CN112759620A - 肝靶向化合物及寡核苷酸缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新的含小分子药物的肝靶向化合物及包含其的寡核苷酸的缀合物，也涉及制备这些化合物和缀合物的方法，以及本发明的寡核苷酸缀合物用于调控肝细胞中的基因表达，以预防和/或治疗相关疾病的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的肝靶向化合物和寡核苷酸缀合物、它们的制备方法和用途。
背景技术
基因调控剂，如寡核苷酸，正逐步发展成为传统小分子药物的替代物，以抑制与疾病相关的蛋白的功能。寡核苷酸可用于沉默或激活特定疾病的基因表达，从而防止或促进特定蛋白的形成，起到治疗疾病的作用。寡核苷酸包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、小激活RNA(saRNA)、反义寡核苷酸(ASO)和微小RNA(microRNA，miRNA)。
近年来，利用去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了较好的效果。专利申请WO2009073809A2中公开了一种包含三簇N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的寡核苷酸缀合物，其中包含GalNAc的片段经由3-羟基-5-羟甲基吡咯烷与寡核苷酸连接。这些缀合物具有抑制细胞中相应的基因表达的活性。文献Rajeev等,Chembiochem.2015 Apr 13；16(6):903-8中也公开了三簇N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的寡核苷酸缀合物，其中含GalNAc单体的片段经由3-磷酸酯基-5-羟甲基吡咯烷或3-硫代磷酸酯基-5-羟甲基吡咯烷与寡核苷酸缀合。所述寡核苷酸缀合物可以降低血浆总胆固醇水平，毒性较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的靶向化合物，该靶向化合物用于将寡核苷酸靶向递送至肝脏。本发明的另外一个目的是提供了一种寡核苷酸缀合物、其制备方法及应用，该寡核苷酸缀合物具有较高的体内递送效率、较好的稳定性、肝细胞中较高的基因表达抑制活性和/或较低的毒性。
一方面，本公开提供一种肝靶向化合物(下文亦称为缀合分子)，该化合物具有式(I)所示的结构：
其中，
R7代表羟基保护基团；
R8代表任何能与羟基反应形成亚磷酸酯基的基团；
Rj代表小分子药物基团；
A0表示全部活性羟基被保护的靶向基团。
在一方面，本发明提供了一种连接至固相载体的缀合分子，具有如式(II)所示的结构：
其中，
A0为全部活性羟基基团被保护的靶向基团；
Rj代表小分子药物基团；
R7代表羟基保护基团；
n代表选自0-7的整数；
SPS代表固相载体；
W0具有如式(A59)所示的结构：
其中，
E0独立地为O、S或BH；
B2独立地选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基中的一种；
在一方面，本发明提供了一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物具有式(III)所示的结构：
其中，
n代表选自0-7的整数；
A代表靶向基团；
R16和R15各自为H或具有式(A60)所示结构的基团，并且其中至少一个为具有式(A60)所示结构的基团；
W具有如式(A61)所示的结构：
其中，E1为OH、SH或BH2，
Nu为功能性寡核苷酸；
Rj代表小分子药物基团；可选地，所述小分子药物基团与所述功能性寡核苷酸用于治疗或预防相同或相关疾病或状况。
又另一方面，本发明提供了制备式(I)的缀合分子、式(II)的连接至固相载体的缀合分子、式(III)的寡核苷酸缀合物的方法。
又另一方面，本发明提供了本发明的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
又另一方面，本发明提供了一种调控肝细胞中基因表达的方法，所述调控包括抑制或增强所述基因的表达，该方法包括将有效量的本发明的寡核苷酸缀合物与所述肝细胞进行接触。
又另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的寡核苷酸缀合物。
本发明提供的缀合分子通过与寡核苷酸形成寡核苷酸缀合物，有望同时向肝细胞中递送具有相似或相同或协同起效的治疗作用的小分子药物和功能性寡核苷酸，有效地提高体内递送效率、具有尽量低的毒性、具有较好稳定性和/或较高肝细胞中基因表达抑制或激活活性，从而达到更好的治疗效果。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
定义
在上文及下文中，特别是在描述本公开的递送化合物(以下，有时也称为“本公开的缀合分子”或简称为“缀合分子”)的制备方法或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的RNA序列，在固相亚磷酰胺合成中使用的“未修饰或修饰RNA亚磷酰胺(unmodified or modified RNAphosphoramidite)”，固相亚磷酰胺合成是本领域合成RNA众所周知的方法。在本文中RNA亚磷酰胺同时也指核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidites)。除非另有说明，本公开所使用的核苷单体均可商购得到。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)是用于指示取代基连接点的位置。例如：-C1-C10烷基-NH2通过C1-C10烷基而连接。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代的烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不现实、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1到20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以是双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两个氢分子而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的子集，指的是与炔基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子系统。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香族碳环，通常具有3至7个环碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤代”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3至18元非芳香族环基，包含2-12个碳原子和选自氮、氧和硫的1-6个杂原子。除非说明书中另有说明，否则杂环基是单环、双环、三环或四环系统，可包括稠环或桥环系统。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。
“杂芳基”指由3至18元芳香族环自由基衍生的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，所述环包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过任何环原子连接至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上附加以及去除，而实质上不损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”、“减轻”、或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物或组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
缀合分子
根据本发明的一个方面，提供一种肝靶向化合物，具有式(I)所示的结构：
其中，
R7代表羟基保护基团；
R8代表任何能与羟基反应形成亚磷酸酯基的基团；
Rj代表小分子药物基团；
A0表示全部活性羟基被保护的靶向基团。
在一些实施方式中，R8代表任何与羟基反应形成亚磷酸酯基的基团，可选地，R8为具有式(R8-1)所示结构的亚磷酰胺基团：
其中，
表示基团共价键连接的位点，B1选自取代或未取代的C1-C5烃基，B2选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基中的一种。在一些实施方式中，B1为甲基、乙基或异丙基，B2为氰乙基(-CH2CH2CN)。在一些实施方式中，R8具有式(C3)所示的结构：
通过与羟基发生反应，式(I)化合物可通过亚磷酸酯连接至其它位置，所述其它位置包括但不限于核酸合成固相载体、连接在固相载体上的寡核苷酸链段等。所述亚磷酸酯可随后经反应形成化学上更稳定的、和/或生物利用度更高的基团，例如，经氧化或硫化形成磷酸酯或硫代磷酸酯连接。
