CN110157790A - 一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，该试剂盒包含了针对SLC22A5基因的12个SNP位点的特异性多重PCR引物对，所述引物对通过扩增能够包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP位点，所述特异性多重PCR引物对的核苷酸序列如SEQ NO.1～24所示，且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。本试剂盒利用多重PCR技术和SNaPshot微测序技术相结合的方法，可在一个反应内筛查与心脏结构和功能高度相关的SLC22A5基因的12个突变位点，大大节省了时间和经济成本。

Description

一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒
技术领域
本发明属于生物基因检测技术领域，具体涉及一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒。
背景技术
猝死(sudden death)是指机体潜在的疾病或重要器官急性功能障碍导致的急速、意外的自然性死亡。在全球，每年猝死人数占自然死亡人数的10％甚至更多，严重威胁着社区人群的生命安全。心脏性猝死(sudden cardiac death，SCD)是指由于心脏原因所致的突然死亡，约占全部猝死的50％，居猝死病因分布的首位。SCD主要病因有冠状动脉性心脏病、心肌炎、心肌病等，但在法医病理学实践中，部分猝死案例并无明显器质性病变，病因不明，被称之为不明原因猝死(sudden unexplained death，SUD)，其法医学死因鉴定已成为一个亟待解决的难题；同时，具有这类猝死风险的高危患者的筛选诊断问题也成为临床医学的难题。
目前针对SUD诊断领域的研究主要集中于探寻心脏离子通道病与重要离子通道蛋白编码基因以及与离子通道蛋白相互作用蛋白编码基因的突变与猝死的关联性。但有相当数量的SUD无法用心脏离子通道病来解释死因，其真正死因无法被揭示。例如一种遗传代谢性疾病——原发性肉碱缺乏症，在临床上较不常见，且临床表现不典型，可以以猝死为首发且唯一的表现。然而，在法医病理学及临床医学领域，对本病与恶性心律失常、猝死的关系均认识不足，未将本病列入SUD的病因诊断和筛查之列，造成部分SUD难于探寻到准确病因，给其死因鉴定及其高危近亲属的猝死防治带来困难。
原发性肉碱缺乏症(Primary Carnitine Deficiency Syndrome,CDSP)是SLC22A5基因突变导致新型有机阳离子转运体2(organic carnitine transporter 2，OCTN2)功能缺陷所致的一种脂肪酸β氧化代谢疾病，遗传方式为常染色体隐性遗传。CDSP临床表现个体差异大，主要表现为代谢异常(低酮型低血糖、高血氨等)、心肌受累(心肌病、心律失常等)、肌无力、肝肿大等，非典型表现包括发育迟缓、易疲劳甚至猝死等。其中心脏是CDSP患者最易受累的器官，因此CDSP所引起的猝死大多是SCD，且可先于器质性心脏病变出现，这种情况下，如死者生前无明显临床症状，又未确诊为CDSP，真正死因很难被发现。
CDSP是为数不多可治疗的遗传性代谢疾病，SLC22A5基因突变为目前唯一已知病因，多数患者在婴幼儿期确诊，血浆游离肉碱浓度明显下降(参考值：>10μM)即可确诊，存在SLC22A5基因突变可辅助诊断。目前唯一且有效的治疗方法为口服左旋肉碱，需终身服药。因此通过早期SLC22A5基因筛查来规避本病导致的不良后果(特别是猝死)就显得尤为重要。但我国目前并未将本病列入产前筛查及新生儿筛查常规项目，这就给本病患者带来了极大的健康及生命安全隐患。
现有猝死分子病医学诊断及筛查试剂盒不能发现CDSP这一病因引起的不明原因猝死的分子病因；且绝大多数的筛查试剂盒对猝死病因诊断的精确性不够(只筛查多态位点)，未定位到引起猝死的遗传突变。现有猝死分子病因学诊断及筛查试剂盒主要针对心脏离子通道及其相互作用蛋白编码基因的筛查，没有包括CDSP相关致病基因的检测；且绝大部分猝死筛查试剂盒仅针对多态位点进行检测，未精确定位致病性突变的检测。
因此，为了协助早期治疗CDSP、预防SCD和完善猝死易感性风险评估体系，开发相关快速基因突变检测试剂盒是亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种心脏性猝死快速基因筛查试剂盒，本试剂盒是基于与心脏结构、功能相关的SLC22A5基因的12个变异点作为不明原因猝死筛查的位点，设计了引物混合物，实现了多位点的基因扩增。本方法采用多重PCR技术和SNaPshot微测序技术相结合的方法来解决位于SLC22A5基因上SCD相关的12个突变位点的检测问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，包含针对SLC22A5基因的12个SNP位点的特异性多重PCR引物对，所述引物对通过扩增能够包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP位点，所述特异性多重PCR引物对的核苷酸序列如SEQ NO.1～24所示，且所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。
进一步地，所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，包含检测SLC22A5基因的12个SNP位点，所述SNP位点的rs编号表1所示：
表1：SLC22A5基因的12个SNP位点
序号 氨基酸突变类型 rs编号
1 F17L rs11568520
2 N32S rs72552725
3 P46S rs202088921
4 C113Y 727504159
5 W132X r886041277
6 R254X rs121908893
7 V275X rs765954398
8 S280F rs386134209
