CN102251059B

CN102251059B - 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针

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Publication number: CN102251059B
Application number: CN201110194236.XA
Authority: CN
Inventors: 唐景峰; 王业富; 刘绪
Original assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2031-07-12
Also published as: CN102251059A

Abstract

本发明公开了乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。本试剂盒包括荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、rt204位点正向引物、rt204位点反向引物、rt204M位点探针、rt204I位点探针、rt204V位点探针；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株，荧光定量PCR方法改进为“2步法”，避免了PCR延伸的步骤；探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域、特别涉及一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针。

背景技术

乙肝病毒(HBV)是一种高危险性的病毒，乙型肝炎病毒感染在世界范围广泛流行，乙肝病毒感染不仅可导致急、慢性病毒性肝炎，而且还可发展为肝硬化及肝细胞癌、每年导致大约100万人死亡、严重影响了人类的健康。乙肝病毒吸附并进入肝细胞后脱去衣壳、在DNA聚合酶作用下、以负链DNA为模板修补正链空隙、从而形成共价闭合环状的双链DNA进入细胞核内转录。在乙肝病毒的复制过程中，由于RNA的反转录缺乏读码校正功能、所以容易导致碱基错配的发生，因而病毒基因突变十分频繁，乙肝病毒的变异率是其它DNA病毒的10倍左右。病毒的变异导致病毒耐药株的出现，耐药株的出现是与病毒的高变异率和免疫压力以及各种抗病毒治疗药物诱导变异等综合因素的结果。随着抗病毒药物治疗的广泛开展，病毒变异和耐药株不断出现，一个位点的突变甚至可以引起对多种药物的交叉耐药。

拉米夫定(lamivudine、LAM)是一种双脱氧核苷类似物，拉米夫定作用于乙肝病毒基因开放阅读框的P区后，能迅速抑制乙型肝炎病毒的复制，使血清转氨酶降至正常水平。长期服用拉米夫定可显著改善肝脏炎症性坏死、减轻或阻止肝脏纤维化的进程。然而由于乙肝病毒超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子的存在，短期用药很难治愈乙型肝炎，拉米夫定的用药必须在一年以上；拉米夫定的长期使用容易导致病毒耐药，患者在服用该药后6～8个月即可能出现耐药的病毒株，随着服药时间的延长，耐药率明显增加。研究表明，长期服用拉米夫定药物，乙肝病毒DNA的P区204位的YMDD基序的蛋氨酸会被缬氨酸、异亮氨酸或被丝氨酸所取代、分别生成YVDD、YIDD或YSDD、三者均对拉米夫定耐药、YV/IDD是被广泛报道和研究的突变类型；YSDD变异是最近发现的一种新的变异类型，这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月患者的血清中发现的，体外转染研究也证实了这种YSDD变异株对拉米夫定耐药，大量测序研究表明，拉米夫定耐药的病毒株在204位密码子发生突变的同时常会出现180位密码子的联合突变，即180位的亮氨酸变为蛋氨酸，生成rtL180M。

现有技术中拉米夫定的耐药突变检测的方法主要有直接测序法、错配PCR限制性片断多态性分析法、基因芯片法、焦磷酸测序法、高效变性液相色谱法(DHPLC)和实时定量PCR等。这些方法各有利弊、并且有些检测方法的弊端暂时还没有较好的解决办法。

1、直接测序法

DNA直接测序法一直被认为是检测基因突变的金标准。很多学者都曾利用直接测序法或结合其他方法检测乙肝病毒YMDD基序变异、但由于直接测序法在大多数情况会要求将目标序列先进行PCR扩增并连接到载体，费时、费力且必须送到测序公司完成测序，显然不适合于乙肝病毒的快速诊断和大规模的检测。另外，直接测序法对于含量低的病毒以及混合突变的病毒检测显得不够灵敏，对于野生、突变混合型或不同突变型混合存在的病毒，大多数情况下只能检测到其中的一种DNA含量较高的优势病毒株；当然、直接测序法能检测新发突变位点是它的最大优势。

2、错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术

错配PCR技术最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查、目前已广泛应用于基因点突变的检测。根据PCR引物设计的不同、可将错配PCR分为间接和直接错配PCR；间接错配PCR的引物与野生型完全互补，突变株不能PCR扩增；直接错配PCR的引物与特定的点突变完全互补，野生株不能进行PCR扩增。RFLP技术是利用限制性内切酶专一性识别切割DNA序列的特点，不同的序列就会被切割成长短不一的DNA片段，再通过凝胶电泳观察酶切结果，然后对酶切图像进行多态性分析找出差异。Allen等研究表明，错位PCR和RFLP联合检测YMDD的突变株是十分精确的，有人认为在检测野生型病毒和突变型病毒混合存在的样本时RFLP比直接测序法更敏感。尽管如此，错位PCR-RFLP技术也是有缺陷的，该方法对于低浓度的突变和混合突变检测敏感性不太高、且操作较复杂、耗时较长、只能检测已知的突变位点等。

