CN109852732A

CN109852732A - 荧光定量pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN109852732A
Application number: CN201910259261.8A
Authority: CN
Inventors: 赵耀; 杨宇婷
Original assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明提供一种荧光定量PCR隐匿性乙肝病毒检测试剂盒，包括荧光定量反应液、引物探针组合，其引物、探针组合包括S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合中的至少一种。本发明通过在乙肝病毒S、C保守序列分别设计引物探针，运用双重双基因荧光定量PCR技术对HBV DNA进行同管同时检测，操作简便，快速，提高隐匿性乙肝病毒检测方法的灵敏度、特异性，尽可能的降低因突变导致假阴性结果发生的几率，并且能进一步提高检测效率。

Description

荧光定量PCR隐匿性乙肝病毒检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种双重双基因同管荧光定量PCR隐匿性乙肝病毒检测方法及试剂盒。

背景技术

乙肝病毒感染仍然是全球面临的重大公共卫生问题。2017年世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)全球肝炎报告估计，世界人口中仍有3.5％(2.57亿)患有慢性乙肝病毒感染，且西太平洋地区的乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性率最高(6.2％)。自1992年起，我国将乙型肝炎疫苗接种纳入常规婴儿的免疫接种计划，新生儿的乙肝免疫预防工作取得了明显的成果，但是中国的HBV感染负担仍然是世界上最高的，全世界2.4亿慢性HBV患者中有三分之一生活在中国。

一般临床上通过检测血液中的病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)来判断是否存在HBV感染，然而，随着分子检测技术的发展，上世纪80年代首次发现HBsAg阴性个体中也可能存在(Hepatitis B Virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA)，这种特殊形式的慢性乙肝病毒感染被称为隐匿性乙型肝炎病毒感染(Occult HBVinfection,OBI)。目前较多观点认为OBI很可能是由于机体免疫系统对病毒复制的抑制，从而影响相关基因的表达，因此存在低病毒载量感染，当血清中能检测到时HBV DNA水平一般低于200IU/mL。

近年来随着研究的深入，OBI的临床危害越来越突出。有不少研究发现，隐匿性乙肝病毒感染与慢性肝脏疾病、肝硬化、肝细胞癌(HCC)等密切相关；隐匿性乙肝病毒可以通过输血，器官移植等方式传播；并且OBI患者如果接受免疫抑制治疗，发生乙肝病毒再激活的风险也会随之增大，所以对OBI患者进行及时准确的检测特别重要。

迄今为止，HBV DNA检测有很大进展，但是OBI检测尚无标准、有效、统一的方法。欧洲肝脏研究协会(European Association for the Study of the Liver,EASL)在2007年将巢式PCR(nested PCR)技术作为OBI诊断标准：从患者肝组织或血清/血浆样本中提取核酸，使用多组特异性引物对HBV不同基因序列进行扩增检测，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳观察，当结果至少出现两个不同基因片段扩增阳性(≥2)，提示可能存在OBI。然而，巢式PCR技术存在如下缺点：①操作繁琐，复杂，费时费力；②需要多对引物进行多次PCR扩增反应，增加污染的机会，并且需要的较大样本量；③扩增结果只能通过琼脂糖凝胶电泳进行定性分析。因此，巢式PCR技术并不适合OBI流行病学调查和临床的大规模推广使用。

发明内容

鉴于巢式PCR检测的技术缺点，本发明的目的在于提供一种双重双基因同管荧光定量PCR检测病毒的方法及试剂盒，用于解决现有技术中因OBI临床检测方法实用性低、HBV发生碱基突变、造成对OBI漏检、假阴性的发生等问题，该方法对其结果进行实时监控，无需进一步凝胶电泳分析。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种引物探针组合，所述引物探针组合选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合中的至少一种，所述S基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合S1：

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：TGCCCGTTTGTCCTCTAATTCC(SEQ IDNO.1)；

含有如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：AGGTGCAGTTTCCATCCATAGG(SEQ IDNO.2)；

含有如SEQ ID NO.3所示序列的探针：TCATCAACCACCAGCACGGGACCA(SEQ IDNO.3)；

组合S2：

含有如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC(SEQ IDNO.4)；

含有如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：CATCCATAGGTTTTGTACAGCAAC(SEQ IDNO.5)；