在一些实施方式中，R7为羟基保护基团。在一些实施方式中，R7可以是任意的羟基保护基团。在一些实施方式中，可根据将通过式(I)化合物连接并递送的活性药物(特别是功能性寡核苷酸)和/或将进行的反应选择合适的羟基保护基团。在一些实施方式中，R7选自Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。在一些实施方式中，R7是DMTr。在一些实施方式中，在后续的亚磷酰胺固相合成过程中，所述羟基保护基团发生脱保护，随后在偶联反应条件下与亚磷酰胺基团(例如，亚磷酰胺核苷单体上的亚磷酰胺基团，或者另一分子的式(I)化合物中的R8基团)发生偶联形成亚磷酸酯。
在一些实施方式中，Rj代表小分子药物基团。小分子药物的作用方式通常是与蛋白结合，抑制或激活蛋白的功能，也有部分小分子抗病毒药物通过干扰病毒的复制过程而发挥作用。因此，小分子药物和寡核苷酸药物在作用机制上具有互补性。基于小分子药物和寡核苷酸药物的体内递送、细胞靶向、吸收、代谢等都存在差异，如果能够将针对同一疾病的小分子药物和寡核苷酸药物同时靶向递送到组织细胞，将可能提高治疗效果、降低药物使用量、降低耐药性等等。因此，在一些实施方式中，Rj表示小分子药物基团，所述小分子药物基团能够在靶细胞中释放出相应的小分子药物或其前体。籍此，通过在递送化合物中包含小分子药物基团，从而在寡核苷酸缀合物中同时包含功能性寡核苷酸和小分子药物，一方面有希望提高小分子药物在肝细胞中的靶向递送水平，另一方面，可通过适当选择小分子药物，实现小分子药物与功能性寡核苷酸共同递送进入相同细胞，在目标细胞中协同起效，从而预期能够提供显著药物协同作用。在一些实施方式中，Rj是核苷类小分子药物基团。在一些实施方式中，Rj可以是核苷类小分子药物基团，所述核苷类小分子药物选自以下化合物所组成的组：恩替卡韦(Entecavir)、克拉夫定(Clevudine)、替比夫定(Telbivudin)、利巴韦林(Ribavirin)、单磷酸阿糖腺苷(Vidarabine Monophosphate)、西多福韦(Cidofovir)、更昔洛韦(Ganciclovir)、三氟胸苷、碘苷、阿糖腺苷(Vidarabine)、喷昔洛韦(Penciclovir)。在一些实施方式中，Rj选自式(I-Rj-N)、(I-Rj-O)或(I-Rj-C)所示结构的任意一种：
其中，
表示基团共价键连接的位点。
在一些实施方式中，本发明的式(I)所示化合物中的A0为由式-L-S表示的全部活性羟基基团被保护的靶向基团，其中，S代表对哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲和力的配体M1，该配体M1中的活性羟基(如果有的话)全部被羟基保护基团保护；L表示连接S与Rj的连接基团。
在一些实施方式中，L是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于由以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。技术人员会理解，尽管为了方便起见，L被定义为线性烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或置换而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
在一些实施方式中，L的作用是将M1配体与小分子药物连接，从而为本公开的寡核苷酸缀合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合：
其中，j1为1-20的整数；
j2为1-20的整数；
R’为C1-C10烷基；
Ra选自式A27-A45基团中的一种：
Rb为C1-C10烷基。
在一些实施方式中，L选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，L选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中，L的长度可能为3-25、3-20、4-15或5-12个原子。在一些实施方式中，L的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55或60个原子。所述L的长度是指与式(I)化合物中Rj连接的原子到与S连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数。
在本公开的一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R’为C1-C4烷基，在一些实施方式中，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现M1配体与Rj表示的小分子药物基团相连接，并使M1配体之间的空间位置更适合于使M1配体与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一种M1为能够和肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和哺乳动物肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。
在一些实施方式中，M1可能是对哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲合力的任何一种配体，这些配体的种类为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，至少一个M1为糖类。在一些实施方式中，每个M1为糖。在一些实施方式中，至少一个M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，每个M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，至少一个M1是修饰的糖。在一些实施方式中，每个M1为修饰的糖。在一些实施方式中，每个M1独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖或单糖衍生物。在一些实施方式中，每个或至少一个M1可能独立地选自由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物以及唾液酸。
在一些实施方式中，每个或至少一个M1可能独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在一些实施方式中，至少一个M1为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施方式中，每个M1均为N-乙酰基半乳糖胺。在一些实施方式中，配体选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
CN105378082A公开了一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团及1个或多个配体，每个配体选自多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。据称，该化合物可以降低细胞中核酸转录物的量或活性。
N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)，是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的配体。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了较好的效果。例如，阿尔尼拉姆公司(Alnylam pharmaceuticals,Inc.)首次报道了基于GalNAc缀合技术的siRNA在小鼠体内发挥干扰活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)。文章报道了缀合有三簇GalNAc的siRNA，在体内和体外实验中均展现了良好的递送活性。通过皮下给药的小鼠体内实验，单一剂量的ED50确定为1mg/kg，单次注射剂量小于1ml。在长期给药实验中，每周皮下注射一次，可获得长达9个月的稳定干扰活性。
在本公开的实施方式中，S是M1中的活性羟基(如果存在的话)被全部羟基保护基团保护而形成的基团。在一些实施方式中，任何本领域技术人员熟知的羟基保护基团可能被用于保护M1上的活性羟基。在一些实施方式中，被保护的羟基具有YCOO-的形式，其中每个Y独立地选自于由C1-C10烷基和C6-C10芳基组成的组，其可任选地由一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素取代基和C1-C6烷基。在一些实施方式中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基和C1-C6烷基苯基。
在一些实施方式中，每个S各自独立地选自于由式A46-A54基团所组成的组：
在一些实施方式中，S为式A49或A50。
