JPH0591898A - 制限増巾検定法 - Google Patents

制限増巾検定法

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JPH0591898A
JPH0591898A JP3228220A JP22822091A JPH0591898A JP H0591898 A JPH0591898 A JP H0591898A JP 3228220 A JP3228220 A JP 3228220A JP 22822091 A JP22822091 A JP 22822091A JP H0591898 A JPH0591898 A JP H0591898A
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target
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nucleic acid
cleavable bond
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Jr Albert L George
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Oncor Inc
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ONKAA Inc
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

(57)【要約】 ［目的］ 制限増巾によりターゲットヌクレオチド配列
の存在を検定する方法、試薬およびキットを提供するこ
とを目的とする。 ［構成］ 核酸配列を検出するため特異的制限部位を含
むターゲット分子を該ターゲット分子の少なくとも２８
塩基と相同的な配列を含む標識化プローブとハイブリダ
イズさせる。このプローブが特異的ターゲットにハイブ
リダイズした場合検出用のプローブを放出する制限酵素
で切断される。プローブ分子の３´末端に相同的で、か
つターゲット側に制限酵素部位を再構築する５´側塩基
を含む第２オリゴヌクレオチドを反応物中に含めてお
く。このようにすることでターゲット配列が検定物中に
存在する場合定常的に切断プローブが再生され、著しく
検出感度が向上する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はターゲットヌクレオチド配列の存
在を決定するための方法、試薬およびキットに関する。
特に本発明は特異的ターゲットヌクレオチド配列を未知
量含む試料中該特異的ターゲットヌクレオチド配列の存
在を検定する方法およびこの検定に使用するプローブに
関する。
【０００２】
【従来技術】遺伝物質操作技術または生物の遺伝的特性
の評価において特定の遺伝子または遺伝子の一部が生物
中またはその生物由来の遺伝物質の細胞外抽出物中に存
在するかどうか確認し得ることが望ましい。基本的に遺
伝子またはその一部分はポリヌクレオチド分子全体また
はその一部を形成するヌクレオチド塩基の特異的配列で
あるので遺伝子を形成しているヌクレオチド塩基の特異
的配列がその試料中に存在するかどうかを知るためにそ
の試料を直接テストし得る。
【０００３】ヌクレオチド塩基の特異的配列への興味は
病原の存在の検出、対立遺伝子の存在の決定、宿主ゲノ
ム内での損障の検出および特定ｍＲＮＡまたは細胞宿主
の修正の検出にある。ハンチントン舞踏病、筋ジストロ
フィー、フェニルケトン尿症、サラセミアおよび鎌状赤
血球貧血などの遺伝病は個人のＤＮＡを分析することに
より診断し得る。さらにウイルス、ウイロイド、バクテ
リア、菌類、プロトゾアまたはその他の植物または動物
生活形態の診断や同定はヌクレオチドプローブを用いた
ハイブリダイゼーション検定で決定し得る。
【０００４】種々の核酸検出法が文献に報告されてい
る。これらの検定法、特にポリヌクレオチドの検出を必
要とする検定法はＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ
＝重鎖における相補的核酸鎖のプリン−ピリミジン塩基
対合性に基づいている。この塩基対合過程は二本鎖ＤＮ
Ａにおけるアデノシン−チミン（Ａ−Ｔ）およびグアノ
シン−シトシン（Ｇ−Ｃ）の対合の水素結合形成を通し
て最も起こりやすい。アデノシン−ウラシル塩基対はＤ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子の水素結合によって形成
される。プローブヌクレオチド配列と試料ヌクレオチド
配列を含む所定のヌクレオチド配列の存否を決定するた
めの核酸鎖との塩基対合は一般に核酸ハイブリダイゼー
ションまたは単にハイブリダイゼーションと呼ばれる。
【０００５】分子生物学の最も強力な道具の１つは核酸
を分画し、かつＤＮＡまたはＲＮＡ分子の配列に相補的
な配列を該核酸が有するかどうかを決定し得る能力であ
る。サザンブロットはゲルマトリクスから電気泳動で分
画したＤＮＡを能動的拡散でニトロセルロース固体サポ
ートに転移させ、つづいて標識化プローブによるハイブ
リダイゼーションを行うよく知られた方法である。若干
修正して同様の方法がＲＮＡの検出にも用いられ、当分
野でノーザンブロット法として知られている。固定相と
して乾燥アガロースゲルを用いる方法はアンブロット法
として知られている。これら全ての技術はｍＲＮＡ、ク
ローン、遺伝子、フラグメント、隣接配列、反復要素な
どを分析する場合の秀れた道具となる。
【０００６】米国特許第4,358,535 号はターゲット核酸
配列を用いた病原の検出法について報告している。この
方法には放射能標識ヌクレオチドプローブによるハイブ
リダイゼーション前の不活性サポートへのターゲット核
酸配列の固定化が含まれる。それから不活性サポート上