9 W283C rs386134211
10 R289X rs756260416
11 Y396X rs756015838
12 S467C rs60376624
进一步地，所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，扩增SLC22A5基因12个SNP位点特异性PCR多重引物对的核苷酸序列如表2所示：
表2：SLC22A5基因的12个SNP位点的特异性多重引物对
进一步地，所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其SNP的SNaPshot单碱基延伸引物的核苷酸序列如表3所示。
表3：SLC22A5基因的12个SNP位点的SNaPshot单碱基延伸引物
rs编号 延伸引物序列(5'to3') 序列号
rs11568520 gagcaggaagaagatgaggcgctg SEQ NO.25
rs72552725 tgactgactgactgactgactacggaggacaggccggtgaagcca SEQ NO.26
rs20208892 gactgacttgtcctccgtgttcctgatagcgacc SEQ NO.27
rs727504159 tgactgactgactgactgactgactgactgaactcccagccatccaga SEQ NO.28
rs886041277 gactgactgactgactgactgactgactgactgactccagtcgtcctcacacaccaggttc SEQ NO.29
rs121908893 gactcgccaccagcagcatccgccagtctc SEQ NO.30
rs765954398 ctgactgactgactgactgactgactgactgactgggtgctatgcgtggcactctggt SEQ NO.31
rs386134209 gactgactgactgactgactgactgactgactgactgacttccctgagagatgagccatcggggg SEQ NO.32
rs386134211 tgactgactgactgagtttcatccctgagtccccccgatg SEQ NO.33
rs756260416 gactgactgactgactgactgactgactgactccgatggctcatctctcagggac SEQ NO.34
rs756015838 actgactgactgactgactgactgactgaagcagttcacaaagatgtcccca SEQ NO.35
rs60376624 actgactgactgactgacttgctgcccaggcgggatgctgtg SEQ NO.36
进一步地，所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTP混合液、Taq酶和超纯水。
进一步地，应用所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒进行PCR扩增的反应体系为10μl，所述反应体系包括1μl的DNA模板、1μl引物混合物、5μl的2×Taq PCR预混液、3μl超纯水。
进一步地，应用所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒进行PCR扩增的程序如下：
95℃，3min预变性；
95℃，30sec变性，56℃，30sec退火，72℃，30sec，复性，热循环45次；
72℃，2min，延伸。
进一步地，应用所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒进行SNaPshot单碱基延伸的反应体系为5μl，所述反应体系为0.5μl SNaPshot Mix、3μl多重PCR反应纯化产物、1μl的单碱基延伸引物、0.5μl超纯水。
进一步地，应用所述不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒进行SNaPshot单碱基延伸的反应程序如下：
95℃，2min预变性；
95℃，10sec；52℃，5sec；60℃，30sec，共40个循环；
4℃forever。
本发明的有益效果：本试剂盒综合检测与分析受检人群是否携带与心脏结构和功能高度相关的SLC22A5基因突变，及时筛查出具猝死风险的CDSP患者，给予临床干预，避免SCD的发生，弥补了现有试剂盒仅针对于心脏离子通道及其相互作用蛋白编码基因筛查诊断的局限性。
本发明的试剂盒操作简便，节约成本。目前临床上对SLC22A5基因的检测多采用全外显子组测序，无目的性，价格昂贵。本试剂盒利用多重PCR技术和SNaPshot微测序技术相结合的方法，可在一个反应内筛查与心脏结构和功能高度相关的SLC22A5基因的12个突变位点，大大节省了时间和经济成本。
附图说明
图1为应用实施例中该家系中成员外周血样本的sanger测序SLC22A5基因1种突变峰图；
图2为应用实施例中健康人群Sanger测序SLC22A5基因峰图；
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1本发明试剂盒的操作步骤
1、Multiplex PCR及其产物纯化处理：
(1)多重PCR反应
以样本中提取的DNA为模板，通过Thermal Cycler2720PCR仪进行多重PCR反应，获得Multiplex PCR产物；所述样本包括健康个体构成的对照组、CDSP可疑家系构成的CDSP组。
所述样本中提取DNA的方法为：采用TIANGEN TGuide M16自动核酸提取仪(OSE-M16)，配合TIANGE TGuide大体积血液基因组DNA提取试剂盒(1-3ml)提取人体静脉血DNA，对于提取的DNA按照光密度值法进行分析，确定基因组DNA的浓度。
多重PCR体系包含如SEQ NO.1～24所示的12对引物，体系组成成分如下：
2×Taq PCR Master Mix 5μl
Primer Mix 1ul
DNA template 1μl
