CN113416779B - 一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒 - Google Patents

一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113416779B
CN113416779B CN202110832360.8A CN202110832360A CN113416779B CN 113416779 B CN113416779 B CN 113416779B CN 202110832360 A CN202110832360 A CN 202110832360A CN 113416779 B CN113416779 B CN 113416779B
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
equal
concentration
value
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110832360.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113416779A (zh
Inventor
曾亚平
赖楚明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd filed Critical Shenzhen Tianda Biological Medical Equipment Co ltd
Priority to CN202110832360.8A priority Critical patent/CN113416779B/zh
Publication of CN113416779A publication Critical patent/CN113416779A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113416779B publication Critical patent/CN113416779B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因多态性检测技术领域，具体涉及一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测C667T位点多态性的引物和探针组合，PCR反应液以及样品稀释液。所述样品稀释液具有稀释DNA样本的作用，同时还能降低DNA检出限。本发明提供的样品稀释液为二甲基亚砜与烷基酰胺配制得到的水溶液，其中，二甲基亚砜浓度为0.01‑0.1mg/mL，烷基酰胺浓度为0.1‑0.3mg/mL。本发明提供的试剂盒检出限最低达到0.4ng/μL，使以唾液或者尿液作为样本直接进行基因分型检测成为可能。

Description

一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
技术领域
本发明属于基因多态性检测技术领域，具体涉及一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒及检测方法。
背景技术
叶酸，又称为维生素B9，在DNA合成、DNA甲基化等方面发挥重要作用，是细胞增殖、组织生长与机体发育不可缺少的营养素。由于机体叶酸摄入量不足，或者因为遗传缺陷导致机体对叶酸利用能力低下，均会导致细胞周期不正常，蛋白质甲基化异常，导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人发生癌症或者心血管疾病。经验证，亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸是体内物质合成的间接甲基供体。MTHFR基因一旦发生缺陷，将导致机体多个基础生化过程紊乱，尤其是对于孕妇人群会引起胎儿神经管缺陷。
MTHFR C667T位点的基因型包括野生型(677CC型)、野生突变杂合型(677CT型)和突变型(677TT型)。C677T位点突变会导致酶对热不耐受使酶的活性降低，与CC型个体相比，CT型个体酶活性只有65％，TT型个体酶活性只有30％。因此，MTHFR C667T位点基因分型检测可提示有突变型等位基因的人群及时补充叶酸，降低由于叶酸不足导致的5-甲基四氢叶酸合成不足的脑卒中等心脑血管病的风险，为个体化增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学依据。
专利文献202010942972.8公开了一种检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法，所述方法针对C677T位点分别设计了野生型和突变型的引物和探针，使用qPCR技术扩增C677T位点的野生型目的片段和突变型目的片段。再如，专利文献202011546979.4公开了一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合，所述方法针对MTHFR基因多态性在其677和1298位点设计特异性引物，并且选用和MTHFR基因在同一条染色体上的RPAP2基因作为内参基因。虽然上述两种方法披露的对MTHFR基因突变的检测准确率均为100％，但是检测方法检测限高。
对于一些DNA含量较低的样本，如唾液或者尿液等，现有公开的试剂盒由于检出限较高对上述样本无法进行直接检测。为了改善现有技术的缺陷，本发明提供一种人MTHFR基因C677T位点多态性检测试剂盒，所述试剂盒检测限低，使以唾液或者尿液作为样本直接进行基因分型检测成为可能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合，本发明的另一个目的是提供一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒及其试剂盒的应用方法。
