KR100280219B1

KR100280219B1 - 삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약

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Publication number: KR100280219B1
Application number: KR1019980006278A
Authority: KR
Inventors: 진동규
Original assignee: 이수빈; 사회복지법인삼성생명공익재단(삼성서울병원); 박영구; 삼성정밀화학주식회사; 진동규; 윤종용; 삼성전자주식회사
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2001-04-02
Also published as: AU2550699A; KR19990071059A; WO1999043852A1; US6124100A; CA2287878A1; EP0996746A1; CN1256714A; JP2001503281A

Abstract

본 발명은 삼핵산 반복 서열 (trinucleotide repeats sequence)을 이용한 유전성 신경정신 질환의 새로운 진단 방법 및 진단 시약에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 (1) 삼핵산 반복 서열을 포함하는 신경정신 질환 관련 유전자를 기질에 부착하는 단계; (2) 진단 환자의 염색체 상의 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 단계; (3) 유전자 하이브리디제이션을 수행하는 단계; (4) 상기 결과를 비교 검색하는 단계로 구성되는, 역상 점 하이브리디제이션 (reverse dot blot hybridization) 또는 중합효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션 (PCR-MPH) 등을 수행하여 삼핵산 반복 서열의 증가를 확인하는 SCAIII 증후군의 진단 방법 및 이를 간단하게 수행할 수 있는 진단 시약에 관한 것으로서, 상기 진단 시약으로 삼핵산 반복 서열의 증가 정도를 조사하면 신경정신 질환을 효과적으로 진단 및 치료할 수 있다.

Description

삼핵산 반복 서열을 이용한 신경정신 질환의 진단 방법 및 진단 시약

보다 상세하게는, 본 발명은 (1) 삼핵산 반복 서열을 포함하는 신경정신 질환 관련 유전자를 기질에 부착하는 단계; (2) 진단 환자의 염색체 상의 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 단계; (3) 유전자 하이브리디제이션을 수행하는 단계; (4) 상기 결과를 비교 겅색하는 단계로 삼핵산 반복 서열의 증가를 확인하는 신경정신 질환인 SCAIII 증후군의 진단 방법 및 이를 간단하게 수행할 수 있는 진단 시약에 관한 것이다.

신경정신 질환은 그 원인 및 발생 기작이 정확히 밝혀져 있지 않아 진단 및 치료가 매우 어려운 질환 중의 하나이다. 이러한 신경정신 질환을 정확하게 진단하기 위하여 최근 이들 질환과 관련된 유전자를 이용하려는 방법이 시도되고 있다.

삼핵산 반복 서열 (trinucleotide repeats sequence, TNR)은 염색체에 존재하는 삼핵산 단위로 반복되는 염기 서열을 말하는데, 정상인의 경우 게놈 유전자 상에 수십 배수 (copy)의 반복 서열이 존재한다. 그러나 신경정신 질환이 이환된 환자의 경우 삼핵산 반복 서열이 정상인에 비하여 수배에서 수백 배로 증가되는 것이 보고되었다.

실제로 1991년 처음으로 신경정신 질환으로 프레질 X 증후군 (fragile X syndrome) 환자의 게놈 유전자 상에서 3개의 핵산이 연결된 서열 (이하 ‘삼핵산 반복 서열’이라 약칭함)인 (CGG)n 서열이 증가되는 것이 보고되었다. 또한, 1996년 프리드리히 운동실조증 (Friedreich's ataxia)에서 그리고 1997년 SCAVI증후군 및 SCAVII 증후군을 포함하여 13개의 신경정신 질환에서 삼핵산 반복 서열이 질환의 발생과 직접적으로 관련이 있는 것이 보고되었다.

한편 유 등은 프레질 X 증후군 환자의 염색체 Xq 27.3 (FRAXA) 부분을 클로닝하고 이들 환자에서 공통적으로 FRAXA 부분이 불안정하게 늘어나 있는 것을 발견하여 보고하였다 (Yu, S. et al., Science, 252 : 1179-1181, 1991). 또한 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy) 환자에서도 이러한 반복 서열이 있고, 이로 인하여 체세포 분열(mitosis)이 불안정해짐으로 체세포 모자이크화(somatic mosaicism)가 유발되는 것이 확인되었다.