の標識の存在を検定することによりターゲット核酸配列
の有無を決定する。
【０００７】ヨーロッパ特許出願第 0 117 440号は非放
射性の化学的標識化ポリヌクレオチドプローブおよび該
プローブの使用法を公開している。この場合もターゲッ
ト核酸配列を固体サポートに固定化する。米国特許第4,
767,699 号および第4,795,701 号は核酸置換検定法を公
開している。これらの検定法は２つのポリヌクレオチド
を使用している。１つのポリヌクレオチドを標識してお
き、もう１つのポリヌクレオチドはターゲット配列から
標識化プローブを置換するのに用いる。そうすることに
よりターゲット分子の検出が可能となる。これらの検定
法はターゲット分子とのハイブリダイゼーションが起っ
たかどうかの検出にＡＴＰを用いる。
【０００８】ヌクレオチドプローブを使う多くの検定法
には検出システムに問題がある。標識化プローブの感度
および検定中に発生するバックグランドレベルはしばし
ば誤った結果をもたらす。所定の配列のＤＮＡまたはＲ
ＮＡから核酸配列を効率的に検出するためにターゲット
増巾法が利用できる。ＰＣＲとして知られるこの方法は
米国特許第4,683,195 号に報告されており、この方法は
ターゲットヌクレオチドの核酸配列を伸長し、かつ後の
プローブ検出を可能にするためにそれを増巾する一組の
プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを使用する。ＤＮ
Ａ配列を増巾することによりヌクレオチドプローブによ
りターゲットヌクレオチドをより効率的に検出し得る。
このプローブ検定法における問題の１つは反応溶液の汚
染である。
【０００９】当分野ではＤＮＡ分子内の特異的個所で二
本鎖を切断するタイプII制限酵素が知られている。これ
らの酵素はバクテリア内に広く存在しており、また１種
類のサブユニットから成り立ちＤＮＡの切断にはＭｇ2+
のみを必要とする。ＤＮＡの切断は酵素認識部位内また
はその近傍で起こる。今日まで４００種類以上の制限酵
素がバクテリアから単離されている。これらの制限酵素
は基本的にその認識配列と切断特異性で特徴づけられて
いる。大部分の制限酵素またはエンドヌクレアーゼは４
〜６ヌクレオチド長の配列を認識するが７〜８塩基の認
識部位を有するものも見つかっている。全部ではないが
ほとんどの認識部位は２回回転対称軸を含んでおり、か
つほとんどの場合その部位内の全ての塩基はユニークに
決ったものである。ハイブリダイズした配列またはパリ
ンドロームの対称的配列がエンドヌクレアーゼによる認
識される。一般に対称な認識部位のエンドヌクレアーゼ
は対称に切断する。特異的切断部位をもつ制限酵素はこ
の分野でよく使用される。通常制限酵素は特異的マッピ
ング、クローニングおよびＤＮＡ配列の特徴付けに使わ
れている。しかしそれらは種々のヌクレオチドプローブ
検定法にも使用されてきている。たとえば米国特許第4,
683,194 号は制限部位を含む核酸配列の１つの鎖に相補
的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションによる核
酸配列内の特異的制限部位の有無の検出法を公開してい
る。ハイブリダイズした配列は制限酵素で切断され、切
断したオリゴマーと未切断オリゴマーを分離することに
よりプローブ標識に基づいてその切断が検出される。制
限部位半分を有するターゲットヌクレオチドの検出も同
じ考え方で米国特許第4,725,537 号に報告されている。
この特許は置換型検定法における制限エンドヌクレアー
ゼの使用を公開している。
【００１０】ヌクレオチドプローブ中の核酸配列を切断
する考え方を使用する別のタイプの検定法が米国特許第
4,876,187 号に公開されている。この方法は少なくとも
１点でプローブの核酸配列を特異的に切断し、相補的タ
ーゲットＤＮＡ配列に結合しないレポーター分子を除す
ることによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出するのに使
用される。この検定法は検出システムのＳＮ比が高く、
感度の高い検定法である。
【００１１】これまで述べてきた検定法はターゲット分
子内の核酸配列を検出する方法を提供しているが、より
感度の高く、検出が容易で、検定反応への汚染が少な
く、操作性が良く、かつ、正しい結果を与える検定法を
必要としている。本発明は新しい制限増巾の使用を通し
て核酸配列を検出する非常に感度の高い方法を導入する
ことによりこれまで議論してきた技術の欠点を克服して
いる。本検定法には目的の切断されたターゲット配列を
リサイクルする第２のオリゴヌクレオチドが使用され標
識化され、かつ切断されたプローブオリゴヌクレオチド
が増巾される。
【００１２】本発明の目的は核酸配列を検出するための
高感度核酸リサイクルまたはプローブ増巾検定法を提供
することである。本発明のもう１つの目的は目的とする
ターゲット配列をリサイクルし、それにより標識化プロ
ーブを増巾する検定法を提供することである。本発明は
生物試料中の核酸配列の存在を検定する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列と実質的に相補的な核酸配列
および切断可能な結合を含み、かつ検出可能なマーカー
を有する第１オリゴヌクレオチドを提供するステップ、
（ｂ）第１オリゴヌクレオチドの末端に実質的に相補的
で、ターゲット配列にハイブリダイズせず、かつターゲ
ット分子側に切断された切断可能な結合を再構築する少
なくとも１つの塩基を含む第２オリゴヌクレオチドを添
加して混合物とするステップ、（ｃ）該ターゲット配列
および該第１オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする
場合、切断可能な結合を切断し得る切断酵素を該反応混
