KR101056523B1

KR101056523B1 - 신규한 ｐｎａ (감마3-ｐｎａ) 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101056523B1
Application number: KR1020080111212A
Authority: KR
Inventors: 이희승; 옥태동; 이주희; 임지수; 박현규; 정철희; 박철민
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2008-11-10
Filing date: 2008-11-10
Publication date: 2011-08-11
Also published as: KR20100052266A

Abstract

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 RNA에 선택적으로 결합하고 키랄성을 갖는 신규한 PNA 모노머(PNA monomer)인 γ³-PNA 모노머 분자, 상기 γ³-PNA 모노머의 제조 방법, 및 상기 γ³-PNA를 포함하는 혼성 PNA 올리고머에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 혼성 PNA 올리고머를 유기체에서 분리된 RNA와 선택적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 유전자 발현의 조절 방법, 상기 혼성 PNA 올리고머를 유기체 세포 내의 RNA를 포함하는 시료와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 RNA 분해 유도 방법, 및 상기 혼성 PNA 올리고머와 세포 또는 바이러스의 RNA를 포함하는 용액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포 또는 바이러스의 사멸 방법에 관한 것이다.

PNA, gamma3-PNA, aegPNA

Description

신규한 ＰＮＡ (감마3-ＰＮＡ) 및 이의 제조 방법{A NOVEL PNA (gamma3-PNA) AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

특정 RNA 염기서열에 선택적으로 결합하는 비천연 핵산 유사체의 개발은 질병 치료, 질병 진단 도구 및 생물학적 도구 등으로의 다양한 응용 가능성으로 주목받고 있다(De Mesmaeker, A.; Haener, R.; Martin, P.; Moser, H.E. Acc. Chem. Res. 1995, 28, 366.; Braasch, D. A.; Corey, D. R. Biochemistry, 2002, 41, 4503). 최근에는 기존의 안티센스 mRNA 타겟 외에도 염기 서열이 짧은 스몰 RNA(small RNA(마이크로 RNA)) 또한 의약개발의 중요한 타겟이 될 수 있다고 보고되고 있으며(Zamore, P.D.; Haley. B. Science 2005, 309, 1519), 이러한 최근의 보고들은 효소 및 화학적 안정성을 지니면서도 특정 RNA와 결합하는 핵산 유사체의 개발을 더욱 요구하고 있다. 그러나 같은 염기서열을 가진 단일-가닥 DNA(single-stranded DNA)와 RNA를 선택적으로 구별하여 결합할 수 있는 핵산 유사체의 개발은 아직까지 걸음마 단계를 벗어나지 못하고 있다. 이러한 과제를 해결하기 위한 노력으로 많은 연구 그룹들이 RNA의 C3'-엔도 구조를 모방하여 견고한 형태를 갖는 단량체를 개발하고자 노력해왔다(Kumar, V.A., Ganesh, K.N. Curr . Top . Med . Chem . 2007, 7, 715 and references therein.; Kumar, V.A., Ganesh, K.N. Acc . Chem . Res., 2005, 38, 404. For a recent example of RNA selective binding oligonucleotide by triplex formation.; Gogoi, K., Gunjal, A.D., Kumar , V. A. Chem. Commun., 2006, 2373).

위와 같은 목적을 달성하기 위해서 지금까지 이루어진 접근 방법 중 아미노에틸글라이실 PNA (aminoethylglycyl PNA, aegPNA; 화학식 16)를 기본 골격으로 한 변형핵산 연구들이 주목을 받고 있다. PNA를 기본골격으로 선택한 연구들이 활발하게 진행된 이유는, PNA가 펩타이드 골격 구조로 이루어져 있기 때문에 핵산 가수분해 효소에도 안정하고, 음전하를 제거한 효과 때문에 DNA나 RNA와의 결합이 훨씬 강하고 빠르며, DNA와 마찬가지로 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통하여 DNA 및 RNA와 염기서열 선택적으로 결합하는 장점을 가지고 있기 때문이다(Nielsen, P. E., Egholm, M., Berg, R. H., Buchardt, O. Science 1991, 254, 1497; Nielsen, P. E. Acc . Chem . Res . 1999, 32, 624-630).

이와 같은 연구들 중에서 주목할 만한 것은 최근 Kumar와 Ganesh 그룹에서 개발한 씨스-싸이클로헥사닐 변형 PNA (cis-cyclohexanyl PNA, chPNA; 화학식 17)이며, 이들은 RNA에 월등히 강하게 결합하는 것으로 보고하고 있다(Govindaraju, T; Kumar, V. A.; Ganesh, K.N. J. Am . Chem . Soc . 2005, 127, 4144). 그러나 광학적으로 순수한 씨스-싸이클로헥실다이아민이 포함된 단량체를 합성하기 위해서는 매우 길고 비효율적인 합성과정이 필요하며(Govindaraju, T., Kumar, V.A., Ganesh, K.N. J. Org . Chem . 2004, 69, 1858), 같은 그룹의 후속 연구에 의해서 보고된 바에 의하면 RNA 선택성은 향상된 반면 결합의 방향선택성 (평행 대 역평행)이 현저히 줄어드는 단점이 있다 (Govindaraju, T., Madhuri, V., Kumar, V.A., Ganesh, K.N. J. Org . Chem . 2006, 71, 14).

비록 chPNA가 전례없는 RNA 결합 선택성을 보이기는 했지만, 치료와 진단용으로 사용하기 위해서는 보다 효과적이고 효율이 높은 변형 aegPNA를 만드는 새로운 전략이 필요하다(For an excellent example of modified PNA for biological application, see: Zhang, N.; Appella, D. H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 8424). 이와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 RNA 결합 선택성을 가질 것으로 예상되는 키랄센터(chiral center)를 갖는 간단한 비고리형 신규 PNA 모노 머(PNA monomer)의 개발에 주력해 왔다(For examples of the acyclic chiral PNA showing improved binding affinity of both DNA and RNA, Englund, E. A., Appella, D. H. Org . Lett. 2005, 7, 3465.; Dragulescu-Andrasi, A., Rapireddy, S., Frezza, B. M., Gayathri, C., Gil, R. R., Ly, D. H. J. Am . Chem . Soc . 2006, 128, 10258. Englund, E. A., Appella, D. H. Angew . Chem . Int . Ed . 2007, 46, 1414). 그 결과 본 발명자들은 완전히 새로운 형태의 펩타이드 핵산 (이하 감마3-PNA)의 개발에 성공하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 RNA에 특이적으로 결합하고 키랄성을 갖는 신규한 PNA 모노머(PNA monomer)인 γ³-PNA 모노머 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 γ³-PNA 모노머의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 γ³-PNA를 포함하는 혼성 PNA 올리고머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혼성 PNA 올리고머를 유기체에서 분리한 RNA와 선택적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 유전자 발현의 조절 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혼성 PNA 올리고머를 유기체 세포 내의 RNA를 포함하는 시료와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 RNA 분해 유도 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 혼성 PNA 올리고머와 세포 또는 바이러스의 RNA를 포함하는 용액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포 또는 바이러스의 사멸 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 RNA에 특이적으로 결합하고 키랄성을 갖는 신규한 PNA 모노머(PNA monomer)인 γ³-PNA 모노머 구조에 관한 것이다.

PNA란 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acids, PNA)을 의미하며, 이는 디옥시리보오스 포스페이트 골격(backbone)이 펩타이드 올리고머로 치환된 DNA 유사 화합물이다. 기존에 공지된 일반적인 PNA의 구조는 N-(2-아미노에틸)글리신 (N-(2-aminoethyl)glycine) 단위가 아마이드 결합에 의해 반복적으로 연결되어 N-(2-아미노에틸)글리신 골격을 형성하고 이 골격에 퓨린(purin: A 및 G)과 피리미딘(pyrimidine: C 및 T) 염기와 같은 핵산 염기가 메틸렌 카르보닐(methylene carbonyl) 결합을 통해 연결되어 있다. PNA 모노머란 상기 PNA 구조를 갖는 단량체를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어인 'γ³-PNA 모노머(감마3-PNA 모노머)'란 일반적인 PNA와는 구분되는 화학적 구조를 가지는데, 그 특징으로서 γ³-PNA는 기존에 개발되었던 변형 PNA들에 비하여 감마/델타(γ/δ)-혼합 펩타이드 골격, 즉 키랄(chiral) 감마3-아미노산과 델타-아미노산 동배체(isostere)인 aegPNA 단위를 가짐으로써 기존의 변형 PNA들이 aegPNA 골격 단위(델타-펩타이드)를 그대로 유지하는 것과 구별된다. 또한 기존의 변형 PNA 모노머들이 형태적으로 견고한 고리형 구조가 포함되어 합성하는데 여러 단계와 시간이 소모되었으나, γ³-PNA는 빠르고 간단하게 합성할 수 있는 비고리형 구조이다. 또한 기존의 PNA에는 염기들이 골격 내에 있는 질소 원자에 3차 아마이드 결합으로 되어 있어 비키랄성(achiral)을 가졌지만, 본 발명의 γ³-PNA는 탄소-탄소(C-C) 결합으로 골격과 연결됨으로써 감마-아미노산의 베타 위치에 (R)-형태의 키랄 센터 도입이 가능하게 되었고, 이것은 단일 가닥의 변형 PNA도 수용액상에서 광학 성질을 가진 2차 구조를 형성할 수 있게 되었다.

본 발명의 γ³-PNA 분자의 구조는 다음과 같다(화학식 18).

여기에서, P는 아민 보호기이고;

Y는 H, OR, NHR', N(R')₂, 또는 N(R')₃ ⁺로서, 이때 R은 H, CH₂OCH₃, 또는 (CH₂CH₂O)_nCH₃ (n은 0 내지 3인 정수)이고, R'은 H, (CH₂)_nCH₃ (n은 0 내지 3인 정수), 또는 CH₂Ph이며;

Base는 보호되거나 보호되지 않은 핵산 염기이고;

n은 1 내지 3인 정수이며;

m은 1 내지 5인 정수이다.

