CN112662751A - 一种用于检测mthfr基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。本发明针对MTHFR基因多态性在MTHFR基因的677和1298位点设计特异性引物，并且选用和MTHFR基因在其同一条染色体上的RPAP2基因作为内参作为检测MTHFR基因多态性的引物组合。在检测时，将引物组合分为突变型检测体系和野生型检测体系，设置检测位点和内参的荧光值差异的阈值，通过突变型检测体系和野生型检测体系中的荧光值差异判断待测样本在677和1298位点的基因型，进而可以快速、准确地判断MTHFR基因的多态性。这在检测MTHFR基因的领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。
背景技术
MTHFR全称5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，其基因位于染色体lp36.3位置。该基因全长19.3kb，共有12个外显子，逆转录的mRNA有7105bp，翻译合成的蛋白质有657个氨基酸。MTHFR在叶酸--甲硫氨酸循环代谢途径中催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，从而为体内物质，如碱基的合成及核酸和蛋白质的甲基化提供甲基原料，同时在循环途径中维持体内的同型半胱氨酸在一个较低的水平。
MTHFR基因中最常见的突变位点是C677T和A1298C。MTHFR C677T突变可改变翻译编码的丙氨酸为缬氨酸，仅一个氨基酸的改变就造成了MTHFR酶活力的下降，MTHFR基因杂合突变后，酶活力下降30％，而纯合突变则下降65％以上。MTHFR A1298C突变，会引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，与C677T位点相同，也会导致MTHFR酶活力下降，但下降程度比MTHFR C677T突变轻微，但却与其突变有协同效应。
科学研究证明，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低，即使按照常量(400μg/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足，从而难以维持体内正常的血浆同型半胱氨酸浓度水平，使同型半胱氨酸在体内长期积蓄，达到一定程度即为高同型半胱氨酸血症，引发一系列的心脑血管疾病，如全身动脉粥样硬化、血栓。轻、中度同型半胱氨酸水平升高可使心血管疾病死亡危险性增加4-6倍，是冠心病独立危险因素。通过基因检测发现叶酸代谢能力存在缺陷的患者，可以通过增补叶酸，降低心脑血管疾病的发生率。
现实生活中，50％以上的孕妇是无意中怀孕的，增补叶酸的时间往往滞后了2～3个月(怀孕前3个月即应开始增补叶酸)，错过了补充叶酸的关键时期，不利于预防胎儿畸形。新婚夫妇准备怀孕前，通过叶酸利用能力的基因检测，可以发现不同个体对叶酸的吸收利用水平，筛查出容易引起叶酸缺乏的高危人群，实现个体化增补叶酸，从而增强叶酸补充依从性，降低新生儿出生缺陷风险。但是，叶酸的增补剂量并非越多越好，过量补充叶酸也会导致以下不良后果：1.胎儿缺锌；2.胎儿生长缓慢，出生体重过低；3.掩盖VB12缺乏；4.增加结肠腺瘤癌变风险。因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿和孕妇健康。
目前，对MTHFR基因突变位点的检测，主要是利用特异性荧光探针法和熔解曲线法。特异性荧光探针法利用特异性的探针，对目标序列进行检测，该方法的特异性很高，但对于探针的设计要求很高，而且合成探针的费用也较高。熔解曲线的方法，虽然快速、准确，但是对于扩增仪的温控要求非常高，一般的仪器无法满足要求。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法。
第一方面，本发明提供一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合，包括：
MTHFR 677 C上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGC-3’(SEQ ID NO.1)，
MTHFR 677 T上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.2)，
MTHFR 1298 A上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGA-3’(SEQ ID NO.3)，
MTHFR 1298 C上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGC-3’(SEQ ID NO.4)，