在一些实施方式中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；出于简化本公开的缀合分子的目的，在一些实施方式中，Y为甲基。
在本公开的一些实施方式中，式(I)的缀合分子具有以下式(I-O-1)、(I-N-1)、(I-N-2)、(I-N-3)、(I-N-4)、(I-N-5)或(I-C-1)中的任意一者所表示的结构：
其中，R7和R8具有如前所述的定义和可选择的范围。
式(I)缀合分子的制备
可通过任意合理的路线制备式(I)化合物(以下，也称为式(1)缀合分子)。
在一些实施方式中，式(I)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在形成式(I)化合物的条件下，将式(I-2)所示化合物与包含R8基团的化合物接触，分离出式(I)所示化合物。
例如，在一些实施方式中，式(I)化合物可通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在取代反应条件下，以及在活化剂和有机碱存在下，将式(I-2)所示化合物与式(I-3)所示的亚磷酰二胺接触，分离出式(I)所示化合物：
A0、Rj、R7和R8各自的定义和可选择的范围如前所述，每个B1独立地为取代或未取代的C1-C5烃基；B2选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基中的一种。此时，所获得的式(I)化合物中，R8为式(R8-1)所示的亚磷酰胺官能团。
式(I-3)所示化合物可通过商购得到，或可由本领域技术人员通过公知的方法合成获得。在一个实施方式中，式(I-3)化合物为市售的双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦。相对于所述式(I-2)所示化合物，式(I-3)化合物的用量(摩尔比)为1:1-5:1，例如可以为1.5:1-3:1。
所述取代反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为1-20小时，在一些实施方式中，所述取代反应条件为反应温度为10-40℃，反应时间为2-8小时。
所述有机溶剂为环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、腈类溶剂、二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。所述环氧类溶剂例如可以为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂例如可以为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂例如可以为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，所述腈类溶剂例如可以为乙腈或正丁腈。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于所述式(I-2)所示化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，例如可以为5-20L/mol。
所述催化剂为N-甲基咪唑或四氮唑(或称四唑，Tetrazole)，例如可以为四氮唑。相对于所述式(I-2)所示化合物，所述催化剂的用量(摩尔比)为0.1:1-5:1，例如可以为0.5:1-3:1。
所述有机碱可以是胺类有机碱或吡啶类有机碱。在一些实施方式中，所述有机碱可以是N,N-二异丙基乙胺。相对于所述式(I-2)所示化合物，所述活化剂的用量(摩尔比)为0.1:1-5:1，例如可以为0.5:1-3:1。
所述式(I-3)所示化合物与式(I-2)所示化合物的摩尔比为0.5:1-5:1，例如可以为0.5:1-3:1。
可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(I)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(I)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:0-100:1梯度洗脱；反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。
在一些实施方式中，式(I-2)化合物的A0基团中的链段L部分包含酰胺键。此时，式(I-2)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在有机溶剂中，在酰胺化反应条件下，以及活化剂存在下，将式(I-4)所示化合物与式(I-5)所示化合物接触，随后在脱保护反应条件下脱除羟基保护基团Rk1，分离出式(I-2)所示化合物：
其中，R7、Rj、S各自的定义和可选择的范围如前所述；Rk1为羟基保护基团；所得到的式(I)化合物中，A0中的链段L具有-L1-CONH-L2-的结构，其中，L1和L2各自独立地为连接基团。在一些实施方式中，L1和L2各自独立地为C1-C5亚烷基。
羟基保护基团Rk1的作用在于防止在与式(I-5)化合物的反应中发生不期望的副反应。在一些实施方式中，基团Rk1是与R7相同的羟基保护基团。在一些实施方式中，基团Rk1是与R7不同的羟基保护基团。在一些实施方式中，基团Rk1是与R7相比更易脱除的羟基保护基团。在一些实施方式中，羟基保护基团Rk1是叔丁基二甲基硅基(TBS)。在一些实施方式中，基团Rk1是与R7不同的羟基保护基团，上述式(I-2)所示化合物的制备方法还包括在将式(I-4)所示化合物与式(I-5)所示化合物接触后，在脱保护反应条件下脱除羟基保护基团R7与Rk1；在羟基保护反应条件下与羟基保护剂接触，重新形成经保护的羟基-OR7；分离获得式(I-2)所示化合物。所述羟基保护反应条件与脱保护反应条件根据羟基保护基团R7与Rk1的结构而相应确定，并且可例如参考Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2d ed，JohnWiley&Sons，New York，1991中的描述，以引用的方式将上述文献整体并入本文。在一些实施方式中，羟基保护基团Rk1是TBS基团，此时，脱保护反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为0.5-4小时，在一些实施方式中为1-2小时，并可通过例如TLC等方式对反应完全程度进行检测。脱保护试剂可以选自四丁基卤化铵、酸如氢卤酸或乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃(THF)溶液。脱保护试剂与式(I-4)化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一些实施方式中为1.5:1-5:1。
式(I-5)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公开的化合物，或者，式(I-5)化合物可由本领域技术人员通过各种方法制备，例如，可参照US 8,106,022B2实施例1中所公开的方法制备某些式(I-5)化合物，以引用的方式将以上文献的全部内容整体并入本文。
所述酰胺化反应条件包括：反应温度为0-100℃，反应时间为8-48小时，在一些实施方式中，所述酰胺化反应条件为反应温度10-40℃，反应时间为8-20小时。
所述有机溶剂为环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述环氧类溶剂例如可以为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂例如可以为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂例如可以为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(I-4)化合物，有机溶剂用量为3-50L/mol，例如可以为5-20L/mol。
所述活化剂为3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)中的一种或多种。例如可以为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)。相对于所述式(I-4)所示化合物，所述活化剂的用量(摩尔比)为0.1:1-10:1，例如可以为1:1-5:1。
所述式(I-5)所示化合物与所述式(I-4)所示化合物的摩尔比为0.5:1-100:1，例如可以为1:1-10:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(I-2)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(I-2)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:1-20:1梯度洗脱；反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(I-2)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，L2与Rj可能以多种形式共价连接。在一些实施方式中，式(I-2a)化合物中具有L3链段和R4基团，式(I-3a)化合物中具有R5基团，所述R4基团能够与所述R5基团经反应形成共价键连接，从而通过该共价键连接和L3链段共同形成连接基团L2，此时，式(I-4)化合物可通过以下制备方法得到：
