KR101072899B1 - 아미노산 스페이서가 결합된 펩티드 핵산의 합성 및 그의응용 - Google Patents

아미노산 스페이서가 결합된 펩티드 핵산의 합성 및 그의응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다수의 알킬렌글리콜(alkyleneglycol)을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산이 하나 이상 결합된 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, 이하 'PNA'라 함) 올리고머와 이의 합성법에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 기능화된 고형지지체의 표면에 고정된 PNA 올리고머을 이용하여 타겟 유전자를 검출하는 장치에서 고형지지체와 PNA 올리고머 사이의 충분한 거리를 유지하여 PNA 올리고머와 타겟 유전자와의 상호 작용이 방해받지 않도록 공간을 확보할 수 있게 하는 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산 스페이서에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 이용하여 제작된 민감도와 특이성이 개선된 PNA 어레이, PNA 칩 및 유전자 진단용 키트에 관한 것이다.
Figure R1020080006078
펩티드핵산, peptide nucleic acid, PNA, 스페이서, 칩, 어레이, 핵산 검출 장치

Description

아미노산 스페이서가 결합된 펩티드 핵산의 합성 및 그의 응용{Synthesis of peptide nucleic acids conjugated with amino acids and their application}
본 발명은 펩티드 핵산(peptide nucleic acid, 이하 'PNA'라 함) 올리고머에 스페이서(spacer)로 다수의 알킬렌글리콜(alkyleneglycol)을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산이 하나 이상 결합된 PNA와 이의 합성법에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 PNA 올리고머을 이용하여 PNA 어레이를 제작할 때 고형지지체와 PNA 올리고머 사이의 충분한 거리를 유지하여 타겟 유전자와의 상호 작용을 원할하게 할 수 있도록 공간을 확보할 수 있게 하는 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산 스페이서에 대한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 이용하여 제작된 민감도와 특이성이 개선된 PNA 어레이, PNA 칩 및 유전자 진단용 키트에 관한 것이다.
PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다 (Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, “Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine- substituted polyamide”, Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500) (도 1). PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 핵산의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산 분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 이중가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 PNA는 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.
염기 서열이 알려진 탐침(probe)을 이용하여 균일 용액에서 핵산 염기 서열을 인식하거나 검출하는 경우 보통 한 번에 하나의 서열만을 인식할 수 있을 뿐, 색깔이 다른 형광 염료를 쓰는 경우 수 개 이상의 서열을 동시에 검출하는 것은 어렵다. 그에 비해 고체 표면에 고정한 탐침을 이용하면 그보다 훨씬 많은 수의 탐침을 이용하여 특정 핵산 염기 서열의 존재 여부를 동시에 검사할 수 있다. 수십만개 이상의 탐침을 2차원으로 배열한 DNA 마이크로어레이가 이미 상용화되어 있다. DNA 탐침 대신 PNA 탐침을 사용한 PNA 마이크로어레이 또는 PNA 칩도 알려져 있다 (Brandt O, Hoheisel JD, “Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors” Trends Biotechnology 2004, Vol. 22, pp617-622). 2차원의 위치 정보 대신 구분할 수 있는 수 ㎛ 크기의 마이크로구슬(microbead 또는 microsphere) 표면에 PNA 탐침을 고정시켜 다수의 탐침에 대한 검사를 동시에 하는 방법도 알려져 있다 (Rockenbauer E, Petersen KH, Vogel U, Bolund L,
Figure 112008004756060-pat00001
S, Nielsen KV,
Figure 112008004756060-pat00002
BA, “SNP genotyping using microsphere-linked PNA and flow cytometric detection” Cytometry Part A 2005, Vol. 64A, pp80-86). 형광을 이용하여 탐침에 상보적인 핵산 염기 서열이 혼성화되었는지를 알아내는 방법이 널리 쓰이지만 실리콘 반도체 또는 실리콘 나노선(nanowire)에 고정한 PNA를 이용한 전계 효과 트랜지스터를 써서 핵산 염기 서열을 전기적인 방법으로 검출하는 방법도 알려져 있다 [F. Uslu et al. “Labelfree fully electronic nucleic acid detection system based on a field-effect transistor device”, Biosensors and Bioelectronics 2004, Vol. 19 pp1723-1731; J. Hahm and C. M. Lieber, “Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors”, Nano Letters 2004, Vol. 4, pp51-54]. 임피던스 변화로 핵산 염기 서열을 검출하는 장치도 보고되었다 [A. Macanovic et al. “Impedance-based detection of DNA sequences using a silicon transducer with PNA as the probe layer”, Nucleic Acids Research 2004, Vol.32, e20].
타겟 핵산이 혼성화하기 전과 후에는 탐침의 질량이 변화하므로 이에 따르는 기계적인 변화를 이용해서도 핵산 염기 서열을 검출할 수 있다. DNA 또는 RNA가 결합하기 전과 결합한 후는 마이크로외팔보(microcantilever) 또는 표면 음파(surface acoustic wave, SAW) 센서의 진동 주파수가 다르기 때문에 이를 검출할 수 있다. PNA를 사용하는 마이크로외팔보와 SAW 센서가 보고되었다 [S. Manalis and T. Burg, US Patent 7,282,329 “Suspended microchannel detectors”; P. Warthoe and S. Iben, US Patent Application Publication 2004/0072208 A1 “Surface acoustic wave sensors and method for detecting target analytes”].
이렇게 여러 PNA 탐침을 상대로 동시에 염기 서열을 검사하는 장치나 방법에서는 PNA를 고체표면에 고정할 필요가 있다. 고정화하는 방법으로는 물리적 결합보다 안정한 화학적 공유 결합을 이용하는 경우가 많다. 일반적으로 PNA 칩, DNA 칩, 단백질 칩 등의 바이오 칩에서는 알데히드(aldehyde)-아민, 카복실 산(carboxylic acid)-아민, 에폭사이드(epoxide)-아민 반응에 의해 생성되는 공유결합을 이용하는 고정화 방법이 널리 이용된다 (M. Schena, Microarray analysis, A John Wiley & Sons, Inc., Publication, pp95-120). 유리 표면에 고정화하는 경우에는 일반적으로 알데히드나 아민 그리고 에폭시 기를 가지고 있는 유기실란 (organosilane) 물질을 실릴화 (silylation) 과정을 통하여 유리 표면에 기능성 작용기가 표출되게 만들고, PNA의 N-말단의 아민(amine)기를 상기 표출된 기능성 작용기와 반응시켜 공유결합을 형성한다.
고체 표면에 고정된 탐침을 사용하는 경우 탐침이 지지체에 너무 가까우면 탐침이 타겟 유전자와 혼성화할 때 지지체에 의한 입체 장애를 받게 되므로 이를 개선하기 위하여 탐침(Probe)과 고형 지지체 사이에 스페이서를 사용한다. 인산 결합으로 연결된 핵산(nucleotide) 스페이서와 비교적 짧은 사슬의 아미노산 스페이서가 사용될 수 있다. 이러한 스페이서는 길이, 전하, 소수성(hydrophobicity) 그리고 용매화(solvation) 같은 특성에 따라 타겟 물질과 탐침의 상호 작용에 많은 영향을 준다.
DNA 칩에 있어서 타겟 유전자의 검출 민감도 및 특이성을 증가시키기 위하여 주로 인산 결합으로 연결된 핵산 스페이서를 사용하였다 (Magdalena Gabig, Acta Bio . Polonica, 2001, 48, 615). 그러나 인산 결합으로 연결된 핵산 스페이서에는 아미드 결합을 형성하는 아민(amine), 카복실 산(carboxylic acid) 이나 에스테르(ester) 잔기가 존재하지 않아 아미드 결합으로 뼈대가 연결된 PNA에 직접 도입하기에 적합하지 않다. 또한 인산 음이온은 혼성화 효율을 낮추는 문제가 있다 (W. Pils and R. Micura, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 1859.; 미국특허 US 7,205,104). 또한 양전하 또는 음전하를 띄는 스페이서의 경우 중성의 스페이서에 비해 혼성화 효율이 감소하는 것으로 알려져 있다 (M. S. Shchepinov, Nucleic Acids Research, 1997, 25, 1155). 이런 문제점으로 인해 PNA에 아미드(amide) 결합을 이뤄 쉽게 도입할 수 있는 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid) 과 같은 선형구조를 갖는 중성의 아미노산 유도체가 사용되었다. PNA 올리고머에 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산 여러 개가 중합된 탐침을 합성 하고 이를 고정화하여 지지체와 PNA 올리고머 사이에 공간을 확보함으로서 혼성화 효율을 증가시킬 수 있다.
