JP2007525151A - 一本鎖dnaライブラリーの調製方法 - Google Patents
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- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Abstract
本発明は、増幅反応および配列決定反応に用いる一本鎖DNAライブラリーの作製方法に関する。さまざまな局面において、開示の方法は、DNAを断片化する段階; 断片の末端をポリッシングする段階; 断片をユニバーサルアダプターに連結する段階; ニックの入った断片の鎖置換および鎖伸長を行う段階; 二本鎖の連結産物を精製する段階; 二本鎖の連結産物を固相支持体に捕捉する段階; ならびに一本鎖DNAライブラリー断片を単離する段階、およびこれらの断片を別の固相支持体に結合させる段階を含む。
Description
発明の分野
本発明は、タンパク質化学、分子生物学、および配列解析用の一本鎖ライブラリーの調製方法に関する。より具体的には、本発明は、増幅反応および配列決定反応に用いるDNAの処理方法を含む。
本発明は、タンパク質化学、分子生物学、および配列解析用の一本鎖ライブラリーの調製方法に関する。より具体的には、本発明は、増幅反応および配列決定反応に用いるDNAの処理方法を含む。
関連出願
本出願は、以下の出願に対する優先権の恩典を主張するものである: 2003年1月29日付で出願した米国特許出願第60/443,471号、2003年4月23日付で出願した米国特許出願第60/465,071号; 2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,504号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,313号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,592号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,602号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,592号、および2003年8月25日付で出願した米国特許出願第60/497,985号。本段落の全ての特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、以下の出願に対する優先権の恩典を主張するものである: 2003年1月29日付で出願した米国特許出願第60/443,471号、2003年4月23日付で出願した米国特許出願第60/465,071号; 2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,504号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,313号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,592号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,602号、2003年6月6日付で出願した米国特許出願第60/476,592号、および2003年8月25日付で出願した米国特許出願第60/497,985号。本段落の全ての特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願には同様に、以下の同時係属中の米国特許出願の2004年1月29日付で出願した「Bead Emulsion Nucleic Acid Amplification」、2004年1月29日付で出願した「Bead Emulsion Nucleic Acid Amplification with Continuous Flow」、2004年1月29日付で出願した「Double Ended Sequencing」、および2004年1月29日付で出願した「Methods Of Amplifying And Sequencing Nucleic Acids」が参照により組み入れられる。
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅では、二つのプライマーが、ある数のヌクレオチドによりDNA鋳型分子上で分離されるそれぞれのプライマーに相補的な位置で、鋳型DNAにハイブリダイズするように設計される。プライマー間のおよびプライマーを含む鋳型DNAの塩基配列が反復的な相補鎖伸長反応により増幅され、それにより、多数の標的DNA断片のコピーが数百倍分だけ増幅される。増幅は2nのように指数関数的である(式中nは増幅サイクルの数に等しい)。PCR後、増幅されたDNAは、従来の配列決定法により配列決定することができる(米国特許第6,274,320号を参照されたい)。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅では、二つのプライマーが、ある数のヌクレオチドによりDNA鋳型分子上で分離されるそれぞれのプライマーに相補的な位置で、鋳型DNAにハイブリダイズするように設計される。プライマー間のおよびプライマーを含む鋳型DNAの塩基配列が反復的な相補鎖伸長反応により増幅され、それにより、多数の標的DNA断片のコピーが数百倍分だけ増幅される。増幅は2nのように指数関数的である(式中nは増幅サイクルの数に等しい)。PCR後、増幅されたDNAは、従来の配列決定法により配列決定することができる(米国特許第6,274,320号を参照されたい)。
大きい鋳型DNAを含む試料または長いヌクレオチド配列を含む全ゲノムDNAは、PCRによる効率的な増幅に寄与しない。これらの長い分子にはもともと、プライマーのハイブリダイゼーションに有用な配列がない。さらに、プライマーのハイブリダイゼーション配列を二本鎖DNA分子に付加する場合、増幅されたDNA分子の方向性を確定するのは困難であり、これが配列決定の取り組みの妨げになる。
これらの欠点のいくつかを克服するため、さまざまな方法が設計されている。例えば、米国特許第5,508,169号は、核酸断片のサブセットを同一でない5'突出付着末端または3'突出付着末端に含まれる情報に基づいて指標付け(すなわち、選択または標的化)できることについて記載している。これには、II型制限酵素および断続性の回文構造を認識するII型制限酵素によるDNAの切断により露呈されるもののような、3塩基、4塩基または5塩基の付着末端を有する断片が含まれる。その特許は、(認識配列ではなく)制限酵素による切断部位の付着末端に相補的な突出一本鎖を含むアダプターに似た核酸分子(指標付けリンカー(indexing linker)といわれる)について記載している。さまざまな官能基または特定の用途のために設計した特異的な核酸配列を上記の断片のサブセットに選択的に付着させてもよい。周知の塩基配列を付着末端に有する指標付けリンカーの、その相補的な付着末端を持つ断片のサブセットとの選択的付着は、断片のサブセットの検出、同定、単離、増幅、および操作に使用することができる。
米国特許第6,468,748号は、いくつかの段階を含む遺伝子および/または遺伝子断片の選別方法について記載している。第一に、ds cDNA分子を逆転写により、任意でポリ-T配列の上流に一般的プライマー-鋳型配列を有するポリ-Tプライマーを用いてmRNA分子から調製し、任意で一般的プライマー-鋳型配列を有する、ポリ-T配列を持つds cDNA分子を得る。第二に、ds cDNA分子を、一定数の任意のヌクレオチドのssDNA突出配列が入った付着末端を有する消化cDNA分子を生成する制限酵素で消化する。第三に、消化cDNA分子をdsDNAオリゴヌクレオチドアダプターのセットであって、そのアダプターのそれぞれが、消化cDNAの考えられるssDNA突出配列の一つに相補的な付着末端性ssDNAアダプター配列をその末端の一端に、ssDNAアダプター相補配列に特有の特異的プライマー-鋳型配列を他端に、およびそのセットの異なるアダプターの全てで同じである一定配列をその両端の間に有するdsDNAオリゴヌクレオチドアダプターのセットに連結させる。第四に、連結cDNA分子を、各個別のポリメラーゼ連鎖反応を目的に、任意でcDNAの一般的プライマー-鋳型(配列)を有するcDNAのポリ-T配列にアニーリングするプライマーと、cDNAの特異的プライマー-鋳型配列にアニーリングする異なる特異的プライマーのセットのあるプライマーとを使用して、個別のポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる。第五に、増幅cDNA分子を各個別のポリメラーゼ連鎖反応後の増幅産物を回収することにより重複のない群(特異的プライマー-鋳型配列にアニーリングして、ポリメラーゼ連鎖反応を開始する特異的プライマーにより決定される増幅cDNA分子の各群)に選別する。
米国特許第5,863,722号は、オリゴヌクレオチドタグを有するポリヌクレオチドを選別するための方法および材料について記載している。オリゴヌクレオチドタグは、天然型オリゴヌクレオチドと比べて結合強度および特異性の増加したサブユニットからなる相補的なオリゴマー化合物にハイブリダイズすることができる。そのような相補的なオリゴマー化合物は「タグ相補体」といわれる。タグ相補体のサブユニットは、「アンチセンス単量体」といわれる、非天然型ヌクレオチド類似体の単量体からなってもよく、またはそれらには、アンチセンス単量体を含む、3〜6個の範囲内の長さのヌクレオチドを有するオリゴマーもしくはその類似体であって、最小限に交差ハイブリダイズするセットから選択されるオリゴマーが含まれてもよい。そのようなセットの場合、セットのオリゴマーとセットの他のオリゴマーの相補体とからなる二重鎖には、少なくとも2つのミスマッチが含まれる。言い換えれば、最小限に交差ハイブリダイズするセットのオリゴマーは、せいぜい、同じセットの他のオリゴマーの相補体と少なくとも2つのミスマッチを有する二重鎖を形成するだけである。固相支持体に付着されるタグ相補体を使用して、ポリヌクレオチドの混合物からそれぞれタグを含んだポリヌクレオチドを選別する。各支持体の表面は、特定の配列を有するただ一種類のタグ相補体により誘導体化される。同様に、選別されるポリヌクレオチドはそれぞれ、同じポリヌクレオチドが同じタグを有し、異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するように、オリゴヌクレオチドタグをレパートリーとして含む。従って、支持体およびポリヌクレオチドの集団が、オリゴヌクレオチドタグのその各相補体との特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件の下で混合される場合、同じポリヌクレオチドの亜集団が特定のビーズまたは領域に選別される。その後、ポリヌクレオチドの亜集団をマイクロ生化学的技術により固相支持体上で操作することができる。
米国特許第5,728,524号は、核酸配列の分類の方法であって、それぞれが所定のヌクレオチド塩基を含む配列に対する結合特異性を示すアダプター分子の集団に、その核酸配列を結合させる方法について記載している。得られる連結配列をその後、特定塩基に対する選択に基づいて分類する。
しかしながら、当技術分野では、それぞれが他方とは異なる二つの既知配列を、それぞれが(未知断片配列の)各末端に隣接するようにしてさらに含んだ未知断片配列のライブラリーを作製するための方法については記載されていない。このように、先行技術の欠点を克服する方法に対する必要性が存在する。従って、本発明は、試料中の複数のDNA配列の操作を容易とするのに必要な方法、材料、およびキットを説明するものである。
発明の簡単な概要
本発明は、ライブラリーがさらなる定量分析および比較分析に適するような、特に複数の核酸配列が未知であって、大きい鋳型DNAまたは全ての(もしくは一部の)ゲノムDNAに由来するような、試料から複数の核酸配列のライブラリーを調製するための新規な方法について記載する。本発明のある種の態様において、一本鎖DNA(ssDNA)の配列は、大きい鋳型DNAまたは全てのもしくは一部のゲノムDNAの試料から断片化、ポリッシング(polishing)、アダプター連結、ニック修復、およびssDNAの単離を経て調製される。
本発明は、ライブラリーがさらなる定量分析および比較分析に適するような、特に複数の核酸配列が未知であって、大きい鋳型DNAまたは全ての(もしくは一部の)ゲノムDNAに由来するような、試料から複数の核酸配列のライブラリーを調製するための新規な方法について記載する。本発明のある種の態様において、一本鎖DNA(ssDNA)の配列は、大きい鋳型DNAまたは全てのもしくは一部のゲノムDNAの試料から断片化、ポリッシング(polishing)、アダプター連結、ニック修復、およびssDNAの単離を経て調製される。
従って、ある局面において、本発明により、複数のssDNAを含んだライブラリーをクローニングにより単離するための方法であって、その際に各ssDNAは第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含み、以下の段階を含む方法が提供される:
(a) 大きい鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階;
(b)第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一または第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に付着させて、アダプター連結DNA分子の混合物を形成させる段階;
(c) それぞれが第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含む複数の一本鎖DNA分子を単離する段階; および
(d) 複数のリアクターに一つのDNA分子が含まれるように一本鎖DNA分子をリアクターに送達し、それによってライブラリーをクローニングにより単離する段階。
(a) 大きい鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階;
(b)第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一または第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に付着させて、アダプター連結DNA分子の混合物を形成させる段階;
(c) それぞれが第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含む複数の一本鎖DNA分子を単離する段階; および
(d) 複数のリアクターに一つのDNA分子が含まれるように一本鎖DNA分子をリアクターに送達し、それによってライブラリーをクローニングにより単離する段階。
ある種の局面において、一本鎖DNA分子は、油中水型乳濁液中の液滴(すなわち、マイクロリアクター)内に、またはマルチウェル表面(例えば、PicoTiterプレート)上に送達される。一本鎖DNA分子は、固相支持体(例えば、ビーズ)への付着により送達されてもよい。
他の局面において、第一の二本鎖ユニバーサルアダプターと第二の二本鎖ユニバーサルアダプターとを含むアダプター連結DNA分子は、二本鎖ユニバーサルアダプターの片鎖を介して(第一または第二のユニバーサルアダプターを介して)固相支持体に付着される。固相支持体に付着されていないアダプター連結DNA分子は洗い流されて、アダプター連結DNA分子の片鎖が遊離される。これにより、第一および第二のユニバーサルアダプター対を有する一本鎖分子の集団を含んだ複数のssDNAを含有する混合物が得られ、それによってライブラリーが得られる。
断片化したDNAの配列は、既知であっても未知であってもよい。好ましい態様において、断片化したDNAの配列、特に断片化したDNAの末端の配列は未知である。
別の局面において、本発明には、以下の段階を含む、固相支持体に結合されたssDNAライブラリーを作製するための方法が含まれる: (a) 鋳型ssDNAのライブラリーを作製する段階; (b) 鋳型ssDNAを固相支持体に付着させる段階; および(c) 一つの鋳型ssDNAが付着された固相支持体を単離する段階。別の局面において、本発明には、本明細書に記載の方法により作製される可動性の固相支持体のライブラリーが含まれる。
発明の詳細な説明
本発明は、増幅反応および配列決定反応のための試料DNAの調製に関する。本発明には、以下の段階からなる試料DNAの調製方法が含まれる: (a) 大きい鋳型DNAまたは全ゲノムDNAの試料を断片化して複数のDNA消化断片を作製させる段階; (b) 複数のDNA消化試料に適合末端を作製する段階; (c) 断片化したDNA分子の末端にユニバーサルアダプター配列のセットを連結して複数のアダプター連結DNA分子を作製する段階であって、その際に各ユニバーサルアダプター配列はPCR用プライマー配列と、配列決定用プライマー配列と識別可能なキー配列とを含み、およびその際に一方のアダプターにはビオチンが付着している段階; (d) 複数の連結DNA断片を分離かつ単離する段階; (e) 複数の連結DNA断片の任意部分を取り出す段階; (f) 複数の連結DNA断片をニック修復および鎖伸長する段階; (g) それぞれの連結DNA断片を固相支持体に付着させる段階; および(h) 各末端に特有のアダプターが存在する(すなわち、方向性を与える)一本鎖のアダプター連結DNA断片を含んだ集団を単離する段階。
本発明は、増幅反応および配列決定反応のための試料DNAの調製に関する。本発明には、以下の段階からなる試料DNAの調製方法が含まれる: (a) 大きい鋳型DNAまたは全ゲノムDNAの試料を断片化して複数のDNA消化断片を作製させる段階; (b) 複数のDNA消化試料に適合末端を作製する段階; (c) 断片化したDNA分子の末端にユニバーサルアダプター配列のセットを連結して複数のアダプター連結DNA分子を作製する段階であって、その際に各ユニバーサルアダプター配列はPCR用プライマー配列と、配列決定用プライマー配列と識別可能なキー配列とを含み、およびその際に一方のアダプターにはビオチンが付着している段階; (d) 複数の連結DNA断片を分離かつ単離する段階; (e) 複数の連結DNA断片の任意部分を取り出す段階; (f) 複数の連結DNA断片をニック修復および鎖伸長する段階; (g) それぞれの連結DNA断片を固相支持体に付着させる段階; および(h) 各末端に特有のアダプターが存在する(すなわち、方向性を与える)一本鎖のアダプター連結DNA断片を含んだ集団を単離する段階。
特別の定めのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。本発明の実施に際して、本明細書に記載のものに類似であるかまたは等価である方法および材料を使用することができるが、例示として適当な方法および材料を以下に記載する。例えば、三つまたはそれ以上の段階を含む方法が記載される場合がある。そのような方法では、全ての段階が規定の目標を達成するのに必要とされるとは限らない可能性があり、本発明はこれら(段階)の個別の目標を達成するのに、孤立的段階の使用を想定する。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず限定を意図するものではない。
本明細書で用いられる場合の「ユニバーサルアダプター」という用語は、PCRのプライミングのためのヌクレオチド配列と配列決定のプライミングのためのヌクレオチド配列とを含むように設計される二本の相補的な且つアニーリングするオリゴヌクレオチドを指す。任意で、ユニバーサルアダプターは、非反復ヌクレオチド配列からなる特有の識別可能なキー配列(すなわち、ACGT、CAGTなど)をさらに含むことができる。ユニバーサルアダプターのセットには、二本鎖DNAの末端に連結され得る二本の特有であり且つ異なる二本鎖配列が含まれる。従って、同じユニバーサルアダプターまたは異なるユニバーサルアダプターをDNA分子の両端に連結することができる。一本鎖である大きいDNA分子に含まれる場合またはオリゴヌクレオチドとして存在する場合、ユニバーサルアダプターは、一本鎖のユニバーサルアダプターということができる。
本明細書で用いられる場合の「識別可能なキー配列」という用語は、4種類のデオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)の組み合わせを含む配列を指す。DNA断片の丸ごとのライブラリーには、識別可能な同一配列を使用することができる。または、異なる生物に由来するDNA断片のライブラリーを追跡するには、識別可能な異なるキー配列を使用することができる。二つまたはそれ以上のライブラリーの混合には、識別可能なより長いキー配列を使用することができる。
本明細書で用いられる場合の「複数の分子」という用語は、同じ供給源から単離されたDNAを指し、したがって、異なる生物は同じ方法により別々に調製することができる。ある態様において、複数のDNA試料は、大きいDNA断片、例えば、ゲノムDNA、cDNA、ウイルスDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA(例えば、BAC、YAC、MAC、PAC)、合成DNA、ファージミドDNA、ファセミド(phasemid)DNAから、またはウイルスRNAの逆転写産物から得られる。このDNAは、任意の哺乳類(すなわち、ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類、またはイヌ)、植物、鳥類、爬虫類、魚類、真菌、細菌、またはウイルスを含む、任意の供給源から得ることができる。
本明細書で用いられる場合の「ライブラリー」という用語は、大きい鋳型DNA、例えば、断片化したゲノムまたは全ゲノムから作製された小さなサイズのDNA種のサブセットを指す。
本明細書で用いられる場合の「特有のPCRプライミング領域」などで、「特有の」という用語は、増幅されるまたは配列決定されるDNA分子内に存在しないまたは極端に低いコピーレベルで存在する配列を指す。
本明細書で用いられる場合の「適合する」という用語は、アダプター分子が付着できる二本鎖DNAの末端(すなわち、平滑末端または付着末端)を指す。
本明細書で用いられる場合の「断片化する」という用語は、大きいDNA分子を小さなDNA断片に変換する工程を指す。
本明細書で用いられる場合の「大きい鋳型DNA」とは、5 kb、10 kb、または25 kbを超える、好ましくは500 kbを超える、より好ましくは1 MBを超える、および最も好ましくは5 MBまたはそれ以上のDNAとすることができる。
本明細書で用いられる場合の「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、完全に相補的な配列のみが互いにハイブリダイズできる条件を指す。
以下の説明は、本発明の方法に含まれる基本的段階を要約している。各段階は特定の順序で列挙されているが、しかしながら、当業者に公知のように、各工程の順序は同じ結果を達成するように操作されてもよい。そのような操作は、本発明者らによって予想されている。さらに、一部の段階は、当業者に同様にして公知であるように最小化されてもよい。
断片化
本発明の方法の実施に際して、DNA試料の断片化は、当業者に周知の任意の手段により行われることができる。断片化は酵素的手段、化学的手段、または機械的手段により行われることが好ましい。機械的手段には、超音波処理、フレンチプレス、HPLC、HydroShear(GeneMachines, San Carlos, CA)および噴霧を含むことができる。酵素的手段は、デオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)、非特異的ヌクレアーゼ、または単一のもしくは複合の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により行われることができる。好ましい態様において、断片化により、末端に隣接する配列が未知の末端が生ずる。末端に隣接する配列は、少なくとも5塩基、10塩基、20塩基、30塩基、または50塩基とすることができる。
本発明の方法の実施に際して、DNA試料の断片化は、当業者に周知の任意の手段により行われることができる。断片化は酵素的手段、化学的手段、または機械的手段により行われることが好ましい。機械的手段には、超音波処理、フレンチプレス、HPLC、HydroShear(GeneMachines, San Carlos, CA)および噴霧を含むことができる。酵素的手段は、デオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)、非特異的ヌクレアーゼ、または単一のもしくは複合の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化により行われることができる。好ましい態様において、断片化により、末端に隣接する配列が未知の末端が生ずる。末端に隣接する配列は、少なくとも5塩基、10塩基、20塩基、30塩基、または50塩基とすることができる。
酵素による断片化
好ましい態様において、酵素的手段はDNaseIである。DNaseIは、二本鎖DNA(dsDNA)を非特異的に切断して5'-リン酸化オリゴヌクレオチド産物を放出する汎用酵素である。DNaseIは、Mn2+、Mg2+およびCa2+を含有する緩衝液中で至適活性を有する。DNaseIによる消化段階の目的は、大きいゲノムDNAを、ライブラリーを構成するより小さな種に断片化することである。DNaseIの切断特性により、鋳型DNAの無作為消化(すなわち、最小配列の偏り)をもたらし、マンガンに基づく緩衝液の存在下で使用する場合には平滑末端dsDNA断片が圧倒的に多い量になる(Melgar, E. and D.A. Goldthwait.1968. Deoxyribonucleic acid nucleases. II. The effects of metal on the mechanism of action of Deoxyribonuclease I. J. Biol. Chem. 243: 4409)。鋳型ゲノムのDNase I処理後に生ずる消化産物の範囲は、次の三つの要因に依存する: i) 使用する酵素の量(単位); ii) 消化の温度(℃); およびiii) インキュベーション時間(分)。以下に概略を説明するDNase I消化条件は、50〜700塩基対(bp)に及ぶサイズのゲノムライブラリーを得るために最適化された。
好ましい態様において、酵素的手段はDNaseIである。DNaseIは、二本鎖DNA(dsDNA)を非特異的に切断して5'-リン酸化オリゴヌクレオチド産物を放出する汎用酵素である。DNaseIは、Mn2+、Mg2+およびCa2+を含有する緩衝液中で至適活性を有する。DNaseIによる消化段階の目的は、大きいゲノムDNAを、ライブラリーを構成するより小さな種に断片化することである。DNaseIの切断特性により、鋳型DNAの無作為消化(すなわち、最小配列の偏り)をもたらし、マンガンに基づく緩衝液の存在下で使用する場合には平滑末端dsDNA断片が圧倒的に多い量になる(Melgar, E. and D.A. Goldthwait.1968. Deoxyribonucleic acid nucleases. II. The effects of metal on the mechanism of action of Deoxyribonuclease I. J. Biol. Chem. 243: 4409)。鋳型ゲノムのDNase I処理後に生ずる消化産物の範囲は、次の三つの要因に依存する: i) 使用する酵素の量(単位); ii) 消化の温度(℃); およびiii) インキュベーション時間(分)。以下に概略を説明するDNase I消化条件は、50〜700塩基対(bp)に及ぶサイズのゲノムライブラリーを得るために最適化された。
好ましい態様において、DNase Iを使用して大きい鋳型DNAまたは全ゲノムDNAを1〜2分間消化し、50〜500 bp、または50〜700 bpに及ぶオリゴヌクレオチドの集団を作製する。別の好ましい態様において、DNase I消化を10℃〜37℃の温度で行う。別の好ましい態様において、消化されたDNA断片は長さが50 bp〜700 bpである。
機械的断片化
核酸の断片化のための別の好ましい方法は、機械的な断片化である。機械的な断片化方法には、超音波処理および噴霧、ならびにHydroShear、HPLC、およびフレンチプレスの使用が含まれる。超音波処理は、適当な緩衝液(すなわち、10 mM Tris、0.1 mM EDTA)に入れたDNAを含有しており、さまざまな回数の10秒バーストの間、最大出力と連続出力を使用して超音波処理する管により行われることができる。超音波破砕機は、例えば、Misonix社(Farmingdale, NY)から市販されており、本質的にはBankier and Barrell (Bankier, A.T., Weston, K.M., and Barrell, B.G.,「Random cloning and sequencing by the M13/dideoxynucleotide chain termination method」, Meth. Enzymol. 155, 51-93 (1987)により記載されているように使用することができる。超音波処理の場合、試料を氷上に保持することにより、核酸を均一な温度に維持することが好ましい。例えば、0℃の一定温度条件は、均一の断片分布を維持するのに好ましい。超音波処理に最適な条件は、調製用の超音波処理を行う前に、所定のDNA試料に対して実験的に決定することができる。例えば、DNAの一定分割量を超音波処理の下で異なる時間、処理することができ、DNAのサイズと質をPAGEにより分析することができる。最適な超音波処理条件が決定されると、残りのDNAをその予め決められた条件に従って超音波処理することができる。
核酸の断片化のための別の好ましい方法は、機械的な断片化である。機械的な断片化方法には、超音波処理および噴霧、ならびにHydroShear、HPLC、およびフレンチプレスの使用が含まれる。超音波処理は、適当な緩衝液(すなわち、10 mM Tris、0.1 mM EDTA)に入れたDNAを含有しており、さまざまな回数の10秒バーストの間、最大出力と連続出力を使用して超音波処理する管により行われることができる。超音波破砕機は、例えば、Misonix社(Farmingdale, NY)から市販されており、本質的にはBankier and Barrell (Bankier, A.T., Weston, K.M., and Barrell, B.G.,「Random cloning and sequencing by the M13/dideoxynucleotide chain termination method」, Meth. Enzymol. 155, 51-93 (1987)により記載されているように使用することができる。超音波処理の場合、試料を氷上に保持することにより、核酸を均一な温度に維持することが好ましい。例えば、0℃の一定温度条件は、均一の断片分布を維持するのに好ましい。超音波処理に最適な条件は、調製用の超音波処理を行う前に、所定のDNA試料に対して実験的に決定することができる。例えば、DNAの一定分割量を超音波処理の下で異なる時間、処理することができ、DNAのサイズと質をPAGEにより分析することができる。最適な超音波処理条件が決定されると、残りのDNAをその予め決められた条件に従って超音波処理することができる。
核酸の断片化のための別の好ましい方法は、噴霧装置による処理である(例えば、GeneMachines, San Carlos, Californiaから得られる手順、およびハードウェア。同様に米国特許第5,506,100号および米国特許第5,610,010号を参照されたい)。噴霧の場合、流体力学的剪断力を使用して、DNA鎖を断片化する。例えば、急縮小流路(abrupt contraction)を備えた管にDNA水溶液を通すことができる。溶液が縮小流路に接近するにつれ、流体は縮小流路の狭い領域を通過する体積流量を維持するように加速する。この加速の間、流体抵抗により、DNAは切れるまで引き延ばされる。任意で、DNA溶液は、断片をさらに剪断するにはあまりにも短いところまで、縮小流路に数回(例えば、15〜20サイクル)通すことができる。縮小流路および流体の流量を調整することにより、最終的なDNA断片のサイズを決定することができる。反応条件を制御するおよび監視するためのソフトウェアは、噴霧過程の自動化を可能とするのに使用することができる。別の利点として、噴霧化のための特別な緩衝液の必要性がない。例えば、DNAは、以下に限定されることはないが、水、Tris緩衝液、Tris-EDTA緩衝液、および0.5 MまでのNaClを有するTris-EDTAを含む、さまざまな溶液に懸濁させることができる。
ポリッシング
Mn2+の存在下でDNase Iを用いて鋳型ゲノムDNA(gDNA)をポリッシング消化することで、平滑末端であるかまたは1塩基もしくは2塩基の長さの突出末端を有するDNAの断片が生成される。同様に、機械的手段によるDNAの断片化により、平滑末端または突出末端を有する断片の組み合わせが得られる。これらのDNA断片は、酵素的にまたは機械的に作製されたかにかかわらず、下記の手順を使用して「ポリッシングされる」ことができる。
Mn2+の存在下でDNase Iを用いて鋳型ゲノムDNA(gDNA)をポリッシング消化することで、平滑末端であるかまたは1塩基もしくは2塩基の長さの突出末端を有するDNAの断片が生成される。同様に、機械的手段によるDNAの断片化により、平滑末端または突出末端を有する断片の組み合わせが得られる。これらのDNA断片は、酵素的にまたは機械的に作製されたかにかかわらず、下記の手順を使用して「ポリッシングされる」ことができる。
ポリッシング(末端修復ともいわれる)とは、平滑末端DNAへの非平滑末端DNAの変換を指す。一つの方法として、ポリッシングは、BAL32ヌクレアーゼまたはマングビーン・ヌクレアーゼのような、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを用いた処理により行われることができる。一般に、ヌクレアーゼは使用前に正確に測定されるべきである。
ある態様において、平滑末端は、Pfu DNAポリメラーゼによりもたらされる。他の態様において、平滑末端は、T4 DNAポリメラーゼまたはクレノーDNAポリメラーゼのような他のDNAポリメラーゼによりもたらされる。Pfu「ポリッシング」または平滑末端化を使用して、DNaseIによる鋳型ゲノムの消化後に作製される平滑末端種の量を増加させることができる。Pfu DNAポリメラーゼは、5'突出部を埋める。さらに、Pfu DNAポリメラーゼは、3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を示す。従って、この酵素を使用して一つのおよび二つのヌクレオチド伸長部分を除去し、アダプターの連結に使用可能な平滑末端DNA断片の量をさらに増加させることができる。
アダプターの連結
DNAライブラリーの断片化および平滑末端化に続いて、ユニバーサルアダプター配列を各DNA断片に付加することができる。本発明の種々の態様において、ユニバーサルアダプターは、以下を含むように設計される: 1) 次の2)に隣接して位置する長さが通常10〜20 bpである(任意の適当なサイズを使用することができる)特有のPCRプライミング領域のセット; 2) 任意で次の3)に先行する、長さが通常10〜20 bpである(任意の適当なサイズを使用することができる)特有の配列決定プライミング領域のセット; 3) 4種のデオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)のそれぞれの少なくとも1つの組み合わせを含む特有の識別可能なキー配列(例えば、長さが1〜12 bp)。好ましい態様において、識別可能なキー配列は4塩基長である。別の態様において、識別可能なキー配列は1〜4塩基の組み合わせとすることができる。別の態様において、キー配列は4種のヌクレオチドのそれぞれを1つ含む。ある種の態様において、キー配列は1つまたは複数のリボヌクレオチド、例えば、Uを含む。
DNAライブラリーの断片化および平滑末端化に続いて、ユニバーサルアダプター配列を各DNA断片に付加することができる。本発明の種々の態様において、ユニバーサルアダプターは、以下を含むように設計される: 1) 次の2)に隣接して位置する長さが通常10〜20 bpである(任意の適当なサイズを使用することができる)特有のPCRプライミング領域のセット; 2) 任意で次の3)に先行する、長さが通常10〜20 bpである(任意の適当なサイズを使用することができる)特有の配列決定プライミング領域のセット; 3) 4種のデオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)のそれぞれの少なくとも1つの組み合わせを含む特有の識別可能なキー配列(例えば、長さが1〜12 bp)。好ましい態様において、識別可能なキー配列は4塩基長である。別の態様において、識別可能なキー配列は1〜4塩基の組み合わせとすることができる。別の態様において、キー配列は4種のヌクレオチドのそれぞれを1つ含む。ある種の態様において、キー配列は1つまたは複数のリボヌクレオチド、例えば、Uを含む。
本発明のある態様において、それぞれの特有のユニバーサルアダプターは長さが44 bpであるが、任意の適当なサイズを使用することができる。好ましい態様において、ユニバーサルアダプターは、T4 DNAリガーゼによりDNA断片の各末端に連結されて、各DNA断片に対し全体で88 bpのヌクレオチド付加をもたらすが、任意の適当なサイズを使用することができる。異なるユニバーサルアダプターを各DNAライブラリーの調製専用に設計することができ、その結果、各生物に特有の識別子(identifier)を与えることができる。例えば、異なるライブラリーの調製に、異なるキー配列を採用することができる。当業者には明らかであるように、ユニバーサルアダプターのサイズおよび配列は変化させることができるものと理解される。従って、本発明で用いるアダプターは、本明細書に記載のサイズおよび配列に限定されることはない。
例えば、二つの異なる(すなわち、「第一」および「第二」)ユニバーサルアダプターを調製するのに、一本鎖オリゴヌクレオチドを商業者(例えば、Integrated DNA Technologies, IAまたはOperon Technologies, CA)に注文することができる。本発明のある種の態様において、ライブラリーの第一アダプターの全てがPCRプライミング配列、配列決定用プライマー配列、および識別可能なキー配列を含む、あるヌクレオチド配列を共有し、その一方、第二アダプターの全てが別のヌクレオチド配列を共有する。別の態様において、ユニバーサルアダプターのオリゴヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合に代えて一つまたは複数のホスホロチオエート結合を用いた合成の間に修飾される。例えば、アダプターのオリゴヌクレオチドは、二つまたは三つのホスホロチオエート結合を5'と3'双方の末端に、または一端に含むことができる。未修飾のオリゴヌクレオチドは通常、ヌクレオチド塩基間のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する混入ヌクレアーゼによる急速な分解を受けやすい。オリゴヌクレオチドの用途で用いるのに使用可能な一つの単純かつ広く使用されるヌクレアーゼ抵抗性の化学的性質がホスホロチオエート修飾である。ホスホロチオエートでは、硫黄原子がオリゴヌクレオチド骨格中の非架橋酸素に取って代わることで、これを全ての形態のヌクレアーゼ消化に抵抗性(すなわち、エンドヌクレアーゼ消化およびエキソヌクレアーゼ消化の双方に抵抗性)とする。各オリゴヌクレオチドをHPLC精製して、合成オリゴヌクレオチド調製物に混入しないことまたは擬似オリゴヌクレオチド配列が存在しないことを確実にする。
ユニバーサルアダプターは、断片化したDNAに対する定方向連結を可能とするように設計される。二本鎖ユニバーサルアダプターの各セットは、相互にまたは平滑末端DNA断片に連結できない非相補的な5'の4塩基突出部を含むPCRプライミング領域を考慮して設計される。従って、結合は、アダプターの3'末端とDNA断片の5'末端との間でまたはDNA断片の3'末端とアダプターの5'末端との間で起こる。二本鎖ユニバーサルアダプターの配列は、主に相補オリゴヌクレオチドをアニーリング可能として、二つの非相補オリゴヌクレオチド間の交差ハイブリダイゼーションを阻止可能とする配列を考慮して設計される一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて作製される。
ある態様において、ユニバーサルアダプターの95%が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。好ましい態様において、ユニバーサルアダプターの97%が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。より好ましい態様において、ユニバーサルアダプターの99%が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。最も好ましい態様において、ユニバーサルアダプターの100%が相補オリゴヌクレオチドのアニーリングから形成される。プライマーと擬似標的配列との間の交差ハイブリダイゼーションを最少化するためのプタイマー設計の典型的な方法が実施例2に示されている。
本発明のある種の局面において、突出するヌクレオチド(例えば、T)を第一および第二アダプターの3'平滑末端に付加する。並行して、ポリメラーゼを使用して、鋳型DNAの5'平滑末端に突出するヌクレオチド(例えば、A)を付加する。アダプターおよび鋳型の突出ヌクレオチドは相補的であり、一層効率的なアダプターの連結を可能とする。
他の局面において、プラスミド捕捉系を開示の方法に従って使用する。例えば、二本鎖ユニバーサルアダプターをプラスミドに挿入することができる。アダプター領域は、以下の配列を順番に含むことができる: 制限部位、PCRプライマー配列1、配列決定用プライマー配列1、キー配列1、制限部位、キー配列2、配列決定用プライマー配列2、PCRプライミング配列2、および制限部位。一つのアプローチでは、プラスミドをキー配列1とキー配列2との間を切断する一つまたは複数の制限酵素で消化する。断片化された鋳型DNAをキー配列1とキー配列2との間に連結する。連結されたコンストラクトを次に消化して、PCRプライミング配列2の後で切断する。PCRプライミング配列2に隣接する消化末端をビオチン化ヌクレオチドで埋める。ビオチン化コンストラクトを消化して、PCRプライマー配列1の前で切断する。アダプター-DNA断片-アダプター-ビオチン断片を切り出して、例えば、ストレプトアビジン磁気ビーズに結合させることで単離する。プラスミド捕捉系の他の態様が同様に、周知のクローニング技術の適用により可能である。これらの態様は同様に本発明に包含される。
二つのアダプターのうちの一方を支持体の結合部分に結び付けることができる。好ましい態様において、5'ビオチンを第一ユニバーサルアダプターに付加して、その後の鋳型ssDNAの単離およびビオチン結合タンパク質(例えば、ストレプトアビジン、NeutrAvidin(商標)またはアビジン)で飽和した固相支持体の表面とのユニバーサルアダプターの非共有結合を可能とする。適当な支持体には、以下に限定されることはないが、磁気ビーズ、アフィニティーカラム、膜(例えば、PDVF膜、ニトロセルロースなど)が含まれ、これらはストレプトアビジンまたは結合対のもう一方のメンバーで被覆することができる。他の結合が当技術分野において公知であり、ビオチン-ストレプトアビジンの代わりに使用されてもよい。例えば、抗体/抗原-抗原決定基、受容体/リガンドおよびオリゴヌクレオチド対合または相補結合を使用することができる。ある態様において、固相支持体はビーズ、好ましくはポリスチレンビーズである。一つの好ましい態様において、ビーズは約2.8 μmの直径を有するが、任意の適当なサイズを使用することができる。別の好ましい態様において、ビーズは常磁性ビーズ(例えば、Dynal Biotech, Inc., Lake Success, NY)である。本明細書で用いられる場合のこのビーズを「試料調製用ビーズ」という。
各ユニバーサルアダプターは、一方がセンス配列を含み、もう一方がアンチセンス(相補)配列を含む、二つのssDNAオリゴヌクレオチドの組み合わせとアニーリングにより調製することができる。ユニバーサルアダプター設計の略図が、図2に描かれている。
連結産物の単離
ユニバーサルアダプターの連結により、アダプターを各端に有する断片化したDNA、未結合の単一アダプター、およびアダプター二量体の形成が起こる。好ましい態様において、アダプターが連結されたDNAライブラリー集団を未連結の単一アダプターおよびアダプター二量体の集団から分離かつ単離する方法として、アガロースゲル電気泳動が使用される。他の態様において、断片は、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、ショ糖沈降法、または当業者に公知の他の核酸分離技術により分離することができる。DNAのDNase I消化手順により通常、50〜700 bpに及ぶライブラリー集団が得られる。好ましい態様において、DNAマーカーの存在下でアガロースゲル電気泳動を行う際に、88 bpのユニバーサルアダプターセットの付加は、DNAライブラリー集団をより大きいサイズに変えて、約130〜800 bpのサイズ範囲の移動プロファイルをもたらすことになり; アダプター二量体は88 bpに移動することになり; および未連結のアダプターは44 bpに移動することになる。従って、サイズが200〜800 bpに及ぶ多数の二本鎖DNAライブラリーをアガロースゲルから物理的に単離して、標準的なゲル抽出技術により精製することができる。ある態様において、アダプターが連結されたDNAライブラリーのゲル分離により、サイズが200〜500 bpに及ぶライブラリー集団が回収されることになる。アダプターが連結された断片を識別する他の方法は、当業者に公知である。
ユニバーサルアダプターの連結により、アダプターを各端に有する断片化したDNA、未結合の単一アダプター、およびアダプター二量体の形成が起こる。好ましい態様において、アダプターが連結されたDNAライブラリー集団を未連結の単一アダプターおよびアダプター二量体の集団から分離かつ単離する方法として、アガロースゲル電気泳動が使用される。他の態様において、断片は、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過、ショ糖沈降法、または当業者に公知の他の核酸分離技術により分離することができる。DNAのDNase I消化手順により通常、50〜700 bpに及ぶライブラリー集団が得られる。好ましい態様において、DNAマーカーの存在下でアガロースゲル電気泳動を行う際に、88 bpのユニバーサルアダプターセットの付加は、DNAライブラリー集団をより大きいサイズに変えて、約130〜800 bpのサイズ範囲の移動プロファイルをもたらすことになり; アダプター二量体は88 bpに移動することになり; および未連結のアダプターは44 bpに移動することになる。従って、サイズが200〜800 bpに及ぶ多数の二本鎖DNAライブラリーをアガロースゲルから物理的に単離して、標準的なゲル抽出技術により精製することができる。ある態様において、アダプターが連結されたDNAライブラリーのゲル分離により、サイズが200〜500 bpに及ぶライブラリー集団が回収されることになる。アダプターが連結された断片を識別する他の方法は、当業者に公知である。
ニック修復
ユニバーサルアダプターに使用されるDNAオリゴヌクレオチドは5'リン酸化されていないので、リガーゼ処理の後、ギャップが断片化したDNAの3'連結部に存在することになる(図3Aを参照されたい)。これらの「ギャップ」または「ニック」は、ニックの入ったDNA断片に結合し、これを鎖置換、および伸長できるDNAポリメラーゼ酵素を使用することにより埋めることができる。3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性はないが5'から3'方向のエキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼは、ニックの修復およびニックの入っていない二本鎖DNAの形成をもたらすように、ニックを認識し、ニックの入った鎖を置換して、鎖を伸長する能力を有する(図3Bおよび3Cを参照されたい)( Hamilton, S.C., J.W. Farchaus and M.C. Davis. 2001. DNA polymerases as engines for biotechnology. BioTechniques 31:370)。
ユニバーサルアダプターに使用されるDNAオリゴヌクレオチドは5'リン酸化されていないので、リガーゼ処理の後、ギャップが断片化したDNAの3'連結部に存在することになる(図3Aを参照されたい)。これらの「ギャップ」または「ニック」は、ニックの入ったDNA断片に結合し、これを鎖置換、および伸長できるDNAポリメラーゼ酵素を使用することにより埋めることができる。3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性はないが5'から3'方向のエキソヌクレアーゼ活性を示すDNAポリメラーゼは、ニックの修復およびニックの入っていない二本鎖DNAの形成をもたらすように、ニックを認識し、ニックの入った鎖を置換して、鎖を伸長する能力を有する(図3Bおよび3Cを参照されたい)( Hamilton, S.C., J.W. Farchaus and M.C. Davis. 2001. DNA polymerases as engines for biotechnology. BioTechniques 31:370)。
ポリメラーゼ、リガーゼ、およびキナーゼを含むが、これらに限定されることはない、さまざまな修飾酵素がニック修復段階に使用される。本発明の方法で使用できるDNAポリメラーゼには、例えば、大腸菌(E. coli) DNAポリメラーゼI、サーモアンアエロバクター・サーモハイドロサルファリカス(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)ポリメラーゼI、およびバクテリオファージφ29が含まれる。好ましい態様において、鎖置換酵素のバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)ポリメラーゼI(Bst DNAポリメラーゼI)を使用して、ニックの入ったdsDNAを修復し、ニックの入っていないdsDNAを作製する(図3Dを参照されたい)。別の好ましい態様において、リガーゼはT4 DNAリガーゼであり、キナーゼはT4ポリヌクレオチドキナーゼである。
一本鎖DNAの単離
ニックの入っていないdsDNAの作製に続いて、第一および第二双方のアダプター分子を含むssDNAを単離することができる。二本鎖DNAライブラリーには、アダプターが以下の配置で結合される。
ユニバーサルアダプターA - DNA断片 - ユニバーサルアダプターA
ユニバーサルアダプターB - DNA断片 - ユニバーサルアダプターA*
ユニバーサルアダプターA - DNA断片 - ユニバーサルアダプターB*
ユニバーサルアダプターB - DNA断片 - ユニバーサルアダプターB
ニックの入っていないdsDNAの作製に続いて、第一および第二双方のアダプター分子を含むssDNAを単離することができる。二本鎖DNAライブラリーには、アダプターが以下の配置で結合される。
ユニバーサルアダプターA - DNA断片 - ユニバーサルアダプターA
ユニバーサルアダプターB - DNA断片 - ユニバーサルアダプターA*
ユニバーサルアダプターA - DNA断片 - ユニバーサルアダプターB*
ユニバーサルアダプターB - DNA断片 - ユニバーサルアダプターB
「A」および「B」は、第一および第二アダプターに相当する。所望の集団は、星印で指定されている。
ユニバーサルアダプターは、一方のユニバーサルアダプターのみが5'ビオチン部分を有するように設計されることが好ましい。例えば、ユニバーサルアダプターBが5'ビオチン部分を有する場合、ストレプトアビジンで被覆された試料調製用ビーズを使用して、ユニバーサルアダプターBを有する二本鎖DNAライブラリー種を全て結合することができる。二つのユニバーサルアダプターAを含むゲノムライブラリー集団種は、5'ビオチン部分を含んでおらず、ストレプトアビジン含有試料調製用ビーズに結合しないことになり、従って、洗い流すことができる。ビーズに付着したままであると思われる唯一の種は、ユニバーサルアダプターAとBとを有するものおよび二つのユニバーサルアダプターB配列を有するものである。
二つのユニバーサルアダプターB配列(すなわち、各5'末端にビオチン部分)を有するDNA種は、二本鎖に含まれる各鎖が結合するので、ストレプトアビジン被覆試料調製用ビーズに各末端で結合することになる。ユニバーサルアダプターAとユニバーサルアダプターBとを有する二本鎖DNA種は、単一の5'ビオチン部分を含むことになり、従って、ストレプトアビジン被覆ビーズに一端のみで結合することになる。試料調製用ビーズが磁性である場合、ビーズは、磁化時には固相支持体に結合したままである。従って、低塩(「融解」または変性)溶液の存在下では、単一のユニバーサルアダプターAと単一のユニバーサルアダプターB配列とを含んだそのDNA断片だけが相補的な非結合鎖を遊離することになる。ビーズに付着したこの一本鎖DNAの集団を回収して、例えば、ピロリン酸配列決定法、リアルタイム定量PCR法、アガロースゲル電気泳動法、蛍光色素結合アッセイ法(PicoGreen(登録商標); Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)、またはキャピラリーゲル電気泳動法により定量することができる。
ある態様において、本発明の方法により作製されるssDNAライブラリーを定量して、単位容量あたりの分子数を算出する。例えば、分子を、ssDNA種のユニバーサルアダプター末端のPCRプライミング領域に相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プライマーを含んだ固相支持体にアニーリングさせることができる。
ある種の態様において、ssDNAライブラリーの分子にアニーリングした捕捉プライマーを含むビーズをサーモサイクラーに移し、PCR増幅を可能とすることができる。DNAビーズに捕捉された一本鎖DNAの単一種のクローン集団を次に、配列決定することができる。ある態様において、固相支持体はビーズ、好ましくはセファロースビーズである。本明細書で用いられる場合のこのビーズを「DNA捕捉ビーズ」という。
本明細書で使用されるビーズは、任意の手ごろなサイズのものとすることができ、さまざまな周知の材料から製造することができる。そのような材料の例としては、無機材料、天然高分子、および合成高分子が挙げられる。これらの材料の具体例としては、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス; シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニル・ピロリドン、ビニルとアクリルアミドとの共重合体、ジビニルベンゼンまたは同様のもので架橋したポリスチレン(Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390を参照されたい)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然スポンジ、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン(例えば、セファデックス(商標))およびアガロースゲル(セファロース(商標))ならびに当業者に周知の固相支持体が挙げられる。ある態様において、DNA捕捉ビーズの直径は20〜70 μmである。好ましい態様において、DNA捕捉ビーズの直径は20〜50 μmである。より好ましい態様において、DNA捕捉ビーズの直径は約30 μmである。
ある局面において、本発明には、以下の段階を含む、固相支持体のライブラリーを作製するための方法が含まれる: (a) 本明細書に開示される方法により鋳型ssDNAの集団を調製する段階; (b) 固相支持体あたりDNA 1分子が存在するように各鋳型DNAを固相支持体に付着させる段階; (c) 増幅により各固相支持体上に各DNA断片のクローン集団が生じるように一本鎖の鋳型の集団を増幅する段階; (d) 鋳型ssDNAのクローン集団を配列決定する段階。
ある態様において、固相支持体はDNA捕捉ビーズである。別の態様において、DNAはゲノムDNA、cDNA、またはRNA(例えば、ウイルスRNA)の逆転写産物である。DNAは、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン結合、共有結合を介して、または相補オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより固相支持体に付着することができる。ある態様において、各鋳型DNAはユニバーサルアダプターのセットに連結される。別の態様において、ユニバーサルアダプター対には、PCRプライマー配列、配列決定用プライマー配列、および識別可能なキー配列が含まれる。特有の末端を有する一本鎖DNAを単離し、その後、固相支持体に付着させて、クローン増幅のための増幅技術にさらす。DNAはPCRにより増幅することができる。ある局面において、本発明により、本明細書に記載の方法により作製された固相支持体に付着されたライブラリーが提供される。
この方法により調製されるDNAは、鎖状伸長、ローリングサークル増幅、PCR、および配列決定のような、多くの分子生物学的手法に使用することができる。結合反応は、例えば、DNAに対するビーズのモル比を高くすることによって進められることができる。一本鎖DNA分子の捕捉は、ポアソン分布に従い、DNAが付着していないビーズ、DNA 1分子が付着したビーズ、またはDNA 2分子またはそれ以上の分子が付着したビーズの部分集合が生ずる。好ましい態様において、DNA 1分子が各ビーズに付着している。さらに、単離したライブラリーのさらなる操作に有用とできるアダプターによるさらなる修飾を含むことが可能である。
捕捉ビーズとの鋳型核酸の結合
本発明のある種の態様において、増幅される一本鎖核酸の鋳型は、捕捉ビーズに付着される。核酸の鋳型は、当技術分野において公知の任意の方法で固相支持体の捕捉ビーズに付着することができる。好適な微細ビーズのような固相支持体にDNAを付着させるための多数の方法が当技術分野において存在する。本発明によって、ビーズとのDNAの共有結合性の化学結合は、ホスホアミデート結合を介してDNAの5'-リン酸をアミンで被覆した捕捉ビーズに結合させる、水溶性カルボジイミドのような、標準的なカップリング剤を用いることにより達成することができる。別の代替手段は、同様の化学反応を使用して、最初に特定のオリゴヌクレオチドリンカーをビーズに結合させて、次に、DNAリガーゼを用いてDNAをビーズ上のリンカーに結合させることである。オリゴヌクレオチドをビーズに結合させる他の結合化学反応には、N-ヒドロキシコハク酸アミド(NHS)およびその誘導体の使用が含まれる。そのような方法の場合、オリゴヌクレオチドの一端には、固相支持体と共有結合を形成する反応基(アミン基のような)が含まれてもよく、その一方、リンカーの他端には、固定化されるオリゴヌクレオチドと結合できる第二の反応基が含まれる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、共有結合によりDNA捕捉ビーズに結合される。しかしながら、キレート化または抗原-抗体複合体のような、非共有結合を使用して、オリゴヌクレオチドをビーズに結合させてもよい。
本発明のある種の態様において、増幅される一本鎖核酸の鋳型は、捕捉ビーズに付着される。核酸の鋳型は、当技術分野において公知の任意の方法で固相支持体の捕捉ビーズに付着することができる。好適な微細ビーズのような固相支持体にDNAを付着させるための多数の方法が当技術分野において存在する。本発明によって、ビーズとのDNAの共有結合性の化学結合は、ホスホアミデート結合を介してDNAの5'-リン酸をアミンで被覆した捕捉ビーズに結合させる、水溶性カルボジイミドのような、標準的なカップリング剤を用いることにより達成することができる。別の代替手段は、同様の化学反応を使用して、最初に特定のオリゴヌクレオチドリンカーをビーズに結合させて、次に、DNAリガーゼを用いてDNAをビーズ上のリンカーに結合させることである。オリゴヌクレオチドをビーズに結合させる他の結合化学反応には、N-ヒドロキシコハク酸アミド(NHS)およびその誘導体の使用が含まれる。そのような方法の場合、オリゴヌクレオチドの一端には、固相支持体と共有結合を形成する反応基(アミン基のような)が含まれてもよく、その一方、リンカーの他端には、固定化されるオリゴヌクレオチドと結合できる第二の反応基が含まれる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、共有結合によりDNA捕捉ビーズに結合される。しかしながら、キレート化または抗原-抗体複合体のような、非共有結合を使用して、オリゴヌクレオチドをビーズに結合させてもよい。
制限酵素部位由来の重複末端またはバクテリオファージλを用いるクローニングベクターの「付着末端」のような、DNA断片の末端の特異配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドリンカーを採用することができるが、平滑末端連結を有利に使用することもできる。これらの方法は、米国特許第5,674,743号に詳細に記載されている。ビーズを固定化するのに使用されるどの方法も、本発明の方法の各段階にわたって、固定化されたオリゴヌクレオチドを結合し続けることが好ましい。
ある態様において、各捕捉ビーズは鋳型核酸の一部分を認識する(すなわち、その一部分に相補的である)核酸プライマーを複数有するように設計され、従って、鋳型核酸は捕捉ビーズにハイブリダイズされる。本明細書に記載される方法の場合、鋳型種のクローン増幅が好ましく、従って、ただ一つの特有の鋳型核酸がいずれか一つの捕捉ビーズに付着されることが好ましい。
本明細書で使用されるビーズは、任意の手ごろなサイズのものとすることができ、さまざまな周知の材料から製造することができる。そのような材料の例としては、無機材料、天然高分子、および合成高分子が挙げられる。これらの材料の具体例としては、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニル・ピロリドン、ビニルとアクリルアミドとの共重合体、ジビニルベンゼンまたは同様のもので架橋したポリスチレン(例えば、Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390に記載されているような)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、天然スポンジ、シリカゲル、細孔性ガラス(control pore glass)、金属、架橋デキストラン(例えば、セファデックス(商標))、アガロースゲル(セファロース(商標))、および当業者に周知の固相支持体が挙げられる。好ましい態様において、捕捉ビーズは、直径が約25〜40 μmのセファロースビーズである。
乳化
本発明で使用する場合、付着した鋳型核酸の有無にかかわらず捕捉ビーズは、熱安定性の油中水型乳濁液に懸濁させることができる。複数のマイクロリアクターには、ただ一つの鋳型および一つのビーズが含まれると考えられる。鋳型を含んでいないかまたはビーズを含んでいない多くの液滴が存在する可能性がある。同様に、二コピーまたはそれ以上の鋳型を含んだ液滴が存在する可能性がある。乳濁液は当技術分野において公知の任意の適当な方法により形成することができる。乳濁液を作製する一つの方法が以下に記載されるが、乳濁液を作製するための任意の方法を使用することができる。これらの方法は、当技術分野において公知であり、アジュバント法、向流法、逆流法、回転ドラム法、および膜法を含む。さらに、マイクロカプセルのサイズは、成分の流量および流速を変化させることにより調整することができる。例えば、液滴添加の場合、液滴のサイズおよび到達の総時間を変化させることができる。乳濁液は、封入ビーズ約3000個/マイクロリットルの密度を含むことが好ましい。
本発明で使用する場合、付着した鋳型核酸の有無にかかわらず捕捉ビーズは、熱安定性の油中水型乳濁液に懸濁させることができる。複数のマイクロリアクターには、ただ一つの鋳型および一つのビーズが含まれると考えられる。鋳型を含んでいないかまたはビーズを含んでいない多くの液滴が存在する可能性がある。同様に、二コピーまたはそれ以上の鋳型を含んだ液滴が存在する可能性がある。乳濁液は当技術分野において公知の任意の適当な方法により形成することができる。乳濁液を作製する一つの方法が以下に記載されるが、乳濁液を作製するための任意の方法を使用することができる。これらの方法は、当技術分野において公知であり、アジュバント法、向流法、逆流法、回転ドラム法、および膜法を含む。さらに、マイクロカプセルのサイズは、成分の流量および流速を変化させることにより調整することができる。例えば、液滴添加の場合、液滴のサイズおよび到達の総時間を変化させることができる。乳濁液は、封入ビーズ約3000個/マイクロリットルの密度を含むことが好ましい。
生体反応に適した種々の乳濁液は、Griffiths and Tawfik, EMBO, 22, pp. 24-35 (2003); Ghadessy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, pp. 4552-4557(2001); 米国特許第6,489,103号および国際公開公報第02/22869号(それぞれが完全に参照により本明細書に組み入れられる)のなかで言及されている。Griffiths et al.,(米国特許第6,489,103号および国際公開公報第99/02671号)は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする一つまたは複数の遺伝要素のインビトロ選別のための方法について言及していることに留意されたい。この方法には、遺伝子の区画化、遺伝子の発現、および発現産物に基づく区画化遺伝子の選別が含まれる。本発明とは対照的に、Griffithのマイクロカプセル化による選別方法は、その核酸産物は固定されないおよび固定されることができないので、複数のマイクロカプセルの平行分析には適していない。Griffithsの核酸は固定されないので、それらは解乳化の間に混合されると思われる。
乳濁液は、ビーズを増幅溶液に添加することにより作製されることが好ましい。本明細書で用いられる場合の「増幅溶液」という用語は、鋳型DNAの増幅を行うのに必要な試薬の十分な混合液を指す。増幅溶液の一つの例であるPCR増幅溶液が以下の実施例に示される。当然のことながら、実施される増幅のタイプや鋳型DNAがビーズに付着されるか溶液状態で供与されるかに基づいて、増幅溶液に種々の変更を行うことができる。ある態様において、ビーズと増幅溶液との混合液を生体適合性油(例えば、軽油, Sigma)の撹拌混合液に滴下して、乳化させる。別の態様において、ビーズおよび増幅溶液を十字流の生体適合性油に滴下する。使用される油には、一つまたは複数の生体適合性乳化安定剤が添加されてもよい。これらの乳化安定剤には、Atlox 4912、Span 80、および他の認識されかつ市販されている適当な安定剤が挙げられる。好ましい局面において、乳濁液は温度サイクリングを可能とするため、例えば、少なくとも94℃まで、少なくとも95℃まで、または少なくとも96℃まで熱安定性である。好ましくは、形成される液滴は、サイズが約5μm〜約500μmに、より好ましくは約10μm〜約350μmに、さらにより好ましくは約50〜250μmに、および最も好ましくは約100μm〜約200μmに及ぶ。十字流型の流体混合により、液滴形成の制御、および液滴サイズの均一性を可能とすることが好都合である。本発明者らは、ビーズを含有していない小さな水滴が乳濁液に存在し得ることに注目している。
マイクロリアクターは、必要とされる増幅の程度に合う十分な増幅試薬を含むために十分に大きくするべきである。しかしながら、マイクロリアクターは、それぞれがDNAライブラリーのメンバーを含有するマイクロリアクターの集団を、従来の実験装置、例えば、PCRサーモサイクリング装置、試験管、インキュベーターおよび同様のものにより増幅できるように十分に小さくするべきである。とりわけ、マイクロリアクターの使用により、配列を混合させることなく鋳型の複合混合物(例えば、ゲノムDNA試料または全細胞RNA)の増幅、または一つもしくは複数の鋳型による優位性(例えば、PCR選択の偏り; Wagner et al., 1994, Suzuki and Giovannoni, 1996; Chandler et al., 1997, Polz and Cavanaugh, 1998を参照されたい)が可能となる。
上記の制限により、マイクロリアクターの最適サイズは、直径を平均して100〜200μmとすることができる。このサイズのマイクロリアクターにより、容量が10 ml未満のマイクロリアクターの懸濁液中で約600,000個のメンバーからなるDNAライブラリーの増幅が可能になる。例えば、PCRが選択された増幅方法である場合、マイクロリアクター液10 mlをチューブ96 本収容の通常のサーモサイクラーのチューブ96本分に適合させることができる。好ましい態様において、600,000個のマイクロリアクターの懸濁液は、1 ml未満の容量を有する。1 ml未満の懸濁液は、従来のPCRサーモサイクラーのチューブ約10本中で増幅させることができる。最も好ましい態様において、600,000個のマイクロリアクターの懸濁液は、0.5 ml未満の容量を有する。