본 발명에서 사용되는 핵산 염기(Base)는 뉴클레오타이드 화학에서 통상적으로 지칭되는 염기로서, 예를 들면 아데닌(adenine; A), 시토신(cytosine; C), 구아닌(guanine; G), 티민(thymine; T) 및 우라실(uracil; U)과 같은 천연 염기이거나 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아닌, N⁴N⁴-에타노시토신, N⁶N⁶-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C₃-C₆)-알카닐우라실, 5-(C₃-C₆)알키닐시토신, 5-플루오로우라실 및 슈도이소시토신과 같은 비천연 염기가 포함된다.

또한 상기 핵산 염기는 보호되거나 보호되지 않은 핵산 염기일 수 있는데, 보호된 핵산 염기의 경우 핵산 염기의 엑소사이클릭(exocyclic) 아미노 또는 하이드록실 기는 벤조일(Bz), 이소부타노일, 아세틸, 페녹시아세틸, 4-(t-부틸)벤조일(t-BuBz), 4-(t-부틸)페녹시아세틸, 4-(메톡시)벤조일, 2-(4-니트로페 닐)에틸옥시카르보닐, 2-(2,4-디니트로페닐)에틸옥시카르보닐, 9-플루오렌일메틸옥시카르보닐(N-하이드록시-석신이미드; Fmoc(Osu)), 디페닐카르바모일 또는 포름아미딘 기와 같은 적합한 공지의 보호기에 의해 보호될 수 있다. 바람직하게 핵산 염기는 벤조일, 이소부타노일, 아세틸, 페녹시아세틸, 4-(t-부틸)벤조일, 4-(메톡시)벤조일 또는 9-플로오렌일메톡시카르보닐기에 의해 보호될 수 있으며, 구아닌의 경우 2-N-아세틸 및 6-O-디페닐카바모일의 조합에 의해 또는 피리딘에 Mmt조합에 의해 보호될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Boc 또는 Mmt를 이용하여 핵산 염기의 엑소사이클릭 아미노기를 보호하였다.

상기 화학식 18의 P는 아민 보호기로서, 1차 아민을 적절한 보호기(P)로서 보호할 수 있다.본 발명에서 사용되는 아민 보호기는 공지의 아민 보호기를 제한없이 사용할 수 있으며, 그 예로 아릴옥시카보닐(Alloc), 벤질옥시카보닐(Cbz), tert-부틸옥시카보닐(Boc), 4,4-디메틸벤즈히드로옥시카보닐(DMBhoc), 2-트리메틸실릴에톡시카보닐(Teoc), 트리페닐메틸(Trityl), (4-메톡시페닐)디페닐메틸(Mmt) 및 비스(4--디메틸페닐)페닐메틸(DMT) 등을 들 수 있다.

바람직한 양태로서, 상기 화학식 18에서 P는 Fmoc이고, R은 수소이며, Base는 보호되거나 보호되지 않은 핵산 분자일 수 있다. 또한 바람직한 양태로서, 본 발명의 γ³-PNA는 하기 화학식 5, 화학식 8, 화학식 11 및 화학식 15로 표시된다.

γ³-PNA는 기존에 공지된 PNA, aegPNA, 변형 PNA와는 구분되는 RNA와의 선택적 결합 특이성 및 키랄성(chirality)을 동시에 갖는다. RNA에 선택적으로 결합하는 특성은 RNA와 DNA가 혼합되어 있는 환경에서 DNA와 RNA를 구분하여 RNA에 더 높은 비율로 상보적 결합을 하는 특성을 의미하며, 본 발명에서는 RNA와 DNA가 1:1의 비율로 혼합된 용액 중에서 RNA만을 선택적으로 결합하는 것을 확인함으로써 RNA에의 결합 선택성을 증명하였다(도 4 및 도 5).

기존의 PNA가 골격 내에 있는 질소 원자에 3차 아마이드 결합하여 비키랄성을 갖는 것과는 달리 본 발명의 γ³-PNA는 탄소 골격에 연결됨으로써 키랄 센터의 도입을 가능하게 하였다. 키랄성을 갖는 본 발명의 특징으로 인하여 RNA와 결합시, 단지 한 두 개 정도의 γ³-PNA 잔기를 PNA 올리고머 내에 포함시켜 올리고머를 제작(혼성 PNA 올리고머)하는 경우, 전형적인 RNA와 같은 우나선 구조 형태를 이룰 수 있음을 확인하였다. 비고리형이고 구조적으로 간단한 키랄 γ³-PNA 모노머를 포함하는 혼성 PNA는, RNA와 같은 형태의 나선 구조를 미리 형성하도록 유도할 수 있게 한다. 또한 혼성 PNA 올리고머는 RNA 와 DNA를 구분하여 RNA에 선택적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 역평행(antiparalle) 방향의 결합선택성도 갖게 하는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 이러한 특징을 PNA-RNA, PNA-DNA 결합에 대한 Tm값 측정 및 CD 곡선 분석 실험을 통하여 확인하였다(도 16 내지 도 21).

또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 γ³-PNA 모노머의 제조 방법에 관한 것이다. γ³-PNA 모노머의 제조는 당업계에 알려진 방법을 적절하게 선택 또는 변형하여 실시할 수 있다. 일 양태로서, 다음과 같은 단계를 통해 제조할 수 있다.

1. (R)-아지도메틸 감마-부틸로락톤(화학식 1)의 고리 열림 반응을 통하여 화학식 2의 화합물을 생성하는 단계;

2. 생성된 화학식 2의 화합물과 보호된 핵산 염기가 반응하거나 또는 화학식 2에 핵산 염기를 반응시킨 후 핵산 염기의 엑소사이클릭(exocyclic) 아미노 또는 하이드록실기를 보호하는 반응을 수행하는 단계; 및

3. 상기 단계에 의해 핵산이 결합된 화합물에서 아자이드를 환원시키고, 환원된 아민기에 보호기를 붙여 화학식 19의 화합물을 생성하는 단계;

를 거쳐 생성될 수 있으며, 각 핵산 염기의 특성에 따라 각 단계에 첨가되는 반응물은 당업계에 공지된 통상의 방법으로 최적화될 수 있다.

시작 물질인 (R)-아지도메틸 감마-부틸로락톤(화학식 1)은 본 발명의 이전에 공지된 방법(Ok, T.; Jeon, A.; Lim, J.-H.; Hong, C.S.; Lee, H.-S. J. Org. Chem. 2007, 72, 7390)에 따라 (S)-에피클로로하이드린을 구매하여 두 단계의 합성을 통해 수득하였으며, (R)-아지도메틸 감마-부틸로락톤((R)-azidomethyl gamma-butyrolactone)의 고리열림반응을 수행하여 화학식 2의 화합물인 (R)-3-아지도메틸-4-브로모-뷰틸릭 애시드 에틸 에스터((R)-3-Azidomethyl-4-bromo-butyric acid ethyl ester)가 생성되었다. 이어서 핵산 염기의 엑소사이클릭 부분의 아미노기가 보호된 염기를 부착하거나, 보호되지 않은 핵산 염기를 부착한 뒤 보호하는 반응을 수행하여 골격에 핵산 염기를 도입하는 반응을 수행하고, 이어서 골격의 아자이드(azide)기를 환원시킨 후 보호기를 부착하는 반응을 수행하였다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 γ³-PNA를 포함하는 혼성 PNA 올리고머에 관한 것이다. PNA 올리고머는 2 이상의 PNA 모노머가 펩타이드 결합으로 중합된 중합체를 의미하며, 그 중합 길이에는 제한이 없다.

본 발명에서 사용되는 용어인 '혼성 PNA 올리고머'란 공지의 PNA 올리고머에 있어서, 하나 또는 그 이상의 γ³-PNA가 포함되어 중합된 형태를 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 파나진(PANAGENE, 대전, 대한민국)의 A, G, C의 엑소사이클릭 부위가 Bhoc로 보호되어 있고, 아민기가 Fmoc-보호된 aegPNA (aminoethylglycyl PNA)을 구입하여 자동 Peptide Synthesizer(ABI 433A, Applied Biosystems Inc., 미국)를 이용, γ³-Thymine PNA가 포함된 혼성 PNA 올리고머를 합성하였다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 유기체 내의 RNA에 선택적으로 결합하는 혼성 PNA 올리고머를 상기 유기체에서 분리된 유전자가 포함된 시료의 RNA와 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 시험관 내에서의 유전자 발현의 조절 방법을 제공한 다.

상기 언급한 바와 같이 혼성 PNA 올리고머는 RNA에 선택적인 결합력을 가지는바, 시료 내에 DNA와 RNA가 동시에 존재하는 경우 높은 선택성을 갖고 RNA에 결합하게 된다.

바람직하게 상기 조절 방법은 유기체 내의 번역(translation)을 저해하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다. 번역이란 센트럴 도그마 (Central Dogma) 과정에서 전사(transcription)과정에서 DNA를 원본으로 사용하여 만들어진 RNA를 주형으로 하여 단백질을 합성하는 과정을 일컬으며, 이렇게 생성된 RNA 또는 생성되고 있는 RNA에 혼성 PNA가 결합하는 경우, 번역작용을 저해하게 되어 유전자 발현을 조절할 수 있게 된다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 유기체 내의 RNA에 특이적으로 결합하는 혼성 PNA 올리고머를 유기체 세포 내의 RNA를 포함하는 시료와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내에서의 RNA 분해 유도 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서 본 발명은 세포 또는 바이러스 게놈(genome)의 RNA 일부에 선택적으로 결합하는 따른 혼성 PNA 올리고머와 상기 세포 또는 바이러스의 RNA를 포함하는 용액을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포 또는 바이러스의 사멸 방법을 제공한다.