含有如SEQ ID NO.6所示序列的探针：AGGATCATCAACCACCAGCACGGG(SEQ IDNO.6)；

组合S3：

含有如SEQ ID NO.7所示序列的上游引物：GTGTCTGCGGCGTTTATCA(SEQ ID NO.7)；

含有如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物：CCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG(SEQ IDNO.8)；

含有如SEQ ID NO.9所示序列的探针：TTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCC(SEQ IDNO.9)；

所述C基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合C1：

含有如SEQ ID NO.10所示序列的上游引物：ATCAACACTTCCGGAAACTACTG(SEQ IDNO.10)；

含有如SEQ ID NO.11所示序列的下游引物：TTCCCGAGATTGAGATCTTCTGC(SEQ IDNO.11)；

含有如SEQ ID NO.12所示序列的探针：GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT(SEQ IDNO.12)；

组合C2：

含有如SEQ ID NO.13所示序列的上游引物：AGCCTTAAAATCTCCTGAGCATTG(SEQ IDNO.13)；

含有如SEQ ID NO.14所示序列的下游引物：CAAATTATTACCCACCCAGGTAGC(SEQ IDNO.14)；

含有如SEQ ID NO.15所示序列的探针：TCACCACACAGCACTCAGGCAAGC(SEQ IDNO.15)；

组合C3：

含有如SEQ ID NO.16所示序列的上游引物：AGGCAGGTCCCCTAGAAGAAG(SEQ IDNO.16)；

含有如SEQ ID NO.17所示序列的下游引物：ACATTGGGATTCCCGAGATTGAG(SEQ IDNO.17)；

含有如SEQ ID NO.18所示序列的探针：ACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGG(SEQ IDNO.18)；

上述各探针还包括荧光染料和荧光淬灭剂。

可选地，所述S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合是根据GenBank中登录的乙肝病毒标准株(accession number:X02763、D00329、X04615、X65259、X75657、X69798、AF160501、AY090454)的高度保守基因序列设计得来。

通过研究，本发明提供的引物组的特异性强、灵敏度好、检测效率高，可用于OBI患者体内HBV DNA的有效扩增，从而实现OBI的高效检测和准确定量。

可选地，所述荧光染料选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox、TET中的至少一种。

可选地，所述荧光淬灭剂选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ、TAMRA中的至少一种。

上述荧光染料和荧光淬灭剂的详细说明如下：

荧光染料：

VIC：绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白)，所以VIC缩写可能是来源于Victoria；

FAM：6-Carboxy-fluorescein(6-羧基-荧光素)；

HEX：5-Hexachloro-flurescein(5-六氯-荧光素)；

Cy5：Indodicarbocyanine；

Rox：Carboxy-x-rhodamine(羧基-X-罗丹明)；

TET：5-Tetrachloro-fluorescein(5-四氯-荧光素)。

荧光淬灭剂：

BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3：Black Hole Quencher-1，Black Hole Quencher-2，BlackHole Quencher-3，即黑洞淬灭剂-1、黑洞淬灭剂-2、黑洞淬灭剂-3；

BBQ：Black Berry Quencher(黑莓猝灭剂)；

TAMRA：Tetramethyl-6-carboxyrhodamine(四甲基-6-羧基罗丹明)。

上述荧光染料、荧光淬灭剂仅仅是部分列举，也可采用其他试剂。

本发明第二方面提供用于双重双基因同管荧光定量PCR检测隐匿性乙肝病毒的试剂盒，包括上述引物探针组合以及荧光定量反应液。

可选地，所述荧光定量反应液包括缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶，该荧光定量反应液可以从市场上购买得到，具体可以是购自罗氏公司的2×PCR Probes Master荧光定量反应液等，当然，不限于上述公司，也可以购自美国ABI、BIO-RAD等公司。