本発明の別の態様は、鋳型とビーズとを用いるが、しかし鋳型をビーズに付着させずに核酸増幅を行う方法に向けられる。ある局面において、ビーズには、増幅後に増幅された核酸を結合できるリンカー分子が含まれてもよい。例えば、リンカーは、活性化できるリンカーであってもよい。そのようなリンカーは、公知であり、ストレプトアビジン/ビオチンおよび抗体/抗原のような温度感受性または塩感受性の結合対を含む。鋳型核酸は、ビーズで封入されて、増幅されてもよい。増幅後、増幅された核酸は、例えば、温度または塩濃度の調整によりビーズに結合されてもよい。
増幅
鋳型核酸は、ビーズに付着していてもまたは付着していなくとも、転写に基づく増幅系(Kwoh D. et al., Proc. Natl. Acad Sci. (U.S.A.) 86: 1173 (1989); Gingeras T. R. et al., 国際公開公報88/10315号; Davey, C. et al., 欧州特許第329,822号; Miller, H.I. et al., 国際公開公報第89/06700号)、「RACE法」(Frohman, M. A., In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY (1990))および片側(one-sided)PCR法(Ohara, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86. 5673-5677 (1989))を含む任意の適当な増幅方法により増幅することができる。ジオリゴヌクレオチド増幅法、等温増幅法(Walker, G. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 392-396 (1992))、核酸配列に基づく増幅法(NASBA; 例えば、Deiman B et al., 2002, Mol Biotechnol. 20(2): 163-79を参照されたい)、全ゲノム増幅法(例えば、Hawkins TL et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13(1): 65-7を参照されたい)、鎖置換増幅法(例えば、Andras SC, 2001, Mol Biotechnol. 19(1): 29-44を参照されたい)、ローリングサークル増幅法(米国特許第5,714,320号に概説されている)のようなさらに他の方法、および他の公知の技術を本発明により使用することができる。ある種の局面において、鋳型核酸は、マイクロリアクター中のビーズで封入後に増幅される。または、鋳型核酸は、マルチウェルの表面、例えば、PicoTiterプレートに分配後に増幅される。
鋳型核酸は、ビーズに付着していてもまたは付着していなくとも、転写に基づく増幅系(Kwoh D. et al., Proc. Natl. Acad Sci. (U.S.A.) 86: 1173 (1989); Gingeras T. R. et al., 国際公開公報88/10315号; Davey, C. et al., 欧州特許第329,822号; Miller, H.I. et al., 国際公開公報第89/06700号)、「RACE法」(Frohman, M. A., In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY (1990))および片側(one-sided)PCR法(Ohara, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86. 5673-5677 (1989))を含む任意の適当な増幅方法により増幅することができる。ジオリゴヌクレオチド増幅法、等温増幅法(Walker, G. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 392-396 (1992))、核酸配列に基づく増幅法(NASBA; 例えば、Deiman B et al., 2002, Mol Biotechnol. 20(2): 163-79を参照されたい)、全ゲノム増幅法(例えば、Hawkins TL et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13(1): 65-7を参照されたい)、鎖置換増幅法(例えば、Andras SC, 2001, Mol Biotechnol. 19(1): 29-44を参照されたい)、ローリングサークル増幅法(米国特許第5,714,320号に概説されている)のようなさらに他の方法、および他の公知の技術を本発明により使用することができる。ある種の局面において、鋳型核酸は、マイクロリアクター中のビーズで封入後に増幅される。または、鋳型核酸は、マルチウェルの表面、例えば、PicoTiterプレートに分配後に増幅される。
好ましい態様において、DNA増幅はPCRにより行われる。本発明によるPCRは、PCRに必要な試薬全てを含んだPCR溶液で標的核酸を封入することにより行われることができる。次に、PCRは、その乳濁液を当技術分野において公知の任意の適当なサーモサイクリング法にかけることにより達成することができる。好ましい態様において、30〜50サイクル、好ましくは約40サイクルの増幅が行われる。増幅手順が終わったら、増幅サイクルの後に1回または複数回のハイブリダイゼーションおよび伸長サイクルがあることが望ましいが、必ず必要とされるわけではない。好ましい態様において、10〜30サイクル、好ましくは約25サイクルのハイブリダイゼーションおよび伸長が行われる(例えば、実施例に記載のとおり)。日常的には、鋳型DNAは、通常、少なくとも10,000〜50,000,000コピーが各ビーズに固定化されるまで増幅される。核酸検出用途の場合、より少ない鋳型コピーが必要とされるものと認識される。核酸配列決定用途の場合、本発明者らは、少なくとも2百万〜5千万コピー、好ましくは約1千万〜3千万の鋳型DNAのコピーが各ビーズに固定化されることがよいと考えている。当業者は、ビーズのサイズ(およびその上の捕捉部位)により、捕捉プライマーをどのくらい結合することができるか(および従って増幅された鋳型をどのくらい各ビーズに捕捉することができるか)が決まることを認識すると思われる。
ある局面において、本発明には、以下の段階を含む、複数の一本鎖DNA分子を含んだライブラリーをクローニングにより単離するための方法が含まれる: a) 大きい鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階; b) 第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一または第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に付着させて、アダプター連結DNA分子の混合物を形成させる段階; c) それぞれが第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含む複数の一本鎖DNA分子を単離して、ライブラリーを得る段階; およびd) 複数のリアクターに一つのDNA分子が含まれるように一本鎖DNA分子をリアクターに送達し、それによってライブラリーをクローニングにより単離する段階。
別の局面において、本発明には、以下の段階を含む、複数の一本鎖DNA分子を含んだライブラリーを作製するための方法が含まれる: a) 大きいまたは全ゲノムの鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階; b) 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一のユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に連結させて、アダプター連結DNA分子の混合物を作製させる段階であって、その際に第一のユニバーサルアダプターには固相支持体に結合する部分が含まれる段階; c) 固相支持体に第一の二本鎖ユニバーサルアダプターを含むDNA分子を付着させる段階; d) 固相支持体に付着されていないアダプター連結DNA分子を洗い流す段階; e) 固相支持体に付着されたアダプター連結DNA分子を鎖分離させて、第一の一本鎖ユニバーサルアダプターを一端におよび第二の一本鎖アダプターを他端に含む複数の一本鎖DNA分子を遊離させる段階; およびf) 一本鎖DNA分子を単離し、それによってライブラリーを作製する段階。特定の局面において、(f)はi) 一本鎖DNA分子をリアクターアレイ上のある位置に送達する段階; またはii) 一本鎖DNA分子を油中水型乳濁液中の液滴内に送達する段階により達成することができる。
これらの方法により、第一の二本鎖ユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを連結により断片化したDNA分子に付着させることができる。例えば、DNAリガーゼを使用することができる。これらの方法は、ポリメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、またはその組み合わせのような、DNA修復酵素およびDNA修飾酵素を用いて、アダプター連結DNA分子の混合物における一本鎖ニックを修復する段階をさらに含むことができる。特定の例として、この酵素には、バチルス・ステアロサーモフィルスのポリメラーゼI、T4リガーゼ、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼが挙げられる。これらの方法のための鋳型DNAには、ゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA、合成DNA、ファセミドDNA、ファージミドDNA、または逆転写産物を含むことができる。断片化は酵素的手段、化学的手段、または機械的手段により行われることができる。例えば、DNase I酵素は、10〜37℃の温度で1〜2分間行われる消化で使用することができる。または、制限酵素を使用することができる。機械的手段は、噴霧装置、フレンチプレス、超音波処理器、またはHydroShearとすることができる。
これらの方法で使用する場合、断片化したDNA分子は、長さを50 bp〜700 bpとすることができる。適合末端は平滑末端とすることができる、または適合末端はAもしくはT突出部を含むことができる。平滑末端は、Pfuポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、およびクレノーフラグメントのような酵素で生成することができる。第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターは、一つまたは複数のホスホロチオエート結合を含んでもよく、ビオチン部分に付着されてもよい。さらに、第一の二本鎖ユニバーサルアダプターにもしくは第二の二本鎖ユニバーサルアダプターにまたはどちらの二本鎖ユニバーサルアダプターにも、識別可能なキー配列が含まれてもよい。例えば、識別可能なキー配列は、長さが3〜12ヌクレオチドであり、A、G、C、U、およびTからなる群より選択される少なくとも一つのヌクレオチドを含む。第一および第二の二本鎖ユニバーサルアダプターには、PCRプライミング配列および配列決定用プライマー配列が含まれてもよい。さまざまな局面において、PCRプライミング配列は長さが10〜20塩基対であり、配列決定用プライマー配列は長さが10〜20塩基対である。さらに、PCRプライミング配列および配列決定用プライマー配列は重複してもよい。
これらの方法に合わせて、アダプター連結DNA分子の混合物をゲル電気泳動、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、およびショ糖沈降法からなる群より選択される方法により分離する。複数の一本鎖DNA分子は、低塩処理、高pH処理、および化学的変性処理からなる群より選択される処理により得ることができる。さらなる局面において、複数の一本鎖DNA分子をDNA捕捉ビーズに付着することができる。さらに、DNA捕捉ビーズは、ビオチン/アビジン、リガンド/受容体、抗原/抗体または相補ヌクレオチドのような、結合対の成分を含むことができる。DNA捕捉ビーズは常磁性ビーズであることが好ましい。
本発明には同様に、以下の段階を含む、固相支持体に付着された一本鎖DNAライブラリーを作製するための方法が含まれる: a) 複数の鋳型一本鎖DNAを作製する段階; b) 複数の鋳型ssDNAのそれぞれを固相支持体に付着させる段階; およびc) 鋳型一本鎖DNAが付着された固相支持体を単離する段階。
本発明にはさらに、以下の段階を含む、固相支持体に付着された一本鎖DNAライブラリーを作製するための方法が含まれる: a) 大きい鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階; b) 第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一または第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に付着させて、アダプター連結DNA分子の混合物を作製する段階; c) 第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含む一本鎖DNA分子を単離する段階; およびd) (c)より単離された一本鎖分子を固相支持体に付着させる段階。
この方法で使用する場合、固相支持体はDNA捕捉ビーズとすることができ、DNAはゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA、合成DNA、ファセミドDNA、またはファージミドDNAとすることができる。ある種の局面において、DNAをアビジン/ビオチン、リガンド/受容体、抗原/抗体および相補ヌクレオチドのような結合対により固相支持体に付着させる。この方法により作製される可動性の固相支持体(mobile solid support)のライブラリーも包含される。
さらに、本発明には、第一のアダプターと、鋳型DNAの断片と、第二のアダプターとを含む核酸分子が含まれ、その際に第一のアダプターと第二のアダプターそれぞれが、配列決定用プライマーと、PCRプラマーと識別可能なキー配列とを含み、およびその際に第一のアダプターと第二のアダプターは、解離した場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で相互に交差ハイブリダイズしない。この方法では、PCRプライマーは長さを10〜20塩基対とすることができ、配列決定用プライマーは長さを10〜20塩基対とすることができ、および識別可能なキー配列は長さを3〜12塩基対とすることができる。例として、鋳型DNAはゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA、合成DNA、ファセミドDNA、またはファージミドDNAとすることができる。核酸分子は、解離した場合に、解離した鋳型DNAに対する交差ハイブリダイゼーションが最小であることが好ましい。
本発明により同様に包含されるのは、以下の段階を含む、一本鎖DNA分子を調製するための方法である: a) 大きいまたは全ゲノムの鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階; b) 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一のユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に連結させて、アダプター連結DNA分子の混合物を作製させる段階; c) 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターの片鎖を介して固相支持体に第一の二本鎖ユニバーサルアダプターと第二の二本鎖アダプターとを含むアダプター連結DNA分子を付着させる段階; d) 固相支持体に付着されていないアダプター連結DNA分子を洗い流す段階; e) 固相支持体に付着されたアダプター連結DNA分子を鎖分離させて、第一の一本鎖ユニバーサルアダプターを一端におよび第二の一本鎖アダプターを他端に含む複数の一本鎖DNA分子を遊離させる段階; およびf) 一本鎖DNA分子を単離する段階。
本発明によりさらに包含されるのは、以下の段階を含む、鋳型核酸を複数の反応中心に送達するための方法である: a) 鋳型核酸の集団を供与する段階; b) 各鋳型核酸を集団から隔離剤にまで単離して、隔離された鋳型核酸の集団を形成させる段階; およびc) 隔離された鋳型核酸の集団を複数の反応中心に送達する段階であって、その際に各反応中心は隔離された核酸を一つ受け取る段階。この方法の場合、単離する段階は、鋳型核酸をビーズに付着させる段階、または鋳型核酸を油中水型乳濁液の乳濁液中に封入する段階を含むことができる。鋳型核酸は、核酸を結合できるビーズで封入されてもよい。この方法の場合、送達する段階は、隔離された核酸を複数の反応中心に送達する段階を含むことができ、その際に各反応中心はpicotiterプレートのウェルである。この方法は、単離された一本鎖分子をそれぞれ個別的に固相支持体に付着させる段階をさらに含むことができる。
本発明の他の特徴は、本発明の説明のために示されるのであって、その限定であるとは意図されない典型的な態様に関する以下の記載のなかで明らかになると思われる。本明細書を通じて、当技術分野の状況および内容を記載するため、さまざまな特許、公開特許公報および科学文献が引用される。それらの開示は、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
実施例
実施例1: 試料調製
DNA試料:
DNAは良質のものであるべきであり、タンパク質、ヌクレアーゼ、脂質、および他の化学物質(調製液からの残存EDTAのような)および塩のような混入物をなくすべきである。好ましくは、ゲノムDNAは1.8またはそれ以上の260/280比率を有するべきである。ただ一種類の生物のゲノムを配列決定することが望まれる場合には、DNAは、混入DNAが存在しないことを保証する検査が行われた品質とするべきである。例えば、ヒトDNAの調製は、細菌DNA分子による混入がないことを保証するPCRにより検査することができる。混入がないか検査する別の方法は、制限消化パターンおよび特に制限消化に続いて、生物(例えば、ヒトまたはマウス)に特異的であることが知られている適当なプローブや考えられる混入生物(例えば、大腸菌)に特異的であることが知られている第二のプローブを用いたサザンブロットによるものである。所望であれば、DNAは、生物の単一クローン(例えば、細菌の場合にはコロニー)を起源とすべきである。
実施例1: 試料調製
DNA試料:
DNAは良質のものであるべきであり、タンパク質、ヌクレアーゼ、脂質、および他の化学物質(調製液からの残存EDTAのような)および塩のような混入物をなくすべきである。好ましくは、ゲノムDNAは1.8またはそれ以上の260/280比率を有するべきである。ただ一種類の生物のゲノムを配列決定することが望まれる場合には、DNAは、混入DNAが存在しないことを保証する検査が行われた品質とするべきである。例えば、ヒトDNAの調製は、細菌DNA分子による混入がないことを保証するPCRにより検査することができる。混入がないか検査する別の方法は、制限消化パターンおよび特に制限消化に続いて、生物(例えば、ヒトまたはマウス)に特異的であることが知られている適当なプローブや考えられる混入生物(例えば、大腸菌)に特異的であることが知られている第二のプローブを用いたサザンブロットによるものである。所望であれば、DNAは、生物の単一クローン(例えば、細菌の場合にはコロニー)を起源とすべきである。
段階1: DNase I消化
DNase I消化段階の目的は、全ゲノムまたは大きいゲノム部分のようなDNAの大きいストレッチを小さな種に断片化することである。単一の鋳型DNAから作製された小サイズのDNA種のこの集団を「ライブラリー」という。デオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)は、二本鎖の鋳型DNAを切断するエンドヌクレアーゼである。DNaseIの切断特性により、鋳型DNAの無作為消化(すなわち、最小の配列の偏り)を可能にし、マンガンに基づく緩衝液の存在下で使用する場合には平滑末端の、二本鎖DNA断片が優勢になるあると考えられる(Melgar and Goldthwait 1968)。DNase Iによる鋳型ゲノムの消化は、次の三つの要因に依存する: i) 使用する酵素の量(単位数); ii) 消化の温度(℃); およびiii) インキュベーション時間(分)。以下に概略を説明するDNase I消化条件は、50〜700塩基対(bp)に及ぶサイズのDNAライブラリーを得るために最適化された。
1. DNAを得て、Tris-HCl (10 mM, pH 7〜8)で0.3 mg/mlの濃度に調製した。この調製には、全部でDNA(15 μg) 134 μlが必要とされた。EDTAを含有する緩衝液(すなわち、TE, Tris/EDTA)で希釈したDNA調製物を使わないことを推奨する。EDTAの存在は、DNaseIによる酵素消化に阻害的である。DNA調製物にEDTAが含まれる場合、DNAを溶液から「塩析」して、適当なTris-HCl緩衝液(10 mM, pH 7〜8)またはナノピュアH2O(pH 7〜8)で再構成することが重要である。
2. 0.2 mlチューブに、Tris pH 7.5(1M) 50 μl、MnCl2(1M) 10μl、BSA(100 mg/ml) 1 μl、および水39 μlを含有する、DNase I緩衝液を調製した。
3. 別の0.2 mlチューブに、DNase I緩衝液15 μlおよびDNase I(1U/ml) 1.5 μlを添加した。反応チューブを15℃設定のサーマルサイクラーにセットした。
4. DNA(0.3 mg/ml) 134 μlを15℃設定のサーマルサイクラーにセットしたDNase I反応チューブに添加した。蓋を閉じて、試料を正確に1分間インキュベートした。インキュベーション後、50 mM EDTA 50 μlを添加して、酵素消化を停止させた。
5. 消化したDNAは、QiaQuick PCR精製キットを用いて精製した。消化反応液を次に、4分割量に分けて、4本のスピンカラムを使用して各分割量を精製した(スピンカラムあたり37.5 μl)。製造元の手順書に従い、各カラムを溶出用緩衝液(EB) 30 μlで溶出した。次いで、溶出液を合わせて、最終反応容量120 μlを得た。
6. 消化反応液の一定分割量3 μl 1つをBioAnalzyer DNA 1000 LabChipによる分析のために確保しておいた。
DNase I消化段階の目的は、全ゲノムまたは大きいゲノム部分のようなDNAの大きいストレッチを小さな種に断片化することである。単一の鋳型DNAから作製された小サイズのDNA種のこの集団を「ライブラリー」という。デオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI)は、二本鎖の鋳型DNAを切断するエンドヌクレアーゼである。DNaseIの切断特性により、鋳型DNAの無作為消化(すなわち、最小の配列の偏り)を可能にし、マンガンに基づく緩衝液の存在下で使用する場合には平滑末端の、二本鎖DNA断片が優勢になるあると考えられる(Melgar and Goldthwait 1968)。DNase Iによる鋳型ゲノムの消化は、次の三つの要因に依存する: i) 使用する酵素の量(単位数); ii) 消化の温度(℃); およびiii) インキュベーション時間(分)。以下に概略を説明するDNase I消化条件は、50〜700塩基対(bp)に及ぶサイズのDNAライブラリーを得るために最適化された。
1. DNAを得て、Tris-HCl (10 mM, pH 7〜8)で0.3 mg/mlの濃度に調製した。この調製には、全部でDNA(15 μg) 134 μlが必要とされた。EDTAを含有する緩衝液(すなわち、TE, Tris/EDTA)で希釈したDNA調製物を使わないことを推奨する。EDTAの存在は、DNaseIによる酵素消化に阻害的である。DNA調製物にEDTAが含まれる場合、DNAを溶液から「塩析」して、適当なTris-HCl緩衝液(10 mM, pH 7〜8)またはナノピュアH2O(pH 7〜8)で再構成することが重要である。
2. 0.2 mlチューブに、Tris pH 7.5(1M) 50 μl、MnCl2(1M) 10μl、BSA(100 mg/ml) 1 μl、および水39 μlを含有する、DNase I緩衝液を調製した。
3. 別の0.2 mlチューブに、DNase I緩衝液15 μlおよびDNase I(1U/ml) 1.5 μlを添加した。反応チューブを15℃設定のサーマルサイクラーにセットした。
4. DNA(0.3 mg/ml) 134 μlを15℃設定のサーマルサイクラーにセットしたDNase I反応チューブに添加した。蓋を閉じて、試料を正確に1分間インキュベートした。インキュベーション後、50 mM EDTA 50 μlを添加して、酵素消化を停止させた。
5. 消化したDNAは、QiaQuick PCR精製キットを用いて精製した。消化反応液を次に、4分割量に分けて、4本のスピンカラムを使用して各分割量を精製した(スピンカラムあたり37.5 μl)。製造元の手順書に従い、各カラムを溶出用緩衝液(EB) 30 μlで溶出した。次いで、溶出液を合わせて、最終反応容量120 μlを得た。
6. 消化反応液の一定分割量3 μl 1つをBioAnalzyer DNA 1000 LabChipによる分析のために確保しておいた。
段階2: Pfuポリッシング
DNase Iによる鋳型DNAの消化により、主に平滑末端であるDNAの断片が得られるが、しかし、一部の断片は、1塩基または2塩基の長さの突出末端を含んだ末端を有することになる。Pfuポリッシングを使用して、5'突出部の埋め込み(すなわち、「平滑末端化」)により平滑末端種の量を増加させる。さらに、Pfu DNAポリメラーゼは、一つのおよび二つのヌクレオチド伸長部分の除去をもたらす3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する。Pfuポリッシングにより、アダプターの連結に使用可能な平滑末端DNA断片の量を増加させる(Costa 1994a, 1994b, 1994c)。以下のPfuポリッシング手順を使用した。
1. 0.2 mlチューブに、精製済みの、DNase I消化DNA断片115 μl、10×クローン化Pfu緩衝液15 μl、dNTP(10mM) 5 μl、およびクローン化Pfu DNAポリメラーゼ(2.5 U/μl)を順に添加した。
2. ポリッシング反応の各成分を十分に混合して、72℃で30分間インキュベートした。
3. インキュベーション後、反応チューブを取り出して、氷上に2分間置いた。
4. ポリッシング反応混合液を次に、4分割量に分けて、QiaQuick PCR精製カラムを使用して精製した(各カラムに37.5 μl)。製造元の手順書に従い、各カラムを緩衝液EB 30 μlで溶出した。次いで、溶出液を合わせて、最終反応容量120 μlを得た。
5. 最終的なポリッシング反応液の一定分割量3 μl 1つをBioAnalzyer DNA 1000 LabChipによる分析のために確保しておいた。
DNase Iによる鋳型DNAの消化により、主に平滑末端であるDNAの断片が得られるが、しかし、一部の断片は、1塩基または2塩基の長さの突出末端を含んだ末端を有することになる。Pfuポリッシングを使用して、5'突出部の埋め込み(すなわち、「平滑末端化」)により平滑末端種の量を増加させる。さらに、Pfu DNAポリメラーゼは、一つのおよび二つのヌクレオチド伸長部分の除去をもたらす3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性を有する。Pfuポリッシングにより、アダプターの連結に使用可能な平滑末端DNA断片の量を増加させる(Costa 1994a, 1994b, 1994c)。以下のPfuポリッシング手順を使用した。
1. 0.2 mlチューブに、精製済みの、DNase I消化DNA断片115 μl、10×クローン化Pfu緩衝液15 μl、dNTP(10mM) 5 μl、およびクローン化Pfu DNAポリメラーゼ(2.5 U/μl)を順に添加した。
2. ポリッシング反応の各成分を十分に混合して、72℃で30分間インキュベートした。
3. インキュベーション後、反応チューブを取り出して、氷上に2分間置いた。
4. ポリッシング反応混合液を次に、4分割量に分けて、QiaQuick PCR精製カラムを使用して精製した(各カラムに37.5 μl)。製造元の手順書に従い、各カラムを緩衝液EB 30 μlで溶出した。次いで、溶出液を合わせて、最終反応容量120 μlを得た。
5. 最終的なポリッシング反応液の一定分割量3 μl 1つをBioAnalzyer DNA 1000 LabChipによる分析のために確保しておいた。
段階3: 断片化したDNAライブラリーへのユニバーサルアダプターの連結
ゲノムDNAライブラリーの断片化およびポリッシング後、プライマー配列を各DNA断片の末端に付加する。これらのプライマー配列は「ユニバーサルアダプター」といわれ、PCR増幅およびヌクレオチド配列決定の双方を可能とする特異的なプライミング領域を含む二本鎖オリゴヌクレオチドからなる。ユニバーサルアダプターは、各デオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)の1つからなる特有の4塩基の「キー」に先行する、長さが20 塩基対である特有の配列決定プライミング領域のセットに隣接して位置する長さが20 塩基対である特有のPCRプライミング領域のセットを含むように設計される。それぞれの特有のユニバーサルアダプター(「ユニバーサルアダプターA」および「ユニバーサルアダプターB」といわれる)は、長さが44塩基対(44 bp)である。ユニバーサルアダプターは、T4 DNAリガーゼにより、DNA断片の各末端に連結されて、各DNA断片に対し全体で88 bpのヌクレオチド付加をもたらす。異なるユニバーサルアダプターを各ゲノムDNAライブラリーの調製専用に設計して、その結果、各生物に特有の識別子を与えることができる。
ゲノムDNAライブラリーの断片化およびポリッシング後、プライマー配列を各DNA断片の末端に付加する。これらのプライマー配列は「ユニバーサルアダプター」といわれ、PCR増幅およびヌクレオチド配列決定の双方を可能とする特異的なプライミング領域を含む二本鎖オリゴヌクレオチドからなる。ユニバーサルアダプターは、各デオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)の1つからなる特有の4塩基の「キー」に先行する、長さが20 塩基対である特有の配列決定プライミング領域のセットに隣接して位置する長さが20 塩基対である特有のPCRプライミング領域のセットを含むように設計される。それぞれの特有のユニバーサルアダプター(「ユニバーサルアダプターA」および「ユニバーサルアダプターB」といわれる)は、長さが44塩基対(44 bp)である。ユニバーサルアダプターは、T4 DNAリガーゼにより、DNA断片の各末端に連結されて、各DNA断片に対し全体で88 bpのヌクレオチド付加をもたらす。異なるユニバーサルアダプターを各ゲノムDNAライブラリーの調製専用に設計して、その結果、各生物に特有の識別子を与えることができる。
ユニバーサルアダプターの対を調製するため、一本鎖オリゴヌクレオチドを自家設計して、商業者を通じて製造する。ユニバーサルアダプターのDNAオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ活性を防ぐ働きをする、各オリゴヌクレオチド末端の二つのホスホロチオエート結合を考慮して設計する(Samini, T.D., B. Jolles, and A. Laigle. 2001. Best minimally modified antisense oligonucleotides according to cell nuclease activity. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 11(3):129., これらの開示は、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる)。各オリゴヌクレオチドをHPLC精製して、最終調製物に混入または擬似DNAオリゴヌクレオチド配列が存在しないことを確実にする。
ユニバーサルアダプターは、平滑末端にした、断片化ゲノムDNAに対する定方向連結を可能とするように設計される。各ユニバーサルアダプター対に対し、PCRプライミング領域には5'の4塩基突出部および平滑末端にした3'キー領域が含まれる。ユニバーサルアダプターの平滑末端側は平滑末端DNA断片に連結するが、アダプターの5'突出部は平滑末端DNA断片に連結することができないので、指向性が達成される。さらに、5'ビオチンをユニバーサルアダプターBに付加して、その後の鋳型ssDNAの単離(段階8)を可能とする。各ユニバーサルアダプターは、単一チューブ内で、二つの一本鎖の相補DNAオリゴヌクレオチド(すなわち、センス配列を含む一方のオリゴおよびアンチセンス配列を含むもう一方のオリゴ)をアニーリングさせることにより調製する。以下の連結手順を使用した。
1. 0.2 mlチューブに、nH2O(分子生物等級純水) 39 μl、消化済みの、ポリッシングしたDNAライブラリー 25 μl、2×クイックリガーゼ反応用緩衝液100μl、MMP1 (10 pm/μl)アダプターセット 20 μl(100倍比)、およびクイックリガーゼ 16 μlを順に添加した。この連結反応液を十分に混合して、室温で20分間インキュベートした。
2. その後、連結反応液を取り除いて、連結反応液の一定分割量10 μl 1つをBioAnalyzerで用いるために精製した。Qiagen Min-Eluteキットのシングルスピンカラムを使用した。製造元の手順書による手順に従い、カラムをEB 10 μlで溶出した。精製した連結反応液の一定分割量1 μl 1つをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより添加した。未精製の連結反応液には、試料がBioAnalyzerで正しく泳動するのを阻害することになる多量の塩およびPEGが含まれるので、この精製段階を推奨する。
3. 連結反応液の残り(190 μL)を段階4のゲル分離に使用した。
1. 0.2 mlチューブに、nH2O(分子生物等級純水) 39 μl、消化済みの、ポリッシングしたDNAライブラリー 25 μl、2×クイックリガーゼ反応用緩衝液100μl、MMP1 (10 pm/μl)アダプターセット 20 μl(100倍比)、およびクイックリガーゼ 16 μlを順に添加した。この連結反応液を十分に混合して、室温で20分間インキュベートした。
2. その後、連結反応液を取り除いて、連結反応液の一定分割量10 μl 1つをBioAnalyzerで用いるために精製した。Qiagen Min-Eluteキットのシングルスピンカラムを使用した。製造元の手順書による手順に従い、カラムをEB 10 μlで溶出した。精製した連結反応液の一定分割量1 μl 1つをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより添加した。未精製の連結反応液には、試料がBioAnalyzerで正しく泳動するのを阻害することになる多量の塩およびPEGが含まれるので、この精製段階を推奨する。
3. 連結反応液の残り(190 μL)を段階4のゲル分離に使用した。
段階3a: マイクロコンろ過(Microcon Filtration)およびアダプター構築
全調製時間は約25分であった。
ユニバーサルアダプターの連結反応には、100倍過剰のアダプターが必要とされる。これらの過剰なアダプターの除去を補助するため、二本鎖gDNAライブラリーをMicrocon YM-100ろ過器に通す。Microcon YM-100膜を使用して、125 bpよりも小さな二本鎖DNAを除去することができる。従って、未結合のアダプター(44 bp)、ならびにアダプター二量体(88 bp)を連結化gDNAライブラリー集団から除去することができる。以下のろ過手順を使用した。
1. 段階4の連結反応液190 μLを組立型のMicrocon YM-100ろ過器に添加した。
2. ろ過器を遠心機にセットして、5000×gで約6分間、または膜がほぼ乾燥するまで回転させた。
3. 洗浄するため、1×TE 200 μlを添加した。
4. 試料を5000×gでさらに9分間、または膜がほぼ乾燥するまで回転させた。
5. 回収するため、ろ過容器を新たなバイアルに挿入して、3000×gで3分間回転させた。ろ過容器は廃棄した。回収された容量は、約10 μlであった。次に、TE 80 μlを添加した。
全調製時間は約25分であった。
ユニバーサルアダプターの連結反応には、100倍過剰のアダプターが必要とされる。これらの過剰なアダプターの除去を補助するため、二本鎖gDNAライブラリーをMicrocon YM-100ろ過器に通す。Microcon YM-100膜を使用して、125 bpよりも小さな二本鎖DNAを除去することができる。従って、未結合のアダプター(44 bp)、ならびにアダプター二量体(88 bp)を連結化gDNAライブラリー集団から除去することができる。以下のろ過手順を使用した。
1. 段階4の連結反応液190 μLを組立型のMicrocon YM-100ろ過器に添加した。
2. ろ過器を遠心機にセットして、5000×gで約6分間、または膜がほぼ乾燥するまで回転させた。
3. 洗浄するため、1×TE 200 μlを添加した。
4. 試料を5000×gでさらに9分間、または膜がほぼ乾燥するまで回転させた。
5. 回収するため、ろ過容器を新たなバイアルに挿入して、3000×gで3分間回転させた。ろ過容器は廃棄した。回収された容量は、約10 μlであった。次に、TE 80 μlを添加した。
アダプター(AおよびB)は、使用の前に、HPLC精製して、ホスホロチオエート結合で修飾した。アダプター「A」(10 μM)の場合、100 μMアダプターA(44 bp、センス) 10 μlを100 μMアダプターA(40 bp、アンチセンス) 10 μlと混合して、1×アニーリング用緩衝液30 μlを混合した(Vf = 50μl)。プライマーは、Sample Prep LabサーマルサイクラーのANNEALプログラムを用いてアニーリングさせた(下記参照)。アダプター「B」(10 μM)の場合、100 μMアダプターB(40 bp、センス) 10 μlを100 μMアダプターB(44 bp、アンチセンス) 10 μlと混合して、1×アニーリング用緩衝液30 μlを混合した(Vf = 50μl)。プライマーは、Sample Prep LabサーマルサイクラーのANNEALプログラムを用いてアニーリングさせた。アダプターの対は、使用するまで-20℃で保存することができる。
ANNEAL-プライマーアニーリング用のプログラム
1. 95℃で1分インキュベートする。
2. 15℃まで0.1℃/秒で温度を下げる。ならびに
3. 15℃で保持する。
1. 95℃で1分インキュベートする。
2. 15℃まで0.1℃/秒で温度を下げる。ならびに
3. 15℃で保持する。
ゲノムDNA挿入断片およびアダプターに必要な方向はなかった。断片は両端で連結可能とされた。ユニバーサルアダプターのセットには、4本の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドが含まれた。各一本鎖オリゴヌクレオチドは、1マイクロモルのスケールで合成されて、HPLC精製された。各一本鎖オリゴヌクレオチドには、各末端に四つのホスホロチオエート結合が含まれた。
段階4: 連結されたDNAライブラリーのゲル電気泳動および抽出
ユニバーサルアダプターの連結手順により以下のものが生ずる: 1) 両端にアダプターを有する断片化したDNA; 2) 未結合の単一アダプター; またはアダプター二量体の形成。アダプターが連結されたDNAライブラリー集団を未連結の、単一アダプターおよびアダプター二量体の集団から分離かつ単離する方法として、アガロースゲル電気泳動が使用される。ゲノムDNAのDNase I消化手順により、50〜700 bpに及ぶライブラリー集団が得られる(段階1)。88 bpのユニバーサルアダプターセットの付加は、その集団をより大きいサイズに変えて、約130〜800 bpのサイズ範囲の移動プロファイルをもたらすことになる。アダプター二量体は88 bpに移動することになり、未連結のアダプターは44 bpに移動することになる。従って、サイズ範囲が200 bpを超えるゲノムDNAライブラリーをアガロースゲルから物理的に単離して、標準的なゲル抽出技術により精製することができる。アダプターが連結されたDNAライブラリーのゲル分離により、サイズ範囲が200 bpまたはそれ以上であるライブラリー集団が回収されることになる(ライブラリーのサイズ範囲は、用途に応じて変化させることができる)。以下の電気泳動および抽出手順を使用した。
1. 2%アガロースゲルを調製した。
2. 10×Ready-Load Dye 10 μlをDNA連結混合液の残り90 μlに添加した。
3. 色素/連結反応混合液を4本の隣接レーンを使ってゲルに添加した(25 μl/レーン)。
4. 100 bp ラダー(0.1 μg/μl) 10 μlを連結反応液のレーンから2レーン離して添加した。
5. ゲルを100 Vで3時間泳動させた。
6. ゲルの泳動が完了した場合には、ゲルをゲル槽から取り出して、プラスチックラップで覆った平面に移した。DNAのバンドを手持ち式の長波長UVライトにより可視化した。無菌の、使い捨ての外科用メスを用いて、200〜400 bpの断片サイズをアガロースゲルから切り出した。この手法を用いて、任意のサイズ範囲のライブラリーを単離することができる。二つまたはそれ以上のサイズ範囲を単離することも可能である。ライブラリーのサイズ範囲が200〜900 bpである場合、単一ウェルからいくつかのサイズ範囲を単離することが可能である(すなわち、200〜400 bpおよび500〜700 bp)。
7. アガロースゲル内に埋まったDNAは、製造元の使用説明書に従い、Qiagen MinElute Gel Extractionキットを用いて単離した。手短に言えば、緩衝液QGをチューブ内のアガロースを覆うように添加した。アガロースを完全に溶解させた。緩衝液QGの色をQiagenの使用説明書に従ってpHを調整することにより維持し、試料の損失を最小限にした。2本のMinEluteスピンカラム(Qiagen)を精製のために使用した。溶解したアガロースの容量が多く、各カラムに何回も添加する必要があった。カラムを予め55℃に温めておいた緩衝液EB 10 μlで溶出した。溶出液をプールして、gDNAライブラリー 20 μlを得た。
8. それぞれ単離したDNAライブラリーの一定分割量1 μl 1つをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより分析して、DNAライブラリー集団の正確な分布を評価した。
ユニバーサルアダプターの連結手順により以下のものが生ずる: 1) 両端にアダプターを有する断片化したDNA; 2) 未結合の単一アダプター; またはアダプター二量体の形成。アダプターが連結されたDNAライブラリー集団を未連結の、単一アダプターおよびアダプター二量体の集団から分離かつ単離する方法として、アガロースゲル電気泳動が使用される。ゲノムDNAのDNase I消化手順により、50〜700 bpに及ぶライブラリー集団が得られる(段階1)。88 bpのユニバーサルアダプターセットの付加は、その集団をより大きいサイズに変えて、約130〜800 bpのサイズ範囲の移動プロファイルをもたらすことになる。アダプター二量体は88 bpに移動することになり、未連結のアダプターは44 bpに移動することになる。従って、サイズ範囲が200 bpを超えるゲノムDNAライブラリーをアガロースゲルから物理的に単離して、標準的なゲル抽出技術により精製することができる。アダプターが連結されたDNAライブラリーのゲル分離により、サイズ範囲が200 bpまたはそれ以上であるライブラリー集団が回収されることになる(ライブラリーのサイズ範囲は、用途に応じて変化させることができる)。以下の電気泳動および抽出手順を使用した。
1. 2%アガロースゲルを調製した。
2. 10×Ready-Load Dye 10 μlをDNA連結混合液の残り90 μlに添加した。
3. 色素/連結反応混合液を4本の隣接レーンを使ってゲルに添加した(25 μl/レーン)。
4. 100 bp ラダー(0.1 μg/μl) 10 μlを連結反応液のレーンから2レーン離して添加した。
5. ゲルを100 Vで3時間泳動させた。
6. ゲルの泳動が完了した場合には、ゲルをゲル槽から取り出して、プラスチックラップで覆った平面に移した。DNAのバンドを手持ち式の長波長UVライトにより可視化した。無菌の、使い捨ての外科用メスを用いて、200〜400 bpの断片サイズをアガロースゲルから切り出した。この手法を用いて、任意のサイズ範囲のライブラリーを単離することができる。二つまたはそれ以上のサイズ範囲を単離することも可能である。ライブラリーのサイズ範囲が200〜900 bpである場合、単一ウェルからいくつかのサイズ範囲を単離することが可能である(すなわち、200〜400 bpおよび500〜700 bp)。
7. アガロースゲル内に埋まったDNAは、製造元の使用説明書に従い、Qiagen MinElute Gel Extractionキットを用いて単離した。手短に言えば、緩衝液QGをチューブ内のアガロースを覆うように添加した。アガロースを完全に溶解させた。緩衝液QGの色をQiagenの使用説明書に従ってpHを調整することにより維持し、試料の損失を最小限にした。2本のMinEluteスピンカラム(Qiagen)を精製のために使用した。溶解したアガロースの容量が多く、各カラムに何回も添加する必要があった。カラムを予め55℃に温めておいた緩衝液EB 10 μlで溶出した。溶出液をプールして、gDNAライブラリー 20 μlを得た。
8. それぞれ単離したDNAライブラリーの一定分割量1 μl 1つをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより分析して、DNAライブラリー集団の正確な分布を評価した。
段階5: ニックの入った二本鎖DNAライブラリーの鎖置換および鎖伸長
ユニバーサルアダプターに使用されるDNAオリゴヌクレオチドはリン酸化されないので、ギャップが断片化gDNAの3'連結部に存在する。これらの二つの「ギャップ」または「ニック」は、鎖置換DNAポリメラーゼを使用することにより埋めることができる。このポリメラーゼは、ニックの修復およびニックの入っていない二本鎖DNAの形成をもたらすように、ニックを認識し、ニックの入った鎖を置換して、鎖を伸長する。使用される鎖置換酵素は、Bst DNAポリメラーゼのラージフラグメントである。
1. 0.2 mlチューブに、ゲル抽出したDNAライブラリー 19 μl、nH2O 40 μl、10×ThermoPol反応用緩衝液(Reaction Buffer) 8 μl、BSA(1 mg/ml) 8 μl、dNTP(10 mM) 2 μl、およびBst Iポリメラーゼ(8 U/μl) 3 μlを順に添加した。
2. 試料を十分に混合してサーマルサイクラーにセットし、鎖置換インキュベーションプログラム:「BST」を用いてインキュベートした。ニックの入った二本鎖DNAの鎖置換および鎖伸長用のBSTプログラム
1. 65℃で30分インキュベートする。
2. 80℃で10分インキュベートする。
3. 58℃で10分インキュベートする。 ならびに
4. 14℃で保持する。
3. Bst処理DNAライブラリーの一定分割量1 μL 1つをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより泳動した。
ユニバーサルアダプターに使用されるDNAオリゴヌクレオチドはリン酸化されないので、ギャップが断片化gDNAの3'連結部に存在する。これらの二つの「ギャップ」または「ニック」は、鎖置換DNAポリメラーゼを使用することにより埋めることができる。このポリメラーゼは、ニックの修復およびニックの入っていない二本鎖DNAの形成をもたらすように、ニックを認識し、ニックの入った鎖を置換して、鎖を伸長する。使用される鎖置換酵素は、Bst DNAポリメラーゼのラージフラグメントである。
1. 0.2 mlチューブに、ゲル抽出したDNAライブラリー 19 μl、nH2O 40 μl、10×ThermoPol反応用緩衝液(Reaction Buffer) 8 μl、BSA(1 mg/ml) 8 μl、dNTP(10 mM) 2 μl、およびBst Iポリメラーゼ(8 U/μl) 3 μlを順に添加した。
2. 試料を十分に混合してサーマルサイクラーにセットし、鎖置換インキュベーションプログラム:「BST」を用いてインキュベートした。ニックの入った二本鎖DNAの鎖置換および鎖伸長用のBSTプログラム
1. 65℃で30分インキュベートする。
2. 80℃で10分インキュベートする。
3. 58℃で10分インキュベートする。 ならびに
4. 14℃で保持する。
3. Bst処理DNAライブラリーの一定分割量1 μL 1つをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより泳動した。
段階6: ストレプトアビジンビーズの調製
ニックの入っていない二本鎖ゲノムDNAの作製に続いて、隣接のユニバーサルアダプター配列を含んだ一本鎖ゲノムDNAを単離することが必要である。この段階は、ストレプトアビジンビーズとのビオチン標識二本鎖DNAの結合について概説する。ストレプトアビジンビーズを調製するのに、以下の手順を使用した。
1. Dynal M-270ストレプトアビジンビーズ 100 μlは、この磁気ビーズをMPCに適用することにより1×結合用緩衝液(1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 5 mM Tris, pH 7.5) 200 μlで2回洗浄した。
2. ビーズを2×結合用緩衝液 100 μlに再懸濁させて、次にBst処理DNA試料(段階5からの)の残り79 μlおよび水20 μlを添加した。
3. ビーズ溶液を十分に混合して、チューブ回転装置に室温で20分間載せておいた。ビーズ混合液を、MPCを用いて、1×結合用緩衝液100 μlで2回、次いでnH2Oで2回洗浄した。結合および洗浄用(B & W)緩衝液 (2×および1×): 2×B & W緩衝液は、10 mM Tris・HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、および2 M NaClを混合することにより調製した。試薬を上記のように混ぜ合わせて、完全に混合した。この溶液は室温で6ヶ月間保存することができる。1×B & W緩衝液は、2×B & W緩衝液をnH2Oと1:1で混合することにより調製した。終濃度は上記の半分、すなわち、5 mM Tris・HCl (pH 7.5)、0.5 mM EDTA、および1 M NaClとなった。
ニックの入っていない二本鎖ゲノムDNAの作製に続いて、隣接のユニバーサルアダプター配列を含んだ一本鎖ゲノムDNAを単離することが必要である。この段階は、ストレプトアビジンビーズとのビオチン標識二本鎖DNAの結合について概説する。ストレプトアビジンビーズを調製するのに、以下の手順を使用した。
1. Dynal M-270ストレプトアビジンビーズ 100 μlは、この磁気ビーズをMPCに適用することにより1×結合用緩衝液(1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 5 mM Tris, pH 7.5) 200 μlで2回洗浄した。
2. ビーズを2×結合用緩衝液 100 μlに再懸濁させて、次にBst処理DNA試料(段階5からの)の残り79 μlおよび水20 μlを添加した。
3. ビーズ溶液を十分に混合して、チューブ回転装置に室温で20分間載せておいた。ビーズ混合液を、MPCを用いて、1×結合用緩衝液100 μlで2回、次いでnH2Oで2回洗浄した。結合および洗浄用(B & W)緩衝液 (2×および1×): 2×B & W緩衝液は、10 mM Tris・HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、および2 M NaClを混合することにより調製した。試薬を上記のように混ぜ合わせて、完全に混合した。この溶液は室温で6ヶ月間保存することができる。1×B & W緩衝液は、2×B & W緩衝液をnH2Oと1:1で混合することにより調製した。終濃度は上記の半分、すなわち、5 mM Tris・HCl (pH 7.5)、0.5 mM EDTA、および1 M NaClとなった。
段階7: ストレプトアビジンビーズを用いた一本鎖DNAライブラリーの単離
ストレプトアビジンビーズとの二本鎖gDNAライブラリーの結合に続いて、連結されたプールからユニバーサルアダプターAとユニバーサルアダプターBとを含んだ一本鎖gDNAだけを単離することが好ましい(所望の集団は、星印で下記に指定されている)。二本鎖ゲノムDNA断片のプールには、以下の予想配置でアダプターが結合されることになる。
ユニバーサルアダプターA - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターA
ユニバーサルアダプターB - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターA*
ユニバーサルアダプターA - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターB*
ユニバーサルアダプターB - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターB
ストレプトアビジンビーズとの二本鎖gDNAライブラリーの結合に続いて、連結されたプールからユニバーサルアダプターAとユニバーサルアダプターBとを含んだ一本鎖gDNAだけを単離することが好ましい(所望の集団は、星印で下記に指定されている)。二本鎖ゲノムDNA断片のプールには、以下の予想配置でアダプターが結合されることになる。
ユニバーサルアダプターA - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターA
ユニバーサルアダプターB - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターA*
ユニバーサルアダプターA - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターB*
ユニバーサルアダプターB - gDNA断片 - ユニバーサルアダプターB
ユニバーサルアダプターBだけが5'ビオチン部分を有するので、磁性のストレプトアビジン含有ビーズを使用して、ユニバーサルアダプターBを保有する全てのgDNAライブラリー種を結合することができる。二つのユニバーサルアダプターAを含むゲノムライブラリー集団種(または非連結種)は、ストレプトアビジン含有ビーズに結合せず、洗浄手順の間に除去される。洗浄後にビーズに結合したままの種には、ユニバーサルアダプターAとBとを有するものまたは二つのユニバーサルアダプターB末端を有するものが含まれる。
二つのユニバーサルアダプターB配列を有し、二つのビオチン分子を有するゲノムDNA種は、ストレプトアビジン含有ビーズに両端で結合することができる。アダプターAとアダプターBとを有する種は一つのビオチン分子を有するのみで、ビーズに「B」末端でのみ結合することができる。一本鎖の集団を単離するため、ビーズに結合した二本鎖DNAを、相補DNA鎖間の水素結合を切断する働きをする水酸化ナトリウム溶液で処理する。DNA断片がビオチンをそれぞれの末端(ユニバーサルアダプターBの末端)に有する場合、生ずる一本鎖はどちらもビーズに結合したままである。断片が一つのビオチンのみ(ユニバーサルアダプターAおよびB)を有する場合には、相補鎖はDNA-ビーズ複合体から分離する。
生ずる一本鎖ゲノムDNAライブラリーを液相から回収して、例えば、ピロリン酸配列決定(PyroSequence)法を使用して、またはRNA Pico 6000 LabChip (Agilent, Palo Alto, CA)を使用することにより定量化する。一本鎖ゲノムDNAライブラリーを、単位容量あたりの分子数を計算することにより定量化する。次いで、一本鎖gDNA分子を、DNA捕捉プライマー(PCRプライマーB)を含有する25〜30 μmのセファロースビーズにアニーリングさせる(1ビーズにつき1個の有効なコピーを得るためにビーズあたり半分のコピー数で)。次に、鋳型を乳濁液ポリメラーゼ連鎖反応手順により増幅させる。その後の配列決定は、周知技術を使用して行うことができる。一本鎖ライブラリーの単離のために、以下の手順を使用した。
1. 融解溶液(0.125 M NaOH, 0.1 M NaCl) 250 μlを上記段階6の洗浄済みのビーズに添加した。
2. ビーズ溶液を十分に混合して、ビーズ混合液をチューブ回転装置上で室温にて10分間インキュベートした。
3. Dynal MPC (磁性粒子濃縮器)を使用し、沈殿ビーズを注意深く取り除いて、上清を取っておいた。250 μlの上清には、一本鎖DNAライブラリーが含まれていた。
4. 別のチューブに、PB(QiaQuick精製キットからの) 1250 μlを添加して、この溶液を20%酢酸9 μlの添加により中和した。
5. Dynal MPCを用いて、一本鎖gDNAライブラリーを含有する250 μlの上清からビーズを沈殿させて、この上清を注意深く取り出し、新たに調製したPB/酢酸溶液に移した。
6. この溶液1500 μlを1個のQiaQuick精製スピンカラムにより精製した(試料を1回の添加につき750 μlとして2回同じカラムに添加して通す)。一本鎖DNAライブラリーをEB 50 μlで溶出した。
1. 融解溶液(0.125 M NaOH, 0.1 M NaCl) 250 μlを上記段階6の洗浄済みのビーズに添加した。
2. ビーズ溶液を十分に混合して、ビーズ混合液をチューブ回転装置上で室温にて10分間インキュベートした。
3. Dynal MPC (磁性粒子濃縮器)を使用し、沈殿ビーズを注意深く取り除いて、上清を取っておいた。250 μlの上清には、一本鎖DNAライブラリーが含まれていた。
4. 別のチューブに、PB(QiaQuick精製キットからの) 1250 μlを添加して、この溶液を20%酢酸9 μlの添加により中和した。
5. Dynal MPCを用いて、一本鎖gDNAライブラリーを含有する250 μlの上清からビーズを沈殿させて、この上清を注意深く取り出し、新たに調製したPB/酢酸溶液に移した。
6. この溶液1500 μlを1個のQiaQuick精製スピンカラムにより精製した(試料を1回の添加につき750 μlとして2回同じカラムに添加して通す)。一本鎖DNAライブラリーをEB 50 μlで溶出した。
段階8a: ピロリン酸配列決定による一本鎖gDNAの定量化
全調製時間は約1時間であった。
1. 0.2 mlチューブに、以下の試薬を順に添加した。
2. DNAをANNEAL-Sプログラム(以下の補遺を参照されたい)によりアニーリングさせた。
3. 試料をPSQ(ピロリン酸配列決定装置(jig))で泳動して、各試料中の鋳型のピコモル数を決定した(下記を参照されたい)。配列決定の方法は、米国特許第6,274,320号; 米国特許第4,863,849号; 米国特許第6,210,891号; および米国特許第6,258,568号のなかで見出すことができる(これらの開示は、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる)。計算を行い、1マイクロリットルあたりの一本鎖gDNA鋳型分子の数を決定した。調製した一本鎖gDNAライブラリーの残り25 μlは、増幅およびその後の配列決定(反応数およそ1×106)に使用した。
全調製時間は約1時間であった。
1. 0.2 mlチューブに、以下の試薬を順に添加した。
2. DNAをANNEAL-Sプログラム(以下の補遺を参照されたい)によりアニーリングさせた。
3. 試料をPSQ(ピロリン酸配列決定装置(jig))で泳動して、各試料中の鋳型のピコモル数を決定した(下記を参照されたい)。配列決定の方法は、米国特許第6,274,320号; 米国特許第4,863,849号; 米国特許第6,210,891号; および米国特許第6,258,568号のなかで見出すことができる(これらの開示は、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる)。計算を行い、1マイクロリットルあたりの一本鎖gDNA鋳型分子の数を決定した。調製した一本鎖gDNAライブラリーの残り25 μlは、増幅およびその後の配列決定(反応数およそ1×106)に使用した。
段階8b: RNA Pico 6000 LabChipによる一本鎖gDNAの定量化。全調製時間は約30分であった。
1. BioAnalyzer(ソフトウェアバージョン2.12)で、選択肢mRNA Picoアッセイを選択した。
2. BioAnalyzer上で、製造元のガイドラインに従い、RNA Pico 6000 LabChipを調製した。
3. RNA LabChipラダー(RNA 6000ラダー)を製造元(Ambion)の指示に従って調製した。手短に言えば、溶液状態のRNA LabChipラダーを70℃に2分間加熱した。ラダーを急冷するため、溶液を氷上で5分間冷却した。管壁から凝縮物を取り除くため、溶液を手短に遠心した。このRNA LabChipラダーは、氷上で保存し、1日のうちに使用した。
4. 分析されるssDNAライブラリーは、一定分割量1 μl 3つを用い、隣接レーンに入れて、3回通り泳動した。
5. BioAnalyzerのソフトウェアを使用して、各ssDNAライブラリーのレーンの濃度を計算した(下記表および図8を参照されたい)。以下に概略を説明した手順を用い、3つのレーン全ての平均を使って、ライブラリーのDNA濃度を計算した。
a. ピーク積分の下限線(図8の長い点線)をライブラリーのピークの直前に動かした(下記を参照されたい)。
b. ピーク積分の上限線(図8の長い点線)をライブラリーのピークの直後に動かした。このような方法で、下限および上限の積分線を結び付けるピーク積分線は、バックグラウンドの傾きに従った。
c. マウス矢印を使用してベースとなるピークの平均サイズ(通常、ピークの最高点付近)を決定した、またはソフトウェアにより選択されるような確定ピークを使用した。
d. ピーク中の物質量を求めるのに積分値を使用した。ピコグラムで得られた回収値を回収分子に変換した(下記表を参照されたい)。次いで、ライブラリーの濃度(1マイクロリットルあたりの分子数)を決定した。
1. BioAnalyzer(ソフトウェアバージョン2.12)で、選択肢mRNA Picoアッセイを選択した。
2. BioAnalyzer上で、製造元のガイドラインに従い、RNA Pico 6000 LabChipを調製した。
3. RNA LabChipラダー(RNA 6000ラダー)を製造元(Ambion)の指示に従って調製した。手短に言えば、溶液状態のRNA LabChipラダーを70℃に2分間加熱した。ラダーを急冷するため、溶液を氷上で5分間冷却した。管壁から凝縮物を取り除くため、溶液を手短に遠心した。このRNA LabChipラダーは、氷上で保存し、1日のうちに使用した。
4. 分析されるssDNAライブラリーは、一定分割量1 μl 3つを用い、隣接レーンに入れて、3回通り泳動した。
5. BioAnalyzerのソフトウェアを使用して、各ssDNAライブラリーのレーンの濃度を計算した(下記表および図8を参照されたい)。以下に概略を説明した手順を用い、3つのレーン全ての平均を使って、ライブラリーのDNA濃度を計算した。
a. ピーク積分の下限線(図8の長い点線)をライブラリーのピークの直前に動かした(下記を参照されたい)。
b. ピーク積分の上限線(図8の長い点線)をライブラリーのピークの直後に動かした。このような方法で、下限および上限の積分線を結び付けるピーク積分線は、バックグラウンドの傾きに従った。
c. マウス矢印を使用してベースとなるピークの平均サイズ(通常、ピークの最高点付近)を決定した、またはソフトウェアにより選択されるような確定ピークを使用した。
d. ピーク中の物質量を求めるのに積分値を使用した。ピコグラムで得られた回収値を回収分子に変換した(下記表を参照されたい)。次いで、ライブラリーの濃度(1マイクロリットルあたりの分子数)を決定した。
上記の表に示されるように、ライブラリー1の濃度は1639 pg/μl(列5)と算出され、その平均断片サイズは434ヌクレオチド(列9)となった。これらの値は、上記の段階(a)〜(d)に記載されているようにAgilent 2100ソフトウェアから得られた。リボヌクレオチドの平均分子量(MW)は328.2 g/モル(列10)である。ライブラリー平均断片のMW (1.42×105 g/モル、列11)は、平均断片長(434)に平均リボヌクレオチド(328.2)を掛けることにより算出した。定量化したライブラリー(1639 pg/μl)を1マイクロリットルあたりのグラム数(1.64×10-9 g/μl、列12)に変換した。1マイクロリットルあたりのモル数(1.15×10-14モル/μl、列14)は、1マイクロリットルあたりのグラム数(1.64×10-9 g/μl、列12)をライブラリー断片の平均分子量(1.42×105、列11)で割ることにより算出した。最後に、1マイクロリットルあたりの分子数(6.93×109分子/μl、列15)は、1マイクロリットルあたりのモル数(1.15×10-14モル/μl、列14)にアボガドロ数(6.02×1023分子/モル)を掛けることにより得られた。
最終のライブラリー濃度は、1×108分子/μlよりも大きくなると予想された。ライブラリーの質にとってさらに重要な要因は、アダプター二量体の濃度であった。図8で、ライブラリーのピークの高さは、アダプター二量体のピーク(マーカー後の最初のピーク)よりも約10倍高いと測定された。高品質のライブラリーは、二量体のピークよりも少なくとも2倍高いピーク高さを有すると予想される。提供のRNA Pico 6000 LabChipにより一本鎖gDNA濃度が500%の精度内で推定されることに留意されたい。従って、投入gDNAのビーズあたりのコピー数(cpb)を決定する鋳型の滴定を使用して、最初の配列決定の泳動を行うことが重要であった。推奨される投入DNAは、2.5 cpb、1 cpb、0.5 cpb、および0.1 cpbである。この滴定は、14×43 PTPの4スロットのビーズ充填室を使用して簡単に調べられた。
段階9: 一本鎖gDNAライブラリーの希釈および保存
一本鎖gDNAライブラリーは、緩衝液EBで溶出かつ定量化した。分解を防ぐため、一本鎖gDNAライブラリーは、EDTAの存在下で-20℃にて凍結保存した。定量化後、等量の10 mM TEをライブラリー貯蔵液に添加した。以降の全ての希釈はTE中とした。収量は次の通りであった。
PSQ分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 25 μl。
LabChip分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 47 μl。
一本鎖gDNAライブラリーは、緩衝液EBで溶出かつ定量化した。分解を防ぐため、一本鎖gDNAライブラリーは、EDTAの存在下で-20℃にて凍結保存した。定量化後、等量の10 mM TEをライブラリー貯蔵液に添加した。以降の全ての希釈はTE中とした。収量は次の通りであった。
PSQ分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 25 μl。
LabChip分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 47 μl。
最初の貯蔵液の希釈では、一本鎖gDNAライブラリーを100×106分子/μl 1×ライブラリー用溶出緩衝液に希釈した。共用の一本鎖gDNAライブラリーの一定分割量を調製した。このため、200,000分子/μlを1×ライブラリー用溶出緩衝液に希釈して、一定分割量20 μlを計量した。使い捨てライブラリーの一定分割量は、-20℃に保存した。
段階10: 乳濁液ポリメラーゼ連鎖反応(Emulsion Polymerase Chain Reaction)
cpb数の増加が好ましい場合、ビーズ乳濁液のPCRを2003年6月6日付で出願された米国特許出願第06/476,504号(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているように行った。
cpb数の増加が好ましい場合、ビーズ乳濁液のPCRを2003年6月6日付で出願された米国特許出願第06/476,504号(その全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているように行った。
試薬調製
停止溶液(50 mM EDTA)には、50 mM EDTA溶液1.0 mlを得るためにnH2O 900 μlと混合した0.5 M EDTA 100 μlが含まれた。10 mM dNTPの場合、dCTP(100 mM) 10 μl、dATP(100 mM) 10 μl、dGTP(100 mM) 10 μl、およびdTTP(100 mM) 10 μlを分子生物等級純水60 μlと混合した。4種の100 mMヌクレオチド貯蔵液は全て氷上で融解させた。次いで、各ヌクレオチド10 μlをnH2O 60 μlと混合して最終容量を100 μlとし、完全に混合した。次に、一定分割量1 mlを1.5 ml微量遠心管に分注した。この貯蔵液は、-20℃で1年間保存することができる。
停止溶液(50 mM EDTA)には、50 mM EDTA溶液1.0 mlを得るためにnH2O 900 μlと混合した0.5 M EDTA 100 μlが含まれた。10 mM dNTPの場合、dCTP(100 mM) 10 μl、dATP(100 mM) 10 μl、dGTP(100 mM) 10 μl、およびdTTP(100 mM) 10 μlを分子生物等級純水60 μlと混合した。4種の100 mMヌクレオチド貯蔵液は全て氷上で融解させた。次いで、各ヌクレオチド10 μlをnH2O 60 μlと混合して最終容量を100 μlとし、完全に混合した。次に、一定分割量1 mlを1.5 ml微量遠心管に分注した。この貯蔵液は、-20℃で1年間保存することができる。
