CN117418001A - 一种脊髓小脑共济失调sca3型基因检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种脊髓小脑共济失调sca3型基因检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，公开了一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒及检测方法。所述检测试剂盒包括下游特异性引物P1、长引物P2、非人基因组引物P3及PCR反应试剂。所述检测方法为：将样本加入到上述检测试剂中进行PCR扩增反应，将反应产物采用毛细管电泳进行检测，将毛细管电泳结果转换成CAG重复数，根据CAG重复数判定样本中是否含有脊髓小脑共济失调SCA3型基因。本发明通过设计下游特异性引物P1、长引物P2和非人基因组引物P3用于脊髓小脑共济失调SCA3型基因的PCR检测，其准确性、精密度、抗干扰能力和阈值测定检出的指标均符合临床分析性能要求，且具有检测效率高、检测成本低的优点。

Description

一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脊髓小脑共济失调也叫遗传性共济失调(spinocerebellar ataxia,SCA)，是一组以共济失调为主要临床症状的神经系统遗传变性病，其病变部位主要分布在脊髓、小脑以及脑干，所以也称为脊髓-小脑-脑干疾病。多发生于30岁以上的人群，其临床表现为平衡障碍、步态不稳、进行性肢体协调运动障碍、构音障碍、以及眼球运动障碍等，尚可伴有复杂的神经系统损害症状，如锥体系、锥体外系、听觉以及视觉损害，还可伴有其他系统异常。
经典类型SCA为常染色体显性遗传，因相应基因外显子(CAG)三核苷酸拷贝数异常重复扩增产生多谷氨酰胺所致。后来也发现了常染色体隐性遗传、X连锁遗传和线粒体遗传(NARP、MERRF以及CoQ10缺乏)的类型。
SCA3患者通常成年发病（10岁-50岁为常见发病年龄段），隐匿起始，逐渐进展。一旦发病表现为小脑共济失调，前期症状包括醉汉步态，动作笨拙，复视，眼震等；当病情逐渐进展起病10-15年后丧失行动能力，长期吞咽困难导致营养不良，最终导致死亡。因此在胎儿出生前实行相应的产前筛查具有及其重要的意义。
目前临床上针对SCA3患者的筛查工作主要采用的方法为：1）影像学检查头MR或头CT示小脑及脑干萎缩，尤其是脑桥和小脑中脚萎缩，第四脑室扩大，小脑半球及蚓部沟回加深，矢状位呈树枝状。萎缩程度与病情轻重呈正比。2）电生理检查：脑干听觉诱发电位可异常。神经传导检查可见远端感觉神经传导波幅下降，呈轴索性周围神经病改变，并进行性加重。但是以上两种检测方法均存在假阴性的问题。3）基因检测：基因检测是SCA最重要的确诊手段。通过PCR、毛细管凝胶电泳等方法确定AXTN3基因编码序列第10外显子中(CAG)n的重复数。正常人群(CAG)重复数在12~44次，SCA3 患者重复数多在52~86次。重复数介于45~51次为中间重复次数，可无明显临床症状或不全外显，但重复序列已不稳定，向下一代传递时，重复数增多可发展为病理重复次数范围。而现有基因检测方法的准确性仍有待进一步提高。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，以解决传统SCA3基因检测假阴性的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，包括下游特异性引物P1、长引物P2、非人基因组引物P3及PCR反应试剂；各引物序列如下：
下游特异性引物P1：5’-FAM-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’（SEQ ID No：1）；
长引物P2：5’-TGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATACAGCAGCAGCAGCAG-3’（SEQ ID No：2）；
非人基因组引物P3：5’-TGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATA-3’（SEQ ID No：3）。
进一步地，所述PCR反应试剂为包括DNA聚合酶、10× PCR缓冲液、PCR增强剂及dNTP混合液的反应液I，或所述PCR反应试剂为包括DNA聚合酶，2× PCR 缓冲液及dNTP混合液的反应液II。更优选地，所述PCR反应试剂为反应液II。