이외에도 헌팅턴씨 병(Hungtington's disease), 척수소뇌성 운동실조증 타입 I (spinocerebellar ataxia type I; SCAI), X 염색체 관련 척수성 운동실조증(X-linked spinobubar atrophy, SBMA), 덴테이토루부랄 파리도누이지안 위축증(dentatorubral and pallidoluysian atrophy; DRPLA), 척수소뇌성 운동실조증 타입 III (spinocerebellar ataxia type III; SCAIII) 및 FRAXE 정신 박약 등이 삼핵산 반복 서열의 증가로 인하여 유발되는 것이 확인되었다.

최근 연구를 통하여 삼핵산 반복 서열의 증가가 유전성 신경정신 질환의 주요 원인임이 밝혀졌으며, 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자는 대개 뇌에서 핵심적인 인산화효소(kinase)로 작용하는 것으로 보이나, 아직 삼핵산 반복 서열과 질환의 발생 기작과의 관계는 정확하게 밝혀지지 않았다.

삼핵산 반복 서열의 증가로 유발되는 질환은 비교적 공통적인 임상 소견을 나타내며, 구체적으로 상기 질환은 하기에 기술한 4가지 공통적인 특징을 나타내는 데, 첫째 예상 현상 (phenomenon of anticipation), 둘째 유전적 소인 (상염색체 우성 및 성염색체 우성), 셋째 신경퇴행 증상 또는 정신지체, 넷째 체세포 모자이크화(somatic mosaicism) 등이다.

예상 현상이란 세대가 내려감에 따라 증상이 심해지고 증상 발현 시기가 당겨지는 현상이다. 예를 들어 프레질 X 증후군에서 나타나는 삼핵산 반복 서열인 (CGG)n 반복 서열은 정상인인 경우 50 이하로 반복되어 있으나 프레질 X 증후군의 보인자인 경우는 60-200 정도로 증가되어 있는데, 이 보인자들은 대개 정상의 지능을 보이고 외관상 환자들에서 보이는 특징이 관찰되지 않는다. 그러나 이들이 결혼하여 자녀를 갖는 경우 (CGG)n 반복 서열이 200 이상으로 늘어나 전형적인 프레질 X 증후군의 소견인 지능 박약과 특징적인 얼굴, 귀 모습을 나타내고 일부는 사춘기 이후에 고환이 커지는 특징도 나타낸다.

유전적 소인으로 상염색체 또는 성염색체 우성을 보이는 현상은 유전학에 있어서 소위 동적인 돌연변이 (dynamic mutation)의 예로서 수백 수천 세대를 내려가도 변함이 없어야 할 유전정보가 그대로 내려가지 못하고 단 1세대만에 진화가 일어나는 것을 말한다. 구체적으로 근긴장성 이영양증 (myotonic dystrophy) 환자의 경우 할아버지, 아버지, 손자 대에서 각각 질환 발현 시기가 다르게 나타나는 현상이 관찰되는데, 할아버지는 70-80 대에, 아버지는 30-40 대에, 손자는 10 대에 증상을 나타낸 것으로 보고된 바 있다. 이러한 현상은 삼핵산 반복 서열의 증가에 의하여 초래되는 질환에서 대부분 관찰할 수 있으므로 상기 질환의 예후 증상을 예상할 수 있다.

신경퇴행 증상 또는 정신지체는 이 질환을 보유한 환자들이 병원을 찾는 주요 원인으로, 구체적으로 프레질 X 증후군 이나 FRAXA 증후군에서는 정신지체가, 근긴장성 이영양증의 경우는 근육의 퇴행성 병변에 의한 근력의 저하 그리고 그 밖의 질환에서는 운동실조증이 주요 증상으로 나타난다. 따라서, 이러한 증상을 보이는 환자들의 유전자를 검사함으로 상기 신경정신 질환을 진단할 수 있다.

