CN105358715B - 正交合成测序 - Google Patents

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Abstract

一种用于测序的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供第一核酸模板和第二核酸模板，其中两种模板具有不同的序列；(b)使用第一聚合酶类型和第一核苷酸类似物组使与第一模板结合的第一引物延伸；(c)使用第二聚合酶类型和第二核苷酸类似物组使与第二模板结合的第二引物延伸，其中第一聚合酶类型不同于第二聚合酶类型，且其中第一核苷酸类似物组不同于第二核苷酸类似物组；(d)检测第一引物延伸产物和第二引物延伸产物；及(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定第一模板和第二模板的不同序列。

Description

正交合成测序
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年7月3日提交的美国临时专利申请号61/842,501的优先权的权益，其在此通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开内容一般性地涉及核酸分析，且更具体地涉及核酸测序。
背景
目前用于对DNA测序的可用的商业平台相对地昂贵。这些平台使用‘合成测序(sequencing-by-synthesis)’方法，这样命名是因为在检测每个单体(即，核苷酸)向生长的聚合物结构的添加的同时合成DNA聚合物。因为模板DNA链严格地指导新的DNA聚合物的合成，技术人员能够从在合成期间添加到生长的链的一系列核苷酸单体推断出模板DNA的序列。检测单体添加的能力被生化成分的经特别工程化的变体所促进，所述生化成分通常在生物系统中进行DNA合成。这些工程化的成分的制备相对昂贵且在合成测序期间被相对大量地消耗。此外，监控反应使用相对昂贵的硬件，诸如激光器、检测光学器件和复杂的流体递送系统。目前最成功的商业平台也需要昂贵的试剂和硬件以在合成测序恰好能够开始前扩增DNA模板。这些平台的复杂性和花费已经阻碍了它们在对该技术存在明显需求的一些临床和研究背景中的使用。
因此，存在对合成测序平台改进的需求以使它们更具成本效益、更快速且更便利。本公开内容解决了这一需求并且还提供了其他优势。
概述
本公开内容提供了一种用于对核酸模板测序的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供位点的阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列；(b)使用第一聚合酶类型和第一核苷酸类似物组，使与所述第一模板结合的第一引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生具有第一核苷酸类似物的第一引物延伸产物；(c)使用第二聚合酶类型和第二核苷酸类似物组，使与所述第二模板结合的第二引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生具有第二核苷酸类似物的第二引物延伸产物，其中所述第一聚合酶类型不同于所述第二聚合酶类型且其中所述第一核苷酸类似物组不同于所述第二核苷酸类似物组；(d)检测在所述位点的每一个处的所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物；以及(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定在所述位点的每一个处的所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
本文还提供了用于对核酸模板测序的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列；(b)使用第一聚合酶类型和第一核苷酸类似物组，使与所述第一模板结合的第一引物延伸，从而产生具有第一核苷酸类似物的第一引物延伸产物；(c)使用第二聚合酶类型和第二核苷酸类似物组，使与所述第二模板结合的第二引物延伸，从而产生具有第二核苷酸类似物的第二引物延伸产物，其中所述第一聚合酶类型不同于所述第二聚合酶类型且其中所述第一核苷酸类似物组不同于所述第二核苷酸类似物组；(d)使用检测器检测所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物，所述检测器具有低于所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物之间的空间间隔的分辨率；以及(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
附图简述
图1示出了包括检测步骤(图1A)和聚合酶延伸步骤(图1B)的正交合成测序(sequencing-by-orthogonal-synthesis)反应的示意图。
图2A示出了可用于1-染料正交合成测序反应的示例性的可逆终止子脱氧核糖核苷酸(d-FFN)和可逆终止子核糖核苷酸(r-FFN)的组。
图2B示出了用于1-染料正交合成测序反应的反应循环的示意图，包括在2个不同发射通道中检测到的信号的模拟数据。
图3A示出了可用于2-染料正交合成测序反应的示例性的可逆终止子脱氧核糖核苷酸(d-FFN)和可逆终止子核糖核苷酸(r-FFN)的组。
图3B示出了用于2-染料正交合成测序反应的反应循环的示意图，包括在4个不同发射通道中检测到的信号的模拟数据。
图4示出了用于制备用于正交合成测序反应的模板的方法的示意图。
图5示出了用于正交合成测序的配对末端格式的构建体。
详述
本公开内容提供了一种用于高密度核酸检测的方法。本公开内容的方法的特定实施方案利用了用于操作和检测核酸的已知技术。但是，以下示出的改进提供了正交处理，以使得从使用这些技术获得的信息的密度增加。
基于引物延伸的检测技术的实例例证了所能够获得的信息的增加的密度。具体地，核酸的靶序列可与引物杂交，且所述引物通过DNA聚合酶延伸以添加带标记的核苷酸。阵列格式可与多位点一起使用，每个位点具有单个靶序列，所述单个靶序列不同于在其他位点处存在的靶序列。各自具有可区分的标记物的若干不同的核苷酸类型也任选地被使用。引物延伸导致标记的核苷酸被招募到具有靶序列的核酸。在其中使用不同的标记的核苷酸的阵列格式中，技术人员能够区分被招募到每个位点的标记物，并使用这一信息鉴定在该位点处的靶核酸。从该阵列格式获得的信息的密度是每个位点一个鉴定的靶序列。
在本公开内容的正交格式中，阵列的每一个位点可包含两种或更多种不同靶序列，所述两种或更多种不同靶序列可同时检测并且可彼此区分。在这种情况下，来源于阵列的信息可至少被加倍。例如，两种不同引物可与每个个体位点处的两种不同靶序列杂交。第一引物可以是DNA引物，其能够通过使用DNA聚合酶添加标记的脱氧核糖核苷酸而被延伸，且第二引物可以是RNA引物，其能够通过使用DNA聚合酶添加标记的核糖核苷酸而被延伸。从DNA引物延伸试剂不会与RNA引物交叉反应且RNA引物延伸试剂不会与DNA引物交叉反应这个意义上来说，用于延伸DNA引物的试剂正交于用于延伸RNA引物的试剂。脱氧核糖核苷酸可具有标记物，该标记物与在核糖核苷酸上的标记物可区分。产生的在生化反应中的正交性和标记物管理允许在每个位点将DNA引物延伸事件与RNA引物延伸事件相区分。因此，两种靶序列可被可区分地检测出。
正交性可起因于对两种不同检测事件赋予选择性的多种生化成分或反应条件中的任一种。如由使用DNA聚合酶和RNA聚合酶的反应所例示的，正交性可来源于两种不同的聚合酶对不同的引物类型以及对不同种类的核苷酸的特异性。在一些实施方案中，正交性可以替代性地来源于不同聚合酶对特定类型的模板(例如DNA对比RNA)的选择性，无论聚合酶是否对特定类型的引物或核苷酸种类是选择性的。因此，使用不同聚合酶可以是可能的，所述不同聚合酶用脱氧核糖核苷酸延伸DNA引物，但分别对DNA模板和RNA模板具有不同的选择性。例如，DNA聚合酶通常对DNA模板是选择性的，并且逆转录酶通常对RNA模板是选择性的；然而，这两种酶都可使用DNA引物和脱氧核糖核苷酸。预期将天然和/或工程化的聚合酶的组合用在正交反应系统中。
以上例示的基于引物延伸的检测技术的正交性的概念可容易地应用到合成测序(SBS)技术。如在图1A和1B中所图解的，以及如在下面进一步详细示出的，可使用正交引物、聚合酶和核苷酸进行每个SBS循环以提供来自在SBS技术中使用的流通池或其他基质的增加的信息获取。为了说明的目的，将举例说明正交性用于测序方法，称为“正交合成测序”(SBOS)；然而，如在下面进一步详细示出的，其他方法也可从正交操作和检测中获益。然而，不需要将本文示出的组合物、装置和方法限于测序应用。
可以利用正交性以将信息获取的密度增加2倍或更多。例如，信息密度多于2倍的增加可通过使用多于两种正交试剂组获得。作为实例，可以使用3种试剂组，包括：(1)基于DNA聚合酶的延伸试剂、(2)基于RNA聚合酶的延伸试剂及(3)与HNA(1,5失水己糖醇核酸)偶联的工程化的聚合酶。
如以上证明的，以及如将在下面进一步详细示出的，本公开内容提供了阵列的超分辨率成像的优势，其中在给定位点的可同时分辨的靶序列的数目大于一。超分辨率成像可提供同时区分大于阵列上的位点数的许多不同靶核酸的益处。相似地，之所以提供了超分辨率是由于能够使用检测器区分固相基质上的两种不同靶序列，所述检测器具有低于否则区分基质上两种靶序列所需的空间分辨率的分辨率。
在特定实施方案中，本公开内容提供了用于有效的核酸检测的试剂和硬件配置。示例性配置使用比在引物延伸步骤中待被区分的核苷酸类型的数目更少的标记物。例如，基于单个标记类型的检测可区分四种类型的脱氧核糖核苷酸。如在下面进一步详细示出的，这可通过使用包括以下四种类型的第一核苷酸组实现：(1)具有第一标记物的类型、(2)具有配体的类型、(3)具有可裂解的与第一标记物的连键的类型及(4)缺少在随后步骤中使用的任何标记物或配体的类型。正交核苷酸组(例如，正交于脱氧核糖核苷酸的核糖核苷酸)可包括以下四种类型：(5)具有第二标记物的类型、(6)具有第一标记物和第二标记物的混合物的类型、(7)具有可裂解的与第二标记物的连键的类型及(8)缺少在随后步骤中使用的任何标记物或配体的类型。基于适当计算在特定流体步骤后什么标记物出现或消失，每个组中的类型可彼此区分，且基于两种不同标记物可区分两种正交核苷酸组。回到以上8种类型的实例，类型(1)和(5)可基于不同标记物彼此区分，且因为它们在最初的标记步骤后的显现和它们对裂解剂的耐受性，它们可与所有其他类型相区分；类型(2)可基于在与标记的受体孵育后标记物的显现被区分；类型(3)和(7)可基于不同标记物彼此区分，且基于初始的标记物显现和随后在用裂解试剂处理后的消失，类型(3)和(7)与所有其他类型相区分；类型(6)可基于两种标记物以完全标记的类型的强度的一半的强度存在与所有其他类型相区分；以及类型(4)和(8)可基于在各自已经被检测的组中缺少任何其他类型的推断被区分。许多其他配置可能改变标记物的数目、在检测阶段过程中流体操作的数目和/或区分一定数目的标记物的检测装置的复杂性。如此，配置可被调整以适应特定方法或应用。