合物に添加するステップ、（ｄ）該反応混合物をハイブ
リダイズさせるステップ、および（ｅ）切断した検出可
能マーカーを検出するステップ 以上（ａ）〜（ｅ）のステップを含む方法を提供する。
【００１３】本発明のもう１つの態様は試料中の核酸配
列の検出法であって、（ａ）（ｉ）切断可能な結合を含
み、かつ実質的にターゲット分子の核酸配列に相補的な
第１オリゴヌクレオチドおよび(ii)該第１オリゴヌクレ
オチドの３′末端に実質的に相補的であり、かつ該ター
ゲット分子側に切断した切断可能な結合を再構築する
５′側塩基を含む第２オリゴヌクレオチドの存在下、切
断可能な結合を含むターゲット核酸配列を変性させ混合
物とするステップ、（ｂ）該混合物に切断酵素を添加す
るステップ、（ｃ）該反応混合物をハイブリダイズさせ
切断酵素により該第１オリゴヌクレオチドから検出可能
マーカーを放出させるステップ、および（ｄ）切断した
検出可能マーカーを検出するステップ 以上（ａ）〜（ｄ）のステップを含む方法に関する。
【００１４】また本発明のもう１つの態様は生物試料中
の核酸配列の検出法であって、（ａ）切断可能な結合を
有するターゲット分子を該ターゲットに相補的配列及び
検出可能マーカーを有する標識化第１オリゴヌクレオチ
ドプローブにハイブリダイズしプローブ：ターゲット二
重鎖を得るステップ、（ｂ）切断可能な結合部位で該二
重鎖を切断するステップ、（ｃ）ターゲット分子側に切
断した切断可能な結合を再構築する第２オリゴヌクレオ
チドを添加するステップ、（ｄ）再構築したターゲット
分子をリサイクルするステップ、および（ｅ）切断した
該第１オリゴヌクレオチドプローブを検出するステップ 以上（ａ）〜（ｅ）のステップを含む方法に関する。
【００１５】また本発明のもう１つの目的は上述の方法
を用いて種々の病気を診断するキットを提供することで
ある。本発明は特にターゲット分子中目的の核酸配列を
検出する方法に関する。この検定法は前記ターゲット分
子の切断可能な結合を再構築し得る第２オリゴヌクレオ
チドを使用し、第１オリゴヌクレオチドの切断後ターゲ
ット配列をリサイクルして切断した第１オリゴヌクレオ
チドプローブの量を増巾する。本明細書で使用している
“オリゴヌクレオチド”とは小数のヌクレオチドの縮合
で成り立つ化合物を意味している。オリゴヌクレオチド
の正確な大きさは該オリゴヌクレオチドの最終的機能を
含む多くの因子に依存する。
【００１６】本明細書で使用している“切断可能な結
合”とは制限酵素または制限エンドヌクレアーゼにより
切断可能な部位特異的認識ヌクレオチド配列を意味して
いる。本明細書で用いている“制限エンドヌクレアー
ゼ”および“制限酵素”とは特異的認識ヌクレオチド部
位またはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌性酵素
を意味する。
【００１７】ここで使用する試料核酸は所定の核酸配列
内に特定の制限部位を含む条件で生物を含むあらゆる起
源に由来するものである。したがってこの方法は制限エ
ンドヌクレアーゼにより切断し得るならば一本鎖、二本
鎖、ｃＤＮＡまたはこれらの混合物を問わない純粋なＤ
ＮＡを使用する。この起源にはたとえばｐＢＲ３２２な
どのプラスミド、クローン化したＤＮＡあらゆる起源の
ゲノムＤＮＡが含まれる。典型的起源はバクテリア、イ
ースト、ウイルスおよび植物、鳥、爬虫類および哺乳類
などの高等生物を含む生物試料に由来する。
【００１８】ゲノムＤＮＡは種々の技術（たとえばマニ
アチス（Maniatis）等、モレキュラー・クローニング
（１９８２）２８０−２８１に述べられているもの）に
より血液、尿、絨毛膜の絨毛または羊膜細胞のような組
織物質から調製する。その粘度を低める必要がある場
合、分析するヒトＤＮＡの調製試料を物理的に細分する
かまたは特異的制限エンドヌクレアーゼを用いて消化す
る。
【００１９】本発明で使用する第１オリゴヌクレオチド
は一本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつ検出する核酸
配列に相補的構造を有している。通常このプローブはＤ
ＮＡであり、また制限のない数の塩基を含んでいる。し
かしこのプローブは約１００個までの塩基を含み、好ま
しくは約１０から４０個の塩基を含んでいる。このプロ
ーブはメッセンジャーＲＮＡから、逆転写酵素でメッセ
ンジャーＲＮＡの逆転写で得られるｃＤＮＡの相補鎖か
ら、または簡便にはエンドヌクレアーゼ消化によるゲノ
ムの切断と従来法によるその遺伝子または遺伝子フラグ
メントのクローニングにより得られる。たとえばコーン
バーグ（Kornberg）、ＤＮＡ複製、W.H.フリーマン社
版、サンフランシスコ、１９８０、pp. ６７０−６７
９；ソ(So)等、Infect.Immun.,２１：４０５−４１１、
１９７８参照。望ましい遺伝子またはＤＮＡフラグメン
トの単離および特性化の後その遺伝子またはＤＮＡフラ
グメントをプローブの調製に用いる。またこのプローブ
はMILLIGEN（登録）合成機などの自動合成機を用いて化
学的に合成し得る。プローブの化学合成は本発明で使用
する望ましいプローブを得る方法として好ましい。
【００２０】ほとんどの場合、このオリゴヌクレオチド
プローブは原子、無機ラジカル、放射性ヌクレオチド、
重金属、抗体、酵素などを用いた検出可能マーカーで標
識される。簡便には放射性ラベルが用いられる。放射性
ラベルには32Ｐ、 3Ｈ、14Ｃなどがある。適当なシグナ
ルを与え、かつ十分な寿命があるものならどの放射性ラ
ベルでも使える。他のラベルには標識化抗体に対する特
異的結合対メンバーとして働き得るリガンド、蛍光物
質、化学発光物質、酵素、標識化リガンドに対する特異
的結合対メンバーとして働き得る抗体などが含まれる。
本検定法で容易に使用し得る広範囲のラベルが免疫検定
法で使用されてきた。標識の選択は遺伝子ＤＮＡへのプ
