KR20210151593A - 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체 - Google Patents

신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체 Download PDF

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KR20210151593A
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Abstract

본 발명은 비자연 시토신 중에서 피롤로시토신(pC)을 가지는 몰포리노뉴클레오티드모노머를1종 이상 포함하는 신규한 몰포리노올리고뉴클레오티드로서, 보다 표적 RNA에 선택적으로 결합할 수 있으며, 천연 시토신을 가진 MPO보다 매우 우수한 세포투과도를 보여줌으로서 몰포리노올리고뉴크레오티드 영역의 난치병치료제 개발에 큰 기여를 할 수 있는 몰포리노올리고뉴클레오티드이다.

Description

신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체{Novel Morpholino Oligonucleotide derivatives}
본 발명은 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체에 관한 것이다. 　보다 상세하게는, 비자연 핵산염기(unnatural nucleobase)분야에서, 특히 비자연 시토신(unnatural cytosine)중에서 피롤로시토신(pC)을 가지는 뉴클레오티드 모노머가 1종 이상 함유되고, 각 몰포리노 뉴클레오티드 모노머(morpholino nucleotide monomer)들 사이에 포스포로디아미데이트(phosphorodiamidate)결합으로 이루어져 매우 우수한 세포투과능을 가져 다양한 유전자 치료에 사용가능한　신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체에 관한 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides: ASO라 칭함)는 주로 유기합성을 통해서 만들어지는 다수의 뉴클레오티드 단위체가 중합된 단일사슬 구조의 고분자 물질로서, 세포 내에 있는 표적 RNA와 왓슨-클릭 염기쌍을 형성 할 수 있는 인공유전자이다. 그러한 특성으로 말미암아, ASO는 표적RNA의 특정부분과 결합하면서, 원하지 않는 단백질 생성을 억제할 수 있음으로써, 유전자 차원에서 질병 치료에 적용될 수 있음이 널리 알려져 왔다. 최근에 ASO는 핵 속에 존재하는 프리커서(precursor) RNA와 선택적 스플라이싱 과정, 즉 유전적으로 결핍된 특정 엑손과 결합할 수 없게 되고, 건너뛰어서 그 다음 엑손과 결합함으로써 약간 변형된 mRNA를 만들 수 있다는 것이 보고되었다. 이처럼 엑손스키핑(exon skipping) 특성을 활용하여, 특정 엑손이 결핍된 유전자를 가지는 유전질환으로 인해 기능이 상실되었던 특정 단백질을 새로이 기능할 수 있도록 약간 변형된 단백질로 복구 시킬 수 있는 새로운 영역의 유전병 치료제 개발이 활발히 진행되고 있다.
한편, 지금까지 매우 다양한 구조를 가지는 변형된 올리고뉴클레오티드(modified oligonucleotides)가 알려져 왔다. 초기의 유도체인 메틸포스페이트 올리고뉴클레오티드(methylphosphonate oligonucleotide)를 시작으로 포스포로티올레이트 올리고뉴클레오타이드(phosphorothiolate oligonucleotide), 포스포라미데이트 올리고뉴클레오타이드(phosphoramidate oligonucleotide) 등은 모노머들 사이의 링커(linker)를 변형시킨 유도체들이다.
또한, 당(sugar)의 구조를 변형한, 예로서 2’-OMe, 2’-O-MOE, 2’-F-RNA, LNA 등 수십 가지 유도체들도 알려져 왔다.
그리고, 당 구조를 가지지 않는 특이한 구조로서 대표적인 것은 PNA(peptide nucleic acid) 및 MPO(morpholino oligonucleotide)들이 있다.
기타로, siRNA를 기반으로 하는 RNAi 치료제들도 많은 연구가 되어 오고 있다.
이상과 같이 많은 영역에서 구조적으로나 제법적으로 다양한 올리고뉴클레오티드를 이용한 유전자 치료제가 개발되고 있는데, 그 인공유전자들이 치료제로 사용하기 위해서는 다음과 같은 필요충분조건들이 요구된다.
1) 세포내에 있는 뉴클레아제(Nuclease) 효소에 안정해야 함, 2) 비교적 장시간 약효, 즉 목표 유전자와 상보적인 결합을 유지하여 단백질 발현을 억제해야 함, 3) 물에 대한 용해도가 우수해야 함 4) 낮은 독성을 가져야 하고, 특히, 생체내의 단백질과 결합함으로써 유발되는 독성들이 배제되어야 함 5) 목표 유전자와 매우 선택성을 가짐으로써 미스매치(mismatch)가 없어야 함.
이와 같이 유전자 치료제가 필수적으로 가져야 하는 조건을 전부 충족하는 유도체 중에서 대표적인 것으로는 앞서 언급한MPO가 있다. 　MPO는 골격(backbone)인 링커가 이온특성을 가지지 않는 중성의 물질로서 용해도가 우수한 유전자 치료제 유도체이다.
특히, PNA에 비해서 용해도가 매우 우수하여, 25mer 이상까지도 자체응고(self-aggregation) 없이 제조할 수 있는 특성을 가지는 ASO영역에 포함되어 있다.
MPO는 PNA와 유사하게 목표 유전자와 상보적으로 결합하여 번역(translation)과정에서 입체적방해(steric blocking)함으로서 단백질 생성을 저해 시키는 인공유전자 유도체이다. MPO의 일반 구조는 아래와 같다.
[MPO의 일반구조]
Figure pat00001
지금까지 MPO를 사용하여 치료할 수 있는 적응증은 널리 알려져 왔다. 이는 세포질내의 표적 mRNA와 개시코돈 근처에서 상보적으로 결합함으로써 특정 단백질의 번역을 억제시키는 작용기전에 따른 것으로, 이러한 작용기전에 의해 다양한 적응증을 치료할 수 있어, MPO는 항암제, 신경계 치료제, 항바이러스제, 내성균 항균제, 통증치료제, 면역관련 치료제 등 거의 모든 영역의 치료제에 적용될 수 있다.
한편 엑손스키핑을 통한 적응증의 대표적인 예시로는 유전질환인 뒤센근위축증(Duchenne muscular dystrophy:DMD)을 들 수 있고, ‘그 치료제로 현재 사렙타사의 에테플러센(eteplirsen)이 Exondye 51TM이라는 상품명으로 시판되고 있다.
해당 상품은 DMD질환 이외에 계속해서 유전성 희귀난치성 질환 적응증으로 치료 영역을 확대해가고 있다. 이처럼, MPO유도체들은 새로이 다양한 적응증에 대한 신약으로 개발될 수 있는 큰 잠재력이 있는 영역이나, 보다 진보적인 신약이 되기 위해서는 여러 측면에 걸친 문제점 해결이 필요하다.
그 중 가장 중요하게 해결해야 할 과제로는 양호한 세포투과성(cell penetration)을 가질 수 있게 하는 것이다. 이에, 고분자인 MPO에 대하여 다양한 방법 및 유도체들의 개발로 세포투과도를 증진시키는 연구들이 공개되었다. 지금까지 알려진 세포투과를 증진시키는 유도체들은 다음과 같다.
첫째는, 올리고뉴클레오티드 말단에 세포투과단백질(cell penetrating peptides:CPPs)를 도입하는 유도체이다. 페네트레인(Penetrain), Tat48-60, 트랜스포탄(transportan), MPG, Oligoarginine, (R-Ahx-R)4, Pip2b등의 다양한 CPP도입이 지금까지 알려져 왔다. 그러나, 이러한 CPP도입은 고가의 제조비가 요구되는 경제적 측면을 제외하더라도, 선택적으로 MPO의 특정 위치에 공유 결합시키기 어렵고, 제조 및 분리 정제가 매우 어려울 수 있다는 문제점을 안고 있다. 둘째는, 골격 및 링커에 양전하를 줄 수 있는 치환체를 도입한 유도체이다.
예를 들어, 세포투과성을 증진시키는 변형된 대표적인 MPO유도체로는 하기의 비보-몰포리노스(vivo-morpholinos), PMO plus가 있다.
[세포투과성을 증진시키는 MPO 유도체들]
Figure pat00002
상기 비보-몰포리노스는 MPO N-말단에 덴드리머 옥타구아니딘으로 치환된 트리아진일 피페라진이 핵심 구성요소인 MPO 유도체이고, PMOplus는 포스포로디아미데이트 링커에서 디메틸아미드 대신에 피페라진으로 치환되어 말단 아민의 양이온적 성질을 줌으로서 세포 투과를 향상시킬 수 있는 유도체이다.
이상 살펴본 바와 같이, 지금까지 연구자들은 세포 투과를 향상시키기 위한 MPO의 구조적인 유도체 개발측면에서, 상기와 같이 모노머 사이의 링커인 포스포로디아미데이트를 변형하거나, 말단에 양이온 적인 성질을 주거나, 펩타이드를 도입하는 등 다양한 시도를 해왔다.
한편, 핵산염기를 변형시킴으로써 새로운 MPO유도체를 개발한 연구들은(예: Eur.J.Org.Chem 2013년, 1271~1286) 몇 가지 알려져 있으며, 그 중에서 시토신 유도체들이 주로 연구되어왔다. 그러나 피롤로시토신 유도체들을 도입하여 세포투과를 증진시키려는 시도는 아직 잘 알려진 바 없다.
하기에 나타낸 바와 같이 다양한 올리고뉴클레오티드에 적용되었던 변형된 시토신 염기에 관련된 물질들이 존재한다.
[변형된 시토신 염기 유도체들]
Figure pat00003
상기에서, (1)은 DNA-페녹사진유도체로서 표적RNA에 상보적인 G와 G-클램프(G-clamp)를 형성할 수 있는 유도체라고 알려져 있다(Bioorganic & medicinal chemistry 25 (2017) 3597~3605).
(2)는 PNA-피롤로시토신(pC)　유도체(Bioorganic & medicinal chemistry Letter 19 (2009) 6181~6184)이고, (3)과 (4)는 페닐 혹은 알코올 및 아민기가 치환된 PNA-피롤로시토신(pC) 유도체이다(Nucleoside, nucleotides, and nucleic acids 24(2005) 581~584) 이 중 (5)는 대한민국등록특허 제10-1598423호에서 공개되었는데,　PNA-아미노알킬이 말단에 치환된 피롤로시토신(pC) 유도체로서 L1과 같은 메틸렌라디칼 링커를 주어서 말단에 치환된 아미노기의 공간적 영역을 확장한 유도체이다.
이들은 대부분 G-클램프를 통한 결합을 이용하여 상보적인 구아닌 염기에 큰 선택성과 부수적인 수소결합을 통해 안정성을 줄 수 있다. 더해서, 말단의 아미노기는 양이온적 특성을 가지므로 세포표면과의 결합 및 투과효과의 증진에 대한 기대감으로 고안되었다고 여겨진다.
이와 같이 변형된 시토신 유도체들은 주로 PNA에 적용된다. 그러나, MPO에는 아직까지 상기 (5)과 같은 시토신 유도체를 적용시킨 사례가 없다.
한편, 대한민국 등록특허 제10-1598423호에서는 반응식1 과 같은 합성공정을 통하여 변형된 시토신이 포함된 PNA유도체의 제조가 공개되었다.
[반응식 1]　변형된 시토신을 함유하는 PNA유도체
Figure pat00004
　 　
(상기 식에서, PG1은 아민기의 보호기이다.)
상기 반응식 1과 같이 일련의 합성공정을 통하여 피롤로시토신의 피롤부분에 아미노알킬이 치환된 PNA 모노머가 알려졌다.　 상기 특허는 변형된 시토신뿐만 아니라 말단에 아미노알킬이 치환된 아데닌과 구아닌의 변형체도 동시에 공개하였다. 또한 변형된 핵산염기들은 PNA와 결합됨으로 그 기능이 작용한다고 국한하고 있다.　
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 탁월한 세포투과성을 나타내는 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체를 개발하고자 오랜 시간 노력한 결과, 시토신 유도체, 특히 피롤로시토신(pC)을 일부분을 시토신과 함께, 또는 전부 시토신 대신 하는 비천연핵산염기중 피롤로시토신을 함유하는 몰포리노 올리고뉴클레오티드 모노머(morpholino nucleotide monomer, 이하, “unMPM”라고도 함) 및 몰포리노 올리고뉴클레오티드 모노머들을 염기서열에 의해 인위적으로 제조된 몰포리노 올리고뉴클레오티드(morpholino oligonucleotide, 이하 “unMPO”라고도 함)를 발명하게 되었다. 이와 같은unMPO는 종래 사렙타사(社) 등에 의해 공지된 기존의 천연핵산염기만으로 구성된 동일한 염기서열을 가지는 몰포리노올리고뉴클레오티드(MPO) 유도체들과 비교하여 매우 탁월한 세포투과성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
이러한 탁월한 세포투과성으로 인해, 본 발명에 따른 unMPO 는 향후 유전자 치료제 영역에서 큰 발전을 줄 수 있다.
변형된 시토신(modified Cytosine)을 MPO 모노머에 도입시키기 위해서는 제조 방법상 난이도가 높은 합성 설계 및 기술이 요구된다. 이에 본 발명자는 오랜 노력 끝에 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1598423호