第一方面，本发明提供一种用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合，其特征在于，包括：如SEQ ID No.1-2所示的MTHFR基因C667T正向扩增引物和MTHFR基因C667T反向扩增引物，以及如SEQ IDNo.3所示的MTHFR基因C667C探针，如SEQ ID No.4所示的MTHFR基因C667T探针。
优选的，所述用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合还包括：如SEQ ID No.5-6所示的内参正向扩增引物和内参反向扩增引物，以及如SEQ ID No.7所示的内参探针。
MTHFR基因C667T正向扩增引物5’-CTCAAAGAAAACTGCGTGA-3’
MTHFR基因C667T反向扩增引物5’-AGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3’
MTHFR基因C667C探针5’-TGAAATCGGCTCCCGC-3’
MTHFR基因C667T探针5’-TGAAATCGACTCCCGC-3’。
内参正向扩增引物5’-ACCTCTGACCATCCTTCCCA-3’
内参反向扩增引物5’-GGAAGTTGTCAAAGATGGTGCC-3’
内参探针5’-CATCCTCCAGGTCAAG-3’。
优选的，上述探针的5’端分别标记不同的荧光基团，3’端标记MGB。本发明对于荧光基团的种类没有特殊限制，本领域常用荧光基团即可。在本发明的优选实施方式中，所述探针的5’端标记FAM荧光基团、VIC荧光基团或者ROX荧光基团。
第二方面，本发明提供一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如上所示的引物和探针组合，以及PCR反应液。
优选的，所述引物和探针的浓度为0.1-1μmol/L，所述PCR反应液中MgCl2终浓度为1.5-2.0mM，dNTPs终浓度为100-200nM，热启动DNA聚合酶浓度为1-2U/反应。
优选的，所述引物的浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.5μmol/L。
优选的，所述MgCl2终浓度为1.5mM。
优选的，所述dNTPs终浓度为100nM。
优选的，所述热启动DNA聚合酶浓度为2U/反应。
优选的，所述试剂盒中还包括样品稀释液，所述样品稀释液为二甲基亚砜与烷基酰胺配制得到的水溶液，其中，二甲基亚砜浓度为0.01-0.1mg/mL，烷基酰胺浓度为0.1-0.3mg/mL。
更优选的，所述二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，烷基酰胺浓度为0.1mg/mL。
所述烷基酰胺为甲酰胺、乙酰胺、烷基酰胺甜菜碱、N、N-双羟乙基烷基酰胺中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述烷基酰胺为烷基酰胺甜菜碱或者N、N-双羟乙基烷基酰胺。
在本发明的优选实施方式中，所述烷基酰胺为N、N-双羟乙基烷基酰胺。
第三方面，本发明提供一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒的应用方法，所述方法包括如下步骤：
(1)DNA提取：从待测样本中提取基因组DNA，浓度为0.4-10ng/μL；
(2)以提取的基因组DNA作为模板进行荧光PCR扩增；
(3)根据扩增曲线的CT值判断MTHFR C667T位点的基因型，具体结果判读参考下表。
表1MTHFR C667T位点基因分型结果对照表
型别 CT值
野生型 C667C探针22≤CT值≤35；C667T探针CT值≥35；内参探针CT值≤35
突变型 C667C探针CT值≥35；C667T探针19≤CT值≤35；内参探针CT值≤35
杂合型 C667C探针22≤CT值≤35；C667T探针19≤CT值≤35；内参探针CT值≤35
实验失败 内参探针CT值≥35
优选的，所述待测样本为全血、唾液或者尿液。
标准对照的MTHFR型质粒可用于校正外部条件造成的实验误差。本发明对荧光PCR反应后的结果判定简单易操作，仅根据扩增曲线的CT值来判断基因分型。
优选的，本发明确定的荧光PCR扩增最佳反应条件如下所示：
表2荧光PCR扩增最佳反应条件
Figure GDA0004197853700000041
本发明提供的一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒具有如下优势：(1)采用荧光PCR技术，实现在同一检测管内检测同一SNP的两个基因分型，大大节约了成本并节省了时间；(2)简便快速、耗时短，只需简单的加样上机，整个过程操作时间在2h内，步骤少；(3)特异性好，本发明中使用的探针为MGB修饰探针，对SNP的区分能力强，荧光背景低；(4)均相检测、闭管操作，本发明为均相检测体系，添加模板后PCR扩增在封闭的反应管中完成，无需PCR后续操作，减少了气溶胶污染的几率；(5)现有公开的或市售的人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒最低检出限均≥1ng/μL，本发明在常规试剂盒的基础上增加了样本稀释液，发明人预料不到的发现，在样品稀释液中加入烷基酰胺甜菜碱或者N、N-双羟乙基烷基酰胺具有降低DNA检测限的功效，最低使DNA检出限达到0.4ng/μL。本发明的技术方案对DNA含量较低的体液样本如唾液或者尿液进行MTHFR基因C667T位点多态性检测奠定了基础。
本发明涉及的核苷酸序列具体如下：
SEQ ID NO:1CTCAAAGAAAACTGCGTGA
SEQ ID NO:2AGCAGGGAGCTTTGAGGCTG
SEQ ID NO:3TGAAATCGGCTCCCGC
SEQ ID NO:4TGAAATCGACTCCCGC
SEQ ID NO:5ACCTCTGACCATCCTTCCCA
SEQ ID NO:6GGAAGTTGTCAAAGATGGTGCC
SEQ ID NO:7CATCCTCCAGGTCAAG