除非另有说明，本文使用的术语将理解为采用它们的普通含义。以下示出了本文使用的若干术语和它们定义的实例。
如本文使用的，术语“阵列”指可根据相对位置彼此区分的位点群体。在阵列的不同位点的不同分子可根据在阵列中的位点的位置彼此区分。阵列的单个位点可包含一个或更多个特定类型的分子。例如，一个位点可包含具有特定序列的单个靶核酸分子，或一个位点可包含具有相同序列(和/或其互补序列)的若干核酸分子。阵列的位点可以是位于相同基质上的不同特征。示例性特征包括但不限于，基质中的孔、基质中或基质上的珠(或其他颗粒)、基质的突起部分、基质上的脊或基质里的通道。阵列的位点可以是各自具有不同分子的独立的基质。附接至独立的基质的不同分子可根据基质在该基质与其联系的表面上的位置或根据基质在液体或凝胶中的位置被鉴定出。其中独立的基质位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔里具有珠的那些。
如本文使用的，当提及核酸使用时术语“簇”指附接到固相以形成特征或位点的核酸群体。核酸通常是单一类型的，从而形成同质簇。然而，在一些实施方案中，核酸可以是异质的，如此使得具有不同序列的个体分子在位点或特征处存在。核酸通常例如经由它们的5’末端共价地附接，但在一些情况下，其他附接方式是可能的。簇中的核酸可以是单链或双链。在一些但并非所有实施方案中，通过称为桥式扩增(bridge amplification)的固相扩增方法制备簇。簇和它们的制备方法的示例性配置在例如美国专利号5,641,658、美国专利公开号2002/0055100、美国专利号7,115,400、美国专利公开号2004/0096853、美国专利公开号2004/0002090、美国专利公开号2007/0128624、及美国专利公开号2008/0009420中示出，其每一个通过引用并入本文。
如本文使用的，当提及核酸使用时术语“不同的”意为核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两个或更多个核酸可具有沿它们的整个长度不同的核苷酸序列。可选地，两个或更多个核酸可具有沿它们长度的大部分不同的核苷酸序列。例如，两个或更多个核酸可具有彼此不同的靶核苷酸序列部分同时还具有彼此相同的通用序列区域。通常，当本文提及两种类型为“不同的”时，一种类型将具有与第二种类型的结构性质不相同的结构性质。例如，两种不同的聚合物类型(诸如两种蛋白)可具有不同的单体亚基序列(诸如两种不同的蛋白的不同的氨基酸序列)。
如本文使用的，当提及项目的集合使用时术语“每个”预期鉴定集合中的个体项目，但不必需指集合中的每个项目。如果明确的公开内容或上下文清楚地另行指出，则可出现例外。
如本文使用的，术语“位点”意指阵列中存在特定分子类型的位置。位点可仅包含单个分子或其可包含相同类型的若干分子的群体。阵列的位点通常是离散的。离散的位点可以是邻接的或它们彼此之间可具有距离。
如本文使用的，术语“核酸”预期与其在本领域中的使用一致，并包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性的方式与核酸杂交或能够被用作用于复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的骨架。类似物的结构可具有替代性的骨架连键，所述骨架连键包括本领域中已知的多种骨架连键的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，在脱氧核糖核酸(DNA)中发现的)或核糖(例如，在核糖核酸(RNA)中发现的)。核酸可包含本领域中已知的这些糖部分的多种类似物的任一种。核酸可包括天然碱基或非天然碱基。在这方面，天然脱氧核糖核酸可具有选自由以下组成的组的一个或更多个碱基：腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤，且核糖核酸可具有选自由以下组成的组的一个或更多个碱基：尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或鸟嘌呤。可被包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域中已知的。当提及核酸使用时术语“靶”预期在本文示出的方法或组合物的上下文中作为用于核酸的语义标识符，且除非另有明确指示否则不必需限制核酸的结构或功能。
如本文使用的，术语“核酸模板”指能够用作用于聚合酶催化的复制的指导的核酸或其部分。核酸分子可包括沿其长度的多个模板，或可选地，仅单个模板可被用于本文的特定实施方案。核酸模板还可行使作为连接酶催化的引物延伸的指导的功能。
如本文使用的，术语“核苷酸”或“核苷酸类似物”预期包括天然核苷酸、非天然核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸和称为核苷酸的其他分子。例如，该术语在本文被用于通常指包含碱基部分并且任选地附接到一个或更多个磷酸部分的核苷部分(无论核糖、脱氧核糖或其类似物)。该术语可被用于指存在于聚合物中的单体单元，例如，以鉴定存在于DNA或RNA链中的亚基。术语还可被用于指不必需存在于聚合物中的单体分子，例如，能够通过聚合酶以模板依赖的方式并入多核苷酸中的分子。
示例性的核苷酸包括但不限于，单磷酸核糖核苷酸(有时称为核糖核苷单磷酸)、二磷酸核糖核苷酸(有时称为核糖核苷二磷酸)、三磷酸核糖核苷酸(有时称为核糖核苷三磷酸)、单磷酸脱氧核苷酸(有时称为脱氧核苷单磷酸)、二磷酸脱氧核苷酸(有时称为脱氧核苷二磷酸)和三磷酸脱氧核苷酸(有时称为脱氧核苷三磷酸)。为了清楚，当期望将RNA成分与DNA成分区分时，术语“核糖核苷酸”可被用于指定RNA核苷酸，诸如核糖尿苷三磷酸、核糖鸟苷三磷酸、核糖胞苷三磷酸或核糖腺苷三磷酸；且术语“脱氧核苷酸”被被用于指定RNA核苷酸，诸如脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸。在特定实施方案中，核苷酸是‘可延伸的’，例如，在核苷酸的3’羟基或任何其他位置上缺少延伸封闭部分。在其他实施方案中，核苷酸是被‘封闭’的，具有防止3’位置参与通过添加另一个核苷酸或寡核苷酸而延伸的部分。
如本文使用的，术语“引物”意指具有与模板序列上或靠近模板序列的引物结合位点结合的序列的核酸。通常，引物以允许例如经由引物的聚合酶延伸复制模板的构型结合。引物可以是核酸分子的第一部分，所述核酸分子的第一部分与核酸分子的第二部分结合，第一部分是引物序列且第二部分是引物结合序列(例如，发夹引物)。可选地，引物可以是第一核酸分子，所述第一核酸分子与具有模板序列的第二核酸分子结合。引物可由DNA、RNA或其类似物组成。
如本文使用的，术语“引物的延伸产物”意指已经通过添加至少一个核苷酸类似物而被修饰的引物。例如，引物可通过向其3’端添加一个或更多个核苷酸类似物(例如经由聚合酶催化)而被修饰，从而形成引物的延伸产物。可选地，引物的延伸产物可通过寡核苷酸与引物的3’或5’端的连接来制备。在这种情况下，引物的延伸产物延伸了等价于寡核苷酸长度的长度。引物的延伸产物可以比引物长至少1、2、5、10、500、1000或更多个核苷酸。可选地或另外地，引物的延伸产物可以比引物长不多于1、2、5、10、500或1000个核苷酸。例如，使用封闭的核苷酸提供了比引物长至少1个核苷酸且还比引物长不多于1个核苷酸的延伸产物。
如本文使用的，涉及与第二事物相比“选择性地”操作(或“选择性”操作)第一个事物预期意指与对第二事物的作用相比该操作对第一事物具有更大的作用。该操作不需对第二事物具有任何作用。该操作可对第一事物具有比对第二事物的作用大至少1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％或99％的作用。该操作可对第一事物具有比对第二事物的作用高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1x103倍、1x104倍或1x106倍的作用。该操作可包括，例如修饰、接触、处理、改变、裂解(例如，化学键的裂解)、光化学裂解(例如，化学键的裂解)、形成(例如，化学键的形成)、光化学形成(例如，化学键的光化学形成)、共价修饰、非共价修饰、破坏、光去除(photo-ablating)、移除、合成、聚合、光聚合、扩增(例如，核酸的扩增)、拷贝(例如，核酸的拷贝)、延伸(例如，核酸的延伸)、连接(例如，核酸的连接)或本文示出的或本领域中另外已知的其他操作。
如本文使用的，当提及核酸使用时术语“序列”指核酸中核苷酸(或碱基)的顺序。在其中不同类型的核苷酸存在于核酸中的情况下，序列包含核酸中各个位置处的核苷酸(或碱基)类型的鉴定。序列是整个或部分核酸分子的性质。术语可被相似地用于描述其他聚合物中单体单元的顺序和位置标识，诸如蛋白质聚合物的氨基酸单体单元的顺序和位置标识。
如本文使用的，术语“类型”用于鉴定共享相同化学结构的分子。例如，核苷酸的混合物可包括数个dCTP分子。dCTP分子将被理解为彼此相同的但与dATP、dGTP、dTTP等相比不同的类型。相似地，具有相同核苷酸序列的个体DNA分子是相同类型，而具有不同序列的DNA分子是不同类型。作为另一个实例，与RNA聚合酶相比，DNA聚合酶是不同的聚合酶类型(即使这两种聚合酶来源于相同生物体)。
鉴于以上定义，下文示出的以及在权利要求中引述的实施方案能够被理解。