10×アニーリング用緩衝液には、200 mM Tris (pH 7.5)および50 mM酢酸マグネシウムが含まれた。この溶液の場合、Tris 24.23 gをnH2O 800 mlに添加して、この混合液をpH 7.5に調整した。この溶液に、酢酸マグネシウム10.72 gを添加して、完全に溶解させた。この溶液は最終容量を1000 mlに合わせて、4℃で1ヶ月間保存することができる。10×TEには、100 mM Tris・HCl (pH 7.5)および50 mM EDTAが含まれた。これらの試薬を同時に添加して、完全に混合した。この溶液は室温で6ヶ月間保存することができる。
実施例2: プライマー設計
上記のように、ユニバーサルアダプターは、以下を含むように設計される: 1) 長さが通常20 bpである特有のPCRプライミング領域のセット((2)に隣接して位置する); 2) 長さが通常20 bpである特有の配列決定プライミング領域のセット; および3) 任意で、続けて4種のデオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)のそれぞれの少なくとも1つからなる特有の識別可能なキー配列。プライマーと関心対象のゲノムの意図しない領域との間の交差ハイブリダイゼーションの確率は、ゲノムサイズが増加するにつれおよびプライマーとの完全な適合性が低下するにつれて増加する。しかしながら、交差ハイブリダイズする領域(CHR)とのこの潜在的相互作用は、下記の理由から問題をもたらすとは予想されない。
上記のように、ユニバーサルアダプターは、以下を含むように設計される: 1) 長さが通常20 bpである特有のPCRプライミング領域のセット((2)に隣接して位置する); 2) 長さが通常20 bpである特有の配列決定プライミング領域のセット; および3) 任意で、続けて4種のデオキシリボヌクレオチド(すなわち、A、C、G、T)のそれぞれの少なくとも1つからなる特有の識別可能なキー配列。プライマーと関心対象のゲノムの意図しない領域との間の交差ハイブリダイゼーションの確率は、ゲノムサイズが増加するにつれおよびプライマーとの完全な適合性が低下するにつれて増加する。しかしながら、交差ハイブリダイズする領域(CHR)とのこの潜在的相互作用は、下記の理由から問題をもたらすとは予想されない。
本発明の好ましい態様において、一本鎖DNAライブラリーは、PCR増幅およびその後の配列決定に使用される。配列決定法には、150〜500塩基対の断片への所定のゲノムの無作為消化が必要となり、その後、二つの特有の両方向性プライマー(PCRおよび配列決定領域の双方からなる)を断片の5'および3'末端に連結する(図5)。融解温度(Tm)、ゲノム内のプライミング配列の特異性および特定領域または関心対象の遺伝子との近接性に基づいて、ゲノムの既存部分をプライミング部位として選択する典型的なPCR増幅とは異なり、開示の方法では、合成によるプライミング部位を用いており、慎重な新規のプライマー設計が必要になる。
四量体の選択:
デノボプライマー設計の戦略は、ハイブリダイゼーション実験のための分子タグ(Hensel, M. and D.W. Holden, Molecular genetic approaches for the study of virulence in both pathogenic bacteria and fungi. Microbiology, 1996. 142(Pt 5): p. 1049-58; Shoemaker, D.D., et al., Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nat Genet, 1996. 14(4): p. 450-6を参照されたい)およびPCR/LDR(ポリメラーゼ連鎖反応/連結検出反応)のハイブリダイゼーションプライマー(Gerry, N.P., et al., Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. Journal of Molecular Biology, 1999. 292: p. 251-262; Witowski, N.E., et al., Microarray-based detection of select cardiovascular disease markers. BioTechniques, 2000. 29(5): p. 936-944.を参照されたい)に対して行われた研究に関する既刊文献に見出される。
デノボプライマー設計の戦略は、ハイブリダイゼーション実験のための分子タグ(Hensel, M. and D.W. Holden, Molecular genetic approaches for the study of virulence in both pathogenic bacteria and fungi. Microbiology, 1996. 142(Pt 5): p. 1049-58; Shoemaker, D.D., et al., Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nat Genet, 1996. 14(4): p. 450-6を参照されたい)およびPCR/LDR(ポリメラーゼ連鎖反応/連結検出反応)のハイブリダイゼーションプライマー(Gerry, N.P., et al., Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. Journal of Molecular Biology, 1999. 292: p. 251-262; Witowski, N.E., et al., Microarray-based detection of select cardiovascular disease markers. BioTechniques, 2000. 29(5): p. 936-944.を参照されたい)に対して行われた研究に関する既刊文献に見出される。
PCR/LDRの研究は、特に関連性があり、オリゴヌクレオチド「ジップコード」、つまり類似の最終Tmを有する6つの特異的に設計された四量体からなる24塩基のプライマーの設計に重点的に取り組んでいた(Gerry, N.P., et al., Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. Journal of Molecular Biology, 1999. 292: p. 251-262; 米国特許第6,506,594号を参照されたい)。四量体成分は、以下の判定基準に基づいて選択された: 各四量体は少なくとも2塩基だけ他のものと異なっていた、自己対合またはヘアピン形成を起こした四量体は除外した、および回文構造の四量体(AGCT)または反復性の四量体(TATA)は同様に取り除いた。考えられる256(44)通りの順列のうち36通りが必要条件を満たし、次に、許容可能なPCRプライマーの設計に必要なさらなる制約にかけられた(表1)。
表1
表1には、Gerry et al. 1999. J. Mol. Bio. 292: 251-262により概説される判定基準に基づく四量体プライマー成分の選択を明示する行列が示されている。各四量体は少なくとも2塩基だけ他の全てのものと異なることが必要とされた。これらの四量体は他のどの四量体とも回文構造または相補的になることはない。36通りの四量体(太字、下線)を選択した。斜体の配列は、考慮から除外された回文構造の四量体を示す。
表1には、Gerry et al. 1999. J. Mol. Bio. 292: 251-262により概説される判定基準に基づく四量体プライマー成分の選択を明示する行列が示されている。各四量体は少なくとも2塩基だけ他の全てのものと異なることが必要とされた。これらの四量体は他のどの四量体とも回文構造または相補的になることはない。36通りの四量体(太字、下線)を選択した。斜体の配列は、考慮から除外された回文構造の四量体を示す。
プライマー設計:
PCRプライマーは、一般的なプライマー設計に共通の規格を満たすように設計し(Rubin, E. and A.A. Levy, A mathematical model and a computerized simulation of PCR using complex templates. Nucleic Acids Res, 1996. 24(18): p. 3538-45; Buck, G.A., et al., Design strategies and performance of custom DNA sequencing primers. Biotechniques, 1999. 27(3): p. 528-36を参照されたい)、実際の選択はコンピュータプログラムMMPにより行った。プライマーは、すべての両方向性PCR/配列決定用プライマーの効率的な合成のため、20塩基(5つの四量体)の長さに制限した。各プライマーは5'末端に2塩基のGCクランプ、および3'末端に1塩基のGCクランプを含み(表2)、全てのプライマーが類似のTm(+/-2℃)を共有していた(図10)。プライマー内でヘアピン形成(内部ヘアピンステム ΔG > -1.9 kcal/モル)させなかった。二量体化も同様に制御した。3塩基の最大許容二量体を許容したが、これは最後の6つの3'塩基で起こり、3'二量体に対する最大許容ΔGは-2.0 kcal/モルであった。さらに、3'末端がグループ内の他のものに過度に類似するプライマーに、ペナルティーを適用して、これにより、あるプライマーと他の逆相補体との間の交差ハイブリダイゼーションを阻止した。
PCRプライマーは、一般的なプライマー設計に共通の規格を満たすように設計し(Rubin, E. and A.A. Levy, A mathematical model and a computerized simulation of PCR using complex templates. Nucleic Acids Res, 1996. 24(18): p. 3538-45; Buck, G.A., et al., Design strategies and performance of custom DNA sequencing primers. Biotechniques, 1999. 27(3): p. 528-36を参照されたい)、実際の選択はコンピュータプログラムMMPにより行った。プライマーは、すべての両方向性PCR/配列決定用プライマーの効率的な合成のため、20塩基(5つの四量体)の長さに制限した。各プライマーは5'末端に2塩基のGCクランプ、および3'末端に1塩基のGCクランプを含み(表2)、全てのプライマーが類似のTm(+/-2℃)を共有していた(図10)。プライマー内でヘアピン形成(内部ヘアピンステム ΔG > -1.9 kcal/モル)させなかった。二量体化も同様に制御した。3塩基の最大許容二量体を許容したが、これは最後の6つの3'塩基で起こり、3'二量体に対する最大許容ΔGは-2.0 kcal/モルであった。さらに、3'末端がグループ内の他のものに過度に類似するプライマーに、ペナルティーを適用して、これにより、あるプライマーと他の逆相補体との間の交差ハイブリダイゼーションを阻止した。
表2には、2つの5'および1つの3'G/Cクランプを与える、36通りの選択された四分子の考えられる順列が示されている。内部の位置は、残る四分子からなる。この結果、8×19×19×19×9通りの順列、または493,848通りの可能な組み合わせが生まれる。図10は初回通過、つまり493,848通りのプライマーの範囲を64〜66℃のTmを有する56,246通りの候補に減らす、Tmに基づく許容可能なプライマーの選択を示す。
複雑な試料集団でのミスマッチに対するPCRの許容度が報告されている(例えば、Rubin, E. and A.A. Levy, A mathematical model and a computerized simulation of PCR using complex templates. Nucleic Acids Res, 1996. 24(18): p. 3538-45を参照されたい)にもかかわらず、相補領域が関心対象のゲノム内に発生する確率は、プライマー設計過程において主要な懸案事項ではなかった。20塩基のプライマーに対して完全適合性を見出す確率は極めて低い(420)(表3)が、それほど連続的ではない適合性を見出す確率は、関心対象のゲノムのサイズとともに顕著に増加する。結果として、20塩基のうち少なくとも10塩基の完全適合性を見出す確率は、アデノウイルスのゲノムでは99.35%になる。16塩基の完全適合性を見出す確率は、NCBIデータベースの配列(アデノウイルスのゲノムよりも約100倍大きい)では97%になる。20塩基のプライマーに対して17塩基の完全適合性を見出す確率は、ヒトゲノムの配列(30億塩基)では99%になる。
ゲノムの領域に対するプライマーの交差ハイブリダイゼーションの確率の高さは、鋳型断片を作製させるために使用される無作為DNA消化により、予想されるほどの問題にはならない。従って、交差ハイブリダイズする領域(CHR)の影響はほとんど害がない。CHRが溶液中のPCRプライマーとその鋳型との間の完全適合性と十分に競合できる可能性は低い。さらに、3'末端にミスマッチを含むプライマーはいずれも、著しく競合上不利な状態にあるものと思われる。たとえCHRが意図するPCRプライマーを打ち負かした(outcompete)としても、それにより、配列決定用プライマーに対する下流部位のない、切断型のPCR産物が作製されることになる。切断産物が捕捉ビーズに追いやられて、固定化される場合、二つの状況のうちの一つが生じることになる。CHRが液相のプライマーを打ち負かした場合には、固定化産物は配列決定用プライマー結合部位がないことになり、空のPicoTiterプレート(PTP)ウェルが生ずることになる。CHRがビーズ結合プライマーを打ち負かした場合には、配列決定用プライマーは依然として存在することになり、その唯一の影響は短い挿入断片ということになる。どちらの結果も配列決定の質を過度に落とすことにはならない。試料調製工程で使用されるゲノム材料の量が多い(今回、25 μg、35Kbのアデノウイルスゲノムを5.29×1016コピーを含有する)ことを考慮して、過剰なサンプリングを用い、完全なCHRのない断片を供与して、問題の領域の標準的PCR増幅を可能とすることができる。
実施例3: 噴霧による試料調製
噴霧によるDNAの調製
噴霧段階の目的は、全ゲノムまたは大きいゲノム部分のようなDNAの大きいストレッチをDNA配列決定に適した小さな分子種に断片化することである。単一の鋳型DNAから作製された小サイズのDNA種のこの集団をライブラリーという。噴霧により二本鎖鋳型DNAが50〜900塩基対に及ぶ断片に剪断される。剪断されたライブラリーには、T4 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI(クレノーフラグメント)、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼの組み合わせにより末端修復される一本鎖の末端が含まれる。T4 DNAポリメラーゼもクレノーDNAポリメラーゼも、その5'から3'方向のポリメラーゼ活性によってDNAの3'陥凹末端(5'突出部)を「埋める」ために使用される。T4およびクレノーポリメラーゼの一本鎖の3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性により3'突出末端が除去されることとなり、T4ポリヌクレオチドキナーゼのキナーゼ活性により5'ヒドロキシル末端にリン酸が付加されることとなる。
噴霧によるDNAの調製
噴霧段階の目的は、全ゲノムまたは大きいゲノム部分のようなDNAの大きいストレッチをDNA配列決定に適した小さな分子種に断片化することである。単一の鋳型DNAから作製された小サイズのDNA種のこの集団をライブラリーという。噴霧により二本鎖鋳型DNAが50〜900塩基対に及ぶ断片に剪断される。剪断されたライブラリーには、T4 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI(クレノーフラグメント)、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼの組み合わせにより末端修復される一本鎖の末端が含まれる。T4 DNAポリメラーゼもクレノーDNAポリメラーゼも、その5'から3'方向のポリメラーゼ活性によってDNAの3'陥凹末端(5'突出部)を「埋める」ために使用される。T4およびクレノーポリメラーゼの一本鎖の3'から5'方向のエキソヌクレアーゼ活性により3'突出末端が除去されることとなり、T4ポリヌクレオチドキナーゼのキナーゼ活性により5'ヒドロキシル末端にリン酸が付加されることとなる。
試料を以下のように調製した。
1. gDNA(ゲノムDNA) 15 μgを得て、10 mM TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.6; 項の末尾の試薬リストを参照されたい)で最終容量100 μlに調整した。このDNAを吸光度260/280比の測定により混入がないか分析した。この比は1.8またはそれより高かった。gDNA最終濃度は約300 μg/mlになると予想された。
2. 氷冷の噴霧緩衝液(項の末尾を参照されたい) 1600 μlをgDNAに添加した。
3. この反応混合液を氷冷の噴霧装置(CIS-US, Bedford, MA)にセットした。
4. 15 mlスナップキャップ・ファルコンチューブのキャップを噴霧装置の先端に取り付けた(図7A)。
5. キャップを汚れのない噴霧装置のクランプ部品(ぴったりのカバー(ファルコンチューブの蓋に対し)と2つのゴム製O-リングとからなる)で固定した(図7B)。
6. 噴霧装置の底面を窒素供給器に取り付けて、装置全体をパラフィルムで包んだ(図7Cおよび7D)。
7. 噴霧装置を垂直に維持したまま(図7Dに示されるように)、50 psi(平方インチ当たりのポンド)の窒素を5分間加えた。噴霧装置の底面を数秒毎に硬質表面に叩きつけて、濃縮液を底面に押し進めた。
8. 窒素を5分後に止めた。圧力が平常値に戻った後(30秒)、窒素供給源を噴霧装置から取り外した。
9. パラフィルムを除去して、噴霧装置の先端の蓋を回して外した。試料を取り出して、1.5 ml微量遠心管に移した。
10. 噴霧装置の先端の蓋を再び取り付けて、噴霧装置を500 rpmで5分間遠心した。
11. 噴霧装置中の試料の残りを回収した。総回収量は約700 μlであった。
12. 回収された試料は、製造元の使用説明書に従い、QIAquickカラム(Qiagen社、Valencia, CA)を用いて精製した。量が多く、カラムに数回添加することが必要になった。試料は、55℃に予め暖めておいた緩衝液EB(10 mM Tris HC1, pH 8.5; Qiagenキットで供給される) 30 μlで溶出させた。
13. 試料はUV分光法により定量化した(100倍希釈の場合には水198 μlに2 μl)。
1. gDNA(ゲノムDNA) 15 μgを得て、10 mM TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 7.6; 項の末尾の試薬リストを参照されたい)で最終容量100 μlに調整した。このDNAを吸光度260/280比の測定により混入がないか分析した。この比は1.8またはそれより高かった。gDNA最終濃度は約300 μg/mlになると予想された。
2. 氷冷の噴霧緩衝液(項の末尾を参照されたい) 1600 μlをgDNAに添加した。
3. この反応混合液を氷冷の噴霧装置(CIS-US, Bedford, MA)にセットした。
4. 15 mlスナップキャップ・ファルコンチューブのキャップを噴霧装置の先端に取り付けた(図7A)。
5. キャップを汚れのない噴霧装置のクランプ部品(ぴったりのカバー(ファルコンチューブの蓋に対し)と2つのゴム製O-リングとからなる)で固定した(図7B)。
6. 噴霧装置の底面を窒素供給器に取り付けて、装置全体をパラフィルムで包んだ(図7Cおよび7D)。
7. 噴霧装置を垂直に維持したまま(図7Dに示されるように)、50 psi(平方インチ当たりのポンド)の窒素を5分間加えた。噴霧装置の底面を数秒毎に硬質表面に叩きつけて、濃縮液を底面に押し進めた。
8. 窒素を5分後に止めた。圧力が平常値に戻った後(30秒)、窒素供給源を噴霧装置から取り外した。
9. パラフィルムを除去して、噴霧装置の先端の蓋を回して外した。試料を取り出して、1.5 ml微量遠心管に移した。
10. 噴霧装置の先端の蓋を再び取り付けて、噴霧装置を500 rpmで5分間遠心した。
11. 噴霧装置中の試料の残りを回収した。総回収量は約700 μlであった。
12. 回収された試料は、製造元の使用説明書に従い、QIAquickカラム(Qiagen社、Valencia, CA)を用いて精製した。量が多く、カラムに数回添加することが必要になった。試料は、55℃に予め暖めておいた緩衝液EB(10 mM Tris HC1, pH 8.5; Qiagenキットで供給される) 30 μlで溶出させた。
13. 試料はUV分光法により定量化した(100倍希釈の場合には水198 μlに2 μl)。
酵素ポリッシング
鋳型DNAの噴霧により非相補的末端を有する多くのDNA断片が得られる。これらの末端は、3種の酵素、つまりT4 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いることにより、平滑およびアダプター断片に連結される状態にされる。
鋳型DNAの噴霧により非相補的末端を有する多くのDNA断片が得られる。これらの末端は、3種の酵素、つまりT4 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いることにより、平滑およびアダプター断片に連結される状態にされる。
試料を以下のように調製した。
1. 0.2 mlチューブに、以下の試薬を順に添加した。
2. 段階1の溶液を十分に混合して、MJサーモサイクラー(任意の的確なインキュベーターを使用することができる)中で25℃にて10分間インキュベートした。
3. 大腸菌DNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)(5単位/ml) 1.25 μlを添加した。
4. 反応液を十分に混合して、MJサーモサイクラー中で25℃にて10分間および16℃にてさらに2時間インキュベートした。
5. 処理したDNAは、QiaQuickカラムを用いて精製し、55℃に予め暖めておいた緩衝液EB(10 mM Tris HC1, pH 8.5) 30 μlで溶出させた。
6. 以下の試薬を0.2 mlチューブに混合した。
7. 溶液を混合して、37℃で30分間、65℃で20分間のインキュベーション、その後、14℃で保存のT4 PNKプログラムを使用するMJサーマルサイクラーにセットした。
8. 試料は、QiaQuickカラムを用いて精製し、55℃に予め暖めておいた緩衝液EB 30 μlで溶出させた。
10. 最終ポリッシング反応液の一定分割量2 μlをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipによる分析のためにとっておいた(以下を参照されたい)。
1. 0.2 mlチューブに、以下の試薬を順に添加した。
2. 段階1の溶液を十分に混合して、MJサーモサイクラー(任意の的確なインキュベーターを使用することができる)中で25℃にて10分間インキュベートした。
3. 大腸菌DNAポリメラーゼ(クレノーフラグメント)(5単位/ml) 1.25 μlを添加した。
4. 反応液を十分に混合して、MJサーモサイクラー中で25℃にて10分間および16℃にてさらに2時間インキュベートした。
5. 処理したDNAは、QiaQuickカラムを用いて精製し、55℃に予め暖めておいた緩衝液EB(10 mM Tris HC1, pH 8.5) 30 μlで溶出させた。
6. 以下の試薬を0.2 mlチューブに混合した。
7. 溶液を混合して、37℃で30分間、65℃で20分間のインキュベーション、その後、14℃で保存のT4 PNKプログラムを使用するMJサーマルサイクラーにセットした。
8. 試料は、QiaQuickカラムを用いて精製し、55℃に予め暖めておいた緩衝液EB 30 μlで溶出させた。
10. 最終ポリッシング反応液の一定分割量2 μlをBioAnalyzer DNA 1000 LabChipによる分析のためにとっておいた(以下を参照されたい)。
アダプターの連結
アダプターを連結するための手順は、次のように行った。
1. 0.2 mlチューブに、以下の試薬を順に添加した。
上記の反応液は、5 μg用に設計されており、使用するgDNAの量に応じてスケールを変えた。
2. 試薬を十分に混合して、25℃で20分間インキュベートした。チューブは、ゲルがアガロースゲル電気泳動用に調製されるまで氷上とした。
アダプターを連結するための手順は、次のように行った。
1. 0.2 mlチューブに、以下の試薬を順に添加した。
上記の反応液は、5 μg用に設計されており、使用するgDNAの量に応じてスケールを変えた。
2. 試薬を十分に混合して、25℃で20分間インキュベートした。チューブは、ゲルがアガロースゲル電気泳動用に調製されるまで氷上とした。
連結されたgDNAライブラリーのゲル電気泳動および抽出
ゲノムDNAの噴霧により、50〜900 bpに及ぶライブラリー集団が得られる。88 bpのユニバーサルアダプターセットの付加は、その集団をより大きいサイズに変えて、より大きいサイズ範囲(約130〜980 bp)の移動プロファイルをもたらすことになる。アダプター二量体は88 bpに移動することになり、連結されていないアダプターは44 bpに移動することになる。従って、サイズ範囲が250 bpまたはそれ以上に分離されるゲノムDNAライブラリーをアガロースゲルから物理的に単離して、標準的なゲル抽出技術により精製することができる。アダプターが連結されたgDNAライブラリーのゲル分離により、サイズ範囲が250 bpまたはそれ以上であるライブラリー集団が回収されることになる(ライブラリーのサイズ範囲は、用途に応じて変化させることができる)。アダプターの連結後のライブラリーのサイズ範囲は130〜980 bpである。この手順は、ゲルの異なる領域を切り出すことにより、例えば、130〜200 bp、200〜400 bp、250〜500 bp、300〜600 bp、500〜700 bpなどのような任意のバンドサイズ範囲の単離のために適合できることに留意されたい。下記の手順は、250 bp〜500 bpの単離断片に使用した。
ゲノムDNAの噴霧により、50〜900 bpに及ぶライブラリー集団が得られる。88 bpのユニバーサルアダプターセットの付加は、その集団をより大きいサイズに変えて、より大きいサイズ範囲(約130〜980 bp)の移動プロファイルをもたらすことになる。アダプター二量体は88 bpに移動することになり、連結されていないアダプターは44 bpに移動することになる。従って、サイズ範囲が250 bpまたはそれ以上に分離されるゲノムDNAライブラリーをアガロースゲルから物理的に単離して、標準的なゲル抽出技術により精製することができる。アダプターが連結されたgDNAライブラリーのゲル分離により、サイズ範囲が250 bpまたはそれ以上であるライブラリー集団が回収されることになる(ライブラリーのサイズ範囲は、用途に応じて変化させることができる)。アダプターの連結後のライブラリーのサイズ範囲は130〜980 bpである。この手順は、ゲルの異なる領域を切り出すことにより、例えば、130〜200 bp、200〜400 bp、250〜500 bp、300〜600 bp、500〜700 bpなどのような任意のバンドサイズ範囲の単離のために適合できることに留意されたい。下記の手順は、250 bp〜500 bpの単離断片に使用した。
2%アガロース、1×TBE、およびエチジウムブロマイド(10 mg/ml貯蔵液) 4.5 μlを含むアガロースゲル150 mlを調製した。連結DNAを10×Ready Load Dyeと混合して、ゲルに添加した。さらに、100 bp ラダー(0.1 μg/μl) 10 μlを試料隣りの連結反応液から2レーン離して添加した。ゲルを100 Vで3時間電気泳動させた。ゲルの泳動が完了した場合には、ゲルをゲル槽から取り出し、GelDocに移して、プラスチックラップで覆った。DNAのバンドをPrep UVライトにより可視化した。無菌の、使い捨ての外科用メスを用いて、アガロースゲルから250〜500 bpの断片サイズを有するライブラリー集団を切り出した。この工程は、DNAのニッキングを防ぐために可能な限り素早く行った。このゲルスライスを15 mlファルコンチューブに入れた。アガロース内に埋まったgDNAライブラリーは、Qiagen MinElute Gel Extractionキットを用いて単離した。それぞれ単離したgDNAライブラリーの一定分割量をBioAnalyzer DNA 1000 LabChipにより分析して、gDNAライブラリー集団の正確な分布を評価した。
gDNAライブラリーの鎖置換および鎖伸長ならびにストレプトアビジンビーズによる一本鎖gDNAライブラリーの単離
ニックの入った二本鎖gDNAライブラリーの鎖置換および鎖伸長は、Bst処理試料を65℃のサーマルサイクラー中で30分間インキュベートして、必要とされるまで氷上に置いたことを除いて、実施例1に記載されているように行った。ストレプトアビジンビーズは、最後の洗浄を1×結合用緩衝液200 μlで2回洗浄およびnH2O 200 μlで2回洗浄により行ったことを除いて、実施例1に記載されているように調製した。一本鎖gDNAライブラリーは、以下のようにストレプトアビジンビーズを用いて単離した。洗浄したビーズから水を除去して、融解溶液(以下を参照されたい) 250 μlを添加した。このビーズ懸濁液を十分に混合して、チューブ回転装置に載せて室温で10分間インキュベートした。別のチューブのなかで、PB(QiaQuick精製キットからの) 1250 μlおよび20%酢酸9 μlを混合した。融解溶液 250 μl中のビーズをDynal MPCにより沈殿させて、この上清を注意深く取り出し、新たに調製したPB/酢酸溶液に移した。この溶液1500 μlからDNAを1個のMinElute精製スピンカラムにより精製した。これは、試料を1回の添加につき750 μlとして2回同じカラムに添加して通すことで行った。一本鎖gDNAライブラリーを予め55℃に温めておいた緩衝液EB 15 μlで溶出した。
ニックの入った二本鎖gDNAライブラリーの鎖置換および鎖伸長は、Bst処理試料を65℃のサーマルサイクラー中で30分間インキュベートして、必要とされるまで氷上に置いたことを除いて、実施例1に記載されているように行った。ストレプトアビジンビーズは、最後の洗浄を1×結合用緩衝液200 μlで2回洗浄およびnH2O 200 μlで2回洗浄により行ったことを除いて、実施例1に記載されているように調製した。一本鎖gDNAライブラリーは、以下のようにストレプトアビジンビーズを用いて単離した。洗浄したビーズから水を除去して、融解溶液(以下を参照されたい) 250 μlを添加した。このビーズ懸濁液を十分に混合して、チューブ回転装置に載せて室温で10分間インキュベートした。別のチューブのなかで、PB(QiaQuick精製キットからの) 1250 μlおよび20%酢酸9 μlを混合した。融解溶液 250 μl中のビーズをDynal MPCにより沈殿させて、この上清を注意深く取り出し、新たに調製したPB/酢酸溶液に移した。この溶液1500 μlからDNAを1個のMinElute精製スピンカラムにより精製した。これは、試料を1回の添加につき750 μlとして2回同じカラムに添加して通すことで行った。一本鎖gDNAライブラリーを予め55℃に温めておいた緩衝液EB 15 μlで溶出した。
一本鎖gDNAの定量化および保存
一本鎖gDNAは、実施例1に記載されているようにRNA Pico 6000 LabChipを用いて定量化した。場合によっては、一本鎖ライブラリーは、最初のAgilent 2100による定量化が正確に行われることを確実にするため、第二のアッセイにより定量化した。このために、RiboGreenによる定量化を記載のように(蛍光光度法によるssDNA定量化)行い、Agilent 2100による定量化を確認した。この二通りの推定値が3倍を超えるまでに異なっていた場合、各分析を繰り返した。定量化により二通りの手順の間で3倍を超える相違が明らかになった場合、ビーズに対してより広範囲の鋳型を使用した。
一本鎖gDNAは、実施例1に記載されているようにRNA Pico 6000 LabChipを用いて定量化した。場合によっては、一本鎖ライブラリーは、最初のAgilent 2100による定量化が正確に行われることを確実にするため、第二のアッセイにより定量化した。このために、RiboGreenによる定量化を記載のように(蛍光光度法によるssDNA定量化)行い、Agilent 2100による定量化を確認した。この二通りの推定値が3倍を超えるまでに異なっていた場合、各分析を繰り返した。定量化により二通りの手順の間で3倍を超える相違が明らかになった場合、ビーズに対してより広範囲の鋳型を使用した。
一本鎖gDNAライブラリーの希釈および保存は、実施例1に記載されているように行った。収量は次の通りであった。
LabChip分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 12 μl。
RiboGreen分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 9 μl。
TEの添加後のssDNAライブラリーの最終容量 = 18 μl。
LabChip分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 12 μl。
RiboGreen分析後のssDNAライブラリーの残りの最終容量 = 9 μl。
TEの添加後のssDNAライブラリーの最終容量 = 18 μl。
等量のTEを一本鎖gDNAライブラリーの貯蔵液に添加した。一本鎖gDNAライブラリーを1×108分子/μl TE緩衝液に。貯蔵液を200,000分子/μl TEに希釈(500倍)して、一定分割量20 μlを調製した。
噴霧後のライブラリー断片サイズの分布
噴霧およびポリッシング後の材料1 μlのAgilent 2100 DNA 1000 LabChip分析から得られた典型的な結果が図9Aに示されている。大部分の産物のサイズ範囲分布は、50〜900塩基対前後に収まると予想された。平均サイズ(ピークの最高点)は、約450 bpになると予想された。アダプターが連結されたライブラリー断片のゲル精製後に得られた典型的な結果が図9Bに示されている。
噴霧およびポリッシング後の材料1 μlのAgilent 2100 DNA 1000 LabChip分析から得られた典型的な結果が図9Aに示されている。大部分の産物のサイズ範囲分布は、50〜900塩基対前後に収まると予想された。平均サイズ(ピークの最高点)は、約450 bpになると予想された。アダプターが連結されたライブラリー断片のゲル精製後に得られた典型的な結果が図9Bに示されている。
試薬
特別の定めのない限り、実施例に記載の試薬は、市販されている標準的な試薬に相当する。例えば、クレノー、T4 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ緩衝液、T4 PNK、T4 PNK緩衝液、クイック T4 DNAリガーゼ、クイックライゲーション緩衝液、Bst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)およびThermoPol反応用緩衝液は、New England Biolabs (Beverly, MA)から入手できる。dNTPミックスはPierce (Rockford, IL)から入手できる。アガロース、超高純度(UltraPure)TBE、ブルージュース・ゲルローディング緩衝液およびReady-Load 100 bp DNAラダーは、Invitrogen (Carlsbad, CA)から購入することができる。エチジウムブロマイドおよび2-プロパノールはFisher (Hampton, NH)から購入することができる。RNAラダーはAmbion (Austin, TX)から購入することができる。その他の試薬は、一般に公知であるおよび/または下記に記載されている。
特別の定めのない限り、実施例に記載の試薬は、市販されている標準的な試薬に相当する。例えば、クレノー、T4 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ緩衝液、T4 PNK、T4 PNK緩衝液、クイック T4 DNAリガーゼ、クイックライゲーション緩衝液、Bst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)およびThermoPol反応用緩衝液は、New England Biolabs (Beverly, MA)から入手できる。dNTPミックスはPierce (Rockford, IL)から入手できる。アガロース、超高純度(UltraPure)TBE、ブルージュース・ゲルローディング緩衝液およびReady-Load 100 bp DNAラダーは、Invitrogen (Carlsbad, CA)から購入することができる。エチジウムブロマイドおよび2-プロパノールはFisher (Hampton, NH)から購入することができる。RNAラダーはAmbion (Austin, TX)から購入することができる。その他の試薬は、一般に公知であるおよび/または下記に記載されている。
結合および洗浄用(B & W)緩衝液 (2×および1×):
2×B & W緩衝液には、終濃度で10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、および2 M NaClが含まれた。記載の試薬を混ぜ合わせて、完全に混合した。この溶液は室温で6ヶ月間保存することができる。1×B & W緩衝液は、2×B & W緩衝液をピコピュアH2Oと1:1で混合することにより調製した。終濃度は上記のものの半分、すなわち、5 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.5 mM EDTA、および1 M NaClとなった。
2×B & W緩衝液には、終濃度で10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、および2 M NaClが含まれた。記載の試薬を混ぜ合わせて、完全に混合した。この溶液は室温で6ヶ月間保存することができる。1×B & W緩衝液は、2×B & W緩衝液をピコピュアH2Oと1:1で混合することにより調製した。終濃度は上記のものの半分、すなわち、5 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.5 mM EDTA、および1 M NaClとなった。
その他の緩衝液には、以下が含まれた。1×T4 DNAポリメラーゼ緩衝液: 50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mMジチオスレイトール(25℃でpH 7.9)。TE: 10 mM Tris、1 mM EDTA。
ライブラリーアニーリング用緩衝液、10×:
10×アニーリング用緩衝液には、200 mM Tris (pH 7.5)および50 mM酢酸マグネシウムが含まれた。この緩衝液の場合、Tris 200 mlをピコピュアH2O 500 mlに添加した。次に、酢酸マグネシウム10.72 gを溶液に添加して、完全に溶解させた。この溶液を最終容量1000 mlに調整した。この溶液は4℃で6ヶ月間保存することができる。ライブラリーの混入の可能性を回避するため、この緩衝液を単回使用または短期使用のために分注した。
10×アニーリング用緩衝液には、200 mM Tris (pH 7.5)および50 mM酢酸マグネシウムが含まれた。この緩衝液の場合、Tris 200 mlをピコピュアH2O 500 mlに添加した。次に、酢酸マグネシウム10.72 gを溶液に添加して、完全に溶解させた。この溶液を最終容量1000 mlに調整した。この溶液は4℃で6ヶ月間保存することができる。ライブラリーの混入の可能性を回避するため、この緩衝液を単回使用または短期使用のために分注した。
アダプター:
アダプター「A」(400 μM):
この溶液の場合、1000 pmol/μl アダプターA(44 bp、センス) 10 μlを1000 pmol/μl アダプターA(40 bp、アンチセンス) 10 μl、10×ライブラリーアニーリング用緩衝液2.5 μl、および水2.5 μlと混合した(Vf = 25 μl)。アダプターは、Sample Prep LabサーマルサイクラーのANNEAL-Aプログラム(以下の補遺を参照されたい)を用いてアニーリングさせた。アダプター設計に関する詳細は、補遺に示されている。
アダプター「A」(400 μM):
この溶液の場合、1000 pmol/μl アダプターA(44 bp、センス) 10 μlを1000 pmol/μl アダプターA(40 bp、アンチセンス) 10 μl、10×ライブラリーアニーリング用緩衝液2.5 μl、および水2.5 μlと混合した(Vf = 25 μl)。アダプターは、Sample Prep LabサーマルサイクラーのANNEAL-Aプログラム(以下の補遺を参照されたい)を用いてアニーリングさせた。アダプター設計に関する詳細は、補遺に示されている。
アダプター「B」(400 μM):
この溶液の場合、1000 pmol/μl アダプターB(40 bp、センス) 10 μlを1000 pmol/μl アダプターB(44 bp、アンチ) 10 μl、10×ライブラリーアニーリング用緩衝液2.5 μl、および水2.5 μlと混合した(Vf = 25 μl)。アダプターは、Sample Prep LabサーマルサイクラーのANNEAL-Aプログラム(補遺を参照されたい)を用いてアニーリングさせた。アニーリング後、アダプター「A」およびアダプター「B」を混合した(Vf = 50 μl)。アダプターセットは、使用前まで-20℃で保存することができる。
この溶液の場合、1000 pmol/μl アダプターB(40 bp、センス) 10 μlを1000 pmol/μl アダプターB(44 bp、アンチ) 10 μl、10×ライブラリーアニーリング用緩衝液2.5 μl、および水2.5 μlと混合した(Vf = 25 μl)。アダプターは、Sample Prep LabサーマルサイクラーのANNEAL-Aプログラム(補遺を参照されたい)を用いてアニーリングさせた。アニーリング後、アダプター「A」およびアダプター「B」を混合した(Vf = 50 μl)。アダプターセットは、使用前まで-20℃で保存することができる。
補遺
アダプターアニーリングプログラム
ANNEAL-プライマーアニーリング用のプログラム
1. 95℃で1分インキュベートする。
2. 15℃まで0.1℃/秒で温度を下げる。ならびに
3. 14℃で保持する。
アダプターアニーリングプログラム
ANNEAL-プライマーアニーリング用のプログラム
1. 95℃で1分インキュベートする。
2. 15℃まで0.1℃/秒で温度を下げる。ならびに
3. 14℃で保持する。
末端修復用のT4ポリメラーゼ/クレノーPOLISHプログラム
1. 25℃で10分インキュベートする。
2. 16℃で2時間インキュベートする。ならびに
3. 4℃で保持する。
1. 25℃で10分インキュベートする。
2. 16℃で2時間インキュベートする。ならびに
3. 4℃で保持する。
末端修復用のT4 PNKプログラム
1. 37℃で30分インキュベートする。
2. 65℃で20分インキュベートする。ならびに
3. 14℃で保持する。
1. 37℃で30分インキュベートする。
2. 65℃で20分インキュベートする。ならびに
3. 14℃で保持する。
ニックの入った二本鎖gDNAの鎖置換および鎖伸長用のBSTプログラム
1. 65℃で30分インキュベートする。ならびに
2. 14℃で保持する。
1. 65℃で30分インキュベートする。ならびに
2. 14℃で保持する。
本明細書を通じて、当技術分野の状況および内容を記載するため、さまざまな特許、公開された特許出願および科学文献が引用される。それらの開示は、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
他の態様
特定の態様を本明細書で詳細に開示してきたが、これは例示の目的のためにのみ一例として行われたものであり、先の、添付の特許請求の範囲に対して限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲にある本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな置換、変更、および変形を本発明に対して行うことができるものと考える。
特定の態様を本明細書で詳細に開示してきたが、これは例示の目的のためにのみ一例として行われたものであり、先の、添付の特許請求の範囲に対して限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲にある本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな置換、変更、および変形を本発明に対して行うことができるものと考える。
Claims (55)
- 以下の段階を含む、複数の一本鎖DNA分子を含んだライブラリーをクローニングにより単離するための方法:
(a) 大きい鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階;
(b) 第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一または第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に付着させて、アダプター連結DNA分子の混合物を形成させる段階;
(c) それぞれが第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含む複数の一本鎖DNA分子を単離して、ライブラリーを得る段階; および
(d) 複数のリアクターに一つのDNA分子が含まれるように一本鎖DNA分子をリアクターに送達し、それによってライブラリーをクローニングにより単離する段階。 - 以下の段階を含む、複数の一本鎖DNA分子を含んだライブラリーを作製するための方法:
(a) 大きいまたは全ゲノムの鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階;
(b) 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一のユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に連結させて、アダプター連結DNA分子の混合物を作製させる段階であって、その際に第一のユニバーサルアダプターには固相支持体に結合する部分が含まれる段階;
(c) 固相支持体に第一の二本鎖ユニバーサルアダプターを含むDNA分子を付着させる段階;
(d) 固相支持体に付着されていないアダプター連結DNA分子を除去する段階;
(e) 一端のみで固相支持体に付着されたアダプター連結DNA分子を鎖分離させて、第一の一本鎖ユニバーサルアダプターを一端におよび第二の一本鎖アダプターを他端に有する複数の一本鎖DNA分子を遊離させる段階; および
(f) 段階(e)の遊離された一本鎖DNA分子のライブラリーを固相支持体に付着したままのそれらのDNA分子から単離する段階。 - 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターが、連結により付着される、請求項1または2記載の方法。
- (f)がi) 一本鎖DNA分子をリアクターアレイ上のある位置に送達する段階; またはii) 一本鎖DNA分子を油中水型乳濁液中の液滴内に送達する段階により達成される、請求項1記載の方法。
- DNA修復酵素およびDNA修飾酵素を用いて、アダプター連結DNA分子の混合物における一本鎖ニックを修復する段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
- DNA修復酵素およびDNA修飾酵素が、ポリメラーゼ、リガーゼ、キナーゼ、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- ポリメラーゼがバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)ポリメラーゼIであり、リガーゼがT4リガーゼであり、およびキナーゼがT4ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項6記載の方法。
- 鋳型DNAが、ゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA、合成DNA、ファセミド(phasemid)DNA、およびファージミドDNAからなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
- 鋳型DNAには逆転写産物が含まれる、請求項1または2記載の方法。
- 断片化が酵素的手段、化学的手段、および機械的手段からなる群より選択される手段により行われる、請求項1または2記載の方法。
- 酵素的手段がDNaseIである、請求項10記載の方法。
- 機械的手段が噴霧である、請求項10記載の方法。
- DNase I消化が10〜37℃の温度で1〜2分間行われる、請求項11記載の方法。
- 酵素的手段が制限酵素である、請求項10記載の方法。
- 機械的手段がフレンチプレス、超音波処理器、HydroShear、および噴霧装置からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- 断片化したDNA分子の長さが50 bp〜700 bpである、請求項1または2記載の方法。
- 適合末端が平滑末端である、請求項1または2記載の方法。
- 平滑末端がPfuポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼおよびクレノーフラグメントからなる群より選択される酵素で生成される、請求項17記載の方法。
- 適合末端にはAまたはT突出部が含まれる、請求項1または2記載の方法。
- 第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターには、ホスホロチオエート結合が含まれる、請求項1または2記載の方法。
- ビオチン部分が第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターに付着される、請求項1または2記載の方法。
- 第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターが、T4 DNAリガーゼで連結される、請求項1または2記載の方法。
- 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターにもしくは第二の二本鎖ユニバーサルアダプターにまたはどちらの二本鎖ユニバーサルアダプターにも、識別可能なキー配列が含まれる、請求項1または2記載の方法。
- 識別可能なキー配列の長さが3〜12ヌクレオチドである、請求項23記載の方法。
- 識別可能なキー配列が、A、G、C、U、およびTからなる群より選択される少なくとも一つのヌクレオチドを含む、請求項23記載の方法。
- 第一および第二の二本鎖ユニバーサルアダプターには、PCRプライミング配列および配列決定用プライマー配列が含まれる、請求項1または2記載の方法。
- PCRプライミング配列の長さが10〜20塩基対である、請求項26記載の方法。
- 配列決定用プライマー配列の長さが10〜20塩基対である、請求項26記載の方法。
- PCRプライミング配列および配列決定用プライマー配列が重複する、請求項26記載の方法。
- アダプター連結DNA分子の混合物がゲル電気泳動、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、およびショ糖沈降法からなる群より選択される方法により分離される、請求項1または2記載の方法。
- 複数の一本鎖DNA分子がDNA捕捉ビーズに付着される、請求項1または2記載の方法。
- DNA捕捉ビーズが結合対の成分を含む、請求項31記載の方法。
- 結合対が、アビジン/ビオチン、リガンド/受容体、抗原/抗体および相補ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項31記載の方法。
- DNA捕捉ビーズが常磁性ビーズである、請求項31記載の方法。
- 複数の一本鎖DNA分子が、低塩処理、高pH処理、および化学的変性処理からなる群より選択される処理により得られる、請求項1または2記載の方法。
- 以下の段階を含む、固相支持体に付着された一本鎖DNAライブラリーを作製するための方法:
(a) 複数の鋳型一本鎖DNAを作製する段階;
(b) 複数の鋳型ssDNAのそれぞれを固相支持体に付着させる段階; および
(c) 鋳型一本鎖DNAが付着された固相支持体を単離する段階。 - 以下の段階を含む、固相支持体に付着された一本鎖DNAライブラリーを作製するための方法:
(a) 大きい鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階;
(b) 第一または第二の二本鎖ユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一または第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に付着させて、アダプター連結DNA分子の混合物を作製する段階;
(c) 第一の一本鎖ユニバーサルアダプターと第二の一本鎖ユニバーサルアダプターとを含む一本鎖DNA分子を単離する段階; および
(d) (c)からの単離された一本鎖分子を固相支持体に付着させる段階。 - 固相支持体がDNA捕捉ビーズである、請求項37記載の方法。
- DNAが、ゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA、合成DNA、ファセミドDNA、およびファージミドDNAからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
- DNAが結合対により固相支持体に付着される、請求項37記載の方法。
- 結合対が、アビジン/ビオチン、リガンド/受容体、抗原/抗体および相補ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
- 請求項37の方法により作製される可動性の固相支持体のライブラリー。
- 第一のアダプターと、鋳型DNAの断片と、第二のアダプターとを含む核酸分子であって、その際に第一のアダプターと第二のアダプターそれぞれが、配列決定用プライマーと、PCRプラマーと、識別可能なキー配列とを含み、およびその際に第一のアダプターと第二のアダプターが、解離した場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で相互に交差ハイブリダイズしない核酸分子。
- PCRプライマーの長さが10〜20塩基対である、請求項43記載の核酸分子。
- 配列決定用プライマーの長さが10〜20塩基対である、請求項43記載の核酸分子。
- 識別可能なキー配列の長さが3〜12塩基対である、請求項43記載の核酸分子。
- 鋳型DNAがゲノムDNA、cDNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、人工染色体DNA、合成DNA、ファセミドDNA、およびファージミドDNAからなる群より選択される、請求項43記載の核酸分子。
- 核酸分子が、解離した場合に、解離した鋳型DNAに対する交差ハイブリダイゼーションが最小である、請求項43記載の核酸分子。
- 以下の段階を含む、一本鎖DNA分子を調製するための方法:
(a) 大きいまたは全ゲノムの鋳型DNA分子を断片化して複数の断片化したDNA分子を作製する段階;
(b) 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第一の末端におよび第一のユニバーサルアダプターまたは第二のユニバーサルアダプターを断片化した各DNA分子の第二の末端に連結させて、アダプター連結DNA分子の混合物を作製させる段階;
(c) 第一の二本鎖ユニバーサルアダプターの片鎖を介して固相支持体に第一の二本鎖ユニバーサルアダプターと第二の二本鎖アダプターとを含むアダプター連結DNA分子を付着させる段階;
(d) 固相支持体に付着されていないアダプター連結DNA分子を洗い流す段階;
(e) 一端のみで固相支持体に付着されたそれらのアダプター連結DNA分子を鎖分離させて、第一の一本鎖ユニバーサルアダプターを一端におよび第二の一本鎖アダプターを他端に含む複数の一本鎖DNA分子を遊離させる段階; および
(f) 一本鎖DNA分子を単離する段階。 - 以下の段階を含む、鋳型核酸を複数の反応中心に送達するための方法:
(a) 鋳型核酸の集団を供与する段階;
(b) 各鋳型核酸を前記の集団から隔離剤までに単離して、隔離された鋳型核酸の集団を形成させる段階;
(c) 前記の隔離された鋳型核酸の集団を前記の複数の反応中心に送達する段階であって、その際に各反応中心が隔離された核酸を一つ受け取る段階。 - 単離する段階が、鋳型核酸をビーズに付着させる段階を含む、請求項50記載の方法。
- 単離する段階が、鋳型核酸を油中水型乳濁液の乳濁液中に封入する段階を含む、請求項50記載の方法。
- 鋳型核酸が、核酸を結合できるビーズで封入される、請求項52記載の方法。
- 送達する段階が、隔離された核酸を複数の反応中心に送達する段階を含み、その際に各反応中心がpicotiterプレートのウェルである、請求項50記載の方法。
- 単離された一本鎖分子をそれぞれ個別的に固相支持体に付着させる段階をさらに含む、請求項1、2または49記載の方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013520202A (ja) * | 2010-02-25 | 2013-06-06 | アドバンスト リキッド ロジック インコーポレイテッド | 核酸ライブラリーの作製方法 |
JP2018508235A (ja) * | 2015-02-17 | 2018-03-29 | コンプリート・ゲノミックス・インコーポレーテッド | 制御された鎖置換を用いてのdna配列決定 |
Families Citing this family (1135)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7622294B2 (en) * | 1997-03-14 | 2009-11-24 | Trustees Of Tufts College | Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions |
US20030027126A1 (en) | 1997-03-14 | 2003-02-06 | Walt David R. | Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions |
EP1908832B1 (en) * | 1997-07-07 | 2012-12-26 | Medical Research Council | A method for increasing the concentration of a nucleic acid molecule |
GB9900298D0 (en) * | 1999-01-07 | 1999-02-24 | Medical Res Council | Optical sorting method |
CA2290731A1 (en) * | 1999-11-26 | 2001-05-26 | D. Jed Harrison | Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis system |
US6432290B1 (en) | 1999-11-26 | 2002-08-13 | The Governors Of The University Of Alberta | Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems |
US7846733B2 (en) * | 2000-06-26 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
AU2001271595A1 (en) * | 2000-06-26 | 2002-01-08 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
DE60142709D1 (de) | 2000-12-13 | 2010-09-09 | Nugen Technologies Inc | Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben |
ZA200210369B (en) * | 2001-03-09 | 2004-07-08 | Nugen Technologies Inc | Methods and compositions for amplification or RNA sequences. |
US7727713B2 (en) * | 2001-06-20 | 2010-06-01 | Nuevolution A/S | Templated molecules and methods for using such molecules |
WO2003004690A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | 454$m(3) CORPORATION | Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter |
DE10147074A1 (de) * | 2001-09-25 | 2003-05-08 | Beru Ag | Verfahren zum Betreiben einer aus mehreren Heizelementen bestehenden mehrstufigen elektrischen Heizung |
US20030108664A1 (en) * | 2001-10-05 | 2003-06-12 | Kodas Toivo T. | Methods and compositions for the formation of recessed electrical features on a substrate |
EP1438385A1 (en) * | 2001-10-25 | 2004-07-21 | Bar-Ilan University | Interactive transparent individual cells biochip processor |
GB0127564D0 (en) * | 2001-11-16 | 2002-01-09 | Medical Res Council | Emulsion compositions |
CN101006177B (zh) * | 2002-03-15 | 2011-10-12 | 纽韦卢森公司 | 改善的用于合成模制分子的方法 |
US20030217923A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Harrison D. Jed | Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems |
WO2004013070A2 (en) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Nuevolution A/S | Multi-step synthesis of templated molecules |
US7595883B1 (en) * | 2002-09-16 | 2009-09-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biological analysis arrangement and approach therefor |
CA2539890A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Carlsberg A/S | Spatially encoded polymer matrix |
CN102838654B (zh) | 2002-10-30 | 2016-05-18 | 纽韦卢森公司 | 合成双功能复合物的方法 |
AU2003291964A1 (en) | 2002-12-19 | 2004-07-14 | Nuevolution A/S | Quasirandom structure and function guided synthesis methods |
JP2006512092A (ja) | 2002-12-30 | 2006-04-13 | ザ・リージェンツ・オブ・ジ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア | 病原体の検出および分析のための方法および装置 |
US7575865B2 (en) * | 2003-01-29 | 2009-08-18 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
EP2159285B1 (en) * | 2003-01-29 | 2012-09-26 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
US20070026397A1 (en) | 2003-02-21 | 2007-02-01 | Nuevolution A/S | Method for producing second-generation library |
CN1791682B (zh) | 2003-02-26 | 2013-05-22 | 凯利达基因组股份有限公司 | 通过杂交进行的随机阵列dna分析 |
IL154677A0 (en) * | 2003-02-27 | 2003-09-17 | Univ Bar Ilan | A method and apparatus for manipulating an individual cell |
US7041481B2 (en) | 2003-03-14 | 2006-05-09 | The Regents Of The University Of California | Chemical amplification based on fluid partitioning |
GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
WO2004092418A2 (en) * | 2003-04-14 | 2004-10-28 | Nugen Technologies, Inc. | Global amplification using a randomly primed composite primer |
FR2856498B1 (fr) * | 2003-06-19 | 2005-09-30 | Goulven Jean Alain Vernois | Distribution sous atmosphere controlee |
US7888110B2 (en) * | 2003-06-26 | 2011-02-15 | Seng Enterprises Ltd. | Pico liter well holding device and method of making the same |
US8597597B2 (en) * | 2003-06-26 | 2013-12-03 | Seng Enterprises Ltd. | Picoliter well holding device and method of making the same |
US9200245B2 (en) * | 2003-06-26 | 2015-12-01 | Seng Enterprises Ltd. | Multiwell plate |
EP2532745B1 (en) | 2003-07-05 | 2015-09-09 | The Johns Hopkins University | Method and Compositions for Detection and Enumeration of Genetic Variations |
DK1670939T3 (da) * | 2003-09-18 | 2010-03-01 | Nuevolution As | Fremgangsmåde til opnåelse af strukturel information om et kodet molekyle og fremgangsmåde til udvælgelse af forbindelser |
WO2005028110A2 (en) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Applera Corporation | Microplates useful for conducting thermocycled nucleotide amplification |
US20060019264A1 (en) * | 2003-12-01 | 2006-01-26 | Said Attiya | Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter |
US7972994B2 (en) | 2003-12-17 | 2011-07-05 | Glaxosmithkline Llc | Methods for synthesis of encoded libraries |
US20110059865A1 (en) | 2004-01-07 | 2011-03-10 | Mark Edward Brennan Smith | Modified Molecular Arrays |
ES2432040T3 (es) * | 2004-01-28 | 2013-11-29 | 454 Life Sciences Corporation | Amplificación de ácido nucleico con emulsión de flujo continuo |
US20090239211A1 (en) * | 2004-02-17 | 2009-09-24 | Nuevolution A/S | Method For Enrichment Involving Elimination By Mismatch Hybridisation |
US8440404B2 (en) * | 2004-03-08 | 2013-05-14 | Rubicon Genomics | Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation |
US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
US7622281B2 (en) * | 2004-05-20 | 2009-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid |
US7622296B2 (en) | 2004-05-28 | 2009-11-24 | Wafergen, Inc. | Apparatus and method for multiplex analysis |
US7799553B2 (en) * | 2004-06-01 | 2010-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microfabricated integrated DNA analysis system |
US7264934B2 (en) * | 2004-06-10 | 2007-09-04 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Rapid parallel nucleic acid analysis |
US7692219B1 (en) | 2004-06-25 | 2010-04-06 | University Of Hawaii | Ultrasensitive biosensors |
WO2006003664A1 (en) * | 2004-07-07 | 2006-01-12 | Seng Enterprises Ltd. | Method and device for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
WO2006021959A2 (en) * | 2004-08-25 | 2006-03-02 | Seng Enterprises Ltd. | Method and device for isolating cells |
US7745207B2 (en) | 2006-02-03 | 2010-06-29 | IntegenX, Inc. | Microfluidic devices |
EP2261650A3 (en) * | 2004-09-15 | 2011-07-06 | IntegenX Inc. | Microfluidic devices |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
US20060110764A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-25 | Tom Tang | Large-scale parallelized DNA sequencing |
US7785785B2 (en) | 2004-11-12 | 2010-08-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Charge perturbation detection system for DNA and other molecules |
US7485451B2 (en) * | 2004-11-18 | 2009-02-03 | Regents Of The University Of California | Storage stable compositions of biological materials |
KR20070093992A (ko) * | 2004-12-11 | 2007-09-19 | 사이토제닉, 인크. | 고품질 핵산의 무세포 생합성 및 그것의 사용 |
ES2352344T3 (es) * | 2005-01-25 | 2011-02-17 | Seng Enterprises Limited | Dispositivo de microfluido para estudio de células. |
WO2006084132A2 (en) | 2005-02-01 | 2006-08-10 | Agencourt Bioscience Corp. | Reagents, methods, and libraries for bead-based squencing |
JP2006211984A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-17 | Univ Nagoya | エマルジョンを利用した核酸増幅方法、及び核酸増幅反応用キット |
US8374887B1 (en) | 2005-02-11 | 2013-02-12 | Emily H. Alexander | System and method for remotely supervising and verifying pharmacy functions |
EP1848819A4 (en) * | 2005-02-16 | 2010-01-06 | Genetic Technologies Ltd | METHOD FOR GENETIC ANALYSIS WITH AMPLIFICATION OF COMPLEMENTARY DUPLICATES |
US7964413B2 (en) * | 2005-03-10 | 2011-06-21 | Gen-Probe Incorporated | Method for continuous mode processing of multiple reaction receptacles in a real-time amplification assay |
US20060269934A1 (en) * | 2005-03-16 | 2006-11-30 | Applera Corporation | Compositions and methods for clonal amplification and analysis of polynucleotides |
US7604940B1 (en) | 2005-03-16 | 2009-10-20 | Applied Biosystems, Llc | Compositions and methods for analyzing isolated polynucleotides |
CA2604095A1 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | 454 Life Sciences Corporation | Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing |
US20060228721A1 (en) | 2005-04-12 | 2006-10-12 | Leamon John H | Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing |
ATE474937T1 (de) * | 2005-04-29 | 2010-08-15 | Synthetic Genomics Inc | Amplifikation und klonierung einzelner dna- moleküle mittels rolling-circle-amplifikation |
NZ564095A (en) * | 2005-05-10 | 2009-06-26 | Oregon State | Methods of mapping polymorphisms and polymorphism microarrays |
US20090233291A1 (en) * | 2005-06-06 | 2009-09-17 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
EP1910537A1 (en) * | 2005-06-06 | 2008-04-16 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
RS51868B (en) | 2005-06-09 | 2012-02-29 | Praecis Pharmacueuticals Inc. | PROCEDURES FOR SYNTHESIS OF CODED LIBRARIES |
EP2463386B1 (en) | 2005-06-15 | 2017-04-12 | Complete Genomics Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
EP1910562B1 (en) | 2005-06-23 | 2010-12-08 | Keygene N.V. | Strategies for high throughput identification and detection of polymorphisms |
DE602006013831D1 (de) * | 2005-06-23 | 2010-06-02 | Keygene Nv | Verbesserte strategien zur sequenzierung komplexer genome unter verwendung von sequenziertechniken mit hohem durchsatz |
US20070031865A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-02-08 | David Willoughby | Novel Process for Construction of a DNA Library |
GB0514910D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Method for sequencing a polynucleotide template |
GB0514935D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Solexa Ltd | Methods for sequencing a polynucleotide template |
US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US10081839B2 (en) * | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US10083273B2 (en) * | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
JP2009505642A (ja) * | 2005-08-19 | 2009-02-12 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション | アラクノカンパのルシフェラーゼ |
EP1928570B1 (en) | 2005-08-22 | 2015-04-15 | Life Technologies Corporation | Apparatus, system, and method using immiscible-fluid-discrete-volumes |
WO2007030759A2 (en) | 2005-09-07 | 2007-03-15 | Nugen Technologies, Inc. | Improved nucleic acid amplification procedure |
CN101263227A (zh) * | 2005-09-16 | 2008-09-10 | 454生命科学公司 | cDNA文库制备 |
CA2910861C (en) * | 2005-09-29 | 2018-08-07 | Michael Josephus Theresia Van Eijk | High throughput screening of mutagenized populations |
US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
CA2624896C (en) | 2005-10-07 | 2017-11-07 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
WO2007133831A2 (en) | 2006-02-24 | 2007-11-22 | Callida Genomics, Inc. | High throughput genome sequencing on dna arrays |
US20070141555A1 (en) * | 2005-10-11 | 2007-06-21 | Mordechai Deutsch | Current damper for the study of cells |
EP1948816B1 (en) | 2005-10-24 | 2011-12-07 | The Johns Hopkins University | Improved methods for beaming |
KR100828714B1 (ko) | 2005-10-25 | 2008-05-09 | 주식회사 엘지화학 | 리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법 |
EP1940755A2 (en) * | 2005-10-28 | 2008-07-09 | Praecis Pharmaceuticals Inc. | Methods for identifying compounds of interest using encoded libraries |
GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
WO2007052245A1 (en) * | 2005-11-03 | 2007-05-10 | Seng Enterprises Ltd. | Method and device for studying floating, living cells |
JP2009515192A (ja) * | 2005-11-08 | 2009-04-09 | インコム,インコーポレイテッド | 光ファイバ探査型マイクロスライド、マイクロスライドキット、およびその使用 |
ES2422288T3 (es) * | 2005-11-14 | 2013-09-10 | Keygene Nv | Método para el cribado ultrarrápido de poblaciones de transposón etiquetado e identificación masiva de la secuencia en paralelo de los sitios de inserción |
GB0524069D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
EP2336315B1 (en) | 2005-12-01 | 2017-07-19 | Nuevolution A/S | Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries |
US20070128610A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Buzby Philip R | Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing |
DK1966394T3 (da) * | 2005-12-22 | 2012-10-29 | Keygene Nv | Forbedrede strategier til transkriptprofilering under anvendelse af high throughput-sekventeringsteknologier |
ES2882401T3 (es) | 2005-12-22 | 2021-12-01 | Keygene Nv | Método de detección de polimorfismos basado en AFLP de alto rendimiento |
WO2007081386A2 (en) * | 2006-01-11 | 2007-07-19 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic devices and methods of use |
CA2637974A1 (en) * | 2006-01-19 | 2007-07-26 | The Research Foundation Of State University Of New York | Methods and devices for detection and identification of encoded beads and biological molecules |
CN101360819A (zh) * | 2006-01-20 | 2009-02-04 | 凸版印刷株式会社 | 反应容器及dna的扩增反应方法 |
US20070172839A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-07-26 | Smith Douglas R | Asymmetrical adapters and methods of use thereof |
US7749365B2 (en) | 2006-02-01 | 2010-07-06 | IntegenX, Inc. | Optimized sample injection structures in microfluidic separations |
DE102006005287B4 (de) * | 2006-02-06 | 2012-12-27 | Siemens Ag | Verfahren zum Nachweis von Zielnukleinsäuren |
CN101415839B (zh) | 2006-02-08 | 2012-06-27 | 亿明达剑桥有限公司 | 对多核苷酸模板进行测序的方法 |
ATE514775T1 (de) * | 2006-02-08 | 2011-07-15 | Illumina Cambridge Ltd | Endenmodifikation zur verhinderung einer überrepräsentierung von fragmenten |
EP2002367B1 (en) * | 2006-02-16 | 2017-03-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for correcting primer extension errors in nucleic acid sequence data |
US8364417B2 (en) | 2007-02-15 | 2013-01-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method to correct out of phase errors in DNA sequencing data by use of a recursive algorithm |
US11237171B2 (en) | 2006-02-21 | 2022-02-01 | Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution |
US8460879B2 (en) * | 2006-02-21 | 2013-06-11 | The Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution |
SG10201405158QA (en) * | 2006-02-24 | 2014-10-30 | Callida Genomics Inc | High throughput genome sequencing on dna arrays |
US7766033B2 (en) * | 2006-03-22 | 2010-08-03 | The Regents Of The University Of California | Multiplexed latching valves for microfluidic devices and processors |
US20070231823A1 (en) * | 2006-03-23 | 2007-10-04 | Mckernan Kevin J | Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing |
EP4105644A3 (en) | 2006-03-31 | 2022-12-28 | Illumina, Inc. | Systems and devices for sequence by synthesis analysis |
EP2002017B1 (en) * | 2006-04-04 | 2015-06-10 | Keygene N.V. | High throughput detection of molecular markers based on restriction fragments |
US7439014B2 (en) | 2006-04-18 | 2008-10-21 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet-based surface modification and washing |
US8809068B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-08-19 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Manipulation of beads in droplets and methods for manipulating droplets |
US20090062129A1 (en) * | 2006-04-19 | 2009-03-05 | Agencourt Personal Genomics, Inc. | Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing |
US7702468B2 (en) * | 2006-05-03 | 2010-04-20 | Population Diagnostics, Inc. | Evaluating genetic disorders |
US10522240B2 (en) | 2006-05-03 | 2019-12-31 | Population Bio, Inc. | Evaluating genetic disorders |
EP2047910B1 (en) | 2006-05-11 | 2012-01-11 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic device and method |
US9074242B2 (en) | 2010-02-12 | 2015-07-07 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
WO2007136736A2 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Codon Devices, Inc. | Methods for nucleic acid sorting and synthesis |
US20080124726A1 (en) * | 2006-05-26 | 2008-05-29 | Althea Technologies, Inc. | Biochemical analysis of partitioned cells |
US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
WO2007145996A2 (en) * | 2006-06-06 | 2007-12-21 | Dow Corning Corporation | A silicone acrylate hybrid composition |
US8614278B2 (en) | 2006-06-06 | 2013-12-24 | Dow Corning Corporation | Silicone acrylate hybrid composition and method of making same |
US8569416B2 (en) | 2006-06-06 | 2013-10-29 | Dow Corning Corporation | Single phase silicone acrylate formulation |
US20080124707A1 (en) * | 2006-06-09 | 2008-05-29 | Agency For Science, Technology And Research | Nucleic acid concatenation |
EP2548972A1 (en) | 2006-06-14 | 2013-01-23 | Verinata Health, Inc | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
CA2655018A1 (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-21 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Controlled initiation of primer extension |
PL2038425T3 (pl) | 2006-07-12 | 2011-03-31 | Keygene Nv | Wysokowydajne mapowanie fizyczne z zastosowaniem techniki AFLP |
US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
WO2008015396A2 (en) | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Solexa Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
EP3536396B1 (en) | 2006-08-07 | 2022-03-30 | The President and Fellows of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
US8053191B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-11-08 | Westend Asset Clearinghouse Company, Llc | Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits |
WO2008039998A2 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for sequencing dna |
WO2008042067A2 (en) | 2006-09-28 | 2008-04-10 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for nucleotide sequencing |
US7754429B2 (en) | 2006-10-06 | 2010-07-13 | Illumina Cambridge Limited | Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides |
WO2008045575A2 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | J. Craig Venter Institute, Inc. | Sequencing method |
US8841116B2 (en) * | 2006-10-25 | 2014-09-23 | The Regents Of The University Of California | Inline-injection microdevice and microfabricated integrated DNA analysis system using same |
WO2008070352A2 (en) * | 2006-10-27 | 2008-06-12 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
WO2008058018A2 (en) | 2006-11-02 | 2008-05-15 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Predicting cancer outcome |
EP2061588B1 (en) * | 2006-11-06 | 2016-07-13 | Clondiag GmbH | Device and process for binding assays |
US20090111706A1 (en) | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by amplification |
EP2518162B1 (en) * | 2006-11-15 | 2018-03-07 | Biospherex LLC | Multitag sequencing and ecogenomics analysis |
US20080242560A1 (en) * | 2006-11-21 | 2008-10-02 | Gunderson Kevin L | Methods for generating amplified nucleic acid arrays |
US7902345B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
US11339430B2 (en) | 2007-07-10 | 2022-05-24 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
WO2008076842A2 (en) * | 2006-12-14 | 2008-06-26 | Applied Biosystems Inc. | Sequencing methods |
EP2653861B1 (en) | 2006-12-14 | 2014-08-13 | Life Technologies Corporation | Method for sequencing a nucleic acid using large-scale FET arrays |
US8262900B2 (en) * | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
US7932034B2 (en) | 2006-12-20 | 2011-04-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Heat and pH measurement for sequencing of DNA |
WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
US20110039303A1 (en) * | 2007-02-05 | 2011-02-17 | Stevan Bogdan Jovanovich | Microfluidic and nanofluidic devices, systems, and applications |
WO2008097559A2 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
US9152150B1 (en) | 2007-02-22 | 2015-10-06 | Applied Biosystems, Llc | Compositions, systems, and methods for immiscible fluid discrete volume manipulation |
WO2008109176A2 (en) | 2007-03-07 | 2008-09-12 | President And Fellows Of Harvard College | Assays and other reactions involving droplets |
EP2121984A2 (en) * | 2007-03-16 | 2009-11-25 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of hiv drug resistant variants |
US20100151465A1 (en) | 2008-03-27 | 2010-06-17 | Jingyue Ju | Selective Capture and Release of Analytes |
US20080243865A1 (en) * | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Oracle International Corporation | Maintaining global state of distributed transaction managed by an external transaction manager for clustered database systems |
US20080239867A1 (en) * | 2007-03-28 | 2008-10-02 | Gilbert Donna J | Adjustable stir |
JP2008245612A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Hitachi Ltd | 試料調製法および装置 |
WO2008130623A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
EP2164985A4 (en) * | 2007-06-01 | 2014-05-14 | 454 Life Sciences Corp | SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUAL SAMPLES FROM A MULTIPLEX MIXTURE |
US7883265B2 (en) * | 2007-06-01 | 2011-02-08 | Applied Biosystems, Llc | Devices, systems, and methods for preparing emulsions |
CA2689389A1 (en) * | 2007-06-28 | 2009-01-08 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for adaptive reagent control in nucleic acid sequencing |
EP2171097A2 (en) * | 2007-06-29 | 2010-04-07 | Population Genetics Technologies LTD. | Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants |
WO2009015296A1 (en) * | 2007-07-24 | 2009-01-29 | The Regents Of The University Of California | Microfabricated dropley generator |
WO2009012984A1 (en) * | 2007-07-26 | 2009-01-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Target preparation for parallel sequencing of complex genomes |
JP5020734B2 (ja) * | 2007-07-31 | 2012-09-05 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸解析方法及び装置 |
JP2010537643A (ja) | 2007-08-29 | 2010-12-09 | アプライド バイオシステムズ, エルエルシー | 代替的な核酸配列決定法 |
US20090093378A1 (en) * | 2007-08-29 | 2009-04-09 | Helen Bignell | Method for sequencing a polynucleotide template |
WO2009032781A2 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction |
CA2734029C (en) | 2007-08-30 | 2016-03-29 | The Trustees Of Tufts College | Methods for determining the concentration of an analyte in solution |
CN101795744A (zh) * | 2007-09-11 | 2010-08-04 | 阿尔利克斯公司 | 用于分选物体的结合方法和仪器 |
WO2009035621A1 (en) * | 2007-09-13 | 2009-03-19 | Arryx, Inc. | Methods and apparatuses for sorting objects in forensic dna analysis and medical diagnostics |
WO2009036192A1 (en) * | 2007-09-13 | 2009-03-19 | Applied Precision, Inc. | Method of dispersing immersion liquid on a specimen substrate for high resolution imaging and lithographie |
US8716190B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-05-06 | Affymetrix, Inc. | Amplification and analysis of selected targets on solid supports |
US9388457B2 (en) | 2007-09-14 | 2016-07-12 | Affymetrix, Inc. | Locus specific amplification using array probes |
EP2188386A2 (en) * | 2007-09-17 | 2010-05-26 | Universite De Strasbourg | Method for detecting or quantifying a truncating mutation |
US20090118129A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-05-07 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Virtual reads for readlength enhancement |
US20090191553A1 (en) * | 2007-10-01 | 2009-07-30 | Applied Biosystems Inc. | Chase Ligation Sequencing |
US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
EP2053132A1 (en) | 2007-10-23 | 2009-04-29 | Roche Diagnostics GmbH | Enrichment and sequence analysis of geomic regions |
WO2009055597A2 (en) * | 2007-10-25 | 2009-04-30 | Monsanto Technology Llc | Methods for identifying genetic linkage |
US9975118B2 (en) * | 2007-11-15 | 2018-05-22 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
US9145540B1 (en) | 2007-11-15 | 2015-09-29 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
US8592150B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-11-26 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for long fragment read sequencing |
US9797010B2 (en) | 2007-12-21 | 2017-10-24 | President And Fellows Of Harvard College | Systems and methods for nucleic acid sequencing |
US8189186B2 (en) * | 2007-12-27 | 2012-05-29 | Lawrence Livermore National Security, Llc. | Signal enhancement using a switchable magnetic trap |
US20090181390A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Signosis, Inc. A California Corporation | High throughput detection of micrornas and use for disease diagnosis |
EP2620511B1 (en) | 2008-01-17 | 2018-02-28 | Sequenom, Inc. | Single molecule nucleic acid sequence analysis processes |
CN101990516B (zh) * | 2008-01-22 | 2015-09-09 | 英特基因有限公司 | 多用试样准备系统及其在集成分析系统中的使用 |
US7767400B2 (en) * | 2008-02-03 | 2010-08-03 | Helicos Biosciences Corporation | Paired-end reads in sequencing by synthesis |
US20090203086A1 (en) * | 2008-02-06 | 2009-08-13 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for improved signal detection in nucleic acid sequencing |
US20090203531A1 (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-13 | Nurith Kurn | Method for Archiving and Clonal Expansion |
WO2009102878A2 (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-20 | Nugen Technologies, Inc. | Method for archiving and clonal expansion |
EP2271772B1 (en) * | 2008-03-11 | 2014-07-16 | Sequenom, Inc. | Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination |
BRPI0908734A2 (pt) | 2008-03-17 | 2015-07-28 | Expressive Res Bv | Métodos para a identificação de dna genômico em uma amostra e para a indentificação de polimorfismos, e, kit |
US10745740B2 (en) * | 2008-03-19 | 2020-08-18 | Qiagen Sciences, Llc | Sample preparation |
GB2470672B (en) * | 2008-03-21 | 2012-09-12 | Nugen Technologies Inc | Methods of RNA amplification in the presence of DNA |
CN104862383B (zh) * | 2008-03-28 | 2019-05-28 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于核酸测序的组合物和方法 |
EP2260130B1 (en) * | 2008-04-04 | 2013-10-23 | Allopartis Biotechnologies, Inc. | Method of enhancing enzyme activity |
JP5227062B2 (ja) | 2008-04-08 | 2013-07-03 | 株式会社日立製作所 | Dna分析装置 |
TWI460602B (zh) * | 2008-05-16 | 2014-11-11 | Counsyl Inc | 廣用的懷孕前篩檢裝置 |
EP2291553A4 (en) | 2008-05-28 | 2011-12-14 | Genomedx Biosciences Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR THE EXPRESSION-BASED DISTINCTION OF DIFFERENT CLINICAL ILLICIT STADIAS IN PROSTATE CANCER |
US10407731B2 (en) | 2008-05-30 | 2019-09-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes |
JP5667049B2 (ja) | 2008-06-25 | 2015-02-12 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 大規模なfetアレイを用いて分析物を測定するための方法および装置 |
US7888034B2 (en) | 2008-07-01 | 2011-02-15 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of HIV tropism variants |
WO2010003132A1 (en) | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Illumina Cambridge Ltd. | Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces |
WO2010009426A2 (en) * | 2008-07-17 | 2010-01-21 | Life Technologies Corporation | Devices and methods for reagent delivery |
EP2315629B1 (en) | 2008-07-18 | 2021-12-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet libraries |
US20100068711A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-03-18 | Xenomics, Inc. | Methods of PCR-Based Detection of "Ultra Short" Nucleic Acid Sequences |
US20100035252A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods for sequencing individual nucleic acids under tension |
WO2010025310A2 (en) | 2008-08-27 | 2010-03-04 | Westend Asset Clearinghouse Company, Llc | Methods and devices for high fidelity polynucleotide synthesis |
WO2010027497A2 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Pacific Biosciences Of California, Inc | Preparations, compositions, and methods for nucleic acid sequencing |
US8962247B2 (en) | 2008-09-16 | 2015-02-24 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses |
US8476013B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-07-02 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses |
US20110218123A1 (en) | 2008-09-19 | 2011-09-08 | President And Fellows Of Harvard College | Creation of libraries of droplets and related species |
US8222047B2 (en) | 2008-09-23 | 2012-07-17 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays |
US9399215B2 (en) | 2012-04-13 | 2016-07-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sample holder with a well having a wicking promoter |
US9417190B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-08-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Calibrations and controls for droplet-based assays |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US10512910B2 (en) | 2008-09-23 | 2019-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based analysis method |
US8709762B2 (en) | 2010-03-02 | 2014-04-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for hot-start amplification via a multiple emulsion |
WO2011120024A1 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Quantalife, Inc. | Droplet generation for droplet-based assays |
US9764322B2 (en) | 2008-09-23 | 2017-09-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for generating droplets with pressure monitoring |
US9132394B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US20100075439A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification |
US20100075862A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Quanterix Corporation | High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample |
US8951939B2 (en) | 2011-07-12 | 2015-02-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel |
US20100184045A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-07-22 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for sequencing degraded or modified nucleic acids |
US11130128B2 (en) | 2008-09-23 | 2021-09-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection method for a target nucleic acid |
US9492797B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-11-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US8633015B2 (en) * | 2008-09-23 | 2014-01-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler |
US20100261189A1 (en) | 2008-10-03 | 2010-10-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | System and method for detection of HLA Variants |
US20100087325A1 (en) * | 2008-10-07 | 2010-04-08 | Illumina, Inc. | Biological sample temperature control system and method |
US20100301398A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
US8541207B2 (en) | 2008-10-22 | 2013-09-24 | Illumina, Inc. | Preservation of information related to genomic DNA methylation |
US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
EP2508529B1 (en) | 2008-10-24 | 2013-08-28 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
JP2012506705A (ja) * | 2008-10-27 | 2012-03-22 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム |
CA2742298C (en) | 2008-11-03 | 2019-09-10 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting modification resistant nucleic acids |
JP2010110262A (ja) * | 2008-11-06 | 2010-05-20 | Hitachi Maxell Ltd | ウェルプレートを用いた核酸増幅法 |
US9394567B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis |
US9506119B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-11-29 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of sequence determination using sequence tags |
US9365901B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-06-14 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia |
US8748103B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-06-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
US9528160B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-12-27 | Adaptive Biotechnolgies Corp. | Rare clonotypes and uses thereof |
CN102272327B (zh) | 2008-11-07 | 2015-11-25 | 赛昆塔公司 | 通过序列分析监测状况的方法 |
US8628927B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-14 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
AU2009314502B2 (en) | 2008-11-17 | 2015-01-22 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions of molecular profiling for disease diagnostics |
US10236078B2 (en) | 2008-11-17 | 2019-03-19 | Veracyte, Inc. | Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue |
US9495515B1 (en) | 2009-12-09 | 2016-11-15 | Veracyte, Inc. | Algorithms for disease diagnostics |
CA2745853A1 (en) | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Keygene N.V. | Farnesene synthase |
US8748094B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-06-10 | President And Fellows Of Harvard College | Particle-assisted nucleic acid sequencing |
US8236532B2 (en) * | 2008-12-23 | 2012-08-07 | Illumina, Inc. | Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols |
WO2010077322A1 (en) | 2008-12-31 | 2010-07-08 | Microchip Biotechnologies, Inc. | Instrument with microfluidic chip |
JP2012514977A (ja) | 2009-01-13 | 2012-07-05 | キージーン・エン・フェー | 新規ゲノム配列決定戦略 |
WO2010083456A1 (en) | 2009-01-15 | 2010-07-22 | Imdaptive Inc. | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
US20100179074A1 (en) * | 2009-01-15 | 2010-07-15 | Honeywell International Inc. | Methods and apparatus for fluid delivery and removal of micron scale structures |
CN102333891A (zh) * | 2009-01-20 | 2012-01-25 | 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 | 用于药靶诊断、预后和鉴别的单细胞基因表达 |
US20100331204A1 (en) | 2009-02-13 | 2010-12-30 | Jeff Jeddeloh | Methods and systems for enrichment of target genomic sequences |
JP5457222B2 (ja) | 2009-02-25 | 2014-04-02 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 小型化ハイスループット核酸分析 |
US9347092B2 (en) | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
US9074258B2 (en) | 2009-03-04 | 2015-07-07 | Genomedx Biosciences Inc. | Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease |
EP2406003A2 (en) | 2009-03-13 | 2012-01-18 | President and Fellows of Harvard College | Scale-up of flow-focusing microfluidic devices |
CN102428191A (zh) * | 2009-03-18 | 2012-04-25 | 塞昆纳姆股份有限公司 | 热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用 |
US8528589B2 (en) | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
GB0904934D0 (en) | 2009-03-23 | 2009-05-06 | Geneseqe As | Method and apparatus for detecting molecules |
GB0904957D0 (en) | 2009-03-23 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Tumour gene profile |
CN102625850B (zh) | 2009-04-03 | 2014-11-26 | 蒂莫西·Z·刘 | 多重核酸检测方法和系统 |
US20100261230A1 (en) * | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Applied Biosystems, Llc | System comprising dual-sided thermal cycler and emulsion pcr in pouch |
US9090663B2 (en) * | 2009-04-21 | 2015-07-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Systems and methods for the capture and separation of microparticles |
AU2010242073C1 (en) | 2009-04-30 | 2015-12-24 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
EP2248914A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
CN102459636B (zh) | 2009-05-07 | 2016-08-17 | 威拉赛特公司 | 用于诊断甲状腺病症的方法和组合物 |
US8003329B2 (en) * | 2009-05-12 | 2011-08-23 | Becton Dickinson & Company | Molecular counting by color-coded micelles |
US20120261274A1 (en) | 2009-05-29 | 2012-10-18 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
US8776573B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-07-15 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
US8673627B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-03-18 | Life Technologies Corporation | Apparatus and methods for performing electrochemical reactions |
US8574835B2 (en) | 2009-05-29 | 2013-11-05 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
EP3663750B1 (en) | 2009-05-29 | 2021-11-03 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
EP2438154A1 (en) | 2009-06-02 | 2012-04-11 | Integenx Inc. | Fluidic devices with diaphragm valves |
AU2010256429B2 (en) | 2009-06-05 | 2015-09-17 | Integenx Inc. | Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system |
US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
EP2446052B1 (en) | 2009-06-25 | 2018-08-08 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
EP2449125A4 (en) * | 2009-07-02 | 2013-05-29 | Zygem Corp Ltd | COMBINED NUCLEIC ACID BLOCKING, EXTRACTION AND DETECTION IN A SINGLE REACTION VESSEL |
JP5099455B2 (ja) * | 2009-07-16 | 2012-12-19 | 独立行政法人科学技術振興機構 | エマルジョンを用いたrnaの選択的増幅法 |
DK2456892T3 (en) * | 2009-07-24 | 2014-12-08 | Illumina Inc | Procedure for sequencing of a polynukleotidskabelon |
