JPH02135100A - 特異的核酸配列の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、標的ヌクレオチド配列の存在を検出する方法
に関する。

核酸ハイブリダイゼーションは、核酸類の同等性を評価
するために使用されてきた。ハイブリダイゼーションは
、相補的塩基対形成に基づいている。少なくとも部分的
に相補的な単鎖核酸が、温度、ｔｌＨおよびイオン強麿
の適切な条件のもとに溶液中で熟成された場合、相補的
塩基配列は、対形成して二重鎖の安定なハイブリッド分
子を形成する。単鎖のデオキシリポ核１１ｉ（ｓｓｌ）
ＮＡ＞またはリボ核酸（ＲＮＡ）が、その相補的核酸配
列と共に水素結合構造を形成する能力は、組換えＤＮＡ
研究において分析的手段どして採用されてぎた。高い比
活性の放射性ヌクレオシド三リン酸が入手可能であるこ
と、およびＴ４ボリヌクレＡ゛チドキナーゼならびに他
の公知方法によるＤＮＡの３２Ｐｓ！識等の前記ヌクレ
オチド類を核酸ブＵ　−ブ中に導入する合成方法は、生
物学的に興味ある種々の核酸配列の同定、単鎖および特
徴付番ノを可能ならしめた。核酸ハイブリダイゼーショ
ンは、宿主の核酸組成に対する変化または付加に媒介さ
れる疾患状態の診断において、大きい可能性を有してい
る。これらの核酸組成の変化は、細菌類、カビ類、菌類
、およびウィルス類の感染による、ＤＮＡについての挿
入、削除、転移、点変異または外来ＤＮＡのｙＡ得等に
よる遺伝子的または環境的な変化を含むであろう。核酸
のハイブリダイゼーションは、これまで第一・義的には
学術上および産業上の分子生物学研究室で採用されてき
た。臨床医学における診断手段としての核酸ハイブリダ
イゼーションの適用は、患者体液中の疾患関連ＤＮＡま
たはＲＮＡの濃度がしばしば極めて低いこと、およびＤ
ＮＡハイブリダイゼーション分析の充分に高感度で迅速
な方法が利用できなかった為に限られたものであった。

ＤＮＡプローブ類の検出のための今［１の方法は、一般
に標的核酸をニトロセルロース紙、セルロース紙、ジア
ゾ化紙またはナイロン膜等の固体担体上に固定すること
を含む。標的核酸を担体上に固定した後、該担体は、適
切に標識化された＃Ｉ酸プ０−ブと約２ないし４８時間
接触さけられる。上記時間後、該固体担体は、注意深く
調節された温度にて、特異的に結合するプローブを除去
することなく非結合および非特異的結合ブロー１を除去
するために、数回洗浄される。次いで、該担体は乾燥さ
れ、該ハイブリッド化物質が、オートラジオグラフィま
たは色測定法により検出される。極めて低濃度を検出し
なければならない場合には、非特異的結合プローブに対
する特異的プローブの比が極めて低く、高度に厳格な条
件下での反復洗浄がしばしば必要となる。これらの条件
−トでは、分析の感度は、特異的結合プローブの実質的
な損失および容易な検出を許容Ｊる充分に高い非特買的
結合に対する特異的結合の比を達成できない等の為に、
しばしば悪化される。極めて低激瓜を検出しなければな
らない場合には、現在の方法は、近くかつ労力を要し、
しかも放射標識より検出が容易でない非同位体標識は、
しばしば適当でない。

核酸プローブ標識としての３２Ｐヌクレオチドの使用は
、い（つかの理由により望ましくない。第１には、３２
ｐは、１４．２の比較的短い半減期を有する。従って、
最大の感電を達成する為に（よ相補的プローブＤＮＡは
、ハイブリダイゼー・シ三１ン処理の直前に調製されな
ｉｊればならない。第２には、３２ｐの高い崩＃Ｊネル
ギーが、取扱いと廃棄の問題および望ましくない危険性
とを生じる、従って、多くの場合には危険’ｔｌＬ　／
Ｊτ少ない標識を利用し、かつ該プローブの貯蔵スレー
を長＜　′４’　３　（Ｘ　（２が有利である。高い比
活性の１〜リヂウム標識プローブが代替物を与える。−
・般に、トリノーラムはオー１−ラジオグラフィによる
検出のために長い露光時間を要する従来のハイブリダイ
ゼーン」ン法においては有用でないことが分かつ（いる
が、液体シンチレーション４数により標１７０−ブを検
出する液体法は、高い感度を有し望土しい。３２ｐより
低エネルギーの同位体であり、長い半減期を有する他の
ものは、炭ｊｔ（−１４−ｒある。

核酸プローブの非放射能標識の発展は、他の選択枝を与
える。高感度の非放射能ｉ）　Ｎ　Ａ標識系は、Ｌａｎ
ｇｃｒらの、Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ　八ｃａｄ、ｓｃｉ、、
ｌｌ５Ａ、　　　７８、６６３３　（１９８１）に記述
されている。該系は、ツク］・ランスレージョン処理に
よるビＡヂン化デＡキシウリジン三リン酸のＤ　Ｎ　Ａ
プローブへの取込みにＵいでいる。得られたビオチン化
ＤＮＡプローブは、安定であり、かつ非ビオヂン化ＤＮ
Ａプローブと同様の挙動をする。ビオチン化ｆ）　Ｎ　
Ａの検出は、インシヂュ（ｉｎ　ｓ＋ｔｕ　）　ハイブ
リッドぜ一ジョン後の固定化細胞または組織においで、
また、ゲル電気泳動により分離され、ニトロヒルロース
フィルタ上に移されたＤＮＡ断片のハイブリダイピージ
ョンにおいて、特定のＤＮＡまたはＲＮΔ配列の検出に
適用されてきた。ハイブリッド化したビオチン化プロー
ブの検出は、蛍光性抗体または酵素増幅技術のいずれか
によって実施される。これらの技術は、更にＧａｒｄｎ
ｅｒのに記述されている。

１　に とを含む。これらの蛍光ＲＮ△プローブ類は、細胞化学
的なハイブリダイピージョンに適用されてぎた。Ｂａｕ
ｍａｎらのＪ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、　ｃｙｔｏｃｈｅｍ
２９．２２７−２３８　（１９８１）。

簡単、迅速、（非同位体的）、均質または異質的な核酸
配列の検出方法を可能とする感度の増大方法が必要であ
る。

２、九■１」０鳩肚菫 ＬａｎｇｅｒらのＰｒｏｃ、　Ｈａｔ　Ｉ　　八ｃａｄ
、Ｓｃｉ　　ＵＳＡ、　　（１９８１）■、６６３３−
６６３７は、ビオチン標識ポリヌクレオチドの酵素的合
成およびこれらの材料の新規な核酸親和性プローブとし
ての使用を開示している。ビオチン標識ハイブリダイゼ
ーションプローブを用いた培養細胞中およびパラフィン
埋め込み組織断面中のウィルスゲノムの検出は、Ｂｒｉ
ｇａｔｉ　らのＶｉｒｏｌｏ（１，（１９８３）　１２
６．３２−５０により論じられている。米国特許第４゜
４８６．５３９号は、−段階のリンドイツチハイブリッ
ド化試験による微生物的核酸の検出を開示している。Ｄ
ＮＡ検出に基づく悪性腫瘍の高感肛な試験は、米国特許
第４’、４９０．４７２号に記載されでいる。米国特許
第４．４．８０，０４０号は、診断されるウィルス核ま
たはウィルス核酸に対して相補的な放射能標１４　Ｄ　
Ｎ　Ａを採用した植物ウィルス病またはウィルスの高感
度かつ迅速な診断を開示している。ヨーロッパ特許出願
第８３１０６１１２．２号（優先権主張米国特許出願第
３９１．４４０号、１９８２年６月２３日出願）は、修
飾標識ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドならびにそ
れらの調製、使用および検出方法を教示している。細胞
ＤＮＡの検出および測定のための方法および組成物は、
米国特許第４．４２３，１５３号に開示されている。

相応し、反復し、および増幅された核酸配列の検出およ
び単離は、米国特許第４．６７５．２８３号に開示され
ている。それ自体または他の核酸に反復的にハイブリッ
ド化して増幅された実在物を形成する゛ことが可能な単
鎖自己ハイブリッド化核酸プローブは、１９８６年７月
２２日出願の米国特許出願番号第６−８８８．０５８号
（ダウエンド抄録用８７−０７２６８１／１０）に記載
されている。米国特許第４，６８３，１９５号および米
国特許第４．６８３，２０２号は、試薬錯体由来の置換
ＲＮＡ単鎖ポリヌクレオチドの消化および２種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマを用いた核酸の分離された相補
鎖の処理による核酸配列の増幅を用いた相同的ポリヌク
レオチド置換アッセイが開示されている。ヨーロッパ特
許出願第０２００３６２号には、核酸配列の増幅、検出
またはクローニング方法であって、疾患の診断および形
質転換ベクターの調製において有用な方法が記載されて
いる。細胞質ドツトハイブリダイゼーションによる多数
の少量試料中の相対的核酸量の簡易分析法は、米国特許
第４，６７７．０５４号に記載されている。チオメクレ
オチドを含むプローブを用いた核酸配列の検出のハイブ
リダイゼーション法は、米国特許第４．６４７．５２９
号に記載されている。

ＤＮＡをセルロースに共有的に固定するための簡単かつ
効率的な酵素払、ならびにそのハイブリダイゼーション
−制限分析およびＤＮＡプローブのインビトロ合成への
応用は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
　（１９８６）工４　：９１７”ｌ−９１９１に記載さ
れている。ＥＣ０ＲＩ制限エンドヌクレアーゼによる単
鎖オリゴヌクレオチド類の切断は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８７）　１５　：
　７０９−７１６に記載されている。

標的配列に対して交差結合可能なプローブを用いた核酸
ハイブリダイゼーション試験は、米国特許第４，５９９
，３０３号に記載されている。この方法は、二官能性交
差結合分子が共有結合的に導入された特定の単鎖リボ核
酸またはデオキシリボ核酸の調製を含んでいる。この導
入は、交差結合分子が、共有結合的交差結合を形成する
為のプローブに対する標的である細菌１、ウィルス、ま
たは哺乳類染色体の核酸との第２の反応を行なう能力を
保存するようになされる。交差結合に次いで、非交差結
合プローブは、単鎖プローブと二重鎖共有結合プローブ
−標的複合体とを区別する数種の方法の一つを使用しで
、共有結合的交差結合プローブ−標的複合体から分離さ
れる。

遺伝子異常性疾患の診断の為の診断用および隣接的プロ
ーブを使用するハイブリダイゼーションによる核酸類中
の標的配列の検出は、特に自動化処理においてヨーロッ
パ特許出願第０１８５　４９４Ａ２に記載されている。

該方法において、試料は、標的配列の診断部分に相補的
なブ０−ブ（診断用プローブ）および該診断部分に隣接
するヌクレオチド配列に相補的なプローブ（ｌｌｊｌ接
プローブ）と、該診断用プローブが該標的配列を含む試
料核酸にのみ、実質的に結合する条件下で、ハイブリッ
ド化される。次いで、該診断用プローブと隣接プローブ
とは、共有的に結合されて標的配列に相補的な標的プロ
ーブが生成され、そして、結合されなかったプローブ類
が除去される。好ましい態様においては、プローブの一
つが、試料核酸標的プローブ二重体を融解し、解離した
標的プローブを溶離し、標識について試験を行なうこと
によって標的配列の存在または不在が試験し得るように
標識される。

上記の方法は、隣接配列が必要どされる点において、少
なくとも一つの不利益を被る。該方法を実施するために
は、診断配列と隣接配列とを同定し、かつこれらの配列
に相補的な診断用および隣接プローブを創製しなければ
ならない。該診断用および隣接プローブが厳密に同定さ
れない場合には、これら診断用および隣接プローブは、
充分にハイブリッド化しないであろうし、該アッセイの
特異性および感度は損われ、あるいは実質的に低減する
。

水１」戸へ１員 本発明の一面は、（１）第１のヌクレオチド配列および
第２のヌクレオチド配列を、標的ヌクレオチド配列の非
隣接部分にハイブリッド化させ、（２）該標的配列にハ
イブリッド化している場合に、該第１および第２の配列
を共有的に結合さ１１ならびに（３）共有的に結合され
た第１および第２の配列の存在を測定することを含んで
なる標的ヌクレオチド配列の存在の検出方法に関する。

共有的に結合された第１および第２の配列の存在は、標
的ヌクレオチド配列の存在と関連している。

本発明の伯の一面は、標的ヌクレオチド配列の検出方法
であって、ここで下記の組合せが液体培地中に用意され
る：■標的ヌクレオチド配列を含むと思われる試料、（
ｂ）該標的ヌクレオチドの第１の部分に相補的な第１の
ヌクレオチド配列、（ｃ）該第１の部分以外であって、
かつこれに隣接しない該標的ヌクレオチド配列の部分に
相補的な第２のヌクレオチド配列、ならびに＠該Ｍ１お
よび第２の配列を、これらの配列が該標的ヌクレオチド
配列にハイブリッド化している場合に共有的に結合する
手段。該組合往は、該第１および第２の配列が該標的ヌ
クレオチド配列とハイブリッド化し、かつ該標的ヌクレ
オチド配列が存在する場合に共有的に結合する条件のも
とに用意される。該共有結合した第１および第２の配列
の存在が測定され、その存在は、該標的ヌクレオチド配
列が試料中に存在することを示しでいる。

本発明の他の一面は、液体培地中に、■標的ヌクレオチ
ド配列を含むと思われる試料、０該標的ヌクレオチド配
列の第１の部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、（
ｃ）該第１の部分以外であり、かつこれに隣接しない該
標的ヌクレオチド配列の部分に相補的な第２のヌクレオ
チド配列、（ｃ）該第２のヌクレオチド配列が、該標的
ヌクレオチド配列にハイブリッド化している場合に、該
第２のヌクレオチド配列を延長して該第１および第２の
ヌクレオチド配列を隣接ｕしめる手段、ならびに、（ｅ
）該第１および第２の配列を共有的に結合させる手段を
組合せにおいて用意ツることを含んでなる標的ヌクレオ
チド配列の検出方法である。該組合せは、第１および第
２の配列が、標的ヌクレオチド配列が存在する場合にこ
れにハイブリッド化し、第２の配列が延長されて該配列
と該第１の配列とが隣接し、かつ、該第１および第２の
配列が共有的に結合される条件のもとに用意される。共
有的に結合した第１および第２の配列の存在が測定され
、これは試料中の標的ヌクレオチド配列の存在を示す。

