CN109182492B - 一种Citrin缺陷症致病基因检测引物及试剂盒 - Google Patents

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明公开了一种Citrin缺陷症致病基因检测引物，包括如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针。本发明还公开了所述检测引物在制备Citrin缺陷症检测试剂中的用途及一种Citrin缺陷症检测试剂盒。本发明提供的检测引物可实现在同一管PCR反应中同时检测Citrin缺陷症致病基因SLC25A13基因c.851_854del(rs80338720)的野生型、杂合突变及纯合突变，具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床Citrin蛋白缺乏症的检测和诊断。

Description

一种Citrin缺陷症致病基因检测引物及试剂盒
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域，具体涉及一种Citrin缺陷症致病基因检测引物及试剂盒。
背景技术
Citrin蛋白是一种位于线粒体内膜上的钙结合性跨膜溶质载体蛋白，负责将线粒体中的天冬氨酸转运至胞浆，同时将细胞质的谷氨酸转运至线粒体内部。这一过程与苹果酸穿梭相偶联，同时将细胞质中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被重新氧化为NAD+，从而维持了细胞质中氧化/还原状态的稳定性。Citrin蛋白由SLC25A13基因编码，主要在肝脏中表达。SLC25A13基因为核基因，位于人类染色体7q21.3，含18个外显子，其开放读码框长度为2028bp，编码含675个氨基酸。
SLC25A13基因突变导致其所编码的Cirtin蛋白功能不足或丧失，引发一系列生化代谢紊乱，并最终形成临床表型及预后各不相同的以肝脏损害为突出临床表型的常染色体隐性遗传病-Citrin缺陷病(Citrin Deficiency,CD)。我国人群SLC25A13基因突变的携带率约为1/63。中国已知的高频突变主要是c.851_854del、1638_1660dup、IVS6+5G>A和IVS16ins3kb。
Citrin蛋白缺乏症的诊断主要依据临床表现、实验室检查及基因检测等方面综合评估，其中基因检测明确存在基因突变是该病的金标准。目前的基因检测方法存在检测成本高、操作繁琐、灵敏度和特异性不足等缺点。因此，急需为该病的确诊提供一种操作简便、灵敏度和特异性高、成本低的检测方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种Citrin缺陷症致病基因检测引物，其在用于Citrin缺陷症致病基因检测时具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种Citrin缺陷症致病基因检测引物，包括如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；
所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光猝灭基团。
SEQ ID No.1：5’-GGAGGAGGGCAGCAATCAG-3’；
SEQ ID No.2：5’-GGCCTCAGCCAAGTTAAAGG-3’；
SEQ ID No.3：5’-TTTGTTTTTCCCCTACAGACGTATGACCTTAGCAGA
CATTGAAC-3’。
优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1。
优选地，所述检测引物的工作终浓度为：SEQ ID No.1所示的上游引物0.05-0.3umol/L、SEQ ID No.2所示的下游引物0.25-1.25umol/L和SEQ ID No.3所示的探针0.05-0.3umol/L。
所述Citrin缺陷症致病基因为SLC25A13，本发明检测引物可用于检测SLC25A13基因c.851_854del(rs80338720)的野生型、杂合突变及纯合突变。
本发明还提供了所述的检测引物在制备Citrin缺陷症致病基因检测试剂中的用途。
本发明检测引物可用于制备Citrin缺陷症致病基因的检测试剂，用于检测SLC25A13基因c.851_854del(rs80338720)的野生型、杂合突变及纯合突变，从而对Citrin缺陷症进行诊断。
本发明还提供了一种Citrin缺陷症致病基因检测试剂盒，包含所述的检测引物。
优选地，所述检测试剂盒还可以包含以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶；所述PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl。
优选地，所述PCR缓冲液的pH值为8.0-9.0。
优选地，所述Mg2+为MgCl2。
所述dNTPs包含dATP、dGTP、dTTP和dCTP，且所述dATP、dGTP、dTTP和dCTP的浓度相同。
优选地，所述试剂盒在用于检测时各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl2-20mmol/L、KCl 10-100nmol/L、Mg2+1.875-4.375mmol/L、dNTPs 0.1875-0.4375mmol/L、上游引物0.05-0.3umol/L、下游引物0.25-1.5umol/L、探针0.05-0.3umol/L和DNA聚合酶0.025-0.125U/ul。
