CN114317714A - 用于检测slc22a5基因九种高频致病变异的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,所述试剂盒包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点(含九种变异)的引物、针对所述变异位点的MGB探针、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料;所述引物的序列如SEQ ID NO.1‑16所示,所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17‑33所示。本发明的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,既可以使用人基因组DNA溶液作为模板,也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测,适合在临床推广;采用本发明的试剂盒,能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体来说,涉及一种用于检测SLC22A5 基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。
背景技术
原发性肉碱缺乏症(Primary Carnitine Deficiency,简称PCD)是一种常染色体隐性遗传病,其临床特点为肉碱代谢出现异常。该病的致病基因为编码有机阳离子转运2型(OCTN2)的SLC22A5基因。
目前国内外对于原发性肉碱缺乏症筛查方法有全基因组Sanger测序、串联质谱、临床检查。其中全基因的测序费用过高,很难满足目前临床实际需求。
相比较而言,荧光PCR是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段,准确度较高,但目前还没有专门针对SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题,本发明提出一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物和探针,包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点(含九种变异)的引物以及针对所述变异位点的MGB探针,所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16 所示,所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示。
进一步地,所述探针的5'端均标记荧光基团,所述探针的3'端均标记MGB。
进一步地,所述荧光基团包括FAM、VIC、NED、CY5。
进一步地,所述SLC22A5基因九种高频致病变异为 NM_003060.3(SLC22A5):c.760C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.428C>T、 NM_003060.3(SLC22A5):c.338G>A、NM_003060.3(SLC22A5):c.1195C>T、 NM_003060.3(SLC22A5):c.51C>G、NM_003060.3(SLC22A5):c.51A>G、 NM_003060.3(SLC22A5):c.844C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.797C>T及 NM_003060.3(SLC22A5):c.1400C>G。
根据本发明的另一方面,提供了一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒,包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物、针对所述变异位点的MGB探针、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料;所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示,所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示。
进一步地,所述试剂盒的检测反应包含8个PCR反应,所述8个PCR 反应分别在独立的PCR管中进行。
进一步地,当DNA模板中含有所述九种高频致病变异的任何一种时,对应的反应孔中FAM和VIC双通道都出现明显的扩增曲线,且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0。
进一步地,对于野生型的位点,对应的反应孔中仅能观察到VIC通道出现明显的扩增曲线,且FAM通道无明显扩增曲线,或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
进一步地,当所述八个高频变异位点中某一个位点为纯合突变时,对应的反应孔中FAM通道出现明显的扩增曲线,且VIC通道无明显扩增曲线,或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
本发明的有益效果:本发明的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,既可以使用人基因组DNA溶液作为模板,也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测,省去了DNA提取的过程;该反应体系的探针/引物群经过优化,同一反应管内可以容纳最多两个等位基因,且等位基因之间的扩增效率差异达到最大化,使实验人员可以方便准确的解读结果,不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析;该反应体系即适用于Ct值的判读,也可以使用终点法进行判读;该反应体系可以覆盖95%以上的患者,并且覆盖80%以上的已知致变异位点。相较于NGS和其他检测手段,荧光定量PCR的成本低廉,准确性得到公认,适合在临床推广;采用本发明的试剂盒,能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例所述的使用野生型人DNA作为模板得到的实验结果;
图2是根据本发明实施例所述的使用纯合突变的质粒DNA作为模板得到的实验结果;
图3是根据本发明实施例所述的使用杂合型DNA作为模板得到的实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物和探针,包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点(含九种变异)的引物以及针对所述变异位点的MGB探针,所述引物的序列如表1所示,所述 MGB探针的序列如表2所示。
表1:针对高频致病变异位点的引物(51位点涵盖两类变异)
表2:针对高频致病变异位点的探针(51位点涵盖两类变异)
所述SLC22A5基因八个高频致病变异位点如表3所示。
表3:高频致病变异位点
以上八个变异位点的致病性明确,且在携带者和患者中的出现频次较高,根据文献调研,在明确基因型的111名PCD患者中,以上八个位点的等位基因覆盖率可以达到80.18%,(178/222),患者检出率可以达到95.50% (106/111),如表4-5所示。
表4:等位基因覆盖率计算(患者111人,等位基因222个)
变异位点 | 变异出现频次 | 单个位点覆盖率 |