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1引物和探针组合
本发明提供一种用于检测人MTHFR基因C667T位点多态性的引物和探针组合，序列如下：
MTHFR基因C667T正向扩增引物5’-CTCAAAGAAAACTGCGTGA-3’
MTHFR基因C667T反向扩增引物5’-AGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3’
MTHFR基因C667C探针VIC-TGAAATCGGCTCCCGC-MGB
MTHFR基因C667T探针FAM-TGAAATCGACTCCCGC-MGB。
内参正向扩增引物5’-ACCTCTGACCATCCTTCCCA-3’
内参反向扩增引物5’-GGAAGTTGTCAAAGATGGTGCC-3’
内参探针ROX-CATCCTCCAGGTCAAG-MGB
实施例2人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合和PCR反应液。具体的，所述引物和探针组合如下表所示：
表3引物和探针浓度
C667T正向扩增引物 0.1μmol/L
C667T反向扩增引物 0.1μmol/L
C667C探针 0.1μmol/L
C667T探针 0.1μmol/L
内参正向扩增引物 0.3μmol/L
内参反向扩增引物 0.3μmol/L
内参探针 0.5μmol/L
所述PCR反应液浓度如下表所示：
表4PCR反应液浓度
PCR缓冲液 1×
dNTPs 100nM
MgCl2 1.5mM
Taq酶 2U
实施例3人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合、PCR反应液和样品稀释液。其中，引物和探针组合、PCR反应液与实施例2所示的试剂盒相同，样品稀释液为二甲基亚砜与N、N-双羟乙基烷基酰胺使用双蒸水配置得到的水溶液，其中二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，N、N-双羟乙基烷基酰胺浓度为0.1mg/mL。
实施例4引物、探针及PCR反应液浓度优化
选取MTHFR 677野生型血液样本20例、杂合型血液样本20例、突变型血液样本20例。上述样本均为人EDTA抗凝全血，各样本均由一代基因测序确定基因分型。使用本领域熟知的方法提取样本中的DNA，使用双蒸水作为溶剂稀释DNA使浓度为10ng/μL，分别采用实施例2和实施例3所示的试剂盒进行检测，以提取的DNA作为模板进行荧光PCR扩增，获得扩增曲线，根据扩增曲线的CT值判断MTHFR C667T位点的基因型。
所述引物和探针浓度如表5所示，PCR反应液中各成分浓度如表6所示，利用正交试验方法优选得到的引物和探针最优选为浓度2，PCR反应液最优选为浓度1。
表5引物和探针浓度
试剂名称 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4
C667T正向扩增引物 0.1μmol/L 0.3μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L
C667T反向扩增引物 0.1μmol/L 0.3μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L
C667C探针 0.1μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 1μmol/L
C667T探针 0.1μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 1μmol/L
内参正向扩增引物 0.3μmol/L 0.3μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L
内参反向扩增引物 0.3μmol/L 0.3μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L
内参探针 0.5μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 1μmol/L
表6PCR反应液浓度
Figure GDA0004197853700000071
Figure GDA0004197853700000081
由于试验数据体系较大，为了节省篇幅，发明人没有将所有数据附在说明书文本中。在此公开我们的优化方法，以MTHFR 677野生型样本为例，因为前期我们已经知晓20例样本全部是野生型，因此利用本发明提供的试剂盒进行检测最理想的状态是所有样本出现C667C探针22≤CT值≤35；C667T探针CT值≥35；内参探针CT值≤35的情况。在这一组试验中我们重点关注C667C探针的CT值，如果引物和探针，或者PCR反应液的浓度不佳，会出现C667C探针CT值＜22或者CT值＞35的现象，说明荧光PCR扩增收到激发或者抑制，导致CT值偏离。
再如，对于突变型样本，C667T探针19≤CT值≤35，当荧光强度偏离这个区间则视为不准确。经过多次重复试验，我们得到引物和探针为浓度2，PCR反应液为浓度1时结果是100％准确。本发明提供的基因分型结果对照标准，如C667C探针的CT值区间在22-35之间，C667T探针的CT值区间在19-35之前，是本发明技术人员经过大量试验筛选得到的最佳CT值区间，使用本发明提供的试剂盒进行基因分型检测后，按照所述结果对照标准进行判读，所得到的结果与基因测序方法检测的基因分型100％吻合。
实施例5人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合和PCR反应液。具体的，所述引物和探针组合如下表所示：
表7引物和探针浓度
Figure GDA0004197853700000082
Figure GDA0004197853700000091
所述PCR反应液浓度如下表所示：
表8PCR反应液浓度
试剂名称 浓度1
PCR缓冲液 1×
dNTPs 100nM
MgCl2 1.5mM