本公开内容提供了一种用于对核酸模板测序的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供位点的阵列，其中每个位点包括第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列；(b)使用第一聚合酶类型和第一核苷酸类似物组，使与所述第一模板结合的第一引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生具有第一核苷酸类似物的第一引物延伸产物；(c)使用第二聚合酶类型和第二核苷酸类似物组，使与所述第二模板结合的第二引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生具有第二核苷酸类似物的第二引物延伸产物，其中所述第一聚合酶类型不同于所述第二聚合酶类型且其中所述第一核苷酸类似物组不同于所述第二核苷酸类似物组；(d)检测所述位点的每一个处的所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物；及(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定所述位点的每一个处的所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
本文还提供了用于对核酸模板测序的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列；(b)使用第一聚合酶类型和第一核苷酸类似物组，使与所述第一模板结合的第一引物延伸，从而产生具有第一核苷酸类似物的第一引物延伸产物；(c)使用第二聚合酶类型和第二核苷酸类似物组，使与所述第二模板结合的第二引物延伸，从而产生具有第二核苷酸类似物的第二引物延伸产物，其中所述第一聚合酶类型不同于所述第二聚合酶类型，且其中所述第一核苷酸类似物组不同于所述第二核苷酸类似物组；(d)使用检测器检测所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物，所述检测器具有低于所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物之间的空间间隔的分辨率；及(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
如以上示出的，本公开内容的方法可包括提供第一核酸模板和第二核酸模板的步骤，其中两个模板的序列不同。两个模板序列可以是单个核酸分子的部分，或可选地，两个模板序列可位于独立的分子上。如在本文其他部分进一步详细示出的，两个模板序列可以处于邻近状态，所述邻近状态太靠近以至于不能用使用的检测系统空间分辨。然而，本公开内容的正交检测方法允许将这些模板序列进行区分。正交检测方案针对两个模板序列进行示例，但可用于两个或更多个模板序列。因此，本文示出的系统或方法可包括至少2、3、4、5、10或更多个模板序列，所述模板序列极为邻近，例如在单个核酸分子上，在阵列的单个位点，或所述模板序列处于邻近状态，所述邻近状态太靠近以至于不能用使用的检测系统空间分辨。
本文使用的靶核酸可包括DNA、RNA或其类似物。靶核酸的来源可以是基因组DNA、信使RNA或来自天然来源的其他核酸。在一些情况下，来源于此类来源的靶核酸可在本文的方法或组合物中使用之前被扩增。
可从其中获得靶核酸的示例性生物样品包括例如，来自哺乳动物诸如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄类动物、马、绵羊、猪、山羊、牛、猫、狗、灵长类动物、人类或非人类灵长类动物；植物诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻、油菜或大豆；藻类诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；线虫诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；昆虫诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、蚊子、果蝇、蜜蜂或蜘蛛；鱼诸如斑马鱼；爬行动物；两栖动物诸如蛙类动物或非洲爪蟾(Xenopuslaevis)；盘基网柄菌(dictyostelium discoideum)；真菌诸如卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、酵母、酿酒酵母(Saccharamoyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；或恶性疟原虫(plasmodium falciparum)的生物样品。靶核酸还可来源于原核生物诸如细菌、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)；古细菌；病毒诸如丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒；或类病毒。靶核酸可来源于以上生物体的同质培养物或群体，或可选地来源于例如一个群落或生态系统中数种不同生物体的集合。可使用本领域中已知的方法分离核酸，所述方法包括例如，在以下中描述的那些：Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，冷泉港实验室，New York(2001)或Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wileyand Sons,Baltimore,Md.(1998)，其每一个通过引用并入本文。
在特定实施方案中，核酸样品可被修饰或制备用于在本文示出的一种或更多种方法中使用。在一些情况下，期望将一个或更多个引物结合位点添加到核酸。可使用已知的分子生物学技术以例如经由具有引物结合位点的衔接子的插入、产生引物结合位点的突变、具有引物结合位点的衔接子的连接等在各模板序列的上游引入引物结合位点。在Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)中记载了有用的方法。实施例I提供了基于加标签(tagmention)的技术的说明。加标签对引入一个或更多个引物结合位点特别有用，且可使用例如在美国专利号6,294,385和8,383,345，及PCT公开号WO 2012/106546中示出的技术来进行，其每一个通过引用并入本文。将理解的是，在一些情况下，位于各模板序列上游的天然存在的序列区域可被采用作为在本文示出的方法中的引物结合位点。与以上关于引物结合位点示例的方法相似的方法可用于引入其他期望的序列元件，诸如用于基于RNA聚合酶的延伸的启动子元件或标签序列。用于产生核酸片段的示例性方法在图4中示出并在实施例I中描述，所述核酸片段每一个具有邻近DNA引发位点的第一模板序列和邻近RNA引发位点和RNA聚合酶启动子的第二模板序列。
通用引发位点对于本文示出的方法的多重应用尤其有用。当提及核酸使用时术语“通用的”意指两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中这些分子还具有不同序列的区域。在分子集合的不同成员中存在的通用序列可允许使用与通用序列互补的单个通用引物类型复制、扩增或检测多个不同序列。因此，通用引物包括可与通用序列特异性杂交的序列。将通用序列附接到靶核酸的集合的方法的实例可见于美国专利申请公开号2007/0128624A1，其通过引用并入本文。
可针对待使用的特定RNA聚合酶视情况使用多种启动子的任一种。例如，细菌启动子可与细菌RNA聚合酶一起使用，或真核启动子可与真核RNA聚合酶一起使用。启动子将通常位于待检测的模板附近、RNA引物结合位点上游并与模板在同一链上。可使用标准核酸合成和/或分子生物学技术以在靶核酸中产生功能性启动子结构。特别有用的启动子是双向启动子诸如在哺乳动物双向基因对中存在的那些。双向启动子对于配对末端测序应用诸如在下面进一步详细示出的那些可以是有用的。
在一些实施方案中，靶核酸可作为一个或更多个较大的核酸的片段而被获得。可使用本领域中已知的多种技术的任一种进行片段化，所述技术例如雾化、声处理、化学裂解、酶促裂解或物理剪切。片段化还可以由于特定扩增技术的使用而产生，所述扩增技术通过仅拷贝较大的核酸的一部分产生扩增子。例如，PCR扩增产生具有由用于扩增的侧翼引物之间的片段长度定义的尺寸的片段。
靶核酸或其扩增子的群体可具有期望的或适合于本文示出的方法或组合物的特定应用的平均链长。例如，平均链长可小于约100,000个核苷酸、50,000个核苷酸、10,000个核苷酸、5,000个核苷酸、1,000个核苷酸、500个核苷酸、100个核苷酸或50个核苷酸。可选地或另外地，平均链长可大于约10个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、500个核苷酸、1,000个核苷酸、5,000个核苷酸、10,000个核苷酸、50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。靶核酸或其扩增子的群体的平均链长可在以上示出的最大值和最小值之间的范围内。将理解的是，在扩增位点处产生的(或本文另外制备的或使用的)扩增子可具有在选自以上示例的那些的上限和下限之间的范围内的平均链长。
在一些情况下，可制备或另外配置靶核酸的群体以使得其成员具有最大长度。例如，如本文示出的制备或使用的成员的最大长度可小于约100,000个核苷酸、50,000个核苷酸、10,000个核苷酸、5,000个核苷酸、1,000个核苷酸、500个核苷酸、100个核苷酸或50个核苷酸。可选地或另外地，可根据条件制备或另外配置靶核酸或其扩增子的群体，以使得其成员具有最小长度。例如，在本文示出的方法的一个或更多个步骤中使用的或存在于特定组合物中的成员的最小长度可多于约10个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、500个核苷酸、1,000个核苷酸、5,000个核苷酸、10,000个核苷酸、50,000个核苷酸或100,000个核苷酸。群体中的靶核酸的最大链长和最小链长可在以上示出的最大值和最小值之间的范围内。将理解的是，在扩增位点处产生的(或本文另外制备的或使用的)扩增子可具有以上示例的上限和下限之间的范围内的最大链长和/或最小链长。