체세포 모자이크화 현상도 이 질환의 중요한 특징 중의 하나로서, 프레질 X 증후군 환자 및 그 가족의 유전자를 이용하여 서던 하이브리디제이션 및 메틸화 분석 등을 수행하면 그 결과에서 정상 단일 밴드 이외에 산만하게 분포되어 있는 퍼진 양상 (smear)을 관찰할 수 있다. 이는 각 세대가 가지고 있는 (CGG)n 반복 서열의 증가 양상이 서로 다름을 나타내는 것으로, 감수분열 뿐만 아니라 체세포 분열시에도 (CGG)n 반복 서열의 증가가 세포 분열 때마다 달라지는 것을 보여주고 있다. 또한 환자의 각 장기마다도 (CGG)n 반복 서열의 수가 다른 경우가 보고된 바있는데, 이는 양수 융모 샘플링 (chorionic villous sampling)을 통한 산전 진단으로 프레질 X 증후군을 진단하는 경우 확진하는 것을 어렵게 하므로 임상적으로 중요하다. 실제로 최근에 환자의 말초 혈액에서 증명되는 메틸화 이상이 산전 진단에서는 검출되지 않는 것이 보고되었다.

삼핵산 반복 서열의 증가로 유발되는 신경정신 질환은 공통적으로 특정 질환의 거의 모든 환자가 동일한 유전자 위치에서 상기 삼핵산 반복 서열이 증가되는 현상이 발견된다. 이와 같이 상기 신경정신 질환들의 원인이 되는 유전자 돌연변이가 일정 유전자 부위의 이상에서 기인하으로 기원이 동일한 조상에 의하여 유래된 것으로 보이고 (founder effect), 이는 우성 상염색체 질환인 말환 증후군(Marfan syndrome) 또는 유전성 비후성 심근병 (hereditary hypertrophic cardiomyopathy)에서 돌연변이가 비교적 여러 엑손 (exon)들에 넓게 퍼져있는 것과 비교된다. 물론 극히 예외적으로 삼핵산 반복 서열 이외의 엑손에 돌연변이가 있는 프레질 X 증후군도 발견된 바 있으나 대부분의 신경정신 질환들은 돌연변이가 한 곳에 모여 있다.

이외에도, 상기 신경정신 질환을 유발하는 유전자는 증가된 삼핵산 반복 서열 부위를 포함하여 그 염색체에 모두 동일한 다형 표식(polymorphic marker)을 가지고 있음이 연관분석(linkage analysis)을 통하여 확인되었다.

이와 같이 신경정신 질환이 특정 유전자 상의 삼핵산 반복 서열의 증가라는 단일 기작에 의하여 일어난다는 점을 이용하면 이를 분자유전학적으로 쉽게 진단할 수 있다. 즉, 다른 엑손들의 돌연변이를 모두 조사할 필요없이 삼핵산 반복 서열의 증가 정도만을 조사하여 상기 질환을 진단할 수 있음으로써 진단율이 높은 유전자 진단 방법을 개발하는데 유용하다. 반면 예전에는 프레질 X 증후군이 의심되면 임상적으로 엽산(folate) 결핍 배지를 사용하여 세포를 배양하고 염색체를 검사하였고, 그 방법의 진단율도 약 50 % 밖에 되지 않았다.

이미 신경정신 질환과 관련된 삼핵산 반복 서열을 검색하는 방법은 개발되어 특허 출원된 바 있고 (USP 5545539, USP 5650277, USP 5597694, USP 5723301, WO 9727328, USP 5582979), 특히 헌팅튼씨병 (Huntington's disease)에 관하여는 그 유전자 전체가 권리로 보호되어 있다 (General Hospital Corporation; US 466828, EP 0614977, US 5538844, US 5686288, US 5693757). 그러나 신경정신 질환을 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 이용한 역상 점 하이브리디제이션 또는 중합 효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션 등으로 진단하는 방법은 아직까지 전혀 보고된 바 없었다.

상기 유전학적 방법을 신경정신 질환에 응용하면 정확하고 높은 진단율이 보장될 것이고, 특히 점 하이브리디제이션 방법 (dot hybridization)을 개선하여 막이나 플레이트에 탐침을 고정시키고 여기에 목적 DNA 를 하이브리디제이션시킨 다음 그 양을 측정하는 역상 점 하이브리디제이션 방법 등은 막이나 플레이트에 여러개의 탐칭을 고정시킬 수 있고 진단 과정이 간편하여 병원의 일반 스크리닝(routine screening) 검사 방법으로 유용할 것으로 기대된다.

실제로, 중합효소 연쇄반응 및 역상 점 하이브리디제이션 방법을 이용한 조직적합성 진단(HLA typing) 방법 등은 일본의 와쿠나가(Wakunaga) 사가 개발하여 이미 특허출원 (일본특허출원 평 8-53480호)된 바 있으나 이를 신경정신 질환에 이용한 보고는 전혀 없었다.