그러나 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산은 길이가 짧기 때문에 지지체와 PNA 사이의 충분한 거리를 유지하려면 PNA 올리고머에 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산을 4~5회 또는 그 이상 반복하여 중합해야 하는 번거로움이 있다. 따라서 중합 반응을 여러 번 반복하지 않고도 PNA 올리고머와 지지체 사이에 충분한 거리를 유지할 수 있도록 길이가 긴 스페이서를 사용할 필요가 있다.
본 발명은 PNA 올리고머에 활용되는 기존의 아미노산 스페이서보다 길이가 긴, 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서가 결합된 PNA 및 그의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 다수의 알킬렌글리콜 기를 갖는 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서를 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 이용하여 기능화된 표면에 고정화하는 효율을 높여 민감도와 특이성을 개선시킨 고정화 방법 및 상기 고정화방법을 이용하여 기능화된 유리 기판 뿐만 아니라 기능화된 플라스틱 기판, 실리카, 반도체, 자성입자, 나이론, 고분자화합물, 박막, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스의 고형물질의 표면에 고정하여 제작되어 민감도와 특이성이 개선된 PNA 칩 및 유전자 진단용 키트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여 PNA 올리고머에 스페이서로 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산이 하나 이상 결합된 PNA와 이의 합성법 및 이의 활용에 대한 것이다. 더욱 상세하게는 기능성 분자인 PNA의 아민 말단(N-terminal)에 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산 유도체를 결합시켜 제조된 PNA 탐침 및 이를 이용하여 지지체 표면과 PNA 올리고머 사이의 충분한 거리를 유지하여 타겟 유전자의 검출 민감도 (sensitivity) 와 특이성 (specificity) 및 용해도를 개선하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 PNA 올리고머을 이용하여 PNA 어레이를 제작할 때 고형지지체와 PNA 올리고머 사이의 충분한 거리를 유지하여 타겟 유전자와의 상호 작용을 원활하게 할 수 있도록 공간을 확보할 수 있게 하는 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 사슬의 아미노산 스페이서에 대한 것으로, 선형 또는 가지형의 사슬이 더 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 이용하여 제작된 민감도와 특이성이 개선된 PNA 어레이, PNA 칩 및 유전자 진단용 키트에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 사용되는 PNA는 DNA의 골격이 되는 N-(2-아미노에틸)글리신(N-(2-aminoethyl)glycine)의 아미드로 대체된 인공 합성 DNA 유사체로써 하기 구조로 표현되며, 1991년 덴마크의 Buchardt, Nielsen, Egholm, Berg 등에 의해 합성이 최초로 보고되었으며 DNA 대비 우수한 물성을 지니고 있다.
Figure 112008004756060-pat00003
N-(2-아미노에틸)글리신(N-(2-aminoethyl)glycine)이 중합된 기본 골격의 PNA가 가장 흔히 사용되지만 아래 구조의 PNA도 알려져 있고 [P.E. Nielsen and M. Egholm “An Introduction to PNA” in P.E. Nielsen (Ed.) “Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications” 2nd Ed. Page 9 (Horizon Bioscience, 2004)] 이러한 PNA도 본 발명에 이용될 수 있다.
Figure 112008004756060-pat00004
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 바람직하게 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머로, 하기 구조로서 예시될 수 있다.
Figure 112008004756060-pat00005
상기 구조에서, B는 천연 또는 비천연 핵산염기로, 구체적인 예로는 티민(thymine), 시토신(cytosine), 아데닌(adenine) 또는 구아닌(guanine)이고, w는 8 내지 40의 정수이다. 비천연 핵산 염기에는 2,6-디아미노퓨린(2,6-Diaminopurine), 슈도이소시토신(Pseudoisocytosine), 2-티오우라실(2-Thiouracil), 5-브로모우라실(5-Bromouracil), 이노신(Inosine) 등이 있다. 이외에 여러 핵산 염기에 결합할 수 있는 유니버셜 염기로 1,2-디데옥시-D-리보퓨라노스(1,2-dideoxy-D-ribofuranose) 및 1,2-디데옥시-1-페닐-β-D-리보퓨라노스(1,2- dideoxy-l-phenyl-β-D-rlbofuranose) [T. A. Millican et al. Nucleic Acids Research, 1984, 12, 7435-7453], 하이포잔틴(Hypoxanthine), 잔틴(xanthine) 및 탈아민화된 구아닌 [R. Eritja et al., Nucleic Acids Research, 1986, 14, 8135-8153] 및 2'-데옥시이노신(2'-deoxyinosine) [F. Seela and K. Kaiser, Nucleic Acids Research, 1986, 14, 1825-1844], 5'-플루오로데옥시우리딘(5'-fluorodeoxyuridine) [J. F. Habener et al., 1988, Proceedings of the National Academy of Sciences., 85, 1735-1739] 및 메톡시시토신(methoxycytosine), 6H,8H-3,4-디하이드로-피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온(6H,8H-3,4-dihydro-pyrimido[4, 5-c][1, 2] oxazin-7-one) [P. K. T. Lin and D. M. Brown., 1989, Nucleic Acids Research, 17, 10373-10383] 등이 있다. 문헌 [D. Loakes, “Survey and Summary: The applications of universal DNA base analogues” Nucleic Acids Research, 2001, vol. 29 pp2437-2447]에 더 많은 유니버셜 염기의 예가 있다.
본 발명에 따른 PNA 올리고머의 아민 말단(N-terminal)에 아미노산 스페이서가 결합된 PNA는 하기 화학식 1로 표현된다.
[화학식 1]
Figure 112008004756060-pat00006
[상기 식에서, Z 는 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머이며, 상기 PNA 올리고머의 아민(N)말단이 카보닐에 결합되며;
L1 및 L2 는 서로 독립적으로 화학결합이거나 직쇄 또는 분쇄의 탄소수 1 내지 15의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 8개의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
Y는 수소 또는 지지체에 고정화하기 위한 링커이고;
m 및 n 은 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.]
상기 화학식 1에서 지지체에 고정화하기 위한 링커인 Y는 하기 구조로 나타낼 수 있다.
Figure 112008004756060-pat00007
[상기 구조에서 L3, L4 및 L5는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 3개의 산소로 더 치환될 수 있고; E는 CH 또는 N이고; a은 0 또는 1 이고, b는 2 내지 10 의 정수이다.]
상기 링커 Y의 구조에서 L3, L4 및 L5는 서로 독립적으로 화학결합이거나 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- 또는 -CH2CH2CH2CH2-이고, E는 CH 또는 N이며, b는 2 내지 7의 정수이며, a는 0 또는 1인 것이 바람직하며, 하기 구조로 표시되는 링커로, 이에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112008004756060-pat00008
Figure 112008004756060-pat00009
Figure 112008004756060-pat00010
Figure 112008004756060-pat00011
본 발명은 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머에 하기 화학식 2로 표시되는 아미노산 스페이서 단량체를 순차적으로 1 내지 10회 반응시켜 하기 화학식 3의 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 제조하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 2]
Figure 112008004756060-pat00012
[상기 식에서, L1 및 L2 는 서로 독립적으로 화학결합이거나 직쇄 또는 분쇄의 탄소수 1 내지 15의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 8개의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
X는 수소 또는 아민 보호기이고;
n 은 1 내지 10의 정수이다.]
[화학식 3]
Figure 112008004756060-pat00013
[상기 식에서, Z 는 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머이며, 상기 PNA 올리고머의 아민(N)말단이 카보닐에 결합되며;
L1 및 L2 는 서로 독립적으로 화학결합이거나 직쇄 또는 분쇄의 탄소수 1 내지 15의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 8개의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
m 및 n 은 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.]
또한, 본 발명은 상기 화학식 3의 아미노산 스페이서가 결합된 PNA에 하기 화학식 4로 표시되는 고정화 링커 단량체를 순차적으로 2 내지 10회 추가 반응시켜 하기 화학식 5의 고정화 링커가 부착된 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 제조하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 4]
Figure 112008004756060-pat00014
[화학식 5]
Figure 112008004756060-pat00015
[상기 화학식 4 및 5에서, Z 는 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머이며, 상기 PNA 올리고머의 아민(N)말단이 카보닐에 결합되며;
L1 및 L2 는 서로 독립적으로 화학결합이거나 직쇄 또는 분쇄의 탄소수 1 내지 15의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 8개의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
L3, L4 및 L5는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 3개의 산소로 더 치환될 수 있고;
E는 CH 또는 N이고; X는 아민 보호기이고;
a은 0 또는 1 이고; b는 2 내지 10의 정수이고; m 및 n 은 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.]
상기 화학식 2로 표시되는 아미노산 단량체 또는 화학식 4로 표시되는 고정화 링커 단량체는 아민기를 보호하기 위하여 통상의 아민보호기를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 t-부톡시카보닐(Boc), 9H-플로렌-9-일메톡시카보닐(Fmoc), 트리틸(trityl), 벤질, 클로로아세틸, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 포밀, 트리플루오로아세틸, p-톨루엔술포닐, 벤젠술포닐, 메탄술포닐, p-니트로벤질옥시카보닐 또는 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐 등이 있다.
