JP2023540177A - ヘアピンアダプターを使用して配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮する方法 - Google Patents

Abstract

二本鎖核酸断片を含む配列決定ライブラリーを濃縮するための方法が本明細書に開示され、二本鎖断片の末端における１つ以上のアダプターを有する二本鎖断片のライブラリーを調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートの標的配列に結合し、非標的配列に結合しない、伸長プライマーをハイブリダイズさせることと、を含む。一実施形態では、アダプターは、ヘアピンアダプターであり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用する伸長プライマーからの伸長は、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的なヘアピンアダプターの配列の全部又一部を除去する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年９月１１日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＥＮＲＩＣＨＩＮＧ Ａ ＴＡＲＧＥＴ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＦＲＯＭ Ａ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＬＩＢＲＡＲＹ ＵＳＩＮＧ ＨＡＩＲＰＩＮ ＡＤＡＰＴＯＲＳ」と題する米国仮出願第６３／０７７，２７１号の優先権及び利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年９月８日に作成され、名前がＩＰ－２０４３－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが８０６バイトである。

（発明の分野）
本開示は、ヘアピンアダプターを使用して配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮する調製に関する。

配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮することは、遅くて複雑なワークフローによって妨げられる可能性がある。例えば、ハイブリダイゼーション捕捉方法を使用するライブラリー濃縮は、ハイブリダイゼーション捕捉工程の前にライブラリー全体の増幅を必要とする。更に、標的化増幅を用いた濃縮の従来のアプローチは、断片末端情報が失われる可能性がある。

本方法は、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するためにヘアピンアダプターを使用する。場合によっては、単一の増幅工程は、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮することができる。ヘアピンアダプターを用いるこれらの方法は、断片末端情報の損失を回避することができ、これは、無細胞ＤＮＡの分析及び断片重複排除（fragment deduplication）アプローチに有用であり得る。

本明細書によれば、二本鎖ライブラリー断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターを使用して、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮する方法が本明細書に記載される。また、フォークアダプター（forked adaptor）及びフォークアダプターを有する配列決定ライブラリーを生成するための方法及びキットが本明細書に記載される。

核酸配列決定ライブラリーを調製する際に使用するためのアダプターが本明細書に開示され、５’末端及び３’末端を有する第１の配列と、５’末端及び３’末端を有する第２の配列と、を含み、第１の配列の３’末端の部分及び第２の配列の５’末端の部分が、相補的であり、第１の二本鎖領域を形成し、第１の配列の５’末端の部分及び第２の配列の３’末端の部分が、非相補的であり、第１の鎖の５’末端の部分が、第２の二本鎖領域を含む。

いくつかの実施形態では、第２の二本鎖領域は、ヘアピン構造である。いくつかの実施形態では、第２の二本鎖領域は、非核酸部分を含む。いくつかの実施形態では、非核酸部分は、リンカーである。いくつかの実施形態では、第１の鎖の５’末端は、エキソヌクレアーゼによって分解可能でない部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の二本鎖領域は、少なくとも５つの連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の二本鎖領域は、少なくとも５つの連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の鎖の５’末端は、リン酸化されている。いくつかの実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖の全てのシトシン塩基は、メチル化されている。いくつかの実施形態では、アダプターは、捕捉部分を更に含む。

また、核酸配列決定ライブラリーを調製する方法も本明細書に記載され、複数の二本鎖核酸断片を生成することと、複数の二本鎖核酸断片の少なくとも一方の末端に、１つ以上のフォークアダプターを結合させることと、を含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、タグメンテーションを介して結合している。いくつかの実施形態では、アダプターは、ライゲーションを介して結合している。

また、核酸配列決定ライブラリーを調製するためのキットも本明細書に記載され、フォークアダプターと、アダプターの部分にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマーと、少なくとも１つの酵素と、ｄＮＴＰと、を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、エキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの構成要素は、凍結乾燥形態又は乾燥形態にある。

二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法が本明細書に開示され、配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、二本鎖核酸を含むインサートと、二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、ヘアピンアダプターが、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、配列決定ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、増幅プライマー配列に結合する増幅プライマーを使用して断片を増幅することを更に含む。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間にリンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、当該リンカーは、エキソヌクレアーゼによって分解可能ではない。

いくつかの実施形態では、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、Ｔａｑである。いくつかの実施形態では、伸長プライマー及び／又は伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成するために使用されるポリメラーゼは、伸長後に除去される。いくつかの実施形態では、伸長プライマー及び／又は伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成するために使用されるポリメラーゼを除去することは、固相可逆的固定化（solid-phase reversible immobilization、ＳＰＲＩ）ビーズによって、かつ／又は感熱性ポリメラーゼを変性させることによって行われる。

いくつかの実施形態では、伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することは、ウラシルを含む反応混合物を用いて行われる。いくつかの実施形態では、ウラシルを含む反応混合物を用いて生成された核酸鎖は、１つ以上のウラシル特異的除去試薬（uracil-specific excision reagent、ＵＳＥＲ）によって切断される。いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの活性を有する単一酵素である。

いくつかの実施形態では、ライブラリー中の複数の二本鎖断片は、標的配列を含まない。いくつかの実施形態では、当該ヘアピンアダプターは、ライブラリーの二本鎖断片に含まれ、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部が存在する。いくつかの実施形態では、方法は、標的配列を含まないライブラリー中の複数の二本鎖断片において、ヘアピンアダプターを制限エンドヌクレアーゼで切断することを更に含む。

いくつかの実施形態では、ウラシルを含む反応混合物を用いて生成された核酸鎖は、制限エンドヌクレアーゼ消化に耐性である。いくつかの実施形態では、核酸鎖へのウラシルの組み込みは、以前は制限エンドヌクレアーゼ切断部位であった配列を変化させ、それによって、鎖及びその相補体を切断から保護する。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、増幅プライマー配列の増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との会合によって形成された二本鎖核酸において、切断する。

また、二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法も本明細書に開示され、配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、二本鎖核酸を含むインサートと、二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、ヘアピンアダプターが、第１のセットのヌクレオチド配列であって、第１のセットのヌクレオチド配列がアダプター配列及びアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、第１のセットのヌクレオチド配列と、第２のセットのヌクレオチド配列であって、第２のセットのヌクレオチド配列が、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、第１のセットのヌクレオチド配列が、第２のセットのヌクレオチド配列よりもインサートに近い、第２のセットのヌクレオチド配列と、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間のリンカーと、を含む、調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、（１）配列決定ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する第１の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、核酸鎖を生成するための反応混合物が、ウラシルを含み、（２）アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、第１の伸長プライマーを除去することと、ＵＳＥＲを提供することと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、（１）二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、（２）増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、増幅プライマー配列に結合する増幅プライマーを使用して断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列の相補体及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間のリンカーは、エキソヌクレアーゼによって分解可能ではない。

いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列の相補体及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間のリンカーは、ウラシルを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、第１のプライマーを使用して核酸鎖を生成した後、ヘアピンアダプターを制限エンドヌクレアーゼで切断することを更に含み、当該ヘアピンアダプターがライブラリーの二本鎖断片に含まれ、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部が存在する。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間にリンカーを更に含む。

いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、第１のプライマー伸長によって生成された核酸鎖、ヘアピンアダプターに含まれたリンカー、及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列を切断する。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の伸長プライマーは、異なる配列に結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の伸長プライマーは、二本鎖核酸の同じ鎖に結合する。

いくつかの実施形態では、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、Ｔａｑである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、断片を増幅する前に除去される。

いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、当該プライマーを使用して核酸鎖を生成した後に除去される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ及び／又は第２の伸長プライマーは、ＳＰＲＩビーズを使用して、かつ／又は熱感受性ポリメラーゼを変性させることによって除去される。

また、二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法も本明細書に開示され、配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、二本鎖核酸を含むインサートと、二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、ヘアピンアダプターが、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、プライマーミックスと、ライゲーション活性及びポリメラーゼ活性を有し、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない、１つ以上の酵素と、を使用し、（１）プライマーミックスの第１の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、プライマーミックスが、第１の伸長プライマー及びブロックされた第２の伸長プライマーを含み、第１の伸長プライマー及びブロックされた第２の伸長プライマーが、二本鎖核酸に含まれた目的の異なる配列に結合し、（２）第１の伸長プライマーを使用して生成された核酸鎖を、ブロックされた第２の伸長プライマーにライゲーションすることと、インサートに結合していないプライマーミックスを除去することと、ブロックされた第２の伸長プライマーを脱ブロックすることと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、（１）ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、（２）増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。

また、二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法もまた、本明細書中に開示される。方法は、配列決定ライブラリーを調製することを含み、二本鎖断片の各断片が、末端アダプター間に配置されたインサートを含み、各末端アダプターが、第１のセットのヌクレオチド配列を含み、第１のセットのヌクレオチド配列が、アダプター配列及びアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列、第１のセットのヌクレオチド配列の３’終端から離れて伸長する増幅プライマー配列を含む。方法はまた、二本鎖断片を変性させて、分離鎖を形成することであって、各分離鎖が、インサートの一本鎖部分を含む、形成することと、配列特異的伸長プライマーを、インサートの一本鎖部分の相補配列にアニーリングすることと、アニーリングした伸長プライマーから相補鎖を伸長させて、二本鎖末端を有する相補鎖及び分離鎖の二重鎖を形成することであって、二本鎖末端が、相補鎖の３’末端及び分離鎖の５’末端を含む、形成することと、二本鎖アダプターを二重鎖の各二本鎖末端にライゲーションすることと、二重鎖を変性させることと、二重鎖の変性鎖を増幅して、増幅産物を生成することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ブロックされた第２の伸長プライマーは、それが脱ブロックされない限り、核酸鎖を生成することができない。いくつかの実施形態では、ブロックされた第２の伸長プライマーは、少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列及び第１の伸長プライマーによって結合された配列の５’に結合する。いくつかの実施形態では、ブロックされた第２の伸長プライマーは、６０℃未満の融解温度でインサートに結合する。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することは、６０℃以上の温度で行われる。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーのアニーリング及び伸長温度は、第２の伸長プライマーの融解温度を上回る。いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、増幅する前に除去される。いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、ＳＰＲＩビーズ又はエキソヌクレアーゼを使用して除去される。

いくつかの実施形態では、１つ以上の伸長プライマーは、遺伝子特異的プライマーである。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、二本鎖断片の一方の鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、ライゲーション又はタグメンテーションによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、各々、少なくとも１４ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、各々、１４～６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、安定性を増加させるための１つ以上の増強を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、１つ以上の修飾核酸又はロックド核酸を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、８－アザ－７－デアザグアノシンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、６０℃以上、６５℃以上、又は７０℃以上の温度で、増幅プライマー配列の増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との会合を維持する。

いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列は、Ａ１４、Ａ１４’、Ｂ１５、又はＢ１５’配列を含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列が、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列と会合している場合、増幅プライマーは、ヘアピンアダプターに含まれた増幅プライマー配列に結合することができない。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、増幅プライマー配列の相補体と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、増幅プライマー配列の相補体を含む。

いくつかの実施形態では、二本鎖断片の一方又は両方の鎖は、ヘアピンアダプターの３’の１つ以上の追加のアダプターを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖断片は、一方又は両方の鎖の３’末端における１つ以上のアダプターを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターの３’の１つ以上の追加のアダプター及び／又は一方又は両方の鎖の３’末端における１つ以上のアダプターは、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、増幅プライマーを使用して断片を増幅することは、ヘアピンアダプターを破壊することができない。いくつかの実施形態では、増幅プライマーを使用して断片を増幅するために使用されるポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、又は増幅プライマーを使用して断片を増幅するために使用されるポリメラーゼは、鎖置換ポリメラーゼではない。いくつかの実施形態では、断片を増幅するために使用されるポリメラーゼは、Ｑ５である。いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、増幅された断片の配列決定を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、インサートの全配列の配列決定を可能にする。

いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、無細胞ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法は、断片重複排除ために使用される。

追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から明白であるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。

前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的のみであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を図解し、明細書とともに本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。

非標的配列と対照的に、断片の一方又は両方の５’末端でヘアピンアダプターを使用して、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮する代表的な方法を示す。 本開示の態様による、ヘアピンアダプターがどのように増幅プライマー配列からの増幅をブロックすることができるかを示す。 本開示の態様による、ヘアピンアダプターが、少なくとも部分的に相補的である２つのセットのヌクレオチド配列（Ａ１４／Ａ１４’及びＸ／Ｘ’）を含む方法を示す。 本開示の態様による、第１及び第２の伸長プライマー（各々、異なる標的配列に結合する）がリンカーを介して連結される方法を示す。 本開示の態様による、アダプターライゲーションなし、したがって、標的インサートを含有しない断片からの双方向増幅なしとは対照的に、標的インサート含有断片の末端にライゲーションされた二本鎖アダプターを使用して、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮する代表的な方法を示す。 ヘアピンアダプター及び対照アダプターを使用したライブラリー増幅の結果を示す。 図６のライブラリー増幅において使用されるヘアピン及び対照アダプターを示す。

（配列の説明）
表１は、本明細書中で参照される特定の配列のリストを提供する。

（発明を実施するための形態）
Ｉ．核酸配列決定ライブラリーの調製及びライブラリー調製において使用するためのアダプター
いくつかの実施形態では、アダプターは、核酸配列決定ライブラリーを調製するために使用される。

いくつかの実施形態では、これらのアダプターは、フォークアダプター（forked adaptor）である。本明細書で使用される場合、「フォークアダプター」という用語は、２本の鎖が互いにアニーリングしている第１の末端と、２本の鎖が互いにアニーリングしていない第２の末端と、を有する二本鎖核酸を意味する。すなわち、フォークアダプターは、二本鎖領域及び一本鎖領域を含む。一実施形態では、フォークアダプターの末端は、二本鎖である。フォークアダプター又はＹ字型アダプターの例は、例えば、米国特許第７，７４１，４６３号、米国特許第１０，２５３，３５９号、及び米国特許第９，８６８，９８２号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、核酸配列決定ライブラリーを調製する際に使用するためのアダプターは、５’末端及び３’末端を有する第１の配列と、５’末端及び３’末端を有する第２の配列と、を含み、第１の配列の３’末端の部分及び第２の配列の５’末端の部分が、相補的であり、第１の二本鎖領域を形成し、第１の配列の５’末端の部分及び第２の配列の３’末端の部分が、非相補的であり、第１の鎖の５’末端の部分が、第２の二本鎖領域を含む。

いくつかの実施形態では、第２の二本鎖領域は、ヘアピン構造である。いくつかの実施形態では、第２の二本鎖領域は、非核酸部分を含む。いくつかの実施形態では、非核酸部分は、リンカーである。いくつかの実施形態では、第１の鎖の５’末端は、エキソヌクレアーゼによって分解可能でない部分を含む。言い換えれば、第１の鎖の５’末端はエキソヌクレアーゼ耐性であり得る。いくつかの実施形態では、第１の二本鎖領域は、少なくとも５つの連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の二本鎖領域は、少なくとも５つの連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の鎖の５’末端は、リン酸化されている。いくつかの実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖の全てのシトシン塩基は、メチル化されている。いくつかの実施形態では、アダプターは、捕捉部分を更に含む。

いくつかの実施形態では、核酸配列決定ライブラリーを調製する方法は、複数の二本鎖核酸断片を生成することと、複数の二本鎖核酸断片の少なくとも一方の末端にフォークアダプターを結合させることと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプターは、タグメンテーションを介して結合している。いくつかの実施形態では、１つ以上のアダプターは、ライゲーションを介して結合している。

多種多様なライブラリー調製が当該技術分野で公知であり、本方法は、ライブラリー生成の手段によって限定されない。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、タグメンテーション又はライゲーションを使用して調製される。例えば、タグメンテーション又はライゲーション方法を使用して、アダプター（例えば、ヘアピンアダプター、一本鎖アダプター、及び／又は二本鎖アダプター）をライブラリー断片の末端に組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローで例示されるように、トランスポゾンベースの技術をＤＮＡの断片化に利用することができ、ゲノムＤＮＡは、インプットＤＮＡを同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）操作されたトランスポソームによって断片化され、それによって、断片の末端に固有のアダプター配列を含む断片化された核酸分子の集団が生成され得る。

転位によるフォークアダプターの付加を介した配列決定ライブラリーの調製は、米国特許第１０，２４６，７４６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「タグメンテーション」という用語は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体化したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を指す。タグメンテーションは、二重断片の両方の鎖の５’末端へのＤＮＡの同時フラグメンテーション及びアダプターのライゲーションもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製工程に続いて、更なる配列を、例えばＰＣＲ、ライゲーション、又は当業者に公知の他の任意の適切な方法によって、適合断片の末端に付加することができる。

本明細書で使用されるとき、「トランスポソーム複合体」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができる機能的複合体を形成するために、トランスポゾン認識配列に結合する。いくつかの態様では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、二本鎖核酸のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を二本鎖核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の一方の鎖が二本鎖核酸に移され、開裂事象が生じる。例示的な転位手順及びシステムは、トランスポザーゼでの使用に容易に適合され得る。

タグメンテーションは、固定化されたトランスポソーム複合体又は溶液相トランスポソーム複合体を用いて行うことができる。

Ｔｒｕｓｅｑ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローで例示されているように、ライゲーションによるアダプターの組み込みも周知である。

いくつかの実施形態では、核酸配列決定ライブラリーを調製するためのキットは、フォークアダプターと、アダプターの部分にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマーと、少なくとも１つの酵素と、ｄＮＴＰと、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、エキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、キットの少なくとも１つの構成要素は、凍結乾燥形態又は乾燥形態にある。

ＩＩ．ヘアピンアダプターを使用して配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮する方法
ヘアピンアダプターを使用して配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法が本明細書に開示される。以下に記載するように、標的配列に結合する伸長プライマー及び５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して、ヘアピンアダプターを特異的に「ロック解除」し、標的配列を含む断片の増幅を可能にすることができる（図１を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、配列決定の結果は、本方法を使用して改善される。これは、断片末端を回収し得ない濃縮方法（例えば、多重ＰＣＲを使用する直接標的化増幅）と比較して、濃縮の間に断片末端が回収されるためである。

いくつかの実施形態では、二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法は、配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、二本鎖核酸を含むインサートと、二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、ヘアピンアダプターが、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、（１）配列決定ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、（２）増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む。

本方法は、無細胞ＤＮＡなどの断片化核酸の全配列を生成するためなど、様々な用途を有する。更に、本方法は、断片重複排除に使用することができる。

Ａ．標的配列及び配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、任意の目的の配列をいう。例えば、標的配列は、目的の遺伝子に含まれた配列、特定の目的の変異、又はユーザにとって任意の他の目的の配列が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための本方法の不在下で、二本鎖核酸から生成された比較的低い割合のライブラリー断片が、標的配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ライブラリー中の複数の二本鎖断片は、濃縮前に標的配列を含まない。いくつかの実施形態では、ライブラリー中の二本鎖断片の大部分は、濃縮前に標的配列を含まない。

いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮することは、標的配列を含む断片が、濃縮前と比較して濃縮後にライブラリー中に２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１，０００倍以上、１０，０００倍以上、又は１００，０００倍以上多く含まれることを意味する。したがって、本方法は、「濃縮ライブラリー」を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、試料中に含まれる二本鎖ＤＮＡの小領域（すなわち、数キロベース）の高濃縮を可能にする。

いくつかの実施形態では、標的配列は、ライブラリー調製のために使用される二本鎖核酸に含まれる。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、標的濃縮を必要とするか、又は標的濃縮が有益である任意のタイプの試料中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、無細胞ＤＮＡ（cell-free DNA、ｃｆＤＮＡ）に含まれる。いくつかの実施形態では、標的配列は、液体生検試料などの腫瘍学試料中に含まれる。いくつかの実施形態では、標的配列は、エクソーム試料に含まれる。いくつかの実施形態では、標的配列は、希少未診断疾患（rare and undiagnosed disease、ＲＵＧＤ）エクソーム試料に含まれる。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＲＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーに含まれる。いくつかの実施形態では、標的配列はメチル化ライブラリーに含まれる。

Ｂ．増幅プライマー配列を含むヘアピンアダプター
本明細書で使用される場合、「ヘアピン」とは、互いに少なくとも部分的に相補的である一対の核酸配列を含む核酸を指す。少なくとも部分的に相補的であるこれらの２つの核酸配列は、互いに結合し、核酸の折り畳みを媒介することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも部分的に相補的である２つの核酸配列は、ヘアピン二次構造を有する核酸を生成する。

本明細書で使用される「ヘアピンアダプター」は、互いに少なくとも部分的に相補的である少なくとも１対の核酸配列を含むアダプターを指す。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、折り畳まれた二次構造を有する。

図１は、各鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターを有する二本鎖インサート（インサート及びインサート配列）を含むライブラリー断片を示す。図１の代表的な実施形態では、各ヘアピンアダプターは、互いに少なくとも部分的に相補的である１対の核酸配列（Ａ１４／Ａ１４’）を含む。いくつかの実施形態では、互いに少なくとも部分的に相補的である一対の核酸配列間の塩基対形成は、アダプターをヘアピン二次構造に「ロック」する。このような方法では、使用される伸長プライマーの長さを増加させて、標的配列を含む断片を増幅する方法の特異性を改善することができる。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、互いに少なくとも部分的に相補的である２つ以上の対の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、互いに少なくとも部分的に相補的である２対の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、互いに少なくとも部分的に相補的である核酸配列の３つ以上の対の核酸配列を含む。図２は、互いに少なくとも部分的に相補的である２対の核酸配列（Ａ１４／１４’対及びＸ／Ｘ’対）を含むヘアピンアダプターを示す。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列と、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部と、を含む。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全ての部が除去されない限り、（互いに少なくとも部分的に相補的である一対の核酸配列間の塩基対形成を介して）「ロック」される。いくつかの実施形態では、ロックされたヘアピンは、ポリメラーゼが伸長して増幅プライマー配列の相補体を生成することを防止する。