본 발명은 비키랄(achiral) aegPNA 골격에 키랄(chiral) 비고리형 감마3-아미노산을 도입, 혼성 PNA 올리고머를 제조하여 DNA 및 RNA와 결합함에 있어서 역평행 선택성 및 RNA와의 결합 선택성을 효과적으로 증가시켰다. RNA에 선택적으로 결합하는 γ³-PNA(감마3-PNA)는 기존 PNA의 응용 범위를 확장시킬 뿐만 아니라, 향후 RNA를 타겟으로 한 다양한 치료 및 진단에 응용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : γ ³ - PNA 제조의 개요

펩타이드 합성에 사용되는 고체 지지체인 Nova TG Sieber resin (치환율 : 0.12 mmol/g), Fmoc-Lys(Boc)-OH 및 FmocOSu는 Novabiochem^®에서 구매하였다. HBTU (O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N', N'-tetramethyluronium hexaflurophosphate)는 Hanchem Co., Ltd.에서 구매하였고, 그 외의 시약들은 Aldrich 및 Fluka, Acros Organics 나 TCI Organic Chemicals에서 구매하였다. 융해 온도(Tm)의 측정은 모세관을 이용한 융해점 측정기구를 통해 이루어졌고, 이후 교정하지 않았다.

실시예2 : (R)-γ ³ Thymine monomer 의 합성

(R)- 아지도메틸 감마- 부틸로락톤(화학식 1)의 제조

시작물질인 (R)-아지도메틸 감마-부틸로락톤 ((R)-azidomethyl gamma-butyrolactone; 화학식 1)은 본 발명자들의 이전 보고 방법에 따라 (Ok, T.; Jeon, A.; Lee, J.; Lim, J.-H.; Hong, C.S.; Lee, H.-S. J. Org . Chem. 2007, 72, 7390.; 이하 ref 1) 구매가능한 (S)-에피클로로하이드린 ((S)-epichlorohydrine) 으로부터 두 단계의 합성을 통해 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR은 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다.

(R)-3-아지도메틸-4-브로모-뷰틸릭 애시드 에틸 에스터(화학식 2)의 제조

화학식 1의 화합물(1.42g, 10.1 mmol)과 에탄올(2.94mL, 50.4 mmol)을 무수 메틸렌클로라이드(45 mL)에 혼합한 후 교반시킨 혼합물에 0℃에서 브로모트리메틸실란(3.92 mL, 30.0 mmol)을 천천히 적가하였다. 반응혼합물을 상온에서 24시간 동안 교반하고 증류수를 가하여 퀀칭(quenching)하고 5분간 교반하였다. 유기층을 분리한 후 5% 소듐티오설페이트로 씻어준 후 무수 마그네슘설페이트로 건조시키고 감압하에서 농축시킨 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하여 목적화합물인 (R)-3-아지도메틸-4-브로모-뷰틸릭 애시드 에틸 에스터((R)-3-Azidomethyl-4-bromo-butyric acid ethyl ester; 화학식 2)를 무색 오일(2.43g, 96.6%)로 얻었다. ¹H NMR (도 8 참조) 및 ¹³C NMR (도 9)의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ4.14 (2H, q, J_HH = 7.17 Hz), 3.50 (4H, m), 2.45 (3H, m), 1.25 (3H, t, J_HH = 7.11 Hz);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ171.28, 60.86, 52.90, 36.81, 35.08, 34.82, 14.16;

HRMS (EI) calcd. for C₇H₁₂BrN₃O₂: 249.0113, found: 249.0110.

(S)-3- 아지도메틸 -4-(3- 벤조일 -5- 메틸 -2,4- 다이옥소 -3,4- 다이하이드로 -2H-피리미딘-1-일)- 뷰틸릭 애시드 에틸 에스터(화학식 3)의 제조

N³-벤조일 티민과 (1.58 g, 7.3 mmol), 18-크라운-6 에테르 (1.93 g, 7.3 mmol), 및 활성화된 포타슘 카보네이트 (potassium carbonate) (1.01 g, 7.3 mmol)를 넣고 무수 DMF (30 mL)에서 30분간 교반하였다. 상기 현탁액은 무수 DMF (10 mL)에 용해된 화학식 2의 화합물이 포함된 혼합물 (915 mg, 3.7 mmol) 로 캐뉼러(cannular)를 통해 가하였다. 상기 반응 혼합물은 24시간동안 교반하였다. 반응은 포화 염화암모늄 수용액을 가하여 퀀칭하고 무수 메틸렌클로라이드로 3회 추출한 후 무수 마그네슘설페이트를 이용해 건조시키고 감압하에서 농축시킨 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(40% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하여 목적화합물인 (S)-3-아지도메틸-4-(3-벤조일-5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로-2H-피리미딘-1-일)-뷰틸릭 애시드 에틸 에스터((S)-3-Azidomethyl-4-(3-benzoyl-5-methyl-2,4- dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-yl)-butyric acid ethyl ester; 화학식 3)을 점성 높은 무색 오일 (1.32 g, 90.3%)로 얻었다. ¹H NMR (도 10) 및 ¹³C NMR (도 11)의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ7.90 (2H, d, J_HH = 8.50 Hz), 7.61 (1H, t, J_HH = 7.46 Hz), 7.46 (2H, t, J_HH = 8.00 Hz), 7.13 (1H, s), 4.11 (2H, q, J_HH = 7.19 Hz), 3.79 (1H, dd, J_HH = 14.02 Hz and 7.31 Hz), 3.68 (1H, dd, J_HH = 13.99 Hz and 6.23 Hz), 3.44 (2H, m), 2.51 (1H, m), 2.38 (2H, m), 1.92 (3H, s), 1.23 (3H, t, J_HH = 7.10 Hz);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ171.34, 168.85, 162.93, 150.05, 140.27, 134.97, 131.48, 130.34, 129.08, 110.92, 60.95, 52.32, 49.86, 35.18, 34.11, 14.07, 12.31;

HRMS (EI) calcd. for C₁₉H₂₁N₅O₅: 399.1543, found: 399.1537.

(S)-3- 아지도메틸 -4-(5- 메틸 -2,4- 다이옥소 -3,4- 다이하이드로 -2H-피리미딘-1-일- 뷰틸릭 애시드(화학식 4)의 제조

THF, MeOH 및 물의 혼합용매(THF:MeOH:물=6:3:1, 60 mL)에 화학식 3의 화합 물 (2.56 g, 6.41 mmol)을 용해시킨 후 수산화리튬 1수화물(2.69 g, 64.1 mmol)을 첨가하였다. 반응혼합물은 0℃에서 11시간 동안 교반시킨 후 유기용매를 감압하에서 제거하였다. 물층은 1N HCl 수용액으로 산성화 시킨 후 메틸렌클로라이드로 3회 추출하였다. 화합된 유기층을 무수 소듐설페이트로 건조시키고 감압하에서 농축시킨 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10% 메탄올/ 메틸렌클로라이드) 로 정제하여 목적화합물인 (S)-3-아지도메틸-4-(5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로-2H-피리미딘-1-일-뷰틸릭 애시드((S)-3-Azidomethyl-4-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-yl)-butyric acid; 화학식 4)를 가루형의 흰색 고체 (1.57 g, 91.5%)로 얻었다. ¹H NMR (도 12) 및 ¹³C NMR (도 13)의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.32 (1H, bs), 11.20 (1H, s), 7.43 (1H, s), 3.68 (2H, dd, J_HH = 13.72 Hz and 6.84 Hz), 3.58 (2H, dd, J_HH = 13.76 Hz and 7.32 Hz), 2.41 (1H, m), 2.26 (2H, d, J_HH = 6.60 Hz), 1.74 (3H, s);

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ172.80, 164.24, 151.15, 141.43, 108.60, 52.09, 48.95, 34.54, 33.88, 11.95;

HRMS (EI) calcd. for C₁₀H₁₃N₅O₄: 267.0968, found: 267.0977.

(R)-3-[(9H- 플루오렌 -9-일 메톡시카보닐아미노 )- 메틸 ]-4-(5- 메틸 -2,4- 다이옥 소-3,4- 다이하이드로 -2H-피리미딘-1-일)- 뷰틸릭 애시드(화학식 5)의 제조

THF와 물의 혼합 용매 (THF/H₂O= 10/1, 33 mL)에 화학식 4의 화합물 (400 mg, 1.50 mmol)를 교반시키고, 1.0M의 농도로 THF에 용해된 트리메틸포스핀(trimethylphosphine) (1.65 mL, 1.65 mmol)을 상온에서 첨가한 후 70^oC에서 1시간 교반시켰다. 유기용매는 감압하에서 제거시키고, 잔사는 증류수에 용해시킨 후 에틸아세테이트로 1회 씻어주었다. 감압하에서 물을 제거한 후, 0.15 M 의 Na₂CO₃ 수용액 (30 mL) 과 아세톤에 0.2M 로 용해된 FmocOSu (9 mL)를 첨가하여 밤새 교반하였다. 상기 혼합물의 아세톤은 감압하에서 제거시키고, 물층은 에틸아세테이트로 3회 씻어주었다. 상기혼합물은 1N HCl 수용액을 가하여 산성화 시키고 에틸아세테이트 (50 mL)를 부가하여 2시간 동안 교반시켰다. 물층은 에틸아세테이트로 2회 추출하고, 화합한 유기층은 무수 마그네슘 설페이트로 건조시켰다. 상기 현탁액의 용액은 감압하에서 제거시키고 흰색의 정제되지 않은 고체를 얻었다. 상기 고체는 에틸 아세테이트를 가한 후 1분간 볼텍스(vortex)시키고, 원심분리한 후 용액을 따라 버린다. 이러한 세척 과정을 2회 더 반복한 후, 유기용매는 감압하에 완전히 제거하여 목적화합물인 (R)-3-[(9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐아미노)-메틸]-4-(5-메틸-2,4-다이옥소-3,4-다이하이드로-2H-피리미딘-1-일)-뷰틸릭 애시드 (((R)-3-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-methyl]-4-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-yl)-butyric acid); 화학식 5)를 가루형의 흰색 고체(482 mg, 69.5%)로 얻었다. ¹H NMR (도 14) 및 ¹³C NMR (도 15)의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.14(1H, bs), 11.19(1H, s), 7.87(2H, d, J = 7.52 Hz), 7.68(2H, d, J = 7.40 Hz), 7.36(6H, m), 4.30(2H, d, J =7.12), 4.21(1H, t, J = 6.68 Hz), 3.62(1H, m), 3.53(1H, m), 3.06(1H, m), 2.98(1H, m), 2.30(1H, m), 2.16(1H, dd, J = 9.68 Hz, 16.44 Hz), 1.73(1H, s);