이에 본 발명자들은 신경정신 질환을 효과적으로 진단하기 위하여 연구를 계속한 결과, SCAIII 증후군 환자에서 SCAIII 유전자의 삼핵산 반복 서열 부위가 증가된 것을 확인하고 중합효소 연쇄반응을 수행하여 상기 삼핵산 반복 부위를 포함하는 유전자를 삽입한 플라스미드 벡터를 제작한 다음 이를 이용한 역상 점 하이브리디제이션 방법 및 중합효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션(PCR-MPH) 방법 등을 수행하여 환자와 정상인의 반응 결과를 비교하고 이로부터 신경정신 질환을 정확히 진단함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신경정신 질환의 일반적인 스크리닝 방법으로 사용될 수 있는 삼핵산 반복 서열을 이용한 유전성 신경정신 질환의 진단 방법 및 그의 진단 시약을 제공함에 그 목적이 있다.

제1도는 본 발명의 플라스미드 벡터의 유전자 지도를 도식화하여 나타낸 것이고,

제2도는 본 발명의 플라스미드 벡터 pSCAIII73 및 pSCAIII8에 포함되는 삼핵산 반복 서열의 염기 서열을 확인한 결과를 나타낸 것이고,

제3도는 본 발명의 플라스미드 벡터 pSCAIII8, pSCAIII22 및 pSCAIII73를 각각 이용하여 역상 점 하이브리디제이션을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

A : 정상인의 PCR 산물을 이용한 경우;

B : 신경정신 질환 환자의 PCR 산물을 이용한 경우

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 삼핵산 반복 서열을 포함하는 신경정신 질환 관련 유전자를 기질에 부착하는 단계, (2) 진단 환자의 염색체 상의 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 단계; (3) 유전자 하이브리디제이션을 수행하는 단계, (4) 상기 결과를 비교 검색하는 단계로 구성되는 신경정신 질환의 진단 방법을 제공한다.

바람직하게는 본 발명은 서열 1, 서열 2 및 서열 3 의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드 등을 사용하여 신경정신 질환인 SCAIII 증후군을 진단한다.

또한, 본 발명은 (1) 삼핵산 반복 부위을 포함하는 신경정신 질환 관련 유전자를 부착시킨 기질; (2) 진단 환자의 염색체 상의 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 시발체; (3) 중합효소 연쇄반응용 완충용액 및 효소; (4) 유전자 하이브리디제이션을 수행하기 위한 완충용액 및 효소로 구성되는 신경정신 질환의 진단 시약을 제공한다.

본 발명의 진단 시약은 (1) 단계에 사용하는 유전자는 삼핵산 반복 부의를 포함하는 SCAIII 유전자 전체 또는 일부로서, 이를 삽입한 플라스미드 벡터, 올리고 뉴클레오타이드 또는 유전자 단편의 형태를 포함하고, 기질로는 멤브레인 또는 마이크로플레이트 등을 포함하며, (2) 단계에서 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 시발체로는 방사성 동위원소 또는 바이오틴으로 표지된 올리고 뉴클레오타이드 등을 사용한다.

본 발명은 상기에 더하여 (5) 세척 완충용액; (6) 아비딘 - 효소 결합체 및 색소성 기질 등을 포함하는 신경정신 질환의 진단 시약을 제공한다. 이 때 아비딘 - 효소 결합체로 스트렙타비딘 - 알칼라인 포스파테이즈 등을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 신경정신 질환인 SCAIII 증후군 환자의 SCAIII 유전자 부위를 포함하는 플라스미드 벡터 pSCAIII73를 제공한다 (수탁번호 : KCTC 0435 BP).

또한, 본 발명은 정상인의 SCAIII 유전자 부위를 포함하는 플라스미드 벡터 pSCAIII8를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 삼핵산 반복 서열 (TNR)을 이용한 유전성 신경정신 질환의 새로운 진단 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 기존의 역상 점 하이브리디제이션 방법 및 중합효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션 방법 등을 이용하여 신경정신 질환을 진단한다.