ddH<sub>2</sub>O 3ul
多重PCR体系的扩增程序如下：
(2)多重PCR产物纯化
采用虾碱酶纯化法：虾碱酶MIX(EX-SAP)的主要功能成分为SAP及ExoI，SAP酶将残余dNTPs去磷酸化，ExoI降解游离单链引物。
多重PCR产物纯化处理的组成成分，其纯化体系如下：
消化体系组分 体积(ul)
ddH<sub>2</sub>O 0.75
SAP(1U/ul) 0.5
ExoI(5U/ul) 0.15
10×SAP buffer 0.6
PCR产物 4
总体积 6
纯化步骤：将上述纯化体系在PCR仪上进行消化孵育，其条件为：37℃，40min后85℃，5min。
2、SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)及其纯化处理：
(1)SNaPshot单碱基延伸反应(SBE)：对Multiplex PCR产物通过如SEQ NO.25～36所示的引物进行SNaPshot单碱基延伸反应。
SNaPshot单碱基延伸反应的组成成分，体积和扩增程序如下：
SBE体系如下：
组分 体积(ul)
SNaPshot Mix 0.5
Pooled PCR Products 3
Pooled Primers 1
dH<sub>2</sub>O 0.5
总体积 5
SBE反应程序：95℃2min→(95℃10sec→52℃5sec→60℃30sec)×40循环→4℃forever
(2)SBE产物纯化：
向SBE反应产物中加入2ul SAP Mix，配制组分如下：
组分 体积(ul)
水 0.9
SAP(1U/ul) 0.5
10×SAP buffer 0.6
总计 2
在PCR仪上，程序：37℃40min→75℃15min。
3、SNaPshot单碱基延伸产物的结果分析：取2ul消化后的SBE反应产物加入到8ul含有0.4％LIZ120的去离子甲酰胺中，95℃变性5min，然后放置-20℃骤冷后利用ABI3730进行测序，完成对延伸引物的检测。
实施例2应用实施例
为了检测本试剂盒的应用效能，对不明原因猝死死者1名，经常规基因检测未发现携带重要离子通道蛋白编码基因以及与离子通道蛋白相互作用蛋白编码基因突变，及其他任何已证实为猝死相关基因突变。经本试剂盒检测，结果显示死者携带SLC22A5突变p.F17L与p.R254X。经了解家族史发现家族中另存在2名不明原因猝死者，高度怀疑为CDSP家系，提示死者真正死因可能为CDSP。利用本试剂盒检测上述CDSP疑似家系共20人和健康人群的外周血样本。
检测结果：该家系中20名家族成员外周血样本均出现阳性结果，提示均携带至少一种SLC22A5基因变异。附图1为该疑似CDSP家系中，经本试剂盒检测后，发现携带一杂合突变(图中箭头所示)。附图2为健康人群样本测序结果，经本试剂盒检测后，未检测到SLC22A5基因的突变，均为纯合野生型。
经后续临床检查，有3名成员出现血游离肉碱浓度下降，其中1名心电图检查表现为早期复极综合征，其他2名出现血游离肉碱浓度显著下降，心电图结果均表现为短QT综合征，临床确诊为CDSP。上述3名成员在接受临床治疗后，血游离肉碱水平维持在正常水平，心电图异常改变消失。
在本应用实例中，该家系2名血游离肉碱浓度显著下降的成员虽无器质性病变，却已出现短QT综合征的心电图改变，短QT综合征与SCD高度相关，结合猝死家族史，此2名家族成员有高度猝死风险，使用本试剂盒进行筛查后，及时接受临床治疗，避免了这一不良后果的发生。
以上所述实施方式仅表达了本发明的其中一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒
<130> 2019.4.9
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<170> PatentIn version 3.3
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gactgactga ctgactgact gactgactga ctgactgact tccctgagag atgagccatc 60
ggggg 65
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
tgactgactg actgagtttc atccctgagt ccccccgatg 40
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
gactgactga ctgactgact gactgactga ctccgatggc tcatctctca gggac 55
<210> 35
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
actgactgac tgactgactg actgactgaa gcagttcaca aagatgtccc ca 52
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
actgactgac tgactgactt gctgcccagg cgggatgctg tg 42

Claims (10)

1.一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对SLC22A5基因的12个SNP位点的特异性多重PCR引物对，所述引物对通过扩增能够包含不同SNP的扩增子，每段扩增子至少含有一个SNP位点，所述特异性多重PCR引物对的核苷酸序列如SEQ NO.1～24所示；所述试剂盒还包含SNP的SNaPshot单碱基延伸引物。
2.如权利要求1所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，所述SNP位点的rs编号如下：rs11568520、rs72552725、rs202088921、727504159、r886041277、rs121908893、rs765954398、rs386134209、rs386134211、rs756260416、rs756015838、rs60376624。