Taq酶 2U
使用双蒸水将全血DNA稀释为不同浓度待测样本，分别为0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL、0.5ng/μL、0.6ng/μL、0.7ng/μL、0.8ng/μL、0.9ng/μL、1.0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL，所述试剂盒的DNA最低检出限为1ng/μL。
选取MTHFR 677野生型血液样本20例，所述样本由一代基因测序确定基因分型。使用所述试剂盒进行基因分型检测，结果20例均为MTHFR 677野生型，准确率100％。
实施例6人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合、PCR反应液和样品稀释液。引物和探针组合、PCR反应液与实施例5完全相同。所述样品稀释液为二甲基亚砜与甲酰胺使用双蒸水配置得到的水溶液，其中二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，甲酰胺浓度为0.1mg/mL。使用该样品稀释液将从全血样本中提取的DNA稀释为不同浓度待测样本，分别为0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL、0.5ng/μL、0.6ng/μL、0.7ng/μL、0.8ng/μL、0.9ng/μL、1.0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL，所述试剂盒的DNA最低检出限为1ng/μL。
选取MTHFR 677野生型血液样本20例，所述样本由一代基因测序确定基因分型。使用所述试剂盒进行基因分型检测，结果20例均为MTHFR 677野生型，准确率100％。
实施例7人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合、PCR反应液和样品稀释液。引物和探针组合、PCR反应液与实施例5完全相同。样品稀释液为二甲基亚砜与乙酰胺使用双蒸水配置得到的水溶液，其中二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，乙酰胺浓度为0.1mg/mL。使用该样品稀释液将从全血样本中提取的DNA稀释为不同浓度待测样本，分别为0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL、0.5ng/μL、0.6ng/μL、0.7ng/μL、0.8ng/μL、0.9ng/μL、1.0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL，所述试剂盒的DNA最低检出限为1ng/μL。
选取MTHFR 677野生型血液样本20例，所述样本由一代基因测序确定基因分型。使用所述试剂盒进行基因分型检测，结果20例均为MTHFR 677野生型，准确率100％。
实施例8人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合、PCR反应液和样品稀释液。引物和探针组合、PCR反应液与实施例5完全相同。当试剂盒3中的样品稀释液为二甲基亚砜与烷基酰胺甜菜碱使用双蒸水配置得到的水溶液，其中二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，烷基酰胺甜菜碱浓度为0.1mg/mL。使用该样品稀释液将从全血样本中提取的DNA稀释为不同浓度待测样本，分别为0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL、0.5ng/μL、0.6ng/μL、0.7ng/μL、0.8ng/μL、0.9ng/μL、1.0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL，所述试剂盒的DNA最低检出限为0.7ng/μL。
选取MTHFR 677野生型血液样本20例，所述样本由一代基因测序确定基因分型。使用所述试剂盒进行基因分型检测，结果20例均为MTHFR 677野生型，准确率100％。
实施例9人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
所述试剂盒中包括引物和探针组合、PCR反应液和样品稀释液。引物和探针组合、PCR反应液与实施例5完全相同。样品稀释液为二甲基亚砜与N、N-双羟乙基烷基酰胺使用双蒸水配置得到的水溶液，其中二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，N、N-双羟乙基烷基酰胺浓度为0.1mg/mL。使用该样品稀释液将从全血样本中提取的DNA稀释为不同浓度待测样本，分别为0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL、0.5ng/μL、0.6ng/μL、0.7ng/μL、0.8ng/μL、0.9ng/μL、1.0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL，所述试剂盒的DNA最低检出限为0.4ng/μL。
选取MTHFR 677野生型血液样本20例，所述样本由一代基因测序确定基因分型。使用所述试剂盒进行基因分型检测，结果20例均为MTHFR 677野生型，准确率100％。
为了确定样品稀释液的最佳种类组合和浓度，发明人也做了大量的组合对比试验和正交试验，由于过程太长无法在专利文本中体现，我们在上述实施例中仅展现了检出限筛选过程。
根据上述试验结果可以看出，样品稀释液具有稀释DNA样本的作用，本发明技术人员预料不到的发现以二甲基亚砜与烷基酰胺配置得到的样品稀释液会降低DNA的最低检出限，其中最佳组合为二甲基亚砜与N、N-双羟乙基烷基酰胺形成的组合。分析原因我们认为，二甲基亚砜具有提高PCR扩增效率的作用，烷基酰胺可作为DNA再纯化试剂。与甲酰胺和乙酰胺相比，当样品稀释液中含有烷基酰胺甜菜碱或者N、N-双羟乙基烷基酰胺时，DNA检出限会进一步降低。我们认为烷基酰胺甜菜碱或者N、N-双羟乙基烷基酰胺均为中性表面活性剂，其具有进一步清洁DNA表面杂质的功效，清洗粘附在DNA表面的少量蛋白质、多糖等杂质，使DNA在进行PCR之前得到再次纯化，从而降低DNA的检出限。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 深圳市天大生物医疗器械有限公司