进一步优选地，所述反应液I中DNA聚合酶为5U/μL的TaKaRa LA Taq HSPolymerase，10× PCR缓冲液为25mM MgCl2，PCR增强剂为DMSO，dNTP混合液包括2.5mMdATP、2.5mM dTTP、2.5mM dCTP和2.5mM dGTP；所述反应液II中DNA聚合酶为0.5U/μL的TaKaRa LA Taq HS Polymerase，2× PCR 缓冲液为1.5mM MgCl2，dNTP混合液包括0.2mMdATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP和0.2mM dGTP。
进一步优选地，所述检测试剂盒由如下含量的组分构成：
1~5μM下游特异性引物P1 1μL；
0.1~0.5μM长引物P2 1μL；
1~5μM非人基因组引物P3 1μL；
10× PCR缓冲液 3μL；
dNTP混合液 4μL；
DNA聚合酶 0.3μL；
PCR增强剂 1.5μL；
水 适量。
一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测方法，包括如下步骤：
将样本加入到上述检测试剂中进行PCR扩增反应，将PCR扩增反应产物采用毛细管电泳进行检测，将毛细管电泳结果转换成CAG重复数，根据CAG重复数判定样本中是否含有脊髓小脑共济失调SCA3型基因。
进一步地，所述PCR扩增反应包括两步扩增法或一步扩增法，所述两步扩增法包括如下步骤：
（1）采用样本、下游特异性引物P1和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，PCR扩增反应条件为：94℃预变性1 min，1循环；98℃变性10 s、60℃退火2 min、72℃延伸60 s，15循环；72℃延伸5 min，1循环；
（2）在步骤（1）扩增后的反应体系中再次加入下游特异性引物P1、长引物P2和非人基因组引物P3进行PCR扩增反应，PCR扩增反应条件为：94℃预变性1 min，1循环；98℃变性10 s、60℃退火2 min、72℃延伸60 s，35循环；72℃延伸5 min，1循环；
所述一步扩增法包括如下步骤：
采用样本、下游特异性引物P1、长引物P2、非人基因组引物P3和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，PCR扩增反应条件为：94℃预变性1 min，1循环；98℃变性10 s、60℃退火2min、72℃延伸60 s，35循环；72℃延伸5 min，1循环。
进一步优选地，所述PCR扩增反应为一步扩增法。
本发明利用TP-PCR的检测原理，针对ATXN3基因中的CAG重复序列，合成三条引物，第一引物P1为用于扩增SCA3基因CAG重复区域的下游特异性引物，第二引物P2为含CAG重复序列与非人源性基因组序列的长引物，第三引物P3为非人源性基因组序列。下游特异性引物、长引物和非人基因组引物形成三引物扩增系统对CAG重复数进行检验，然后PCR产物采用毛细管电泳进行分离，根据计算公式，将毛细管电泳结果转换成CAG重复数，根据CAG重复数判定样本中是否含有脊髓小脑共济失调SCA3型基因。具体三引物扩增原理如图1所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明通过设计下游特异性引物P1、长引物P2和非人基因组引物P3用于脊髓小脑共济失调SCA3型基因的PCR检测，其准确性、精密度、抗干扰能力和阈值测定检出的指标均符合临床分析性能要求，解决了传统SCA3基因检测假阴性的技术问题。
（2）采用本发明的检测试剂对脊髓小脑共济失调SCA3型基因进行检测的方法具有检测效率高、检测成本低的优点。
附图说明
图1为本发明三引物扩增原理图。
图2为本发明实施例中两步扩增法的扩增产物毛细管电泳分析结果图。
图3为本发明实施例中一步扩增法的扩增产物毛细管电泳分析结果图。
图4为本发明实施例中PCR扩增体系反应试剂1的扩增产物毛细管电泳分析结果图。
图5为本发明实施例中PCR扩增体系反应试剂2的扩增产物毛细管电泳分析结果图。
图6为本发明实施例中10ng样本投入量的扩增产物毛细管电泳分析结果图。
图7为本发明实施例中100ng样本投入量的扩增产物毛细管电泳分析结果图。
图8 为本发明实施例中将毛细管电泳结果转换成CAG重复数的计算公式原理图。
图9为本发明实施例中CAG重复值＞18的样本结果图。
图10为本发明实施例中CAG重复值≤18的样本结果图。