いくつかの実施形態では、本方法は、ヘアピンアダプターが、後の増幅工程に使用することができる増幅プライマー配列を含むので、ヘアピンアダプターに結合していない断片の増幅をブロックする。

このようにして、本方法は、「ロック解除された（unlocked）」ヘアピンアダプターに結合しているライブラリー断片の増幅のみを可能にする。ヘアピンアダプターに結合しなかったライブラリー断片及び「ロックされた」ヘアピンアダプターに結合したライブラリー断片は、増幅されない。望ましくない断片（すなわち、標的配列を含まない断片）の増幅を阻害するそのような手段は、下流の方法に関連するコスト及びユーザ時間を回避することができる。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、二本鎖断片の一方の鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、二本鎖断片の両方の鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、ライゲーション又はタグメンテーションによって組み込まれる。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、各々、少なくとも１４ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、各々、１４～６０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、安定性を増加させるための１つ以上の増強を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、１つ以上の修飾核酸又はロックド核酸を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸は、８－アザ－７－デアザグアノシンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、６０℃以上、６５℃以上、又は７０℃以上の温度で、増幅プライマー配列の増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との会合を維持する。

いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列は、Ａ１４配列（配列番号１）若しくはＢ１５配列（配列番号２）、又はそれらの相補体（それぞれ、Ａ１４’若しくはＢ１５’）を含む。

いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、増幅プライマー配列の相補体と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、増幅プライマー配列の相補体を含む。

１．アダプター
いくつかの実施形態では、ライブラリー断片は、ヘアピンアダプターに加えて、又はその代わりに、２本鎖ライブラリー断片の両方の５’末端のみ又は両方の３’末端のみに提供される対称単一アダプター（symmetrical single adaptor）などの１つ以上のアダプターを含む（図５）。一実施形態では、対称単一アダプターは、二本鎖ライブラリー断片の一本鎖末端を生成する。一実施形態では、対称単一アダプターは、Ｂ１５又はＢ１５’アダプターである。一実施形態では、対称単一アダプターは、Ａ１４又はＡ１４’アダプターである。

いくつかの実施形態では、二本鎖断片の一方又は両方の鎖は、ヘアピンアダプターの３’側の１つ以上の追加のアダプターを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖断片は、一方又は両方の鎖の３’末端における１つ以上のアダプターを含む。

いくつかの実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、配列決定関連配列は、後の配列決定工程に関連する任意の配列であり得る。配列決定関連配列は、下流の配列決定工程を単純化するように作用し得る。例えば、配列決定関連配列は、他の点でアダプターを核酸断片にライゲーションする工程を介して組み込まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、特定の配列決定方法においてフローセルへの結合を容易にするために、Ｐ５又はＰ７配列（又はそれらの相補体）を含む。

いくつかの実施形態では、ヘアピンに含まれた増幅プライマー配列は、ユニバーサルプライマー配列である。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸断片に共通の（すなわち、共有される）ヌクレオチド配列の領域である。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間にリンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、このリンカーは、非ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施形態では、このリンカーは、合成リンカーである。いくつかの実施形態では、このリンカーは、エキソヌクレアーゼ活性がリンカーで終結するように、エキソヌクレアーゼによって分解可能ではない（すなわち、リンカーはエキソヌクレアーゼ耐性である）。

Ｃ．二本鎖核酸
いくつかの実施形態では、ライブラリーを生成するために使用される二本鎖核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの類似体から構成される。いくつかの実施形態では、酸の供給源は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、又は天然源由来の他の核酸である。いくつかの実施形態では、そのような供給源に由来する核酸を、本明細書に記載の方法において使用する前に増幅することができる。

二本鎖核酸が由来し得る例示的な生物学的試料としては、例えば、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒト、若しくは非ヒト霊長類などの哺乳動物；例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、トウモロコシ、ソルガム、カラスムギ、コムギ、イネ、セイヨウアブラナ、若しくはダイズなどの植物；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの藻類；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓなどの線形動物；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、カ、ショウジョウバエ、ミツバチ、若しくはクモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚；爬虫類；カエル若しくはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓなどの両生類；キイロタマホコリカビ（dictyostelium discoideum）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉなどの真菌、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒａｍｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、若しくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；又はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが挙げられる。二本鎖核酸はまた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ブドウ球菌属（staphylococci）、若しくは肺炎マイコプラズマ（mycoplasma pneumoniae）などの細菌などの原核生物、古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス若しくはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；又はウイロイドに由来し得る。二本鎖核酸は、上記の生物の均質な培養物若しくは生物の集団に由来し得るか、又は代替的に、例えば、群集若しくは生態系におけるいくつかの異なる生物のコレクションに由来し得る。核酸は、当該技術分野で公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９８）に記載されている方法が挙げられる）を使用して単離され得る（その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、１つ以上のより大きな核酸の断片として得ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的開裂、酵素的開裂、又は物理的剪断を含む、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかを用いて行うことができる。

二本鎖核酸の集団又はそのアンプリコンは、本明細書に記載の方法又は組成物の特定の用途に望ましい又は適切な平均鎖長を有し得る。例えば、平均鎖長は、約１００，０００ヌクレオチド、５０，０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、５，０００ヌクレオチド、１，０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、又は５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的に、又は追加的に、平均鎖長は、１０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１，０００ヌクレオチド、５，０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、５０，０００ヌクレオチド、又は１００，０００ヌクレオチド超であり得る。二本鎖核酸又はそのアンプリコンの集団の平均鎖長は、上記の最大値と最小値との間の範囲であり得る。増幅部位で生成された（又は別の手段で本明細書で作製又は使用された）アンプリコンは、上記に例示されているものから選択される上限と下限との間の範囲にある平均鎖長を有し得ることが理解されよう。

いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、比較的短い平均鎖長、例えば、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、７５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、又は３６ヌクレオチド未満を有する。比較的短い平均鎖長を有する試料タイプの例は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及びエクソーム配列決定試料である。

いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、母体血液試料由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、母体血漿試料から抽出される。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは非侵襲的出生前検査（noninvasive prenatal testing、ＮＩＰＴ）用である。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、エクソームである。いくつかの実施形態では、エクソームは、希少未診断疾患（ＲＵＧＤ）が疑われる患者からの試料に由来する。

Ｄ．伸長プライマー
本明細書中で使用される場合、「伸長」とは、プライマーに関して使用される場合、１つ以上のヌクレオチドがプライマーに付加されるか（例えば、ポリメラーゼ活性を介して）、又は１つ以上のオリゴヌクレオチドがプライマーに付加される（例えば、リガーゼ活性を介して）プロセスを含むことが意図される。

いくつかの実施形態では、１つ以上の伸長プライマーは、二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する。５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して、方法は、（１）伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することと、（２）ヘアピンアダプター中の増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全て又は一部を除去することと、を含み得る（図１に示されるように）。いくつかの実施形態では、ロックされたヘアピンは、ポリメラーゼが、生成された核酸鎖中の増幅プライマー配列の相補体を伸長及び生成することを防止する。したがって、標的配列を含むインサートへの伸長プライマーの結合は、この断片上のヘアピンアダプターの選択的な「ロック解除」を可能にする。

いくつかの実施形態では、１つ以上の伸長プライマーは、遺伝子特異的プライマーである。例えば、伸長プライマーは、がん遺伝子の標的配列に結合して、配列決定ライブラリーからこの標的配列を濃縮することができる。

いくつかの実施形態では、方法は、単一の伸長プライマーを使用する。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の伸長プライマーを使用する。

いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、６０℃以上の融解温度を有する。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、６０℃以上、６５℃以上、又は７０℃以上の融解温度を有する。いくつかの実施形態では、６０℃以上の融解温度を有する伸長プライマーは、「ホットスタート」反応が非特異的結合を減少させることを可能にする。いくつかの実施形態では、伸長プライマーの融解温度は、プライマーの長さ、ＧＣ含有量、又は当業者に周知の他の要因によって制御される。

いくつかの実施形態では、２つ以上の伸長プライマーが、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去する、単一工程で使用される。いくつかの実施形態では、複数の伸長プライマーが、方法の単一工程で使用される。例えば、複数の伸長プライマーは、目的の遺伝子内の異なる標的配列又は異なる目的の遺伝子に結合することができる。

いくつかの実施形態では、複数の伸長プライマーは、１つ以上のリンカー（すなわち、図４に示されているようなリンカー）を介して連結される。いくつかの実施形態では、２つの伸長プライマーは、リンカーを介して連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカーを介して連結された複数の伸長プライマーは、より高い融解温度を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカーを介して連結された複数の伸長プライマーは、各伸長プライマー（例えば、図４に示されているｆｗｄ１’及びｆｗｄ２’）に結合することができる標的配列を含むインサートに結合する。

いくつかの実施形態では、２つの伸長プライマーは、以下に記載されるように、方法の間に一緒にライゲーションされ得る。

いくつかの実施形態では、異なる伸長プライマーが、方法の異なる工程で使用される。

Ｅ．５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
いくつかの実施形態では、方法は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することと、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性は、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することを媒介する。いくつかの実施形態では、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全て又は一部を切断する。いくつかの実施形態では、ロックされたヘアピンは、ポリメラーゼが、生成された核酸鎖中の増幅プライマー配列の相補体を伸長及び生成することを防止する。

いくつかの実施形態では、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、Ｔａｑである。いくつかの実施形態では、伸長プライマー及び／又は伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成するために使用されるポリメラーゼは、伸長後に除去される。いくつかの実施形態では、伸長プライマー及び／又は伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成するために使用されるポリメラーゼを除去することは、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズによって行われる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱感受性ポリメラーゼであり、変性させることによって除去される。いくつかの実施形態では、熱感受性ポリメラーゼは、完全長のＢｓｔ又はＤＮＡポリメラーゼＩである。

Ｆ．増幅
いくつかの実施形態では、方法は、増幅プライマー配列に結合する増幅プライマーを使用して断片を増幅することを更に含む。いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全て又は一部が除去された断片のみが増幅され得る。いくつかの実施形態では、ロックされたヘアピンは、ポリメラーゼが伸長して増幅プライマー配列の相補体を生成することを防止する。