CN102712950B (zh) * | 2009-07-29 | 2015-05-20 | 皮罗比特私人有限公司 | 用于实施测定法的方法和装置 |
US9416409B2 (en) * | 2009-07-31 | 2016-08-16 | Ibis Biosciences, Inc. | Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests |
SI2669387T1 (sl) | 2009-08-25 | 2017-01-31 | Illumina, Inc. | Metode za izbiro in pomnoževanje polinukleotidov |
WO2011028539A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | Quantalife, Inc. | System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions |
WO2011028764A2 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-10 | President And Fellows Of Harvard College | Multiple emulsions created using jetting and other techniques |
US10174368B2 (en) | 2009-09-10 | 2019-01-08 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods and systems for sequencing long nucleic acids |
CN102858995B (zh) | 2009-09-10 | 2016-10-26 | 森特瑞隆技术控股公司 | 靶向测序方法 |
SG10201405883XA (en) | 2009-09-23 | 2014-11-27 | Celmatix Inc | Methods and devices for assessing infertility and/or egg quality |
ES2640776T3 (es) | 2009-09-30 | 2017-11-06 | Natera, Inc. | Métodos para denominar de forma no invasiva ploidía prenatal |
WO2011042564A1 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
US8609339B2 (en) | 2009-10-09 | 2013-12-17 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for emulsion breaking and recovery of biological elements |
US9056289B2 (en) | 2009-10-27 | 2015-06-16 | President And Fellows Of Harvard College | Droplet creation techniques |
EP2494069B1 (en) * | 2009-10-30 | 2013-10-02 | Roche Diagniostics GmbH | Method for detecting balanced chromosomal aberrations in a genome |
WO2011053845A2 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Illumina, Inc. | Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same |
WO2011056872A2 (en) * | 2009-11-03 | 2011-05-12 | Gen9, Inc. | Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly |
HUE052213T2 (hu) | 2009-11-06 | 2021-04-28 | Univ Leland Stanford Junior | Grafitkilökõdés nem invazív diagnosztizálása szervátültetett betegekben |
WO2011059285A2 (ko) * | 2009-11-16 | 2011-05-19 | (주)지노믹트리 | 지노타이핑 방법 |
EP2504448B1 (en) * | 2009-11-25 | 2016-10-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for detecting genetic material |
EP2504449B1 (en) | 2009-11-25 | 2016-03-23 | Gen9, Inc. | Methods and apparatuses for chip-based dna error reduction |
US9216414B2 (en) | 2009-11-25 | 2015-12-22 | Gen9, Inc. | Microfluidic devices and methods for gene synthesis |
US8584703B2 (en) * | 2009-12-01 | 2013-11-19 | Integenx Inc. | Device with diaphragm valve |
US10446272B2 (en) | 2009-12-09 | 2019-10-15 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for classification of samples |
WO2011071382A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Keygene N.V. | Polymorfphic whole genome profiling |
CN102656279A (zh) | 2009-12-17 | 2012-09-05 | 凯津公司 | 基于全基因组测序的限制性酶 |
JP2013514080A (ja) | 2009-12-18 | 2013-04-25 | キージーン・エン・フェー | 改善されたバルク変異体分析 |
ES2577017T3 (es) | 2009-12-22 | 2016-07-12 | Sequenom, Inc. | Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia |
US10837883B2 (en) | 2009-12-23 | 2020-11-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
US9217144B2 (en) | 2010-01-07 | 2015-12-22 | Gen9, Inc. | Assembly of high fidelity polynucleotides |
US20110245085A1 (en) | 2010-01-19 | 2011-10-06 | Rava Richard P | Methods for determining copy number variations |
US20120100548A1 (en) | 2010-10-26 | 2012-04-26 | Verinata Health, Inc. | Method for determining copy number variations |
ES2596655T3 (es) | 2010-02-01 | 2017-01-11 | Illumina Inc. | Procedimientos de enfoque y sistemas y conjuntos ópticos que usan los mismos |
US20110195457A1 (en) * | 2010-02-09 | 2011-08-11 | General Electric Company | Isothermal amplification of nucleic acid using primers comprising a randomized sequence and specific primers and uses thereof |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US8575124B2 (en) | 2010-02-18 | 2013-11-05 | Anthony P. Shuber | Compositions and methods for treating cancer |
WO2011106629A2 (en) | 2010-02-26 | 2011-09-01 | Life Technologies Corporation | Modified proteins and methods of making and using same |
ES2544635T3 (es) | 2010-03-01 | 2015-09-02 | Quanterix Corporation | Métodos para extender el rango dinámico en ensayos para la detección de moléculas o partículas |
US8415171B2 (en) | 2010-03-01 | 2013-04-09 | Quanterix Corporation | Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles |
US9678068B2 (en) * | 2010-03-01 | 2017-06-13 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods |
US8236574B2 (en) | 2010-03-01 | 2012-08-07 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects |
US8399198B2 (en) | 2010-03-02 | 2013-03-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Assays with droplets transformed into capsules |
US8716467B2 (en) * | 2010-03-03 | 2014-05-06 | Gen9, Inc. | Methods and devices for nucleic acid synthesis |
DE202011003570U1 (de) | 2010-03-06 | 2012-01-30 | Illumina, Inc. | Systeme und Vorrichtungen zum Detektieren optischer Signale aus einer Probe |
WO2011116120A2 (en) * | 2010-03-16 | 2011-09-22 | Life Technologies Corporation | Method and apparatus for addressable flow cells in single molecule sequencing |
EP2556170A4 (en) | 2010-03-25 | 2014-01-01 | Quantalife Inc | TRAPPING TRANSPORT AND DETECTION SYSTEM |
JP2013524169A (ja) | 2010-03-25 | 2013-06-17 | クァンタライフ・インコーポレーテッド | 液滴によるアッセイ用の検出システム |
WO2011123246A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Illumina, Inc. | Solid-phase clonal amplification and related methods |
ES2555106T3 (es) | 2010-04-05 | 2015-12-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Ensayos biológicos codificados espacialmente |
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
WO2011127933A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Nuevolution A/S | Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes |
US20110269194A1 (en) * | 2010-04-20 | 2011-11-03 | Swift Biosciences, Inc. | Materials and methods for nucleic acid fractionation by solid phase entrapment and enzyme-mediated detachment |
US9930297B2 (en) | 2010-04-30 | 2018-03-27 | Becton, Dickinson And Company | System and method for acquiring images of medication preparations |
WO2011135041A1 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Roche Diagnostics Gmbh | System and method for purification and use of inorganic pyrophosphatase from aquifex aeolicus |
EP2388337B1 (en) * | 2010-04-30 | 2014-07-02 | Nxp B.V. | Sensing device and manufacturing method thereof |
WO2011139372A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Sequenta, Inc. | Sequence analysis of complex amplicons |
CA2798635A1 (en) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Integrated sample preparation systems and stabilized enzyme mixtures |
US9234240B2 (en) | 2010-05-07 | 2016-01-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Measurement and comparison of immune diversity by high-throughput sequencing |
US8530158B2 (en) | 2010-05-10 | 2013-09-10 | Life Technologies Corporation | System and method for processing a biological sample |
WO2011143361A2 (en) | 2010-05-11 | 2011-11-17 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for diagnosing conditions |
CA2798758C (en) | 2010-05-18 | 2019-05-07 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US20110287432A1 (en) | 2010-05-21 | 2011-11-24 | 454 Life Science Corporation | System and method for tailoring nucleotide concentration to enzymatic efficiencies in dna sequencing technologies |
US8512538B2 (en) | 2010-05-28 | 2013-08-20 | Integenx Inc. | Capillary electrophoresis device |
EP2580353B1 (en) | 2010-06-11 | 2015-07-29 | Life Technologies Corporation | Alternative nucleotide flows in sequencing-by-synthesis methods |
US9353412B2 (en) | 2010-06-18 | 2016-05-31 | Illumina, Inc. | Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids |
RU2587606C2 (ru) * | 2010-06-30 | 2016-06-20 | БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд | Новый способ пцр-секвенирования и его применение в генотипировании hla |
WO2012003363A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Life Technologies Corporation | Ion-sensing charge-accumulation circuits and methods |
TWI569025B (zh) | 2010-06-30 | 2017-02-01 | 生命技術公司 | 用於測試離子感測場效電晶體(isfet)陣列之裝置及方法 |
EP2598804B1 (en) | 2010-06-30 | 2021-10-20 | Life Technologies Corporation | Method to generate an output signal in an isfet-array |
US11307166B2 (en) | 2010-07-01 | 2022-04-19 | Life Technologies Corporation | Column ADC |
US8653567B2 (en) | 2010-07-03 | 2014-02-18 | Life Technologies Corporation | Chemically sensitive sensor with lightly doped drains |
US9650629B2 (en) * | 2010-07-07 | 2017-05-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Clonal pre-amplification in emulsion |
WO2012008831A1 (en) | 2010-07-13 | 2012-01-19 | Keygene N.V. | Simplified de novo physical map generation from clone libraries |
ES2669870T3 (es) | 2010-07-22 | 2018-05-29 | Gencell Biosystems Limited | Células de líquido compuesto |
CN103392182B (zh) | 2010-08-02 | 2017-07-04 | 众有生物有限公司 | 用于发现遗传疾病中致病突变的系统和方法 |
US8700338B2 (en) | 2011-01-25 | 2014-04-15 | Ariosa Diagnosis, Inc. | Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy |
US10167508B2 (en) | 2010-08-06 | 2019-01-01 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
US20130040375A1 (en) * | 2011-08-08 | 2013-02-14 | Tandem Diagnotics, Inc. | Assay systems for genetic analysis |
US11031095B2 (en) | 2010-08-06 | 2021-06-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Assay systems for determination of fetal copy number variation |
US10533223B2 (en) | 2010-08-06 | 2020-01-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of target nucleic acids using hybridization |
US20130261003A1 (en) | 2010-08-06 | 2013-10-03 | Ariosa Diagnostics, In. | Ligation-based detection of genetic variants |
US20120034603A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Tandem Diagnostics, Inc. | Ligation-based detection of genetic variants |
US20140342940A1 (en) | 2011-01-25 | 2014-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization |
US11203786B2 (en) | 2010-08-06 | 2021-12-21 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Detection of target nucleic acids using hybridization |
EP2606242A4 (en) | 2010-08-20 | 2016-07-20 | Integenx Inc | MICROFLUIDIC DEVICES HAVING MECHANICALLY SEALED DIAPHRAGM VALVES |
WO2012024658A2 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | IntegenX, Inc. | Integrated analysis system |
US20120070829A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Size selection of dna for chromatin analysis |
US9618475B2 (en) | 2010-09-15 | 2017-04-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
EP2619564B1 (en) | 2010-09-24 | 2016-03-16 | Life Technologies Corporation | Matched pair transistor circuits |
IN2013MN00522A (ja) | 2010-09-24 | 2015-05-29 | Univ Leland Stanford Junior | |
US20120077716A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-03-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for producing functionally distinct nucleic acid library ends through use of deoxyinosine |
WO2012050920A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-19 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for sequencing nucleic acids |
GB201016484D0 (en) | 2010-09-30 | 2010-11-17 | Geneseque As | Method |
US9562897B2 (en) | 2010-09-30 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
JP6114694B2 (ja) | 2010-10-04 | 2017-04-12 | ジナプシス インコーポレイテッド | 自動化された再使用可能な並行生物反応のための系および方法 |
US9184099B2 (en) | 2010-10-04 | 2015-11-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biosensor devices, systems and methods therefor |
US9399217B2 (en) | 2010-10-04 | 2016-07-26 | Genapsys, Inc. | Chamber free nanoreactor system |
EP2625320B1 (en) | 2010-10-08 | 2019-03-27 | President and Fellows of Harvard College | High-throughput single cell barcoding |
US20120322665A1 (en) | 2010-10-08 | 2012-12-20 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of hiv-1 clades and recombinants of the reverse transcriptase and protease regions |
US9689012B2 (en) | 2010-10-12 | 2017-06-27 | Cornell University | Method of dual-adapter recombination for efficient concatenation of multiple DNA fragments in shuffled or specified arrangements |
US10233501B2 (en) | 2010-10-19 | 2019-03-19 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
US10093981B2 (en) | 2010-10-19 | 2018-10-09 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
US20150225792A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-13 | Northwestern University | Compositions and methods for identifying depressive disorders |
US20150218639A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-08-06 | Northwestern University | Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment |
US8753816B2 (en) | 2010-10-26 | 2014-06-17 | Illumina, Inc. | Sequencing methods |
US9387476B2 (en) | 2010-10-27 | 2016-07-12 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
EP2632593B1 (en) | 2010-10-27 | 2021-09-29 | Illumina, Inc. | Flow cells for biological or chemical analysis |
WO2012058459A2 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Life Technologies Corporation | Predictive model for use in sequencing-by-synthesis |
US10273540B2 (en) | 2010-10-27 | 2019-04-30 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatuses for estimating parameters in a predictive model for use in sequencing-by-synthesis |
CN103429331B (zh) | 2010-11-01 | 2016-09-28 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 用于形成乳液的系统 |
US10457935B2 (en) | 2010-11-12 | 2019-10-29 | Gen9, Inc. | Protein arrays and methods of using and making the same |
ES2548400T3 (es) | 2010-11-12 | 2015-10-16 | Gen9, Inc. | Métodos y dispositivos para la síntesis de ácidos nucleicos |
EP2643484A4 (en) | 2010-11-22 | 2014-04-16 | Univ California | METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN |
JP2013545472A (ja) | 2010-12-01 | 2013-12-26 | モルフォシス・アー・ゲー | 単一細胞内の生体分子の同時検出 |
EP2652659B1 (en) | 2010-12-14 | 2020-04-15 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for run-time sequencing run quality monitoring |
CN103608466B (zh) | 2010-12-22 | 2020-09-18 | 纳特拉公司 | 非侵入性产前亲子鉴定方法 |
US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
WO2012118555A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-09-07 | Life Technologies Corporation | Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations |
WO2012092455A2 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
US20130060482A1 (en) | 2010-12-30 | 2013-03-07 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing |
US10241075B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-03-26 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
KR20230141927A (ko) | 2010-12-30 | 2023-10-10 | 파운데이션 메디신 인코포레이티드 | 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화 |
US8951781B2 (en) | 2011-01-10 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis |
US20130005591A1 (en) * | 2011-01-13 | 2013-01-03 | Halgen Corporation | Method for parallel amplification of nucleic acids |
CA2823815A1 (en) | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Keygene N.V. | Paired end random sequence based genotyping |
US9217132B2 (en) | 2011-01-20 | 2015-12-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Microfluidic transducer |
US8756020B2 (en) | 2011-01-25 | 2014-06-17 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations |
US9994897B2 (en) | 2013-03-08 | 2018-06-12 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Non-invasive fetal sex determination |
US10131947B2 (en) | 2011-01-25 | 2018-11-20 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies |
US11270781B2 (en) | 2011-01-25 | 2022-03-08 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination |
US9952237B2 (en) | 2011-01-28 | 2018-04-24 | Quanterix Corporation | Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles |
WO2012104851A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-08-09 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing disease using overlap extension pcr |
EP2670863B1 (en) | 2011-01-31 | 2018-06-27 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Methods of identifying multiple epitopes in cells |
AU2011358564B9 (en) | 2011-02-09 | 2017-07-13 | Natera, Inc | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
EP3859011A1 (en) | 2011-02-11 | 2021-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
WO2012112804A1 (en) | 2011-02-18 | 2012-08-23 | Raindance Technoligies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
EP2686449B1 (en) | 2011-03-18 | 2020-11-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals |
US20120244523A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-09-27 | 454 Life Sciences Corporation | System and Method for Detection of HIV Integrase Variants |
US20120252682A1 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Maples Corporate Services Limited | Methods and systems for sequencing nucleic acids |
US9121047B2 (en) * | 2011-04-07 | 2015-09-01 | Life Technologies Corporation | System and methods for making and processing emulsions |
WO2012139125A2 (en) | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Life Technologies Corporation | System and methods for making and processing emulsions |
CN105861645B (zh) | 2011-04-08 | 2020-02-21 | 生命科技股份有限公司 | 用于合成测序中的相保护试剂流排序 |
WO2012142301A2 (en) | 2011-04-12 | 2012-10-18 | Quanterix Corporation | Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
EP3907297A1 (en) | 2011-04-15 | 2021-11-10 | The Johns Hopkins University | Safe sequencing system |
EP2702175B1 (en) | 2011-04-25 | 2018-08-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
US8460872B2 (en) | 2011-04-29 | 2013-06-11 | Sequenom, Inc. | Quantification of a minority nucleic acid species |
US9487825B2 (en) * | 2011-05-13 | 2016-11-08 | Mount Sinai School Of Medicine | Pooled adapter strategy for reducing bias in small RNA characterization |
CN112592960A (zh) * | 2011-05-20 | 2021-04-02 | 富鲁达公司 | 核酸编码反应 |
WO2012162296A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | President And Fellows Of Harvard College | Control of emulsions, including multiple emulsions |
US8585973B2 (en) | 2011-05-27 | 2013-11-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Nano-sensor array |
US9926596B2 (en) | 2011-05-27 | 2018-03-27 | Genapsys, Inc. | Systems and methods for genetic and biological analysis |
WO2012166647A1 (en) * | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Life Technologies Corporation | Methods for manipulating biomolecules |
US9556470B2 (en) | 2011-06-02 | 2017-01-31 | Raindance Technologies, Inc. | Enzyme quantification |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
JP6164657B2 (ja) | 2011-06-10 | 2017-07-19 | シュティッヒティング・テクノロジッシュ・トップインスティテュート・グレーネ・ジェネティカ・(ファウンデーション・テクノロジカル・トップ・インスティテュート・グリーン・ジェネティクス) | テルペン生合成を調節する転写因子 |
CA2839418A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Gen9, Inc. | Methods for preparative in vitro cloning |
US9752176B2 (en) | 2011-06-15 | 2017-09-05 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Methods for preparative in vitro cloning |
EP2980226A1 (en) | 2011-07-08 | 2016-02-03 | Keygene N.V. | Sequence based genotyping based on oligonucleotide ligation assays |
WO2013009654A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Life Technologies Corporation | Method and apparatus for automated sample manipulation |
WO2013009927A2 (en) | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet actuators and techniques for droplet-based assays |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
EP2737089B1 (en) | 2011-07-29 | 2017-09-06 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Library characterization by digital assay |
WO2013019714A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Mems affinity sensor for continuous monitoring of analytes |
WO2013022778A1 (en) | 2011-08-05 | 2013-02-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing by electrochemical detection |
EP3624124B1 (en) | 2011-08-18 | 2023-11-22 | Life Technologies Corporation | Systems for making base calls in nucleic acid sequencing |
BR112014004213A2 (pt) | 2011-08-23 | 2017-06-20 | Found Medicine Inc | novas moléculas de fusão kif5b-ret e usos das mesmas |
ES2737957T3 (es) | 2011-08-26 | 2020-01-17 | Gen9 Inc | Composiciones y métodos para el ensamblaje de alta fidelidad de ácidos nucleicos |
US10704164B2 (en) | 2011-08-31 | 2020-07-07 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, computer readable media, and kits for sample identification |
US8712697B2 (en) | 2011-09-07 | 2014-04-29 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Determination of copy number variations using binomial probability calculations |
EP2753715A4 (en) | 2011-09-09 | 2015-05-20 | Univ Leland Stanford Junior | METHODS FOR OBTAINING A SEQUENCE |
US10385475B2 (en) | 2011-09-12 | 2019-08-20 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Random array sequencing of low-complexity libraries |
US9453258B2 (en) | 2011-09-23 | 2016-09-27 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
CN103732760A (zh) * | 2011-09-23 | 2014-04-16 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 核酸在微芯片上的分离和富集 |
AU2012316218B2 (en) | 2011-09-26 | 2016-03-17 | Gen-Probe Incorporated | Algorithms for sequence determinations |
US10378051B2 (en) | 2011-09-29 | 2019-08-13 | Illumina Cambridge Limited | Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing |
DE102011054101A1 (de) | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen |
US9617590B2 (en) | 2011-09-30 | 2017-04-11 | Stc.Unm | DNA sample preparation and sequencing |
US10221454B2 (en) | 2011-10-10 | 2019-03-05 | The Hospital For Sick Children | Methods and compositions for screening and treating developmental disorders |
CN102329876B (zh) * | 2011-10-14 | 2014-04-02 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法 |
EP3604555A1 (en) | 2011-10-14 | 2020-02-05 | President and Fellows of Harvard College | Sequencing by structure assembly |
CA2852665A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Good Start Genetics, Inc. | Analysis methods |
SG11201401628WA (en) | 2011-10-19 | 2014-05-29 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
CA2853088C (en) | 2011-10-21 | 2018-03-13 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
US10865440B2 (en) | 2011-10-21 | 2020-12-15 | IntegenX, Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
US20150136604A1 (en) | 2011-10-21 | 2015-05-21 | Integenx Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
DE102011085473A1 (de) | 2011-10-28 | 2013-05-02 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Verfahren zur Identifikation von Aptameren |
EP2773779B1 (en) | 2011-11-04 | 2020-10-14 | Population Bio, Inc. | Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions |
CA2854023A1 (en) | 2011-11-07 | 2013-05-16 | Illumina, Inc. | Integrated sequencing apparatuses and methods of use |
JP2015501974A (ja) | 2011-11-07 | 2015-01-19 | インジェヌイティ システムズ インコーポレイテッド | 原因ゲノム変異の同定の方法およびシステム。 |
GB201120711D0 (en) | 2011-12-01 | 2012-01-11 | Univ Erasmus Medical Ct | Method for classifying tumour cells |
CN104105797B (zh) | 2011-12-01 | 2016-08-31 | 吉纳普赛斯股份有限公司 | 用于高效电子测序与检测的系统和方法 |
US9970984B2 (en) | 2011-12-01 | 2018-05-15 | Life Technologies Corporation | Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array |
WO2013085918A1 (en) * | 2011-12-05 | 2013-06-13 | The Regents Of The University Of California | Methods and compostions for generating polynucleic acid fragments |
EP2788499B1 (en) | 2011-12-09 | 2016-01-13 | Illumina, Inc. | Expanded radix for polymeric tags |
KR101830778B1 (ko) | 2011-12-09 | 2018-02-22 | 삼성전자주식회사 | 발열 입자를 포함하는 오일 층을 이용하는 핵산 증폭 장치 및 방법 |
US9824179B2 (en) | 2011-12-09 | 2017-11-21 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
US9499865B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-22 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
EP2791359B1 (en) | 2011-12-13 | 2020-01-15 | Decipher Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using non-coding transcripts |
US20130189679A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-07-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Pseudogenes and uses thereof |
WO2014163886A1 (en) * | 2013-03-12 | 2014-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
CA2859761C (en) | 2011-12-22 | 2023-06-20 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
US9803188B2 (en) | 2011-12-22 | 2017-10-31 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids |
US9334491B2 (en) | 2011-12-22 | 2016-05-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples |
US10150993B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule positioning by electrical potential |
US11021737B2 (en) | 2011-12-22 | 2021-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for analyte detection |
US9823246B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-11-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon |
US9506113B2 (en) | 2011-12-28 | 2016-11-29 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid ligation systems and methods |
US9803231B2 (en) | 2011-12-29 | 2017-10-31 | Ibis Biosciences, Inc. | Macromolecule delivery to nanowells |
WO2013101741A1 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbott Molecular, Inc. | Channels with cross-sectional thermal gradients |
JP2015503923A (ja) | 2012-01-09 | 2015-02-05 | オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフOslo Universitetssykehus Hf | 結腸直腸癌の解析のための方法およびバイオマーカー |
EP3434789A1 (en) | 2012-01-13 | 2019-01-30 | Data2Bio | Genotyping by next-generation sequencing |
US8821798B2 (en) | 2012-01-19 | 2014-09-02 | Life Technologies Corporation | Titanium nitride as sensing layer for microwell structure |
US8747748B2 (en) | 2012-01-19 | 2014-06-10 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface |
CA2861959A1 (en) | 2012-01-25 | 2013-08-01 | Gencell Biosystems Limited | Biomolecule isolation |
CA2862552A1 (en) | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
CA2861387A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Invenra, Inc. | High throughput screen for biologically active polypeptides |
US8597882B2 (en) | 2012-02-03 | 2013-12-03 | Pyrobett Pte. Ltd. | Method and apparatus for conducting an assay |
WO2013117595A2 (en) * | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
DK2812452T3 (da) | 2012-02-09 | 2020-06-29 | Population Bio Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til screening og behandling af udviklingsforstyrrelser |
EP2817627A2 (en) | 2012-02-21 | 2014-12-31 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
US20130217023A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-22 | 454 Life Sciences Corporation | System And Method For Generation And Use Of Compact Clonally Amplified Products |
EP2820129A1 (en) | 2012-03-02 | 2015-01-07 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
JP6302847B2 (ja) | 2012-03-05 | 2018-03-28 | アダプティヴ バイオテクノロジーズ コーポレーション | 頻度が一致したサブユニットからの、対をなす免疫受容体鎖の決定 |
CA2866254A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer |
NO2694769T3 (ja) | 2012-03-06 | 2018-03-03 | ||
US9150853B2 (en) | 2012-03-21 | 2015-10-06 | Gen9, Inc. | Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis |
US20130261984A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Illumina, Inc. | Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities |
EP2834370B1 (en) | 2012-04-03 | 2019-01-02 | The Regents Of The University Of Michigan | Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease |
EP4219012A1 (en) | 2012-04-03 | 2023-08-02 | Illumina, Inc. | Method of imaging a substrate comprising fluorescent features and use of the method in nucleic acid sequencing |
US8209130B1 (en) | 2012-04-04 | 2012-06-26 | Good Start Genetics, Inc. | Sequence assembly |
US8812422B2 (en) | 2012-04-09 | 2014-08-19 | Good Start Genetics, Inc. | Variant database |
US20130274148A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Illumina, Inc. | Portable genetic detection and analysis system and method |
CN108485940B (zh) * | 2012-04-12 | 2022-01-28 | 维里纳塔健康公司 | 拷贝数变异的检测和分类 |
US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
EP3461910B1 (en) | 2012-04-19 | 2020-08-26 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
WO2013158313A1 (en) | 2012-04-19 | 2013-10-24 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
WO2013163210A1 (en) * | 2012-04-23 | 2013-10-31 | Philip Alexander Rolfe | Method and system for detection of an organism |
CN104603286B (zh) | 2012-04-24 | 2020-07-31 | Gen9股份有限公司 | 在体外克隆中分选核酸和多重制备物的方法 |
CN111495613B (zh) * | 2012-04-30 | 2022-04-26 | 生命技术公司 | 离心机装置和系统 |
WO2013166302A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-07 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid sequencing systems and methods |
PL2831276T3 (pl) | 2012-05-08 | 2016-10-31 | Kompozycje i sposób oznaczania i kalibracji dla odchylenia amplifikacji w reakcjach multipleksowej pcr | |
US9646132B2 (en) | 2012-05-11 | 2017-05-09 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
US10192024B2 (en) | 2012-05-18 | 2019-01-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for generation and use of optimal nucleotide flow orders |
AU2013266394B2 (en) * | 2012-05-21 | 2019-03-14 | The Scripps Research Institute | Methods of sample preparation |
US10289800B2 (en) | 2012-05-21 | 2019-05-14 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Processes for calculating phased fetal genomic sequences |
US9920361B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-03-20 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for analyzing nucleic acid |
CN102766574B (zh) * | 2012-05-24 | 2013-12-25 | 中国科学院北京基因组研究所 | 用于dna测序仪的反应仓 |
WO2013176767A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods |
US8786331B2 (en) | 2012-05-29 | 2014-07-22 | Life Technologies Corporation | System for reducing noise in a chemical sensor array |
WO2013184754A2 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes |
US9012022B2 (en) | 2012-06-08 | 2015-04-21 | Illumina, Inc. | Polymer coatings |
US8895249B2 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-25 | Illumina, Inc. | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
JP6181751B2 (ja) | 2012-06-18 | 2017-08-16 | ニューゲン テクノロジーズ, インコーポレイテッド | 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法 |
CN113512577A (zh) | 2012-06-25 | 2021-10-19 | Gen9股份有限公司 | 用于核酸组装和高通量测序的方法 |
WO2014005076A2 (en) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and biomarkers for detection of kidney disorders |
EP2870264A4 (en) | 2012-07-03 | 2016-03-02 | Sloan Kettering Inst Cancer | QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THE RECOVERY OF HUMAN T-CELL REPERTOIR AFTER TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC BLOOD-GENERATING STEM CELLS |
US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
AU2013290102B2 (en) | 2012-07-13 | 2018-11-15 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses |
US9092401B2 (en) | 2012-10-31 | 2015-07-28 | Counsyl, Inc. | System and methods for detecting genetic variation |
GB201212775D0 (en) * | 2012-07-18 | 2012-08-29 | Dna Electronics Ltd | Sensing apparatus and method |
US9977861B2 (en) | 2012-07-18 | 2018-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes |
CN104583421A (zh) | 2012-07-19 | 2015-04-29 | 阿瑞奥萨诊断公司 | 遗传变体的基于多重的顺序连接的检测 |
SG11201408813VA (en) * | 2012-07-24 | 2015-02-27 | Natera Inc | Highly multiplex pcr methods and compositions |