MTHFR 677下游引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGA-3’(SEQ ID NO.5)，
MTHFR 1298下游引物：5’-GCAGGGGATGAACCAG-3’(SEQ ID NO.6)，
内参上游引物：5’-GGCGGTTCTATGCTCACAG-3’(SEQ ID NO.7)，
内参下游引物：5’-CTCCCAGTCAGGCTACACG-3’(SEQ ID NO.8)。
进一步地，所述引物组合分为野生型检测体系和突变型检测体系；
所述野生型检测体系包括：
MTHFR 677 C上游引物、MTHFR 1298 A上游引物、MTHFR 677下游引物、MTHFR 1298下游引物、内参上游引物和内参下游引物；
所述突变型检测体系包括：
MTHFR 677 T上游引物、MTHFR 1298 C上游引物、MTHFR 677下游引物、MTHFR 1298下游引物、内参上游引物和内参下游引物。
本发明进一步提供和所述引物组合配套使用的探针组合，所述探针组合包括如下探针：
MTHFR 677探针：5’-CCACCTGTTCAAGGCGAGGG-3’(SEQ ID NO.9)，
MTHFR 1298探针：5’-TCTCGGGAGAACCAAACCG-3’(SEQ ID NO.10)，
内参探针：5’-CAGAGGGTTAGCCGAAGCAAG-3’(SEQ ID NO.11)，
每条探针的5’端为荧光基团，3’端为淬灭基团。
进一步地，所述荧光基团为荧光基团FAM、VIC、ROX、HEX或Cy5；
所述淬灭基团为BHQ或MGB。
第二方面，本发明提供一种用于检测MTHFR基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组合和探针组合。
进一步地，所述试剂盒包括如下两个PCR体系：
表1野生型PCR反应液
| 试剂名称 | 浓度 |
| MTHFR 677C上游引物 | 150～200nM |
| MTHFR 1298A上游引物 | 150～200nM |
| MTHFR 677下游引物 | 150～200nM |
| MTHFR 1298下游引物 | 150～200nM |
| MTHFR 677探针 | 150～200nM |
| MTHFR 1298探针 | 150～200nM |
| 内参上游引物 | 150～200nM |
| 内参下游引物 | 150～200nM |
| 内参探针 | 150～200nM |
| PCR缓冲液 | 1× |
| dNTPs | 200μM |
| MgCl<sub>2</sub> | 400μM |
| Taq酶 | 1U |
| UNG酶 | 1U |
| 超纯水 | 补至总体为18μL |
表2突变型PCR反应液
进一步地，所述试剂盒还包括：突变型对照品和野生型对照品。
进一步地，野生型对照品是浓度为5ng/μL的MTHFR677和1298位点均为野生型的DNA，突变型对照品是浓度为5ng/μL的MTHFR677和1298位点均为突变型的DNA。
本试剂盒实际使用时的反应体系为20μL，其分为野生型反应体系、突变型反应体系。野生型反应体系中加入18μL的野生型PCR反应液和2μL的样本或野生型对照品，突变型反应体系中加入18μL的突变型PCR反应液和2μL的样本或突变型对照品，同时，每个反应体系还需设置空白对照，即PCR反应液中加入2μL的超纯水。
第三方面，本发明提供一种检测MTHFR基因多态性的方法，包括：
使用所述试剂盒，对待测样本进行PCR检测，根据荧光检测结果判断待测样本的MTHFR基因为突变型还是野生型。
进一步地，所述PCR检测的流程为：
20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，40～50个循环，收集荧光。
进一步地，所述根据荧光检测结果判断待测样本的MTHFR基因为突变型还是野生型，具体为：
以同一反应体系中目标检测位点的Ct值-同一反应体系中内参的Ct值为△Ct，针对MTHFRC的677位点：
当野生型体系中△Ct≤0.55，突变型体系中△Ct＞0.5或目标检测位点的Ct值为Undetermined时，判断待测样本的MTHFRC 677位点为野生型；
当野生型体系中△Ct＞0.55或者目标检测位点Ct值为Undetermined，突变型体系中△Ct≤0.5，判断待测样本的MTHFRC 677位点为纯合突变型；
当野生型体系△Ct≤0.55和突变型体系△Ct≤0.5时，判断待测样本的MTHFRC677位点为杂合突变型；
针对MTHFRC的1298位点：
当野生型体系中△Ct≤3.2，突变型体系中△Ct＞3.69或者目标检测位点Ct值为Undetermined，判断待测样本的MTHFRC 1298位点为野生型；
当野生型体系中△Ct＞3.2或者目标检测位点Ct值为Undetermined，突变型体系中△Ct≤3.69，判断待测样本的MTHFRC 1298为纯合突变型；
当野生型体系△Ct≤3.2和突变型体系△Ct≤3.69时，判断待测样本的MTHFRC1298为杂合突变型。