이 때 역상 점 하이브리디제이션은 기존의 점 하이브리디제이션 (dot blot hybridization)이 먼저 PCR 산물을 멤브레인에 블럿팅한 다음 탐침으로 플라스미드를 사용하여 하이브리디제이션을 수행하는 것과 비교하여 탐침인 플라스미드를 먼저 멤브레인에 블럿팅한 다음 PCR 산물을 표지하여 하이브리디제이션을 수행하는 것이다.

우선 본 발명은 신경정신 질환인 SCAIII 증후군이 의심되는 환자에서 염색체 14q24.3 부분에 존재하는 SCAIII 유전자 부위로부터 삼핵산 반복 부위의 증가를 확인하고 삼핵산 반복 서열을 포함하는 SCAIII 유전자 전체 또는 일부를 중합효소 연쇄반응으로 증폭시킨 다음 이를 플라스미드 벡터에 삽입한다(제1도 참조).

SCAIII 증후군은 폴리글루타민 트랙 (polyglutamine tract) 유전자에 삼핵산 반복 서열인 (CAG)n 반복 서열이 증가됨으로 유발되는 신경정신 질환으로, 정상인의 경우 염색체 내에 13 내지 34 배수의 반복 서열이 존재하나 환자의 경우는 68 내지 79 배수까지 반복 서열이 증가하는 특징을 가진다.

본 발명은 SCAIII 증후군 환자의 SCAIII 유전자를 플라스미드 벡터 pCRII 2.1-TOPO의 제한효소 EcoR I 인식부위에 삽입하여 플라스미드 벡터 pSCAIII73를 제작하고, 정상인의 SCAIII 유전자도 동일하게 플라스미드 벡터 pCRII2.1-TOPO 에 삽입하여 플라스미드 벡터 pSCAIII22 및 pSCAIII8을 제작한다(제1도 참조). 이 때 삼핵산 반복 서열 부위를 포함하는 환자 및 정상인의 SCAIII 유전자 전체 또는 일부가 삽입된 모든 플라스미드 벡터는 본 발명에 포함된다.

본 발명은 상기 플라스미드 벡터 pSCAIII73을 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 1월 23일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0435 BP).

본 발명은 역상 점 하이브리디제이션 방법으로 신경정신 질환을 진단하기 위하여, 상기 삼핵산 반복 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 나일론 멤브레인 등에 블럿팅시키고, 진단하고자 하는 환자로부터 분리한 DNA 를 주형으로 하여 신경정신질환의 원인이 되는 삼핵산 반복 서열을 증폭할 수 있고 검색 가능한 표지가 있는 시발체를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 다음 상기 멤브레인과 하이브리디제이션시키고 그 결과를 자가방사능 분석 방법(autoradiography) 또는 색소 분석 방법 등으로 분석한다.

이 때 시발체로는 SCAIII 유전자의 5′ 및 3′-말단의 특정 부위에 각각 해당하는 염기 서열을 가지고, 방사성 동위원소 또는 바이오틴 등으로 표지된 모든 올리고 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는 서열 1 및 서열 2; 또는 서열 1 및 서열 3의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 진단하고자하는 환자의 삼핵산 반복 서열을 포함하는 SCAIII 유전자 부위을 증폭시킨다. 또한 상기 하이브리디제이션 과정은 6× SSC, 5× 덴하르트 용액 (Denhart solution), 0.1% 연어 정자 DNA 등을 포함하는 완충용액을 사용한다.

상기 과정으로 분석한 결과, 정상인에서는 플라스미드 벡터 pSCAIII22 및 pSCAIII8를 이용한 경우에 강한 시그날을, 신경정신 질환 환자에서는 플라스미드 벡터 pSCAIII73를 이용한 경우에 강한 시그날을 확인할 수 있었고 이를 이용하면 신경정신 질환의 여부 및 그의 이환 정도를 용이하게 진단할 수 있다(제3도 참조).

즉, 플라스미드 벡터 pSCAIII8 및 pSCAIII73을 멤브레인 또는 웰 플레이트에 고정하고 진단하고자 하는 사람의 혈액을 상기 시발체를 이용하여 증폭시킨 다음 하이브리디제이션을 수행하면, 진단하고자 한 사람이 정상이면 플라스미드 벡터 pSCAII8을 사용한 경우에 강한 시그날이 나타나고, 진단하고자 한 사람이 환자이면 플라스미드 벡터 pSCAIII73를 사용한 경우에 강한 시그날이 나타나게 된다.