图11为本发明实施例中阳性样本sample1的毛细管电泳结果图。
图12为本发明实施例中阴性样本sample4的毛细管电泳结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
1.实验流程
1.1 引物设计：
下游特异性引物P1: 5’-FAM-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’（SEQ ID No：1）；
长引物P2: 5’-TGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATACAGCAGCAGCAGCAG-3’（SEQ ID No：2）；
非人基因组引物P3: 5’-TGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATA-3’（SEQ ID No：3）。
1.2 体系优化：
1.2.1 PCR扩增体系
1）方案：
在样本、三引物群比例一致的前提下，分别设置两步扩增法和一步扩增法的PCR扩增体系，将PCR产物采用毛细管电泳进行分离，根据计算公式，将毛细管电泳结果转换成CAG的重复值，比对两种体系的扩增结果。
2）执行
a、PCR扩增体系反应试剂1包括DNA聚合酶、10× PCR缓冲液、PCR增强剂及dNTP混合液；其中，
DNA聚合酶为5U/μL的TaKaRa LA Taq HS Polymerase；
10× PCR缓冲液为10× PCR Buffer(25mM MgCl2)；
PCR增强剂为DMSO（100%）；
dNTP混合液为2.5mM dATP、2.5mM dTTP、2.5mM dCTP、2.5mM dGTP。
b、两步法PCR扩增体系及扩增条件如下表1所示：
表1
c、一步法PCR扩增体系及扩增条件如下表2所示：
表2
d、按照上述的PCR扩增体系扩增，将PCR产物采用毛细管电泳进行分离，得到图2图3所示的结果数据。
3）结果
由图2和图3可知，在样本、三引物比例一致、扩增试剂一致的前提下，两步扩增法和一步扩增法的扩增产物通过毛细管电泳比较，峰值一致。
4）结论
一步扩增法和二步扩增法的扩增结果均符合本发明后续毛细管电泳所需的PCR产物需求，但一步扩增法较便捷，后续选用一步扩增法。
1.2.2 PCR扩增试剂
1）方案：
在样本、三引物群比例一致的前提下，分别用1.2.1中的PCR扩增体系反应试剂I和另一种PCR扩增体系反应试剂II采用一步扩增法进行PCR扩增，将PCR产物采用毛细管电泳进行分离，根据计算公式，将毛细管电泳结果转换成CAG的重复值，比对两种PCR扩增体系反应试剂的扩增结果。
2）执行
a、PCR扩增体系反应试剂II包括PCR基础混合体系工作液；其中，
PCR基础混合体系为2×反应液体系；
PCR基础混合体系工作液（即1×）中DNA聚合酶为0.5U/μL，MgCl2浓度为1.5mM，每种dNTP浓度为混合液为0.2mM。
b、PCR扩增体系反应试剂I扩增体系及扩增条件如下表3所示：
表3
c、PCR扩增体系反应液试剂II扩增体系及扩增条件如下表4所示：
表4
d、按照上述的PCR扩增体系扩增，将PCR产物采用毛细管电泳进行分离，得到图4图5所示的结果数据。
3）结果
由图4和图5可知，在样本、三引物群比例一致的前提下，PCR扩增体系反应液试剂I和PCR扩增体系反应液试剂II经过一步扩增法后的扩增产物通过毛细管电泳比较，峰值一致。
4）结论
PCR扩增体系反应试剂I和 PCR扩增体系反应试剂II的扩增结果均符合本发明后续毛细管电泳所需的PCR产物需求，但 PCR扩增体系反应试剂II较便捷，后续选用 PCR扩增体系反应试剂II。
1.2.3 样本投入量
1）方案：
设置不同的样本投入量，用1.2.2中的PCR扩增体系反应试剂II的扩增体系进行PCR扩增，将PCR产物测定双链浓度值后，采用毛细管电泳进行分离，根据计算公式，将毛细管电泳结果转换成CAG的重复值，比对两种样本投入量的扩增结果。
2）执行
a、10ng样本投入量扩增体系及扩增条件如下表5所示：
表5
b、100ng样本投入量扩增体系及扩增条件如下表6所示：
表6
c 按照上述的PCR扩增体系扩增，测定双链浓度值后，将PCR产物采用毛细管电泳进行分离，得到图6图7所示的结果数据。
2）结果
不同样本投入量PCR扩增产物双链浓度如下表7所示：
表7
由扩增产物浓度已知，10ng样本投入量的PCR产量比100ng样本投入量的低；由图6和图7可知，10ng样本投入量的峰值比100ng样本投入量的峰值低，且五指峰不明显，不利于结果判读。
