JP2023547366A - 複数のインサートを含む配列決定鋳型、並びに配列決定スループットを改善するための組成物及び方法 - Google Patents

複数のインサートを含む配列決定鋳型、並びに配列決定スループットを改善するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

複数のインサートを含む配列決定鋳型として使用するためのポリヌクレオチドが本明細書に記載される。また、これらのポリヌクレオチドを生成及び使用する方法、並びに連続性情報の分析を含むそのような鋳型の使用方法も本明細書に記載される。更に、インサート配列及びインサート配列のコピーを含む配列決定鋳型を使用して、配列決定若しくは増幅中に生じるランダムエラーを修正するか、又は二本鎖核酸において非標準塩基対形成をもたらす核酸塩基損傷若しくは他の変異を同定することができる。メチル化分析を行う方法も本明細書に記載されている。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６３／０９４，４２２号及び２０２１年１０月１５日に出願された同第６３／２５６，０４０号の優先権の利益を主張するものであり、これらの内容はそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
説明
本出願は、リードプライマー結合配列、標的核酸に由来するインサート配列、連結配列、及び付着配列を含むポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドを含む組成物、並びに連結された核酸配列決定鋳型を生成及び配列決定する方法も記載される。加えて、本開示は、複数のインサートを含む配列決定鋳型を調製する方法に関する。本開示はまた、連続性情報の分析を含む、そのような鋳型の使用方法に関する。更に、同じインサート配列の２つのコピー（すなわち、インサート配列及びインサート配列のコピー）を含む配列決定鋳型を使用して、配列決定若しくは増幅中に生じるランダムエラーを修正するか、又は二本鎖核酸において非標準塩基対形成をもたらす核酸塩基の損傷若しくは他の変異を同定することができる。インサート配列及びインサート配列のコピーを含むこれらの配列決定鋳型は、メチル化分析にも使用することができる。
典型的には、合成による配列決定（ＳＢＳ）プラットフォームにおけるリード長は、フェージング／プレフェージングのために２５０～３００塩基対に制限される。このリード長は、ＳＢＳプラットフォームのスループットを制限する。
以前は、複数のインサートを含むポリヌクレオチドを使用してＳＢＳスループットを改善する方法が説明された。多くの場合、これらの方法は、例えば、異なるポリメラーゼ若しくは基質の組み合わせ、又はプライマーブロッキングを用いた直交的なＳＢＳ反応に依存していた（国際公開第２０１５／０００２７８９号及び米国特許出願公開第２０１８０３１２９１７号参照）。しかしながら、非標準試薬を必要とすることなくフローセルからの配列決定出力を増加させて、配列決定出力を増加させる費用効率が高く使い勝手のよい手段を可能にする簡単な手段が必要とされている。
本開示は、１つ以上の標的核酸に由来する複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを記載する。これらのポリヌクレオチドは、複数のＤＮＡライブラリーから生成され得る。その後、１つのライブラリー産物中のハイブリダイゼーション配列を別のライブラリー産物中のハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することにより、伸長が可能になり、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを形成する。これらの複数のインサート配列の配列決定は、ポリヌクレオチドに含まれる複数の異なるリードプライマー結合配列に基づく逐次的なＳＢＳ伸長反応によって行うことができる。
加えて、従来のショートリード配列決定法は、インタクトなゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ由来の短い別個の断片の初期生成を含む。これらの断片は、物理的剪断、酵素消化、又は１つ以上のプライマーからのポリメラーゼ伸長といったいくつかの方法で生成される。次いで、鋳型調製物は、これらの断片を改変し、合成アダプターを付加して、配列決定を可能にする。これらの配列決定鋳型は、多くの場合、インタクトなゲノムと同じ順序及び並置で塩基配列を含む元の試料由来の単一の断片を常に含む。鋳型が二本鎖である場合、配列の相補体は、２つの鎖のハイブリダイゼーションによって会合される。しかし、二本鎖鋳型が変性されると、２つの相補鎖が分離し、鋳型は、元の試料由来の単一配列断片を含む一本鎖になる。このプロセスにおいて、２つの相補鎖の間のあらゆる会合が失われる。更に、この断片化及び鋳型調製のプロセスにおいて、元の断片化されていないゲノムにおいて隣接していた２つ以上の断片間のあらゆる会合も失われる。
連続性情報の喪失というこの規則の例外は、配列決定アダプターを付加する前に２つ以上の遠位断片を一緒に連結するためのライゲーションを使用する鋳型調製方法において見出される。１つの例は、「メイトペア」ライブラリーであり、ここで、大きなＤＮＡ断片の末端が一緒に連結されて環を形成し、その後更に断片化され、続いて、一緒に連結された末端にまたがる小断片が回収される。これによる鋳型は、タンデムに連結された元の大きな断片由来の２つの配列を含む。別の例は、ゲノム中のＤＮＡの遠位断片が、インビボでクロマチンと複合体化されたＤＮＡの構造的配置により非常に近接して空間的に組織化される、クロマチンベースの立体構造捕捉である。互いに近接した断片のライゲーション及びその後のプロセシングは、空間的関連性と、推論により、個々のインサートの機能的関連性についての情報を与えるタンデムインサートを有する配列決定鋳型を生成する。
多くの異なる方法、例えば、Ｄｕｐｌｅｘ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｓｃｈｍｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：１４５０８－１４５１３（２０１２）、Ｄｕｐｌｅｘ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐｒｏ－Ｓｅｑ、Ｐｅｌ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３：１－１９（２０１８）に記載）、ＣｙｐｈｅｒＳｅｑ（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４：ｅ２２（２０１６））、ｏ２ｎ－ｓｅｑ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１５３３５（２０１７））、Ｃｉｒｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０：１９８７２－１９８７７（２０１３））、及びＢｏｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３：９８４６－９８５１（２０１６）及びＡｂａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５９３，４０５－４１０（２０２１））が、複数のインサートを有する配列決定鋳型の調製を改善する可能性のある手段として開発されている。しかしながら、これらの方法は全て欠点を示しており、いずれも汎用性がない。
２０２１年６月１２日投稿のＢａｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，１０．１１０１／２０２１．０６．１１．４４８１１０に最近記載された、Ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｎｇ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｄｕｐｌｅｘ ｆｏｒ Ｅｒｒｏｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ（ＣＯＤＥＣ）法は、特殊なＣＯＤＥＣアダプター複合体を使用して単一のリード対を有する単一の二本鎖の配列決定のため、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を物理的に連結することを含む。ＣＯＤＥＣ法を使用して、核酸塩基損傷又は二本鎖核酸の一方の鎖のみに含まれる変化、並びにＰＣＲ増幅又は配列決定の間に導入された可能性があるエラーに起因し得る、非標準塩基対形成を同定することができる。しかしながら、ＣＯＤＥＣ法は、変換効率を制限し得る２回の連続したライゲーションを必要とし、副産物もまた、望ましくないライゲーションによって形成され得る。
ゲノム中の配列間の固有の構造的関係が存在しない場合、バーコードの形態の代理「関連マーカー」が使用され得る。例えば、ＤＮＡの大きな、例えば、１０００塩基対超、又は更に５０００塩基対超の断片は、希釈、区画化、又は表面上への固定化によって単離され得、更に断片化され、ここで、各小断片は、その後、共通のバーコード配列を付加する。したがって、多くの断片が並行して処理され、各単離された断片が後続のサブ配列に付加された固有のバーコード配列を受け取る場合、全ての断片由来の全ての小断片のプールを、１回の実験において配列決定でき、小断片は、それらのバーコード配列を同定及び照合することによって明確にされ得る。このアプローチは、ゲノム内の隣接配列が互いに関連付けられることを可能にし、はるかに大きなインシリコ断片への多数の小断片のインシリコアセンブリを可能にし、ゲノムにおける変異体のフェージングに役立ち得る。
別のタイプのバーコード化では、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、鋳型調製及び配列決定の間に物理的に分離するゲノム内の配列間の関連性を保存する。ＵＭＩは、個々の単一分子がそれぞれ固有のバーコードを受け取るように、鋳型調製中にＤＮＡ又はＲＮＡの断片に付加された短いバーコード配列を含む。配列決定によるＵＭＩの読み取りは、元の試料が長さ及び配列において２つ以上の同一の断片を含有していた場合であっても、個々の分子（鋳型調製物内の断片など）を識別することができる。ＵＭＩはまた、ＰＣＲ又は元の鋳型のコピーを作製する他のそのような方法の間に生成及び伝播されたエラー（例えば、自然ゲノム配列に対する改変）を同定するのにも役立つ。これは、この方法以外ではＰＣＲによって作製された人工変異体のバックグラウンドにおいて同定することが潜在的に困難である低頻度の自然な変異体を含有する試料を配列決定するための実験において有用である。ＵＭＩの別の用途では、二本鎖断片を、二本鎖ＵＭＩ（すなわち、ゲノム断片の第１及び第２の鎖がそれぞれ共通のＵＭＩバーコードを付加するように、二本鎖アダプター中のその相補体にハイブリダイズしたＵＭＩバーコード）を含有する二本鎖アダプターに付加してライゲーションすることができる。このようにして、変性による分離後、第１の鎖及び第２の鎖を同定し、ＵＭＩによって再会合させることができる。そのようなＵＭＩの使用は、ゲノム中の配列の２種類の「リード」を与えることによって、言い換えれば、断片由来の鋳型の「センス」及び「アンチセンス」対を同定して使用し、いずれかの鋳型の配列決定リード中のベースコールの妥当性を推測することによって、シーケンシングの精度を改善するのに役立ち得る。
ゲノム内の遠位又は相補のいずれかの配列を関連付けるためのバーコードの使用は、アダプター及び配列決定反応中のバーコードの設計及び組み込みに関する制約のために、実際には複雑である。例えば、バーコードの所与の長さに対して有限個の順列が存在する。一例では、４塩基バーコードは２５６個の順列のみを有し、自己相補性及び他の配列を考慮すると、実際には全てが機能的であるわけではない。同様の問題は、バーコードがより長いが、バーコードを読み取るためにより多くの配列決定サイクルを必要とする追加のペナルティを伴う場合に現れる。
アダプターにバーコードを追加することは、アダプター自体に複雑さを加える。例えば、あるアダプターから別のアダプターへの性能の変化を付加することは、ライブラリプール中の正規化に関する課題をもたらす。複雑なバーコードはまた、特にバーコード及びその相補体が二本鎖アダプターにおいてハイブリダイズする場合、複雑な製造を必要とする。
メイトペア又はクロマチン立体構造捕捉などのインビボ構造的会合の使用もまた、複雑なワークフローを必要とし、それが同定できる会合が限定される。例えば、メイトペアの課題は、極端なサイズの巨大断片であり、一方、クロマチン立体構造捕捉の課題は、クロマチン誘導性会合である。
ゲノム内の隣接配列及び相補配列に関する関連情報を提供できるバーコードを用いない方法が、本明細書に開示される。これらの方法は、単一の鋳型内でタンデムに配列を連結するための表面を利用し得る。方法はまた、近接性又はハプロタイプデータについての鋳型を生成するために区画化を使用し得る。配列決定されると、得られた鋳型は、配列決定におけるエラーを修正するため、又は非標準塩基対形成を同定するための情報を提供することができ、アセンブリ及びゲノム情報のフェージングのための連続性情報も提供することができる。
メチル化状態を検出する方法も本明細書に開示される。ゲノムＤＮＡ中のメチル化状態を検出するための従来の方法は、一般に、目的の塩基を異なる塩基に変換するために化学的又は生化学的反応を使用する。この変換の検出は、塩基がメチル化されたか否かを推測するために使用される。これらの方法は、試料を２つのアリコートに分割することを必要とする。一方のアリコートは化学的／生化学的に処理され、他方のアリコートは未処理のままである。次いで、両方を配列決定し、互いに比較してメチル化状態を推定する。このような化学的法の一例は、バイサルファイトシークエンシングであり、これは、亜硫酸水素ナトリウムによる非メチル化Ｃ塩基のＵ塩基への変換を使用する。次いで、ウラシルヌクレオチドを、ＰＣＲなどの増幅工程の間にチミンヌクレオチドに変換する。処理試料及び未処理試料の両方の配列決定後、リードを比較し、未処理試料中のＣ塩基が処理試料中のＴとして読み取られる場合、このＣ塩基が元の試料中でメチル化されていなかったことを示す。しかしながら、未処理試料中のＣ塩基が依然として処理試料中のＣ塩基として読み取られる場合、理論的に、Ｃ塩基は元の試料中でメチル化されていた。
Ｖａｉｓｖｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．３１（７）：１２８０－１２８９（２０２１）に記載されているように、同様の戦略をＥＭ－Ｓｅｑアッセイで使用するが、非メチル化Ｃを変換するために化学反応ではなく酵素反応が使用されることが例外である。最近の刊行物（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７（４）：４２４－４２９（２０１９））では、メチル化Ｃヌクレオチドを変換し、非メチル化Ｃヌクレオチドを変換しないボラン系の代替的な化学法を導入した。これは、バイサルファイトシークエンシングなどの通常のＣ変換化学法よりも有利であると報告されているが、なぜならば、（変換されたゲノムがほとんどＡ、Ｇ及びＴであるバイサルファイト化学法とは対照的に）ゲノムのわずかな割合しかメチル化されていないため、変換されたゲノムはほとんどが依然としてＡ、Ｃ、Ｇ及びＴを含む４塩基ゲノムであるからである。
メチル化分析の現在の方法の共通の特徴は、試料を２つのアリコートに分割する必要があり、これらのアリコートを並行して処理及び配列決定することである。試料を分割する必要なく塩基のメチル化状態を直接検出する技術が存在する。これらの方法は、元の試料中のメチル化塩基と非メチル化塩基を区別することができる配列決定戦略を使用する、単一分子配列決定技術に依存する。そのような技術の例としては、ナノ細孔配列決定（例えば、「Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｄｏｗｎｌｏａｄｅｄ ｏｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ ７，２０２１、ｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ／ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ－ａｎｄ－ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ａｎａｌｙｓｉｓ参照）及びＳＭＲＴ配列決定（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７（６）：４６１－４６５（２０１０）に記載）が挙げられる。しかし、これらの戦略は、ハイスループット配列決定が必要であるか、又は目的のゲノムが無細胞ＤＮＡなどの断片サイズが小さい方法には不利である。
ゲノムのメチル化状態を識別するために、単一のアリコートのメチル化試料を処理し、配列決定する方法が、本明細書に記載される。この方法は、ヒドロキシメチル化シトシンをメチル化シトシンから識別できる方法を含む。本発明の方法は、試料調製及び配列決定における労力を低減することができ、メチル化分析に必要とされる出発材料の量を潜在的に減少させ得る。
Ｓｃｈｍｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：１４５０８－１４５１３（２０１２） Ｐｅｌ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３：１－１９（２０１８） Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４：ｅ２２（２０１６） Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８，１５３３５（２０１７） Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０：１９８７２－１９８７７（２０１３） Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３：９８４６－９８５１（２０１６） Ａｂａｓｃａｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５９３，４０５－４１０（２０２１） Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，１０．１１０１／２０２１．０６．１１．４４８１１０ Ｖａｉｓｖｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．３１（７）：１２８０－１２８９（２０２１） Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７（４）：４２４－４２９（２０１９） Ｆｌｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．７（６）：４６１－４６５（２０１０）
複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に記載される。これらのポリヌクレオチドは、標的核酸由来の複数のインサート配列の配列決定を可能にする方法において使用され得る。また、本明細書に記載されるのは、エラー訂正及び非標準塩基対形成の同定、連続性データの決定、並びにメチル化分析の方法における配列決定鋳型として使用するための複数のインサートを含むポリヌクレオチドである。
実施形態１は、（ａ）第１のリードプライマー結合配列を含む５’末端ポリヌクレオチドと、（ｂ）５’末端ポリヌクレオチドの３’側に位置する第１のインサート配列であって、標的核酸に由来する第１のインサート配列と、（ｃ）第２のリードプライマー結合配列及びハイブリダイゼーション配列を含む、第１のインサート配列の３’側に位置する連結配列と、（ｄ）連結配列の３’側に位置する第２のインサート配列であって、標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は第１のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、第２のインサート配列と、（ｅ）３’末端ポリヌクレオチド配列と、を含む、ポリヌクレオチドである。
実施形態２は、第１のリードプライマー結合配列を含む３’末端ポリヌクレオチドと、標的核酸に由来する３’末端ポリヌクレオチドの５’側の第１のインサート配列と、第１のリードプライマー結合配列に直交する第２のリードプライマー結合配列を含む連結配列であって、第２のリードプライマー結合配列がハイブリダイゼーション配列を含む、連結配列と、連結配列の５’側にあり、標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は第１のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、第２のインサート配列と、ポリヌクレオチドの５’末端にあり、付着配列を含む、付着ポリヌクレオチドと、を含み、３’末端ポリヌクレオチド、連結配列、及び付着ポリヌクレオチドが標的核酸に由来しない、ポリヌクレオチドである。
実施形態３は、２つのインサート配列が異なる標的核酸に由来する、実施形態１又は２に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態４は、第１のインサート配列及び第２のインサート配列がそれぞれ独立して、４０～４００ヌクレオチド、１００～２００ヌクレオチド、又は１５０ヌクレオチドを含む、実施形態１～３のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態５は、第１のリードプライマー結合配列が、第１のアダプター配列を含む、実施形態１～４のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態６は、第１のリードプライマー結合配列が、トランスポゾン末端配列の相補体を更に含む、実施形態１～５のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７は、第１のアダプター配列が、Ａ１４プライマー配列の相補体（Ａ１４’）又はＢ１５プライマー配列の相補体（Ｂ１５’）である、実施形態５又は６に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態８は、３’末端ポリヌクレオチドが、Ｐ７プライマー配列の相補体（Ｐ７’）又はＰ５プライマー配列の相補体（Ｐ５’である、実施形態及び３～７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態９は、３’末端ポリヌクレオチドがＰ５プライマー配列の相補体（Ｐ５’）を含み、付着ポリヌクレオチドがＰ７プライマー配列（Ｐ７）を含む、又は、３’末端ポリヌクレオチドがＰ７プライマー配列の相補体（Ｐ７’）を含み、付着ポリヌクレオチドがＰ５プライマー配列（Ｐ５）を含む、実施形態２～７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１０は、連結配列が、（ａ）ハイブリダイゼーション配列を含み、任意選択的に（ｂ）ハイブリダイゼーション単位の３’側のトランスポゾン末端配列及びハイブリダイゼーション単位の５’側のトランスポゾン末端配列の相補体を含む、実施形態２～９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１１は、第２のリードプライマー結合配列が、ハイブリダイゼーション配列及びトランスポゾン末端配列の相補体を含む、実施形態１０に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１２は、付着ポリヌクレオチドが、第２のアダプター配列と、任意選択的にトランスポゾン末端配列と、を含む、実施形態２～１１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１３は、第２のアダプター配列が、Ａ１４配列又はＢ１５配列である、実施形態１２に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１４は、第１のアダプター配列がＡ１４配列の相補体（Ａ１４’）であり、第２のアダプター配列がＢ１５配列である、又は、第１のアダプター配列がＢ１５配列の相補体（Ｂ１５’）であり、第２のアダプター配列がＡ１４配列である、実施形態１３に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１５は、３’末端ポリヌクレオチド及び／又は付着ポリヌクレオチドが、それぞれ独立して、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む、実施形態２～７又は９～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１６は、ポリヌクレオチドが、固体支持体上に固定されている、実施形態２～７及び９～１４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１７は、ポリヌクレオチドが、付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されている、実施形態１６に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１８は、ポリヌクレオチドが、固体支持体の表面上の付着ポリヌクレオチド相補体への付着ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して固体支持体上に固定されている、実施形態１７に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態１９は、ポリヌクレオチドが、付着ポリヌクレオチド上の親和性部分の固体支持体の表面上の結合部分への結合を介して固体支持体に固定されている、実施形態１７に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態２０は、固体支持体が、フローセル又はビーズである、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態２１は、ポリヌクレオチドが、第２のインサート配列と付着ポリヌクレオチドとの間に、標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は他のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、５’末端のインサート配列と、リードプライマー結合配列を含む３’末端の連結配列と、を含む、少なくとも１つの挿入単位を含み、リードプライマー結合配列は、他のリードプライマー結合配列と直交している、実施形態２～７又は９～２０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態２２は、ポリヌクレオチドが、その相補体にハイブリダイズしている、実施形態２１に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態２３は、実施形態１、３～８、又は２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドと、その相補体と、を含む組成物であって、相補体は、（ａ）第１の相補リードプライマー結合配列を含む５’末端相補体と、（ｂ）５’末端相補体の３’側に位置する第２のインサート配列の相補配列と、（ｃ）第２のインサート配列の相補配列の３’側に位置する相補連結配列であって、第２のインサート配列が、（ｉ）第２の相補リードプライマー結合配列と、（ｉｉ）相補ハイブリダイゼーション配列と、を含む、相補連結配列と、（ｄ）相補連結配列の３’側に位置する第１のインサート配列の相補配列と、（ｅ）３’末端相補体と、を含む、組成物である。
実施形態２４は、実施形態２～７又は９～２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドと、その相補体と、を含む組成物であって、相補体は、第１の相補リードプライマー結合配列を含む３’末端相補体であって、第１の相補リードプライマー結合配列は、第１及び第２のリードプライマー結合配列に直交している、３’末端相補体と、３’末端相補体の５’側にある第２のインサート配列の相補体と、第２のインサート配列の相補体の５’側にあり、３’から５’への第２の相補リードプライマー結合配列を含む相補連結配列であって、第２の相補リードプライマー結合配列は、第１及び第２のリードプライマー結合配列、並びに第１の相補リードプライマー結合配列に直交している、相補連結配列と、相補連結配列の５’側の第１のインサート配列の相補体と、５’末端に相補付着配列を含む相補付着ポリヌクレオチドと、を含む、組成物である。
実施形態２５は、第１の相補リードプライマー結合配列が、第２のアダプター配列、及び存在する場合、付着ポリヌクレオチドのトランスポゾン末端配列に相補的であり、相補連結配列が、連結配列に相補的であり、相補付着ポリヌクレオチドが、第１のアダプター配列、及び存在する場合、トランスポゾン末端配列の相補体に相補的である、実施形態２４に記載の組成物である。
実施形態２６は、ポリヌクレオチドが、第１の付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されている、実施形態２４又は２５に記載の組成物である。
実施形態２７は、相補体が、相補付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されている、実施形態２４又は２５に記載の組成物である。
実施形態２８は、ポリヌクレオチドが、３’－Ｐ７’－Ｂ１５’－ＭＥ’－インサート１－ＭＥ－ＨＹＢ－ＭＥ’－インサート２－ＭＥ－Ａ１４－Ｐ５－５’の構造を有し、ＭＥ’は、モザイク末端配列（例えば、配列番号３）の相補体である、実施形態２～７若しくは９～２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、又は実施形態２４～２７のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態２９は、ポリヌクレオチドの相補体が、３’－Ｐ５’－Ａ１４’－ＭＥ’－インサート２－ＭＥ－ＨＹＢ’－ＭＥ’－インサート１－ＭＥ－Ｂ１５－Ｐ７－５’の構造を有する、実施形態２８に記載のポリヌクレオチド又は組成物である。
実施形態３０は、トランスポソーム複合体であって、トランスポザーゼと、第１のリードプライマー結合配列の相補体を含む第１のトランスポゾンであって、第１のリードプライマー結合配列の相補体は、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を含む、第１のトランスポゾンと、第１のアダプター配列の相補体と、トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含む、第２のトランスポゾンと、ハイブリダイゼーション配列の相補体と、を含む、トランスポソーム複合体である。
実施形態３１は、第１のアダプター配列の相補体がＢ１５配列である、実施形態３０に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３２は、第２のトランスポゾンが、第１のリードプライマー結合配列の５’側に相補付着配列を含み、任意選択的に、相補付着配列がＰ７配列を含む、実施形態３０又は３１に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３３は、トランスポソーム複合体が、
Figure 2023547366000002
 の構造を有し、ＭＥは、配列番号６などのモザイク末端配列である、実施形態３０に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３４は、トランスポソーム複合体が、第１又は第２のトランスポゾンを介してビーズ上に固定されている、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３５は、トランスポザーゼと、付着ポリヌクレオチドを含む第１のトランスポゾンであって、付着ポリヌクレオチドは、付着配列を含む５’部分を含む、第１のトランスポゾンと、第２のリードプライマー結合配列を含む３’部分であって、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を含む、３’部分と、アダプターと、トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含む第２のトランスポゾンと、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、トランスポソーム複合体である。
実施形態３６は、アダプターがＡ１４配列である、実施形態３５に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３７は、付着配列がＰ５配列を含む、実施形態３５又は３６に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３８は、トランスポソーム複合体が、
Figure 2023547366000003
 の構造を有する、実施形態３５に記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態３９は、トランスポソーム複合体が、第１又は第２のトランスポゾンを介して固体支持体に固定されている、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態４０は、トランスポソーム複合体が、ビーズ上に固定されている、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態４１は、トランスポソーム複合体が、第１又は第２のトランスポゾンに付着したリンカーに接続された親和性エレメントを介して固体支持体又はビーズ上の親和性結合パートナーに固定されている、実施形態３０～４０のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体である。
実施形態４２は、実施形態３０～４１のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体などの２つ以上のトランスポソーム複合体を含む、組成物又はキットである。
実施形態４３は、組成物又はキットであって、固体支持体であって、任意選択的に、任意選択の支持体はビーズである、固体支持体と、トランスポソーム複合体を生成するための構成要素であって、トランスポザーゼと、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成するためのオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドは、３’トランスポゾン末端配列と、５’の第１のアダプター配列と、を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’トランスポゾン末端配列と、３’の第２のアダプター配列と、を含み、５’トランスポゾン末端配列は、３’トランスポゾン末端配列に相補的であり、第１及び第２のアダプター配列は同じでない、オリゴヌクレオチドと、を含む、構成要素と、ＰＣＲによって断片に付着配列及びハイブリダイゼーション配列を付加するための第１及び第２のプライマーセットであって、第１のプライマーセットは、断片にハイブリダイゼーション配列及び第１の付着配列を付加するためのプライマーを含み、第２のプライマーセットは、断片に相補ハイブリダイゼーション配列及び第２の付着配列を付加するためのプライマーを含み、第１及び第２の付着配列は同じでない、第１及び第２のプライマーセットと、を含む、組成物又はキットである。
実施形態４４は、第１のフォーク型アダプター複合体と、第２のフォーク型アダプター複合体と、を含む、アダプター組成物又はキットであって、第１のフォーク型アダプター複合体は、相補付着ポリヌクレオチドであって、相補付着配列を含む５’部分と、アダプターを含む３’部分と、を含む、相補付着ポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドであって、（ａ）アダプターの一部の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分と、（ｂ）ハイブリダイゼーション配列の相補体であって、ハイブリダイゼーション配列の相補体は、相補付着ポリヌクレオチドに相補的ではない、ハイブリダイゼーション配列の相補体と、を含む、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと、を含み、第２のフォーク型アダプター複合体は、付着ポリヌクレオチドであって、付着配列を含む５’部分と、アダプターを含む３’部分と、を含む、付着ポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドであって、（ａ）アダプターの一部の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分と、（ｂ）ハイブリダイゼーション配列であって、付着ポリヌクレオチドに相補的ではない、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと、を含む、アダプター組成物又はキットである。
実施形態４５は、付着配列がＰ５プライマー配列を含み、相補付着配列がＰ７プライマー配列を含む、実施形態４４に記載のアダプター組成物又はキットである。
実施形態４６は、相補付着ポリヌクレオチドがＢ１５配列を含み、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドがＡ１４配列を含む、実施形態４４又は４５に記載のアダプター組成物又はキットである。
実施形態４７は、第１のフォーク型アダプター複合体が、
Figure 2023547366000004
 の構造を有し、第２のフォーク型アダプター複合体が、
Figure 2023547366000005
 の構造を有する、実施形態４６に記載のアダプター組成物又はキットである。
実施形態４８は、アダプター複合体がメチル化ヌクレオチドを含む（例えば、メチル化シトシンを含む）、実施形態４４～４７のいずれか１つに記載のアダプター組成物又はキットである。
実施形態４９は、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、第１のリードプライマー結合配列を、第１の標的核酸に由来する第１のインサート配列の３’末端に付着させることと、第１のインサート配列の５’末端にハイブリダイゼーション配列を付着させることと、ハイブリダイゼーション配列の相補体を、第１の標的核酸の不連続領域又は第２の標的核酸に由来する第２のインサート配列の３’末端に付着させることと、ハイブリダイゼーション配列をハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することと、を含み、第１のインサート配列と第２のインサート配列との間の領域は、第２のリードプライマー結合配列であって、ハイブリダイゼーション配列を含み、第１のリードプライマー結合配列に直交する、第２のリードプライマー結合配列を含み、それにより、連結された核酸配列決定鋳型を生成する、方法である。
実施形態５０は、第１のリードプライマー結合配列を付着させること及びハイブリダイゼーション配列を付着させることが、タグメンテーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸をトランスポソーム複合体と接触させることを含む、実施形態４８に記載の方法である。
実施形態５１は、ハイブリダイゼーション配列の相補体を、第１の標的核酸の不連続領域又は第２の標的核酸に由来する第２のインサート配列の３’末端に付着させることが、タグメンテーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸をトランスポソーム複合体と接触させることを含む、実施形態４９又は５０に記載の方法である。
実施形態５２は、第１のリードプライマー結合配列を第１のインサート配列の３’末端に付着させること及びハイブリダイゼーション配列を第１のインサート配列の５’末端に付着させることが、アダプター複合体の断片の末端へのライゲーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸を実施形態４４～４８のいずれか１つに記載の第１のフォーク型アダプター複合体と接触させて、両端で第１のアダプター複合体とライゲーションした断片及び両端で第２のアダプター複合体とライゲーションした断片を形成し、ライゲーションした断片を変性させることを含む、実施形態４９に記載の方法である。
実施形態５３は、ハイブリダイゼーション配列の相補体を第２のインサート配列の３’末端に付着させることが、アダプター複合体の断片の末端へのライゲーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸を第２のフォーク型アダプター複合体と接触させて、両端で第１のアダプター複合体とライゲーションした断片及び両端で第２のアダプター複合体とライゲーションした断片を形成し、ライゲーションした断片を変性させることを含む、実施形態４９又は５０に記載の方法である。
実施形態５４は、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、第１の標的核酸を含む第１の試料を第１のトランスポソーム複合体及び第２のトランスポソーム複合体と接触させることであって、各トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、アダプター配列を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分を含む、第２のトランスポゾンと、を含み、第１のトランスポソーム複合体中のアダプター配列は、第１のアダプター配列の相補体であり、第２のトランスポソーム複合体中のアダプター配列は、第２のアダプター配列であり、第１の標的核酸を断片化して、一方の末端が第１のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされ、他方の末端が第２のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第１の標的核酸由来のインサート配列を含む第１のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第１のタグ付き生成物の３’末端に相補付着配列を付加し、第１のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第１の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、第２の標的核酸を含む第２の試料をトランスポソーム複合体と接触させることであって、第２の標的核酸を断片化して、一方の末端が第１のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされ、他方の末端が第２のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第２の標的核酸由来のインサート配列を含む第２のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第２のタグ付き生成物の３’末端に付着配列を付加し、第２のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列を付加して、第２の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、第１の修飾されたタグ付き生成物のハイブリダイゼーション配列を第２の修飾されたタグ付き生成物中のハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することであって、連結された核酸配列決定鋳型は、（ａ）第２の標的核酸由来のインサート配列の３’側にある、第１のリードプライマー結合配列であって、第１のアダプター配列と、トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、第１のリードプライマー結合配列と、（ｂ）２つのインサート配列の間にある第２のリードプライマー結合配列であって、トランスポゾン末端配列と、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のリードプライマー結合配列と、を含み、第１のリードプライマー結合配列は、第２のリードプライマー結合配列に直交する、ことと、を含む、方法である。
実施形態５５は、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、第１の標的核酸を含む第１の試料を第１のトランスポソーム複合体と接触させることであって、第１のトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、付着配列及び第１のアダプター配列の相補体を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分を含む、第２のトランスポゾンと、を含み、第１の標的核酸を断片化して、各末端が第１のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第１の標的核酸由来のインサート配列を含む第１のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第１のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第１の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、第２の標的核酸を含む第２の試料を第２のトランスポソーム複合体と接触させることであって、第２のトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のアダプター配列及び相補付着配列を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分を含む、第２のトランスポゾンと、を含み、第２の標的核酸を断片化して、各末端が第２のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第２の標的核酸由来のインサート配列を含む第２のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第２のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第２の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、第１の修飾されたタグ付き生成物のハイブリダイゼーション配列を第２の修飾されたタグ付き生成物中のハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することであって、連結された核酸配列決定鋳型は、（ａ）第２の標的核酸由来のインサート配列の３’側にある、第１のリードプライマー結合配列であって、第１のアダプター配列と、トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、第１のリードプライマー結合配列と、（ｂ）２つのインサート配列の間にある第２のリードプライマー結合配列であって、トランスポゾン末端配列と、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のリードプライマー結合配列と、を含み、第１のリードプライマー結合配列は、第２のリードプライマー結合配列に直交する、ことと、を含む、方法である。
実施形態５６は、トランスポソーム複合体が固体支持体上に固定されている、実施形態５４又は５５に記載の方法である。
実施形態５７は、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）第１の標的核酸を含む第１の二本鎖ポリヌクレオチドを第１の制限酵素と、かつ、（ｉｉ）第２の標的核酸を含む第２の二本鎖ポリヌクレオチドを第２の制限酵素と、接触させ、適合性オーバーハングを有する第１及び第２のポリヌクレオチドを産生することであって、制限酵素は、ＩＩ型、ＩＩＳ型、ＩＩＰ型、及びＩＩＴ型制限酵素から選択される、ことと、（ｂ）リガーゼを使用して、第１及び第２のポリヌクレオチドの適合性オーバーハングを付着させることと、を含む、方法である。
実施形態５８は、接触工程の前に、（ａ）第１の制限酵素切断部位を、任意選択的にアダプターを使用することによって、第１の標的核酸に付着させ、プライマー伸長によって第１の二本鎖ポリヌクレオチドを生成することと、（ｂ）第２の制限酵素切断部位を、任意選択的にアダプターを使用することによって、第２の標的核酸に付着させ、プライマー伸長によって第２の二本鎖ポリヌクレオチドを生成することと、が行われる、実施形態５７に記載の方法である。
実施形態５９は、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）第１の核酸供給源及び第２の核酸供給源を剪断又は消化して、核酸断片の第１のライブラリー及び核酸断片の第２のライブラリーをそれぞれ生成することと、（ｂ）第１の核酸供給源由来の各核酸断片に第１のアダプターを付着させ、第２の核酸供給源由来の各核酸断片に第２のアダプターを付着させることであって、（ｉ）核酸断片を第１のポリメラーゼと接触させて、平滑末端を有する核酸断片を生成することと、（ｉｉ）キナーゼを用いて核酸断片の５’－ヒドロキシルをリン酸化することと、（ｉｉｉ）第２のポリメラーゼを用いて核酸断片に３’アデニンを付加することと、（ｉｖ）第１のアダプターを前記第１のライブラリーの各核酸断片にライゲーションし、第２のアダプターを第２のライブラリーの各核酸断片にライゲーションすることと、を含む、ことと、（ｃ）任意選択的にＰＣＲによって、第１及び第２の核酸ライブラリーを混合かつアニーリングすることであって、（ｉ）核酸が高温で変性し、（ｉｉ）Ａ及びＡ’配列がより低温で互いにハイブリダイズする、ことと、（ｄ）任意選択的にＰＣＲによって、完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することと、を含む、方法である。
実施形態６０は、方法が、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定することを含む、実施形態５４～５９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６１は、第１のリードプライマー結合配列に相補的な第１のリード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの第１のインサート配列を配列決定することと、第２のリードプライマー結合配列に相補的な第２のリード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第２のインサート配列を配列決定することと、を含む、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定する方法である。
実施形態６２は、方法が、第１の相補リードプライマー結合配列に相補的な第１の相補リード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第２のインサート配列の相補体を配列決定することと、第２の相補リードプライマー結合配列に相補的な第２の相補リード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第１のインサート配列の相補体を配列決定することと、を更に含む、実施形態６１に記載の方法である。
実施形態６３は、標的二本鎖核酸を含む試料を複数の異なる区画に区画化することが行われ、連結された核酸配列決定鋳型を生成することが異なる区画内で行われる、実施形態４９～５９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６４は、ポリヌクレオチドであって、（ａ）第１のリード配列決定プライマー配列を含む５’末端ポリヌクレオチドと、（ｂ）標的核酸に由来するインサート配列であって、５’末端ポリヌクレオチドの３’側にある、インサート配列と、（ｃ）インサート配列の３’側にあるハイブリダイゼーション配列と、（ｄ）ハイブリダイゼーション配列の３’側にあるインサート配列のコピーと、（ｅ）第２のリード配列決定プライマー配列の相補体を含む３’末端ポリヌクレオチドと、を含む、ポリヌクレオチドである。
実施形態６５は、ポリヌクレオチドであって、（ａ）第１のリード配列決定プライマー配列を含む５’末端ポリヌクレオチドと、（ｂ）標的核酸に由来するインサート配列であって、５’末端ポリヌクレオチドの３’側にある、第１のインサート配列と、（ｃ）インサート配列の３’側にあるハイブリダイゼーション配列と、（ｄ）ハイブリダイゼーション配列の３’側にある第２のインサート配列と、（ｅ）第２のリード配列決定プライマー配列の相補体を含む３’末端ポリヌクレオチドと、を含む、ポリヌクレオチドである。
実施形態６６は、インサート配列が４０～４００ヌクレオチドを含み、任意選択的に、インサート配列が１０００以下のヌクレオチドを含む、実施形態６４又は６５に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態６７は、ハイブリダイゼーション配列が１０～３０ヌクレオチドを含み、任意選択的に、ハイブリダイゼーション配列中の１つ以上のヌクレオチドがロック核酸である、実施形態６４～６６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態６８は、第１のリード配列決定プライマー配列及び第２のリード配列決定プライマー配列が異なっている、実施形態６４～６７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態６９は、第１のリード配列決定プライマー配列及び第２のリード配列決定プライマー配列がそれぞれ、Ａ１４配列若しくはＢ１５配列、又はそれらの相補体を含む、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７０は、３’末端ポリヌクレオチドがＰ５プライマー配列の相補体（Ｐ５’）を含み、５’末端ポリヌクレオチドがＰ７プライマー配列（Ｐ７（配列番号８））を含む、又は、３’末端ポリヌクレオチドがＰ７プライマー配列の相補体（Ｐ７’）を含み、５’末端ポリヌクレオチドがＰ５プライマー配列（Ｐ５（配列番号７））を含む、実施形態６４～６９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７１は、３’末端ポリヌクレオチド及び／又は５’末端ポリヌクレオチドが、それぞれ独立して、アダプター、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む、実施形態６４～７０のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７２は、ポリヌクレオチドが、固体支持体上に固定されている、実施形態及び６４～７１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７３は、ポリヌクレオチドが、５’末端ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されている、実施形態７２に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７４は、ポリヌクレオチドが、５’末端ポリヌクレオチド上の親和性部分の固体支持体の表面上の結合部分への結合を介して固体支持体に固定されている、実施形態７３に記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７５は、親和性部分が、リンカーを介して５’末端ポリヌクレオチドに付着している、実施形態６４～７４のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７６は、親和性部分が、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンである、実施形態６４～７５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７７は、ポリヌクレオチドが、５’－Ｐ５－Ａ１４－インサート－ＨＹＢ－インサート－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’又は５’－Ｐ７－Ｂ１５－インサート－ＨＹＢ’－インサート－Ａ１４’－Ｐ５’－３’の構造を有し、ＨＹＢは、ハイブリダイゼーション配列であり、ＨＹＢ’は、ハイブリダイゼーション配列の相補体である、実施形態６４又は６６～７６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７８は、ポリヌクレオチドが、５’－Ｐ５－Ａ１４－インサート１－ＨＹＢ－インサート２－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’又は５’－Ｐ７－Ｂ１５－インサート１－ＨＹＢ’－インサート２－Ａ１４’－Ｐ５’－３’の構造を有し、ＨＹＢはハイブリダイゼーション配列であり、ＨＹＢ’はハイブリダイゼーション配列の相補体である、実施形態６５～７７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドである。
実施形態７９は、その相補体にハイブリダイズしている、実施形態６４～７８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組成物である。
実施形態８０は、親和性部分が、ビオチン、デスチオビオチン又はデュアルビオチンであり、結合部分が、アビジン又はストレプトアビジンである、固体支持体の表面に固定されている実施形態６４～７８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む組成物又は実施形態７９に記載の組成物である。
実施形態８１は、固体支持体が、ビーズ、スライド、容器の壁、フローセル、又はフローセルに含まれるナノウェルである、実施形態８０に記載の組成物である。
実施形態８２は、（ａ）配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、（ｂ）３’ハイブリダイゼーション配列又はその相補体を含む第２の鎖と、を含み、第１の鎖の３’末端は、第２の鎖の５’末端に完全に又は部分的に相補的である、２つのポリヌクレオチド鎖を含むフォーク型アダプターである。
実施形態８３は、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体が、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している、実施形態８２に記載のフォーク型アダプターである。
実施形態８４は、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体が、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している、実施形態８３に記載のフォーク型アダプターである。
実施形態８５は、第１の鎖及び／又は第２の鎖が、アダプター、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、試料インデックス配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態８２～８４のいずれか１つに記載のフォーク型アダプターである。
実施形態８６は、第１の鎖及び／又は第２の鎖が、Ｐ７若しくはＰ５プライマー配列、又はそれらの相補体を更に含む、実施形態８２～８５のいずれか１つに記載のフォーク型アダプターである。
実施形態８７は、配列決定プライマー配列が、Ｂ１５配列（配列番号６）若しくはＡ１４配列（配列番号４）、又はそれらの相補体を含む、実施形態８２～８６のいずれか１つに記載のフォーク型アダプターである。
実施形態８８は、第１の鎖が、固体支持体又はビーズ上の親和性結合パートナーに結合することができる５’親和性エレメントを含む、実施形態８２～８７のいずれか１つに記載のフォーク型アダプターである。
実施形態８９は、親和性エレメントが、第１の鎖に付着したリンカーを介して接続されている、実施形態８８に記載のフォーク型アダプターである。
実施形態９０は、（ａ）第１のフォーク型アダプターが、第１のリード配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、ハイブリダイゼーション配列の相補体を含む第２の鎖と、を含み、（ｂ）第２のフォーク型アダプターが、第２のリード配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、ハイブリダイゼーション配列を含む第２の鎖と、を含む、実施形態８２～８９のいずれか１つに記載の２つのフォーク型アダプターを含む組成物又はキットである。
実施形態９１は、一方又は両方のフォーク型アダプターが、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、実施形態４４～４８又は９０に記載の組成物又はキットである。
実施形態９２は、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）標的核酸から調製されたインサートをそれぞれ含む二本鎖核酸断片を含む試料を、２つのフォーク型アダプターを含む組成物又はキットと接触させることであって、一方又は両方のフォーク型アダプターは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含み、任意選択的に、第１のリード配列決定アダプター配列は、第１のリードプライマー結合配列を含む、ことと、（ｂ）フォーク型アダプターを二本鎖断片にライゲーションして、タグ付けされた二本鎖断片を調製することと、（ｃ）タグ付けされた二本鎖断片を固体支持体上に固定することと、（ｄ）（１）固定された一本鎖断片を生成するために固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するためにブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、（ｅ）２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、（ｆ）各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の固定された一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法である。
実施形態９３は、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、溶液中のトランスポソーム複合体の２つのプールと接触させることであって、トランスポソーム複合体の第１のプールは、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）３’トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含み、トランスポソーム複合体の第２のプールは、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）３’トランスポゾン末端配列及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含み、一方又は両方の第２のトランスポゾンは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｂ）二本鎖核酸をタグメンテーションして、タグ付けされた二本鎖断片を生成することと、（ｃ）トランスポソーム複合体を二本鎖断片から遊離させることと、（ｄ）二本鎖断片を伸長し、ライゲーションすることと、（ｅ）タグ付けされた二本鎖断片を固体支持体上に固定することと、（ｆ）（１）固定された一本鎖断片を生成するために固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するためにブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、（ｇ）２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、（ｈ）各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の固定された一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法である。
実施形態９４は、変性させることが、温度の上昇、ｐＨの変化、及び／又は１つ以上のカオトロピック剤の添加によって行われる、実施形態９２又は９３に記載の方法である。
実施形態９５は、温度の上昇が、４５℃～５５℃から８５℃～９５℃への上昇であり、任意選択的に、温度の上昇が、５０℃から９０℃への上昇である、実施形態９４に記載の方法である。