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체를 포함하는 유전자 치료제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비자연 시토신 유도체, 특히 피롤로시토신(pC) 유도체를 최소한 1개 이상 포함하는 몰포리노 올리고뉴클레오티드(unMPO)를 제공한다. 본 발명은 비자연 핵산염기(unnatural nucleobase)분야에서, 특히 비자연 시토신(unnatural cytosine)중에서 피롤로시토신(pC)을 가지는 몰포리노뉴클레오티드모노머(morpholino nucleotide monomer: 이후 unMPM라고도 함)을 최소한 1개 이상 포함하고, 각 몰포리노 뉴클레오티드 모노머(morpholino nucleotide monomer)들 사이에 포스포로디아미데이트(phosphorodiamidate)결합으로 이루어진 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드(morpholino oligonucleotide: 이후 unMPO라고도 함)에 관한 것을 특징으로 한다. 　
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
구체적인 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체이다:
[화학식 1]
Figure pat00005
본 발명에 따른 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체는 상기 화학식 1로 나타내어지고, 핵산염기(NB)중 비천연시토신 염기, 구체적으로 하기 화학식 2의 피롤로시토신(pC) 몰포리노뉴클레오티드 모노머를 최소한 한 개 이상 포함하는, 몰포리노올리고뉴클레오티드(unMPO)이다.
상기 화학식 1에서, NB는 핵산염기를 의미한다.
NB1, NB2, NB3, NBn-1 내지 NBn은 각각 독립적으로 하기와 같이 표시되는 퓨린기로서 아데닌(adenine,A), 구아닌(guanine,G), 피리미딘기로서 티민(thymine,T), 시토신(cytosine,C), 그리고 변형된 시토신(modified cytosine)으로서 피롤로시토신(pC) 및 유라실(uracil,U)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
[핵산염기(NB)들]
Figure pat00006
;
m은 1 내지 40이고;
n은 1 내지 40이고;
x는 2 내지 5이고;
y는 1 내지 3이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수가 1 내지 10인 알킬기이고, 산소가 함유된 알킬옥시알킬기, 알킬옥시아실기이고, 질소가 함유된 알킬아미노알킬기, 알킬아미노아실기가 될 수 있다.
R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수가 1 내지 5인 알킬기이고,
상기 NB1, NB2, NB3, NBn-1 내지 NBn중 최소한 한 개 이상은, 변형된 시토신(modified cytosine) 중 상기의 피롤로시토신(pC) 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 갖는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명은 화학식 1로 일반식으로서 표현되고, 핵산염기(NB)중 에서 비자연 시토신(modified cytosine)중 피롤로시토신(pC) 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 최소한 1개 이상 함유된 비자연 시토신염기를 가지는 몰포리노 올리고뉴클레오티드(unMPO)이다.
화학식 1에서 표기되는 핵산염기(NB)의 염기서열은 표적 유전자, 구체적으로, 표적 RNA 또는 프리커서 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 가지는 신규한 unMPO이다.
"상보적" 또는 “상보성”은 하나 또는 두개의 올리고머 가닥들 상에서 2개 뉴클레오티드간에 정확한 페어링 능력을 말한다. "상보성"은 올리고머 화합물과 표적 RNA 또는 프리커서 RNA 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 수의 뉴클레오티드에 걸쳐 충분한 수준의 정확한 페어링 또는 상보성을 나타낼 때 사용되는 용어들이다.　 올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되는 이의 표적 유전자의 서열에 가능하면 정확하게 상보적으로 일치하면 바람직하지만, 100% 상보성일 필요가 없다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 사이에 있는 또는 인접 단편(가령, 루프 구조, 미스매취 또는 헤어핀 구조)은 혼성화 과정에 관여하지 않도록 하나 이상의 단편에 걸쳐 혼성화될 수 있다. 본 발명의 몰포리노 올리고뉴클레오타이드는 이들이 표적으로 하는 표적 핵산 서열내에 표적 부위에 대해 최소한 약 70%, 또는 최소한 약75%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 85%, 또는 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%, 또는 최소한 약 99% 서열 상보성을 포함한다.
표적 RNA 또는 프리커서 RNA부위와 안티센스 화합물의 상보성 비율은 당업계에 공지되어 있는 BLAST 프로그램(기본적인 국소 배열 연구 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일상적으로 결정할 수 있다. 상동성 비율, 서열 동일성 또는 상보성은 Smith 및 Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489)을 이용하는 디폴트 세팅을 이용하여 예를 들면, Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, 유전자tics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있다.
새롭게 변형된 시토신인 피롤로시토신을 가지는 unMPO를 사용하면 보다 표적 RNA의 구아닌 위치에 보다 선택적으로 결합할 수 있다. 특히나, 더욱 중요한 장점으로는 자연 시토신을 가진 MPO보다 매우 우수한 세포투과도를 보여줌으로서 몰포리노 올리고뉴크레오티드 영역에서 난치병치료제 개발에 큰 기여를 할 수 있다고 여겨진다.
본 발명에 따른 몰포리노 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위하여 변형된 시토신(modified Cytosine)을 몰포리노 뉴클레오티드 모노머에 도입시키기 위해서는 기존에 알려진PNA와는 합성공정이 크게 상이할 뿐만 아니라 난이도가 매우 높은 합성기술이 요구된다.
구체적으로 본 발명에 따른 몰포리노 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.
1) 천연핵산염기를 가지는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 합성하는 단계;
2) 피롤로시토신이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 합성하는 단계; 및
3) 상기 단계 1) 및 2)에서 제조된 천연핵산염기를 가지는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머 및 피롤로시토신이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 사용하여 고분자지지합성법으로 몰포리노 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계.
이러한 몰포리노 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.
[몰포리노 뉴클레오티드 모노머의 합성]
1. 천연핵산염기를 가지는 모노머의 합성
먼저 첫 번째 단계에서는, 핵산염기의 기능기 및 몰포리노의 아민기가 보호된 아데닌(A-MPM), 구아닌(G-MPM), 티민(T-MPM), 또는 시토신(C-MPM)이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 합성한다. 보호기는 공지의 보호기로서 핵산염기의 기능기 및 몰포리노의 아민기를 보호할 수 있는 보호기라면 제한없이 사용될 수 있으나, 비제한적인 예로서, 트리틸(trityl)기, 벤조일(Bz)기, 이소프로필카르보닐(이소부티릴), 아세틸기 등이 있다. 이러한 핵산염기의 기능기 및 몰포리노의 아민기가 보호된 아데닌(A-MPM), 구아닌(G-MPM), 티민(T-MPM), 시토신(C-MPM)이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 제조 할 수 있는 여러 방법들이 공개되고 있으며(미합중국특허 5185444,　Nucleosides, nucleotides and nucleic acid 31(2012) 763~782), 본 발명에서는 이러한 공개된 방법에 의거하여 보호기로 보호된 천연핵산염기를 가지는 모노머를 제조하여 사용한다. 구체적인 일 예로, 본 발명의 제조방법의 단계 1)에서 합성되는 천연 핵산염기를 가지는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머는 하기 화학식 2) 내지 5) 중 어느 하나일 수 있다.
[천연 핵산염기를 가지는 MPM]
[화학식 2]
Figure pat00007
[화학식 3]
Figure pat00008
[화학식 4]
Figure pat00009
[화학식 5]
Figure pat00010
2. 변형된 핵산염기인 피롤로시토신이 치환된 몰포리노뉴클레오티드 모노머의 합성
두 번째 단계는unMPO를 제조하기 위하여 변형된 시토신인 피롤로시토신(pC)유도체들을 가지는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머(pC-MPM) 유도체를 합성하는 단계이다. 고분자지지합성법으로 unMPO를 제조하기 위해서는 아민기 및 알코올기 같은 기능기가 적절한 보호기들로　보호된 pC-MPM이 요구된다.
구체적인 일 예로서, 상기 피롤로시토신 유도체들을 갖는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머는 하기 화학식 6, 6-1, 6-2 및 6-3으로 나타내어진다. 화학식 6은 기능기들이 적당한 보호기, 구체적으로 PG3 및 PG4 로 보호된 피롤로시토신(pC)이 치환된 pC-MPM의 일반식이며, 화학식 6-1, 6-2 및 6-3은 화학식 6의 구체적인 예이다.
[피롤로시토신을 가지는 pC-MPM 일반식]
[화학식6]
Figure pat00011
상기 식에서,
PG3 및 PG4는 고분자지지 커플링 반응 중에 부반응(side reaction)이 발생되지 않도록 충분히 안정한 보호기가 적용되어야 한다. 바람직하게, PG3는 산에 안정한 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), 1,1-디옥소벤조[b]티오펜-2-일메톡시카르보닐(Bsmoc), 2-(4-니트로페닐설포닐)에톡시카르보닐(Nsc), 2-(4-설포페닐설포닐)에톡시카르보닐(Sps), 에탄설포닐에톡시카르보닐(Esc), 프탈로일, 테트라클로로프탈로일(TCP), 2-플루오로 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc(2F)) 및 2,7-디tert-부틸 플루오레닐메톡시카르보닐(DtBFmoc)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, PG4는 염기에 안정한 보호기로서 tert-부톡시카르보닐(Boc), 트리틸(Trt),α,α-디메틸-3,5-디메틸벤질옥시카르보닐(Ddz), 2-(4-비페닐)이소프로폭시카르보닐(Bpoc) 및 2-니트로페닐설페닐(Nps)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
x는 1 내지 3의 정수이고, y는 1 내지 3의 정수이다.
[화학식6-1]
Figure pat00012
(pC-MPM에서 x=2, y=1, PG3=Fmoc, PG4=Boc)
[화학식 6-2]
Figure pat00013
(pC-MPM에서 x=3, y=1, PG3=Fmoc, PG4=Boc)
[화학식 6-3]
Figure pat00014
(pC-MPM에서 x=2, y=2, PG3=Fmoc, PG4=Boc)
구체적인 일례로서, 상기 단계 2)는 하기 반응식 2에 따른 제조방법에 의해 수행될 수 있다. 반응식 2는 상기와 같은 아민기 및 알코올기 같은 기능기가 적절한 보호기들로 보호된 pC-MPM 유도체들의 제조방법 중 일례로서, 반응식 2를 통해 변형된 시토신이 치환된 몰포리노모노머(pC-MPM) 중, x=2, y=1인 유도체를 제조할 수 있다.
[반응식 2] 변형된 시토신이 치환된 몰포리노 모노머(pC-MPM) (x=2, y=1) 유도체의 제법