在有机溶剂中，在缩合反应条件和缩合剂存在下，使式(I-3a)化合物与式(I-2a)化合物经缩合反应共价连接，分离；随后在脱保护反应条件下，脱除氨基保护基团Rk，分离获得式(I-4)化合物。
其中，R7、Rj、Rk1基团的定义和选择范围如前所述。氨基保护基团Rk可以是如Boc保护基、Fmoc保护基等，在一些实施方式中为Boc保护基。由于反应的目的在于最终获得式(I-4)化合物，因此所述缩合反应条件和缩合剂可不受限制地根据例如所期望的反应产物和反应原料(特别是R4和R5的结构)确定。例如，在一些实施方式中，可通过成酰胺反应条件和成酰胺缩合剂，获得酰胺键连接的式(I-4)化合物。在一些实施方式中，R4与R5经酰化反应形成含有酰胺键的连接基团，这种情况下，R4为氨基、R5为羟基，此时，可通过例如在有机溶剂中，在酰化反应条件下，在有机碱存在下，将式(I-3a)化合物与酰化试剂进行接触，随后再加入式(I-2a)化合物，分离获得氨基被保护的式(I-4)化合物；随后在有机溶剂中、在脱保护反应条件下，脱除氨基保护基团Rk，分离获得式(I-4)化合物。
在一些实施方式中，所述酰化试剂为三光气(triphosgene，可市售获得)，此时，所述有机溶剂为环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述环氧类溶剂例如可以为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂例如可以为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂例如可以为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为四氢呋喃。相对于式(I-3a)所示化合物，有机溶剂用量为10-100L/mol，例如可以为15-80L/mol。所述酰化反应条件包括在氮气氛下、在冰浴中进行1-10h反应；所述有机碱为三乙胺、三丙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、吡啶、二甲氨基吡啶中的一种或多种，例如可以为三乙胺和二甲氨基吡啶的混合物(摩尔比10:1-50:1)；相对于式(I-3a)所示化合物，所述有机碱的总用量(摩尔比)为0.5:1-10:1，例如可以为1:1-5:1。所述酰化试剂与所述式(I-3a)所示化合物的摩尔比为0.5:1-2:1，例如可以为0.5:1-1:1。式(I-2a)化合物可由本领域技术人员通过已知的方法合成获得、或者通过市售获得。在一些实施方式中，式(I-2a)化合物可以是一个氨基被保护的二胺；在一些实施方式中，式(I-2a)化合物为可市售获得的N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺。所述式(I-2a)化合物与所述式(I-3a)化合物的摩尔比为2:1-10:1，例如可以为4:1-8:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离获得氨基被保护的式(I-4)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离氨基被保护的式(I-4)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用石油醚:二氯甲烷:乙酸乙酯＝4:4:1-1:1:1梯度洗脱；反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到氨基被被保护的式(I-4)化合物粗产品，该粗产品可以直接进行后续脱保护反应。
所述脱保护反应在有机溶剂中进行。所述有机溶剂可以选自环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述环氧类溶剂例如可以为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂例如可以为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂例如可以为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于所述氨基被保护的式(I-4)化合物而言，所述有机溶剂的用量可以为5L/mol-10L/mol。所述脱保护反应条件为在有机碱和脱保护反应剂存在下，在10-50℃、例如为15-30℃下反应5-24h。所述有机碱可以是例如三乙胺、三丙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、吡啶、二甲氨基吡啶中的一种或多种，例如可以为2,6-二甲基吡啶，所述有机碱与氨基被被保护的式(I-4)化合物的用量比(摩尔比)可以为5:1-15:1。所述脱保护反应剂可以是例如三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)，所述脱保护反应剂与氨基被被保护的式(I-4)化合物的用量比(摩尔比)可以为5:1-15:1，例如8:1-12:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离获得式(I-4)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(I-4)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:乙醇＝50:1-10:1梯度洗脱；反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(I-4)化合物粗产品，该粗产品可以直接进行后续反应。
在一些实施方式中，式(I-2a)化合物经一次反应直接连接至式(I-3a)化合物，形成式(I-4)化合物；在一些实施方式中，L3中包含多于一个酰胺键，因此可自式(I-3a)起始通过多次所述缩合反应连续形成链段L3，最终获得式(I-4)化合物。
根据期望产物中小分子药物基团Rj的结构，可容易地从包含Rj基团的小分子化合物出发，经由一步或多步脱保护和/或保护反应，获得具有合适反应位点的式(I-3a)化合物。例如，当小分子化合物使用恩替卡韦时，可通过TBS保护多余羟基、和/或以乙酰基保护氨基，从而在该小分子化合物中仅保留R5一处活性反应位点。在一些实施方式中，R5是羟基。在一些实施方式中，R5是氨基。
在一些实施方式中，包含Rj的小分子化合物是恩替卡韦(ETV)：
并且，R5是羟基时，所述式(I-3a)化合物具有式(SE-4)所示的结构：
此时，式(I-3a)化合物可通过以下制备方法得到：在有机溶剂中，在偶联反应条件下，在偶联剂和活化剂存在下，使经保护的ETV(在一些实施方式中，例如式(SE-2)所示化合物)与吡啶接触，随后在醇解反应条件下，在有机碱存在下，进一步与二醇接触，分离。
所述有机溶剂可以选自环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、吡啶中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为吡啶。相对于式(SE-2)化合物而言，所述有机溶剂的用量可以为1L/mol-10L/mol。所述偶联反应条件为在偶联剂和活化剂存在下，在冰浴中反应5-24h。所述偶联剂可以是例如三氮唑、苯并三唑、吡唑中的一种或多种，例如可以为1,2,3-三氮唑，所述偶联剂与式(SE-2)化合物的用量比(摩尔比)可以为5:1-15:1。所述活化剂可以是例如2-氯苯基二氯膦或者苯基二氯膦，所述活化剂与式(SE-2)化合物的用量比(摩尔比)可以为1:1-6:1，例如2:1-5:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离获得式(SE-4)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(SE-4)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1-0:1梯度洗脱；反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(I-4)化合物粗产品，该粗产品可以直接进行后续反应。
经保护的ETV可通过根据所期望的产物对ETV中的羟基和/或氨基分别进行保护而获得，所述保护可在有机溶剂中，在保护基反应条件下，与保护剂反应而进行。
在一些实施方式中，所述羟基保护反应的条件包括在保护气氛下，在有机溶剂中，在10-50℃下与羟基保护剂接触，反应进行10-48h，分离。其中，所述有机溶剂可以选自醚类溶剂、卤代烷类溶剂、吡啶中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为吡啶。所述有机溶剂的用量相对于ETV而言可以为2-20L/mol，例如3-10L/mol。所述羟基保护剂可以是例如叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)。所述羟基保护剂的用量相对于ETV而言可以为(摩尔比)2:1-5:1、例如2.5:1-4:1。在一些实施方式中，所述分离可以包括除去溶剂得到粗产品，该粗产品可以直接进行后续反应。所述保护气氛指惰性气体气氛，如氮气、氦气和/或或氩气。