多种已知的扩增技术的任一种可被用于增加用于本文示出的方法的存在的模板序列的量。示例性的技术包括但不限于具有模板序列的核酸分子的聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)。将理解的是，在本文示出的方法或组合物中使用之前靶核酸的扩增是任选的。如此，在本文示出的方法和组合物的一些实施方案中使用之前，靶核酸将不被扩增。靶核酸可任选地来源于合成文库。合成的核酸可具有天然DNA或RNA组成或可以是其类似物。还可使用固相扩增方法，包括例如，在基于阵列的方法的上下文中的簇扩增、桥式扩增或以下示出的其他方法。
在本文示出的方法中使用的核酸可以是溶液相或固相。当在溶液相中时，核酸通常是可溶的，但也可以呈能够被沉淀的悬浮形式，如对于一些大核酸类型的情况，诸如染色体或核酸纳米球(参见，例如，美国专利公开号2007/0099208 A1，其通过引用并入本文。固相的核酸可存在于固相支持物中或固相支持物上。示例性的固相支持物包括由玻璃、硝化纤维、二氧化硅、金属、塑料和在本文其他部分示出的其他材料制造的那些，例如，关于阵列格式和流通池。相似地，核酸可以存在于半固体支持物诸如凝胶中或半固体支持物诸如凝胶上。有用的示例性凝胶包括但不限于，具有胶体结构，诸如琼脂糖；聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺的那些。水凝胶尤其有用，诸如在美国专利公开号2011/0059865 A1和美国专利申请系列号13/784,368中示出的那些，其每一个通过引用并入本文。
将核酸附接到支持物(无论是刚性或半刚性)可通过共价或非共价连键发生。示例性的连键在美国专利号6,737,236、7,259,258、7,375,234和7,427,678；及美国专利公开号2011/0059865 A1中示出，其每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中，核酸或其他反应成分可被附接到凝胶或其他半固体支持物，所述凝胶或其他半固体支持物转而附接或粘附到固相支持物。在这样的实施方案中，核酸或其他反应成分将被理解为是固相的。
正交检测系统可基于用于引物延伸的两个或更多个试剂系统的使用，其中两个试剂系统的成分基本上不会交叉反应。例如，第一试剂系统可包括DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸和DNA引物；且第二试剂系统可包括RNA聚合酶、核糖核苷酸和RNA引物。两个系统都能够作用于DNA模板，例如，具有与DNA引物互补的第一引发位点和与RNA引物互补的第二引发位点的DNA模板。然而，DNA聚合酶是DNA引物和脱氧核糖核苷酸特异性的，如此使得其使用脱氧核糖核苷酸而不是核糖核苷酸选择性地延伸DNA引物。相反，RNA聚合酶是RNA引物和核糖核苷酸特异性的，如此使得其使用核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸选择性地延伸RNA引物。相似地，可使用其他特异性的试剂系统实现正交性，所述其他特异性的试剂系统诸如工程化的聚合酶，其选择性地将HNA(1,5失水己糖醇核酸)并入由HNA单体制备的引物。基于HNA的引物延伸正交于DNA聚合酶和RNA聚合酶延伸系统。可用于基于HNA的引物延伸的示例性条件和试剂在Pinheiro等，Science,336(6079):341-344(2012)和Cozens等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,109(21):8067-8072(2012)中描述，其每一个通过引用并入本文。
根据以上示出的示例性实施方案，可认为脱氧核糖核苷酸是相对于核糖核苷酸和HNA的正交核苷酸种类。相似地，在特定实施方案的上下文中，DNA聚合酶和RNA聚合酶的种类是彼此正交的，且DNA引物和RNA引物的种类是彼此正交的。当与第二核苷酸类似物种类相比，第一聚合酶对第一核苷酸类似物种类是选择性的并且其中与第一核苷酸类似物种类相比，第二聚合酶对第二核苷酸类似物种类是选择性的时，通常可在本文示出的方法中利用正交性。相似地，当与第二引物种类相比，第一聚合酶对第一引物种类是选择性的并且当与第一引物种类相比，第二聚合酶对第二引物种类是选择性的时，正交性可存在。
多种聚合酶的任一种可用于本文示出的方法或组合物中，所述聚合酶包括例如，分离自生物系统的基于蛋白的酶及其功能变体。将理解的是，提及特定聚合酶诸如以下示例的那些，包括其功能变体，除非另有说明。聚合酶的尤其有用的功能是使用存在的核酸作为模板催化核酸链的聚合。其他有用的功能在本文其他部分描述。有用的聚合酶的实例包括DNA聚合酶、逆转录酶和RNA聚合酶。
具有固有的3’到5’的校正外切核酸酶活性的聚合酶对于一些实施方案可以是有用的。实质上缺少3’到5’校正外切核酸酶活性的聚合酶在一些实施方案例如在大多数测序实施方案中也是有用的。外切核酸酶活性的缺失可以是野生型特征或由变体或工程化的聚合酶结构赋予的特征。例如，exo minus Klenow片段是突变形式的Klenow片段，其缺少3’到5’校正外切核酸酶活性。
取决于待使用的实施方案，聚合酶可以是嗜热的或热失活的。嗜热聚合酶通常对于高温条件或在热循环条件诸如聚合酶链式反应(PCR)技术采用的热循环条件中是有用的。嗜热聚合酶的实例包括，但不限于9°N DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、RB69DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和DNA聚合酶。分离自非嗜热生物体的大多数聚合酶是热失活的。实例是来自噬菌体的DNA聚合酶。将理解的是，可修饰来自多种来源的任一种的聚合酶以在增加或减少他们对高温条件的耐受性。对于并入具有标记物和/或可逆终止部分的核苷酸尤其有用的聚合酶在US 2006/0281109 A1中描述，其通过引用并入本文。
引物延伸的另一个正交试剂系统是基于连接酶的系统，其选择性并入寡核苷酸而不是单体核苷酸，所述单体核苷酸由以上描述的基于聚合酶的延伸系统并入。当在其中DNA引物通过DNA连接酶但不会通过RNA聚合酶延伸且其中RNA引物通过RNA聚合酶但不会通过DNA连接酶延伸的条件下使用时，DNA连接酶试剂系统与基于RNA聚合酶的试剂系统完全正交。通过连接酶的延伸可使用具有一或二碱基编码方案(one-or two-base encodingscheme)的部分随机探针寡核苷酸的群体在测序应用中进行。可在延伸反应中诸如在测序环境中的延伸反应中用于检测的基于连接的延伸技术在McKernan等，Genome Research 19(9):1527–41(2009)；Shendure等，Science 309:1728-1732(2005)；及US专利号5,599,675和5,750,341中示出，其每一个通过引用并入本文。
根据本公开内容的正交操作和检测不需要两个模板序列在沿他们长度的每个位置处不同。相反，相同的碱基部分可存在于分别在第一模板和第二模板上检测的位置处。可基于存在于正交试剂系统中的标记物的可区分的特征和用于延伸适当的引物的试剂系统的特异性区分两个位置。这一信息转而可被用于可区分地检测两个不同的模板序列，即使这两个位置使用检测器被同时地检测，所述检测器具有的分辨率太低以至于无法分辨等同于两个模板序列的间距的距离处的点。
可使用多种标记物的任一种。当用于检测核苷酸类似物时尤其有用的标记物部分可以是当与核苷酸类似物的环境中存在的其他分子相比时提供可区分的特征的该核苷酸类似物的任何部分。可区分的特征可以是，例如，光学信号诸如辐射的吸收、荧光发射、发光发射、荧光寿命、荧光偏振等；对配体或受体的结合亲和力；磁性性质；电性质；电荷；质量；放射性等。示例性的标记物部分包括但不限于荧光团、发光团、发色团、放射性同位素、质量标记物、电荷标记物、自旋(spin)标记物、受体、配体等。标记物部分可以是存在于核酸聚合物中的单体单元的核苷酸的部分，或标记物部分可以是游离核苷酸类似物(例如，核苷三磷酸)的一部分。
荧光团尤其有用并包括，例如，荧光纳米晶体；量子点、荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、Cy3、Cy5、芪、荧光黄、Cascade蓝、德克萨斯红、Alexa染料、SETA染料、Atto染料、藻红蛋白、氟硼二吡咯等。有用的光学探针在Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第三版,Springer(2006)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,第九版，Molecular Probes，Inc,(2002)；Shapiro,Practical Flow Cytometry，第四版，JohnWiley&Sons(2003)；WO 98/59066；WO 91/06678或美国专利申请公开号2010/0092957 A1中描述，其每一个通过引用并入本文。
其他标记物(其中一些是非光学标记物)可被用于本文示出的方法和组合物的多种实施方案中。实例包括但不限于同位素标记物诸如天然非丰富的放射性或重同位素；磁性物质；富含电子的物质诸如金属；电化学发光标记物诸如Ru(bpy)32+；或可基于核磁、顺磁性、电、荷质或热特征检测的部分。标记物还可包括磁性颗粒或光学编码的纳米颗粒。此类标记物可使用本领域技术人员已知的适当方法检测。例如，带电荷的标记物可使用电检测器检测，所述电检测器诸如在来自Ion Torrent(Guilford,CT,a Life Technologiessubsidiary)的市售可得的测序系统或在美国专利申请公开号2009/0026082 A1、2009/0127589 A1、2010/0137143 A1及2010/0282617 A1中描述的检测系统中使用的那些，其每一个通过引用并入本文。将理解的是，对于一些实施方案，核苷酸类似物不需要具有一个或更多个本文示出的标记物。
可以以不同的方式将标记物部分附接到核苷酸。可用于核苷酸的示例性的附接和标记物组合物在Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、US 7,057,026、WO91/06678、WO 07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US 7,405,281和US2008/0108082中示出，其每一个通过引用并入本文。