実施形態９６は、１つ以上のカオトロピック剤が、ホルムアミド及び／又はＮａＯＨを含む、実施形態９２～９５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９７は、固定が、（１）第１及び／若しくは第２のフォーク型アダプターに含まれるか、又は（２）第２のトランスポソーム由来のタグに含まれる、親和性部分の、固体支持体の表面上の１つ以上の結合部分への結合による、実施形態９２～９６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９８は、親和性部分が、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンであり、結合部分が、アビジン又はストレプトアビジンである、実施形態９２～９７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９９は、１回以上の追加の変性、ハイブリダイズ、及び伸長する工程が行われる、実施形態９２～９８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１００は、第１の一本鎖断片がインサートを含み、第２の一本鎖断片が、第１の断片に含まれるインサートの相補体であるインサートを含む、実施形態９２～９９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０１は、第１の一本鎖断片がインサートを含み、第２の断片が、第１の断片に含まれるインサートの相補体ではないインサートを含む、実施形態９２～１００のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０２は、ハイブリダイズすることが、（１）各断片の一方の末端にライゲーションされた第１のフォーク型アダプター及び各断片の他方の末端にライゲーションされた第２のフォーク型アダプター、又は（２）各断片の一方の末端の第１のトランスポソーム複合体の第２のトランスポゾン由来のタグ及び各断片の他方の末端の第２のトランスポソームの第２のトランスポゾン由来のタグ、を含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こる、実施形態９２～１０１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０３は、２つの固定された一本鎖断片が、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列の、第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体への結合がない状態で、互いにハイブリダイズして架橋を形成しない、実施形態９２～１０２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０４は、２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズして架橋を形成することが、（１）各断片の両端にライゲーションされた同じフォーク型アダプター、又は（２）各断片の両端にある同じトランスポソーム複合体由来のタグを含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こらない、実施形態１０３に記載の方法である。
実施形態１０５は、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）標的二本鎖核酸を含む試料を、複数の異なる区画内に区画化することと、（ｂ）複数の異なる区画内の二本鎖核酸由来のインサートをそれぞれ含む、断片を調製することと、（ｃ）複数の異なる区画を、実施形態９１に記載の２つのフォーク型アダプターを含む組成物又はキットと接触させることであって、一方又は両方のフォーク型アダプターは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことと、（ｄ）フォーク型アダプターを二本鎖断片にライゲーションして、複数の異なる区画内のタグ付けされた二本鎖断片を調製することと、（ｅ）（１）一本鎖断片を生成するために固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）複数の異なる区画内のハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するためにブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、（ｆ）同じ区画内の２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、（ｇ）各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、同じ区画内の両方の一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法である。
実施形態１０６は、標的二本鎖核酸が、二本鎖ＤＮＡ断片を含み、断片を調製することが、二本鎖ＤＮＡ断片の小断片を調製する、実施形態１０５に記載の方法である。
実施形態１０７は、区画が、ウェル、チューブ、又は液滴である、実施形態６３、１０５、又は１０７に記載の方法である。
実施形態１０８は、変性させることが、温度の上昇、ｐＨの変化、及び／又は１つ以上のカオトロピック剤の添加によって行われる、実施形態１０５～１０７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１０９は、温度の上昇が、４５℃～５５℃から８５℃～９５℃への上昇であり、任意選択的に、温度の上昇が、５０℃から９０℃への上昇である、実施形態１０８に記載の方法である。
実施形態１１０は、１つ以上のカオトロピック剤が、ホルムアミド及び／又はＮａＯＨを含む、実施形態１０８又は１０９に記載の方法である。
実施形態１１１は、１回以上の追加の変性、ハイブリダイズ、及び伸長する工程が行われる、実施形態１０５～１１０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１２は、第１の一本鎖断片がインサートを含み、第２の一本鎖断片が、第１の断片に含まれるインサートの相補体であるインサートを含む、実施形態１０５～１１１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１３は、第１の一本鎖断片がインサートを含み、第２の断片が、第１の断片に含まれるインサートの相補体ではないインサートを含む、実施形態１０５～１１１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１４は、ハイブリダイズすることが、各断片の一方の末端にライゲーションされた第１のフォーク型アダプターと、各断片の他方の末端にライゲーションされた第２のフォーク型アダプターと、を含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こる、実施形態１０５～１１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１５は、一本鎖断片が、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列の、第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体への結合がない状態で、互いにハイブリダイズしない、実施形態１０５～１１４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１６は、２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズすることが、各断片の両端にライゲーションされた同じフォーク型アダプターを含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こらない、実施形態１１５に記載の方法である。
実施形態１１７は、区画化することが、ほとんどの区画が１つの標的二本鎖核酸を含むか又は標的二本鎖核酸を含まないように試料を希釈することを含む、実施形態６３又は１０５～１１６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１８は、同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサートが、同じ標的核酸から調製されている、実施形態１１７に記載の方法である。
実施形態１１９は、区画化することが、最も相違するハプロタイプを異なる区画内に分離し、方法が、ハプロタイプフェージングのために使用される、実施形態６３又は１０５～１１８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２０は、ハプロタイプフェージングがバーコードを必要としない、実施形態１１９に記載の方法である。
実施形態１２１は固定されているトランスポソーム複合体の２つのプールを含む固体支持体であって、（ａ）トランスポソーム複合体の第１のプールは、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）３’トランスポゾン末端配列と、第１のリード配列決定アダプター配列と、５’親和性部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列と、ハイブリダイゼーション配列の３’相補体と、を含む、第２のトランスポゾンと、を含み、（ｂ）トランスポソーム複合体の第２のプールは、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）３’トランスポゾン末端配列と、第２のリード配列決定アダプター配列と、５’親和性部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列と、３’ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のトランスポゾンと、を含み、各第１のトランスポゾンは、固体支持体の表面上の結合部分への５’親和性部分の結合によって固定されている、固体支持体である。
実施形態１２２は、トランスポソーム複合体の第１又は第２のプールが、実施形態３０～４２のいずれか１つに記載のトランスポソーム複合体を含み、第１のリード配列決定アダプター配列が、第１のリードプライマー結合配列を含む、実施形態１２１に記載の固体支持体である。
実施形態１２３は、トランスポソーム複合体の第１及び／又は第２のプールが、ホモダイマー及び／又はヘテロダイマーを含む、実施形態１２１又は１２２に記載の固体支持体である。
実施形態１２４は、固体支持体が、ビーズ、スライド、容器の壁、フローセル、又はフローセルに含まれるナノウェルである、実施形態１２２又は１２３に記載の固体支持体である。
実施形態１２５は、１つ以上のトランスポゾンがインデックス配列及び／又はＵＭＩを含む、実施形態１２１～１２４のいずれか１つに記載の固体支持体である。
実施形態１２６は、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第１のトランスポゾン及び／又はトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第１のトランスポゾンが、試料インデックスを含む、実施形態１２５に記載の固体支持体である。
実施形態１２７は、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第１のトランスポゾン及びトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第１のトランスポゾンの両方が、試料インデックスを含む、実施形態１２６に記載の固体支持体である。
実施形態１２８は、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第２のトランスポゾン及び／又はトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第２のトランスポゾンが、試料インデックス及び／又は固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む、実施形態１２１～１２７のいずれか１つに記載の固体支持体である。
実施形態１２９は、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第２のトランスポゾン及びトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第２のトランスポゾンの両方が、試料インデックスを含む、実施形態１２８に記載の固体支持体である。
実施形態１３０は、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第２のトランスポゾン及びトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第２のトランスポゾンの両方が、ＵＭＩを含む、実施形態１２８又は実施形態１２９に記載の固体支持体である。
実施形態１３１は、１つ以上の二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）固体支持体に固定されている二本鎖核酸を含む試料を適用することと、（ｂ）二本鎖核酸をタグメンテーションして、二本鎖核酸由来のインサートを含むタグ付けされた二本鎖断片を生成することであって、二本鎖断片は、固体支持体の表面上の結合部分への５’親和性部分の結合によって固体支持体に固定されている、ことと、（ｃ）トランスポソーム複合体を二本鎖断片から遊離させることと、（ｄ）二本鎖断片を伸長し、ライゲーションすることと、（ｅ）二本鎖断片を一本鎖断片に変性させることであって、５’親和性部分を含む一本鎖断片は、固体支持体上に固定されたままである、ことと、（ｆ）第１の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列を、第２の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体にハイブリダイズさせ、それによって架橋を形成することと、（ｇ）二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を伸長し、生成することと、を含む、方法である。
実施形態１３２は、トランスポソーム複合体を二本鎖断片から遊離させることが、ＳＤＳを用いて実施される、実施形態１３１に記載の方法である。
実施形態１３３は、ハイブリダイズさせることが、固体支持体を冷却すること、及び／又はハイブリダイゼーション緩衝液を適用することを含む、実施形態１３１又は１３２に記載の方法である。
実施形態１３４は、冷却することが、固体支持体の温度を６０℃以下に低下させることを含む、実施形態１３３に記載の方法である。
実施形態１３５は、ハイブリダイゼーション緩衝液が高塩濃度を含み、任意選択的に、高塩濃度は７５０ｍＭ ＮａＣｌである、実施形態１３３又は１３４に記載の方法である。
実施形態１３６は、変性させることが、固体支持体を加熱すること、又は化学変性剤を適用することを含む、実施形態１３１～１３５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１３７は、変性させることが、固体支持体の温度を９０℃以上に上昇させることを含む、実施形態１３６に記載の方法である。
実施形態１３８は、伸長させることが、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び伸長緩衝液を提供することを含む、実施形態１３１～１３７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１３９は、追加の、ハイブリダイズさせ、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を伸長し、生成する工程を更に含む、実施形態１３１～１３８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４０は、第１の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の、第２の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体へのハイブリダイゼーションは、第１及び第２の断片が、第１又は第２の断片の長い方の長さよりも近い固体支持体の表面上で互いに近接している場合にのみ起こる、実施形態１３１～１３９に記載の方法である。
実施形態１４１は、第１の固定された断片及び第２の固定された断片が、固体支持体上に近接して固定されており、近接していることにより、第１の固定された断片に含まれるハイブリダイゼーション配列に含まれる４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上のヌクレオチドが、第２の固定された断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体に含まれるヌクレオチドに結合することが可能になる、実施形態１３１～１４０に記載の方法である。
実施形態１４２は、第１の固定された断片及び第２の固定された断片が、固体支持体の表面上で互いに２０～５００ナノメートル以内に固定されている、実施形態１３１～１４１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４３は、試料が複数の二本鎖核酸を含む、実施形態９３～１２１又は１３１～１４２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４４は、第１及び第２の固定された断片の両方が、同じ二本鎖核酸から調製され、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型が、同じ二本鎖核酸由来の２つのインサートを含む、実施形態１４３に記載の方法である。
実施形態１４５は、２つのインサートが、同じ二本鎖核酸に含まれる２つの隣接配列に由来する、実施形態１４４に記載の方法である。
実施形態１４６は、２つのインサートが、同じ二本鎖核酸に含まれる２つの近接配列に由来し、近接配列が、二本鎖核酸中の１００以下のヌクレオチド、２００以下のヌクレオチド、３００以下のヌクレオチド、４００以下のヌクレオチド、５００以下のヌクレオチド、７００以下のヌクレオチド、又は１，０００以下のヌクレオチドによって隔てられている、実施形態１４４に記載の方法である。
実施形態１４７は、固体支持体の領域が、同じ二本鎖核酸に含まれる近接配列由来の共通のインサート配列を共有する複数の二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を含む、実施形態１４６の方法である。
実施形態１４８は、実施形態１３１～１４７のいずれか１つに記載の方法によって調製された二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型であって、鋳型の構造が、（ａ）５’－Ｐ５－ｉ５－Ａ１４－ＭＥ－インサート１－ＭＥ’－ＨＹＢ－ＭＥ－インサート２－ＭＥ’－Ｂ１５’－ｉ７’－Ｐ７’－３’、（ｂ）５’－Ｐ５－Ａ１４－ＭＥ－インサート１－ＭＥ’－ｉ６－ＨＹＢ－ｉ８’－ＭＥ－インサート２－ＭＥ’－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’、若しくは（ｃ）５’－Ｐ５－ｉ５－Ａ１４－ＭＥ－インサート１－ＭＥ’－ｉ６－ＨＹＢ－ｉ８’－ＭＥ－インサート２－ＭＥ’－Ｂ１５’－ｉ７’－Ｐ７’－３’、又はそれらの相補体を含む、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型である。
実施形態１４９は、（ａ）固体支持体から二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を遊離させることと、（ｂ）鋳型を配列決定して、鋳型に含まれるインサート配列を決定することと、を更に含む、実施形態１３１～１４８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５０は、遊離させることが、酵素消化又は化学的開裂を含む、実施形態１４９に記載の方法である。
実施形態１５１は、遊離後かつ配列決定前に、鋳型を増幅することを更に含む、実施形態１４９又は１５０に記載の方法である。
実施形態１５２は、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、（ａ）標的二本鎖核酸を含む試料を、複数の異なる区画内に区画化することと、（ｂ）二本鎖核酸をタグメンテーションして、複数の異なる区画内の二本鎖核酸由来のインサートを含むタグ付けされた二本鎖断片を生成することであって、タグメンテーションは、トランスポソーム複合体の２つのプールを用いて実施され、トランスポソーム複合体の第１のプールは、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）３’トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含み、トランスポソーム複合体の第２のプールは、（ｉ）トランスポザーゼと、（ｉｉ）３’トランスポゾン末端配列及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｉｉｉ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、ことと、（ｂ）タグ付けされた二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を生成することと、（ｃ）第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって、同じ区画内の２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせることと、（ｄ）各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法である。
実施形態１５３は、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型が、同じ区画に存在する２つの一本鎖断片のハイブリダイゼーションからのみ生成される、実施形態１５２に記載の方法である。
実施形態１５４は、ハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体が、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合しており、変性させることが、ブロッキングオリゴヌクレオチドを変性させてハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体をブロック解除することを含む、実施形態１５２又は１５３に記載の方法である。
実施形態１５５は、トランスポソーム複合体が溶液中に存在する、実施形態１５２～１５４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５６は、区画が、ウェル、チューブ、又は液滴である、実施形態１５２～１５５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５７は、変性させることが、温度の上昇、ｐＨの変化、及び／又は１つ以上のカオトロピック剤の添加によって行われる、実施形態１５２～１５６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５８は、温度の上昇が、４５℃～５５℃から８５℃～９５℃への上昇であり、任意選択的に、温度の上昇が、５０℃から９０℃への上昇である、実施形態１５７に記載の方法である。
実施形態１５９は、１つ以上のカオトロピック剤が、ホルムアミド及び／又はＮａＯＨを含む、実施形態１５７又は１５８に記載の方法である。
実施形態１６０は、１回以上の追加の変性、ハイブリダイズ、及び伸長する工程が行われる、実施形態１５２～１５９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６１は、第１の一本鎖断片がインサートを含み、第２の断片が、第１の断片に含まれるインサートの相補体ではないインサートを含む、実施形態１５２～１６０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６２は、区画化することが、ほとんどの区画が１つの標的二本鎖核酸を含むか又は標的二本鎖核酸を含まないように試料を希釈することを含む、実施形態１０５～１６１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６３は、同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサートが、同じ標的核酸から調製されている、実施形態１６２に記載の方法である。
実施形態１６４は、区画化することが、最も相違するハプロタイプを異なる区画内に分離し、方法が、ハプロタイプフェージングのために使用される、実施形態６３又は１５２～１６３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６５は、ハプロタイプフェージングがバーコードを必要としない、実施形態１６４に記載の方法である。
実施形態１６６は、鋳型を増幅することを更に含む、実施形態９３～１２１又は１３１～１６５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６７は、鋳型を配列決定することを更に含む、実施形態４９～５５、５７～５９、９３～１２１、又は１３１～１６６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６８は、配列決定が、Ａ１４、Ｂ１５、及び／又はハイブリダイゼーション配列（ＨＹＢ）に結合する配列決定プライマーを使用して行われる、実施形態１６７に記載の方法である。
実施形態１６９は、配列決定が暗サイクルを含み、データが配列決定の一部について記録されていない、実施形態１６７又は１６８に記載の方法である。
実施形態１７０は、記録されていないデータが、３’トランスポゾン末端配列又はその相補体に関連する配列データである、実施形態１６９に記載の方法である。
実施形態１７１は、（ａ）同じ鋳型に含まれるインサートの配列を評価することと、（ｂ）同じ鋳型に含まれるインサートに基づいて、二本鎖核酸に含まれる配列についての近接データを決定することと、を更に含む、実施形態１６７～１７０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７２は、近接データが、インサート配列（又はその相補体）が同じ標的核酸に含まれていたことを決定する、実施形態１７１に記載の方法である。
実施形態１７３は、（ａ）異なる鋳型から調製された所与のインサートの複数の配列由来の配列決定結果を評価することと、（ｂ）（ｉ）同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサート及びその相補体、並びに／又は、（ｉｉ）複数の連結された配列決定鋳型に含まれるインサート、由来の配列決定データに基づいて、非標準塩基対形成の事象を決定すること、を更に含む、実施形態１６７～１７２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７４は、異なる鋳型から調製された所与のインサートの複数の配列由来の配列決定結果を評価することと、（ｉ）同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサート及びその相補体、並びに／又は、（ｉｉ）複数の連結された配列決定鋳型に含まれるインサート、由来の配列決定データに基づいて、このインサートに関する配列決定結果におけるエラーを修正することと、を更に含む、実施形態１６７～１７３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７５は、連結された配列決定鋳型に含まれるインサート配列に含まれる修飾シトシンを同定する方法であって、（ａ）二本鎖の連結された配列決定鋳型を調製することであって、各鎖はインサート配列及びインサート配列のコピーを含み、２つの鎖は互いに相補的である、ことと、（ｂ）二本鎖の連結された配列決定鋳型を、修飾及び／又は非修飾シトシンを改変する条件に供することと、（ｃ）二本鎖の連結された配列決定鋳型の各鎖のアンプリコンを調製することと、（ｄ）アンプリコンを配列決定し、各鎖から生成されたアンプリコン中のインサート配列及びインサート配列のコピーに関する配列決定結果を評価することと、（ｅ）二本鎖の連結された配列決定鋳型の各鎖の配列に基づいて、インサート配列に含まれる修飾シトシンの位置を決定することと、を含む、方法である。
実施形態１７６は、修飾シトシンが、メチル化又はヒドロキシメチル化シトシンである、実施形態１７５に記載の方法である。
実施形態１７７は、連結された配列決定鋳型が、実施形態９３～１２１又は１３１～１６５のいずれか１つに記載の方法によって調製される、実施形態１７５又は１７６の方法である。
実施形態１７８は、二本鎖の連結された配列決定鋳型を生成するための伸長が、メチル化ｄＣＴＰを含む反応溶液を用いて行われる、実施形態１７７に記載の方法である。
実施形態１７９は、連結された配列決定鋳型に含まれるウラシルが、アンプリコンを調製するときにチミンに変換される、実施形態１７５～１７８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８０は、修飾シトシン又は非修飾シトシンが改変され、任意選択的に、修飾シトシンがＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）処理によって改変されるか、又は非修飾シトシンが亜硫酸水素ナトリウム若しくは酵素処理によって改変される、実施形態１７５～１７９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８１は、修飾シトシンが改変され、修飾シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｔ，Ｃ）の存在によって決定され、非修飾シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｃ，Ｃ）の存在によって決定され、修飾シトシン及び非修飾シトシンが、相補鎖中のＧ’と対形成している、実施形態１８０に記載の方法である。
実施形態１８２は、非修飾シトシンが改変され、修飾シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｃ，Ｔ）の存在によって決定され、非修飾シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｔ，Ｔ）の存在によって決定され、修飾シトシン及び非修飾シトシンが、相補鎖中のＧ’と対形成している、実施形態１８０に記載の方法である。
実施形態１８３は、方法が、メチル化シトシンの位置をヒドロキシメチル化シトシンから区別する、実施形態１８０に記載の方法である。
実施形態１８４は、修飾及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を供することが、（ａ）各鎖を、β－グリコシルトランスフェラーゼと反応させることと、（ｂ）各鎖を、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）と反応させることと、（ｃ）各鎖を、非修飾シトシンをウラシルに変換する条件で反応させることと、を含む、実施形態１８３に記載の方法である。
実施形態１８５は、（ａ）メチル化シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｃ，Ｃ）の存在によって決定され、（ｂ）ヒドロキシメチル化シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｃ，Ｔ）の存在によって決定され、（ｃ）非修飾シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｔ，Ｔ）の存在によって決定され、メチル化、ヒドロキシメチル化、及び非修飾シトシンが、相補鎖中のＧ’と対形成している、実施形態１８４に記載の方法である。
実施形態１８６は、修飾シトシン及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を供することが、（ａ）各鎖を、ＤＮＭＴと反応させること、（ｂ）各鎖を、メチル化シトシンをジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ）に変換する条件で反応させることと、を含む、実施形態１８３に記載の方法である。
実施形態１８７は、（ａ）メチル化シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｔ，Ｔ）の存在によって決定され、（ｂ）ヒドロキシメチル化シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｔ，Ｃ）の存在によって決定され、（ｃ）非修飾シトシンの位置が、それぞれインサート配列及びインサート配列のコピー中の（Ｃ，Ｃ）の存在によって決定され、メチル化、ヒドロキシメチル化、及び非修飾シトシンが、相補鎖中のＧ’と対形成している、実施形態１８６に記載の方法である。
追加の目的及び利点は、以下の説明において部分的に記載され、一部は説明から明白であるか、又は実践によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的のみであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付図面は、１つの（いくつかの）実施形態を図解し、明細書とともに本明細書に記載される原理を説明する役割を果たす。
２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドがフローセルでの配列決定スループットを増加させる方法に関する概要を提供する。配列決定は、リード１（Ｒ１）配列決定プライマー、続いてリード２（Ｒ２）配列決定プライマーを用いて行われる。次いで、ターンアラウンドが行われ、リード３（Ｒ３）配列決定プライマー、続いてリード４（Ｒ４）配列決定プライマーを用いて配列決定が行われる。 ポリヌクレオチドが、Ｐ５’及びＰ７配列、並びにハイブリダイゼーション（ＨＹＢ）配列を含む、２つのインサート配列を有する代表的なポリヌクレオチドの配列決定を示す。ポリヌクレオチドは、まずポリヌクレオチドの３’ポリヌクレオチド（Ｐ５’配列を含む）にハイブリダイズするリード１配列決定プライマー、続いてＨＹＢ配列にハイブリダイズするリード２配列決定プライマーを使用して配列決定される。ターンアラウンドが行われる。次いで、ポリヌクレオチドは、３ポリヌクレオチド（Ｐ７’配列を含む）にハイブリダイズするリード３配列決定プライマー及びハイブリダイゼーション配列の相補体（ＨＹＢ’）にハイブリダイズするリード４配列決定プライマーを使用して配列決定される。 ライブラリーＡ又はライブラリーＢから生成された、２つのインサート配列を有する代表的なポリヌクレオチドの配列決定を示す。ポリヌクレオチドは、まず３’ポリヌクレオチド（Ｐ５’配列を含む）にハイブリダイズするリード１配列決定プライマー、続いてＨＹＢ配列及びＳＢＳ配列にハイブリダイズするリード２配列決定プライマーを使用して配列決定される。ＳＢＳ配列は、配列決定プライマーの結合を補助し、例えば、ＳＢＳ配列は、ＭＥ又はＭＥ’）を含み得る。ターンアラウンドが行われる。次いで、ポリヌクレオチドは、３ポリヌクレオチド（Ｐ７’配列を含む）にハイブリダイズするリード３配列決定プライマー、続いてハイブリダイゼーション配列の相補体（ＨＹＢ’）及びＳＢＳ配列にハイブリダイズするリード４配列決定プライマーを使用して配列決定される。代表的なポリヌクレオチドはまた、２つのインサート配列が２つの別々のライブラリー（ライブラリーＡ及びライブラリーＢ）に由来し得ることも示す。 ２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドの配列と比較した、１つのインサートを含む標準的なＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリーの配列決定の概要を示す。（Ａ）標準的なＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリーを用いて、１５０サイクルの逐次合成による配列決定（ＳＢＳ）配列決定を、Ａ１４’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード１配列決定（ｓｅｑ）プライマー（配列番号２２）を用いてフォワードで行う。次いで、ペアエンドターンアラウンドを実施し、ＳＢＳによる１５０サイクルの配列決定を、Ｂ１５’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード２ ｓｅｑプライマー（配列番号２３）を用いてリバース鎖について実施する。（Ｂ）２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドのペアエンドライブラリーを用いて、１５０サイクルのＳＢＳ配列決定を、Ａ１４’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード１配列決定（第１のリード）プライマーを用いてフォワードで行う。次いで、ＳＢＳ合成鎖を変性させることができ、リード１－Ｂ ｓｅｑプライマー（第２のリード）をＨＹＢ及びＭＥ’にハイブリダイズさせる。ペアエンドターンアラウンドを実施し、ＳＢＳ配列決定による１５０サイクルの配列決定を、Ｂ１５’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード２－Ａ 配列決定（第３のリード）プライマー、次いでＨＹＢ’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード２－Ｂ配列決定（第４のリード）プライマーを使用して、ポリヌクレオチドの２つのインサート配列のそれぞれのリバース鎖について行う。このようにして、標的核酸由来の２つのインサート配列の配列は、標準的な方法と同じフローセルの領域を使用して取得される。 ２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドの配列と比較した、１つのインサートを含む標準的なＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリーの配列決定の概要を示す。（Ａ）標準的なＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリーを用いて、１５０サイクルの逐次合成による配列決定（ＳＢＳ）配列決定を、Ａ１４’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード１配列決定（ｓｅｑ）プライマー（配列番号２２）を用いてフォワードで行う。次いで、ペアエンドターンアラウンドを実施し、ＳＢＳによる１５０サイクルの配列決定を、Ｂ１５’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード２ ｓｅｑプライマー（配列番号２３）を用いてリバース鎖について実施する。（Ｂ）２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドのペアエンドライブラリーを用いて、１５０サイクルのＳＢＳ配列決定を、Ａ１４’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード１配列決定（第１のリード）プライマーを用いてフォワードで行う。次いで、ＳＢＳ合成鎖を変性させることができ、リード１－Ｂ ｓｅｑプライマー（第２のリード）をＨＹＢ及びＭＥ’にハイブリダイズさせる。ペアエンドターンアラウンドを実施し、ＳＢＳ配列決定による１５０サイクルの配列決定を、Ｂ１５’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード２－Ａ 配列決定（第３のリード）プライマー、次いでＨＹＢ’及びＭＥ’にハイブリダイズするリード２－Ｂ配列決定（第４のリード）プライマーを使用して、ポリヌクレオチドの２つのインサート配列のそれぞれのリバース鎖について行う。このようにして、標的核酸由来の２つのインサート配列の配列は、標準的な方法と同じフローセルの領域を使用して取得される。 標的核酸（ゲノムＤＮＡ又はｇＤＮＡ）由来の単一インサート配列を含む配列決定の準備が整った断片をもたらす、標準的なＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘワークフローにおける工程を示す。 標的核酸（ゲノムＤＮＡ又はｇＤＮＡ）由来の単一インサート配列を含む配列決定の準備が整った断片をもたらす、標準的なＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘワークフローにおける工程を示す。 標的核酸（ゲノムＤＮＡ又はｇＤＮＡ）由来の単一インサート配列を含む配列決定の準備が整った断片をもたらす、標準的なＮｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘワークフローにおける工程を示す。 Ａ１４及びＢ１５配列を組み込むためのトランスポソームを用いたタンデムリードライブラリーの調製（Ａ）、続いてＰ５及びＨＹＢ（Ｈ）配列（Ｂ）又はＨＹＢ’（Ｈ’）及びＰ７’（Ｃ）のいずれかを付加するためのＰＣＲの一般的概要を示す。（Ｄ）のボックスで囲まれたライブラリー産物は、伸長を可能にするために別のライブラリー産物とのハイブリダイゼーション付加物（ＨＹＢ／ＨＹＢ’ハイブリダイゼーションを介する）を形成することができる。伸長した産物の少なくとも１／９ は、配列決定可能な生成物であると予想される（Ｅ）。 Ａ１４及びＢ１５配列を組み込むためのトランスポソームを用いたタンデムリードライブラリーの調製（Ａ）、続いてＰ５及びＨＹＢ（Ｈ）配列（Ｂ）又はＨＹＢ’（Ｈ’）及びＰ７’（Ｃ）のいずれかを付加するためのＰＣＲの一般的概要を示す。（Ｄ）のボックスで囲まれたライブラリー産物は、伸長を可能にするために別のライブラリー産物とのハイブリダイゼーション付加物（ＨＹＢ／ＨＹＢ’ハイブリダイゼーションを介する）を形成することができる。伸長した産物の少なくとも１／９ は、配列決定可能な生成物であると予想される（Ｅ）。 Ａ１４及びＢ１５配列を組み込むためのトランスポソームを用いたタンデムリードライブラリーの調製（Ａ）、続いてＰ５及びＨＹＢ（Ｈ）配列（Ｂ）又はＨＹＢ’（Ｈ’）及びＰ７’（Ｃ）のいずれかを付加するためのＰＣＲの一般的概要を示す。（Ｄ）のボックスで囲まれたライブラリー産物は、伸長を可能にするために別のライブラリー産物とのハイブリダイゼーション付加物（ＨＹＢ／ＨＹＢ’ハイブリダイゼーションを介する）を形成することができる。伸長した産物の少なくとも１／９ は、配列決定可能な生成物であると予想される（Ｅ）。 Ａ１４及びＢ１５配列を組み込むためのトランスポソームを用いたタンデムリードライブラリーの調製（Ａ）、続いてＰ５及びＨＹＢ（Ｈ）配列（Ｂ）又はＨＹＢ’（Ｈ’）及びＰ７’（Ｃ）のいずれかを付加するためのＰＣＲの一般的概要を示す。（Ｄ）のボックスで囲まれたライブラリー産物は、伸長を可能にするために別のライブラリー産物とのハイブリダイゼーション付加物（ＨＹＢ／ＨＹＢ’ハイブリダイゼーションを介する）を形成することができる。伸長した産物の少なくとも１／９ は、配列決定可能な生成物であると予想される（Ｅ）。 Ａ１４及びＢ１５配列を組み込むためのトランスポソームを用いたタンデムリードライブラリーの調製（Ａ）、続いてＰ５及びＨＹＢ（Ｈ）配列（Ｂ）又はＨＹＢ’（Ｈ’）及びＰ７’（Ｃ）のいずれかを付加するためのＰＣＲの一般的概要を示す。（Ｄ）のボックスで囲まれたライブラリー産物は、伸長を可能にするために別のライブラリー産物とのハイブリダイゼーション付加物（ＨＹＢ／ＨＹＢ’ハイブリダイゼーションを介する）を形成することができる。伸長した産物の少なくとも１／９ は、配列決定可能な生成物であると予想される（Ｅ）。 Ｐ５－ＨＹＢ’フォーク型ライブラリーがビーズベースのタグメンテーションを用いて１つのチューブ内で形成され、Ｐ７－ＨＹＢフォーク型ライブラリーが溶液ベースのタグメンテーションを用いて別のチューブ内で形成される方法を示す（Ａ）。ライブラリー産物は、ＨＹＢ及びＨＹＢ’のハイブリダイゼーションに基づいてハイブリダイズした付加物を形成することができ、ポリヌクレオチドを伸長を介して生成することができる（Ｂ）。 Ｐ５－ＨＹＢ’フォーク型ライブラリーがビーズベースのタグメンテーションを用いて１つのチューブ内で形成され、Ｐ７－ＨＹＢフォーク型ライブラリーが溶液ベースのタグメンテーションを用いて別のチューブ内で形成される方法を示す（Ａ）。ライブラリー産物は、ＨＹＢ及びＨＹＢ’のハイブリダイゼーションに基づいてハイブリダイズした付加物を形成することができ、ポリヌクレオチドを伸長を介して生成することができる（Ｂ）。 チューブ１（Ｐ５によってビーズに固定された１型ＢＬＴ）及びチューブ２（Ｐ７によってビーズに固定された２型ＢＬＴ）におけるビーズに連結したトランスポソーム（ＢＬＴ）によるライブラリー産物の調製を示す。Ｐ７は、単一のデスチオビオチンを用いてビーズに固定することができ、これは、遊離緩衝液を用いてストレプトアビジン被覆ビーズから容易に除去することができる（Ａ）。したがって、Ｐ７－ＨＹＢライブラリーは、ビーズから選択的に遊離され、ビーズタイプ１上のＰ５－ＨＹＢ’ライブラリーにハイブリダイズが可能になり得る（Ｂ）。伸長後、連結された核酸配列決定鋳型が生成される。 チューブ１（Ｐ５によってビーズに固定された１型ＢＬＴ）及びチューブ２（Ｐ７によってビーズに固定された２型ＢＬＴ）におけるビーズに連結したトランスポソーム（ＢＬＴ）によるライブラリー産物の調製を示す。Ｐ７は、単一のデスチオビオチンを用いてビーズに固定することができ、これは、遊離緩衝液を用いてストレプトアビジン被覆ビーズから容易に除去することができる（Ａ）。したがって、Ｐ７－ＨＹＢライブラリーは、ビーズから選択的に遊離され、ビーズタイプ１上のＰ５－ＨＹＢ’ライブラリーにハイブリダイズが可能になり得る（Ｂ）。伸長後、連結された核酸配列決定鋳型が生成される。 一方のライブラリー産物がＨＹＢ’を含み、他方のライブラリー産物がＨＹＢを含む、２つのライブラリーの生成を可能にするビーズに連結したトランスポゾンに基づく簡易な単一チューブでのワークフローを示す（Ａ）。変性、ハイブリダイゼーション、及び伸長のプロセスにより、連結された核酸配列決定鋳型が調製される（Ｂ）。 一方のライブラリー産物がＨＹＢ’を含み、他方のライブラリー産物がＨＹＢを含む、２つのライブラリーの生成を可能にするビーズに連結したトランスポゾンに基づく簡易な単一チューブでのワークフローを示す（Ａ）。変性、ハイブリダイゼーション、及び伸長のプロセスにより、連結された核酸配列決定鋳型が調製される（Ｂ）。 配列決定に使用できる２つのインサートを含むポリヌクレオチドを生成するために使用できる、２つのライブラリー産物を生成するための代表的なＴｒｕｓｅｑ法を示す。ＳＢＳ配列は、配列決定プライマーに結合し得る配列であり、例えば、ＳＢＳ配列は、既知の配列決定プライマーに相補的な配列を含み得る。この図における「ＳＢＳ」は、ＳＢＳ配列、又はＳＢＳ配列に完全に若しくは部分的に相補的な配列（例えば、ＳＢＳ又はＳＢＳ’）のいずれかを総称的に指す。 タンデムライブラリーを生成するために使用される２つのライブラリー産物（Ｐ５－ＨＹＢ’及びＰ７－ＨＹＢ）と比較した、Ｔｒｕｓｅｑ法によって生成されたタンデムライブラリー（すなわち、２つのインサート配列を含むポリヌクレオチド）のサイズに関するバイオアナライザーの結果を示す。 各フォーク型アダプターの付着ポリヌクレオチド及びハイブリダイゼーションポリヌクレオチドがＳＢＳ配列を含む、Ｔｒｕｓｅｑ法によって生成された２つのライブラリーを示す。図１２に示されるように、「ＳＢＳ」は、ＳＢＳ又はＳＢＳ’配列のいずれかを総称的に指し得る（すなわち、図１２のタンデムＳＢＳ配列は、完全に又は部分的に相補的なＳＢＳ／ＳＢＳ’配列を含むことができる）。 各フォーク型アダプターの付着ポリヌクレオチドがＡ１４及びＭＥ又はＢ１５及びＭＥのいずれかを含む、Ｔｒｕｓｅｑ法によって生成された２つのライブラリーを示す。 リード１－Ａ ｓｅｑプライマー（第１のリードプライマー１、（Ａ））及びリード１－Ｂ ｓｅｑプライマー（第２のリードプライマー、（Ｂ））を有する２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドの配列決定のデータのサムネイル画像を示す。 リード１－Ａ ｓｅｑプライマー（第１のリードプライマー１、（Ａ））及びリード１－Ｂ ｓｅｑプライマー（第２のリードプライマー、（Ｂ））を有する２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドの配列決定のデータのサムネイル画像を示す。 ライゲーションを使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１５Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位を有する例示的な第１の出発ライブラリーを示す。図１５Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位を有する例示的な第２の出発ライブラリーを示す。２つの出発ライブラリーの各々を、それぞれの制限酵素で消化して、適合性オーバーハングを生成する（図１５Ｃ～Ｄ）。ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して消化されたＤＮＡを精製し、消化されたＤＮＡを一緒にライゲーションする（図１５Ｅ）。ＤＮＡの各新しい断片は、フォーク型ハンドルの相補性に関する問題を軽減する固有のアダプターを有する。プライマーリード１、２、３、及び４を使用して、新しいライブラリーを配列決定する（図１５Ｆ）。例示的なＰ５及びＰ７配列は、黒色のハイライト及び白色のテキストで示される。 ライゲーションを使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１５Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位を有する例示的な第１の出発ライブラリーを示す。図１５Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位を有する例示的な第２の出発ライブラリーを示す。２つの出発ライブラリーの各々を、それぞれの制限酵素で消化して、適合性オーバーハングを生成する（図１５Ｃ～Ｄ）。ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して消化されたＤＮＡを精製し、消化されたＤＮＡを一緒にライゲーションする（図１５Ｅ）。ＤＮＡの各新しい断片は、フォーク型ハンドルの相補性に関する問題を軽減する固有のアダプターを有する。プライマーリード１、２、３、及び４を使用して、新しいライブラリーを配列決定する（図１５Ｆ）。例示的なＰ５及びＰ７配列は、黒色のハイライト及び白色のテキストで示される。 ライゲーションを使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１５Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位を有する例示的な第１の出発ライブラリーを示す。図１５Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位を有する例示的な第２の出発ライブラリーを示す。２つの出発ライブラリーの各々を、それぞれの制限酵素で消化して、適合性オーバーハングを生成する（図１５Ｃ～Ｄ）。ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して消化されたＤＮＡを精製し、消化されたＤＮＡを一緒にライゲーションする（図１５Ｅ）。ＤＮＡの各新しい断片は、フォーク型ハンドルの相補性に関する問題を軽減する固有のアダプターを有する。プライマーリード１、２、３、及び４を使用して、新しいライブラリーを配列決定する（図１５Ｆ）。例示的なＰ５及びＰ７配列は、黒色のハイライト及び白色のテキストで示される。 ライゲーションを使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１５Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位を有する例示的な第１の出発ライブラリーを示す。図１５Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位を有する例示的な第２の出発ライブラリーを示す。２つの出発ライブラリーの各々を、それぞれの制限酵素で消化して、適合性オーバーハングを生成する（図１５Ｃ～Ｄ）。ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して消化されたＤＮＡを精製し、消化されたＤＮＡを一緒にライゲーションする（図１５Ｅ）。ＤＮＡの各新しい断片は、フォーク型ハンドルの相補性に関する問題を軽減する固有のアダプターを有する。プライマーリード１、２、３、及び４を使用して、新しいライブラリーを配列決定する（図１５Ｆ）。例示的なＰ５及びＰ７配列は、黒色のハイライト及び白色のテキストで示される。 ライゲーションを使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１５Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位を有する例示的な第１の出発ライブラリーを示す。図１５Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位を有する例示的な第２の出発ライブラリーを示す。２つの出発ライブラリーの各々を、それぞれの制限酵素で消化して、適合性オーバーハングを生成する（図１５Ｃ～Ｄ）。ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して消化されたＤＮＡを精製し、消化されたＤＮＡを一緒にライゲーションする（図１５Ｅ）。ＤＮＡの各新しい断片は、フォーク型ハンドルの相補性に関する問題を軽減する固有のアダプターを有する。プライマーリード１、２、３、及び４を使用して、新しいライブラリーを配列決定する（図１５Ｆ）。例示的なＰ５及びＰ７配列は、黒色のハイライト及び白色のテキストで示される。 ライゲーションを使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１５Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位を有する例示的な第１の出発ライブラリーを示す。図１５Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位を有する例示的な第２の出発ライブラリーを示す。２つの出発ライブラリーの各々を、それぞれの制限酵素で消化して、適合性オーバーハングを生成する（図１５Ｃ～Ｄ）。ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して消化されたＤＮＡを精製し、消化されたＤＮＡを一緒にライゲーションする（図１５Ｅ）。ＤＮＡの各新しい断片は、フォーク型ハンドルの相補性に関する問題を軽減する固有のアダプターを有する。プライマーリード１、２、３、及び４を使用して、新しいライブラリーを配列決定する（図１５Ｆ）。例示的なＰ５及びＰ７配列は、黒色のハイライト及び白色のテキストで示される。 ２つの異なる末端を有するタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１６Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位及びＰ５－リード１部位を有するアダプターを使用して第１のライブラリーを作製するための例示的なワークフローを示す。図１６Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位及びＰ７－リード２部位を有するアダプターを使用して第２のライブラリーを作製するための例示的なワークフローを示す。両方のライブラリーは、１つのプライマーを使用するプライマー伸長によって二本鎖にされる。 ２つの異なる末端を有するタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。図１６Ａは、ＢｔｇＺＩ切断部位及びＰ５－リード１部位を有するアダプターを使用して第１のライブラリーを作製するための例示的なワークフローを示す。図１６Ｂは、ＢｇｌＩＩ切断部位及びＰ７－リード２部位を有するアダプターを使用して第２のライブラリーを作製するための例示的なワークフローを示す。両方のライブラリーは、１つのプライマーを使用するプライマー伸長によって二本鎖にされる。 鎖オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）法を使用してタンデムインサートライブラリーを調製する例示的な方法を示す。ＤＮＡ１及びＤＮＡ２は、例示的な第１及び第２のライブラリーに対する入力を表す。ＤＮＡ１及びＤＮＡ２は別々に調製され、その結果、それぞれの得られたタンデムインサートライブラリーは、固有のアダプターに付加されたＤＮＡを有する。各ライブラリーを剪断してＤＮＡ断片を生成し、ポリメラーゼで処理して、剪断プロセスで生じた損傷ＤＮＡ末端を除去する。ＤＮＡ断片をポリメラーゼで処理して平滑末端ＤＮＡ二本鎖を生成し、キナーゼで処理してＤＮＡ断片の５’ＯＨをリン酸化する。次いで、ポリメラーゼを使用して、アデニンを各二重鎖の３’末端に付加し、ＤＮＡ断片をアダプターにライゲーションする。第１のライブラリーは、Ｐ５－リード１／Ａアダプター（アダプター１）とライゲーションする。第２のライブラリーは、Ｐ７－インデックス－リード２／Ａ’アダプター（アダプター２又は３）とライゲーションする。ライブラリーを精製して、１５０～２００塩基対断片を選択する。ライブラリーを混合し、ＰＣＲ反応に添加する。ＤＮＡ断片を高温で変性し、低温で再アニールする。これにより、Ａ及びＡ’相補的配列が互いにハイブリダイズする。ポリメラーゼにより鎖を伸長して、タンデムインサートポリヌクレオチドを形成する。ＥＲ＝末端修復。Ａ－テール＝アデニンテール。タグ＝バーコード配列中の例示的なインデックス。Ｐ５＝Ｐ５プライマー配列。Ｐ７＝Ｐ７プライマー配列。いくつかの実施形態では、タグは、Ｐ７に隣接して付加される。いくつかの実施形態では、タグは、Ｐ５に隣接して付加される。 アダプター配列によって分離された２つのインサートを有する例示的なライブラリー断片を示す。示されるように、４つの配列決定リードが可能である。リード１及び４は、第１のインサート由来のペアエンドデータを与える。リード２及び３は、第２のインサート由来のペアエンドデータを与える。Ｐ５＝Ｐ５プライマー配列。Ｐ７＝Ｐ７プライマー配列。 ２つの別個のゲノム（Ｅ．ｃｏｌｉ及びヒト）由来のインサート、又は同じゲノム由来の２つの別個のアンプリコンを有する例示的なタンデムインサートライブラリー断片を示す。２つのインサートは、アダプター配列によって分離されている。示されるように、４つの配列決定リードが可能である。例えば、リード１及び４は、Ｅ．ｃｏｌｉインサート由来のペアエンドデータを与える。リード２及び３は、ヒトインサート由来のペアエンドデータを与える。Ｐ５＝Ｐ５プライマー配列。Ｐ７＝Ｐ７プライマー配列。 図１５Ａ～図１５Ｆに示されるライゲーション法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２０Ａ＝リード１。図２０Ｂ＝リード２。図２０Ｃ＝リード３。図２０Ｄ＝リード４。 図１５Ａ～図１５Ｆに示されるライゲーション法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２０Ａ＝リード１。図２０Ｂ＝リード２。図２０Ｃ＝リード３。図２０Ｄ＝リード４。 図１５Ａ～図１５Ｆに示されるライゲーション法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２０Ａ＝リード１。図２０Ｂ＝リード２。図２０Ｃ＝リード３。図２０Ｄ＝リード４。 図１５Ａ～図１５Ｆに示されるライゲーション法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２０Ａ＝リード１。図２０Ｂ＝リード２。図２０Ｃ＝リード３。図２０Ｄ＝リード４。 図１５Ａ～図１５Ｆに示されるライゲーション法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。各サイクル数又はリードでのベースコール割合を示す。各インサートは、当該ゲノムについて正確な塩基組成を示す。図２１Ａ＝Ｅ．ｃｏｌｉインサートに対するリード１及び４。図２１Ｂ＝ヒトインサートに対するリード２及び３。 図１５Ａ～図１５Ｆに示されるライゲーション法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。各サイクル数又はリードでのベースコール割合を示す。各インサートは、当該ゲノムについて正確な塩基組成を示す。図２１Ａ＝Ｅ．ｃｏｌｉインサートに対するリード１及び４。図２１Ｂ＝ヒトインサートに対するリード２及び３。 図１７に示されるＳＯＥ法を用いて作製されるタンデムインサートライブラリー断片を示す。剪断したゲノムＤＮＡフラグメントを用いる代わりに、この実験では単一鋳型（ｍｏｎｏｔｅｍｐｌａｔｅｓ）を使用し、ＰｈｉＸアンプリコンをインサート１に使用し、Ｅ．ｃｏｌｉアンプリコンをインサート２に使用した。アダプターを単一鋳型にライゲーションし、図１７に示されるように、ＳＯＥ法を用いてタンデムインサートライブラリーを作製した。リード１及び４は、ＰｈｉＸアンプリコン由来のペアエンドデータを与える。リード２及び３は、Ｅ．ｃｏｌｉアンプリコン由来のペアエンドデータを与える。Ｐ５＝Ｐ５プライマー配列。Ｐ７＝Ｐ７プライマー配列。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２３Ａ＝リード１。図２３Ｂ＝リード２。図２３Ｃ＝リード３。図２３Ｄ＝リード４。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２３Ａ＝リード１。図２３Ｂ＝リード２。図２３Ｃ＝リード３。図２３Ｄ＝リード４。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２３Ａ＝リード１。図２３Ｂ＝リード２。図２３Ｃ＝リード３。図２３Ｄ＝リード４。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２３Ａ＝リード１。図２３Ｂ＝リード２。図２３Ｃ＝リード３。図２３Ｄ＝リード４。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２４Ａは、タンデムインサートライブラリーポリヌクレオチド由来のリード１、２、３、及び４の予想配列を示す。ダブルスラッシュマーク「／／」は、示されるＤＮＡ配列が単一のポリヌクレオチド鋳型に属することを示す。図２４Ｂ～Ｃは、観察されたリード１（図２４Ｂ）及びリード２配列（図２４Ｃ）を示す。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２４Ａは、タンデムインサートライブラリーポリヌクレオチド由来のリード１、２、３、及び４の予想配列を示す。ダブルスラッシュマーク「／／」は、示されるＤＮＡ配列が単一のポリヌクレオチド鋳型に属することを示す。図２４Ｂ～Ｃは、観察されたリード１（図２４Ｂ）及びリード２配列（図２４Ｃ）を示す。 図１７に示されるＳＯＥ法を使用して生成されたタンデムインサートライブラリーの配列決定データを示す。図２４Ａは、タンデムインサートライブラリーポリヌクレオチド由来のリード１、２、３、及び４の予想配列を示す。ダブルスラッシュマーク「／／」は、示されるＤＮＡ配列が単一のポリヌクレオチド鋳型に属することを示す。図２４Ｂ～Ｃは、観察されたリード１（図２４Ｂ）及びリード２配列（図２４Ｃ）を示す。 標的核酸由来の複数のインサートを含む配列決定鋳型を調製するために使用され得るフォーク型アダプターの概要を提供する。第１のフォーク型アダプター（「第１のアダプター」）の第１のオリゴヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’末端と、第１のリード配列決定アダプター配列（Ｐ５．Ｒ１）などのアダプターを含む５’末端とを含み得る。第１のアダプターはまた、第１のオリゴヌクレオチドに含まれるトランスポゾン末端配列の相補体を含む５’末端と、ハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）を含む３’末端とを含む第２のオリゴヌクレオチドも含み得る。第１のアダプターはまた、Ｘ’に結合することができるブロッキングオリゴヌクレオチド（Ｘ’Ｂ）である第３のオリゴヌクレオチドも含み得る。並行して、第２のフォーク型アダプター（「第２のアダプター」）の第１のオリゴヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む３’末端と、第２のリード配列決定アダプター配列（Ｐ７．Ｒ２）などのアダプターを含む５’末端とを含む第１のオリゴヌクレオチドを含み得る。第２のアダプターはまた、第１のオリゴヌクレオチドに含まれるトランスポゾン末端配列の相補体を含む５’末端と、ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）を含む３’末端とを含む第２のオリゴヌクレオチドも含み得る。第２のアダプターはまた、Ｘに結合することができるブロッキングオリゴヌクレオチド（Ｘ’Ｂ’）である第３のオリゴヌクレオチドも含み得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドが除去されるまで、第１のフォーク型アダプター中のＸ’の第２のフォーク型アダプター中のＸへのハイブリダイゼーションをブロックするように働く。第１のアダプター及び第２のアダプターは共に、本明細書に記載されるように、２つのインサートを含む配列決定鋳型を調製するための方法において使用され得る。Ｂｉｏ＝ビオチンであり、親和性部分として使用することができる。 本発明の方法において使用され得る異なる第１及び第２のフォーク型アダプターの組み合わせを、溶液中のトランスポソームを使用する類似の断片の調製方法の提示とともに示す。（Ａ）第１及び第２のフォーク型アダプターの両方の第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｂ）第１のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｃ）第２のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｄ）溶液中のトランスポソームの２つのプールを使用して、標的核酸を溶液中の断片にタグメンテーションできる。不活化（例えば、ＳＤＳによる）並びに、伸長－ライゲーションミックス（ＥＬＭ）を用いる伸長及びライゲーションの後、類似のタグ付けされた断片を、フォーク型アダプターのライゲーションについてＡ～Ｃに示されるように調製され得る。 本発明の方法において使用され得る異なる第１及び第２のフォーク型アダプターの組み合わせを、溶液中のトランスポソームを使用する類似の断片の調製方法の提示とともに示す。（Ａ）第１及び第２のフォーク型アダプターの両方の第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｂ）第１のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｃ）第２のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｄ）溶液中のトランスポソームの２つのプールを使用して、標的核酸を溶液中の断片にタグメンテーションできる。不活化（例えば、ＳＤＳによる）並びに、伸長－ライゲーションミックス（ＥＬＭ）を用いる伸長及びライゲーションの後、類似のタグ付けされた断片を、フォーク型アダプターのライゲーションについてＡ～Ｃに示されるように調製され得る。 