상기 화학식 2로 표시되는 아미노산 단량체의 L1은 -CH2-이고, L2는 -CHH2CH2OCH2CH2-이고, n은 2, 4 또는 6인 것이 바람직하고, 하기 화학식 2-1로 예시될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2-1]
Figure 112008004756060-pat00016
[상기 화학식에서, n은 2, 4 또는 6이다.]
상기 화학식 2의 아미노산 단량체의 제조방법을 예를 들어 설명하면, 도 3 내지 도 5 에 도시된 바와 같이, 양말단에 아민기와 알코올기를 갖는 2-(2-아미노에톡시)에탄올 (2-(2-Aminoethoxy)ethanol)을 전구체로 하여 아민을 보호기로 보호한 후 4-니트로페닐 클로로포메이트(4-Nitrophenyl chloroformate)와 반응시켜 다른 말단의 알코올을 활성화된 카보네이트(carbonate)로 변환한다. 활성화된 카보네이트를 2-(2-아미노에톡시)에탄올의 아민기와 반응시켜 카바메이트(carbamate)를 합성한다. 이러한 알코올의 활성화와 아미노알콜의 반응을 반복하여 에틸렌글리콜(ethyleneglycol) 이외에 다양한 알킬렌글리콜이 포함된 다양한 길이의 선형 아미노산 스페이서 단량체를 합성할 수 있다.
또한 본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 대한민국 공개특허공보 제2007-0040420호의 방법에 따라 Bts (Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체로부터 합성되었으며, 이외에도 알려진 9-플루오레닐메틸 카바메이트(9-fluorenylmethyl carbamate, Fmoc) 또는 t-부톡시카보닐(t-butoxycarbonyl, Boc)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성 할 수도 있으며 (J. Org . Chem., 59, 5767-5773, J. Peptide Sci . 3, 175-183, Tetrahedron Letters, 22, 6179-6194), PNA 합성 방법에 따라 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
도 2에 본 발명에 따른 PNA의 고체상 합성(solid phase synthesis) 과정을 도식화하였다. PNA 올리고머는 대한민국 등록특허 10-0464261의 방법에 따라 Bts기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 합성하였다. 합성 과정은 PNA 올리고머의 아민기에 결합되어 있는 보호기를 제거하는 탈보호 (deprotection) 과정, PNA 또는 아미노산 스페이서 단량체를 PNA에 결합시키는 중합 (coupling or conjugation) 과정, 반응하지 않은 아민기의 활성을 제거하는 캡핑 (capping) 과정의 총 3단계로 이루어진다.
본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 기능화된 고체 표면에 고정화시키기 위하여 일반적으로 사용되는 말단에 있는 아민기를 이용하여 고형물질의 표면에 고정화시켜 PNA 칩 어레이 또는 유전자 진단용 키트 등을 제작할 수 있다. 상기 고형물질은 유리기판, 실리카, 반도체, 자성입자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록세인(poly(dimethyl siloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스가 바람직하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 고형물질의 표면은 알데히드 기, 카르복실 산 기, 에폭시 기, 이소티오시아네이트 기, N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 기 또는 활성화 에스터 기의 작용기로 기능화되어 있다.
본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA 올리고머는 유리, 실리카, 반도체, 자성 입자, 플라스틱, 금 또는 은 튜브 또는 박막, 다공성 필터 또는 비드에 결합되어 있는 칩(chip) 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 기능화된 고형물질의 표면에 고정하여 핵산 염기 서열을 검출하거나 분석하는 장치를 제작할 수 있다. 이러한 장치에는 다수의 PNA 프로브가 2차원으로 배열된 PNA 마이크로어레이, PNA 칩, 표면에 PNA가 고정된 수 ㎛ 크기의 마이크로구슬, 실리콘 반도체 또는 실리콘 나노선(nanowire)에 고정된 PNA를 이용한 전계 효과 트랜지스터, 임피던스 검출기, 마이크로외팔보, 표면음파센서 등이 있으나, 본 발명이 이것들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 아미노산 스페이서의 효과를 살펴보기 위하여 PNA 칩에서 반응 및 분석조건 수립하였다.
우선, (a) 상기 PNA 칩에 표적 DNA를 함유하는 반응 시료를 가한다.
(b) PNA 탐침과 표적 DNA를 혼성화 반응시킨다.
(c) PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
단계 (a)에서, 표적 DNA는 바이오틴(biotin)이 말단에 표지된 프라이머를 이용하여, 다양한 길이의 표적핵산을 제작한다.
단계 (b)에서, PNA 탐침과 표적 핵산의 혼성화 반응이 잘 일어날 수 있도록 적당한 성분을 포함하는 혼성화 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.　 이때 프라이머 말단에 표지되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색하는 스트렙타비딘-시아닌 5(Streptavidin-cy5)를 첨가하여 혼성화하는 것이 바람직하다.　 혼성화 반응 후에는, 반응되지 않은 잔여 표적 핵산과 비특이적 반응물을 효과적으로 제거할 수 있는 세척 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
단계 (c)에서, 검출수단으로는 DNA/DNA 혼성화 반응 유무에 의한 신호를 검출하는 광학적, 전기화학적, 기타 방법을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 시아닌 5(cy5), 바이오틴 결합 화합물, 시아닌 3(cy3) 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.　 바람직하게는 스트렙타비딘-시아닌 5를 이용하여 표적 핵산의 말단에 부착되어 있는 바이오틴과 결합하여 발색되는 형광을 스캐닝하는 것이 바람직 하다.　
상기에서 살펴본 것과 같이, 본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA는 기능성 분자인 PNA의 아민 말단(N-terminal)에 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서 단량체를 1개 또는 여러 개를 중합시켜 스페이서의 길이를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 다수의 알킬렌글리콜을 갖는 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서 단량체는 아민기와 알코올기를 양말단에 갖는 전구체의 아민기 보호, 알코올기를 활성화된 카보네이트로 변환, 카바메이트 합성 및 카보네이트로의 변환과정을 통하여 카바메이트로 연결된 알킬렌글리콜의 길이를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA는 긴 선형 사슬의 아미노산 스페이서로 인하여 PNA 칩 제작 시 지지체와 PNA 올리고머 사이의 충분한 거리를 유지하여 타겟 유전자의 검출 신호강도와 민감도를 개선하는데 큰 효과가 있다.
본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA 올리고머는 유리, 실리카, 반도체, 자성 입자, 플라스틱, 금 또는 은 튜브 또는 박막, 다공성 필터 또는 비드에 결합되어 있는 칩(chip) 형태로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 기능화된 고형물질의 표면에 고정하여 핵산 염기 서열을 검출하거나 분석하는 다양한 장치를 제작할 수 있다.