いくつかの実施形態では、増幅プライマーは、インデックス配列を含み得る（例えば、図１のｉ５及びｉ７インデックス配列を参照されたい）。これらのインデックス配列は、試料及びアレイ中の位置を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、インデックス配列は、固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）を含む。ＵＭＩは、特許出願第ＷＯ２０１６／１７６０９１号、第ＷＯ２０１８／１９７９５０号、第ＷＯ２０１８／１９７９４５号、第ＷＯ２０１８／２００３８０号、及び第ＷＯ２０１８／２０４４２３号に記載されている（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態では、増幅プライマーを使用して断片を増幅することは、ヘアピンアダプターを破壊することができない。いくつかの実施形態では、増幅プライマーを使用して断片を増幅するために使用されるポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、又は増幅プライマーを使用して断片を増幅するために使用されるポリメラーゼは、鎖置換ポリメラーゼではない。いくつかの実施形態では、断片を増幅するために使用されるポリメラーゼは、Ｑ５である。いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含む。

いくつかの実施形態では、試料は、固体支持体上で増幅される。

例えば、いくつかの実施形態では、試料は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスタ増幅方法論を使用して増幅される（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定化された核酸分子のクラスタ又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定化することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスタ又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスタ化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の産物は、固定化されたポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「ブリッジ（ｂｒｉｄｇｅｄ）」構造体であり、両方の鎖は、いくつかの実施形態では、共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定化されている。クラスタ増幅方法論は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを産生する方法の例である。他の好適な方法論を使用して、本明細書で提供される方法に従って産生された固定化されたＤＮＡ断片から固定化されたアンプリコンを産生することもできる。例えば、１つ以上のクラスタ又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方又は両方のプライマーが固定化されているかどうかにかかわらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。

他の実施形態では、試料は、溶液中で増幅される。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、切断されるか、又は他の方法で固体支持体から遊離され、次いで、増幅プライマーは、溶液中で遊離分子にハイブリダイズする。他の実施形態では、増幅プライマーを、１つ以上の初期の増幅工程のために所望の試料にハイブリダイズさせ、続いて、溶液中で後続の増幅工程を行う。いくつかの実施形態では、固定化された核酸鋳型を使用して、液相アンプリコンを生成することができる。

本明細書に記載されているか又は当該技術分野で一般に知られている増幅方法論のいずれかを、ユニバーサルプライマー又は標的特異的プライマーとともに利用して、所望の試料を増幅できることが理解されるであろう。増幅のための好適な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification、ＳＤＡ）、転写媒介増幅（transcription mediated amplification、ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（nucleic acid sequence based amplification、ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、１つ以上の目的の核酸を増幅することができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、固定化ＤＮＡ断片を増幅することができる。いくつかの実施形態では、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーは、増幅反応に含まれる。

ポリヌクレオチドの増幅に好適な他の方法としては、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーション、ローリングサークル増幅（rolling circle amplification、ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５－２３２（１９９８）、参照により本明細書に組み込まれる）、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligonucleotide ligation assay、ＯＬＡ）（一般に米国特許第７，５８２，４２０号、同第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号、及び同第５，５７３，９０７号、欧州特許第０３２０３０８（Ｂ１）号、欧州特許第０３３６７３１（Ｂ１）号、欧州特許第０４３９１８２（Ｂ１）号、国際公開第９０／０１０６９号、国際公開第８９／１２６９６号、及び国際公開第８９／０９８３５号、その全てが参照により組み込まれる）技術、を挙げることができる。これらの増幅方法論は、固定化ＤＮＡ断片を増幅するように設計され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅方法は、目的の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を含んでもよい。目的の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、米国特許第７，５８２，４２０号及び同第７，６１１，８６９号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に例示されるようなＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に使用されるプライマーを含み得る。

本開示の方法で使用され得る例示的な等温増幅方法としては、例えばＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：５２６１－６６（２００２）により例示される多置換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＭＤＡ）、又は例えば米国特許第６，２１４，５８７号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る他の非ＰＣＲベースの方法としては、例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５、米国特許第５，４５５，１６６号、及び同第５，１３０，２３８号、並びにＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１－９６（１９９２）に記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は例えば、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３：２９４－３０７（２００３）に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。等温増幅方法は、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大型断片、５’→３’エキソ－とともに使用することができる。これらのポリメラーゼの使用は、それらの高い加工性及び鎖置換活性を利用する。高い加工性により、ポリメラーゼは、１０～２０ｋｂの長さの断片を産生することが可能になる。上記のように、クレノウポリメラーゼなどの低いプロセッシビティと鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して、等温条件下でより小さな断片を産生することができる。増幅反応、条件、及び成分の更なる説明は、米国特許第７，６７０，８１０号の開示に詳細に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

Ｇ．配列決定
いくつかの実施形態では、方法は、増幅された断片の配列決定を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、インサートの全配列の配列決定を可能にする。インサートの全配列を生成する能力は、プライマーが結合する場所を越えたインサートの部分が直接標的化増幅により失われ得るので、直接標的化増幅（例えば、多重ＰＣＲ）を用いる方法とは対照的である。

本明細書に記載の濃縮方法後の配列決定は、様々な異なる方法を使用して行うことができる。

１つの例示的な配列決定方法論は、合成による配列決定（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）である。ＳＢＳにおいて、核酸テンプレートに沿った核酸プライマーの伸長を監視して、テンプレート中のヌクレオチド配列を判定する。基礎となる化学プロセスは、重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される）であり得る。特定のポリマーベースのＳＢＳの実施形態では、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマーに付加する（それによってプライマーを伸長させる）。

フローセルは、配列決定のための便利な固体支持体を提供する。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１つ以上の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つ以上の増幅された核酸分子を収容するフローセルに流入／通過させることができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドを組み込む部位は、検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、更なるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、脱ブロック作用因子が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないように、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加することができる。したがって、可逆的終端を使用する実施形態では、脱ブロック試薬をフローセルに送達することができる（検出発生の前又は後）。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルをｎ回繰り返してプライマーをｎ個のヌクレオチドで伸長し、それによって長さｎの配列を検出することができる。本開示の方法によって生成されるアンプリコンとともに使用するために容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

パイロシークエンシングなどの、サイクル反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれる際の、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４２（１），８４－９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１（５３７５），３６３（１９９８）、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、及び米国特許第６，２７４，３２０号、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出することができ、生成されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシークエンシング手順には必要ない。本開示に従って生成されたアンプリコンへのパイロシークエンシングの適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器、及び手順は、例えば国際公開第２０１２０５８０９６号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８（Ａ１）号、米国特許第７，５９５，８８３号、及び同第７，２４４，５５９号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）相互作用を介して、又はゼロモード導波路（zeromode waveguide、ＺＭＷ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースの配列決定のための技術及び試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９９，６８２－６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかのＳＢＳ実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組み込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術、又は、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３（Ａ１）号、若しくは米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７（Ａ１）号に記載されている配列決定方法及びシステムを使用することができ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。速度論的排除（kinetic exclusion）を使用して核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成することができる。

別の有用なシークエンシング技術は、ナノポアシークエンシングである（例えば、Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，１４７－１５１（２０００）；Ｄｅａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３５：８１７－８２５（２００２）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２：６１１－６１５（２００３）を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかのナノポアの実施形態では、核酸又は核酸から除去された個々のヌクレオチド個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸又はヌクレオチドがナノポアを通過するとき、各ヌクレオチドの種類は、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することによって識別され得る。（米国特許第７，００１，７９２号、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６－２００１（２００７）、Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９－４８１（２００７）、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８－８２０（２００８）、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。

本開示による検出に適用することができるアレイベースの発現及び遺伝子型解析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号、同第６，８９０，７４１号、同第６，９１３，８８４号、若しくは同第６，３５５，４３１号、又は米国特許公開第２００５／００５３９８０（Ａ１）号、同第２００９／０１８６３４９（Ａ１）号、若しくは同第２００５／０１８１４４０（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の方法の利点は、複数の核酸を並行して迅速かつ効率的に検出することを提供することである。したがって、本開示は、上記で例示されるものなどの当該技術分野において既知の技術を使用して核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又は配列決定試薬を１つ以上の固定化されたＤＮＡ断片に送達することができる流体構成要素を含むことができ、システムは、ポンプ、弁、リザーバ、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、核酸を検出するための統合システムで構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８（Ａ１）号及び同第２０１２／０２７０３０５（Ａ１）号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体構成要素の１つ以上を増幅方法及び検出方法に使用することができる。核酸配列決定の実施形態を一例として取ると、統合システムの流体構成要素の１つ以上を、本明細書に記載の増幅方法、及び上記に例示したような配列決定方法における配列決定試薬の送達に使用することができる。代替的に、統合システムは、増幅方法を実施し、検出方法を実施するための別々の流体システムを含み得る。増幅された核酸を作成し、また、核酸の配列を決定することができる統合配列決定システムの例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び米国公開第２０１２／０２７０３０５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の装置が挙げられるが、これらに限定されない。

ＩＩＩ．ヘアピンアダプター及びウラシル特異的除去試薬又は制限エンドヌクレアーゼを使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
本明細書に記載されるヘアピンアダプターは、いくつかの異なるワークフローにおいて使用することができる。例えば、様々な異なるワークフローを使用して、標的配列を含む断片の存在を増加させ、かつ／又は標的配列を含まない断片の存在を減少させることができる。

Ａ．ウラシルを含む核酸鎖及びウラシル特異的除去試薬
いくつかの制限酵素は、ウラシルを含む核酸鎖を切断することができない。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼ切断部位内のチミンを置換すると、エンドヌクレアーゼによる切断が阻害される（Ｇｌｅｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７（６）：１０８６－１０９０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、方法は、図２に示されるように、ウラシルを含み、制限酵素消化に対して耐性である核酸鎖を生成することを含む。

いくつかの実施形態では、ウラシルを含む核酸鎖中のウラシルは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位中のチミンを置換する。

いくつかの実施形態では、ウラシルを含む核酸鎖は、増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を含み、それによって、増幅プライマー配列及びそれに少なくとも部分的に相補的な配列を含む二本鎖核酸を制限エンドヌクレアーゼ切断に対して耐性にする。

いくつかの実施形態では、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、ウラシルを組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ）の使用を含む。ＵＳＥＲは、ウラシルを含む核酸鎖を切断することができる。

いくつかの実施形態では、伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することは、ウラシルを含む反応混合物を用いて行われる。いくつかの実施形態では、ウラシルを含む反応混合物を用いて生成された核酸鎖は、１つ以上のＵＳＥＲによって切断される。いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの活性を有する単一酵素である。

いくつかの実施形態では、ウラシルを含む反応混合物を用いて生成された核酸鎖は、制限エンドヌクレアーゼ消化に耐性である。

Ｂ．制限エンドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、方法は、標的配列を含まないライブラリー中の複数の二本鎖断片において、ヘアピンアダプターを制限エンドヌクレアーゼで切断することを更に含む。

いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、増幅プライマー配列の増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との会合によって形成された二本鎖核酸において、切断する。

いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、アダプター配列のアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列との会合によって形成された二本鎖核酸で切断する（例えば、図２におけるＡ１４／Ａ１４’の切断を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼによる切断の効率は、エンドヌクレアーゼの切断部位を含む二本鎖ＤＮＡ配列に含まれるウラシルの量が増加するにつれて減少する。いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ウラシルを含む１つ以上の二本鎖核酸を切断することができない。

いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、チミンを含む。いくつかの実施形態では、核酸鎖へのウラシルの組み込みは、以前は制限エンドヌクレアーゼ切断部位であった配列を変化させ、それによって、鎖及びその相補体を切断から保護する。いくつかの実施形態では、制限酵素はヘアピンアダプターを切断し、オーバーハングを生成する。いくつかの実施形態では、制限酵素はヘアピンアダプターを切断し、平滑末端を生成する。

Ｃ．ＵＳＥＲと、少なくとも部分的に相補的である２つ以上のセットの配列を含むヘアピンアダプターと、を含む方法
いくつかの実施形態では、二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法は、配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、二本鎖核酸を含むインサートと、二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、ヘアピンアダプターが、第１のセットのヌクレオチド配列であって、第１のセットのヌクレオチド配列がアダプター配列及びアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、第１のセットのヌクレオチド配列と、第２のセットのヌクレオチド配列であって、第２のセットのヌクレオチド配列が、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、第１のセットのヌクレオチド配列が、第２のセットのヌクレオチド配列よりもインサートに近い、第２のセットのヌクレオチド配列と、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間のリンカーと、を含む、調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、配列決定ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する第１の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、核酸鎖を生成するための反応混合物が、ウラシルを含み、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、第１の伸長プライマーを除去することと、ＵＳＥＲを提供することと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、（１）二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、（２）増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。かかる方法の代表的な例を、図２に示す。

いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列の相補体及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間のリンカーは、エキソヌクレアーゼ耐性である。

いくつかの実施形態では、増幅プライマー配列の相補体及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間のリンカーは、ウラシルを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、第１のプライマーを使用して核酸鎖を生成した後、ヘアピンアダプターを制限エンドヌクレアーゼで切断することを更に含み、当該ヘアピンアダプターがライブラリーの二本鎖断片に含まれ、アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部が、存在し、ウラシルを含まない。

いくつかの実施形態では、第１のプライマー伸長を使用して生成された核酸鎖は、ウラシルを含み、制限エンドヌクレアーゼ消化に耐性である。

いくつかの実施形態では、ヘアピンアダプターは、増幅プライマー配列と増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間にリンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、このリンカーは、エキソヌクレアーゼによって分解可能ではない。いくつかの実施形態では、このリンカーは、合成である。いくつかの実施形態では、このリンカーはウラシルを含むか、又はそうでなければポリメラーゼ活性を停止させるように作用する。

いくつかの実施形態では、ＵＳＥＲは、第１のプライマー伸長によって生成された核酸鎖、ヘアピンアダプターに含まれたリンカー、及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列を切断する。いくつかの実施形態では、第１のプライマー伸長によって生成された核酸鎖、ヘアピンアダプターに含まれたリンカー、及び／又はアダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列は、１つ以上のウラシルを含む。

いくつかの実施形態では、第１及び第２の伸長プライマーは、異なる配列に結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の伸長プライマーは、二本鎖核酸の同じ鎖に結合する。

いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、当該プライマーを使用して核酸鎖を生成した後に除去される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ及び／又は第２の伸長プライマーは、ＳＰＲＩビーズを使用して除去される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱感受性ポリメラーゼであり、変性させることによって除去される。いくつかの実施形態では、熱感受性ポリメラーゼは、完全長のＢｓｔ又はＤＮＡポリメラーゼＩである。

ＩＶ．ヘアピンアダプター及び複数の伸長プライマーのライゲーションを使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
いくつかの実施形態では、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法は、配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、二本鎖核酸を含むインサートと、二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、ヘアピンアダプターが、増幅プライマー配列及び増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、調製することと、二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、プライマーミックスと、ライゲーション活性及びポリメラーゼ活性を有し、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない、１つ以上の酵素と、を使用し、プライマーミックスの第１の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、プライマーミックスが、第１の伸長プライマー及びブロックされた第２の伸長プライマーを含み、第１の伸長プライマー及びブロックされた第２の伸長プライマーが、二本鎖核酸に含まれた目的の異なる配列に結合し、第１の伸長プライマーを使用して生成された核酸鎖を、ブロックされた第２の伸長プライマーにライゲーションすることと、インサートに結合していないプライマーミックスを除去することと、ブロックされた第２の伸長プライマーを脱ブロックすることと、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、（１）ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、（２）増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列の全部又は一部を除去することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ブロックされた第２の伸長プライマーは、それが脱ブロックされない限り、核酸鎖を生成することができない。いくつかの実施形態では、ブロックされた第２の伸長プライマーは、ブロックを含み、そのため、ブロックが除去されない限り、伸長が起こり得ない。いくつかの実施形態では、ブロックは、ブロックされた第２のプライマー上の３’リン酸の存在である。いくつかの実施形態では、ブロックされた第２のプライマーは、３’リン酸を切断するキナーゼによって脱ブロックされる。いくつかの実施形態では、脱ブロックされた第２の伸長プライマーは、核酸鎖を生成することができる。

いくつかの実施形態では、ブロックされた第２の伸長プライマーは、少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列及び第１の伸長プライマーによって結合された配列の５’に結合する。

いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、６０℃未満の融解温度でインサートに結合する。言い換えれば、第２の伸長プライマーは、インサートに対して比較的弱い結合を有し得る。言い換えれば、第２の伸長プライマーは、第２の伸長プライマーがブロックされているか否かにかかわらず、インサートに対して比較的弱い結合を有し得る。いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、６０℃超、６５℃超、又は７０℃超の温度でインサートから解離する。

いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマー及びポリメラーゼは、「ホットスタート」伸長プロトコルが使用される場合、標準的な伸長プロトコルと比較して、より少ない核酸鎖を生成する。いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマー及びポリメラーゼは、温度が６０℃超、６５℃超、又は７０℃超である場合、より少ない核酸鎖を生成する。いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマー及びポリメラーゼは、６０℃超、６５℃超、又は７０℃超の温度で核酸鎖を生成することができない。

いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーは、６０℃以上の融解温度でインサートに結合する。言い換えれば、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーは、インサートに対して比較的強い結合を有し得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーは、６０℃超、６５℃超、又は７０℃超の温度でインサートと会合したままである。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することは、６０℃以上の温度で行われる。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することは、６０℃以上、６５℃以上、又は７０℃以上の温度で行われる。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーのアニーリング及び伸長温度は、第２の伸長プライマーの融解温度を上回る。

いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、増幅する前に除去される。いくつかの実施形態では、第２の伸長プライマーは、ＳＰＲＩビーズ又はエキソヌクレアーゼを使用して除去される。

実施例１．ヘアピンアダプターを使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
ヘアピンアダプターを用いる方法を使用して、配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮することができる。図１は、例示的な二本鎖断片１２を示し、これは、それぞれ異なるインサート１４を有する複数の断片１２から形成された配列決定ライブラリーの代表的な断片である。各断片１２は、両端にアダプター１８を含む。図示された実施形態では、アダプター１８は同じである。アダプターは、第１の鎖２２及び第２の鎖２３を有するフォークアダプターである。第１の鎖２２及びその第２の鎖２３は、二本鎖領域２４を形成する。第１の鎖はまた、ヘアピン二本鎖領域２６を有するヘアピン領域２５と、二本鎖領域２６の自己相補的部分の間に配置されたリンカー２７と、を含む。

図１の特定の例では、ヘアピン領域２５は、Ａ１４及びその相補体Ａ１４’を含む。二本鎖領域２６内のＡ１４／Ａ１４’の塩基対形成は、ヘアピン領域２５がインタクトである場合、Ａ１４プライマー配列が増幅プライマーへの結合に利用できないことを意味する。この例では、ヘアピン領域２５の二本鎖領域２６は、Ａ１４プライマー配列及びその相補体（Ａ１４’）を含む。

図１に示されるワークフローは、断片１２を変性させてプラス鎖及びマイナス鎖を得る工程を含む。図示された例では、マイナス鎖２８が示されている。しかしながら、ワークフロー工程は、実施形態ではプラス鎖にも適用されることが理解されるべきである。断片１２が目的の標的化インサート１４ａを含む場合、鎖２８ａは、標的化インサート１４ａの部分に相補的である伸長プライマー２９に結合する。ヘアピン領域２５のＡ１４’配列は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ３０（例えば、Ｔａｑ）を使用して除去される。ポリメラーゼ３０は、以前は二本鎖であった領域２６を一本鎖にし、Ａ１４配列を利用可能にする。

次いで、ポリメラーゼ３０を除去する。第１の増幅プライマー３６からの完全な伸長は、鎖２８ａをコピーすることが可能であり、第２の増幅プライマー３８は、標的配列を含むインサートを含む断片を特異的に増幅するために、生成された核酸鎖中のＡ１４’に結合する。この方法では、ヘアピンアダプターを含まない断片（断片生成の失敗による）、又は鎖２８ｂなどの断片若しくは鎖の増幅はなく、ヘアピンアダプター及びヘアピン領域２５は「ロック」されている（すなわち、ヘアピンのＡ１４配列及びＡ１４’配列が互いに会合している）。ロックされたヘアピンは、ポリメラーゼがＡ１４を越えて伸長するのを妨げる。したがって、ヘアピンを含む断片は、Ａ１４’を含む核酸鎖を生成することができず、したがって、Ａ１４プライマーによって増幅することができない。この方法における伸長プライマーの長さは、インサート配列を含むインサートへの結合に対する特異性を確実にするために増加され得る。ｉ５及びｉ７配列は、インデックス配列を表し、これは、アレイ内の試料及び位置を識別するために使用され得る。ＭＥ＝モザイク末端配列（トランスポザーゼがトランスポゾンを標的配列に組み込むのに必要なトランスポゾン中の配列）、及びＭＥ’＝モザイク末端配列の相補体。増幅により、それぞれの末端に異なる配列決定プライマー及びインデックスを有する標的化インサート１４を含む全長産物５０が得られる。

配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するために、ユーザは、二本鎖ＤＮＡ中の１つ以上の標的配列に結合する伸長プライマー（すなわち、標的プローブ）を生成することができる。ライブラリー生成及びタグ付けの公知の手段（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ、Ｔｒｕｓｅｑなど）を使用して、ヘアピン含有アダプター１８を二本鎖断片の一方又は両方の５’末端に付加することができる。

ライブラリーの二本鎖断片を変性させることができる。次いで、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して、（１）二本鎖断片のライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、（２）Ａ１４’配列の全て又は一部を除去することができる。