本発明の他の面は、液体培地中に、（の標的ヌクレオチ
ド配列を含むと思われる試料、（ｂ）該標的配列の第１
の部分に結合し得る第１のヌクレオチド配列、および（
ｃ）該第１の部分以外であり、かつこれに隣接しない該
標的ヌクレオチドの部分に結合し１ｑる第２のヌクレオ
チド配列を合することを含む標的ヌクレオチド配列の検
出方法である。上記のものは、該第１および第２のヌク
レオチド配列が、該標的配列にハイブリッド化する条件
のもとに液体培地中に合せられる。該培地には、第１お
よび第２のヌクレオチド配列が、該標的配列にハイブリ
ッド化している場合に、これら第１および第２の配列を
共有的に結合する手段が添加される。

次いで、該第１および第２の配列が、共有的に結合した
か否かについて測定が行なわれる。第１および第２の配
列は、該標的配列が試料中に存在する場合にのみ共有的
に結合するであろうから、前記測定は、試料中の標的配
列の存在の指示を与える。

本発明の他の面は、液体培地中に、（２）標的ヌクレオ
チド配列を含むど思われる試料、（ｂ）該標的ヌクレオ
チド配列の部分に結合可能であり、かつ固定化手段を有
するか、あるいは右し得る第１のヌクレオチド配列、（
９該第１のヌクレオチド配列とは非隣接的であり、該第
１の核酸配列が結合づる該標的ヌクレオチド配列の部分
以外の部分に結合可能であり、伝達基を有するか、ある
いは有し得る第２のヌクレオチド配列、および＠該第１
のヌクレオチド配列を該第２のヌクレオチド配列に、共
有的に結合せしむる手段を含んでなる標的ヌクレオチド
配列の検出方法に関する。該培地は、該第１および第２
のヌクレオチド配列が、（１）該ヌクレオチド配列が存
在する場合には、これとハイブリッド化し、（２）互い
に共有的に結合する条件下で熟成される。該第１のヌク
レオチド配列は、該培地から分離される。分離された第
１のヌクレオチド配列は、該第２のヌクレオチド配列の
存在について試験される。該第１のヌクレオチド配列を
伴った第２のヌクレオチド配列の存在は、試料中の標的
ヌクレオチド配列の存在を示している。

本発明の他の面においては、標的ヌクレオチドの存在の
検出方法が開示されている。該方法は、液体培地中に、
（１）標的ヌクレオチド配列を含むと思われる試料、（
２）該標的ヌクレオチド配列の第１の部分に相補的な第
１のヌクレオチド配列、および、（３）該第１の部分以
外であり、かつこれに隣接しない標的配列の部分に相補
的な第２のヌクレオチド配列を合することを含む。該第
１および第２のヌクレオチド配列の少４ｊくとも一方は
、それに結合された有機小分子を有し、他方は、伝達基
に結合しているか、あるいは結合する能力を右している
。該第合せは、該第１おにび第２のヌクレオチド配列が
、標的配列に結合する条件−ＩＺで作製される。ポリヌ
クレオヂドボリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三
リン酸は、該第２のヌクレオチド配列が、延長されて第
１のヌクレオチド配列に隣接するようになる条件下で該
培地に添加される。次いで、リガーゼが、該第１および
第２のヌクレオチドが共有的に結合する条件下にて該培
地に添加される。次いで、表面が該培地に添加される。

該表面は、該有機小分子の結合相手を有している。アッ
セイの条件下で、該第１のヌクレオチド配列は、該表面
に結合する。該表面は、該培地から分館され、伝達基の
存在について試験される。

該伝達基の存在は、試料中に該標的ヌクレオチド配列が
存在づることを示す。

本発明は、更に、標的ヌクレオチド配列の存在を検出す
るための材料の組成物およびキットを包含している。

特定の実施態様の記載 上述したように、本発明は、標的ヌクレオチド配列の存
在の検出方法に関づ−る。本発明の−・実施態様は、第
１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を
、標的ヌクレオチド配列の非隣接部分にハイブリッド化
し、これらの配列が該標的配列にハイブリッド化してい
る場合に第１および第２の配列を共有的に結合し、なら
びに該共有的に結合した第１おにび第２の配列の存イ１
を測定することに関連する。該共有的に結合した、第１
および第２の配列の存在は、標的ヌクレオチド配列の存
在を示している。

本発明の特定の実施態様の記載を更に進めるに先立って
、多くの用晶が定義される。

ポリヌクレオチド分析物−一測定されるべき化合物また
は組成物であって、約２０から５００゜ＯＯＯまたはそ
れ以上のヌクレオチド、通常は、約１００から２００，
０００のヌクレオチド、より頻繁には５００から１５．
０００のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである
。該ポリヌクＬ／　、ｔ　ｆ　ト分析物は、ｔ−ＲＮＡ
、ｍ−ＲＮＡ。

ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ。

クロロプラストＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡＲＮＡハイ
ブリッド類またはこれらの混合物を含む１）ＮＡ（ｄｓ
ＤＮＡおよび５ｓＤＮＡ）およびＲＮＡ、遺伝子類、染
色体類、プラスミド類、例えば細菌類、酵母類、ウィル
ス類、ヴイロ１イド類、カビ類、キノコ類、植物、動物
、ヒト等の微生物などの生物学的材料のゲノム類ならび
にそれらの断片等を含む精製または未精製のいかなる供
給鉤に出来する核酸を包含する。該ポリヌクレオチド分
析物は、生物学的試料などの複雑な混合物の単に非主要
画分であってもよい。該分析物は、秤々な生物学的材料
からこの分野において周知の方法により得ることができ
る。このような１物学的材料の数例を、下記第１表中に
限定ではなり３１明のために示しである。

第１表 ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＋ｕｌｄｉｐｔｈ（３ｒｉａ
ｐｎｅｕｉｏｃｏｃｃｔ Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃ＋ ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｙｒｏｇｅｎｅｓＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　５ａｌｉｖａｒｕｓＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｕｓＮｅｉｓｓｅｒｉａ
ｅ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍＯｎｔｎｇ＋ｔ＋ｄ＋ｓＮｅ１
ｓｓｅｒｉａ　　ｇｏｎｏｒｒｈｅａＥｎｔｅｒＯｂａ
ＣｌｅｒｉａＣｌａｅＥＳＣｈｅｒｉＣｌｌｉａ　　ｃ
ｏｔ 八ｅへｏｂａｃｔｅｒ　　ａｅｒｏｇｅｎｅｓにＩｅｂ
ｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ　　ｔｙｐｈｏｓａＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｃ
ｌｌｏｌｅｒａｅｓｕｉｓＳａｌｍＯｎｏｌｌａ　　ｔ
ｌ／ｐｈｉｍＵｒｌｕｌｌｌＳｈｉｇｅｌｌａｅ　ｄｙ
ｓｅｎｔｅｒ＋ａＳｈｉｇｃｌｌａｅ　５ｃｈｎ＋＋ｔ
ｚＳ１１ｉｇｅｌ　ｌａｅ　ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄａ
Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ　　ｆｌｃｘｎｅｒＳｈｉｇｅｌｌ
ａｅ　ｂｏｙｄ Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ　５ｏｎｎｅ Ｏｔｈｅｒ　　ｅｎｔｅｒｉｃ　　ｂａｃｉｌＰｒｏｔ
ｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｕｓ　　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓＰｒＯｔｅＵＳ
　　ｍｏｒｇａｎｉ ＰＳＯＵｄＯｍＯｎａＳ　　ａｅｒＵ（ｌｌｎＯ３ａＡ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓコリ型細菌 Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ科 Ｓｈｉｇｅｌｌａ科 Ｐｒｏｔｅｕｓ種 Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ　８
ａｃｉＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｌ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｔｅｔａｎｉＣｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ　　ｐｃｒｒｒｒｎｇｅｎｓＣＩＯ３ｔｒｉｄ
ｉＵＩＩｌ　ｎ０ｖｙｉＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｉ＋　　
ｓｅｐｔｉｃｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏ
ｌｙｔｉｃｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　　ｔｅｒｔｉ
ｕｍＣＩＯ８ｔｒｉｄｉｌＪｍ　ｂ；ｒｅｒｍｅｎｔａ
ｎｓＣＩＯＳｔｒｉｄｉＵｍ　　５ｐＯｒＯ（ＪＯｎｅ
ＳＨｙＣＯｂａＣｔｅｒｉａ Ｈｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ　　１ｌ１０ｍ１ｎｉｓＨｙｃｏｂａｃｔｃｒｉ
ｕ　　ｂｏｖｉｓＨｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ａｖ
ｉｕｍＨｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｌｅｐｒａｅｓ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｒｕｍ　ｐａｒａｔＵｂｅｒｃＵＩ
Ｏ３ｉｓ八ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　　へ（１’ｕｎ
ｇｕｓ−ｌｉｋｅ　　ｂａｃｔｅｒｉａ）Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ　ｌ５ａｅｌｉ八ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　　
ｂｏｖｉｓ八ｃｔｉへｏｍｙｃｅｓ　　ｎａｅｓｌｕｎ
ｄｉＶｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏ　　ｅｒａｅ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　ｒｏ
ｕＨｅｍｏｐｂｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ、１１．
ｄｕｃｒｙｉＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｈｅｍｏｐ旧１ｕ
ｓＨｅｌｌｌＯｐｈｉｌｕＳ　ａｅｇｙｐｔｉｃｕｓｔ
ｌｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｒｌｕｅｎｚａｅ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓＰａｓｔ
ｅｕｒｅｌ　Ｉａｅ Ｐａｓｔｅｕｒａｌｌａ　　ｐｅｓｔ’５Ｐａｓｔｅｕ
ｒｅｌｌａ　　ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓＢｒｕｃｅ　　　
ａｅ Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ｍｅｌ目ｅｎｓ　ｉ　５Ｂｒｕｃｅ
ｌｌａ　　ａｂｏｒｔｕｓ Ｂｒｕｃｅｌｌａ　　５ｕｉｓ Ａｅｒｏｂｉｃ　　Ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ　　Ｂ
ａｃｉｌｌｉＢａｃｉｌｌｕｓ　　ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓＢａＣｉｌｌｔ
ｌＳ　　ｍｅ（ｌａｔｅｒｉＵＩｌｅａｃｒ＋＋ｕｓ　
　ｃｅｒｅｕｓ Ｎｏｃａｒｄｉａ　　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓＮｏｃａｒ
ｄｉａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓＴｈｅ　　Ｓ　　ｉ
ｒｏｃｈｅｔｅｓ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ　Ｓｐｉｒｉｌ
ｌｕｍ　ｍｉｎｕｓＴｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐｅｒｔｅｎ
ｕｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｎｏｉｌｉ
ｆｏｒｍｉｓ ｒｒｅｐｏｎｅｍａ　　ｃａｒａｔｅｕｍＢｏｒｒｅｌ
ｉａ　　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｓＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ　
　ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅＬｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ　ｃａｎｉｃｏｌａｒｒｙｐａｎａｓｏｍｅｓ ＋ｙｃｏｐ　ｌａｓｌＩｌａｓ Ｈｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＲｈｉＺ
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ｃｅｔｅｓＲｌｌｉＺＯｐＵＳ　ｎｉｇｒｉｃａｎｓＳ
ｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｌｓｃｈｅｎｋｉｉＦＩＯｎＳ（
ｉｃａｅａ　　ｐｅｄｒｏｓｏｉＦｏｎｓｅｃａｅａ　
　ｃｏｍｐａｃｔｒｏｎｓｅｃａｃｅａ　ｄｅｒｌＲａ
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Ｈｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ　　ｃａｎｉｓＴ　ｒ　＋　Ｃ
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ｌａ Ｐｏｘｖｉｒｕｓ　　ｂｏｖｉｓ ＰａｒａＶａＣＣｉｎｉａ ＭＯＩＩＵＳＣｔｌｌｌｌ　　ＣＯｎｔａ（ｌｉＯ３Ｌ
ＩｍＰｉＣＯｒｎａＶｉｒＵＳｅＳ ＰＯｌｉＯＶｉｒｕＳ ＣＯＸＳａＣｋｉｅＶｉｒＵＳ ＥＣｈＯＶｉｒｕＳｅＳ ＲｈｉｎＯＶｉｒＵＳｅＳ Ｍｌ／Ｘ０Ｖｌｒｕｓｅｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（八、Ｂ、ａｎｄ　　Ｃ）Ｐａｒａ
ｉｎｆ’１ｕｅｎａｚ（１−４）＋＋ｕ＋ｎｐｓ　　Ｖ
ｌｒｕ８ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　Ｖｉｒｕｓ
Ｍｅａｓｌｅｓ　　Ｖｉｒｕｓ ＲｉｎｄｅｒｐｅＳｔ　　Ｖｉｒｕｓ Ｃａｎｉｎｅ　Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ　ＶｉｒｕｓＲｅｓ
ｐｉｒａｔｏｒｙ　　５ｙｎｃｙｔｉａｌ　　Ｖｉｒｕ
ｓＲＵＭｌｌａ　　Ｖｉｒｕｓ 八ｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ 他の病原 Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＥｒｙ
ｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ
Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｏｎｉｌｉｆｏｒ
ｍｉｓＤＯｎＶａｎｉａ　（ｌｒａｎｕｌｏＩＩｌａｔ
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ｋｅｔｔｓｉａ　ｃｏｎｏｒ ＲｉＣｋｅｔｔＳｉａ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ旧ｃｋｅｔ
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類不能なｐａｒａｓｉｔｅｓｂａｃｔｅｒｉａｌ／ｖｉ
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（命名不確実）ｕｎｇｉ ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｎｅｏｔｏｒｍａｎｓＢ
ｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ旧ｓｏｐ
ｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｎ＋Ｃｏｃｃｉｄｉｏ
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ｓＨｕｃｏｒ　ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒ（＾ｂｓｉｄｉａ
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ＶｉｒｕｓＳｉｎｄｂｉｓ　　Ｖｉｒｕｓ Ｃｈｉｋｕｇｕｎｙａ　Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｍｌｉｋｉ　　Ｆｏｒｅｓｔ　　Ｖｉｒｕｓｓａｙ
ｏｒａ　　Ｖｉｒｕｓ Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　　Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ　　Ｖ
ｉｒｕｓＣａｌｉｆｏｒｎｉａ　　ＥｎＣｅｐｈａｌｉ
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　Ｆｅｖｅｒ　　Ｖｉｒｕｓ１’ｅｌｌｏｗ　　Ｆｅｖ
ｅｒ　　ＶｉｒｕｓＤｅｎｇｕｅ　　Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｒｅｏｖｉｕｒｓ　　Ｔｙｐｅｓ　　１−３１−３Ｒｅ
ｔｒＯＶｉｒｕ ＳｅＳＨｕ　　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖ
ｉｒｕｓｅｓ（旧■）１１ｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｌ
ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃＶｉｒｕｓ　　Ｉ　　＆　　
ＩＩ　　（ＨＴＬＶ）１１ｅｐａＮＮｓ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ａ　　ＶｉｒｕｓＨｅｐａｔｉ
ｔｉｓ　　Ｂ　　Ｖｉｒｕｓ１１ｅｐａｔ＋ｔ＋ｓ　　
ｎｏｎ八−ｎｏｎｅ　　ＶｉｒｕｓＴｕｍｏｒ　　Ｖｉ
ｒｕｓｅｓ Ｒａｕｓｃｈｅｒ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　Ｖｉｒｕｓ
Ｇｒｏｓｓ　　Ｖｌｒｕｓ Ｈａｌｏｎｅｙ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　ＶｉｒｕｓＨ
ｕｍａｎ　　Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　　Ｖｉｒｕｓｅｓ該
ポリヌクレオチド分析物は、適切な場合または必要な場
合には、処理されて該分析物が切断され、標的ヌクレオ
チド配列を含む断片が得られるであろう。従って、該分
析物は、制限エンドヌクレアーゼまたは他の部位特異的
な化学的または酵素的切断方法による処理等の公知の技
術により切断され得る。