도 2 내지 도 4는 본 발명에 따른 PNA 올리고머 합성 및 긴 선형구조의 아미노산 스페이서의 합성과정을 도식화하였으며, 이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
[ 실시예 1] 긴 선형구조의 아미노산 단량체 (화합물 8)의 합성 [도 3]
Figure 112008004756060-pat00017
[1-1] t-부틸 2-(2- 하이드록시에톡시 ) 에틸카바메이트 ( tert - butyl 2-(2-hydroxyethoxy)ethylcarbamate ; 화합물 1)의 합성
2-(2-아미노에톡시)에탄올 (30g, 0.28mol)을 디클로로메탄 500ml에 용해 후 얼음조(ice-bath)로 충분히 냉각한 후 t-부톡시카보닐 무수물 (Boc anhydride, 82g, 0.36mol, 1.3eq)를 천천히 가하였다. 20분 동안 충분히 냉각한 후 트리에틸아민 (40ml, 0.28mol, 1eq)를 가한 후 상온에서 40분 동안 교반 하였다. 반응 혼합물을 1N 염산(HCl) 수용액 500ml로 씻어주었다. 유기층을 얻어 황산마그네슘 (MgSO4) 으로 건조한 후 용매를 제거하여 표제화합물인 t-부틸 2-(2-하이드록시에톡시)에틸카바메이트 (화합물 1)를 56g (수율 92%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.44 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.21 (q, J = 5.2 Hz, -HNCH 2 CH2-, 2H), 3.53 - 3.60 (m, -CH2 CH 2 OCH 2 -, -OCH2-, 4H), 3.69 (q, J = 4.4 Hz, -CH2 CH 2 OH, 2H), 4.69 (brs, -CH2 OH, 1H), 5.9 (brs, -CNHCH2-, 1H)
[1-2] t-부틸 2-(2-((4- 니트로페녹시 ) 카보닐옥시 ) 에톡시 ) 에틸카바메이트 ( tert - butyl 2-(2-((4-nitrophenoxy)carbonyloxy)ethoxy)ethylcarbamate ; 화합물 2)의 합성
t-부틸 2-(2-하이드록시에톡시)에틸카바메이트(화합물 1) (tert-butyl 2-(2-hydroxyethoxy) ethyl carbamate, 47g, 0.14mol)을 디클로로메탄 400ml에 용해 후 얼음조로 충분히 냉각한 후 4-니트로페닐클로로포메이트 (4-Nitrophenyl chloroformate, 33.2g, 0.17mol, 1.2eq)을 디클로로메탄에 녹여 천천히 가하였다. 20분 동안 충분히 냉각한 후 트리에틸아민 (39ml, 0.28mol, 2eq)를 가한 후 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 염산 수용액 500ml로 2회 씻어주었다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제화합물인 t-부틸 2-(2-((4-니트로페녹시)카보닐옥시)에톡시)에틸카바메이트 (화합물 2)를 57.8g (수 율 90.7%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.44 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.32 (q, J = 5.2 Hz, -HNCH 2 CH2-, 2H), 3.56 (t, J = 5.2 Hz, -CH2 CH 2 O- , 2H), 3.67 (t, J = 5.2 Hz, -OCH 2 CH2-, 2H), 4.25 (t, J = 4.4 Hz, -CH2 CH 2 O-, 2H), 5.2 (brs, -CNHCH2-, 1H), 7.45 (d, J = 6.8 Hz, Ar-H, 2H), 8.33 (d, J = 6.8 Hz, Ar-H, 2H)
[1-3] 2-(2-(t- 부톡시카보닐아미노 ) 에톡시 )에틸 2-(2- 하이드록시에톡시 ) 에틸카바메 이트 (2-(2-( tert - butoxycarbonylamino ) ethoxy ) ethyl 2-(2- hydroxyethoxy ) ethylcarbamate ; 화합물 3)의 합성
t-부틸 2-(2-((4-니트로페녹시)카보닐옥시)에톡시)에틸카바메이트 (화합물 2) (tert -butyl 2-(2-((4-nitrophenoxy)carbonyloxy)ethoxy)ethylcarbamate, 47g, 0.12mol)을 디클로로메탄 500ml에 용해 후 2-(2-아미노에톡시)에탄올(19.3ml, 0.18mol, 1.5eq)를 천천히 가한 후 트리에틸아민 (12.5ml, 0.084mol, 0.7eq)를 가하고 후 상온에서 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N HCl 500ml로 씻어준 뒤, 다시 0.5N 수산화나트륨 (NaOH) 수용액으로 2회 씻어주었다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하여 표제화합물인 2-(2-(t-부톡시카보닐아미노)에톡시)에틸 2-(2-하이드록시에톡시)에틸카바메이트 (화합물 3)를 40g (수율 92%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.44 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.32 - 3.46 (m, -HNCH 2 CH2-, 4H), 3.56 - 3.62 (m, -CH2 CH 2 O-, 4H), 3.67 - 3.79 (m, -OCH 2 CH2-, 4H), 4.25 (t, J = 5.2 Hz, -CH2 CH 2 O-, 2H), 4.65 (t, J = 4.4 Hz, -CH2 CH 2 OH, 2H), 4.8 (brs, -CH2 OH, 1H), 4.9 (brs, -CNHCH2-, 1H), 5.2 (brs, -CNHCH2-, 1H)
[1-4] 2-(2-(t- 부톡시카보닐아미노 ) 에톡시 )에틸 2-(2-((4- 니트로페녹시 ) 카보닐옥시 ) 에톡시 ) 에틸카바메이트 (2-(2-( tert - butoxycarbonylamino ) ethoxy ) ethyl 2-(2-((4- nitrophenoxy ) carbonyloxy ) ethoxy ) ethylcarbamate ; 화합물 4)의 합성
2-(2-(t-부톡시카보닐아미노)에톡시)에틸 2-(2-하이드록시에톡시)에틸카바메이트 (화합물 3) (2-(2-(tert-butoxycarbonylamino)ethoxy)ethyl 2-(2-hydroxyethoxy)ethylcarbamate, 47g, 0.14mol)로 [1-2]와 동일한 방법을 사용하여 표제화합물인 2-(2-(t-부톡시카보닐아미노)에톡시)에틸 2-(2-((4-니트로페녹시)카보닐옥시)에톡시)에틸카바메이트 (화합물 4)를 57.8g (수율 91%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.47 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.35 (q, J = 5.2 Hz, -HNCH 2 CH2-, 2H), 3.46 (q, J = 5.2 Hz, -HNCH 2 CH2-, 2H), 3.58 (t, J = 5.2 Hz, -CH2 CH 2 O-, 2H), 3.64 (t, J = 5.2 Hz, -CH2 CH 2 O-, 2H), 3.69 (t, J = 4.4 Hz, -OCH 2 CH2-, 2H), 3.81 (t, J = 4.4 Hz, -OCH 2 CH2-, 2H), 4.27 (t, J = 4.4 Hz, -CH2 CH 2 O-, 2H), 4.48 (t, J = 4.4 Hz, -CH2 CH 2 O-, 2H), 4.97 (brs, -CNHCH2-, 1H), 5.21 (brs, -CNHCH2-, 1H), 7.45 (d, J = 6.8 Hz, Ar-H, 2H), 8.33 (d, J = 6.8 Hz, Ar-H, 2H)
[1-5] (2-{2-[2-(2-t- 부톡시카보닐아미노에톡시 ) 에톡시카보닐아미노 ] 에톡시 } 에톡시 카보닐아미노)아세트산 에틸 에스테르 ((2-{2-[2-(2- tert - Butoxycarbonylamino ethoxy)ethoxycarbonylamino]ethoxy}ethoxycarbonylamino) acetic acid ethyl ester ; 화합물 5)의 합성
글리신 에틸에스테르 (Glycine ethylester.HCl, 8.5g, 0.06mol, 1.5eq)을 디메틸포름아미드 300ml에 용해시킨 후 2-(2-(t-부톡시카보닐아미노)에톡시)에틸 2-(2-((4-니트로페녹시)카보닐옥시)에톡시)에틸카바메이트 (화합물 4) (2-(2-(tert-butoxycarbonylamino)ethoxy)ethyl 2-(2-((4-nitrophenoxy) carbonyloxy)ethoxy) ethylcarbamate, 20g, 0.04mol)와 트리에틸아민 (17ml, 0.12mol, 3eq)를 차례로 가한 후 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N HCl 500ml로 2회 씻어준 후 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조 한 후 농축하였다. 농축액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제화합물인 (2-{2-[2-(2-t-부톡시카보닐아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노)-아세트산 에틸 에스테르 (화합물 5)를 17.5g (수율 94.2%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.29 (t, J = 7.1 Hz, -CH2 CH 3 , 3H), 1.45 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.33 (q, J = 5.2 Hz, -HNCH 2 CH2-, 2H), 3.38 (q, J = 5.2 Hz, -HNCH 2 CH2-, 2H), 3.53-3.58 (m, -CH2 CH 2 O-, 4H), 3.64 - 3.67 (m, -OCH 2 CH2-, 4H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.18-4.26 (m, -CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH3, 6H), 5.04 (brs, -CNHCH2-, 1H), 5.50 (m, -CNHCH2-, 2H)
[1-6] (2-{2-[2-(2-t- 부톡시카보닐아미노에톡시 ) 에톡시카보닐아미노 ] 에톡시 } 에톡시 카보닐아미노)아세트산 ((2-{2-[2-(2- tert - butoxy carbonylaminoethoxy)ethoxy carbonylamino ] ethoxy } ethoxy carbonylamino ) acetic acid ; 화합물 7)의 합성