优选地，所述试剂盒在用于检测时各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl10mmol/L、KCl 50nmol/L、Mg2+3.125mmol/L、dNTPs 0.25mmol/L、上游引物0.25umol/L、下游引物1.25umol/L、探针0.2umol/L和DNA聚合酶0.05U/ul。
优选地，所述试剂盒的检测程序为：95℃3min；10个循环：95℃15s、62℃30s、72℃30s；40个循环：95℃15s、55℃30s(收集荧光)、72℃30s；1个循环：95℃3min、45℃2min；1个循环：45℃1min、90℃15s(收集荧光，升温速率0.06℃/s)。
优选地，所述试剂盒在用于检测时的结果判断标准为：
(1)Citrin缺陷症致病基因野生型：Ct值小于35；Tm值：70.94±0.55℃，单峰；
(2)Citrin缺陷症致病基因杂合突变型：Ct值小于35；Tm值：(63.45±0.95℃)/(70.94±0.55℃)，双峰；
(3)Citrin缺陷症致病基因纯合突变型：Ct值小于35；Tm值：63.45±0.95℃，单峰。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明使用荧光PCR技术、不对称PCR技术及熔解曲线分析技术，可实现在同一管PCR反应中同时检测Citrin缺陷症致病基因SLC25A13基因c.851_854del(rs80338720)的野生型、杂合突变及纯合突变，具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床Citrin蛋白缺乏症的检测和诊断。
附图说明
图1为本发明试剂盒对1号样本Citrin缺陷症致病基因的检测结果图；
图2为1号样本Citrin缺陷症致病基因的测序结果图；
图3为本发明试剂盒对2号样本Citrin缺陷症致病基因的检测结果图；
图4为2号样本Citrin缺陷症致病基因的测序结果图；
图5为本发明试剂盒对3号样本Citrin缺陷症致病基因的检测结果图；
图6为3号样本Citrin缺陷症致病基因的测序结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
本发明Citrin缺陷症致病基因检测试剂盒的一种实施例，包含如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；所述探针5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光猝灭基团BHQ1。
SEQ ID No.1：5’-GGAGGAGGGCAGCAATCAG-3’；
SEQ ID No.2：5’-GGCCTCAGCCAAGTTAAAGG-3’；
SEQ ID No.3：5’FAM-TTTGTTTTTCCCCTACAGACGTATGACCTTAGC
AGACATTGAAC-BHQ1 3’。
所述引物由生物公司合成，按说明书进行配置。
实施例2
本实施例利用实施例1所述试剂盒对Citrin缺陷症致病基因进行检测。
1、反应体系配置
按表1所示的组分和组分终浓度配置反应体系：
表1反应体系
所述DNA模板为从患者外周血细胞中提取的DNA。
2、反应程序
PCR反应程序如表2所示：
表2反应程序
3、结果判断标准
本发明试剂盒可用于检测SLC25A13基因c.851_854del(rs80338720)的野生型、杂合突变及纯合突变，从而对Citrin缺陷症进行诊断。检测结果判断标准如下：
(1)Citrin缺陷症致病基因野生型：Ct值小于35；Tm值：70.94±0.55℃，单峰；
(2)Citrin缺陷症致病基因杂合突变型：Ct值小于35；Tm值：(63.45±0.95℃)/(70.94±0.55℃)，双峰；
(3)Citrin缺陷症致病基因纯合突变型：Ct值小于35；Tm值：63.45±0.95℃，单峰。
4、检测结果
对3例临床标本进行检测，结果如下：
1号样本检测结果如图1所示：扩增曲线平滑，呈“S”型；CT值为13.56；Tm值：70.90℃，单峰；判断为Citrin缺陷症致病基因野生型(GTAT/GTAT)，检测结果与一代测序结果符合(图2)；
2号样本检测结果如图3所示：扩增曲线平滑，呈“S”型；CT值为14.80；Tm值：63.55℃/71.15℃，双峰；判断为Citrin缺陷症致病基因杂合突变型(-/GTAT，“-”为缺失GTAT)，检测结果与一代测序结果符合(图4)；
3号样本检测结果如图5所示：扩增曲线平滑，呈“S”型；CT值为14.79；Tm值：63.68℃，单峰；判断为Citrin缺陷症致病基因纯合突变型(-/-，“-”为缺失GTAT)，检测结果与一代测序结果符合(图6)。
实施例3
本实施例对15例临床样本的Citrin缺陷症致病基因进行检测。取待测者外周血样本，提取DNA后利用实施例1所述试剂盒，按照实施例2所述检测方法进行检测，同时对样本进行一代测序。检测结果如表3所示：
表3检测结果
上述结果表明，本发明试剂盒在用于Citrin缺陷症致病基因检测时具有很好的准确性，检测结果与测序结果完全一致。
表4Mg2+终浓度优化反应体系
实施例4