在一些实施方式中，所述氨基保护反应的条件包括在有机溶剂中，在有机碱存在下，在0-80℃下与氨基保护剂接触，反应进行1-4h，分离。其中，所述有机溶剂可以选自醚类溶剂、卤代烷类溶剂、吡啶中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为吡啶。所述有机溶剂的用量相对于ETV而言可以为2-20L/mol，例如3-10L/mol。所述有机碱可以为例如4-二甲胺基吡啶(DMAP)。所述有机碱的用量相对于ETV而言可以为(摩尔比)0.1:1-1:1，例如0.3:1-0.7:1。所述氨基保护剂可以是例如醋酸酐(Ac2O)。所述氨基保护剂的用量相对于ETV而言可以为10:1-20:1，例如12:1-18:1。所述分离可由本领域技术人员通过任意合理的方式进行。在一些实施方式中，在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(I-4)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:乙酸乙酯＝5:1-0:1梯度洗脱；反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到氨基保护的ETV粗产品，该粗产品可以直接进行后续反应。
所述羟基保护反应与所述氨基保护反应可依次进行。在一些实施方式中，先进行所述羟基保护反应，随后将得到的粗产品用于进行氨基保护反应，分离得到经保护的ETV化合物。在一些实施方式中，得到的经保护的ETV化合物是式(SE-2)化合物。
小分子药物可由本领域技术人员通过已有文献报道的方法获得，或通过商购获得。例如，当所使用的小分子药物是恩替卡韦(ETV)时，可容易地通过各种途径商购获得。
连接至固相载体的缀合分子
在一个实施方式中，本公开提供了一种化合物及其制备方法，该化合物具有式(II)所示的结构(以下，也将该式(II)化合物称为本公开的连接至固相载体的缀合分子)：
其中，
R7、Rj、A0各自的定义和可选择的范围如前所述，
n代表0-7的整数；
SPS代表固相载体(Solid Phase Support)；
W0具有如式(A59)所示的结构：
其中，
表示基团共价键连接的位点；
E0独立地为O、S或BH；
B2独立地选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基中的一种。
式(II)化合物中的固相载体可以是本领域中公知的可用于核酸固相合成的固相载体，例如，式(II)化合物中的固相载体可以是以W0基团取代市售的通用固相载体(
HL UnyLinkerTM300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate LifeSciences公司，结构如式B80所示)中的DMTr而获得的固相载体部分：
其中，Resin表示树脂。
在一些实施方式中，SPS表示树脂。在一些实施方式中，SPS可以是羟基或氨基树脂、或者SPS进一步包含连接基团，此时W0可直接地、或通过该连接基团与树脂上的羟基或氨基形成共价键连接。
W0是式(I)化合物中的R8与固相载体上的羟基或其它式(I)化合物脱保护后产生的羟基反应形成亚磷酰胺连接，该亚磷酰胺连接再经过氧化、硫化或硼氢化反应后得到的连接基团。因此，B2的选择与式(I)中的对应基团相同，而E0则可以是O、S或BH。在后续反应中，B2基团可水解脱除形成羟基，随后与E0经构型互变形成磷酰氧基和式(A60)和式(A61)中的E1，对应的E1则分别为OH、SH或BH2。综合考虑成本与反应简便的需要，在一个实施方式中，B2为氰乙基，而E0是O。
根据本公开，n可以是0-7的整数，从而保证述缀合分子中基团S的个数至少为1；在一个实施方式中，n≥1，这样可以使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，M1配体的个数至少为2，从而使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进寡核苷酸缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于4个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一个实施方式中，n为1-4的整数。在一个实施方式中，n为1-2的整数。
参见后述，本公开的连接至固相载体的缀合分子可用于代替常规亚磷酰胺核酸固相合成方法所使用的固相载体作为起始，按照亚磷酰胺固相合成方法依次连接核苷单体，从而将本公开的缀合分子缀合至核苷酸序列。在连接结束后，可将缀合至核苷酸序列的缀合分子从固相载体上切割下来，并随后经分离纯化等步骤，并且根据目标功能性寡核苷酸的结构，进行可选的退火步骤，最终获得本公开的寡核苷酸缀合物。
在本公开的一些实施方式中，式(II)的连接至固相载体的缀合分子具有以下式(II-O-1)、(II-N-1)、(II-N-2)、(II-N-3)、(II-N-4)、(II-N-5)或(II-C-1)中的任意一者所表示的结构：
其中，R7、SPS、E0、B2具有如前所述的定义和可选择的范围。
式(II)表示的连接至固相载体的缀合分子的制备
本领域技术人员可使用任何合理的合成路线制备获得式(II)表示的连接至固相载体的缀合分子。例如，当式(II)化合物具有式(II-O-1)所示的结构时，在本公开的一些实施方式中，所述制备方法包括如下步骤(i)或步骤(i)和步骤(ii)：
(i)脱除带有经保护的羟基的固相载体上的保护基团，在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(SE)所示的化合物与该固相载体进行接触，随后，进行盖帽反应，再进行氧化、硫化或硼氢化反应。
(ii)按照步骤(i)的方法再进行2次与式(SE)化合物的接触，每次均是对前一步骤得到的产物进行脱保护，随后与式(SE)化合物相接触，进行盖帽反应，并进行氧化、硫化或硼氢化反应。
所使用的固相载体可使用如前所述的固相载体，例如市售的通用固相载体。
所述脱保护、偶联、盖帽、氧化、硫化或硼氢化反应可使用与常规亚磷酰胺固相核酸合成法中相同的条件与试剂，具体反应条件和试剂将在后文详细描述。
寡核苷酸缀合物
在一个实施方式中，本发明提供了一种寡核苷酸缀合物，其具有式(III)所示的结构：
其中，
A代表靶向基团；
Rj的定义和可选择的范围如前所述；
n代表0-7的整数；
R16和R15各自为H或具有式(A60)所示结构的基团，并且其中至少一个为具有式(A60)所示结构的基团；
W具有如式(A61)所示的结构：
E1为OH、SH或BH2，
Nu为功能性寡核苷酸，
Rj代表小分子药物基团；在一些实施方式中，所述小分子药物基团与Nu代表的功能性寡核苷酸用于治疗或预防相同或相关疾病或状况。在一些实施方式中，所述小分子药物基团与Nu代表的功能性寡核苷酸对相同或相关疾病或状况显示出治疗和/或预防活性，或者所述小分子药物基团增强所述功能性寡核苷酸的治疗和/或预防活性
在本公开的实施方式中，A是前述A0表示的靶向基团中的全部羟基保护基团发生脱保护、释放出活性羟基而形成的基团。因此，在一些实施方式中，A为由式M1-L-表示的靶向基团，其中，M1和L的定义和可选择的范围如前所述。
通过形成由式(A60)所示的的寡核苷酸缀合物，所述功能性寡核苷酸共价经由由Rj表示的小分子药物基团，连接至一个或多个对哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的M1配体，从而使得所述功能性寡核苷酸易于与小分子药物同时被富集至肝细胞表面，并进一步协同进入肝细胞，从而实现功能性寡核苷酸的特异性靶向递送，并预期当对小分子药物基团进行适当选择时，所述小分子药物和所述功能性寡核苷酸可显示出优异的协同效应。
在一些实施方案中，本发明的式(III)的寡核苷酸缀合物中，n为1-4的整数；在另一些实施方案中，n为2或3。
在本发明的具体实施方案中，式(III)的寡核苷酸缀合物具有以下式(III-O-1)、(III-N-1)、(III-N-2)、(III-N-3)、(III-N-4)、(III-N-5)或(III-C-1)中的任意一者所表示的结构
其中，Nu代表功能性寡核苷酸。在一些实施方式中，Nu代表对病毒基因表达具有抑制作用的功能性寡核苷酸。
在本发明的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物。更具体地，对于本公开而言，“缀合分子”可以是指由式(I)表示的化合物，相应地，“寡核苷酸缀合物”可以是指由式(III)表示的化合物。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指这样的寡核苷酸：所述寡核苷酸能够通过与靶序列之间产生稳定且特异性的杂交，利用RNA激活(RNA activation，RNAa)、RNA干扰(RNA interference，RNAi)、反义核酸技术、外显子跳跃(exon skipping)技术等原理，上调或下调靶基因的表达，或导致mRNA可变剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸还可以是与靶蛋白之间产生稳定且特异性地结合的核酸结构。此外，本领域技术人员容易理解的是，多核苷酸(例如mRNA本身或其片段)也同样适用于与本公开提供的缀合分子缀合形成缀合物以实现靶向递送，比如肝靶向递送，从而调节mRNA转录出的蛋白质的表达。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵盖mRNA或其片段。
在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸能够与靶序列发生相互作用，从而影响靶序列分子的正常功能，如导致发生mRNA断裂或翻译阻遏或外显子跳跃引发mRNA可变剪接等。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以大体上与靶序列的碱基互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以与靶序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的碱基互补，或者与靶序列完全互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1个、2个或3个不与靶序列互补的碱基。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以是单链的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合体(chimera)，或者是双链的DNA、RNA或DNA-RNA杂交体(hybrids)。
由此，在一些实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、核酸适配体(Nucleic Acid Aptamer)、小激活RNA(small activating RNA，saRNA)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。WO2015/006740A2公开了一种不同配体缀合到寡核苷酸的缀合物，其中配体通过接头(linker)与寡核苷酸进行连接，所述寡核苷酸选自小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、适配体(aptamer)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。这些缀合物在寡核苷酸的体内递送上表现出好的稳定性。在进一步的实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公开的寡核苷酸，以引用的方式将其整体内容并入本文。
在本公开的上下文中，当提及小分子药物和相应的小分子药物基团Rj时，应当理解的是，在一些实施方式中，包含于本公开的寡核苷酸缀合物的小分子药物基团可以不在体内解离出相应的小分子药物。此时，所述小分子药物基团仅用于起到连接基团的作用，即将寡核苷酸以适当的空间和化学方式连接至靶向基团。在一些实施方式中，包含于本公开的寡核苷酸缀合物的小分子药物基团具有对目标组织和/或细胞的靶向作用。在这些情况下，所述小分子药物基团与所连接的靶向基团协同地将所缀合的寡核苷酸递送至目标组织或细胞。在上述不解离出相应小分子药物的情况下，所述小分子药物与所递送的寡核苷酸的治疗目的可以彼此独立地相同或不同。在一些实施方式中，考虑到不希望引进与治疗的疾病无关的药物成分，或者，本发明提供的缀合物在体内解离出寡核苷酸药物的同时，小分子药物也解离出来，此时小分子药物与所递送的寡核苷酸可能协同起效，因此，在一些实施方式中，所选择的小分子药物与所递送的寡核苷酸针对相同的目标疾病或生理异常现象。例如，当所递送的寡核苷酸针对的是乙型肝炎病毒(HBV)基因和/或其表达产物时，所选择的小分子药物基团可以是具有病毒抑制效果或者抑制HBV疾病症状的小分子药物形成的小分子药物基团。在一些实施方式中，所递送的寡核苷酸是针对HBV基因表达的mRNA的寡核苷酸药物，例如siRNA，Rj是恩替卡韦基团或其类似物。在一些实施方式中，所选择的小分子药物可增强或加速所递送的寡核苷酸的基因表达调节作用。
本公开的寡核苷酸缀合物可通过提高活性剂比如功能性寡核苷酸的肝靶向递送效率，来调节特定细胞如肝细胞中特定基因的异常表达，从而增强功能性寡核苷酸和细胞中靶向序列之间的相互作用。在一些实施方式中，所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在肝细胞中异常表达的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、、FXII、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述在肝细胞异常表达的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本公开的上下文中，HBV基因是指具有如Genbank注册号NC_003977.1所示序列的基因；ANGPTL3基因是指具有如Genbank注册号NM_014495.3所示mRNA序列的基因；APOC3基因是指具有如Genbank注册号NM_000040.1所示mRNA序列的基因。
在一些实施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本公开的上下文中，“靶mRNA”是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA，它既可以是过量表达的基因对应的mRNA，或者是表达不足的基因对应的mRNA。由于大部分疾病源于mRNA的过量表达，因此，在本公开中，靶mRNA尤其指过量表达的基因对应的mRNA。在本公开的一些实施方式中，相应于上述异常表达的基因，所述靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FXII、p53、HBV、HCV等基因对应的mRNA。在一些实施方式中，所述靶mRNA可以是由对应HBV基因转录而得的mRNA、或者ANGPTL3基因所对应的mRNA、或者APOC3基因所对应的mRNA。
式(III)中具有式(A60)的结构中的P原子(以下，也简称为式(III)中的P原子)可以连接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以连接到寡核苷酸的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，所述连接包括但不仅限于所述P原子通过形成磷酸酯键而连接至所述核苷酸。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是单链寡核苷酸(例如，单链RNA或者适配体)，此时，式(III)中的P原子可以连接到所述单链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式(III)中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的末端。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是双链寡核苷酸(例如，siRNA、microRNA或者DNA)，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链。在一些实施方式中，所述式(III)中的P原子连接到所述双链寡核苷酸中正义链或反义链的端部，所述端部指所述正义链或所述反义链中从一端起算的前4个核苷酸，在一些实施方式中，式(III)中的P原子连接到所述正义链或所述反义链的任意末端；在一些实施方式中，式(III)中的P原子连接到所述正义链的3'末端。在式(III)中的P原子连接至双链寡核苷酸的正义链的上述位置的情况下，本公开提供的寡核苷酸缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的双链寡核苷酸反义链，以阻断靶mRNA翻译蛋白质的过程，抑制特定基因的表达。
式(III)中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式(III)中的P原子可通过形成磷酸二酯键而连接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些具体实施方式中，式(III)中的P原子连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，可将该P原子及相应的磷酸酯基团视为归属于双链寡核苷酸中的P原子和磷酸酯基团)，或者式(III)中的P原子通过取代双链寡核苷酸序列中正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式(III)中的P原子通过取代双链寡核苷酸序列中正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
在不愿受到限制的情况下，在下面的实施方式和实施例中，详细描述了本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸为小干扰RNA(siRNA)的情况。此时，本公开的寡核苷酸缀合物为siRNA缀合物。在本文的上下文中，为了描述方便，也将这些实施方式中的siRNA缀合物称为本公开的siRNA缀合物。这并不代表本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸仅可以是siRNA，相反，所述寡核苷酸可能是本公开的或者本领域技术人员所熟知的其它替代药物。根据siRNA缀合物的详细说明，可以设想其它功能性寡核苷酸与本公开提供的缀合分子缀合时也会有类似的作用。
本领域技术人员公知，siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常具有活性的，即功能性siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方式中约为15-30个核苷酸，所述siRNA中的每个核苷酸可以独立地是修饰或未修饰的核苷酸，为了增加稳定性，所述siRNA中至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
本公开的发明人发现，下面的实施方式中所述的siRNA具有较高的活性和/或稳定性，因而可以作为本公开中siRNA的发明目的。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的siRNA(以下，也称为本公开的siRNA)中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成互补双链区，所述核苷酸序列2的至少一部分与第一段核苷酸序列互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是指在3mg/kg的浓度下，能够抑制至少50％乙型肝炎病毒基因表达、至少50％血管生成素样蛋白3基因表达或者至少50％载脂蛋白C3基因表达的siRNA。在一些实施方式中，本公开的siRNA在浓度为3mg/kg时，能够抑制至少55％、60％、65％、70％、75％或80％HBV基因表达。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列。在不愿受到限制的情况下，这些特定的核苷酸差异并不会显著降低siRNA缀合物的靶基因抑制能力，而这些包含特定核苷酸差异的siRNA缀合物也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，该第二段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。因此，所述正义链和反义链的长度可以是19-23个核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；在一些实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为1或2个核苷酸。这样，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、或者和所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一个实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的肝细胞mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA不含修饰的核苷酸基团；在一些实施方式中，本公开的siRNA含有修饰的核苷酸基团。
目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括骨架修饰(也称为核苷酸间连接修饰，如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基被修饰，比如2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。
在本公开的一些实施方式中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基(或修饰的磷酸酯基和/或修饰的核糖基)。本公开的一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的结构。
非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(208)所示。2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(209)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(210)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(211)所示。
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶的基团。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物可以为如异核苷酸、桥联核酸(bridged nucleic acid，简称BNA)核苷酸或无环核苷酸。
BNA核苷酸是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖环的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(212)所示，ENA如式(213)所示，cET BNA如式(214)所示。
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)核苷酸或甘油核酸(GNA)核苷酸，其中，UNA如式(215)所示，GNA如式(216)所示。
其中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(217)或(218)所示。
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代而形成的具有如式(207)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成如式(208)所示的结构。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：或者按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：可选地，正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5′末端到3′末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，按照5′末端到3′末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在本公开所述siRNA的一些具体实施方式中，所述核苷酸含有磷酸基团修饰。在本公开的上下文中，磷酸基团修饰在一个实施方式中为如下式(201)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)修饰，即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。在一些实施方式中，该修饰能稳定siRNA的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
根据本公开的一些实施方式，所述siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置的组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5′末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3′末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5′末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的5′末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3′末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3′末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5′末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5′末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的3′末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；以及