(2-{2-[2-(2-t-부톡시카보닐아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노)아세트산 에틸 에스테르(화합물 5) ((2-{2-[2-(2-tert-butoxy carbonylaminoethoxy)ethoxycarbonylamino]ethoxy}ethoxycarbonylamino)acetic acid ethyl ester, 12.2g, 0.026mol)을 테트라히드로퓨란(THF) 150ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 2N 수산화리튬 (LiOH) 수용액 40ml를 천천히 가한 후 상온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 THF를 제거한 후 1N 염산을 천천히 가하여 산성화 한 후 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하여 표제 화합물인 (2-{2-[2-(2-t-부톡시카보닐아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노)아세트산 (화합물 7)을 11g (수율 90.1%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.45 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.31 (q, -HNCH 2 CH2-, J = 5.2 Hz, 2H), 3.37 (q, -HNCH 2 CH2-, J = 5.2 Hz, 2H), 3.55-3.58 (m, -CH2 CH 2 O-, 4H), 3.66-3.68 (m, -OCH 2 CH2-, 4H), 3.98 (d, -NHCH 2 C-, J = 5.7 Hz, 2H), 4.25-4.27 (m, -CH2 CH 2 O-, 4H), 5.14-5.60 (m, -CNHCH2-, 3H)
[1-7] [2-(2-{2-[2-((9 H - 플루오렌 -9- 일메톡시 ) 카보닐아미노 ) 에톡시 ] 에톡시카보닐아 미노} 에톡시 ) 에톡시카보닐아미노 ]아세트산 ([2-(2-{2-[2-((9 H - Fluoren -9-yl methoxy ) carbonylamino ) ethoxy ] ethoxycarbonylamino } ethoxy ) ethoxycarbonylamino ]acetic acid ; 화합물 8)의 합성
(2-{2-[2-(2-t-부톡시카보닐아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노)아세트산 (화합물 7) ((2-{2-[2-(2-tert-butoxy carbonyl aminoethoxy)ethoxycarbonylamino]ethoxy}ethoxy carbonylamino)acetic acid, 7.1g, 0.016mol) 을 디클로로메탄 80ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 트리플루오르아세트산 80ml를 천천히 가한 후 상온에서 30분 동안 교반 하였다. 용매 제거 후 디에틸에테르로 2회 씻어준 후 건조하였다. 건조한 화합물을 디클로로메탄 80ml에 용해 후 얼음조로 충분히 냉각한 후 트리에틸아민(22ml, 0.16mol, 10eq)를 천천히 가하여 중성화 하였다. N-석신이미달 9H-플루오렌-9-일메탈 카보네이트(Fmoc-OSu, 6.6g, 0.019mol, 1.2eq)을 가한 후 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 염산으로 2회 씻어준 후 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제 화합물인 [2-(2-{2-[2-((9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐아미노)에톡시]에톡시카보닐아미노}에톡시)에톡시카보닐아미노]아세트산 (화합물 8)을 6.8g(수율 76%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 3.33 - 3.35 (m, -HNCH 2 CH2-, 4H), 3.46-3.63 (m, CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH2, 8H), 3.96 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.21-4.23 (m, -CH2 CH 2 O-, -CHCH2- 5H), 4.40 (d, J = 6.8 Hz, -CHCH 2 O-, 2H), 5.55 - 5.66 (m, -CNHCH2-, 3H), 7.30 (t, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.39 (t, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.60 (d, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.76 (d, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H); MALDI-TOF MS for C27H33N3O10 [M+H+]: calcd 599.58, found 590.62
[ 실시예 2] 긴 선형구조의 아미노산 단량체 (화합물 12)의 합성 [도 4]
Figure 112008004756060-pat00018
[2-1] 에틸 38,38-디메틸-4,12,20,28,36- 펜타옥소 -5,8,13,16,21,24,29,32,37- 노나옥사 -3,11,19,27,65- 펜타아자노나트리아콘탄 -1- 오에이트 ( ethyl 38,38- dimethyl -4,12,20,28,36-pentaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32,37-nonaoxa-3,11,19,27,35-penta azanonatriacontan -1- oate ; 화합물 9)의 합성
(2-{2-[2-(2-t-부톡시카보닐아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노 아세트산 에틸 에스테르 (화합물 5) ((2-{2-[2-(2-tert-butoxy carbonylaminoethoxy)ethoxycarbonylamino]ethoxy}ethoxycarbonylamino)acetic acid ethyl ester, 13.2g, 0.03mol, 1eq)을 디클로로메탄 100ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 트리플루오르아세트산 150ml를 천천히 가한 후 상온에서 30분 동안 교반하였다. 용매 제거 후 디에틸에테르로 2회 씻어준 후 건조하여 (2-{2-[2-(아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노)아세트산 에틸에스터의 트리플루오르아세트산 염 (화합물 6) ((2-{2-[2-(aminoethoxy)ethoxycarbonylamino] ethoxy}ethoxycarbonylamino)acetic acid ethyl ester. trifluoroacetic acid)를 14.3g (수율 99.4%) 얻었다. 상기 (2-{2-[2-(아미노에톡시)에톡시카보닐아미노]에톡시}에톡시카보닐아미노)아세트산 에틸에스터의 트리플루오르아세트산 염 (화합물 6) (14.1g, 0.029mol, 1.5eq)을 디클로로메탄 200ml에 용해 후 얼음조로 충분히 냉각한 후 트리에틸아민 (28ml, 0.2mol, 10eq)를 천천히 가하여 중성화 하였다. 전에 합성한 2-(2-(t-부톡시카보닐아미노)에톡시)에틸 2-(2-((4-니트로페녹시)카보닐옥시)에톡시)에틸카바메이트 (화합물 4) (2-(2-(tert-butoxycarbonylamino)ethoxy)ethyl 2-(2-((4- nitrophenoxy)carbonyloxy)ethoxy)ethylcarbamate, 10g, 0.02mol, 1eq)을 가하였다. 여기에 트리에틸아민(5.6ml, 0.04mol, 2eq)를 천천히 가한 후 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 염산 수용액 250ml로 3회 씻어주었다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제화합물인 에틸 38,38-디메틸-4,12,20,28,36-펜타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37-노나옥사-3,11,19,27,65-펜타아자노나트리아콘탄-1-오에이트 (화합물 9) 를 10.2g (수율 74%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.29 (t, J = 7.1 Hz, -CH2 CH 3 , 3H), 1.44 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.30-3.40 (m, -HNCH 2 CH2-, 8H), 3.52-3.58 (m, -CH2 CH 2 O-, 8H), 3.65-3.66 (m, -OCH 2 CH2-, 8H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.18-4.26 (m, -CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH3, 10H), 5.07 (brs, -CNHCH2-, 1H), 5.42-5.60 (m, -CNHCH2-, 4H).
[2-2] 38,38-디메틸-4,12,20,28,36- 펜타옥소 -5,8,13,16,21,24,29,32,37- 노나옥사 -3,11,19,27,35-펜타아자-1- 노나트리아콘타노익 산 (38,38-dimethyl-4,12,20,28,36- pentaoxo -5,8,13,16,21,24,29,32,37- nonaoxa -3,11,19,27,35- pentaaza -1-nonatriacontanoic acid ; 화합물 11)의 합성
에틸 38,38-디메틸-4,12,20,28,36-펜타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37-노나옥사-3,11,19,27,65-펜타아자노나트리아콘탄-1-오에이트 (화합물 9) (ethyl 38,38- dimethyl-4,12,20,28,36-pentaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32,37-nonaoxa-3,11,19,27, 35-pentaazanonatriacontan-1-oate; 17g, 0.025mol)을 THF 170ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 2N 수산화리튬 수용액 55ml를 천천히 가한 후 상온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 THF를 제거한 후 1N 염산을 천천히 가하여 산성화한 후 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하여 표제화합물인 38,38-디메틸-4,12,20,28,36-펜타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37-노나옥사-3,11,19,27,35-펜타아자-1-노나트리아콘타노익 산 (화합물 11)를 15.5g (수율 98.3%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.44 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.30-3.40 (m, -HNCH 2 CH2-, 8H), 3.52 - 3.69 (m, -CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH2-, 16H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.17-4.24 (m, -CH2 CH 2 O-, 8H), 5.21 - 5.70 (m, -CNHCH2-, 5H).