ローブのハイブリダイゼーションおよび結合の速度に関
するプローブの影響に支配される。この標識はハイブリ
ダイゼーションに使用可能なＤＮＡ量を検出するのに十
分な感度を提供することが必要である。その他にプロー
ブの容易な合成、操作性のより装置自動化への発展性、
簡便性などが考慮される。
【００２１】標識のプローブへの結合様式は標識の性質
に応じて様々である。放射性ラベルの場合巾広い技術を
使い得る。一般に用いられるのはα−32Ｐ−ＮＴＰおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた末端標識であ
る。それとは別に存在する１つ以上の元素を放射性同位
元素で置換した、たとえば水素をトリチウムで置換した
ヌクレオチドが合成される。
【００２２】他の放射性ヌクレオチド標識を用いるのに
種々の結合基を使用し得る。末端水酸基を無機酸でエス
テル化することができる。たとえば32Ｐリン酸または14
Ｃ有機酸を末端水酸基でエステル化するか、またはエス
テル化して標識に対する結合基を与えることができる。
別に中間塩基を標識が結合し得る活性化可能な結合基で
置換し得る。
【００２３】リガンドおよびアンチリガンドも様々であ
る。リガンドがビオチン、チロキシンおよびコルチゾー
ルなどの天然レセプターを持つ場合、そのリガンドを標
識化した天然のレセプターとともに使用できる。抗体と
ともにパプテン性または抗原性のどの化合物も使用し得
る。標識として使用する酵素は主にハイドロラーゼ、特
にエステラーゼやグリコシダーゼ、ホスファターゼ、ま
たはオキシドレダクターゼ、特にパーオキシダーゼであ
る。蛍光性化合物にはフルオレセインおよびその誘導
体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、アルベリ
フェロンなどが含まれる。化学発光物質にはルシフェリ
ン、および２，３−シヒドロフサラシンジオン、すなわ
ちルミノールが含まれる。
【００２４】ヌクレオチドプローブの標識化および検出
のための別の方法は米国特許第4,８６8,１０３に公開さ
れている。そこではエネルギー転移がバソクロミックン
および、または遅延蛍光を発生させている。第１エネル
ギーエミッター（Ｅ1 ）から発せられる蛍光が第２エネ
ルギーエミッター（Ｅ2 ）に吸収される。この第２エミ
ッターは第１エネルギーエミッターよりも長波長の蛍光
を発する。（Ｅ1 ）および（Ｅ2 ）は互いに適当な距離
以内に存在し、その結果（Ｅ1 ）から発せられるエネル
ギーが（Ｅ2 ）により吸収され、（Ｅ2 ）がより長波長
の蛍光を発し得る。
【００２５】標識化および標識化プローブの検出のため
のいずれも方法も本発明に使用し得る。しかし、標識は
切断可能な結合から距離をおいて結合しており、かつ、
第１プローブオリゴヌクレオチドの３′または５′末端
に存在することが好ましい。第１オリゴヌクレオチド上
に標識が存在することとは別にこの第１オリゴヌクレオ
チドは問題とするターゲット分子に相補的な切断可能な
結合も含んでいなければならない。この切断可能な結合
はハイブリダイゼーションが起った後制限酵素または他
の手段で容易に切断されなければならない。第１オリゴ
ヌクレオチドがＤＮＡ配列の場合、この結合は制限酵素
で切断し得る。
【００２６】制限酵素は当分野でよく知られており、特
異的な認識部位を有している。本発明で使用し得る制限
酵素にはＡatII、ＡccII、ＡccIII 、ＡhaIII 、Ａlu
Ｉ、ＡOCＩ、ＡpaＩ、ＡpaL Ｉ、ＡvaＩ、ＡvaII、Ｂal
Ｉ、ＢamＨＩ、ＢclＩ、ＢglII、ＢssＨII、ＢstＥII、
ＣlaＩ、ＤraＩ、Ｅco５２Ｉ、ＥcoＲＩ、ＥcoＲII、Ｅ
coＲＶ、ＦspＩ、ＨaeII、ＨhaＩ、ＨindIII、ＨpaＩ、
ＨpaII、ＫpnＩ、ＫspＩ、ＮciＩ、ＭstII、ＮaeＩ、Ｐ
stＩ、ＰvuＩ、ＸbaＩなどが含まれる。バクテリアから
単離し得る制限酵素には４００種類以上あり、これらの
いずれの酵素も本発明で使用し得る。制限酵素は選択す
る基準はターゲットヌルレオチド分子の認識部位、第１
オリゴヌクレオチドプローブ、および酵素の性質に基づ
く。切断可能な結合を含む第１オリゴヌクレオチドプロ
ーブはターゲットヌクレオチドの認識または切断可能な
結合部位に相補的でなければならず、それにこれらのオ
リゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせ、つい
で制限酵素を添加してこの二重鎖を切断する。
【００２７】制限酵素またはエンドヌクレアーゼは比較
的安定なたんぱく質である。これらを均一にまで精製す
ることは必ずしも必要ではない。全ての酵素は切断する
ためにＭg2+ またはＭn2+ などの補因子を必要とし、ま
た7.２から7.６のpH範囲で最も活性がある。通常酵素切
断には適当なバッファシステムを使用する。これらのバ
ッファシステムはハイブリダイズした二重鎖を切断する
のに用いる制限酵素により様々である。それゆえ、ＤＮ
Ａ基質および制限酵素に加えて、ほとんどの反応溶液に
はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩ
Ｓ）バッファ、Ｍg2+ 、Nacl、２−メルカプトエタノー
ルおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる。制
限酵素の間の顕著な差はイオン強度依存性である。切断
効率を最大にするためにこのバッファシステムは制限酵
素によって変える。たとえばこの検定法で制限酵素Ｈin
dIIIを使うなら５０mM NaCl 、２５mM ＴＲＩＳ−HCl
、pH7.７、１０mM MgCl2、１０mM β−メルカプトエ
タノールおよび１００μｇ／mlＢＳＡを含むバッファを
用いて最大の切断効率を得る。ＥcoＲＩを用いる場合は