本発明の目的のため、該ポリヌクレオチド分析物または
該ポリヌクレオチド分析物から得られた切断断片は、通
常、少なくとも部分的に、変性もしくは単鎖化され、ま
たは変性もしくは単鎖するように処理される。このよう
な処理は、この分野でよく知られており、例えば加熱ま
たはアルカリ処理を含む。例えば二重鎖ＤＮＡは、９０
−１００℃にて１から１０分間、適切なイオン強度の条
件下に加熱され、変性材料が生成される。

標的ヌクレオチド配列−一同定すべきヌクレオチド類の
配列の少なくとも一部であり、王の同一性は、標的配列
の非隣接部分にハイブリッド化する非隣接結合ポリヌク
レオチド配列類の調製を可能とするに充分な適疫に知ら
れている。該標的ヌクレオチド配列は、通常的１２から
１０００またはそれ以上、好ましくは１５から１００ヌ
クレオチドを含むであろう。該標的ヌクレオチドは、般
にはより大ぎい分子の断片であるか、または実質的に全
分子であってもよい。該標的ポリヌクレオチド配列にお
（プる最小ヌクレオチド数は、ヌクレＡヂド分析物の存
在が測定され得ることが確実となるにうに選択される。

該標的配列における最大ヌクレオチド類は、普通には、
ポリヌクレオチド分析物の長さにより、および切断によ
り、内部的ヌクレアーゼにより、または該標的配列を切
１１ｉするために用いる試薬により分断される性質に制
限される。

ｆ５１のヌクレオヂド配列−−該標的ヌクレオヂド配列
の一領域に相補的なポリヌクレオチド配列を有すること
による効力で該標的ヌクレオチド配列とハイブリッド化
可能な化合物で、該第１のヌクレオチド配列は、該標的
ヌクレオチドのそのような領域に結合するであろう。

該第１のヌクレオチド配列は、生合成または化学合成に
よって得ることができる。短い配列（１００ヌクレオチ
ドまで）については、化学合成は、しばしば生合成に比
べてよりＩＩ￥湾的であろう。経済性に加え、化学合成
は、合成段階において低分子量化合物および／または修
飾塩基を導入り゛る便利な方法を与える。更に、化学合
成は、該標的ヌクレオチド配列の長さおよび領域の選択
において非常に融通がきく。該第１のヌクレオチド配列
は、商業的な自動化核酸合成装置等の標準的方法により
合成可能である。ＤＮＡの適切に修飾されたガラスまた
は樹脂上での化学合成は、該表面に共有的に結合された
ＤＮＡを生じ得る。このことは、洗浄および試料の取扱
いにおいて優位性を与えるであろう。長い配列について
は、分子生物学において採用されている標準的な複製方
法、例えばＲＮＡ調製のための商業的なキットにＪ５い
て採用されている方法（例えばＰｒ０１ｌｅ（ｌａ、Ｈ
ａｄｉＳＯｎ。

Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより〉、および、Ｊ、）ｌｅｓｓｉ
ｎｇ　　（１９８３）ＨｅｔｈｏｄｓＥｎｚｍｏｌ、　
　１０１．２０−７８により記述されているように単鎖
ＤＮＡのためのＭ２Ｓの使用にＪ：る方法が用いられる
。

オリゴヌクレオヂド合成の伯の方法は、リン酸エステル
およびリン酸ジエステル法（ＮａｒａｎＱらの（１９７
９）　Ｈｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　　６旦＝９０）
および、担体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅらの（１９
８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　　
２２　：　１８５９−１８６２）が、ホスホラミデート
技術、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　Ｈ，Ｈ。

らの″Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
１５４巻、２８７−３１４頁（１９８８）ならびに５ｙ
ｎｔｈｅｓｒｓａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　
ｏｆ　　ＤＮＡ　　ａｎｄ　　ＩＩＮＡ″　Ｓ、Ａ、Ｎ
ａｒａｎｇ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　、　１９８７およびこれに含まれた文献に
記載されている他の方法に加えて含まれる。

該第１のヌクレオチド配列を選択するための主な基準は
、（１）該配列が確かなもの、すなわち、合成される領
域が厳密に知られたものでなければならず、かつ、該ポ
リヌクレオチド分析物に対して特異的でなければならな
い。（２）該配列は、安定かつ特異的な結合をｈえるた
めに充分な長さでな（プればならない。最小の配列は、
通常少なくとも４、より好ましくは少なくとも１０ヌク
レオチドの長さである。一般には、合成ポリヌクレオチ
ドは、約８から３００ヌクレＡヂド、より鵡通には、１
５から５０ヌクレオチドの長さぐある。第１および第２
のヌクレオチド配列のハイブリッド化部分の合せた長さ
は、好適には少なくとも約２０．好ましくは約３０から
３０００ヌクレオチドの長さである。生物学的に合成さ
れたポリヌクレＡ゛ヂドを用いた未知の配列の無作為断
片は、核酸が単鎖であり、かつポリヌクレオチド分析物
に相補的である限りにおいて使用することができる。

第２のヌクレオチド配列−一該第２のヌクレオチド配列
は、該標的ヌクレオチドに対し、該第１のヌクレオチド
配列がハイブリッド化する領域以外であって同領域と隣
接しない領域においてハイブリッド化可能である。該第
２のヌクレオチド配列は、該第１のヌクレオチド配列に
ついて上述したように、確かめられ、調製され得る。

該標的ヌクレオチド配列の第１および第２のヌクレオチ
ド配列に対して相補的な２つの領域は、該分析物の実質
的な両分が結合される２つの領域を有することを確実と
するＪ：うに、互いに適当に近接し、しかも近隣しない
位置にある。該２つの領域は、連結用酵素が、非隣接的
である場合の該配列を連結し得るように、鎖の延長を必
要としない１から３ヌクレオチド以内にあってもよい。

第２のヌクレオチド配列の鎖延長を採用する場合には、
該２つの領域は、通常５．０００塩基以内、しばしば２
，０００塩基以内、よりしばしば５００塩基以内にある
が、特にアラレイが２つの核酸配列の連結を示す場合に
は、１０．０００塩基またはそれ以上に分離されていて
もよい。

特異的結合対の部分（ｓ　ｂ　ｐ部分″ｉ−２つの異な
る分子の１つであり、表面上または空孔内に、伯の分子
の特定の空間的および極性的組織１対して特異的に結合
し、従って、相補性を定義する領域を有している。該特
異的結合対の部分はリガンドＪ５よびレセプタ（抗リガ
ンド）として言及される。これらは、通常抗原−抗体等
の免役対であり、ビオチン−アビジン、ホルモン類−ホ
ルモンレセプタ類、核酸二重体、ＩＱＧ＝蛋白質Ａ１Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−０ＲＮＡ等の他の特異的結合対
は、免疫対ではないが、本発明の範囲内に含まれる。

リガンドーーレセプタが天然に存在するか、あるいは調
製可能な任意の化合物。

レセプタ（″抗リガンド″）−一例えばエピトープ性ま
たは決定子部位等の分子の特定の空間的および極性的組
織を認識し得る任意の化合物または組成物。例示的なレ
セプタは、例えば天然に産生ずるレセプタ類を含め、チ
ロキシン結合グロブリン、抗体類、酵素類、Ｆａｂ断片
断片レクチン類、核酸類、蛋白質Ａ、完全構成物Ｃ１ｑ
などを含む。

有機小分子−一ビオチン、蛍光体、ローダミンおよび他
の染料、テ１〜ラサイクリンおよび他の蛋白質結合分子
、ならびにハプテン等の分刊１５ＯＯ禾満、好ましくは
７００から１０００、より好ましくは３００から６００
の化合物１．該有機小分子は、ヌクレオチド配列を、標
識または担体に固定する手段を与える。

担体または表面−一多孔性または非多孔性の水不溶性材
料。該担体は、親水性または親水性を与えられ得るもの
で、シリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナ等の無
機粉体；例えば口紙、９１コマトゲラフ紙等の紙類を含
む繊維のような天然ポリマー材料、特にセルロース性材
１Ｆｌ−４３よびセルロスから誘導される材料；ニトロ
セル１コース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、
ポリアクリルアミド、交差結合デクストラン、アガロー
ス、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリゾロピレン
、ポリ（４−メチルブタン）、ポリスチレン。

ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）
、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等の合成または
修飾された天然産生高分子：それｌう自体または他の材
料との組合せにおいて使用され；Ｂｉｏｇｌａｓｓとし
て入手可能なガラス、セラミクス、金属類等を含む。リ
ポソーム類、リン脂質粒子、および細胞等の天然または
合成集合体もまた、利用可能である。

担体または表面に対するｓｂｐ部分の結合は、文献中に
Ｉ一般に入手可能な公知の技術により行なうことができ
る。例えば、Ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚｙｍｅｓ
　Ｉｃｈｉｒｏ　Ｃｈｔｂａｔａ、ｔｌａｌｓｔｅｄ　
Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９７８）およびＣ
ｕａｔｒｅｃａｓａｓのＪ、Ｂｉｏｌ。

Ｑ」ユ　２４５　：３０５９　（１９７０）参照。該表
面は、多くの形状、切片、棒、ビーズを含めた粒子等の
うちの任意のものでよい。

該表面は、通常、多官能性であるか、もしくは多官能性
とされ、得るか、または、特異的もしくは非特異的な共
有もしくは非共有性相互作用を通してオリゴヌクレオチ
ドもしくはｓｂｐ部分を結合し得る。多くの種類の官能
基が利用可能であり、あるいは導入され得る。官能基は
、カルボン酸類、アルデヒド類、アミノ基類、シアノ基
類、エチレン基類、ヒドロキシル基類、メルカプト基類
等を含む。多種類にわたる化合物を粒子に連結する方法
は、周知であり、文献中に広く例丞されている。

例えば、ＣａｕｔｒｅｃａｓａｓのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、　　２４５　。

３０５９　（１９７０）参照。オリゴヌクレオチドまた
はｓｂｐ部分に対する連結基の長さは、連結される化合
物の性質、該配列のハイブリダイゼーションに対する連
結される化合物と粒子との間の距離の影響等に依存して
広く変化し得る。該オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐ部
分は、該粒子の実質的に外部表面に結合されるであろう
。

該表面として使用される粒子は、直接的または常法によ
り粒子に結合された蛍光性化合物もしくは蛍光体の効果
により蛍光ｆ’Ｌ　ｒあり得る。該蛍光体は、通常粒子
に溶かし込まれるか、または共有的もしくは非共有的に
結合され、また、しばしば粒子を介して実質的に均質に
結合される。蛍光化ラテックス粒子は、米国特許第３，
８５３．’９８７号に開示され、かつＣｏｖａｌｅｎｔ
　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｐ、からＣｏｖａｓｐｈ
ｅｒｅｓとして商業的に入手可能である。

標識または伝達基−一信号生成系の一員であり、第１も
しくは第２のヌクレオチド配列、または、該第１および
第２のヌクレオチド配列が該標的配列にハイブリッド化
している際に、これらのヌクレオチドを隣接させる為に
用いられる１もしくはそれ以上のヌクレオチドに結合さ
れているか、または結合させられる。好ましくは、第１
または第２の配列、および該１またはそれ以上のヌクレ
オチドのうちの１つは、標識を右するか、または有し得
る。−船釣には、検出可能ないかなるＩＩｊＸ識も使用
可能である。該標識は、同位体性または非同位体性で、
通常は非同位体性であり、触媒、染料、蛍光性分子、化
学発光体、補酵素、基質、放射性基、ラテックスもしく
は炭素粒子等の粒子、金属ゾル、結晶、リポソーム、細
胞等であり得、これらは更に染料、触媒、または他の検
出可能な基等により標識されていても、されていなくと
もよい。