本発明の方法において使用され得る異なる第１及び第２のフォーク型アダプターの組み合わせを、溶液中のトランスポソームを使用する類似の断片の調製方法の提示とともに示す。（Ａ）第１及び第２のフォーク型アダプターの両方の第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｂ）第１のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｃ）第２のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｄ）溶液中のトランスポソームの２つのプールを使用して、標的核酸を溶液中の断片にタグメンテーションできる。不活化（例えば、ＳＤＳによる）並びに、伸長－ライゲーションミックス（ＥＬＭ）を用いる伸長及びライゲーションの後、類似のタグ付けされた断片を、フォーク型アダプターのライゲーションについてＡ～Ｃに示されるように調製され得る。 本発明の方法において使用され得る異なる第１及び第２のフォーク型アダプターの組み合わせを、溶液中のトランスポソームを使用する類似の断片の調製方法の提示とともに示す。（Ａ）第１及び第２のフォーク型アダプターの両方の第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｂ）第１のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｃ）第２のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。（Ｄ）溶液中のトランスポソームの２つのプールを使用して、標的核酸を溶液中の断片にタグメンテーションできる。不活化（例えば、ＳＤＳによる）並びに、伸長－ライゲーションミックス（ＥＬＭ）を用いる伸長及びライゲーションの後、類似のタグ付けされた断片を、フォーク型アダプターのライゲーションについてＡ～Ｃに示されるように調製され得る。 図２６Ａ～２６Ｄに示される第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターの混合物を有する溶液中でのライゲーション又はタグメンテーションによって生成され得る、異なるタグ付けされた断片を示す。（Ａ）一方の末端が第１のフォーク型アダプターで、他方の末端がライゲーションされた第２のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。（Ｂ）両端が第１のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。（Ｃ）第１及び第２の末端の両方でライゲーションされた第２のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。タグ付けされた断片の予想される比は、５０％（Ａ）：２５％（Ｂ）：２５％（Ｃ）であろう。 図２６Ａ～２６Ｄに示される第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターの混合物を有する溶液中でのライゲーション又はタグメンテーションによって生成され得る、異なるタグ付けされた断片を示す。（Ａ）一方の末端が第１のフォーク型アダプターで、他方の末端がライゲーションされた第２のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。（Ｂ）両端が第１のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。（Ｃ）第１及び第２の末端の両方でライゲーションされた第２のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。タグ付けされた断片の予想される比は、５０％（Ａ）：２５％（Ｂ）：２５％（Ｃ）であろう。 図２６Ａ～２６Ｄに示される第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターの混合物を有する溶液中でのライゲーション又はタグメンテーションによって生成され得る、異なるタグ付けされた断片を示す。（Ａ）一方の末端が第１のフォーク型アダプターで、他方の末端がライゲーションされた第２のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。（Ｂ）両端が第１のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。（Ｃ）第１及び第２の末端の両方でライゲーションされた第２のフォーク型アダプターでタグ付けされた断片。タグ付けされた断片の予想される比は、５０％（Ａ）：２５％（Ｂ）：２５％（Ｃ）であろう。 異なるタイプのタグ付けされた断片（図２５に示される代表的な第１及び第２のアダプターを用いる方法又は図２６Ｄの方法を使用）が、固体支持体の表面上に固定された後にハイブリダイズする又はハイブリダイズしない方法を示す。説明を容易にするために、左及び右に示される固体支持体は、固体支持体上の同じ表面の２つの異なる図を提示し、核酸断片は全て、固体支持体上の同じ表面から上方に伸長し、ハイブリダイズした断片は架橋構成を形成する。（Ａ）インサートを含む二本鎖断片を固体支持体の表面に固定し、変性させることにより、２つの一本鎖断片を生成する。一方の末端に第１のフォーク型アダプター（Ｐ５．Ｒ１）のライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチド、及び他方の末端（Ｘ）に第２のフォーク型アダプターのライゲーションされた第２のオリゴヌクレオチドを含む第１の一本鎖断片は、一方の末端に第１のフォーク型アダプター（Ｘ’）のライゲーションされた第２の鎖、及び他方の末端（Ｐ７．Ｒ２）に第２のフォーク型アダプターのライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチドを含む第２の一本鎖断片にハイブリダイズし得る。二本鎖断片由来の両方の鎖は、二本鎖断片が変性した後に互いに近接して固定されている可能性が高いため（図示）、これらの２つの断片は、互いの相補体である可能性が高い（すなわち、同じ二本鎖断片に含まれる２つの一本鎖であった）。２つの断片はまた、互いの相補体ではない配列であり得る（図示せず）。２つの一本鎖断片のこのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）のハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）への結合を介して起こる。Ｘ／Ｘ’による２つの断片のハイブリダイゼーション後、ライゲーションされた配列の３’末端から伸長を行うことができる。（Ｂ）両末端に第１のフォーク型アダプター由来のライゲーションされた第１／第２のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖のタグ付けされた断片は、互いにハイブリダイズすることができない（それらが両方とも一方の末端にＸ’配列を含むため）。（Ｃ）両端に第２のフォーク型アダプター由来のライゲーションされた第１／第２のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖のタグ付けされた断片は、ハイブリダイゼーション配列において互いにハイブリダイズすることができない（それらが両方とも一方の末端にＸ配列を含むため）。したがって、ハイブリダイゼーション配列で互いにハイブリダイズできる同じインサートを有する一本鎖断片の１００％は、第１の末端に１つのフォーク型アダプター及び第２の末端に第２のフォーク型アダプターを有する二本鎖断片から調製されたものである。 異なるタイプのタグ付けされた断片（図２５に示される代表的な第１及び第２のアダプターを用いる方法又は図２６Ｄの方法を使用）が、固体支持体の表面上に固定された後にハイブリダイズする又はハイブリダイズしない方法を示す。説明を容易にするために、左及び右に示される固体支持体は、固体支持体上の同じ表面の２つの異なる図を提示し、核酸断片は全て、固体支持体上の同じ表面から上方に伸長し、ハイブリダイズした断片は架橋構成を形成する。（Ａ）インサートを含む二本鎖断片を固体支持体の表面に固定し、変性させることにより、２つの一本鎖断片を生成する。一方の末端に第１のフォーク型アダプター（Ｐ５．Ｒ１）のライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチド、及び他方の末端（Ｘ）に第２のフォーク型アダプターのライゲーションされた第２のオリゴヌクレオチドを含む第１の一本鎖断片は、一方の末端に第１のフォーク型アダプター（Ｘ’）のライゲーションされた第２の鎖、及び他方の末端（Ｐ７．Ｒ２）に第２のフォーク型アダプターのライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチドを含む第２の一本鎖断片にハイブリダイズし得る。二本鎖断片由来の両方の鎖は、二本鎖断片が変性した後に互いに近接して固定されている可能性が高いため（図示）、これらの２つの断片は、互いの相補体である可能性が高い（すなわち、同じ二本鎖断片に含まれる２つの一本鎖であった）。２つの断片はまた、互いの相補体ではない配列であり得る（図示せず）。２つの一本鎖断片のこのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）のハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）への結合を介して起こる。Ｘ／Ｘ’による２つの断片のハイブリダイゼーション後、ライゲーションされた配列の３’末端から伸長を行うことができる。（Ｂ）両末端に第１のフォーク型アダプター由来のライゲーションされた第１／第２のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖のタグ付けされた断片は、互いにハイブリダイズすることができない（それらが両方とも一方の末端にＸ’配列を含むため）。（Ｃ）両端に第２のフォーク型アダプター由来のライゲーションされた第１／第２のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖のタグ付けされた断片は、ハイブリダイゼーション配列において互いにハイブリダイズすることができない（それらが両方とも一方の末端にＸ配列を含むため）。したがって、ハイブリダイゼーション配列で互いにハイブリダイズできる同じインサートを有する一本鎖断片の１００％は、第１の末端に１つのフォーク型アダプター及び第２の末端に第２のフォーク型アダプターを有する二本鎖断片から調製されたものである。 異なるタイプのタグ付けされた断片（図２５に示される代表的な第１及び第２のアダプターを用いる方法又は図２６Ｄの方法を使用）が、固体支持体の表面上に固定された後にハイブリダイズする又はハイブリダイズしない方法を示す。説明を容易にするために、左及び右に示される固体支持体は、固体支持体上の同じ表面の２つの異なる図を提示し、核酸断片は全て、固体支持体上の同じ表面から上方に伸長し、ハイブリダイズした断片は架橋構成を形成する。（Ａ）インサートを含む二本鎖断片を固体支持体の表面に固定し、変性させることにより、２つの一本鎖断片を生成する。一方の末端に第１のフォーク型アダプター（Ｐ５．Ｒ１）のライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチド、及び他方の末端（Ｘ）に第２のフォーク型アダプターのライゲーションされた第２のオリゴヌクレオチドを含む第１の一本鎖断片は、一方の末端に第１のフォーク型アダプター（Ｘ’）のライゲーションされた第２の鎖、及び他方の末端（Ｐ７．Ｒ２）に第２のフォーク型アダプターのライゲーションされた第１のオリゴヌクレオチドを含む第２の一本鎖断片にハイブリダイズし得る。二本鎖断片由来の両方の鎖は、二本鎖断片が変性した後に互いに近接して固定されている可能性が高いため（図示）、これらの２つの断片は、互いの相補体である可能性が高い（すなわち、同じ二本鎖断片に含まれる２つの一本鎖であった）。２つの断片はまた、互いの相補体ではない配列であり得る（図示せず）。２つの一本鎖断片のこのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）のハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）への結合を介して起こる。Ｘ／Ｘ’による２つの断片のハイブリダイゼーション後、ライゲーションされた配列の３’末端から伸長を行うことができる。（Ｂ）両末端に第１のフォーク型アダプター由来のライゲーションされた第１／第２のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖のタグ付けされた断片は、互いにハイブリダイズすることができない（それらが両方とも一方の末端にＸ’配列を含むため）。（Ｃ）両端に第２のフォーク型アダプター由来のライゲーションされた第１／第２のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖のタグ付けされた断片は、ハイブリダイゼーション配列において互いにハイブリダイズすることができない（それらが両方とも一方の末端にＸ配列を含むため）。したがって、ハイブリダイゼーション配列で互いにハイブリダイズできる同じインサートを有する一本鎖断片の１００％は、第１の末端に１つのフォーク型アダプター及び第２の末端に第２のフォーク型アダプターを有する二本鎖断片から調製されたものである。 フォーク型アダプターを使用して調製された各鎖に２つのインサートを含む二本鎖の連結された配列決定鋳型を示す。この代表的な例において、両方のインサートは、鎖Ａ又は鎖Ａ’（図示）の同じインサート配列のコピーである。他の例では、二本鎖の連結された配列決定鋳型の各鎖における２つのインサート配列は、互いに異なっていてもよい（図示せず）。 変性（二本鎖断片の鎖を分離し、ブロッキングオリゴヌクレオチドを除去するため）及び固定された一本鎖断片のアニーリングの方法を示す。フォーク型アダプターのライゲーション後に使用される場合、これらの方法は、各鎖に２つのインサートを含む連結された配列決定鋳型を調製することができる。二本鎖断片の両方の鎖が拘束され、固体支持体の同じ領域内で結合する可能性が高いため、この方法は、多くの場合、同じインサート配列（例えば、Ａ’／Ａ’及びＡ／Ａ）の２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型を生成する。連結された配列決定鋳型は、異なるアダプター（例えば、Ａ／Ａ’、Ｂ／Ｂ’、及びＤ／Ｄ’）を含む一本鎖断片から調製され得るが、連結された配列決定鋳型（１つの二本鎖断片から生成された２つの一本鎖断片から生成）は、両端に同じアダプター（例えば、Ｃ／Ｃ’及びＥ／Ｅ’）を含む一本鎖断片から調製されない。 区画としてチューブ又はウェルを使用して連結された配列決定鋳型を調製する方法を示す。ｆ１、ｆ２、及びｆ３は、後に小断片に変換され得る、異なる比較的大きな断片を指す。 区画として液滴を使用して連結された配列決定鋳型を調製する方法を示す。 区画を使用するハプロタイプフェージングのための連結された配列決定鋳型を調製する方法を示す。試料を区画内で限界希釈することで、異なるハプロタイプの２つの染色体が同じ区画内に含まれる可能性を非常に低くする。この例では、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ１及びＣｈｒ２－Ｈａｐ１は１つの区画に含まれ、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ２及びＣｈｒ２－Ｈａｐ２は異なる区画に含まれる。チェック付き矢印で示されるボックスは、変性、再アニーリング、及び伸長のプロセス後に生成され得る連結された配列決定鋳型を含む。「Ｘ」の矢印で示されるボックスは、生成され得ない連結された配列決定鋳型を示す（これらの染色体が異なる区画に含まれていたため）。連結された配列決定鋳型は、同じ区画に含まれていた染色体由来のインサート配列のみを含むことができ、これらの鋳型は、チェック付き矢印で示されるボックスに含まれる。チェック付き矢印で示されるボックス内の破線の楕円は、元のハプロタイプを構成する連結された配列決定鋳型を表す。チェック付き矢印で示されるボックス内の他の連結された配列決定鋳型（すなわち、破線の楕円内にないもの）は、異なる染色体に由来するインサートを含む。 ２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型を調製するために使用され得るトランスポソームを示す。第１及び第２のトランスポソームはそれぞれ、フォーク型アダプターを含む。本明細書で使用される場合、「第１のオリゴ」又は「第１の鎖」は、フォーク型アダプターに含まれる第１のトランスポゾンを指し得、「第２のオリゴ」又は「第２の鎖」は、フォーク型アダプターに含まれる第２のトランスポゾンを指し得る。第１のトランスポソームのフォーク型アダプターは、３’トランスポゾン末端配列（ＭＥ、配列番号６など）及び５’第１リード配列決定アダプター配列（Ｐ５．Ｒ１）を含む第１の鎖と、トランスポゾン末端配列の５’相補体（ＭＥ’、配列番号３など）及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体（Ｘ’）を含む第２の鎖とを含む。第２のトランスポソームのフォーク型アダプターは、３’トランスポゾン末端配列及び５’第２リード配列決定アダプター配列（Ｐ７．Ｒ２）を含む第１の鎖と、トランスポゾン末端配列の５’相補体及び３’ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）を含む第２の鎖とを含む。この代表的な例は、トランスポソームの２つのプールを示し、各プールはホモダイマーである（２つのチェック柄のトランスポゾン又は２つの縞模様のトランスポゾンで示される）。本明細書に記載されるように、トランスポソームはヘテロダイマーを含んでもよい。 その表面上に固定されている固定されたトランスポソーム（図３４に更に詳細に示す）を有する固体支持体を示す。Ｂ＝ビオチンであり、トランスポソームを固体支持体の表面に結合させるための親和性部分として使用される。 図３５に示される固体支持体を使用するタグメンテーションの工程を示す。二本鎖核酸を固体支持体に添加する。次に、タグメンテーションによって断片を調製する。ＳＤＳ及び洗浄を使用してトランスポザーゼを除去する。最後に、伸長ライゲーションミックス（ＥＬＭ）緩衝液を用いて伸長及びライゲーションを行う。この例は、１対のトランスポソームのみによるタグメンテーションを示す。 トランスポソームによって生成された断片の架橋を示す。二本鎖ＤＮＡは、センス鎖に配列Ａを含み、アンチセンス鎖にＡ’を含み得る。架橋は、第１のトランスポソームと第２のトランスポソームとの間、又は第１のトランスポソームと第１のトランスポソームとの間、又は第２のトランスポソームと第２のトランスポソームとの間にあってもよい。このような順列は、それぞれ５０：２５：２５の比で生じる。 トランスポソームの遊離及び断片の変性後の固定された断片を示す。一本鎖断片は、第１のトランスポソーム及び第２のトランスポソーム（５０％）から、又は第１のトランスポソーム及び第１のトランスポソーム（２５％）から、又は第２のトランスポソーム及び第２のトランスポソーム（２５％）から調製されている場合がある。したがって、断片は、どのトランスポソームが各断片を調製したかに基づいて、その遊離末端にＸ又はＸ’のいずれかを有する。 代表的な一本鎖断片と、それらが互いにハイブリダイズして架橋を形成し得るかどうかを示す。２つの異なる一本鎖断片におけるＸ／Ｘ’セットの配列はハイブリダイズすることができ（１００％のハイブリダイゼーションを生じる）、Ｘ’／Ｘ’セットの配列はハイブリダイズすることができず（０％）、Ｘ／Ｘの配列セットはハイブリダイズすることができない（０％）。したがって、１００％架橋された一本鎖断片は、１つの断片中のＸ配列の別の断片中のＸ’への結合（すなわち、ハイブリダイゼーション配列のその相補体への結合）から調製される。 インサート配列の２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型の形成（又は非形成）を示す。Ｘ／Ｘ’配列のハイブリダイゼーション（１００％）後に、センス鎖中のタンデムのＡ鎖の２つのコピー及びアンチセンス鎖中のタンデムのＡ’鎖の２つのコピーを含む二本鎖の連結された配列決定鋳型が形成されるが、両方がＸ’を含む（０％）か、又は両方がＸ配列を含む（０％）一本鎖断片間には連結された配列決定鋳型は形成されない。得られた二本鎖の連結された配列決定鋳型は、一方の末端にＰ５又はＰ５’を含み、他方の末端にＰ７又はＰ７’を含み得る。 二本鎖核酸がトランスポソームによってタグメンテーションされて２つの架橋インサートが調製される場合に形成され得る架橋を示す。この代表的な例において、二本鎖核酸は、センス鎖に配列Ａ及びＢを含み、アンチセンス鎖に配列Ａ’及びＢ’を含む。トランスポソームに含まれる第１及び／又は第２のフォーク型アダプターとは異なるアダプター配列で２つの架橋断片をタグ付けするための例示的な選択肢を示す。 連結された配列決定鋳型を生成するための一本鎖断片間の例示的なハイブリダイゼーションを示す。これらのハイブリダイゼーションは、インサート及びその相補配列（例えば、Ａ／Ａ’又はＢ／Ｂ’）を含む断片間、又は２つの異なるインサート（例えば、Ａ／Ｂ、Ａ’／Ｂ、Ａ／Ｂ’、及びＡ’／Ｂ’）を含む断片間で起こり得る。いくつかのハイブリダイゼーションは全て、一方の末端にＰ５／Ｐ５’及び他方の末端にＰ７／Ｐ７’を有する配列決定可能な連結された配列決定鋳型を生成する（伸長後）。他のハイブリダイゼーションは、いくつかの配列決定不可能な連結された配列決定鋳型を生成する（伸長後）。配列決定不可能な連結された配列決定鋳型は、両末端にＰ５／Ｐ５’又は両末端にＰ７／Ｐ７’を有するものを含むことができ、これらの代表的な鋳型は破線のボックスで描かれている。 第２のフォーク型アダプターを含むトランスポソームのみから、又は第１のフォーク型アダプターを含むトランスポソームのみから調製された２つの架橋インサートを示す。 両末端に第２のフォーク型アダプター由来のアダプターを有する一本鎖断片が一緒にハイブリダイズすることができず、両末端に第１のフォーク型アダプター由来のアダプターを有する一本鎖断片が一緒にハイブリダイズすることができないことを示す。このハイブリダイゼーションの欠如は、Ｘ配列が別のＸ配列とハイブリダイズすることができず、同様にＸ’配列が別のＸ’配列とハイブリダイズすることができないためである。 ５つの架橋インサートの群が、異なるインサート配列を含む断片間の多様なハイブリダイゼーションをもたらし得る代表的な例を示す。図には示していないが、同じ配列のセンス及びアンチセンスを有する断片（Ａ及びＡ’など）もハイブリダイズすることができる。全ての対形成が、鋳型の末端に異なるアダプターを有する配列決定可能な連結された配列決定鋳型を生じる（伸長後）わけではないが、多くの組み合わせが生じる。ハイブリダイズした一本鎖断片から生成された例示的な連結された配列決定鋳型をボックス内に示す。 試料インデックスを含む配列決定鋳型を示す。（Ａ）第１のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖上の試料インデックスｉ５、及び第２のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖上の試料インデックスｉ７を、これらのトランスポソームを使用して調製し得る配列決定鋳型と共に含むトランスポソーム複合体。（Ｂ）第１のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖上の試料インデックスｉ８、及び第２のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖上の試料インデックスｉ６を、これらのトランスポソームを使用して調製し得る配列決定鋳型と共に含むトランスポソーム複合体。（Ｃ）第１及び第２のトランスポソームの第１及び第２の鎖が試料インデックスを含む場合に調製され得る代表的な配列決定鋳型。 試料インデックスを含む配列決定鋳型を示す。（Ａ）第１のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖上の試料インデックスｉ５、及び第２のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖上の試料インデックスｉ７を、これらのトランスポソームを使用して調製し得る配列決定鋳型と共に含むトランスポソーム複合体。（Ｂ）第１のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖上の試料インデックスｉ８、及び第２のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖上の試料インデックスｉ６を、これらのトランスポソームを使用して調製し得る配列決定鋳型と共に含むトランスポソーム複合体。（Ｃ）第１及び第２のトランスポソームの第１及び第２の鎖が試料インデックスを含む場合に調製され得る代表的な配列決定鋳型。 試料インデックスを含む配列決定鋳型を示す。（Ａ）第１のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖上の試料インデックスｉ５、及び第２のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖上の試料インデックスｉ７を、これらのトランスポソームを使用して調製し得る配列決定鋳型と共に含むトランスポソーム複合体。（Ｂ）第１のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖上の試料インデックスｉ８、及び第２のトランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖上の試料インデックスｉ６を、これらのトランスポソームを使用して調製し得る配列決定鋳型と共に含むトランスポソーム複合体。（Ｃ）第１及び第２のトランスポソームの第１及び第２の鎖が試料インデックスを含む場合に調製され得る代表的な配列決定鋳型。 連結された配列決定鋳型のためのプライマー結合部位として使用されるＡ１４、Ｂ１５’、又はＸ配列へのプライマーの結合後に、ＭＥ配列の配列決定を回避するために暗サイクルを使用し得る方法を示す。プライマーの結合は、配列決定リードの方向を示す矢印で示される。 インサート配列が、本明細書において修飾シトシンと称され得る、メチル化シトシン（ｍＣ）及びヒドロキシメチル化シトシン（ｈｍＣ）を含む、各鎖にインサート及びインサートのコピーを含む代表的な二本鎖の連結された配列決定鋳型を示す。一方の一本鎖鋳型は、センスインサート（Ｓ）及びそのコピー（Ｓ－コピー）を含み、他方の一本鎖鋳型は、アンチセンスインサート（Ｓ’）及びそのコピー（Ｓ’－コピー）を含む。Ｓ－コピー及びＳ’－コピーは、修飾シトシンを含まない。下線を引いたＡ、Ｔ、及びＧの位置は、非シトシンヌクレオチドを示す。 非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理（亜硫酸水素ナトリウムなど）による、図４８に示される鋳型の処理の結果を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図２５に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図２５に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図２５に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 修飾シトシン（メチル化シトシン及びヒドロキシメチル化シトシン）をジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ、例えばＴＡＰＳ法による）に変換する処理による、図４８に示される鋳型の処理の結果を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５１に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５１に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５１に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 メチル化ｄＣＴＰの存在下で行われた伸長により調製された配列決定鋳型を示す。Ｓ－コピー及びＳ’－コピーは、この方法によって調製される場合、メチル化シトシンを含み得る。 非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理による、図５３に示される配列決定鋳型の処理後の結果を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５４に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５４に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５４に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理による、図５３に示される配列決定鋳型の処理後の結果を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５４に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５４に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５４に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 β－グルコシルトランスフェラーゼ処理と、その後のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）処理を使用する、非修飾シトシン、メチル化シトシン、及びヒドロキシメチル化シトシンを区別するメチル化分析を行うための方法に含まれる代表的な工程を示す。 図５８で調製された配列決定鋳型中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する方法を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５９に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５９に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図５９に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）及びメチル化シトシンのＤＨＵへの変換を使用する、シトシン、メチル化シトシン、及びヒドロキシメチル化シトシンを区別するメチル化分析を行うための方法に含まれる代表的工程を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図６１に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図６１に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。 アンプリコンを調製するためのＰＣＲ前後の、図６１に示される二本鎖の連結された配列決定鋳型の上鎖（Ａ）及び下鎖（Ｂ）、並びに配列決定結果の分析（Ｃ）を示す。
配列の説明
表１は、本明細書中で参照される特定の配列のリストを提供する。
Figure 2023547366000006
Figure 2023547366000007
インサート配列が１つ以上の標的核酸に由来する、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に記載される。これらのポリヌクレオチドは、連結配列及び複数のプライマー配列を含み得る。本出願はまた、これらのポリヌクレオチドを生成する方法及びこれらのポリヌクレオチドの使用についても記載する。所与のポリヌクレオチド内の複数のインサート配列の存在は、フローセル当たりに生成されるリードの数を増加させることによって、配列決定プラットフォームの出力を増加させることができる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で参照される全ての特許、出願、公開出願、及び他の刊行物は、別途記載のない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書において用語のための複数の定義が存在する場合、別途記載のない限り、定義のセクション内のものが優先する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでない旨を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。別途記載のない限り、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法が採用される。「又は」又は「及び」の使用は、別途記載のない限り、「及び／又は」を意味する。更に、用語「含む（including）」、並びに他の形態、例えば、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含まれる（included）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書で使用される場合、移行句中か又は請求項の本文中のいずれであっても、用語「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、これらの用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。プロセスの文脈において使用される場合、用語「含む（comprising）」は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、構成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、化合物、構成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成目的のみのためであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
Ｉ．定義
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション配列」又は「ＨＹＢ」は、相補ハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズできる配列を指す。１つのライブラリー産物中のＨＹＢの別のライブラリー産物中のＨＹＢ’へのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション付加物をもたらすことができ、このとき、２つのライブラリー産物は、ＨＹＢ／ＨＹＢ’のハイブリダイゼーションを介して互いにアニールする。
本明細書中で使用される場合、「連結された核酸配列決定鋳型」とは、ポリヌクレオチド及びその相補体の二本鎖組成物をいう。連結された核酸配列決定鋳型は、ＨＹＢ／ＨＹＢ’のハイブリダイゼーションによる２つのライブラリー産物の会合、続く二本鎖鋳型を生成するための伸長によって生成され得る。
本明細書で使用される「インサート配列」は、ポリヌクレオチドに含まれる標的核酸の領域を指す。ポリヌクレオチドは、複数のインサート配列を含み得る。
本明細書で使用される「スタックされたリード」又は「タンデムリード」は、単一のポリヌクレオチドから生成される複数のインサート配列の配列決定リードに関する。これらの配列決定リードは連続的であり得る。例えば、２つ以上のインサート配列及び２つ以上のプライマー配列を含むポリヌクレオチドを使用して、タンデムリードを生成することができる。本明細書で使用される「タンデムリードライブラリー」は、タンデムリードを生成するために使用され得る複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを指す。
本明細書で使用される「ＳＢＳ」は、リードプライマーの結合を改善するためにポリヌクレオチドに組み込まれる配列を指す。ポリヌクレオチドがタグメンテーションによって産生されるライブラリー産物から作製される実施形態では、ＳＢＳはモザイク末端配列であってもよく、ＳＢＳ’はＭＥ及びＭＥ’などのモザイク末端配列の相補体であってもよい。ライブラリー産物がＴｒｕｓｅｑ法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して産生される場合、ＳＢＳ及びＳＢＳ’配列もアダプターに含まれ得る。
ＩＩ．複数のインサート配列を含むポリヌクレオチド
各インサートが１つ以上の標的核酸の一部を含む、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に記載される。複数のインサート配列を含む単一のポリヌクレオチドは、フローセルの同じ領域における１つ以上の標的核酸の複数の領域の配列決定を可能にする。このようにして、より大きなフローセルを必要とせずに、１つ以上の標的核酸のより多くの領域を配列決定することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、一方のライブラリー産物中のＨＹＢを他方のライブラリー産物中のＨＹＢ’配列にハイブリダイズさせてハイブリダイズした付加物を形成し、続いて伸長させて連結された核酸配列決定鋳型を生成することに基づいて、２つの別々のライブラリー産物から生成される。
これらのポリヌクレオチドはまた、追加の配列、例えば、１つ以上のプライマー配列、連結配列、付着ポリヌクレオチドも含み得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のリードプライマー結合配列を含む３’末端ポリヌクレオチドと、標的核酸に由来する３’末端ポリヌクレオチドの５’側の第１のインサート配列と、第１のリードプライマー結合配列に直交する第２のリードプライマー結合配列を含む連結配列であって、第２のリードプライマー結合配列がハイブリダイゼーション配列を含む、連結配列と、連結配列の５’側にあり、標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は第１のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、第２のインサート配列と、ポリヌクレオチドの５’末端にあり、付着配列を含む、付着ポリヌクレオチドと、を含み、３’末端ポリヌクレオチド、連結配列、及び付着ポリヌクレオチドは、標的核酸に由来しない。
図１は、４つのプライマー配列を有する例示的なポリヌクレオチドの配列決定により、２つの別個のインサート配列の配列決定を可能にする方法を示す、これらのポリヌクレオチドの概要を提示する。
図２は、連結配列が、ハイブリダイゼーション配列（ＨＹＢ）を含む第２のリードプライマー結合配列（リード２）と、Ｐ５’配列を含む３’ポリヌクレオチドに結合する第１のリードプライマー結合配列（リード１）と、Ｐ７配列を含む付着配列と、を含む、例示的なポリヌクレオチドの構造を示す。図３に示されるように、ポリヌクレオチド中の異なるインサートは、異なるライブラリーから生成され得る。
複数のインサート配列を有するポリヌクレオチドは、図４Ｂに対して図４Ａに示されるように、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリーと比較して、より多くの量の配列がフローセルから生成されることを可能にし得る。図４Ａ及び４Ｂでは、両方の場合において同じ量のフローセル表面を使用したため、単一のインサートを含むポリヌクレオチドと比較して、２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドを使用したフローセル表面の同じ面積について、２倍の配列が生成された。
配列決定鋳型として使用され得るポリヌクレオチドもまた、本明細書中に記載される。これらの配列決定鋳型は、当該技術分野で既知である任意の標準的な配列決定法とともに使用され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上のインサート配列を含む。本明細書で使用される「インサート配列」又は「インサート」は、ポリヌクレオチドに含まれる、二本鎖核酸などの標的核酸の領域を指す。ポリヌクレオチドは、複数のインサート配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３つ、４つ、又は５つのインサート配列を含む。配列決定鋳型として使用できる２つ以上のインサートを含むポリヌクレオチドは、本明細書において「連結された核酸配列決定鋳型」又は「連結された配列決定鋳型」と称され得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列又はハイブリダイゼーション配列の相補体を含む。本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション配列」又は「ＨＹＢ」は、相補ハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズできる配列を指す。例えば、１つの断片（例えば、ライブラリー産物）中のＨＹＢの別の断片中のＨＹＢ’（ハイブリダイゼーション配列の相補体）へのハイブリダイゼーションにより、２つの断片が、ＨＹＢ／ＨＹＢ’のハイブリダイゼーションを介して互いにアニールしている、ハイブリダイゼーション付加物又は架橋がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、ＨＹＢは、ＨＹＢがＨＹＢ’にハイブリダイズする場合に２つの一本鎖断片を一緒に付着させるのに十分なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型に含まれるＨＹＢ配列は、図４７に示されるように、プライマー結合部位として使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＹＢ又はＨＹＢ’は、１０～３０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１の一本鎖核酸断片中のＨＹＢの第２の一本鎖核酸断片中のＨＹＢ’への結合は、２つの断片を「架橋」するのに十分である（図２８Ａ及び３９に示される例を用いて本明細書中の方法に記載される）。ＨＹＢ又はＨＹＢ’に含まれるヌクレオチドは、天然又は人工又は修飾ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、人工又は修飾ヌクレオチドを含むＨＹＢ又はＨＹＢ’は、２つの一本鎖断片間の架橋を可能にするために、これらの配列においてより少ないヌクレオチドを必要とし得る。
いくつかの実施形態では、ＨＹＢ又はＨＹＢ’中の１つ以上のヌクレオチドは、ロック核酸又は架橋核酸である。本明細書で使用される場合、「ロック核酸」又は「ＬＮＡ」は、リボース部分が２’酸素と４’炭素とを接続する余分な架橋で修飾されている修飾ＲＮＡヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ＬＮＡは、ＨＹＢ又はＨＹＢ’配列において高められた構造安定性を付与し、したがって、ＨＹＢ／ＨＹＢ’相互作用のハイブリダイゼーション融解温度（Ｔｍ）を上昇させる。例えば、１つ以上のＬＮＡを含むＨＹＢ又はＨＹＢ’配列は、比較的短い配列（例えば、１０～２０ヌクレオチド）のみを含む場合があるが、それでもなお、ＨＹＢを含む第１の一本鎖断片とＨＹＢ’を含む第２の一本鎖断片との間の架橋の形成を可能にするのに十分に強い結合を付与し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上のインサートを含む。本明細書に記載されるように、これらのインサートは、標的核酸由来の同じ配列のコピーであってもよく、又は標的核酸由来の別個の配列であってもよい。本明細書で使用される場合、「キメラ鋳型」は、異なるインサートを含む鋳型を指す。
図２９及び図４０のものなど、２つのインサートを含む多種多様な異なるポリヌクレオチドが本明細書に記載される。２つ以上のインサート及びハイブリダイゼーション配列（又はその相補体）に加えて、本発明のポリヌクレオチドはまた、種々の他の型のインサートを含み得る。
例えば、ポリヌクレオチドは、１つ以上の配列決定プライマー配列を含み得る。このような配列決定プライマー配列は、ポリヌクレオチドが配列決定鋳型として使用される場合、配列決定を開始するためのプライマー結合のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のリード配列決定プライマー配列及び／又は第２のリード配列決定プライマー配列を含む。本明細書で使用される場合、「第１のリード配列決定プライマー配列」及び「第２のリード配列決定プライマー配列」は、異なる配列決定リードにおいて使用され得るプライマーに結合できる配列を指す。これらの用語は、任意の特定の配列に限定されず、例えば、第１のリード配列決定プライマー配列は、所与の実験において第２の配列決定リードを開始するために使用されてもよく、第２のリード配列決定プライマーは、所与の実験において第１の配列決定リードを開始するために使用されてもよい。このようなプライマー配列は、ユーザーが利用を計画する配列決定プラットフォームに基づいて変化し得、このようなプライマー配列は、Ａ１４（配列番号４）及びＢ１５配列（配列番号５）のように、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、第１のリード配列決定プライマー配列及び第２のリード配列決定プライマー配列は異なる。いくつかの実施形態では、第１のリード配列決定プライマー配列及び第２のリード配列決定プライマー配列はそれぞれ、Ａ１４配列若しくはＢ１５配列、又はそれらの相補体を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドはＰ５プライマー配列の相補体（Ｐ５’）を含み、５’末端ポリヌクレオチドはＰ７プライマー配列（Ｐ７、配列番号４８）を含む、又は、３’末端ポリヌクレオチドはＰ７プライマー配列の相補体（Ｐ７’）を含み、５’末端ポリヌクレオチドはＰ５プライマー配列（Ｐ５、配列番号７）を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチド及び／又は５’末端ポリヌクレオチドは、それぞれ独立して、アダプター、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む。言い換えれば、ポリヌクレオチドは、配列決定など、ユーザーが実施したい方法において有用な追加の配列を含んでもよい。
本明細書中に記載される方法を使用して、ポリヌクレオチド中の一方のインサートは、標的核酸のセンス鎖の一部を含む断片から調製され得、他方のインサートは、標的核酸のアンチセンス鎖の一部を含む断片からの伸長によって調製される。本明細書中に記載される方法を使用して、一方のインサートは、標的核酸のアンチセンス鎖の一部を含む断片から調製され得、他方のインサートは、標的核酸の鎖の一部を含む断片からの伸長によって調製される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、互いのコピーである２つのインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ａ）第１のリード配列決定プライマー配列と、（ｂ）標的核酸に由来するインサート配列であって、５’末端ポリヌクレオチドの３’側にある、インサート配列と、（ｃ）インサート配列の３’側にあるハイブリダイゼーション配列と、（ｄ）ハイブリダイゼーション配列の３’側にあるインサート配列のコピーと、（ｅ）第２のリード配列決定プライマー配列の相補体を含む３’末端ポリヌクレオチドと、を含む、５’末端ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、配列決定鋳型であり得る。インサートの２つのコピー（すなわち、インサート配列及びインサート配列のコピー）は同一であると予想され得るが、配列決定結果は、それらが同一でないことを示し得る。例えば、インサートの２つのコピーは、標的核酸中のミスマッチ変異に基づいて、又はＰＣＲ増幅中のエラーの導入に基づいて異なり得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、互いのコピーではない２つのインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのインサート配列は異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドに含まれる２つのインサート配列は、標的核酸の異なる領域から調製された。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ａ）第１のリード配列決定プライマー配列を含む５’末端ポリヌクレオチドと、（ｂ）標的核酸に由来するインサート配列であって、５’末端ポリヌクレオチドの３’側にある、第１のインサート配列と、（ｃ）インサート配列の３’側にあるハイブリダイゼーション配列と、（ｄ）ハイブリダイゼーション配列の３’側にある第２のインサート配列と、（ｅ）第２のリード配列決定プライマー配列の相補体を含む３’末端ポリヌクレオチドと、を含む。固定されたトランスポソームを用いる方法に関して本明細書に記載されるように、２つの異なるインサート配列を有するそのような鋳型を使用して、連続性データを決定することができる。
ポリヌクレオチドに含まれる２つのインサートは、同じであっても異なったサイズであってもよい。いくつかの実施形態では、コピーであるインサートは、同じ数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、インサート配列は４０～４００ヌクレオチドを含み、任意選択的に、インサート配列は１０００以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５００超のヌクレオチドを含むものなどの、より大きなインサートに対して、ペア配列決定リードプロトコールを実施することができる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’末端ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されている（図２９に示される実施形態など）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’末端ポリヌクレオチド上の親和性部分の固体支持体の表面上の結合部分への結合を介して固体支持体に固定されている。いくつかの実施形態では、親和性部分は、リンカーを介して５’末端ポリヌクレオチドに付着されている。いくつかの実施形態では、親和性部分は、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、
５’－Ｐ５－Ａ１４－インサート－ＨＹＢ－インサート－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’、又は
５’－Ｐ７－Ｂ１５－インサート－ＨＹＢ’－インサート－Ａ１４’－Ｐ５’－３’の構造を有し、ＨＹＢはハイブリダイゼーション配列であり、ＨＹＢ’はハイブリダイゼーション配列の相補体である。いくつかの実施形態では、２つのインサート配列は、同一である同じ配列のコピー、又は９５％超の配列相同性を有する２つの配列である。非標準塩基対形成又は配列決定中に導入されるランダムエラーなど、インサート配列の２つのコピーにおける差異の潜在的な理由は、本明細書に記載されている。図４０は、２つの相補的な連結された配列決定鋳型を含む代表的な二本鎖ポリヌクレオチドを示す。一方の鋳型は２つのＡインサートを含み、相補鎖は２つのＡ’インサートを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、
５’－Ｐ５－Ａ１４－インサート１－ＨＹＢ－インサート２－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’、又は
５’－Ｐ７－Ｂ１５－インサート１－ＨＹＢ’－インサート２－Ａ１４’－Ｐ５’－３’の構造を有し、ＨＹＢはハイブリダイゼーション配列であり、ＨＹＢ’はハイブリダイゼーション配列の相補体である。いくつかの実施形態では、インサート１及びインサート２は、配列相同性がほとんど又は全くない異なる配列を含む。図４５は、各々が２つの異なる配列を含む２つの相補的ポリヌクレオチドを生成するために使用され得る架橋の代表的な手段を示す。
いくつかの実施形態では、組成物は、その相補体にハイブリダイズしたポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その相補体にハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、二本鎖の連結された配列決定鋳型と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の連結された配列決定鋳型は、その５’末端の両方によって固体支持体の表面に固定されている。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びその相補体を含む組成物は、固体支持体の表面上に固定化され、このとき、親和性部分は、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンであり、結合部分は、アビジン又はストレプトアビジンである。
広範な異なる固体支持体が固定化のために使用され得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、スライド、容器の壁、フローセル、又はフローセルに含まれるナノウェルである。
いくつかの実施形態では、親和性部分をポリヌクレオチドに付着させるためのリンカーは、開裂可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、ユーザーは、この開裂可能なリンカーを開裂することによって、所望の時間に固体支持体からポリヌクレオチドを遊離することができる。
Ａ．標的核酸
本明細書中で使用される標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの類似体から構成され得る。標的核酸の供給源は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャＲＮＡ、又は天然供給源由来の他の核酸であり得る。いくつかの場合では、そのような供給源に由来する標的核酸を、本明細書の方法又は組成物において使用する前に増幅することができる。
標的核酸が由来し得る例示的な生物学的試料としては、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒト又は非ヒト霊長類などの哺乳動物；例えば、シロイヌナズナ、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、小麦、米、キャノーラ、若しくは大豆などの植物；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの藻類；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓなどの線形動物；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、蚊、ショウジョウバエ、ミツバチ、若しくはクモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚；爬虫類；カエル又はＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓなどの両生類；ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ、酵母、Ｓａｃｃｈａｒａｍｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ若しくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅなどの真菌；又はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ由来のものが挙げられる。標的核酸はまた、原核生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ若しくはｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの細菌；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルス若しくはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；又はビロイドに由来し得る。標的核酸は、上記の生物の均質な培養物若しくは生物の集団、又は代替的に、例えば、群衆若しくは生態系におけるいくつかの異なる生物のコレクションに由来し得る。核酸は、当該技術分野で既知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９８）（その各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを用いて単離することができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、１つ以上のより大きな核酸の断片として得ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的開裂、酵素的開裂、又は物理的剪断を含む、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかを用いて行うことができる。断片化はまた、より大きな核酸の一部のみをコピーすることによって、アンプリコンを生成する特定の増幅技術の使用から生じ得る。例えば、ＰＣＲ増幅は、増幅に使用される隣接プライマー間の断片の長さによって規定されるサイズを有する断片を生成する。
標的核酸又はそのアンプリコンの集団は、本明細書に記載の方法又は組成物の特定の用途に望ましい又は適切な平均鎖長を有し得る。例えば、平均鎖長は、１００，０００ヌクレオチド、５０，０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、５，０００ヌクレオチド、１，０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、又は５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的に、又は追加的に、平均鎖長は、１０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１，０００ヌクレオチド、５，０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、５０，０００ヌクレオチド、又は１００，０００ヌクレオチド超であり得る。標的核酸又はそのアンプリコンの集団の平均鎖長は、上記の最大値と最小値との間の範囲内であり得る。増幅部位で生成された（又は別の手段で本明細書で作製又は使用された）アンプリコンは、上記に例示されているものから選択される上限と下限との間の範囲の平均鎖長を有し得ることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、２００ヌクレオチド未満、１５０ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、７５ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、又は３６ヌクレオチド未満などの比較的短い平均鎖長を有する。比較的短い平均鎖長を有する標的核酸の配列決定は、リード長によって制限されず、リード数の増加は、配列決定出力を顕著に増加させ得る。比較的短い平均鎖長を有する試料タイプの例は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及びエクソーム配列決定試料である。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、母体血液試料由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、母体血漿試料から抽出される。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）用である。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、エクソームである。いくつかの実施形態では、エクソームは、標的化再配列決定によって調製される。いくつかの実施形態では、エクソームは、全ゲノム濃縮によって調製される。いくつかの実施形態では、エクソームは、ハイブリダイゼーションに基づく濃縮によって調製される。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡである。ＲＮＡ及びＤＮＡの別々のライブラリーを調製して、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチドを作製することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む１つ以上のインサート及びＤＮＡを含む１つ以上のインサートを含む。ＲＮＡインサート及びＤＮＡインサートを含むそのようなポリヌクレオチドは、「ハイブリッドポリヌクレオチド」と呼ぶことができ、１回の配列決定実行から複数の読み出しを生成することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡインサート及びＤＮＡインサートを含むポリヌクレオチドは、自己正規化を可能にする二重試料インデックスを有する。いくつかの実施形態では、出発ライブラリー中の最少量のＤＮＡ又はＲＮＡが、生成されるハイブリッドポリヌクレオチドの量を決定する。
任意の種々の既知の増幅技術が、本明細書中に記載される方法における使用のために存在する鋳型配列の量を増加させるために使用され得る。例示的な技術としては、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、又は鋳型配列を有する核酸分子のランダムプライマー増幅（ＲＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される方法又は組成物における使用前の標的核酸の増幅は任意であることが理解されるであろう。したがって、標的核酸は、本明細書に記載される方法及び組成物のいくつかの実施形態において使用前に増幅されない。標的核酸は、任意選択的に、合成ライブラリーに由来し得る。合成核酸は、天然のＤＮＡ若しくはＲＮＡ組成物を有することができ、又はその類似体であり得る。例えば、クラスター増幅、架橋増幅又はアレイベースの方法の文脈において以下に記載される他の方法を含む、固相増幅法もまた使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、任意の好適な核酸配列決定プラットフォームを使用して、標的配列の核酸配列を決定することができる。いくつかの態様では、対象となる配列は、１つ以上の先天性又は遺伝性疾患、病原性、抗生物質耐性、若しくは遺伝子修飾と相関するか、又は関連している。配列決定は、短いタンデムリピート、一塩基多型、遺伝子、エキソン、コード領域、エクソーム、又はそれらの一部の核酸配列を決定するために使用することができる。したがって、本明細書に記載される方法及び組成物は、非限定的に、癌及び疾患診断、予後及び治療法、ＤＮＡフィンガープリンティング用途（例えば、ＤＮＡデータバンキング、犯罪ケースワーク）、メタゲノム研究及び発見、アグライゲノム用途、並びに病原体同定及びモニタリングにおいて有用な方法に関する。
いくつかの実施形態では、配列決定を調製するために使用される試料は、二本鎖核酸を含む。この二本鎖核酸は、標的核酸と称され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸を、固定されたトランスポソームを含む固体支持体に添加してもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸を断片化し、フォーク型アダプターの混合物と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、試料は、複数の二本鎖核酸を含む。
本開示に従って使用される生物学的試料は、標的核酸を含む任意のタイプであり得る。しかしながら、試料は完全に精製される必要はなく、例えば、タンパク質と混合された核酸、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又は任意の他の夾雑物を含むことができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、核酸、タンパク質、他の核酸種、他の細胞成分、及び／又はインビボで見られるものとほぼ同じ割合で存在する任意の他の夾雑物の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、成分は、無傷細胞に見られるものと同じ割合で見出される。いくつかの実施形態では、生体試料は、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、又は０．６０以下の２６０／２８０吸光度比を有する。いくつかの実施形態では、生体試料は、少なくとも２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、又は０．６０の２６０／２８０吸光度比を有する。本明細書で提供される方法により、核酸を固形支持体に結合させることができるため、他の夾雑物は、表面結合タグメンテーションが生じた後に固形支持体を洗浄するだけで除去することができる。生体試料は、例えば、粗細胞溶解物又は全細胞を含み得る。例えば、本明細書に記載の方法において固体支持体に適用される粗細胞溶解物は、他の細胞成分から核酸を単離するために従来から使用している分離工程のうちの１つ以上が行われる必要はない。例示的な分離工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、固体支持体に適用される試料は、１．７以下である２６０／２８０吸光度比を有する。
したがって、いくつかの実施形態では、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引液、糞便、及びそれらの浸軟組織、若しくはそれらの溶解物、又は核酸を含む任意の他の生体標本を含み得る。