５０mM NaCl 、１００mM ＴＲＩＳ−HCl 、pH7.５、５
mM MgCl2および１００μｇ／ml ＢＳＡを含むバッファ
を使用する。それゆえ本発明は本検定法で使用する制限
酵素に従って様々である種々のバッファシステムの使用
に関する。
【００２８】また制限酵素の至適温度も様々である。ほ
とんどの切断は３７℃で行うが、ＳmaＩなどいくつかの
エンドヌクレアーゼはより低いインキュベーション温度
を好み、またＴaqＩなど好熱菌から単離されるものには
より高い温度を好むものがある。それゆえ、本発明の反
応温度は検定に使用する制限酵素を考慮して選択する。
【００２９】ハイブリダイゼーション後形成される二本
鎖分子を制限酵素で切断することとは別にこの切断過程
に他の方法も使用し得る。たとえば二本鎖複合体の特異
的部位を切断するのに特定の化学物質を用いることがで
きる。また本発明は切断したターゲット分子を再構築し
この検定液内でプローブオリゴヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションを可能にする第２オリゴヌクレオチド
も使用する。第２オリゴヌクレオチドは目的のターゲッ
ト配列をリサイクルさせ、検出用に切断したプローブ量
を増巾するのに役立つ。この第２オリゴヌクレオチドは
３′末端または５′末端など第１オリゴヌクレオチドプ
ローブの末端に相補的な一本鎖ヌクレオチドである。こ
の第２オリゴヌクレオチドは先に述べたように第１オリ
ゴヌクレオチドの合成と同じ過程で誘導する。
【００３０】第１オリゴヌクレオチドの３′または５′
端と相補的なこととは別に第２オリゴヌクレオチドは制
限酵素により切断された部位でターゲット分子を再構築
する５′塩基または３′塩基などの塩基を含んでいる。
ターゲット分子の切断した末端を再構築した後、もう一
度標識化第１オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションが起こり、この過程がもう１サイクル進行する。
これにより標識化プローブが再び反応液中に放出され
る。この第２オリゴヌクレオチドは１００個までの塩基
を含み、好ましくは約１０個から２０個の塩基を含み、
より好ましくは約１４個の塩基を含む。図１および図２
には本発明がどのように進行するかを表わす例を示して
ある。
【００３１】本検定法は試料ターゲット分子を一本鎖分
子とする変性で開始する。一般にターゲット分子または
基質の変性は煮沸で行なう。さらに基質、第１オリゴヌ
クレオチド、第２オリゴヌクレオチド、バッファおよび
蒸留水を混ぜ５〜１０分間煮沸する。その後この混合物
を室温まで冷やす。冷却後制限酵素を加え反応を開始さ
せる。
【００３２】検定を行う温度は使用する制限酵素、オリ
ゴヌクレオチドの長さ、検定液中に存在するオリゴヌク
レオチドのＧＣ含量に従って変わる。サグス(Suggs) 等
（“Developmental Biology Using Purified Genes"
（D.D.ブラウン(Brown) 編）、ｐ６８３、アカデミック
プレス、ニューヨーク、１９８１）はオリゴヌクレオチ
ドＤＮＡ複合体が解離する温度に基づく適当なハイブリ
ダイゼーション温度を決定する実験式を開発した。誘導
した式は： Ｔｄ＝２°（Ａ＋Ｔ残基の数）＋４°（Ｇ＋Ｃ残基の
数） である。この実験式を用いて反応温度を見積ることがで
きるが、一方では検定に使用する制限酵素も考慮しなけ
ればならない。先に議論したように多くの制限酵素は３
７℃で活性であるが、他のものはより高いまたはより低
い温度を必要とする。反応温度はハイブリダイゼーショ
ンおよび制限酵素切断が至適速度で起こるよう選択す
る。
【００３３】反応時間は目的配列の濃度、ストリンジェ
ンシー、相補的な第１オリゴヌクレオチドプローブ配列
の長さ、使用する制限酵素などによって変わる。ターゲ
ット配列をリサイクルすることによりプローブの増巾が
可能となるよう十分な時間が与えられなければならな
い。通常この検定は１〜３時間、好ましくは２時間で行
なわれる。
【００３４】反応後反応混合物の一部をポリアクリルア
ミドゲルローディングバッファに入れることにより停止
する。それからこのサンプルを電気泳動し、この電気泳
動したゲルのオートラジオグラフをとる。もし必要なら
スキャンニングデンシトメーターを用いプローブ量を定
量することができる。本発明およびその利点を説明する
ため以下に例を示すがこれらは説明のためであって発明
を制限するものではない。 （オリゴヌクレオチドの合成）制限増巾法には２つのオ
リゴヌクレオチドが必要である。配列５′ＡＣＣ ＡＴ
Ｇ ＧＣＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ
ＡＡＴ Ｇ３′（２８マー）の第１オリゴヌクレオチ
ドおよび配列５′ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ Ｇ
Ｔ３′（１４マー）の第２オリゴヌクレオチドの合成は
ホスホアミダイト法で行ない、つづいてアニオン交換Ｈ
ＰＬＣで精製した。ホスホアミダイト法で合成したオリ
ゴヌクレオチドの５′端はＯＨ基である。 （第１オリゴヌクレオチドの標識）第１オリゴヌクレオ
チドには５′−ＯＨ基があり、ポリヌクレオチドキナー
ゼを用い〔γ32Ｐ〕ＡＴＰから〔32Ｐ〕リン酸を転移さ
せることによりこれを標識した。蒸留水に各オリゴヌク
レオチドを溶かして標識反応を行った。水に溶かした各
オリゴヌクレオチドの濃度は0.５×１０-11 モル濃度で
行う。反応は第１オリゴヌクレオチド（0.５×１０-11
モル濃度）１μｌ、0.５Ｍ ＴＲＩＳ−HCl、pH7.６、
１mMスペルミジン、５０mMジチオスレイトール、１mM
ＥＤＴＡおよび0.１Ｍ MgCl2を含むキナーゼバッファ５
μｌ、３0.５μｌ蒸留水、１2.５μｌ32Ｐ−ＡＴＰ（0.