可选地，所述荧光定量反应液体积为10-15μL，保存条件为-20℃。

可选地，还包括模板、阳性参控品、阴性参控品中的至少一种。

可选地，所述模板选自标准阳性模板、人基因组DNA提取液中的任一种。

可选地，所述标准阳性模板为重组质粒。

可选地，所述标准阳性模板为：插入乙肝病毒全基因组3215个核苷酸特异序列的pLB-T载体质粒。

可选地，所述标准阳性模板的浓度为5×10⁰～5×10⁵拷贝/μL，体积为5-10μL，保存条件为-20℃。

可选地，乙肝病毒S基因区681个核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

可选地，乙肝病毒C基因区552个核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

根据研究目的的不同，选取的保守区位置不太相同，上述两个序列是我们通过比对、筛选得到的可以作为我们引物和探针序列设计的保守区序列。

可选地，所述阳性参控品为乙肝病毒。

可选地，所述阳性参控品为从感染患者体内分离得到的乙肝病毒，具体地，进行克隆测序，运用NCBI比对工具进行比对，得到的阳性参控品为乙肝病毒核酸。

可选地，所述阴性参控品为水。

可选地，上游引物、下游引物的浓度均为0.5μM，容积均为0.7μL至0.25μL，保存条件为-20℃。

可选地，荧光探针的浓度为0.2-0.5μM，体积为0.5μL至1.5μL，保存条件为-20℃。

本发明第三方面提供一种双重双基因同管荧光定量PCR检测隐匿性乙肝病毒的方法，包括如下步骤：

取荧光定量反应液、标准阳性模板和引物探针组合，形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR，绘制标准曲线；

取荧光定量反应液、待测样品DNA和上述引物探针组合进行荧光定量PCR，根据标准曲线，获得待测样品的HBV定量检测结果。

可选地，荧光定量PCR的反应程序包括：

1)预变性：95℃，时间为10min；

2)扩增：95℃，时间是10s；退火温度为62℃，时间30s；经过45个变性退火循环。

上述步骤由瑞士ROCHE公司的Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出。

本发明至少具有如下优势之一：

1、通过研究证明，本发明提供的引物组的特异性强、灵敏度高，可实现HBV的高效、准确定量。

2、S基因区、C基因区的引物探针的荧光标记不同，可在同一试管中同时进行检测，方便迅速，高效，降低了试剂成本和人力成本。

3、同时对HBV两个基因区保守序列进行扩增，大大降低了假阴性结果的发生，提高检测的灵敏度。

4、本发明提供的HBV定量检测试剂盒定量准确，可以准确定量检测病毒核酸；灵敏度及特异性好，效率高；检测速度快，仅需一个小时，加上核酸的提取，共仅需2～3小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。

5、本发明可以对OBI定量检测，不仅可以分别单管不同基因的检测，还可以双基因同时同管完成定量检测。

6、本发明适用于隐匿性乙肝病毒的临床或实验室定量及定性检测，隐匿性乙肝病毒感染的早期诊断，实现对乙肝病毒流行性进行更好的监测，以及对疗效进行评估。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中检测HBV S基因区的扩增曲线示意图。

图2显示为本发明实施例2中检测HBV C基因区的扩增曲线示意图。

图3显示为本发明实施例3中双重荧光定量PCR检测的程序设置图。

图4显示为本发明实施例3中检测HBV S基因区的扩增曲线示意图。

图5显示为本发明实施例3中检测HBV C基因区的扩增曲线示意图。

图6显示为本发明实施例4中验证HBV DNA检测特异性试验示意图。

图7显示为本发明实施例5中检测OBI模拟样本中S、C基因区的扩增曲线示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

隐匿性乙肝病毒感染已被证实与肝硬化、原发性肝癌等疾病的发生发展密切相关，还可能增加相关临床危害，如通过输血、器官移植等传播HBV。

检测HBV DNA是诊断隐匿性乙肝病毒感染的金标准，目前OBI检测主要是采用巢式PCR技术，使用多组引物对HBV不同基因保守区域进行两轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳进行定性分析，但是巢式PCR技术操作繁琐，费时长，并且容易污染，因此并不适用于临床大规模推广检测。

为尽量减少OBI漏检的发生，需要建立一种新型高灵敏的临床实用型OBI检测方法，因此，同时对HBV不同基因进行检测的方法，既满足OBI临床检测诊断的要求，又不会因某一目标检测片段突变，出现不能检测的假阴性结果而影响对OBI的检测及判断。

因此，如果需要建立一种新型高灵敏的临床实用型OBI检测方法，必须解决这个问题，并且能够同时设置几个目的基因进行检测，这样既可以满足OBI临床检测诊断的要求，避免基因突变和检测逃逸，又能够高灵敏度地检测OBI的存在。