本实施例研究反应体系中Mg2+终浓度对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表4，反应程序同表5，进行不同Mg2+终浓度的检测。分别配置以下Mg2+终浓度的反应体系：1.875mmol/L、2.5mmol/L、3.125mmol/L、3.75mmol/L和4.375mmol/L。结果表明，当Mg2+在反应体系中的终浓度在1.875～4.375mmol/L时均能实现检测，其中，当Mg2+在反应体系中的终浓度为3.125mmol/L时，检测结果最佳。
表5反应体系优化过程的反应程序
实施例5
本实施例研究反应体系中dNTPs终浓度对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表6，反应程序同表5，进行不同dNTPs终浓度的检测。分别配置以下dNTPs终浓度的反应体系：0.1875mmol/L、0.25mmol/L、0.3125mmol/L、0.375mmol/L和0.4375mmol/L。结果表明，当dNTPs在反应体系中的终浓度在0.1875～0.4375mmol/L时均能实现检测，其中，当dNTPs在反应体系中的终浓度为0.25mmol/L时，检测结果最佳。
表6dNTPs终浓度优化反应体系
表7上、下游引物比例优化反应体系
实施例6
本实施例研究反应体系中上、下游引物比例对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表7，反应程序同表5，进行不同上、下游引物终浓度比例的检测。分别配置以下上、下游引物比例的反应体系(上游引物：下游引物)：(0.5：0.5)umol/L、(0.25：0.5)umol/L、(0.167：0.5)umol/L、(0.125：0.5)umol/L、(0.1：0.5)umol/L、(0.05：0.5)umol/L、(0.025：0.5)umol/L和(0.0125：0.5)umol/L。结果表明，当上、下游引物在反应体系中的终浓度在(0.25：0.5)-(0.0125：0.5)umol/L时均能实现检测，其中，当上、下游引物在反应体系中的终浓度为(0.1：0.5)umol/L时，检测结果最佳。
实施例7
本实施例研究反应体系中上、下游引物终浓度对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表8，反应程序同表5，进行不同上、下游引物终浓度的检测。分别配置以下上、下游引物终浓度的反应体系(上游引物：下游引物)：(0.05：0.25)umol/L、(0.1：0.5)umol/L、(0.15：0.75)umol/L、(0.2：1.0)umol/L、(0.25：1.25)umol/L、和(0.3：1.5)umol/L。结果表明，当上、下游引物在反应体系中的终浓度在(0.05：0.25)-(0.3：1.5)umol/L时均能实现检测，其中，当上、下游引物在反应体系中的终浓度为(0.2：1.0)umol/L时，检测结果最佳。
表8上、下游引物中浓度优化反应体系
实施例8
本实施例研究反应体系中探针终浓度对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表9，反应程序同表5，进行不同探针终浓度的检测。分别配置以下探针终浓度的反应体系：0.05umol/L、0.1umol/L、0.15umol/L、0.2umol/L、0.25umol/L和0.3umol/L。结果表明，当探针在反应体系中的终浓度在0.05-0.3umol/L时均能实现检测，其中，当探针在反应体系中的终浓度为0.2umol/L时，检测结果最佳。
表9探针终浓度优化反应体系
实施例9
本实施例研究反应体系中上、下游引物与探针终浓度比值对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表10，反应程序同表5，进行不同上、下游引物与探针终浓度比值的检测。分别配置以下上、下游引物与探针终浓度比值的反应体系(上有引物：下游引物：探针)：(0.15：0.75：0.2)umol/L、(0.15：0.75：0.25)umol/L、(0.2：1.0：0.2)umol/L、(0.2：1.0：0.25)umol/L、(0.25：1.25：0.2)umol/L和(0.25：1.25：0.25)umol/L。结果表明，当反应体系中上、下游引物与探针终浓度比值为(0.25：1.25：0.2)umol/L时，检测结果最佳。
表10上、下游引物与探针终浓度优化反应体系
表11DNA聚合酶终浓度优化反应体系
实施例10
本实施例研究反应体系中DNA聚合酶终浓度对检测结果的影响。
PCR反应体系其他组分的终浓度同表11，反应程序同表5，进行不同DNA聚合酶终浓度的检测。分别配置以下DNA聚合酶终浓度的反应体系：0.025U/ul、0.05U/ul、0.075U/ul、0.1U/ul和0.125U/ul。结果表明，当DNA聚合酶在反应体系中的终浓度在0.025-0.125U/ul时均能实现检测，其中，当DNA聚合酶在反应体系中的终浓度为0.05U/ul时，检测结果最佳。
实施例11
本实施例研究反应程序中步骤2退火温度对检测结果的影响。
PCR反应程序其他步骤同表5，反应体系同表1，进行反应程序中不同步骤2退火温度的检测。分别设置以下步骤2退火温度的反应程序：64℃、62℃、60℃和58℃。结果表明，当步骤2退火温度在58～64℃时均能实现检测，其中，当步骤2退火温度为62℃时，检测结果最佳。