在特定实施方案中，例如，在正交合成测序方法中利用循环引物延伸的实施方案中，核苷酸可包括可逆终止子部分。可逆终止子部分提供了控制延伸反应以仅将单个核苷酸添加到引物直至进行随后的去封闭步骤的简便方式。这可在如下测序方法的上下文中被理解。为了启动第一个测序循环，可将一个或更多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等递送到引物结合的核酸模板的阵列。任选地，核苷酸可包括可逆终止子部分，如此使得随后的延伸直到递送去封闭剂以移除该部分才发生。通过引物延伸反应添加到位点的两个或更多个标记物可例如使用本文示出的方法或装置被检测。可使去封闭试剂与阵列接触(在检测发生之前或之后)以移除可逆终止子。在多个递送步骤之间可进行洗涤。然后可重复循环n次，以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。示例性的测序技术和有用的试剂在，例如，Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、US 7,057,026、WO 91/06678、WO07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US 7,405,281和US 2008/0108082中描述，其每一个通过引用并入本文。
可将本文示出的正交测序方法用于配对末端测序方法。通常，配对末端测序涉及确定在模板序列区域两端的序列，其中模板序列区域的长度是已知的。用于片段化靶核酸样品(例如，基因组DNA样品)、附接引物以适应配对末端读段及从片段的末端读取序列的方法是已知的，并可如例如在美国专利号7,754,429、8,017,335及8,192,930中描述的进行，其每一个通过引用并入本文。
在正交合成测序实施方案的情况下，可将核酸片段构建成具有两个模板序列，且配对读段可从两个模板的每一个获得以从单个片段获得4个读段。可通过使用侧翼为RNA聚合酶结合位点的双向启动子促进配对末端读段。示例性的构建体在图5中示出。在这个实例中，构建体包括用于第一正交读段的读段1和读段1’引发位点。在第一正交读段中，DNA引物可与读段1引发位点杂交以允许在模板1的第一末端(由在上图中的实心箭头指示)的序列的DNA聚合酶催化的读取。同样在第一正交读段中，读段1’引发位点可与RNA引物杂交，且由于邻近双向启动子，RNA聚合酶可读取模板2的第一末端(由在上图中的空心箭头指示)。第二正交读段可通过以下获得：将DNA引物与读段2引发位点杂交并读取模板2的第二末端，以及将RNA引物与读段2’引发位点杂交并读取模板1的第二末端(由下图中实心箭头指示)。双向启动子邻近读段2’引发位点，允许RNA聚合酶延伸发生(由下图中的空心箭头指示)。可例如使用图4中描述的方法制备图5中示例的构建体。
在正交合成测序实施方案中，双向启动子对于使用RNA聚合酶的配对末端读段不是必需的。相反，RNA引发位点和它们的启动子可以位于模板2构建体的末端，且连接两个模板的衔接子可包含DNA引发位点。以图5中的构建体为例，读段1和读段1’引发位点的位置可以交换，读段2和读段2’引发位点的位置可以交换，双向启动子可被移除且独立的RNA启动子可分别位于读段1’和读段2’引发位点的上游。
使用本文示出的方法进行的核酸延伸反应或其他循环反应可进行一个或更多个循环。在特定实施方案中，多循环反应可包括至少2个循环、5个循环、10个循环、50个循环、100个循环、500个循环、1,000个循环、5,000个循环、10,000个循环或更多。可选地或另外地，反应可具有上限，其中不多于1个循环、2个循环、5个循环、10个循环、50个循环、100个循环、500个循环、1,000个循环、5,000个循环或10,000个循环发生。在一些实施方案中，每个循环将导致单个核苷酸类似物向延伸的引物中的并入。在这种情况下，可将以上示例的最小循环数或最大循环数理解为在聚合酶催化的反应中并入延伸产物中的核苷酸的最小数目或最大数目的示例。
一些实施方案可使用非循环延伸反应，诸如单碱基延伸(SBE)反应或等位基因特异性引物延伸(ASPE)反应。可将可逆终止子部分用于非循环延伸。由于去封闭步骤对于这些非循环反应不是必需的，核苷酸可替代性地被非可逆地终止。例如，可使用双脱氧核苷酸。用于SBE、ASPE和其他有用的非循环延伸技术的示例性试剂和相关的技术在例如美国专利号7,670,810和美国专利申请公开号2003/0108867、2003/0108900、2003/0170684、2003/0207295或2005/0181394中描述，其每一个通过引用并入本文。使用非循环延伸技术并可被修饰以通过本文示出的正交检测方法增加信息量的市售可得的产品的实例是从Illumina,Inc.(San Diego,CA)可得的基因分型产品。
循环和非循环反应以同样的方式可包括其中将反应成分彼此分离或从反应环境中移出的步骤。可例如通过将固相成分从液相成分分离，将一种或更多种反应成分分离。可任选地包括洗涤步骤以更完全地从一种或更多种固相成分中移出不需要的一种或更多种液相成分。对于这样的分离尤其有用的反应容器是流通池，诸如在循环测序方法中通常使用的那些。示例性的流通池、其制造方法及其使用方法在美国专利申请公开号2010/0111768 A1和2012/0270305 A1、及WO 05/065814中描述，其每一个通过引用并入本文。无论是否使用固相分离方法，可通过本领域中已知的多种其他技术的任一种移出反应成分，所述技术包括，液液提取、固相提取、色谱、过滤、离心等。
检测可在本公开内容的方法中使用适用于使用的特定标记物的装置来进行。例如，可将光学检测器诸如荧光检测器、吸光度检测器、发光检测器等用于检测适当的光学标记物。针对基于阵列的检测设计的系统尤其有用。例如，可以将与本文示出的方法一起使用的光学系统构建成包括多种元件和配件，如在美国专利号8,241,573、7,329,860和8,039,817及美国专利申请公开号2009/0272914 A1和2012/0270305 A1中描述的，其每一个通过引用并入本文。
如以上示出的，本公开内容的方法可包括两个正交引物延伸步骤。例如，以上示出了一种方法，所述方法尤其包括以下步骤：(b)使用第一聚合酶类型和第一核苷酸类似物组，使与第一核酸结合的第一引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生具有第一核苷酸类似物的第一引物延伸产物；及(c)使用第二聚合酶类型和第二核苷酸类似物组，使与第二核酸结合的第二引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生具有第二核苷酸类似物的第二引物延伸产物，其中所述第一聚合酶类型不同于所述第二聚合酶类型，且其中所述第一核苷酸类似物组不同于所述第二核苷酸类似物组。在一些实施方案中，步骤(b)和(c)同时进行。任选地，步骤(b)和(c)可以以任何顺序顺序地进行。在任何一种情况下，引物延伸反应的正交性允许两种延伸产物被区分。因此，两种延伸产物可在检测步骤过程中同时存在，并且不需要通过使用的检测器在空间上分辨。
多重反应可使用固相支持物。固相支持物对于分离单个反应物可以是有用的，如此使得每一个反应物可被分开地或单独地询问。例如，可将混合物中若干种不同的核酸附接到固相支持物上。可以阵列格式将核酸附接到固相支持物上。
在一些实施方案中，提供了一种位点的阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，且其中第一核酸模板具有与第二核酸模板的序列不同的序列。可以是有用的示例性的阵列包括但不限于从Inc.(San Diego,CA)可得的BeadChip Array或诸如在美国专利号6,266,459、6,355,431、6,770,441、6,859,570或7,622,294或PCT公开号WO 00/63437中描述的那些的阵列，其每一个通过引用并入本文。可被使用的市售可得的阵列的另外的实例包括，例如，阵列或根据有时被称为VLSIPSTM(超大规模固定化聚合物合成(Very Large Scale Immobilized PolymerSynthesis))技术的技术合成的其他阵列。点制阵列根据一些实施方案也可以被使用。示例性的点制阵列是从Amersham Biosciences可得的CodeLinkTM阵列。另一个有用的阵列是使用喷墨印刷方法制造的阵列，所述喷墨印刷技术诸如从Agilent Technologies可得的SurePrintTM技术。
其他有用的阵列包括在核酸测序应用中使用的那些。例如，具有基因组片段的扩增子(通常称为簇)的阵列尤其有用，诸如在Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)、WO04/018497、US 7,057,026、WO 91/06678、WO 07/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US7,315,019、US 7,405,281和US 2008/0108082中描述的那些，其每一个通过引用并入本文。
可通过固相扩增方法产生核酸簇。例如，可将具有一个或更多个待检测的模板序列的核酸附接到表面，并使用桥式扩增进行扩增。有用的桥式扩增方法在例如美国专利号5,641,658、美国专利公开号2002/0055100、美国专利号7,115,400、美国专利公开号2004/0096853、美国专利公开号2004/0002090、美国专利公开号2007/0128624及美国专利公开号2008/0009420中描述，其每一个通过引用并入本文。用于在表面上扩增核酸另一个有用的方法是滚环扩增(RCA)，例如，如在Lizardi等，Nat.Genet.19:225-232(1998)和美国专利申请公开号2007/0099208A1中描述的，其每一个通过引用并入本文。另一个有用的阵列类型是从乳液PCR扩增技术产生的颗粒阵列。实例在Dressman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:8817-8822(2003)、WO 05/010145、US 2005/0130173或US 2005/0064460中描述，其每一个通过引用并入本文。尽管已经在测序应用的上下文中描述了以上阵列，将理解的是可将这些阵列用于其他实施方案，包括，例如，使用非循环引物延伸技术的实施方案。