3、基因芯片技术

生物芯片技术是根据分子间特异性地相互作用的原理，将生物学研究中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生化分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的基因芯片，固体芯片表面按一定的阵列集成了大量的特异目标探针，它能与待测的有荧光标记的样品核酸通过碱基互补杂交反应，通过激光共聚焦系统检测到杂交信号、数据资料经由计算机分析处理、最后获取样品的各种信息，完成对核酸序列的大规模高通量分析。基因芯片技术广泛应用于基因突变的检测，且检测精度很高，对于检测耐药乙肝病毒是可靠和有用的一种工具；生物芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点，其缺点是费用很高、数据可能需要专业的生物信息学人员分析、只能检测已知的突变位点等。

4、焦磷酸测序技术

焦磷酸测序技术是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术、该技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，当引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。该技术可以用在研究单核苷酸多态性(SNP)、遗传多态性、植物多态性分析、分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等方面。该技术不需要凝胶电泳、也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。宋家武等，应用该技术建立了高通量测定乙型肝炎病毒YMDD突变区的方法，经标准的YMDD突变质粒及血清标本的重复性及可靠性检测，质粒标准品的突变检出率及重复率均达100％，而血清标本达98.8％。然而焦磷酸测序技术需要购买专门的实验仪器、只能精确检测大约40bp左右的碱基，而传统的测序技术可对500bp碱基进行检测。可见，焦磷酸测序技术更适于对已知突变位点的大规模检测，而不适于对大范围基因突变的筛选，这正好满足临床上对乙肝病毒YMDD突变检测的需求。

5、变性高效液相色谱(DHPLC)

DHPLC技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，DHPLC亦称为温度调节的杂合双链分析，其利用在部分变性条件下同源、异源双链DNA解链特征的差异进行变异检测。另外在非变性条件或完全变性条件下，DHPLC还可用于分离、分析双链或单链核酸片段，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA Sepcartridge分离柱。

柱温是决定DHPLC敏感性的最关键因素，先把野生型和突变型PCR产物等比例混合，将柱温升高使DNA片段开始变性，在部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物经变性复性过程，形成同源双链，同时也错配形成异源双链。由于异源双链DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被较低浓度的乙腈洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，异源双链将被测序以识别可能的突变位点；完全匹配的同源双链在目标产物处出现一个单峰。陈发林等，通过该方法检测结果显示野生型YMDD的图形呈单峰，而变异型YIDD、YVDD的DHPLC图形呈现3峰，且峰型低矮、宽大、与野生型YMDD的DHPLC图形明显不同。DHPLC具有快速、高通量、灵敏性更高、特异性更强、廉价省时、操作简单等优点。但是、它对待检样本的PCR扩增要求比较高，不但有PCR引物设计、PCR条件控制、扩增片断最适长度的要求，还对PCR样品的质量和含量、扩增产物的特异性有较高要求。PCR扩增特异性差时，会导致假阳性，以致检测失败。

现有技术中还没有一种荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸试剂盒。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种具有高度的特异性、灵敏度与准确性、且技术操作简便、自动化程度高的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物和探针，包括下述正向引物、反向引物和荧光探针的一组序列：

204位点引物和探针

rt204位点正向引物序列如序列表中SEQ ID NO.1所示：

5'GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG3'；

rt204位点反向引物序列如序列表中SEQ ID NO.2所示：

5'TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC3'；

rt204M位点探针序列如序列表中SEQ ID NO.3所示：5'CATCATCCATATAACTG3'；

rt204I位点探针序列如序列表中SEQ ID NO.4所示：5'CACATCATCAATATAACT3'；

rt204V位点探针序列如序列表中SEQ ID NO.5所示：5'TCATCCACATAACTG3'；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光染料修饰。

其中，荧光探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU、NEP；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明试剂盒利用特异性的TaqMan探针来检测乙型肝炎病毒，检测完成后无需开盖电泳，避免了产物污染及对实验室人员的伤害。

本发明可用LNA探针、MGB探针、AllGlo^TM探针来实现。

本发明实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时检测克服了扩增产物终点检测所存在的“平台效应”对产物定量的影响；本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株，试剂盒可以单用和多重检测乙肝病人的拉米夫定耐药情况，荧光定量PCR方法改进为“2步法”，避免了PCR延伸的步骤、探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。且技术操作简便、自动化程度高；由于采用闭管操作，不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题等特点，结果可靠。