表12PCR反应程序中步骤3退火温度优化
实施例12
本实施例研究反应程序中步骤3退火温度对检测结果的影响。
PCR反应程序其他步骤同表12，反应体系同表1，进行反应程序中不同步骤3退火温度的检测。分别设置以下步骤3退火温度的反应程序：53℃、54℃、55℃、56℃和57℃。结果表明，当步骤3退火温度在53～57℃时均能实现检测，其中，当步骤3退火温度为55℃时，检测结果最佳。
实施例13
本实施例研究反应程序中步骤4退火温度对检测结果的影响。
其他反应程序同表13，反应体系同表1，进行反应程序中不同步骤4退火温度的检测。分别设置以下步骤4退火温度的反应程序：45℃、48℃、51℃和54℃。结果表明，当步骤4退火温度在45～54℃时均能实现检测，其中，当步骤4退火温度为45℃时，检测结果最佳。
表13PCR反应程序中步骤4退火温度优化
因此，综合分析实施例4至实施例13的结果，PCR反应体系各个组分的最优终浓度如表1，PCR反应最优程序如表2。
另外，本发明是通过溶解曲线的Tm值判断基因型，因而Tm值是否稳定对本试剂盒的性能是最为关键的要素。通过以上优化实验发现，在10*PCR Buffer(缓冲液)成分固定的条件下，反应体系中对溶解曲线Tm值影响最大的三个试剂成分分别是：镁离子、dNTPs和DNA聚合酶。因此，试剂配制前应特别关注镁离子、dNTPs和DNA聚合酶。再者，除非是操作失误、PCR成分有问题或检测仪器有故障等问题而导致的体系扩增失败，否则本发明的扩增曲线均可以扩增出S型曲线，即本发明的扩增曲线可以作为“内参照”而不再需要多增加一个管家基因作为扩增体系的“内参照”。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江门市妇幼保健院
<120> 一种Citrin 缺陷症致病基因检测引物及试剂盒
<130> 2018.8.23
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggaggagggc agcaatcag 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggcctcagcc aagttaaagg 20
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tttgtttttc ccctacagac gtatgacctt agcagacatt gaac 44

Claims (7)

1.一种利用不对称PCR技术及熔解曲线分析技术检测Citrin缺陷症致病基因的引物，其特征在于，由如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ IDNo.3所示的探针组成；
所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；
所述检测引物的工作终浓度为：SEQ ID No.1所示的上游引物0.0125-0.25umol/L、SEQID No.2所示的下游引物0.5umol/L和SEQ ID No.3所示的探针0.05-0.3umol/L；
所述引物的检测程序为：95℃3min；10个循环：95℃15s、62℃30s、72℃30s；40个循环：95℃15s、55℃30s收集荧光、72℃30s；1个循环：95℃3min、45℃2min；1个循环：45℃1min、90℃15s收集荧光，升温速率0.06℃/s；
所述引物用于检测时的结果判断标准为：
(1)Citrin缺陷症致病基因野生型：Ct值小于35；Tm值：70.94±0.55℃，单峰；
(2)Citrin缺陷症致病基因杂合突变型：Ct值小于35；Tm值：(63.45±0.95℃)/(70.94±0.55℃)，双峰；
(3)Citrin缺陷症致病基因纯合突变型：Ct值小于35；Tm值：63.45±0.95℃，单峰。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
3.根据权利要求1或2所述的引物在制备Citrin缺陷症致病基因检测试剂中的用途。
4.一种利用不对称PCR技术及熔解曲线分析技术检测Citrin缺陷症致病基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还可以包含以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶；所述PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl2-20mmol/L、KCl10-100nmol/L、Mg2+1.875-4.375mmol/L、dNTPs0.1875-0.4375mmol/L、探针0.05-0.3umol/L和DNA聚合酶0.025-0.125U/ul。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl10mmol/L、KCl50nmol/L、Mg2+3.125mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、上游引物0.25umol/L、下游引物1.25umol/L、探针0.2umol/L和DNA聚合酶0.05U/ul。
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