[2-3] 1-(9 H - 플루오렌 -9-일)-3,11,19,27,35- 펜타옥소 -2,7,10,15,18,23,26,31,34- 노 나옥사-4,12,20, 28,36- 펜타아자 -28- 옥타트리아콘타노익 산 (1-(9 H - fluoren -9- yl )-3,11,19,27,35-pentaoxo-2,7,10,15,18,23,26,31,34-nonaoxa-4,12,20,28,36-penta aza-38-octatriacontanoic acid ; 화합물 12)의 합성
38,38-디메틸-4,12,20,28,36-펜타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37-노나옥사-3,11,19,27,35-펜타아자-1-노나트리아콘타노익 산 (화합물 11) (38,38-dimethyl- 4,12,20,28,36-pentaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32,37-nonaoxa-3,11,19,27,35-penta aza-1-nonatriacontanoic acid, 10g, 0.015mol) 을 디클로로메탄 100ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 트리플루오르아세트산 150ml를 천천히 가한 후 상온에서 30분 동안 교반하였다. 용매 제거 후 디에틸에테르로 2회 씻어준 후 건조하였다. 건조한 화합물을 디클로로메탄 100ml에 용해 후 얼음조로 충분히 냉각한 후 트리에틸아민(20ml, 0.15mol, 10eq)을 천천히 가하여 중성화 하였다. N-석신이미딜 9H-플루오렌-9일메틸 카보네이트을 가한 후 2시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 염산으로 2회 씻어준 후 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제화합물인 1-(9H-플루오렌-9-일)-3,11,19,27,35-펜타옥소-2,7,10,15,18,23,26, 31,34-노나옥사-4,12,20,28,36-펜타아자-28-옥타트리아콘타노익 산 (화합물 12)를 9.1g (수율 78%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 3.33-3.45 (m, -HNCH 2 CH2-, 8H), 3.46 - 3.63 (m, -CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH2-, 16H), 3.96 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.19-4.23 (m, -CH2 CH 2 O-, -CHCH2-, 9H), 4.40 (d, J = 6.8 Hz, -CHCH 2 O, 2H), 5.56 - 5.80 (m, -CNHCH2-, 5H), 7.29 (t, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.36 (t, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.57 (d, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.73 (d, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H); MALDI-TOF MS for C37H51N5O16 [M+H+]: calcd 821.84, found 822.96
[ 실시예 3] 긴 선형구조의 아미노산 단량체 (화합물 15)의 합성 [도 5]
Figure 112008004756060-pat00019
[3-1] 에틸 54,54-디메틸-4,12,20,28,36,44,52- 헵타옥소 -5,8,13,16,21,24,29,32, 37,40,45,48,53-트리데카옥사-3,11,19,27,35,43,51- 헵타아자펜타펜타코탄 -1- 오에이 트 ( Ethyl 54,54- dimethyl -4,12,20,28,36,44,52- heptaoxo -5,8,13,16,21,24, 29,32,37,40,45,48,53- tridecaoxa -3,11,19,27,35,43,51-heptaazapentapentacontan-1-oate ; 화합물 13)의 합성
에틸 38,38-디메틸-4,12,20,28,36-펜타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37-노나옥사-3,11,19, 27,65-펜타아자노나트리아콘탄-1-오에이트 (화합물 9) (ethyl 38,38-dimethyl-4,12,20,28,36-pentaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32,37-nonaoxa-3,11, 19,27,35-pentaazanonatriacontan-1-oate, 2.8g, 0.0039mol, 1eq)을 디클로로메탄 30ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 트리플루오르아세트산 30ml를 천천히 가한 후 상온에서 30분 동안 교반하였다. 용매 제거 후 디에틸에테르로 2회 씻어준 후 건조하여 (2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(아미노에톡시)에톡시카보닐아미노)에톡시)에톡시카보닐아미노)에톡시)에톡시카보닐아미노)에톡시)에톡시카보닐아미노)아세트 산 에틸 에스터의 트리플루오르아세트산 염 (화합물 10) ((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxycarbonylamino)ethoxy)ethoxycarbonylamino)ethoxy)ethoxy carbonylamino)ethoxy)ethoxycarbonyl amino) acetic acid ethylester. trifluoroacetic acid)를 3.0g(수율 99.6%) 얻었다. (2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(아미노에톡시)에톡시카보닐아미노)에톡시)에톡시카보닐아미노)에톡시)에톡시카보닐아미노)에톡시)에톡시카보닐아미노)아세트산 에틸 에스터의 트리플루오르아세트산 염 (화합물 10) (3.0g, 0.0039, 1.2eq)을 디클로로메탄 30ml에 용해 후 얼음조로 충분히 냉각한 후 트리에틸아민 (5.6ml, 0.04mol, 10eq)를 천천히 가하여 중성화 하였다. 전에 합성한 2-(2-(t-부톡시카보닐아미노)에톡시)에틸 2-(2-((4-니트로페녹시)카보닐옥시)에톡시)에틸카바메이트 (화합물 4) (2-(2-(tert-butoxycarbonylamino)ethoxy)ethyl 2-(2-((4-nitrophenoxy)carbonyloxy)ethoxy) ethylcarbamate, 1.7g, 0.0033mol, 1eq)을 가하였다. 여기에 트리에틸아민 (2.7ml, 0.02mol, 5eq)를 천천히 가한 후 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 1N HCl로 3회 세척하였다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 73% 수율로 표제 화합물인 에틸 54,54-디메틸-4,12,20,28,36,44,52-헵타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37,40,45,48,53-트리데카옥사-3,11,19,27,35,43,51-헵타아자펜타펜타코탄-1-오에이트 (화합물 13)을 2.5g (수율 73%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.28 (t, -CH2 CH 3 , J = 7.1 Hz, 3H), 1.45 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.30-3.40 (m, -HNCH 2 CH2-, 12H), 3.52 - 3.58 (m, -CH2 CH 2 O-, 12H), 3.65-3.67 (m, -OCH 2 CH2-, 12H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.17 - 4.26 (m, -CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH3, 14H), 5.09 (brs, -CNHCH2-, 1H), 5.50-5.62 (m, -CNHCH2-, 6H).
[3-2] 54,54-디메틸-4,12,20,28,36,44,52- 헵타옥소 -5,8,13,16,21,24,29,32,37,40, 45,48,53-트리데카옥사-3,11,19,27,35,43,51- 헵타아자 -1- 펜타펜타코타노익 산 (54,54-dimethyl-4,12,20,28,36,44,52-heptaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32,37,40,45, 48,53-tridecaoxa-3,11,19,27,35,43,51-heptaaza-1-pentapentacontanoic acid ; 화합물 14)의 합성
에틸 54,54-디메틸-4,12,20,28,36,44,52-헵타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32, 37,40,45,48,53-트리데카옥사-3,11,19,27,35,43,51-헵타아자펜타펜타콘탄-1-오에이트(화합물 13) (ethyl 54,54-dimethyl-4,12,20,28,36,44,52-heptaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32,37,40,45,48,53-tridecaoxa-3,11,19,27,35,43,51-heptaaza pentapentacontan-1-oate, 2.4g, 0.0025mol)을 THF 30ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 2N 수산화리튬 수용액 8ml를 천천히 가한 후 상온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 THF를 제거한 후 1N 염산을 천천히 가하여 산성화 한 후 디클로로메탄으로 3회 추출하였다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하여 표제 화합물인 54,54-디메틸-4,12,20,28,36,44,52-헵타옥소-5,8,13,16,21, 24,29,32,37,40,45,48,53-트리데카옥사-3,11,19,27,35,43,51-헵타아자-1-펜타펜타코타노익 산 (화합물 14)을 2.3g(수율 99.1%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 1.48 (s, ( CH 3 ) 3 C-, 9H), 3.36 - 3.37 (m, -HNCH 2 CH2-, 12H), 3.48 - 3.56 (m, -CH2 CH 2 O-, 12H), 3.65 - 3.67 (m, -OCH 2 CH2-, 12H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.17 - 4.24 (m, -CH2 CH 2 O-, 12H), 5.13 (brs, -CNHCH2-, 1H), 5.53 - 5.73 (m, -CNHCH2-, 6H).
[3-3] 1-(9 H - 플루오렌 -9-일)-3,11,19,27,35,43,51- 헵타옥소 -2,7,10,15,18,23,26, 31,34,39,42,47,50-트리데카옥사-4,12,20,28,36,44,52- 헵타아자 -54- 테트라펜타콘타 노익 산 (1-(9 H - fluoren -9- yl )-3,11,19,27,35,43,51- heptaoxo -2,7,10,15,18,23,26, 31,34,39,42,47,50- tridecaoxa -4,12,20,28,36,44,52- heptaaza -54-tetrapenta contanoic acid ; 화합물 15)의 합성
54,54-디메틸-4,12,20,28,36,44,52-헵타옥소-5,8,13,16,21,24,29,32,37,40, 45,48,53-트리데카옥사-3,11,19,27,35,43,51-헵타아자-1-펜타펜타코타노익 산 (화합물 14) (54,54-dimethyl-4,12,20,28,36,44,52-heptaoxo-5,8,13,16,21,24,29,32, 37,40,45,48,53-tridecaoxa-3,11,19,27,35,43,51-heptaaza-1-pentapentacontanoic acid, 2.3g, 0.0024mol) 을 디클로로메탄 30ml에 용해 후 교반하였다. 여기에 트리플루오르아세트산 30ml를 천천히 가한 후 상온에서 30분 동안 교반하였다. 용매 제 거 후 디에틸에테르로 2회 씻어준 후 건조하였다. 건조한 화합물을 디클로로메탄 30ml에 용해 후 얼음조로 충분히 냉각한 후 트리에틸아민 (3.3ml, 0.024mol, 10eq)를 천천히 가하여 중성화하였다. N-석신이미딜 9H-플루오렌-9-일메틸 카보네이트 (Fmoc-OSu, 1.7g, 0.0048mol, 2eq)을 가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 1N 염산으로 2회 씻어준 후 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제 화합물인 1-(9H-플루오렌-9-일)-3,11,19,27,35,43,51-헵타옥소-2,7,10,15,18,23,26,31,34,39,42,47,50-트리데카옥사-4,12,20,28,36,44,52-헵타아자-54-테트라펜타콘타노익 산 (화합물 15)을 1.8g(수율 69%)로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 3.34-3.36 (m, -HNCH 2 CH2-, 12H), 3.54-3.63 (m, -CH2 CH 2 O-, -OCH 2 CH2-, 24H), 3.95 (d, J = 5.7 Hz, -NHCH 2 C-, 2H), 4.17 - 4.24 (m, -CH2 CH 2 O-, -CHCH2-, 13H), 4.40 (d, J = 6.8 Hz, -CHCH 2 O, 2H), 5.56-5.83 (m, -CNHCH2-, 7H), 7.31 (t, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.40 (t, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.60 (d, J = 7.3 Hz, Ar-H, 2H), 7.76 (d, Ar-H, J = 7.3 Hz, 2H); MALDI-TOF MS for C47H69N7O22 [M+H+]: calcd 1084.11, found 1085.30
[ 실시예 4 내지 8] 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서를 갖는 PNA 탐침 ( probe )의 합성
PNA 올리고머는 대한민국 공개특허공보 제2007-0040420호의 방법에 따라 Bts (Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법으로 합성되었으며, PNA가 레진에 부착된 상태로 다음 반응에 이용되었다.