ヘアピンのＡ１４’配列が除去された（すなわち、ヘアピンがロック解除された）断片では、次いで、増幅プライマーを使用して、ロック解除されたヘアピンアダプターを有する断片を選択的に増幅することができる。この方法を使用して、ロック解除されたヘアピンを有する断片のみが増幅される。ヘアピンのＡ１４’配列の全部又は一部がインタクトであるヘアピンを含む断片は、増幅されない。図１に示される非標的インサート１４ｂを含む増幅されていない例では、ヘアピンアダプター中のＡ１４配列は、相補的Ａ１４’配列と塩基対を形成する。ヘアピンアダプターがインタクトである場合、増幅プライマーは、「ロックされた」ヘアピン二次構造のために、増幅プライマー配列に結合することができない。したがって、非標的インサートは、増幅されない。

図１に示される方法では、第１の鎖が増幅される場合（Ｂ１５’を含むプライマーを使用して）、Ａ１４’を含む核酸鎖が生成される（破線として示されている）。ライブラリー断片から新たに生成された鎖を変性させた後、Ａ１４を含む増幅プライマーは、次いで、増幅のためのＡ１４’に結合することができる（図１の破線鎖へのＡ１４の結合として示されている）。

実施例２．ヘアピンアダプター及びＵＳＥＲ試薬を使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮は、「二重ロック解除（double unlock）」法を使用して行うことができる（図２）。この代表的な方法では、ヘアピン領域２５は、リンカー２７を含み、これは、ウラシル又はＸ’配列にウラシルを含むものなどの合成リンカー６０である。標的化インサート１４ａ中の標的配列に結合する２つの伸長プライマー（ｆｗｄ１ ６２及びｆｗｄ２ ６４）を逐次使用することで、「二重ロック解除」を使用する（逐次、Ａ１４’を除去し、次いでＸ’を除去する）ことによって、配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮の増加を可能にする。この逐次法では、第１の核酸鎖は、ウラシルを含む。制限エンドヌクレアーゼを使用して、ヘアピンアダプター中のＡ１４／Ａ１４’配列を切断することができる。ここでは、Ａ１４’配列は除去されておらず、ウラシルを含む配列で置換されている。制限エンドヌクレアーゼ工程を使用して、標的配列を含まないインサート（すなわち、「非標的化インサート」を含む断片）を除去することができる。

この方法を使用して、特異性を増加させるための方法における工程に基づいて、配列決定ライブラリーから標的配列を更に濃縮することができる。この方法は、２つの伸長プライマー（ｆｗｄ１及びｆｗｄ２）を使用し、これらは両方とも、標的配列に結合することができ、単一のインサートに含まれ得る。言い換えれば、ｆｗｄ１及びｆｗｄ２は、二本鎖ＤＮＡ試料において空間的に近い標的配列に結合することができる。

この方法におけるヘアピンアダプターは、２セットの相補的な核酸（図２におけるＡ１４／Ａ１４’及びＸ／Ｘ’）を含む。この実施形態では、Ａ１４は、アダプターであり（Ａ１４’は、その相補体である）、Ｘは、増幅プライマー配列である（Ｘ’は、その相補体である）。更に、Ｘ’及び／又はＸ’とＡ１４’との間のリンカーは、ウラシルを含むか、又はそうでなければエキソヌクレアーゼ耐性である。

ライブラリー断片を変性させ、伸長プライマーを添加する（ｆｗｄ１）。次いで、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）を使用して、（１）ｆｗｄ１を使用して核酸鎖が生成され、ここで、核酸鎖を生成するための反応混合物は、ウラシルＮＴＰを含み、（２）Ａ１４’の全て又は一部が除去される。したがって、生成された核酸鎖は、ウラシルを含み、制限エンドヌクレアーゼ切断に耐性である。

ｆｗｄ１プライマーを除去する（エキソヌクレアーゼ又はＳＰＲＩビーズによって）。

更に、制限酵素は、Ａ１４’が除去されず、ウラシルを含む核酸鎖で置換された任意のヘアピンアダプターを切断することができる。図２に示されるように、ウラシルを含む核酸鎖は、制限エンドヌクレアーゼによる切断からＡ１４配列をブロックすることができる。対照的に、ウラシルを含む核酸鎖が生成されなかったライブラリー断片上のヘアピンアダプター（すなわち、ｆｗｄ１プライマーに結合しなかったインサートを含む断片）は、制限エンドヌクレアーゼによって切断される。

次いで、ＵＳＥＲを使用して、ウラシル及び／又は合成リンカー（Ａ１４’とＸ’との間）若しくはＸ’中のウラシルを含む核酸鎖を切断することができる。次いで、ｆｗｄ２プライマーが結合し得、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）を使用して、（１）標的配列に結合するｆｗｄ２を使用して核酸鎖を生成し、（２）Ｘ’の全て又は一部が除去する。Ｘ’が除去されると、Ｘに結合する増幅プライマーを使用することができ、ｆｗｄ１及びｆｗｄ２の両方に結合することができるインサートを含む断片を選択的に増幅することができる。この方法は、ｆｗｄ１及びｆｗｄ２プライマーによって媒介される別々のロック解除工程（Ａ１４’及び次いでＸ’を除去すること）を含み、また、ウラシルを含まないＡ１４／Ａ１４’を含むインタクトなヘアピンアダプターの制限エンドヌクレアーゼ切断も含むため、特異性を高めた。

実施例３．ヘアピンアダプター及び２つの伸長プライマーのライゲーションを使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
この方法では、２つの伸長プライマー８０、８２（ｆｗｄ１及びｆｗｄ２）が使用され、これらは両方とも、目的のインサート内の標的配列に結合する。すなわち、図３に示されるように、ｆｗｄ１及びｆｗｄ２伸長プライマーは、それぞれ、個々の標的化インサート配列１４ａの異なる領域（例えば、非隣接領域）に結合する。エキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼ及びリガーゼを使用して、ライゲーションされたｆｗｄ１及びｆｗｄ２構造８４が生成される。このライゲーションされたプライマーは、ｆｗｄ２が脱ブロックされた後、ホットスタート伸長反応のために使用され得る。すなわち、ｆｗｄ２プライマーは、伸長を媒介し得ないようにブロックされる。この場合、最初の伸長は、リガーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼを含む酵素混合物を用いて行われる。エキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼとリガーゼとのかかる混合物は、ＥＬＭ混合物（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ ＰＣＲ－Ｆｒｅｅライブラリー調製キット＃１０００００００８６９２２において提供されるもの）であり得る。したがって、ｆｗｄ１からの伸長は、ｆｗｄ２を切断することなく、ｆｗｄ１とｆｗｄ２との間の核酸鎖をライゲーションする。

ライゲーションされたｆｗｄ１－ｆｗｄ２プライマーは、ライゲーションされたプライマーとインサートとの間の多数の対合したヌクレオチドに基づいて、インサートに高い親和性で結合するであろう。その後、ｆｗｄ２上のブロックを除去することができる。

ｆｗｄ２プライマーは、６０℃未満の融解温度を有するように、その標的配列に対して比較的低い親和性を有するように設計することができる。このようにして、「ホットスタート」伸長反応（６０℃以上の温度で開始する）は、ｆｗｄ２プライマーが核酸鎖を生成する前にインサートから解離することを意味する。対照的に、ライゲーションされたｆｗｄ１－ｆｗｄ２脱ブロックされたプライマーは、より高い温度で結合されたままであり、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して、（１）ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を産生し、（２）Ａ１４’の全て又は一部を除去することを媒介する。

この方法を使用して、配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮は、ｆｗｄ１及びｆｗｄ２の両方を用いて行われる。したがって、この方法は、ｆｗｄ１に結合する標的配列とｆｗｄ２に結合する標的配列とを含む目的の断片を選択的に増幅するためのより高い特異性を有する。

実施例４．ヘアピンアダプター及び連結された伸長プライマーを使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
図４に示される別の例において、２つのプライマー９０、９２は、リンカー９４を介して連結され、リンカー９４は、一実施形態では、標的化インサート配列に相補的ではなく、連結された伸長プライマー構造９６を形成する。図４にｆｗｄ１及びｆｗｄ２として示されるプライマー９０、９２は、標的化インサート配列の２つの異なる非隣接領域に相補的である。リンカーがハイブリダイズせず、したがって融解温度に著しく寄与しないので、ラ連結された伸長プライマー構造の融解温度は、図４に示されるようにｆｗｄ１’及びｆｗｄ２’プライマーに対する相補配列にハイブリダイズする場合の融解温度によって支配される。

アニーリング及び伸長は、ｆｗｄ１又はｆｗｄ２伸長プライマー単独の融解温度よりも高い融解温度で起こり得る。溶融温度は、ｆｗｄ１又はｆｗｄ２プライマーの一方のみが相補配列を有する場合、連結された伸長プライマー構造が結合できないように十分に高い。両方のプライマーが標的化インサート配列に結合することができる場合、連結された伸長プライマー構造は、伸長のために結合したままであり得る。したがって、存在する２つの別個の配列のより高い特異性要件が実現される。ヘアピンアダプターの二本鎖部分を除去して、示されるような５’Ａ１４配列を曝露又はロック解除するために、本明細書で一般的に考察されるエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用する伸長反応において、結合した連結された伸長プライマー構造を使用することができる。

リンカーは、２つの異なるプライマーを連結するユニバーサル配列であり得る。複数の異なる標的化インサート配列のための反応混合物を生成するために、第１及び第２のプライマーの各異なるセットは、それぞれの目的の標的配列に特異的であり得る。したがって、各々の異なる標的配列は、特異的な第１のプライマー及び特異的な第２の伸長プライマーを有し得る。しかしながら、全てのセットのライゲーション配列は、各第１プライマーをその対応する第２プライマーと連結するために使用される同じ配列であってもよい。この配置により、共通のリンカー配列によって連結されるより短い特異的配列を比較的安価にカスタム製造することが可能になる。リンカーは、リンカーが標的化インサート配列に結合しないように設計することができる。

実施例５．ライゲーションされた二本鎖アダプターを使用した配列決定ライブラリーからの標的配列の濃縮
本明細書で考察される特定の実施形態はヘアピンアダプターに関するが、他の実施形態は、図５に示されるように、伸長媒介二本鎖アダプターライゲーションを用いて実施され得る。図５は、インサート１４を有するライブラリー断片１２間の比較を示し、いくつかの断片１２は、標的化インサート配列１４ａを有し、他の断片１２は標的化インサート配列１４ｂを有しない。

断片１２は、末端アダプター１００を有する。各末端アダプターは、第１の鎖１０１及び第２の鎖１０２を含む。第１の鎖１０１及び第２の鎖１０２の部分は相補的であり、二本鎖領域１０３を形成する。第２の鎖１０２の別の部分は、二本鎖領域１０３の３’終端から離れて伸長する一本鎖３’終端領域１０４を含む。図５の図示された例におけるアダプター１００は、ヘアピンを含まない。