¹³C NMR(100MHz, DMSO) δ173.14, 164.22, 156.36, 151.17, 143.85, 141.52, 140.70, 127.58, 127.04, 125.14, 120.09, 108.45, 65.33, 49.10,46.74, 41.55, 35.26, 33.85, 11.96;

HRMS (FAB+) calcd. for [C₂₅H₂₅N₃O₆+Na⁺ ]: 486.1641, found: 486.1644.

실시예3 : (R)-γ ³ Adenine monomer 의 합성

(S)-3- 아지도메틸 -4-[6- 비스 ( 터트 - 뷰톡시카보닐 )-아미노-퓨린-9-일]- 뷰티릭 애시드 에틸 에스터(화학식 6)의 제조

무수 DMF (70 mL)에 아데닌(2.02g, 15mmol)을 가한 뒤 강하게 교반시킨 현탁액에 소듐하이드라이드 (오일형의 60%, 600mg, 15mmol)를 가하고 상온에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물은 무수 DMF (10mL)에 용해된 화학식 2의 화합물 (3.4g, 13.6mmol) 로 캐뉼러(cannular)를 통해 가한 후, 48시간 동안 교반하였다. 상기혼합물의 유기 용매는 감압하에 제거하고, 잔사는 톨루엔과 함께 증발시켰다. 무수 THF (100 mL)와 4-다이메틸아미노피리딘 (4-Dimethylaminopyridine)(830mg, 6.8mmol) 및 다이-tert-뷰틸 다이카보네이트 (Di-tert-butyl dicarbonate)(12g, 55mmol)는 상기의 미정제 혼합물에 첨가하고 상온에서 밤새 교반시켰다. 상기 현탁액에 있는 과량의 THF는 회전식 농축기를 통해 제거시키고, 100 mL의 물을 추가시켰다. 상기 화합물은 메틸렌클로라이드로 3회 추출한 후, 무수마그네슘설페이트로 건조시켰다. 상기의 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(30% 에틸아세테이트/헥산) 로 정제하여 목적화합물인 (S)-3-아지도메틸-4-[6-비스(테트-뷰톡시카보닐)-아미노-퓨린-9-일]-뷰티릭 애시드 에틸 에스터((S)-3-Azidomethyl-4-[6-bis(tert-butoxycarbonyl)-amino-purin-9-yl]-butyric acid ethyl ester; 화학식 6)를 높은 점도를 가진 노란색의 오일(4.2g, 61.2%)로 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ8.79(1H, s), 8.10(1H, s), 4.32(2H, m), 4.07(2H, q, J_HH=7.15Hz), 3.37(2H, ddd, J_HH=35.4Hz, 12.6Hz and 4.77Hz), 2.71(1H, m), 2.34(2H, m), 1.39(18H, s), 1.19(3H, t, J_HH=7.16 );

¹³C NMR(100MHz, CDCl₃) δ170.95, 153.41, 152.14, 150.29, 150.22 145.01, 128.12, 83.71, 60.89, 51.83, 44.73, 35.71, 33.82, 27.64, 14.00;

HRMS (EI) calcd. for C₂₂H₃₂N₈O₆ : 504.2445, found: 504.2452

(S)-3- 아지도메틸 -4-(6- 터트 - 뷰톡시카보닐아미노 -퓨린-9-일)- 뷰티릭 애시드( 화학식 7)의 제조

THF, MeOH 및 물의 혼합용매(THF:MeOH:물=6:3:1, 20 mL)에 화학식 6의 화합물 (527mg, 1.05mmol)을 용해시킨 후 수산화리튬 1수화물(438.2mg, 10.45mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 3시간 동안 교반시킨 후 상온에서 16시간 교반시키고, 유기용매를 감압하에서 제거하였다. 물층은 얼음 배스에서 0.1N HCl 수용액으로 중화시킨 후 1N HCl 수용액으로 pH를 1~2로 산성화시켰다. 상기 용액은 에틸아세테이트로 5회 추출하고 무수 소듐설페이트로 건조시킨 후 감압하에서 농축시킨 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(10% 메탄올/ 메틸렌클로라이드) 로 정제하여 목적 화합물인 (S)-3-아지도메틸-4-(6-터트-뷰톡시카보닐아미노-퓨린-9-일)-뷰티릭 애시드((S)-3-Azidomethyl-4-(6-tert-butoxycarbonylamino-purin-9-yl)-butyric acid ; 화학식 7)를 가루형의 흰색 고체 (203.5mg, 86.4%)로 얻었다. ¹H NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.31(1H, bs), 10.03(1H, s), 8.57(1H, s), 8.39(1H, s), 4.26(2H, m), 3.43(2H, ddd, J_HH= 35.28Hz, 12.92Hz and 6.24Hz), 2.66(1H, m), 2.28(2H, m), 1.46(9H, s);

¹³C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ172.57, 152.15, 151.44, 151.08, 149.80, 144.28, 123.25, 80.00, 52.00, 44.72, 35.22, 33.95, 27.83 HRMS (FAB+) calcd. for [C₁₅H₂₀N₈O₄ ⁺H⁺]: 377.1686, found: 377.1702

(R)-γ ³ - PNA -아데닌- Fmoc 모노머 ( BOC -보호기)(R) ((R)-4-(6- 터트 - 뷰톡시카보 닐아미노-퓨린-9-일)-3-[(9H- 플루오렌 -9-일 메톡시카보닐아미노 )- 메틸 ]- 뷰티릭 애 시드(화합물 8)의 제조

THF와 물의 혼합 용매 (THF/H₂O= 10/1, 110 mL)에 화학식 7의 화합물 (5.64g, 15.0mmol)를 교반시키고, 1.0M의 농도로 THF에 용해된 트리메틸포스핀(trimethylphosphine) (45ml, 45.0mmol)을 첨가한 후 40^oC에서 6시간 교반시켰다. 유기용매는 감압하에서 제거시키고, 잔사는 증류수에 용해시킨 후 다이에틸에테르로 1회 씻어주었다. 감압하에서 물을 제거한 후, 증류수 (60 mL)에 Na₂CO₃ (4.76g, 45mmol)를 용해시키고 아세토니트릴 (60 mL)에 FmocOsu (6.06g, 18mmol)를 용해시킨 혼합물을 첨가하여 밤새 교반하였다. 상기 혼합물의 아세토니트릴은 감압하에서 제거시키고, 물층은 다이에틸에테르로 3회 씻어주었다. 상기 혼합물은 1N HCl 수용액을 가하여 산성화 시키고 에틸아세테이트 (100 mL)를 부가하여 2시간 동안 교반 시켰다. 물층은 에틸아세테이트로 2회 추출하고, 화합한 유기층은 무수 소듐설페이트로 건조시켰다. 상기 현탁액의 용액은 감압하에서 제거시키고 흰색의 정제되지 않은 고체를 얻었다. 상기 고체는 에틸 아세테이트를 가한 후 1분간 볼텍스(vortex)시키고, 원심분리한 후 용액을 따라 버린다. 이러한 세척 과정을 2회 더 반복한 후, 유기용매는 감압하에 완전히 제거하여 목적 화합물인 (R)-γ³-PNA-아데닌-Fmoc 모노머(BOC-보호기)(R) ((R)-4-(6-터트-뷰톡시카보닐아미노-퓨린-9-일)-3-[(9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐아미노)-메틸]-뷰티릭 애시드(((R)-4-(6-tert-Butoxycarbonylamino-purin-9-yl)-3-[(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-methyl]-butyric acid); 화합물 8)를 가루형의 흰색 고체 (3.75g, 43.7%)로 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ12.13(1H, bs), 10.02(1H, s), 8.55(1H, s), 8.39(1H, s), 7.87(2H, d, J_HH=5.64Hz), 7.69(2H, d, J=7.40Hz), 7.47(1H, m), 7.36(4H, m), 4.31(2H, d, J=6.76), 4.22(3H, m), 3.04(2H, m), 2.57(1H, m), 2.20(2H, dd, J_HH=40.96Hz, 6.16Hz), 1.46(9H, s);

¹³C NMR(100MHz, DMSO-d6) δ172.88, 156.50, 152.16, 151.43, 151.11, 149.79, 144.42, 143.90, 143.86, 140.76, 127.60, 127.05, 125.19, 123.11, 120.10, 80.09, 65.40, 46.81, 44.86, 41.51, 36.03, 33.95, 27.85 ;

HRMS (FAB+) calcd. for [C₃₀H₃₂N₆O₆ ⁺H⁺]: 573.2462, found:573.2465

실시예4 : (R)-γ ³ Cytosine monomer 의 합성

(S)-3- 아지도메틸 -4-(4-{[(4- 메톡시 - 페닐 )- 다이페닐 - 메틸 -아미노}-2-옥소-2H-피리미딘-1-일)- 뷰티릭 애시드 에틸 에스터(화학식 9)의 제조