EP2880448B1 (en) | 2012-08-03 | 2022-06-29 | Foundation Medicine, Inc. | Human papilloma virus as predictor of cancer prognosis |
US10174310B2 (en) | 2012-08-08 | 2019-01-08 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells |
EP4001426A1 (en) | 2012-08-13 | 2022-05-25 | The Regents of The University of California | Methods and systems for detecting biological components |
US9567631B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-02-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US20150005200A1 (en) * | 2012-08-14 | 2015-01-01 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US20140378345A1 (en) * | 2012-08-14 | 2014-12-25 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US20140378322A1 (en) * | 2012-08-14 | 2014-12-25 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US10400280B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US9388465B2 (en) * | 2013-02-08 | 2016-07-12 | 10X Genomics, Inc. | Polynucleotide barcode generation |
US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US20150005199A1 (en) * | 2012-08-14 | 2015-01-01 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN113528634A (zh) * | 2012-08-14 | 2021-10-22 | 10X基因组学有限公司 | 微胶囊组合物及方法 |
US11035005B2 (en) | 2012-08-16 | 2021-06-15 | Decipher Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using biomarkers |
NL2017959B1 (en) | 2016-12-08 | 2018-06-19 | Illumina Inc | Cartridge assembly |
US10876152B2 (en) | 2012-09-04 | 2020-12-29 | Guardant Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
US11913065B2 (en) | 2012-09-04 | 2024-02-27 | Guardent Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
WO2014043143A1 (en) | 2012-09-11 | 2014-03-20 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
EP3257952B1 (en) | 2012-09-11 | 2020-02-12 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification |
CN104797718B (zh) * | 2012-09-12 | 2020-05-08 | 加利福尼亚大学董事会 | 通过单链扩增和测序对单个细胞进行精确基因组测序 |
DK2895621T3 (da) | 2012-09-14 | 2020-11-30 | Population Bio Inc | Fremgangsmåder og sammensætning til diagnosticering, prognose og behandling af neurologiske tilstande |
CA2922005A1 (en) | 2012-09-27 | 2014-04-03 | Population Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for screening and treating developmental disorders |
WO2014055561A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
US10329608B2 (en) | 2012-10-10 | 2019-06-25 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for repeat sequencing |
US10162800B2 (en) | 2012-10-17 | 2018-12-25 | Celmatix Inc. | Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time |
US9177098B2 (en) | 2012-10-17 | 2015-11-03 | Celmatix Inc. | Systems and methods for determining the probability of a pregnancy at a selected point in time |
WO2014068407A2 (en) * | 2012-10-26 | 2014-05-08 | Sysmex Inostics Gmbh | Emulsion systems and emulsion-based amplification of nucleic acid |
US9651539B2 (en) | 2012-10-28 | 2017-05-16 | Quantapore, Inc. | Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment |
CN104956225B (zh) | 2012-10-29 | 2018-10-02 | 约翰·霍普金斯大学 | 卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试 |
EP2914621B1 (en) | 2012-11-05 | 2023-06-07 | Foundation Medicine, Inc. | Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof |
KR20150090037A (ko) | 2012-11-27 | 2015-08-05 | 젠셀 바이오시스템즈 리미티드 | 액체 샘플의 취급 |
EP2925893A4 (en) * | 2012-12-03 | 2016-09-07 | Elim Biopharmaceuticals Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREPARATION OF NUCLEIC ACID AND ANALYZES |
US9836577B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-12-05 | Celmatix, Inc. | Methods and devices for assessing risk of female infertility |
US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
EP2746405B1 (en) | 2012-12-23 | 2015-11-04 | HS Diagnomics GmbH | Methods and primer sets for high throughput PCR sequencing |
US9080968B2 (en) | 2013-01-04 | 2015-07-14 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for point of use removal of sacrificial material |
US9841398B2 (en) | 2013-01-08 | 2017-12-12 | Life Technologies Corporation | Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors |
WO2014113502A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Quanterix Corporation | Detection of dna or rna using single molecule arrays and other techniques |
US9128861B2 (en) | 2013-01-17 | 2015-09-08 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
EP3939614A1 (en) | 2013-01-18 | 2022-01-19 | Foundation Medicine, Inc. | Methods of treating cholangiocarcinoma |
WO2014116729A2 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing |
US8962366B2 (en) | 2013-01-28 | 2015-02-24 | Life Technologies Corporation | Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors |
US9411930B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-08-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
GB2547875B (en) | 2013-02-01 | 2017-12-13 | Univ California | Methods for meta-genomics analysis of microbes |
US9512422B2 (en) | 2013-02-26 | 2016-12-06 | Illumina, Inc. | Gel patterned surfaces |
EP2964781B1 (en) | 2013-03-08 | 2018-01-10 | Roche Diagnostics GmbH | Egfr mutation blood testing |
US8841217B1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-23 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with protruded sensor surface |
CN105378108A (zh) | 2013-03-13 | 2016-03-02 | 雅培分子公司 | 用于分离核酸的系统和方法 |
US10443092B2 (en) | 2013-03-13 | 2019-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of elongating DNA |
US8963216B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-02-24 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface |
EP2971100A1 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-20 | Sequenom, Inc. | Primers for dna methylation analysis |
JP2016512437A (ja) | 2013-03-14 | 2016-04-28 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | 多重メチル化特異的増幅システムおよび方法 |
US20140296080A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Life Technologies Corporation | Methods, Systems, and Computer Readable Media for Evaluating Variant Likelihood |
US20140287946A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Nucleic acid control panels |
US9146248B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-29 | Intelligent Bio-Systems, Inc. | Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments |
WO2014152421A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for analyzing nucleic acids |
ES2716094T3 (es) | 2013-03-15 | 2019-06-10 | Ibis Biosciences Inc | Métodos para analizar la contaminación en la secuenciación del ADN |
WO2014142981A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Enzyme-linked nucleotides |
WO2014149779A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | Chemical device with thin conductive element |
BR112015022490A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-07-18 | Veracyte Inc | métodos e composições para classificação de amostras |
JP6581074B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-09-25 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 一貫性のあるセンサ表面積を有する化学センサ |
GB2584364A (en) | 2013-03-15 | 2020-12-02 | Abvitro Llc | Single cell bar-coding for antibody discovery |
DK2970959T3 (en) * | 2013-03-15 | 2018-08-06 | Lineage Biosciences Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MARKING AND ANALYSIS OF SAMPLES |
CN105408496A (zh) | 2013-03-15 | 2016-03-16 | 夸登特健康公司 | 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法 |
US9116117B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-08-25 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with sidewall sensor surface |
US9835585B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-05 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with protruded sensor surface |
WO2014152625A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Genapsys, Inc. | Systems and methods for biological analysis |
WO2014149780A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with consistent sensor surface areas |
US9591268B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-03-07 | Qiagen Waltham, Inc. | Flow cell alignment methods and systems |
EP2971130A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-05 | Nugen Technologies Inc | SEQUENTIAL SEQUENCING |
CA2905410A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Abbott Molecular Inc. | Systems and methods for detection of genomic copy number changes |
EP2971152B1 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers |
EP3312295A1 (en) * | 2013-03-19 | 2018-04-25 | Directed Genomics, LLC | Enrichment of target sequences |
SG10201708498VA (en) | 2013-04-17 | 2017-11-29 | Agency Science Tech & Res | Method for generating extended sequence reads |
US10486152B2 (en) | 2013-04-19 | 2019-11-26 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Non-contact micro droplet dispenser and method |
RU2578009C2 (ru) * | 2013-05-08 | 2016-03-20 | Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" | Способ идентификации нативных пар фрагментов днк или рнк, присутствующих в одних и тех же живых клетках |
US20140336063A1 (en) | 2013-05-09 | 2014-11-13 | Life Technologies Corporation | Windowed Sequencing |
US10160995B2 (en) | 2013-05-13 | 2018-12-25 | Qiagen Waltham, Inc. | Analyte enrichment methods and compositions |
AU2014268322B2 (en) | 2013-05-24 | 2019-01-24 | Quantapore, Inc. | Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed FRET detection |
US8847799B1 (en) | 2013-06-03 | 2014-09-30 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
US10458942B2 (en) | 2013-06-10 | 2019-10-29 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor array having multiple sensors per well |
US10526640B2 (en) | 2013-06-19 | 2020-01-07 | Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University | Methods for retrieving sequence-verified nucleic acid fragments and apparatuses for amplifying sequence verified nucleic acid fragments |
KR101648252B1 (ko) * | 2014-01-28 | 2016-08-16 | 연세대학교 산학협력단 | 염기서열 확인 과정에서 분리된 핵산 단편들을 회수하는 방법 |
WO2014210225A1 (en) | 2013-06-25 | 2014-12-31 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
KR102070483B1 (ko) | 2013-07-01 | 2020-01-29 | 일루미나, 인코포레이티드 | 촉매-무함유 표면 작용화 및 중합체 그라프팅 |
ES2628485T3 (es) | 2013-07-03 | 2017-08-03 | Illumina, Inc. | Secuenciación mediante síntesis ortogonal |
US9926597B2 (en) | 2013-07-26 | 2018-03-27 | Life Technologies Corporation | Control nucleic acid sequences for use in sequencing-by-synthesis and methods for designing the same |
KR102291045B1 (ko) | 2013-08-05 | 2021-08-19 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 드 노보 합성된 유전자 라이브러리 |
DK3030645T3 (da) | 2013-08-08 | 2023-01-30 | Illumina Inc | Fluidsystem til levering af reagenser til en flowcelle |
US20150051117A1 (en) * | 2013-08-16 | 2015-02-19 | President And Fellows Of Harvard College | Assembly of Nucleic Acid Sequences in Emulsions |
EP2840148B1 (en) | 2013-08-23 | 2019-04-03 | F. Hoffmann-La Roche AG | Methods for nucleic acid amplification |
EP2848698A1 (en) | 2013-08-26 | 2015-03-18 | F. Hoffmann-La Roche AG | System and method for automated nucleic acid amplification |
KR20160081896A (ko) | 2013-08-30 | 2016-07-08 | 일루미나, 인코포레이티드 | 친수성 또는 다양한-친수성 표면 상에서의 액적의 조작 |
US10395758B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequencing methods |
EP3965111A1 (en) | 2013-08-30 | 2022-03-09 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genomic analysis |
CA2959978A1 (en) * | 2013-09-24 | 2015-04-02 | The Regents Of The University Of California | Encapsulated sensors and sensing systems for bioassays and diagnostics and methods for making and using them |
US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
GB2535066A (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Personalis Inc | Methods for analyzing genotypes |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
US10410739B2 (en) | 2013-10-04 | 2019-09-10 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for modeling phasing effects in sequencing using termination chemistry |
EP3875601A1 (en) | 2013-10-17 | 2021-09-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries |
WO2015057565A1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
US9897986B2 (en) | 2013-10-29 | 2018-02-20 | Regal Beloit America, Inc. | System and method for enabling a motor controller to communicate using multiple different communication protocols |
CN103540672B (zh) * | 2013-10-29 | 2015-04-08 | 中国科学技术大学 | 一种亲和核酸分子的快速鉴定和分离方法 |
WO2015069798A1 (en) * | 2013-11-05 | 2015-05-14 | The Regents Of The University Of California | Single-cell forensic short tandem repeat typing within microfluidic droplets |
WO2015070086A1 (en) | 2013-11-07 | 2015-05-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell-free nucleic acids for the analysis of the human microbiome and components thereof |
WO2015069634A1 (en) | 2013-11-08 | 2015-05-14 | President And Fellows Of Harvard College | Microparticles, methods for their preparation and use |
US9533240B2 (en) | 2013-11-12 | 2017-01-03 | Life Technologies Corporation | System and method for emulsion breaking |
EP2891722B1 (en) | 2013-11-12 | 2018-10-10 | Population Bio, Inc. | Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating endometriosis |
US9546399B2 (en) | 2013-11-13 | 2017-01-17 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
CN104630202A (zh) * | 2013-11-13 | 2015-05-20 | 北京大学 | 一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法 |
WO2015073999A1 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Integenx Inc. | Cartridges and instruments for sample analysis |
US10385335B2 (en) | 2013-12-05 | 2019-08-20 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Modified surfaces |
GB2537077B (en) | 2013-12-05 | 2018-05-09 | Centrillion Tech Holdings Corp | Methods for sequencing nucleic acids |
CN111118121A (zh) | 2013-12-05 | 2020-05-08 | 生捷科技控股公司 | 图案化阵列的制备 |
CA2931533C (en) | 2013-12-09 | 2023-08-08 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
EP3540074A1 (en) | 2013-12-11 | 2019-09-18 | The Regents of the University of California | Method of tagging internal regions of nucleic acid molecules |
US10125393B2 (en) | 2013-12-11 | 2018-11-13 | Genapsys, Inc. | Systems and methods for biological analysis and computation |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
US9909181B2 (en) | 2013-12-13 | 2018-03-06 | Northwestern University | Biomarkers for post-traumatic stress states |
US9824068B2 (en) | 2013-12-16 | 2017-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods and apparatus for sorting data |
WO2015095355A2 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Detection of an antibody against a pathogen |
CN111534580A (zh) | 2013-12-28 | 2020-08-14 | 夸登特健康公司 | 用于检测遗传变异的方法和系统 |
WO2015103225A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Illumina, Inc. | Addressable flow cell using patterned electrodes |
WO2015103367A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Raindance Technologies, Inc. | System and method for detection of rna species |
WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
US9587268B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-03-07 | Agilent Technologies Inc. | Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment |
US9387451B2 (en) | 2014-02-03 | 2016-07-12 | International Business Machines Corporation | Flow cell array and uses thereof |
CN106029885A (zh) | 2014-02-10 | 2016-10-12 | 基因细胞生物系统有限公司 | 复合液体池(clc)介导的核酸文库制备装置及其使用方法 |
WO2015131107A1 (en) | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
WO2015134787A2 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
WO2015138774A1 (en) | 2014-03-13 | 2015-09-17 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
WO2015141649A1 (ja) * | 2014-03-20 | 2015-09-24 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 核酸増幅自動化装置、及び核酸増幅分析自動化装置 |
US11060139B2 (en) | 2014-03-28 | 2021-07-13 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for sequencing nucleic acids |
US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
US20150284715A1 (en) * | 2014-04-07 | 2015-10-08 | Qiagen Gmbh | Enrichment Methods |
MX2016013156A (es) | 2014-04-10 | 2017-02-14 | 10X Genomics Inc | Dispositivos, sistemas y metodos fluidicos, para encapsular y dividir reactivos, y aplicaciones de los mismos. |
ES2777529T3 (es) | 2014-04-17 | 2020-08-05 | Adaptive Biotechnologies Corp | Cuantificación de genomas de células inmunitarias adaptativas en una mezcla compleja de células |
EP3132060B1 (en) | 2014-04-18 | 2019-03-13 | Genapsys Inc. | Methods and systems for nucleic acid amplification |
RU2717641C2 (ru) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | Натера, Инк. | Обнаружение мутаций и плоидности в хромосомных сегментах |
WO2015175530A1 (en) | 2014-05-12 | 2015-11-19 | Gore Athurva | Methods for detecting aneuploidy |
US10208332B2 (en) | 2014-05-21 | 2019-02-19 | Integenx Inc. | Fluidic cartridge with valve mechanism |
US10760109B2 (en) | 2014-06-06 | 2020-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease |
US9534215B2 (en) * | 2014-06-11 | 2017-01-03 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for substrate enrichment |
EP3155127B1 (en) * | 2014-06-13 | 2020-07-22 | Life Technologies Corporation | Multiplex nucleic acid amplification |
WO2015200541A1 (en) | 2014-06-24 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital pcr barcoding |
CN113249435A (zh) | 2014-06-26 | 2021-08-13 | 10X基因组学有限公司 | 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法 |
SG11201610691QA (en) | 2014-06-26 | 2017-01-27 | 10X Genomics Inc | Processes and systems for nucleic acid sequence assembly |
US10697007B2 (en) | 2014-06-27 | 2020-06-30 | The Regents Of The University Of California | PCR-activated sorting (PAS) |
BR112016030008A2 (pt) | 2014-06-27 | 2017-10-24 | Abbott Lab | método para a detecção de infecção por pegivirus humano 2 em um indivíduo, para a detecção de ácido nucleico de pegivirus humano 2 e para a detecção de pegivirus humano 2 em uma amostra, e, composição |
US10179932B2 (en) | 2014-07-11 | 2019-01-15 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy |
US10208350B2 (en) | 2014-07-17 | 2019-02-19 | Celmatix Inc. | Methods and systems for assessing infertility and related pathologies |
US10072306B2 (en) | 2014-07-24 | 2018-09-11 | Abbott Molecular Inc. | Compositions and methods for the detection and analysis of mycobacterium tuberculosis |
EP3174980A4 (en) | 2014-08-01 | 2018-01-17 | Dovetail Genomics, LLC | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
WO2016022696A1 (en) | 2014-08-05 | 2016-02-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of isolating aptamers for minimal residual disease detection |
US10102337B2 (en) | 2014-08-06 | 2018-10-16 | Nugen Technologies, Inc. | Digital measurements from targeted sequencing |
GB201413929D0 (en) | 2014-08-06 | 2014-09-17 | Geneseque As | Method |
US9982291B2 (en) | 2014-08-11 | 2018-05-29 | Luminex Corporation | Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays |
CN106796212A (zh) | 2014-08-12 | 2017-05-31 | 新生代吉恩公司 | 用于基于收集的体液而监测健康的系统和方法 |
US10435685B2 (en) | 2014-08-19 | 2019-10-08 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for enrichment of nucleic acids |
CN107076739B (zh) | 2014-08-21 | 2018-12-25 | 伊卢米纳剑桥有限公司 | 可逆表面官能化 |
CA2996445A1 (en) | 2014-09-05 | 2016-03-10 | Eli Hatchwell | Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions |
EP3929543A3 (en) | 2014-09-08 | 2022-03-16 | Becton, Dickinson and Company | System and method for preparing a pharmaceutical compound |
WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
CN105400864B (zh) * | 2014-09-12 | 2020-04-14 | 深圳华大基因股份有限公司 | 用于基于血液样品构建测序文库的方法及其在确定胎儿遗传异常中的用途 |
WO2016037361A1 (zh) * | 2014-09-12 | 2016-03-17 | 深圳华大基因科技有限公司 | 试剂盒及其在核酸测序中的用途 |
JP6483249B2 (ja) * | 2014-09-12 | 2019-03-13 | エムジーアイ テック カンパニー リミテッドMGI Tech Co., Ltd. | 単離されたオリゴヌクレオチドおよび核酸の配列決定におけるその使用 |
EP3194593B1 (en) | 2014-09-15 | 2019-02-06 | AbVitro LLC | High-throughput nucleotide library sequencing |
EP3194643B1 (en) | 2014-09-17 | 2020-02-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Sequencing by synthesis using pulse read optics |
KR102538753B1 (ko) | 2014-09-18 | 2023-05-31 | 일루미나, 인코포레이티드 | 핵산 서열결정 데이터를 분석하기 위한 방법 및 시스템 |
EP3224595A4 (en) | 2014-09-24 | 2018-06-13 | Good Start Genetics, Inc. | Process control for increased robustness of genetic assays |
US9885079B2 (en) | 2014-10-10 | 2018-02-06 | Quantapore, Inc. | Nanopore-based polymer analysis with mutually-quenching fluorescent labels |
WO2016060974A1 (en) | 2014-10-13 | 2016-04-21 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer-readable media for accelerated base calling |
US10344317B2 (en) | 2014-10-13 | 2019-07-09 | Mgi Tech Co., Ltd | Method and a sequence combination for producing nucleic acid fragments |
US10690627B2 (en) | 2014-10-22 | 2020-06-23 | IntegenX, Inc. | Systems and methods for sample preparation, processing and analysis |
EP3209419A4 (en) | 2014-10-22 | 2018-10-03 | The Regents of The University of California | High definition microdroplet printer |
EP3209800B1 (en) | 2014-10-24 | 2022-02-16 | Quantapore, Inc. | Efficient optical analysis of polymers using arrays of nanostructures |
CA2966201A1 (en) | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples |
AU2015339148B2 (en) | 2014-10-29 | 2022-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing |
EP4026913A1 (en) | 2014-10-30 | 2022-07-13 | Personalis, Inc. | Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin |
ES2772127T3 (es) | 2014-10-31 | 2020-07-07 | Illumina Cambridge Ltd | Polímeros y recubrimientos de copolímeros de ADN |
JP6812797B2 (ja) * | 2014-11-04 | 2021-01-13 | 凸版印刷株式会社 | 核酸導入方法、核酸検出方法、生体成分解析方法、生体成分定量用アレイデバイス、及び生体成分解析キット |
WO2016073237A1 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Illumina Cambridge Limited | Reducing dna damage during sample preparation and sequencing using siderophore chelators |
US9975122B2 (en) | 2014-11-05 | 2018-05-22 | 10X Genomics, Inc. | Instrument systems for integrated sample processing |
WO2016073778A2 (en) | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Nirmidas Biotech, Inc. | Metal composites for enhanced imaging |
US20170335396A1 (en) | 2014-11-05 | 2017-11-23 | Veracyte, Inc. | Systems and methods of diagnosing idiopathic pulmonary fibrosis on transbronchial biopsies using machine learning and high dimensional transcriptional data |
US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
US11789906B2 (en) | 2014-11-19 | 2023-10-17 | Arc Bio, Llc | Systems and methods for genomic manipulations and analysis |
WO2016081585A1 (en) | 2014-11-20 | 2016-05-26 | Ampliwise Inc. | Compositions and methods for nucleic acid amplification |
US10233490B2 (en) | 2014-11-21 | 2019-03-19 | Metabiotech Corporation | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
EP3224384A4 (en) | 2014-11-25 | 2018-04-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing |
US11959141B2 (en) | 2014-12-05 | 2024-04-16 | Foundation Medicine, Inc. | Multigene analysis of tumor samples |
US10077472B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-09-18 | Life Technologies Corporation | High data rate integrated circuit with power management |
WO2016100895A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Life Technologies Corporation | Calibration panels and methods for designing the same |
KR102593647B1 (ko) | 2014-12-18 | 2023-10-26 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 트랜스미터 구성을 갖춘 높은 데이터율 집적 회로 |
EP3234575B1 (en) | 2014-12-18 | 2023-01-25 | Life Technologies Corporation | Apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays |
EP3237616A1 (en) | 2014-12-24 | 2017-11-01 | Keygene N.V. | Backbone mediated mate pair sequencing |
US10066259B2 (en) | 2015-01-06 | 2018-09-04 | Good Start Genetics, Inc. | Screening for structural variants |
KR102321863B1 (ko) | 2015-01-12 | 2021-11-08 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리 |
KR20170106979A (ko) | 2015-01-13 | 2017-09-22 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 구조 변이 및 위상 조정 정보를 시각화하기 위한 시스템 및 방법 |
GB201501012D0 (en) * | 2015-01-21 | 2015-03-04 | Base4 Innovation Ltd | Improved droplet sequencing apparatus and method |
EP3251054A4 (en) * | 2015-01-30 | 2018-09-12 | Ent. Services Development Corporation LP | Relationship preserving projection of digital objects |
GB2548763B (en) | 2015-02-02 | 2021-07-21 | Hitachi High Tech Corp | Multicolor fluorescence analysis device |
US10646869B2 (en) * | 2015-02-03 | 2020-05-12 | Hitachi, Ltd. | Flow cell device for single cell analysis, and single cell analysis device |
US11111519B2 (en) | 2015-02-04 | 2021-09-07 | The Regents Of The University Of California | Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities |
CA2975855A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Compositions and methods for synthetic gene assembly |
CA2975852A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | Twist Bioscience Corporation | Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly |
SG11201705996PA (en) | 2015-02-09 | 2017-09-28 | 10X Genomics Inc | Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data |
BR112017017142B1 (pt) * | 2015-02-11 | 2024-03-12 | Paragon Genomics, Inc | Método para redução dos produtos de amplificação não específicos a partir de uma reação de extensão de iniciador dependente de molde |
US10421993B2 (en) | 2015-02-11 | 2019-09-24 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for reducing non-specific amplification products |
US9715573B2 (en) | 2015-02-17 | 2017-07-25 | Dovetail Genomics, Llc | Nucleic acid sequence assembly |
WO2016134342A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Wafergen, Inc. | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells |
AU2016222788B2 (en) | 2015-02-24 | 2022-03-31 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
EP3936619A1 (en) | 2015-02-24 | 2022-01-12 | 10X Genomics, Inc. | Methods for targeted nucleic acid sequence coverage |
EP4286516A3 (en) | 2015-02-24 | 2024-03-06 | 10X Genomics, Inc. | Partition processing methods and systems |
CN107614096A (zh) | 2015-03-13 | 2018-01-19 | 哈佛学院院长及董事 | 使用扩增测定细胞 |
AU2016235288B2 (en) | 2015-03-24 | 2019-02-28 | Illumina Cambridge Limited | Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis |
US11807896B2 (en) | 2015-03-26 | 2023-11-07 | Dovetail Genomics, Llc | Physical linkage preservation in DNA storage |
US20160287152A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Verily Life Sciences Llc | Functionalized Nanoparticles, Methods and In Vivo Diagnostic System |
WO2016160965A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods and compositions for repair of dna ends by multiple enzymatic activities |
WO2016161273A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
CA2980769A1 (en) | 2015-04-02 | 2016-10-06 | The Jackson Laboratory | Method for detecting genomic variations using circularised mate-pair library and shotgun sequencing |
EP3901281B1 (en) | 2015-04-10 | 2022-11-23 | Spatial Transcriptomics AB | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
WO2016172377A1 (en) | 2015-04-21 | 2016-10-27 | Twist Bioscience Corporation | Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis |
CN106117288B (zh) | 2015-05-08 | 2019-10-15 | 生捷科技控股公司 | 二硫键连接的可逆终止子 |
EP4190912A1 (en) | 2015-05-11 | 2023-06-07 | Illumina, Inc. | Platform for discovery and analysis of therapeutic agents |
US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
EP4220645A3 (en) | 2015-05-14 | 2023-11-08 | Life Technologies Corporation | Barcode sequences, and related systems and methods |
US10640809B2 (en) * | 2015-05-29 | 2020-05-05 | Epicentre Technologies Corporation | Methods of analyzing nucleic acids |
JP6698708B2 (ja) | 2015-06-09 | 2020-05-27 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体 |
WO2016201111A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for sequencing nucleic acids |
CN107924121B (zh) | 2015-07-07 | 2021-06-08 | 亿明达股份有限公司 | 经由纳米压印的选择性表面图案化 |
CN108184327A (zh) | 2015-07-14 | 2018-06-19 | 雅培分子公司 | 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法 |
US10392613B2 (en) | 2015-07-14 | 2019-08-27 | Abbott Molecular Inc. | Purification of nucleic acids using copper-titanium oxides |
US20180207920A1 (en) | 2015-07-17 | 2018-07-26 | Illumina, Inc. | Polymer sheets for sequencing applications |
US10150994B2 (en) | 2015-07-22 | 2018-12-11 | Qiagen Waltham, Inc. | Modular flow cells and methods of sequencing |
BR112017023418A2 (pt) * | 2015-07-30 | 2018-07-24 | Illumina, Inc. | desbloqueio ortogonal de nucleotídeos |
JP6946292B2 (ja) | 2015-08-06 | 2021-10-06 | エイアールシー バイオ リミテッド ライアビリティ カンパニー | ゲノム分析のためのシステムおよび方法 |
US11286531B2 (en) | 2015-08-11 | 2022-03-29 | The Johns Hopkins University | Assaying ovarian cyst fluid |
CN108474805A (zh) | 2015-08-24 | 2018-08-31 | 亿明达股份有限公司 | 用于生物和化学测定的线路内蓄压器和流量控制系统 |
US10906044B2 (en) | 2015-09-02 | 2021-02-02 | Illumina Cambridge Limited | Methods of improving droplet operations in fluidic systems with a filler fluid including a surface regenerative silane |
US9938572B1 (en) | 2015-09-08 | 2018-04-10 | Raindance Technologies, Inc. | System and method for forming an emulsion |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
KR20180050411A (ko) | 2015-09-18 | 2018-05-14 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성 |
CN113604546A (zh) | 2015-09-22 | 2021-11-05 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于核酸合成的柔性基底 |
US10465232B1 (en) | 2015-10-08 | 2019-11-05 | Trace Genomics, Inc. | Methods for quantifying efficiency of nucleic acid extraction and detection |
EP3362032A4 (en) | 2015-10-13 | 2019-05-01 | President and Fellows of Harvard College | SYSTEMS AND METHODS OF MAKING AND USING GEL MICROSPHERES |
SG11201803289VA (en) | 2015-10-19 | 2018-05-30 | Dovetail Genomics Llc | Methods for genome assembly, haplotype phasing, and target independent nucleic acid detection |
MX2018005611A (es) | 2015-11-03 | 2018-11-09 | Harvard College | Metodo y aparato para la formacion de imagenes volumetricas de una matriz tridimensional que contiene acido nucleico. |
US11371094B2 (en) | 2015-11-19 | 2022-06-28 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides |
WO2017095958A1 (en) | 2015-12-01 | 2017-06-08 | Twist Bioscience Corporation | Functionalized surfaces and preparation thereof |
WO2017096110A1 (en) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Method and device for optimizing the process of identification of pathogens |
EP3882357B1 (en) | 2015-12-04 | 2022-08-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
WO2017120531A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiple beads per droplet resolution |
CA3008031A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Illumina Singapore Pte Ltd | Detection apparatus having a microfluorometer, a fluidic system, and a flow cell latch clamp module |
EP3402883A4 (en) | 2016-01-12 | 2019-09-18 | Seqwell, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING |
WO2017123770A1 (en) * | 2016-01-12 | 2017-07-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Synthesizing barcoding sequences utilizing phase-shift blocks and uses thereof |
CN113970589A (zh) | 2016-01-22 | 2022-01-25 | 普度研究基金会 | 带电质量标记系统 |
JP6685138B2 (ja) | 2016-01-27 | 2020-04-22 | シスメックス株式会社 | 核酸増幅の精度管理方法、精度管理用試薬およびその試薬キット |
WO2017139260A1 (en) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | RGENE, Inc. | Multiple ligase compositions, systems, and methods |
CN108779491B (zh) | 2016-02-11 | 2021-03-09 | 10X基因组学有限公司 | 用于全基因组序列数据的从头组装的系统、方法和介质 |