該標識は、信号生成系の一員であり、単独で、または該
信号生成系の他の構成員と共に検出可能な信号を生成す
る。該標識は、直接的に第１もしくは第２のヌクレオチ
ド配列または介在ヌクレオチド配列に結合されるか、あ
るいは、該第１もしくは第２のヌクレオチド配列または
該介在ヌクレオチド配列に結合されたｓｂｐ部分に対し
て相補的なｓｂｐ部分に結合することにより、それらに
対して結合させ得る。

信号生成系−−−該信号生成系は、１つ以上の構成要素
を有し、少なくとも１つの構成要素は、標識または伝達
基である。該信号生成系は、試料中のポリヌクレオチド
分析物の存在または量に関連する信号を生成覆る。該信
号生成系は、測定可能な信号を生成するために要するす
べての試薬を含んでいる。該標識が、該第１もしくは第
２のヌクレオチド配列または該介在ヌクレＡ“チド配列
に結合されていない場合には、該標識は、通常該第１ま
たは第２のヌクレオチド配列の一部であるｓｂｐ部分に
相補的なｓｂｐ部分に結合される。

該信号生成系の他の構成要素は、展開溶液中に含有され
ていてもよく、また、基質、増強因子、活性化因子、化
学発光性化合物、協同因子、阻害剤、廃棄体、金属イオ
ン、信号生成物質に結合する為に要する特異的結合物質
などを包含することができる。該信号生成系の他の構成
要素は、補酵素、酵素的生成物と反応する物質、他の酵
素および触媒等であってもよい。該信号生成系は、外部
的な手段により、電磁放射の使用、好ましくは可視的試
験により検出可能な信号を生成する。

該信号生成系は、少なくとも１秒類の触媒、通常は酵素
、および少なくと゛ｂ１種類の基質を含んでもよく、ま
た、２種類以上の酵素および複数の基質を含んでもよく
、更にまた、１つの酵素の基質が他の酵素の生成物であ
る場合に酵素の組合せを含んでもよい。該信号生成系の
操作は、試料中のポリヌクレオチド分析物の量に関連す
る検出可能な信号を生成するためである。

信号生成系において有用な多くの酵素および補酵素は、
ここに参考文献として含める米国特許第４．２７５．１
４９号第１９欄から第２３欄および米国特許第４．３１
８．９８０号第１０欄から第１４欄に示されている。多
くの酵素の組合け゛は米国特許第４．２７５．１４９号
の第２３欄から第２８欄までに示され、この組合せは、
本発明において用途が見出し得る。この開示は、ここに
参考として含める。

特に興味あるものは、過酸化水素の生成および該過酸化
水素の染料前駆体を染料へと酸化するための使用に関連
する酵素類である。特定の組合せは、グルコースおよび
ガラクトース第４ニジダーゼ等の糖類酸化酵素または、
ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ等のへゾロ環
酸化酵素が、過酸化水素を染料前駆体の酸化に使用する
酵素、すなわちセイヨウワサビパーオキシダーゼ、ラク
トパーオキシダーゼまたはマイクロパーオキシダーゼ等
の過酸化酵素と組合されたものを含む。追加的な酵素の
組合せは、参考として加えた主題中に見出されるであろ
う。単独の酵素を標識として使用した場合、弛の酵素類
は、加水分解酵素、転移酵素、および酸化物還元酵素、
好ましくはアルカリホスファターゼ、およびβ−ガラク
トシダーゼ等の加水分解酵素等の用途が見出されるであ
ろう。

別法どして、蛍のルシフエラー１および細菌ルシフェラ
ーゼ等のルシフェラーゼが使用されてもよい。

用途が見出される例示的な補酵素は、ＮＡＤ［Ｈ］　：
　　ＮＡＤＰ　［Ｈ］　；　　ピリドキサルリン酸；　
ＦＡＤ　［Ｈ］　：　ＦＭＮ４１−１］等を含み、通常
は補酵素類は、閉環反応に係わる。特に米国特許第４，
３１８．９８０号参照。

該酵素反応の生成物は、通常染料または、蛍光体である
。多くの例示的な蛍光体は、ここに参考として含める米
国特許第４．２７５，１４９Ｍの第３０欄おにび第３１
欄に示されている。

該信号生成系は、１種以上の粒子を含んでもよく、これ
は、直径が少なくとも約５Ｑｎｍかつ約５０ミクロン以
上ではなく、通常は、少なくとも約１１００ｎで、かつ
約２５ミクロン未満であり、好ましくは約０．２から５
ミクロンまでの、不溶性粒子である。該粒子は、有機性
または無機性、多孔性または非多孔性、好ましくは水に
近い密度であり、−船釣には約０．７から約１．ＥＩＪ
／ｍｉ！であり、また、透明、半透明もしくは不透明の
材料からなる。

該有機性粒子は、イ］加反応または縮合ポリマのいずれ
かのポリマーからなり、アラ廿イ媒体中に容易に分散さ
せ得る。該粒子の表面は、オリゴヌクレオヂドまたはｓ
ｂｐ部分を直接的または間接的のいずれかにより結合す
べく、吸着性または官能化可能である。該粒子の性質は
、上述した。

興味ある蛍光体類は、一般に波長３５０　ｎｍ以上、通
常は４００　ｎｍ以上、また、好ましくは４５０ｎｍ以
上の光を放出づる。好ましくは、該蛍光体は、高い量子
収率と、大ぎいストークジットを有し、かつそれらの結
合および使用条件下で化学的に安定である。該蛍光体な
る用語は、電磁輻射による活性化または化学的な活性化
にＪ：り光を放射する物質を包含することを意図してお
り、蛍光性およびリン光性物質、シンチレータ、ならび
に化学発光性物質を含む。

興味ある蛍光体類は、ある種の第一・義的機能体を有す
る種々のカテゴリーに含まれる。該第一義的機能体は、
１−ならびに２−アミノナフタレン、ｐ、ｐ−ジアミノ
スチルベン類、ピレン類、第四級フエナントリジン塩類
、９−７ミノアクリジン類、ｏ、ｐ’−ジアミノスチル
ベンイミン類、アントラセン類、オクサカルポギシアニ
ン、メロシアニン、３−アミンエキレニン、ペリレン、
ビス−ベンゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾールベン
ゼン、１．２−ベンゾフェナジン、レヂナール、ビス−
３−アミノピリジニウム塩類、ヘレブリゲニン、テトラ
サイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフ
ェニルアミン、２−オキソ−３−り０メン、インドール
、キサンチン、７−ヒドロキシクマリン、４，５ニベン
ズイミダゾール類、フエノキリンジン、サリチル酸塩、
ストロフアンチジン、ポルフィリン類、トリアリルメタ
ン類、フラビンならびに希土類キレート酸化物および塩
を含む。蛍光体の例示は、ここに参考として含める米国
特許第４．３１８，７０７号の第７欄および第８欄に示
されている。

加つるに、エネルギー吸収性または消去性粒子を採用す
ることができ、これは、プローブど該ポリヌクレオチド
分析物とのパイプリダイゼーションにより、または特異
的結合対の部分間での特異的結合により生じる距離の範
囲内である場合に、蛍光性粒子の蛍光を消去することが
できる直径が少なくとも約５０ｎｍの固体不溶性粒子で
ある。該消去粒子は、蛍光性粒子と同一または異なるも
のでよく、通常は異なっている。通常、該消去粒子は、
粒子表面から測定される距離において、約５０Å以上、
好ましくは５００Å以上、より好ましくは２０００Å以
上の距離で実質的な消去性を与えるであろう。

多くの巽なった型の粒子が、光輻射の変調に対して利用
され得る。特に興味あるものは、木炭、ランプスス、グ
ラファイト、コロイド性炭素等の炭素粒子である。炭素
粒子の他に、金属ゾル、特に、金、銀および白金等貴金
属もまた用途が見出される。他の金属誘導粒子は、鉛、
銀もしくは銅硫化物等の金属硫化物または、鉄もしくは
銅酸化物等の金属酸化物を含んでよい。

検出可能な信号としての光の他の供給源は、化学発光性
供給源である。該化学発光性物質澱は、化学反応により
電ｒ的に励起され、次い−Ｃ検出可能な信号として作用
するか、あるいは蛍光性受容体にエネルギーを与える光
を輻射する化合物を含む。

極めて多くの種類の化合物が、種々の条件のもとに化学
発光性を与えることが見出されている。

化学物の一種としては、２，３−ジヒドロ−１゜４−フ
タラジンジオンがある。最も一般的な化合物は１、ルミ
ノールであって、これは上記化合物の５−アミノ類縁体
である。この種の他の構成員は、５−アミノ−６，７，
８−トリメトキシおよびジメチルアミン−［Ｃａ］ベン
ズ類縁体である。

これらの化合物は、アルカリ性過酸化水素または次亜塩
素酸カルシウムと塩基により発光性とされ得る。化合物
の他の種は、親化合物が一般名としてロフィンを有する
２、４．５−ｔ〜クリフェニルイミダゾール類ある。化
学発光性類縁体は、バラジメチルアミノおよびパラ−メ
トキシ置換体を含む。化学発光ｆｌ：は、塩基作条ｆｌ
十で、通常第４サリルであるオキシレート類、ｐ−ニト
ロフェニル等の活性ニスデル類、過酸化水素等の過酸化
物により得られる。別法として、ルシフェリン類をルシ
フエラーぜまたはルシゲニンとの組合せによって用いて
もよい。

補助的月利−−本発明によるアッセイにおいて、種々の
補助的材料がしばしば使用される。例えば、アッセイ培
地およびアッセイ成分用の安定化剤に加え、アッセイ培
地中には通常緩衝剤が存在する。

しばしばこれらの添加剤に加えて、アルブミン等の蛋白
質が含まれ、あるいは、界面活性剤、特に非イオン性界
面活性剤、例えばポリアルキレングリコール等の結合増
強剤等が含まれる。

ヌクレオシド五すン酸−−５′三リン酸置換基を有する
ヌクレオシドで、通常デオキシヌクレオシド三リン酸。

該ヌクレオシド類は、ペントース糖の１′−炭素に共有
的に結合したプリンまたはピリミジン誘導体のいずれか
の窒素ｆ！Ｉｇｌ基のベン］ヘース糖誘導体である。該
プリン塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、およ
びその誘導体、類縁体を含む。該ピリミジン塩基は、シ
トシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｃ）、および
その誘導体、類縁体を含む。好適なヌクレオシす三リン
酸は、ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ、ｄＧＴ’Ｐ、ｄＣＴ’ｒ−’お
よびｄ　Ｔ　−１−Ｐを含む。

該誘導体および類縁体は、非誘導ヌクレオブす三リン酸
と同様にして認識され、ポリマー化されるものにより例
示される。このような誘導体または類縁体の例は、限定
ではなくして例示の方法として、伝達基による修飾、ビ
オブニル化、アミン修飾、放射標識、アルキル化等によ
り修飾されたもので、また、チオリン酸塩、亜リン酸」
シ、環原子修飾誘導体等も含む。該伝達基は、ノルＡ“
ロセイン等の蛍光性基、ルミノール等の化学発光基、Ｎ
−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸等の
テルビウム配位子等の涯延蛍光性により検出可能なもの
などであり得る。

ポリヌクレオチドポリメラーゼーー触媒、通常は酵素で
あって、第１または第２のヌクレオチド配列（通常は第
２の配列）を、該標的ヌクレオヂドに沿って延長物を形
成するためのものであり、該延長物はそれに対して相補
的である。該ポリヌクレオヂドポリメラーゼは、ヌクレ
オシド三リン酸類を延長物の構築部材としで使用し、こ
れは、５′から３′の方向（標的に関しては３′から５
′　）に該第２のヌクレオチド配列が該第１のヌクレオ
チド配列と隣接づるまで進行する。通常は、該触媒は酵
素であり、例えば原核性ＤＮＡポリメラーゼ（■、■ま
たはｎＩ）、Ｔ４　　ＤＮＡポリメラーぜ、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼ、クレプウ断片、逆転写酵素、ＲＮＡ転写
酵素等のＲＮ　Ａポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリ
メラーゼであって、細胞類、Ｅ、ｃａｌｉ等の細菌類、
植物、動物、ウィルス、好熱性細菌等のいかなる供給源
からも誘導される。

全体的または部分的に順次的な一一一木発明において使
用される試料および種々の試薬は、同時的ではなくして
、１種またはそれ以上が残る試薬の１秒またはそれ以上
と合せられ、副結合物を形成してもよい。次いで、核副
結合物は、本方法の１つまたはそれ以十の工程に供せら
れ得る。かくしで、各々の副結合物は、１種またはそれ
以上の所望の結果を達成するための条件のもとに熟成さ
れ得る。

ハイブリダイゼーション（ｂイブリッド化）および結合
−一ヌクレオチド配列に関しては、これらの用語は、こ
こにおいて交換可能に使用される。

ヌクレオチド配列のハイブリッド化能力は、該ヌクレオ
チド配列の相補性に基づいており、次いで相補的なヌク
レオチドの対形成に基づいている。

与えられた配列が、他の配列に対する相補的なヌクレオ
チドをより多く有しているほど、第１の第２に対するハ
イブリダイゼーションの程麿はより大きくなる。

非隣接的−一第１のヌクレオチド配列および第２のヌク
レＡ′ブード配列が、標的ヌクレオチドの非隣接部分に
ハイブリッド化し、該標的ヌクレオチド配列において、
ハイブリッド化した第１のヌクレオチド配列の５′末端
と、第２のヌクレオチド配列の３′末端との間に、少な
くとも１つのヌクしＡチドが存在する。

隣接的−一−第１および第２のヌクレオチド配列が該標
的ヌクレオチド配列にハイブリッド化した際に、該第１
のヌクレオチド配列の５′末端と、該第２のヌクレオチ
ド配列の３′末端との間にヌクレオチドがない場合、こ
れら第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列
とは隣接すると考えられる。