무수 DMSO (120 mL)에 Mmt-보호된 시토신 (N⁴-Mmt-Cytosine) (9.2g, 24mmol)을 가한 뒤 강하게 교반시킨 현탁액에 소듐하이드라이드 (오일형의 60%, 960mg, 24mmol)를 가하고 상온에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물은 무수 DMSO (10mL)에 용해된 화학식 2의 화합물 (5g, 20mmol) 로 캐뉼러(cannular)를 통해 가한 후, 24 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물의 유기 용매는 감압하에 제거하고, 증류수(150 mL)를 가하였다. 상기 혼탁액은 메틸렌클로라이드로 3회 추출한 후, 무수 마그네슘설페이트로 건조시켰다. 상기의 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (60% 에틸아세테이트/헥산) 로 정제하여 목적 화합물인 (S)-3-Azidomethyl-4-(4-{[(4-methoxy-phenyl)-diphenyl-methyl]-amino}-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-butyric acid ethyl ester (화학식 9)를 높은 점도를 가진 노란색의 오일(9.96g, 90.15%) 로 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) d7.17(10H, m), 7.10(2H, d, J_HH=8.84Hz), 6.97(1H, d, J_HH=5.35Hz), 6.92(1H, bs), 6.78(2H, d, J_HH=8.83Hz), 4.98(1H, d, J_HH=7.38Hz)), 4.06(2H, q, J_HH=7.15Hz), 3.74(3H, s), 3.69(2H, m), 3.37(2H, ddd, J_HH=63.29Hz, 12.60Hz and 4.87Hz), 2.52(1H, m), 2.33(2H, t), 1.20(3H, t, J_HH=7.14Hz);

¹³C NMR(100MHz, CDCl₃) 71.45, 165.42, 158.62, 155.80, 145.44, 144.01, 135.69, 129.83, 128.44, 128.20, 127.41, 113.46, 94.45, 70.49, 60.63, 55.11, 51.98, 50.71, 35.10, 33.84, 14.02;

HRMS (EI) calcd. for C₃₁H₃₂N₆O₄ : 552.2485, found: 552.2475

(S)-3- 아지도메틸 -4-(4-{[(4- 메톡시 - 페닐 )- 다이페닐 - 메틸 ]-아미노}-2-옥소-2H-피리미딘-1-일)- 뷰티릭 애시드(화학식 10)의 제조

THF, MeOH 및 물의 혼합용매(THF:MeOH:물 = 6:3:1, 5 mL)에 화학식 9의 화합물 (100 mg, 0.18 mmol)을 용해시킨 후 수산화리튬 1수화물 (75.9mg, 1.8mmol) 을 첨가하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 3시간 동안 교반시킨 후 상온에서 밤새 교반시키고, 유기용매를 감압하에서 제거하였다. 물층은 얼음 배스(bath)에서 0.1N HCl 수용액으로 중화시킨 후 1N HCl 수용액으로 pH를 1~2로 산성화시켰다. 상기 용액은 에틸아세테이트로 5회 추출하고 무수 소듐설페이트로 건조시킨 후 감압하에서 농축시킨 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(5% 메탄올/메틸렌클로라이드) 로 정제하여 목적화합물인 (S)-3-아지도메틸-4-(4-{[(4-메톡시-페닐)-다이페닐-메틸]-아미노}-2-옥소-2H-피리미딘-1-일)-뷰티릭 애시드 ((S)-3-Azidomethyl-4-(4-{[(4-methoxy-phenyl)-diphenyl-methyl]-amino}-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-butyric acid; 화학식 10)를 가루형의 흰색 고체 (94.7 mg, 99.8%)로 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, DMSO-d6) d12.3(1H, bs), 9.97(1H, bs), 7.97(1H, d, J_HH=6.44Hz), 7.23 (10H, m), 7.12(2H, d, J_HH=8.75Hz), 6.95(1H, bs), 6.88(2H, d, J_HH=8.81Hz), 3.72 (3H, s), 3.72 (3H, s), 3.50 (2H, m), 3.23(2H, m), 2.10(3H, m);

¹³C NMR(100MHz, DMSO-d6) 72.40, 164.16, 157.98, 156.92, 144.12, 143.49, 135.36, 129.96, 128.48, 127.82, 126.87, 113.10, 102.37, 71.19, 68.24, 55.03, 50.98, 33.85, 32.72;

HRMS (EI) calcd. for C₂₉H₂₈N₆O₄ : 524.2172, found: 524.2175

(R)-3-[(9H- 플루오렌 -9-일 메톡시카보닐아미노 )- 메틸 ]-4-(4-{[(4- 메톡시 - 페 닐- 다이페닐 - 메틸 -아미노}-2-옥소-2H-피리미딘-1-일)- 뷰티릭 애시드(화학식 11)의 제조

THF와 물의 혼합 용매 (THF/H₂O= 9/1, 100 mL)에 화학식 10의 화합물 (3.61g, 6.88mmol)를 교반시키고, 트리메틸포스핀(trimethylphosphine) (5.41g, 2.06mmol)을 첨가한 후 밤새 환류시켰다. 유기용매는 감압하에서 제거시키고, 잔사는 증류수에 용해시킨 후 다이에틸에테르로 1회 씻어주었다. 감압하에서 물을 제거한 후, 상 기 혼합물에 0.15 M의 Na₂CO₃ 수용액(135 mL)과 0.2 M의 FmocOsu가 들어있는 아세톤 용액을 가하고, 12시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물의 아세톤은 감압하에서 제거시키고, 물층은 에틸아세테이트로 3회 씻어주었다. 상기 혼합물은 1N HCl 수용액을 가하여 산성화 시키고 에틸아세테이트 (100 mL)를 부가하여 2시간 동안 교반시켰다. 물층은 에틸아세테이트로 2회 추출하고, 화합한 유기층은 무수 소듐설페이트로 건조시켰다. 상기 현탁액의 용액은 감압하에서 제거시키고 흰색의 정제되지 않은 고체를 얻었다. 상기 고체는 다양한 용매에 낮은 용해도를 보였다. 상기 고체에 에틸 아세테이트를 가한 후 1분간 볼텍스(vortex)시키고, 원심분리한 후 용액을 따라 버린다. 이러한 세척 과정을 2회 더 반복한 후, 유기용매는 감압하에 완전히 제거하여 목적화합물인 (R)-3-[(9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐아미노)-메틸]-4-(4-{[(4-메톡시-페닐-다이페닐-메틸-아미노}-2-옥소-2H-피리미딘-1-일)-뷰티릭 애시드((R)-3-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-methyl]-4-(4-{[(4-methoxy-phenyl)-diphenyl-methyl]-amino}-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-butyric acid ; 화학식 11)를 가루형의 흰색 고체 (4.12g, 40%)로 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, DMSO) d12.151H, bs), 8.26(1H, bs), 7.87(2H, d, J=7.40Hz), 7.67(2H, d, J=7.360Hz), 7.41(3H, m), 7.26(17H, m), 6.83(2H, bs), 6.17(1H, bs), 4.27(2H, d, J=6.72), 4.20(1H, m), 3.70(3H, s), 3.48(2H, m), 2.96(2H, m), 2.16(2H, m), 2.05(1H, m);

¹³C NMR(100MHz, DMSO-d6) 73.08, 157.48, 156.34, 155.03, 144.93, 143.87, 143.83, 140.70, 130.11, 129.98, 128.62, 127.59, 127.40, 127.05, 126.75, 126.13, 125.15, 120.10, 112.71, 95.72, 69.77, 65.38, 54.95, 46.75, 41.13, 35.45, 33.64, 25.21;

HRMS (EI) calcd. for C₄₄H₄₀N₄O₆ : 720.2948 found: 720.2969

실시예5 : (R)-γ ³ Guanine monomer 의 합성

4-(2-아미노-6- 클로로 -퓨린-9-일)-3- 아지도메틸 - 뷰티릭 애시드 에틸 에스터 (화학식 12)의 제조

2-아미노-6-클로로퓨린 (2-amino-6-chloropurine)(1.36g, 8.0mmol)과 18-크라운-6 에테르 (2.11g, 8.0mmol) 및 활성화된 포타슘 카보네이트 (potassium carbonate) (1.11g, 8.0mmol)를 넣고 무수 DMF (30 mL)에서 30분간 교반하였다. 상 기 현탁액은 무수 DMF (10 mL)에 용해된 혼합물 2 (1.00g, 4.0mmol)로 캐뉼러(cannular)를 통해 가하였다. 상기 반응 혼합물은 9시간동안 교반하였다. 반응은 포화 염화암모늄 수용액을 가하여 퀀칭하고 메틸렌클로라이드로 3회 추출한 후 무수 마그네슘설페이트를 이용해 건조시키고 감압하에서 농축시킨 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(60% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하여 목적화합물인 4-(2-아미노-6-클로로-퓨린-9-일)-3-아지도메틸-뷰티릭 애시드 에틸 에스터 (4-(2-Amino-6-chloro-purin-9-yl)-3-azidomethyl-butyric acid ethyl ester (화학식 12)를 점성 높은 무색 오일 (1.12g, 82.7%)로 얻었다. ¹H NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(400MHz, CDCl₃) δ7.90(1H, s), 5.13(2H, bs), 4.16(4H, m), 3.42(2H, m), 2.67(1H, m), 2.39(2H, m), 1.25(3H, t, J=7.46Hz) m/z=338.1006(cal.)

3- 아지도메틸 -4-(6- 클로로 -2-{[(3- 메톡시 - 페닐 )- 다이페닐 - 메틸 ]-아미노}-퓨린-9-일)- 뷰티릭 애시드 에틸 에스터(화학식 13)의 제조

무수 피리딘 (25 mL)에 용해된 화합물 12 (1.10g, 3.2mmol)에 메톡시트리틸 클로라이드(methoxytrityl chloride) (1.51g, 4.9mmol) 및 트라이에틸아민 (triethylamine) (0.45ml, 3.2mmol)을 가하고 상온에서 20시간 동안 교반시켰다. 피리딘은 감압하에서 제거하고, 상기 잔여물에 5% CuSO₄ 수용액을 가한 뒤 메틸렌클로라이드로 추출하고 무수 소듐설페이트로 건조시켰다. 상기 미정제 혼합물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(60% 에틸아세테이트/헥산)로 정제하여 목적화합물인 3-아지도메틸-4-(6-클로로-2-{[(3-메톡시-페닐)-다이페닐-메틸]-아미노}-퓨린-9-일)-뷰티릭 애시드 에틸 에스터 (3-Azidomethyl-4-(6-chloro-2-{[(3-methoxy-phenyl)-diphenyl-methyl]-amino}-purin-9-yl)-butyric acid ethyl ester; 화학식 13)을 무색 오일 (1.78g, 89.7%)로 얻었다. ¹H NMR 및 ¹³C NMR의 결과는 하기와 같다.

¹H NMR(300MHz, CDCl₃) δ7.69(1H, s), 7.31(4H, m), 7.22(9H, m), 6.75(2H, d, J=8.91Hz), 6.67(1H, s), 4.10(3H, m), 3.77(3H, s), 3.66(2H, d, J=6.17Hz), 3.09(1H, dd), 2.98(1H, dd), 2.18(1H, m), 2.04(2H, m), 1.21(4H, m);

¹³C NMR(300MHz, CDCl₃) δ170.00, 157.26, 156.46, 151.68, 149.44, 143.85, 141.71, 141.13, 136.03, 129.14, 128.19, 127.83, 127.56, 126.82, 126.68, 126.09, 125.74, 111.96, 69.63, 59.84, 59.35, 54.15, 51.09, 43.82, 34.21, 32.82, 13.11 m/z=610.2208(cal.)

3- 아지도메틸 -4-(2-{[(4- 메톡시 - 페닐 )- 다이페닐 - 메틸 ]-아미노}-6-옥소-5,6- 다이하이드로-퓨린-9-일)- 뷰티릭 애시드(화학식 14)의 제조

10% NaOH 수용액에 화학식 13의 화합물 (100mg, 0.16mmol)을 가한 뒤 4시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합용액은 0^oC에서 1N HCl 수용액으로 산성화시키고, 메틸렌클로라이드로 추출한 뒤 무수마그네슘설페이트로 건조시켰다. 감압을 통해 유기용매를 농축시킨 잔사는 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (10% 메탄올/ 메틸렌클로라이드) 로 정제하여 목적화합물인 3-아지도메틸-4-(2-{[(4-메톡시-페닐)-다이페닐-메틸]-아미노}-6-옥소-5,6-다이하이드로-퓨린-9-일)-뷰티릭 애시드 (3-Azidomethyl-4-(2-{[(4-methoxy-phenyl)-diphenyl-methyl]-amino}-6-oxo-5,6-dihydro-purin-9-yl)-butyric acid, 화학식 14)를 흰색 고체 (83mg, 90.0%) 로 얻었다. m/z=564.2234(cal.)

3-[(9H- 플루오렌 -9-일 메톡시카보닐아미노 - 메틸 -4-(2-{[(4- 메톡시 - 페닐 )- 다 이페닐- 메틸 ]-아미노}-6-옥소-5,6- 다이하이드로 -퓨린-9-일)- 뷰티릭 애시드(화학식 15)의 제조

THF와 물의 혼합 용매 (THF/H₂O= 10/1, 33 mL)에 화학식 14의 화합물 (847mg, 1.50mmol)를 교반시키고, 1.0M의 농도로 THF에 용해된 트리메틸포스핀 (trimethylphosphine) (1.65 mL, 1.65 mmol)을 상온에서 첨가한 후 70^oC에서 1시간 교반시켰다. 유기용매는 감압하에서 제거시키고, 잔사는 증류수에 용해시킨 후 에 틸아세테이트로 1회 씻어주었다. 감압하에서 물을 제거한 후, 0.15 M 의 Na₂CO₃ 수용액 (30 mL) 과 아세톤에 0.2M 로 용해된 FmocOSu (9 mL)를 첨가하여 밤새 교반하였다. 상기 혼합물의 아세톤은 감압하에서 제거시키고, 물층은 에틸아세테이트로 씻어주었다. 상기 혼합물은 6N HCl 수용액을 가하여 산성화 시키고 에틸아세테이트로 추출하였다. 화합한 유기층은 무수 마그네슘 설페이트로 건조시켰다. 상기 현탁액의 유기용매는 감압하에서 제거시키고 흰색의 정제되지 않은 고체를 얻었다. 상기 고체는 다양한 용매에 매우 낮은 용해도를 보인다. 상기 고체는 에틸 아세테이트로 3회 씻어준 후 감압으로 건조하여 목적 화합물인 3-[(9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐아미노-메틸]-4-(2-{[(4-메톡시-페닐)-다이페닐-메틸]-아미노}-6-옥소-5,6-다이하이드로-퓨린-9-일)-뷰티릭 애시드 (3-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-methyl]-4-(2-{[(4-methoxy-phenyl)-diphenyl-methyl]-amino}-6-oxo-5,6-dihydro-purin-9-yl)-butyric acid; 화학식 15)를 가루형의 흰색 고체(685mg, 60%)로 얻었다. m/z=760.3009(cal.)

실시예6 : γ ³ - PNA 올리고머의 합성

올리고머(oligomer)는 자동화된 Peptide Synthesizer (ABI 433A, Applied Biosystems Inc., USA)를 사용, 일반적인 고체 상(standard solid phase) Fmoc-화학을 이용하여 합성되었다. Fmoc-보호된 aegPNA 모노머들은 파나진(PANAGENE; 대전, 서울)로부터 구입하였으며, 상기 모노머들은 A, G, C의 엑소사이클릭 아미노그 룹이 Bhoc-보호된 상태였다.

자동 합성(Automated Synthesis) 올리고머들은 NovaSyn TG Sieber 수지(XAL resin, substitution rate of 0.20 mmol/g)을 이용하여 5μmol 스케일로 합성되었다. 수지는 사용하기 6시간 이전에 용매와 섞인 DMF/DCM(디클로로메탄)으로 처리하여 두었고, N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone; NMP) (3 x 10 sec all other elongation steps)으로 세척하였다. Fmoc 제거는 20% v/v 피페리딘/DMF (1 x 3 min)으로 수행하였다. 때때로, 추가적인 탈보호 과정(4 min)이 전도율 (conductivity) 모니터링에 따라 요구될 수 있다. 수지는 NMP (3 x 10 sec)로 다시 세척되었다. 적절한 aegPNA 모노머들 또는 γ³ T (5 equiv.)이 HATU(5 equiv.), 2,6-루티딘(2,6-lutidine) (5 equv.) 및 DIEA (10 equiv.)로 사전-활성화 되었으며, 상기 시약들은 DMF 용액으로 제조되었다. 사전-활성화된 모노머 용액은 그 후 Fmoc-탈보호된 수지로 옮겨졌고, 100분 동안 섞였다. 커플링 후, 수지는 NMP (3 x 10 sec), DCM (6 x 10 sec)으로 세척되었다. 상기 단계는 최종 N-말단 잔기가 수지에 커플링 될 때 까지 반복되었다. 최종 Fmoc 제거 후, 수지는 NMP (3 x 10 sec), DCM (6 x 10 sec)으로 세척되었고 N₂ 하에서 건조되었다. Bhoc-탈보호된 수지로부터 올리고머를 절단하기 위하여 수지는 트리플루오로아세틱 산 (tirfluoroacetic acid; TFA) 내의 20% v/v m-크레졸(m-cresol)로 3 시간동안 처리되었다. 절단된 수지는 절단 혼합액(cleavage cocktail) (1 x 1 min), TFA (1 x 1 min)로 세척되었고 상기 용액은 테스트 튜브에 수집되었다. 용액은 공기 순환에 의해 건조 증발되었고, -78℃ 다이에틸 에터(diethyl ether)를 사용하여 침전시켰다. 테스트 튜브는 원심분리되었고, 에터를 조심스럽게 튜브로부터 따라 내었다. 세척 단계는 두 번 반복되었다. 결과적으로 조 PNA (crude PNA) 산물은 0.1% TFA와 물/아세토니트릴(water/acetonitrile) (2:1)에 재탕(reconstituted)하였다. 모든 시료는 역상 HPLC (reverse-phase HPLC)로 정제되었고 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석되었다.

PNA	서열(Sequence)	Mass(M+H)^a		Retention Time(min)^b
PNA	서열(Sequence)	계산값	측정값	Retention Time(min)^b
P1	H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂	2855.7857	2856.4026	11.604
P1a^R	H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂	2812.7610	2813.1134	11.584
P1a^S	H₂N-GTAGAT *CACT-Lys-CONH₂	2812.7610	2811.1503	13.448
P1b	H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂	2769.7362	2769.4455	11.744
P2	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	4279.0778	4280.2235	13.202
P2a	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	4236.0530	4237.1979	13.185
P2b	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	4193.0283	4192.7669	13.129
P2c	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	4150.0035	4150.9336	13.244

^a: 도구 - Voyager System 4389 (Applied Biosystems)

^b: 분석 조건 - 유량(flow rate) 1.0 mL/min, 0%B (0-2 min), 0-5%B (2-5 min), 5-20 %B (5-15 min), 20-100%B (15-35 min), 용매 A: 0.1% TFA를 포함하는 H₂O, 용매 B: 0.1% TFA를 포함하는 H₂O, Thermo Hypersil C18, 4.6 x 150mm, 5μ; 60℃, 260 nm에서 검출

A, T, G 및 C는 aegPNA의 염기이고, T는 (R)-γ³-T, T*는 (S)-γ³-T를 나타냄

Duplex 서열			RNA		DNA
Duplex 서열			Tm (℃)	ΔTm (℃)	Tm (℃)^a	ΔTm (℃)
P1a^R: H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂ DNA(RNA): 3'-CATCTXGTGA-5'	X=A	TA(matched)	43	-	39	-
	X=T	TT mismatch	27	-16	25	-14
	X=C	TC mismatch	26	-17	20	-19
	X=G	TG mismatch	32	-11	25	-14

버퍼: 각 가닥 2μM 당 10mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosthate buffer), 100mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.0

실시예7 : Tm 조사

Tm 조사는 열 융해 시스템인 CARY 300 UV 스펙트로포토미터 (Varian LTd.)상에서 수행되었다. Tm 측정을 위한 시료는 측정된 스톡 올리고뉴클레오티드 및 PNA 용액의 양을 혼합하여 최종 부피가 3.0 mL가 되도록 증류수를 첨가하여 제조되었다. 시료는 Tefon stopper를 이용하여 10mm 석영셀(quartz cell)로 옮겨졌다. OD₂₆₀ 값은 5 ~ 95℃(block temperature)로부터 각 단계에서 측정되었다. 결과는 개시 흡광도(initial absorbance)로써 각 온도에서 흡광도를 나눔으로써 표준화되었다. Tm 값은 가열 및 냉각 커브의 평균 커브의 초기 도함수로써 계산되었다(도 16, 도 17, 도 18).

실시예8 : γ ³ - PNA 와 DNA / RNA 의 경쟁 결합 선택성 분석( Competition binding selectivity assay )

준비 단계

칩-기반(chip-based) 분석을 위하여 서로 다른 4 포획 탐침자들(capture probes) (DNA4, P2, P2b 및 P2c; 표 3 참조)은 각 25μM의 최종 농도로 제조하기 위하여 10% (v/v) 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 포함하는 0.1M 카보네이트 버퍼(carbonate buffer) (pH 9.5)에 희석되었다. 포획 탐침자들은 제조사의 방법에 따라 VersArray ChipWriter™ Compact system (Bio-Rad Laboratories Inc., 캘리포니아, 미국)을 이용하여 동일한 알데하이드-활성화된 글래스(aldeghde-activated glass) (CEL-Associates, Houston, TX)상에 스팟 되었고, 습기있는 챔버(chamber))에서 오버나잇(overnight)하여 글래스 표면상에 탐침자들이 공유결합으로 결합되었다. 재현성을 입증하기 위하여, 포획 탐침자의 각 타입 당 여섯 개의 스팟(spot)으로 나타내었다. 배양 후, 글래스는 0.2% SDS로 두 번, 증류수로 두 번 세척 되었고, 95℃ 물에 2분 간 담구었으며, 쉬프 염기(Schiff base) 및 유리 알데하이드(free aldehydes)를 감소시키기 위하여 5분간 소듐 보로하이드라이드 용액 (Sodium borohydride) (인산-버퍼 살린의 750uL 및 100% 에탄올 250 uL에 용해된 2.5 mg NaBH₄)에 옮겨졌다. 슬라이드는 그 후 0.2% SDS로 세 번, 증류수로 두 번 씻어내었다. 마지막으로 슬라이드는 실온에서 공기-건조되었고, 사용될 때까지 진공 데시케이터(desicator)에 4℃로 저장되었다. 신호를 얻기 위하여, 마이크로어레이(microarrays)가 Axon GenePix 4000B fluorescence reader (Axon, Union City, CA)로 스캔되었다. Laser power 및 PMT(photomultiplier tube)는 각각 100 및 600으로 셋팅 되었다. 얻어진 16비트 TIFF 이미지는 기계에서 제공되는 GenePix Pro 3.0 (Axon)으로 분석되었다.

탐침자(Probes)		서열(Sequences)
포획 탐침자	DNA4	5'-H₂N(CH₂)₆- AGG GTC GCT CGG TGT -3'
	aegPNA, P2	H-^LLYS- AGG GTC GCT CGG TGT -HN₂
	γ³-PNA, P2b	H-^LLYS- AGG GTC GCT CGG TGT -HN₂
	γ³-PNA, P2c	H-^LLYS- AGG GTC GCT CGG TGT -HN₂
타겟 탐침자	Cy5-DNA2	5'-Cy5- ACA CCG AGC GAC CCT -3'
타겟 탐침자	Cy3-RNA2	5'-Cy3- ACA CCG AGC GAC CCU -3'

경쟁 결합 선택성 분석

타겟 탐침들 Cy5-DNA2 (Genotech, 대한민국) 및 Cy3-RNA2 (Bioneer, 대한민국)은 각 10nM의 최종 농도로 제조하기 위하여 0.01% Triton X-100 및 1X SSPE (150mM NaCl, 10mM NaH₂PO₄, 1mM EDTA)을 포함하는 결합 버퍼로 희석되었다. 1:1 탐침 용액의 혼합물이 칩(chip)에 적용되었다. 결합 반응(hybridization reactions)은 4시간 동안 37℃에서 수행되었다. 결합 후, 어레이는 0.005% Triton X-100 및 6X SSPE (0.9M NaCl, 60mM NaH₂PO₄, 6mM EDTA, pH 7.4)의 버퍼로서 실온에서 10분간 세척되었다. 결합 선택성은 측정된 형광 강도 비율로 결정되었다(표 4, 도 4 및 도 5).

포획 탐침자 (Capture Probes)	DNA 결합 (FI at 635 nm)	RNA 결합 (FI at 532 nm)	결합 선택성^a
DNA4	9,000	9.200	1.0
aegPNA, P2	14,300	22,000	1.5
γ³-PNA, P2b	3,100	26,800	8.7
γ³-PNA, P2c	1,000	30,400	30.4

^a 결합 선택성은 FI (532 nm) 및 FI (635 nm)의 비율로 정의된다; FI, 형광 강도(fluorescence intensity)

실시예9 : γ ³ - PNA 를 포함하는 혼성 PNA 올리고머에 있어서 PNA - DNA , PNA - RNA 융해 온도의 차이 확인

비고리형 단량체가 결합 정도와 용액상의 형태에 미치는 영향을 알아보기 위해, 일반적으로 알려진 고체상 합성 방법을 사용하여 일련의 γ³-PNA가 포함된 혼성 PNA 올리고머를 합성하였다(표 1 및 표 5의 서열). γ³-PNA가 포함된 혼성 PNA 올리고머와 그의 상보적 서열을 가진 RNA 1-3 및 DNA 1-3과의 결합 안정성은 260 nm에서 온도-의존 융해 온도 측정 실험을 이용해 측정하였다 (표 5). 대부분의 경우 γ³-PNA가 도입되는 개수가 늘어나면서 융해 온도차(ΔTm)도 늘어나는 경향성을 나타냈다 (γ³-티민 도입 한 개당 3-4 ℃ 증가). 한편, γ³-PNA가 들어간 경우 융해 온도의 절대값은 기존의 aegPNA만으로 이루어진 중합체에 비해 낮았는데, 이러한 융해 온도 감소는 염기 서열 의존성을 보이는 것으로 설명 가능하였다. 즉, P1 시리즈 보다 P2 시리즈에서 온도 감소 효과가 더 작은 것은 이중나선을 형성하였을 경우 모든 감마3-티민-아데닌 염기쌍이 P1에서는 A-T와 G-C 염기쌍 사이에 위치하지만, P2에서는 모두 G-C 쌍이 위치하기 때문인 것으로 해석된다.

PNA	서열(sequences)	RNA^b	DNA^c	ΔTm^d
P1	aeg - H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂	58	58	+0
P1a^R	H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂	46	42	+4
P1a^S	H₂N-GTAGAT *CACT-Lys-CONH₂	33	24	+9
P1b	H₂N-GTAGATCACT-Lys-CONH₂	43	37	+6
P2	aeg - H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	91(77)	90(77)	+1
P2a	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	88(70)	84(65)	+4
P2b	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	84(59)	76(54)	+8
P2c	H₂N-Lys-AGGGTCGCTCGGTGT-CONH₂	82(62)	74(nb)	+8

^a: UV 융해 곡선은 100mM NaCl 및 0.1 mM EDTA가 포함된 소듐포스페이트 버퍼 (10mM, pH 7.0) 속에 5 μM의 복선을 넣고 측정함.

^b, ^c, ^d: ΔTm은 PNA:RNA와 PNA:DNA의 융해 온도 차를 의미한다. A, T, G 및 C는 aegPNA의 염기이고, T는 (R)-γ³-3T, T*는 (S)-γ³-3T를 나타냄. 괄호 안의 숫자들은 평행인 복선(duplex)들의 융해 온도, nb는 결합하지 않았다는 의미.