いくつかの実施形態では、試料は、血液である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、粗細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、方法は、試料を固体支持体に適用した後に試料中の細胞を溶解して、細胞溶解物を生成する工程を更に含む。
いくつかの実施形態では、試料は、生検試料である。いくつかの実施形態では、生検試料は、液体又は固体試料である。いくつかの実施形態では、がん患者由来の生検試料を使用して、対象が予測遺伝子中に特定の変異又はバリアントを有するかどうかを決定するために、目的の配列を評価する。
いくつかの実施形態では、試料は、標的二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ＲＮＡから調製される二本鎖ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、コード、非翻訳領域（ＵＴＲ）配列、イントロン配列、及び／又は遺伝子間配列を含む。
Ｂ．３’末端ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、第１のリードプライマー結合配列を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチド及び／又は付着ポリヌクレオチドは、それぞれ独立して、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、ＭＥ’、Ｂ１５’、及び／又はＰ７’配列を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、ＭＥ’、Ｂ１５’、及びＰ７’配列を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、Ｐ５プライマー配列の相補体（Ｐ５’）を含み、付着ポリヌクレオチドは、Ｐ７プライマー配列（Ｐ７）を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、Ｐ７プライマー配列の相補体（Ｐ７’）を含み、付着ポリヌクレオチドは、Ｐ５プライマー配列（Ｐ５）を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチドは、ＭＥ’－Ｂ１５’－Ｐ７’配列を含む。
Ｃ．インサート配列
ポリヌクレオチドに含まれるインサート配列は、標的核酸に由来する配列を含む。したがって、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、配列決定時にタンデムリードを生成するためなど、いくつかの目的のために使用できる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、２つ以上のインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３つのインサート配列を含む。
インサート配列は、１つ以上の標的核酸に由来し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数の標的核酸に由来する複数のインサート配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、全てが同じ標的核酸に由来する複数のインサート配列を含み得る。いくつかの実施形態では、複数のインサート配列は、標的核酸の非隣接配列に由来する。非隣接配列とは、ポリヌクレオチド中の複数のインサート配列が元の標的核酸中で互いに隣接しないことを意味する。いくつかの実施形態では、複数のインサート配列は、標的核酸のランダム領域に由来する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを生成するための方法は、特定のインサート配列について選択しない。
いくつかの実施形態では、複数のインサート配列は、それぞれ４０～４００ヌクレオチドを含むか、又はそれぞれ１００～２００ヌクレオチドを含むか、又はそれぞれ１５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のインサート配列及び第２のインサート配列は、それぞれ４０～４００ヌクレオチドを含むか、又はそれぞれ１００～２００ヌクレオチドを含むか、又はそれぞれ１５０ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、３つ以上のインサート配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第２のインサート配列と付着ポリヌクレオチドとの間に、標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は他のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、５’末端のインサート配列と、リードプライマー結合配列を含む３’末端の連結配列と、を含む、少なくとも１つの挿入単位を含み、リードプライマー結合配列は、他のリードプライマー結合配列と直交している。
ポリヌクレオチドが３つ以上のインサート配列を含む実施形態では、ポリヌクレオチドは複数の異なる連結配列を含むことができ、各連結配列はプライマー配列を含み、異なる連結配列に含まれるプライマー配列は異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上のプライマー配列は、ハイブリダイゼーション配列を含み、ハイブリダイゼーション配列は、異なるプライマー配列において異なる。
例えば、３つのインサート配列を含むポリヌクレオチドを生成するために、ＨＹＢ１／ＨＹＢ１’及びＨＹＢ２／ＨＹＢ２’などの２つの異なるＨＹＢ／ＨＹＢ’配列対を使用できる。３つのインサートを有するポリヌクレオチドを生成するために、ＨＹＢ１／ＨＹＢ１’を用いてインサート１とインサート２を連結することができ、ＨＹＢ２／ＨＹＢ２’を用いてインサート２とインサート３を連結することができる。インサート１のフォーク型アダプターは、Ｐ５及びＨＹＢ１を含むことができ、インサート２のアダプターは、ＨＹＢ１’及びＨＹＢ２を含むことができ、インサート３のアダプターは、ＨＹＢ２’及びＰ７’を含むことができる。
インサート配列は、タグメンテーション又は断片化などの核酸断片を生成するためのいくつかの方法によって生成することができる。
Ｄ．アダプター配列
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のアダプター配列を含み得る。
アダプター配列は、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサ領域、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列、開裂配列、配列決定関連配列、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の機能的配列又は構成要素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列を含む。他の実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列とインデックス又はバーコード配列とを含む。プライマー配列はまた、ユニバーサル配列であってもよい。本開示は、使用できるアダプター配列の種類に限定されず、当業者であれば、ライブラリー調製及び次世代配列決定に使用できる追加の配列を認識するであろう。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸断片に共通のヌクレオチド配列の領域である。任意選択的に、２つ以上の核酸断片はまた、配列差の領域を有し得る。複数の核酸断片の異なるメンバーにおいて存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列の複製又は増幅を可能にすることができる。
いくつかの実施形態では、第１のリードプライマー結合配列は、第１のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列は、Ａ１４プライマー配列の相補体（Ａ１４’）又はＢ１５プライマー配列の相補体（Ｂ１５’）である。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、ＳＢＳ又はＳＢＳ’配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＢＳ又はＳＢＳ’配列は、標準配列プライマーを使用できるように、Ｔｒｕｓｅｑワークフローにおいて使用されるオリゴヌクレオチドに含まれる標準配列の全部又は一部を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＳＢＳはモザイク末端配列であってもよく、ＳＢＳ’はＭＥ及びＭＥ’などのモザイク末端配列の相補体であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＳＢＳ又はＳＢＳ’配列は、Ａ１４－ＭＥ若しくはＢ１５－ＭＥ、又はそれらの相補体を含んでもよい。配列番号１５～２１は、いくつかの例示的なＳＢＳ若しくはＳＢＳ’配列、又はＳＢＳ若しくはＳＢＳ’配列を含むアダプターを示す。
いくつかの実施形態では、ＳＢＳ及びＳＢＳ’は、アダプター二本鎖を形成することができる全て又は部分的に相補的な配列である。いくつかの実施形態では、ＳＢＳ及びＳＢＳ’は、部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、ＳＢＳ及びＳＢＳ’は、完全に相補的である。いくつかの実施形態では、ＳＢＳ及び／又はＳＢＳ’は、１３塩基対配列を含む。いくつかの実施形態では、アダプター二本鎖は、ＳＢＳ又はＳＢＳ’に加えて、Ｐ５－ＨＹＢ’及びＰ７－ＨＹＢを含む。このようにして、例えば、２つのライブラリー断片が一緒に積み重ねられて（すなわち、一緒にタンデムで）、２つのインサートを有するポリヌクレオチドを生成する場合、得られたポリヌクレオチドは、標準的な配列決定プライマーを用いて配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、配列決定プライマーへの結合について６５℃以上の融解温度を有する。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、配列決定のために使用される温度で結合が失われないように、配列決定プライマーに結合する。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧのそれぞれの相当な量（１０％超）を含む。いくつかの実施形態では、アダプター配列のＧ／Ｃ含量は、４０％～６０％である。いくつかの実施形態では、アダプター配列のＧ／Ｃ含量は、３０％以上かつ７０％以下である。いくつかの実施形態では、アダプター配列のＧ／Ｃ含量は、４０％以上５０％以下、又は５０％以上若しくは６０％以下である。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、第２のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のアダプター配列は、Ａ１４配列又はＢ１５配列である。
いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列は、Ａ１４配列の相補体（Ａ１４’）であり、第２のアダプター配列は、Ｂ１５配列である。いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列は、Ｂ１５配列の相補体（Ｂ１５’）であり、第２のアダプター配列は、Ａ１４配列である。
いくつかの実施形態では、アダプター配列は、タグメンテーション反応によって核酸断片の５’末端に転写される。
Ｅ．連結配列
いくつかの実施形態では、連結配列は、第１のリードプライマー結合配列に直交する第２のリードプライマー結合配列を含み、第２のリードプライマー結合配列は、ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列は、ＨＹＢ’である。いくつかの実施形態では、第２のリードプライマー結合配列は、図４Ｂに示されるように、ハイブリダイゼーション配列（ＨＹＢ）及びＳＢＳ’配列の相補体（ＭＥ’）を含む。いくつかの実施形態では、第４のリードプライマー結合配列は、図４Ｂに示されるように、ハイブリダイゼーション配列の相補体（ＨＹＢ’）及びＳＢＳ配列の相補体（ＳＢＳ’）を含む。
いくつかの実施形態では、連結配列は、ハイブリダイゼーション配列の３’側のトランスポゾン末端配列及びハイブリダイゼーション配列の５’側のトランスポゾン末端配列の相補体を含む。
いくつかの実施形態では、連結配列は、ＭＥ’、ＨＹＢ’、及び／又はＭＥを含む。いくつかの実施形態では、連結配列は、ＭＥ’、ＨＹＢ’、及びＭＥを含む。いくつかの実施形態では、連結配列は、ＭＥ’－ＨＹＢ’－ＭＥである。
いくつかの実施形態では、第２のリードプライマー結合配列は、ハイブリダイゼーション配列の相補体及びトランスポゾン末端配列の相補体を含む。いくつかの実施形態では、第２のリードプライマー結合配列は、ＨＹＢ’又はＭＥ’を含む。いくつかの実施形態では、第２のリードプライマー結合配列は、ＨＹＢ’及びＭＥ’を含む。いくつかの実施形態では、第２のリードプライマー結合配列は、ＨＹＢ’－ＭＥ’である。
Ｆ．固定化及び付着ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体上に固定されている。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、付着配列を含む。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、付着配列を含む。いくつかの実施形態では、付着配列は、トランスポソーム複合体中のトランスポゾンにハイブリダイズし、スライド、フローセル、又はビーズなどの固体支持体上に固定されている核酸配列である。いくつかの実施形態では、付着配列は、トランスポソーム複合体を固体支持体に付着させるように機能する。いくつかの実施形態では、付着配列は、ポリヌクレオチドを固体支持体に付着させるように機能する。いくつかの実施形態では、付着配列は、Ｐ５である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、固体支持体の表面上の付着ポリヌクレオチド相補体への付着ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、付着ポリヌクレオチド上の親和性部分の固体支持体の表面上の結合部分への結合を介して固体支持体に固定されている。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセル又はビーズを含む。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、第２のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のアダプター配列は、Ａ１４又はＢ１５である。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、トランスポゾン末端配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列は、ＭＥである。
いくつかの実施形態では、付着配列はＰ５であり、第２のアダプター配列はＡ１４であり、かつ／又は、トランスポゾン末端配列はＭＥである。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、Ｐ５、Ａ１４、及び／又はＭＥを含む。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、Ｐ５、Ａ１４、及びＭＥを含む。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、Ｐ５－Ａ１４－ＭＥを含む。
Ｇ．試料インデックス及びＵＭＩ
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列（又はその相補体）及び少なくとも２つのインサートに加えて、プライマー配列、インデックス配列、バーコード配列、精製タグ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、試料インデックス及び／又は固有分子識別子（ＵＭＩ）を含む。いくつかの実施形態では、これらの配列のうちの１つ以上は、二本鎖断片に連結されるフォーク型アダプターを使用して、又はタグメンテーションの間に二本鎖断片に組み込まれるトランスポソーム内に含まれるフォーク型アダプターを使用して、ポリヌクレオチドに組み込まれる。あるいは、ＰＣＲなどを用いてポリヌクレオチドを生成した後、追加の配列をポリヌクレオチド（連結された配列決定鋳型など）に付加してもよい。
固有分子識別子（ＵＭＩ）は、個々の核酸分子を互いに区別するために使用され得る核酸分子に適用されるか、又は同定されるヌクレオチドの配列である。ＵＭＩは、リード配列が１つのソース核酸分子又は別のものであるかどうかを決定するために、それらが関連する核酸分子とともに配列決定され得る。「ＵＭＩ」という用語は、ポリヌクレオチドの配列情報及び物理的ポリヌクレオチド自体の両方を指すために本明細書で使用され得る。ＵＭＩは、１つの試料のリードを他の試料のリードから区別するために一般的に使用されるバーコードに類似しているが、ＵＭＩは、代わりに、個々の試料からの多くの断片が一緒に配列決定される場合、核酸鋳型断片を別の断片から区別するために使用される。ＵＭＩは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／１０８９７２号及び国際公開第２０１８／１３６２４８号に記載されるように、多くの方式で定義することができる。
いくつかの実施形態では、２つの試料インデックスを用いて、固有の二重インデックス（ＵＤＩ）を調製する。いくつかの実施形態では、試料インデックスは、ｉ５－ｉ８配列である。あるいは、ｉ６及びｉ８配列をＵＭＩとして使用してもよい。
ＵＭＩは、二本鎖核酸中のＰＣＲ複製物の除去及び低頻度変異体の検出に有用であるが、ＵＤＩは、ライブラリー配列決定及び逆多重化におけるインデックスホッピングに起因する試料の不正確なアサインメントを軽減するのに有用である。固有のｉ５及びｉ７インデックス配列などのＵＤＩは、両方の末端がＵＤＩを含むように、標的核酸の末端に付加することができる。ＵＤＩは、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑ ６０００システムなどのパターン化されたフローセルと共に使用できる（例えば、国際公開第２０１８／２０４４２３号、同第２０１８／２０８６９９号、同第２０１９／０５５７１５号、及び同第２０１６／１７６０９１号参照、それらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。図４６Ａ及び４６Ｂに示されるものなどの本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の異なるプールに含まれるトランスポゾンは、タグメンテーション中にＵＤＩ又はＵＭＩを組み込むポリヌクレオチドを調製し、ＵＤＩ又はＵＭＩを組み込むための別個のＰＣＲ工程を不要にするように設計される。ＵＤＩ（ｉ５及びｉ７など）又はＵＭＩ（ｉ６又はｉ８など）を含む例示的なポリヌクレオチドを図４６Ａ～４６Ｃに示す。
Ｈ．ポリヌクレオチド及びその相補体を含む組成物
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリヌクレオチド及びその相補体を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、その相補体にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド及びその相補体は、二本鎖組成物に含まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリヌクレオチド及びその相補体を含み、相補体は、第１の相補リードプライマー結合配列を含む３’末端相補体であって、第１の相補リードプライマー結合配列は、第１及び第２のリードプライマー結合配列に直交している、３’末端相補体と、３’末端相補体の５’側にある第２のインサート配列の相補体と、第２のインサート配列の相補体の５’側にあり、３’から５’への第２の相補リードプライマー結合配列を含む相補連結配列であって、第２の相補リードプライマー結合配列は、第１及び第２のリードプライマー結合配列、並びに第１の相補リードプライマー結合配列に直交している、相補連結配列と、相補連結配列の５’側の第１のインサート配列の相補体と、５’末端に相補付着配列を含む相補付着ポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリヌクレオチド及び相補体を含み、ポリヌクレオチド又は相補体のいずれかが固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、組成物は、第１の付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体上に固定されているポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、相補体は、相補付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定されている。
いくつかの実施形態では、相補付着ポリヌクレオチドは、付着配列を含む。いくつかの実施形態では、相補付着ポリヌクレオチドに含まれる相補配列は、Ｐ７である。
いくつかの実施形態では、相補付着ポリヌクレオチドは、ＭＥ－Ｂ１５－Ｐ７配列を含む。いくつかの実施形態では、相補付着配列は、Ｐ７を含む。いくつかの実施形態では、相補連結配列は、ＭＥ－ＨＹＢ－ＭＥを含む。いくつかの実施形態では、第２のリード相補プライマー配列は、ＨＹＢ－ＭＥ’を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ポリヌクレオチド相補体は、Ｐ５’－Ａ１４’－ＭＥ’を含む。いくつかの実施形態では、第１のリード相補リードプライマー結合配列は、Ａ１４’－ＭＥ’を含む。いくつかの実施形態では、相補ハイブリダイゼーション配列は、ＨＹＢを含む。
Ｉ．ポリヌクレオチド又は組成物の構造
ポリヌクレオチドは、様々な構造を有し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、以下の構造のうちの１つのポリヌクレオチド又はその相補体を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、
３’－Ｐ７’－Ｂ１５’－ＭＥ’－インサート１－ＭＥ－ＨＹＢ－ＭＥ’－インサート２－ＭＥ－Ａ１４－Ｐ５－５’の構造を有する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの相補体は、
３’－Ｐ５’－Ａ１４’－ＭＥ’－インサート２－ＭＥ－ＨＹＢ’－ＭＥ’－インサート１－ＭＥ－Ｂ１５－Ｐ７－５’の構造を有する。
Ｊ．ポリヌクレオチドを含むキット
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、第１のトランスポソーム複合体及び第２のトランスポソーム複合体を含み、第１のトランスポソーム複合体は、ハイブリダイゼーション配列の相補体を含むトランスポゾンを含み、第２のトランスポソーム複合体は、ハイブリダイゼーション配列を含むトランスポゾンを含む。
いくつかの実施形態では、組成物又はキットは、固体支持体であって、任意選択的に、任意選択の支持体はビーズである、固体支持体と、トランスポソーム複合体を生成するための構成要素であって、トランスポザーゼと、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成するためのオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドは、３’トランスポゾン末端配列と、５’の第１のアダプター配列と、を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’トランスポゾン末端配列と、３’の第２のアダプター配列と、を含み、５’トランスポゾン末端配列は、３’トランスポゾン末端配列に相補的であり、第１及び第２のアダプター配列は同じでない、オリゴヌクレオチドと、を含む、構成要素と、ＰＣＲによって断片に付着配列及びハイブリダイゼーション配列を付加するための第１及び第２のプライマーセットであって、第１のプライマーセットは、断片にハイブリダイゼーション配列及び第１の付着配列を付加するためのプライマーを含み、第２のプライマーセットは、断片に相補ハイブリダイゼーション配列及び第２の付着配列を付加するためのプライマーを含み、第１及び第２の付着配列は同じでない、第１及び第２のプライマーセットと、を含む。
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、１つ以上のフォーク型アダプター複合体を含む。いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、第１のフォーク型アダプター複合体及び第２のフォーク型アダプター複合体を含む。
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、１つ以上のアセンブルされたアダプター二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、第１のアダプター二本鎖及び第２のアダプター二本鎖を含むアセンブルされたアダプター二本鎖を含む。
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、フォーク型アダプター複合体及びアセンブルされたアダプター二本鎖を含む。
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、アセンブルされた酵素及びトランスポゾンを含む。
いくつかの実施形態では、キット又は組成物は、精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
ＩＩＩ．複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを調製する方法
様々な方法を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドを生成することができる。
Ａ．転位反応を含む方法
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転位反応を含む方法によって調製される。
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転移反応の構成要素としては、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載の核酸（例えば、インテグラーゼ）を断片化及び標識化することができる他の酵素）、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾン要素、２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに付着されたアダプター配列が挙げられる。二本鎖トランスポゾン末端配列の１つの鎖が、標的核酸の１つの鎖に転写され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は（非転写トランスポゾン配列）ではない。アダプター配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列又は構成要素（例えば、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサ領域、又はインデックスタグ配列）を含み得る。
トランスポゾンベースの技術は、例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＦＬＥＸ ＤＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローに例示されるように、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸は、標的を同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）トランスポソーム複合体で処理され、それによって、断片の末端に特異なアダプター配列でタグ付けされた断片化核酸分子の集団を生成する。
図６Ａ～図９Ｂは、転位反応を用いてＨＹＢ又はＨＹＢ’配列を含むライブラリー産物を作製するための種々のアプローチを示す。いくつかの実施形態では、ビーズに連結したトランスポソーム（ＢＬＴ）が使用される。いくつかの実施形態では、溶液中のトランスポソームが使用される。
「トランスポソーム複合体」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができる機能的複合体を形成するために、トランスポゾン認識配列に結合する。いくつかの態様では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、配列トランスポゾン認識配列を標的核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１つの鎖が標的核酸に転写され、開裂事象が生じる。例示的な転位手順及びシステムは、トランスポザーゼでの使用に容易に適合され得る。
本明細書に提供されるある特定の実施形態で使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ、Ｒ１及びＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼ及びＭｕトランスポザーゼ認識部位、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２、Ｔｙ１、Ｔｎ７トランスポザーゼ、Ｔｎ／Ｏ及びＩＳ１０、Ｍａｒｉｎｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ、Ｔｃ１、Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｔｎ３、細菌インサート配列、レトロウイルス、及び酵母のレトロトランスポゾンが挙げられる（又はそれによってコードされる）。より多くの例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の設計されたバージョンが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、トランスポザーゼの組み合わせを含み、単一のトランスポザーゼのみを含むのではない。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、Ｔｎ７、ＭｕＡ、若しくはビブリオハーベイトランスポザーゼ、又はこれらの活性変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその活性変異体である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ、又はその活性変異体である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第２０１５／１６０８９５号に記載されているＴｎ５トランスポザーゼである。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼに対する５４、５６、３７２、２１２、２１４、２５１、及び３３８位での変異を有する、高活性Ｔｎ５である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼ：Ｅ５４Ｋ、Ｍ５６Ａ、Ｌ３７２Ｐ、Ｋ２１２Ｒ、Ｐ２１４Ｒ、Ｇ２５１Ｒ、及びＡ３３８Ｖに対する以下の変異を有する高活性Ｔｎ５である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列に対するアミノ酸５４、５６、及び３７２における変異を含む高活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼは融合タンパク質であり、任意選択で、融合タンパク質は伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態では、認識部位は、Ｔｎ５型トランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８）。一実施形態では、過剰活性Ｔｎ５トランスポザーゼとの複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される（例えば、ＥＺ Ｔｎ５（商標）Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼの２つの分子のダイマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、トランスポザーゼの２つの分子は各々、同じ型の第１及び第２のトランスポゾンに結合している（例えば、各モノマーに結合した２つのトランスポゾンの配列は同じであり、「ホモダイマー」を形成する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を採用する。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポゾンは同じである。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、第１の集団は、各モノマーにおいて第１のアダプター配列を有し、第２の集団は、各モノマー中に異なるアダプター配列を有する。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼ複合体は、第１及び第２のモノマーを含むトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼ）ダイマーを含む。いくつかの態様では、各モノマーは、第１のトランスポゾン、第２のトランスポゾン、及び付着ポリヌクレオチドを含み、第１のトランスポゾンは、その３’末端にトランスポゾン末端配列（３’トランスポゾン末端配列とも呼ばれる）及びその５’末端にアダプター配列（５’アダプター配列とも呼ばれる）を含み、第２のトランスポゾンは、その５’末端にトランスポゾン末端配列（５’トランスポゾン末端配列とも呼ばれる）及びその３’末端にアダプター配列（３’アダプター配列とも呼ばれる）を含み、付着ポリヌクレオチドは、第１のトランスポゾンの５’アダプター配列にハイブリダイズする付着アダプター配列、プライマー配列、及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンの５’トランスポゾン末端配列は、第１トランスポゾンの３’トランスポゾン末端配列と少なくとも部分的に対して相補的である。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドの付着アダプター配列は、第１のトランスポゾンの５’アダプター配列と少なくとも部分的に対して相補的である。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドのリンカーは、結合要素を含む。
１．トランスポソーム複合体
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１のリードプライマー結合配列の相補体を含む第１のトランスポゾンであって、第１のリードプライマー結合配列の相補体は、トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第１のアダプター配列の相補体と、を含む、第１のトランスポゾンと、トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含む第２のトランスポゾンと、ハイブリダイゼーション配列の相補体と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のリードプライマー結合配列は、第１のリード配列決定アダプター配列を含む。
いくつかの実施形態では、３’トランスポゾン末端配列はモザイク末端（ＭＥ）配列を含み、５’トランスポゾン末端配列はＭＥ’配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のアダプター配列の相補体は、Ｂ１５配列である。
いくつかの実施形態では、第１のリードプライマー結合配列は、ＭＥ’－Ｂ１５’である。
いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンは、第１のリードプライマー結合配列の５’側に相補付着配列を含む。いくつかの実施形態では、相補付着配列は、Ｐ７配列を含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、次の構造を有する。
Figure 2023547366000008
いくつかの実施形態では、標的化されたトランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと、付着ポリヌクレオチドを含む第１のトランスポゾンであって、付着ポリヌクレオチドは、付着配列を含む５’部分を含む、第１のトランスポゾンと、第２のリードプライマー結合配列を含む３’部分であって、トランスポゾン末端配列を含む３’部分を含む、３’部分と、アダプターと、トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含む第２のトランスポゾンと、ハイブリダイゼーション配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、アダプターは、Ａ１４配列である。いくつかの実施形態では、付着配列は、Ｐ５配列を含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、次の構造を有する。
Figure 2023547366000009
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１及び第２のトランスポゾンは、互いにアニーリングされ、第１のトランスポゾンは、付着ポリヌクレオチドにアニーリングされる。次いで、アニーリングされたポリヌクレオチドを、Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼ上に装填し、それによってトランスポソーム複合体を形成し、次いで、ビーズなどの固体支持体と接触され、これに結合される。いくつかの実施形態では、アニーリングされたトランスポゾンは、ビーズなどの固体支持体に結合され、次いで、トランスポザーゼは、トランスポゾンと複合体化され、それによって、固体支持体に結合されるトランスポソームを生成する。
２．末端配列
いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは３’トランスポゾン末端配列を含み、第２トランスポゾンは５’トランスポゾン末端配列を含む。いくつかの実施形態では、５’トランスポゾン末端配列は、３’トランスポゾン末端配列と少なくとも部分的に対して相補的である。いくつかの実施形態では、相補的トランスポゾン末端配列は、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載される他の酵素）に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を形成するようにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列は、モザイク末端（ＭＥ）配列である。したがって、いくつかの実施形態では、３’トランスポゾン末端配列はＭＥ配列であり、５’トランスポゾン末端配列はＭＥ’配列である。
３．アダプター配列
セクションＩＩ．Ｄで上述したように、本明細書に記載される方法の任意の実施形態では、第１のトランスポゾンは５’アダプター配列を含み、第２トランスポゾンは３’アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、５’アダプター配列にハイブリダイズする付着アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、付着アダプター配列は、５’アダプター配列と少なくとも部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、Ａ１４配列又はＢ１５配列である。したがって、いくつかの実施形態では、５’アダプター配列はＡ１４配列であり、付着アダプター配列はＡ１４’配列である。いくつかの実施形態では、３’アダプター配列は、Ｂ１５’配列である。
任意の実施形態では、Ａ１４－ＭＥ、ＭＥ、Ｂ１５－ＭＥ、ＭＥ’、Ａ１４、Ｂ１５、及びＭＥを含むアダプター配列又はトランスポゾン末端配列が以下に提供される：
Ａ１４－ＭＥ：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１）
Ｂ１５－ＭＥ：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号２）
ＭＥ’：５’－ｐｈｏＳ－ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３）
Ａ１４：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
Ｂ１５：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’（配列番号５）
ＭＥ：ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
４．固定されたトランスポソーム及び固体支持体
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１又は第２のトランスポゾンを介して固体支持体に固定されている。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ビーズ上に固定されている。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、第１又は第２のトランスポゾンを介してビーズ上に固定されている。
用語「固体表面」、「固体支持体」、及び他の文法的等価物は、トランスポソーム複合体の結合に適切であるか、又は適切であるように修飾され得る任意の材料を指す。当該技術分野において理解されるように、可能な基材の数は多数である。可能な基材としては、ガラス及び変性又は機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、並びにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）など）、多糖類、多面体有機シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）材料、ナイロン又はニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、又はシリコン並びに変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、ビーズ、常磁性ビーズ、及び様々な他のポリマーを含むシリカ系材料を含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、結合要素（及び任意選択のリンカー）を介して固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、常磁性ビーズ、フローセル、マイクロ流体デバイスの表面、チューブ、プレートのウェル、スライド、パターン化表面、又はマイクロ粒子である。いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズを含むか、又はビーズである。一実施形態では、ビーズは、常磁性ビーズである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、複数の固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、複数の固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、複数の固体支持体は、複数のビーズを含む。いくつかの実施形態では、複数のトランスポソーム複合体は、１ｍｍ２当たり少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６ 個の複合体の密度で固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ又は常磁性ビーズであり、各ビーズに結合した１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、又は６０，０００超のトランスポソーム複合体が存在する。
好適なビーズ組成物としては、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル（thoria sol）、炭素黒鉛、二酸化チタン、ラテックス、又はセファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、及びテフロン（登録商標）などの架橋デキストラン、並びに固体支持体について本明細書に概説される任意の他の材料が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、微小球は、磁気微小球又はビーズ、例えば、常磁性粒子、球体、又はビーズである。ビーズは球状である必要はない。不規則な粒子を使用してもよい。代替的に又は追加的に、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズサイズは、ナノメートル、例えば、１００ｎｍから、ミリメートル、例えば、１ｍｍまでの範囲であり、ビーズは０．２マイクロメートル～２００マイクロメートルが好ましく、０．５～５マイクロメートルが特に好ましいが、いくつかの実施形態では、より小さい又はより大きいビーズが使用されてもよい。ビーズは、結合パートナーがコーティングされてもよく、例えば、ビーズは、ストレプトアビジンがコーティングされてもよい。いくつかの実施形態では、ビーズは、ストレプトアビジンがコーティングされた常磁性ビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号６５６０１）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ粒子（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｚ５４８１）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃビーズ（ＮＥＢカタログ番号Ｓ１４２０Ｓ）及びＭａｘＢｅａｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｕ００８７）である。固体支持体はまた、スライド、例えば、トランスポソーム複合体体が上に固定化され得るように修飾された、フローセル又は他のスライドであってもよい。
いくつかの実施形態では、結合パートナーは、１０００～６０００ｐｍｏｌ／ｍｇ、又は２０００～５０００ｐｍｏｌ／ｍｇ、又は３０００～５０００ｐｍｏｌ／ｍｇ、又は３５００～４５００ｐｍｏｌ／ｍｇの密度で固体支持体又はビーズ上に存在する。
いくつかの実施形態では、固体表面は、試料管の内面である。いくつかの実施形態では、固体表面は、捕捉膜である。一実施例では、捕捉膜は、ビオチン捕捉膜（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）である。いくつかの実施形態では、捕捉膜は、濾紙である。本開示のいくつかの実施形態では、不活性基材又はマトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）からなる固体支持体は、例えば、ポリヌクレオチドなどの分子への共有結合を可能にする反応性基を含む中間材料の層又はコーティングの適用によって官能化された。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基材上に支持されるポリアクリルアミドヒドロゲル、特に国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２００８／０２８０７７３号に記載されているポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されず、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。タグメンテーションされたＤＮＡライブラリーの構築のための、固体表面上でＤＮＡをタグメンテーション（断片化及びタグ付け）する方法については、国際公開第２０１６／１８９３３１号及び米国特許出願公開第２０１４／００９３９１６（Ａ１）号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスポソーム複合体は、結合要素を介して固体支持体に固定化される。いくつかのこのような実施形態では、固体支持体は、結合パートナーとしてストレプトアビジンを含み、結合要素はビオチンである。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ビーズなどの固体支持体上に、特定の密度又は密度範囲で固定化される。いくつかの実施形態では、固体担体上の複合体の密度は、固定化反応中の溶液中のトランスポソーム複合体の濃度を指す。複合体密度は、固定化反応が定量的であることを前提とする。複合体が特定の密度で形成されると、表面結合したトランスポソーム複合体のバッチでは密度は一定のままである。得られたビーズを希釈することができ、希釈された溶液中の複合体の得られた濃度は、ビーズの調製密度を希釈係数で割ったものである。希釈されたビーズストックは、それらの調製物からの複合体密度を保持するが、複合体は希釈溶液におけるより低い濃度で存在する。希釈工程は、ビーズ上の複合体の密度を変化させず、したがって、ライブラリーの収率に影響を及ぼすが、インサート（断片）のサイズに影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、密度は、５ｎＭ～１０００ｎＭ、又は５～１５０ｎＭ、又は１０ｎＭ～８００ｎＭである。他の実施形態では、密度は、１０ｎＭ、又は２５ｎＭ、又は５０ｎＭ、又は１００ｎＭ、又は２００ｎＭ、又は３００ｎＭ、又は４００ｎＭ、又は５００ｎＭ、又は６００ｎＭ、又は７００ｎＭ、又は８００ｎＭ、又は９００ｎＭ、又は１０００ｎＭである。いくつかの実施形態では、密度は１００ｎＭである。いくつかの実施形態では、密度は３００ｎＭである。いくつかの実施形態では、密度は６００ｎＭである。いくつかの実施形態では、密度は８００ｎＭである。いくつかの実施形態では、密度は１００ｎＭである。いくつかの実施形態では、密度は１０００ｎＭである。
いくつかの実施形態では、組成物は、固体支持体と、固体支持体に固定化されたトランスポソーム複合体と、を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン、第１のトランスポゾン、付着ポリヌクレオチド、及び第２のトランスポゾンを含む。いくつかの実施形態では、第１のトランスポゾンは、３’トランスポゾン末端配列及び５’アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、５’アダプター配列及び結合要素にハイブリダイズする付着アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のトランスポゾンは、５’トランスポゾン末端配列及び３’アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、プライマー配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、結合要素は、任意選択的に置換されたビオチンを含むか、又は任意選択的に置換されたビオチンである。いくつかの実施形態では、結合要素は、リンカーを介して付着ポリヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態では、結合要素は、ビオチンリンカーを含むか、又はビオチンリンカーである。いくつかの実施形態では、結合要素は、３’、５’、若しくは内部ビオチンを含むか、又は３’、５’、若しくは内部ビオチンである。
本明細書に記載のトランスポソーム複合体のいくつかの実施形態は、付着ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用するとき、付着ポリヌクレオチドは、一方の末端上のトランスポゾンにハイブリダイズし、第２の末端上の表面に結合するポリヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載のトランスポソーム複合体は、付着ポリヌクレオチドを介して固体支持体に固定化される。いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、第１のトランスポゾンのアダプター配列又は第２のトランスポゾンのアダプター配列、プライマー配列、及びリンカーにハイブリダイズする付着アダプター配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは結合要素を含む。
本明細書に記載されるように、付着アダプター配列は、第１又は第２のトランスポゾンのアダプター配列と少なくとも部分的に対して相補的であってもよい。いくつかの実施形態では、付着アダプター配列は、５’アダプター配列にハイブリダイズする。付着アダプター配列が５’アダプター配列にハイブリダイズする実施形態では、５’アダプター配列はＡ１４配列であり、付着アダプター配列はＡ１４’配列である。いくつかの実施形態では、付着アダプター配列は、３’アダプター配列にハイブリダイズする。付着アダプター配列が３’アダプター配列にハイブリダイズする実施形態では、３’アダプター配列はＢ１５’配列であり、付着アダプター配列はＢ１５配列である。これらの実施形態のいずれにおいても、付着アダプター配列は、第１又は第２のトランスポゾンのアダプター配列に対して完全に相補的であってもよいか、又は第１又は第２のトランスポゾンのアダプター配列に対して部分的に相補的であってもよい。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、プライマー配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、Ｐ５プライマー配列又はＰ７プライマー配列又はその相補体（例えば、Ｐ５’又はＰ７’）である。Ｐ５及びＰ７プライマーは、様々なＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上でシーケンシングするためにＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．が販売している市販のフローセルの表面に使用される。プライマー配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号に記載されている。５’末端でアルキン末端であり得るＰ５及びＰ７プライマーの例としては、以下が挙げられる：
Ｐ５：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ（配列番号７）
Ｐ７：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ（配列番号８）
及びこれらの誘導体。いくつかの実施例では、Ｐ７配列は、Ｇ＊位、例えば、８オキソ－グアニンにおける修飾グアニンを含む。他の実施例では、＊は、Ｇ＊と隣接する３’Ａとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの実施例では、Ｐ５及び／又はＰ７プライマーは、非天然リンカーを含む。任意選択で、Ｐ５及びＰ７プライマーの一方又は両方は、ポリＴテールを含み得る。ポリＴテールは、概して、上記の配列の５’末端に、例えば、５’塩基と末端アルキン単位との間に位置するが、場合によっては３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、任意の数、例えば、２～２０個のＴヌクレオチドを含み得る。Ｐ５及びＰ７プライマーは、例として与えられるが、本明細書に提示される例では、任意の好適なプライマーが使用され得ることを理解されたい。Ｐ５及びＰ７プライマー配列を含むプライマー配列を有するインデックス配列は、配列決定のためのライブラリを活性化するためにＰ５及びＰ７を加える役割を果たす。Ｐ５及びＰ７プライマーを例示するが、本明細書に提示される例では、任意の好適な増幅プライマーを使用できることを理解されたい。
本明細書で使用するとき、リンカーの一例は、結合要素を、付着ポリヌクレオチドのヌクレオチド部分の末端に共有結合する部分であり、付着ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化するために使用されてもよい。リンカーは、開裂可能なリンカー、例えば、付着ポリヌクレオチドを除去するために開裂されることが可能なリンカー、したがって、固体支持体からのトランスポソーム複合体又はタグメンテーション産物であってもよい。本明細書で使用するとき、開裂可能なリンカーは、例えば、光分解、化学的開裂、熱開裂、又は酵素開裂などの化学的又は物理的手段によって開裂され得るリンカーである。いくつかの実施形態では、開裂は、生化学的、化学的、酵素的、求核性、還元感受性剤、又は他の手段によってもよい。開裂可能なリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ部位；ＲＮａｓｅで開裂可能な少なくとも１つのリボヌクレオチド；特定の化学薬品の存在下で開裂可能なヌクレオチド類似体；光開裂可能なリンカーユニット；（例えば）過ヨウ素酸塩による処理によって開裂可能なジオール結合；化学的還元剤で開裂可能なジスルフィド基；光化学的開裂に供され得る開裂可能部分；及び、ペプチダーゼ酵素によって開裂可能なペプチド、又は他の適切な手段からなる群から選択される部分を含み得る。開裂は、開裂可能なヌクレオチド又は核酸塩基を、ウラシル又は８オキソ－グアニンなどの開裂可能なリンカーに組み込むことによって酵素的に媒介されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるリンカーは、例えば、－Ｏ－結合を形成する、付着ヌクレオチドを共有的かつ直接的に付着させてもよいか、又はリン酸塩若しくはエステルなどの別の基を介して共有的に付着されてもよい。代替的に、本明細書に記載されるリンカーは、結合ポリヌクレオチドのリン酸基に共有的に付着されてもよく、例えば、リン酸基を介して３’ヒドロキシルに共有的に付着されても、したがって、－Ｏ－ Ｐ（Ｏ）３－結合を形成してもよい。
本明細書で使用するとき、結合要素は、結合パートナーに共有結合又は非共有結合するために使用することができる部分である。いくつかの態様では、結合要素は、トランスポソーム複合体上にあり、結合パートナーは固体支持体上にある。いくつかの実施形態では、結合要素は、固体支持体上の結合パートナーに結合するか、又は非共有結合することができ、それによって、トランスポソーム複合体を固体支持体に非共有結合的に付着させることができる。いくつかの実施形態では、結合要素は、固体支持体上の結合パートナーに結合（共有結合又は非共有結合）することができる。いくつかの態様では、結合要素は、固体支持体上の結合パートナーに結合（共有結合又は非共有結合）され、固定化されたトランスポソーム複合体をもたらす。
このような実施形態では、結合要素は、例えば、ビオチンを含むか、又はビオチンであり、結合パートナーは、アビジン若しくはストレプトアビジンを含むか、又はアビジン若しくはストレプトアビジンである。他の実施形態では、結合要素／結合パートナーの組み合わせは、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ、ジオキシゲニン／ジオキシゲニン抗体、若しくはハプテン／抗体を含むか、又はＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ、ジオキシゲニン／ジオキシゲニン抗体、若しくはハプテン／抗体である。更なる好適な結合対としては、デスチオビオチン－アビジン、ジチオビオチン－アビジン、イミノビオチン－アビジン、ビオチン－アビジン、ジチオビオチン－スクシニル化アビジン、イミノビオチン－スクシニル化アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、及びビオチン－スクシニル化アビジンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、結合要素はビオチンであり、結合パートナーはストレプトアビジンである。
いくつかの実施形態では、結合要素は、化学反応を介して結合パートナーに結合することができるか、又は固体支持体上の結合パートナーとの反応によって共有結合され、それによって、トランスポソーム複合体を固体支持体に共有的に付着する。いくつかの態様では、結合要素／結合パートナーの組み合わせは、アミン／カルボン酸（例えば、ＥＤＣ又はＮＨＳ媒介カップリングなどの当業者に既知の条件下での標準的なペプチドカップリング反応による結合）を含むか、又はアミン／カルボン酸である。２つの構成要素の反応は、結合要素と結合パートナーとをアミド結合によって結合させる。代替的に、結合要素及び結合パートナーは、２つのクリック化学パートナー（例えば、トリアゾール結合を形成するように反応するアジド／アルキン）であってもよい。
いくつかの実施形態では、付着ポリヌクレオチドは、ユニバーサル配列、スペーサ領域、アンカー配列、又はインデックスタグ配列、又はこれらの組み合わせなどの追加の配列又は構成要素を更に含む。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸断片に共通のヌクレオチド配列の領域である。任意選択で、２つ以上の核酸断片はまた、配列差の領域を有する。複数の核酸断片の異なるメンバーにおいて存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列の複製又は増幅を可能にすることができる。
トランスポザーゼ、トランスポゾン、及び付着ポリヌクレオチドを含む、トランスポソーム複合体の変異が実現され得る。例えば、構成、デザイン、ハイブリダイゼーション、構造要素、及びトランスポソーム複合体の全体的な配置の変異が実現され得る。本明細書で提供される開示及び図面はいくつかのバリエーションを提供するが、本開示の範囲内の更なる変異が容易に実現され得ることが理解される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを生成するために使用される１つ以上のライブラリー産物は、ビーズベースのタグメンテーションによって生成される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを生成するために使用される１つ以上のライブラリー産物は、溶液ベースのタグメンテーションによって生成される。
Ｂ．Ｔｒｕｓｅｑ法
フォーク型アダプターに基づく技術は、例えば、Ｔｒｕｓｅｑ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローにおいて例示されるような、ポリヌクレオチドを生成するために利用することができる。図１０、図１２及び図１３は、Ｔｒｕｓｅｑ法を用いてＨＹＢ又はＨＹＢ’配列を含むライブラリー産物を作製するための種々のアプローチを示す。
いくつかの実施形態では、アダプター組成物又はキットは、第１のフォーク型アダプター複合体と、第２のフォーク型アダプター複合体と、を含む、アダプター組成物又はキットであって、第１のフォーク型アダプター複合体は、相補付着ポリヌクレオチドであって、相補付着配列を含む５’部分と、アダプターを含む３’部分と、を含む、相補付着ポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドであって、（ａ）アダプターの一部の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分と、（ｂ）ハイブリダイゼーション配列の相補体であって、ハイブリダイゼーション配列の相補体は、相補付着ポリヌクレオチドに相補的ではない、ハイブリダイゼーション配列の相補体と、を含む、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと、を含み、第２のフォーク型アダプター複合体は、付着ポリヌクレオチドであって、付着配列を含む５’部分と、アダプターを含む３’部分と、を含む、付着ポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドであって、（ａ）アダプターの一部の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分と、（ｂ）ハイブリダイゼーション配列であって、付着ポリヌクレオチドに相補的ではない、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと、を含む。
いくつかの実施形態では、付着配列は、Ｐ５プライマー配列を含み、相補付着配列は、Ｐ７プライマー配列を含む。
いくつかの実施形態では、相補付着ポリヌクレオチドは、Ｂ１５配列を含み、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドは、Ａ１４配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のフォーク型アダプター複合体は、次の構造を有する。
Figure 2023547366000010
いくつかの実施形態では、第２のフォーク型アダプター複合体は、次の構造を有する。
Figure 2023547366000011
いくつかの実施形態では、アダプター複合体は、メチル化ヌクレオチドを含む（例えば、メチル化シトシンを含む）。
Ｃ．ライゲーションを含む方法