检测可在阵列上在总体或单分子水平上进行。总体水平检测是以在每个个体位点处检测单个模板序列的若干拷贝并且在位点处的个体拷贝彼此不相区分的方式发生的检测。因此，总体检测提供了来自位点处的特定模板序列的平均信号。例如，一个位点可包含特定模板序列的至少10、100、1000或更多个拷贝。当然，一个位点可包含多个不同的模板序列，其每一个作为一个总体存在。可选地，在单分子水平上的检测包括以在阵列上单独地分辨单个模板序列(每个在不同位点)的方式发生的检测。因此，单分子检测提供了来自个体分子的与可从个体分子存在于其中的分子群体中产生的一个或更多个信号区分的信号。当然，即使在单分子阵列中，一个位点可包含若干不同的模板序列(例如，沿着单个核酸分子定位的两个或更多个模板序列区域)。
位点的阵列可表现为点或片的网格。位点可以以重复的模式或以不规则的非重复的模式定位。尤其有用的模式是六边形模式、直线模式、网格模式、具有反射对称的模式、具有旋转对称的模式等。不对称模式也可以是有用的。
阵列中位点的尺寸和/或位点之间的间距可不同以实现高密度、中等密度或较低密度。高密度阵列被表征为具有以小于约15μm间隔的位点。中等密度阵列具有以约15到30μm间隔的位点，而低密度阵列具有以大于30μm间隔的位点。在一些实施方案中有用的阵列可具有以小于100μm、50μm、10μm、5μm、1μm或0.5μm间隔的位点。可将本文示出的方法的实施方案用于以足以区分以以上密度或密度范围的位点的分辨率对阵列成像。然而，检测步骤将通常使用检测器，所述检测器具有的空间分辨率太低以至于无法分辨等同于在位点的每一个处的第一引物延伸产物和第二引物延伸产物之间的间距的距离处的点。在特定实施方案中，阵列的位点可各自具有大于约100nm2、250nm2、500nm2、1μm2、2.5μm2、5μm2、10μm2、100μm2或500μm2的面积。可选地或另外地，阵列的位点可各自具有小于约1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2或100nm2的面积。事实上，位点可具有在选自以上示例的那些的上限和下限之间的范围内的尺寸。
本文示出的方法可使用阵列，所述阵列具有以多种密度包括例如至少约10个位点/cm2、100个位点/cm2、500个位点/cm2、1,000个位点/cm2、5,000个位点/cm2、10,000个位点/cm2、50,000个位点/cm2、100,000个位点/cm2、1,000,000个位点/cm2、5,000,000个位点/cm2或更高的任一种的位点。
正交检测系统，诸如用于正交合成测序的系统，可使用不同标记物以区分添加到每种引物的不同核苷酸。在一个实施方案中，每个核苷酸类型将具有产生独特的信号用于区分该核苷酸类型的独特的光学标记物。一个实例是在以下实施例I中描述并在图1A和图1B中示出的4-染料SBOS方法。在该实例中，将第一4种不同的荧光染料组用于使4种不同的dNTP类似物彼此区分，且将第二4种不同的荧光染料组用于使4种不同rNTP类似物彼此区分。这两组染料是独特的，如此使得该8种染料分别产生8种可区分的信号。
在其中所有核苷酸被可区分地标记，诸如4-染料SBOS方法的实施方案中，可将一对模板序列与所有核苷酸接触并然后此后可进行检测。在此，由于独特的光学标记物区分所有核苷酸的能力提供了相对简单的流体操作的益处，其中所有核苷酸可被递送到模板序列如此使得它们同时存在。在相对简单且优选的SBOS实施方案中，同时递送所有8种核苷酸；然而，如果需要，可顺序地递送一个或更多个子集。检测可以在核苷酸递送过程中或之后发生。该相对简单的流体过程与具有区分所有信号的能力的相对复杂的检测装置相适应。例如，可将能够区分8种不同荧光信号的荧光检测系统用于使用8种不同的荧光标记的核苷酸的SBOS方法。本领域技术人员将知晓或能够确定实现此类信号区分的适当的荧光检测装置。例如，可使荧光标记物的激发和发射性质与荧光计产生的激发波长和检测的发射波长的组合适当地匹配。对于可用于多波长荧光检测的光学器件和标记物的示例性的指导在Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第三版,Springer(2006)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,第九版，Molecular Probes,Inc,(2002)；和Shapiro,Practical Flow Cytometry,第四版，JohnWiley&Sons(2003)中提供，其每一个通过引用并入本文。
以上示例的用于其中所有核苷酸被可区分地标记的系统的原理，可被容易地扩展到阵列格式。当用引物延伸反应系统处理时，具有足够数目和种类的不同模板序列的阵列将被期望并入所有标记的核苷酸。更具体地，在具有跨越阵列位点的很多种核酸并且具有两种不同的模板/位点的基于阵列的SBOS方法中，将预期在其中所有8种核苷酸递送到阵列的引物延伸循环之后，所有可能的2-染料的染料组合在阵列上出现。可使用本领域中已知的光学装置在空间上区分位点，所述光学装置例如在美国专利号8,241,573、7,329,860和8,039,817及美国专利申请公开号2009/0272914 A1和2012/0270305 A1中描述的那些，其每一个通过引用并入本文。可容易地将这样的检测系统改造为适应如以上示出的8色荧光检测。以这种方式改造的检测系统将能够进行多重正交检测，如此使得在多个位点(例如通过测序)区分两种不同的模板，所述多个位点的每一个具有不同的序列组成。
在一些实施方案中，在特定方法中被区分的不同信号的数目少于在该方法中使用的不同的核苷酸类型的数目。例如，多个不同核苷酸类型可具有相同的标记物和/或核苷酸类型的子集可以是未标记的。对于多个不同的核苷酸类型使用相同标记物的配置的实例是正交引物延伸(或SBOS)方法的情况，其中4种不同的脱氧核糖核苷酸具有共同的第一标记物且4种不同的核糖核苷酸具有共同的第二标记物。在该配置中，可通过递送脱氧核糖核苷酸中的一种并检测脱氧核糖核苷酸，然后递送随后的脱氧核糖核苷酸的顺序循环，可将4种不同的脱氧核糖核苷酸彼此区分。在该实例中只要第一标记物和第二标记物是可区分的，就可在4个递送和检测循环中成对递送脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(每1对为单个脱氧核糖核苷酸类型和单个核糖核苷酸类型)。因此，在引物延伸反应中使用的第一核苷酸类似物组的成员(例如dNTP)可仅包括一种类型的被检测的光学标记物，且正交于第一组的第二核苷酸类似物组(例如rNTP)，也可仅包括一种类型的被检测的光学标记物，其中在第一组中使用的标记物与在第二组中使用的标记物在光学上可区分。
灰度分级(greyscaling)允许使用具有相同标记物的多种不同核苷酸类型。在此，可基于检测到的标记物信号的强度区分不同核苷酸类型。例如，可将每种核苷酸类型作为独特地成比例的标记和未标记的形式的该核苷酸类型的混合物递送。对于每种类型的标记的:未标记的核苷酸的比的变化将导致每种混合物的独特地灰度分级的信号输出。通过更具体的实例，第一核苷酸可以是完全标记的(无标记的和未标记的第一核苷酸的混合)，第二核苷酸可以是75％标记的(75％标记的第二核苷酸和25％未标记的第二核苷酸的混合)，第三核苷酸可以是50％标记的(50％标记的第三核苷酸和50％未标记的第三核苷酸的混合)，且第四核苷酸可以是25％标记的(25％标记的第四核苷酸和75％未标记的第四核苷酸的混合)。基于产生的信号强度的差异可区分这四种核苷酸类型，其中引物群体(例如，在阵列位点处的引物群体)将由于并入第一核苷酸而产生完全的信号；由于并入第二核苷酸而产生75％的信号；由于并入第三核苷酸而产生50％的信号；以及由于并入第四核苷酸而产生25％的信号。
在特定实施方案中，核苷酸类型的至少一种可以是完全未标记的。因此，在其中光学标记物存在于核苷酸组中的其他核苷酸上的情况下，还可存在‘暗’核苷酸。延伸引物以并入暗核苷酸或另外未标记的核苷酸，核苷酸可通过基于标记物的不存在的推断被确定，如果在组中的其他核苷酸已经通过延伸反应被并入，所述标记物的不存在则将是期望的。因此，在一些实施方案中，只有在本文示出的引物延伸反应中使用的核苷酸的子集需要具有标记物。
可将完全未标记的核苷酸类型的使用同灰度分级结合。例如，组中四种不同的核苷酸类型中的三种可具有可区分的非零量的特定标记物(例如，混合物中标记的和未标记的核苷酸的比)且第四种核苷酸类型可缺少该标记物。任选地或另外地，可将灰度分级与若干种光学上可区分的标记物的使用结合。例如，一些核苷酸类型可在延伸反应中作为混合物出现，所述混合物是同一类型的核苷酸但具有不同的标记物。在下面的实施例I中示例了这样的配置，其中核苷酸类型作为50％rtrCTP-F红/50％rtrCTP-F蓝的混合物提供。可被改造以用于本公开内容的正交方法中的灰度分级和混合的标记物的另外实例在US 2013/0079232 A1中示出，其通过引用并入本文。
可选地或另外地，对于多种不同标记物、灰度分级和/或未标记的类型的使用，本文示出的实施方案可使用具有配体、可裂解的接头或由于限定的处理而提供标记物的获得或丢失的其他部分的核苷酸。在下面的实施例1中阐述了该类型的试剂系统，其中一些核苷酸类型具有配体，如此使得基于初始可检测信号的不存在而随后在用合适的标记的受体处理之后的信号的出现将它们与其他核苷酸区分。实施例I还阐述了基于初始可检测信号随后由于用修饰标记物的试剂处理(例如经由在标记物和核苷酸之间的接头的化学裂解)而丢失或至少减少而被区分的核苷酸的使用。在这种情况下，组中其他核苷酸类型不易受修饰的影响(例如缺少可裂解的接头)，且基于处理后的持续信号产生被区分。
如在以上和在实施例I中示例的，在一些实施方案中，可将标记物通过可裂解的接头附接到核苷酸类似物。在特定实施方案中，可使用光可裂解的接头代替以上示例的化学可裂解的接头。在一些实施方案中，接头选自酸不稳定的接头(包括双烷氧基苄基接头、Sieber接头、吲哚接头、t-丁基Sieber接头)、亲电子可裂解的接头、亲核可裂解的接头、光可裂解的接头、在还原条件或氧化条件下被裂解的接头、保险栓接头及被消除机制裂解的接头。在一些这样的实施方案中，接头选自二硫化物接头(-S-S-)、酯、硝基苯、亚胺、酶促或化学可裂解的肽和多核苷酸，诸如DNA。
在一些实施方案中，在引物延伸反应中使用的第一核苷酸类似物组的成员(例如dNTP)将仅包括一种类型的被检测的光学标记物，且正交于第一组的第二核苷酸类似物组(例如rNTP)也将仅包括一种类型的被检测的光学标记物，其中在第一组中使用的标记物与在第二组中使用的标记物在光学上可区分。在该实施方案中，可将所述一种类型的光学标记物附接到第一组中第一类型的基本上所有核苷酸类似物，可将所述一种类型的光学标记物附接到第一组中第二类型的核苷酸类似物的子集，可将第一组中第三类型的基本上所有核苷酸类似物附接到配体，并且第一组中第四类型的基本上所有核苷酸类似物未被附接到所述一种类型的光学标记物或配体。
在另一个实施方案中，在引物延伸反应中使用的第一核苷酸类似物组的成员(例如dNTP)将仅包括两种类型的被检测的光学标记物，且正交于第一组的第二核苷酸类似物组(例如rNTP)也将仅包括两种类型的被检测的光学标记物。在该实施方案中，可将所述两种类型的光学标记物的第一种附接到第一组中第一类型的基本上所有核苷酸类似物，可将所述两种类型的光学标记物的第二种附接到第一组中第二类型的基本上所有核苷酸类似物，可将所述两种类型的光学标记物的第一种和所述两种类型的光学标记物的第二种附接到第一组中第三类型的核苷酸类似物，并且第一组中第四类型的基本上所有核苷酸类似物未被附接到所述两种类型的光学标记物的一种或所述两种类型的光学标记物的第二种。
从以上实例将理解，减少正交检测系统中的不同标记物的数目可提供减少区分向模板结合的引物添加的不同核苷酸所需要的检测装置的复杂性的优势。然而，在许多实施方案中，这通过增加流体步骤的复杂性来实现，如此使得与当每个核苷酸类型具有独特的标记物时使用的流体步骤相比在检测步骤过程中使用的流体操作的数目增加。本发明的方法的一般性优势在于本领域技术人员能够选择标记物、流体步骤和检测装置的适当组合以适应特定的应用或环境。
本公开内容提供了反应混合物(本文中也被称为试剂系统)，所述反应混合物包含组分的多种组合。在若干情况下，反应组分和组分的若干组合在示例性的方法的上下文中描述。将理解的是，反应混合物及其组分不需要限于在本文示例的方法中使用。还构思了其他用途。因此，可以以多种有用的组合组装组分，例如以产生试剂盒。试剂盒可用于本文示出的组分的储存、运输、或商业交易。试剂盒可任选地包括用于进行一种或更多种本文示出的方法的说明书。
以下实施例预期阐述但不限制本发明。
实施例I
双引物正交合成测序
本实施例描述了一种新的测序平台，当与传统合成测序(SBS)相比时，所述新的测序平台允许测序输出加倍。该平台利用SBS是由于测序信息来源于测序引物的逐步延长(图1A)。然而，在新平台中，在第一位点处的延长事件平行于第二测序延长事件而发生，所述第二测序延长事件发生在所述第一位点下游的第二位点处(图1B)。
通过使用两种不同的聚合酶和底物组合提供了在SBS位点1和2之间的正交性。如以下示例的，该系统可使用SBS DNA聚合酶和全功能核苷酸(FFN)(诸如从Illumina,Inc.(San Diego,CA)可得的那些)与RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)和相应的标记的rNTP组合(图1B)。虽然对RNA和DNA聚合酶之间的底物特异性的区分不是绝对的，已经示出rNTP和dNTP之间的底物偏好性的差异在某些条件下高达10000倍(Joyce,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,94:1619-1622(1997)和Gao等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 94,407-411(1997)，其每一个通过引用并入本文)。可选地，可通过利用合成DNA/RNA类似物(XNA)及相应的工程化的聚合酶实现正交系统。使用长HNA(1,5失水己糖醇核酸)通过进化的DNA聚合酶的DNA模板合成，这样的系统是可能的。可用于长HNA的DNA模板合成的示例性条件和试剂在Pinheiro等，Science,336(6079):341-344(2012)和Cozens等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,109(21):8067-8072(2012)中描述，其每一个通过引用并入本文。
信号区分
可将以下示例性配置用于在正交合成测序(SBOS)平台中的信号区分。
(1)基于4-染料SBOS化学的方法.在该方法中，使用四种可逆终止子脱氧核糖核苷酸(rtdNTP)的组，其中rtdNTP类型中的每一种具有荧光团，所述荧光团与用于其他三种rtdNTP类型的荧光团在光学上可区分。这类似于在从Illumina,Inc.(San Diego,CA)可得的市售可得的4-染料SBS平台中使用的核苷酸的组合。还使用了四种可逆终止子核糖核苷酸(rtrNTP)的组，且rtrNTP类型中的每一种具有荧光团，所述荧光团与用于其他三种rtrNTP类型的荧光团在光学上可区分。此外，用于rtdNTP的荧光团与用于rtrNTP的荧光团在光学上可区分。如此，存在在两个核苷酸组中使用的8种不同的荧光团。表1示出示例性的组，其中下标指出每种荧光团(F)的发射波长。
表1：用于4-染料SBS配置的核苷酸
在4-染料方法中，用于区分8种不同的荧光团的光学元件可以是相对复杂的，例如，使用多达8种不同的发射通道和/或多达8种不同的激发线路。
(2)基于1-染料SBOS化学的方法.为了降低描述的用于4-染料方法的光学装置的复杂性，可使用另一个方法，所述另一个方法使用了比可使用的核苷酸类型少的荧光团。1-染料方法可使用rtdNTP组，所述rtdNTP组具有第一类型的单一荧光团(例如，发射蓝光的荧光团)。不同类型的rtdNTP由于以下而可彼此区分：在rtdNTP组中第一类型上存在荧光团(例如rtdTTP-发射蓝光的荧光团)，在rtdNTP组中第二类型上存在结合配体(例如rtdCTP-生物素)，在rtdNTP组中第三类型上不存在荧光团和结合配体(例如未标记的rtdGTP)，以及荧光团经由可裂解的接头附接至rtdNTP组中的第四类型(例如rtdATP-二硫键-发射蓝光的荧光团)。可被用于产生用于1-染料检测的核苷酸组的荧光团标记的、配体标记的和未标记的核苷酸类型的示例性组合在US 2013/0079232 A1中进一步详细示出，其通过引用并入本文。
1-染料方法还可使用具有第二类型的荧光团的rtrNTP组。第二类型的荧光团(例如发射红光的荧光团)与用于rtdNTP组的成员的荧光团在光学上可区分。此外，在rtrNTP组中的单个类型可通过与以上关于rtdNTP组示例的组合相似的标记的和未标记的类型的组合彼此区分，具有以下改变。为了避免引入新的生物素-链霉亲和素系统，rtrNTP中的一种可以是使用的两种荧光团的混合。示例性核苷酸组在表2中示出(相似的组在图2A中示出)。
表2：用于1-染料SBS配置的核苷酸
对于使用表2的配置的SBOS方法，光学元件仅需包括2种不同的发射通道及仅1种或2种不同的激发线路。在该方法中，如图2A所示的，每个循环捕获总计4幅图片(每种颜色2幅)。在用链霉亲和素--F蓝处理之前记录两幅图片以及在用链霉亲和素--F蓝处理之后记录两幅图片。在图2A和图2B中，“暗”指示不存在荧光标记物，“NR550C4”是发射蓝光的荧光团，“THP”是裂解二硫键(“SS”)的三(3-羟丙基)磷化氢，“Strep”是链霉亲和素，“d-FFN”是rtdNTP，“r-FFN”是rtrNTP且“红”是发射红光的荧光团。
尽管rtrCTP标记的类型的混合物在以上示例为1：1摩尔比(即50％F红和50％F蓝)，将理解的是，可替代性地使用其他比。例如，调整比以适应两种荧光团的不同光学性质可以是期望的(例如荧光团中的一种可以以轻微的摩尔过量存在，以适应在使用的检测波长下比其他荧光团相对更低的发射强度)。该比还可偏离1:1以适应标记的核苷酸的不同的生物化学性质(例如，对聚合酶的不同亲和力)。
(3)基于2-染料SBOS化学的.本方法提供了核苷酸与比核苷酸类型少的荧光团的另一种组合。可使用具有荧光团的rtrNTP组，所述荧光团具有两种不同的发射光(例如，远红外和蓝光发射)。相似地，可使用具有荧光团的rtdNTP组，所述荧光团具有两种不同的发射光。四种不同的发射光在两个rtNTP组之间是光学上可区分的。一个示例性的核苷酸组在图3中示出。
表3：用于2-染料SBS配置的核苷酸
以上示例的2-染料方法，提供了超过之前示例的1-染料方法的优势，因为在2-染料方法的检测阶段过程中不使用化学处理步骤，诸如链霉亲和素结合和THP裂解。这通过图3中的针对2-染料方法示出的延伸循环方案被证明。然而，在该特定的2-染料方法的情况下，使用了能够区分4种不同颜色的光学装置。如通过该比较说明的，可使用不同方法以调整光学复杂性或流体复杂性以适应特定测序平台。例如，通过添加流体步骤以在SBS检测循环过程中修饰核苷酸，人们可使用较少的和/或较为简单的光学元件。反之，较为复杂的光学元件是可得的情况下，可使用较少的和/或较为简单的流体操作。
样品制备
如在图4中示例的，可制备基因组DNA或其他核酸样品用于2-引物SBS。该方法允许产生具有两个不同引发位点的DNA模板。可在提供在期望尺寸范围内的片段的条件下进行该方法。如图4所示，可使用转座酶用两个不同的标签序列对基因组DNA样品加标签。可选择条件以产生平均约300个核苷酸长且具有在一个末端的第一标签和在另一个末端的第二标签的片段。标签将形成单链突出端，衔接子可与所述单链突出端杂交。如图4所示的杂交的衔接子的连接将产生2-片段多联体，其具有以下的序列区域顺序：p5序列、读段1引发位点、DNA片段1、RNA聚合酶启动子、读段1’引发位点、DNA片段2、索引及p7序列。在多联体末端的p5和p7序列允许例如使用从Illumina,Inc.(San Diego,CA)可得的测序流通池和试剂盒的捕获和桥式扩增。在正交SBS反应中，分别地，读段1引发位点与待通过DNA聚合酶延伸的DNA引物互补，且读段1’引发位点与待通过RNA聚合酶延伸的RNA引物互补。RNA聚合酶启动子在RNA聚合酶引发位点的下游，以激活RNA聚合酶活性。DNA片段1在DNA聚合酶引发位点的下游，并如此放置以用于在SBS反应中通过DNA聚合酶延伸的检测，且DNA片段2在RNA聚合酶引发位点的下游，并如此放置以用于在SBS反应中通过RNA聚合酶延伸的检测。所述索引是任选地可得的以用于样品追踪的目的。
总体来说，通过该实施例提供的平台预期通过加倍每个循环的测序信息增加测序输出；即，2-引物SBS的150个循环运行将等同于市售可得的SBS配对末端的2x150个循环运行(Illumina,Inc.,San Diego CA)，但另外节省了运行时间和试剂使用。如果在配对末端格式中执行，2-引物SBS配对末端的2x75个循环运行将等同于传统的2x150个配对末端运行。
遍及本申请引用了多个出版物、专利和专利申请。在此这些出版物的公开内容通过引用以其整体并入本申请，以更完整地描述本发明所属技术领域的状态。