1) 상기에서 제조된 레진에 부착된 PNA를 1M 염화리튬(LiCl)의 디메틸포름아미드 용액과 메톡시벤젠티올(Methoxybenzene thiol)을 7.7/1(v/v)의 비율로 가하고 상온에서 1분간 흔들어 준 후 메톡시벤젠티올의 70%(Vol%) 비율의 디이소프로필에틸아민을 가하여 40℃에서 10분간 흔들어 주어 PNA의 N-말단의 Bts 아민보호기를 제거한 후 디메틸포름아미드로 5번 세척한다.
2) 레진의 5 당량(eq)의 아미노산(실시예 1 내지 실시예 3에서 제조된 화합물 8, 화합물 12 또는 화합물15), 5 당량의 N-하이드록시벤조트리아졸 (N-hydroxybenzotriazole), 10 당량의 디이소프로필카보디이미드 (diisopropyl carbo diimide) 과 디메틸포름아미드를 가하고 40℃에서 1시간 동안 흔들어준 후 디메틸포름아미드로 5번 세척한다.
3) 5% 무수초산과 6% 루티딘(Lutidin)이 함유된 디메틸포름아미드를 첨가한 후 상온에서 5분간 흔들어준 후 디메틸포름아미드로 3번 세척한다.
4) 10% 피페리딘(piperidine)의 디메틸포름아미드 용액으로 상온에서 20분간 처리하여 N-말단의 Fmoc 아민보호기를 제거한 후 디메틸포름아미드로 5번 세척한 다.
5) 상기 2)에서 4)의 과정을 원하는 만큼 반복하여 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서를 갖는 PNA를 합성한다.
6) 상기 5)에서 합성된 스페이서가 부착된 PNA 올리고머에 FmocLys(Fmoc)-OH를 이용하여 상기 2)에서 4)에 기재된 아미노산 스페이서의 부착 방법과 동일한 방법으로 2회 반복하여 고정화 링커가 부착된 긴 선형 구조의 아미노산 스페이서를 갖는 PNA를 합성한다.
7) 상기 6)에서 합성된 PNA 탐침이 부착된 레진을 m-크레졸/트리플루오로아세트산 = 1/4 (v/v) 용액으로 2시간 처리하여 PNA 탐침을 레진으로부터 떼어내고 디에틸에테르를 첨가하여 석출시킨다.
8) 석출 된 PNA를 여과하고 디에틸에테르로 세척한 후 HPLC로 정제하여 실시예 4 내지 8의 아미노산 스페이서가 중합된 PNA 화합물을 합성하였다.
[표 1]
Figure 112008004756060-pat00020
[ 실시예 9] 재조합 HBV 클론 확보
대장균 JM109(스트라타진(Stratagene), USA)를 통하여 형질전환하여 B형간염 바이러스(Human Hepatitis Virus, HBV)의 야생형과 라미부딘에 내성이 있는 돌연변이형의 DNA를 대량 확보하였고, 염기서열분석으로 야생형과 돌연변이형 유전자를 확인하였다.
[ 실시예 10] 표적 핵산의 제조
임상 검체에서 추출한 DNA 및 실시예 9의 방법으로 확보한 HBV의 라미부딘 내성에 관련된 야생형과 각각의 돌연변이 유전자형 DNA를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다.
PCR은 하기 표 2에 나타낸 바이오틴이 표지된 프라이머를 이용하였고, 주형 DNA로 일차 PCR한 산물을 이용하였으며, 하기 조건으로 PCR을 수행하여 DNA를 증폭하였다.
주형 DNA 용액 (50 ng/㎕) 1 ㎕, 센스 프라이머(10 pmol/㎕) 1.25 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmol/㎕) 0.75 ㎕, dNTP(10 mM) 1 ㎕, 10× Taq 완충액(MgCl2 포함) 5 ㎕, Taq 1 유닛, 증류수 30.8 ㎕의 조성으로 94 ℃에서 4 분간 처리한 후, 94 ℃에서 1 분, 58 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1 분을 30회 반복하였다.
반응이 끝난 산물 (200bp, 536bp, 773bp, 1014bp; 도 6에 DNA 염기서열 나타냄.) 5 ㎕에 젤 로딩 버퍼 1 ㎕ 를 넣고 1.5% 아가로즈 젤에서 전기영동한 후 1 ug/ml 에티듐브로미드 (ethidium bromide, EtBr)에 염색한 후 UV 트랜스 일루미네이터 (UV-transilluminator)에서 산물을 확인하였다. 전기영동 한 결과를 도 7에 나타내었다
[표 2]
Figure 112008004756060-pat00021
[ 실시예 11] PNA 칩의 제작
상기 표 1에 나타낸 실시예 4 내지 8의 정제된 PNA 올리고머를 스팟팅 완충액에 50 mM로 희석하여 에폭시기로 기능화 된 유리판에 핀 방식으로 스팟팅하고, 75% 습도가 유지되는 상온에서 4 시간 동안 정치하였다. 이후 디메틸포름아미드에 가하고 15 분간 초음파 세척하였다. 0.1 M 무수숙신산을 첨가한 디메틸포름아미드에 가하고 40 ℃에서 2 시간 동안 반응하지 않은 아민기를 제거하였다. 반응 후 반응액을 제거하고 디메틸포름아미드, 3차 증류수 순으로 15 분간 초음파 세척하였다. 이후 0.1 M 에탄올아민이 함유된 100 mM 트리스 완충액(Tris-HCl)을 가하고 고체 표면의 잔여 에폭시기를 불활성화하였다. 이 유리 기판을 3차 증류수로 15 분간 초음파 세척하는 과정을 2회 반복한 후, 끓는 물에서 5 분간 처리하고 3차 증류수 를 이용하여 5 분간 세척하고 건조하였다. 이후 100 ㎕의 혼성화 용액이 함유될 수 있도록 제작된 실리콘 반응기를 유리판 위에 밀착시켰다.
[ 실시예 12] PNA 칩에서의 표적 핵산과의 혼성화 반응
바이오틴이 부착된 PCR 산물을 혼성화 완충액 100 ㎕에 5 ㎕ 첨가하여 사용하고, 이때 형광반응을 일으키기 위하여 스트렙타비딘-시아닌 5를 첨가하였다. 실시예 11 에서 각각 제작된 유리 슬라이드의 실리콘 반응기 구멍을 통하여 100 ㎕의 혼성화 혼합액을 주입하고, 40 ℃에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후에 세척 완충액으로 상온에서 5 분간 2회 세척하고 건조하였다. 형광 스캐너(진픽스(Genepix) 4000B, 엑손(Exon), 미국)를 이용하여 유리 슬라이드의 이미지를 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 8의 결과로부터 PCR 산물 크기에 따른 특이성 (P/M ratio, perfect match/mismatch signal ratio)을 비교하여 도 9에 도시하였다.
도 8은 각 PCR 산물의 크기에 따른 스페이서 길이 별로 특이 신호의 세기를 나타낸 것으로 각각의 크기의 PCR 산물(200,500,700,1000bp)에서 스페이서의 길이가 길어질수록 특이 신호가 증가하였다.
도 9는 각 스페이서의 길이에 따른 특이신호와 비특이신호의 분리능을 나타낸 것으로 PCR 산물의 크기가 200bp와 500bp의 경우는 스페이서의 길이가 19 atom보다 38 atom에서 P/M 비율이 증가하였고, 38 atom보다는 70atom에서 P/M 비율이 증가하였다. 또한 70 atom보다 102 atom 에서 P/M 비율이 증가하였다. 그러나 102 atom와 153 atom의 경우는 P/M 비율에 큰 차이를 나타나지 않았다.
PCR 산물의 크기가 700bp와 1000bp의 경우는 스페이서의 길이가 19 atom보다 38 atom에서 P/M 비율이 증가하였고, 38 atom 보다는 70atom 에서 P/M 비율이 증가하였다. 또한 70 atom보다 102 atom에서 P/M 비율이 증가하였다. 또한 102 atom보다 153 atom에서 P/M 비율의 증가를 나타내었다.