Figure pat00015
화학식 6의 pC-MPM의 일례의 화합물 중 하나인 화학식6-1,즉, x=2, y=1인 화합물의 제조방법은 반응식2로 표기된다. 반응식 2의 제조방법을 설명하면 다음과 같다.
먼저 첫 단계는 화합물 (3)을 제조하는 단계로서, 1-아세틸-2,3,5-트리-O-벤조일-베타-D―리보퓨라노스(1)을 사용하여 5-요오드시토신(2)을 글리코실화반응을 통하여 수행될 수 있다 (제조예: heterocyclic letter Vol. 4: (4), 2014, 559-564, effective and regioselective 3-iodination of pyrimidine bases and corresponding nucleosides by inexpensive iodine and sodium nitrite reagent).
두 번째는 제조된 화합물 (3)의 아미노기를 적당한 보호기로 보호하는 단계로서, 보호기로는 벤조일기(Bz)가 바람직하다. 이러한 보호기로 화합물 (3)의 아미노기를 보호하여 화합물 (4)와 같은 화합물을 제조한다.
한편, 변형된 시토신유도체를 제조하기 위해서는 3-{2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시}-1-프로핀 (5)과 같은 삼중결합을 가지는 유도체가 필요하며, 화합물 (5)를 비롯한 프로핀 유도체들 및 이들의 제조방법은 대한민국등록특허 제10-1598423호에 개시되어 있으며, 상기 등록특허에 개시된 방법에 따라 이러한 프로핀 유도체들을 제조할 수 있다. 여기서 화합물 (5)의 말단 아민을 보호하는 보호기인 PG2로는 강염기에서도 안정성을 가지는 tert-부톡시카르보닐(Boc)기가 바람직하다.
세 번째는, 제조된 화합물 (4)와 상기 화합물 (5)를 반응시켜 화합물 (6)을 제조하는 단계이다. 구체적으로, 화합물(4)와 화합물(5)를 소노가시라(sonogashira) 크로스 커플링 반응을 통해서 화합물 (6)을 제조할 수 있다.
상기 단계에서는 Pd 또는 Cu 촉매를 사용할 수 있다. Pd촉매로는 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0), 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)디클로라이드　등을 사용할 수 있는데, 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)디클로라이드를 사용하는 것이 바람직하다. 　또한 Cu 촉매로는 쿠퍼(I)요오드 (CuI)를 촉매량 사용이 바람직하다. 아울러 반응에 사용되는 유기염기로는 3차 아민을 사용하며, 이러한 3차 아민의 예로는 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민이 있으며, 디이소프로필에틸아민이 적합하다. 반응시 사용되는 반응용매로는 헥산, 펜탄 같은 지방족 탄화수소 용매; 디에틸에테르, 페트로늄에테르, 테트라히드로 퓨란, 메틸테트라히드로퓨란 같은 에테르; 벤젠, 톨루엔 같은 방향족 탄화수소 용매; 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올같은 알코올 용매; 물; 아세톤, 메틸에틸케톤 같은 케톤 용매; 에틸아세테이트 같은 에스테르 용매; 아세토니트릴 같은 니트릴 용매; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 같은 아미드 용매; 디메틸술폭시드 같은 술폭시드 용매; 및 상기 용매들의 혼합용매; 등이 가능하나 아미드 용매 및 에테르 용매의 혼합용매가 가장 바람직하다.
반응 온도는 -30~120℃까지 가능 하나, 이상적인 온도는 0~50℃이다.
반응시 반응 진행 정도는 HPLC 및 박막크로마토그래피법(TLC)등을 사용하여 확인할 수 있다.
반응 후 제조된 화합물 (6)은 분리 정제될 수도 있으며, 분리 정제하는 방법으로는 컬럼크로마토그래피법 또는 재결정법 같은 정화방법 등이 사용될 수 있다. 이후, 특별한 언급이 없는 한 반응용매, 반응온도, 반응진행정도 확인 그리고 정제방법 등은 유사한 조건을 적용하여 제조할 수 있다.
네 번째로, 제조된 화합물 (6)로부터 분자내고리화 반응을 통해 피롤로시토신기를 형성시켜 화합물 (7)을 제조한다. 이때에 사용하는 용매로는 에탄올, 이소프로판올 같은 저급알코올을 사용하는 것이 바람직하고, 반응온도로는 가열환류조건이 바람직하다.
이후, 알코올 및 아민기에 보호된 보호기들을 순차적으로 탈보호 시켜 화합물 (8)과 화합물 (9)를 제조한다.
상기 순차적인 화합물 (8)의 탈보호 및 화합물 (9)의 탈보호 반응 조건 중 가장 중요한 점으로는 리보퓨라노스에 도입된 피롤로시토신기가 분리 제거되지 않을 정도의 가능한 한 순한 반응 조건이 요구된다는 것이다.
따라서, 화합물 (8)은 알코올 용매에서 암모니아수를 사용하여 벤조일기를 탈보호 시키는 것이 바람직하다. 화합물(9)는 트리플루오로아세트산 또는 무수염산을 사용할 수 있으나, 트리플루오로 아세트산이 바람직하다. 이에, 화합물 (9)은 트리플루오로 아세트산 염으로 제조될 수 있다.
다음으로, 상기 제조된 화합물 (9)의 말단 아민을 보호기(PG3)로 보호하여 화합물 (10)을 제조한다. 이때, 상기 말단 아민의 보호기로는 산성조건에서 안정한 보호기가 요구되며, 바람직한 PG3 보호기로는 대표적으로는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)이고, 그와 유사한 보호기로는 Fmoc(2F), DtBFmoc등이다. 반응 조건으로는 3차 유기염기 하에서 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(Fmoc-Cl), 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 N-히드록시숙시닐이미드(Fmoc-OSu)를 사용함으로서 제조할 수 있다.
이후, 상기 제조된 화합물 (10)의 1차 알코올을 선택적으로 보호함으로써 화합물 (11)을 제조할 수 있다. 이 때 보호기로는 tert-부틸디메틸실란, tert-부틸디페닐실란등이 적용될 수 있으나, tert-부틸디메틸실란(TBS) 보호기를 사용하는 것이 바람직하다.
다음 단계에서, 제조된 화합물 (11)과 과요오딘산 나트륨(NaIO4)을 사용하여 화합물 (12)을 제조한다. 화합물 (12)의 몰포리노환을 제조하는 방법은 Nucleosides, nucleotides and nucleic acid 31(2012) 763~782등의 논문 및 특허문헌들에 개시되어 있으며, 이러한 문헌들은 참고문헌으로서 본 발명의 범위에 포함된다.
화합물(11)를 과요오딘산 나트륨(NaIO4)를 사용하여 비시날디올(vicinal diol)을 폐환반응(oxidative cleavage반응)후 생성된 디알데히드를 환원반응을 경유한 분자내 몰포리노로 고리화반응을 통하여 제조함이 보편적으로 알려져 왔고 본 발명도 이에 준하여 합성함으로서 화합물(12)을 제조할 수 있었다.
디알데히드 중간체를 몰포리노로 고리화 반응을 시키는데 사용되는 아민은 암모니움비보레이트테트라히드레이트((NH4)2B4O7-4H2O)가 적당하고, 환원제로는 소디움보로하이드라이드, 소디움시아노보로하이드라이드(NaCNBH3) 등이 사용 가능하나, 이 중 소디움시아노보로하이드라이드가 보다 바람직하다.
이후, 제조된 화합물 (12) 화합물 (12)의 TBS로 보호된 알코올기를 산 조건에서 탈보호하여 알코올기로 전환시킴으로서 화합물(13)을 산 염형태로 얻어낸다. 이때 사용하는 산은 트리플루오로산, 또는 무수 염산이 가능하나, 결정상태의 산염으로 분리 정제하기 용이한 무수염산 사용이 바람직하다. 　
이후, 제조된 화합물 (13)에 트리페닐메틸클로라이드(trityl chloride)를 사용하여 약염기 조건에서 치환반응에 의해 몰포리노환의 2차 아민기가 트리페닐메틸(trityl)기로　보호된 화합물 (14)를 제조한다.
상기 반응에서 사용되는 용매로는 테트라히드로퓨란 같은 에테르류, 디클로로메탄 같은 할로알칸류가 적당하고, 적당한 염기로는 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 같은 3차 유기아민 종류의 약염기가 바람직하다.
다음으로, 제조된 화합물 (14) 의 피롤로시토신 중의 피롤로기를 무수 테트라히드로퓨란 같은 고리형에테르류 용매를 사용하여 0~50℃ 온도 조건에서 N,N’디메틸피리딘 촉매하에 보호기 도입에 의해 PG4기로 보호시켜 화합물 (15)를 합성한다.
화합물 (15)은 본 발명에서 가장 중요한 중간체로, 피롤로시토신을 가지는 몰포리노모노머 중 피롤로기는 약염기성으로, 올리고머를 제조하는 고분자지지 반응상에서 피롤로기의 염기성으로 인해서 고분자지지 커플링 반응 중 불순물이 발생될 수 있다. 따라서, 이러한 불순물의 발생을 최소화하기 위한 적당한 보호기(PG4)가 요구되어, 상기 화합물 (14)의 피롤로기에 PG4를 도입한다. 　PG4에 사용되는 보호기로는 아세틸, tert-부톡시카르보닐(Boc) 등 산에　의해 탈보호 될 수 있는 보호기가 바람직하나, 더욱 바람직하게는 tert-부톡시카르보닐(Boc) 보호기이다.
다음으로, 제조된 화합물 (15)에 클로로포스포아미데이트(chloro phosphoramidate) 기능기를 몰포리노환의 1차 알코올기에 도입하여 화합물 (16)을 합성한다. 본 단계에 의해 합성된 화합물 (16)이 피롤로시토신으로 치환된 몰포리노뉴클레오티드 모노머로서 고분자지지 올리고머 합성에 최종적으로 사용되며, 상기와 같은 클로로포스포아미데이트의 도입에 의해 분자간 커플링을 수행할 수 있게 된다.
상기와 같은 단계는 미합중국특허 제8076476호에 개시된 방법과 유사하게 수행될 수 있다. 구체적으로, 화합물 (15)를 출발물질로 하여, 매우 약염기, 예를 들어, 2,6-루티딘, N-메틸이미다졸, 또는 N-에틸몰포린 존재 하에 N,N-디메틸포스포아미도 디클로리데이트(N,N-dimethylphosphoamido dichloridte)를 사용하여 화합물 (16)을 제조한다.
이때 사용되는 용매로는 화합물 (15)과 화합물 (16)를 모두 잘 용해시킬 수 있는 디클로로메탄 같은 할로알칸류, 디에틸에테르, 테트라히드로퓨란 같은 에테르류,디메틸포름아미드 같은 아미드류 혹은 그들의 혼합용매들이 바람직하다. 반응 온도는 매우 반응성이 크므로 -10~25℃ 사이가 적당하다.
반응 후, 제조된 최종 몰포리노뉴클레오티드 모노머인 화합물 (16)를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 정제는 공지의 정제방법을 적절히 선택하여 수행할 수 있으나, 실리카젤을 사용한 컬럼크로마토그래피법을 적용함이 바람직하다.
[몰포리노 올리고머의 합성: 고분자지지합성법을 이용한 unMPO의 합성]
상기에서 합성된 천연 핵산염기 및 피롤로시토신이 치환된 몰포리노뉴클레오티드 모노머들을 사용하여 본 발명에 따른 몰포리노올리고뉴클레오타이드를 제조한다.
상기 천연 핵산염기 및 피롤로시토신이 치환된 몰포리노뉴클레오티드 모노머들로 표적 RNA와 상보적인 염기서열을 가지게 디자인하여, 고분자지지합성법(polymer-supported synthesis)으로 5 내지50mer가 가능하나 바람직하게는 10 내지 40mer의 몰포리노 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
표적 RNA의 염기서열은 Gen Bank에서 매우 다양하고 많은 유전자들의 염기서열이 공개되고 있으므로, 이러한 염기서열을 기반으로 표적 RNA와 상보적인 염기서열을 갖는 본 발명의 unMPO를 합성할 수 있다. 　MPO의 특성상 표적 RNA의 개시코돈 근처에 있는 염기서열을 목표로 하여 염기서열을 고안할 수 있다.
본 발명의 unMPO는 매우 많은 RNA에 관해서 안티센스올리고뉴클레오티드(ASO)로서 활용될 수 있지만, 본 발명에서는 일례로서 실시예에서 적용한 목표물질 즉, 몰포리노 올리고뉴클레오티드의 대상 물질은 OH(3’)-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-NH(5’)(서열번호 1) 염기서열을 가지는 물질로서 Annals of Oncology 19(2008) 1698~1705에 공지된 오브리머센(oblimersen) ASO의 염기서열을 대상으로 선택하고 실시하였다. 오브리머센은 동일 염기서열을 가지는 18-mer의 포스포로티올레이트 올리고뉴클레오티드 ASO이고, Bcl-2를 발현시키는 mRNA의 초기 6개 코돈에 상보적인 염기서열을 가지는 유방암 등 항암제치료를 목적으로 연구된 올리고뉴클레오티드 유도체이다.
18-mer를 가지는 unMPO의 염기서열은 TunCT-unCunCunC-AGunC-GTG-unCGunC-unCAT이다. 여기서 unC(unnatural Cytosine)는 피롤로시토신(x=2,y=1)몰포리노 뉴클레오티드이다.
고분자지지합성법에 대해 다양한 수지를 적용할 수 있지만, 그 중 바람직한 수지는 디비닐벤젠(DVB) 가 1%로 가교화된 아미노메틸폴리스티렌(AMPS) 수지가 적당하다.