다시 말하자면, 중합효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션(PCR - MPH) 방법으로 신경정신 질환을 진단하기 위하여, 우선 마이크로플레이트에 삼핵산 반복 서열을 가지는 탐침을 웰 플레이트에 고정시키고 이에 환자의 DNA를 주형으로 하고, 바이오틴 등으로 표지되고 삼핵산 반복 서열을 증폭시키는 시발체로 중합효소 연쇄반응을 수행한 다음 하이브리디제이션을 수행한다. 다음 세척 완충용액으로 세척하고, 웰에 남아있는 PCR 산물을 스트렙타비딘 - 알칼라인 포스파테이즈(streptavidin - alkaline phosphatase)와 색소성 기질 (chromogenic substrate) 등을 첨가하여 반응시키고 마이크로타이터 플레이트 리더 (microtiter plate reader) 등을 이용하여 450nm 에서 흡광도를 측정함으로써 신경정신 질환을 진단한다.

이 때 탐침으로는 신경정신 질환과 관련있는 유전자 또는 이들이 나란히 연결된 탐침 (ssDNA-containing tandemly ligated probe) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 역상 점 하이브리디제이션 방법 및 중합효소 연쇄반응 - 마이크로 플레이트 하이브리디제이션 방법은 다양한 시발체와 탐침으로 사용되는 유전자를 이용함으로 모든 종류의 유전성 신경정신 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[참조예 1]

[서던 하이브리디제이션]

기존의 서던 하이브리디제이션 (Southern hybridization) 방법으로 신경정신 질환을 진단하기 위하여, 신경정신 질환이 있는 가계의 각 가족 구성원의 말초 혈액으로부터 전체 DNA 를 추출하여 제한효소 EcoRI 으로 처리한 다음 0.7% 아가로스 젤에 전기영동하였다. 다음 분리된 DNA 를 나일론 멤브레인 (Hybond N, Amersham)에 옮기고 65℃에서 6× SSC, 5× 덴하르트 용액 (Denhart solution), 0.1% 연어 정자 DNA 등을 가하여 하이브리디제이션시켰다. 이 때 탐침 (probe)으로는 SCAIII 유전자의 3′ 영역을 포함하는 유전자가 플라스미드에 삽입된 플라스미드 벡터를 랜덤 프라이머 (random primer) 방법으로 [α-³²P]dATP 를 표지하여 사용하였다. 상기 하이브리디제이션 반응을 12 - 18 시간 동안 진행시킨 다음 멤브레인을 씻고 자가방사능 분석 방법(autoradiography)을 수행하여 그 결과를 분석하였다.

[실시예 1]

[역상 점 하이브리디제이션]

본 발명은 역상 점 하이브리디제이션 (reverse dot hybridization) 방법으로 신경정신 질환을 진단하기 위하여, 우선 이미 알려진 환자의 혈액으로부터 얻은 전체 DNA 를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 SCAIII 유전자 부위를 증폭시키고 이를 포함하는 플라스미드 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 환자의 SCAIII 유전자를 플라스미드 벡터 pCRII2.1-TOPO(Promega사 제품)의 제한효소 EcoRI 인식부위에 삽입하여 플라스미드 벡터 pSCAIII73 를 얻고, 정상인의 DNA 를 상기와 동일한 과정으로 PCR 증폭하여 SCAIII 유전자를 얻은 다음 이를 플라스미드 벡터 pCRII2.1-TOPO의 제한효소 EcoRI 인식부위에 삽입하여 플라스미드 벡터 pSCAIII22 및 pSCAIII8 을 얻었다.

다음 상기 플라스미드 벡터를 기존의 방법으로 하이본드 N⁺나일론 멤브레인에 블럿팅시켰다 (Sambrook, et al., Molecular Cloning). 다음 진단하고자 하는 환자에서 얻은 DNA를 주형으로 하고 방사성 동위원소 또는 바이오틴 등으로 표지된 서열 1 및 서열 2 의 염기 서열을 가지는 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 하기 실시예의 과정으로 수행하여 SCAIII 유전자 부위를 증폭시킨 다음 상기 플라스미드 벡터가 블럿된 멤브레인을 상기 실시예 1 의 과정으로 하이브리디제이션시켜 자가방사능 분석 방법 및 색소 분석 방법으로 분석하였다.