分離した鎖を形成するための断片の変性は、標的化インサート１４ａを含む鎖１１２ａに特異的にハイブリダイズする標的特異的伸長プライマー１１０の結合を可能にする。標的配列を含まないインサート１４ｂを有する他の鎖１１２ｂは、反応条件下でプライマー１１０に結合しない。一実施形態では、方法は、それぞれの異なる標的配列に対して異なる配列を有する複数の標的特異的伸長プライマー１１０と併せて使用され得る。

プライマー１１０からの相補鎖の伸長は、相補鎖と、非標的インサート１４ｂを有する他の鎖１１２ｂ上に存在しない二本鎖末端１２０を有する鎖１１２ａとの二重鎖を生成する。二本鎖末端１２０は、Ａオーバーハングを付加するために伸長されて、続いて、二本鎖アダプター１２４にライゲーションされ得る。鎖１１２ａの５’末端でのライゲーションは、５’末端をアダプター付加（adaptorize）し、次いで、これを増幅して、標的化インサート１４ａを含有する本明細書で提供される異なる末端アダプターを有する完全長産物１３０を得ることができる。例えば、完全長産物の各鎖は、５’末端に第１の増幅プライマー配列及び３’末端に第２の増幅プライマー配列を有することができる。増幅は、本明細書で考察されるように、インデックス化プライマーを使用してもよい。図示された例は、Ａオーバーハングライゲーションを示すが、二本鎖末端１２０は、平滑二本鎖アダプターへの平滑二本鎖非鋳型ライゲーションであってもよい。

図示された方法では、非標的インサート１４ｂを有する鎖１１２ｂは増幅されない。プライマー１１０についての結合事象は存在せず、したがって、二本鎖末端を生成するための伸長はない。したがって、プライマーセットの単一のプライマー３６のみが非標的鎖１１２ｂに結合することができ、非標的鎖の増幅はない。

実施例６．ヘアピンアダプター及び対照アダプターを使用したライブラリー増幅の結果
ヘアピン領域内に結合するプライマーとフォーク領域内に結合するプライマー（陽性対照）を使用して、ライゲーションされたヘアピンアダプターのＰＣＲ増幅の効果を試験するために実験を設計した。モデル８０ｍｅｒオリゴヌクレオチド二本鎖ＤＮＡ鋳型を、リン酸化５’末端を有する３’単一Ａ－オーバーハングを含むように合成した。このモデル鋳型は、二本鎖ＤＮＡ試料インサートの単純なモデルとして機能した。この鋳型に、２つの異なるアダプタータイプを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＬＩＧ２試薬を使用して、３０℃で１０分間ライゲーションした。対照二重鎖オリゴは１ｕＭであり、アダプターは９ｕＭであった。最初に、二重鎖ＭＥ領域、内部配列ＣＰＨ４’、並びに一方のフォーク上にＢ１５’、及び他方のフォーク上にＡ１４を含有する対照アダプタータイプを使用した（図７対照アダプターを参照されたい）。他のアダプター型は、同じＭＥ二重鎖領域、対照アダプターと同じ上部鎖を含有したが、フォークの下部鎖は、追加の内部配列（ＣＰＨ３）及びＡ１４のヘアピンを含有した。アダプターを９５℃で変性させた後、氷上で急速冷却して、Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＮａＣｌ中に５０μＭのストックを形成した。Ａ１４とＡ１４’との間のヘアピン配列は、５塩基長であったことに留意されたい。別々のライゲーション反応で各アダプターを付加して、二重鎖の各末端に対照アダプター又はヘアピンアダプターのいずれかを有するライゲーションされた二重鎖を作製した。ＰＣＲ増幅は、内側プライマー（対照フォークアダプターについてはＣＰＨ４－ＭＥ及びＡ１４－ｉ５－Ｐ５、並びにヘアピンアダプターについてはＣＰＨ４－ＭＥ及びＣＰＨ３－ＭＥ）又は外側プライマー（両方のアダプターについてはＡ１４－ｉ５－Ｐ５及びＢ１５－ｉ７－Ｐ７）のいずれかを用いて行った。ライゲーションされた鋳型を７．５倍に希釈し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲミックス（ＥＰＭ）中でＰＣＲ試薬と混合した。増幅は、最初に９５℃で３分間変性させ、続いて、伸長温度の温度勾配（７２℃～６０℃）を用いて、９５℃で２０秒間、６０℃で１５秒間を８サイクル行った。Ｔｈｅに続いて、７２℃で５分間の最終伸長を行い、次いで、４℃にした。増幅産物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００ ＨＳ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎを使用して定量した。

図６は、伸長温度対ピークモル濃度の４つのパネルを示し、図７は、図６の結果を生成するために使用された対照及びヘアピンアダプター構造を示す。伸長温度勾配からはほとんど効果が見られないが、最も低い収量の増幅産物は、外側プライマーを用いて増幅された場合、ヘアピンアダプターを用いて明らかに見られる（右下パネル）。ヘアピンアダプターについての対照内側プライマーは、産物が、内側プライマーを用いてライゲーションされたアダプター鋳型から増幅され得ることを明確に示し、ヘアピンアダプターのライゲーションを確認する。非ヘアピンアダプターライブラリーについては、ＰＣＲが内側及び外側プライマー対から使用される場合、同様の収率が観察される。これらのデータは、ヘアピン（この場合、Ａ１４）に含まれるプライマー対が使用される場合、ヘアピンアダプター配列がＰＣＲ増幅を阻害することを示唆する。言い換えれば、ヘアピンのロックされた構成が増幅を妨げる。

均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。

本明細書で使用するとき、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、割合、及び百分率を含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを変更する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。

Claims (91)