目前，已有的实验方法中△Ct的计算方法是将两管中的野生型Ct值-突变型Ct值，由于野生型Ct值和突变型Ct值是在两个PCR反应管中分别获得，而实际操作中不能保证两管中反应条件的完全一致，故容易引起较大的△Ct偏差，最终导致基因型的错判。而本发明针对目的基因位点设计野生型和突变型的ARMS引物以及Taqman探针，通过实时荧光PCR仪上收集信号，分别计算野生型和突变型体系中△Ct值，对样本DNA的基因型进行判定。该方法设计的引物特异性较高，能够区分野生型和突变型基因，同时，对同一个管中得到的Ct值进行△Ct计算，即野生型体系中△Ct＝目标检测位点Ct值-内参Ct值，突变型体系中△Ct＝目标检测位点Ct值-内参Ct值，而后分别根据野生型体系和突变型体系中的△Ct对目的位点突变型进行判断，这相较于现有技术而言具备更高的准确率且不易受到环境影响。
与现有技术相比，本发明运用突变型检测体系和野生型检测体系中的荧光值差异判读方法区分野生型和突变型，具有如下有益效果和显著进步：
(1)结果的准确性高，内参基因与目标检测基因位于同一条染色体，能够保证染色体复制中的同一性和拷贝数相同，从而保证了△Ct判断标准的准确性。
(2)防污染能力强，反应体系中加入了UNG酶以及dUTP，能够消除残留的扩增产物，避免了假阳性结果的产生。
(3)检测速度快，本发明的试剂盒中是PCR预混反应液，检测时只需分装至反应管中加入样本即可。加样过程和PCR反应过程一共仅需50分钟，缩短了报告时间。
(4)节约成本，本发明试剂盒中采用的是多重荧光检测，在同一管中即可检测两个位点的基因多态性，节省了反应液的成本，提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明实验例1提供的临床样本的扩增曲线；其中，样本的基因多态性为MTFRR 677位点野生型，1298位点野生型。
图2为本发明实验例1提供的临床样本的扩增曲线；其中，样本的基因多态性为MTFRR 677位点杂合突变型，1298位点杂合突变型。
图3为本发明实验例1提供的临床样本的扩增曲线；其中，样本的基因多态性为MTFRR 677纯合突变型，1298位点野生型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物和探针的设计
本发明通过分析MTHFR基因C677T位点和A1298C位点的序列和内参基因RPAP2的基因序列，利用引物设计软件PrimePrimer5.0，设计引物和探针，序列如下：
MTHFR 677 C上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGC-3’
MTHFR 677 T上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGT-3’
MTHFR 677下游引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGA-3’
MTHFR 677探针：5’-CCACCTGTTCAAGGCGAGGG-3’，5’端为荧光基团FAM，3’端为淬灭基团BHQ。
MTHFR 1298 A上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGA-3’
MTHFR 1298 C上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGC-3’
MTHFR 1298下游引物：5’-GCAGGGGATGAACCAG-3’
MTHFR 1298探针：5’-TCTCGGGAGAACCAAACCG-3’，5’端为荧光基团VIC，3’端为淬灭基团BHQ。
内参上游引物：5’-GGCGGTTCTATGCTCACAG-3’
内参下游引物：5’-CTCCCAGTCAGGCTACACG-3’
内参探针：5’-CAGAGGGTTAGCCGAAGCAAG-3’，5’端为荧光基团ROX，3’端为淬灭基团BHQ。
实施例2多重扩增引物、探针浓度的选择
本发明采用实施例1中所示的引物和探针，对多重扩增中的各位点的引物和探针的浓度进行筛选。筛选的浓度组合如下表：
表3引物探针浓度组合
按照上表中各引物探针的浓度，配制PCR反应液，PCR反应液中其他组分浓度如下：
表4 PCR反应液中其他组分
选用一个C677T位点和A1298C位点均为杂合突变型的样本进行扩增，每个反应体系中加入2μL样本，PCR反应程序如下表：
表5 PCR反应程序
表6检测结果
由上述结果可知，组合1中，FAM信号即677位点的扩增受到抑制，Ct值靠后；组合3中，ROX信号即内参的扩增受到抑制，不利于结果的判读；组合2中，三个位点均有较好的Ct值和扩增曲线，可以很好的对结果进行判断。所以，选择组合2中的引物探针浓度作为试剂盒配制的依据。
实施例3利用ROC曲线，得出基因扩增的判断标准