基于这样的假设，我们建立了一种双重双基因的隐匿性乙肝病毒检测方法。

同时还考虑了以下一些因素：

1、检测的经济性，不增加太多的检测成本(同管检测双基因)。

2、检测的方便性，不增加太多的检测步骤(同管检测双基因)。

3、检测的准确性，不降低检测的准确性(荧光定量PCR方法)。

4、检测的时效性，不增加检测的耗时(同管检测双基因)。

5、检测的样本量，不增加检测需要的血清量(同管检测双基因)。

6、检测的复杂性，不需要检测操作人员另外培训(同样的荧光定量PCR方法)。

7、检测的灵敏度，并且具有更高的检测灵敏度(多基因的同时检测)。

荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，目前已广泛用于分子生物学和医学等研究领域。而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在科学研究和临床诊断中广泛使用。

本发明利用了荧光定量PCR的优点和特点，设计了双重双基因同管荧光定量PCR的检测方法，这样既可以满足OBI检测需要的两个片段阳性的原则，又提高了灵敏度和特异性，高效快速，并且成本还更低。

本发明采用多对引物和探针组，不仅可以单管进行不同基因的检测，还可以同时同管对HBV不同基因保守序列，应用荧光定量PCR方法进行检测。本发明能够进一步提高检测方法的灵敏度，获得更为准确、有效的定量结果，为临床预防治疗方案的制定提供更有力的依据。

主要实验材料：

DNA提取试剂盒(QIAampUltraSensViral Kit)，购自Qiagen公司；2×PCR ProbesMaster荧光定量反应液(规格5ml)，购自罗氏公司，货号04707494001；大肠杆菌DH5α、质粒提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；HBV血清标准品(编号：GBW(E)090666)及阴性血清购自中山大学达安基因股份有限公司。

引物、探针根据GenBank中的乙肝病毒标准序列(accession number:X02763，D00329，X04615，X65259，X75657，X69798，AF160501，AY090454)，采用基于Smith Waterman算法的CLUSTAL X多序列比对软件进行比对分析，具体采用MEGA5.0软件、Oligo6.71软件进行分析，找出一些可以设计引物和探针的保守特异区域。在HBV DNA的S基因区、C基因区的保守序列分别设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan探针，建立了一种快速、准确检测HBV DNA载量的高灵敏、特异性的多重多基因同管荧光定量PCR乙肝病毒检测方法。引物探针组合由上海英骏生物技术有限公司合成。

标准阳性模板为：插入乙肝病毒全基因组核苷酸特异序列的pLB载体质粒(pLB零背景快速克隆试剂盒，货号VT206，购自天根生化科技(北京)有限公司)，将乙肝病毒全基因组序列克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5a增殖后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，然后，用分光光度计A₂₆₀定量并稀释至1×10⁸拷贝/μL。

阴性参控品为水。

阳性参控品是从患者体内分离得到的HBV，进行克隆测序，利用NCBI基因工具进行比对，得到的阳性参控品乙肝病毒核酸。

以下实施例采用的序列如下：

实施例1

单重S基因区荧光定量PCR HBV定量检测敏感性测试

1.用蒸馏水溶解标准阳性模板，并将其倍比稀释为3×10⁵拷贝/μL、3×10⁴拷贝/μL、3×10³拷贝/μL、3×10²拷贝/μL、3×10¹拷贝/μL、3×10⁰拷贝/μL。

2.荧光定量PCR实验(20μL扩增反应体系)：荧光定量反应液10.0μL，S基因区引物组正向引物0.7μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.7μL(0.5μM)，荧光探针1.5μL(0.2μM)，引物探针组选自组合S1，标准阳性模板7.0μL。

荧光定量PCR反应参数如下：预变性：温度为95℃，时间是10min；变性：温度为95℃，时间是10s，退火：温度为62℃，时间是30s，45个变性退火循环，该步骤由瑞士ROCHE公司的Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出，结果见附图1。

实施例2

单重C基因区荧光定量PCR HBV定量检测敏感性测试

荧光定量PCR实验(20μL扩增反应体系)：荧光定量反应液10.0μL，正向引物0.7μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.7μL(0.5μM)，荧光探针1.5μL(0.2μM)，引物探针组选自组合C1，标准阳性模板7.0μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，结果见附图2。