1. 核酸配列決定ライブラリーを調製する際に使用するためのアダプターであって、
   ａ．５’末端及び３’末端を有する第１の鎖と、
   ｂ．５’末端及び３’末端を有する第２の鎖と、を含み、
   前記第１の鎖の前記３’末端の部分及び前記第２の鎖の前記５’末端の部分が、相補的であり、第１の二本鎖領域を形成し、
   前記第１の鎖の前記５’末端の部分及び前記第２の鎖の前記３’末端の部分が、非相補的であり、
   前記第１の鎖の前記５’末端の前記部分が、第２の二本鎖領域を含む、アダプター。
2. 前記第２の二本鎖領域が、ヘアピン構造である、請求項１に記載のアダプター。
3. 前記第２の二本鎖領域が、非核酸部分を含む、請求項１又は２に記載のアダプター。
4. 前記非核酸部分が、リンカーである、請求項３に記載のアダプター。
5. 前記第１の鎖の前記５’末端が、エキソヌクレアーゼによって分解可能でないリンカー部分を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のアダプター。
6. 前記第１の二本鎖領域が、少なくとも５つの連続したヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載のアダプター。
7. 前記第２の二本鎖領域が、少なくとも５つの連続したヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載のアダプター。
8. 前記第２の鎖の前記５’末端が、リン酸化されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のアダプター。
9. 前記第１の鎖及び前記第２の鎖における全てのシトシン塩基が、メチル化されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のアダプター。
10. 前記アダプターが、捕捉部分を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のアダプター。
11. 核酸配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
    ａ．複数の二本鎖核酸断片を生成することと、
    ｂ．請求項１～１０のいずれか一項に記載のアダプターを、前記複数の二本鎖核酸断片の少なくとも１つの末端に結合させることと、を含む、方法。
12. 前記アダプターが、タグメンテーションを介して結合している、請求項１１に記載の方法。
13. 前記アダプターが、ライゲーションを介して結合している、請求項１１に記載の方法。
14. 核酸配列決定ライブラリーを調製するためのキットであって、
    ａ．請求項１～１０のうちのいずれか一項に記載のアダプターと、
    ｂ．前記アダプターの部分にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのプライマーと、
    ｃ．少なくとも１つの酵素と、
    ｄ．ｄＮＴＰと、を含む、キット。
15. 前記少なくとも１つの酵素が、エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１４に記載のキット。
16. 前記少なくとも１つの酵素が、ポリメラーゼである、請求項１４又は１５に記載のキット。
17. 少なくとも１つの構成要素が、凍結乾燥又は乾燥形態にある、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のキット。
18. 二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法であって、
    ａ．前記配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、
    ｉ．二本鎖核酸を含むインサートと、
    ｉｉ．前記二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターであって、前記ヘアピンアダプターが増幅プライマー配列及び前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヘアピンアダプターと、を含む、調製することと、
    ｂ．前記二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、
    ｃ．５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、
    ｉ．前記配列決定ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する１つ以上の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、
    ｉｉ．前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列の全部又は一部を除去することと、を含む、方法。
19. 前記増幅プライマー配列に結合する増幅プライマーを使用して断片を増幅することを更に含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ヘアピンアダプターが、前記増幅プライマー配列と前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との間にリンカーを更に含み、かつ／又は前記２つ以上の伸長プライマーが、リンカーを介して結合している、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記リンカーが、エキソヌクレアーゼによって分解可能ではない、請求項２０に記載の方法。
22. 前記５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Ｔａｑである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記１つ以上の伸長プライマー及び／又は伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成するために使用される前記ポリメラーゼが、伸長後に除去される、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記１つ以上の伸長プライマー及び／又は伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成するために使用される前記ポリメラーゼを除去することが、固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズによって、かつ／又は熱感受性ポリメラーゼを変性させることによって生じる、請求項２３に記載の方法。
25. １つ以上の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することが、ウラシルを含む反応混合物を用いて行われる、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ウラシルを含む反応混合物を用いて生成された前記核酸鎖が、１つ以上のウラシル特異的除去試薬（ＵＳＥＲ）によって切断される、請求項２５に記載の方法。
27. ＵＳＥＲが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項２６に記載の方法。
28. ＵＳＥＲが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの活性を有する単一酵素である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ライブラリー中の複数の二本鎖断片が、前記標的配列を含まない、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ヘアピンアダプターが前記ライブラリーの二本鎖断片に含まれ、前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列の全部又は一部が存在する、請求項１８～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記標的配列を含まない前記ライブラリー中の複数の二本鎖断片において、前記ヘアピンアダプターを制限エンドヌクレアーゼで切断することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
32. ウラシルを含む反応混合物を用いて生成された前記核酸鎖が、制限エンドヌクレアーゼ消化に耐性である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記制限エンドヌクレアーゼが、前記増幅プライマー配列の前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との会合によって形成された二本鎖核酸において、切断する、請求項３２に記載の方法。
34. 二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法であって、
    ａ．前記配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、
    ｉ．二本鎖核酸を含むインサートと、
    ｉｉ．前記二本鎖断片の一方又は両方の鎖の前記５’末端におけるヘアピンアダプターと、を含み、前記ヘアピンアダプターが、
    １．第１のセットのヌクレオチド配列であって、前記第１のセットのヌクレオチド配列がアダプター配列及び前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、第１のセットのヌクレオチド配列と、
    ２．第２のセットのヌクレオチド配列であって、前記第２のセットのヌクレオチド配列が増幅プライマー配列及び前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含み、
    前記第１のセットのヌクレオチド配列が前記第２のセットのヌクレオチド配列よりも前記インサートに近い、第２のセットのヌクレオチド配列と、
    ３．前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列と前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との間のリンカーと、を含む、調製することと、
    ｂ．前記二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、
    ｃ．５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、
    ｉ．前記配列決定ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた前記標的配列に結合する第１の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、前記核酸鎖を生成するための前記反応混合物が、ウラシルを含み、
    ｉｉ．前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列の全部又は一部を除去することと、
    ｄ．前記第１の伸長プライマーを除去することと、
    ｅ．ＵＳＥＲを提供することと、
    ｆ．５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、
    ｉ．二本鎖断片の前記ライブラリー中の少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列に結合する第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、
    ｉｉ．前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列の全部又は一部を除去することと、を含む、方法。
35. 前記増幅プライマー配列に結合する増幅プライマーを使用して断片を増幅することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記増幅プライマー配列の前記相補体及び／又は前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列と前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との間の前記リンカーが、エキソヌクレアーゼによって分解可能ではない、請求項３４又は３５に記載の方法。
37. 前記増幅プライマー配列の前記相補体及び／又は前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列と前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との間の前記リンカーが、ウラシルを含む、請求項３６に記載の方法。
38. 前記第１のプライマーを使用して核酸鎖を生成した後、前記ヘアピンアダプターを制限エンドヌクレアーゼで切断することを更に含み、前記ヘアピンアダプターが前記ライブラリーの二本鎖断片に含まれ、前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列の全部又は一部が存在する、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記第１のプライマー伸長を使用して生成された前記核酸鎖が、ウラシルを含み、制限エンドヌクレアーゼ消化に耐性である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記ヘアピンアダプターが、前記増幅プライマー配列と前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列との間にリンカーを更に含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記リンカーが、エキソヌクレアーゼによって分解可能でない、請求項４０に記載の方法。
42. ＵＳＥＲが、第１のプライマー伸長によって生成された前記核酸鎖、前記ヘアピンアダプターに含まれた前記リンカー、及び／又は前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列を切断する、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. ＵＳＥＲが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項４２に記載の方法。
44. ＵＳＥＲが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの活性を有する単一酵素である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記第１及び第２の伸長プライマーが、異なる配列に結合する、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記第１及び第２の伸長プライマーが、前記二本鎖核酸の同じ鎖に結合する、請求項４５に記載の方法。
47. 前記５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Ｔａｑである、請求項３４～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記ポリメラーゼが、断片を増幅する前に除去される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記第２の伸長プライマーが、前記プライマーを使用して核酸鎖を生成した後に除去される、請求項３４～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記ポリメラーゼ及び／又は第２の伸長プライマーが、ＳＰＲＩビーズを使用して、かつ／又は熱感受性ポリメラーゼを変性させることによって除去される、請求項４８又は４９に記載の方法。
51. 二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法であって、
    ａ．前記配列決定ライブラリーを調製することであって、各断片が、
    ｉ．二本鎖核酸を含むインサートと、
    ｉｉ．前記二本鎖断片の一方又は両方の鎖の５’末端におけるヘアピンアダプターであって、前記ヘアピンアダプターが増幅プライマー配列及び前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヘアピンアダプターと、を含む、調製することと、
    ｂ．前記二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を形成することと、
    ｃ．プライマーミックスと、ライゲーション活性及びポリメラーゼ活性を有し、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない、酵素のミックスと、を使用し、
    ｉ．プライマーミックスの第１の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、前記プライマーミックスが、第１の伸長プライマー及びブロックされた第２の伸長プライマーを含み、前記第１の伸長プライマー及び前記ブロックされた第２の伸長プライマーが、前記二本鎖核酸に含まれた目的の異なる配列に結合し、
    ｉｉ．前記第１の伸長プライマーを使用して生成された前記核酸鎖を、前記ブロックされた第２の伸長プライマーにライゲーションすることと、
    ｄ．インサートに結合していないプライマーミックスを除去することと、
    ｅ．前記ブロックされた第２の伸長プライマーを脱ブロックすることと、
    ｆ．５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用し、
    ｉ．ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成し、
    ｉｉ．前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列の全部又は一部を除去することと、を含む、方法。
52. 前記増幅プライマー配列に結合する増幅プライマーを使用して断片を増幅することを更に含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記ヘアピンアダプターが、前記増幅プライマー配列と前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との間にリンカーを更に含む、請求項５１又は５２に記載の方法。
54. 前記リンカーが、エキソヌクレアーゼによって分解可能でない、請求項５３に記載の方法。
55. 前記ブロックされた第２の伸長プライマーが、脱ブロックされない限り、核酸鎖を生成することができない、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記ブロックされた第２の伸長プライマーが、少なくとも１つのインサートに含まれた標的配列及び前記第１の伸長プライマーによって結合された前記配列の５’に結合する、請求項５５に記載の方法。
57. 前記ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーのアニーリング及び伸長温度が、前記第２の伸長プライマーの融解温度を上回る、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記ブロックされた第２の伸長プライマーが、６０℃未満の融解温度で前記インサートに結合し、かつ／又は前記ライゲーションされた第１及び第２の伸長プライマーを使用して核酸鎖を生成することが、６０℃以上の温度で行われる、請求項５７に記載の方法。
59. 前記第２の伸長プライマーが、増幅の前に除去される、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 前記第２の伸長プライマーが、ＳＰＲＩビーズ又はエキソヌクレアーゼを使用して除去される、請求項５９に記載の方法。
61. １つ以上の伸長プライマーが、遺伝子特異的プライマーである、請求項１８～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. 前記ヘアピンアダプターが、二本鎖断片の一方の鎖の前記５’末端にある、請求項１８～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. 前記ヘアピンアダプターが、二本鎖断片の両方の鎖の前記５’末端にある、請求項１８～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記ヘアピンアダプターが、ライゲーション又はタグメンテーションによって組み込まれる、請求項１８～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記増幅プライマー配列及び前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列が、各々、少なくとも１４ヌクレオチドを含む、請求項１８～６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記増幅プライマー配列及び前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列が、各々、１４～６０ヌクレオチドを含む、請求項１８～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記ヘアピンアダプターが、安定性を増加させるための１つ以上の増強を含み、任意選択的に、増強が、１つ以上の修飾核酸又はロックド核酸である、請求項１８～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記ヘアピンアダプターが、６０℃以上、６５℃以上、又は７０℃以上の温度で、前記増幅プライマー配列の前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列との会合を維持する、請求項１８～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記増幅プライマー配列が、Ａ１４、Ａ１４’、Ｂ１５、又はＢ１５’配列を含む、請求項１８～６８のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記増幅プライマー配列が、前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列と会合している場合、増幅プライマーが、前記ヘアピンアダプターに含まれた前記増幅プライマー配列に結合することができない、請求項１８～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. 前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な前記配列が、前記増幅プライマー配列の前記相補体と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、請求項１８～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記増幅プライマー配列に少なくとも部分的に相補的な配列が、前記増幅プライマー配列の前記相補体を含む、請求項７１に記載の方法。
73. 二本鎖断片の一方又は両方の鎖が、前記ヘアピンアダプターの３’の１つ以上の追加のアダプターを含む、請求項１８～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 二本鎖断片が、一方又は両方の鎖の３’末端における１つ以上のアダプターを含む、請求項１８～７３のいずれか一項に記載の方法。
75. 前記１つ以上のアダプターが、プライマー配列、インデックスタグ配列、捕捉配列、バーコード配列、切断配列、若しくは配列決定関連配列、又はそれらの組み合わせを含む、請求項７３又は７４に記載の方法。
76. 増幅プライマーを使用して断片を増幅することが、前記ヘアピンアダプターを破壊することができない、請求項１９～７５のいずれか一項に記載の方法。
77. 増幅プライマーを使用して断片を増幅するために使用される前記ポリメラーゼが、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、又は増幅プライマーを使用して断片を増幅するために使用される前記ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼではない、請求項７６に記載の方法。
78. 断片を増幅するために使用される前記ポリメラーゼが、Ｑ５である、請求項７７に記載の方法。
79. 前記増幅が、ブリッジ増幅である、請求項１９～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 増幅された断片の配列決定を更に含む、請求項１９～７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 前記方法が、前記インサートの全配列の配列決定を可能にする、請求項８０に記載の方法。
82. 前記二本鎖核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む、請求項１８～８１のいずれか一項に記載の方法。
83. 前記二本鎖核酸が、無細胞ＤＮＡ又はエクソーム試料を含む、請求項８１に記載の方法。
84. 前記方法が、断片重複排除に使用される、請求項１８～８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 二本鎖断片の配列決定ライブラリーから標的配列を濃縮するための方法であって、
    ａ．前記配列決定ライブラリーを調製することであって、前記二本鎖断片の各断片が、末端アダプター間に配置されたインサートを含み、各末端アダプターが、
    第１のセットのヌクレオチド配列であって、前記第１のセットのヌクレオチド配列がアダプター配列及び前記アダプター配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、第１のセットのヌクレオチド配列、
    前記第１のセットのヌクレオチド配列の３’終端から離れて伸長する増幅プライマー配列を含む、調製することと、
    ｂ．前記二本鎖断片を変性させて、分離鎖を形成することであって、各分離鎖が、前記インサートの一本鎖部分を含む、形成することと、
    ｃ．配列特異的伸長プライマーを、前記インサートの前記一本鎖部分の相補配列にアニーリングすることと、
    ｄ．前記アニーリングした伸長プライマーから相補鎖を伸長させて、二本鎖末端を有する相補鎖及び分離鎖の二重鎖を形成することであって、前記二本鎖末端が、前記相補鎖の３’末端及び前記分離鎖の５’末端を含む、形成することと、
    ｅ．二本鎖アダプターを前記二重鎖の各二本鎖末端にライゲーションすることと、
    ｆ．前記二重鎖を変性させることと、
    ｇ．前記二重鎖の変性鎖を増幅して、増幅産物を生成することと、を含む、方法。
86. 前記増幅産物を配列決定することを更に含む、請求項８５に記載の方法。
87. インデックス配列を有するプライマーを使用して、前記増幅産物を配列決定することを含む、請求項８６に記載の方法。
88. 前記二本鎖末端にＡオーバーハングを付加することを更に含み、前記二本鎖アダプターが、相補Ｔオーバーハングを含む、請求項８５又は８６に記載の方法。
89. 前記二本鎖アダプターが、第２の増幅プライマー配列及び前記第２の増幅プライマー配列に対する相補配列を含む、請求項８５～８７のいずれか一項に記載の方法。
90. 前記第１のセットのヌクレオチド配列の前記３’終端から離れて伸長する前記増幅プライマー配列が、前記第２の増幅プライマー配列とは異なる配列を含む、請求項８８に記載の方法。
91. 前記配列特異的伸長プライマーが、それぞれ異なる標的配列に対して複数の異なる配列を含む、請求項８５～８９のいずれか一項に記載の方法。

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