术语“包括”在本文中预期是开放式的，不仅包括提及的要素，另外还包括任何另外的要素。
尽管已经参考以上提供的实施例描述本发明，应理解可进行多种修改而不偏离本发明。因此，本发明仅由权利要求限制。

Claims (28)

1.一种用于对核酸模板测序的方法，所述方法包括：
(a)提供位点的阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，
其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列；
(b)使用DNA聚合酶和标记的脱氧核糖核苷酸类似物组，使与所述第一核酸模板结合的DNA引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生包含脱氧核糖核苷酸类似物的DNA引物延伸产物；
(c)使用RNA聚合酶和标记的核糖核苷酸类似物组，使与所述第二核酸模板结合的RNA引物延伸，从而在所述位点的每一个处产生包含核糖核苷酸类似物的RNA引物延伸产物，
(d)检测在所述位点的每一个处的所述DNA引物延伸产物和所述RNA引物延伸产物；以及
(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定在所述位点的每一个处的所述第一核酸模板和所述第二核酸模板的不同序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中与所述标记的核糖核苷酸类似物组相比，所述DNA聚合酶对所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组是选择性的，且其中与所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组相比，所述RNA聚合酶对所述标记的核糖核苷酸类似物组是选择性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中与所述RNA引物相比，所述DNA聚合酶对所述DNA引物是选择性的，且其中与所述DNA引物相比，所述RNA聚合酶对所述RNA引物是选择性的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测使用检测器，所述检测器具有的空间分辨率太低以至于无法分辨距离等于在所述位点的每一个处的所述DNA引物延伸产物和所述RNA引物延伸产物之间的间距的点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测器是光学检测器。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组和所述标记的核糖核苷酸类似物组包含光学标记物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的光学标记物不同于所述标记的核糖核苷酸类似物组的光学标记物。
8.根据权利要求5所述的方法，其中在所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的核苷酸类似物的子集包含光学标记物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述标记的核糖核苷酸类似物组中的核苷酸类似物的子集包含光学标记物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组包含与所述标记的核糖核苷酸类似物组的光学标记物不同的光学标记物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组仅包含在步骤(d)中被检测的一种类型的光学标记物，且所述标记的核糖核苷酸类似物组仅包含在步骤(d)中被检测的一种类型的光学标记物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中将所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的一种类型的光学标记物附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第一类型的基本上所有核苷酸类似物，
将所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的一种类型的光学标记物附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第二类型的核苷酸类似物的子集，
将所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第三类型的基本上所有核苷酸类似物附接到配体，并且
所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第四类型的基本上所有核苷酸类似物未被附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的一种类型的光学标记物或所述配体。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组仅包含在步骤(d)中被检测的两种类型的光学标记物，且所述标记的核糖核苷酸类似物组仅包含在步骤(d)中被检测的两种类型的光学标记物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中仅将所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的两种类型的光学标记物的一种附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第一类型的基本上所有核苷酸类似物，
仅将所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的两种类型的光学标记物的第二种附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第二类型的基本上所有核苷酸类似物，
将所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的两种类型的光学标记物的一种和所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的两种类型的光学标记物的第二种附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第三类型的核苷酸类似物，并且
所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组中的第四类型的基本上所有核苷酸类似物未被附接到所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的两种类型的光学标记物的一种或所述标记的脱氧核糖核苷酸类似物组的两种类型的光学标记物的第二种。
15.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测器的像素捕获来自所述DNA引物延伸产物和所述RNA引物延伸产物两者的信号。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸模板包含与所述第二核酸模板中的碱基部分相同类型的至少一个碱基部分。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一核酸模板和所述第二核酸模板包括DNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一个碱基部分选自由以下组成的组：腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤。
19.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和(c)同时进行。
20.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和(c)顺序进行。
21.根据权利要求1所述的方法，其中单个核酸分子包含所述第一核酸模板和所述第二核酸模板。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核酸模板和所述第二核酸模板在不同的核酸分子上。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点具有不大于100μm2的面积。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点包含所述第一核酸模板和所述第二核酸模板的多个拷贝。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述多个拷贝包含核酸簇。
26.根据权利要求1所述的方法，其中与所述第二核酸模板相比，所述DNA聚合酶对所述第一核酸模板是选择性的，且其中与所述第一核酸模板相比，所述RNA聚合酶对所述第二核酸模板是选择性的。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第一核酸模板包括DNA且所述第二核酸模板包括RNA。
28.一种用于对核酸模板测序的方法，所述方法包括：
(a)提供第一核酸模板和第二核酸模板，
其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列；
(b)使用DNA聚合酶和标记的脱氧核糖核苷酸类似物组，使与所述第一核酸模板结合的DNA引物延伸，从而产生包含脱氧核糖核苷酸类似物的DNA引物延伸产物；
(c)使用RNA聚合酶和标记的核糖核苷酸类似物组，使与所述第二核酸模板结合的RNA引物延伸，从而产生包含核糖核苷酸类似物的RNA引物延伸产物，
(d)使用检测器检测所述DNA引物延伸产物和所述RNA引物延伸产物，所述检测器具有低于所述DNA引物延伸产物和所述RNA引物延伸产物之间的空间间隔的分辨率；以及
(e)重复步骤(b)到(d)，从而确定所述第一核酸模板和所述第二核酸模板的不同序列。
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