고분자지지합성은 초기에 AMPS에 적당한 링커를 결합시키고, 이어서 초기에 사용되는 몰포리노뉴클레오티드 모노머의 1차 알코올을 링커의 말단에 치환 시킨다.
AMPS에 결합시킬 수 있는 다양한 링커가 알려져 있는데, 본 발명에서는 링커로서 숙신닉 안하이드라이드(succinic anhydride)를 사용하여 몰포리노 뉴클레오티드 올리고머 말단에 카르복실산의 생성을 유도하였다.
상기 고분자 수지에 말단에 있는 카르복실산에 몰포리노뉴클레오티드 모노머의 1차 알코올과 에스테르 커플링 결합을 시킴으로서 첫번째 몰포리노뉴클레오티드를 도입시킬 수 있다.
이후 도입된 몰포리노뉴클레오티드의 트리틸기를 탈보호하고, 화학식 2 내지 5 및 6, 6-1, 6-2 및 6-3으로 나타내어지는 몰포리노뉴클레오티드 모노머 중 각 순서에 해당하는 몰포리노뉴클레오티드 모노머를 순차적으로 사용하여 포스포로디아미데이트 결합을 통한 올리고머를 제조한다.
트리틸기의 탈보호 제법은 트리플루오로아세트산 등 다양한 유기산을 적용할 수 있지만, 핵산염기가 분해될 수 있으므로, 가능한 한 순한 조건이 요구된다. 그런 이유로 상기 유기산으로는 시아노아세트산을 적용함이 바람직하다. 또한, 다른 몰포린뉴클레오티드 모노머와 포스포로디아미데이트 결합을 이루는 커플링 방법은 디이소프로필에틸아민 같은 약한 염기를 사용하여 진행한다. 이때 사용하는 용매로는 스웰링이 잘 될 수 있는, 테트라히드로퓨란 같은 에테르류, 아세토니트릴 같은 니트릴류, 디메틸포름아미드, N-메틸-2-피롤리돈 같은 아미드류, 디클로로메탄 같은 할로알칸류 그리고 그들의 혼합용매 등이 바람직하다.
고분자지지합성 반응온도는 0~50℃까지 수행될 수 있으나, 바람직한 온도는 20~30℃이다. 반응 시간은 특별한 경우를 제외하고는 10분에서 60분 사이이다.
또한, 공초점 현미경(confocal microscope) 같은 현미경으로 세포투과정도를 확인하기 위하여 목표 염기서열을 가지고 고분자-지지된 unMPO의 2차 아민 말단에 다양한 형광물질들을 도입할 수 있다. 형광물질로는 프루오레세인, 시아닌(cyanine), 탐라(TAMRA)등을 적용 할 수 있는데, 그 중에서 Fam(fluorescein)을 적용 함이 바람직하다. Fam이 가지는 카르복실산과 링커의 아민과 아미드화 반응할 수 있도록 하여 링커가 결합된Fam유도체의 도입할 수 있다. 링커로는 아미노산이 널리 사용되는데 특히, 6-아미노헥사노익산의 사용이 바람직 하다. 또한, 다양한 Fam의 유도체들이 있지만, 일반적으로 사용되는 6-카르복시플루오레세인(6-Fam)과 6-아미노헥사노익산이 결합된 6-[플루오레세인-5(6)-카르복시아미도]헥사노익산 N-히드록시숙신이미드 로서 카르복실산이 활성화된 형광물질을 사용하였다. 그 형광물질을 사용하여 고분자에 지지되고, 기능기가 보호된 몰포리노 오리고뉴클레오티드의 N말단에 아미드 결합을 형성시킴으로서 형광물질이 결합된 몰포리노 오리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 그러나 본 발명에는 이에 제한되는 것은 아니다.
고분자지지합성을 완결한 후에 고분자수에 달린 unMPO의 보호기를 제거하는 공정이 필요하다. 핵산염기에 달린 보호기를 탈보호하는 조건은 염기성 조건으로 AMPS의 에스테르 링커 및 핵산염기에 보호된 벤조일기, 이소부티릴기, Fmoc기 등을 동시에 제거하는 방법이 바람직하다.
탈보호 방법으로는 메틸아민, 암모니아수 및 혼합염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기를 사용하여 탈보호시킬 수 있다. 반응 시간은 0.5 내지 24시간 동안 진행한다. 바람직하게는 1 내지 5시간이다.
나아가, 분리된 unMPO는 저온에서 감압농축 후 고체화 하여 정제 전의 unMPO를 제조할 수 있다.
이후 순수한 unMPO를 제조하기 위하여 prep-HPLC를 사용하여 역상 컬럼정제하면 목표물질을 제조할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 몰포리노 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 유전자 치료제를 제공한다.
상기 유전자 치료제로서 치료 가능한 질환은 표적 유전자의 활성 또는 비활성을 조절하여 치료될 수 있는 질환으로서, 제한이 없으나, 예를 들어, 표적 mRNA의 단백질 생성을 억제하는 안티센싱을 활용하는 치료제 용도로는 자가면역질환 같은 염증치료제, 항암제, 항바이러스제, 항생제등에 적용될 수 있고, 엑손스키핑에 적용되는 안티센싱으로는 뒤센근이양증(Duchenne Muscular Dystrophy)유전질환에 대한 치료제를 대표적으로 거론 할 수 있고, 기타 유전성 신경근육질환으로는 척수성근위축증(SMA), 근긴장성위축증 타입1(DM1) 율리히 질환 등 매우 다양한 질환들이 대상이다. 본 발명에 따른 유전자 치료제는 상기 피롤로시토신을 포함하는 몰포리노뉴클레오티드를 1종 이상 포함하는 몰포리노올리고뉴클레오티드 유도체를 유효성분으로 포함하여, 탁월한 세포투과성에 의해 표적 유전자와 관련된 질환의 치료에 탁월한 효과를 나타낸다.
본 발명의 유전자 치료제는 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 척수내, 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 유전자 치료제의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.
본 발명의 유전자 치료제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 신규한 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체는, 기존의 천연 핵산염기로만 치환된 MPO에 비해, 매우 우수한 세포투과를 가짐을 보여주고 있다. 본 물질들을 이용하여 그 동안 MPO 영역에서 해결해야 할 가장 중요한 과제였던 세포투과도를 크게 향상시킬 수 있기 때문에 몰포리노 올리고뉴크레오티드 영역의 신약개발에 크게 기여할 수 있다고 여겨진다.
도 1은 실시예 16에서 제조된 태그된 MPO-1-Fam과 unMPO-1-Fam에 대한 세포투과도를 확인한 형광이미지 사진이다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들의 분석에 사용된 기기들에 대한 사양은 다음과 같다.
NMR은 부르커(bruker) 400MHz를 사용하였고, 고성능질량분석기(LC-Q/TOF-MS)는 TripleTOF5600+ 를 사용하였고, HPLC 는 애질런트 1100 series 를 사용하였다. 그리고 세포투과도를 측정하는 장비로서 콘포칼레이저주사현미경은 GE DeltaVision Elite High Resolution Microscope을 사용하였다.
[실시예 1: 반응식 2의 화합물 (4)의 제조: 5-요오도-N4,2’,3’5’-테트라벤조일시티딘]
Heterocyclic letter Vol. 4: (4), 2014, 559-564에서 공개한 화합물 (3)인 5-요오도-2’,3’,5’-트리-O-벤조일시티딘 80g을 디클로로메탄 240ml에 가하고 벤조일안하이드라이드 39.8g을 가한다음 40℃에서 3일간 반응시켰다.
반응 완료후, 정제수 300ml로 3회 추출하여 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조시켰다. 건조제를 여과후 용매를 감압농축시키면 오일상 잔사를 얻을 수 있는데, 잔사에 무수에탄올 600ml를 가하여 1일동안 교반한 후 여과 건조하여 화합물 (4) 84.7g을 얻을 수 있었다.(수율 91.8%)
(화합물(4) NMR DMSO-d6) 12.73(1H,s), 　8.48(1H, s) 7.41~8.18(20H, m) 6.24~6.25(1H, d, J=3.6Hz) 5.96~6.02z(2H,m) 4.67~4.81(3H, m)
Maldi-TOF : [M+23]=808.15
[실시예2 : 반응식 2 (PG2가 Boc)의 화합물 (7)의 제조 : (2R,3R,4R,5S)-2-[(벤조일옥시)메틸]-5-[6-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에톡시)메틸]-2-옥소-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-3(7H)-일)테트라히드로퓨란-3,4-디일 디벤조에이트]
　반응식2의 화합물 (5) 30g을 질소 분위기에서 디메틸포름아미드 90ml 와 테트라히드로퓨란 30ml에 용해시키고, 3-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]-1-프로핀 11.4g을 가한다음 25℃를 유지시켰다.
디이소프로필에틸아민 13.3ml를 가하고, Pd(Ph3P)2Cl2 1.34g과 CuI 1.45g을 순차적으로 가하였다. 상온에서 24hr 반응후 출발물질이 사라지면, 에틸아세테이트　300ml와 정제수 300ml 를 가하고 추출하였다. 정제수 300ml로 2회 세척 후 포화소금물 200ml로 세척하였다.
유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 다음 감압농축하면 화합물 (6)을　갈색오일상으로 얻을 수 있는데, 농축한 잔사를 정제하지 않고 화합물 (7)을 제조하기 위해 다음 반응으로 진행하였다.
화합물 (6)에 무수에탄올 300ml를 가하고 24시간 동안 가열환류시킴으로서 분자내 고리화 반응을 진행시켰다. 반응 진행사항은 박막크로마토그래피법(MC:MeOH=10:1 rf ~0.5)으로 확인하였다. 반응 완료 후 용매를 감압농축시키고, 에틸아세테이트 300ml와 정제수 200ml를 가하여 추출하고, 포화소금물 100ml 로 세척하였다. 무수황산나트륨으로 건조시키고, 여과한 다음 감압농축하여 갈색오일상의 화합물 (7)을 수득하였다.
오일상 잔사에 이소프로필에테르 500ml를 가하여 고체화하고 여과 건조하여 화합물 (7) 25g을 수득할 수 있었다. (총수율 =87%)
(화합물 (7) NMR DMSO-d6) 　11.3(1H,s), 8.76(1H, s), 7.35~8.15(15H, m), 6.87(1H,d), 6.20(1H, s) 5.90~5.95(1H,m) 5.54(1H,s), 5.27(1H,s), 5.09(1H,s), 4.06~4.39(2H,s), 　3.77~3.97(4H,m), 　3.78(1H, m) 　3.61(1H, m), 3.40~3.42(2H, t), 3.15~3.17(2H, m), 1.36(9H, s),
Maldi-TOF : [M+23]=775.53
[실시예3 : 반응식 2 (PG2가 Boc)의 화합물 (8)의 제조: tert-부틸(2-((3-((2S,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(히드록시메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)메톡시)에틸)카르바메이트]
반응식 2의 화합물(7) 30g을 질소 분위기에서 메탄올 80ml와 테트라히드로퓨란 30ml에 용해시키고, 35% 암모니아수 80g을 가하여 2일간 25℃에서 반응시켰다.
3개의 벤조일기가 제거됨을 박막크로마토그래피법(MC:MeOH=5:1 rf ~0.5)으로 확인하였다. 반응완료후 출발물질이 사라지면, 감압하였다.
농축된 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로(컬럼전개용매: MC:MeOH=8:1에서 5:1로 조절하면서 분리) 정제하여 갈색 비결정질 고체 화합물(8) 15g을 얻었다.(수율 =85%)
(화합물 (8) NMR DMSO-d6) 　11.34(1H,s), 8.76(1H, s), 6.87(1H,d), 6.2(1H, s) 5.90~5.95(1H,m) 5.54(1H,s), 5.27(1H,s), 5.09(1H,s), 4.06~4.39(2H,s), 　3.77~3.97(4H,m), 　3.78(1H, m) 　3.61(1H, m), 3.40~3.42(2H, t), 3.15~3.17(2H, m),　1.36(9H, s),
Maldi-TOF : [M+23]=463.14
[실시예4 : 반응식 2의 화합물 (9)의 트리플루오로아세트산 염의 제조 : 6-((2-아미노에톡시)메틸)-3--((2S,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(히드록시메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온 테트라플루오로산 염]
화합물 (8) 11.6g에 아니솔 11.6g과 디클로로메탄 116g을 가하고 현탁시켰다. 현탁된 용액을 10℃로 유지하면서　25℃를 유지하면서 트리플루오로 아세트산 30ml를 서서히 적가하였다. 박막크로마토 그래피를 통한 반응진행정도　(아세토니트릴:물=4:1, rf=0.3)을 통하여 반응종결 확인후 외부온도 40℃이하에서 감압농축시켰다. 농축된 잔사에　에틸아세테이트 50g과 디에틸에테르 100g을 차레로 가하고 생성된 고체를 여과하고,　30℃에서 진공건조시켜 화합물(9)의 트리프루오로아세트산 염 형태로 10.5g을 수득하였다.(수율=87.7%)