도 1은 PNA와 DNA의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 PNA 올리고머의 고체상 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 제조되는 선형 구조의 아미노산 스페이서 화합물 8의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 제조되는 선형 구조의 아미노산 스페이서 화합물 12의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에서 제조되는 선형 구조의 아미노산 스페이서 화합물 15의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 6은 표면에 고정화 되는 PNA 탐침과 상보적인 PCR 산물 크기에 따른 DNA 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 10의 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행하여 DNA 증폭한 전기영동 결과를 나타낸 것이다[M : 1kb + ladder, 1: 200bp 표적핵산, 2: 536bp 표적핵산, 3: 773bp 표적핵산, 4: 1014bp 표적핵산].
도 8은 실시예 12에서 스페이서 길이를 달리하여 합성한 PNA 탐침을 고정한 PNA칩에 PCR 산물을 혼성화하여 얻은 신호의 민감도와 특이성을 비교한 것이다.
도 9는 PCR 산물 크기에 따라 도 8의 신호의 특이성 (P/M ratio, perfect match /mismatch signal ratio)을 비교한 것이다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1의 아미노산 스페이서가 결합된 PNA.
    [화학식 1]
    Figure 112008004756060-pat00022
    [상기 식에서, Z 는 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머이며, 상기 PNA 올리고머의 아민(N)말단이 카보닐에 결합되며;;
    L1 및 L2 는 서로 독립적으로 화학결합이거나 직쇄 또는 분쇄의 탄소수 1 내지 15의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 8개의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
    Y는 수소 또는 지지체에 고정화하기 위한 링커이고;
    m 및 n 은 서로 독립적으로 1 내지 10의 정수이다.]
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 L1은 -CH2-이고, L2는 -CH2CH2OCH2CH2-이고, m은 1 내지 3의 정수이며, n은 2, 4 또는 6인 것을 특징으로 하는 아미노산 스페이서가 결합된 PNA.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 Y는 하기 구조의 링커인 것을 특징으로 하는 아미노산 스페이서가 결합된 PNA.
    Figure 112008004756060-pat00023
    [상기 구조에서 L3, L4 및 L5는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 3개의 산소로 더 치환될 수 있고; E는 CH 또는 N이고; a은 0 또는 1 이고, b는 2 내지 10 의 정수이다.]
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 Y는 하기 구조에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아미노산 스페이서가 결합된 PNA.
    Figure 112008004756060-pat00024
    Figure 112008004756060-pat00025
    Figure 112008004756060-pat00026
    Figure 112008004756060-pat00027
  5. 하기 화학식 2로 표시되는 아미노산 스페이서 단량체.
    [화학식 2]
    Figure 112008004756060-pat00028
    [상기 식에서, L1 및 L2 는 서로 독립적으로 화학결합이거나 직쇄 또는 분쇄의 탄소수 1 내지 15의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 8개의 산소(O)로 더 치환될 수 있고;
    X는 수소 또는 아민 보호기이고;
    n 은 1 내지 10의 정수이다.]
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 아민 보호기인 X 는 t-부톡시카보닐(Boc), 9H-플로렌-9-일메톡시카보닐(Fmoc), 트리틸(trityl), 벤질, 클로로아세틸, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 포밀, 트리플루오로아세틸, p-톨루엔술포닐, 벤젠술포닐, 메탄술포닐, p-니트로벤질옥시카보닐 또는 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐인 것을 특징으로 하는 아미노산 스페이서 단량체.
  7. 핵산 염기 8 내지 40개의 PNA 올리고머에 하기 화학식 2로 표시되는 아미노산 스페이서 단량체를 순차적으로 반응시켜 화학식 3의 아미노산 스페이서가 결합된 PNA을 제조하는 것을 특징으로 하는 아미노산 스페이서가 결합된 PNA의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure 112008004756060-pat00029
    [화학식 3]
    Figure 112008004756060-pat00030
    [상기 식에서, Z, L1, L2, m 및 n은 청구항 제1항의 치환체 정의와 동일하고; X는 아민 보호기이다.]
  8. 제 7항에 있어서,
    하기 화학식 3의 아미노산 스페이서가 결합된 PNA에 하기 화학식 4로 표시되는 고정화 링커 단량체를 순차적으로 반응시켜 화학식 5의 고정화 링커가 부착된 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 제조하는 것을 특징으로 하는 아미노산 스페이서가 결합된 PNA의 제조방법.
    [화학식 3]
    Figure 112008004756060-pat00031
    [화학식 4]
    Figure 112008004756060-pat00032
    [화학식 5]
    Figure 112008004756060-pat00033
    [상기 식에서, Z, L1, L2, m 및 n은 청구항 제1항의 치환체 정의와 동일하고; L3, L4 및 L5는 서로 독립적으로 화학결합이거나 탄소수 1 내지 10의 알킬렌이며, 상기 알킬렌의 탄소는 1 내지 3개의 산소로 더 치환될 수 있고; E는 CH 또는 N이고; X는 아민 보호기이고; a은 0 또는 1 이고; b는 2 내지 10의 정수이다.]
  9. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 알데히드 기, 카르복실 기, 에폭시 기, 이소티오시아네이트 기, N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 기 또는 활성화 에스터 기가 표출된 유리기판, 실리카, 반도체, 자성입자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록세인(poly (dimethyl siloxane), PDMS) 의 고분자 화합물, 박막, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스의 고형 표면에 고정화하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 포함하는 핵산의 분석, 검출 또는 조절 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    PNA가 유리, 실리카, 자성 입자, 반도체, 플라스틱, 금 또는 은 튜브 또는 박막, 다공성 필터 또는 비드에 결합되어 있는 핵산 분석, 검출 또는 조절 키트.
  12. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 포함하는 핵산의 분석 또는 검출 장치.
  13. 제 12항에 있어서,
    PNA가 유리, 실리카, 자성 입자, 반도체, 플라스틱, 금 또는 은 튜브 또는 박막, 다공성 필터 또는 비드에 결합되어 있는 핵산 분석 또는 검출 장치.
  14. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 아미노산 스페이서가 결합된 PNA를 사용하여 핵산을 분석, 검출 또는 조절하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102251059B (zh) * 2011-07-12 2015-02-04 武汉百泰基因工程有限公司 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针
KR102018317B1 (ko) * 2012-10-10 2019-09-05 주식회사 파나진 리포터 및 소광자가 결합된 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 융해곡선 분석을 통한 염기다형성 분석방법 및 염기다형성 분석 키트.
WO2016020373A1 (en) * 2014-08-06 2016-02-11 Ascendis Pharma A/S Prodrugs comprising an aminoalkyl glycine linker
WO2016145008A2 (en) * 2015-03-09 2016-09-15 University Of Kentucky Research Foundation Mirna for treatment of breast cancer
WO2017037718A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Eloxx Pharmaceuticals Ltd. Aminoglycoside derivatives and uses thereof in treating genetic disorders
IL295474A (en) 2015-09-02 2022-10-01 Eloxx Pharmaceuticals Ltd Aminoglycosides for the treatment of genetic diseases
US11306115B2 (en) 2015-09-02 2022-04-19 Eloxx Pharmaceuticals Ltd. Aminoglycoside derivatives and uses thereof in treating genetic disorders
US20180282375A1 (en) * 2017-03-23 2018-10-04 Trucode Gene Repair, Inc. Peptide nucleic acid (pna) monomers with an orthogonally protected ester moiety

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6322968B1 (en) 1997-11-21 2001-11-27 Orchid Biosciences, Inc. De novo or “universal” sequencing array
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
DK51092D0 (da) * 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
CA2272090A1 (en) * 1996-12-09 1998-06-18 Matthew J. Fisher Integrin antagonists
US7205104B2 (en) 2000-03-24 2007-04-17 Eppendorf Array Technologies Sa (Eat) Identification of biological (micro) organisms by detection of their homologous nucleotide sequences on arrays
KR100464261B1 (ko) 2002-01-24 2005-01-03 주식회사 파나진 Ｐｎａ 올리고머를 합성하기 위한 신규한 단량체 및 그의제조방법
US20040072208A1 (en) 2002-05-23 2004-04-15 Peter Warthoe Surface acoustic wave sensors and method for detecting target analytes
US7282329B2 (en) 2002-08-22 2007-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Suspended microchannel detectors
US7211668B2 (en) 2003-07-28 2007-05-01 Panagene, Inc. PNA monomer and precursor

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6441130B1 (en) 1991-05-24 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linked peptide nucleic acids
US6322968B1 (en) 1997-11-21 2001-11-27 Orchid Biosciences, Inc. De novo or “universal” sequencing array

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