选取MTHFR 677野生型74例(编号为677W001～074)，纯合突变型73例(编号为677M001～073)，杂合突变型73例(编号为677H001～073)，MTHFR1298野生型45例(编号为1298W001～045)，纯合突变型45例(编号为1298M001～045)，杂合突变型45例(编号为1298H001～045)。上述样本为人EDTA抗凝全血，各样本的基因型由一代测序进行确定。使用商业用DNA提取试剂盒，提取样本的DNA，DNA需满足纯度在1.6～2.0，浓度大于10ng/μL的要求。再利用本试剂盒对上述样本DNA进行检测，分别计算野生型反应体系和突变型反应体系的△Ct，如果Ct值为Undetermined时，则取最大循环数40代替Ct值进行△Ct的计算。将MTHFR 677三种基因型样本的野生型反应体系的△Ct作为一组数据，突变型反应体系的△Ct作为一组数据，分别使用软件进行ROC分析，找出约登指数最大值的点，同理，对MTHFR1298样本也找出约登指数最大值的点。
表7 MTHFR 677野生型反应体系△Ct值
表8 MTHFR 677野生型反应体系ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| <-5.49 | 0 | 100 | 95.1-100.0 | 0 |
| ≤0.55 | 89.33 | 100 | 95.1-100.0 | 89.33 |
| ≤4.93 | 89.33 | 80.82 | 69.9-89.1 | 70.15 |
| ≤5.02 | 93.33 | 80.82 | 69.9-89.1 | 74.15 |
| ≤5.13 | 93.33 | 79.45 | 68.4-88.0 | 72.78 |
| ≤5.21 | 94.67 | 79.45 | 68.4-88.0 | 74.12 |
| ≤5.23 | 94.67 | 78.08 | 66.9-86.9 | 72.75 |
| ≤5.26 | 96 | 78.08 | 66.9-86.9 | 74.08 |
| ≤5.6 | 96 | 72.6 | 60.9-82.4 | 68.6 |
| ≤6.21 | 100 | 72.6 | 60.9-82.4 | 72.6 |
| ≤16.73 | 100 | 0 | 0.0-4.9 | 0 |
表9 MTHFR 677突变型反应体系△Ct值
表10 MTHFR 677突变型反应体系ROC分析结果
表11 MTHFR1298野生型反应体系△Ct值
表12 MTHFR 1298野生型反应体系ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| <-5.15 | 0.00 | 100.00 | 92.1-100.0 | 0 |
| ≤3.2 | 98.89 | 100.00 | 92.1-100.0 | 98.89 |
| ≤5.57 | 98.89 | 97.78 | 88.2-99.9 | 96.67 |
| ≤9.53 | 100.00 | 97.78 | 88.2-99.9 | 97.78 |
| ≤18.27 | 100.00 | 0.00 | 0.0-7.9 | 0 |
表13 MTHFR 1298突变型反应体系△Ct值
表14 MTHFR 1298突变型反应体系ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| <-3.72 | 0 | 100 | 92.1-100.0 | 0 |
| ≤3.69 | 100 | 100 | 92.1-100.0 | 100 |
| ≤16.08 | 100 | 0 | 0.0-7.9 | 0 |
由统计结果可知，MTHFR677野生型反应体系中约登指数最大值为89.33，其对应的△Ct为≤0.55。MTHFR677突变型反应体系中约登指数最大值为89.19，其对应的△Ct为≤0.5。MTHFR1298野生型反应体系中约登指数最大值为98.89，其对应的△Ct为≤3.2。MTHFR1298突变型反应体系中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤3.69。
综合上述实验结果，MTHFR基因型判断的依据如下：
表15 MTHFR C677T位点基因型结果判断依据
表16 MTHFR A1298C位点基因型结果判断依据
对比例1
本对比例提供了一种不同的△Ct的计算公式。将△Ct的计算公式设定为△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值，重新计算实施例3中样本的△Ct值。将MTHFR 677野生型样本和杂合突变型样本的△Ct作为一组数据，纯合突变型样本和杂合突变型样本的△Ct作为一组数据，分别使用SPSS软件进行ROC分析，找出约登指数最大值的点，同理，对MTHFR1298样本也找出约登指数最大值的点。