附图说明

图1是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt204三重荧光定量PCR实验结果图；

图2是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt180二重荧光定量PCR实验结果图；

图3是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt204重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图；

图4是本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt180重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图；

图5是本发明实施例2中提供的拉米夫定耐药位点rt204位点YMDD/YIDD/YVDD分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图；

图6是本发明实施例2中提供的拉米夫定耐药位点rt180位点180L/180M分别检测样本的荧光定量PCR实验结果和标准曲线图。

图1、图2、图3-A、图3-C、图3-E、图4-A、图4-C、图5-A、图5-C、图5-E、图6-A和图6-C中的横坐标表示循环数(Cycle number)、纵坐标表示荧光值(Delta Rn)；

图3-B、图3-D、图3-F、图4-B、图4-D、图5-B、图5-D、图5-F、图6-B和图6-D中横坐标表示：LogC(乙肝病毒起始浓度的对数值)、纵坐标表示：Ct值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚、下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供了一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒，该试剂盒含有：荧光定量PCR反应液、其中包括DEPC处理水、Taq酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg²⁺离子的溶液、正向引物、反向引物、探针；溶液A，为聚乙二醇6000；溶液B，其中包括EDTA、SDS、Tris-HCl、NP-40；阴性质控品，为不含外源片段的PSG-TS质粒DNA片段；阳性质控品，检测rtM204I/V(YM/I/VDD)时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt204M/rt204I/rt204V相应基因组的DNA片段，检测rtL180M时，为1.0×10⁶copy/mL的含有rt180L/rt180M相应基因组的DNA片段；临界阳性质控品，检测rtM204I/V(YM/I/VDD)时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt204M/rt204I/rt204V相应基因组的DNA片段，检测rtL180M时，为1.0×10⁴copy/mL的含有rt180L/rt180M相应基因组的DNA片段；工作标准品，检测rtM204I/V(YM/I/VDD)的工作标准品为PSG-TS rt204的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt204M/rt204I/rt204V区间的133个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rtL180M的工作标准品为PSG-TS rt180的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入乙型肝炎病毒基因组中含有rt180L/rt180M区间的151个碱基对的核苷酸片段的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。

试剂盒的制造：

1.试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。

2.荧光定量PCR反应液制备

(1)引物及探针设计与合成：

选择乙型肝炎病毒耐药相关的P基因的特异突变位点区域片段作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得乙型肝炎病毒目前已有的8个基因型的乙型肝炎病毒耐药突变位点的基因序列，并通过Vector NTI Advance11软件分别对8个基因型的相应耐药突变位点区间进行序列比对，选择保守区域设计引物和探针。

rt204M序列如序列表中SEQ ID NO.10所示：

CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCT

rt204I序列如序列表中SEQ ID NO.11所示：

CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATTGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCT

rt204V序列如序列表中SEQ ID NO.12所示：

CCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATGTGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCT

rt180L序列如序列表中SEQ ID NO.13所示：

GCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCC

rt180M序列如序列表中SEQ ID NO.14所示：

GCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCC。

利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件Primer Express3.0设计引物、探针序列。引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保引物、探针序列能检测全部8个基因型序列。在本发明中，探针的5’端修饰的荧光染料可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU、NEP或URA；3’端修饰的荧光染料可选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL等。

设计结果如下表所示：

注：“Y和R”为兼并碱基。

Y＝(C/T)、R＝A/G。

表中：F：forward，正向引物；

R：reverse，反向引物；P：probe，探针，探针既可为TaqMan-MGB探针也可为LNA探针或AllGlo^TM探针。

FAM：荧光报告基团。

BHQ或Eclipse：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果、委托宝生物工程(大连)有限公司合成引物和探针。

(2)荧光定量PCR反应液配制：DEPC处理水27.5μL、5U/μL的热启动Taq酶0.3μL、10mmol/L(每种NTP浓度)的dNTPs1μL、10×PCR Buffer5μL、25mmol/L的MgCl₂溶液7μL、10μmol/L的正向引物1.6μL、10μmol/L的反向引物1.6μL和10μmol/L的探针1μL、配制成荧光定量PCR反应液。

3.质控品制备

(1)阴性质控品制备：不含外源片段的PSG-TS质粒DNA片段

取不含外源片段的PSG-TS质粒溶液于样本准备区预处理，定量稀释至浓度为1×10⁷copy/ml(比浊法)，吸取质粒DNA溶液于离心管中，混匀，直接吸取5μL作模板。