共有的に結合Ｊるｍ−該第１のヌクレオチド配列と該第
２のヌクレオチド配列との間に化学結合が形成されるこ
と。該化学結合は、これら第１および第２の配列が該標
的ヌクレオチド配列に結合している場合に、第１および
第２のヌクレオチド配列が隣接的であるか否かのいずれ
であっても形成され得る。共有的結合は、例えばリガー
ゼを用いることにより酵素的に達成し得る。第１および
第２のヌクレオナト配列を連結するに先立って、該第２
のヌクレオチド配列、または他のハイブリッド化したヌ
クレオチド配列に向番プて延長可能な３′末端を有する
配列が処理されて、該第１のヌクレオチド配列と隣接さ
せられるか、または有効裏に隣接さＬ′られねばならな
い。これらの配列は、例えば、酵素的な連結または化学
的なカップリングが行なわれ得る場合に有効裏に隣接し
ている。

一般的には、第１および第２のヌクレオチド配列は、こ
れらが１から３ヌクレオチドの範囲内で分離している場
合に、有効裏に隣接している。鎖の延長は、例えばポリ
ヌクレオチドポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸
類を添加するか、または第１および第２のヌクレオチド
配列に、該標的ヌクレオチド配列の該第１および第２の
ヌクレオチド配列間の非隣接領域に相補的なヌクレオチ
ド配列を連結することにより達成されるであろう。

該共有結合は、第１および第２のヌクレオチド配列のリ
ン酸残基間に化学結合を形成Ｊることにより、化学的に
達成してもよい。別法として、該第１および第２のヌク
レオチド配列をヘワックスの部分として連結して、該第
１および第２のヌクレオチド配列の隣接を必要としない
ようにすることもできる。他の実施態様におい°（、共
有結合は、該第１および第２のヌクレオチド配列をフォ
トカップル化して光化学的に達成することができる。

第２のヌクレオチド配列の延長手段−一該第１および第
２のヌクレオチド配列が、該標的ヌクレオチド配列に結
合している場合に、これらの第１および第２の配列を連
結する為には、該第１および第２のヌクレオチド配列を
隣接させな（〕ればならない。上記に説明したように、
該第１または第２のヌクレオチド配列は、通常は第２の
ものであるが、該標的ヌクレオチド配列にハイブリッド
化するヌクレオチド配列と、ヌクレオチド配列を延長す
る条件下にてポリヌクレオチドポリメラーゼおよびヌク
レオチシド三リン酸を用いて連結することにより延長さ
れ得る。別法として、該標的ヌクレオチド配列の第１お
よび第２のヌクレオチド配列間の非隣接部分に相補的な
ヌクレオチド配列を、該第２のヌクレオチド配列に連結
することが可能である。

本発明の一実施態様は、標的ヌクレオチド配列の存在を
検出する方法に関する。この方法は、該第１のヌクレオ
チド配列および該第２のヌクレオチド配列を、標的ヌク
レオチド配列の非隣接部分にハイブリッド化することを
含む。該第１および第２の配列は、該標的ヌクレオチド
配列にハイブリッド化している場合に、共有的に結合さ
れる。

共有的に結合された第１および第２の配列の存在は、該
標的ヌクレオチドの存在を示している。

一般的には、液体培地中に、標的ヌクレオチド配列を含
むと思われる試料、該標的ヌクレオチド配列の第１の部
分に相補的な第１のヌクレオチド配列、該標的ヌクレオ
チド配列の該第１の部分以外であって、かつ該第１の部
分に隣接しない部分に相補的な第２のヌクレオチド配列
、ならびに、該第１および第２の配列が該標的ヌクレオ
チド配列にハイブリッド化している場合に該第１および
第２の配列を共有的に結合する手段を含む組合せを準備
する。該組合せは、該第１および第２の配列が、該標的
ヌクレオチド配列にハイブリッド化し、かつ該標的ヌク
レオチド配列が存在する場合に共有的に結合する条件の
もとに準備される。

該組合せを形成するための種々の試薬の組合は順序は、
変化してもよく、また、同時的または全体的もしくは部
分的に順次的であってもＪ：い。−船釣には、標的ヌク
レオチド配列を含む試料が得られる。これは、第１およ
び第２のヌクレオチド配列、ヌクレオシド三リン酸、な
らびにポリヌクレオチドポリメラーゼのあらかじめ調製
された組合せに合せられ、次いでリガーげが添加されて
もよい。しかしながら、他の段階的または順次的な添加
の順序に加え、上記の同時的な添加を採用することもで
きる。試薬類の濃度および添加の順序、ならびにこの方
法の為の条件は、一般には、すべての第１および第２の
ヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列とのハイブリ
ダイゼーション、ならびにかくしてハイブリッド化した
第１および第２のヌクレオチドの共有結合を最適化する
要求により支配される。

該第１および第２の配列を、これらの配列が該標的ヌク
レオチド配列とハイブリッド化している場合に、共有的
に結合するための一手段は、第１および第２のヌクレオ
チド配列を隣接させるための第２のヌクレオチド配列の
鎖延長を含む。該第２のヌクレオチド配列を延長する一
手段は、ポリヌクレオチドポリメラーゼおよびデオキシ
ヌクレオシド三リン酸を液体培地に添加し、該第２のヌ
クレオチド配列の３′末端に“Ｃ鎖延長が形成される条
件下で該培地を熟成し、これらの配列が該標的配列にハ
イブリッド化している場合に第２の配列を第１のヌクレ
オチド配列と隣接さゼることを含む。

該第１および第２のヌクレオチド配列が該標的配列にハ
イブリッド化している場合に隣接せしめられた場合には
、該第１　Ｊ５　にび第２のヌクレオチド配列は、次い
で、共有的に結合される。該第１および第２のヌクレオ
チド配列の共有結合を達成するー・方法は、酵素的手段
を採用することである。

好ましくは、該標的配列にハイブリッド化した第１およ
び第２のヌクレオチド配列を含む培地は、−配列の５′
末端ど他方の３′末端どの間のホスホジエステル結合の
形成において触媒作用をするリガーゼを用いて処理され
得る。

ポリヌクレオチド３′−ヒドロキシル基の反応に触媒作
用をし得るいかなる酵素も使用することができる。限定
のためではなく例示の方法として、このような酵素の例
は、Ｆ、ｃｏｌを細菌リガーゼ、Ｔ４ファージＤＮＡリ
ガーゼ、咄乳類ＤＮＡリガーゼ等の任意の供給源由来の
ポリヌクレオチドリガーゼ類であ゛る。上記の反応成分
は、付加的に、ポリヌクレオチドリガ−ゼ を与える反応を起こさない基によって３′末端が終わる
Ａリボヌクレオチドを含んでもよい。ターミナルデオキ
シヌクレオデジル１〜ランスフエラーゼ等のターミナル
ｉ〜ランスノエラーゼを、ジデオキシすクレオシト三リ
ン酸、メチル化ヌクレオシド酸リン酸等と共に使用する
こともできる。このような試薬類および反応は、他の出
願について当分野では周知であり、ここにおいては更に
詳細な議論は不要である。＋１１１、温度、溶媒、およ
び時間についての考慮は、本発明の方法についての上述
と同様であろう。

他の実施態様において、該２つのポリヌクレオチドは、
化学的手段を使用することにより共有的に結合され得る
。このような化学的手段の一つは、該配列の一方にホス
ホイミデートを形成することを含む。隣接するヌクレオ
チドの糖残基上の水酸基は、ホスホイミデートと反応し
て化学結合を形成し、リン酸エステルを生じるであろう
。非隣接ヌクレオチドのリン酸基上の伯のホスホイミデ
ートは、該反応条件下で加水分解されるであろう。

化学結合を形成する為の他の方法は、該第１または第２
のヌクレオチド配列の一方において糖残基上にカルバミ
ン酸塩を形成することを含み、ここでカルバミンＩｎは
、例えばビリドール残基を含む。次いで、隣接するヌク
レオチドの糖残基の水酸基は、該ビリドール基を置換し
て共有結合形成を生じるであろう。

別法において、該第１または第２の配列のヌクレオチド
の糖残基上の水酸基は、ジスル°ノイドを形成するよう
に誘導し得、これは２つの配列を連結する為に使用され
得る。ＣＩ＋ｕらの（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　　工６　（９）：３６
７１−３６９１参照。

別法において、該隣接するヌクレオチドの糖残基の水酸
基は、１〜シル化されることができ、引続く反応は、該
第１および第２のヌクレオチド配列間に共有結合を形成
するであろう。このような方法は、ｌｌ１ｌａＺａＷａ
、　Ｈ，らのＣＣ１１ｅ、ＰＩ）ａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　
　２３（３）、６０４−６１０　（１９７５）およびＮ
ａｇｙｖａｒｙ、　Ｊ、　　らのＪ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈ
ｃｍ、　、　　±５（２４）４８３０−４８３４．（１
９８０）に−船釣に記載されている。

別法において、隣接するヌクレオチドの一方の糖残基の
水酸基は、カルボジイミドにより活性化させることがで
き、かつ隣接するヌクレオチドの糖残基は、アミノ基を
含み得る。該アミン基は、隣接するヌクレオチドの活性
化カルボジイミドと反応して共有結合を生ずるであろう
。このような反応は、Ｄｏｌ　１ｎｎａｙａ、Ｎ、Ｇ、
らのＢＢｌｏｏｒ、に旧ｍ、１２（６）、７５５−７６
３　（１９８６）およびＤｏｌ　１ｎｎａｙａ、　Ｎ、
Ｇ、らのＢｉｏｏｒｇ、に旧ｎ　、、１２　（７）　。

９２”ｌ−９２８（１９８６）に記載されている。

別法において、該隣接づ−るヌクレオチドの糖残基の一
つに保護されたスルフィドリル基を形成し得る。次いで
、このスルフィドリル基は、隣接するヌクレオチド上の
マレイミドと反応して共有結合を生じ得る。

該第１および第２のヌクレオチド配列間に共有結合を化
学的に形成するための別法においては、光化学反応が採
用し得る。例えば、隣接するヌクレオチドの一方を処理
して７リルアジドを形成し、次いで該材料に照射して隣
接するヌクレオチド間に共有結合を形成させ得る。

該第１および第２のヌクレオチド配列が、該標的ヌクレ
オチド配列の非隣接部分にハイブリッド化している場合
の、該第１および第２の配列間の共有結合を達成する他
の手段は、該標的ヌクレオチド配列上の該第１および第
２のヌクレオチド配列の間にある非隣接部に充分に相補
的なヌクレオチド配列の使用を含む。これの記述のため
に、このようなヌクレオチド配列を介在リンカ−配列と
称する。該リンカ−配列は、該第１および第２のヌクレ
オチド配列の調製について上記した方法等の公知の方法
により調製され得る。該リンカ−配列は、該標的配列の
第１Ｊ５よび第２のヌクレオチド配列の間にハイブリッ
ド化し得る。次いで、該リンカ−配列は、第１および第
２のヌクレオチド配列の両者に、前記に引用したように
酵素的または化学的手段を用いて共有的に結合し得る。

また、リンカ−配列類とポリメラーゼとの組合せを、該
第１および第２のヌクレオチド配列が該標的ヌクレオチ
ド配列にハイブリッド化している場合に、これら第１お
よび第２の配列間の隣接的な関連を達成するために使用
することもできる。

該第１および第２のヌクレオナト配列が該標的ヌクレオ
チド配列に、非隣接的な関係においてハイブリッド化し
ている場合に、これらの配列を共有的に結合するための
伯の手段は、該第２のヌクレオチド配列の鎖延長と、そ
れに続いて、Ｄｏｌｉｎｎａｙａらの（１９８８）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１６　（
９）：３７２１−３９３８に記載されているような２つ
の配列間のカルボジイミドカップリングを含む。

本発明の方法を実施づ−るにあたって、水性培地が利用
される。他の極性共溶媒を使用してもよく、通常は、ア
ルコール類、ニスデル類等を含む炭素数１−６、より通
常には１−４の酸素含有有機溶媒である。通常は、これ
らの共溶媒は、約７０重量パーセント未満、より普通に
は約３０重量パーセント未満で存在する。

該培地のｐＨは、通常は約４．５から９．５の範囲内、
より普通には約５．５−８．５の範囲内、好ましくは、
約６−８の範囲内である。該ｐＨおよび温瓜は、同時的
または順次的な標的配列と第１および第２のヌクレオナ
ト配列とのハイブリダイゼーション、第２のヌクレオチ
ド配列の延長、ならびに該第１および第２のヌクレオチ
ド配列の共有結合を与えるように、場合に応じて選択さ
れ、また変更される。ある場合においては、上記工程が
順次的に行なわれるか、または同時的に行なわれるかに
依存して、これらの考慮点の間で妥協があり得る。種々
の緩衝剤が、所望のｐｌ＋を達成し、また測定の間ｐＨ
を維持するために使用されてもよい。例示的な緩衝剤は
、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビツール
等を含む。使用される特定の緩衝剤は、本発明に対して
臨界的ではないが、個々の方法においては、ある緩衝剤
は他のものより好適であり得る。

この方法を実施するためには、通常温和な温度が使用さ
れ、好ましくは、この方法を行なう期間にわたって一定
温度が使用される。この方法についての温度は、一般に
約２０から９０℃までの範囲にあり、より普通には約３
０から７０℃まで、好ましくは３７から５０℃までの範
囲にある。しかしながら、温度は、上記工程が順次的ま
たは同時的に行なわれるかに依存して変化され得る。例
えば、鎖延長工程に対し−では、約２０から４０℃の比
較的低い温度が使用される一方、変性およびハイブリダ
イゼーションは、約４０から８０℃の温度で実施され得
る。

本発明の方法を行なう時間は、一般には該第１および第
２のヌクレオチド配列が標的ヌクレオチド配列に結合し
ている場合に、これらの配列の共有結合を達成し、この
ような共有結合が生じたことを測定するために充分な長
さである。−・般に、この方法を行なうための時間は、
約５から２００分である。便利上の点では、この時間を
最少とすることが通常は好ましい。

測定されるべき標的ヌクレオチド配列の淵麿は、試料中
に１０”Ｍ程度に低温度であり得るが、通常は、約１０
”Ｍから１０−１９Ｍまで、より普通には約１０”Ｍか
ら１０−１９Ｍまでにおいて変化する。該培地中の該第
１および第２のヌクレオチド配列ならびにデオキシヌク
レオシド三リン酸類の濃度は、広く変化し得る。好まし
くは、これらの試薬類は、予想される標的ヌクレオチド
配列の醋に対して過剰のモル数をもって存在り−る。