그 결과, 정상인에서는 플라스미드 벡터 pSCAIII22 및 pSCAIII8를 이용한 경우에 강한 시그날을, 신경정신 질환 환자에서는 플라스미드 벡터 pSCAIII73를 이용한 경우에 강한 시그날을 확인할 수 있었고 이로부터 신경정신 질환의 여부 및 그의 이환 정도를 진단할 수 있었다.

[실시예 2]

[중합효소 연쇄반응]

본 발명은 환자의 말초 혈액에서 추출한 게놈 DNA로부터 SCAIII 유전자의 삼핵산 반복 서열을 증폭시키기 위하여, 우선 상기 게놈 DNA 를 주형으로 하고 서열 1 의 염기 서열을 가지는 시발체 MJD52 (5′-CCAGTGACTACTTTGATTCG-3′) 및 서열 2의 염기 서열을 가지는 시발체 MJD25 (5′-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3′)를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

구체적으로, 게놈 DNA 100 ng, 0.5μM의 서열 1 및 서열 2 시발체 (MJD52 및 MJD25), 200μM 의 dATP, dGTP, dTTP, 50μM의 dCTP 및 0.3μCi[α-³²P]-dCTP, 1× PCR 완충용액 (50 mM 염화칼륨, 10 mM 트리스-염산, pH 8.3, 1.5 mM 염화마그네슘)의 조성으로 반응 혼합액을 부피 2㎕에 가 되도록 하였다. 상기의 반응 혼합액을 95℃에서 5분 동안 디네이쳐(denature)시킨 다음 2 U 의 Taq 폴리머라제를 넣어 핫 스타트 (hot start)하고 95℃에서 1분 동안 디네이쳐, 55℃에서 1분 동안 아닐링(annealing), 72℃에서 1분 동안 익스텐션(extension)의 사이클을 30회 반복하는 과정을 수행하였다.

상기 과정으로 증폭된 PCR산물의 약간으로 6% 폴리아크릴아마이드 / 8M 우레아 시퀀싱 젤에 전기영동하여 그 염기 서열을 결정하였다.

그 결과, 정상인에서의 플라스미드 벡터인 pSCAIII8에서는 삼핵산 반복 서열의 반복되는 정도가 짧은 반면, 환자의 플라스미드 벡터인 pSCAIII73에서는 삼핵산 반복 서열의 반복되는 정도가 상당히 길다는 것을 확인할 수 있었다 (제2도).

[실시예 3]

[삼핵산 반복 서열을 이용한 PCR - MPH 방법]

본 발명은 기존의 중합효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션(PCR - MPH) 방법으로 신경정신 질환을 진단하기 위하여, 우선 마이크로플레이트에 삼핵산 반복 서열을 가지는 단일가닥 DNA 를 포함하는 나란히 연결된 탐침(ssDNA-containing tandemly ligated probe)을 플레이트에 고정시켰다. 다음 마이크로타이터 웰에 환자의 DNA를 넣고 5′ 말단에 바이오틴을 붙인 서열 1 및 서열 2의 염기 서열을 가지는 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 SCAIII 유전자 부위를 증폭시키고, 이 때 얻은 PCR 산물을 이용하여 하이브리디제이션을 수행하였다. 다음 TMAC (3 M 테트라메틸암모니움 클로라이드, 50 mM 트리스-염산, pH 7.5, 2 mM EDTA) 세척 완충용액으로 세척하고 웰에 남아있는 부착된 PCR 산물을 스트렙타비딘 - 알칼라인 포스파테이즈(streptavidin - alkaline phosphatase)와 색소성 기질(chromogenic substrate)을 첨가하여 반응시켰다. 다음 색 반응을 마이크로타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader)를 이용하여 450nm 에서 흡광도로 측정하였다.