结果显示，单重荧光定量PCR对HBV质粒DNA的S、C基因区最低检测浓度为3.0copies/uL。

实施例3

双重双基因同管荧光定量PCR HBV定量检测

荧光定量PCR实验(20μL扩增反应体系)：荧光定量反应液10.0μL，S基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，引物探针组分别选自组合S1、C1，标准阳性模板8.0μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，双通道荧光同时检测，设置如附图3。

S基因区扩增结果见附图4，C基因区扩增结果见附图5。

实验发现，双重双基因同管PCR检测方法的扩增效率与单重单基因荧光定量PCR基本一致，各基因区段目的片段扩增都能较好扩增，互不干扰，双重荧光定量PCR对HBV质粒DNA的S、C基因区最低检测浓度为3.0copies/uL。

实施例4

双重双基因同管荧光定量PCR检测HBV DNA特异性分析

本实施例探讨所述S、C基因区引物和探针组的特异性，利用建立的双重荧光定量PCR方法对人基因组DNA进行检测验证该方法的特异性。

荧光定量PCR实验(20μL扩增反应体系)：荧光定量反应液10.0μL，S基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，引物探针组分别选自组合S1、C1，人基因组DNA提取液作为模板，8.0μL。

荧光定量PCR反应参数如实施例1，双通道荧光同时检测，扩增结果见附图6。

实施例5

模拟OBI样本检测

将已知浓度的HBV标准血清，用阴性血清稀释至2×10¹、2×10²IU/mL，使用病毒核酸提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取待测样本中的DNA，保存于4℃备用；

荧光定量PCR实验(20μL扩增反应体系)：荧光定量反应液10.0μL，S基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，S基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，C基因区引物组正向引物0.25μL(0.5μM)，C基因区引物组反向引物0.25μL(0.5μM)，荧光探针0.50μL(0.2μM)，引物探针组分别选自组合S1、C1，模板8.0μL；阴性参控品水作为PCR反应的阴性对照，阳性参控品作为PCR反应的阳性对照，以检测PCR反应系统是否正常；荧光定量PCR反应参数如实施例1，双通道荧光同时检测。

PCR反应结束后荧光定量检测仪在阴性参控品管中未检测到荧光信号，而在阳性参控品管中检测到目的拷贝数的乙肝病毒，表明PCR反应系统正常，扩增结果见图7。

由图7扩增结果可知，该检测方法能扩增检测到低载量HBV感染，并且检测结果呈现相应浓度的倍数关系，因此适用于隐匿性乙肝病毒感染检测。

综上所述，本发明通过在乙肝病毒S、C基因组保守序列分别设计引物探针，运用双重双基因荧光定量PCR技术对隐匿性乙肝病毒的不同基因区段进行同管同时检测，操作简便，快速，提高隐匿性乙肝病毒检测方法的灵敏度、特异性，尽可能地降低因低载量病毒感染以及碱基突变导致假阴性结果发生的几率，并且能进一步提高OBI检测效率。该方法对其结果进行实时监控，无需进一步凝胶电泳分析。

本发明提供的引物组特异性强、灵敏度高，可用于HBV DNA的有效扩增，从而可实现低载量OBI的准确定量检测；本发明通过对HBV 2个不同基因组的高度保守片段同时进行扩增检测，有效减少假阴性等问题的发生，提高乙肝病毒检测的特异性；检测速度快，仅需一个小时，加上核酸提取，共仅需2～3小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。本发明适用于隐匿性乙肝病毒的临床或实验室定量检测，监视和预测乙肝病毒流行率，以及对HBV感染的治疗进行及时检测和评估。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学附属儿童医院

<120> 荧光定量PCR隐匿性乙肝病毒检测试剂盒

<130> PCQYK193383

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1上游引物

<400> 1

tgcccgtttg tcctctaatt cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1下游引物

<400> 2

aggtgcagtt tccatccata gg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S1探针

<400> 3

tcatcaacca ccagcacggg acca 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S2上游引物

<400> 4

ttgcccgttt gtcctctaat tc 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S2下游引物

<400> 5

catccatagg ttttgtacag caac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S2探针

<400> 6

aggatcatca accaccagca cggg 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S3上游引物