<120> 一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcaaagaaa actgcgtga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcagggagc tttgaggctg 20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaaatcggc tcccgc 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaaatcgac tcccgc 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acctctgacc atccttccca 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaagttgtc aaagatggtg cc 22
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcctccag gtcaag 16

Claims (3)

1.一种人MTHFR基因C667T位点多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQID No.1-2所示的MTHFR基因C667T正向扩增引物和MTHFR基因C667T反向扩增引物，以及如SEQ IDNo.3所示的MTHFR基因C667C探针，如SEQ ID No.4所示的MTHFR基因C667T探针；如SEQ ID No.5-6所示的内参正向扩增引物和内参反向扩增引物，以及如SEQ ID No.7所示的内参探针；所述MTHFR基因C667C探针、MTHFR基因C667T探针和内参探针的5’端分别标记FAM荧光基团、VIC荧光基团、ROX荧光基团中的一种，且所述三种探针标记的荧光基团互不相同，3’端标记MGB；以及PCR反应液，所述引物和探针的浓度为0.1-1μmol/L，所述PCR反应液中MgCl2终浓度为1.5-2.0mM，dNTPs终浓度为100-200nM，热启动DNA聚合酶浓度为1-2U/反应；
所述试剂盒中还包括样品稀释液，所述样品稀释液为二甲基亚砜与烷基酰胺配制得到的水溶液，二甲基亚砜浓度为0.05mg/mL，烷基酰胺浓度为0.1mg/mL，所述烷基酰胺为烷基酰胺甜菜碱或者N.N-双羟乙基烷基酰胺；
所述试剂盒的应用方法包括如下步骤：
(1)DNA提取：从待测样本中提取基因组DNA，浓度为0.4-10ng/μL；
(2)以提取的基因组DNA作为模板进行荧光PCR扩增；
(3)根据扩增曲线的CT值判断MTHFR C667T位点的基因型，结果判读参考标准如下：
野生型：C667C探针22≤CT值≤35；C667T探针CT值≥35；内参探针CT值≤35；
突变型：C667C探针CT值≥35；C667T探针19≤CT值≤35；内参探针CT值≤35；
杂合型：C667C探针22≤CT值≤35；C667T探针19≤CT值≤35；内参探针CT值≤35；
实验失败：内参探针CT值≥35。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.5μmol/L，MgCl2终浓度为1.5mM，dNTPs终浓度为100nM，热启动DNA聚合酶浓度为2U/反应。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述烷基酰胺为N.N-双羟乙基烷基酰胺。
CN202110832360.8A 2021-07-22 2021-07-22 一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒 Active CN113416779B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110832360.8A CN113416779B (zh) 2021-07-22 2021-07-22 一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110832360.8A CN113416779B (zh) 2021-07-22 2021-07-22 一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113416779A CN113416779A (zh) 2021-09-21
CN113416779B true CN113416779B (zh) 2023-06-23

Family

ID=77718097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110832360.8A Active CN113416779B (zh) 2021-07-22 2021-07-22 一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113416779B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010166820A (ja) * 2009-01-20 2010-08-05 Hitachi Software Eng Co Ltd Ｍｔｈｆｒ遺伝子における多型判定用プローブ及びｍｔｈｆｒ遺伝子における多型判定方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107828880A (zh) * 2017-10-25 2018-03-23 长沙三济生物科技有限公司 用于检测mthfr基因分型的lamp引物组、试剂盒及方法