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、各ポリヌクレオチドがアダプター配列によって分離された２つのインサートを含有するように（図１８～図１９）、ライゲーション工程を含む方法（図１５Ａ～図１５Ｆ）によって調製される。各出発ポリヌクレオチドは、１つのインサートを有する。２つ以上のライブラリー由来の出発ポリヌクレオチドを制限酵素で処理して、適合性オーバーハングを有するポリヌクレオチドを生成し、その結果、ポリヌクレオチドを種々の所望の立体配置で一緒に連結して、ポリヌクレオチドの新しいライブラリーを生成し得る。オーバーハングは、フォーク型アダプターハンドルの相補性に起因して生じ得る任意の問題を回避する。いくつかの実施形態では、新しいライブラリーは、２つの出発ライブラリーから調製される。
いくつかの実施形態では、オーバーハングは、制限酵素及び制限酵素認識部位を使用して生成される。いくつかの実施形態では、酵素は、ＩＩ型、ＩＩＳ型、ＩＩＰ型、又はＩＩＴ型制限酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、ＢｔｇＺＩである。いくつかの実施形態では、酵素は、ＢｇＬＩＩである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、リガーゼを使用して一緒にライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ビオチンなどの結合要素に結合される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの消化された末端は、ストレプトアビジン磁気ビーズなどの結合パートナーを適用することによって除去される。
図１５Ａ～図１５Ｆは、タンデムインサートライブラリーを調製する例示的なライゲーション方法を示す。いくつかの実施形態では、タンデムインサートライブラリーは、複数のリードを使用して配列決定される。いくつかの実施形態では、リード１及びリード４は、第１のインサート由来のペアエンドデータを与える。いくつかの実施形態では、リード２及びリード３は、第２のインサート由来のペアエンドデータを与える。
いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、異なる末端を有するポリヌクレオチドを生成するために使用されるインサートにライゲーションされる（図１６Ａ～図１６Ｂ）。いくつかの実施形態では、第１のライブラリーのためのフォーク型アダプターは、（１）その第１の鎖上にＰ５及びリード１、並びに（２）その第２の鎖上にＢｔｚＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、第２のライブラリーのためのフォーク型アダプターは、（１）その第１の鎖上にＰ７及びリード２、並びに（２）その第２の鎖上にＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態では、プライマー伸長を使用して、各ポリヌクレオチドの全長に沿って二本鎖である、すなわち、フォーク型立体配置を有さないポリヌクレオチドを生成する（図１６Ａ～図１６Ｂ）。
Ｄ．鎖オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）を含む方法
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドのライブラリーは、各ポリヌクレオチドがアダプター配列によって分離された２つのインサートを含有するように（図１７～図１８）、鎖オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）を含む方法（図１７～１８）によって調製される。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、１つ以上のプライマー結合配列を含み得るハイブリダイゼーション配列として本明細書において定義される連結配列である。各出発ポリヌクレオチドは、１つのインサートを有する。２つ以上のライブラリー由来の出発ポリヌクレオチドをアダプターと連結する。いくつかの実施形態では、これらのアダプターは、フォーク型アダプター又はＹ字型アダプターである。フォーク型アダプターは、全ての出発ライブラリーがそのポリヌクレオチドに付着した固有のアダプター配列を有するように設計される。これらのアダプター配列は、ポリヌクレオチドの新しいライブラリーを生成するために、様々な所望の立体配置でアニーリングするための相補的配列を提供する（図１７）。いくつかの実施形態では、新しいライブラリーは、２つの出発ライブラリーから調製される。いくつかの実施形態では、新しいライブラリーは、３つ以上の出発ライブラリーから調製される。
例えば、第１のライブラリーは、一方の末端に第１のアダプター配列を有し、他方の末端に第２のアダプター配列を有するポリヌクレオチドを含む。これらの実施形態では、第１又は第２のアダプター配列は、第２のライブラリー中の第３のアダプター配列の３’末端配列に相補的な３’配列を有する。変性及び再アニーリングによる２つのライブラリーの混合は、両方のライブラリー由来の相補的末端のハイブリダイズを可能にする。これらの実施形態では、ポリメラーゼ伸長反応は、相補的領域を完全長まで伸長し、したがって、二重インサートポリヌクレオチドを生成する。
図１７～図１８は、タンデムインサートライブラリーを調製する例示的なＳＯＥ法を示す。いくつかの実施形態では、出発ライブラリーＤＮＡを剪断し、ＤＮＡ断片を生成する。ポリメラーゼを用いて、損傷したＤＮＡ末端を除去し、並びにＤＮＡ鎖を伸長して平滑末端二重鎖を生成する。キナーゼを用いて、ＤＮＡ鎖の５’－ヒドロキシルをリン酸化する。次いで、ポリメラーゼを使用して、各二重鎖の３’末端に単一のアデニン塩基を付加する。このアデニンオーバーハング（図１７の「Ａテール」）により、ＤＮＡ断片の各末端は、アダプターの単一のチミンオーバーハングにライゲーションされ得る。ＤＮＡ断片をアダプターとライゲーションした後、ライブラリーを精製して、１５０～２００塩基対断片について選択し、混合して、ＰＣＲ反応のために調製する。ＤＮＡ鎖は高温で変性し、低温で再アニールする。これにより、Ａ及びＡ’相補的アダプター配列が互いにハイブリダイズすることを可能にする。次いで、ＰＣＲ反応におけるポリメラーゼにより鎖を伸長して、タンデムインサートポリヌクレオチドを形成する。
多くの実施形態では、アダプターは、様々な組合せで様々な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｐ５、リード１、タグ、及び／又はＡ配列を含み得るフォーク型アダプターである。いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｐ７、インデックス、リード２、タグ、及び／又はＡ’配列を含み得るフォーク型アダプターである。
いくつかの実施形態では、タンデムインサートライブラリーは、複数のリードを使用して配列決定される。いくつかの実施形態では、リード１及びリード４は、第１のインサート由来のペアエンドデータを与える。いくつかの実施形態では、リード２及びリード３は、第２のインサート由来のペアエンドデータを与える。
ＩＶ．連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法
本出願はまた、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法を開示する。複数のインサート配列を、連結された核酸配列決定鋳型から配列決定することができる。言い換えれば、連結された核酸配列決定鋳型は、タンデムリードの生成に使用できる。
いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型は、ハイブリダイズした付加物の形成によって生成される。本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイズした付加物」とは、ハイブリダイゼーション配列の相補体にアニールされたハイブリダイゼーション配列をいう。いくつかの実施形態では、完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型は、ハイブリダイズした付加物の形成後に生成される。
いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、第１のリードプライマー結合配列を、第１の標的核酸に由来する第１のインサート配列の３’末端に付着させることと、第１のインサート配列の５’末端にハイブリダイゼーション配列を付着させることと、ハイブリダイゼーション配列の相補体を、第１の標的核酸の不連続領域又は第２の標的核酸に由来する第２のインサート配列の３’末端に付着させることと、ハイブリダイゼーション配列をハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することと、を含み、第１のインサート配列と第２のインサート配列との間の領域は、第２のリードプライマー結合配列であって、ハイブリダイゼーション配列を含み、第１のリードプライマー結合配列に直交する、第２のリードプライマー結合配列を含み、それにより、連結された核酸配列決定鋳型を生成する。
いくつかの実施形態では、第１のリードプライマー結合配列を付着させること及びハイブリダイゼーション配列を付着させることは、タグメンテーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸をトランスポソーム複合体と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列の相補体を、第１の標的核酸の不連続領域又は第２の標的核酸に由来する第２のインサート配列の３’末端に付着させることは、タグメンテーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸をトランスポソーム複合体と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、第１のリードプライマー結合配列を第１のインサート配列の３’末端に付着させること及びハイブリダイゼーション配列を第１のインサート配列の５’末端に付着させることは、アダプター複合体の断片の末端へのライゲーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸を第１のフォーク型アダプター複合体と接触させて、両端で第１のアダプター複合体とライゲーションした断片及び両端で第２のアダプター複合体とライゲーションした断片を形成し、ライゲーションした断片を変性させることを含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列の相補体を第２のインサート配列の３’末端に付着させることは、アダプター複合体の断片の末端へのライゲーションに適した条件下で、１つ以上の標的核酸を第２のフォーク型アダプター複合体と接触させて、両端で第１のアダプター複合体とライゲーションした断片及び両端で第２のアダプター複合体とライゲーションした断片を形成し、ライゲーションした断片を変性させることを含む。
いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、第１の標的核酸を含む第１の試料を第１のトランスポソーム複合体及び第２のトランスポソーム複合体と接触させることであって、各トランスポソーム複合体は、
トランスポザーゼと、
トランスポゾン末端配列を含む３’部分及びアダプター配列を含む５’部分を含む、第１のトランスポゾンと、
トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含み、それにハイブリダイズする第２のトランスポゾンと、を含み、
第１のトランスポソーム複合体中のアダプター配列は、第１のアダプター配列の相補体であり、第２のトランスポソーム複合体中のアダプター配列は、第２のアダプター配列であり、
第１の標的核酸を断片化して、一方の末端が第１のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされ、他方の末端が第２のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第１の標的核酸由来のインサート配列を含む第１のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第１のタグ付き生成物の３’末端に相補付着配列を付加し、第１のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第１の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
第２の標的核酸を含む第２の試料をトランスポソーム複合体と接触させることであって、第２の標的核酸を断片化して、一方の末端が第１のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされ、他方の末端が第２のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第２の標的核酸由来のインサート配列を含む第２のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第２のタグ付き生成物の３’末端に付着配列を付加し、第２のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列を付加して、第２の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
第１の修飾されたタグ付き生成物のハイブリダイゼーション配列を第２の修飾されたタグ付き生成物中のハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、
ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することであって、連結された核酸配列決定鋳型は、
（ａ）第２の標的核酸由来のインサート配列の３’側にある、第１のリードプライマー結合配列であって、第１のアダプター配列と、トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、第１のリードプライマー結合配列と、
（ｂ）２つのインサート配列の間にある第２のリードプライマー結合配列であって、トランスポゾン末端配列と、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のリードプライマー結合配列と、を含み、
第１のリードプライマー結合配列は、第２のリードプライマー結合配列に直交する、ことと、を含む。
いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、
第１の標的核酸を含む第１の試料を第１のトランスポソーム複合体と接触させることであって、第１のトランスポソーム複合体は、
トランスポザーゼと、
トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、付着配列及び第１のアダプター配列の相補体を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、
トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含み、それにハイブリダイズする第２のトランスポゾンと、を含み、
第１の標的核酸を断片化して、各末端が第１のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第１の標的核酸由来のインサート配列を含む第１のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第１のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第１の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
第２の標的核酸を含む第２の試料を第２のトランスポソーム複合体と接触させることであって、第２のトランスポソーム複合体は、
トランスポザーゼと、
トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のアダプター配列及び相補付着配列を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、
トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含み、それにハイブリダイズする第２のトランスポゾンと、を含み、
第２の標的核酸を断片化して、各末端が第２のトランスポソーム複合体のトランスポゾンでタグ付けされた、第２の標的核酸由来のインサート配列を含む第２のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、第２のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第２の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
第１の修飾されたタグ付き生成物のハイブリダイゼーション配列を第２の修飾されたタグ付き生成物中のハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、
ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することであって、連結された核酸配列決定鋳型は、
（ａ）第２の標的核酸由来のインサート配列の３’側にある、第１のリードプライマー結合配列であって、第１のアダプター配列と、トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、第１のリードプライマー結合配列と、
（ｂ）２つのインサート配列の間にある第２のリードプライマー結合配列であって、トランスポゾン末端配列と、ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のリードプライマー結合配列と、を含み、
第１のリードプライマー結合配列は、第２のリードプライマー結合配列に直交する、ことと、を含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、固体支持体上に固定されている。
Ｖ．フォーク型アダプターを用いて配列決定鋳型を調製する方法
いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターを使用して、２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型を調製することができる。
いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｙ字型アダプターとしても知られるフォーク型アダプターであってもよい。フォーク型アダプターに基づく技術は、例えば、Ｔｒｕｓｅｑ（商標）試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローにおいて例示されるような、ポリヌクレオチドを生成するために利用することができる。また、ＴｒｕＳｉｇｈｔ（登録商標）Ｏｎｃｏｌｏｇｙキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローの試薬を使用して、フォーク型アダプターをアセンブルすることもできる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、ＨＹＢ又はＨＹＢ’配列を含む。
本明細書で使用される場合、「フォーク型アダプター」は、核酸の２つの鎖を含むアダプターを指し、２つの鎖はそれぞれ、他方の鎖に相補的である領域及び他方の鎖に相補的ではない領域を含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプター中の２つの鎖の核酸は、ライゲーションの前に一緒にアニーリングされ、アニーリングは、相補的領域に基づく。いくつかの実施形態では、相補的領域は、それぞれ１２ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の末端で両方の鎖にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片の両端にライゲーションされる。いくつかの実施形態では、断片の対向する末端上のフォーク型アダプターは異なる（図２７Ａに示される）。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの一方の鎖は、断片へのライゲーションを促進するために、その５’でリン酸化される。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの一方の鎖は、３’Ｔの直前にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、３’Ｔはオーバーハングである（すなわち、フォーク型アダプターの他方の鎖中のヌクレオチドと対形成していない）。いくつかの実施形態では、３’Ｔオーバーハングは、ライブラリー断片上に存在するＡテールと塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、３’Ｔオーバーハングのエキソヌクレアーゼ消化をブロックする。
いくつかの実施形態では、各フォーク型アダプターは、互いに部分的にハイブリダイズして二本鎖セクション及び一本鎖セクションを形成する第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含む。
図２５は、配列決定鋳型を調製するために使用され得る一対のフォーク型アダプター（すなわち、第１のアダプター及び第２のアダプター）を示す。いくつかの実施形態では、各フォーク型アダプターの第１の鎖は、配列決定プライマー配列などのアダプターを含む。いくつかの実施形態では、各フォーク型アダプターの第２の鎖は、ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）又はハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）のいずれかを含む。
ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）及びその相補体（Ｘ’）が望ましくない時間に互いに結合するのをブロックするために、ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いることができる。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、それらがタグメンテーションの標的にならないように、１つ以上の修飾を含む。言い換えれば、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、トランスポザーゼに耐性であり、したがって、ブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション配列又はその相補体へのハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖核酸の開裂を回避するように設計することができる。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含む。
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズをブロックしたい配列の全部又は一部の相補体を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、Ｘ又はＸ’配列の全て又は一部であり得る。本明細書中で使用される場合、「ブロッキングオリゴヌクレオチド」とは、２つの配列の少なくとも１つに結合したブロッキングオリゴヌクレオチドが除去されるまで、２つの配列の互いへの結合を阻害するために使用され得るオリゴヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション配列（Ｘ又はＨＹＢ）又はその相補体（Ｘ’又はＨＹＢ’）のいずれかの全部又は一部に完全に又は部分的に相補的な配列を含む。例えば、ＨＹＢ配列（図２５のＸ）をブロックするためのブロッキングオリゴヌクレオチド（Ｘ’Ｂ’）は、ＨＹＢ’配列の全部又は一部を含んでもよく、ＨＹＢ’配列（図２５のＸ’）をブロックするためのブロッキングオリゴヌクレオチド（ＸＢ）は、ＨＹＢ配列の全部又は一部を含んでもよい。
図２６に示されるフォーク型アダプターの場合、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドは、一方のフォーク型アダプター中のＸ配列の、他方のフォーク型アダプター中のＸ’配列への結合をブロックするように働き得る。
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチド（ＸＢ）は、Ｘ’配列に結合する。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチド（Ｘ’Ｂ’）は、Ｘ配列に結合する。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、Ｘ配列及びＸ’配列の両方に結合する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、Ｘ配列又はＸ’配列のいずれかに完全に又は部分的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、完全なＸ又はＸ’配列に結合する。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、Ｘ又はＸ’配列の一部に結合する。
一方又は両方のフォーク型アダプターはまた、フォーク型アダプターの第１の鎖の５’末端上に親和性部分を含み得る。図２６に示されるものなどのいくつかの実施形態では、第１のフォーク型アダプターの第１の鎖及び第２のフォーク型アダプターの第１の鎖の両方が、鎖の５’末端に親和性部分を含む。いくつかの実施形態では、親和性部分は、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンである。いくつかの実施形態では、親和性部分は、ビオチンである（すなわち、一方又は両方のフォーク型アダプターの第１の鎖がビオチン化されている）。いくつかの実施形態では、親和性部分は、固体支持体の表面上の結合部分に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、固体支持体の表面上のアビジン又はストレプトアビジンに結合するアビジン又はストレプトアビジンである。結合部分に結合できる親和性部分の範囲は、当業者に既知であり、ユーザーは、選択した親和性／結合部分の任意の対を選択することができる。
いくつかの実施形態では、結合部分は、タグ付けされた断片（フォーク型アダプターの断片へのライゲーションによって調製される）を固体支持体上に固定化する働きをする。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの少なくとも１つの第１の鎖にライゲーションされた一本鎖断片は、固体支持体上に固定されている。いくつかの実施形態では、固定された断片を洗浄でき、ブロッキングオリゴヌクレオチドを、断片が固体支持体の表面から遊離されることなく除去できる。
いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの第１の鎖は、固体支持体又はビーズ上の親和性結合パートナーに結合できる５’親和性エレメントを含む。そのような親和性エレメントは、図２５に示される第１及び第２のアダプター中の「Ｂｉｏ」によって示されるように、ビオチンであり得る。
いくつかの実施形態では、親和性エレメントは、第１の鎖に付着したリンカーを介して接続されている。いくつかの実施形態では、このリンカーは、開裂可能なリンカーである。
いくつかの実施形態では、親和性部分は、リンカーによってフォーク型アダプターの第１の鎖に連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、開裂可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、ユーザーは、親和性部分とフォーク型アダプターの第１の鎖との間の開裂可能なリンカーを開裂することによって、所望の時間に固定された断片から調製された配列決定鋳型を固体支持体から遊離することができる。いくつかの実施形態では、配列決定鋳型のアンプリコンは、固体支持体の表面上で調製され得、この場合、アンプリコンは、表面から配列決定鋳型の遊離を必要とせずに配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列（ＨＹＢ）及びハイブリダイゼーション配列の相補体（ＨＹＢ’）は、互いにハイブリダイズすることができる。しかしながら、いくつかの場合において、これは、１つのフォーク型アダプターにおけるＨＹＢの別のフォーク型アダプターにおけるＨＹＢ’への結合に基づいて、異なるフォーク型アダプター間のダイマー化を潜在的にもたらし得る。このようなアダプターダイマー化は、フォーク型アダプターを核酸断片の末端にライゲーションする能力を低下させる可能性がある。
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユーザーがこの結合が起こることを望むまで、異なるフォーク型アダプター間のＨＹＢのＨＹＢ’への結合をブロックするために使用される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体は、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している。
図２６Ａ～２６Ｃは、様々な異なるフォーク型アダプターの実施形態を示す。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１及び第２のフォーク型アダプターの両方の第２の鎖に結合され得る（図２６Ａ）。あるいは、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１のフォーク型アダプターの第２の鎖のみ（図２６Ｂ）、又は第２のフォーク型アダプターの第２の鎖のみに結合され得る。ハイブリダイゼーション配列（Ｘ）又はハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）のいずれかがブロッキングオリゴヌクレオチドによって結合される限り、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＸのＸ’への会合を介する、フォーク型アダプターの互いへのアニーリングをブロックする。図２６Ｄに示されるように、溶液中のトランスポソーム複合体を用いて同様の方法を実施することができる。
いくつかの実施形態では、２つのポリヌクレオチド鎖を含むフォーク型アダプターは、（ａ）配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、（ｂ）３’ハイブリダイゼーション配列又はその相補体を含む第２の鎖と、を含み、第１の鎖の３’末端は、第２の鎖の５’末端に完全に又は部分的に相補的である。言い換えれば、フォーク型アダプターの２つの鎖は、特定の領域において一緒にハイブリダイズすることができ、一方、２つの鎖は別の領域において分離している。第１及び第２の鎖の配列は、２つの鎖が分離している領域において異なるか、又は全て若しくは部分的に非相補的であってもよいが、第１及び第２の鎖は、同じであり、２つの鎖が一緒にハイブリダイズしている領域において、完全に若しくは部分的に相補的であってもよい。
当該技術分野で周知であるように、ＵＭＩ及び試料インデックスなどの目的とする更なる配列は、フォーク型アダプターに含まれ得る。言い換えれば、フォーク型アダプターは、図２５に示される配列のタイプに限定されないが、フォーク型アダプターは、ＵＭＩ又は試料インデックスなどの１つ以上の更なるタイプの配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、第１の鎖及び／又は第２の鎖は、アダプター、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、試料インデックス配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを更に含む。
いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの第１の鎖に含まれる配列決定プライマー配列は、Ｂ１５配列若しくはＡ１４配列、又はそれらの相補体を含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターの第１の鎖は、Ｐ７若しくはＰ５プライマー配列、又はそれらの相補体を更に含む。そのような実施形態は図２５に示されており、第１のアダプターの第１の鎖は、Ｐ５配列及び第１のリード配列決定アダプター配列（Ｐ５．Ｒ１）を含み、第２のアダプターの第１の鎖は、Ｐ７配列及び第２のリード配列決定アダプター配列（Ｐ７．Ｒ２）を含む。
いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターは、別の非同一のフォーク型アダプターとの混合物に含まれる。いくつかの実施形態では、混合物は、異なる第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターを含む。
いくつかの実施形態では、組成物又はキットは２つのフォーク型アダプターを含み、（ａ）第１のフォーク型アダプターが、第１のリード配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、ハイブリダイゼーション配列の相補体を含む第２の鎖と、を含み、（ｂ）第２のフォーク型アダプターが、第２のリード配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、ハイブリダイゼーション配列を含む第２の鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、キット又は組成物に含まれる一方又は両方のフォーク型アダプターは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。
フォーク型アダプターの混合物は、二本鎖核酸断片にライゲーションされ得る。これらの断片は、当該技術分野で周知の技術、例えば、音響、噴霧、遠心力、ニードル、又は流体力学を使用する物理的手段を使用して、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ）から調製され得る。ＤＮａｓｅ処理などの、断片を調製する酵素的手段も周知である。
第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターを含む混合物が、ライゲーションのための条件下で二本鎖核酸断片と組み合わされる場合、予測される比は、断片の５０％が、一方の末端の第１のフォーク型アダプター、及び第２の末端の第２のフォーク型アダプターでタグ付けされ（図２７Ａ）、断片の２５％が、両方の末端の第１のフォーク型アダプターでタグ付けされ（図２７Ｂ）、断片の２５％が、両方の末端の第２のフォーク型アダプターでタグ付けされる（図２７Ｃ）。いくつかの実施形態では、図２７Ａ～２７Ｃに示されるライゲーション産物は、溶液中で調製されるライゲーション反応によって生成され得る。言い換えれば、図２７Ａ～２７Ｃに示されるタグ付けされた断片は、溶液中で調製され得る。
いくつかの実施形態では、フォーク型アダプターのライゲーションによって溶液中で調製されたタグ付けされた断片は、次いで、固体支持体の表面上に固定化され得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、標的核酸から調製されたインサートをそれぞれ含む二本鎖核酸断片を含む試料を、２つのフォーク型アダプターを含む組成物又はキットと接触させることであって、一方又は両方のフォーク型アダプターは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことを含む。いくつかの実施形態では、試料を２つのフォーク型アダプターと接触させた後、方法は、フォーク型アダプターを二本鎖断片にライゲーションして、タグ付けされた二本鎖断片を調製することと、タグ付けされた二本鎖断片を固体支持体上に固定することとを含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖断片は、フォーク型アダプターとのライゲーション後に固体支持体に適用される。いくつかの実施形態では、タグ付けされた二本鎖断片の両方の５’末端の両方は、固体支持体の表面上の結合部分に結合できる親和性部分を含む（親和性部分を含むフォーク型アダプターの第１の鎖のライゲーションに基づく）。いくつかの実施形態では、結合部分への親和性部分の結合により、固体支持体上の断片を固定され、その結果、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に結合したブロッキングオリゴヌクレオチドの遊離を可能にし得る温度変化によって支持体から遊離されない。
固体支持体の表面上に二本鎖断片を固定化した後、方法は、（１）固定された一本鎖断片を生成するために固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するためにブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることを含む。いくつかの実施形態では、変性させることは、温度の上昇、ｐＨの変化、及び／又は１つ以上のカオトロピック剤の添加によって行われる。いくつかの実施形態では、例えば、１回の温度変化は、二本鎖断片の２つの鎖の変性及びブロッキングオリゴヌクレオチドの遊離を媒介し得る。いくつかの実施形態では、変性に関連する温度の上昇は、４５℃～５５℃から８５℃～９５℃への上昇であり、任意選択的に、温度の上昇は、５０℃～９０℃への上昇である。いくつかの実施形態では、１つ以上のカオトロピック剤は、ホルムアミド及び／又はＮａＯＨを含む。
いくつかの実施形態では、第１の一本鎖断片はインサートを含み、第２の一本鎖断片は、第１の断片に含まれるインサートの相補体であるインサートを含む。いくつかの実施形態では、第１の一本鎖断片はインサートを含み、第２の断片は、第１の断片に含まれるインサートの相補体ではないインサートを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、各断片の一方の末端にライゲーションされた第１のフォーク型アダプターと、各断片の他方の末端にライゲーションされた第２のフォーク型アダプターと、を含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こる。いくつかの実施形態では、２つの固定された一本鎖断片は、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列の、第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体への結合がない状態で、互いにハイブリダイズして架橋を形成しない。いくつかの実施形態では、２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズして架橋を形成することは、各断片の両端にライゲーションされた同じフォーク型アダプターを含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こらない。
いくつかの実施形態では、固体支持体の表面は、変性後に洗浄され、ブロッキングオリゴヌクレオチドは洗浄によって除去されるが、一本鎖断片は、固体支持体の表面の結合部分を有する断片上の５’親和性部分間の相互作用に起因して固定されたままである。いくつかの実施形態では、二本鎖又は一本鎖断片の固定化は、第１及び／又は第２のフォーク型アダプター由来の親和性部分の、固体支持体の表面上の１つ以上の結合部分への結合による。いくつかの実施形態では、親和性部分は、ビオチン、デスチオビオチン、又はデュアルビオチンであり、結合部分は、アビジン又はストレプトアビジンである。
一本鎖断片は、固体支持体上の単一表面上に既に固定されている二本鎖断片から調製されるので、二本鎖断片由来の相補的一本鎖断片は、非常に近接している可能性が高い（図２８Ａに示され、ここでは、固体支持体の左表面及び右表面が同じ表面の異なる図を示す）。ブロッキングオリゴヌクレオチドの変性は、ハイブリダイゼーション配列及びその相補体（図２８ＡにおけるＸ及びＸ’）がこの段階で互いに結合するために利用可能であることを意味する。
次に、方法は、２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、両方の一本鎖断片の３’末端から伸長させて、鋳型の各鎖が両方の固定された一本鎖断片由来のインサート（又はその相補体）を含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む（図２９に示される）。
いくつかの実施形態では、第１の末端で第１のフォーク型アダプターの第１の鎖（例えば、図２５に示される）及び第２のフォーク型アダプターの第２の鎖とライゲーションされた二本鎖断片から調製された一本鎖断片は、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列（Ｘ）の、第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’）への会合によって、第１の末端で第１のフォーク型アダプターの第１の鎖及び第２のフォーク型アダプターの第２の鎖とライゲーションされた二本鎖断片から調製された別の一本鎖断片に結合することができる（図２８Ａ）。
いくつかの実施形態では、変性、ハイブリダイズ及び伸長の１回以上の更なる工程が実施される。このようにして、方法は、一本鎖断片が、ＨＹＢ／ＨＹＢ’結合を介して架橋（及び連結された配列決定鋳型）を形成する適切な他の一本鎖断片がなくなるまで、配列決定鋳型の作製を進行できる。
いくつかの実施形態では、二本鎖断片から調製された両方の一本鎖断片は、同じ固体支持体の表面上に固定されている。いくつかの実施形態では、方法は、固体支持体上の単一の表面を用いて行われ、その結果、全ての断片が同じ固体支持体上に固定される。図２８Ａ～２８Ｃに提示される左及び右の表面（第１及び第２の断片が付着して示される）は、固体支持体上の同じ表面の２つの異なる図を表す。
いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの遊離は、それらの相補配列に結合できる「遊離」ハイブリダイゼーション配列を生成する。いくつかの実施形態では、１つの一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列は、別の一本鎖断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合し得る。そのような結合は、図２８Ａに示されるような「架橋」を生成し得る。
伸長後、連結された配列決定鋳型は、図２９に示されるように、互いのコピーである２つのインサートを含み得る。
同一のライゲーションされたアダプターを有する一本鎖断片は、互いにハイブリダイズすることができない。例えば、Ｘ’でタグ付けされた２つの断片は、ハイブリダイゼーション配列において互いに対形成することができず（図２８Ｂ）、Ｘでタグ付けされた２つの断片は、ハイブリダイゼーション配列において互いに対形成することができない（図２８Ｃ）。したがって、２つのインサートを含む配列決定鋳型を、同じアダプターを含む断片から調製することができない（図２８Ｂ及び図２８Ｃに示される０％によって示される）。２つのインサート配列は互いにハイブリダイズすることができるが（図２８Ａ～２８Ｃの鎖Ａ及び鎖Ａ’の配列）、鎖Ａと鎖Ａ’との間のそのような対形成の後に相補的ではない３’配列（Ｘ／Ｘ’）が続くため、これらの配列間の直接的なハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイズ後の伸長が不可能になる。
このようにして、２つのコピーのインサートを含む配列決定鋳型の１００％が、異なるアダプターを含む断片から調製される（図２８Ａ）。第１のフォーク型アダプターは、第２のフォーク型アダプターとは異なる配列を含み得るので、この態様は重要である。例えば、図２８Ａに示されるように、第１のフォーク型アダプターは、第１のリード配列決定アダプター配列（Ｐ５．Ｒ１）を含んでもよく、第２のフォーク型アダプターは、第２のリード配列決定アダプター配列（Ｐ７．Ｒ２）を含んでもよい。
したがって、図２９に示されるように、同じインサート配列の２つのコピーと所望の配列決定プラットフォームに必要とされ得る適切なアダプターとを含む全長の連結された配列決定鋳型を、伸長後に調製することができる。言い換えれば、当業者は、結果として生じる配列決定鋳型が、好ましい配列決定プラットフォームのための所望のアダプター配列を含むように、フォーク型アダプターを設計することができる。
二本鎖断片は、最初に固体支持体上に固定化され、次いで変性されるので、同じ二本鎖断片から変性された２つの一本鎖断片は、表面上で互いに近接して固定されている可能性が高い。この工程の順序は、同じ二本鎖断片由来の２つの一本鎖断片（図２８Ａに示されるように、一方の断片が鎖Ａ配列を含み、他方の断片が鎖Ａ’配列を含む）が、互いに相互作用できる可能性が高いことを意味する。この態様は、本発明の方法によって調製される配列決定鋳型が、標的核酸由来の同じ配列の２つのコピー（鎖Ａ由来の１つ及び伸長によって調製される鎖Ａ’の相補体由来の１つ）を含む可能性を増加させる。本明細書に記載されるように、（標的核酸の相補鎖から生じる）同じインサート配列の２つのコピーを有するこの配列決定鋳型は、標的核酸の鎖とアンチセンス鎖との間の塩基対ミスマッチのエラー訂正又は同定を可能にする。このような塩基対ミスマッチはまれである場合があり、そうでなければ標準的な配列決定での解決が困難であり得る。
あるいは、無関係のインサート配列及び相補的アダプターを含む一本鎖断片もまた、ハイブリダイズして架橋を形成し、次いで、連結された配列決定鋳型を生成し得る。２つの異なるインサートを有する連結された配列決定鋳型は、単一のインサートを含む標準的な配列決定鋳型を用いた配列決定と比較して、追加の配列リードを可能にすることによって、シーケンシング深度を増加させるのに役立ち得る。
Ａ．近接データを評価するための区画化の方法
本明細書に記載される任意の方法は、区画化と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、区画化は、異なるインサートが同じ標的核酸に含まれたかどうかなど、近接データを生成することを可能にする。同じ標的核酸が染色体である場合、区画化は、本明細書中に記載されるハプロタイプフェージングの方法に使用され得る。
いくつかの実施形態では、区画化は、フォーク型アダプター又はトランスポソームを使用して近接データを評価する本発明の方法と共に使用される。いくつかの実施形態では、区画は、利用可能な標的核酸の数を制限するために希釈して使用されてもよい。いくつかの実施形態では、各区画は、一般に、希釈後に１つの標的核酸を含むか、又は標的核酸を含まない（図３１に示す）。したがって、所定の区画において調製された断片は、一般に、同じ標的核酸から調製された断片である。このようにして、これらの方法によって調製された同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサートは、同じ標的核酸に由来したと推測することができる。
いくつかの実施形態では、区画は、ウェル、チューブ、又は液滴である。例えば、図３１はウェルを用いる方法を示し、図３２は液滴を用いる方法を示す。広範な異なるウェル、チューブ、及び液滴が当業者に既知であり、任意のタイプが本発明の方法において使用され得る。
「液滴」は、液滴アクチュエータ上のある体積の液体を意味する。典型的には、液滴は、充填流体によって少なくとも部分的に結合される。例えば、液滴は、充填流体によって完全に包囲されてもよく、又は充填流体及び液滴アクチュエータの１つ以上の表面に囲まれていてよい。別の例として、液滴は、充填流体、液滴アクチュエータの１つ以上の表面、及び／又は大気によって囲まれていてよい。別の例では、液滴は、充填流体及び大気によって囲まれていてよい。液滴は、例えば、水性若しくは非水性であってもよく、又は水性及び非水性成分を含む混合物若しくはエマルジョンであってもよい。液滴は、多種多様な形状をとることができ、非限定的な例としては、略円盤形、スラグ形、切頭球形、楕円形、球形、部分的に圧縮された球形、半球形、卵形、円筒形、そのような形状の組み合わせ、及び液滴操作中に形成される様々な形状、例えば、合体若しくは分割、又はそのような形状と液滴アクチュエータの１つ以上の表面との接触の結果として形成される様々な形状が挙げられる。本開示のアプローチを使用して液滴操作に供され得る液滴流体の例については、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００７年１０月２５日公開のＥｃｋｈａｒｄｔら、国際公開第２００７／１２０２４１号、表題「Ｄｒｏｐｌｅｔ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」を参照されたい。米国特許第１０，９７５，３７１号は、液滴及び液滴アクチュエータの多種多様な用途を教示しており、その全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、断片は、フォーク型アダプターの２つのプールを使用して区画内で調製することができ、一方のプールは、ハイブリダイゼーション配列を含むフォーク型アダプター（すなわち、図２５の第２のアダプター）を含み、他方のプールは、ハイブリダイゼーション配列の相補体を含むフォーク型アダプター（すなわち、図２５の第１のアダプター）を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、標的二本鎖核酸を含む試料を複数の異なる区画に区画化することと、複数の異なる区画内の二本鎖核酸由来のインサートをそれぞれ含む断片を調製することとを含む。次に、方法は、複数の異なる区画を、２つのフォーク型アダプターを含む組成物又はキットと接触させることであって、一方又は両方のフォーク型アダプターが、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことと、フォーク型アダプターを二本鎖断片にライゲーションして、複数の異なる区画内でタグ付けされた二本鎖断片を調製することとを包含し得る。
いくつかの実施形態では、方法は、次に、（１）一本鎖断片を生成するために固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）複数の異なる区画内のハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するためにブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、同じ区画内の２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、を含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、同じ区画内の両方の一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することを含み得る。
いくつかの実施形態では、標的二本鎖核酸は、二本鎖ＤＮＡ断片を含み、断片を調製することにより、二本鎖ＤＮＡ断片の小断片を調製する。言い換えれば、標的二本鎖核酸は、比較的大きな断片に断片化されてもよく、これは次に区画内で小断片に断片化される。これは図３１及び図３２に示され、ここでｆ１断片は小断片１．１、１．２及び１．３に断片化される。
この方法では一本鎖断片が固定化されないため、２つの異なるインサート配列を含む連結された配列決定鋳型が調製される可能性が高い。いくつかの実施形態では、第１の一本鎖断片はインサートを含み、第２の断片は、第１の断片に含まれるインサートの相補体ではないインサートを含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、各断片の一方の末端にライゲーションされた第１のフォーク型アダプターと、各断片の他方の末端にライゲーションされた第２のフォーク型アダプターと、を含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こる。
いくつかの実施形態では、一本鎖断片は、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列の、第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体への結合がない状態で、互いにハイブリダイズして架橋を形成しない。いくつかの実施形態では、２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズして架橋を形成することは、各断片の両端にライゲーションされた同じフォーク型アダプターを含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こらない。
Ｂ．ハプロタイプフェージング
「ハプロタイプフェージング」は、本明細書で使用される場合、同じ染色体上に共存する対立遺伝子を同定することを指す。配列決定データは、一般に、フェージングされていない遺伝子型からなり、このようなデータは、特定の対立遺伝子が２つの親染色体又はハプロタイプのいずれに該当するかを区別することができない。
区画化の方法（例えば、全ゲノムハプロタイピングの準備に使用するため）は当技術分野で周知であり、例えば、Ａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４６（１２）：１３４３－９（２０１４）、Ｋａｐｅｒ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．１１０（１４）：５５５２－５５５７（２０１３）、Ｋｉｔｚｍａｎ ＪＯ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１）：５９－６３（２０１１）、Ｐｅｔｅｒｓ ＢＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．４８７（７４０６）：１９０－１９５（２０１２）、Ｆａｎ ＨＣ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１）：５１－５７（２０１１）、Ｌｅｖｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．５（１０）：ｅ２５４（２００７）、Ｄｕｉｔａｍａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０（５）：２０４１－２０５３（２０１２）、Ｓｕｋ ＥＫ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２１（１０）：１６７２－１６８５（２０１１）に教示されており、各々の全開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、区画化は、異なるハプロタイプを異なる区画に分離し、方法は、ハプロタイプフェージングに使用される。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡなどの標的核酸は、限界希釈によって複数の区画に等分され、その結果、個々の区画は、限定された数のＤＮＡ分子を含み、それによって、ゲノムの任意の位置が、区画中のハプロイドＤＮＡによって表される可能性が高い。
いくつかの実施形態では、限界希釈は、両方のハプロタイプ（図３３におけるＣｈｒ１－Ｈａｐ１及びＣｈｒ２－Ｈａｐ２など）が同じ区画内にある可能性を低減するが、方法は、単一の染色体のみが区画内に含まれることを必要としない。言い換えれば、希釈は、同じ染色体の２つのハプロイドコピーが同じ区画に含まれる可能性が無視できる程度（例えば、５％未満又は１％未満）であり得るが、区画は、多くの場合、２つ以上の染色体を含み得る（このとき、２つ以上の染色体は、一般的に、同じ染色体のハプロイドコピーではない）。
そのような方法は図３３に示されており、ここでは染色体を区画内への限界希釈に供し、続いて一本鎖断片を調製し、次いでハイブリダイゼーション及び伸長を行って個々の区画内で連結された配列決定鋳型を調製する。
図３３に示す例では、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ１は、Ｃｈｒ２－Ｈａｐ１を有する区画に含まれるが、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ２は、Ｃｈｒ２－Ｈａｐ２を有する区画に含まれる。連結された配列決定鋳型は区画を用いて調製されるため、これらの鋳型は、同じ区画にあった染色体のインサートのみを含むことができる（チェック付き矢印を有するボックスとして示される）。他の組合せ（「Ｘ」矢印を有するボックスに示される）は、これらのハプロタイプがこの例において同じ区画に含まれなかったため、形成することができない。
この方法が既知のゲノムを有する生物由来の試料を用いて実施される場合、同じ連結された配列決定鋳型における異なる染色体由来のインサートの存在（これらの異なる染色体は、方法の間に同じ区画に含まれていたため）は、配列決定データから解明され得る。同じ区画にあった染色体を決定するための分析によって、ハプロイドコピーに含まれる対立遺伝子に関する情報を決定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、バーコードを必要としない。代わりに、本発明の、区画において調製された連結された配列決定鋳型の使用は、バーコードを必要とすることなく、どのインサート配列がハプロイドコピーに含まれていたかについて、分析を可能にする。
ＶＩ．溶液中でトランスポソームを使用して複数のインサートを含む配列決定鋳型を調製する方法
いくつかの実施形態では、タグメンテーションを溶液中で実施して、タグ付けされた二本鎖断片を調製する。これらのタグ付けされた二本鎖断片は、フォーク型アダプターのライゲーションのための上記の方法と同様に、複数のインサートを含む配列決定鋳型を調製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、タグ付けされた二本鎖断片は、トランスポソームの２つのプールを使用して溶液中で調製され、次いで、タグ付けされた二本鎖断片は、固体支持体上に固定される。いくつかの実施形態では、固定化は、タグメンテーション中にタグ付けされた断片に組み込まれた親和性部分を、固体支持体上の結合部分に結合させることによって行われる。図２６Ｄは、タグメンテーションを使用して溶液中でタグ付けされた二本鎖断片を調製する実施形態を示し、これらのタグ付けされた二本鎖断片は、フォーク型アダプターを使用する方法について上述したように、連結された配列決定鋳型を調製するために使用できる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、（ａ）二本鎖標的核酸を含む試料を、溶液中のトランスポソーム複合体の２つのプールと接触させることであって、トランスポソーム複合体の第１のプールは、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含み、トランスポソーム複合体の第２のプールは、トランスポザーゼと、３’トランスポゾン末端配列及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、ことを含む。
いくつかの実施形態では、一方又は両方の第２のトランスポゾンは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む。そのようなブロッキングオリゴヌクレオチドは、フォーク型アダプターを用いる方法について上述されており、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、トランスポソーム複合体の一方のプールに含まれるハイブリダイゼーション配列の、トランスポソーム複合体の他方のプールにおけるハイブリダイゼーション配列の相補体への結合を阻害するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖核酸をタグメンテーションして、タグ付けされた二本鎖断片を生成することと、トランスポソーム複合体を二本鎖断片から遊離させることと、二本鎖断片を伸長し、ライゲーションすることと、を含む。
いくつかの実施形態では、タグ付けされた二本鎖断片は、固体支持体上に固定される。いくつかの実施形態では、この固定化は、タグに含まれる５’親和性部分を固体支持体上の結合部分に結合させることによって行われる。
いくつかの実施形態では、方法は、次に、（１）固定された一本鎖断片を生成するために固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するためにブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることを含む。いくつかの実施形態では、変性後、方法は、２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の固定された一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型は、インサート配列及びインサート配列のコピーを含む。いくつかの実施形態では、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型は、互いに異なる２つのインサート配列を含む。
１つの一本鎖鋳型中のハイブリダイゼーション配列の、別の一本鎖鋳型中のハイブリダイゼーション配列の相補体へのハイブリダイズ、及び連結された配列決定鋳型を調製するための伸長は、フォーク型アダプター方法について上述されるように実施され得る。本質的に、溶液中でタグ付けされた二本鎖断片が調製されると（フォーク型アダプターのライゲーション又は溶液中のタグメンテーションのいずれかによって）、後の固定化及び架橋調製の工程の後、連結された配列決定鋳型を同様の工程によって実施できる。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイズすることは、各断片の一方の末端に第１のトランスポソーム複合体の第２のトランスポゾン由来のタグと、各断片の他方の末端に第２のトランスポソームの第２のトランスポゾン由来のタグとを含む、二本鎖断片から調製された一本鎖断片間で起こる。
いくつかの実施形態では、２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて架橋を形成することは、各断片の両端に同じトランスポソーム複合体由来のタグを含む二本鎖断片から調製された一本鎖断片間では起こらない。
ＶＩＩ．固定されたトランスポソームを有する固体支持体を用いて複数のインサートを含む配列決定鋳型を調製する方法
いくつかの実施形態では、複数のインサートを含む配列決定鋳型は、固体支持体上に固定されたトランスポソームを使用して調製される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、スライド、容器の壁、フローセル、又はフローセルに含まれるナノウェルである。
本明細書で使用するとき、「トランスポソーム複合体」又は「トランスポソーム」は、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載の他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、転移反応を触媒することができる機能的複合体を形成するために、トランスポゾン認識配列に結合する。いくつかの側面では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を標的核酸に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１つの鎖が標的核酸に転写され、開裂事象が生じる。例示的な転位手順及びシステムは、トランスポザーゼでの使用に容易に適合され得る。
「トランスポザーゼ」は、トランスポゾン末端含有組成物（例えば、トランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）を有する機能的複合体を形成し、かつ二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入又は転位を触媒することができる酵素を意味する。本明細書に提示されるトランスポザーゼはまた、レトロトランスポゾン及びレトロウイルスからのインテグラーゼを含み得る。
トランスポゾンベースの技術は、ＤＮＡを断片化するために利用することができ、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸は、標的を同時に断片化及びタグ付けする（「タグメンテーション」）トランスポソーム複合体で処理され、それによって、断片の末端に固有のアダプター配列でタグ付けされた断片化核酸分子の集団を生成する。タグメンテーションは、トランスポゾン末端配列（本明細書でトランスポゾンと称される）を含む１つ以上のタグ（アダプター配列など）で複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を含む。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化及び二重鎖断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションを同時にもたらし得る。
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンがランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の構成要素としては、トランスポザーゼ（又は本明細書に記載される核酸を断片化及びタグ付けすることができる他の酵素、例えば、インテグラーゼ）、及び酵素に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾン要素、及び２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに結合されたアダプター配列が含まれ得る。二本鎖トランスポゾン末端配列のうちの一本鎖は、標的核酸の一本鎖に転移され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は、転移されない（すなわち、非転移トランスポゾン配列）。アダプター配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列（例えば、プライマー配列）を含み得る。