일반적으로 예상할 수 있는 결과와는 달리, P2b와 P2c는 γ³-PNA가 도입된 개수가 다름에도 불구하고 서로 비슷한 융해 온도 (Tm)와 융해 온도 차이 (ΔTm)를 보임을 관찰할 수 있었다. 기존에는 변형 PNA의 결합선택성을 논할 때 일반적으로 이중나선의 융해 온도 차이 (ΔTm)를 선택성의 지표로 보고해 왔다. 그러나, 본 발명자들은 위와 같은 실험 결과를 토대로, 관찰하고 싶은 두 분자만이 존재하는 시스템 안에서 두 분자의 결합력을 비교한 융해 온도의 차이 (ΔTm) 결과가 실제 세포안의 조건처럼 여러 분자가 함께 존재하는 경쟁 조건에서의 결합 선택성과 직접적인 상관 관계가 없을지도 모른다는 의문을 가지게 되었다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 칩을 이용한 실험을 통한 경쟁 결합선택성 분석(competition binding selectivity assay)으로 γ³-PNA의 결합 선택성을 정량화하고자 하였다(실시예 8 참고). 그 결과 융해 온도 차(ΔTm)가 같음에도 불구하고, RNA에 3.5배 이상 선택적으로 결합하였으며, 이러한 결과는 기존의 융해 온도 측정 방법으로는 알아낼 수 없었던 발견이었다. 또한, P2c는 DNA 4나 P2에 비하여 RNA에 각각 30배와 20배 이상 선택적으로 결합하며, Cy5-DNA2와의 결합은 육안으로 감지하기 힘들 정도로 낮은 결합력을 보였다 (실시예 8, 도 5 참조). 예상하였던 대로 DNA 4와 P2는 RNA 및 DNA를 구별해 내지 못하였는데, 이러한 현상 역시 융해 온도 측정 결과와 일치하였다. 상기 실험으로부터, γ³-PNA들이 놀라운 RNA 선택성을 보이는 이유를 추론하여 보면, 이들이 RNA와 DNA가 경쟁적으로 결합하려고 할 때 RNA와 유사한 우나선 구조를 미리 형성함으로써 RNA와의 결합 엔트로피 측면에서 유리하기 때문에 일어날 수 있는 것으로 설명된다. 즉, γ³-PNA가 DNA 보다는 RNA와 더 빨리 결합하여 이중나선을 형성하고, 일단 이중나선이 형성된 후에는 DNA와의 이중나선보다는 더 늦게 풀어지기 때문에 γ³-PNA의 RNA에 대한 선택성이 얻어지는 것으로 판단된다.

실시예10 : γ ³ - PNA 의 CD 분석

올리고뉴클레오티드의 CD 스펙트라는 JASCO-700 스펙트로미터 상에서 기록되었다. 모든 시료는 0.1 cm path 길이 석영 큐벳(quartz cuvette)을 사용하여 실온(room temperature)에서 50nm/min의 스캔 속도로 0.1nm의 해상도, 1.0nm의 대역폭(bandwidth), 50mdeg의 민감도 및 1s 반응으로 300에서 200 nm 파장 범위에서 스캔되었다. 각 측정은 5번 반복되었고 평균값이 얻어졌다(도 19, 도 20, 도 21).

실시예11 : γ ³ - PNA 의 키랄성( chirality) 에 따른 PNA - RNA 나선구조의 방향성 확인

(R)-γ³티민을 포함한 단일 가닥의 P1a^R와 P1b의 CD 곡선은 단지 한 두 개 정도의 감마3-잔기 도입으로도 전형적인 RNA 같은 우나선 구조 형태를 이룰 수 있음을 보여준다. 거울상 이성질체인 (S)-γ³ 티민이 포함된 P1a^S의 단일 가닥은 반대로 뒤집혀진 CD 곡선으로 좌나선 구조 형태를 보이며, 이것은 예상한 바와 일치한다 (도 2). 도 3에서 보는 것처럼 γ³ -PNA (P2a 또는 P2b)와 RNA 2를 각각 1:1 의 비율로 혼합한 경우 CD 곡선의 형태는 aegPNA P2/RNA 2 가 이중나선을 이룰 때의 CD 형태와 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 사실은 γ³ -PNA가 RNA가 aegPNA와 RNA가 형성하는 이중나선과 유사한 형태의 이중나선을 이루고 있음을 나타낸다. Tm 연구와 CD 연구결과를 종합하면 다음과 같은 결론을 도출할 수 있다. 즉, 비고리형이고 구조적으로 간단한 키랄 γ³ -PNA 단량체가 포함된 변형 PNA는 RNA와 같은 나선 구조를 미리 형성하도록 유도할 수 있고, 이러한 γ³ -PNA의 구조적 특징은 RNA와 DNA를 구분하여 선택적으로 결합하게 할 뿐만 아니라 역평행 방향의 결합선택성도 갖게 할 수 있음을 알 수 있다.

도 1은 핵산 염기가 도입된 신규한 γ³-PNA의 기본 골격 구조를 나타낸다.

도 2은 단일 나선 PNA 들의 CD 곡선(각각 5μM)을 나타내고 있으며, P1a^R와 P1b는 (R)-γ³T를, P1a^S는 (S)-γ³T를 포함하고 있다.

도 3는 γ³-PNA와 RNA 이중나선의 CD 곡선을 나타낸다.

도 4는 포획된 프로브(capture probe)의 RNA 결합 선택성을 막대 그래프로 표현한 그래프로서, y 축의 수는 Cy3-RNA 2와 Cy5-DNA 2의 형광 강도(FI; Fluoresence Intensity) 비율을 나타낸다.

도 5는 635 nm (A)와 532 nm (B)에서 측정된 경쟁 결합 선택성 분석 (competition binding assay) 결과의 형광 이미지를 나타낸다. DNA 4의 서열은 5'-H₂N(CH₂)₆-AGGGTCGCTCGGTGT-3' 이다.

도 6 내지 도 15는 γ3-PNA 제조 과정의 중간체에 대한 ¹H NMR 및 ¹³C NMR을 나타낸 그래프이다.

도 16은 pH 7.0, 가열률 0.5℃ 조건으로 각 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 10mM 소듐 포스페이트 버퍼에서 5μM 가닥 농도를 사용하여 RNA1 또는 DNA1과 P1 시리즈(P1, P1a^R, P1a^S 및 P1b)의 역평행 듀플렉스(antiparallel duplexes)의 UV-융해 커브를 나타낸 것이다. RNA1, 5'-AGUGAUCUAC-3'(ap); DNA1, 5'-AGTGATCTAC-3'(ap)

도 17은 pH 7.0, 가열률 0.5℃ 조건으로 각 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 10mM 소듐 포스페이트 버퍼에서 5μM 가닥 농도를 사용하여 RNA2 또는 DNA2와 P2 시리즈(P2, P2a, P2b 및 P2c)의 역평행 듀플렉스(antiparallel duplexes)의 UV-융해 커브를 나타낸 것이다. RNA2, 5'-ACACCGAGCGACCCU-3'(ap); DNA2, 5'-ACACCGAGCGACCCT-3'(ap).

도 18은 pH 7.0, 가열률 0.5℃ 조건으로 각 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 10mM 소듐 포스페이트 버퍼에서 5μM 가닥 농도를 사용하여 RNA3 또는 DNA3와 P2 시리즈(P2, P2a, P2b 및 P2c)의 평행 듀플렉스(parallel duplexes)의 UV-융해 커브를 나타낸 것이다. RNA3, 5'-UCCCAGCGAGCCACA-3'(p); DNA3, 5'-TCCCAGCGAGCCACA-3'(p).

도 19는 pH 7.0, 각 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 10mM 소듐 포스페이트 버퍼에서 5μM 가닥 농도를 사용하여 DNA1과 P1 시리즈(P1, P1a^R 및 P1b)의 복선(duplex) CD 스펙트라를 나타낸 것이다.

도 20은 pH 7.0, 각 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 10mM 소듐 포스페이트 버퍼에서 5μM 가닥 농도를 사용하여 RNA1과 P1 시리즈(P1, P1a^R 및 P1b)의 복선(duplex) CD 스펙트라를 나타낸 것이다.

도 21은 pH 7.0, 각 100mM NaCl 및 0.1mM EDTA를 포함하는 10mM 소듐 포스페이트 버퍼에서 5μM 가닥 농도를 사용하여 DNA2와 P2 시리즈(P1, P1a^R 및 P1b)의 복선(duplex) CD 스펙트라를 나타낸 것이다.

Claims

하기의 화학식으로 표현되는 γ³-PNA 모노머 분자(γ³-PNA monomer molecule).

[화학식 18]

여기에서, P는 아민 보호기이고;

Y는 H이며;

Base는 보호되거나 보호되지 않은 핵산 염기이고;

n은 1 내지 3인 정수이며;

m은 0이다.
제1항에 있어서, P는 Fmoc (9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐; 9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)이고, Base는 보호된 핵산 염기인 γ³-PNA 모노머 분자.
하기 화학식 5, 8, 11 및 15 중 어느 하나로 선택되는 γ³-PNA 모노머 분자.

[화학식 5]

[화학식 8]

[화학식 11]

[화학식 15]
(R)-아지도메틸 감마-부틸로락톤(화학식 1)의 고리 열림 반응을 통하여 화학식 2의 화합물을 생성하는 단계; 생성된 화학식 2의 화합물과 보호된 핵산 염기가 반응하거나 또는 화학식 2에 핵산 염기를 반응시킨 후 핵산 염기의 엑소사이클릭 아미노 또는 하이드록실기를 보호하는 반응을 수행하는 단계; 및 상기 단계에 의해 핵산 염기가 결합된 화합물에서 아자이드를 환원시키고, 환원된 아민기에 보호기를 붙여 화학식 19의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 γ³-PNA의 제조방법.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 19]
제1항의 γ³-PNA 모노머 분자를 이용하여 합성된 혼성 PNA 올리고머(PNA oligomer).
유기체 내의 RNA에 선택적으로 결합하는 제5항의 혼성 PNA 올리고머를 상기 유기체에서 분리된 유전자가 포함된 시료의 RNA와 선택적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내에서의 유전자 발현의 조절 방법.
제6항에 있어서, 상기 조절 방법은 유기체 내의 전사(transcription)를 저해하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
유기체 내의 RNA에 특이적으로 결합하는 제5항에 따른 혼성 PNA 올리고머를 상기 유기체 세포 내의 RNA를 포함하는 시료와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내에서의 RNA 분해 유도 방법.
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