NM_003060.3(SLC22A5):c.760C>T | 25 | 11.26% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.428C>T | 10 | 4.50% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.338G>A | 8 | 3.60% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.1195C>T | 9 | 4.05% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.51C>G | 18 | 8.11% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.844C>T | 1 | 0.45% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.51A>G | 15 | 6.76% |
NM_003060.3(SLC22A5):c.797C>T | 5 | 2.25% |
NM_003060(SLC22A5):c.1400C>G | 87 | 39.19% |
合计 | 178 | 80.18% |
表5:患者检出率计算(患者111人)
本发明还提供了一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒,包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物、针对所述变异位点的MGB探针、高效DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系(适用于高GC)及用于校准反应液体积的ROX参比荧光染料;所述引物的序列如表1所示,所述MGB探针的序列如表2所示。
该试剂盒的检测反应包含8个PCR反应,分别在独立的PCR管中进行。当DNA模板中含有表1九种变异的任何一种时,可以在对应的反应孔中观察到FAM和VIC双通道都出现了明显的扩增曲线,且FAM通道和 VIC通道的Ct值差距不大于1.0;对于其他为野生型的位点,其反应孔中仅能观察到VIC通道出现明显的扩增曲线,且FAM通道无明显扩增曲线,或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0;当以上八个位点中某一个位点为纯合突变时,可以观察到对应反应孔中FAM通道出现明显的扩增曲线,且VIC通道无明显扩增曲线,或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
采用本发明的试剂盒对待测样本进行检测时,单个PCR管的试剂配置如表6-8所示。
表6:单个PCR管的试剂配置(单SNP位点)
组分 | 体积ul | 终浓度 |
primer F(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
primer R(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
TaqMan Probe WT(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
TaqMan Probe MT(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
Qpcr反应缓冲液 | 10 | |
模板(DNA溶液) | 2 | |
Rnase-free ddH2O | 3.6 | |
total volume | 20 |
表7:单个PCR管的试剂配置(双SNP位点)
表8:单个PCR管的试剂配置(单SNP位点三个探针)
组分 | 体积ul | 终浓度 |
primer F1(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
primer R1(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
TaqMan Probe WT1(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
TaqMan Probe MT1(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
TaqMan Probe WT2(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
Qpcr反应缓冲液 | 10 | |
模板(DNA溶液) | 2 | |
Rnase-free ddH2O | 3.2 | |
total volume | 20 |
扩增程序如表9所示。
表9:扩增程序
实施例1
采用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因八个高频致病变异位点,当使用野生型人DNA作为模板时,检测结果如表10及图1所示。
表10:野生型人DNA检测结果
A1-A6孔为野生型人DNA,A7为纯化水的空白对照。在A1-A3的反应体系中含有两对探针/引物,可以同时检测两个SNP位点。由于797位点存在两种野生型的碱基,因此需要三个探针进行区别。FAM和NED代表两种野生型探针,VIC代表突变型探针。在以上反应程序中,阈值线设为0.3。
由检测结果可见,代表野生型位点的FAM和NED通道均有明显的S型扩增曲线,Ct平均值为35.02,变异系数CV=1.68%。代表突变位点的VIC和 CY5通道未检测到扩增曲线和Ct值。
实施例2
采用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因八个高频致病变异位点,当使用纯合突变的质粒DNA作为模板(10^5稀释)时,检测结果如表11及图2 所示。
表11:纯合突变的质粒DNA检测结果
B1-B6孔为合成的带有突变位点的质粒DNA,B6为纯化水的空白对照。在B1-B3的反应体系中含有两对探针/引物,可以同时检测两个SNP位点。由于797位点存在两种野生型的碱基,因此需要三个探针进行区别。质粒稀释 10^5倍使用。在以上反应程序中,阈值线设为0.3。
由检测结果可见,代表突变型位点的VIC和CY5通道均有明显的S型扩增曲线,Ct平均值为25.42,变异系数CV=1.10%。代表野生型位点的FAM和 NED通道未检测到扩增曲线和Ct值。
实施例3
采用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因八个高频致病变异位点,将带有野生型基因位点的质粒和带有突变基因位点的质粒1:1等比例混合后,作为杂合型DNA作为模板使用(10^5稀释)时,检测结果如表12及图3所示。
表12:杂合型DNA检测结果
C1-C6孔为含有1:1等比例混合的两种基因型质粒DNA,C7为纯化水的空白对照。在C1-C3的反应体系中含有两对探针/引物,可以同时检测两个SNP位点。由于797位点存在两种野生型的碱基,因此需要三个探针进行区别。质粒稀释10^5倍使用。在以上反应程序中,阈值线设为0.3。
由检测结果可见,除空白对照以外,代表突变位点的VIC和CY5通道以及代表野生型位点的FAM和NED通道均有明显的S型扩增曲线。突变型荧光通道的Ct值和野生型荧光通道的Ct值差距均小于1.0。
综上所述,借助于本发明的上述技术方案,本发明的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒,既可以使用人基因组DNA溶液作为模板,也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测,省去了DNA提取的过程;该反应体系的探针/引物群经过优化,同一反应管内可以容纳最多两个等位基因(5个管内检测9个位点),且等位基因之间的扩增效率差异达到最大化,使实验人员可以方便准确的解读结果,不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析;该反应体系即适用于Ct值的判读,也可以使用终点法进行判读;该反应体系可以覆盖95%以上的患者,并且覆盖80%以上的已知致变异位点。相较于NGS和其他检测手段,荧光定量PCR的成本低廉,准确性得到公认,适合在临床推广;采用本发明的试剂盒,能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华诺奥美基因医学检验实验室有限公司