JP2017143783A (ja) * | 2016-02-17 | 2017-08-24 | 国立大学法人 筑波大学 | 並列反応用懸濁液、並列反応方法、スクリーニング方法および検査方法 |
CA3014911A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Dovetail Genomics, Llc | Generation of phased read-sets for genome assembly and haplotype phasing |
WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
CN109477127A (zh) | 2016-03-14 | 2019-03-15 | R基因股份有限公司 | 超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶 |
EP3433373B1 (en) | 2016-03-22 | 2022-01-12 | Myriad Women's Health, Inc. | Combinatorial dna screening |
CA3185611A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Karius, Inc. | Synthetic nucleic acid spike-ins |
US20170274374A1 (en) | 2016-03-28 | 2017-09-28 | Ilumina, Inc. | Multi-plane microarrays |
WO2017180909A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Nextgen Jane, Inc. | Sample collection and preservation devices, systems and methods |
US11355328B2 (en) | 2016-04-13 | 2022-06-07 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for isolating a target ion in an ion trap using a dual frequency waveform |
ITUA20162640A1 (it) * | 2016-04-15 | 2017-10-15 | Menarini Silicon Biosystems Spa | Metodo e kit per la generazione di librerie di dna per sequenziamento massivo parallelo |
CA3210120C (en) | 2016-04-25 | 2024-04-09 | President And Fellows Of Harvard College | Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection |
CN105821482B (zh) * | 2016-04-29 | 2018-04-10 | 李星军 | 一种生化微反应体系、高通量测序的建库仪及应用 |
US10077459B2 (en) | 2016-05-04 | 2018-09-18 | General Electric Company | Cell-free protein expression using rolling circle amplification product |
US10619205B2 (en) | 2016-05-06 | 2020-04-14 | Life Technologies Corporation | Combinatorial barcode sequences, and related systems and methods |
IL262946B2 (en) | 2016-05-13 | 2023-03-01 | Dovetail Genomics Llc | Retrieving long-range grip information from preserved samples |
WO2017197338A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | 10X Genomics, Inc. | Microfluidic systems and methods of use |
KR102171865B1 (ko) | 2016-05-18 | 2020-10-29 | 일루미나, 인코포레이티드 | 패턴화된 소수성 표면을 사용한 자가 조립된 패터닝 |
US11299783B2 (en) | 2016-05-27 | 2022-04-12 | Personalis, Inc. | Methods and systems for genetic analysis |
WO2017214561A1 (en) | 2016-06-10 | 2017-12-14 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for nucleic acid amplification |
EP3469097B1 (en) * | 2016-06-14 | 2020-02-19 | Base4 Innovation Limited | Method for the separation of a modified polynucleotide |
US11091795B2 (en) | 2016-07-11 | 2021-08-17 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias |
CN109790575A (zh) | 2016-07-20 | 2019-05-21 | 吉纳普赛斯股份有限公司 | 用于核酸测序的系统和方法 |
EP3487616B1 (en) | 2016-07-21 | 2023-08-09 | Takara Bio USA, Inc. | Multi-z imaging of wells of multi-well devices and liquid dispensing into the wells |
US11142791B2 (en) | 2016-08-10 | 2021-10-12 | The Regents Of The University Of California | Combined multiple-displacement amplification and PCR in an emulsion microdroplet |
AU2017315252B2 (en) | 2016-08-22 | 2023-03-16 | Biolumic Limited | System, device and methods of seed treatment |
WO2018038772A1 (en) | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Twist Bioscience Corporation | De novo synthesized nucleic acid libraries |
AU2017315425B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-11-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
CN109923216A (zh) | 2016-08-31 | 2019-06-21 | 哈佛学院董事及会员团体 | 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法 |
JP7239465B2 (ja) | 2016-08-31 | 2023-03-14 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 蛍光in situ配列決定による検出のための核酸配列ライブラリの作製法 |
JP6882453B2 (ja) * | 2016-08-31 | 2021-06-02 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 全ゲノムデジタル増幅方法 |
WO2018045162A1 (en) | 2016-09-01 | 2018-03-08 | Biogen Ma Inc. | Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof |
WO2018049260A1 (en) * | 2016-09-09 | 2018-03-15 | Tl Biolabs Corp . | Reusable microarray compositions and methods |
US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
KR102217487B1 (ko) | 2016-09-21 | 2021-02-23 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 핵산 기반 데이터 저장 |
BR112019005810A2 (pt) | 2016-09-27 | 2019-06-25 | Ubiome Inc | método para sequenciamento de microbioma melhorado para caracterizar uma afecção relacionada a micro-organismo para um usuário associado a uma amostra biológica, e método para sequenciamento de microbioma melhorado |
WO2018064116A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Illumina, Inc. | Methods and systems for data compression |
US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
US10190155B2 (en) | 2016-10-14 | 2019-01-29 | Nugen Technologies, Inc. | Molecular tag attachment and transfer |
CN111781139B (zh) | 2016-10-14 | 2023-09-12 | 亿明达股份有限公司 | 夹盒组件 |
US11725232B2 (en) | 2016-10-31 | 2023-08-15 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Compositions, methods and kits for detection of genetic variants for alzheimer's disease |
EP3692161A4 (en) | 2016-11-11 | 2022-05-25 | Psomagen, Inc. | METHODS AND SYSTEM FOR FRAGMENT ARRANGEMENT AND SEQUENCE IDENTIFICATION |
US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
EA201991262A1 (ru) | 2016-12-16 | 2020-04-07 | Твист Байосайенс Корпорейшн | Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез |
WO2018118971A1 (en) | 2016-12-19 | 2018-06-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna |
WO2018114706A1 (en) * | 2016-12-20 | 2018-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Single stranded circular dna libraries for circular consensus sequencing |
AU2017382905A1 (en) | 2016-12-21 | 2019-07-04 | The Regents Of The University Of California | Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets |
US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10815525B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-10-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
AU2017385424A1 (en) | 2016-12-27 | 2019-08-01 | Qingdao MGI Tech Co., Ltd. | Single fluorescent dye based sequencing method |
IL267836B2 (en) * | 2017-01-04 | 2023-09-01 | Complete Genomics Inc | Stepwise sequence determination by unlabeled reversible terminations or natural nucleotides |
GB201704754D0 (en) | 2017-01-05 | 2017-05-10 | Illumina Inc | Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries |
US10100358B2 (en) | 2017-01-10 | 2018-10-16 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for reducing redundant molecular barcodes created in primer extension reactions |
WO2018132916A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Genomedx Biosciences, Inc. | Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer |
EP4310183A3 (en) | 2017-01-30 | 2024-02-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for droplet-based single cell barcoding |
GB201701688D0 (en) | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illumia Inc | System and method with fiducials in non-recliner layouts |
GB201701686D0 (en) | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illunina Inc | System & method with fiducials having offset layouts |
GB201701689D0 (en) | 2017-02-01 | 2017-03-15 | Illumia Inc | System and method with fiducials of non-closed shapes |
US10240205B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-03-26 | Population Bio, Inc. | Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test |
US10995333B2 (en) | 2017-02-06 | 2021-05-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation |
EP3585889A1 (en) | 2017-02-21 | 2020-01-01 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
CA3054303A1 (en) | 2017-02-22 | 2018-08-30 | Twist Bioscience Corporation | Nucleic acid based data storage |
EP3838268B1 (en) * | 2017-02-24 | 2023-05-10 | The Regents of the University of California | Particle-drop structures and methods for making and using the same |
GB201703049D0 (en) * | 2017-02-24 | 2017-04-12 | Univ I Tromsø - Norges Arktiske Univ | Single-strand binding protein |
JP6931540B2 (ja) * | 2017-02-27 | 2021-09-08 | シスメックス株式会社 | 検体処理チップを用いた送液方法、検体処理チップの送液装置 |
CA3055925A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Decipher Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
CA3056388A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Twist Bioscience Corporation | Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof |
WO2018175399A1 (en) | 2017-03-24 | 2018-09-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Universal hairpin primers |
WO2018187013A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | Omniome, Inc. | Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions |
WO2018186930A1 (en) * | 2017-04-06 | 2018-10-11 | MyOmicsDx, Inc | Method and kit for constructing nucleic acid library |
WO2018191563A1 (en) | 2017-04-12 | 2018-10-18 | Karius, Inc. | Sample preparation methods, systems and compositions |
CA3019250A1 (en) | 2017-04-14 | 2019-10-13 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generation of cell-derived microfilament network |
EP3612646A1 (en) | 2017-04-18 | 2020-02-26 | Dovetail Genomics, LLC | Nucleic acid characteristics as guides for sequence assembly |
US10161003B2 (en) | 2017-04-25 | 2018-12-25 | Omniome, Inc. | Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency |
JP2018183097A (ja) * | 2017-04-26 | 2018-11-22 | 株式会社エンプラス | 細胞由来の解析用液滴の単離方法、および細胞の解析方法 |
US11078542B2 (en) | 2017-05-12 | 2021-08-03 | Decipher Biosciences, Inc. | Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor aggressiveness |
CN106957842B (zh) * | 2017-05-15 | 2020-05-22 | 青岛安德贝生命科技有限公司 | Bac克隆dna的提取方法 |
EP3625715A4 (en) | 2017-05-19 | 2021-03-17 | 10X Genomics, Inc. | DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS |
US20180340169A1 (en) | 2017-05-26 | 2018-11-29 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
EP4230746A3 (en) | 2017-05-26 | 2023-11-01 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
CN110997934A (zh) * | 2017-05-31 | 2020-04-10 | 生捷科技控股公司 | 具有电子检测系统的寡核苷酸探针阵列 |
AU2018279728B2 (en) | 2017-06-08 | 2023-07-20 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for identifying epitopes |
KR20240013290A (ko) | 2017-06-12 | 2024-01-30 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 심리스 핵산 어셈블리를 위한 방법 |
WO2018231864A1 (en) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | Twist Bioscience Corporation | Methods for seamless nucleic acid assembly |
US11001885B2 (en) * | 2017-06-13 | 2021-05-11 | Personal Genomics Taiwan, Inc. | Apparatus for single molecular sequencing and method of sequencing nucleic acid molecules |
WO2018236918A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | MDA USING A BALL OLIGONUCLEOTIDE |
CA3068273A1 (en) | 2017-06-21 | 2018-12-27 | Bluedot Llc | Systems and methods for identification of nucleic acids in a sample |
US11217329B1 (en) | 2017-06-23 | 2022-01-04 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for determining biological sample integrity |
EP3655572A4 (en) * | 2017-07-17 | 2021-03-24 | Seqonce Biosciences, Inc. | RAPID BANK CONSTRUCTION FOR HIGH-RATE SEQUENCING |
US10858701B2 (en) | 2017-08-15 | 2020-12-08 | Omniome, Inc. | Scanning apparatus and method useful for detection of chemical and biological analytes |
WO2019038594A2 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Biolumic Limited | TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY |
EP3673064A4 (en) | 2017-08-24 | 2021-05-26 | Takara Bio USA, Inc. | METHOD OF PRODUCING NUCLEIC ACIDS USING STIMULUS MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES |
GB2581620A (en) | 2017-09-11 | 2020-08-26 | Twist Bioscience Corp | GPCR binding proteins and synthesis thereof |
SG11202002282TA (en) | 2017-09-20 | 2020-04-29 | Regeneron Pharma | Immunotherapy methods for patients whose tumors carry a high passenger gene mutation burden |
CN111566224A (zh) | 2017-09-21 | 2020-08-21 | 吉纳普赛斯股份有限公司 | 用于核酸测序的系统和方法 |
WO2019060716A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Freenome Holdings, Inc. | SAMPLE EXTRACTION METHODS AND SYSTEMS |
CA3076911A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-07-18 | The Regents Of The University Of California | Method of generating monodisperse emulsions |
US10837047B2 (en) | 2017-10-04 | 2020-11-17 | 10X Genomics, Inc. | Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers |
CA3077085A1 (en) | 2017-10-06 | 2019-04-11 | Oncotherapy Science, Inc. | Screening of t lymphocytes for cancer-specific antigens |
US10501739B2 (en) | 2017-10-18 | 2019-12-10 | Mission Bio, Inc. | Method, systems and apparatus for single cell analysis |
US11193166B2 (en) | 2017-10-19 | 2021-12-07 | Omniome, Inc. | Simultaneous background reduction and complex stabilization in binding assay workflows |
US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
CN111565834B (zh) | 2017-10-20 | 2022-08-26 | 特韦斯特生物科学公司 | 用于多核苷酸合成的加热的纳米孔 |
WO2019084043A1 (en) | 2017-10-26 | 2019-05-02 | 10X Genomics, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS |
EP4241882A3 (en) | 2017-10-27 | 2023-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods for sample preparation and analysis |
EP4180534A1 (en) | 2017-11-02 | 2023-05-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Transposase-based genomic analysis |
SG11201913654QA (en) | 2017-11-15 | 2020-01-30 | 10X Genomics Inc | Functionalized gel beads |
US10829815B2 (en) | 2017-11-17 | 2020-11-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles |
WO2019103967A1 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating cancer |
AU2018375160A1 (en) | 2017-11-29 | 2020-05-28 | Xgenomes Corp. | Sequencing of nucleic acids by emergence |
US11427867B2 (en) | 2017-11-29 | 2022-08-30 | Xgenomes Corp. | Sequencing by emergence |
US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
WO2019108851A1 (en) | 2017-11-30 | 2019-06-06 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis |
WO2019136058A1 (en) | 2018-01-02 | 2019-07-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Multi-droplet capture |
EP3735459A4 (en) | 2018-01-04 | 2021-10-06 | Twist Bioscience Corporation | DNA-BASED DIGITAL INFORMATION STORAGE |
WO2019140146A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Life Technologies Corporation | Methods for flow space quality score prediction by neural networks |
EP4324962A2 (en) | 2018-01-31 | 2024-02-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes |
CA3090102A1 (en) | 2018-01-31 | 2019-08-08 | Dovetail Genomics, Llc | Sample prep for dna linkage recovery |
WO2019157529A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations |
CN110184325A (zh) * | 2018-02-22 | 2019-08-30 | 张家港万众一芯生物科技有限公司 | 基于微孔阵列芯片的单分子文库pcr扩增的基因测序方法 |
US11639928B2 (en) | 2018-02-22 | 2023-05-02 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations |
JP2021518165A (ja) * | 2018-03-13 | 2021-08-02 | イノベージョン ラボ,インコーポレイテッド | 単一分子シーケンシングの方法 |
AU2019247652A1 (en) | 2018-04-02 | 2020-10-15 | Enumera Molecular, Inc. | Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules |
SG11202009889VA (en) | 2018-04-06 | 2020-11-27 | 10X Genomics Inc | Systems and methods for quality control in single cell processing |
EP3553182A1 (en) | 2018-04-11 | 2019-10-16 | Université de Bourgogne | Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection |
AU2019255987A1 (en) | 2018-04-19 | 2020-12-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods |
WO2019209426A1 (en) | 2018-04-26 | 2019-10-31 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes |
US20210239700A1 (en) | 2018-05-04 | 2021-08-05 | Abbott Laboratories | Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products |
CN108588200A (zh) * | 2018-05-06 | 2018-09-28 | 湖南大地同年生物科技有限公司 | 一种R-Loop高通量测序文库构建方法 |
CA3100739A1 (en) | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Twist Bioscience Corporation | Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization |
US10801064B2 (en) | 2018-05-31 | 2020-10-13 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
US11814750B2 (en) | 2018-05-31 | 2023-11-14 | Personalis, Inc. | Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples |
US11180794B2 (en) * | 2018-05-31 | 2021-11-23 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for capping nucleic acids |
US11339428B2 (en) | 2018-05-31 | 2022-05-24 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Increased signal to noise in nucleic acid sequencing |
US11932899B2 (en) | 2018-06-07 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules |
US11703427B2 (en) | 2018-06-25 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for cell and bead processing |
US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
WO2020023362A1 (en) | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Omniome, Inc. | Serial formation of ternary complex species |
US20200032335A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for metabolome analysis |
WO2020028194A1 (en) | 2018-07-30 | 2020-02-06 | Readcoor, Inc. | Methods and systems for sample processing or analysis |
EP4177356A1 (en) | 2018-08-08 | 2023-05-10 | PML Screening, LLC | Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test |
EP4249651A3 (en) | 2018-08-20 | 2023-10-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions |
US11519033B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-12-06 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
EP3856753A4 (en) | 2018-09-28 | 2022-11-16 | Centrillion Technology Holdings Corporation | DISULFIDE CROSSLINKED REVERSIBLE TERMINATORS |
JP2022503873A (ja) | 2018-10-25 | 2022-01-12 | イルミナ インコーポレイテッド | インデックス及びバーコードを使用してアレイ上のリガンドを識別するための方法及び組成物 |
WO2020101795A1 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Omniome, Inc. | Electronic detection of nucleic acid structure |
EP3887545A4 (en) * | 2018-11-29 | 2022-08-24 | XGenomes Corp. | COALESCENCE SEQUENCING |
US10710076B2 (en) | 2018-12-04 | 2020-07-14 | Omniome, Inc. | Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays |
US20220162667A1 (en) | 2018-12-07 | 2022-05-26 | Octant, Inc. | Systems for protein-protein interaction screening |
US11459607B1 (en) | 2018-12-10 | 2022-10-04 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes |
EP3894593A2 (en) | 2018-12-13 | 2021-10-20 | DNA Script | Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules |
US20200208214A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-07-02 | Illumina, Inc. | Methods for improving polynucleotide cluster clonality |
CN113227348A (zh) | 2018-12-20 | 2021-08-06 | 欧姆尼欧美公司 | 用于分析核酸和其他分析物的温度控制 |
CN111378557B (zh) | 2018-12-26 | 2023-06-06 | 财团法人工业技术研究院 | 用于产生液珠的管状结构及液珠产生方法 |
CN109738469A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-10 | 赛纳生物科技(北京)有限公司 | 一种fop表面微坑镀膜的致密性检测方法 |
WO2020142768A1 (en) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Northwestern University | Storing temporal data into dna |
US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
US11845983B1 (en) | 2019-01-09 | 2023-12-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for multiplexing of droplet based assays |
WO2020146740A1 (en) | 2019-01-10 | 2020-07-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence |
MX2021009482A (es) * | 2019-02-11 | 2021-11-12 | Ultima Genomics Inc | Metodos para el analisis de acidos nucleicos. |
US11851683B1 (en) | 2019-02-12 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for selective analysis of cellular samples |
EP3924505A1 (en) | 2019-02-12 | 2021-12-22 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
US11467153B2 (en) | 2019-02-12 | 2022-10-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods for processing nucleic acid molecules |
US11499189B2 (en) | 2019-02-14 | 2022-11-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes |
US11680950B2 (en) | 2019-02-20 | 2023-06-20 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes |
US11655499B1 (en) | 2019-02-25 | 2023-05-23 | 10X Genomics, Inc. | Detection of sequence elements in nucleic acid molecules |
KR20210144698A (ko) | 2019-02-26 | 2021-11-30 | 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 | 항체 최적화를 위한 변이 핵산 라이브러리 |
EP3930753A4 (en) | 2019-02-26 | 2023-03-29 | Twist Bioscience Corporation | NUCLEIC ACID VARIANT BANKS FOR THE GLP1 RECEPTOR |
EP3938537A1 (en) | 2019-03-11 | 2022-01-19 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for processing optically tagged beads |
EP3937780A4 (en) | 2019-03-14 | 2022-12-07 | InSilixa, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION |
NL2023314B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based quality scoring |
US11210554B2 (en) | 2019-03-21 | 2021-12-28 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
NL2023311B9 (en) | 2019-03-21 | 2021-03-12 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
NL2023312B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based base calling |
WO2020205296A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-10-08 | Illumina, Inc. | Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata |
NL2023316B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Artificial intelligence-based sequencing |
NL2023310B1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-28 | Illumina Inc | Training data generation for artificial intelligence-based sequencing |
EP3947718A4 (en) | 2019-04-02 | 2022-12-21 | Enumera Molecular, Inc. | METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR COUNTING NUCLEIC ACID MOLECULES |
US20220179891A1 (en) * | 2019-04-09 | 2022-06-09 | University Of Washington | Systems and methods for providing similarity-based retrieval of information stored in dna |
CN109853047A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-07 | 翌圣生物科技(上海)有限公司 | 一种基因组dna测序文库快速构建方法及配套试剂盒 |
KR20220004947A (ko) | 2019-04-29 | 2022-01-12 | 일루미나, 인코포레이티드 | 신속한 인큐베이션 및 핵산 풍부화에 의한 미생물 샘플의 확인 및 분석 |
WO2020227382A1 (en) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | Qiagen Sciences, Llc | Sequential sequencing methods and compositions |
US11593649B2 (en) | 2019-05-16 | 2023-02-28 | Illumina, Inc. | Base calling using convolutions |
WO2020237222A1 (en) | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Mission Bio, Inc. | Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of dna, rna and protein |
KR20220015443A (ko) | 2019-05-28 | 2022-02-08 | 옥탄트, 인크. | 전사 릴레이 시스템 |
WO2020252186A1 (en) | 2019-06-11 | 2020-12-17 | Omniome, Inc. | Calibrated focus sensing |
CN114729342A (zh) | 2019-06-21 | 2022-07-08 | 特韦斯特生物科学公司 | 基于条形码的核酸序列装配 |
WO2021003255A1 (en) | 2019-07-01 | 2021-01-07 | Mission Bio | Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments |
US11377655B2 (en) | 2019-07-16 | 2022-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Synthetic nucleic acids having non-natural structures |
US10656368B1 (en) | 2019-07-24 | 2020-05-19 | Omniome, Inc. | Method and system for biological imaging using a wide field objective lens |
CN110499361B (zh) * | 2019-07-31 | 2022-11-25 | 齐鲁工业大学 | 一种末端碱基流式荧光测序微球的制备方法及应用 |
JP2022544626A (ja) | 2019-08-19 | 2022-10-19 | グリーン クロス ゲノム コーポレーション | 核酸断片間距離情報を用いた染色体異常検出方法 |
TW202124406A (zh) | 2019-09-10 | 2021-07-01 | 美商歐姆尼歐美公司 | 核苷酸之可逆修飾 |
SG11202113372WA (en) | 2019-09-20 | 2021-12-30 | Illumina Inc | Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes |
AU2020361681A1 (en) | 2019-10-10 | 2022-05-05 | 1859, Inc. | Methods and systems for microfluidic screening |
EP4045683A1 (en) * | 2019-10-18 | 2022-08-24 | Omniome, Inc. | Methods and compositions for capping nucleic acids |
MX2022004501A (es) | 2019-11-07 | 2022-05-06 | Oncxerna Therapeutics Inc | Clasificacion de microambientes tumorales. |
WO2021091611A1 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
EP4025711A2 (en) | 2019-11-08 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
CN110951852B (zh) * | 2019-11-25 | 2022-11-25 | 齐鲁工业大学 | 单碱基连续延伸流式靶向测序法 |
US20230028790A1 (en) | 2019-11-29 | 2023-01-26 | GC Genome Corporation | Artificial intelligence-based chromosomal abnormality detection method |
SG11202106899SA (en) | 2019-12-23 | 2021-09-29 | 10X Genomics Inc | Methods for spatial analysis using rna-templated ligation |
AU2021208466A1 (en) | 2020-01-13 | 2022-08-11 | Fluent Biosciences Inc. | Single cell sequencing |
US11827936B2 (en) | 2020-01-13 | 2023-11-28 | Fluent Biosciences Inc. | Methods and systems for single cell gene profiling |
CA3167729A1 (en) | 2020-01-13 | 2021-07-22 | Fluent Biosciences Inc. | Emulsion based drug screening |
US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
US11821035B1 (en) | 2020-01-29 | 2023-11-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods of making gene expression libraries |
WO2021152586A1 (en) | 2020-01-30 | 2021-08-05 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state |
US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
US20230054204A1 (en) | 2020-02-04 | 2023-02-23 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Flow cells and methods for their manufacture and use |
US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
US11835462B2 (en) | 2020-02-11 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for partitioning a biological sample |
WO2021163637A1 (en) | 2020-02-13 | 2021-08-19 | Zymergen Inc. | Metagenomic library and natural product discovery platform |
US20210265018A1 (en) | 2020-02-20 | 2021-08-26 | Illumina, Inc. | Knowledge Distillation and Gradient Pruning-Based Compression of Artificial Intelligence-Based Base Caller |
US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
US11926863B1 (en) | 2020-02-27 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells |
US11768175B1 (en) | 2020-03-04 | 2023-09-26 | 10X Genomics, Inc. | Electrophoretic methods for spatial analysis |
CA3175931A1 (en) | 2020-03-16 | 2021-09-23 | Fluent Biosciences Inc. | Multi-omic analysis in monodisperse droplets |
CN111455469B (zh) * | 2020-04-07 | 2023-08-18 | 深圳易倍科华生物科技有限公司 | 一种单链快速建库方法及建库仪器 |
WO2021214766A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto |
WO2021216708A1 (en) | 2020-04-22 | 2021-10-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted rna depletion |
US11188778B1 (en) | 2020-05-05 | 2021-11-30 | Illumina, Inc. | Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator |
US20230203592A1 (en) | 2020-05-05 | 2023-06-29 | Akershus Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing bowel cancer |
US20230183798A1 (en) | 2020-05-05 | 2023-06-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes |
US11851700B1 (en) | 2020-05-13 | 2023-12-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules |
US10941453B1 (en) | 2020-05-20 | 2021-03-09 | Paragon Genomics, Inc. | High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens |
EP4153775A1 (en) | 2020-05-22 | 2023-03-29 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
WO2021237087A1 (en) | 2020-05-22 | 2021-11-25 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
WO2021242834A1 (en) | 2020-05-26 | 2021-12-02 | 10X Genomics, Inc. | Method for resetting an array |
EP4158067A1 (en) | 2020-05-27 | 2023-04-05 | Genetic Technologies Limited | Methods of assessing risk of developing a severe response to coronavirus infection |
EP4025692A2 (en) | 2020-06-02 | 2022-07-13 | 10X Genomics, Inc. | Nucleic acid library methods |
WO2021247568A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | 10X Genomics, Inc. | Spatial trancriptomics for antigen-receptors |
EP4162074B1 (en) | 2020-06-08 | 2024-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
EP4165207A1 (en) | 2020-06-10 | 2023-04-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for determining a location of an analyte in a biological sample |
CN116034166A (zh) | 2020-06-25 | 2023-04-28 | 10X基因组学有限公司 | Dna甲基化的空间分析 |
US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
JP2023533271A (ja) | 2020-07-08 | 2023-08-02 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 次世代シーケンシングライブラリーの標的捕捉中の、ポイズンプライマーを使用した非標的ライブラリー分子の標的化された枯渇 |
US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
WO2022098736A1 (en) * | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Fluent Biosciences Inc. | Methods and systems for detecting pathogenic microbes in a patient |
US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
KR20220074088A (ko) | 2020-11-27 | 2022-06-03 | 주식회사 지씨지놈 | 인공지능 기반 암 진단 및 암 종 예측방법 |
AU2021409136A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
CA3204784A1 (en) | 2021-01-13 | 2022-07-21 | Alex Nemiroski | Surface structuring with colloidal assembly |
WO2022174054A1 (en) | 2021-02-13 | 2022-08-18 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof |
AU2022227563A1 (en) | 2021-02-23 | 2023-08-24 | 10X Genomics, Inc. | Probe-based analysis of nucleic acids and proteins |
WO2022198068A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-22 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
CA3210451A1 (en) | 2021-03-22 | 2022-09-29 | Illumina Cambridge Limited | Methods for improving nucleic acid cluster clonality |
WO2022208171A1 (en) | 2021-03-31 | 2022-10-06 | UCL Business Ltd. | Methods for analyte detection |
US20220336052A1 (en) * | 2021-04-19 | 2022-10-20 | University Of Utah Research Foundation | Systems and methods for facilitating rapid genome sequence analysis |
KR20220160806A (ko) | 2021-05-28 | 2022-12-06 | 주식회사 지씨지놈 | 세포유리 핵산단편 말단 서열 모티프 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법 |
EP4355476A1 (en) | 2021-06-15 | 2024-04-24 | Illumina, Inc. | Hydrogel-free surface functionalization for sequencing |
US11859241B2 (en) | 2021-06-17 | 2024-01-02 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
US11427855B1 (en) | 2021-06-17 | 2022-08-30 | Element Biosciences, Inc. | Compositions and methods for pairwise sequencing |
CN113174388B (zh) * | 2021-06-28 | 2021-09-10 | 中国农业大学 | 一种功能核酸纳米杆与功能核酸纳米花的制备及形貌转换方法 |
US11455487B1 (en) | 2021-10-26 | 2022-09-27 | Illumina Software, Inc. | Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling |
KR20240031968A (ko) | 2021-07-19 | 2024-03-08 | 일루미나, 인코포레이티드 | 염기 호출에 대한 보간 및 적응을 갖는 강도 추출 |
GB202110479D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
GB202110485D0 (en) | 2021-07-21 | 2021-09-01 | Dnae Diagnostics Ltd | Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides |
WO2023002203A1 (en) | 2021-07-21 | 2023-01-26 | Dnae Diagnostics Limited | Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides |
US20230116852A1 (en) | 2021-07-23 | 2023-04-13 | Illumina, Inc. | Methods for preparing substrate surface for dna sequencing |
WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
WO2023049212A2 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Illumina, Inc. | State-based base calling |
WO2023069927A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Illumina, Inc. | Methods for capturing library dna for sequencing |
WO2023081300A2 (en) * | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Abbott Laboratories | Systems and methods for sample analysis |
US20230348957A1 (en) | 2021-12-07 | 2023-11-02 | Luminex Corporation | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
WO2023114190A1 (en) * | 2021-12-13 | 2023-06-22 | Cz Biohub Sf, Inc. | Single-cell epigenomic profiling using fluidics and hydrogels |
WO2023122363A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Illumina Software, Inc. | Dynamic graphical status summaries for nucelotide sequencing |
US20230215515A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-07-06 | Illumina Software, Inc. | Facilitating secure execution of external workflows for genomic sequencing diagnostics |
WO2023129764A1 (en) | 2021-12-29 | 2023-07-06 | Illumina Software, Inc. | Automatically switching variant analysis model versions for genomic analysis applications |