(2)阳性质控品制备：高浓度的含有rt204M/rt204I/rt204V相应基因组的DNA片段和高浓度的含有rt180L/rt180M相应基因组的DNA片段；

含rt204M/rt204I/rt204V位点的乙型肝炎病毒菌液(菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供)经培养后，取含rt204M/rt204I/rt204V位点的乙型肝炎病毒菌液100μL加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清液，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁶copy/ml，即可作为rt204M/rt204I/rt204V位点阳性质控品模板；rt180L/rt180M位点的乙型肝炎病毒的阳性质控品模板的制备选用含rt180L/rt180M位点的乙型肝炎病毒菌液，制作方法与上述的制作方法相同。

(3)临界阳性质控品制备：低浓度的含有rt204M/rt204I/rt204V相应基因组的DNA片段和(或)低浓度的含有rt180L/rt180M相应基因组的DNA片段；

含rt204M/rt204I/rt204V位点的乙型肝炎病毒菌液和含rt180L/rt180M位点的乙型肝炎病毒菌液(菌株由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供)经培养后，取含rt204M/rt204I/rt204V位点的乙型肝炎病毒菌液100μL加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清液，加入50μL裂解溶液B，充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液用分光光度计测A₂₆₀定量，然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁴copy/ml，即可作为rt204M/rt204I/rt204V位点临界阳性质控品模板；rt180L/rt180M位点的乙型肝炎病毒的临界阳性质控品模板的制备选用含rt180L/rt180M位点的乙型肝炎病毒菌液，制作方法与上述的制作方法相同。

4.DNA提取液制备：

(1)溶液A，浓度为15％的聚乙二醇6000(PEG6000)；

(2)溶液B，其中包括乙二胺四乙酸(EDTA)(1mM)、SDS(0.5％)、Tris-HCl(10mM、pH8.0)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)(0.1％)；

5.工作标准品制备：

(1)工作标准品1，为1.0×10⁷copy/mL的PSG-TS rt204质粒DNA溶液和/或1.0×10⁷copy/mL的PSG-TS rt180质粒DNA溶液；

(2)工作标准品2，为1.0×10⁶copy/mL的PSG-TS rt204质粒DNA溶液和/或1.0×10⁶copy/mL的PSG-TS rt180质粒DNA溶液；

(3)工作标准品3，为1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS rt204质粒DNA溶液和/或1.0×10⁵copy/mL的PSG-TS rt180质粒DNA溶液；

(4)工作标准品4，为1.0×10⁴copy/mL的PSG-TS rt204质粒DNA溶液和/或1.0×10⁴copy/mL的PSG-TS rt180质粒DNA溶液；

检测rtM204I/V(YM/I/VDD)的工作标准品为PSG-TS rt204的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入乙型肝炎病毒基因组中含有rt204M/rt204I/rt204V区间的133个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rtL180M的工作标准品为PSG-TS rt180的质粒DNA，该质粒是在PSG-TS载体中插入乙型肝炎病毒基因组中含有rt180L/rt180M区间的151个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取质粒DNA；经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A₂₆₀定量；然后根据公式换算并稀释至1.0×10⁹copy/ml，-20℃保存。贮存浓度为1.0×10⁹copy/ml，使用前用无菌生理盐水或0.01mol/L PBS进行10倍梯度的系列稀释。工作浓度依次为1.0×10⁷copy/ml、1.0×10⁶copy/ml、1.0×10⁵copy/ml和1.0×10⁴copy/ml，使用前，12000rmp离心1分钟，取上清液作模板。

本发明的试剂盒可以按照下表进行配置(24人份/盒)：

本发明的试剂盒在-10℃±5℃避光储存、避免反复冻融；有效期6个月；适用仪器(ABI7500、ABI7300、Bio-Rad iQ5^TM、Stratagene Mx3000P、Stratagene Mx3005P、达安7000)等。

实施例1

用本发明的试剂盒在ABI7300荧光定量PCR仪上检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸的方法

(1)采集样品：采集人血清样品；

a、用无菌注射器抽取受检者1ml静脉血，注入无菌1.5ml离心管中，于室温静置2小时，转入4℃静置1小时，8000rpm离心5分钟，吸取200μL上清(注意勿吸入红细胞)，转入另一无菌1.5ml离心管中，即为血清标本。

b、标本保存和运输：如果标本不立即测试，应储存于-20℃、避免反复冻融。标本长途运送应采用0℃冰壶。

(2)样品处理：取待测血清各100μL，加入等量15％溶液A，混匀，13000rpm离心10min，去上清，加入50μL裂解溶液B充分混匀后，在100℃加热10min，13000rpm再离心10min，取上清液待测；