<120> 用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgagtccccc cgatg 15
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccttccagc gcctcatctt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccttgcagc gcctcatctt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tggagcagga gagctgtctg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggagcagga gagctctctg 20
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctggaaggcc ctact 15
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actggaaggc cccac 15
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgccagtctc agat 14
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tccgccagtc tcgga 15
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aatatttgcc ctggcgc 17
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aatatttgcc ccggcg 16
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgacgatgcc gggggt 16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgacgatgct gggggt 16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgacgatgcg gggggt 16
Claims (9)
1.一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物和探针,其特征在于,包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物以及针对所述变异位点的MGB探针,所述八个高频致病变异位点含九种变异,所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示,所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针,其特征在于,所述探针的5'端均标记荧光基团,所述探针的3'端均标记MGB。
3.根据权利要求2所述的引物和探针,其特征在于,所述荧光基团包括FAM、VIC、NED、CY5。
4.根据权利要求1所述的引物和探针,其特征在于,所述SLC22A5基因九种高频致病变异为NM_003060.3(SLC22A5):c.760C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.428C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.338G>A、NM_003060.3(SLC22A5):c.1195C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.51C>G、NM_003060.3(SLC22A5):c.51A>G、NM_003060.3(SLC22A5):c.844C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.797C>T及NM_003060.3 (SLC22A5):c.1400C>G。
5.一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于,包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物、针对所述变异位点的MGB探针、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料;所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示,所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的检测反应包含8个PCR反应,所述8个PCR反应分别在独立的PCR管中进行。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,当DNA模板中含有所述九种高频致病变异的任何一种时,对应的反应孔中FAM和VIC双通道都出现明显的扩增曲线,且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,对于野生型的位点,对应的反应孔中仅能观察到VIC通道出现明显的扩增曲线,且FAM通道无明显扩增曲线,或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,当所述八个高频致病变异位点中的一个位点为纯合突变时,对应的反应孔中FAM通道出现明显的扩增曲线,且VIC通道无明显扩增曲线,或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
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CN110157790A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-08-23 | 中山大学 | 一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒 |
CN113215243A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-06 | 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司 | 一种用于检测slc22a5基因高频致病变异的荧光定量pcr探针引物组和试剂盒 |
-
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CN113215243A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-06 | 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司 | 一种用于检测slc22a5基因高频致病变异的荧光定量pcr探针引物组和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
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YANGHUI ZHANG等: "Molecular investigation in Chinese patients with primary carnitine deficiency", MOL GENET GENOMIC MED, vol. 7, no. 9, pages 901 * |
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