該デオキシヌクレオシド三リン酸は、通常１０−６から
１０−２Ｍ、好ましくは１０−５から１０−３Ｍで存在
する。該第１のヌクレオチド配列に加え、該第２のヌク
レオチド配列は、通常は少なくとも１０−１２Ｍ、好ま
しくは１０”Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０’Ｍ
存在するであろう。

該ポリメラーゼおよび任意の共因子の培地中の濃度もま
た、実質的に変化され得る。これらの試薬類は、１０−
１２Ｍ程麿０低温度で存在してもよいが、該第１および
第２のヌクレオチド配列の濃度ど少なくとも同程痕、ま
たはより高い濃度で存在してもよく、第一の制限因子は
、試薬類、通常酵素類の費用である。各試薬類の最終濃
度は、通常は本方法を速さＪ３よび感度の両者について
最適化するべく、経験的に決定される。

該第１または第２のヌクレオチド配列が、該配列を固定
化する手段を有するか、あるいは有し得ることは、望ま
しく、またある場合には実際に好ましい。一般に、この
固定化手段は、担体を含んでいる。第１または第２のヌ
クレオチド配列のいずれか一方が、本発明の方法におい
てこの配列を使用するに先立ち、処理を受けて担体に固
定され得る。ヌクレオチド配列を固体担体に結合する為
の多くの方法が知られている。例えば、Ｔ、　Ｇｏ　１
ｄｋｏｒｎらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　（１９８６）上４：９１７１−９１９１およ
びこれに含まれる文献を参照。一般に、該ヌクレオチド
配列を担体に固定するための処理は、配列中のあるヌク
レオチドの化学修飾を含み、これにより該配列は担体に
結合され得る。好ましくは、該担体と該ヌクレオチド配
列との間の結合は、共有的であり、更に好ましくは、該
ヌクレオチド配列と担体との間に連結基を含む。例えば
、該担体を処理してマレイミド基が導入され、該第１ま
たは第２のヌクレオチド配列を処理してチオール基が導
入され得る。該チオール基は、マレイミド基の活性化オ
レフィンに対して反応性を有し、この様にしてヌクレオ
チド配列は、担体に共有的に結合され得る。

このような他の連結基の例は、Ｎｏｙｅｓ、　Ｂ、　Ｅ
、と５ｔａｒｔ、　Ｇ、　Ｒ，による収旦　５．３０１
　（１９７５）およびＡｌｗｉｎｅ、Ｊ、Ｃ，らのＰｒ
ｏｃ、Ｎａ口、＾ｃａｄ、　５ｃｔ１．ｓ、Ａ、７４．
５３５０　（１９７７）に記載サレルようにジアゾベン
ジルオキシメチル基により誘導されたセルロース、なら
びに５ｅｅｄ、ＢのＮｕｃｌｅ＋ｃＡｃ＋ｄｓ、Ｒｅｓ
、　、上０，１７９９　（１９８２）等に記載された０
−アミノフェニルチオエーテルにより誘導されたセルロ
ースである。

該第１または第２のヌクレオチド配列が、最初に担体に
結合されでいない場合には、２つの配列の一方を本発明
の方法の間の適当な時期、好ましくは、第１および第２
のヌクレオチド配列が該標的配列にハイブリッド化して
いる場合に第１または第２の配列が共有的に結合された
か否かを測定する前に、担体に結合される。従って、該
担体および該ヌクレオチド配列の一方は、これらの担体
とヌクレオチド配列との間に結合を与え得る反応性基を
含まなければならない。該反応性基の性質は、本発明の
方法と適合するようなものであろう。

このような系の一つは、上述したものであって、該担体
はマレイミド基を含み、該ヌクレオチド配列は、チオー
ル基を含んでいる。他の実ＦＭ態様においては、該ヌク
レオチド配列および該担体は、ビオチン−アビジン等の
相補的な特異的結合対部分を含み得る。かくして本発明
の方法は、溶液中で操作され、適切な時期において該相
補的ｓｂｐ部分が結合するであろう担体が導入され得る
。該担体が洗浄された後、次いで、該第１および第２の
配列が、互いに共有的に結合したか否かについて測定さ
れ得る。

このような系の他の例は、リプレッサーオペレータ相ｎ
作用であって、ヌクレオチド配列の一方が、固体表面に
固定化された特定のリプレッサまたはモデュレータ蛋白
質との配列特異性相互作用により、固体表面に捕獲され
る。この捕獲相の実／Ｉ！態様の優位点は、ある場合に
おいてリプレッサからのオペレータＤＮＡの解放が、該
複合体をインデューサ分子により処理することにより行
なえることである。例えば、一方または他方のヌクレオ
チド配列上に存在するオペレータ配列が、該溶液を表面
に接触させた場合に特異的に捕捉され、維持されるよう
に、テトラザイクリンリブレツサを固体表面に固定して
もよい。次いで、該表面は、非特異的結合を除去する為
に洗浄され、そして最終的にオペレータ金石ヌクレオチ
ドが、該表面に存在するリプレッサーオペレータ複合体
にインデューサ分子（この場合、テトラサイクリンまた
はその活性類縁体）を接触させることにより解放される
。

該インデューサ分子は、それが生物学的／制御的リプレ
ツザーオペレ〜り複合体の解離を起こす性質において構
造的に同等な分子であるという意味で”天然インデュー
サ″であってよく、または、同様もしくは増強された結
合および複合体解離活性を有する天然インデューザの合
成類縁体であってもよい。上記の例は、１ｌｉｌｌｅｎ
、Ｗ、らの３２　（１９８５）に記載されているような
テトラサイクリンリプレッサーオペレータ相互作用およ
びそのテトラサイクリンによる解離を含む。

該第１または第２の配列の一方が担体に共有的に結合さ
れている場合には、該結合配列を、例えば増幅または配
列のクローン化等のために担体から外すことが望ましい
。このような場合、該ヌク８ル オチド配列と担体との間に切断可能な基を導入すること
が望ましい。このような切断可能な基の例は、プロリン
酸結合、ジスルフィド結合、および制限酵素切断部位で
ある。

該第１および第２のヌクレオチド配列を該標的ヌクレオ
チド配列が存在する場合にこれにハイブリッド化させて
、該第１および第２の配列を共有的に結合させ、準備が
なされた後に、共有的に結合した第１および第２の配列
の存在が測定される。

共有的な結合の存在は、試料中の標的ヌクレオチド配列
の存在を示している。一般にこの測定は、標識または伝
達基を有する非結合ヌクレオチド配列を実質的にすべて
除去し、そして残留分を標識を保持する共有的に結合さ
れた第１および第２のヌクレオチド配列の存在について
測定することを含む。該ヌクレオチド配列の一方が、相
体に結合されているか、あるいは結合される場合、該担
体が該培地から取出され、非結合材料が無いように洗浄
され、次いで標識または伝達基の存在について試験され
る。一般にこの試験は、該相体を試料中の標的ヌクレオ
チド配列の存在に関連して信号を生成するための信号生
成系の残る部分と接触させることを含む。

本発明による方法の使用は、担体に対して洗浄を、ハイ
ブリダイゼーションが共有結合なしに行なわれた場合に
使用される条件より通常、激しい条件下において行なう
ことを許容１°る。しばしば洗浄条件は、担体に結合し
−（いる二重体を完全に解離してしまう。これらの条件
は、尿素等のカオトロピックな試薬を、単独、または周
囲もしくは高められた温度のいずれかで使用されるホル
ムアミド等の他の変性剤との組合せにおいて含有する溶
液を含む。該第１および第２のヌクレオチド配列間の共
有結合、ならびに表面に対するヌクレオチド配列の一方
の結合は、しかしながら影響されないであろう。該表面
に結合して得られた標識材料の検出は、試料中の標的ヌ
クレオチド配列の存在を示すであろう。

該第１のヌクレオチド配列が表面に結合されない場合、
または標識ヌクレオチドが組込まれた場合、第２のヌク
レオチド配列の共有的延長における重要な特徴は、該第
１のヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチドボリメラー
げによる鎖延長反応において反応不能な基をもって３′
末端にて終了してることである。このようにして、第１
のヌクレオチド配列に沿った鎖延長が防＋Ｌされている
。

このような基の例は、限定のためではなく例示の方法と
して、ジデオキシチミジン、ジブ第４−シアデノシン、
ジデオキシグアノシンおよびジデオキシシチジン等のジ
デオキシヌクレオヂド類、イソブロビルボスホリル、リ
ン酸塩、Ｎ−（トリメチル　アン−しニウムエチル）カ
ルバモイル、デクストラン等の多糖類、ボリスヂレン、
ヒドラゾン類、蛋白質類等である。

ジデオキシヌクレオチド４二ψツピングは、Ａｔｋｉｎ
ＳＯｎらの（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　８．　
４８９７−４９０４に記載されているように、通常の技
術に従って実施することができる。ヒドラゾン形成は、
リボヌクレオチドを３′末端において、過ヨウ素酸塩に
より酸化してジアルデヒドを形成することにより得るこ
とができ、これが、次いでジニトロフェニルヒドラジン
、２−トリメチルアンモニウム−１−エチルヒドラジン
等の正荷電ヒドラジン類、デクストランおよび蛋白質類
に結合したヒドラジン類、特にカルボキシアルキルデク
ストランおよび蛋白質類のヒドラジド誘導体などの置換
ヒドラジン類と反応される。このような３′ブロツク材
料は、次いで他の反応混合物成分からアフイニテイクロ
マトグラフイおよびこの分野で公知の他の技術により分
離され得る。アルデヒド形成とそれに続くアルデヒドの
誘導は、型枠の３′末端のブロックのための一般的処理
法である。

例えば、Ｒｅ　ｉ　ｎｅらの（１９７４）　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、１，７６７−７８６参照。

３′−末端リン酸基は、例えばりボヌクレオチドで終る
単鎖ポリヌクレオチドを過ヨウ素酸塩を用いて処理し、
シクロヘキシルアミンまたはベンジルアミンによるβ−
消去（にｒｙｎｅｔｓｋａｙａらの（１９８６）Ｎｕｃ
ｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、
　　５　（１）　　：　３３４３）、あるいはＴ４リガ
ーゼによるｐｃｐ（３’　、５’　−二リン酸シチジン
）付加により達成でき、ＤＮＡの３′末端標識において
典型的に行なわれるようにしてなされる。

３′末端のブロックは、また、３′末端をガラスピーズ
、樹脂ま・たは任意の他、の適切に修飾された粒子もし
くはビーズに共有的に結合することによっても達成され
る。この３′官能性のブロック手段は、オリゴヌクレオ
チドの合成において多くの形態で通常に行なわれている
。この方法は、表面への結合を与え得る。

信号の検出は、使用される信号生成系の性質に依存する
であろう。標識または伝達基が酵素である場合には、該
信号生成系の付加的部分は酵素基質等を含み、該酵素反
応生成物は、好ましくは分光測定的に検出可能な染料で
ある。該ｅ識が蛍光性分子である場合には、該培地は光
照射され、そして蛍光が測定される。該標識が放射能基
である場合には、該培地は放射能４数を測定ずべく　ｉ
ｔ数される。

信号検出の為の他の方法において、該第２のヌクレＡヂ
ド配列は、該配列の５′−末端に存在する″標識配列″
を用いＣ標識され得る。この標識配列は、第３のヌクレ
オチド配列および第４のヌクレオチド配列とハイブリッ
ド化される。該第３のヌクレオチド配列は、２つの副配
列を有しており、一方は、第２のヌクレオチド配列の標
識配列に相補的な配列であり、他方は異種配列である。

該第４のヌクレオチド配列は、該第３のヌクレオチド配
列の該異種配列に相補的な配列、および該第２のヌクレ
オチド配列の標識と本質的に同等な配列を有している。

該第３および第４の相補的部分の一対は、該各プローブ
の同じ末端（すなわち３′または５′）であり、かつ、
特別な配列およびその相補的配列からなる第２の対は、
各プローブの他方の末端である。標識ヌクレオチド配列
と該第３および第４のヌクレオチド配列とのハイブリダ
イゼーションは、次いで、該標識ヌクレオチド配列から
延びる延長釦を形成する。好ましくは、該第３のヌクレ
オチ配列の３′末端は、隣合う第３のヌクレオチド配列
の５′末端に隣接し、かつ、該第４のヌクレオチド配列
の３′末端は、隣合う第４のヌクレオチド配列の５′末
端に隣接するであろう。ハイブリダイゼーションの後に
、該末端はリガーゼを用いて連結される。非共有的に結
合している第３および第４のヌクレオチド配列は、洗浄
除去され得る。次いで、連結された第３および第４のヌ
クレオチド配列は、好ましくは一方または両方に結され
た標識の検出によって検出される。該第３または第４の
ヌクレオチド配列は、第１および第２のヌクレオチド配
列について先に記載したようにして標識され得る。

本発明の検出面における別の実施態様においては、上記
方法で標識配列の形成により生ずる増幅された信号を、
共有的に結合された第１および第２のヌクレオチド配列
の存在の検出に使用することもできる。該第２のヌクレ
オ−ブト配列は、５′末端に結合された標識を含むこと
ができる９、該標識は、制限部位で始まり、そして終る
ヌクレオチド配列からなるものでよい。好ましくは、こ
のヌクレオチド配列は、オリゴマーの反復配列であるう
。該標識は、上記方法に従って該第１のヌクレオチド配
列に連結された後に信号を提供する。この目的のために
、該連結された第２のヌクレオチド配列は、この第２の
ポリヌクレオチド配列の部分に相補的で切断可能なポリ
ヌクレオチド型枠二重体を生じる伺加的ポリヌクレオチ
ド配列、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、ヌクレオシド
三リン酸類、および該制限部位の切断に適した制限酵素
に露される。その結果新たに形成された相補的ヌクレオ
チド配列は、通常は６から３０ヌクレオチドの長さであ
ろう。この配列は、直接に測定され得、または、３′末
端がブロックされた第２のヌクレオチド配列の少なくと
も一部分に相補的な型枠の追加量を使用し、ここにその
開示を全体について参考として加える１９８７年７月２
３日出願の米国特許用０７６．８０７号（ヨーロッパ特
許出願第８８３０６７１７．５号）に記載された核酸増
幅法に従って増幅されてもよい。別法として、新たに形
成された配列に相補的であり、反復する型枠配列の３′
末端に結合された特異的結合配列を、上記特許出願中に
記載されたようにして使用することもできる。