(3)加样：向装有45μL荧光定量PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品各5μL，盖好管盖，5,000rpm离心10秒；

rt204FQ-PCR反应体系如下表：

试剂名称及浓度	加入量/人份(μl)	终浓度
			10×PCR buffer	5.0	1×PCR buffer
MgCl₂(25mmol/L)	7.0	3.5mmol/L
			dNTPs(10mmol/L)	3	0.6mmol/L
rt204FP(10μmol/L)	3.5	0.70μmol/L
			rt204RP(10μmol/L)	3.5	0.70μmol/L
rt204M Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			rt204I Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
rt204V Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			Taq酶(5U/μl)	0.9	6.0U/份
模板	5
			加水	19.1
总体积	50

rt180FQ-PCR反应体系如下表：

试剂名称及浓度	加入量/人份(μl)	终浓度
			10×PCR buffer	5.0	1×PCR buffer
MgCl₂(25mmol/L)	7.0	3.5mmol/L
			dNTPs(10mmol/L)	2	0.4mmol/L
rt180FP(10μmol/L)	2.3	0.46μmol/L
			rt180RP(10μmol/L)	2.3	0.46μmol/L
rt180L Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
			rt180M Probe(10μmol/L)	1	0.20μmol/L
Taq酶(5U/μl)	0.6	4.0U/份
			模板	5
加水	23.8
			总体积	50

(4)荧光定量PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，选择要用的Taqman探针；定义样品孔：阴性质控品选NTC；待检样品、阳性质控品及临界阳性质控品选Unknown。

按下表进行荧光定量PCR扩增；

在反应程序的第二步的终了读取荧光值Ct；

(5)分析判断：

分析判断：

Ct值小于28的为阳性；Ct值大于32的为阴性；Ct值大于和等于28且小于和等于32的为临界阳性。

本发明实施例1的rt204位点探针在10⁷copies/μl的相同质粒浓度条件下三重荧光定量PCR试验结果如图1所示，rt180位点探针在10⁷copies/μl的相同质粒浓度条件下二重荧光定量PCR试验结果如图2所示。本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt204重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果如图3所示；本发明实施例1中提供的拉米夫定耐药位点rt180重组质粒倍比稀释扩增曲线和标准曲线结果图如图4所示。

(6)测定结果：

使用ABI公司的7500仪器，得出YM/I/VDD探针和rtL180M探针在质粒浓度均为10⁷时多重荧光定量PCR扩增曲线的Ct值如下表：

探针名称	YMDD	YIDD	YVDD
				Ct值	10.43	10.56	10.52

实施例2

用本发明的试剂盒按照实施例1的方法定量检测未知样本的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸。60个未知样本来源于××医院病人待测定耐药的乙肝病毒样品。

本发明实施例2的YMDD位点探针分别对样本荧光定量PCR试验的结果如图5所示，其中，A，B：分别代表rt204M(野生株)的扩增曲线及标准曲线；C，D：分别代表rt204I(突变株)的扩增曲线及标准曲线；E，F：分别代表rt204V(突变株)的扩增曲线及标准曲线；由图可以看出，曲线呈平滑S型，扩增效果较好。rt180位点探针分别对样本荧光定量PCR试验的结果如图6所示，其中，A、B：分别代表rt180L(野生株)的扩增曲线及标准曲线；C，D：分别代表rt180M(突变株)的扩增曲线及标准曲线；由图可以看出，曲线呈平滑S型，扩增效果较好。

rt204的具体样本扩增结果如下：

rt180的具体样本扩增结果如下：

由表可见，YI/VDD耐药时两者通常不会同时发生耐药突变，而是其中的一种，YI/VDD耐药能同时伴随着YMDD的耐药突变；同样，对于rtL180M耐药突变，rt180M耐药突变样本中同时能检测出rt180L野生型，YMDD探针和180L探针均能检测出野生型的病毒株，通常两者是同时出现的，YIDD/YVDD耐药可能有部分伴随着180M位点耐药。

以上所述仅为本发明的较佳实施例、并不用以限制本发明、凡在本发明的精神和原则之内、所作的任何修改、等同替换、改进等、均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物和探针，包括下述正向引物、反向引物和荧光探针的一组序列：

204位点引物和探针

rt204位点正向引物序列为：5'GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG3'；

rt204位点反向引物序列为:5'TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC3'；

rt204M位点探针序列为：5'CATCATCCATATAACTG3'；

rt204I位点探针序列为：5'CACATCATCAATATAACT3'；

rt204V位点探针序列为：5'TCATCCACATAACTG3'。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物和探针，其特征在于，其中，荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、MAR、JUP、SAT、PLU或NEP；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。