表17 MTHFR 677野生型样本和杂合突变型样本ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| ≥-9.21 | 100 | 0 | 0.0-4.9 | 0 |
| >-5.3 | 100 | 86.49 | 76.5-93.3 | 86.49 |
| >-1.26 | 97.26 | 86.49 | 76.5-93.3 | 83.75 |
| >-1.03 | 97.26 | 87.84 | 78.2-94.3 | 85.1 |
| >0.45 | 0 | 87.84 | 78.2-94.3 | -12.16 |
| >9.42 | 0 | 100 | 95.1-100.0 | 0 |
表18 MTHFR 677纯合突变型样本和杂合突变型样本ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| <-1.41 | 0 | 100 | 95.1-100.0 | 0 |
| ≤0.45 | 100 | 100 | 95.1-100.0 | 100 |
| ≤19.4 | 100 | 0 | 0.0-4.9 | 0 |
表19 MTHFR 1298野生型样本和杂合突变型样本ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| ≥-16.38 | 100 | 0 | 0.0-7.9 | 0 |
| >-3.31 | 100 | 100 | 92.1-100.0 | 100 |
| >1.59 | 0 | 100 | 92.1-100.0 | 0 |
表20 MTHFR 1298纯合突变型样本和杂合突变型样本ROC分析结果
| △Ct | 灵敏度(％) | 特异性(％) | 95％CI | 灵敏度+特异性-100 |
| <-1.23 | 0 | 100 | 92.1-100.0 | 0 |
| ≤1.59 | 100 | 100 | 92.1-100.0 | 100 |
| ≤19.13 | 100 | 0 | 0.0-7.9 | 0 |
由统计结果可知，MTHFR 677野生型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为86.49，其对应的△Ct为＞-5.3。MTHFR 677纯合突变型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤0.45。MTHFR 677野生型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为＞-3.31。MTHFR 677纯合突变型样本和杂合突变型样本数据中约登指数最大值为100，其对应的△Ct为≤1.59。
MTHFR基因型判断的依据如下：
表21 MTHFR C677T位点基因型结果判断依据
| 野生型 | 纯合突变型 | 杂合突变型 | |
| △Ct | △Ct≤-5.3 | △Ct＞0.45 | -5.3＜△Ct≤0.45 |
表22 MTHFR A1298C位点基因型结果判断依据
| 野生型 | 纯合突变型 | 杂合突变型 | |
| △Ct | △Ct≤-3.31 | △Ct＞1.59 | -3.31＜△Ct≤1.59 |
本对比例中提供了一种基因型判断的依据，但是与实施例3中的计算方法比较，虽然两种方法均选取ROC曲线中约登指数最大点最为判断标准，但是比较两种方法中95％CI可知，实施例3中的方法更加可靠。
对比例2
本对比例提供了一种与已在专利(CN 105256019B)中提到的实验方法进行对比的实验结果。
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成专利中提到的MTHFR基因中C677T位点和A1298C位点的引物探针。按照专利说明中提到的试剂盒成分，配制PCR反应液，并按照专利说明中提到的方法提取30例EDTA抗凝血样本，分别稀释至1ng/μL和5ng/μL，按照反应程序进行PCR反应。将该方法得到的结果与本发明的实验配方检测得到的结果进行符合率的对比，两种方法中最终加入反应体系的样本总量要求为10ng，即专利方法中加入10μL浓度为1ng/μL样本，本发明的实验体系中加入2μL浓度为5ng/μL样本。
专利中的PCR反应液配制，具体内容如下：
表23专利(CN 105256019B)中PCR反应液配方
| 试剂名称 | 专利(CN 105256019B)中内容 |
| MgCl2 | 2.0mmol |
| dNTPs | 0.2mmol |
| 各条引物 | 0.1μmol |
| 各条探针 | 0.1μmol |
| PCR缓冲液 | ABI Fast master premix 6μL |
| 模板 | 1ng/μL,10μL |
| 总体积 | 40μL |