WO2023135485A1 (en) | 2022-01-13 | 2023-07-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Prostate cancer markers and uses thereof |
WO2023141154A1 (en) | 2022-01-20 | 2023-07-27 | Illumina Cambridge Limited | Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing |
WO2023152568A2 (en) | 2022-02-10 | 2023-08-17 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for characterizing lung cancer |
EP4341425A2 (en) * | 2022-03-15 | 2024-03-27 | Illumina, Inc. | Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on concatenated polynucleotides for methylation detection |
US20230343414A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-10-26 | Illumina, Inc. | Sequence-to-sequence base calling |
CN114592023B (zh) * | 2022-03-31 | 2023-03-24 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 一种细胞裂解自组装多肽复合物、自组装方法、自组装多肽制剂及应用 |
EP4253550A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-04 | GenCC GmbH 6 Co. KG | Method for the manufacture of a viral system, a vector system or any transport system for cancer-specific crispr complexes |
US11680293B1 (en) | 2022-04-21 | 2023-06-20 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules |
US20230392201A1 (en) | 2022-06-06 | 2023-12-07 | Element Biosciences, Inc. | Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations |
US20230407386A1 (en) | 2022-06-09 | 2023-12-21 | Illumina, Inc. | Dependence of base calling on flow cell tilt |
WO2024050450A1 (en) | 2022-08-31 | 2024-03-07 | Gigamune, Inc. | Engineered enveloped vectors and methods of use thereof |
WO2024072614A1 (en) | 2022-09-27 | 2024-04-04 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Polypeptide capture, in situ fragmentation and identification |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06510668A (ja) * | 1991-09-24 | 1994-12-01 | ケイヘーネ・エヌ・ベー | 選択的な制限断片増幅:一般的なdnaフィンガプリント法 |
Family Cites Families (234)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4175054A (en) | 1976-11-11 | 1979-11-20 | Petrolite Corporation | Use of hydrocarbon polymers in demulsification |
US5171534A (en) | 1984-01-16 | 1992-12-15 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
US5821058A (en) | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4801529A (en) * | 1985-06-18 | 1989-01-31 | Brandeis University | Methods for isolating mutant microoganisms using microcapsules coated with indicator material |
US4863849A (en) | 1985-07-18 | 1989-09-05 | New York Medical College | Automatable process for sequencing nucleotide |
US4811218A (en) | 1986-06-02 | 1989-03-07 | Applied Biosystems, Inc. | Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing |
US5252494A (en) | 1986-06-25 | 1993-10-12 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix |
US5143853A (en) | 1986-06-25 | 1992-09-01 | Trustees Of Tufts College | Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors |
US4822746A (en) | 1986-06-25 | 1989-04-18 | Trustees Of Tufts College | Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors |
US5254477A (en) | 1986-06-25 | 1993-10-19 | Trustees Of Tufts College | Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods |
US4994372A (en) * | 1987-01-14 | 1991-02-19 | President And Fellows Of Harvard College | DNA sequencing |
US5525464A (en) | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
AU624601B2 (en) | 1988-01-21 | 1992-06-18 | Genentech Inc. | Amplification and detection of nucleic acid sequences |
CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
GB8810400D0 (en) | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
SE8801070D0 (sv) | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
US4971903A (en) | 1988-03-25 | 1990-11-20 | Edward Hyman | Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids |
AU3556789A (en) | 1988-04-22 | 1989-11-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for forming and using microdroplets |
US5225332A (en) | 1988-04-22 | 1993-07-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for manipulation of non-aqueous surrounded microdroplets |
US5700637A (en) | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
US6054270A (en) | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
GB8822228D0 (en) | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Southern E M | Support-bound oligonucleotides |
US5512439A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US4938876A (en) | 1989-03-02 | 1990-07-03 | Ohsol Ernest O | Method for separating oil and water emulsions |
US5629158A (en) * | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
JPH02299598A (ja) † | 1989-04-14 | 1990-12-11 | Ro Inst For Molecular Genetics & Geneteic Res | 微視的サイズの別個の粒子と結合している核酸試料中のごく短い配列の全部または一部のオリゴヌクレチドプローブとのハイブリダイゼーションによる決定法 |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
US5871928A (en) | 1989-06-07 | 1999-02-16 | Fodor; Stephen P. A. | Methods for nucleic acid analysis |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5302509A (en) * | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
US5545522A (en) | 1989-09-22 | 1996-08-13 | Van Gelder; Russell N. | Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex |
KR0185192B1 (ko) | 1989-10-05 | 1999-04-01 | 제임스 더블유. 데이비 | 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리 |
AU653712B2 (en) * | 1990-02-16 | 1994-10-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improvements in the specificity and convenience of the polymerase chain reaction |
CA2036946C (en) * | 1990-04-06 | 2001-10-16 | Kenneth V. Deugau | Indexing linkers |
JPH04223A (ja) * | 1990-04-16 | 1992-01-06 | Toshiba Corp | 無線電話装置、その充電方法および無線電話充電システム |
US5506100A (en) | 1990-10-11 | 1996-04-09 | Indiana University Foundation | Process and apparatus for fragmenting biomaterials |
WO1992007091A1 (en) * | 1990-10-11 | 1992-04-30 | Indiana University Foundation | Process and apparatus for fragmenting biomaterials |
US5320814A (en) | 1991-01-25 | 1994-06-14 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample |
US5250264A (en) | 1991-01-25 | 1993-10-05 | Trustees Of Tufts College | Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample |
US5244636A (en) | 1991-01-25 | 1993-09-14 | Trustees Of Tufts College | Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample |
US5114984A (en) | 1991-04-26 | 1992-05-19 | Olin Corporation | Process for producing an antimicrobially effective polyurethane |
EP0597960B1 (en) † | 1991-08-10 | 1999-01-20 | Medical Research Council | Treatment of cell populations |
US5474796A (en) | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
WO1993005183A1 (en) * | 1991-09-09 | 1993-03-18 | Baylor College Of Medicine | Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme |
US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
DE69233331T3 (de) | 1991-11-22 | 2007-08-30 | Affymetrix, Inc., Santa Clara | Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese |
US5445971A (en) | 1992-03-20 | 1995-08-29 | Abbott Laboratories | Magnetically assisted binding assays using magnetically labeled binding members |
GB9208733D0 (en) | 1992-04-22 | 1992-06-10 | Medical Res Council | Dna sequencing method |
GB9210176D0 (en) | 1992-05-12 | 1992-06-24 | Cemu Bioteknik Ab | Chemical method |
DE4223169C1 (de) | 1992-07-10 | 1993-11-25 | Ferring Arzneimittel Gmbh | Verfahren zur Mikroverkapselung wasserlöslicher Wirkstoffe |
GB9214873D0 (en) * | 1992-07-13 | 1992-08-26 | Medical Res Council | Process for categorising nucleotide sequence populations |
US6114114A (en) | 1992-07-17 | 2000-09-05 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Comparative gene transcript analysis |
RU2048522C1 (ru) | 1992-10-14 | 1995-11-20 | Институт белка РАН | Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления |
US5436143A (en) * | 1992-12-23 | 1995-07-25 | Hyman; Edward D. | Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides |
IL104384A (en) | 1993-01-13 | 1996-11-14 | Yeda Res & Dev | Method for screening catalytic non-enzyme polypeptides and proteins |
US5298741A (en) | 1993-01-13 | 1994-03-29 | Trustees Of Tufts College | Thin film fiber optic sensor array and apparatus for concurrent viewing and chemical sensing of a sample |
EP0682671A4 (en) | 1993-02-01 | 1998-01-14 | Seq Ltd | METHOD AND DEVICES FOR SEQUENCING DNA. |
US5436149A (en) | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
US5714320A (en) | 1993-04-15 | 1998-02-03 | University Of Rochester | Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides |
WO1994024314A1 (en) | 1993-04-19 | 1994-10-27 | Kauffman Stuart A | Random chemistry for the generation of new compounds |
NZ265818A (en) | 1993-04-19 | 1997-09-22 | Medisorb Technologies Internat | Compositions of nucleic acids encapsulated with molecules that facilitate uptake and integration into living cells |
GB9315847D0 (en) | 1993-07-30 | 1993-09-15 | Isis Innovation | Tag reagent and assay method |
US5482845A (en) | 1993-09-24 | 1996-01-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for construction of normalized cDNA libraries |
JP3488465B2 (ja) * | 1993-10-28 | 2004-01-19 | ヒューストン・アドバンスド・リサーチ・センター | 結合反応を別々に検出する微細加工フロースルー多孔性装置 |
US5429807A (en) | 1993-10-28 | 1995-07-04 | Beckman Instruments, Inc. | Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface |
WO1995011922A1 (en) | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
GB9401833D0 (en) | 1994-02-01 | 1994-03-30 | Isis Innovation | Method for discovering ligands |
US5928905A (en) | 1995-04-18 | 1999-07-27 | Glaxo Group Limited | End-complementary polymerase reaction |
US5834252A (en) | 1995-04-18 | 1998-11-10 | Glaxo Group Limited | End-complementary polymerase reaction |
AU710504B2 (en) * | 1994-03-15 | 1999-09-23 | Brown University Research Foundation | Polymeric gene delivery system |
AU2187295A (en) * | 1994-03-18 | 1995-10-09 | General Hospital Corporation, The | Cleaved amplified rflp detection methods |
JP2556293B2 (ja) | 1994-06-09 | 1996-11-20 | 日本電気株式会社 | Mos ota |
US5512490A (en) | 1994-08-11 | 1996-04-30 | Trustees Of Tufts College | Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns |
US5695934A (en) * | 1994-10-13 | 1997-12-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides |
US6013445A (en) | 1996-06-06 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
US5604097A (en) * | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
US5795716A (en) | 1994-10-21 | 1998-08-18 | Chee; Mark S. | Computer-aided visualization and analysis system for sequence evaluation |
FR2726286B1 (fr) | 1994-10-28 | 1997-01-17 | Genset Sa | Procede d'amplification d'acides nucleiques en phase solide et trousse de reactifs utile pour la mise en oeuvre de ce procede |
US5919673A (en) | 1995-03-22 | 1999-07-06 | The Scripps Research Institute | One-pot enzymatic sulfation process using 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate and recycled phosphorylated adenosine intermediates |
EP0735144B1 (en) * | 1995-03-28 | 2002-06-05 | Japan Science and Technology Corporation | Method for molecular indexing of genes using restriction enzymes |
GB9507238D0 (en) | 1995-04-07 | 1995-05-31 | Isis Innovation | Detecting dna sequence variations |
US5750341A (en) | 1995-04-17 | 1998-05-12 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions |
KR20040041639A (ko) | 1995-04-24 | 2004-05-17 | 크로막솜 코포레이티드 | 새로운 대사 경로를 만들고 이를 스크리닝하는 방법 |
US5648245A (en) | 1995-05-09 | 1997-07-15 | Carnegie Institution Of Washington | Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication |
DE19518505A1 (de) * | 1995-05-19 | 1996-11-21 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Genexpressionsanalyse |
US5690894A (en) | 1995-05-23 | 1997-11-25 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
US5910408A (en) | 1995-06-07 | 1999-06-08 | The General Hospital Corporation | Catalytic DNA having ligase activity |
US5814444A (en) * | 1995-06-07 | 1998-09-29 | University Of Washington | Methods for making and using single-chromosome amplfication libraries |
DE69614768T2 (de) | 1995-06-14 | 2002-06-20 | Tonen Corp | Emulsionsspaltung durch Mikroorganismen |
US5728529A (en) | 1995-06-23 | 1998-03-17 | Baylor College Of Medicine | Alternative dye-labeled ribonucleotides, deoxyribonucleotides, and dideoxyribonucleotides for automated DNA analysis |
US6200737B1 (en) | 1995-08-24 | 2001-03-13 | Trustees Of Tufts College | Photodeposition method for fabricating a three-dimensional, patterned polymer microstructure |
US5843655A (en) | 1995-09-18 | 1998-12-01 | Affymetrix, Inc. | Methods for testing oligonucleotide arrays |
US5871697A (en) | 1995-10-24 | 1999-02-16 | Curagen Corporation | Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing |
DE19646372C1 (de) | 1995-11-11 | 1997-06-19 | Evotec Biosystems Gmbh | Genotyp und Phänotyp koppelnde Verbindung |
US5780231A (en) | 1995-11-17 | 1998-07-14 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA extension and analysis with rolling primers |
US5962228A (en) | 1995-11-17 | 1999-10-05 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA extension and analysis with rolling primers |
US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
US6143495A (en) | 1995-11-21 | 2000-11-07 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
US5633972A (en) | 1995-11-29 | 1997-05-27 | Trustees Of Tufts College | Superresolution imaging fiber for subwavelength light energy generation and near-field optical microscopy |
US5814524A (en) | 1995-12-14 | 1998-09-29 | Trustees Of Tufts College | Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations |
US5851772A (en) | 1996-01-29 | 1998-12-22 | University Of Chicago | Microchip method for the enrichment of specific DNA sequences |
WO1997029211A1 (en) * | 1996-02-09 | 1997-08-14 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | RESTRICTION DISPLAY (RD-PCR) OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED mRNAs |
AU2069597A (en) | 1996-03-04 | 1997-09-22 | Genetrace Systems, Inc. | Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry |
GB9608540D0 (en) | 1996-04-25 | 1996-07-03 | Medical Res Council | Isolation of enzymes |
US5770637A (en) * | 1996-05-01 | 1998-06-23 | Johnson & Johnson Vision Products, Inc. | Anti-bacterial, UV absorbable, tinted, metal-chelating polymers |
US6022688A (en) * | 1996-05-13 | 2000-02-08 | Sequenom, Inc. | Method for dissociating biotin complexes |
US5846727A (en) | 1996-06-06 | 1998-12-08 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural & Mechanical College | Microsystem for rapid DNA sequencing |
ATE356221T1 (de) * | 1996-06-06 | 2007-03-15 | Solexa Inc | Sequenzierung durch ligation kodierter adapter |
US6083693A (en) | 1996-06-14 | 2000-07-04 | Curagen Corporation | Identification and comparison of protein-protein interactions that occur in populations |
US5916524A (en) | 1997-07-23 | 1999-06-29 | Bio-Dot, Inc. | Dispensing apparatus having improved dynamic range |
US5846721A (en) | 1996-09-19 | 1998-12-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Efficient and simpler method to construct normalized cDNA libraries with improved representations of full-length cDNAs |
EP0915976A2 (en) | 1996-09-27 | 1999-05-19 | Icos Corporation | Method to identify compounds for disrupting protein/protein interactions |
GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
US6124092A (en) | 1996-10-04 | 2000-09-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Multiplex polynucleotide capture methods and compositions |
US6133436A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
US5900481A (en) | 1996-11-06 | 1999-05-04 | Sequenom, Inc. | Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports |
US6887665B2 (en) | 1996-11-14 | 2005-05-03 | Affymetrix, Inc. | Methods of array synthesis |
DE19648372A1 (de) | 1996-11-22 | 1998-05-28 | Serck Como Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zum Eindampfen von Abwässern |
WO1998023733A2 (en) | 1996-11-27 | 1998-06-04 | University Of Washington | Thermostable polymerases having altered fidelity |
US6310354B1 (en) * | 1996-12-03 | 2001-10-30 | Erkki Soini | Method and a device for monitoring nucleic acid amplification reactions |
US20020172965A1 (en) * | 1996-12-13 | 2002-11-21 | Arcaris, Inc. | Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom |
US6060245A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Stratagene | Methods and adaptors for generating specific nucleic acid populations |
GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
ES2373110T3 (es) | 1997-01-21 | 2012-01-31 | The General Hospital Corporation | Selección de proteínas usando fusiones de arn-proteína. |
WO1998033939A1 (fr) | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Hitachi, Ltd. | Procede pour determiner une sequence de base d'acide nucleique et appareil correspondant |
CA2196496A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-07-31 | Stephen William Watson Michnick | Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions |
DE69825601T2 (de) | 1997-02-12 | 2005-04-28 | Chan, Eugene Y, Brookline | Verfahren zur analyse von polymeren |
GB9703369D0 (en) | 1997-02-18 | 1997-04-09 | Lindqvist Bjorn H | Process |
US5994068A (en) * | 1997-03-11 | 1999-11-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Nucleic acid indexing |
US6023540A (en) * | 1997-03-14 | 2000-02-08 | Trustees Of Tufts College | Fiber optic sensor with encoded microspheres |
CA2284066A1 (en) | 1997-03-18 | 1998-09-24 | Chromaxome Corporation | Methods for screening compounds using encapsulated cells |
US5891477A (en) * | 1997-03-28 | 1999-04-06 | Biohybrid Technologies, Inc. | Non-steroidal anti-inflammatory agents inhibition of fibrotic response to an implanted device |
ES2563643T3 (es) * | 1997-04-01 | 2016-03-15 | Illumina Cambridge Limited | Método de secuenciación de ácido nucleico |
AU6846798A (en) * | 1997-04-01 | 1998-10-22 | Glaxo Group Limited | Method of nucleic acid sequencing |
US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
US6406845B1 (en) | 1997-05-05 | 2002-06-18 | Trustees Of Tuft College | Fiber optic biosensor for selectively detecting oligonucleotide species in a mixed fluid sample |
ES2163271T3 (es) * | 1997-05-13 | 2002-01-16 | Azign Bioscience As | Procedimiento para clonar arnm y visualizar transcriptores diferencialmente expresados (dodets). |
EP1908832B1 (en) | 1997-07-07 | 2012-12-26 | Medical Research Council | A method for increasing the concentration of a nucleic acid molecule |
JP3610231B2 (ja) * | 1997-08-01 | 2005-01-12 | キヤノン株式会社 | 反応場アレー、反応場アレーの製造方法、反応場アレーを用いた反応方法及び反応場アレーを用いた試料溶液中の物質の定量方法 |
EP0895083B1 (en) | 1997-08-01 | 2009-09-23 | Canon Kabushiki Kaisha | Reaction site array, preparation of it, reaction process using it and quantitative determination method of substance in sample solution using it |
US5961228A (en) * | 1997-08-22 | 1999-10-05 | Paxar Corporation | Modular printer |
US20010006630A1 (en) | 1997-09-02 | 2001-07-05 | Oron Yacoby-Zeevi | Introducing a biological material into a patient |
US6087099A (en) * | 1997-09-08 | 2000-07-11 | Myriad Genetics, Inc. | Method for sequencing both strands of a double stranded DNA in a single sequencing reaction |
US6475722B1 (en) | 1997-12-03 | 2002-11-05 | Curagen Corporation | Surface treatments for DNA processing devices |
NL1007781C2 (nl) | 1997-12-12 | 1999-06-15 | Packard Instr Bv | Microtiterplaat. |
DE69822206T2 (de) | 1997-12-19 | 2005-02-17 | Affymetrix, Inc., Santa Clara | Erkenntnisse der genomforschung für die suche nach neuartigen wirkstoffen |
EP1042497B1 (en) | 1997-12-22 | 2008-07-16 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Direct rt-pcr on oligonucleotide-immobilized pcr microplates |
KR100280219B1 (ko) * | 1998-02-26 | 2001-04-02 | 이수빈 | 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약 |
US5882874A (en) | 1998-02-27 | 1999-03-16 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Reciprocal subtraction differential display |
US6210910B1 (en) | 1998-03-02 | 2001-04-03 | Trustees Of Tufts College | Optical fiber biosensor array comprising cell populations confined to microcavities |
US6378527B1 (en) | 1998-04-08 | 2002-04-30 | Chondros, Inc. | Cell-culture and polymer constructs |
WO1999055886A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Genova Pharmaceuticals Corporation | Function-based gene discovery |
JP2981547B1 (ja) * | 1998-07-02 | 1999-11-22 | 農林水産省食品総合研究所長 | クロスフロー型マイクロチャネル装置及び同装置を用いたエマルションの生成または分離方法 |
EP1100889A4 (en) | 1998-07-17 | 2002-03-06 | Mirus Corp | SURFACTANT SOLUTIONS |
US6210896B1 (en) | 1998-08-13 | 2001-04-03 | Us Genomics | Molecular motors |
US6263286B1 (en) | 1998-08-13 | 2001-07-17 | U.S. Genomics, Inc. | Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer |
CA2247545C (en) | 1998-09-15 | 2008-12-30 | Dynal As | Method of isolation of primer extension products with modular oligonucleotides |
US6287825B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-09-11 | Molecular Staging Inc. | Methods for reducing the complexity of DNA sequences |
AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
US6203989B1 (en) | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
AU2595300A (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-31 | City Of Hope | Method for detecting mutations in nucleic acids |
GB9900298D0 (en) * | 1999-01-07 | 1999-02-24 | Medical Res Council | Optical sorting method |
US20020150909A1 (en) * | 1999-02-09 | 2002-10-17 | Stuelpnagel John R. | Automated information processing in randomly ordered arrays |
AU779231B2 (en) * | 1999-02-22 | 2005-01-13 | Lynx Therapeutics, Inc. | Polymorphic DNA fragments and uses thereof |
US6255476B1 (en) | 1999-02-22 | 2001-07-03 | Pe Corporation (Ny) | Methods and compositions for synthesis of labelled oligonucleotides and analogs on solid-supports |
US6225061B1 (en) | 1999-03-10 | 2001-05-01 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment |
DK1159453T3 (da) * | 1999-03-10 | 2008-10-06 | Asm Scient Inc | Fremgangsmåde til direkte nukleinsyresekventering |
EP1196554B1 (en) * | 1999-03-18 | 2009-02-25 | Complete Genomics AS | Methods of cloning and producing fragment chains with readable information content |
US6506594B1 (en) | 1999-03-19 | 2003-01-14 | Cornell Res Foundation Inc | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
GB9907812D0 (en) | 1999-04-06 | 1999-06-02 | Medical Biosystems Ltd | Sequencing |
US6284465B1 (en) * | 1999-04-15 | 2001-09-04 | Agilent Technologies, Inc. | Apparatus, systems and method for locating nucleic acids bound to surfaces |
US6355431B1 (en) * | 1999-04-20 | 2002-03-12 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays |
ATE553219T1 (de) | 1999-04-20 | 2012-04-15 | Illumina Inc | Erkennung von nukleinsäurereaktionen auf bead- arrays |
US20030108867A1 (en) | 1999-04-20 | 2003-06-12 | Chee Mark S | Nucleic acid sequencing using microsphere arrays |
US6221653B1 (en) | 1999-04-27 | 2001-04-24 | Agilent Technologies, Inc. | Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids |
WO2000075373A2 (en) | 1999-05-20 | 2000-12-14 | Illumina, Inc. | Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays |
US20020051971A1 (en) | 1999-05-21 | 2002-05-02 | John R. Stuelpnagel | Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays |
US6300070B1 (en) * | 1999-06-04 | 2001-10-09 | Mosaic Technologies, Inc. | Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids |
US6340589B1 (en) | 1999-07-23 | 2002-01-22 | Mj Research, Inc. | Thin-well microplate and methods of making same |
GB9921155D0 (en) | 1999-09-08 | 1999-11-10 | Medical Res Council | Selection system |
US7244559B2 (en) * | 1999-09-16 | 2007-07-17 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US7211390B2 (en) | 1999-09-16 | 2007-05-01 | 454 Life Sciences Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
US6274320B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
AU2438501A (en) | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy, The | Expression of proteins from amplified, immobilized nucleic acids |
EP1255860A2 (en) * | 1999-12-29 | 2002-11-13 | Mergen Ltd. | Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support |
AU2001229589A1 (en) | 2000-01-20 | 2001-07-31 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Barcoded synthetic lethal screening to identify drug targets |
AU2001238067B2 (en) | 2000-02-07 | 2007-01-25 | Illumina, Inc. | Nucleic acid detection methods using universal priming |
US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
US6714874B1 (en) * | 2000-03-15 | 2004-03-30 | Applera Corporation | Method and system for the assembly of a whole genome using a shot-gun data set |
JP3442338B2 (ja) | 2000-03-17 | 2003-09-02 | 株式会社日立製作所 | Dna分析装置、dna塩基配列決定装置、dna塩基配列決定方法、および反応モジュール |
CN1189159C (zh) * | 2000-05-05 | 2005-02-16 | 欧莱雅 | 含水溶性美容活性组分水性核的微胶囊及含其的组合物 |
US6475736B1 (en) * | 2000-05-23 | 2002-11-05 | Variagenics, Inc. | Methods for genetic analysis of DNA using biased amplification of polymorphic sites |
US6808874B2 (en) | 2000-06-13 | 2004-10-26 | Cyclacel Ltd. | Methods of monitoring enzyme activity |
AU2001284760A1 (en) | 2000-08-09 | 2002-02-18 | Illumina, Inc. | Automated information processing in randomly ordered arrays |
GB0021977D0 (en) | 2000-09-07 | 2000-10-25 | Pyrosequencing Ab | Method of sequencing DNA |
GB0022069D0 (en) * | 2000-09-08 | 2000-10-25 | Pyrosequencing Ab | Method |
GB0022458D0 (en) * | 2000-09-13 | 2000-11-01 | Medical Res Council | Directed evolution method |
WO2002027029A2 (en) * | 2000-09-27 | 2002-04-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Method for determining relative abundance of nucleic acid sequences |
US6632610B2 (en) * | 2000-10-12 | 2003-10-14 | Gensat S.A. | Methods of identification and isolation of polynucleotides containing nucleic acid differences |
US20020172980A1 (en) * | 2000-11-27 | 2002-11-21 | Phan Brigitte Chau | Methods for decreasing non-specific binding of beads in dual bead assays including related optical biodiscs and disc drive systems |
JP2002257070A (ja) | 2001-02-28 | 2002-09-11 | Toyota Industries Corp | 真空ポンプにおける軸封構造 |
US6936264B2 (en) * | 2001-03-05 | 2005-08-30 | The Procter & Gamble Company | Delivery of reactive agents via multiple emulsions for use in shelf stable products |
US6996287B1 (en) | 2001-04-20 | 2006-02-07 | Adobe Systems, Inc. | Method and apparatus for texture cloning |
GB0114854D0 (en) * | 2001-06-18 | 2001-08-08 | Medical Res Council | Selective gene amplification |
GB0114856D0 (en) | 2001-06-18 | 2001-08-08 | Medical Res Council | Selection by avidity capture |
WO2003004690A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | 454$m(3) CORPORATION | Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter |
US20030064400A1 (en) * | 2001-08-24 | 2003-04-03 | Li-Cor, Inc. | Microfluidics system for single molecule DNA sequencing |
US6902921B2 (en) | 2001-10-30 | 2005-06-07 | 454 Corporation | Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase |
US6956114B2 (en) | 2001-10-30 | 2005-10-18 | '454 Corporation | Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase |
GB0127564D0 (en) | 2001-11-16 | 2002-01-09 | Medical Res Council | Emulsion compositions |
JP2005517900A (ja) | 2001-11-21 | 2005-06-16 | アプレラ コーポレイション | デジタルアッセイ |
US7198897B2 (en) * | 2001-12-19 | 2007-04-03 | Brandeis University | Late-PCR |
DE60301622T2 (de) * | 2002-04-04 | 2006-06-14 | Biotage Ab Uppsala | Auf primer verlängerung basierendes verfahren, das nukleotide verwendet, die über spaltbare linker markiert sind |
CA2510166A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-09-30 | Caliper Life Sciences, Inc. | Single molecule amplification and detection of dna |
CA2509512A1 (en) * | 2003-01-15 | 2004-08-05 | Eugene L. Brown | Novel high throughput method of generating and purifying labeled crna targets for gene expression analysis |
US7575865B2 (en) * | 2003-01-29 | 2009-08-18 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
EP2159285B1 (en) | 2003-01-29 | 2012-09-26 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
US8150627B2 (en) * | 2003-05-15 | 2012-04-03 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific DNA methylation patterns |
EP2532745B1 (en) * | 2003-07-05 | 2015-09-09 | The Johns Hopkins University | Method and Compositions for Detection and Enumeration of Genetic Variations |
ES2432040T3 (es) | 2004-01-28 | 2013-11-29 | 454 Life Sciences Corporation | Amplificación de ácido nucleico con emulsión de flujo continuo |
US7682816B2 (en) | 2005-04-07 | 2010-03-23 | 454 Life Sciences Corporation | Thin film coated microwell arrays and methods of using same |
US7785862B2 (en) | 2005-04-07 | 2010-08-31 | 454 Life Sciences Corporation | Thin film coated microwell arrays |
EP1910537A1 (en) | 2005-06-06 | 2008-04-16 | 454 Life Sciences Corporation | Paired end sequencing |
EP2002367B1 (en) | 2006-02-16 | 2017-03-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for correcting primer extension errors in nucleic acid sequence data |
US8364417B2 (en) | 2007-02-15 | 2013-01-29 | 454 Life Sciences Corporation | System and method to correct out of phase errors in DNA sequencing data by use of a recursive algorithm |
CN101506378A (zh) | 2006-06-19 | 2009-08-12 | 约翰·霍普金斯大学 | 在油包水乳液中的微粒上的单分子pcr |
US7585865B2 (en) | 2006-07-21 | 2009-09-08 | The Penn State Research Foundation | Protein kinase C zeta inhibition to treat vascular permeability |
EP2121984A2 (en) | 2007-03-16 | 2009-11-25 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of hiv drug resistant variants |
EP3404009B1 (en) | 2017-05-16 | 2019-12-25 | Arkema France | Method for manufacturing 1,4-bis(4-phenoxybenzoyl)benzene in supersaturation conditions |
-
2004
- 2004-01-28 EP EP09166658A patent/EP2159285B1/en not_active Expired - Lifetime
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2007
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2008
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2009
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-
2010
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-
2011
- 2011-02-23 US US13/033,240 patent/US8748102B2/en active Active
-
2012
- 2012-03-13 US US13/419,241 patent/US20120238475A1/en not_active Abandoned
- 2012-08-20 JP JP2012181295A patent/JP5495399B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 2012-11-27 JP JP2012258136A patent/JP5726155B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2012-12-26 JP JP2012282220A patent/JP2013090635A/ja active Pending
-
2013
- 2013-09-25 US US14/036,398 patent/US20140162885A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-10-20 US US14/518,700 patent/US20150099672A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-06-23 US US15/190,886 patent/US10240192B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2019
- 2019-01-16 US US16/249,681 patent/US10982274B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06510668A (ja) * | 1991-09-24 | 1994-12-01 | ケイヘーネ・エヌ・ベー | 選択的な制限断片増幅:一般的なdnaフィンガプリント法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6009055192, IEICE TRANS.ELECTRON., 2001, Vol.E84−C,No.12, p.1807−1812 * |
JPN6009055196, Journal of Biotechnology, 1994, Vol.35, p.229−238 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013520202A (ja) * | 2010-02-25 | 2013-06-06 | アドバンスト リキッド ロジック インコーポレイテッド | 核酸ライブラリーの作製方法 |
JP2018508235A (ja) * | 2015-02-17 | 2018-03-29 | コンプリート・ゲノミックス・インコーポレーテッド | 制御された鎖置換を用いてのdna配列決定 |
US11319588B2 (en) | 2015-02-17 | 2022-05-03 | Mgi Tech Co., Ltd. | DNA sequencing using controlled strand displacement |
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