１２５ミリキューリーまたは３０００キューリー／μmo
le）および１μｌポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニ
ット）を用いて行った。上述の反応成分を合わせ３７℃
で１時間インキュベートした。反応は反応液を８０℃で
１０分間加熱して停止する。
【００３５】この方法で調製した標識化第１オリゴヌク
レオチドは−２０℃保存で少なくとも１週間安定であ
る。 （ＨＰＶ１６基質）ＨＰＶ１６−ＤＮＡウイルスを従来
法を用いて頸管障害部から単離し標準法でｐＢＲ３２２
にクローン化した。クローン化ＤＮＡをＨ．Ｃ．バーン
ボイム（Birn-boim)およびＪ．デーリー（Daly)(Nuclei
c Acids Res.７、１５１３（１９７９））の方法の修正
法で単離した。
【００３６】細胞を激しく振とうしながら１００μｇ／
mlのアンピシリンを含むＬＢ培地５ml中３７℃で一晩増
殖させる。1.５mlの培養物を1.５mlの遠心チューブに移
し１0.０００ｇで１分間遠心する。上清を注意深く除去
してそのペレットを出来る限り乾燥させる。この細胞を
５０mMグルコース、１０mM ＥＤＴＡおよび２５mMＴＲ
ＩＳ−HCl 、（pH8.０）を含む氷冷液１００μｌ中に懸
濁する。この細胞懸濁液を室温で５分間インキュベート
する。この細胞に0.２Ｎ NaOH 、１％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）を含む新しく調製した溶液２０μｌを
加え逆さにしてよく混合する。さらに０℃で５分間イン
キュベーションする。
【００３７】インキュベーション後pH4.８の氷冷酢酸カ
リウム溶液１５０μｌ（氷酢酸１1.５mlおよび水２8.５
mlを５Ｍ酢酸カリウム６０mlに加えて調製する）を加
え、この混合物を１０秒間逆さにしてから０℃で５分間
インキュベートする。ついで混合物を１0.０００ｇで５
分間遠心し、その上清を別のチューブに移す。その上清
を再び１0.０００ｇで５分遠心し、上清を別の新しいチ
ューブに移す。ついでＲＮase Ａを最終濃度２０μｇ／
mlとなるように上清に加える。この反応液を３７℃で２
０分間インキュベートする。
【００３８】インキュベート後等容量のフェノール：ク
ロロホルム（１：１、５０mM ＴＲＩＳ−HCl （pH8.