(화합물 (9) NMR DMSO-d6) 11.41(1H, s), 8.85(1H, s), 6.28(1H,s), 4.50(2H, s) 3.97~3.99(2H,m), 3.40~3.42(2H, m), 3.19~3.32(2H,m), 3.11~3.17(2H, m), 3.03~3.07(2H, m),
Maldi-TOF : [M+23]=363..13
[실시예5 : 반응식 2(PG3가Fmoc)의 화합물 (10)의 제조: (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-((3-((2S,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(히드록시메틸)테트라히드로퓨란-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)메톡시)에틸)카르바메이트]
반응식2의 화합물 (9) 10g을 질소 분위기에서 에탄올 100ml에 용해시키고, 트리에틸아민 5.56g을 가한다. 반응온도를 10℃이하로 유지시키고, 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (Fmoc-Cl)6.3g을 조금씩 적가하였다.
박막크로마토그래피법(MC:MeOH=5:1 rf ~0.5)으로 반응이 완료됨을 확인하면 반응액을 35℃이하에서 감압 농축시키고, 농축된 잔사를 실리카젤을 사용하여 컬럼 크로마토그래피법(용출액 : MC:MeOH=5:1)으로 정제하였다.
연갈색 비결정질 고체 화합물(10)　9.5g을 얻을 수 있었다. (수율 =76.7%)
(화합물 10 NMR DMSO-d6) 11.30(1H, s), 8.78(1H, s),　7.67~7.90(2H, m), 7.41~7.43(2H, m),　7.30~7.43(4H,m), 6.18(1H,s),　5.99(1H, s), 4.49(2H, s), 4.41(1H, s), 3.94~3.99(2H,m) 3.47~3.51(2H,m) 3.34~3.45(2H,m), 3.17~3.19(2H, m)
Maldi-TOF : [M+23]=585.36.
[실시예6: 반응식 2(PG3가Fmoc)의 화합물 (11) 의 제조: (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-((3-((2S,3R,4S,5R)-3,4-디히드록시-5-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-3,4-디히드록시-테트라히드로퓨란-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)메톡시)에틸)카르바메이트]
반응식 2의 화합물 (10) 9.1g을　피리딘 45ml를 가하여 용해시키고, N,N’-디메틸아미노피리딘 0.2g을 가하고 15℃로 온도를 유지시켰다.
tert-부탈 디메틸 클로로실란 6g을 12시간 간격으로 1/3씩 나누어서 가하여 반응시킨다. 반응 완료후 반응용매를 감압농축시키고, 에틸아세테이트 100ml에 용해시키고, 포화소금물 100ml로 세척하였다. 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시키고, 여과후 감압농축하였다. 농축후 잔사에 이소프로필에테르 100ml를 가하고 생성된 고체를 여과하여 목적화합물(11)을 8.2g 수득하였다. (수율=74.9%)
(화합물 (11) NMR DMSO-d6) 11.32(1H, s), 8.79(1H, s), 7.67~7.90(2H, m), 7.40~7.45(2H, m), 7.30~7.45(4H,m), 6.18(1H,s), 5.99(1H, s), 4.50(2H, s), 4.40(1H, s), 3.91~4.00(2H,m) 3.45~3.53(2H,m), 3.32~3.45(2H,m), 3.15~3.(2H, m), 2.45~2.50(6H,m), 0.90(9H, s)
Maldi-TOF : [M+23]=699..51
[실시예7 : 반응식 2(PG3가Fmoc)의 화합물(12)의 제조 : (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-((3-((2S,6S)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)메톡시)에틸)카르바메이트]
반응식 2의 화합물 (11) 8.0g을 메탄올 150ml를 가하여 용해시키고, 암모니움비보레이트테트라히드레이트((NH4)2B4O7-4H2O) 7.2g을 반응액에 가하였다. 과요오딘산나트륨(NaIO4) 7.2g을 가하고 20±5℃에서 5hr 교반하면서 반응시켰다. 화합물 11이 사라짐을 확인하고, 셀라이트를 통해서 여과하고, 여액에 소디움시아노보로하이드라이드(NaCNBH3) 1.5g을 가하였다. 곧 이어서 초산 1.4g을 가하였다. 20±5℃에서 2hr 반응시키고, 감압농축시킨다. 잔사에 에틸아세테이트 150ml를 가하고, 정제수 100ml를 가한다. 추출후, 유기층을 포화소금물 50ml로 세척하고 유기층을 무수황산나트륨으로 건조시켰다. 　여과후 감압농축한 잔사에 이소프로필에테를 100ml를 적가하여 생성된 고체를 여과하고 30℃에서 진공건조시켜 화합물(12) 5.4g 얻을 수 있었다. (수율=69.2%)
(화합물 12 NMR DMSO-d6) 11.31(1H, s), 8.75(1H, s), 7.67~7.90(2H, m), 7.41~7.43(2H, m), 7.30~7.43(4H,m), 6.20(1H,s), 5.48~5.55(1H,m), 4.05~4.44(2H, s), 3.63~3.67(1H,m), 3.50~3.61(2H,m) ,3.34~3.45(2H, m), 3.09~3.19(2H, m), 2.74~2.79(2H, m), 2.60~2.67(1H,m), 2.30~2.38(1H,m) , 2.47~2.49(6H,m), 0.89(9H, s)
Maldi-TOF : [M+23]=682.45
[실시예 8 : 반응식 2(PG3가Fmoc)의 화합물(13)의 제조: (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-((3-((2S,6S)-6-(히드록시메틸)몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)메톡시)에틸)카르바메이트]
반응식 2의 화합물(12) 9.6g을 무수에탄올 200ml를 가하여 용해시키고, 이소프로필알코올 13%에 용해된 염산용액 20ml를 20±5℃에서　가하고, 3hr 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 감압농축시켰다. 잔사에 아세톤 200ml를 가하고 생성된 고체를 여과하였다. 여과후 아세톤 30ml로 세척하면 화합물 (13)의 염산염 형태로　7.2g 얻을 수 있었다. (수율=85%)
상기 조 화합물 (13) 염산염에 정제수 70ml와 테트라히드로퓨란 20ml를 가하여 용해시키고, 5%탄산수소나트륨 40ml를 가한다. 2시간동안 반응시키고, 반응액에 테트라히드로퓨란 100ml와 에틸아세테이트 50ml를 순차적으로 가하였다. 분리된 물층을 제거하고, 유기층에 포화소금물 50ml를 가하여 세척하고, 유기층을 분리하였다. 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 농축된 잔사에 아세톤과 에틸아세테이트 혼합용매로 고체화시키고 여과하고 에틸아세테이트로 세척하였다. 30℃에서 진공건조시키면 자유아민을 가지는 화합물 (13) 5.5g 을 얻을 수 있었다.(수율=82%)
　(화합물 (13) NMR DMSO-d6) 11.35(1H, s), 8.75(1H, s), 7.67~7.90(2H, m), 7.41~7.43(2H, m), 7.30~7.43(4H,m),　6.20(1H,s), 5.48~5.55(1H,m), 4.05~4.44(2H, s), 3.63~3.67(1H,m), 3.50~3.61(2H,t) ,3.34~3.45(2H, m), 3.09~3.19(2H, m), 2.74~2.79(2H, m), 2.60~2.67(1H,m), 2.30~2.38(1H,m) ,
Maldi-TOF : [M+23]=568.45
[실시예 9 : 반응식 2(PG3가Fmoc)의 화합물(14)의 제조: (9H-플루오렌-9-일)메틸 (2-((3-((2S,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일)메톡시)에틸)카르바메이트]
반응식 2의 화합물 (13) 8.4g을 디클로로메탄 150ml를 가하여 용해시키고, 트리에틸아민 3.2ml를 가하고,　10±5℃를 유지시켰다. 　 반응액에 트리틸클로라이드(Trityl chloride) 5.2g을 1/4씩 30분 간격으로 가하고, 5시간동안 반응시켰다. 반응완료후 정제수 100ml를 가하고, 유기층을 추출하고, 포화소금물 50ml로 세척한다. 분리된 유기층에 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 농축된 잔사에 에틸에테르로 고체화 시키고 여과한 후 에틸에테르로 세척하였다. 30℃에서 진공건조시키면 화합물(14) 9.58g을 얻을 수 있었다.(수율=79%)
(화합물 (14) NMR DMSO-d6) 11.35(1H, s), 8.75(1H, s), 7.67~7.90(2H, m), 7.67~7.90(2H, m), 7.00~7.60(21H, m), 　6.20(1H,s), 5.48~5.55(1H,m), 4.05~4.44(2H, s), 3.63~3.67(1H,m), 3.50~3.61(2H,t) ,3.34~3.45(2H, m), 3.09~3.19(2H, m), 2.74~2.79(2H, m), 2.60~2.67(1H,m), 2.30~2.38(1H,m) ,
Maldi-TOF : [M+23]=810.63
[실시예 10 : 반응식 2(PG3가Fmoc, PG4가 Boc)의 화합물(15)의 제조: tert-부틸-6-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)에톡시)메틸)-3-((2S,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-(3H)-카르복실레이트]
반응식 2의 화합물(14)　1.64g을　무수테트라히드로퓨란 20ml를 가하여 용해시키고, 디메틸피리딘 25mg를 가하고,　0±5℃를 유지시켰다. 　 반응액에 디 tert-부틸 디카르보네이트(Boc anhydride) 0.5g가 테트라히드로퓨란 5ml에 용해된 용액을　1시간동안 서서히 적가하였다. 20±5℃에서 5시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응완료후 감압농축후, 농축된 잔사를　실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제(전개액 : 　에틸아세테이트 : n-헥산=3:1)하여 에틸에테르로 고체화하고 30℃에서 진공건조 시켜 화합물(15) 1.55g을 수득하였다.(수율=83.9%)
(화합물 15 NMR CDCl3) 8.02(1H, s), 7.87(1H,s), 7.74~7.62(2H, m), 7.41~7.43(2H, d), 7.17 ~7.60(23H, m), 6.57~6.59(1H,m), 6.37~6.40(1H,m), 5.19(1H,m), 4.67(2H, m), 4.36~4.44(3H,m), 4.19~4.23(2H,m), 3.59~3.68(6H,m), 3.41~3.43(2H,m), 3.13~3.23(2H, m), 1.58~1.65(9H,d)
Maldi-TOF : [M+23]=911.02
[실시예 11: 반응식 2 (PG3가Fmoc, PG4가 Boc)의 화합물(16-1)의 제조: : tert-부틸-6-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)에톡시)메틸)-3-((2S,6S)-6-(((클로로(디메틸아미노)포스포릴)옥시)메틸)-4-트리틸몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-(3H)-카르복실레이트]
N,N’-디메틸포스포아미딕 디클로라이드 2.0g을 무수테트라히드로퓨란 30ml에 용해시키고, 0±5℃를 유지시켰다. N-메틸이미다졸 1.22g을 가하였다. 반응액에 반응식 2의 화합물(15)　5.5g을 가하여 10분 동안 반응시켰다. 반응액에 N-에틸 몰포린 0.78ml를 가하고, 3시간 교반시키면서 반응시켰다.
반응 완료후, 반응액을 1M KH2PO4수용액 50ml와 에틸아세테이트 50ml 혼합용액에 가한다. 유기층을 분리하고, 포화소금물로 세척한 다음 무수황산나트륨으로 건조시켰다.
건조제를 여과하고 감압농축한 잔사를 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 전개액　(에틸아세테이트:n-헥산=2:1)로 분리정제하였다. 에틸에테르로 고체화하고 30℃에서 진공건조 시키면 화합물(16-1) 5.1g을 얻을 수 있었다.(수율=81.2%)