「トランスポゾン末端」という用語は、インビトロ転位反応で機能するトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素との複合体を形成するために必要なヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖核酸ＤＮＡを指す。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端は、転位反応においてトランスポザーゼと機能複合体を形成することができる。非限定的な例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号の開示に記載されるように、トランスポゾン末端は、１９－ｂｐの外側末端（「outer end、ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「inner end、ＩＥ」）トランスポゾン末端、又は野生型若しくは変異体Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識される「モザイク末端」（「mosaic end、ＭＥ」）トランスポゾン末端、又はＲ１及びＲ２トランスポゾン末端を含み得る。トランスポゾン末端は、インビトロ転位反応においてトランスポザーゼ又はインテグラーゼ酵素と機能複合体を形成するのに好適な任意の核酸又は核酸類似体を含み得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾骨格を含むことができ、一方又は両方の鎖にニックを含むことができる。「ＤＮＡ」という用語は、トランスポゾン末端組成物に関連して本開示全体を通して使用されるが、任意の好適な核酸又は核酸類似体がトランスポゾン末端において利用され得ることを理解すべきである。
同様に、「転移鎖」という用語は、両方のトランスポゾン末端の転移部分を指す。同様に、「非転移鎖」という用語は、両方の「トランスポゾン末端」の非転移部分を指す。転移鎖の３’末端は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移される。転移されたトランスポゾン末端配列に相補的なトランスポゾン末端配列を示す非転移鎖は、インビトロ転位反応で標的ＤＮＡに結合又は転移されない。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンは、フォーク型アダプタートランスポゾンである。フォーク型アダプタートランスポゾンは、２つの鎖を含む。いくつかの実施形態では、フォーク型アダプタートランスポゾンの第２の鎖は、アダプター配列と、第１のフォーク型アダプタートランスポゾンの第１の鎖に完全に又は部分的に相補的な配列とを含む。第１及び第２の鎖において完全な又は部分的な相補性を有する配列は、２つの鎖が一緒にハイブリダイズして、フォーク型構造を形成することを可能にする。
いくつかの実施形態では、２種類以上のトランスポソーム複合体は、固体支持体の表面上に固定されている。いくつかの実施形態では、断片は、異なるトランスポソームの使用に基づいて異なるタグを備えて調製することができる。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、固定されたトランスポソーム複合体の２つのプールを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールは、（ａ）トランスポザーゼと、（ｂ）３’トランスポゾン末端配列、第１のリード配列決定アダプター配列、及び５’親和性部分を含む第１のトランスポゾンと、（ｃ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第２のプールは、（ａ）トランスポザーゼと、（ｂ）３’トランスポゾン末端配列、第２のリード配列決定アダプター配列、及び５’親和性部分を含む第１のトランスポゾンと、（ｃ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む。いくつかの実施形態では、各第１のトランスポゾンは、固体支持体の表面上の結合部分への５’親和性部分の結合によって固定されている。
いくつかの実施形態では、固定されたトランスポソーム複合体の第１のプールは、Ｐ５．Ｒ１を含む第１のオリゴヌクレオチドと、Ｘ’（ハイブリダイゼーション配列の相補体）を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含む、第１のフォーク型アダプターを含む。いくつかの実施形態では、固定されたトランスポソーム複合体の第２のプールは、Ｐ７．Ｒ２を含む第１のオリゴヌクレオチドと、Ｘ（ハイブリダイゼーション配列）を含む第２のオリゴヌクレオチドとを含む、第２のフォーク型アダプターを含む。このような例示的な実施形態は、図３４に示される。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼの２つの分子のダイマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ホモダイマー及び／又はヘテロダイマーを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、トランスポザーゼの２つの分子は各々、同じ型の第１及び第２のトランスポゾンに結合している（例えば、各モノマーに結合した２つのトランスポゾンの配列は同じであり、「ホモダイマー」を形成する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を採用する。いくつかの実施形態では、各集団におけるトランスポゾンは同じである。本明細書で使用される場合、「ホモダイマー」は、両方の部位に同じトランスポゾン配列を含むトランスポソームダイマーを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、第１のフォーク型アダプターをトランスポザーゼと接触させて第１のトランスポソーム複合体を調製し、第２のフォーク型アダプターをトランスポザーゼと接触させて第２のトランスポソーム複合体をアセンブルし、次いで第１及び第２のトランスポソーム複合体を一緒にプールすることによってアセンブルされた、トランスポソーム複合体の集団を使用する。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体のプールは、第１のフォーク型アダプターを含むホモダイマー及び第２のフォーク型アダプターを含むホモダイマーを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体は、ヘテロダイマーであり、トランスポザーゼの２つの分子は各々、第１及び第２のトランスポゾンを含む異なるフォーク型アダプターに結合している（例えば、トランスポソーム複合体の各モノマーに結合した２つのトランスポゾンの配列は異なり、「ヘテロダイマー」を形成する）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターをトランスポザーゼと一緒にプールして、トランスポソーム複合体のプールをアセンブルすることによってアセンブルされた、トランスポソーム複合体の集団を使用する。このプールの後、アセンブルされたトランスポソーム複合体の予測される比率は、第１のフォーク型アダプターを含むホモダイマーであるトランスポソーム複合体が２５％、第２のフォーク型アダプターを含むホモダイマーであるトランスポソーム複合体が２５％、並びに、第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターを含むヘテロダイマーであるトランスポソーム複合体が５０％である。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１及び／又は第２のプールは、ホモダイマー又はヘテロダイマーである。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１及び第２のプールは、ホモダイマー又はヘテロダイマーである。例示的なホモダイマー、ヘテロダイマー、及び固定化ホモダイマーを含む固体支持体、並びにそれらの使用方法は、米国特許第９，６８３，２３０号に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれる。図３５は、ホモダイマーの２つのプールを含む例示的な固体支持体を示し、ここで、全てのホモダイマーは固体支持体の表面上に固定されている。２つのホモダイマーのプール又はヘテロダイマーを含むプールを使用して、タグ付けされた二本鎖断片を生成することができ、少なくともいくつかの断片は、第１のプールに含まれるトランスポソーム複合体由来のタグを一方の末端に、第２のプールに含まれるトランスポソーム複合体由来のタグを他方の末端に含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のトランスポゾンは、アダプター、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む。言い換えれば、トランスポゾンは、配列決定など、ユーザーが実施したい方法において有用な追加の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のトランスポゾンは、インデックス配列及び／又はＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のトランスポゾンは、インデックス配列及びＵＭＩを含む。ＵＭＩを含むトランスポゾン及びそれらの使用方法は、国際公開第２０１９／１０８９７２号、同第２０１８／１３６２４８号、同第２０１６１７６０９１号、及び同第２０２０１４４３７号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第１のトランスポゾン及び／又はトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第１のトランスポゾンは、試料インデックスを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第１のトランスポゾン及びトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第１のトランスポゾンの両方は、試料インデックスを含む。代表的な例では、実施形態は、図４６Ａに示されるように、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれるｉ５を含む第１のトランスポゾンと、トランスポソーム複合体の第２のプールに含まれるｉ７を含む第１のトランスポゾンとを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第２のトランスポゾン及び／又はトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第２のトランスポゾンは、試料インデックス及び／又はＵＭＩを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第２のトランスポゾン及びトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第２のトランスポゾンの両方は、試料インデックスを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれる第２のトランスポゾン及びトランスポソーム複合体の第２のプールに含まれる第２のトランスポゾンの両方は、ＵＭＩを含む。代表的な例では、実施形態は、図４６Ｂに示されるように、トランスポソーム複合体の第１のプールに含まれるｉ８を含む第２のトランスポゾンと、トランスポソーム複合体の第２のプールに含まれるｉ６を含む第２のトランスポゾンとを含んでよく、ｉ６及びｉ８はＵＭＩとして機能する。
いくつかの実施形態では、トランスポソームの第１のプール及び第２のプールの両方に含まれる第１及び第２のトランスポゾンは、試料インデックス配列又はＵＭＩのいずれかを含み得る。そのようなトランスポソームが本発明の方法において使用される場合、図４６Ｃに示されるようなポリヌクレオチドが産生され得る。
いくつかの実施形態では、１つ以上の二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型（図３７に示されるような）を生成する方法は、固体支持体に固定されている二本鎖核酸を含む試料を適用することと、二本鎖核酸をタグメンテーションして、二本鎖核酸由来のインサートを含むタグ付けされた二本鎖断片を生成することとを含み、二本鎖断片は、５’親和性部分が固体支持体の表面上の結合部分に結合することによって固体支持体に固定されている。いくつかの実施形態では、５’親和性部分は、第１のトランスポゾン（すなわち、トランスポソーム複合体に含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖）に含まれる。
いくつかの実施形態では、次いでトランスポソーム複合体が二本鎖断片から遊離される。いくつかの実施形態では、二本鎖断片からのトランスポソーム複合体の遊離は、ＳＤＳ及び洗浄を用いて実施される。
いくつかの実施形態では、方法は、トランスポソーム複合体の遊離後に、伸長して二本鎖断片をライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態では、伸長及びライゲーションは、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び伸長緩衝液（ＥＬＭＴ）を提供することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、伸長してライゲーションした二本鎖断片を一本鎖断片に変性させることを含み、５’親和性部分を含む一本鎖断片は、図３８に示されるように、固体支持体上に固定されたままである。いくつかの実施形態では、変性は、固体支持体を加熱すること、又は化学変性剤を適用することを含む。いくつかの実施形態では、変性させることは、固体支持体の温度を９０℃以上に上昇させることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、第１の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列を、第２の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体にハイブリダイズさせ、それによって架橋を形成することを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズさせることは、固体支持体を冷却すること、及び／又はハイブリダイゼーション緩衝液を適用することを含む。いくつかの実施形態では、冷却することは、固体支持体の温度を６０℃以下に低下させることを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション緩衝液は高塩濃度を含み、任意選択的に、高塩濃度は７５０ｍＭ ＮａＣｌである。
いくつかの実施形態では、第１の一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列（Ｘ又はＨＹＢ）は、第２の一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体（Ｘ’又はＨＹＢ’）にハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体は、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合しており、変性させることは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを変性させてハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体をブロック解除することを含む。このようなブロッキングオリゴヌクレオチドは、フォーク型アダプターについて上述したように機能し得、このとき、ハイブリダイゼーション配列のその相補体への会合は、ブロッキングオリゴヌクレオチドが変性されるまでブロックされる。いくつかの実施形態では、トランスポソームに含まれるフォーク型アダプターは、３つのオリゴヌクレオチドを含み、このとき、２つのオリゴヌクレオチドは、フォーク型トランスポゾンの第１及び第２のトランスポゾンを含み、第３のオリゴヌクレオチドは、ブロッキングオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチド（例えば、ＸＢ又はＸ’Ｂ’）は、第２のトランスポゾンの３’末端の一本鎖セクションにおいてフォーク型アダプタートランスポゾンにハイブリダイズされる。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、フォーク型アダプタートランスポゾンの第１及び第２のアダプターのいずれか又は両方にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１のフォーク型アダプタートランスポゾン及び第２のフォーク型アダプタートランスポゾンが、第２のオリゴヌクレオチドの３’相補的セクションを介して互いにハイブリダイズすることを防止する。いくつかの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、タグメンテーションの標的ではないヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、第１の固定された一本鎖断片に含まれるＨＹＢの、第２の固定された一本鎖断片に含まれるＨＹＢ’への結合は、「架橋」と称され得る（フォーク型アダプターを使用する方法においてこの用語が使用されるのと同様）。
いくつかの実施形態では、Ｘ配列を含む断片は、他の断片中のＸ’配列にハイブリダイズすることができる（図４２及び４５に示される）。いくつかの実施形態では、第２のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターのみから、又は第１のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターのみから組み込まれたアダプターを含む断片は、一緒に架橋することができない（図４３及び図４４に示される）。
いくつかの実施形態では、２つの一本鎖断片の架橋後、方法は、伸長させ、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ハイブリダイズさせ、伸長させ、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成する更なる工程を含む。換言すれば、２つの固定された一本鎖断片間の架橋を可能にする工程は、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型がこれ以上調製できなくなるまで繰り返され得る。調製される二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型の数は、相補的ＨＹＢ／ＨＹＢ’配列に近接して固定された一本鎖断片の数によって制限され得る。一本鎖断片が他の一本鎖断片と結合できなくなると、更なる連結された配列決定鋳型を調製することができなくなる。
いくつかの実施形態では、固定されたトランスポソームを使用して調製された連結された配列決定鋳型は、同じインサートの２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡのトランスポソームに対する比率が高いと、同じインサートの２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型の割合が高くなる。いくつかの実施形態では、固定されたトランスポソームによるタグメンテーションの前に、ＤＮＡを長さ１０００ｂｐ未満の短い断片に予め断片化して、同じインサートの２つのコピーを含む高い割合の連結された配列決定鋳型を生成する。このような条件下での結果、一緒にハイブリダイズするセンス及びアンチセンス相補的配列を含む一本鎖断片が主となり、伸長が同じインサートの２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型を生成する。
いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型は、互いのコピーではない２つのインサートを含む。いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型に含まれるインサートは異なる。いくつかの実施形態では、２つの異なるインサートを含む連結された配列決定鋳型は、以下に概説される方法を使用する近接データを生成するために使用される。
Ａ．空間的に局在化されたトランスポソームによる二本鎖核酸の近接領域又は隣接領域の断片化
トランスポソーム複合体に含まれるトランスポザーゼへの二本鎖核酸の結合はランダムであるが、所与の二本鎖核酸は、固体支持体の表面の特定の領域に固定されているトランスポソームによって断片化される。方法のこの態様は、図４５に概説されており、このとき、領域Ａ～Ｅは、１つの二本鎖核酸において順序付けられ、したがって、タグメンテーションされた場合に架橋断片を生成する。この二本鎖核酸は空間的な制限を課し、二本鎖核酸の第１の領域が表面の所与の領域においてトランスポソーム複合体に結合すると、二本鎖核酸の残りはこの領域においてトランスポソーム複合体に自由に結合するだけである。トランスポソームが固定された固体支持体の表面上の断片の位置に基づいてゲノム接続性情報を保持する能力は、米国特許第１０，２４６，７４６号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
要するに、図４５に示されるように、同じ二本鎖核酸由来の異なる断片をタグメンテーションし、隣接するトランスポソーム複合体にわたって固定することができる。したがって、二本鎖核酸から調製されたインサートを含む断片は、タグメンテーション前の二本鎖核酸中のこれらのインサート配列の距離に基づいた空間的関係で固定されている。
Ｂ．架橋のための固定された一本鎖断片の近接
固定されたトランスポソームを使用して調製された一本鎖核酸は、第１の一本鎖断片中のＨＹＢと第２の一本鎖断片中のＨＹＢ’との間に架橋を形成する前に固定されているため、架橋中で結合する第１及び第２の断片は、固体支持体の表面上に近接して固定化されなければならない。例えば、第１及び第２の断片は、同じ二本鎖断片から産生されたセンス鎖及びアンチセンス鎖であり得る。これは図３８及び３９に示されており、両末端で固定されている二本鎖断片由来の相補的一本鎖断片を変性させて、次いでハイブリダイゼーションが可能な場合に互いに再アニールさせてもよい。図４０に示されるように、一本鎖インサート（Ａ及びＡ’を含むものなど）のハイブリダイゼーションは、伸長後に連結された配列決定鋳型の生成をもたらし得る。対照的に、鋳型は、両方がＸ’を含むか、又は両方がＸを含む２つの断片の間で調製されない。
いくつかの実施形態では、異なる二本鎖断片から調製された一本鎖断片は、架橋のために互いにハイブリダイズするのに十分に近接していてもよい。本質的に、第１及び第２の一本鎖断片の両方は、それらの５’末端で固体支持体の表面に係留され、したがって、各断片（ＨＹＢ又はＨＹＢ’を含む）の遊離３’末端は、相互作用するために互いに到達し得なければならない。２つの固定されている断片の３’末端が、それらが固体支持体の表面上で離れすぎて固定されているために互いに到達できない場合、ＨＹＢ／ＨＹＢ’架橋は、これらの２つの断片の間に形成され得ない。
したがって、２つの固定されている断片間の距離が、長い方の断片の長さよりも大きい場合、それらのＨＹＢ／ＨＹＢ’配列が重複し得ないので、これらの断片が相互作用することはない。いくつかの実施形態では、第１の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の、第２の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体へのハイブリダイゼーションは、第１及び第２の断片が、第１又は第２の断片の長い方の長さよりも近い固体支持体の表面上で互いに近接している場合にのみ起こる。
いくつかの実施形態では、第１の一本鎖断片中のＨＹＢに含まれる十分な数のヌクレオチドは、第２の一本鎖断片中のＨＹＢ’にハイブリダイズすることができなければならない。第１の一本鎖断片中のＨＹＢと第２の一本鎖断片中のＨＹＢ’との間のヌクレオチドが互いにハイブリダイズすることができない場合、これらの２つの断片は架橋を生成することができない。いくつかの実施形態では、第１の固定された断片及び第２の固定された断片は、固体支持体上に近接して固定されており、近接していることにより、第１の固定された断片に含まれるハイブリダイゼーション配列に含まれる４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上のヌクレオチドは、第２の固定された断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体に含まれるヌクレオチドに結合することが可能になる。
いくつかの実施形態では、第１の固定された断片及び第２の固定された断片は、固体支持体の表面上で互いに２０～５００ナノメートル以内に固定されている。いくつかの実施形態では、第１の固定された断片及び第２の固定された断片は、固体支持体の表面上で互いに２０～３００ナノメートル以内に固定されている。いくつかの実施形態では、５００ナノメートル以内である固定された一本鎖断片は少なく、１つの断片中のＨＹＢの他の断片中のＨＹＢ’への結合を介して互いに架橋することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸において隣接していた配列由来の２つの固定された断片は、異なる断片がそれらの間に固定されていることなく、固体支持体の表面上で隣接し得る。
いくつかの実施形態では、試料は、複数の異なる二本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、空間的に局在化された断片は、同じ二本鎖核酸から調製される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の固定された断片の両方は、同じ二本鎖核酸から調製され、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型は、同じ二本鎖核酸由来の２つのインサートを含む。
いくつかの実施形態では、２つのインサートは、同じ二本鎖核酸（図４１に示される架橋断片など）に含まれる２つの連続する配列に由来する。例えば、図４２は、それ自体と架橋するか、又はＢ若しくはＢ’配列を含む一本鎖断片と架橋するＡ若しくはＡ’インサートを含む一本鎖断片を示し、Ａ／Ａ’断片及びＢ／Ｂ’断片の両方は、同じ二本鎖核酸中の隣接配列から調製される。このような対形成は、１つの断片中のＸ配列の別の断片中のＸ’配列へのハイブリダイゼーションに基づく。伸長後、二本鎖の連結された配列決定鋳型を調製することができる。連結された配列決定鋳型の少なくともいくつかは、一方の末端におけるＰ５／Ｐ５’及び他方の末端におけるＰ７／Ｐ７’の存在に基づいて配列決定可能である（図４２において実線で輪郭を描いたボックスに示される）。生成され得る他の連結された配列決定鋳型は、それらが鋳型の両端に同じ相補的アダプター配列を有するため、一般的に配列決定可能ではない例えば、Ｐ５／Ｐ５’又はＰ７／Ｐ７’、図４２の破線ボックス中の鋳型に示される）。
配列決定鋳型が固体支持体から遊離され、配列決定される場合、一本鎖鋳型中のＡ及びＢインサート（並びに別の一本鎖鋳型中のＡ’及びＢ’インサート）の存在は、Ａ配列及びＢ配列が同じ二本鎖核酸において近接していることを示すために使用され得る。例えば、Ａ及びＢ配列は、同じ標的核酸中にあったと決定され得る。
図４３は、同一のトランスポソーム（すなわち、同じトランスポゾンを含む）を用いてランダムに生じる架橋タグメンテーション反応を示す。図４４に示されるように、得られた一本鎖断片は、Ｘ（上図）又はＸ’（下図）配列のみを含むため、得られた一本鎖断片は、互いにハイブリダイズ及び架橋することができない。Ｘを含むいくつかの一本鎖断片及びＸ’を含むいくつかの一本鎖断片の非存在下では、架橋は想定されず、二本鎖の連結された配列決定鋳型の生成を伴わない。
いくつかの実施形態では、固体支持体に適用される試料中の二本鎖核酸の濃度は、異なる二本鎖核酸ポリヌクレオチド由来の一本鎖断片が互いに架橋するのに十分に近接していることを一般に回避するのに十分に低い。このようにして、一緒に架橋する（かつ、二本鎖の連結された配列決定鋳型の調製を可能にする）ほとんどの断片は、同じ二本鎖核酸ポリヌクレオチドから調製された二本鎖断片由来であり、同じ試料中の別の二本鎖ポリヌクレオチド由来ではない。このようにして、無関係な二本鎖核酸由来の断片を含む連結された配列決定鋳型は、ユーザーが好む場合、固定されたトランスポソームを用いる方法を使用するときに一般に回避することができる。
いくつかの実施形態では、それらのＨＹＢ／ＨＹＢ’間に架橋を形成する第１の一本鎖断片及び第２の一本鎖断片に含まれる２つのインサートは、同じ核酸の非連続領域に由来する。いくつかの実施形態では、ＨＹＢ／ＨＹＢ’架橋を形成する第１の一本鎖断片及び第２の一本鎖断片中の２つのインサートは、同じ二本鎖核酸中に含まれる２つの近接配列に由来する。いくつかの実施形態では、近接配列は、二本鎖核酸において、１００以下のヌクレオチド、２００以下のヌクレオチド、３００以下のヌクレオチド、４００以下のヌクレオチド、５００以下のヌクレオチド、７００以下のヌクレオチド、又は１，０００以下のヌクレオチドによって分離される。近接配列間のそのような比較的短い距離は、これらの配列由来の一本鎖断片が互いに架橋して、連結された核酸配列決定鋳型を生成できる可能性を高める。
いくつかの実施形態では、固体支持体の領域は、同じ二本鎖核酸に含まれる近接配列由来の共通のインサート配列を共有する複数の二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を含む。図４５に示される例示的な核酸を使用して、断片Ａ～Ｅの空間的関係は、調製され得る連結された配列決定鋳型からの配列決定データを使用して解明され得る。図４５は、１次元図を使用して可能な対形成を示すが、これらの相互作用が２次元平面（Ｘ，Ｙ）上で起こることを理解しなければならない。更に、最初のトランスポソームに結合した核酸は、他のトランスポソームに結合する前に、曲がりくねった配置でそれ自体が複数回ねじれて戻ることができるため、断片を表面上に局在化させることができる。したがって、配列の最終的な対形成は、表面上の一本鎖断片のこの曲がりくねった配置に基づき得る。
いくつかの実施形態では、配列（図４５のＡ～Ｅなど）の近接性は、これらの配列を含むどの断片が架橋し、連結された配列決定鋳型を形成できたかを分析することによって解決することができる。
いくつかの実施形態では、固体支持体の表面上でより近い断片（タグメンテーションされた二本鎖核酸において近接していた断片から調製されたため）は、より離れた断片よりも高い頻度で互いに架橋する。したがって、所与の二本鎖核酸から生成された一本鎖断片の表面上の曲がりくねった配置に基づいて、隣接断片は一般に最も高い頻度で架橋して連結された配列決定鋳型を形成する（図３９に示されるように、連結された配列決定鋳型を生成しない、それらのインサート配列を含む同じインサートを用いて調製された一本鎖断片の再アニーリング、及び図４０に示されるように、一方の断片におけるハイブリダイゼーション配列決定を他方の断片におけるその相補体に架橋することによって同じインサートを用いて調製された一本鎖断片の再アニーリングを除く）。図４５に示されるように、断片化された二本鎖核酸中の２つの配列間の距離が増加するにつれて、固体支持体の表面上のインサートとしてこれらの配列を含む一本鎖断片間の距離も一般に増加する。したがって、２つの異なるインサート（又はそれらの相補体）を含む生成された連結された配列決定鋳型の頻度は、タグメンテーションされた二本鎖核酸における近接情報の分析を可能にする。
隣接配列は、より離れた配列と比較して、同じ連結された配列決定鋳型に含まれる頻度がより高いと推定され、この頻度は、断片間の距離が増加するにつれて減少する。その結果、タグメンテーションされた二本鎖核酸中の距離が大きすぎる任意の２つの配列は、架橋して連結された配列決定鋳型を形成することができない。したがって、配列決定データにおけるこれらの連結された配列決定鋳型の欠如は、所与のインサート対を含む一本鎖断片間に架橋を形成するには距離が遠すぎると解釈することができる。
図４５は、固定されたトランスポソームを用いて調製された架橋断片が、ＸのＸ’への結合に基づいて互いにハイブリダイズすることができる変性一本鎖断片もたらす方法について示す。一本鎖断片の架橋（続いて、連結された配列決定鋳型を生成し得る）は、タグメンテーションされた二本鎖核酸の配列に沿って「ウォーク」するために使用され得る。したがって、表面上に形成された連結された配列決定鋳型のプールのコンパイルされた配列決定データを使用して、タグメンテーションされた二本鎖核酸の表現を形成することができる。
同じ二本鎖断片（例えば、図４０のＡ及びＡ’を含むもの）から形成される一本鎖断片は、互いに架橋し、次いで、同じインサート配列の２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型を形成することができる。同じインサートの２つのコピーを含むそのような連結された配列決定鋳型は、本明細書に記載されるように、エラー訂正、一本鎖にのみ存在する変異の同定、及びメチル化分析のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、タグメンテーション事象後に残された核酸配列中のギャップは、伸長工程を使用して埋めることができる。一般に、伸長工程の後にライゲーション工程が続く。伸長及び／又はライゲーションは、適切な条件を使用して行われる。いくつかの実施形態では、使用される緩衝液は、伸長－ライゲーションミックス緩衝液（例えば、伸長－ライゲーションミックス緩衝液３、ＥＬＭ３）である。Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌ Ｅｘｏ－（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０３Ｓ）又はＴｔａｑ６０８などのポリメラーゼを、かかる伸長及び／又はライゲーション工程において使用できる。
Ｃ．固定されたトランスポソームを用いて調製された配列決定鋳型の代表的な構造
ユーザーは、フォーク型アダプターを含むトランスポゾンを設計して、目的の配列（例えば、アダプター、プライマー結合部位など）を組み込むことができる。これらの目的の配列は、例えば、使用を好む配列決定プラットフォーム、及びそのプラットフォーム上で鋳型を配列決定するための要件に基づいて、ユーザーによって選択され得る。
本明細書に記載される配列決定鋳型を調製するためのトランスポソームに含まれ得る代表的な第１及び第２のフォーク型アダプターを図４６Ａ及び図４６Ｂに示す。図４６Ａ～図４６Ｃはまた、そのようなトランスポソームを用いて生成され得る代表的な配列決定鋳型の構造を示す。
いくつかの実施形態では、固定されたトランスポソームを使用して調製される配列決定鋳型は、以下の構造を有する。
５’－Ｐ５－ｉ５－Ａ１４－ＭＥ－インサート１－ＭＥ’－ＨＹＢ－ＭＥ－インサート２－ＭＥ’－Ｂ１５’－ｉ７’－Ｐ７’－３’、
５’－Ｐ５－Ａ１４－ＭＥ－インサート１－ＭＥ’－ｉ６－ＨＹＢ－ｉ８’－ＭＥ－インサート２－ＭＥ’－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’、若しくは
５’－Ｐ５－ｉ５－Ａ１４－ＭＥ－インサート１－ＭＥ’－ｉ６－ＨＹＢ－ｉ８’－ＭＥ－インサート２－ＭＥ’－Ｂ１５’－ｉ７’－Ｐ７’－３’、又はこれらの相補体。
Ｄ．増幅
いくつかの実施形態では、方法は、生成された二本鎖配列決定鋳型を固体支持体の表面から遊離させた後、かつ配列決定の前に増幅することを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定鋳型は、米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の開示によって例示されるように、クラスター増幅法を使用して増幅され、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定されている核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。そのようなアレイ上の各クラスター又はコロニーは、複数の同一の固定化されたポリヌクレオチド鎖及び複数の同一の固定化された相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そのように形成されたアレイは、本明細書では一般に「クラスター化アレイ」と称される。米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号に記載されているような固相増幅反応の産物は、固定されているポリポリヌクレオチド鎖と固定されている相補鎖の対をアニーリングすることによって形成されるいわゆる「架橋（bridged）」構造体であり、両方の鎖は、いくつかの実施形態では、共有結合を介して、５’末端で固体支持体上に固定されている。クラスター増幅方法論は、固定化された核酸鋳型を使用して固定化されたアンプリコンを産生する方法の例である。他の好適な方法を使用して、本明細書で提供される方法に従って産生された配列決定鋳型から固定されたアンプリコンを産生することもできる。例えば、１つ以上のクラスター又はコロニーは、増幅プライマーの各対の一方又は両方のプライマーが固定化されているかどうかにかかわらず、固相ＰＣＲによって形成することができる。
他の実施形態では、配列決定鋳型は、溶液中で増幅される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸断片は、開裂されるか、又は別の方法で固体支持体から遊離され、次いで増幅プライマーは、溶液中で遊離分子にハイブリダイズされる。他の実施形態では、増幅プライマーを、１つ以上の初期の増幅工程のために核酸断片にハイブリダイズさせ、その後溶液中の後続の増幅工程を行う。したがって、いくつかの実施形態では、固定化された核酸鋳型を使用して、液相アンプリコンを産生することができる。
本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において一般に既知である増幅法論のいずれも、配列決定鋳型を増幅するために、ユニバーサル又は標的特異的プライマーとともに利用され得ることを理解されたい。増幅のための好適な方法には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，００３，３５４号に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されない。上記の増幅方法を使用して、関心対象の１つ以上の核酸を増幅することができる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して配列決定鋳型を増幅することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマーは、増幅反応に含まれる。
ＶＩＩＩ．区画内の溶液中でトランスポソームを使用して複数のインサートを含む配列決定鋳型を調製する方法
二本鎖核酸内の配列の近接データを評価する方法は、フォーク型アダプターを用いる方法について上述したような区画を使用して、区画を用いて行うこともできる。いくつかの実施形態では、区画は、ウェル、チューブ、又は液滴である。
いくつかの実施形態では、区画内のトランスポソームは、溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、トランスポソームは、区画内で配列決定鋳型を調製するときに固体支持体上に固定化されない。
いくつかの実施形態では、二本鎖断片は、一本鎖断片を調製する前に固定化されないため、区画中のトランスポソームを用いる方法は、一般に、２つの異なるインサートを含む連結された配列決定鋳型を調製する。これは、同じ二本鎖断片から調製された２つの一本鎖断片を固体支持体に近接して有する選択圧が、断片が固定化されず、代わりにタグメンテーションが溶液相中で起こる場合に失われるためである。
いくつかの実施形態では、トランスポソームの２つのプールを使用できる。いくつかの実施形態では、図３４に示される第１のトランスポソーム及び第２のトランスポソームを使用できる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法は、標的二本鎖核酸を含む試料を複数の異なる区画に区画化することと、二本鎖核酸をタグメンテーションして、複数の異なる区画内の二本鎖核酸由来のインサートを含むタグ付けされた二本鎖断片を生成することと、を含む。
いくつかの実施形態では、タグメンテーションは、トランスポソーム複合体の２つのプールを用いて行われる。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第１のプールは、（ａ）トランスポザーゼと、（ｂ）３’トランスポゾン末端配列、及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｃ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含む。いくつかの実施形態では、トランスポソーム複合体の第２のプールは、（ａ）トランスポザーゼと、（ｂ）３’トランスポゾン末端配列及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、（ｃ）３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む。いくつかの実施形態では、タグメンテーションにより、タグ付けされた二本鎖断片が調製される。いくつかの実施形態では、第１の一本鎖断片はインサートを含み、第２の断片は、第１の断片に含まれるインサートの相補体ではないインサートを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、タグ付けされた二本鎖断片を変性させて一本鎖断片を生成することと、第１の断片中のハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって、同じ区画内の２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせることと、各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、鋳型は、更なる処理の前に区画から遊離される。
いくつかの実施形態では、二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型は、同じ区画に存在する２つの一本鎖断片のハイブリダイゼーションからのみ生成される。言い換えれば、同じ区画内の一本鎖断片のみが一緒にハイブリダイズすることができ、異なる区画内の一本鎖断片は互いへの会合に利用できない。いくつかの実施形態では、区画化することは、ほとんどの区画が１つの標的二本鎖核酸を含むか又は標的二本鎖核酸を含まないように試料を希釈することを含む。このようにして、同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサート配列は、同じ標的核酸に含まれていた可能性が高い。
このようにして、ユーザーは、同じ連結された配列決定鋳型に含まれる２つの配列が同じ標的核酸に由来することを同定することができる。同じ標的核酸に由来する配列を同定するそのような能力は、所与の標的核酸を含む配列に役立ち得る。
いくつかの実施形態では、区画化は、異なるハプロタイプを異なる区画に分離し、方法は、ハプロタイプフェージングに使用される。言い換えれば、ユーザーは、同じ連結された配列決定鋳型に含まれる配列を評価し、これらの配列が同じハプロタイプに含まれることを決定することができる。いくつかの実施形態では、ハプロタイプフェージングは、バーコードを必要としない。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体は、ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合しており、変性させることは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを変性させてハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体をブロック解除することを含む。このようなブロッキングオリゴヌクレオチドは、フォーク型アダプターを用いる方法について上述されている。いくつかの実施形態では、１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドは、溶液中での第１のトランスポソームと第２のトランスポソームとの会合を阻害する。換言すれば、ハイブリダイゼーション配列及びその相補体の会合のタイミングは、一本鎖のタグ付けされた断片が調製された後にのみ起こるように制御され得る。
いくつかの実施形態では、変性させることは、温度の上昇、ｐＨの変化、及び／又は１つ以上のカオトロピック剤の添加によって行われる。いくつかの実施形態では、温度の上昇は、４５℃～５５℃から８５℃～９５℃への上昇であり、任意選択的に、温度の上昇は、５０℃から９０℃への上昇である。いくつかの実施形態では、１つ以上のカオトロピック剤は、ホルムアミド及び／又はＮａＯＨを含む。
いくつかの実施形態では、変性、ハイブリダイズ及び伸長の１回以上の更なる工程が実施される。言い換えれば、変性、ハイブリダイズ、及び伸長の工程は、他の一本鎖断片とハイブリダイズするために利用可能な一本鎖断片がなくなるまで繰り返され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、鋳型を増幅することを更に含む。
ＩＸ．連結された核酸配列鋳型を配列決定する方法
いくつかの実施形態では、方法は、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、タンデムリードは、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定することによって生成される。
いくつかの実施形態では、異なるインサートの配列は、連続的に生成される。いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定する方法は、第１のインサート配列を配列決定することと、第２のインサート配列を配列決定することとを含む。
いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定する方法は、第１のリードプライマー結合配列に相補的な第１のリード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、ポリヌクレオチドの第１のインサート配列を配列決定することと、第２のリードプライマー結合配列に相補的な第２のリード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第２のインサート配列を配列決定することと、を含む。例示的な方法は図２に示しており、ここでは、「リード１」配列決定プライマーを使用して、第１のインサート配列（ポリヌクレオチド中のＰ５’配列とＨＹＢ配列との間に位置する）を配列決定し、「リード２」配列決定プライマーを使用して、第２のインサート配列（ポリヌクレオチド中のＨＹＢ’配列とＰ７’配列との間に位置する）を配列決定する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のインサート配列は、別々のライブラリー（図３に示される「ライブラリーＡ」及び「ライブラリーＢ」）から生成され得る。
いくつかの実施形態では、連結された核酸配列決定鋳型を配列決定する方法は、第２のインサート配列の相補体を配列決定し、次いで第１のインサート配列の相補体を配列決定することを含む。
いくつかの実施形態では、連結された核酸を配列決定する方法は、第１の相補リードプライマー結合配列に相補的な第１の相補リード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第２のインサート配列の相補体を配列決定することと、第２の相補リードプライマー結合配列に相補的な第２の相補リード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第１のインサート配列の相補体を配列決定することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド由来の３つ以上のインサート配列又はインサート配列の３つ以上の相補体を配列決定することができる。
本明細書に記載される複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドは、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器及び関連技術を使用し得る放出されたプロトンの検出に基づく配列決定、ナノ細孔配列決定などを含む、直接配列決定又は次世代配列決定などの、任意の好適な配列決定方法論に従って配列決定され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、フローセルなどの固体支持体上で配列決定される。本開示の複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドでの使用に容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体システム、及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される方法は、使用される任意の特定の種類のシーケンシング計装系に限定されない。
Ｘ．複数のインサートを含む配列決定鋳型の使用方法
いくつかの実施形態では、複数のインサートを含む配列決定鋳型を使用して、二本鎖核酸由来の２つ以上のインサートの配列を決定する。
いくつかの実施形態では、２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型を使用して、二本鎖核酸由来のインサートの配列の複数のコピーを生成する。そのような鋳型に含まれるインサート由来の各配列は同じ配列を有すると予想されるが、様々な異なるアーチファクトが不正確な配列をもたらし得ることが周知である。例えば、増幅中に配列決定鋳型から生成されるアンプリコンに導入されるエラーは、インサートを調製するために使用される二本鎖核酸における差異に関連しない配列における不一致を引き起こし得る。
Ａ．配列決定
いくつかの実施形態では、方法は、固体支持体から生成された二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を遊離させることと、鋳型を配列決定して、鋳型に含まれるインサート配列を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、遊離は、酵素消化又は化学的開裂を含む。固体支持体の表面から配列決定鋳型を遊離させるこのような手段は、当該技術分野で周知である。
米国特許第７，９８５，５６５号及び同第７，１１５，４００号の組み込まれている材料は、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体上に固定化することを可能にする固相核酸増幅の方法を記載する。
本開示の方法によって生成されるアンプリコンでの使用に容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体システム、及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、配列決定は、増幅後に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、配列決定前に行われない。多数の異なる配列決定法が当業者に既知であり、例えば、米国特許第９，６８３，２３０号及び同第１０，９２０，２１９号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、シーケンシング断片を、フローセルに付着させる。いくつかの実施形態では、シーケンシング断片を、フローセル又は表面にグラフトされた相補的プライマーにハイブリダイズさせる。いくつかの実施形態では、シーケンシング断片の配列は、アレイシーケンシング法又は合成しながらのシーケンシングなどの次世代シーケンシング法によって検出される。
Ｐ５及びＰ７プライマーは、様々なＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上でシーケンシングするためにＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．が販売している市販のフローセルの表面に使用される。このようなプライマー配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５（Ａ１）号に記載されている。Ｐ５及びＰ７プライマーを例示するが、本明細書に提示される例では、任意の好適な増幅プライマーを使用できることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、配列決定のために使用される配列決定プライマーは、配列決定鋳型に含まれる１つ以上の固有のプライマー結合配列に完全に又は部分的に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、配列決定プライマーは、少なくともＡ２配列（配列番号４０）、少なくともＡ１４配列（配列番号４）、若しくは少なくともＢ１５配列（配列番号５）、又はそれらの相補体を含む。
いくつかの実施形態では、配列決定は、Ａ１４、Ｂ１５、及び／又はハイブリダイゼーション配列（ＨＹＢ）に結合する配列決定プライマーを使用して行われる。図４７は、本明細書に記載される鋳型を配列決定するために使用され得るプライマーのいくつかの代表的な組み合わせを提示する。
本明細書に記載の特定の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並行して提供することである。したがって、本開示は、当該技術分野において既知の技術を使用して核酸を調製及び検出することができる統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬及び／又は配列決定試薬を１つ以上の核酸断片に送達することができる流体成分を含むことができ、システムは、ポンプ、弁、リザーバ、流体ラインなどの構成要素を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成及び／又は使用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８（Ａ１）号及び米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載され、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように、統合システムの流体構成要素の１つ以上を増幅方法及び検出方法に使用することができる。核酸配列決定の実施形態を一例として取ると、統合システムの流体構成要素の１つ以上を、本明細書に記載の増幅方法、及び上記に例示したような配列決定方法における配列決定試薬の送達に使用することができる。代替的に、統合システムは、増幅方法を実施し、検出方法を実施するための別々の流体システムを含み得る。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することができる統合配列決定システムの例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｂ．配列決定における暗サイクル
いくつかの実施形態では、カスタム配列決定レシピは、特定の配列の記録をスキップするために使用される暗サイクル（暗領域としても知られる）を含むように調製することができる。本明細書中で使用される場合、「暗サイクル」とは、特定の配列の配列決定化学が行われるが、この配列決定がシーケンサーによって画像化されない方法をいう。国際公開第２０１２０５５９２９号及び同第２０１０１２７３０４号は、暗サイクルについて記載しており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。暗サイクルを使用して、配列決定結果を全体的に悪化させ得る、ＭＥ配列のライブラリーなどの低多様性配列を繰り返し配列決定することに関するフェージング／プレフェージング問題を軽減することができる。暗サイクルの後、配列決定鋳型に含まれるインサート配列が記録されるように、配列の画像化が再開される。
カスタム配列決定プロトコールは、スキップされる配列の長さに及ぶ適切な数の暗サイクルを含み得る。言い換えれば、暗サイクルの数は、スキップが意図される塩基の数に基づき得る。例えば、スキップされる配列が１９塩基長のＭＥ配列である場合、１９回の暗サイクルが使用される。いくつかの実施形態では、スキップされる配列は、ＭＥ配列又はその相補体である。１９ヌクレオチド長のＭＥを有する実施形態では、暗サイクルの数は１９である。異なる数のヌクレオチドを有するＭＥでは、暗サイクルは一般的にヌクレオチドの数である。いくつかの実施形態では、ユーザーは、ＭＥ全体をスキップすることができる。いくつかの実施形態では、ユーザーは、ＭＥドメイン及びその配列部分の大部分をスキップして、配列決定されるＭＥに含まれるヌクレオチドを無視することができる。
いくつかの実施形態では、配列決定法は、データが配列決定法の一部について記録されていない暗サイクルを含む。いくつかの実施形態では、記録されていないデータは、３’トランスポゾン末端配列に関連する配列データである。いくつかの実施形態では、記録されていない配列データは、ＭＥ配列である。いくつかの実施形態では、暗サイクルは１９サイクルを含む。
いくつかの実施形態では、配列決定は、データが配列決定の一部について記録されていない暗サイクルを含む。いくつかの実施形態では、記録されていないデータは、トランスポゾン末端配列又はその相補体（ＭＥ又はＭＥ’）に関連する配列データである。
配列決定プライマー配列（すなわち、プライマー結合部位）への配列決定プライマーの結合の例を、図４７の代表的なポリヌクレオチドの上の矢印で示す。配列決定プライマーがＡ１４、Ｂ１５’、又はＸ配列に結合した後、暗サイクルを使用して、ＭＥ配列の一部又は全部の配列決定を回避することができる。
いくつかの実施形態では、配列決定法は、暗サイクルを含まない。これらの実施形態では、カスタムプライマーを使用して暗サイクルの必要性を排除する。いくつかの実施形態では、カスタムプライマーは、ＭＥと整列する配列を含む架橋プライマーであってもよく、ＭＥ配列は画像化されない。
Ｃ．二本鎖核酸の一本鎖に存在する変異のエラー訂正又は同定
いくつかの実施形態では、同じインサートの２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型は、エラー訂正、及び一本鎖にのみ存在する変異の同定のために使用され得る。これは、本質的に、単一の連結された配列決定鋳型の読み取りが、タグメンテーションされた二本鎖核酸の両方の鎖を読み取ることと等価であるためである。したがって、連結された配列決定鋳型の調製及び配列決定は、シーケンシング深度を増加させることができる。シーケンシング深度の増加は、例えば、固形腫瘍患者に存在する稀な体細胞変異を発見して、変異を同定する機会を高めるために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される連結された配列決定鋳型の配列決定の結果は、エラー訂正を可能にする。このようなエラーは、増幅又は配列決定自体の間に導入されたランダムエラーを補正することを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される連結された配列決定鋳型の配列決定の結果は、二本鎖核酸の一方の鎖にのみ存在する変異又は他の塩基対の差異の同定を可能にする。
同じインサートの２つのコピーを含むそのような連結された配列決定鋳型を調製する異なる手段、例えば、フォーク型アダプターのライゲーションを使用して（図２９に示される）、又はフォーク型アダプターを含むトランスポソームによるタグメンテーションを使用して（図４０に示される）調製された一本鎖断片の架橋後の伸長が、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型における配列の２つのコピー間の差異は、エラー（例えば、配列決定又は増幅によって導入されるミス）に起因する。
いくつかの実施形態では、方法は、異なる鋳型から調製された所与のインサートの複数の配列の配列決定結果を評価することと、このインサートに関する配列決定結果におけるエラーを補正することとを含む。いくつかの実施形態では、エラーを補正することは、同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサート及びその相補体並びに／又は複数の連結された配列決定鋳型に含まれるインサート由来の配列決定データに基づく。
いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型における配列の２つのコピー間の差異は、タグメンテーションされた二本鎖核酸の一本鎖にのみ存在した変異に起因する。一方の鎖のみに存在するそのような変異は、「非標準塩基対形成」と呼ばれる場合があり、核酸塩基損傷又は変異による場合がある。このような非標準塩基対形成は、一般に、評価することが困難であり得、本発明の方法は、このような塩基対形成の同定を改善し得る。
いくつかの実施形態では、方法は、異なる鋳型から調製された所与のインサートの複数の配列の配列決定結果を評価することを含む。いくつかの実施形態では、非標準塩基対形成の事象を決定することは、同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサート；及びその相補体並びに／又は複数の連結された配列決定鋳型に含まれるインサート由来の配列決定データに基づく。
Ｄ．近接性又は連続性情報の決定
いくつかの実施形態では、方法は、同じ鋳型に含まれるインサートの配列を評価することと、同じ鋳型に含まれるインサートに基づいて、二本鎖核酸に含まれる配列についての近接データを決定することとを含む。
図４５に示されるように、本発明の方法は、二本鎖核酸から調製された二本鎖断片を変性させることによって生成される一本鎖断片由来の連結された配列決定鋳型の架橋及び生成とともに、二本鎖核酸（例えば、図４５に示されるもの）に沿って「ウォーク」するために使用できる。上述したように、所与のインサート対を含む連結された配列決定鋳型の数及び頻度を使用して、二本鎖核酸についての連続性データを決定することができる。
ＸＩ．連結された配列決定鋳型を使用するメチル化分析の方法
いくつかの実施形態では、インサート配列及び同じインサートのコピーを含む連結された配列決定鋳型をメチル化分析に使用できる。これらの配列は、インサート配列の「２つのコピー」を有する連結配列として上述され得るが、インサート配列のコピーは、それらを促進する条件の非存在下では、修飾ヌクレオチド（例えば、修飾シトシン）を含まない。この態様は図４８に示されており、ここでは、Ｓ及びＳ’インサート配列はメチル化シトシン及びヒドロキシメチル化シトシンを含むが、Ｓ－コピー及びＳ’－コピーは含まない。したがって、Ｓ及びＳ－コピーの配列は同じであり、Ｓ’及びＳ’－コピーは同じであるが、Ｓ及びＳ－コピーのメチル化状態は異なり得、Ｓ’及びＳ’－コピーのメチル化状態は異なり得る。
本明細書で使用される場合、「メチル化分析」とは、標的核酸由来の所定のインサート中のシトシンがメチル化又はヒドロキシメチル化されているかどうかを評価することをいう。本明細書で使用される場合、「修飾シトシン」は、メチル化又はヒドロキシメチル化シトシンを指し、「非修飾シトシン」は、メチル化されていないシトシンを指す。いくつかの実施形態では、メチル化シトシンは５－メチルシトシン（５ｍＣ）であり、ヒドロキシメチル化シトシンは５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈＭＣ）である。
メチル化分析を実施する手段は、当該技術分野で一般的に既知であるが、これらの方法は、試料の２つの異なるアリコート（一方のアリコートは、修飾シトシン又は非修飾シトシンを改変するための薬剤で処理され、他方のアリコートは未処理である）の比較に依存し得る。次いで、メチル化分析のための標準的な配列決定分析が、多くの場合、処理されたアリコートと未処理のアリコートとの間のミスマッチを評価すること、及び／又は標的核酸由来の相補配列の配列結果における差異を評価することによって、修飾シトシンを同定するために行われ得る。
代わりに、本発明の方法は、試料の２つの別個のアリコートを必要とせずに、標的核酸を含む試料から調製された二本鎖の連結された配列決定鋳型を使用する。更に、本発明の方法は、一本鎖の連結された配列決定鋳型中に一緒に連結されたインサート配列及びインサート配列のコピーを有し、これらの２つの配列間の差異をメチル化分析に使用できる。これらの連結された配列の分析は、連結されていない配列の分析よりも簡単であり、単一の試料のみを必要とする。
いくつかの実施形態では、二本鎖の連結された配列決定鋳型の２つの相補鎖は、増幅され（例えば、クラスター増幅を用いて）、フローセル上で配列決定され、これにより、本明細書に記載されるように、修飾及び非修飾シトシンを同定するための塩基コード分析を可能にする。いくつかの実施形態では、ウラシルはＳＢＳ配列決定に使用されるポリメラーゼを停止させるため、増幅は、配列決定鋳型に組み込まれるウラシルをチミンで置換する。いくつかの実施形態では、増幅中のウラシルのチミンによる置換は、クラスター増幅ミックス中のｄＴＴＰの存在（及びクラスター増幅ミックス中のｄＵＰＴの非存在）に基づく。
本出願は、図４８～図６２Ｃに示されるように、当業者がそのような分析を行うために選択し得る、多種多様な異なる方法を開示する。特定の方法の選択は、ユーザーがシトシンを変換したいのか、メチル化シトシンを変換したいのかに依存する。また、ユーザーは、メチル化シトシン、ヒドロキシメチル化シトシン、及び非修飾シトシンを互いに区別する方法を選択してもよく、又はユーザーは、修飾シトシンのみを非修飾シトシンから区別することを選択してもよい。