3）结论
10ng样本投入量扩增后得到的产物不符合本发明后续毛细管电泳所需的PCR产物需求，说明，样本的投入量会影响PCR扩增后的产物。 后续选用100ng的样本投入量。
1.3 毛细管电泳结果分析
1.3.1 计算原理
根据公式[（最后一个有效的 CAG 三引物扩增峰的电泳长度-63）/3]+6计算通过TP-PCR获得的SCA3基因的CAG重复数。在这个公式中，用TP-PCR中扩增等位基因对应区域的最后一个有效扩增峰的电泳长度（bp）减去63bp（非人基因组引物的21个核苷酸加CAG重复区以外片段的42个核苷酸），再除以CAG三碱基的倍数；然后再从非纯重复区（CAA区域）添加6个重复，最后得到CAG重复值。原理如图8所示。
1.3.2实验操作
1）按1:9的体积比分别取通过PCR扩增得到的PCR产物和毛细管电泳体系混合，95℃变性3min，冰上冷却2min，得到混合物；然后用Classic 116型基因测序仪将混合物进行毛细管电泳，其中，进样电压1.2kV、30秒，电泳时间2000秒；
再后利用GeneMapper软件分析，得到PCR产物长度大小，再根据公式得出CAG重复数。
1.3.3结果判读
1）CAG重复值＞18的样本：
a 调整Y轴高度为24000或以上，选择最后一个有效五指峰的尾峰，添加“AddAllele Call”，选中的扩增产物峰会出现对应的数值，为最后一个有效的CAG三引物扩增峰的电泳长度，如图9所示。
b 根据公式计算CAG重复数：6+[(最后一个有效的CAG三引物扩增峰的电泳长度-63)/3]。
2）CAG重复值≤18的样本：
因扩增过程会出现引物二聚体情况，引物二聚体的长度在80-100bp，根据计算公式：6+[(最后一个有效的CAG三引物扩增峰的电泳长度-63)/3]，若样本的CAG重复值≤18，则扩增产物峰会与引物二聚体峰重叠，无法分辨，故当出现图10的峰图，则可判定此样本的的CAG重复值≤18，为正常样本。
2.性能验证
按上述试验的实验条件，进行准确性、精密度、抗干扰能力、阈值测定的性能验证实验。
2.1准确性
选择8例阳性样本和11例阴性样本与第三方检测结果进行对比，相应样本信息如下表8所示。将本次检测的数据进行统计分析，对比双方检测结果的一致性以及CAG重复值的数值，结果如下表9所示。
表8
表9
结论：1）所有检测样本的阴阳性结果准确性为100%，结果符合要求。
2）CAG值重复：阳性样本CAG重复值相差在2个重复值内，阴性样本CAG重复值相差在4个重复值内。
2.2精密度
3个样本进行三次批间重现性和三次批内重复性实验，统计检测准确的结果一致性。结果如下表10所示。
表10
结论：1）阴阳性：所有检测样本的阴阳性结果准确性为100%，结果符合要求。
2）CAG值重复：阳性样本结果一致，阴性样本结果相差2个重复值。
2.3符合度
选择如表8所示的8例阳性样本和11例阴性样本与金域检测结果进行对比，统计每组样本中两种检测方法检测结果的一致程度。结果如下表11所示。
表11
敏感性=a/(a+c)×100%=8/8×100%=100%；
结论：敏感性为100%，结果符合要求。
特异性 =d/(b+d)×100% =11/11×100%=100%；
结论：特异性为100%，结果符合要求。
符合度=(a+d)/( a+b+c+d)×100%=19/19 ×100%=100%；
结论：符合度为100%，结果符合要求。
2.4抗干扰能力
使用5%酒精，按照扩增总体积的1%-5%-10%投入，统计扩增体系中的抗干扰能力。结果如下表12所示。
表12
结论：1）阴阳性：所有检测样本的阴阳性结果准确性为100%，结果符合要求。
2）CAG重复值：阳性样本结果相差1个重复值，阴性样本结果一致。
2.5阈值测定
选择16例样本，进行全长扩增后，将最大的片段送检一代测序，统计一代测序结果和上述2.1准确性结果的一致程度。结果如下表13所示。以阳性样本sample1及阴性样本sample4作为举例，阳性样本sample1和阴性样本sample4的毛细管电泳结果图分别如图11和图12所示。其它不一一列举。
表13
结论：1）阴阳性：经过一代测序辅助验证，所有检测样本的阴阳性结果准确性为100%，结果符合要求。
2）CAG重复值：阳性样本结果相差2个重复值，阴性样本结果相差2个重复值。
以上性能验证结果统计如下表14所示：
表14
2.6结论
1）经实验验证，本发明项目的准确性、精密度、抗干扰能力和阈值测定检出的指标均可接受，符合其临床分析性能要求。