更に別の実施態様において、該第２のポリヌクレオチド
は、３’　−０ｆ−１基を含むポリヌクレオチドを含有
１−るか、あるいはその前駆体であり、この方法は更に
、 （１）　　前記共有的に結合された第１および第２のポ
リヌクレオドを、３’−０１−１基が存在しない場合に
該基を与える手段、３’　−ｏＨｍを含む前記ポリヌク
レオチドに相補的な型枠ポリヌクレオチド、ポリヌクレ
オチドポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および面
層型枠に相補的なポリヌクレオチドを切断する手段を用
いて、前記３′−ＯＨ基を含むポリヌクレオチドを延長
し、かつ該延長物を切断する条件下で処理し、ならびに
、（２）　　前記切断された延長物を検出することを含
んでなる。

便利上のために、本発明で使用される試薬類は、試料中
のポリヌクレオチド分析物のアッセイにおいて本方法で
使用するためのあらかじめ定められた量をもって包装さ
れた組合せとしてキット中に用意され得る。例えば、本
方法において有用なキットは、他の試薬類と組合ゼだ包
装された中に、標識されるか、もしくは担体に結合され
、または標識されるか、もしくは担体に結合された配列
を与える群をもって準備されることができる第１および
第２のヌクレオチド配列を含むことができる。

このキットは更に、包装された組合せにおいて、デオキ
シヌクレオチド三リン酸類、例えば、デオキシアデノシ
ン三リン酸（ｄＡＴＰ）　、デオキシグアノシン三リン
ｉｌｌ　（ｄＧＴＰ）　、デオキシシチジン三リン酸（
ｄＣＴＰ）、デオキシリンジン三リンｌ　（ｄＴＴＰ）
等のヌクレオシド三リン酸類を含むことができる。この
キットは、更に、ポリヌクレオチドポリメラーゼおよび
リガーゼ等の第１および第２の配列を共有的に結合する
手段もまた含むことができる。

キット中の種々の試薬類の相対的な量は、本方法で起こ
る必要のある反応を実質的に最適化するような試薬類の
濃痘を与え、また、アッセイの感度を実質的に最適化す
るように広範囲で変化させ得る。適切な場合には、キッ
ト中の一つまＩこはそれ以上の試薬類は、賦形剤を含む
乾燥粉末、通常は凍結乾燥物として与えることができ、
その溶解により、本発明による方法またはアッセイを行
なうために適切なＩｆ！　ＩＩを有ｌ゛る試薬溶液を与
えるであろう。各試薬は、その反応性および貯蔵期間が
許す限りにおいて、分離された容器中に包装され得、ま
たはいくつかの試薬を１つの容器中に合せることもでき
る。

例 本発明は、以下の例示的な例によって史に説明される。

物質および方法 １２／ｌａ基の“伝達（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）　”　Ｄ　
Ｎ　Ａ　（１２４量体）が、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｈ，
１１，らの″Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ”　　１５４巻、２８７−３１４頁（１９８８）のホ
スホラミダイト法により、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８７５
０自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成され、これは以下の
配列を含有していた。

”　ＣＧＧＣＣＡＧ　ｒＧＡＡ　ＩＴＣＴ　ｌ’　Ｔ　
Ｔ　Ｔ　Ｔ　１’　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　Ｔ　ＣＴ丁ＴＴＴＴ
Ｔ’ｒＴＴＴＣＴＴＣＴＩ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＩ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴ ＴＴＴＴＩｏｒＴＴＴｃＴＴｃＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴｒ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣ３３１塩基
の″標的“ＤＮＡ（３１同体〉もまた同様な方法により
合成され、以下の配列を有していた。

５°ＴＴＴ＾ＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＡＡ
ＴＴＣＧＴＴＴ丁　３゜Ｍ１３ｍｐ７単鎖ファージＤＮ
Ａは、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、　
　（１９８０）　１４３．１６１１７８）により調製さ
れた。該ヌクレオチド配列は、ジデオキシ配列化により
確認された。該１）１鎖ＤＮＡのＥＣ０ＲＩまたは３　
ａ　ｍ　ＨＩによる消化は、アガロースゲル電気泳動に
より確認された（旧ｃｃａ、Ｇ、Ａ、らのＰｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉＵ、　Ｓ、八　１９８
２）７’え、　　７２１−７２８）　　。

酵素類 Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（ａット番号５１１３１．１、
ＯＵ　／μＬ）、Ｔ４　　キナーゼ（ａット番号６６１
１１．１０Ｕ／μ［）および制限エンドヌクレアーゼ１
３ａｍｔｌｌ’（ａット番Ｍ４６１０１゜１０Ｕ／μ［
−）は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｓ（ＢＲＬ）　、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙ
ｌａｎｄから購入した。

緩衝溶液および他の試薬類 反応緩衝溶液＃３（１０Ｘ）は、１ｘの濃度に希釈した
後に、５０ｍＨｉ−リス−ＨＣｊ！（＋）ｌ１８、Ｏ）
　、１０ｎ＋ＨＭＣＪＣＩ１２、および１００ｍＨＮａ
Ｃｊ！である。ＴＥ（１ｘ）は、１００ｎ＋Ｈトリスー
トＩＣ！（ｐＨ７，６）および１　ｍＨＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ
である。Ｔ　Ｌ　Ｓは、１０１１１Ｍトリス−Ｈ（、ｊ
！（１）Ｈ８、Ｏ）　、１１ＨＥＤＴＡおにび４００ｍ
ＭＮ　ａ　ＣＡ　’ｒある。５ｓｓｃは、７５０ｍＨＮ
ａＣＡ、５０ｍＨＮａ３ＰＯ４および７５ｍＨりエン酸
ナトリウム（ｐＨ６，５＞である。キナーゼ用反応緩衝
溶液（５×）は、３００ｍＨｔ〜リスＨＣｊ！　（ＥＩ
Ｈ７，８）、７５１１１８　２−メルカプトエタノール
、５　Ｃ）ｍＨＭ　’Ｊ　Ｃ１２および１．６５ＨＭ　
　ＡＴＰである。５ｅｑｕｅｎａｓｅ　　（商標）緩衝
溶液（５×）は、１×の１１瓜に希釈した後に、４０ｎ
＋Ｈトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、２０ｍＨＭｇ
Ｃ１２、および５０１８　　ＮａＣｊ！である。γ３”
Ｐ　　ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍ　　ｍｏｌ：１０ｍ　
　Ｃｉ／ｍＬ）は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ
ｅａｒＣｏｒｐ、Ｂｏｓｔｏｎ　ＨＡから購入した。特
に詳細が記されていない他の緩衝溶液および方法は、Ｈ
ａｎｉａｔｉｓらの″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９
８２）　、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎａ　ｔｌａｒｂｏｒ　
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｄ　５ｐｒｉｎｏ　Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載され”ｉＮるものと同
様である。

Ｍ１３ｍ　　７の３μｍＨＩによる ２０ＣＩＬ　（１，１μｇ／μＬ）のＭ１３ｍｐ７フア
ージＤＮＡ、１６μＬ（ＩＯＬＩ／μＬ）の３　ａ　ｍ
　ＨＩおよび２４μ［の１０ｘ反応ＭｖＭ溶液＃３の溶
液を３７℃にて３時間熟成した。完全な消化は、１％ア
ガロースゲル電気泳動により証明された。該溶液は、２
４０μＬの緩衝溶液平衡化フェノールににり抽出され、
該水性相は、等容積のクロロボルムとイソアミルアルコ
ールの２４＝１混合物により２回抽出された。得られた
溶液は、等容積の５Ｍ　　ＮＨ４０Ａｃおよび２．５倍
容積の無水エタノールにより０℃にて処理された。よく
混合された溶液は、４℃にて４０分間遠心分離され、上
澄が除去された。該残香は、７０％エタノールで洗浄さ
れ、次いで減圧下に乾燥された。

沈殿物は、０．１１８ＥＤＴＡ　（ｐＨ＝７．８）によ
り１μｇ／μＬの濃度まで希釈され、−２０℃にて貯蔵
された。

伝達ＤＮＡの標識 ５０μＬ　（１ｐｍｏＡ／μＬ）の１２４聞体、１８μ
Ｌの５×キナーゼ緩衝溶液、１５μＬのγ３２Ｐ　　Ａ
ＴＰおよび７μＬ（ＩＯＵ／μＬ）のＴ４キナーゼから
３７℃にて１．５時間熟成された。該反応溶液は、製造
者の指示に従ってＮＯｎＳＯｒｂカラム（ＤｕＰｏｎｔ
　）　ヲ３ｆｆｌ　Ｌ　７”　ｔａ　製すｔＬ、溶媒が
減圧下で除去された。該残香は、１μｍＯｊ！／μＬ１
７）１１度で水に溶解’ｃｓし、−２０℃ニ”（Ｆｉ”
ｉａされた。

標的特異性重合およびＤＮＡ類の連結 ２μしく０．５μｍｏ１／μｌ　）のＢ　ａ　ｍ　Ｉ−
Ｉ　Ｉ線形化Ｍ１３ｍｐ７ＤＮＡ、１μＬ　（１μｍｏ
１／μＬ）の標識１２４量体、１μｌ−（１μｍｏ１／
μＬ）の３１量体、２μＬの５　ｘ　５ｅｑｕｅｎａｓ
ｅ（商標）緩衝溶液および２μＬの水が８０℃にて５分
間加熱され、２３℃までゆっくり冷却された。液体を試
験管底部に集めるために簡単な遠心操作を行なった後、
１　μＬのＡＴＰ　＜０．１Ｍ）　および１単位のＴ４
　　ＤＮＡリガーゼ、１０単位の５ｅｑｕｅｎａｓｅ　
　（商標）（修飾−１−７ＤＮＡポリメラーゼであって
、ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０ｈｉ
ｏから商業的に入手可能である）ならびに、最終１１３
ｍ１３３μＭとなるｄＣＴＰを該反応物に添加した。得
られた溶液は、２３℃にて１２時間熟成された。この熟
成模、１０単位のＥｃｏＲＩ　（１μＬ）が添加され、
該反応物（よ、３７℃で更に１時間維持された。

上記反応物からの分別物の変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動は、１３８塩基の長さの３２ｐ標識生成物を示
した。こ゛の生成物は、非隣接的にハイブリッド化した
オリゴヌクレオチド１２４量体およびＢａｍＨＩ線形化
Ｍ１３ｍＰ７のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位までの充填および
連結物に対応する。該１３８塩基生成物は、標的３１聞
体の不存在下（ａ的３１量体を１μｌの殺菌脱イオン水
にて置換）では観察されない。このことは、該反応が標
的特異的であり、本発明により有用である。

例２ 限定のためではなく例示のために再度準備された本発明
の他の例にｄ３いて、単鎖ＤＮＡオリゴマーが、３′末
端が修飾ガラス表面に共有的に結合されたＤＮＡ＠与え
るために、誘導ガラス上に直接に合成された。５′　リ
ン酸を与えるため、ＡＴＰおよび１４ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化し、このＤＮＡ−ガラスは、Ｔ
ｉＯ２ ＤＮＡリガーゼと共に、溶液中に存在する標識伝達オリ
ゴヌクレオチドが非隣接的に結合重る標的オリゴヌクレ
オチドの存在下および不在下に反応させた。下記の結果
は、標的オリゴヌクレオチドの存在が、２つの非隣接的
にハイブリッド化したオリゴヌクレオチドと共に検出さ
れたことを小ず。

調整多孔ガラス（ＣＰＧ）（２００／４００メツシユ　
大きさ−−９６．２ｎｍ径−ロット０８Ｇ０２−−　Ｅ
ｌｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　、
　Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ。

Ｎ、Ｊ、）が乾燥され、次いで不活性雰囲気および無水
条件下でＪｏｓｔらのＪ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１
８５　（１９７９）、４０３−４１２およびこれに含ま
れる文献の方法に従って、（１，２−エポキシ−３−プ
ロピルプロポキシ）１ヘリメトギシシラン（＾Ｉｄｒｉ
ｃ１１）と反応させた。該ガラスは、乾燥１−チルによ
り広範囲に洗浄され、最後に減圧下で１００℃にて４時
間乾燥された。該ガラスは、無水エタノール中に再懸濁
され、触媒量のＢＦ３工テラート（Ａｌｄｒｉｃｈ　）
が添加された。該混合物は、撹拌しつつ４時間還流され
た。得られた白色の誘導ＣＰＧは、次いで無水エタノー
ルにより広範囲に洗浄され、減圧下に乾燥された。該乾
燥材料は、１μｍＯｆ！、ｅ規模のプラスチックＤＮＡ
合成カラムアッセンブリ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒ
ｐ、５ａｎＲａｆａｅ１．ＣＡ、製品８６００−０４５
６　；約５０＃ｌ！Ｊ／カラム）に分取された。

ＤＮＡ合成 上記の誘導ＣＰＧカラムは、標準１．０μｍＯＡボスホ
ラミデートＤＮＡ合成のプロトコールおよび試薬類（Ｂ
ｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐ、　）において使用された
。ガラス上に合成された配列は、５’　　ＣＡＡＴＴＡ
ＡＧＧ八ＡＴＧＴＡＴＴへＡＧＣＴＴＧＴＧＴ八ＡＴＴ
ＧＴＴ八へ　　３’であへた。

１ｆｌＮＨ４０８を用いた５０℃での１０時間の処理に
より、ガラス上の合成りＮＡを脱保護した後、該ガラス
は広く洗浄され、製造者の記述に従ってＡＴＰおよびＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂ　ＲＬ　）により処理
し、５′水酸基末端をリン酸化した。この装置（ｔｈｅ
　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　８６５０　）上での通常のＤＮ
Ａ合成法においては、第１のヌクレオチドはすでに調整
多孔ガラス上に結合されて供給されることに注意しなけ
ればならない。従って、該装置は、３’Ａがガラス上に
既に存在することを受は負っている。該ガラス上に存在
づる実際の配列は、上記したものより３′末端において
１つ少ないΔを有している。