いくつかの実施形態では、シトシン又は修飾シトシンのウラシル又はジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ）への変換後、ＰＣＲ反応は、ウラシル又はＤＨＵをチミンに変換する。このようにして、相補的配列中のＴ／Ｇミスマッチ（標準的なＣ／Ｇマッチの代わりに）は、以下に議論されるように、シトシン又は修飾シトシンのいずれかを含む位置として評価され得る。
いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型に含まれるインサート配列に含まれる修飾シトシンを同定する方法は、二本鎖の連結された配列決定鋳型を調製することであって、各鎖はインサート配列及びインサート配列のコピーを含み、２つの鎖は互いに相補的である、ことと、修飾シトシン及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を供することとを含む。種々のアプローチが本明細書中に記載されるが、当業者は、修飾シトシン又は非修飾シトシンのいずれかを改変するための任意の方法を選択し得る。いくつかの実施形態では、修飾シトシン又は非修飾シトシンのいずれかを改変することは、いくつかの代表的な方法について本明細書に記載されるように、ユーザーが標的核酸中の修飾シトシン又は非修飾シトシンの位置を同定することを可能にする。
各鎖がインサート配列及びインサート配列のコピーを含み、２つの鎖が互いに相補的である、本発明の方法に使用できる例示的な二本鎖の連結された配列決定鋳型を図４８に示す（一方の鎖にＳインサート及びＳ－コピーを含み、他方の鎖にＳ’インサート及びＳ’－コピーを含む）。
いくつかの実施形態では、方法は、各一本鎖の連結された配列決定鋳型のアンプリコン及び配列決定アンプリコンを調製することと、各鎖から生成されたアンプリコン中のインサート配列及びインサート配列のコピーに関する配列決定結果を評価することとを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖の連結された配列決定鋳型の各鎖の配列に基づいて、インサート配列に含まれる修飾シトシンの位置を決定することを含む。
本明細書に示される図では、一方の鎖を「上鎖」と称し、他方を「下鎖」と称して、これらが二本鎖の連結された配列決定鋳型に一緒に含まれる相補的一本鎖鋳型であることを示し得る。
いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型は、本明細書に記載の方法によって調製される。あるいは、ＣＯＤＥＣ法（２０２１年６月１２日投稿のＢａｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ，１０．１１０１／２０２１．０６．１１．４４８１１０に記載）に記載されているような、連結された配列決定鋳型を調製する他の方法を使用してもよく、その後、本明細書に記載されているメチル化分析を行う。
いくつかの実施形態では、二本鎖の連結された配列決定鋳型を生成するための伸長は、図５３に示されるように、メチル化ｄＣＴＰを含む反応溶液を用いて行われる。いくつかの実施形態では、メチル化ｄＣＴＰを含む反応溶液を用いて伸長を実施して、インサート配列のコピー中のメチル化シトシンの保存を可能にする（例えば、図５３のＳ’－コピー及びＳ－コピーに示される）。メチル化ｄＣＴＰによるこの伸長は、図５５Ａ～図５５Ｃに示されるＰＣＲ及び分析を用いて、非修飾シトシンのみを変換する方法で対にすることができる（図５４）。メチル化ｄＣＴＰによるこの伸長はまた、図５７Ａ～５７Ｃに示されるＰＣＲ及び分析を用いて、修飾シトシンのみを変換する方法で対にすることができる（図５６）。ＵからＴへのこのＰＣＲ変換は、標準的な手段による配列決定を可能にする。
いくつかの実施形態では、連結された配列決定鋳型に含まれるウラシルは、アンプリコンを調製するときにチミンに変換される。この態様は、例えば、図５０Ａ及び５０Ｂに示されており、ここでは、ＰＣＲによって調製されたアンプリコンはＴを置換しているが、ＰＣＲ前の鋳型はＵを含んでいた。
いくつかの実施形態では、修飾シトシンは、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）によって改変される。ＴＡＰＳを含む方法が図５１に示されており、ここでは、メチル化シトシン（ｍＣ）及びヒドロキシメチル化シトシン（ｈｍＣ）がジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ）に変換される。ＤＨＵは、図５２Ａ及び５２Ｂに示されるように、ＰＣＲ増幅中にＴによって置換され、それぞれ、インサート（すなわち、「オリジナル」）及びそのコピーにおける（Ｔ，Ｃ）をメチル化シトシンを有する位置として、及び（Ｃ，Ｃ）を非修飾シトシンを有する位置としてコールすることを可能にする。これらの（Ｔ，Ｃ）及び（Ｃ，Ｃ）は全て、図５２Ｃに示されるように、相補鎖の配列中のＧと対になる。
いくつかの実施形態では、非修飾シトシンは、化学反応又は酵素反応によって改変される。言い換えれば、修飾シトシンは影響を受けないままであり得るが、非修飾シトシンは改変され得る。いくつかの実施形態では、化学反応は亜硫酸水素ナトリウムによる処理である。いくつかの実施形態では、酵素反応は、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、Ｔ４－ＢＧＴ、及びＡＰＯＢＥＣ３Ａでの処理を含む（例えば、Ｖａｉｓｖｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．３１（７）：１２８０－１２８９（２０２１）に記載されているように、ＥＭ－ｓｅｑとして知られている方法を使用）。そのような方法は図４９に示され、ここでは未修飾シトシンはウラシルに変換される。ウラシルは、ＰＣＲ増幅中にチミンによって置換され（図５０Ａ及び５０Ｂに示される）、それぞれ、インサート（すなわち、「オリジナル」）及びそのコピー中の（Ｃ，Ｔ）を修飾シトシンを有する位置として、及び（Ｔ，Ｔ）を非修飾シトシンを有する位置としてコールすることを可能にする。相補鎖において、これらの（Ｃ，Ｔ）及び（Ｔ，Ｔ）は全て、図５０Ｃに示されるように、Ｇと対になる。このようにして、標的核酸中で元々Ｃであったインサートの配列中のＴの位置を、標的核酸中で元々Ｔであった位置から区別することができる（標的核酸中に生じたＴが相補鎖中のＡと対になるため）。修飾されたＣは、処理によって改変されなかったため、Ｃとして保持される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ヒドロキシメチル化シトシンからメチル化シトシンの位置を区別する。いくつかの実施形態では、追加の反応工程は、ヒドロキシメチル化シトシンからメチル化シトシンを区別する反応を可能にする。
ヒドロキシメチル化シトシンからメチル化シトシンの位置を区別するためのいくつかの実施形態では、修飾及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を供することは、（ａ）各鎖を、β－グリコシルトランスフェラーゼと反応させることと、（ｂ）各鎖を、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）と反応させることと、（ｃ）各鎖を、非修飾シトシンをウラシルに変換する条件で反応させることと、を含む。かかる方法を図５８及び図５９に示す。この方法の配列決定データの分析を図６０Ａ～図６０Ｃに示す。図６０Ｃに示されるように、この方法を使用して、元の標的核酸由来のシトシンは、配列決定データにおいて（Ｔ，Ｔ）として存在し、メチル化シトシンは（Ｃ，Ｃ）として存在し、ヒドロキシメチル化シトシンは（Ｃ，Ｔ）として存在し、これらの全ては、相補鎖においてＧと対形成される。
ヒドロキシメチル化シトシンからメチル化シトシンの位置を区別するためのいくつかの実施形態では、修飾シトシン及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を供することは、（１）各鎖を、ＤＮＭＴと反応させることと、（２）各鎖を、メチル化シトシンをジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ、例えばＴＡＰＳを使用）に変換する条件で反応させることとを含む。かかる方法を図６１に示す。この方法の配列決定データの分析を図６２Ａ～図６２Ｃに示す。図６２Ｃに示されるように、この方法を使用して、元の標的核酸由来の非修飾シトシンは、配列決定データにおいて（Ｃ，Ｃ）として存在し、メチル化シトシンは（Ｔ，Ｔ）として存在し、ヒドロキシメチル化シトシンは（Ｔ，Ｃ）として存在し、これらの全ては、相補鎖においてＧと対形成される。
Ａ．非修飾ＣのＵへの変換を含む方法
いくつかの実施形態では、メチル化分析は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈＭＣ）を未変化のままにしながら、非メチル化シトシンのウラシルへの変換を用いて行われる。例示的な方法は、バイサルファイトシークエンシングである。亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡのＰＣＲ増幅はウラシルをチミンとして読み取るため、各シトシンの修飾を単一塩基の解像度で推測でき、ＣからＴへの移行が非メチル化シトシンの位置を提供する。
Ｂ．修飾ＣのＵへの変換を含む方法
いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩を含まない方法を、メチル化分析に使用する。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ支援Ｐｉｃ－ボラン配列決定（ＴＡＰＳ）は、修飾シトシンを、一般的なポリメラーゼによってＴとして「読み取る」ことができる、ほぼ天然塩基であるジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ）に変換する。いくつかの実施形態では、ＴＡＰＳは、非修飾シトシンに影響を及ぼすことなく、シトシン修飾を直接検出する。いくつかの実施形態では、ＴＡＰＳを使用して５ｍＣ及び５ｈＭＣを検出することができる。ＴＡＰＳで処理されたＤＮＡのＰＣＲ増幅はＤＨＵをチミンとして読み取るため、各シトシンの修飾を単一塩基の解像度で推測でき、ＣからＴへの移行が修飾シトシンの位置を提供する。
Ｃ．β－グルコシルトランスフェラーゼによる処理を含む方法
いくつかの実施形態では、β－グルコシルトランスフェラーゼは、ヒドロキシメチルシトシン（ｈＭＣ）をグルコシル化メチルシトシン（ｇｍＣ）に選択的に変換する方法において使用される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシメチル化シトシンは、メチル化シトシン及びヒドロキシメチル化シトシンを改変させる後の反応から「保護」される。かかる方法を図５８に示す。
Ｄ．ＤＮＭＴによる治療を含む方法
いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）が使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＭＴ１などのＤＮＭＴは、ヘミメチル化ｍＣｐＧ／ＧｐＣモチーフを認識し、非メチル化Ｃをメチル化してｍＣｐＧ／ＧｐＭＣを形成する。ＤＮＭＴ１は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ ５（２０１５）７４１－７４７に記載されているように、ヘミヒドロキシメチル化ＣｐＧ配列に対して活性を有さない。したがって、ＤＮＭＴによる処理は、図５８～図６２Ｃに示されるように、メチル化シトシンをヒドロキシメチル化シトシンから区別する方法において使用できる。
実施例
実施例１．ビーズに連結したトランスポソームを介したポリヌクレオチドの調製の概要
複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを、ビーズに連結したトランスポソーム（ＢＬＴ）に基づく方法によって生成することができる。図５Ａ～図５Ｃは、Ｎｅｘｔｅｒａ ＦｌｅｘワークフローなどのＢＬＴによるタグメンテーションを使用してインサート配列を含む断片を生成する一般的な方法を示す。しかしながら、図５Ｃに示されるように、標準的なＮｅｘｔｅｒａ配列決定可能断片は、１つ以上の標的核酸由来の単一のインサート配列を含む。対照的に、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、複数のインサート配列を含む。
２つのインサート配列を含む例示的なポリヌクレオチドは、図６Ａ～図６Ｅに示されるように、タグメンテーションと、それに続く異なるタイプの産物を含む２つのライブラリーを生成するためのＰＣＲ反応によって生成することができ、一方のライブラリーは、ライブラリー産物がＰ５－Ａ１４／Ｈｙｂ－Ｂ１５－ＭＥ配列を含み、一方のライブラリーは、ライブラリー産物がＰ７－Ｂ１５／Ｈｙｂ’－Ａ１４－ＭＥ配列を含む。
複数のインサート配列を含む得られたポリヌクレオチドを使用して、配列決定できる連結された核酸配列決定鋳型のライブラリーである「タンデムリードライブラリー」を生成することができる。図４Ａ～図４Ｂは、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドライブラリー（図４Ａ）と、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを用いる本発明の方法（図４Ｂ）との間の差異を強調する。図４Ｂに示されるように、リード１－Ａ配列決定プライマー（第１のリードプライマー）は、このハイブリッドＤＮＡライブラリー（すなわち、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチド）の第１のインサートのフォワードリードを配列決定する。１５０サイクルのＳＢＳ配列決定後、ＳＢＳ合成鎖を変性して、次いで、リード１－Ｂ配列決定プライマー（第２のリードプライマー）をハイブリダイズでき、第２のインサートのフォワードリード。次いで、ペアエンドターンアラウンドを実施して、リード２－Ａ配列決定プライマー（第３のリードプライマー）を有する第２のインサートのリバース鎖、続いてリード２－Ｂ配列決定プライマー（第４のリードプライマー）を有する第１のインサートのリバース鎖についてそれぞれ１５０サイクルを同様に実施することができる。
複数のインサート配列を有するポリヌクレオチドを調製するワークフローは、十分に確立されたビーズに連結したトランスポソームライブラリー調製手法（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ ｆｌｅｘ）又はアダプターベースの方法（例えば、Ｔｒｕｓｅｑ）を活用する。
実施例２．タグメンテーション及びそれに続くＰ５／Ｐ７及びハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの相補体配列の付加によるポリヌクレオチドの調製
例示的な方法では、Ａ１４及びＢ１５配列を含むライブラリー産物を、タグメンテーション反応中にＡ１４及びＢ１５配列を付加するためのタグメンテーションによって生成した（図６Ａ）。これに続いて、図６Ｂ～６Ｃに示されるように、ＰＣＲによってＰ５／ＨＹＢ配列（チューブ１中）及びＰ７／ＨＹＢ’（チューブ２中）を添加した。
精製後、ライブラリーを混合する。次いで、ＨＹＢとＨＹＢ’との間で生成されるハイブリダイズした付加物に基づいて、伸長された産物が調製され得る。図６Ｄにおいてボックスで囲まれた産物のみがＨＹＢ又はＨＹＢ’配列を含み、ＨＹＢ／ＨＹＢ’ハイブリダイゼーションに基づいて別のライブラリー産物とハイブリダイズした付加物を形成することができ、その後、伸長を使用して、連結された核酸配列決定鋳型を生成することができる。伸長産物の少なくとも１／９ は、クラスターを形成することができる配列決定可能な産物である（すなわち、ＨＹＢ’［Ｈ’］及びＰ５を含む１つの鎖並びにＰ７及びＨＹＢ［Ｈ］を含む１つの鎖を含む連結された核酸配列決定鋳型、図６Ｅ）。
実施例３．タグメンテーション及びそれに続くハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの相補体配列の付加によるポリヌクレオチドの調製
例示的な方法では、インサート、アダプター、及びハイブリダイゼーション配列を含むライブラリー産物を、ＢＬＴによるタグメンテーション、続いてＨＹＢ及びＨＹＢ’の付加によって生成した。この例示的な方法において、１つのチューブは、ビーズベースのタグメンテーションを使用してＰ５－ＨＹＢ’フォーク型ライブラリーを形成し、別のチューブは、溶液ベースのタグメンテーションを使用してＰ７－ＨＹＢフォーク型ライブラリーを形成した。ＨＹＢ及びＨＹＢ’を、タグメンテーション後のライブラリー産物に添加した。
最初に、１０μＬのＢＬＴ（１０ｆｍｏｌｅ）を用いてＰ５／ＨＹＢ’ライブラリーを作製し、２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄した。次に、１７６μＬの作業緩衝液を１μＬの一本鎖結合タンパク質と混合した。洗浄緩衝液をビーズから除去し、４４μＬの作業緩衝液＋ＳＳＢミックスを添加した。溶液を室温で１分間インキュベートした。次いで、合計６μＬの１０×タグメンテーション緩衝液をビーズに添加し、タグメンテーションを３７℃で１０分間進行させた。次に、１２μＬの５％ＳＤＳを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした後、２００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。
ハイブリダイゼーション配列を付加するために、断片を６０℃で５分間インキュベートしてＭＥ’配列を変性させた。２００μＬの洗浄緩衝液で素早く洗浄した後、ビーズを８０μＬの２μＭ ＭＥ’－ＨＹＢ’中に再懸濁し、Ａｎｎｅａｌｒｔプログラムを６０℃から開始して２０℃まで下げて行った（１サイクルあたり１℃）。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、８０μＬのＥＬＭ３に再懸濁した後、室温で３０分間回転させた。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液中４℃で保存した。
これとは別に、Ｐ７－Ｂ８－ＭＥ／ＭＥ’を含むオリゴヌクレオチド（オリゴ）二本鎖を用いてＰ７／ＨＹＢライブラリーを作製した。オリゴヌクレオチド二本鎖はオリゴ１及びオリゴ２を含んでいた。表２は、オリゴヌクレオチド二本鎖を生成するための反応溶液の成分を記載する。
オリゴ１：（２０Ｐ７－Ｂ８－ＭＥ）５’－ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＡＣ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＴＡ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＧ－３’（配列番号９）
オリゴ２：（ＭＥ’）５’－／Ｐｈｏｓ／ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＡＴＣ Ｔ－３’（配列番号３）
Figure 2023547366000012
オリゴヌクレオチド二本鎖溶液を調製した後、表３のプロトコールを使用してＡｎｎｅａｌｒｔレシピをＰＣＲで実施した。二本鎖を長期保存のために－２０℃で保存し、複数回の凍結融解サイクルを回避した。
Figure 2023547366000013
酵素複合体を表４に概説するように構築し、３７℃で一晩インキュベートし、次いで２０℃で保存した。
Figure 2023547366000014
酵素複合体を標準保存緩衝液で１／５に希釈して４００ｎＭとした。タグメンテーション反応物を表５に基づいて調製し、タグメンテーションを５５℃で５分間進行させた。
Figure 2023547366000015
ｚｙｍｏ－ｋｉｔを用いてカラム精製を行い、２０μＬの再懸濁緩衝液（ＲＳＢ）中に溶出した。次いで、合計１８μＬのタグメンテーションライブラリー＋２μＬの１００μＭ ＨＹＢ－ＭＥ’オリゴ（最終濃度１０μＭ）を７５℃のインキュベーションで５分間インキュベートし、続いて２０℃までゆっくりと低下させて、オリゴ３及びオリゴ４を使用してＭＥ’オリゴをＨＹＢ－ＭＥ’で置換した。
オリゴ３：（ｐ－１８ＭＥ’ＨＹＢ’）／５Ｐｈｏｓ／ＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴ（配列番号１０）
オリゴ４：（ｐ－１８ＭＥ’ＨＹＢ）／５Ｐｈｏｓ／ＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧ（配列番号１１）
合計１８０μＬのＥＬＭ３を添加し、溶液を室温で３０分間回転させた。ＳＰＲＩビーズ洗浄を行った。
この段階で、Ｐ５ライブラリーはビーズ上にあり、Ｐ７ライブラリーは溶液中にあった。両方のライブラリーを混合し、Ａｎｎｅａｌｒｔプログラムを開始して４０℃から２０℃に下げ、続いてビーズを洗浄し、１００μＬのＡＭＳ１伸長緩衝液（Ｂｓｔポリメラーゼなどの鎖置換ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含む）に再懸濁した。再懸濁した溶液をＮａＯＨで洗浄し、ライブラリーをビーズ表面から増幅した。本実施例では、Ｐ５／Ａ１４及びＰ７／Ｂ１５プライマーを用いてＰＣＲを行った。Ａｍｐｕｒｅビーズ洗浄を実施して、未結合アダプターを除去した。
Ｑｕｂｉｔ濃度は０．８４９μＬ／ｍＬと測定され、これは約２ｎＭである。５ｐＭの一本鎖ライブラリーを、ＦＣ＃ＣＤ７９Ｋを播種したｍｉｓｅｑフローセル上で作製した。クラスターは、かすかで５ｐＭと一致しないようであったため、更に２４サイクルの増幅を行った。
このプロトコールはハイブリッドライブラリを形成するが、十分な効率を有していない可能性がある。例えば、ＮａＯＨによるビーズ上での変性は、試料の損失及び配列決定のためのフローセル上での不十分な密度を引き起こし得る。ビーズ上での両方のライブラリーの調製は、収率を改善し得る。
実施例４．ビーズに連結したトランスポゾンによるＤＮＡライブラリーの調製、その後の変性、ハイブリダイゼーション、及び鎖伸長
ハイブリッドＤＮＡライブラリーを調製するためのワークフローは、ビーズに連結したトランスポゾン（ＢＬＴ）を用いて行うことができる。ライブラリー調製のための標準プロトコールとの違いは、２つのタイプのビーズの存在である（タイプＩビーズは、ＭＥ’－ＨＹＢ’を含むＢＬＴを有し、タイプＩＩビーズは、トランスポゾンの非挿入鎖にＭＥ’－ＨＹＢを含むＢＬＴを有する）。
ＢＬＴタグメンテーション及びギャップ充填ライゲーション（ＥＬＭ３を使用）の後は、ライブラリー調製完了のための２つの選択肢がある。図９Ｂに示されるように、非アンカー鎖をＢＬＴから変性させて、ライブラリーのＨＹＢ－ＨＹＢ’部分をハイブリダイズさせることができ、次いで、ＡＭＳ１ポリメラーゼ伸長ミックスを添加して鎖を伸長させて、末端にＰ５－Ｐ７’又はＰ７－Ｐ５’を有するライブラリーを完成させることができる。次いで、このライブラリーは、ＰＣＲ又はビオチンを有する遊離緩衝液によってビーズから遊離され得る。
別の方法を図８Ａ～図８Ｂに示す。ここで、Ｐ５アンカートランスポソームは、低濃度のビオチンを含有する遊離緩衝液によってライブラリーが遊離できないように、ビオチン又は化学的コンジュゲーションを使用して結合される。他のビーズタイプは、単一のデスチオビオチンを使用してビーズに固定されたＰ７を有し、これは、遊離緩衝液を使用してストレプトアビジンから容易に除去され得る。したがって、Ｐ７－ＨＹＢライブラリーを選択的に遊離し、ビーズタイプＩ上のＰ５－ＨＹＢ’ライブラリーにハイブリダイズが可能になり得る。
再び、ＡＭＳ１ポリメラーゼ伸長ミックスを添加して鎖を伸長させてＰ５－Ｐ７’又はＰ７－Ｐ５’ライブラリーを作製し、次いでＰＣＲ又は他の遊離条件（変性緩衝液＋高温など）を使用してライブラリーをビーズから収集する。
連結された核酸配列決定鋳型を形成するためのＨＹＢのＨＹＢ’へのハイブリダイゼーション及び伸長のためのこれらのアプローチは、Ｔｒｕｓｅｑ又は他のタイプのトランスポソーム反応によって生成されるものなどの他の供給源からのライブラリー産物に使用できる。
実施例５．デスチオビオチンでタグ付けされたオリゴヌクレオチドを使用するビーズベースのプロトコールによるポリヌクレオチドの調製
プロトコールを、デスチオビオチンでタグ付けされたオリゴヌクレオチドを使用して開発した。デスチオビオチンによるタグ付けは、ＮａＯＨ変性工程の必要性を回避することができる。
Ｐ５／ＨＹＢ’ライブラリーを生成するために、合計１０μＬのＢＬＴ（１０ｆｍｏｌｅ）を２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄した。１７６μＬの作業緩衝液を１μＬの一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質と混合した。洗浄緩衝液をビーズから除去し、４４μＬの作業緩衝液＋ＳＳＢミックスを添加し、室温で１分間インキュベートした。次いで、６μＬの１０×タグメンテーション緩衝液をビーズに添加し、タグメンテーションを３７℃で１０分間進行させた。１２μＬの５％ＳＤＳを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。ビーズを６０℃で５分間インキュベートしてＭＥ’を変性させ、２００μＬの洗浄緩衝液で素早く洗浄した。ビーズを８０μＬの２μＭ ＭＥ’－ＨＹＢ’中に再懸濁した。Ｒｕｎ Ａｎｎｅａｌｒｔプログラムを、６０℃から開始し、２０℃まで下げた（１サイクル当たり１℃）。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、８０μＬのＥＬＭ３伸長－ライゲーション緩衝液に再懸濁し、室温で３０分間回転させ、次いで２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、４℃の洗浄緩衝液中に保存した。
Ｐ７／ＨＹＢライブラリーを、単一デスチオビオチンＰ７－Ｂ８－ＭＥオリゴヌクレオチドを使用して生成して酵素複合体を作製し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズにアセンブルした。対照的に、Ｐ５／ＨＹＢ’は、２つのデスチオビオチンを有するＢＬＴを使用して生成した。したがって、遊離条件は、２つのライブラリーについて異なり、Ｐ５／ＨＹＢ’ライブラリーは、６０℃で２０ｍＭビオチンの遊離条件を有する２つのデスチオビオチンを有するＢＬＴを用いて生成され、一方、Ｐ７／ＨＹＢライブラリーは、７０℃で１０μＭビオチンの遊離条件を有する単一のデスチオビオチンを有する。
Ｐ７／ＨＹＢライブラリーを調製するために、オリゴヌクレオチド（オリゴ）二重鎖を表６に記載されるように調製した。
オリゴ１：（ｄｅｓｔｈｉｏ２０Ｐ７－Ｂ８－ＭＥ）５’－ ／５ｄｅＳＢｉｏＴＥＧ／ ＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ ＧＧＧＣＴＣＧＧ ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１２）
オリゴ２：（ＭＥ’）５’－／Ｐｈｏｓ／ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＡＴＣ Ｔ－３’（配列番号３）
Figure 2023547366000016
オリゴヌクレオチド二本鎖溶液を調製した後、表７のプロトコールを使用してＡｎｎｅａｌｒｔレシピをＰＣＲで実施した。二本鎖を長期保存のために－２０℃で保存し、複数回の凍結融解サイクルを回避した。
Figure 2023547366000017
酵素複合体を表８に概説するように構築し、３７℃で一晩インキュベートし、次いで２０℃で保存した。
Figure 2023547366000018
４０μＬのＭ２８０ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、４０μＬの洗浄緩衝液に再懸濁し、２μＬの２μＭトランスポソーム複合体（１０ｆｍｏｌｅ／ＢＬＴ）を添加した。ビーズを室温で３０分間回転させ、洗浄し、４０μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。１０μＬの酵素ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄した。１７６μＬの作業緩衝液を１μＬの一本鎖結合タンパク質と混合した。洗浄緩衝液をビーズから除去し、４４μＬの作業緩衝液＋ＳＳＢミックスを添加し、室温で１分間インキュベートした。６μＬの１０×タグメンテーション緩衝液をビーズに添加し、タグメンテーションを３７℃で１０分間進行させた。次いで、１２μＬの５％ＳＤＳを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。次いで、ビーズを６０℃で５分間インキュベートしてＭＥ’を変性させ、２００μＬの洗浄緩衝液で素早く洗浄し、ビーズを８０μＬの２μＭ ＭＥ’－ＨＹＢ中に再懸濁した。Ｒｕｎ Ａｎｎｅａｌｒｔプログラムを、６０℃から開始し、２０℃まで下げた（１サイクル当たり１℃）。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、８０μＬのＥＬＭ３伸長ライゲーション緩衝液に再懸濁し、室温で３０分間回転させた。ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液中に４℃で保存した。
この時点で、ビーズ上の２つの別々のライブラリーセットが準備される。１５サイクルのＰＣＲを各ライブラリーセットについて行うと、ＰＣＲ産物の上清は、予想される位置にＢＡピークを示す。ＰＣＲ反応において、表９に概説するように、Ｐ５／ＨＹＢ’ライブラリーについてはＰ５及びＨＹＢをＰＣＲプライマー１として使用し、Ｐ７／ＨＹＢライブラリーについてはＰ７及びＨＹＢ’をＰＣＲプライマー２として使用した。
Figure 2023547366000019
Ｐ７／ＨＹＢビーズをＨＴ１ハイブリダイゼーション緩衝液中の１０ｍＭビオチンに再懸濁し、オリゴヌクレオチド二本鎖のオリゴ１が単一のデスチオビオチンを含んでいたため、６０℃で１０分間遊離させた。上清をＰ５／ＨＹＢビーズに添加し、次いで５０℃から開始して２０℃までゆっくりと下降させて、ライブラリー産物をハイブリダイズさせた。次いで、ビーズを洗浄緩衝液で洗浄し、ＡＭＳ１を添加し、５０℃で１０分間インキュベートした。２つのインサート配列（各ライブラリーから１つ）を含むポリヌクレオチドをロードし、ＨＴ１ハイブリダイゼーション緩衝液中の２０ｍＭビオチンによってフローセル上に遊離させた。
実施例６．ＨＹＢ／ＨＹＢ’配列の更新
最初の実験は、ＨＹＢ１と称し得るＨＹＢ配列を用いて行った。
ＨＹＢ１（配列番号１３）：５’－ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＡＧ－３’
更新されたＨＹＢ設計であるＨＹＢ２は、追加のＡ／Ｔ含量、Ａ及びＧヌクレオチドのシャッフル、並びにＨＹＢ配列の５’末端上のＣ／Ｇロックを含めた。
ＨＹＢ２（配列番号１４）：５’－ＧＡＧ ＴＡＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＡＴＡ ＧＧＡ ＡＧＧ－３’
実施例７．Ｔｒｕｓｅｑ ＰＣＲ Ｆｒｅｅを用いたポリヌクレオチドの調製
複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドもまた、Ｔｒｕｓｅｑ ＰＣＲ Ｆｒｅｅプロトコールを用いて調製した。
１μｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡを各フォーク型ライブラリーのインプットとして使用し、続いてＩｌｌｕｍｉｎａ Ｔｒｕｓｅｑ ＰＣＲフリープロトコールを使用してＤＮＡを剪断し、末端修復及びＡテーリングを行った。
使用したライゲーション工程では、Ｐ５／ＨＹＢ２’アダプター及びＰ７／ＨＹＢ２アダプターセットを使用した。Ｐ７／ＨＹＢ２アダプター（配列番号２４及び２５）をインサート配列１に使用し、Ｐ５／ＨＹＢ２’アダプター（配列番号２６及び２７）をインサート配列２に使用した。これらのアダプターにおいて、Ｃはメチル化されていた。
表１０のＡｎｎｅａｌｒｔレシピを用いてアダプターセットを調製し（最終濃度１０μＭ）、二本鎖を－２０℃で長期間保存し、複数回の凍結融解サイクルを回避した。オリゴヌクレオチドのストック濃度は１００μＭであり、最終アダプター濃度は１×アニーリング緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ ＥＤＴＡ）中１０μＭであった。
Figure 2023547366000020
ライゲーションは、カスタムアダプターセットを使用するライゲーション工程についてのＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＣＲ ｆｒｅｅ Ｔｒｕｓｅｑプロトコールに従って実施した。Ｔｒｕｓｅｑプロトコールに列挙されるように２回精製を実施し、最終ライブラリーを２２．５μＬのＩｌｌｕｍｉｎａ再懸濁緩衝液中に溶出した。
次いで、フォーク型ライブラリーは、２つのインサート配列を含むポリヌクレオチドを調製するためのスタッキングの準備ができていた。６μＬのＰ５／Ｈｙｂ２’を有するフォーク型ライブラリー産物及び６μＬのｐ７／Ｈｙｂ２を有するフォーク型ライブラリー産物を混合し、１．３μＬの１０×アニーリング緩衝液を添加した。表１１に列挙したＰＣＲのアニーリングプログラムを使用して、２つのライブラリー産物をハイブリダイズさせた。
Figure 2023547366000021
アニーリング工程後、１１７μＬ（アニーリングしたライブラリーの体積の９倍）のＡＭＳ１を添加し、続いて５０℃で１０分間インキュベートした。伸長後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合タンデムライブラリーを形成した。１×ＳＰＲＩ精製を行い、試料を１２μＬのＩｌｌｕｍｉｎａ再懸濁緩衝液中に溶出した。
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを実行させて、タンデムライブラリーのサイズを確認し、ｑＰＣＲを用いて最終ライブラリー産物を定量した。図１１に示されるように、タンデムライブラリーは６１２塩基対の平均サイズを示し、これは出発のＰ５－ＨＹＢ’又はＰ７－ＨＹＢライブラリーの約２倍であった。これらの結果は、Ｔｒｕｓｅｑ法を用いてタンデムライブラリーの対形成に成功したことを示す。
タンデムライブラリーは、２つではなく４つのリードを有するようにレシピを修正して、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定することができる。配列決定プライマーの位置を更新して、各配列決定リードについて正しい配列決定プライマーを使用した。
実施例８．複数のインサートを含むポリヌクレオチドの配列決定
これらの実験では、ビーズに連結したトランスポゾンを用いてヒトゲノムライブラリー断片を作製した後、複数のインサートを含むポリヌクレオチドを調製した。ポリヌクレオチドを、Ｍｉｓｅｑ ＦＣによって配列決定した。図１４Ａに示すデータは、リード１ ＳＢＳ３Ｔ配列決定プライマーを使用した標準リード１配列決定（リード１－Ａ）である。リード１－Ａによる配列決定を終えた後、合成された鎖を変性させ、中間配列決定プライマー（リード１－Ｂ ｓｅｑプライマー、第２のリードプライマーである）とハイブリダイズさせた。２回の読み取りサイクルの配列決定のサムネイル画像を図１４Ｂに示す。データを明確に示すために、いくつかの過剰増幅されたクラスターが存在する。
１０個のクラスターからのリードの例を表１２に示して、２つのライブラリー断片の単一クラスターへの連結の成功を示す。４×１００サイクルの配列決定を行い、得られたリード対をヒトゲノムにマッピングした。表１２は、ＢＡＭファイルで報告されたクラスターのタイル、ｘ及びｙ座標を示す。所与のクラスターについて、各リードがマッピングされた染色体が提供される。予想通り、各ライブラリーからの２つのペアリードは同じ染色体にマッピングされ、２つのライブラリー断片は異なる染色体にマッピングされる。したがって、表１２の結果は、ポリヌクレオチド中の２つのインサートがヒトゲノム中の異なる領域に由来することを示す。
個々のクラスター由来のリードのこれらの結果は、ポリヌクレオチドへの２つのライブラリー断片の連結が成功したこと、及び２つの別個のインサート配列の配列決定を実証している。
実施例９．ライゲーション法を用いた、剪断されたゲノムＤＮＡ断片を有する出発ライブラリーからのポリヌクレオチドの調製
制限酵素消化及びライゲーションを含む方法を使用して、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを生成した。本明細書中の図１５Ａ～図１５Ｆに記載される例示的な方法において、第１のライブラリーは、剪断されたＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡに由来するインサートを含み、第２のライブラリーは、剪断されたヒトゲノムＤＮＡに由来するインサートを含んだ。第１のライブラリーをＢｔｇＺＩで消化し、第２のライブラリーをＢｇｌＩＩで消化した。２つの消化されたライブラリーを一緒にライゲーションして、各ポリヌクレオチドがＥ．ｃｏｌｉゲノム由来の１つのインサート及びヒトゲノム由来の別のインサートを含有するタンデムインサートライブラリーを生成した（図１９）。
タンデムインサートライブラリーポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドを異なる濃度で含有する８レーン配列決定フローセルを調製し、レーン１は２ｐＭを有し、レーン２は１０ｐＭを有し、レーン３は２０ｐＭを有し、レーン６は２ｐＭを有し、レーン７は１０ｐＭを有し、レーン８は２０ｐＭを有した。レーン４及び５は対照反応のためのレーンであり、レーン４は単一鋳型対照反応を有し、レーン５はｐＨＩＸ配列決定ライブラリー対照反応を有した（図１９）。リード１及び４を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム由来のインサートを配列決定した（図１９）。リード２及び３を使用して、ヒトゲノム由来のインサートを配列決定した（図１９）。
図２０Ａ～図２０Ｄに示されるように、２ｐＭ又は１０ｐＭでクラスター化されたレーンは、純度フィルターを通過した高い割合（％ＰＦ）の純粋なクラスターを生成し、正しく形成された鋳型のクラスター化及び配列決定の成功を示した。更に、予想される参照ゲノムに整列させた場合、高い割合のリードが正確に一致し、鋳型が予想されるインサートを含有したことを示した。
両方のインサートについて配列決定の各サイクルで検出された４塩基の各々の割合は、図２１Ａ～Ｂにおいてサイクルプロットあたりの％ベースコールで表される。Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ断片を含有する第１のインサートにおいて各サイクルについて２５％の割合で生じることが予想され、観察された。同様に、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧは、ヒト断片を含有する第２のインサートにおいて各サイクルについて３０％、３０％、２０％、及び２０％の割合で生じることが予想され、観察された。データは、設計されたライブラリーにおいて２つのインサートを検出した４回の読み取りが行われたことを示す。
実施例１０．鎖オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）法を用いた単一鋳型を有する出発ライブラリーからのポリヌクレオチドの調製。
鎖オーバーラップ伸長（ＳＯＥ）を含む方法を使用して、複数のインサート配列を含むポリヌクレオチドを生成した。本明細書に記載される例示的な方法において（図１６Ａ～図１６Ｂ及び図１７）、第１のライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のインサート単一鋳型（すなわち、アンプリコン）を含有し、第２のライブラリーは、ＰｈｉＸ由来の単一鋳型を含有した（図２２及び図２４Ａ～図２４Ｃ）。少なくとも２つの異なるアンプリコンのセットを使用した。アダプターを単一鋳型にライゲーションし、（図１６Ａ～図１６Ｂ及び図１７）に示すＳＯＥ法を使用してタンデムインサートライブラリーを作製した。
単一インサート対照ＰｈｉＸライブラリーを含有するレーン５を除く全てのレーンにおいて、タンデムインサートライブラリーポリヌクレオチド由来のポリヌクレオチドを含有する配列決定フローセルを調製した。リード１及び４を使用して、ＰｈｉＸ単一鋳型由来のインサートを配列決定した（図２２）。リード２及び３を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ単一鋳型由来のインサートを配列決定した（図２２）。
４リード配列決定実行からの一次メトリックを図２３Ａ～図２３Ｄに示す。第１及び第２のインサートをそれぞれカバーするリード１及び２は、クラスター数、％ＰＦ、及び％アラインを示し、各ポリヌクレオチド中の２つのインサートの存在を示す。対照的に、単一インサート対照を含有するレーン５は、リード２について意味のあるデータを生じず、第２のインサートが存在しないことを示した。
図２４Ａ～Ｃは、本実施例の方法を使用して生成されたタンデムインサートポリヌクレオチドの完全なアンプリコン配列を示す。（アダプター配列は「アダプター」とマークされ、それらの実際の配列は示されていない。）図２４Ａ～Ｃは、リード１及びリード２の上位５つの最も一般的なリード配列、並びにそれらのカウントを強調した、シーケンサー機器出力からの予想配列を示す。リード１は第１のインサートに読み込まれ、リード２は第２のインサートに読み込まれる。データは、両方のアンプリコンの存在を示し、タンデムインサートポリヌクレオチドの生成が成功したことを確認する。
両方のインサートについて配列決定の各サイクルで検出された４塩基の各々の割合は、図２１Ａ～Ｂにおいてサイクルプロットあたりの％ベースコールで表される。Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣは、Ｅ．ｃｏｌｉ断片を含有する第１のインサートにおいて各サイクルについて２５％の割合で生じることが予想され、観察された。同様に、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧは、ヒト断片を含有する第２のインサートにおいて各サイクルについて３０％、３０％、２０％、及び２０％の割合で生じることが予想され、観察された。データは、設計されたライブラリーにおいて２つのインサートを検出した４回の読み取りが行われたことを示す。
実施例１１．フォーク型アダプター及び固体支持体を使用する、２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型の調製
２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型を調製する方法は、フォーク型アダプター及びライゲーションされたアダプターを有する断片を固定化するための表面を用いて行うことができ、固体支持体は、複数の断片を一緒にハイブリダイズさせて、連結された配列決定鋳型を生成することを可能にする。
図２５に示されるように、第１及び第２のアダプターを調製することができる。アダプターは、２つのアダプターがそれぞれ、互いに部分的にハイブリダイズして二本鎖セクション及び一本鎖セクションを形成する第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを含むように、構造が「Ｙ字型」又は「フォーク型」であり得る（すなわち、各アダプターがフォーク型アダプターである）。各フォーク型アダプターは、アダプターを表面に付着させるための結合部分を含む。この部分結合は、ビオチン又は当業者に既知の他の化学物質であり得る。この部分は、フォーク型アダプター中のオリゴヌクレオチドのうちの１つの５’末端に存在し得、これは、フォーク型アダプターの「第１の鎖」と呼ばれ得る。第１の鎖は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定プラットフォームの「リード１」配列（Ｐ５．Ｒ１と称される）に対応する完全配列又は部分配列を含み得、第２のアダプターの場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定プラットフォームの「リード２」配列（例えば、Ｐ７．Ｒ２）を含み得る。第２の鎖は、５’末端セクション及び３’末端セクションの２つのセクションを含む。５’末端セクションは相補的であり、第１の鎖の３’末端にハイブリダイズする。第１のアダプターにおける第２の鎖（Ｘ’）の３’末端セクションは、第２のアダプターにおける第２のオリゴヌクレオチド（Ｘ）の３’末端セクションに相補的である。Ｘ及びＸ’は、それぞれ、ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体であり得る。
ブロッキングオリゴヌクレオチドは、いずれかのフォーク型アダプターの第２の鎖の３’末端で一方又は両方のフォーク型アダプターにハイブリダイズされ得る（すなわち、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、フォーク型アダプターの第２の鎖の一本鎖セクションにハイブリダイズされる）。このブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１のフォーク型アダプター又は第２のフォーク型アダプターのいずれか又は両方にハイブリダイズされ得る（図２６）。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１のフォーク型アダプター及び第２のアダプターが、各第２の鎖の３’相補的セクション（すなわち、図２６に示されるＸ及びＸ’配列、それぞれハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体に対応し得る）を介して互いにハイブリダイズすることを防止する。
第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターの混合物が、第１の鎖（図２７Ａ～２７Ｃの上鎖Ａ）及び下鎖（図２７Ａ～図２７Ｃの下の相補体Ａ’）を含む二本鎖ＤＮＡ断片の末端にライゲーションされる場合、３つの異なるタグ付けされたライブラリー産物が形成され得る。一方の末端に第１のフォーク型アダプター及び他方の末端に第２のフォーク型アダプターを有する断片（図２７Ａ）、両端に第１のフォーク型アダプターを有する断片（図２７Ｂ）、又は両端に第２のフォーク型アダプターを有する断片（図２７Ｃ）。異なる断片（図２７Ａ～図２７Ｃに示される）は、５０（図２７Ａ）：２５（図２７Ｂ）：２５（図２７Ｃ）の比で形成される。
次いで、ライゲーションされたアダプターを有する断片を表面に付加し、フォーク型アダプターの第１の鎖の５’親和性部分を介して付着させることができる。表面は、ビーズ、又はスライド、又は容器の壁、又はフローセル上のナノウェルであってもよい。次に、断片を変性させ、ブロッキングオリゴヌクレオチドが除去されるように流動させることができる。変性は、熱、ｐＨ、又はカオトロピック剤を含む、当業者に既知のいくつかの方法によって起こり得る。
表面が再生に有利な条件（例えば、表面の冷却）に供される場合、２つの一本鎖断片は、それらの全長にわたって完全に再アニーリングし得る。あるいは、一方の末端に第１のフォーク型アダプター由来のアダプター配列を有し、他方に第２のフォーク型アダプター由来のアダプター配列を有する一本鎖断片のみが、それらの３’相補的末端によってのみ再アニーリングし得る（すなわち、図２８Ａに示されるように、第２のフォーク型アダプターの第２の鎖のＸ配列の、第１のフォーク型アダプターの第２のオリゴヌクレオチドのＸ’配列との結合）。ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び緩衝液を添加して、３’末端からポリヌクレオチドを伸長させて、２つのインサートをタンデムで含む新しい鋳型を生成することができる（図２９）。
Ｘ’配列は別のＸ’配列にアニールしないため、両端に第１のフォーク型アダプター由来の配列を含む断片は、それらの３’末端を介して互いにアニールすることができず（図２８Ｂ）、したがって伸長することができない。同様に、Ｘ配列は別のＸ配列にアニールしないため、両端に第２のフォーク型アダプター由来の配列を含む断片は、それらの３’末端を介して互いにアニールすることができず（図２８Ｃ）、したがって伸長することができない。変性、再アニーリング、及び伸長のプロセスは、一方の末端に第１のフォーク型アダプター由来の配列及び他方の末端に第２のアダプター由来の配列（図２８Ａ）を含む全ての断片が、タンデムインサート（すなわち、同じポリヌクレオチド内の２つ以上のインサート）を含む配列決定鋳型に変換されるまで、複数回行うことができる。
図２９に示されるように、配列決定鋳型は、第２のインサートとしてＡ上鎖のコピーに連結されたインサートとして元のＡ上鎖を含むことができる。元のＡ鎖に存在する任意の変異体は、コピーＡ鎖において複製され、したがって、両方のコピーが配列決定される場合、改変体のベースコールにおける信頼性を増加させる。同様に、コピーＡ鎖にのみ現れる変異体は、アーチファクトとして高い信頼度で棄却することができる。このようにして、この実施形態は、配列決定におけるベースコールの精度を改善する。
連結された配列決定鋳型はまた、Ａ’下鎖のコピーに連結された元のＡ’下鎖の相補体を含む。配列決定のためのライブラリー調製の最終段階において、上鎖及び下鎖は、５’表面結合部分を破壊し、続いてライブラリーを変性させることによって表面から回収される。したがって、上鎖及び下鎖は、互いに独立して配列決定される。それらはまた、ＰＣＲ又は配列決定の前にＤＮＡをコピーする他の方法によって複製され得る。
図３０は、多数のライブラリー断片（この例では、５つの断片Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥによって表される）が、表面に結合され、変性され、再アニーリングされ、次いで、伸長されて、連結された配列決定鋳型を形成する方法の概要を示す。両端に第１のフォーク型アダプター由来の配列又は両端に第２のフォーク型アダプター由来の配列を有する鋳型は、それらの３’末端を介して再アニーリングすることができず（例えば、図３０の鋳型Ｃ及びＥ）、したがって伸長することができない。二本鎖断片（後に、一本鎖断片に変性される）は、二本鎖断片由来の２つの断片の再アニーリングに有利に働く密度で表面に添加（かつ固定化）されて、同じインサートの２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型を生成し得、異なる二本鎖断片由来の２つの断片のアニーリングにむしろ有利に働く。
他の場合には、配列決定鋳型は、互いのコピーではない２つ以上のインサートを含み得る。このような配列決定鋳型は、２つの断片中のインサートが相補的であることなく、ＸのＸ’への結合によってアニーリングする２つの断片によって生成され得る。言い換えれば、いくつかの配列決定鋳型は、同じインサートの２つのコピーを有し得るが、他の配列決定鋳型は、無関係の配列を有する２つの異なるインサートを含み得る。
実施例１２．区画化を使用する、２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型の調製
２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型を調製するための方法は、フォーク型アダプター及び区画化の手段を使用し得る。
ＤＮＡ分子、例えば、別々のゲノム、別々の染色体、又はＤＮＡの大きな断片（＞１０００ｂｐ、好ましくは５０００ｂｐ超）のプールは、限界希釈によって複数の区画に分離され、その結果、個々の区画は、ＤＮＡ分子を含まないか、単一のＤＮＡ分子を含むか、又は１つのハプロイドコピーの画分に等しい限定された数のＤＮＡ分子を含み、それによってゲノムの任意の位置がハプロイドＤＮＡによって表される。区画化を組み込む方法は、主に連続性情報を捕捉するが、これらの方法はまた、（同じインサート配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む断片のハイブリダイゼーションを介して）所与のインサート配列の２つのコピーを有する連結された配列決定鋳型を生成することもできる。
区画化の方法（例えば、全ゲノムハプロタイピングの準備に使用するため）は当技術分野で周知であり、例えば、Ａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４６（１２）：１３４３－９（２０１４）、Ｋａｐｅｒ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．１１０（１４）：５５５２－５５５７（２０１３）、Ｋｉｔｚｍａｎ ＪＯ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１）：５９－６３（２０１１）、Ｐｅｔｅｒｓ ＢＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．４８７（７４０６）：１９０－１９５（２０１２）、Ｆａｎ ＨＣ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１）：５１－５７（２０１１）、Ｌｅｖｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．５（１０）：ｅ２５４（２００７）、Ｄｕｉｔａｍａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０（５）：２０４１－２０５３（２０１２）、Ｓｕｋ ＥＫ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２１（１０）：１６７２－１６８５（２０１１）に教示されており、各々の全開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる。ユーザーは、好みと利用可能な装置に基づいて、特定の区画化手段、例えば、エマルジョンを選択し得、この方法は、当該技術分野で既知の種々の区画化方法に適合され得る。
図３１は、区画がプレート上のウェル又は多数のチューブであり、出発プールが３つの分子、ｆ１、ｆ２及びｆ３を含有する方法を示す。各区画は、ライブラリー調製（すなわち、それ自体が比較的大きな断片であり得る出発二本鎖断片の断片化、小断片の末端の修復、及び末端がライゲーションされた小断片を形成するための実施例１１に記載される第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターの混合物を使用するライゲーション反応）に供される。次に、小断片を変性させ、それらの３’相補的末端を介して再アニーリングし、伸長させてタンデムインサート鋳型を形成する。図３１の例示的な実施形態に示されるように、断片分子ｆ１を含有する区画内の分子は、３つの小断片ｆ１．１、ｆ１．２、及びｆ１．３に断片化された。したがって、得られたタンデムインサート鋳型は、これら３つの小断片の順序、例えばｆ１．１－ｆ１．２、ｆ１．１－ｆ１．３、及びｆ１．２－ｆ１．３である。同じ小断片の他の順序、例えば、ｆ１．１－ｆ１．１、ｆ１．２－ｆ１．２、及びｆ１．３－ｆ１．３もまた可能である。
異なる区画（例えば、ｆ２、ｆ３などを含む区画）もまた、タンデムインサート鋳型を形成するが、これらのウェル内の出発分子の順序からのみ形成することが理解される。換言すれば、同じ区画において生成された小断片のみが、一緒にハイブリダイズするために利用可能であり、連結された配列決定鋳型を生成する。したがって、連結された配列決定鋳型中に２つのインサート配列が一緒に存在することを利用して、特に、単一のＤＮＡ分子のみが区画中に一般に存在するように条件が最適化されている場合、これらのインサート配列が同じ出発ＤＮＡ分子（例えば、図３１中の断片ｆ１、ｆ２、又はｆ３）中に含まれていたことを推測することができる。
したがって、全ての区画からタンデムインサート鋳型が一緒にプールされ、配列決定される場合であっても、連続性情報は、連結された配列決定鋳型において捕捉される。図３１は、３つの断片の代表例を示すが、出発二本鎖ＤＮＡ分子（断片化前）由来の４つ以上の断片も可能である。
区画としてウェル又はチューブを使用する利点は、プロセスの各段階で試薬を加えることができることである。ウェル又はチューブを使用することの潜在的な欠点は、液体の取り扱い及びプラスチック器具の物理的規模である。したがって、マイクロフルイディクスを使用する、油中水滴を使用する区画化の代替方法が開発されている。液滴を合体させて、ＤＮＡを断片化するエンドヌクレアーゼなどの試薬を添加することができる。液滴技術は、連続性情報を捕捉するために使用されている（例えば、「Ｅｖｅｒｙｔｈｉｎｇ ｙｏｕ ｗａｎｔｅｄ ｔｏ ｋｎｏｗ ａｂｏｕｔ Ｌｉｎｋｅｄ－Ｒｅａｄｓ」１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ７，２０１７に概説される例示的な方法を参照されたい）が、このような方法は、多くの場合、隣接配列を連結するために外因性合成バーコードの添加を必要とする。
図３２は、第１のフォーク型アダプター及び第２のフォーク型アダプターを使用する例示的な方法を示し、第１及び第２のフォーク型アダプターは相補的３’末端を含み、ワークフローを区画化するために液滴を使用する。区画（例えば、ウェル又はチューブ）を用いる方法と同様に、断片ｆ１、ｆ２、及びｆ３は、別個の液滴中に含まれ得る。フォーク型アダプターをライゲーションし、連結された配列決定鋳型を生成した後、エマルジョンを最終工程で一緒に合わせることができる。特に、より多くの出発核酸が液滴中に個々に含まれるエマルジョンが調製される場合、同じ連結された配列決定鋳型中の異なるインサート配列が存在することを利用して、これらのインサート配列が同じ出発核酸中に含まれていたことを推測することができる。
図３３は、遺伝子中の２つ以上の変異体がそれらの起源染色体ハプロタイプに帰することができるハプロタイプフェージングの例を示す。この例では、出発試料は２つの無関係な遺伝子を有し、１つは染色体１上にあり、１つは染色体２上にある。２つの変異体、ｓｎｐ１及びｓｎｐ２は、染色体１上の遺伝子に存在するが、これらの２つの変異体は、遺伝子の２つのコピーのうちの１つにのみ見出され、すなわち、染色体１／ハプロタイプ１（すなわち、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ１）上に見出される遺伝子は、両方の変異体を含む。他の染色体１／ハプロタイプ２（すなわち、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ２）上のこの遺伝子の第２のコピーは、これらの遺伝子座において変異体を有さず、これらの遺伝子座における配列は野生型（ｗｔ）である。従って、遺伝子１のフェージングされたハプロタイプは、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ１－ｓｎｐ１－ｓｎｐ２及びＣｈｒ１－Ｈａｐ２－ｗｔ－ｗｔである。同様に、染色体２上の第２の遺伝子も２つのコピーである、Ｃｈｒ２－Ｈａｐ１及びＣｈｒ２－Ｈａｐ２を有するが、この場合、２つの変異体（ｓｎｐ３及びｓｎｐ４）はシスではなく（すなわち、両方の変異体が同じコピーにある）、代わりに、変異体が２つのハプロタイプ中の遺伝子のいずれかのコピーに見出される。したがって、フェージングされたハプロタイプは、Ｃｈｒ２－Ｈａｐ１－ｓｎｐ３－ｗｔ及びＣｈｒ２－Ｈａｐ２－ｗｔ－ｓｎｐ４である。
サブハプロイド濃度への限界希釈及び区画化の結果として、同じ遺伝子の２つのコピー（ハプロタイプ）が同じ区画に存在する可能性は低い。しかし、ハプロタイプデータを調製するために、希釈は、所定の区画中の１つの標的核酸に限定する必要はなく、その代わりに、異なる染色体が同じ区画中に含まれることを可能にし得る。希釈は、一般的に、２つのハプロイドコピーが同じ区画に含まれる確率を制限する必要があるだけである。
図３３に示されるように、１つの区画はＣｈｒ１－Ｈａｐ１－ｓｎｐ１－ｓｎｐ２及びＣｈｒ２－Ｈａｐ１－ｓｎｐ３－ｗｔを有し、一方、別の区画はＣｈｒ１－Ｈａｐ２－ｗｔ－ｗｔ及びＣｈｒ２－Ｈａｐ２－ｗｔ－ｓｎｐ４を有する。変性、鋳型の３’末端を介した再アニーリング、及び伸長に続いて、元のハプロタイプを構成するものを含む、タンデムインサートの多くの順列が可能である（図３３においてチェック付き矢印によって強調された破線の円で囲まれたものによって示される）。しかしながら、区画化のために、ハプロタイプをスクランブルする順列、例えば、Ｃｈｒ１－Ｈａｐ１－ｓｎｐ１－Ｃｈｒ１－Ｈａｐ２－ｗｔ又はＣｈｒ２－Ｈａｐ１－ｓｎｐ３－Ｃｈｒ２－Ｈａｐ２－ｓｎｐ４（図３３において「Ｘ」を含む矢印で強調された選択肢として示される）は可能ではない。このようにして、フェージング情報は、バーコード化を必要とすることなくタンデムインサートアプローチによって捕捉される。
実施例１３．固定されたトランスポソームを有する固体支持体を使用する、２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型の調製。
２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型はまた、固定されたトランスポソームを有する固体支持体を使用して調製することができる。第１及び第２のトランスポソームを、図３４に示すように調製する。第１のトランスポソームは、トランスポザーゼ酵素と第１のアダプターとの複合体を含む。第２のトランスポソームは、トランスポザーゼ酵素と第２のアダプターとの複合体を含む。２つのオリゴヌクレオチド、第１の鎖及び第２の鎖が互いに部分的にハイブリダイズして、二本鎖セクション及び一本鎖セクションを含むフォーク型アダプターを形成するため、アダプターの構造は、「Ｙ字型」又は「フォーク型」である。第１の鎖及び第２の鎖はまた、第１トランスポゾン及び第２トランスポゾンと称され得る。
第１及び第２のアダプターの両方は、固体支持体の表面上の結合部分に結合して、第１の鎖を表面に付着させることができる親和性部分を含む。言い換えれば、表面上の結合部分とトランスポソーム中の親和性部分との会合を使用して、トランスポソームを表面に固定することができる。親和性部分は、ビオチン又は当業者に既知の他の化学物質であり得る。親和性部分は、トランスポソームに含まれるフォーク型アダプター中の鎖の１つの５’末端に存在する。第１のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定プラットフォームの「リード１」配列（例えば、Ｐ５．Ｒ１）に対応する完全配列又は部分配列を含み、第２のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定プラットフォームの「リード２」配列（例えば、Ｐ７．Ｒ２）に対応する完全配列又は部分配列を含む。
各フォーク型アダプターの第２の鎖は、２つのセクション、５’末端セクション及び３’末端セクションを含むことができる。第２の鎖の５’末端セクションは相補的であり、第１の鎖の３’末端にハイブリダイズされる。第１のトランスポソームアダプターに含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖（Ｘ’）の３’末端セクションは、第２のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖（Ｘ）の３’末端セクションに相補的である。
トランスポソームは、第１及び第２のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖の５’末端を介して表面に付着される。付着のための方法は当業者に既知であり、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされた表面に付着させるためのオリゴヌクレオチドのビオチン化である。表面への付着は、２つのトランスポソームのランダム配置をもたらしてもよく（図３５）、又はいくつかの実施形態では、配置は、表面上の固定された所定の位置のアレイに順序付けられてもよい。この表面に加えられた二本鎖ＤＮＡの鎖は、ＤＮＡと表面との接触点の下に偶然に配置されたトランスポソームによってタグメンテーションを受ける。タグメンテーションは、固定されている第１のトランスポゾンのタグメンテーションされたＤＮＡへの結合をもたらし、タグメンテーションされたＤＮＡは固体支持体の表面に固定される。
固定されたトランスポソームを有するこの表面に添加された二本鎖ＤＮＡの鎖は、ＤＮＡと表面との接触点の下に偶然に位置付けられた１つ以上のトランスポソームによってタグメンテーションを受ける（図３５）。個々のタグメンテーション反応は、第１のトランスポソーム又は第２のトランスポソームを用いて行うことができる。タグメンテーションはＤＮＡを開裂し、アダプターの第１の鎖の３’ＯＨ末端を、開裂されたＤＮＡの５’末端に共有結合させる。アダプター中の第２の鎖の５’末端は付着せず、ニック／ギャップが形成され、試薬ＥＬＭ（伸長－ライゲーションミックス）を用いる重合／ライゲーション反応によって封止する。この反応を成功させるためには、トランスポザーゼ酵素をＳＤＳ及び洗浄によって除去しなければならない（図３６）。
ＤＮＡ対表面トランスポソーム比は、二本鎖ＤＮＡ分子当たり２つ以下のタグメンテーション事象が生じるように選択することができる。二本鎖ＤＮＡ当たり２つのタグメンテーション反応が起こる場合、隣接するトランスポソーム間に架橋が形成される。
第１のトランスポソーム及び第２のトランスポソームを用いてタグメンテーション反応が生じる場合、両末端に付加されたアダプターを有する出発ＤＮＡのセグメント（例えば、セグメントＡ）を含む架橋が形成される。架橋は、第１のトランスポソームと第２のトランスポソームとの間、又は第１のトランスポソームと第１のトランスポソームとの間、又は第２のトランスポソームと第２のトランスポソームとの間にあってもよい。このような順列は、それぞれ５０：２５：２５の比で生じる。
これらの架橋を処理してＴｎ５トランスポザーゼを除去し（例えば、ＳＤＳ及び洗浄を用いて）、ニック／ギャップを封止し、次いで二本鎖断片を一本鎖断片に変性させると、鋳型の異なる組合せを形成することができる。
例えば、第１のトランスポソームと第２のトランスポソームとの間に架橋が形成される場合、２つの一本鎖鋳型、５’－Ｐ５－Ｒ１－Ａ－Ｘ－３’及び５’－Ｐ７－Ｒ２－Ａ’－Ｘ’－３’が形成される（図３８）。第１のトランスポソームと第１のトランスポソームとの間に架橋が形成される場合、２つの一本鎖鋳型、５’－Ｐ５－Ｒ１－Ａ－Ｘ’－３’及び５’－Ｐ５－Ｒ１－Ａ’－Ｘ’－３’が形成される。第２のトランスポソームと第２のトランスポソームとの間に架橋が形成される場合、２つの一本鎖鋳型、５’－Ｐ７－Ｒ２－Ａ－Ｘ－３’及び５’－Ｐ７－Ｒ２－Ａ’－Ｘ－３’が形成される。