本对比例使用的30例样本中，MTHFRC677T位点野生型10例(677W01～10)，纯合突变型7例(677M01～07)，杂合突变型13例(677H01～13)；MTHFRA1298C位点野生型17例(1298W01～17)，纯合突变型2例(1298M01～02)，杂合突变型11例(1298H01～11)。两种方法检测结果如下：
表24实验结果及基因型判断
实验结果中，本发明实验方法的符合率为100％，但专利中方法在检测样本677H02和1298H01时，基因型判定与已知基因型别不符，故本发明实验方法的准确性要高于专利中方法。
实验例1
本实验选用临床样本132例，其中MTHFRC677T野生型24例，纯合突变型54例，杂合突变型54例，MTHFRA1298C野生型96例，纯合突变型5例，杂合突变型31例，利用本发明涉及的检测试剂盒进行检测，通过荧光PCR仪得到的Ct值，分别利用实施例3和对比例1中的方法，进行计算，统计各方法中样本的符合率，结果如下：
表25临床样本△Ct计算结果
根据实施例3和对比例1中，利用ROC曲线获得的判断基因型别的依据，对两种计算方法得到的结果进行基因型的判断，并且与临床结果进行比较，各基因型结果如下：
表26临床样本各基因位点型别数目
表27两种△Ct计算方法的临床样本符合率比较
通过上述结果表明，通过△Ct＝FAM/VIC-ROX的计算方法判断的基因型与临床结果完全一致，试剂盒的准确度高。
附图1-附图3为部分临床样本的扩增曲线，其中附图1样本的基因多态性为MTFRR677位点野生型，1298位点野生型。附图2样本的基因多态性为MTFRR 677位点杂合突变型，1298位点杂合突变型。附图3样本的基因多态性为MTFRR 677纯合突变型，1298位点野生型。
实验例2
本发明同时采用其他多组引物对重复如本发明实施例3所示的流程，具体有：
对比引物组合1：
MTHFR C677T位点：
MTHFR 677 C上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGC-3’(SEQ ID NO.1)，
MTHFR 677 T上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGT-3’(SEQ ID NO.2)，
MTHFR 677下游引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGA-3’(SEQ ID NO.5)。
MTHFR A1298C位点:
MTHFR 1298 A上游引物：5’-AGCTGACCAGTGAAGAC-3’(SEQ ID NO.12)，
MTHFR 1298 C上游引物：5’-AGCTGACCAGTGAAGCC-3’(SEQ ID NO.13)，
MTHFR 1298下游引物：5’-CCCAACAAAGACCCA-3’(SEQ ID NO.14)。
对比引物组合2：
MTHFR C677T位点：
MTHFR 677 C上游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATCGG-3’(SEQ ID NO.15)，
MTHFR 677 T上游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATCGA-3’(SEQ ID NO.16)，
MTHFR 677下游引物：5’-TGCCCAGTCCCTGTGGTCTC-3’(SEQ ID NO.17)。
MTHFR A1298C位点:
MTHFR 1298 A上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGA-3’(SEQ ID NO.3)，
MTHFR 1298 C上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGC-3’(SEQ ID NO.4)，
MTHFR 1298下游引物：5’-GCAGGGGATGAACCAG-3’(SEQ ID NO.6)。
对比引物组合3：
MTHFR C677T位点：
MTHFR 677 C上游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATCGG-3’(SEQ ID NO.12)，
MTHFR 677 T上游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATCGA-3’(SEQ ID NO.13)，
MTHFR 677下游引物：5’-TGCCCAGTCCCTGTGGTCTC-3’(SEQ ID NO.14)。
MTHFR A1298C位点:
MTHFR 1298 A上游引物：5’-AGCTGACCAGTGAAGAC-3’(SEQ ID NO.15)，
MTHFR 1298 C上游引物：5’-AGCTGACCAGTGAAGCC-3’(SEQ ID NO.16)，
MTHFR 1298下游引物：5’-CCCAACAAAGACCCA-3’(SEQ ID NO.17)。