그 결과, 정상인의 PCR산물을 이용한 경우에는 정상인으로부터 얻은 플라스미드 벡터인 PSCAIII8과 pSCAIII22에서는 발색하였고, 환자로부터 얻은 플라스미드벡터인 pSCAIII73에서는 발색하지 않은 반면, 환자의 PCR 산물을 이용한 경우에는 pSCAIII8에서는 발색하지 않고, pSCAIII73에서는 발색하였다. 이상의 결과로부터 본 발명의 플라스미드 벡터인 pSCAIII8, pSCAIII22 및 pSCAIII73을 이용하여 신경정신 질환인 SCAIII 증후군을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 삼핵산 반복 서열(trinucleotide repeats sequence)을 이용한 역상 점 하이브리디제이션 (reverse dot hybridization) 또는 중합효소 연쇄반응 - 마이크로플레이트 하이브리디제이션(PCR-MPH)으로 SCAIII 유전자의 삼핵산 반복 서열의 증가 정도를 조사함으로써 신경정신 질환인 SCAIII 증후군을 효과적으로 진단 및 치료할 수 있다.

구체적으로 유전성 신경정신 질환을 삼핵산 반복 서열의 증가로 검사하면 분자유전학적 특징으로 인하여 진단율이 99% 이상이 되므로, 다른 어느 진단 방법보다 확진 및 환자 검출에 유리하다. 더욱이 삼핵산 반복 서열의 증가 정도가 보인자에서는 정상보다 약간 늘어나 있고 증상이 심할수록 증가 정도가 늘어나는 것으로 나타나 질환의 예후도 쉽게 예상할 수도 있어 치료에 도움이 된다. 따라서 본 발명의 진단 방법은 환자 개인의 진단뿐만 아니라 연관된 가족 구성원의 이환 여부를 판정하고 증상의 출현 시기와 예후까지 확인할 수 있어 앞으로 신경정신 질환의 진단 및 치료와 관련하여 뇌신경 질환 분야의 일반 스크리닝 검사로서 널리 이용될 것으로 보인다.

[서열목록]

서열번호 : 1

서열의 길이 : 20

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열 1]

CCAGTGACTA CTTTGATTCG 20

[서열목록]

서열번호 : 2

서열의 길이 : 22

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열 2]

TGGCCTTTCA CATGGATGTG AA 22

[서열목록]

서열번호 : 3

서열의 길이 : 22

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

[서열 3]

TGGGGTTTCA CATGGATGTG AA 22

Claims

(1) 삼핵산 반복 서열을 포함하는 신경정신 질환 관련 유전자를 기질에 부착하는 단계; (2) 진단 환자의 염색체 상의 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 단계; (3) 유전자 하이브리디제이션을 수행하는 단계; (4) 상기 결과를 비교 검색하는 단계로 구성되는 신경정신 질환의 진단 방법.
(1) 삼핵산 반복 서열을 포함하는 신경정신 질환 관련 유전자를 부착시킨 기질; (2) 진단 환자의 염색체 상의 삼핵산 반복 서열 부위를 포함하는 유전자를 증폭시키는, 검출 가능한 표지를 가지는 시발체; (3) 중합효소 연쇄반응용 완충용액 및 효소; (4) 유전자 하이브리디제이션을 수행하기 위한 완충용액 및 효소로 구성되는 신경정신 질환의 진단 시약.
제2항에 있어서, (1) 단계에서 사용하는 유전자는 삼핵산 반복 서열을 포함하는 SCAIII 유전자 전체 또는 일부로서, 이 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터, 올리고 뉴클레오타이드 또는 유전자 단편의 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약.
제2항에 있어서, (1) 단계에서 기질로는 멤브레인 또는 마이크로플레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약.
제2항에 있어서, (2) 단계에서 삼핵산 반복 서열 부위를 증폭시키는 시발체는 방사성 동위원소 또는 바이오틴으로 표지된 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시약.
제2항에 있어서, 상기에 더하여 (4) 세척 완충용액; (5) 아비딘 - 효소 결합체 및 색소성 기질을 포함하는 신경정신 질환의 진단 시약.
제2항에 있어서, (2) 삼핵산 반복 서열을 포함하는 유전자 부위를 증폭시키는 시발체로 서열 1 및 서열 2; 또는 서열 1 및 서열 3의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하고, 신경정신 질환인 SCAIII 증후군을 진단하는 것을 특징으로 하는 진단 시약.
신경정신 질환인 SCAIII 증후군 환자의 SCAIII 유전자 부위를 포함하는 플라스미드 벡터 pSCAIII73 (수탁번호 : KCTC 0435 BP).
정상인의 SCAIII 유전자 부위를 포함하는 플라스미드 벡터 pSCAIII8.