次いで、一本鎖の鎖を、当業者に既知の方法、例えば、冷却又は補助緩衝液条件によって処理して、再アニーリングを促進する。１つの結果は、一本鎖断片が単にそれらの相補体に再アニールすることである。あるいは、一本鎖断片は、それらの３’相補的末端によって、すなわち、Ｘ配列のＸ’配列への結合を介して再アニーリングし得る。これは、第１のトランスポソームアダプターと第２のトランスポソームアダプター、すなわち、５’－Ｐ５－Ｒ１－Ａ－Ｘ－３’及び５’－Ｐ７－Ｒ２－Ａ’－Ｘ’の間でのみ可能である（図３９）。５’－Ｐ５－Ｒ１－Ａ－Ｘ’－３’及び５’－Ｐ５－Ｒ１－Ａ’－Ｘ’－３’はハイブリダイズすることができず、５’－Ｐ７－Ｒ２－Ａ－Ｘ－３’及び５’－Ｐ７－Ｒ２－Ａ’－Ｘ－３’も同様である。ポリメラーゼ及びｄＮＴＰが添加され、伸長反応が実施される場合、センス鎖中にタンデムのＡ鎖の２つのコピー及びアンチセンス鎖中にタンデムのＡ’鎖の２つのコピーを含むタンデムインサート鋳型二重鎖が形成される（図４０）。２つの一本鎖インサートは、それらが両方ともＸ’配列を含むか、又は両方ともＸ配列を含む場合、対形成することができない。
２つの架橋が３つのタグメンテーション事象、例えば、図４１においてＡ及びＢによって表される２つの架橋によって形成される場合、第１及び第２のトランスポソームの順列に応じて、クロスインサートハイブリダイゼーションのより多数の順列が可能である。これらは、出発ＤＮＡ由来の連続するＡセグメント及びＢセグメントの順列である２つのインサートを有するキメラ鋳型を生成する（図４２）。インサートのこの近接会合は、タンデム鋳型を配列決定することによって明らかにされる。これらの連結された配列決定鋳型のいくつかは、それらの相補的末端に基づくＰＣＲ中の抑止のために増幅しない。また、いくつかの連結された配列決定鋳型は、それらの５’配列と３’配列との間の相補性のために、ＮＧＳプラットフォーム上で配列を生成しない。例えば、Ｐ５－Ｒ１－Ａ’－ｘ－Ｂ’－Ｒ１’－Ｐ５’及びＰ５’－Ｒ１’－Ａ－ｘ’－Ｂ－Ｒ１－Ｐ５は、両末端にＰ５／Ｐ５’を含み、断片の一方の末端にＰ５／Ｐ５’及び他方の末端にＰ７／Ｐ７’を必要とするペアエンド配列決定に利用可能ではないため、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーで配列を生成しない。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサー上で配列を生成しない連結された配列決定鋳型の例は、図４２において斜線ボックスで示されている。
２つの架橋は、第２のフォーク型アダプターを含む３つのトランスポソーム又は第１のフォーク型アダプターを含む３つのトランスポソームの間にも形成され得ることが理解されるであろう（図４３）。これらの例では、変性鋳型の３’末端間に相補性は存在せず（図４４）、したがって、タンデムインサート鋳型は産生されない。
３つ以上の架橋、例えば、図４５においてＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅによって表される５つの架橋が形成される場合、配列を共有する複数の連結された配列決定鋳型が形成され得る。例えば、インサートＡはインサートＢとハイブリダイズすることができ、インサートＢ’はインサートＣ’とハイブリダイズすることができ、インサートＣはインサートＤとハイブリダイズすることができるなどである。得られた伸長した鋳型は、配列決定されると、連続性情報が発見されること、並びに変異体のフェージングを提供することを可能にする。
変性、再アニーリング、及び伸長のプロセスは、第１の末端で第１のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖由来のアダプター及び第２の末端で第２のトランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第２の鎖由来のアダプターを含む全ての鋳型が、２つのインサートを含む配列決定鋳型に変換されるまで、複数回行うことができる。
次いで、当業者に既知の手段を使用して、例えば、酵素的消化又は化学的開裂によって、フォーク型アダプターの第１の鎖の５’末端から組み込まれたタグを表面とつないでいる連結を破壊することによって、配列決定鋳型を表面から分離することができる。次いで、遊離された鋳型は、配列決定プラットフォームに直接導入され得るか、又は最初に更なる改変、例えば、更なるアダプター配列の付加又はＰＣＲによる増幅を行い、その後配列決定することができる。
本発明の方法は、ゲノム内の隣接配列及び相補配列についての関連情報を捕捉するためのバーコードを必要としない。しかし、異なる試料由来の鋳型の２つ以上のライブラリーが配列決定の前にプールされる場合、試料バーコードが所望され得る。試料バーコードは、フォーク型アダプターの第１の鎖（図４６Ａ）、フォーク型アダプターの第２の鎖（図４６Ｂ）、又はフォーク型アダプターの第１及び第２の鎖の両方（図４６Ｃ）に含まれ得る。試料インデックスは、ｉ５～ｉ８を含む。あるいは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、異なるトランスポソーム複合体によって調製された異なる断片を標識してもよく、ＵＭＩは、トランスポソームに含まれるフォーク型アダプターの第１の鎖及び／又は第２の鎖に含まれ得る。次いで、図４７に示されるように、Ａ１４、Ｂ１５、又はＨＹＢ（又はそれらの相補体）に結合するプライマーを使用する異なる配列決定を実行して、インサート配列並びに試料インデックス及び／又はＵＭＩを配列決定することができる。
実施例１４．区画に含まれるトランスポソームを使用する、２つ以上のインサートを含む配列決定鋳型の調製
トランスポソームはまた、実施例１２に記載されるように、限界希釈及び／又は区画化の方法とともに使用され得る。トランスポソームは、いくつかの断片上のＸ’及び他の断片上のＸへの組み込みを可能にするために、図３４に示されるような第１及び第２のトランスポソームであってもよい。
そのような方法では、トランスポソームは溶液中にあってもよく、固体支持体上に固定されていなくてもよい。トランスポソームはまた、固体支持体（ビーズなど）上に固定されてもよく、ほとんどの区画は単一の固体支持体のみを含む。区画内のＤＮＡ分子は、区画内に存在する第１及び第２のトランスポソームを用いてタグメンテーションされるが、必ずしも表面に付着して二本鎖のタグ付けされた断片を生成するわけではない。
次いで、タグ付けされた断片は、一本鎖断片を調製するために変性され得、ハイブリダイゼーションが、１つの断片上のＸ配列と別の断片上のＸ’配列との間で可能になり得る。ハイブリダイゼーション後、伸長を行って、連結された配列決定鋳型を調製することができる。次いで、これらの連結された配列決定鋳型を配列決定することができる。
溶液相トランスポソームが使用される場合、この方法は、一本鎖断片がハイブリダイズ前に固定化されないため、（同じインサートの２つのコピーを含む連結された配列決定鋳型とは対照的に）２つの異なるインサート配列を含む連結された配列決定鋳型を生成する可能性が高い。これらの区画は、タグメンテーション前に一般に１つのＤＮＡ分子を含むか又はＤＮＡ分子を含まないように最適化され得るため、配列決定結果における２つの異なるインサート配列を有する連結された配列決定鋳型の存在は、これらの２つのインサート配列が単一のＤＮＡ分子に含まれる配列（すなわち、ＤＮＡ分子内の隣接配列又は近接配列）に由来することを推測するために使用され得る。
実施例１５．連結された配列決定鋳型を使用するメチル化分析
本明細書に記載される連結された配列決定鋳型は、メチル化分析のために使用され得る。
図４８は、メチル化シトシン及びヒドロキシメチル化シトシンを含むＤＮＡ断片が、連結された配列決定鋳型に組み込まれる方法を示す。この実施例では、元の二重鎖の「センス」鎖（ｓ）は、５’－Ｃ．Ａ．ｍＣ．Ｇ．ｈｍＣ．Ｇ．Ｔ－３’の塩基を含む配列を含有し、このとき、Ｃは非メチル化シトシン塩基を表し、ｍＣはメチル化シトシン塩基を表し、ｈｍＣはヒドロキシメチル化シトシンを表す。「アンチセンス鎖」（Ｓ’）は、センス鎖の相補体であり、これもメチル化されているため、３’－Ｇ．Ｔ．Ｇ．ｍＣ．Ｇ．ｈｍＣ．Ａ－５’である。非メチル化ｄＣＴＰヌクレオチドを使用してタンデムインサート鋳型に変換した後、「センス」鎖は、メチル化シトシンを有さない「センス」鎖のコピー（ｓ－コピー）にタンデムに連結され、その配列は、５’－Ｃ．Ａ．ｍＣ．Ｇ．ｈｍＣ．Ｇ．Ｔ－ｘ－Ｃ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ｔ－３’である。「アンチセンス鎖」（ｓ’）は同様に、メチル化シトシンを有さない「アンチセンス」鎖のコピー（ｓ’－コピー）にタンデムに連結され、その配列は、３’－Ｇ．Ｔ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．Ａ－ｘ’－Ｇ．Ｔ．Ｇ．ｍＣ．Ｇ．ｈｍＣ．Ａ－５’である。
次いで、連結された配列決定鋳型は、メチル化Ｃを同定するための変換プロセスを受け得る。
図４９に示されるように、連結された配列決定鋳型は、亜硫酸水素ナトリウム化学変換又はＥＭ－Ｓｅｑ等の酵素反応等を用いて、非メチル化ＣをＵに変換する化学反応に供されてもよい。
図５０Ａは、非メチル化ＣからＵへの変換後の、センス配列のコピー（ｓ－コピー）に連結された「センス」配列（ｓ）を含有する図４９に示される連結された配列決定鋳型の上鎖の結末を示す。ＰＣＲ後、ＵをＴに転換する。この一本鎖の連結された配列決定鋳型が配列決定され、「センス」配列（ｓ）がセンス配列のコピー（ｓ－コピー）と比較される場合、元の鋳型（タンデムインサート鋳型への変換前）の各塩基は、２つの「ベースコール」の「コード」によって表される。この「２塩基」コードは、元の鋳型のメチル化状態に依存する。したがって、図５０Ａの例では、元のセンス鎖（ｓ）の５’－Ｃ．Ａ．ｍＣ．Ｇ．ｈｍＣ．Ｇ．Ｔ－３’は、５’－（Ｔ，Ｔ）（Ａ，Ａ）（Ｃ，Ｔ）（Ｇ，Ｇ）（Ｃ，Ｔ）（Ｇ，Ｇ）（Ｔ，Ｔ）－３’としてコードされる。
図５０Ｂは同様に、非メチル化ＣからＵへの変換後の、アンチセンス配列のコピー（ｓ’－コピー’）に連結された「アンチセンス」配列（ｓ’）を含有する図４９に示される連結された配列決定鋳型の下鎖の結末を示す。ＰＣＲ後、ＵをＴに転換する。この一本鎖の連結された配列決定鋳型が配列決定される場合、元のアンチセンス鎖（ｓ）の３’－Ｇ．Ｔ．Ｇ．ｍＣ．Ｇ．ｈｍＣ．Ａ－５’は、３’（Ｇ，Ｇ）（Ｔ，Ｔ）（Ｇ，Ｇ）（Ｔ，Ｃ）（Ｇ，Ｇ）（Ｔ，Ｃ）（Ａ，Ａ）５’としてコードされる。
元の塩基の体系化は、図５０Ｃに示される方法を使用して、タンデムインサート鋳型の上鎖及び下鎖由来のリードからの「２塩基」コードを照合することによって、更に開発及び洗練される。これにより、元の二本鎖のメチル化状態が解読されることを可能にする「２×２塩基」コードを生成する。例えば、非メチル化シトシンを変換する亜硫酸水素塩などの化学物質が使用される図５０Ａの例では、（Ｔ，Ｔ）／（Ｇ，Ｇ）の上鎖／下鎖の「２×２塩基」コードは、元の塩基対が上鎖において非メチル化シトシンであり、下鎖においてグアニンであったことを識別する。対照的に、（Ｃ，Ｔ）／（Ｇ，Ｇ）のコードは、元の塩基対が上鎖においてメチル化シトシンであり、下鎖においてグアニンであったことを同定する。同様に、コード（Ｇ，Ｇ）／（Ｔ，Ｃ）は、元の塩基対が上鎖においてグアニンであり、下鎖においてメチル化シトシンであったことを同定する。このワークフローにおいて、メチル化シトシンは、ヒドロキシメチル化シトシンから区別することができない。
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７（４）：４２４－４２９（２０１９）に記載されるＴＡＰＳワークフローを使用して、図５１に示されるように、非メチル化シトシンではなくメチル化シトシンに対して変換が行われるメチル化分析も行うことができる。ＴＡＰＳは、修飾シトシンを、一般的なポリメラーゼによってＴとして「読み取る」ことができる、ほぼ天然塩基であるジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ）に変換する。「２×２塩基」コードは、図５２Ａ及び図５２Ｂに示されるように生成され、コードは異なるが、それらは依然として、メチル化状態が上述のように同定されることを可能にする（メチル化シトシンは、ヒドロキシメチル化シトシンと区別することができないが）。図５２Ａ及び図５２Ｂに示されるように、ＰＣＲはＤＨＵをＴに変換し、ミスマッチは特異的遺伝子座として（Ｃ，Ｔ）と読み取られる。図５２Ｃは、メチル化シトシンの変換後の連結された配列決定鋳型の評価の概要を示す。
図５３～図５４Ｃは、その全体が本明細書に組み込まれるＷｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９（５）：１０８１－１０８５（１９９１）に記載されるように、連結された配列決定鋳型を生成するためのポリメラーゼ伸長反応が、メチル化ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰを用いて行われる、種々の異なる方法を要約する。伸長の間に調製されたコピー配列は、ここではメチル化シトシンを有し得る（図５３）。ｓ又はｓ’鎖が５ｈＭＣを含む場合、ｓ－コピー又はｓ’－コピーは５ｍＣを含む。
メチル化ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰによる伸長を使用した連結された配列決定鋳型の調製後、非メチル化ＣのＵへの変換は、亜硫酸水素ナトリウム変換、酵素変換、又はボランベースの変換などの当技術分野で周知の方法のいずれかを用いて行うことができる（図５４）。ＰＣＲに続いて、上鎖（図５５Ａ）及び下鎖（図５５Ｂ）について示されるように、ＵをＴに変換する。図５５Ｃに示されるように、シトシンは、元のインサート由来のＴ及び所与の鎖におけるインサートのコピー由来のＣとして配列決定され、一方、メチル化シトシン又はヒドロキシメチル化シトシンは、元のインサート及び所与の鎖におけるインサートのコピーの両方由来のＣとして配列決定される。
図５６及び図５７Ａ～図５７Ｃは、メチル化ｄＣＴＰを含むｄＮＴＰによる伸長と共に、非メチル化シトシンを変換するための化学的又は生化学的方法（亜硫酸水素ナトリウム処理など）を使用するワークフローを示す。新たな「２×２塩基」コードが生成されることにより、メチル化状態を同定することが可能になる（メチル化シトシンは、ヒドロキシメチル化シトシンと区別することができないが）。図５７Ｃに示されるように、シトシンは、元のインサート由来のＣ及び所与の鎖におけるインサートのコピー由来のＴとして配列決定され、一方、メチル化シトシン又はヒドロキシメチル化シトシンは、元のインサート及び所与の鎖におけるインサートのコピーの両方由来のＴとして配列決定される。
方法はまた、シトシン、メチル化シトシン、及びヒドロキシメチル化シトシンを別々に同定するために使用され得る。図５８に示されるように、ポリメラーゼ伸長工程中にｄ－ＣＴＰを用いて生成された連結された配列決定鋳型は、ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）をグルコシル化－メチルシトシン（ｇｍＣ）に選択的に変換するβ－グルコシルトランスフェラーゼなどの酵素で処理することができる。この変換反応は、非メチル化シトシン又はメチル化シトシンでは起こらない。生成物は、ヘミメチル化ｍＣｐＧ／ＧｐＣモチーフを認識し、非メチル化Ｃをメチル化してｍＣｐＧ／ＧｐｍＣを形成するＤＮＭＴ１などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素で更に処理される。ＤＮＭＴ１は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ ５（２０１５）７４１－７４７に記載されているように、ヘミヒドロキシメチル化ＣｐＧ配列に対して活性を有さない。ＤＮＭＴ１処理後、図５９に示されるように、非メチル化シトシンのみを変換する変換（例えば、亜硫酸水素塩処理）を行ってもよい。ＰＣＲ及び配列決定の後、図６０Ａ～６０Ｃに概説されるように分析を行うことができる。図６０Ｃに示されるように、標的核酸由来のシトシンは、インサート及びインサートのコピーにおいてＴとして配列決定され、メチル化シトシンは、インサート及びインサートのコピーにおいてＣとして配列決定され、ヒドロキシメチル化シトシンは、インサートにおいてＣ及びインサートのコピーにおいてＴとして配列決定される。
方法はまた、メチル化シトシンのみの変換を使用して、シトシン、メチル化シトシン、及びヒドロキシメチル化シトシンを同定するために使用され得る。図６１に示されるように、連結された配列決定鋳型をＤＭＮＴ１で処理して、ヘミメチル化ｍＣｐＧ／ＧｐＣモチーフと反応させ、非メチル化Ｃをメチル化してｍＣｐＧ／ＧｐｍＣを形成することができる。次いで、連結された配列決定鋳型を処理して、メチル化ＣのみをＤＨＵに変換することができる（例えば、ＴＡＰＳによる）。ＰＣＲ後に調製した鋳型を図６２Ａ及び６２Ｂに示す。この方法を使用して、図６２Ｃに示されるように、標的核酸由来のシトシンは、インサート及びインサートのコピーにおいてＣとして配列決定され、メチル化シトシンは、インサート及びインサートのコピーにおいてＴとして配列決定され、ヒドロキシメチル化シトシンは、インサートにおいてＴ及びインサートのコピーにおいてＣとして配列決定される。
したがって、ユーザーは、所望のデータ、及びメチル化シトシンとヒドロキシメチル化シトシンとの区別を望むかどうかに基づいて、メチル化分析の決定された手段を選択することができる。
均等物
前述の明細書は、当業者が実施形態を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想到される最良の様式を説明する。しかしながら、前述の内容が本文にどれほど詳細にあらわれていても、実施形態は多くの方式で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、約という用語は、明示的に示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、割合、及び百分率を含む数値を指す。用語は、一般に、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能又は結果を有する）と同等であると考えられる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の±５～１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値又は範囲のリストの前にある場合、その用語はリスト内に提供される値又は範囲の全てを変更する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に丸められた数値を含んでもよい。

Claims (66)

  1. ポリヌクレオチドであって、
    ａ．第１のリードプライマー結合配列を含む５’末端ポリヌクレオチドと、
    ｂ．前記５’末端ポリヌクレオチドの３’側に位置する第１のインサート配列であって、標的核酸に由来する、第１のインサート配列と、
    ｃ．第２のリードプライマー結合配列及びハイブリダイゼーション配列を含む、前記第１のインサート配列の３’側に位置する連結配列と、
    ｄ．前記連結配列の３’側に位置する第２のインサート配列であって、前記標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は前記第１のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、第２のインサート配列と、
    ｅ．３’末端ポリヌクレオチド配列と、を含む、ポリヌクレオチド。
  2. ポリヌクレオチドであって、
    ａ．第１のリードプライマー結合配列を含む３’末端ポリヌクレオチドと、
    ｂ．標的核酸に由来する前記３’末端ポリヌクレオチドの５’側の第１のインサート配列と、
    ｃ．前記第１のリードプライマー結合配列に直交する第２のリードプライマー結合配列を含む連結配列であって、前記第２のリードプライマー結合配列がハイブリダイゼーション配列を含む、連結配列と、
    ｄ．前記連結配列の５’側にあり、前記標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は前記第１のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、第２のインサート配列と、
    ｅ．前記ポリヌクレオチドの５’末端にあり、付着配列を含む、付着ポリヌクレオチドと、を含み、
    前記３’末端ポリヌクレオチド、前記連結配列、及び前記付着ポリヌクレオチドは、前記標的核酸に由来しない、ポリヌクレオチド。
  3. 前記２つのインサート配列が、異なる標的核酸に由来する、請求項１又は請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記第１のインサート配列及び前記第２のインサート配列が、それぞれ独立して、４０～４００ヌクレオチド、１００～２００ヌクレオチド、又は１５０ヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記第１のリードプライマー結合配列が、第１のアダプター配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記第１のリードプライマー結合配列が、トランスポゾン末端配列の相補体を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記連結配列が、（ａ）前記ハイブリダイゼーション配列を含み、任意選択的に（ｂ）前記ハイブリダイゼーション単位の３’側のトランスポゾン末端配列と、前記ハイブリダイゼーション単位の５’側の前記トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記付着ポリヌクレオチドが、第２のアダプター配列と、任意選択的にトランスポゾン末端配列と、を含む、請求項２～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記３’末端ポリヌクレオチド及び／又は前記付着ポリヌクレオチドが、それぞれ独立して、バーコード配列、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列、捕捉配列、又は開裂配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記ポリヌクレオチドが、固体支持体上に固定されている、請求項２～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記第２のインサート配列と前記付着ポリヌクレオチドとの間に、前記標的核酸の非隣接配列に由来するか、又は前記他のインサート配列とは異なる標的核酸に由来する、前記５’末端のインサート配列と、リードプライマー結合配列を含む前記３’末端の連結配列と、を含む、少なくとも１つの挿入単位を含み、前記リードプライマー結合配列は、前記他のリードプライマー結合配列と直交している、請求項２～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. 請求項１、３～６、及び１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、その相補体と、を含む組成物であって、前記相補体が、
    ａ．第１の相補リードプライマー結合配列を含む、５’末端相補体と、
    ｂ．前記５’末端相補体の３’側に位置する、前記第２のインサート配列の相補配列と、
    ｃ．前記第２のインサート配列の前記相補配列の３’側に位置する相補連結配列であって、前記第２のインサート配列が、
    ｉ．第２の相補リードプライマー結合配列と、
    ｉｉ．相補ハイブリダイゼーション配列と、を含む、相補連結配列と、
    ｄ．前記相補連結配列の３’側に位置する前記第１のインサート配列の相補配列と、
    ｅ．３’末端相補体と、を含む、組成物。
  13. 請求項２～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドと、その相補体と、を含む組成物であって、前記相補体が、
    ａ．第１の相補リードプライマー結合配列を含む３’末端相補体であって、前記第１の相補リードプライマー結合配列は、前記第１のリードプライマー結合配列及び前記第２のリードプライマー結合配列に直交している、３’末端相補体と、
    ｂ．前記３’末端相補体の５’側にある前記第２のインサート配列の相補体と、
    ｃ．前記第２のインサート配列の前記相補体の５’側にあり、３’から５’への第２の相補リードプライマー結合配列を含む、相補連結配列であって、前記第２の相補リードプライマー結合配列は、前記第１のリードプライマー結合配列及び前記第２のリードプライマー結合配列、並びに前記第１の相補リードプライマー結合配列に直交している、相補連結配列と、
    ｄ．前記相補連結配列の５’側の前記第１のインサート配列の相補体と、
    ｅ．相補付着配列を含む、前記５’末端にある相補付着ポリヌクレオチドと、を含む、組成物。
  14. トランスポソーム複合体であって、
    ａ．トランスポザーゼと、
    ｂ．第１のリードプライマー結合配列の相補体を含む第１のトランスポゾンであって、前記第１のリードプライマー結合配列の相補体は、
    ｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
    ｉｉ．第１のアダプター配列の相補体と、を含む、第１のトランスポゾンと、
    ｃ．第２のトランスポゾンであって、
    ｉ．前記トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分と、
    ｉｉ．ハイブリダイゼーション配列の相補体と、を含む、第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体。
  15. トランスポソーム複合体であって、
    ａ．トランスポザーゼと、
    ｂ．付着ポリヌクレオチドを含む第１のトランスポゾンであって、前記付着ポリヌクレオチドは、
    ｉ．付着配列を含む５’部分と、
    ｉｉ．第２のリードプライマー結合配列を含む３’部分であって、
    ｉｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、
    ｉｖ．アダプターと、を含む、３’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、
    ｃ．第２のトランスポゾンであって、
    ｉ．前記トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分と、
    ｉｉ．ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のトランスポゾンと、を含む、トランスポソーム複合体。
  16. 請求項１４又は１５に記載のトランスポソーム複合体を含む組成物又はキット。
  17. 組成物又はキットであって、
    ａ．固体支持体であって、任意選択的に、前記任意選択の支持体はビーズである、固体支持体と、
    ｂ．トランスポソーム複合体を生成するための構成要素であって、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．オリゴヌクレオチド二本鎖を生成するためのオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドは、３’トランスポゾン末端配列と、５’の第１のアダプター配列と、を含み、第２のオリゴヌクレオチドは、５’トランスポゾン末端配列と、３’の第２のアダプター配列と、を含み、前記５’トランスポゾン末端配列は、前記３’トランスポゾン末端配列に相補的であり、前記第１のアダプター配列及び前記第２のアダプター配列は同じではない、オリゴヌクレオチドと、を含む、構成要素と、
    ｃ．ＰＣＲによって断片に付着配列及びハイブリダイゼーション配列を付加するための第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットであって、前記第１のプライマーセットは、断片にハイブリダイゼーション配列及び第１の付着配列を付加するためのプライマーを含み、前記第２のプライマーセットは、断片に相補ハイブリダイゼーション配列及び第２の付着配列を付加するためのプライマーを含み、前記第１の付着配列及び前記第２の付着配列は同じでない、第１のプライマーセット及び第２のプライマーセットと、を含む、組成物又はキット。
  18. 第１のフォーク型アダプター複合体及び第２のフォーク型アダプター複合体を含むアダプター組成物又はキットであって、
    前記第１のフォーク型アダプター複合体は、
    ａ．相補付着ポリヌクレオチドであって、
    ｉ．相補付着配列を含む５’部分と、
    ｉｉ．アダプターを含む３’部分と、を含む、相補付着ポリヌクレオチドと、
    ｂ．ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドであって、
    ｉ．前記アダプターの一部の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分と、
    ｉｉ．ハイブリダイゼーション配列の相補体と、を含み、前記ハイブリダイゼーション配列の前記相補体は、前記相補付着ポリヌクレオチドに相補的ではない、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと、を含み、
    前記第２のフォーク型アダプター複合体は、
    ａ．付着ポリヌクレオチドであって、
    ｉ．付着配列を含む５’部分と、
    ｉｉ．前記アダプターを含む３’部分と、を含む、付着ポリヌクレオチドと、
    ｂ．ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドであって、
    ｉ．前記アダプターの一部の相補体を含み、それにハイブリダイズする５’部分と、
    ｉｉ．ハイブリダイゼーション配列と、を含み、前記ハイブリダイゼーション配列は、前記付着ポリヌクレオチドに相補的ではない、ハイブリダイゼーションポリヌクレオチドと、を含む、アダプター組成物又はキット。
  19. 連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．第１のリードプライマー結合配列を、第１の標的核酸に由来する第１のインサート配列の３’末端に付着させることと、
    ｂ．前記第１のインサート配列の５’末端にハイブリダイゼーション配列を付着させることと、
    ｃ．前記ハイブリダイゼーション配列の相補体を、前記第１の標的核酸の不連続領域又は第２の標的核酸に由来する第２のインサート配列の３’末端に付着させることと、
    ｄ．前記ハイブリダイゼーション配列を前記ハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、
    ｅ．前記ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することと、を含み、
    前記第１のインサート配列と前記第２のインサート配列との間の領域は、第2のリードプライマー結合配列であって、前記ハイブリダイゼーション配列を含み、前記第１のリードプライマー結合配列に直交する、第２のリードプライマー結合配列を含み、
    それにより、連結された核酸配列決定鋳型を生成する、方法。
  20. 連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．第１の標的核酸を含む第１の試料を、第１のトランスポソーム複合体及び第２のトランスポソーム複合体と接触させることであって、
    各トランスポソーム複合体が、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分及びアダプター配列を含む５’部分を含む、第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含み、それにハイブリダイズする第２のトランスポゾンと、を含み、
    前記第１のトランスポソーム複合体中の前記アダプター配列は、第１のアダプター配列の相補体であり、前記第２のトランスポソーム複合体中の前記アダプター配列は、第２のアダプター配列であり、
    前記第１の標的核酸を断片化して、一方の末端が前記第１のトランスポソーム複合体の前記トランスポゾンでタグ付けされ、他方の末端が前記第２のトランスポソーム複合体の前記トランスポゾンでタグ付けされた、前記第１の標的核酸由来のインサート配列を含む第１のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
    ｂ．任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、前記第１のタグ付き生成物の３’末端に相補付着配列を付加し、前記第１のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第１の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
    ｃ．第２の標的核酸を含む第２の試料を前記トランスポソーム複合体と接触させることであって、前記第２の標的核酸を断片化して、一方の末端が前記第１のトランスポソーム複合体の前記トランスポゾンでタグ付けされ、他方の末端が前記第２のトランスポソーム複合体の前記トランスポゾンでタグ付けされた、前記第２の標的核酸由来のインサート配列を含む第２のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
    ｄ．任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、前記第２のタグ付き生成物の３’末端に付着配列を付加し、前記第２のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列を付加して、第２の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
    ｅ．前記第１の修飾されたタグ付き生成物の前記ハイブリダイゼーション配列を、前記第２の修飾されたタグ付き生成物中の前記ハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、
    ｆ．前記ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することであって、前記連結された核酸配列決定鋳型は、
    ｉ．前記第２の標的核酸由来の前記インサート配列の３’側にある、第１のリードプライマー結合配列であって、前記第１のアダプター配列と、前記トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、第１のリードプライマー結合配列と、
    ｉｉ．前記２つのインサート配列の間にある第２のリードプライマー結合配列であって、前記トランスポゾン末端配列と、前記ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のリードプライマー結合配列と、を含み、
    前記第１のリードプライマー結合配列は、前記第２のリードプライマー結合配列に直交する、ことと、を含む、方法。
  21. 連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．第１の標的核酸を含む第１の試料を第１のトランスポソーム複合体と接触させることであって、前記第１のトランスポソーム複合体は、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、付着配列及び第１のアダプター配列の相補体を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含み、それにハイブリダイズする第２のトランスポゾンと、を含み、
    前記第１の標的核酸を断片化して、各末端が前記第１のトランスポソーム複合体の前記トランスポゾンでタグ付けされた、前記第１の標的核酸由来のインサート配列を含む第１のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
    ｂ．任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、前記第１のタグ付き生成物の５’末端にハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第１の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
    ｃ．第２の標的核酸を含む第２の試料を第２のトランスポソーム複合体と接触させることであって、前記第２のトランスポソーム複合体は、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．トランスポゾン末端配列を含む３’部分と、第２のアダプター配列及び相補付着配列を含む５’部分と、を含む、第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記トランスポゾン末端配列の相補体を含む５’部分を含み、それにハイブリダイズする第２のトランスポゾンと、を含み、
    前記第２の標的核酸を断片化して、各末端が前記第２のトランスポソーム複合体の前記トランスポゾンでタグ付けされた、前記第２の標的核酸由来のインサート配列を含む第２のタグ付き生成物を生成するのに十分な条件下で行う、ことと、
    ｄ．任意選択的にポリメラーゼ連鎖反応によって、前記第２のタグ付き生成物の５’末端に前記ハイブリダイゼーション配列の相補体を付加して、第２の修飾されたタグ付き生成物を形成することと、
    ｅ．前記第１の修飾されたタグ付き生成物の前記ハイブリダイゼーション配列を、前記第２の修飾されたタグ付き生成物中の前記ハイブリダイゼーション配列の相補体にアニーリングして、ハイブリダイズした付加物を形成することと、
    ｆ．前記ハイブリダイズした付加物から完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することであって、前記連結された核酸配列決定鋳型は、
    ｉ．前記第２の標的核酸由来の前記インサート配列の３’側にある、第１のリードプライマー結合配列であって、前記第１のアダプター配列と、前記トランスポゾン末端配列の相補体と、を含む、第１のリードプライマー結合配列と、
    ｉｉ．前記２つのインサート配列の間にある第２のリードプライマー結合配列であって、前記トランスポゾン末端配列と、前記ハイブリダイゼーション配列と、を含む、第２のリードプライマー結合配列と、を含み、
    前記第１のリードプライマー結合配列は、前記第２のリードプライマー結合配列に直交する、ことと、を含む、方法。
  22. 連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．
    ｉ．第１の標的核酸を含む第１の二本鎖ポリヌクレオチドを第１の制限酵素と、かつ、
    ｉｉ．第２の標的核酸を含む第２の二本鎖ポリヌクレオチドを第２の制限酵素と、接触させ、
    適合性オーバーハングを有する第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを産生することであって、前記制限酵素は、ＩＩ型、ＩＩＳ型、ＩＩＰ型、及びＩＩＴ型制限酵素から選択される、ことと、
    ｂ．リガーゼを使用して、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドの前記適合性オーバーハングを付着させることと、を含む、方法。
  23. 前記接触工程の前に、
    ａ．前記第１の制限酵素切断部位を、任意選択的にアダプターを使用することによって、第１の標的核酸に付着させ、プライマー伸長によって前記第１の二本鎖ポリヌクレオチドを生成することと、
    ｂ．前記第２の制限酵素切断部位を、任意選択的にアダプターを使用することによって、第２の標的核酸に付着させ、プライマー伸長によって前記第２の二本鎖ポリヌクレオチドを生成することと、が行われる、請求項２２に記載の方法。
  24. 連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．第１の核酸供給源及び第２の核酸供給源を剪断又は消化して、核酸断片の第１のライブラリー及び核酸断片の第２のライブラリーをそれぞれ生成することと、
    ｂ．前記第１の核酸供給源由来の各核酸断片に第１のアダプターを付着させ、前記第２の核酸供給源由来の各核酸断片に第２のアダプターを付着させることであって、
    ｉ．前記核酸断片を第１のポリメラーゼと接触させて、平滑末端を有する核酸断片を生成することと、
    ｉｉ．キナーゼを用いて前記核酸断片の５’－ヒドロキシルをリン酸化することと、
    ｉｉｉ．第２のポリメラーゼを用いて前記核酸断片に３’アデニンを付加することと、
    ｉｖ．前記第１のアダプターを前記第１のライブラリーの各核酸断片にライゲーションし、前記第２のアダプターを前記第２のライブラリーの各核酸断片にライゲーションすることと、を含む、ことと、
    ｃ．任意選択的にＰＣＲによって、前記第１の核酸ライブラリー及び前記第２の核酸ライブラリーを混合しアニーリングすることであって、
    ｉ．前記核酸が高温で変性し、
    ｉｉ．Ａ及びＡ’配列がより低温で互いにハイブリダイズする、ことと、
    ｄ．任意選択的にＰＣＲによって、完全二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を合成することと、を含む、方法。
  25. 連結された核酸配列決定鋳型を配列決定する方法であって、
    ａ．第１のリードプライマー結合配列に相補的な第１のリード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの第１のインサート配列を配列決定することと、
    ｂ．第２のリードプライマー結合配列に相補的な第２のリード配列決定プライマーを用いて配列決定を開始することによって、第２のインサート配列を配列決定することと、を含む、方法。
  26. １つ以上の標的二本鎖核酸を含む試料を複数の異なる区画に区画化することを含み、連結された核酸配列決定鋳型を生成することが前記異なる区画内で行われる、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. ポリヌクレオチドであって、
    ａ．第１のリード配列決定プライマー配列を含む５’末端ポリヌクレオチドと、
    ｂ．標的核酸に由来するインサート配列であって、前記５’末端ポリヌクレオチドの３’側にある、インサート配列と、
    ｃ．前記インサート配列の３’側にあるハイブリダイゼーション配列、又は、
    ｄ．前記ハイブリダイゼーション配列の３’側の前記インサート配列のコピー若しくは前記ハイブリダイゼーション配列の３’側の第２のインサート配列と、
    ｅ．第２のリード配列決定プライマー配列の相補体を含む３’末端ポリヌクレオチドと、を含む、ポリヌクレオチド。
  28. 前記ポリヌクレオチドが、
    ａ．５’－Ｐ５－Ａ１４－インサート－ＨＹＢ－インサート－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’、
    ｂ．５’－Ｐ７－Ｂ１５－インサート－ＨＹＢ’－インサート－Ａ１４’－Ｐ５’－３’、
    ｃ．５’－Ｐ５－Ａ１４－インサート１－ＨＹＢ－インサート２－Ｂ１５’－Ｐ７’－３’、又は
    ｄ．５’－Ｐ７－Ｂ１５－インサート１－ＨＹＢ’－インサート２－Ａ１４’－Ｐ５’－３’の構造を有し、ＨＹＢはハイブリダイゼーション配列であり、ＨＹＢ’はハイブリダイゼーション配列の相補体である、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
  29. ２つのポリヌクレオチド鎖を含むフォーク型アダプターであって、
    ａ．配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、
    ｂ．３’ハイブリダイゼーション配列又はその相補体を含む第２の鎖と、を含み、前記第１の鎖の３’末端は前記第２の鎖の５’末端に完全に又は部分的に相補的であり、前記ハイブリダイゼーション配列又はその相補体は、前記ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合している、フォーク型アダプター。
  30. 前記第１の鎖が、固体支持体又はビーズ上の親和性結合パートナーに結合することができる５’親和性エレメントを含み、任意選択的に、前記親和性エレメントは、前記第１の鎖に付着したリンカーを介して接続されている、請求項２９に記載のフォーク型アダプター。
  31. 請求項２９又は３０のいずれか一項に記載の２つのフォーク型アダプターを含む組成物又はキットであって、
    ａ．第１のフォーク型アダプターは、第１のリード配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、ハイブリダイゼーション配列の相補体を含む第２の鎖と、を含み、
    ｂ．第２のフォーク型アダプターは、第２のリード配列決定プライマー配列を含む第１の鎖と、ハイブリダイゼーション配列を含む第２の鎖と、を含み、
    一方又は両方のフォーク型アダプターが、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、組成物又はキット。
  32. １つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．標的核酸から調製されたインサートをそれぞれ含む二本鎖核酸断片を含む試料を、２つのフォーク型アダプターを含む請求項１８又は２９～３１のいずれか一項に記載の組成物又はキットと接触させることであって、一方又は両方のフォーク型アダプターは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことと、
    ｂ．前記フォーク型アダプターを前記二本鎖断片にライゲーションして、タグ付けされた二本鎖断片を調製することと、
    ｃ．前記タグ付けされた二本鎖断片を固体支持体上に固定することと、
    ｄ．（１）固定された一本鎖断片を生成するために前記固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するために前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、
    ｅ．２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中の前記ハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、
    ｆ．各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の固定された一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法。
  33. １つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．二本鎖標的核酸を含む試料を、溶液中のトランスポソーム複合体の２つのプールと接触させることであって、前記トランスポソーム複合体の第１のプールは、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含み、前記トランスポソーム複合体の第２のプールは、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含み、一方又は両方の第２のトランスポゾンは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことと、
    ｂ．前記二本鎖核酸をタグメンテーションして、タグ付けされた二本鎖断片を生成することと、
    ｃ．前記トランスポソーム複合体を前記二本鎖断片から遊離させることと、
    ｄ．前記二本鎖断片を伸長し、ライゲーションすることと、
    ｅ．前記タグ付けされた二本鎖断片を固体支持体上に固定することと、
    ｆ．（１）固定された一本鎖断片を生成するために前記固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、及び、（２）ハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するために前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、
    ｇ．２つの固定された一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中の前記ハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、
    ｈ．各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の固定された一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法。
  34. 前記トランスポソーム複合体の第１のプール又は第２のプールが、請求項１５に記載のトランスポソーム複合体を含み、前記第１のリード配列決定アダプター配列が、第１のリードプライマー結合配列を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. １つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．標的二本鎖核酸を含む試料を、複数の異なる区画内に区画化することと、
    ｂ．前記複数の異なる区画内の前記二本鎖核酸由来のインサートをそれぞれ含む、断片を調製することと、
    ｃ．前記複数の異なる区画を、２つのフォーク型アダプターを含む請求項１８又は２９～３１のいずれか一項に記載の組成物又はキットと接触させることであって、一方又は両方のフォーク型アダプターは、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含む、ことと、
    ｄ．前記フォーク型アダプターを前記二本鎖断片にライゲーションして、前記複数の異なる区画内のタグ付けされた二本鎖断片を調製することと、
    ｅ．（１）一本鎖断片を生成するために前記固定されたタグ付けされた二本鎖断片を、並びに、（２）前記複数の異なる区画内のハイブリダイゼーション配列及びハイブリダイゼーション配列の相補体をブロック解除するために前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを、変性させることと、
    ｆ．前記同じ区画内の２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせて、第１の断片中の前記ハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって架橋を形成することと、
    ｇ．各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、前記同じ区画内の両方の一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法。
  36. 前記区画が、ウェル、チューブ、若しくは液滴であり、かつ／又は、前記同じ連結された配列決定鋳型に含まれるインサートが、前記同じ標的核酸から調製された、請求項２６又は３５に記載の方法。
  37. 前記区画化することが、最も相違するハプロタイプを異なる区画内に分離し、前記方法が、ハプロタイプフェージングのために使用される、請求項２６、３５、又は３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 固定されたトランスポソーム複合体の２つのプールを含む固体支持体であって、
    ａ．前記トランスポソーム複合体の第１のプールは、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列、第１のリード配列決定アダプター配列、及び５’親和性部分を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含み、前記トランスポソーム複合体の第２のプールは、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列、第２のリード配列決定アダプター配列、及び５’親和性部分を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含み、各第１のトランスポゾンは、前記固体支持体の表面上の結合部分への５’親和性部分の結合によって固定されている、固体支持体。
  39. 前記トランスポソーム複合体の第１のプール又は第２のプールが、請求項１５のいずれか一項に記載のトランスポソーム複合体を含み、前記第１のリード配列決定アダプター配列が、第１のリードプライマー結合配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. １つ以上の二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．請求項３８又は３９に記載の固体支持体に固定されている二本鎖核酸を含む試料を適用することと、
    ｂ．前記二本鎖核酸をタグメンテーションして、前記二本鎖核酸由来のインサートを含むタグ付けされた二本鎖断片を生成することであって、前記二本鎖断片は、前記固体支持体の表面上の結合部分への５’親和性部分の結合によって前記固体支持体に固定されている、ことと、
    ｃ．前記トランスポソーム複合体を前記二本鎖断片から遊離させることと、
    ｄ．前記二本鎖断片を伸長し、ライゲーションすることと、
    ｅ．前記二本鎖断片を一本鎖断片に変性させることであって、５’親和性部分を含む一本鎖断片は、前記固体支持体上に固定されたままである、ことと、
    ｆ．第１の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列を、第２の固定された一本鎖断片に含まれるハイブリダイゼーション配列の相補体にハイブリダイズさせ、それによって架橋を形成することと、
    ｇ．二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を伸長し、生成することと、を含む、方法。
  41. 前記第１の固定された断片及び前記第２の固定された断片が、前記固体支持体上に近接して固定されており、近接していることにより、前記第１の固定された断片に含まれる前記ハイブリダイゼーション配列に含まれる４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、若しくは１０個以上のヌクレオチドは、前記第２の固定された断片に含まれる前記ハイブリダイゼーション配列の相補体に含まれるヌクレオチドに結合することが可能になる、又は、前記第１の固定された断片及び前記第２の固定された断片が、前記固体支持体の表面上で互いに２０～５００ナノメートル以内に固定されている、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第１の固定された断片及び前記第２の固定された断片の両方が、前記同じ二本鎖核酸から調製され、前記二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型が、前記同じ二本鎖核酸由来の２つのインサートを含む、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。
  43. 前記２つのインサートが、前記同じ二本鎖核酸に含まれる２つの近接配列に由来し、前記近接配列は、前記二本鎖核酸中の１００以下のヌクレオチド、２００以下のヌクレオチド、３００以下のヌクレオチド、４００以下のヌクレオチド、５００以下のヌクレオチド、７００以下のヌクレオチド、又は１，０００以下のヌクレオチドによって隔てられている、請求項４２に記載の方法。
  44. ａ．前記固体支持体から二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を遊離させることと、
    ｂ．前記鋳型を配列決定して、前記鋳型に含まれるインサート配列を決定することと、を更に含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. １つ以上の連結された核酸配列決定鋳型を生成する方法であって、
    ａ．標的二本鎖核酸を含む試料を、複数の異なる区画内に区画化することと、
    ｂ．前記二本鎖核酸をタグメンテーションして、前記複数の異なる区画内の前記二本鎖核酸由来のインサートを含むタグ付けされた二本鎖断片を生成することであって、前記タグメンテーションは、トランスポソーム複合体の２つのプールを用いて実施され、前記トランスポソーム複合体の第１のプールは、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列及び第１のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及びハイブリダイゼーション配列の３’相補体を含む第２のトランスポゾンと、を含み、
    前記トランスポソーム複合体の第２のプールは、
    ｉ．トランスポザーゼと、
    ｉｉ．３’トランスポゾン末端配列及び第２のリード配列決定アダプター配列を含む第１のトランスポゾンと、
    ｉｉｉ．前記３’トランスポゾン末端配列に完全に又は部分的に相補的な５’配列及び３’ハイブリダイゼーション配列を含む第２のトランスポゾンと、を含む、ことと、
    ｃ．前記タグ付けされた二本鎖断片を変性させて、一本鎖断片を生成することと、
    ｄ．第１の断片中の前記ハイブリダイゼーション配列を第２の断片中のハイブリダイゼーション配列の相補体に結合させることによって、前記同じ区画内の２つの一本鎖断片を互いにハイブリダイズさせることと、
    ｅ．各一本鎖断片の３’末端から伸長させて、両方の一本鎖断片由来のインサートを含む二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型を生成することと、を含む、方法。
  46. 二本鎖の連結された核酸配列決定鋳型が、前記同じ区画に存在する２つの一本鎖断片のハイブリダイゼーションからのみ生成される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体が、前記ハイブリダイゼーション配列又はその相補体に完全に又は部分的に相補的であるブロッキングオリゴヌクレオチドに結合しており、前記変性させることが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドを変性させて前記ハイブリダイゼーション配列及び／又はその相補体をブロック解除することを含む、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
  48. 前記区画化することが、最も相違するハプロタイプを異なる区画内に分離し、前記方法が、ハプロタイプフェージングのために使用される、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記鋳型を配列決定することを更に含む、請求項１９～２４、２６、３２～３７、又は３９～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 配列決定が、Ａ１４、Ｂ１５、及び／又はハイブリダイゼーション配列（ＨＹＢ）に結合する配列決定プライマーを使用して行われ、任意選択的に、配列決定が暗サイクルを含み、データが配列決定の一部について記録されていない、請求項４９に記載の方法。
  51. ａ．前記同じ鋳型に含まれるインサートの配列を評価することと、
    ｂ．前記同じ鋳型に含まれるインサートに基づいて、前記二本鎖核酸に含まれる配列についての近接データを決定することと、を更に含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 前記近接データが、インサート配列（又はその相補体）が前記同じ標的核酸に含まれていたことを決定する、請求項５１に記載の方法。
  53. ａ．異なる鋳型から調製された所与のインサートの複数の配列の配列決定結果を評価することと、
    ｂ．前記配列決定データに基づいて、非標準塩基対形成の事象を決定することであって、前記配列決定データは、
    ｉ．前記同じ連結された配列決定鋳型に含まれる前記インサート及びその相補体、並びに／又は、
    ｉｉ．複数の連結された配列決定鋳型に含まれる前記インサートからのものである、ことと、を更に含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. ａ．異なる鋳型から調製された所与のインサートの複数の配列の配列決定結果を評価することと、
    ｂ．前記配列決定データに基づいて、このインサートに関する配列決定結果におけるエラーを補正することであって、前記配列決定データは、
    ｉ．前記同じ連結された配列決定鋳型に含まれる前記インサート及びその相補体、並びに／又は、
    ｉｉ．複数の連結された配列決定鋳型に含まれる前記インサートからのものである、ことと、を更に含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 連結された配列決定鋳型に含まれるインサート配列に含まれる修飾シトシンを同定する方法であって、
    ａ．二本鎖の連結された配列決定鋳型を調製することであって、各鎖はインサート配列及び前記インサート配列のコピーを含み、前記２つの鎖は互いに相補的である、ことと、
    ｂ．前記二本鎖の連結された配列決定鋳型を、修飾及び／又は非修飾シトシンを改変する条件に供することと、
    ｃ．前記二本鎖の連結された配列決定鋳型の各鎖のアンプリコンを調製することと、
    ｄ．アンプリコンを配列決定し、各鎖から生成された前記アンプリコン中の前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピーに関する配列決定結果を評価することと、
    ｅ．前記二本鎖の連結された配列決定鋳型の各鎖の配列に基づいて、前記インサート配列に含まれる修飾シトシンの位置を決定することと、を含む、方法。
  56. 前記修飾シトシンが、メチル化又はヒドロキシメチル化シトシンである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記連結された配列決定鋳型が、請求項１９～２４、２６、３２～３７、又は３９～４８のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. 前記二本鎖の連結された配列決定鋳型を生成するための伸長が、メチル化ｄＣＴＰを含む反応溶液を用いて行われる、請求項５７に記載の方法。
  59. 修飾シトシン又は非修飾シトシンが改変され、任意選択的に、修飾シトシンがＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）処理によって改変されるか、又は非修飾シトシンが亜硫酸水素ナトリウム若しくは酵素処理によって改変される、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 修飾シトシンが改変され、修飾シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｔ，Ｃ）の存在によって決定され、非修飾シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｃ，Ｃ）の存在によって決定され、前記修飾シトシン及び前記非修飾シトシンが、相補鎖中のＧ’と対形成している、請求項５９に記載の方法。
  61. 非修飾シトシンが改変され、修飾シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｃ，Ｔ）の存在によって決定され、非修飾シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｔ，Ｔ）の存在によって決定され、前記修飾シトシン及び前記非修飾シトシンが、相補鎖中のＧ’と対形成している、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記方法が、メチル化シトシンの位置をヒドロキシメチル化シトシンから区別する、請求項５９に記載の方法。
  63. 修飾シトシン及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を供することが、
    ａ．各鎖をβ－グリコシルトランスフェラーゼと反応させることと、
    ｂ．各鎖をＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）と反応させることと、
    ｃ．各鎖を、非修飾シトシンをウラシルに変換する条件で反応させることと、を含む、請求項６２に記載の方法。
  64. ａ．メチル化シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｃ，Ｃ）の存在によって決定され、
    ｂ．ヒドロキシメチル化シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｃ，Ｔ）の存在によって決定され、
    ｃ．非修飾シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｔ，Ｔ）の存在によって決定され、
    前記メチル化シトシン、前記ヒドロキシメチル化シトシン、及び前記非修飾シトシンは、相補鎖中のＧ’と対形成している、請求項６３に記載の方法。
  65. 修飾シトシン及び／又は非修飾シトシンを改変するための条件に各鎖を前記供することが、
    ａ．各鎖をＤＮＭＴと反応させることと、
    ｂ．各鎖を、メチル化シトシンをジヒドロキシウラシル（ＤＨＵ）に変換する条件で反応させることと、を含む、請求項６２に記載の方法。
  66. ａ．メチル化シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｔ，Ｔ）の存在によって決定され、
    ｂ．ヒドロキシメチル化シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｔ，Ｃ）の存在によって決定され、
    ｃ．非修飾シトシンの位置が、それぞれ前記インサート配列及び前記インサート配列の前記コピー中の（Ｃ，Ｃ）の存在によって決定され、
    前記メチル化シトシン、前記ヒドロキシメチル化シトシン、及び前記非修飾シトシンは、相補鎖中のＧ’と対形成している、請求項６５に記載の方法。
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