上述引物组合中的引物都已经过单体系扩增验证，均可正常扩增且区分相应的基因型别。在PCR反应液配制中除上述引物替换实施例3中的引物，其余PCR反应液中成分和浓度保持不变，PCR反应体系和PCR反应程序也不变。
实验结果如下表：
表24对比引物组合检测结果
上述实验结果中，组合1对于1298位点的野生型的样本无法区分，组合2对于677位点的纯合突变型的样本无法区分，组合3对于677位点和1298位点的野生型和纯合突变型的样本都无法区分，故本发明中不选择以上3个组合的引物序列。
其在构建多重PCR体系时，由上述结果可知，可以看出由于引物间的影响，难以使同一反应体系中的所有引物进行正常扩增。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中生北控生物科技股份有限公司
<120> 一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合、试剂盒以及检测方法
<130> KHP201119038.5
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaggtgtc tgcgggtgc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaaggtgtc tgcgggtgt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagctgacc agtgatga 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagctgacc agtgatgc 18
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggacggtgc ggtgaga 17
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaggggatg aaccag 16
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcggttcta tgctcacag 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcccagtca ggctacacg 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccacctgttc aaggcgaggg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctcgggaga accaaaccg 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagagggtta gccgaagcaa g 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agctgaccag tgaagac 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agctgaccag tgaagcc 17
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccaacaaag accca 15
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgcgtgatg atgaaatcgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgcgtgatg atgaaatcga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgcccagtcc ctgtggtctc 20
Claims (10)
1.一种用于检测MTHFR基因多态性的引物组合，其特征在于，包括：
MTHFR 677 C上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGC-3’，
MTHFR 677 T上游引物：5’-AGAAGGTGTCTGCGGGTGT-3’，
MTHFR 1298 A上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGA-3’，
MTHFR 1298 C上游引物：5’-GGAGCTGACCAGTGATGC-3’，
MTHFR 677下游引物：5’-AGGACGGTGCGGTGAGA-3’，
MTHFR 1298下游引物：5’-GCAGGGGATGAACCAG-3’，
内参上游引物：5’-GGCGGTTCTATGCTCACAG-3’，
内参下游引物：5’-CTCCCAGTCAGGCTACACG-3’。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合分为野生型检测体系和突变型检测体系；