０）、１００mM NaCl 、１mM ＥＤＴＡで飽和）を加
え、この混合物を３０秒間ボルテックスした後１0.００
０ｇで３０秒間遠心する。水層を新しいチューブに移
す。2.５倍容のエタノールをこの水層に加え混合する。
この混合物を−７０℃で５分間インキュベートする。こ
の混合物を１0.０００ｇで５分間遠心した後上清を除去
する。このペレットを１mlの冷７０％エタノールを加え
軽く混ぜてすすぐ。この混合物を１分間遠心する。上清
を除いた後ペレットを減圧下で乾燥する。
【００３９】この方法で得たＤＮＡを２０μｌの蒸留水
に溶解する。 （制限増巾検定法）制限増巾検定法はＨＰＶ１６基質、
標識化第１オリゴヌクレオチドプローブ、非標識化第１
オリゴヌクレオチド、ＰstＩバッファおよび脱イオン水
を合せることから始める。このＲＡＭＰ検定法ではこの
サンプルを用い同時に２つのコントロールを行う。この
例では３２℃と３７℃の２つの温度を使用する。
【００４０】まず反応成分のストック液を調製する。オ
リゴヌクレオチドを0.５×１０-11 Ｍに希釈する。同様
に第２オリゴヌクレオチドも0.５×１０-11 Ｍとなるよ
うに希釈する。ＨＰＶ１６ストックは蒸留水で希釈し１
００μｇ／mlストック溶液を作る。５０ユニット／μｌ
の制限酵素ＰstＩストック液を調製する。各検定はこれ
らのストック液の一部を使って行う。反応容量は５０μ
ｌである。各検定反応液には１μｌ（１００ng）のＨＰ
Ｖ１６、２μｌの標識化第１オリゴヌクレオチド、２μ
ｌの非標識化第１オリゴヌクレオチド、４μｌの第２オ
リゴヌクレオチド、５μｌのＰstＩバッファ（１００mM
NaCl、１０mMＴＲＩＳ−HCl pH7.７、１０mM MgCl2、
１mM ＤＴＴおよび１００μｇ／ml ＢＳＡ）が含まれ
る。５μｌのＰstＩを加える。蒸留水を加えて最終容量
５０μｌとする。
【００４１】別のチューブで５個の検定を行った。第１
チューブ（＃１）には２μｌの32Ｐ標識化第１オリゴヌ
クレオチド、２μｌの非標識化第１オリゴヌクレオチ
ド、４μｌの第２オリゴヌクレオチド、５μｌ ＰstＩ
バッファおよび３２μｌ蒸留水を含める。第１検定混合
物にはＨＰＶ−１６は入れなかった。第２検定チューブ
（＃２）には１μｌ（１００μｇ）ＨＰＶ−１６、２μ
ｌの 32Ｐ標識化第１オリゴヌクレオチド、２μｌの非標
識化第１オリゴヌクレオチド、４μｌの第２オリゴヌク
レオチド、５μｌのＰstＩバッファおよび３５μｌの蒸
留水を含める。
【００４２】第３検定チューブ（＃３）には１μｌのＨ
ＰＶ−１６（１００μｇ）、２μｌの32Ｐ第１オリゴヌ
クレオチド、２μｌコールド第１オリゴヌクレオチド、
５μｌのＰstＩバッファおよび３５μｌの蒸留水を含め
た。第４検定チューブ（＃４）には１μｌのＨＰＶ−１
６（１００μｇ）、２μｌの32Ｐ第１オリゴヌクレオチ
ド、２μｌコールド第１オリゴヌクレオチド、５μｌの
ＰstＩバッファおよび３５μｌの蒸留水を含めた。
【００４３】第５検定チューブ（＃５）には１μｌのＨ
ＰＶ−１６（１００μｇ）、２μｌの32Ｐ第１オリゴヌ
クレオチド、２μｌコールド第１オリゴヌクレオチド、
４μｌの第２オリゴヌクレオチド、５μｌのＰstＩバッ
ファおよび３１μｌの蒸留水を含めた。ＰstＩ添加前上
述の５個の検定チューブを５〜１０分間煮沸し約１０分
間で室温で冷却する。
【００４４】冷却後サンプルをインキュベーターに入れ
る。検定チューブ番号１、４および５は３７℃でインキ
ュベートし、検定チューブ番号２および３は３２℃でイ
ンキュベートする。検定はＰstＬ５μｌを各チャーブに
入れて開始する。この検定反応は２時間行う。インキュ
ベーション後各チューブに８０％ホルムアミド、１５mM
ＴＲＩＳ−HCl （pH7.６）、１mM ＥＤＴＡ、0.１％
ｗ／ｖブロモフェノールブルーおよび0.１％ｗ／ｖキ
シレンシアノールＦＦを含む溶液１０μｌを添加して反
応を停止する。その後各チューブを６５℃で５分間加熱
し、素速く冷却する。
【００４５】３０％アクリルアミド（１９：１アクリル
アミド：ビス）（１９グラム アクリルアミド、１ｇ
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドおよび蒸留水）
を６７mlに希釈することによりポリアクリルアミドゲル
を調製する。１リットル中１０８グラムのＴＲＩＳベー
ス、５５グラムのホウ酸および9.３グラムのＥＤＴＡ・
2Na ・2H2Oを含む濃厚ＴＢＥバッファを調製する。もし
必要ならこの濃ＴＢＥバッファのpHは8.３に調整する。
４８グラムの生化用尿素（８Ｍ）を３０％アクリルアミ
ドを含むストック溶液に添加する。１０mlのＴＢＥバッ
ファを加え、尿素をこの溶液に溶かす。５０μｌ（１０
０mlアクリルアミド溶液当り）のＮ，Ｎ，Ｎ′Ｎ′−テ
トラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および１ml
（１００ml当り）の１０％過硫酸アンモニウムを加え、
この溶液をよく混合する。このゲル溶液を電気泳動装置
の２枚のガラスプレートの間に注ぎ込み、直ちにコーム
を挿入する。
【００４６】各サンプル２０μｌを重合したゲルにロー
ドし、0.０８９ＭＴＲＩＳ−ホウ酸、pH8.３および0.０
２５Ｍ ＥＤＴＡ＝ナトリウムを含む運転バッファを入
れる。このサンプルを８０ボルトで４時間泳動する。そ
の後ゲルをプラスチック製ホルダーで包み、コダックＸ
−ＯＭＡＴ ＡＲフイルムに重ねて１０分間感光させ
る。
【００４７】図３は、本発明のオートラジオグラスの例
である。オートラジオグラフから２８マーのオリゴヌク
レオチドおよび１４マーのオリゴヌクレオチドのバンド
の存在により基質の形成を容易に測定できる。２種の温
度において反応液に基質が存在する場合のレーン２およ
びレーン５には二本のパターンが表われる。レーン１は
基質のリサイクルに用いる第２オリゴヌクレオチドを含
まない場合で標識化第１オリゴヌクレオチドだけの存在
を示している。
【００４８】本発明は種々の好ましい態様に関して説明
しているが当業者は本発明の精神を逸脱することなしに
種々の修正、置換、省略および変化が可能であることは
明白である。従って本発明の範囲は特許請求の範囲およ
びその同等物によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】相補的ターゲット配列の場合の本発明の方法を
図式的に表わしたものである。
【図２】非相補的非ターゲット配列の場合の本発明の方
法を図式的に表わしたものである。
【図３】本検定法を用いたいくつかの試料のオートラジ
オグラフである。

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物試料中の核酸配列の存在を検出する
    方法であって、 （ａ）ターゲット核酸配列に実質的に相補的である核酸
    配列および切断可能な結合を含み、かつ検出可能なマー
    カーが結合した第１オリゴヌクレオチドを提供するステ
    ップ、 （ｂ）ターゲット配列に再ハイブリダイズせず第１オリ
    ゴヌクレオチドの末端に実質的に相補的であり、かつタ
    ーゲット分子側に切断された切断可能な結合を再構築す
    る少なくとも１つの塩基を含む第２オリゴヌクレオチド
    を混合物に添加するステップ、 （ｃ）前記ターゲット配列および前記第１オリゴヌクレ
    オチドがハイブリダイズした場合に前記切断可能な結合
    を切断し得る切断酵素を前記反応混合物に添加するステ
    ップ、 （ｄ）前記反応混合物をハイブリダイズさせるステッ