2）阈值测定结果表明，依据扩增峰电泳长度计算得到的CAG重复数存在一定的计算误差，计算误差为±2。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，其特征在于，包括下游特异性引物P1、长引物P2、非人基因组引物P3及PCR反应试剂；各引物序列如下：
下游特异性引物P1：5’-FAM-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3’；
长引物P2：5’-TGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATACAGCAGCAGCAGCAG-3’；
非人基因组引物P3：5’-TGGACCCTGAAGTGTGCCGTTGATA-3’。
2.根据权利要求1所述的一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂为包括DNA聚合酶、10× PCR缓冲液、PCR增强剂及dNTP混合液的反应液I，或所述PCR反应试剂为包括DNA聚合酶，2× PCR 缓冲液及dNTP混合液的反应液II。
3.根据权利要求2所述的一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂为反应液II。
4.根据权利要求2所述的一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，其特征在于，所述反应液I中DNA聚合酶为5U/μL的TaKaRa LA Taq HS Polymerase，10× PCR缓冲液为25mM MgCl2，PCR增强剂为DMSO，dNTP混合液包括2.5mM dATP、2.5mM dTTP、2.5mM dCTP和2.5mM dGTP；所述反应液II中DNA聚合酶为0.5U/μL的TaKaRa LA Taq HS Polymerase，2×PCR 缓冲液为1.5mM MgCl2，dNTP混合液包括0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP和0.2mMdGTP。
5.根据权利要求2所述的一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂由如下含量的组分构成：
1~5μM下游特异性引物P1 1μL；
0.1~0.5μM长引物P2 1μL；
1~5μM非人基因组引物P3 1μL；
10× PCR缓冲液 3μL；
dNTP混合液 4μL；
DNA聚合酶 0.3μL；
PCR增强剂 1.5μL；
水 适量。
6.一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将样本加入到权利要求1~5任一项所述的检测试剂中进行PCR扩增反应，将PCR扩增反应产物采用毛细管电泳进行检测，将毛细管电泳结果转换成CAG重复数，根据CAG重复数判定样本中是否含有脊髓小脑共济失调SCA3型基因。
7.根据权利要求6所述的一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应包括两步扩增法或一步扩增法，所述两步扩增法包括如下步骤：
（1）采用样本、下游特异性引物P1和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，PCR扩增反应条件为：94℃预变性1 min，1循环；98℃变性10 s、60℃退火2 min、72℃延伸60 s，15循环；72℃延伸5 min，1循环；
（2）在步骤（1）扩增后的反应体系中再次加入下游特异性引物P1、长引物P2和非人基因组引物P3进行PCR扩增反应，PCR扩增反应条件为：94℃预变性1 min，1循环；98℃变性10 s、60℃退火2 min、72℃延伸60 s，35循环；72℃延伸5 min，1循环；
所述一步扩增法包括如下步骤：
采用样本、下游特异性引物P1、长引物P2、非人基因组引物P3和PCR反应试剂进行PCR扩增反应，PCR扩增反应条件为：94℃预变性1 min，1循环；98℃变性10 s、60℃退火2 min、72℃延伸60 s，35循环；72℃延伸5 min，1循环。
8.根据权利要求7所述的一种脊髓小脑共济失调SCA3型基因检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应为一步扩增法。
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