3.如权利要求2所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，扩增SLC22A5基因rs11568520位点的上游引物序列如SEQ NO.1所示，下游引物序列如SEQ NO.2所示；
扩增SLC22A5基因rs72552725位点的上游引物序列如SEQ NO.3所示，下游引物序列如SEQ NO.4所示；
扩增SLC22A5基因rs202088921位点的上游引物序列如SEQ NO.5所示，下游引物序列如SEQ NO.6所示；
扩增SLC22A5基因727504159位点的上游引物序列如SEQ NO.7所示，下游引物序列如SEQ NO.8所示；
扩增SLC22A5基因r886041277位点的上游引物序列如SEQ NO.9所示，下游引物序列如SEQ NO.10所示；
扩增SLC22A5基因rs121908893位点的上游引物序列如SEQ NO.11所示，下游引物序列如SEQ NO.12所示；
扩增SLC22A5基因rs765954398位点的上游引物序列如SEQ NO.13所示，下游引物序列如SEQ NO.14所示；
扩增SLC22A5基因rs386134209位点的上游引物序列如SEQ NO.15所示，下游引物序列如SEQ NO.16所示；
扩增SLC22A5基因rs386134211位点的上游引物序列如SEQ NO.17所示，下游引物序列如SEQ NO.18所示；
扩增SLC22A5基因rs756260416位点的上游引物序列如SEQ NO.19所示，下游引物序列如SEQ NO.20所示；
扩增SLC22A5基因rs756015838位点的上游引物序列如SEQ NO.21所示，下游引物序列如SEQ NO.22所示；
扩增SLC22A5基因rs60376624位点的上游引物序列如SEQ NO.23所示，下游引物序列如SEQ NO.24所示.
4.如权利要求2所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，所述SNP的SNaPshot单碱基延伸引物核苷酸序列如SEQ NO.25～36所示。
5.如权利要求4所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，所述rs386134211位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.25所示；所述rs72552725位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.26所示；所述rs202088921位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.27所示；所述rs727504159位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.28所示；所述rs886041277位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.29所示；所述rs121908893位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.30所示；所述rs765954398位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.31所示；所述rs386134209位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.32所示；所述rs386134211位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.33所示；所述rs756260416位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.34所示；所述rs756015838位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.35所示；所述rs60376624位点的SNaPshot单碱基延伸引物序列如SEQ NO.36所示。
6.如权利要求1-5任一项所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTP混合液、Taq酶和超纯水。
7.如权利要求6所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，应用所述试剂盒进行PCR扩增的反应体系为10μl，所述反应体系包括1μl的DNA模板、1μl引物混合物、5μl的2×Taq PCR预混液、3μl超纯水。
8.如权利要求7所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，应用所述试剂盒进行PCR扩增的程序如下：
95℃，3min预变性；
95℃，30sec变性，56℃，30sec退火，72℃，30sec，复性，热循环45次；
72℃，2min，延伸。
9.如权利要求6所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，应用所述试剂盒进行SNaPshot单碱基延伸的反应体系为5μl，所述反应体系包括0.5μlSNaPshot Mix、3μl多重PCR反应纯化产物、1μl的单碱基延伸引物、0.5μl超纯水。
10.如权利要求9所述的不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒，其特征在于，应用所述试剂盒进行SNaPshot单碱基延伸的反应程序如下：
95℃，2min预变性；
95℃，10sec；52℃，5sec；60℃，30sec，共40个循环；
4℃ forever。
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