(화합물 (16-1) NMR CDCl3) 8.02(1H, s), 7.87(1H,s), 7.74~7.62(2H, m), 7.41~7.43(2H, d), 7.17 ~7.60(23H, m), 6.57~6.59(1H,m), 6.37~6.40(1H,m), 5.19(1H,m), 4.67(2H, m), 4.36~4.44(3H,m), 4.19~4.23(2H,m), 3.59~3.68(6H,m), 3.41~3.43(2H,m), 3.13~3.23(2H, m),2.65(6H, dd), 　1.58~1.65(9H,d)
Maldi-TOF : [M+23]=1036.13
[실시예12: 화학식 6의 pC-MPM에서(x=3,y=1,PG3=Fmoc, PG4=Boc )인 화합물(16-2)제조: tert-부틸-6-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로폭시)메틸)-3-((2S,6S)-6-(((클로로(디메틸아미노)포스포릴)옥시)메틸)-4-트리틸몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-(3H)-카르복실레이트]
3- [2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로필 옥시]-1-프로핀을 사용하여 실시예 2내지11까지의 제조방법과 같고, 사용된 중간체 및 시약에 대하여 동일 비율의 당량을 사용하여 목적화합물 (16-2)를 제조하였다.
(화합물 (16-2) NMR CDCl3) 8.02(1H, s), 7.87(1H,s), 7.74~7.62(2H, m), 7.41~7.43(2H, d), 7.17 ~7.60(23H, m), 6.57~6.59(1H,m), 6.37~6.40(1H,m), 5.19(1H,m), 4.67(2H, m), 4.36~4.44(3H,m), 4.19~4.23(2H,m), 3.59~3.68(6H,m), 3.41~3.43(2H,m), 3.13~3.23(2H, m),2.65(6H, dd), 1.60~1.70(2H,m) 　1.58~1.65(9H,d)
Maldi-TOF : [M+23]=1050.03
[실시예 13: 화학식 6의 pC-MPM에서 　(x=2, y=2, PG3=Fmoc, PG4=Boc )인 화합물(16-3)의 제조　tert-부틸-6-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)에톡시)에틸)-3-((2S,6S)-6-(((클로로(디메틸아미노)포스포릴)옥시)메틸)-4-트리틸몰포린-2-일)-2-옥소-3,7-디히드로-2H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-(3H)-카르복실레이트]
4-[2-(tert-부톡시카르보닐아미노)에톡시]-1-부틴을 사용하여 실시예2 내지 실시예11까지의 제조방법과 같고, 사용된 중간체 및 시약에 대하여 동일 비율의 당량을 사용하여 목적화합물 (16-3)를 제조하였다.
(화합물 (16-3) NMR CDCl3)) 8.02(1H, s), 7.87(1H,s), 7.74~7.62(2H, m), 7.41~7.43(2H, d), 7.17~7.60(23H, m), 6.57~6.59(1H,m), 6.37~6.40(1H,m), 5.19(1H,m), 4.67(2H, m), 4.36~4.44(3H,m), 4.19~4.23(2H,m), 3.59~3.68(6H,m), 3.41~3.43(2H,m), 3.13~3.23(2H, m),2.65(6H, dd), 1.60~1.70(2H,m) 　1.58~1.65(9H,d)
Maldi-TOF : [M+23]=1050.25
[실시예 14: 고분자지지합성법에 의한　TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT의 염기서열을 가지는 MPO의 합성]
1) 아미노메틸폴리스티렌 수지(AMPS)에 숙시닐아미드 링커 도입
아미노메틸폴리스티렌 수지 (1% DVD 가교화, 0.8~1.0mmole/g, 100~200mesh) 0.8g에 N-메틸피롤리돈(NMP) 6ml를 가하고 20분동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 스웰링시키고 여과하였다.
숙시닐안하이드라이드 0.8mg, DMAP 40mg이 NMP 2ml와 피리딘 2ml혼합용해에 용해시킨 반응용액을 가한 후 2시간 동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하였다. NMP 4ml를 5분동안 흔들어주면서 세척시키고, 여과하였다. 이를 3회 반복하였다. 이어서 디에틸피로카보네이트 (diethyl pyrocarbonate) 1.0ml가 디클로로메탄 5ml에 용해된 반응용액을 가하고 15분동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 디클로로메탄 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 거쳤다. 시아노아세트산 0.5g이 디클로로메탄 5ml에 용해된 반응용액을 가하고 15분동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 디클로로메탄 5ml로 3분 동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 생성된 숙시닐아미드기가 링커된 고분자지지체를 질소 하에서 건조시켜 1.06g을 수득할 수 있었다.
2) 숙시닐아미드기가 링커된 고분자지지체에 T-MPM(AMPS-Linker-T)도입
상기 숙시닐아미드기가 링커된 고분자지지체 0.5g에 N-트리틸 몰포리노티미딘220mg, DMAP 60mg 디이소프로필카보디이미드(DIC) 100mg을 가하고, 테트라히드로퓨란:디클로로메탄:NMP=2:1:1 비율의 혼합용매 5ml을 가한 다음, 12시간동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 동일비율 용매 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
세척후, 11% 시아노아세트산 용액 (아세토니트릴:디클로로메탄=3:1 혼합용액) 3ml를 가한 다음 10분동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 디클로로메탄 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
이후, 5% 디이소프로필에틸아민 용액(이소프로필알코올: 디클로로메탄=1:3) 2ml로 2회 10분 동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 디클로로메탄 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
3) 염기서열에 의거한 MPO(TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT)도입
상기에서 제조된 AMPS-Linker-T에 A-MPM, C-MPM, T-MPM 및 G-MPM을 사용하여 염기서열에 의거하여 순차적으로 다음과 같이 제조하였다.
이때 사용되는 MPM의 사용량은 각각, A-MPM경우는 320mg/(디클로로메탄:THF=1:2) 혼합용매 3ml, G-MPM경우는 320mg /(디클로로메탄 :THF=1:2) 혼합용매 3ml, T-MPM경우는 230mg/(디클로로메탄:THF=1:2) 혼합용매 3ml, C-MPM경우는 340mg/(디클로로메탄 :THF=1:2) 혼합용매 3ml, T-MPM경우는 280mg 이었다.
각 MPM을 사용하는 커플링반응은 다음과 같다.
우선, AMPS-Linker-T에 N-에틸몰포린 160mg이 테트라히드로퓨란:디클로로메탄=2:1 혼합용액 5ml을 가하고, 이어서 C-MPM 340mg을 가하여, 3시간 동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 동일비율 용매 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
세척 후, 11%(w/w) 시아노아세트산 용액(아세토니트릴:디클로로메탄=3:1 혼합용액) 3ml를 가한 다음 10분동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 디클로로메탄 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
이후, 5% 디이소프로필에틸아민 용액(이소프로필알코올: 디클로로메탄=1:3) 2ml로 2회 10분동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 디클로로메탄 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다.
이후, 각각 다음에 해당되는 MPM으로 상기와 같이 반응시킴으로서 AMPS-Linker-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT 980mg를 제조하였다.
4) 고분자지지수지와 분리
상기 AMPS-Linker-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT 900mg를 플라스크에 가하고, 에탄올 5ml, 암모니아수 5ml, 7%메틸아민/테트라히드로퓨란 10ml를 가하고 24hr동안 300rpm동안 교반하면서 탈보호반응시킨다. 반응완료후 수지를 여과제거하고, 모액을 감압농축하고 건조하면 TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT 염기서열을 가지는 MPO 85mg(MPO-1) 를 얻을 수 있다.
[실시예 15: 고분자지지합성법에 의한 TunCT-CunCunC-AGunC-GTG-unCGunC-unCAT의 염기서열을 가지는 unMPO의 합성]
실시예 14와 같은 방법으로 해당 pC-MPM 460mg를 사용하여 TunCT-CunCC-AGunC-GTG-unCGunC-unCAT의 염기서열을 가지는 unMPO 80mg(MPO-2)을 수득하였다.
[실시예 16 : Fam을 이용한 MPO-1 및 unMPO-1 화합물의 태그]
콘포칼레이저주사현미경을 사용하여 세포투과도를 육안으로 측정하기 위하여 플루오레세인(Fam) 형광물질로 태그하기 위하여 다음과 같은 방법으로 Fam으로 태그된 MPO-1 및 unMPO-1을 제조하였다.
실시예 15 내지 16에서 제조된 AMPS-Linker-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT 100mg및 AMPS-Linker-TunCT-CunCC-AGunC-GTG-unCGC-unCAT 120mg에 6-[플루오레세인-5(6)-카르복시아미도]헥사노익산 N-히드록시숙신이미드 50mg씩을 테트라히드로퓨란:NMP=1:1 혼합용매 5ml에서 각각 3시간 동안 100rpm 속도로 흔들어주면서 반응시키고, 여과하고, 동일비율 용매 5ml로 3분동안 흔들어주고 세척하는 과정을 3회 반복하였다. 　이후 얻어진 AMPS-Linker-TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-Hx-Fam　및 AMPS-Linker-TunCT-CunCC-AGunC-GTG-unCGC-unCAT-Hx-Fam에 동일한 방법으로 고분자지지수지와 분리 후 정제하여 태그된 TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-Hx-Fam(MPO-1-Fam) 및 TunCT-CunCC-AGunC-GTG-unCGC-unCAT-Hx-Fam(unMPO-1-Fam)을 수득하였다.
[실시예 17: 태그된 MPO-1 및 unMPO-1화합물의 세포투과도 확인]
실시예 16에서 제조된 태그된 MPO-1-Fam과 unMPO-1-Fam에 대한 세포투과도를 확인하기 위하여, 8-well chamber(Lab-Tek chamber slide system)에 세포주의 성장속도에 따라서 HeLa 세포 20,000~50,000 cells/well로 분주(seed)시켰다. 각 세포는 37℃에서 5% 이산화탄소 분위기하에서 16~24hr 동안 배양시킨다. 배지를 5 μM의 농도의 MPO-1 및 unMPO-1이 각각 함유된 250 μL 신선한 DMEM 배지(FBS가 포함되지 않음)로 교체 후, 각각 1hr, 2hr, 12hr, 24hr동안 배양한 후에 각 세포들을 FBS로 2회 세척 후, DMEM 배지(FBS가 포함)로 교체하였다.
각 세포들에 대한 형광이미지는 GE/ DeltaVision Elite High Resolution Microscope장비 (100X objective)로 확인하였다. 　도 1은 MPO-1-Fam과 unMPO-1-Fam에 대한 세포투과정도에 대한 사진을 보여주는데, MPO-1-Fam은 거의 세포투과가 이루어지지 않음에 비해서, unMPO-1-Fam은 시간에 비례하여 매우 높은 세포 투과를 보여주고 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체:
    [화학식 1]
    Figure pat00016

    상기 식에서,
    NB1, NB2, NB3, NBn-1 내지 NBn은 각각 독립적으로 하기와 같이 표시되는 퓨린기로서 아데닌(adenine,A), 구아닌(guanine,G), 피리미딘기로서 티민(thymine,T), 시토신(cytosine,C), 피롤로시토신(pC) 및 유라실(uracil,U)로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
    Figure pat00017
    ;
    m은 1 내지 40이고;
    n은 1 내지 40이고;
    x는 2 내지 5이고;
    y는 1 내지 3이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수가 1 내지 10인 알킬기이고, 산소가 함유된 알킬옥시알킬기, 알킬옥시아실기이고, 질소가 함유된 알킬아미노알킬기, 알킬아미노아실기가 될 수 있다.
    R3 및 R4는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수가 1 내지 5인 알킬기이고,
    상기 NB1, NB2, NB3, NBn-1 내지 NBn중 최소한 한 개 이상은, 상기의 피롤로시토신(pC) 몰포리노뉴클레오티드 모노머를 갖는다.
  2. 제1 항에 있어서,
    표적 RNA 또는 프리커서 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기 서열을 갖는 것인, 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체.
  3. 1) 천연핵산염기를 가지는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 합성하는 단계;
    2) 피롤로시토신이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 합성하는 단계; 및
    3) 상기 단계 1) 및 2)에서 제조된 천연핵산염기를 가지는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머 및 피롤로시토신이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머를 사용하여 고분자지지합성법으로 몰포리노 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 화학식 1의 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 천연핵산염기를 갖는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머는 핵산염기의 기능기 및 몰포리노기의 아민기가 보호된 것인, 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 천연핵산염기를 갖는 몰포리노 뉴클레오티드 모노머는 하기 화학식 2 내지 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 것인, 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00018

    [화학식 3]
    Figure pat00019

    [화학식 4]
    Figure pat00020

    [화학식 5]
    Figure pat00021
  6. 제3항에 있어서,
    상기 단계 2)에서 제조되는 피롤로시토신이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머는 하기 화학식 6의 구조로 나타내어지는 것인, 제조방법:
    [화학식6]
    Figure pat00022

    상기 식에서,
    PG3는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), 1,1-디옥소벤조[b]티오펜-2-일메톡시카르보닐(Bsmoc), 2-(4-니트로페닐설포닐)에톡시카르보닐(Nsc), 2-(4-설포페닐설포닐)에톡시카르보닐(Sps), 에탄설포닐에톡시카르보닐(Esc), 프탈로일, 테트라클로로프탈로일(TCP), 2-플루오로 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc(2F)) 및 2,7-디tert-부틸 플루오레닐메톡시카르보닐(DtBFmoc)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
    PG4는 tert-부톡시카르보닐(Boc), 트리틸(Trt), α,α-디메틸-3,5-디메틸벤질옥시카르보닐(Ddz), 2-(4-비페닐)이소프로폭시카르보닐(Bpoc) 및 2-니트로페닐설페닐(Nps)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
    x는 1 내지 3의 정수이고;
    y는 1 내지 3의 정수이다.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 화학식 6의 피롤로시토신이 치환된 몰포리노뉴클레오티드 모노머는 하기 화학식 6-1, 6-2 및 6-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조로 나타내어지는 것인, 제조방법:
    [화학식6-1]
    Figure pat00023

    [화학식 6-2]
    Figure pat00024

    [화학식 6-3]
    Figure pat00025
  8. 제3항에 있어서,
    상기 단계 2)는 하기 반응식 2과 같이 나타내어지고, 다음의 단계를 포함하는 것인, 제조방법:
    Figure pat00026

    (상기 식에서,
    PG2는 터트-부톡시카르보닐(Boc)이고;
    PG3은 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)및 그의 유사체이고;
    PG4는 터트-부톡시카르보닐(Boc)이다)
    a) 화합물 (1) 의 1-아세틸-2,3,5-트리-O-벤조일-베타-D―리보퓨라노스 및 화합물 (2)의 5-요오드시토신을 사용하여 글리코실화반응에 의해 화합물 (3)을 제조하는 단계;
    b) 상기 단계 a)에서 제조된 화합물 (3)의 아미노기를 보호기로 보호하여 화합물 (4)를 제조하는 단계;
    c) 상기 단계 b)에서 제조된 화합물 (4)와 화학식 (5)의 프로핀 유도체 화합물을 사용하여 소노가시라 크로스커플링 반응을 통해 화학식 (6)을 제조하는 단계;
    d) 상기 단계 c)에서 제조된 화합물 (6)으로부터 분자내고리화 반응을 통해 피롤로시토신기를 형성시켜 화합물 (7)을 제조하는 단계;
    e) 상기 단계 d)에서 제조된 화합물 (7)의 알코올기에 보호된 보호기를 탈보호시켜 화합물 (8)을 제조한 후, 순차적으로 화합물 (8)의 아민기에 보호된 보호기를 탈보호시켜 화합물 (9)를 제조하는 단계;
    f) 상기 단계 e)에서 제조된 화합물 (9)의 말단 아민을 보호기로 보호하여 화합물 (10)을 제조하는 단계;
    g) 상기 단계 f)에서 제조된 화합물 (10)의 1차 알코올기를 보호기로 보호하여 화합물 (11)을 제조하는 단계;
    h) 상기 단계 g)에서 제조된 화합물 (11) 및 과요오딘산 나트륨(NaIO4)을 사용하여 몰포리노환을 형성시켜 화합물 (12)를 제조하는 단계;
    i) 상기 단계 h)에서 제조된 화합물 (12)의 알코올기에 보호된 보호기를 산조건에서 탈보호시켜 알코올기로 전환시켜 화합물 (13)을 제조하는 단계;
    j) 상기 단계 i)에서 제조된 화합물 (13)에 트리페닐메틸클로라이드(trityl chloride)를 사용하여 약염기 조건에서 치환반응에 의해 몰포리노환의 2차 아민기가 트리페닐메틸(trityl)기로　보호된 화합물 (14)를 제조하는 단계;
    k) 상기 단계 j)에서 제조된 화합물 (14) 의 피롤로기를 무수 테트라히드로퓨란 같은 고리형에테르류 용매를 사용하여 0~50℃ 온도 조건에서 N,N’-디메틸피리딘 촉매하에서 반응시킴으로서 G4기로 보호시켜 화합물 (15)를 제조하는 단계; 및
    l) 상기 단계 k)에서 제조된 화합물 (15) 중의 몰포리노환의 1차 알코올기에 클로로포스포아미데이트(chloro phosphoramidate) 기능기를 도입하여 화합물 (16)을 제조하는 단계.
  9. 하기 화학식 6의 피롤로시토신이 치환된 몰포리노 뉴클레오티드 모노머:
    [화학식6]
    Figure pat00027

    상기 식에서,
    PG3는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc), 1,1-디옥소벤조[b]티오펜-2-일메톡시카르보닐(Bsmoc), 2-(4-니트로페닐설포닐)에톡시카르보닐(Nsc), 2-(4-설포페닐설포닐)에톡시카르보닐(Sps), 에탄설포닐에톡시카르보닐(Esc), 프탈로일, 테트라클로로프탈로일(TCP), 2-플루오로 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc(2F)) 및 2,7-디tert-부틸 플루오레닐메톡시카르보닐(DtBFmoc)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
    PG4는 tert-부톡시카르보닐(Boc), 트리틸(Trt),α,α-디메틸-3,5-디메틸벤질옥시카르보닐(Ddz), 2-(4-비페닐)이소프로폭시카르보닐(Bpoc) 및 2-니트로페닐설페닐(Nps)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고;
    x는 1 내지 3의 정수이고;
    y는 1 내지 3의 정수이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 6의 피롤로시토신이 치환된 몰포리노뉴클레오티드 모노머는 하기 화학식 6-1, 6-2 및 6-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조로 나타내어지는 것인, 몰포리노뉴클레오티드 모노머:
    [화학식6-1]
    Figure pat00028

    [화학식 6-2]
    Figure pat00029

    [화학식 6-3]
    Figure pat00030
  11. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 몰포리노 올리고뉴클레오티드 유도체를 포함하는 유전자 치료제.
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