所述野生型检测体系包括：
MTHFR 677 C上游引物、MTHFR 1298 A上游引物、MTHFR 677下游引物、MTHFR 1298下游引物、内参上游引物和内参下游引物；
所述突变型检测体系包括：
MTHFR 677 T上游引物、MTHFR 1298 C上游引物、MTHFR 677下游引物、MTHFR 1298下游引物、内参上游引物和内参下游引物。
3.和权利要求1或2所述引物组合配套使用的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括如下探针：
MTHFR 677探针：5’-CCACCTGTTCAAGGCGAGGG-3’，
MTHFR 1298探针：5’-TCTCGGGAGAACCAAACCG-3’，
内参探针：5’-CAGAGGGTTAGCCGAAGCAAG-3’，
每条探针的5’端为荧光基团，3’端为淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的探针组合，其特征在于，所述荧光基团为荧光基团FAM、VIC、ROX、HEX或Cy5；和/或，
所述淬灭基团为BHQ或MGB。
5.一种用于检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述引物组合，以及，权利要求3或4所述探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包括如下两个PCR体系：
野生型PCR反应体系，包括：
MTHFR 677C上游引物150～200nM、MTHFR 1298A上游引物150～200nM、MTHFR 677下游引物150～200nM、MTHFR 1298下游引物150～200nM、MTHFR 677探针150～200nM、MTHFR1298探针150～200nM、内参上游引物150～200nM、内参下游引物150～200nM、内参探针150～200nM、1×PCR缓冲液、150～250μM dNTPs、MgCl2 300～500μM、Taq酶和UNG酶；
突变型PCR反应体系，包括：
MTHFR 677T上游引物150～200nM、MTHFR 1298C上游引物150～200nM、MTHFR 677下游引物150～200nM、MTHFR 1298下游引物150～200nM、MTHFR 677探针150～200nM、MTHFR1298探针150～200nM、内参上游引物150～200nM、内参下游引物150～200nM、内参探针150～200nM、1×PCR缓冲液、150～250μM dNTPs、MgCl2 300～500μM、Taq酶和UNG酶。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：
突变型对照品和野生型对照品。
8.一种检测MTHFR基因多态性的方法，其特征在于，包括：
使用权利要求5-7任一项所述试剂盒，对待测样本进行PCR检测，根据荧光检测结果判断待测样本的MTHFR基因为突变型还是野生型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR检测的流程为：
20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～15秒，60℃，30～60秒，40～50个循环，收集荧光。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述根据荧光检测结果判断待测样本的MTHFR基因为突变型还是野生型，具体为：
以同一反应体系中目标检测位点的Ct值-同一反应体系中内参的Ct值为△Ct，针对MTHFRC的677位点：
当野生型体系中△Ct≤0.55，突变型体系中△Ct＞0.5或目标检测位点的Ct值为Undetermined时，判断待测样本的MTHFRC 677位点为野生型；
当野生型体系中△Ct＞0.55或者目标检测位点Ct值为Undetermined，突变型体系中△Ct≤0.5，判断待测样本的MTHFRC 677位点为纯合突变型；
当野生型体系△Ct≤0.55和突变型体系△Ct≤0.5时，判断待测样本的MTHFRC 677位点为杂合突变型；
针对MTHFRC的1298位点：
当野生型体系中△Ct≤3.2，突变型体系中△Ct＞3.69或者目标检测位点Ct值为Undetermined，判断待测样本的MTHFRC 1298位点为野生型；
当野生型体系中△Ct＞3.2或者目标检测位点Ct值为Undetermined，突变型体系中△Ct≤3.69，判断待测样本的MTHFRC 1298为纯合突变型；
当野生型体系△Ct≤3.2和突变型体系△Ct≤3.69时，判断待测样本的MTHFRC 1298为杂合突变型。
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