    プ、および （ｅ）未切断の第１オリゴヌクレオチドの存在下切断し
    た検出可能なマーカーを検出するステップ 以上、（ａ）〜（ｅ）のステップを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記ターゲット分子が一本鎖ＤＮＡ配列
    を含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記第１オリゴヌクレオチドが一本鎖Ｄ
    ＮＡ配列を含む請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】前記第２オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮ
    Ａ配列を含む請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記切断酵素が制限酵素である請求項１
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ターゲット分子が一本鎖または二本
    鎖である請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記ハイブリダイゼーションを前記切断
    酵素の効率およびオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
    ーションを促進する温度で行う請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第１オリゴヌクレオチド中の前記検
    出可能マーカーが放射性マーカーである請求項１記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 前記第１オリゴヌクレオチド中の前記検
    出可能マーカーが酵素マーカーである請求項１記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 前記第１オリゴヌクレオチド中の前記
    検出可能マーカーが、抗体、蛍光物質、化学発光物質、
    酵素、ビオチンおよびこれらの混合物からなる群から選
    ばれる標識化合物に対して特異的結合対メンバーとして
    働き得るリガンドである請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記第１オリゴヌクレオチドが約１０
    マーから４０マーの間にある請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記第１オリゴヌクレオチドが約２８
    マーである請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記第２オリゴヌクレオチドが約１０
    マーと２０マーの間にある請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記第２オリゴヌクレオチドが約１４
    マーである請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ターゲット核酸配列がＨＰＶ１６
    である請求項２記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記第２オリゴヌクレオチドがターゲ
    ット配列にハイブリダイズせず、かつ前記ターゲット分
    子上に切断された切断可能な結合を再構築する１つ以上
    の５′または３′塩基を含む第１オリゴヌクレオチドの
    末端に実質的に相補的である請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 生物試料中の核酸配列の存在を検出す
    る方法であって、 （ａ）切断可能な結合を有するターゲット分子を該ター
    ゲットに相補的な配列および検出可能マーカーを有する
    標識化第１オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイ
    ズしプローブ：ターゲット二種鎖を得るステップ、 （ｂ）切断可能な結合の個所で該二重鎖を切断するステ
    ップ、 （ｃ）ターゲット分子側に切断された切断可能な結合を
    再構築する第２オリゴヌクレオチドを添加するステッ
    プ、 （ｄ）再構築したターゲット分子をリサイクルするステ
    ップ、および （ｅ）該切断第１オリゴヌクレオチドプローブを検出す
    るステップ 以上（ａ）〜（ｅ）のステップを含む方法。
  18. 【請求項１８】 前記ターゲット分子が一本鎖ＤＮＡ配
    列を含む請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記第１オリゴヌクレオチドが一本鎖
    ＤＮＡ配列を含む請求項１７記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記第２オリゴヌクレオチドが一本鎖
    ＤＮＡ配列を含む請求項１７記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記切断ステップ（ｂ）に制限酵素を
    用いる請求項１７記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記ハイブリダイゼーションを前記切
    断酵素の効率およびオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
    ゼーションを促進する温度で行う請求項１７記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 前記第１オリゴヌクレオチド中の前記
    検出可能マーカーが放射性マーカーである請求項１７記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記第１オリゴヌクレオチド中の前記
    検出可能マーカーが酵素マーカーである請求項１７記載
    の方法。
  25. 【請求項２５】 前記第１オリゴヌクレオチド中の前記
    検出可能マーカーが抗体、蛍光物質、化学発光物質、酵
    素、ビオチンおよびこれらの混合物からなる群から選ば
    れる標識化合物に対する特異的結合対メンバーとして働
    き得るリガンドである請求項１７記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記第１オリゴヌクレオチドが約１０
    マーと４０マーの間にある請求項１７記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記第１オリゴヌクレオチドが約２８
    マーである請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記第２オリゴヌクレオチドが約１０
    マーと２０マーの間にある請求項１７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記第２オリゴヌクレオチドが約１４
    マーである請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ターゲット核酸配列がＨＰＶ１６
    である請求項１７記載の方法。
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