<400> 7

gtgtctgcgg cgtttatca 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S3下游引物

<400> 8

cccgtttgtc ctctaattcc ag 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S3探针

<400> 9

ttcctctgca tcctgctgct atgcc 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C1上游引物

<400> 10

atcaacactt ccggaaacta ctg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C1下游引物

<400> 11

ttcccgagat tgagatcttc tgc 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C1探针

<400> 12

ggcaggtccc ctagaagaag aact 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C2上游引物

<400> 13

agccttaaaa tctcctgagc attg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C2下游引物

<400> 14

caaattatta cccacccagg tagc 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C2探针

<400> 15

tcaccacaca gcactcaggc aagc 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C3上游引物

<400> 16

aggcaggtcc cctagaagaa g 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C3下游引物

<400> 17

acattgggat tcccgagatt gag 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C3探针

<400> 18

actccctcgc ctcgcagacg aagg 24

<210> 19

<211> 681

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> S基因区

<400> 19

atggagaaca tcacatcagg attcctagga ccccttctcg tgttacaggc ggggtttttc 60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120

tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180

tcaccaacct cttgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240

atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcct caacaaccag cacgggacca 360

tgccggacct gcatgactac tgctcaagga acctctatgt atccctcctg ttgctgtacc 420

aaaccttcgg acggaaattg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc tttcggaaaa 480

ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt 540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600

tgggggccaa gtctgtacag catcttgagt ccctttttac cgctgttacc aattttcttt 660

tgtctttggg tatacattta a 681

<210> 20

<211> 552

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C基因区

<400> 20

atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60

tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120

gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180

tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240

tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300

ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360

tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420

tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480

ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540

tctcaatgtt ag 552

Claims

1.一种引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合选自S基因区引物探针组合、C基因区引物探针组合中的至少一种，所述S基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合S1：

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：TGCCCGTTTGTCCTCTAATTCC(SEQ ID NO.1)；

含有如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：AGGTGCAGTTTCCATCCATAGG(SEQ ID NO.2)；

含有如SEQ ID NO.3所示序列的探针：TCATCAACCACCAGCACGGGACCA(SEQ ID NO.3)；

组合S2：

含有如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：TTGCCCGTTTGTCCTCTAATTC(SEQ ID NO.4)；

含有如SEQ ID NO.6所示序列的探针：AGGATCATCAACCACCAGCACGGG(SEQ ID NO.6)；

组合S3：

含有如SEQ ID NO.8所示序列的下游引物：CCCGTTTGTCCTCTAATTCCAG(SEQ ID NO.8)；

含有如SEQ ID NO.9所示序列的探针：TTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCC(SEQ ID NO.9)；

所述C基因区引物探针组合具体选自如下组合中的任意一种：

组合C1：

含有如SEQ ID NO.12所示序列的探针：GGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACT(SEQ ID NO.12)；

组合C2：

含有如SEQ ID NO.15所示序列的探针：TCACCACACAGCACTCAGGCAAGC(SEQ ID NO.15)；

组合C3：

含有如SEQ ID NO.16所示序列的上游引物：AGGCAGGTCCCCTAGAAGAAG(SEQ ID NO.16)；

含有如SEQ ID NO.18所示序列的探针：ACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGG(SEQ ID NO.18)；

上述各探针还包括荧光染料和荧光淬灭剂。

2.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于：所述荧光染料选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox、TET中的至少一种。

3.根据权利要求1所述引物探针组合，其特征在于：所述荧光淬灭剂选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ、TAMRA中的至少一种。

4.一种用于双重双基因同管荧光定量PCR检测隐匿性乙肝病毒的试剂盒，其特征在于：包括荧光定量反应液以及权利要求1-3任意一项所述引物探针组合。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：所述荧光定量反应液选自罗氏公司的2×PCR Probes Master荧光定量反应液。

6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：还包括模板、阳性参控品、阴性参控品中的至少一种。

7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：所述模板选自标准阳性模板、人基因组DNA提取液中的任一种。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于：所述标准阳性模板为重组质粒。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述重组质粒为插入乙肝病毒全基因组3215个核苷酸特异序列的pLB-T载体质粒。

10.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于：所述阳性参控品为乙肝病毒；和/或，所述阴性参控品为水。