該４３塩基の″標的Ｄ　Ｎ　Ａ　″は、配列、５°　Ｇ
ＣＴＴＡＡＴＡＣＡＴＴＣＣＴＴ八ＡＴＴＧＧＧＧＣＣ
ＣＧＧＧＡへＧＡＡＡＡＡＡ八ＡＡＡ　　３゜を有して
いた。

へ隣接的ハイブリッド化伝達ＤＮＡ　（１２４１体）は
、先の例に記載されている。該１２４℃Ｍ体と同じ標的
ハイブリッド化配列部分（すなわちその３′末端）を含
む付加的８４隋体１）　ＮＡもまた、伝達分子として使
用された。これらの伝達ＤＮＡは、先の例中に記載され
ているように、γ３２ＰＡＴＰおよびＴ４キナーゼによ
り標識されていた。

ハイブリダイゼーションおよび連結 前もって殺菌された１、５ｍｌの５ａｒＳｔｅｄｔねじ
栓試験管中に、１０μｍ−のキナ−げ化ＤＮＡ−ガラス
懸濁物（約５０ｐｍｏ１ｅ）、２００ｆｍｏ１ｅの標的
（４３量体）ＤＮＡ、５μｑの酵母ｔ　ＲＮ　Ａ　（Ｓ
ｉｇｍａ）、および、４００ｆｍＯＩ！、ｅの標識伝達
ＤＮＡを、５　ｕ　ｌ−の５×リガーゼ緩衝溶液（２５
０ＩＩＩＨトリスＨＣｊ！、ｐ）Ｉ＝７．５．５０ｍＨ
ＭｇＣｊ！２おにび２５％ＰＥＧ）と合し、全容積１８
μＬとした。負の対照（標的分子を含まない）の場合、
１μＬの標的ＤＮＡ溶液を殺菌脱イオン水に置換えた。

、？ｌ−べての反応混合物は、９５℃にて５分間加熱さ
れ、次いで２１／２時間の間ぐゆっくりと室温（約２３
℃）まで冷却された。冷却および液体を試験管底部に集
めるための簡単な遠心操作後、２μＬのジチオスレイト
ール溶液（０，１Ｍ）、３μＬのＡ　Ｔ’Ｐ（９１０ｍ
Ｍ）および２μＬのＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬま
たはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖ
ｅｒｌｙＭａｓｓ）を加え、該反応物を１５℃にて１２
時間熟成した。反応は、一対で行なった。

稈里 該ガラスを充分に、そのままおよびＤＮＡ変性条件下で
、文献中に充分に確立されているように洗浄し、該カラ
スビーズをＢｅｃｋｍａｎ　Ｌ−Ｓ　２８００シンチレ
ーシヨンカウンタにて計数し、３２Ｐ標識伝達オ゛リゴ
ヌクレオブドの保持を測定した。下記の結果が得られた
。

測定されたｃｐｍ　　（チェレンコフ計数）＋標的　　
２２７１３ 標的　　　　５９５ これらの結果は、試料中の標的ＤＮＡの存在が、本発明
の方法により測定されることを示している。

前述の発明は、理解を明確とする目的で、例示および例
によって詳細に記載されているが、ある種の変更および
修飾は、示された特許請求の範囲内で実施され得ること
は明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチ
   ド配列を、標的ヌクレオチド配列の非隣接部分にハイブ
   リッド化させ、 前記標的配列にハイブリッド化している前記第１および
   第２の配列を、共有的に結合し、ならびに、 共有的に結合した前記第１および第２の配列の存在を測
   定し、その存在が、該標的ヌクレオチド配列の存在に関
   連すること、 を含んでなることを特徴とする標的ヌクレオチド配列の
   検出方法。 （２）液体培地中に、 （ａ）標的ヌクレオチド配列を含有すると思われる試料
   、 （ｂ）前記標的ヌクレオチド配列の第１の部分に相補的
   な配列を有する第１のポリヌクレオチド、（ｃ）前記標
   的ヌクレオチド配列の、前記第１の部分以外であり、か
   つ、これに隣接しない第２の部分に相補的な配列を有す
   る第２のポリヌクレオチド、ならびに、 （ｄ）前記第１および第２のポリヌクレオチドを、これ
   らのポリヌクレオチド類が前記標的ヌクレオチドにハイ
   ブリッド化している場合に、これら第１および第２のポ
   リヌクレオチドが前記標的ヌクレオチドにハイブリッド
   化し、かつ前記標的ヌクレオチドが存在する際に共有的
   に結合する条件において、共有的に結合させるための手
   段を、組合せにおいて用意し；ならびに、 共有的に結合された第１および第２のポリヌクレオチド
   の存在を検出し、それらの存在が前記試料中の前記標的
   ヌクレオチドの存在を示すことを含んでなる請求項第１
   項に記載のポリヌクレオチド中の標的ヌクレオチド配列
   の検出方法。 （３）前記標的ヌクレオチド配列が、ＤＮＡである請求
   項第１項または第２項に記載の方法。 （４）前記共有的結合手段が、前記第２のポリヌクレオ
   チドが前記標的配列にハイブリッド化している場合に、
   該第２のポリヌクレオチドを延長して前記相補配列を隣
   接せしめる手段からなる請求項第１項、第２項または第
   ３項に記載の方法。 （５）前記延長手段が、ポリヌクレオチドポリメラーゼ
   および少くとも１種類のヌクレオチド三リン酸を含んで
   なる請求項第４項に記載の方法。 （６）前記ポリヌクレオシド三リン酸が、 ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰから選択され
   る請求項第５項に記載の方法。 （７）前記第１のヌクレオチドは、長さにおいて少くと
   も１０個のヌクレオチドであり、かつ前記第１および前
   記ポリヌクレオチドの合計の長さが少なくとも２０ヌク
   レオチドである前記請求項のいずれか一項に記載の方法
   。 （８）前記共有的結合の手段が、酵素的方法または化学
   的方法である前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 （９）前記第１または前記第２のポリヌクレオチドが、
   前記ポリヌクレオチドの固定化手段を有するか、または
   有し得る前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 （１０）前記固定化手段が、担体である請求項第９項に
   記載の方法。 （１１）前記第１または前記第２のポリヌクレオチドが
   、伝達基を有するか、または有し得る前記請求項のいず
   れか一項に記載の方法。 （１２）前記伝達基が、ビオチン、蛍光体類、化学発光
   体類、放射能基、触媒類、酵素類、基質類、補酵素類、
   および増幅可能なヌクレオチド配列類からなる群から選
   択される請求項第１１項に記載の方法。 （１３）前記ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
   の３種類以下が使用される請求項第６項に記載の方法。 （１４）液体培地中に、 （ａ）標的ヌクレオチド配列を含有すると思われる試料
   、 （ｂ）前記標的ヌクレオチド配列の一部分に結合し得、
   かつ固定化手段を有するか、または有し得る第１のヌク
   レオチド配列、 （ｃ）前記標的ヌクレオチド配列の、前記第１の核酸配
   列が結合する部分以外の部分、またはそれに隣接する部
   分に結合し得、かつ伝達基を有するか、または有し得る
   第２のヌクレオチド配列、および （ｄ）前記第１のヌクレオチド配列を、前記第２のヌク
   レオチド配列に共有的に結合させる手段を、組合せにお
   いて用意し； 前記培地を、前記第１および第２のヌクレオチド配列が
   前記標的ヌクレオチド配列とハイブリッド化し、かつ前
   記標的ヌクレオチド配列が存在する場合に前記第１およ
   び第２のヌクレオチド配列が互いに共有的に結合合する
   条件下で熟成し；前記第１のヌクレオチド配列を前記培
   地から分離し；ならびに、 前記分離された第１のヌクレオチド配列が前記第２のヌ
   クレオチド配列の存在について試験され該存在が前記標
   的ヌクレオチド配列の存在に関連することを含んでなる
   前記請求項のいずれか一項に記載の標的ヌクレオチド配
   列の検出方法。 （１５）前記結合させる手段が、前記第１および第２の
   ヌクレオチド配列が前記標的配列にハイブリッド化して
   いる場合に、前記第１または第２のヌクレオチド配列を
   延長し、これらの配列を隣接させる手段を含んでなる請
   求項第１４項に記載の方法。 （１６）液体培地中に、（１）標的ヌクレオチド配列を
   含むと思われる試料、（２）前記標的ヌクレオチド配列
   の第１の部分に相補的な第１のヌクレオチド配列、およ
   び（３）前記標的ヌクレオチド配列の前記第１の部分以
   外であり、かつこれに隣接しない部分に対して相補的な
   第２のヌクレオチド配列を、前記第１および第２のヌク
   レオチド配列が前記標的配列と結合する条件下で合し、
   ここで前記第１および第２のヌクレオチド配列のうち少
   くとも一方が、それに結合する有機小分子を有すると共
   に、他方が伝達基に結合するか、あるいは結合する能力
   を有している、 前記培地に、ポリヌクレオチドポリメラーゼおよび少く
   とも１種類のヌクレオシド三リン酸を、前記第２のヌク
   レオチド配列が延長されて前記第１のヌクレオチド配列
   と隣接する条件下で添加し、前記培地に、リガーゼを、
   前記第１および第２のヌクレオチド配列が共有的に結合
   する条件下で添加し、 前記培地に、前記有機小分子に対する結合相手が結合さ
   れている担持表面を、前記第１のヌクレオチド配列が前
   記表面に結合する条件下で添加し、前記表面を前記培地
   から分離し、 前記表面を、前記伝達基の存在について試験し、その存
   在が前記試料中の前記標的ヌクレオチドの存在を示して
   いること、 を含んでなる請求項第１項に記載の標的ヌクレオチド配
   列の存在の検出方法。 （１７）前記有機小分子がビオチンであり、かつ、前記
   表面に結合された結合相手がアビジンである請求項第１
   ６項に記載の方法。 （１８）前記伝達基が、蛍光体類、化学発光体類、触媒
   類、放射能基、酵素類、基質類、補酵素類および増幅可
   能なヌクレオチド配列類からなる群から選択される請求
   項第１６項または第１７項に記載の方法。 （１９）前記第２のポリヌクレオチドが、 ３′−ＯＨ基を含むポリヌクレオチドを含むか、あるい
   はその前駆体であり、更に、 （１）前記共有的に結合された第１および第２のポリヌ
   クレオチドを、３′−ＯＨ基が存在しない場合に該基を
   与える手段、３′−ＯＨ基を含む前記ポリヌクレオチド
   に相補的な型枠ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドポ
   リメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、および前記型枠に
   相補的なポリヌクレオチドを切断する手段を用いて、前
   記 ３′−ＯＨ基を含むポリヌクレオチドを延長し、かつ該
   延長物を切断する条件下で処理し、ならびに、 （２）前記切断された延長物を検出することを含んでな
   る請求項第１項に記載の方法。 （２０）前記切断された延長物が、長さにおいて約６か
   ら３０ヌクレオチドである請求項第１９項に記載の方法
   。 （２１）前記切断された延長物の多重コピーが生成する
   条件下で行なわれる請求項第１９項または第２０項に記
   載の方法。 （２２）前記標的ヌクレオチド配列の第１および第２の
   部分は、１ヌクレオチドをもつて分離されている前記請
   求項のいずれか一項に記載の方法。 （２３）前記第２のヌクレオチド配列が、前記標的ヌク
   レオチド配列に対して結合する末端とは反対の末端に検
   出配列を含み、更に、 前記第２のヌクレオチド配列を、第３のヌクレオチド配
   列および第４のヌクレオチド配列とハイブリッド化し、
   ここにおいて前記第３のヌクレオチド配列は、前記検出
   配列に相補的な配列および異種配列を含み、前記第４の
   ヌクレオチド配列は、前記異種配列に相補的なヌクレオ
   チド配列および前記検出配列と同等なヌクレオチド配列
   を含み、但し、前記第３および第４のヌクレオチド配列
   の一対の相補的ヌクレオチド配列は、各々の同一末端に
   あり、かつ前記第３および第４のヌクレオチド配列の第
   ２の対の相補的ヌクレオチド配列は、各々の他の末端に
   あり、該ハイブリッド化は、前記ヌクレオチド配列が前
   記第２のヌクレオチド配列にハイブリッド化している場
   合に、相互におよび前記第２のヌクレオチド配列に連結
   する条件下に行なわれ、ならびに、 前記連結した第３および／または第４のヌクレオチド配
   列を検出すること、を含んでなる請求項第１項に記載の
   方法。 （２４）パッケージ化された組合せにおいて、標的ヌク
   レオチド配列の部分にハイブリッド化可能であり、その
   固定化手段を有するか、あるいは有し得る第１のヌクレ
   オチド配列、 標識を有するか、あるいは有し得て、前記標的ヌクレオ
   チド配列の、前記第１のヌクレオチド配列により認識さ
   れる部分以外であり、かつこれに隣接しない部分に対し
   てハイブリッド化可能な第２のヌクレオチド配列、なら
   びに、 前記第１および第２のヌクレオチド配列が前記標的ヌク
   レオチド配列にハイブリッド化している場合に、前記第
   １と第２のヌクレオチド配列を共有的に結合させる手段
   を含んでなる標的ヌクレオチド配列の測定において使用
   するためのキット。 （２５）前記第１および第２のヌクレオチド配列の一方
   は、ポリヌクレオチドポリメラーゼおよび１種またはそ
   れ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で鎖延
   長可能であり、第１および第２のヌクレオチド配列の両
   者が前記標的配列にハイブリッド化している場合に、前
   記第１および第２のヌクレオチド配列の他方に隣接し、
   かつ、前記キットは、更に、 ポリヌクレオチドポリメラーゼ、 １種またはそれ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸、
   ならびに 前記第１および第２のヌクレオチド配列の共有的結合手
   段としてのリガーゼを含んでなる請求項第２４項に記載
   のキット。