CN108251557A (zh) * 2017-11-17 2018-07-06 安徽省疾病预防控制中心（省健康教育所） 一种h5n6亚型流感病毒全基因组测序试剂盒及其测序方法
CN107988353B (zh) * 2017-12-08 2019-02-12 益善生物技术股份有限公司 一种人类mthfr和/或mtrr基因多态性检测试剂盒
CN108977532B (zh) * 2018-09-06 2019-07-09 武汉康录生物技术股份有限公司 一种人类mthfr基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用
CN109609627A (zh) * 2019-01-30 2019-04-12 上海酷乐生物科技有限公司 一种直扩型mthfr和/或mtrr及mtr基因多态性的检测试剂盒及检测方法
CN110408685A (zh) * 2019-08-29 2019-11-05 无锡市申瑞生物制品有限公司 用于检测人mthfr基因分型的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN111961709A (zh) * 2020-01-21 2020-11-20 上海酷乐生物科技有限公司 一种用于口腔拭子直接荧光pcr扩增的试剂和试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010166820A (ja) * 2009-01-20 2010-08-05 Hitachi Software Eng Co Ltd Ｍｔｈｆｒ遺伝子における多型判定用プローブ及びｍｔｈｆｒ遺伝子における多型判定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism: epidemiology, metabolism and the associated diseases;Siaw-Cheok Liew 等;《Eur J Med Genet》;第58卷(第1期);第1-10页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113416779A (zh) 2021-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107988353B (zh) 一种人类mthfr和/或mtrr基因多态性检测试剂盒
CN107488711B (zh) 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
CN106755329B (zh) 基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的试剂盒
CN109182501B (zh) 一种叶酸代谢基因多态性检测引物及试剂盒
CN107841537A (zh) 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法
CN110283899B (zh) 一种检测人mthfr和mtrr基因突变的引物、探针及其试剂盒
CN113502335A (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN108642138B (zh) 一种检测叶酸代谢相关基因遗传信息的方法及试剂盒
CN111118138A (zh) 一种叶酸代谢能力基因mthfr和mtrr多态性检测试剂盒及方法
CN110628895A (zh) 基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病snp的方法及所用引物
CN112029837A (zh) 一种基于锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法检测snp位点的试剂盒及其检测方法
CN109182493B (zh) 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法
CN115029444A (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN113151419B (zh) 脊髓性肌萎缩症检测方法
EP2450443A1 (en) Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods
CN113416779B (zh) 一种人mthfr基因c667t位点多态性检测试剂盒
CN110878351A (zh) 用于荧光定量pcr检测mthfr基因多态性的方法
CN111334571A (zh) 一种可自由组合检测mthfr和mtrr基因序列的试剂盒及其使用方法
CN110863040A (zh) 用于荧光定量pcr检测cyp3a5基因多态性的方法
CN115109856A (zh) 与绵羊阶段体重相关的分子标记、其检测方法及应用
CN116004775A (zh) 一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN110819708A (zh) 用于荧光定量pcr检测aldh2基因多态性的方法
CN112553321A (zh) 一种用于检测mtrr基因和mtr基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法
CN112662751A (zh) 一种用于检测mthfr基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法
CN110592237A (zh) 一种用于检测浙东白鹅体重性状的引物、探针、试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant