このような酵素的処理に比較的複雑な装置が必要な
ことである。
性物質を扱わねばならず、これは明らかに満足できない
条件である。これらの技術についてのもう１つの欠点
は、このような酵素的処理に比較的複雑な装置が必要な
ことである。
米特許4,302,204（ウォール等）と4,139,346（ラバニイ
等）は、ともにRNA及びDNAストランドがハイブリダイゼ
ーション技術の一部として、標識付けられたプローブと
ハイブリダイズするハイブリダイゼーション技術を開示
している。
等）は、ともにRNA及びDNAストランドがハイブリダイゼ
ーション技術の一部として、標識付けられたプローブと
ハイブリダイズするハイブリダイゼーション技術を開示
している。
DNA自体は、ここで用いようとしているスクリーニング
技術のための十分な抗原ではないことに注意すべきであ
る。ウイルス性DNAの抗体反応は、不十分であることが
多く、抗原として使用するには不十分である。
技術のための十分な抗原ではないことに注意すべきであ
る。ウイルス性DNAの抗体反応は、不十分であることが
多く、抗原として使用するには不十分である。
DNA修飾および修飾した抗原によって抗体反応を引き出
すという方法は、周知の技術である。MunnsおよびLisze
wskiによる論文；「修飾したヌクレオシドに特異的な抗
体：核酸の分離と特徴付けのための免疫化学的方法」
（「核酸研究と分子生物学の進歩、第24巻109頁−165頁
（1980年）」）は、核酸の修飾成分に対して特異性のあ
る抗体について述べている。
すという方法は、周知の技術である。MunnsおよびLisze
wskiによる論文；「修飾したヌクレオシドに特異的な抗
体：核酸の分離と特徴付けのための免疫化学的方法」
（「核酸研究と分子生物学の進歩、第24巻109頁−165頁
（1980年）」）は、核酸の修飾成分に対して特異性のあ
る抗体について述べている。
Briscoe等による論文；「アルキル化DNAにおけるO6−メ
チルグアニンの免疫学による検出」（Biochemistry,第1
7巻,1896〜1901頁（1978年））は、アルキル化DNAに直
接結合するO6−メチルグアニンに対して特異性をもつ抗
体の使用の可能性について述べている。これらの抗体を
用いる放射性免疫検定システムは、ある種のアルキル化
剤で処理したDNAに含まれるO6−メチルグアニンを検出
するのに有益な方法であると述べている。
チルグアニンの免疫学による検出」（Biochemistry,第1
7巻,1896〜1901頁（1978年））は、アルキル化DNAに直
接結合するO6−メチルグアニンに対して特異性をもつ抗
体の使用の可能性について述べている。これらの抗体を
用いる放射性免疫検定システムは、ある種のアルキル化
剤で処理したDNAに含まれるO6−メチルグアニンを検出
するのに有益な方法であると述べている。
Sage等の論文；「発癌性−Ｎ−アセトキシ−Ｎ−アセチ
ル−２−アミノフルオレンで修飾されたDNAに対する抗
体反応」（Biochemistry,第18巻,1328〜1332頁（1979
年））は、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−アセチル−２−アミノ
フルオレンで修飾されたDNAの抗体反応について記述し
ている。これらの抗体は、非修飾型DNAには反応せず修
飾されたDNAに反応する。
ル−２−アミノフルオレンで修飾されたDNAに対する抗
体反応」（Biochemistry,第18巻,1328〜1332頁（1979
年））は、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−アセチル−２−アミノ
フルオレンで修飾されたDNAの抗体反応について記述し
ている。これらの抗体は、非修飾型DNAには反応せず修
飾されたDNAに反応する。
Lovelessによる論文；「デオキシグアノシンのO6−アル
キル化と、ニトロソアミンとニトロソアミドの突然変異
誘発性と発癌性との関連性（Nature,第223巻、（1969年
７月12日））」は、核酸基を修飾させるＮ−エチル−Ｎ
−ニトロソウレアなどの生物学的アルキル化剤の使用に
ついて述べている。
キル化と、ニトロソアミンとニトロソアミドの突然変異
誘発性と発癌性との関連性（Nature,第223巻、（1969年
７月12日））」は、核酸基を修飾させるＮ−エチル−Ｎ
−ニトロソウレアなどの生物学的アルキル化剤の使用に
ついて述べている。
このように、核酸塩基のエチル化を含む修飾処理は周知
の現象であるが、この原理をハイブリダイゼーションと
組み合わせて、有効な検定技術の一部として用いること
の利点は、これまで一般的には理解されず、最大の利益
をもって使用されていなかった。実際に、これまでハイ
ブリダイゼーションを修飾手段と併用して検定に用いる
ことの提案は、少なくとも一例はあるが、これらはこの
２つの技術を組み合わせて最大の利点を引き出すもので
はなく、ごく制限された有用性だけしか持たない検定方
法にすぎなかった。
の現象であるが、この原理をハイブリダイゼーションと
組み合わせて、有効な検定技術の一部として用いること
の利点は、これまで一般的には理解されず、最大の利益
をもって使用されていなかった。実際に、これまでハイ
ブリダイゼーションを修飾手段と併用して検定に用いる
ことの提案は、少なくとも一例はあるが、これらはこの
２つの技術を組み合わせて最大の利点を引き出すもので
はなく、ごく制限された有用性だけしか持たない検定方
法にすぎなかった。
このような技術は、ヨーロッパ出願S.N.82321824.9にも
見られる（1982年11月13日公告）。ここでは、二重スト
ランドRNA、DNAデュープレックスまたはDNA−RNAハイブ
リッドに組み入れられたとき、ポリペプチドと検出可能
な複合体を形成することができ、少なくとも３ケの炭素
原子からなる分子の部分（moiety）（例えば、ビチオ
ン）を共有結合することによって、プリンまたはピリミ
ジン塩基を修飾させる方法が開示されている。ビチオン
を含むプローブに対するポリペプチド検出子としてアビ
ジン、ストレプトアビジンまたはアンチビオチン免疫グ
ロブリンを用いることができる。特にビオチン型プロー
ブの検出に対して望ましいプロテインは、抗ビオチン免
疫グロブリンである。この抗体には、ペルオキシダーゼ
などの酵素で標識化することができる。30頁37行目から
31頁１〜14行目には、ビオチン成分に対する抗体の使用
について述べている。33頁に図があり、ビオチンやハプ
テンを検出するための抗体の使用について述べてある。
IgG−ペルオキシダーゼの例では、抗体を付けた酵素の
検出システムについて述べている。34頁25〜37行と35頁
１〜２行目には、問題のヌクレオチド発列の存在を検出
するための修飾ヌクレオチドの利用方法について記述す
る。この一般プロトコルは、臨床の試料におけるウイル
ス、バクテリア、カビ菌類、または寄生虫源の核酸配列
の検出に適用することができる。
見られる（1982年11月13日公告）。ここでは、二重スト
ランドRNA、DNAデュープレックスまたはDNA−RNAハイブ
リッドに組み入れられたとき、ポリペプチドと検出可能
な複合体を形成することができ、少なくとも３ケの炭素
原子からなる分子の部分（moiety）（例えば、ビチオ
ン）を共有結合することによって、プリンまたはピリミ
ジン塩基を修飾させる方法が開示されている。ビチオン
を含むプローブに対するポリペプチド検出子としてアビ
ジン、ストレプトアビジンまたはアンチビオチン免疫グ
ロブリンを用いることができる。特にビオチン型プロー
ブの検出に対して望ましいプロテインは、抗ビオチン免
疫グロブリンである。この抗体には、ペルオキシダーゼ
などの酵素で標識化することができる。30頁37行目から
31頁１〜14行目には、ビオチン成分に対する抗体の使用
について述べている。33頁に図があり、ビオチンやハプ
テンを検出するための抗体の使用について述べてある。
IgG−ペルオキシダーゼの例では、抗体を付けた酵素の
検出システムについて述べている。34頁25〜37行と35頁
１〜２行目には、問題のヌクレオチド発列の存在を検出
するための修飾ヌクレオチドの利用方法について記述す
る。この一般プロトコルは、臨床の試料におけるウイル
ス、バクテリア、カビ菌類、または寄生虫源の核酸配列
の検出に適用することができる。
上述した如く、この技術の用途は限定されており、処理
は非常に難しい。この記述を用いる場合は、ストランド
の１つに刻み目を付けたり間隙を開けたりするために、
テンプレート核酸のヌクレアーゼ処理が必要である。こ
こではビオチン置換塩基がポリメラーゼを使ってDNAに
挿入される。修飾DNAは、ここで酵素でラベルされたア
ンチビオチンと複合化し、アンチビオチン−酵素−DNA
複合体を形成することができる。ここで二重ストランド
DNAが開裂し、複合化ストランドと共にプローブとして
使用することができる。このような技術では、二重スト
ランド型DNAにのみ修飾を生じることが条件となる。こ
こで修飾された単一ストランドを使用して、二重ストラ
ンドの核酸を含む生物体だけをハイブリダイズすること
ができる。すなわち、単一ストランドRNAウイルスなど
の物質は、この特許出願の中で提案された方法を使用す
ることによっては修飾させまたは検出することはできな
い。
は非常に難しい。この記述を用いる場合は、ストランド
の１つに刻み目を付けたり間隙を開けたりするために、
テンプレート核酸のヌクレアーゼ処理が必要である。こ
こではビオチン置換塩基がポリメラーゼを使ってDNAに
挿入される。修飾DNAは、ここで酵素でラベルされたア
ンチビオチンと複合化し、アンチビオチン−酵素−DNA
複合体を形成することができる。ここで二重ストランド
DNAが開裂し、複合化ストランドと共にプローブとして
使用することができる。このような技術では、二重スト
ランド型DNAにのみ修飾を生じることが条件となる。こ
こで修飾された単一ストランドを使用して、二重ストラ
ンドの核酸を含む生物体だけをハイブリダイズすること
ができる。すなわち、単一ストランドRNAウイルスなど
の物質は、この特許出願の中で提案された方法を使用す
ることによっては修飾させまたは検出することはできな
い。
さらにこのシステムでは、ヌクレアーゼやポリメラーゼ
などの反応試剤も必要とし、またビオチン塩基を予め合
成することを要する。これらの物質を使用すると、技術
の複雑さが増すだけでなく、高度の純度も要求される。
また、変異された核酸鎖の切断および再生に酵素を使用
することは、このキットの試薬の製造に時間と費用を必
要とし、このため、診断用キットにこの技術を使用する
価値がさらに低下する。
などの反応試剤も必要とし、またビオチン塩基を予め合
成することを要する。これらの物質を使用すると、技術
の複雑さが増すだけでなく、高度の純度も要求される。
また、変異された核酸鎖の切断および再生に酵素を使用
することは、このキットの試薬の製造に時間と費用を必
要とし、このため、診断用キットにこの技術を使用する
価値がさらに低下する。
この特許の62頁〜63頁には、付加によるポリヌクレオチ
ドの修飾について開示されている。水銀塩を用いて、水
銀化誘導体を形成させる。水銀化誘導体は、K2PdCl4の
存在下、リンカーアーム及び反応性末端官能基または修
飾剤自体と反応させる。このように、３つでないにして
も、少なくとも２つのステップが修飾を行うために必要
となる。
ドの修飾について開示されている。水銀塩を用いて、水
銀化誘導体を形成させる。水銀化誘導体は、K2PdCl4の
存在下、リンカーアーム及び反応性末端官能基または修
飾剤自体と反応させる。このように、３つでないにして
も、少なくとも２つのステップが修飾を行うために必要
となる。
このような工程はそれぞれステップ間で精製が必要なの
で満足とは言えない。水銀を使用することはインターカ
レーション（挿入）のために二重ストランド・システム
に対してこの処理が使用できなくなり、大きな欠点とな
る。更に前述のとおり、分子の一部分の付加される位置
のためにリンカーアームが必要となる。リンカーアーム
が必要でない技術の方がより望ましい。更に、開示され
た技術では、一つの塩基に対して１つの付加のみが可能
であるが、通常は１つの塩基に複数の付加ができる方が
望ましい。
で満足とは言えない。水銀を使用することはインターカ
レーション（挿入）のために二重ストランド・システム
に対してこの処理が使用できなくなり、大きな欠点とな
る。更に前述のとおり、分子の一部分の付加される位置
のためにリンカーアームが必要となる。リンカーアーム
が必要でない技術の方がより望ましい。更に、開示され
た技術では、一つの塩基に対して１つの付加のみが可能
であるが、通常は１つの塩基に複数の付加ができる方が
望ましい。
発明の要約 本願発明の目的は、抗体特異性をもち費用が少なくてす
み、そのための試薬を容易に合成することができ、純度
を考慮せずに単一または二重のストランドの生物体核酸
の検定ができ、広い有用性をもった検定技術またはスク
リーニング技術を提供することである。
み、そのための試薬を容易に合成することができ、純度
を考慮せずに単一または二重のストランドの生物体核酸
の検定ができ、広い有用性をもった検定技術またはスク
リーニング技術を提供することである。
この発明の更なる目的は、強い抗原を用い、すなわち強
い抗体反応がもたらされても、存在すると考えられる核
酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが実質的
に妨害されることのない技術を提供することである。
い抗体反応がもたらされても、存在すると考えられる核
酸に対するプローブのハイブリダイゼーションが実質的
に妨害されることのない技術を提供することである。
この発明のもう１つの目的は、放射性核種などの物質を
浴びることを最小限にしたいと希望する場合に、放射性
核種を使用しなくてもすむ技術を提供することである。
浴びることを最小限にしたいと希望する場合に、放射性
核種を使用しなくてもすむ技術を提供することである。
この発明の更に他の目的は、一工程でなされる修飾剤付
加反応を内容とするプローブ形成技術であり、水銀を使
用せず、核酸の単一塩基に複数個修飾剤の付加を可能と
する技術を提供することにある。
加反応を内容とするプローブ形成技術であり、水銀を使
用せず、核酸の単一塩基に複数個修飾剤の付加を可能と
する技術を提供することにある。
以上述べた目的その他を達成するために、試料中に存在
すると考えられる核酸の存在と量を判定することのでき
る本発明の検定法が用いられるが、この発明は、次の段
階で構成される。
すると考えられる核酸の存在と量を判定することのでき
る本発明の検定法が用いられるが、この発明は、次の段
階で構成される。
ａ）単一および二重ストランドのDNAおよびRNAを含む核
酸が存在する場合に、その核酸とハイブリダイズしてハ
イブリダイゼーション複合体を形成するように選択され
た修飾核酸であって、その核酸の塩基を一工程修飾処理
することにより形成したものと、該試料を接触させる段
階、 （ｂ）該修飾核酸を、該修飾核酸の少なくとも修飾部分
に対し特異性を有し、それと複合体（コンプレックス）
を形成するように選択した標識付き抗体に接触させてハ
イブリダイゼーション複合体を形成させる段階、 （ｃ）存在すると考えられる核酸の存在またはその量を
示す表示として、標識を付けた抗体の存在および／また
はその量を測定する段階。
酸が存在する場合に、その核酸とハイブリダイズしてハ
イブリダイゼーション複合体を形成するように選択され
た修飾核酸であって、その核酸の塩基を一工程修飾処理
することにより形成したものと、該試料を接触させる段
階、 （ｂ）該修飾核酸を、該修飾核酸の少なくとも修飾部分
に対し特異性を有し、それと複合体（コンプレックス）
を形成するように選択した標識付き抗体に接触させてハ
イブリダイゼーション複合体を形成させる段階、 （ｃ）存在すると考えられる核酸の存在またはその量を
示す表示として、標識を付けた抗体の存在および／また
はその量を測定する段階。
このような技術を使うことによって、単一および二重ス
トランドのDNAおよびRNAを含む生成物の核酸を他の方法
で要求される純度よりも低い純度条件下で検定すること
が可能となる。
トランドのDNAおよびRNAを含む生成物の核酸を他の方法
で要求される純度よりも低い純度条件下で検定すること
が可能となる。
また、このような技術を用いることによって、放射性で
ない標識を選択することができ、これによって放射性物
質を扱いたくない場合にも容易に標識を用いることがで
きる。標識は、直接酵素を用いることができ、または、
例えばそれ自体酵素と複合化する（複合体を形成する）
１次抗体に対する２次抗体を用いることができる。
ない標識を選択することができ、これによって放射性物
質を扱いたくない場合にも容易に標識を用いることがで
きる。標識は、直接酵素を用いることができ、または、
例えばそれ自体酵素と複合化する（複合体を形成する）
１次抗体に対する２次抗体を用いることができる。
この技術の特別な利点は、酵素または、他の核酸処理技
術を用いることなく、DNAまたはRNAプローブ自体を、直
接修飾させることである。特にヌクレアーゼとポリメラ
ーゼの使用を避けることができる。
術を用いることなく、DNAまたはRNAプローブ自体を、直
接修飾させることである。特にヌクレアーゼとポリメラ
ーゼの使用を避けることができる。
プローブ自体は、単一ストランドか少なくとも部分的変
性の二重ストランドである。プローブの一次的な要件
は、修飾されたときに存在すると考えられる核酸とのハ
イブリダイゼーションが可能であることである。
性の二重ストランドである。プローブの一次的な要件
は、修飾されたときに存在すると考えられる核酸とのハ
イブリダイゼーションが可能であることである。
DNAまたはRNAの特別な修飾は核酸塩基の修飾を含み、特
に望ましい実施例は、塩基のアルキル化である。アルキ
ル化はアルキルニトロソウリアなどのアルキル化合物を
用いることによって行われる。更にメチル、エチルまた
はプロピルニトロソウリア化合物も好ましいものであ
る。特に望ましい実施例の１つでは、アルキル化合物と
して、Ｎ−エチル−ニトロソウレアを用いる。類似する
抗体反応を引き出す他のアルキル化合物も、本発明の範
囲内で、実質的に同様の方法で使用することができる。
使用する特定の化合物によっては、他の位置もアルキル
化することができるが、グアニジンのO6の位置のアルキ
ル化が望ましい。この発明に準じて使用できる付加修飾
反応については、Briscoe他著（前記）を参照のこと。
この論文の開示は参照として記載する。本発明の別の実
施例によると、修飾はスルホン化の形を採ることもでき
る。スルホン化技法は、A.M.Poverenny他の論文；「DNA
構造の研究のための免疫化学手法」「分子免疫学」（Pe
rgamon Press Ltd.）に示されている。
に望ましい実施例は、塩基のアルキル化である。アルキ
ル化はアルキルニトロソウリアなどのアルキル化合物を
用いることによって行われる。更にメチル、エチルまた
はプロピルニトロソウリア化合物も好ましいものであ
る。特に望ましい実施例の１つでは、アルキル化合物と
して、Ｎ−エチル−ニトロソウレアを用いる。類似する
抗体反応を引き出す他のアルキル化合物も、本発明の範
囲内で、実質的に同様の方法で使用することができる。
使用する特定の化合物によっては、他の位置もアルキル
化することができるが、グアニジンのO6の位置のアルキ
ル化が望ましい。この発明に準じて使用できる付加修飾
反応については、Briscoe他著（前記）を参照のこと。
この論文の開示は参照として記載する。本発明の別の実
施例によると、修飾はスルホン化の形を採ることもでき
る。スルホン化技法は、A.M.Poverenny他の論文；「DNA
構造の研究のための免疫化学手法」「分子免疫学」（Pe
rgamon Press Ltd.）に示されている。
ニトロソ化、ニトロフェニル化等の他の種類の付加反応
修飾もまた本発明の範囲内として使用することができ
る。
修飾もまた本発明の範囲内として使用することができ
る。
本発明の技術は核酸が存在すると考えられる試料内の核
酸の存在を検査するキットとして使用することができ
る。このようなキットには、核酸が存在する場合には、
その核酸とハイブリダイズしてハイブリダイゼーション
複合体を形成するように選択した修飾核酸プローブの供
給を含む。修飾核酸自体は、プローブ核酸の塩基の修飾
によって生成される。核酸が存在すると考えられる試料
と修飾核酸とを接触させてハイブリダイゼーション複合
体を生成するための手段にはいくつかがある。修飾核酸
の少なくともその修飾部分と複合体を形成するように選
択された抗体が供給される。抗体は、抗体の存在を知ら
せるための標識剤で標識を付けられる。このキットに
は、さらに、修飾核酸と標識を付けた抗体を接触させる
手段と、存在すると考えられるヌクレオチドの存在ある
いはその量を示す表示として標識の存在および／または
その程度を測定する手段も含まれる。
酸の存在を検査するキットとして使用することができ
る。このようなキットには、核酸が存在する場合には、
その核酸とハイブリダイズしてハイブリダイゼーション
複合体を形成するように選択した修飾核酸プローブの供
給を含む。修飾核酸自体は、プローブ核酸の塩基の修飾
によって生成される。核酸が存在すると考えられる試料
と修飾核酸とを接触させてハイブリダイゼーション複合
体を生成するための手段にはいくつかがある。修飾核酸
の少なくともその修飾部分と複合体を形成するように選
択された抗体が供給される。抗体は、抗体の存在を知ら
せるための標識剤で標識を付けられる。このキットに
は、さらに、修飾核酸と標識を付けた抗体を接触させる
手段と、存在すると考えられるヌクレオチドの存在ある
いはその量を示す表示として標識の存在および／または
その程度を測定する手段も含まれる。
プローブ自体も、それが検定において、使いやすさを与
える物であることから本発明の一態様となる。このよう
なプローブは、少なくとも１つの修飾塩基を含む単一あ
るいは部分的に変性した二重ストランドのDNAまたはRNA
分子遺伝子プローブである。水銀あるいはリンカーアー
ムを使用せずに一工程の付加反応で、DNAあるいはRNAに
付着している間に、塩基は修飾される。プローブはさら
に相補的DNAあるいはRNAストランドとハイブリダイズす
るように調製される。ハイブリダイゼーション自体はよ
く知られた技法であり、多くの刊行物、例えばヨーロッ
パ特許出願821026 73.9（1982年10月３日発行）の７頁
に記述されている。もちろん、この発明のプローブは、
この発明の標識剤とて使用される抗体を作るための抗原
の機能を持つ。プローブ自体は、それが単一あるいは二
重ストランドの状態のとき、もしくは、ここに開示され
ている修飾技法が使われ、部分的に変性している状態で
修飾することができる。
える物であることから本発明の一態様となる。このよう
なプローブは、少なくとも１つの修飾塩基を含む単一あ
るいは部分的に変性した二重ストランドのDNAまたはRNA
分子遺伝子プローブである。水銀あるいはリンカーアー
ムを使用せずに一工程の付加反応で、DNAあるいはRNAに
付着している間に、塩基は修飾される。プローブはさら
に相補的DNAあるいはRNAストランドとハイブリダイズす
るように調製される。ハイブリダイゼーション自体はよ
く知られた技法であり、多くの刊行物、例えばヨーロッ
パ特許出願821026 73.9（1982年10月３日発行）の７頁
に記述されている。もちろん、この発明のプローブは、
この発明の標識剤とて使用される抗体を作るための抗原
の機能を持つ。プローブ自体は、それが単一あるいは二
重ストランドの状態のとき、もしくは、ここに開示され
ている修飾技法が使われ、部分的に変性している状態で
修飾することができる。
本発明の好ましい実施例 本発明は、DNAやRNAなどの単一または二重ストランドの
核酸あるいはこれらのヌクレオチドを含む生物体から核
酸の存在および／またはその量を検定するのに適用され
る。本発明に従って検定される核酸は少なくとも10個の
塩基、好ましくは少なくとも50個の塩基を有する。単一
ストランドの核酸を含む生物体の核酸を検定する場合、
変性を行わずに直接ハイブリダイゼーションを行うこと
ができる。
核酸あるいはこれらのヌクレオチドを含む生物体から核
酸の存在および／またはその量を検定するのに適用され
る。本発明に従って検定される核酸は少なくとも10個の
塩基、好ましくは少なくとも50個の塩基を有する。単一
ストランドの核酸を含む生物体の核酸を検定する場合、
変性を行わずに直接ハイブリダイゼーションを行うこと
ができる。
細胞内のDNAの検定を行う前に、その細胞は溶菌処理を
受けなければならない。このためには、標準的な溶菌技
術を用いることができ、所望により、FALKOW等著のU.S.
P.N4358535記載の溶菌技術を用いることができる。
受けなければならない。このためには、標準的な溶菌技
術を用いることができ、所望により、FALKOW等著のU.S.
P.N4358535記載の溶菌技術を用いることができる。
この発明で用いられるその他の溶菌技術は、寒天培地上
のコロニー番号で固定し、溶菌および変性溶液を入れた
別個の試験管にそれらを移し、溶解変性した内容物をニ
トロセルロースまたは活性紙のどちらかの上に移すこと
を内容とするものもある。
のコロニー番号で固定し、溶菌および変性溶液を入れた
別個の試験管にそれらを移し、溶解変性した内容物をニ
トロセルロースまたは活性紙のどちらかの上に移すこと
を内容とするものもある。
二重ストランドの核酸を含む生物体から核酸を検定する
場合には、少なくとも部分的に単一ストランドにするた
めに、核酸の予備的スプリッティング（変性）が必要で
ある。この技術ではすでに知られたものであり、本発明
の一部分を構成するものではない。例えばこの技術の例
としては、Gergen,J.P,Stern,R.HおよびWensink,P.C.著
の「核酸の研究」、第７巻2115−2136ページに開示され
ている。
場合には、少なくとも部分的に単一ストランドにするた
めに、核酸の予備的スプリッティング（変性）が必要で
ある。この技術ではすでに知られたものであり、本発明
の一部分を構成するものではない。例えばこの技術の例
としては、Gergen,J.P,Stern,R.HおよびWensink,P.C.著
の「核酸の研究」、第７巻2115−2136ページに開示され
ている。
核酸が存在すると考えられる物質は液体中に懸濁し、あ
るいは懸濁剤または、例えばセルロースや濾紙等の固体
基質に固定されている状態で検定することができる。検
定の第１ステップでは、検定される物質にできるだけ特
異性を有するテストプローブで、存在すると考えられる
核酸をハイブリダイズする。かくて、本発明のプローブ
は少なくとも10個または好ましくは50個の塩基を有する
核酸が好ましい。
るいは懸濁剤または、例えばセルロースや濾紙等の固体
基質に固定されている状態で検定することができる。検
定の第１ステップでは、検定される物質にできるだけ特
異性を有するテストプローブで、存在すると考えられる
核酸をハイブリダイズする。かくて、本発明のプローブ
は少なくとも10個または好ましくは50個の塩基を有する
核酸が好ましい。
このプローブ自体は、動物の組織またはクローンから抽
出した、DNAまたはRNAの単一ストランド、または部分変
性二重ストランドの核酸で構成される。どちらの技法も
よく知られており、例えば、Krist等著の論文;Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA.78,2772〜2776（1981年）に開示され
ている。
出した、DNAまたはRNAの単一ストランド、または部分変
性二重ストランドの核酸で構成される。どちらの技法も
よく知られており、例えば、Krist等著の論文;Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA.78,2772〜2776（1981年）に開示され
ている。
核酸ストランドにニックや酵素作用の付加を必要としな
い一工程の技術により、好ましくはハイブリダイゼーシ
ョンの前にプローブ自体を修飾する。或いは、プローブ
が単一または二重ストランドである状態で、直接修飾す
るかまたは部分変性の二重ストランドの変性部分を修飾
する。
い一工程の技術により、好ましくはハイブリダイゼーシ
ョンの前にプローブ自体を修飾する。或いは、プローブ
が単一または二重ストランドである状態で、直接修飾す
るかまたは部分変性の二重ストランドの変性部分を修飾
する。
修飾プローブを得るために、色々の修飾手段が用いられ
る。修飾技術の目的は、効果的な抗原であるプローブを
得ることであり、この目的を達成する修飾手段として
は、プローブの使用されるハイブリダイゼーション工程
を妨げたり、あるいは実質的に妨害することがない限り
いかなる修飾手段を用いられる。かくて、本発明で用い
られる修飾用化合物（モディファイアー）としては、ア
ルキル基（３個以下または３個以上の炭素原子を持
つ）、スルフォン基、ニトロソ基、またはニトロフェノ
ール基で置換され、核酸を修飾することのできるものか
らなる群から選択することができる。他の多くの修飾剤
も使用することができる。特にＮ−メチルニトロソウリ
ア、Ｎ−エチルニトロソウリア、Ｎ−プロピルニトロソ
ウリア、Ｎ−ブチルニトロソウリアは、アルキル化剤と
して使用することができると考えられるが、Ｎ−エチル
ニトロソウリアが望ましい。この種のアルキル化技術は
よく知られており、M.F.Rajewsky他の論文；「Immunolo
gical Detection（免疫的検出）」Carcinogen Fundamen
tal Mechanism and Enviromental Effects」D.Reidel p
ublishing,207−218ページ（1980年）によって開示され
ている、しかし、これらの技術はハイブリダイゼーショ
ン検定の一部として使われたことはなかった。これらの
化合物によりアルキル化する際には、核酸の種々の位置
で置換が起こる。
る。修飾技術の目的は、効果的な抗原であるプローブを
得ることであり、この目的を達成する修飾手段として
は、プローブの使用されるハイブリダイゼーション工程
を妨げたり、あるいは実質的に妨害することがない限り
いかなる修飾手段を用いられる。かくて、本発明で用い
られる修飾用化合物（モディファイアー）としては、ア
ルキル基（３個以下または３個以上の炭素原子を持
つ）、スルフォン基、ニトロソ基、またはニトロフェノ
ール基で置換され、核酸を修飾することのできるものか
らなる群から選択することができる。他の多くの修飾剤
も使用することができる。特にＮ−メチルニトロソウリ
ア、Ｎ−エチルニトロソウリア、Ｎ−プロピルニトロソ
ウリア、Ｎ−ブチルニトロソウリアは、アルキル化剤と
して使用することができると考えられるが、Ｎ−エチル
ニトロソウリアが望ましい。この種のアルキル化技術は
よく知られており、M.F.Rajewsky他の論文；「Immunolo
gical Detection（免疫的検出）」Carcinogen Fundamen
tal Mechanism and Enviromental Effects」D.Reidel p
ublishing,207−218ページ（1980年）によって開示され
ている、しかし、これらの技術はハイブリダイゼーショ
ン検定の一部として使われたことはなかった。これらの
化合物によりアルキル化する際には、核酸の種々の位置
で置換が起こる。
スルホン基を与える化合物としては、重亜硫酸塩または
それと例えばPoverenny他の報告（前出）（ここではス
ルホン化の一技術が開示されている）に示されている０
−メチルハイドロキシルアミンとの化合物がある。スル
ホン化は、核酸の６−スルホ−5,6ジハイドロ−４−メ
トキシアミノピリミドン−２の位置で起きる。
それと例えばPoverenny他の報告（前出）（ここではス
ルホン化の一技術が開示されている）に示されている０
−メチルハイドロキシルアミンとの化合物がある。スル
ホン化は、核酸の６−スルホ−5,6ジハイドロ−４−メ
トキシアミノピリミドン−２の位置で起きる。
ニトロソ基とニトロフェニル基を与える化合物および付
加反応によって修飾を行う他の化合物も用いることがで
きる。
加反応によって修飾を行う他の化合物も用いることがで
きる。
上に挙げた種類の化合物を付加させて修飾することで、
プローブはハイブリダイゼーション用として調製され、
ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で核酸が存
在すると考えられる試料と接触させられる。
プローブはハイブリダイゼーション用として調製され、
ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で核酸が存
在すると考えられる試料と接触させられる。
この接触は、種々の技術、例えば液対液接触や基質サポ
ートへの接触などにより行われる。この接触技術は、P.
S.Thomas;Proc.Natl.Acad.Sci,（1980）,5201〜5205に
例示されている。
ートへの接触などにより行われる。この接触技術は、P.
S.Thomas;Proc.Natl.Acad.Sci,（1980）,5201〜5205に
例示されている。
好ましい技術としては検査されるDNA,RNAを、例えば濾
紙片などのセルロースサポートに付着する方法を採る。
特にセルロース、ニトロセルロースフィルタ保持紙が多
孔質であるなしにかかわらず用いられる。このような物
質は、NEW England Nuclearから「Gene Screen Hybridi
zation transfer membrane」として販売されている。
紙片などのセルロースサポートに付着する方法を採る。
特にセルロース、ニトロセルロースフィルタ保持紙が多
孔質であるなしにかかわらず用いられる。このような物
質は、NEW England Nuclearから「Gene Screen Hybridi
zation transfer membrane」として販売されている。
無孔質ののプラスチックなどの他の保持材質も使用する
ことができる。次に、保持材質に固定されたDNAまたはR
NAをハイブリダイズするためにプローブをサポートに接
触させる。これはプローブを含有したゲルに濾紙を接触
させるだけで毛細管作用により、行うことができる。
ことができる。次に、保持材質に固定されたDNAまたはR
NAをハイブリダイズするためにプローブをサポートに接
触させる。これはプローブを含有したゲルに濾紙を接触
させるだけで毛細管作用により、行うことができる。
ハイブリダイゼーション後、好しくはハイブリダイズさ
れた複合体がまた濾紙上にある間に、そのハイブリダイ
ゼーション複合体を検定を可能にする標識剤でラベル
（標識化）する。
れた複合体がまた濾紙上にある間に、そのハイブリダイ
ゼーション複合体を検定を可能にする標識剤でラベル
（標識化）する。
標識剤には酵素、酵素−抗体の複合体（コンプレック
ス）、放射能でラベルした抗体あるいは酵素等が用いら
れる。放射性物質の使用を避けるため、EIAまたは同等
のシステムを例えば比色分析技術と結びつけて用いると
よい。一般的なEIAの技術におけるように、増幅（アン
プリフィケーション）などが用いられる。この発明の長
所は、修飾されたプローブが、特に良い抗原であること
であり、用いられる標識剤が酵素との複合体である本発
明の目的からも好ましいものである。
ス）、放射能でラベルした抗体あるいは酵素等が用いら
れる。放射性物質の使用を避けるため、EIAまたは同等
のシステムを例えば比色分析技術と結びつけて用いると
よい。一般的なEIAの技術におけるように、増幅（アン
プリフィケーション）などが用いられる。この発明の長
所は、修飾されたプローブが、特に良い抗原であること
であり、用いられる標識剤が酵素との複合体である本発
明の目的からも好ましいものである。
抗体は、Poverenny等（前出）、またはMuller.R.Adamki
ewiczおよびM.F.Rajewsky（IARC Scientific Publ.39巻
463〜479頁）に開示された標準技法で得ることができ
る。酵素は、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ヒアルロニダーゼ、アルカリホスファダーゼ、並び
ゐヨーロッパ特許出願S.N.80 30 3405,7（1981年７月21
日発行）の52〜59頁、61〜64頁に開示された酵素が用い
られ、標準法により抗体と複合体（コンプレックス）を
形成させる。
ewiczおよびM.F.Rajewsky（IARC Scientific Publ.39巻
463〜479頁）に開示された標準技法で得ることができ
る。酵素は、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ヒアルロニダーゼ、アルカリホスファダーゼ、並び
ゐヨーロッパ特許出願S.N.80 30 3405,7（1981年７月21
日発行）の52〜59頁、61〜64頁に開示された酵素が用い
られ、標準法により抗体と複合体（コンプレックス）を
形成させる。
本発明を実施例によれ説明する。
実施例Ｉ 感染した細胞内のSV40配列の検出 （この例は現実に実行されたものである） ａ） CV−１細胞をSV40ウイルスに感染させ、さらに16
時間培養した。細胞はトリプシン処理され、最終的に10
00の細胞数となるようにリン酸緩衝溶液で希釈された。
この懸濁液をS.Lavi＆S.Etkin;「Carcinogenesis2」（1
981）,417〜423頁及びGall J.G.＆Pardue M.1.;「P.NA
S.」63（1969）378〜383頁に記述されているようにニト
ロセルロースフィルタで濾過し、DNA変性処理に付し
た。Denhardtバッファ（Denhardt D.T.;相補的DNAの探
知のための薄膜濾過技法（A membrane tilter Techniqu
e for the detection of complementary DNA）Biochem.
Biophys.Res.Com23（1966）641〜646頁）で67℃、４時
間前培養を行った後、３倍に濃縮され、フィルタを100
マイクログラム/mlの濃度の変性calf thymus DNA（SIGM
AZ）キャリア及び下記のエチルニトロソウレアによるア
ルキル化で修飾された５マイクログラム/mlのSV40DNAを
含む同じバッファに接触させた。
時間培養した。細胞はトリプシン処理され、最終的に10
00の細胞数となるようにリン酸緩衝溶液で希釈された。
この懸濁液をS.Lavi＆S.Etkin;「Carcinogenesis2」（1
981）,417〜423頁及びGall J.G.＆Pardue M.1.;「P.NA
S.」63（1969）378〜383頁に記述されているようにニト
ロセルロースフィルタで濾過し、DNA変性処理に付し
た。Denhardtバッファ（Denhardt D.T.;相補的DNAの探
知のための薄膜濾過技法（A membrane tilter Techniqu
e for the detection of complementary DNA）Biochem.
Biophys.Res.Com23（1966）641〜646頁）で67℃、４時
間前培養を行った後、３倍に濃縮され、フィルタを100
マイクログラム/mlの濃度の変性calf thymus DNA（SIGM
AZ）キャリア及び下記のエチルニトロソウレアによるア
ルキル化で修飾された５マイクログラム/mlのSV40DNAを
含む同じバッファに接触させた。
ｂ）SV40DNAのアルキル化 R Muller＆Rajewsky M.F.;「Naturforsch」33C（1978）
897〜901頁に記述された方法に従ってＮ−エチルニトロ
ソウレアを使用してエチル化したSV40DNAの純品および
エタノール沈澱法によって沈澱されたDNAは再沈降によ
って２回洗浄し、凍結乾燥した。この物質は分子プロー
ブを構成する。
897〜901頁に記述された方法に従ってＮ−エチルニトロ
ソウレアを使用してエチル化したSV40DNAの純品および
エタノール沈澱法によって沈澱されたDNAは再沈降によ
って２回洗浄し、凍結乾燥した。この物質は分子プロー
ブを構成する。
ｃ）抗体形成 エチル処理されたDNAに対する抗体は、上記のようにエ
チル化のための処理を行ったcalf thymus DNAを使用す
ることによって調製した。水酸化アルミニウム及び完全
フロイントアジュバント（Freund′s adjuvent）をウサ
ギの皮下及び後足へ添加しながら、エチル化calf thymu
s DNA（250〜1000マイクログラム/ml）を繰り返し注入
することによって抗体形成を行った。これを繰り返し、
さらにブースター（追加免疫）の静脈注射を行って充分
量の抗体の濃度を得た。代わりに、モノクロナール抗体
も使われる。
チル化のための処理を行ったcalf thymus DNAを使用す
ることによって調製した。水酸化アルミニウム及び完全
フロイントアジュバント（Freund′s adjuvent）をウサ
ギの皮下及び後足へ添加しながら、エチル化calf thymu
s DNA（250〜1000マイクログラム/ml）を繰り返し注入
することによって抗体形成を行った。これを繰り返し、
さらにブースター（追加免疫）の静脈注射を行って充分
量の抗体の濃度を得た。代わりに、モノクロナール抗体
も使われる。
ｄ）特異性抗体の抽出 DNAアフィニティ法が使用され、２時間の培養後、非修
飾DNAに対する抗体を結合した。結合されていないプロ
テインはエチル化塩基を含むアフィニティカラムに通し
てから溶出した。
飾DNAに対する抗体を結合した。結合されていないプロ
テインはエチル化塩基を含むアフィニティカラムに通し
てから溶出した。
ｅ）SV40配列の証明 Lavi他（1981）（前出）により記述された修飾プローブ
を用いたハイブリダイゼーション手段で、 ａ）記述のとおりに準備されたフィルタを、ｂ）記述の
とおりに準備されたプローブに接触させた。ハイブリダ
イゼーションが終了した後、フィルタはタンパク質溶液
（10％の通常の不活性血清）で培養され、食塩水で洗浄
され、ｃ）記述のとおりの抗エチル化DNA抗体の混合物
で、370℃２時間カバーした。フィルタは洗浄され、ヤ
ギー抗ウサギ免疫グロブリン（Miles−Yeda）に接合
（コンジュゲイト）した市販のペルオキシターゼにさら
され、標準手順によって呈色反応を行った。呈色反応の
発現によりSV40DNAが存在することを示し、その度合い
によりその配列の量を示した。
を用いたハイブリダイゼーション手段で、 ａ）記述のとおりに準備されたフィルタを、ｂ）記述の
とおりに準備されたプローブに接触させた。ハイブリダ
イゼーションが終了した後、フィルタはタンパク質溶液
（10％の通常の不活性血清）で培養され、食塩水で洗浄
され、ｃ）記述のとおりの抗エチル化DNA抗体の混合物
で、370℃２時間カバーした。フィルタは洗浄され、ヤ
ギー抗ウサギ免疫グロブリン（Miles−Yeda）に接合
（コンジュゲイト）した市販のペルオキシターゼにさら
され、標準手順によって呈色反応を行った。呈色反応の
発現によりSV40DNAが存在することを示し、その度合い
によりその配列の量を示した。
実施例II ゲル電気泳動及びブロッティング後に特異性遺伝子を同
定するための修飾分子プローブの使用法 クローン遺伝子（例えばグロビン）を含むプラスミドに
よって形質転換（トランスフォーム）されたE.Coliバク
テリアからDNAを制限酵素によって切断し、Southern E.
M.;「J.Mol Biol」98（1975）第503〜517頁のとおりに
電気泳動にかける。
定するための修飾分子プローブの使用法 クローン遺伝子（例えばグロビン）を含むプラスミドに
よって形質転換（トランスフォーム）されたE.Coliバク
テリアからDNAを制限酵素によって切断し、Southern E.
M.;「J.Mol Biol」98（1975）第503〜517頁のとおりに
電気泳動にかける。
同じプラスミドを別々に実施例I bで示したようにアル
キル化あるいはスルホン化して、修飾分子プローブとす
る。
キル化あるいはスルホン化して、修飾分子プローブとす
る。
修飾分子プローブとブロットDNA断片（フラグメント）
とのハイブリダイゼーションは、Sout hern E.M.（197
5）（前出）の記載のとおりに実行する。（この場合に
は、ハイブリダイゼーション物質は放射能とする） ハイブリダイゼーション後、実施例I cの抗体を用い、
処理して実施例I cのごとく呈色反応を起こさせる。グ
ロビン遺伝子の部分を含むバンドのみを修飾分子プロー
ブと結合させるが、その結果として、その抗体と結合し
着色反応が生じる。この同じ手段は細胞遺伝子にも使用
でき、プラスミドに限定されない。同様にこの手段は原
核（prokaryotic）細胞に限定されず、真核細胞にも適
用される。
とのハイブリダイゼーションは、Sout hern E.M.（197
5）（前出）の記載のとおりに実行する。（この場合に
は、ハイブリダイゼーション物質は放射能とする） ハイブリダイゼーション後、実施例I cの抗体を用い、
処理して実施例I cのごとく呈色反応を起こさせる。グ
ロビン遺伝子の部分を含むバンドのみを修飾分子プロー
ブと結合させるが、その結果として、その抗体と結合し
着色反応が生じる。この同じ手段は細胞遺伝子にも使用
でき、プラスミドに限定されない。同様にこの手段は原
核（prokaryotic）細胞に限定されず、真核細胞にも適
用される。
実施例III バクテリアコロニーの同定 寒天プレート上のバクテリアコロニーは、ブロッティン
グによってニトロセルロースフィルタあるいは活性紙上
へ移し、Gall J.G.およびPardur M.L.;「Proc.Nat.Aca
d.Sci.U.S.Washington」,63（1969）378〜383に記述さ
れている方法により“プリント”を得て処理する。対象
のバクテリア菌株に特異性をもつDNA断片からなる修飾
プローブは、実施例I bのとおりに形成される。修飾分
子プローブの各々は、バクテリアコロニーのそれぞれの
“プリント”上でハイブリダイゼーションを行うために
適用され、実施例Ｉのように、抗体反応のために処理さ
れる。
グによってニトロセルロースフィルタあるいは活性紙上
へ移し、Gall J.G.およびPardur M.L.;「Proc.Nat.Aca
d.Sci.U.S.Washington」,63（1969）378〜383に記述さ
れている方法により“プリント”を得て処理する。対象
のバクテリア菌株に特異性をもつDNA断片からなる修飾
プローブは、実施例I bのとおりに形成される。修飾分
子プローブの各々は、バクテリアコロニーのそれぞれの
“プリント”上でハイブリダイゼーションを行うために
適用され、実施例Ｉのように、抗体反応のために処理さ
れる。
既知の修飾分子プローブに相補的な遺伝子をもつバクテ
リアコロニーに対応したスポットにのみに着色反応が発
現するので、バクテリアコロニーの種類を直接同定する
ことができる。
リアコロニーに対応したスポットにのみに着色反応が発
現するので、バクテリアコロニーの種類を直接同定する
ことができる。
実施例IV 混合物中の特定のDNAの存在の同定 DMSOの添加によって分化が誘発され、ヘモグロビンを生
成するFriend Leukemia細胞がこの実験で使用される。
成するFriend Leukemia細胞がこの実験で使用される。
全細胞質RNAは、分化因子の添加後別々に抽出され、Alw
ine J.C.Kemp D,Stark G;Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.74（1
977）,5350〜5354の記述のとおりに活性紙上に固定され
る。グロビン遺伝子の全てあるいは一部分を含み、実施
例I bのとおりに修飾されたプラスミドは、これらのス
ポットに対するハイブリダイゼーションで使用され、実
施例Ｉのような抗体反応や着色反応の処理を受ける。着
色の程度によって、異なる分化段階でこれらの細胞の細
胞質内に存在するグロビンメッセンジャーRNAの量を直
接的に表示する。
ine J.C.Kemp D,Stark G;Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.74（1
977）,5350〜5354の記述のとおりに活性紙上に固定され
る。グロビン遺伝子の全てあるいは一部分を含み、実施
例I bのとおりに修飾されたプラスミドは、これらのス
ポットに対するハイブリダイゼーションで使用され、実
施例Ｉのような抗体反応や着色反応の処理を受ける。着
色の程度によって、異なる分化段階でこれらの細胞の細
胞質内に存在するグロビンメッセンジャーRNAの量を直
接的に表示する。
実施例Ｖ ２つの遺伝子を区別するための二重修飾法 実施例Ｉのように、Herpesウイルス（タイプＩ）または
Herpesウイルス（タイプII）のいずれかが存在すると考
えられる細胞、あるいはこれらのウイルス遺伝子が存在
しないと思われる細胞をニトロセルロースフィルタで処
理する。これらの細胞は、患者（臨床サンプル）あるい
は培養細胞（研究サンプル）から採取される。２つの修
飾分子プローブが使用される。
Herpesウイルス（タイプII）のいずれかが存在すると考
えられる細胞、あるいはこれらのウイルス遺伝子が存在
しないと思われる細胞をニトロセルロースフィルタで処
理する。これらの細胞は、患者（臨床サンプル）あるい
は培養細胞（研究サンプル）から採取される。２つの修
飾分子プローブが使用される。
Herpes I:Herpes IIのDNAとハイブリダイズしないHerpe
s I DNAの断片（フラグメント）を含むプラスミドを実
施例Ｉのとおり得、エチルニトロソウレアによって修飾
する。修飾に対する抗体は、ウサギの体内に生じる。
s I DNAの断片（フラグメント）を含むプラスミドを実
施例Ｉのとおり得、エチルニトロソウレアによって修飾
する。修飾に対する抗体は、ウサギの体内に生じる。
Herpes II:Herpes IのDNAとハイブリダイズしないHerpe
s II DNAの断片を含むプラスミドは、Poverenny等；
「分子免疫学」16（1979）313〜316頁に示すようにスル
ホン化によって修飾する。スルホン化された核酸に対す
る抗体はヤギの体内で生じる。
s II DNAの断片を含むプラスミドは、Poverenny等；
「分子免疫学」16（1979）313〜316頁に示すようにスル
ホン化によって修飾する。スルホン化された核酸に対す
る抗体はヤギの体内で生じる。
２つの修飾分子プローブの混合物は、実施例I aに記述
したとおりハイブリダイゼーション用の試料に接触させ
る。
したとおりハイブリダイゼーション用の試料に接触させ
る。
２つの“第2"抗体がここで使用される。
ａ）正確な基質（（ABTS）（22′アジノ−ジ−３−エチ
ル（ベンゾチアゾリンスルフォン酸））が存在している
時に緑色色素を生成するペルオキシターゼにカップリン
グした抗うさぎイムノグロブリン。
ル（ベンゾチアゾリンスルフォン酸））が存在している
時に緑色色素を生成するペルオキシターゼにカップリン
グした抗うさぎイムノグロブリン。
ｂ）正確な基質（X gal）が存在している時に青色色素
を生成するベータガラクトシダーゼにカップリングした
抗やぎイムノグロブリン。
を生成するベータガラクトシダーゼにカップリングした
抗やぎイムノグロブリン。
２つの抗体の混合物は、抗やぎか抗うさぎの何れがハイ
ブリダイゼーション分子に付着しているかを決定するの
に使われる。そのいずれかであるかは最終生成物の色に
よって判定される。完全反応後に緑色が示されていると
きは、検査される細胞内にHerpes I遺伝子が存在してい
ることを示している。
ブリダイゼーション分子に付着しているかを決定するの
に使われる。そのいずれかであるかは最終生成物の色に
よって判定される。完全反応後に緑色が示されていると
きは、検査される細胞内にHerpes I遺伝子が存在してい
ることを示している。
完全反応後に青色が示されているときは、細胞内にHerp
es II遺伝子が存在していることを示す。２色が存在し
ていると２つの遺伝子が存在していることを示す。着色
反応がないことは組織内にHerpes IとHerpes IIの２つ
の遺伝子が存在していないことを示す。２つを越える数
の修飾分子プローブを用いて同様の判定を行うことによ
って体液及び組織の両方の検査を行うことができる。
es II遺伝子が存在していることを示す。２色が存在し
ていると２つの遺伝子が存在していることを示す。着色
反応がないことは組織内にHerpes IとHerpes IIの２つ
の遺伝子が存在していないことを示す。２つを越える数
の修飾分子プローブを用いて同様の判定を行うことによ
って体液及び組織の両方の検査を行うことができる。
本発明は、特定の手段、物質、方法について説明されて
いるが、本発明の範囲はこれらの開示事項のみに限定さ
れず、クレームの範囲内におけるあらゆる均等物にまで
及ぶものである。
いるが、本発明の範囲はこれらの開示事項のみに限定さ
れず、クレームの範囲内におけるあらゆる均等物にまで
及ぶものである。
Claims (3)
- 【請求項１】単一ストランドの核酸配列を含む可能性の
ある試料中の当該核酸配列の存在及びその量を検定する
方法において、 （ａ）少なくともその核酸配列に対して相補性を有する
単一ストランド核酸配列を含む修飾核酸プローブであっ
て、その塩基部分をアルキル化、スルフォン化、ニトロ
ソ化、ニトロフェニル化から選ばれた１工程による修飾
方法で修飾されたプローブと、該試料とを接触させ、 （ｂ）該試料と該修飾核酸プローブとの間にハイブリダ
イゼーション複合体を形成させ、 （ｃ）該ハイブリダイゼーション複合体と、該修飾核酸
プローブの修飾部分に対して特異性を有し、酵素等の非
放射性標識でラベルした抗体とを接触させて、抗体結合
複合体を形成させ、 （ｄ）呈色反応等の検出手段により該抗体の存在と量を
定性的及び定量的に測定することにより、該核酸配列の
存在及びその量を検定することを特徴とする核酸配列の
検定方法。 - 【請求項２】アルキル化、スルフォン化、ニトロソ化、
ニトロフェニル化から選択された１工程の修飾処理によ
って修飾された少なくとも１個の修飾塩基を含み、単一
ストランドの核酸配列を含む相補性DNAストランドまた
は相補性RNAストランドとハイブリダイズすることがで
きることを特徴とするDNA分子遺伝子プローブ。 - 【請求項３】アルキル化、スルフォン化、ニトロソ化、
ニトロフェニル化から選択された１工程の修飾処理によ
って修飾された少なくとも１個の修飾塩基を含み、単一
ストランドの核酸配列を含む相補性DNAストランドまた
は相補性RNAストランドとハイブリダイズすることがで
きることを特徴とするRNA分子遺伝子プローブ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49944083A | 1983-05-31 | 1983-05-31 | |
| US449440 | 1983-05-31 | ||
| US499440 | 1983-05-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS617469A JPS617469A (ja) | 1986-01-14 |
| JPH0743376B2 true JPH0743376B2 (ja) | 1995-05-15 |
Family
ID=23985265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112156A Expired - Lifetime JPH0743376B2 (ja) | 1983-05-31 | 1984-05-31 | 核酸配列の検定方法及び分子遺伝子プローブ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0128018B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0743376B2 (ja) |
| AT (1) | ATE78301T1 (ja) |
| DE (1) | DE3485811T2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US5605800A (en) * | 1978-04-13 | 1997-02-25 | Institut Pasteur | Method of detecting and characterizing a nucleic acid or a sequence of the latter, and enzymatic reactant for the application of this method |
| FR2558172B1 (fr) * | 1984-01-16 | 1986-06-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| US4670379A (en) * | 1984-12-19 | 1987-06-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence |
| US8597910B1 (en) | 1985-04-11 | 2013-12-03 | Children's Medical Center Corporation | DNA encoding Von Willebrand Factor (VWF) and methods and cells for producing VFW, and VFW produced by the DNA, methods and cells |
| EP0218692A4 (en) * | 1985-04-11 | 1988-03-22 | Childrens Medical Center | VON WILLEBRAND FACTOR. |
| GB8509367D0 (en) * | 1985-04-12 | 1985-05-15 | Amersham Int Plc | Nucleic acid hybridisation |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| AU604684B2 (en) * | 1986-03-20 | 1991-01-03 | Gen-Probe Incorporated | Method for releasing RNA and DNA from cells |
| JPH03231151A (ja) * | 1990-02-07 | 1991-10-15 | Takara Shuzo Co Ltd | Ｄｎａの検出方法 |
| EP0752474A1 (en) | 1995-07-07 | 1997-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| US20020146728A1 (en) | 1998-12-03 | 2002-10-10 | Tanja Ligensa | IGF-1 receptor interacting proteins |
| EP1006184A1 (en) | 1998-12-03 | 2000-06-07 | F. Hoffmann-La Roche Ag | IGF-1 receptor interacting proteins (IIPs) genes coding therefor and uses thereof |
| EP1099757B1 (en) | 1999-11-11 | 2010-02-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for the determination of CTp11 and for determining whether a tumor sample has metatastic potential |
| WO2006098464A1 (ja) | 2005-03-14 | 2006-09-21 | Link Genomics, Inc. | 前立腺がんの診断方法 |
| JP4858414B2 (ja) * | 2007-11-08 | 2012-01-18 | トヨタ自動車株式会社 | ステアリング装置 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| FR2518755B1 (fr) * | 1981-12-23 | 1986-04-11 | Pasteur Institut | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| CA1223831A (en) * | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| JPS5991884A (ja) * | 1982-07-26 | 1984-05-26 | アグラシ−タス | ポリヌクレオチド配列の検定法とプロ−ブ |
-
1984
- 1984-05-31 AT AT84303671T patent/ATE78301T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-05-31 DE DE8484303671T patent/DE3485811T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-05-31 EP EP84303671A patent/EP0128018B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-05-31 JP JP59112156A patent/JPH0743376B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0128018A3 (en) | 1988-02-10 |
| JPS617469A (ja) | 1986-01-14 |
| ATE78301T1 (de) | 1992-08-15 |
| DE3485811T2 (de) | 1993-01-07 |
| EP0128018A2 (en) | 1984-12-12 |
| EP0128018B1 (en) | 1992-07-15 |
| DE3485811D1 (de) | 1992-08-20 |
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