所述反义链的3′末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。
按照本公开的一些实施方式，所述siRNA分子的反义链序列5′末端核苷酸为5′-磷酸核苷酸或5′-磷酸类似物修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，5′-磷酸核苷酸可具有式(202)所示结构：
同时，常用的所述5′-磷酸类似物修饰的核苷酸的种类是本领域技术人员公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts，The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology，2017，35(3)：238-48中公开的如下如式(203)-(206)所示的4种核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；
Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一些实施方式中，5′-磷酸核苷酸或5′-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(203)所示的含有乙烯基磷酸酯(E-vinylphosphonate，E-VP)的核苷酸、式(202)所示的含有5′-磷酸的核苷酸或式(205)所示的含有5′-硫代磷酸修饰的核苷酸。
本公开的发明人意外发现，本公开所述siRNA缀合物在具有显著提高的血清稳定性的同时，还表现出并未明显降低的靶mRNA沉默活性以及优异的基因表达抑制效果。从而显示出，本公开的siRNA缀合物具有较高的体内递送效率。按照本公开的一些实施方式，本公开的寡核苷酸缀合物为包含以下siRNA的siRNA缀合物，所述siRNA例如为表1A-1F中示出的siRNA：
表1一些实施方式中的siRNA序列
表1A
表1B
表1C
表1D
表1E
表1F
*S：正义链；AS：反义链
注：表中的全部序列均为序列表中所对应的核苷酸序列的未经修饰或经修饰的形式。
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸修饰的核苷酸(以下实施例中以P表示)或硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
式(III)寡核苷酸缀合物的制备
可以采用任意合理的合成路线来制备本公开的寡核苷酸缀合物。
例如，本公开的寡核苷酸缀合物的制备方法可以包括：在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照所述功能性寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；并且，所述方法还包含以下步骤(a)或(b)：
(a)以式(II)化合物表示的连接至固相载体的缀合分子起始，进行前述核苷单体的连接；或者，
(b)在通过前述核苷单体的连接形成连接在固相载体上的核苷酸序列后，在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(I)所示的化合物与该连接在固相载体上的核苷酸序列接触，并进行盖帽反应，再进行氧化、硫化或硼氢化反应；随后，再进行n次(n的定义与式(III)中相同)与式(I)化合物的接触，每次均是对前一步骤得到的产物进行脱保护，随后与式(I)化合物相接触，进行盖帽反应，并进行氧化、硫化或硼氢化反应。
在一些实施方式中，该方法还包含脱除保护基并与固相载体切割的步骤、分离纯化步骤。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(II)所示的化合物与正义链或反义链的3'端的第一个核苷单体接触，使式(II)所示的化合物连接上序列中第一个核苷酸，在亚磷酰胺固相合成的条件下，按照期望的正义链或反义链核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成寡核苷酸的正义链或反义链；其中，与第一个核苷单体连接前，式(II)化合物经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接有缀合分子的核酸的正义链或反义链；在亚磷酰胺固相合成的条件下，按照反义链或正义链核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成核酸的反义链或正义链；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得核酸的正义链和反义链，退火。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：按照该双链寡核苷酸中正义链或反义链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成正义链和反义链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链；脱除连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链上末端核苷的羟基保护基团，在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(I)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，从而将式(I)化合物连接至正义链或反义链；脱除保护基并与固相载体切割，分别分离纯化，获得寡核苷酸的反义链或正义链，退火，其中，所述寡核苷酸的正义链或反义链上连接有缀合分子。
在一个具体实施方式中，式A59中的P原子连接至siRNA中的正义链的3'末端，本公开的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)脱除式(II)化合物(以下，也称为连接固相载体的缀合分子)中的羟基保护基团R7；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将该连接固相载体的缀合分子与核苷单体接触，得到通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以所述通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得本公开的siRNA缀合物。
其中，在步骤(1)中，脱除该连接固相载体的缀合分子中的保护基团-R7的方法包括在脱保护条件下，将式(II)化合物与脱保护试剂接触。脱保护条件包括温度为0-50℃，在一个实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一个实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一个实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与式(II)化合物的摩尔比为2:1-100:1，在一个实施方式中为3:1-50:1。
所述偶联反应条件和偶联试剂可使用任何能够实现上述偶联反应的条件和试剂。出于简化工艺的考虑，可在一些实施方式中使用与所采用的固相合成方法中的偶联反应相同的条件与试剂。
一般来说，所述偶联反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一个实施方式中为15-35℃。式(II)化合物与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一个实施方式中为1:5-1:15；式(II)化合物和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，在一个实施方式中为1:50-1:80，反应时间为200-3000秒，在一个实施方式中为500-1500秒。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，在一个实施方式中为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，在一个实施方式中为无水乙腈。相对于式(II)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一个实施方式中为5-20L/mol。
在步骤(2)中，通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用上述步骤制备的通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向合成siRNA缀合物的正义链S。此时，缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端。
步骤(2)和(3)中所述固相合成的其它条件，包括核苷单体脱保护条件，脱保护试剂种类和用量，偶联反应条件，偶联试剂的种类和用量，盖帽反应的条件，盖帽试剂的种类和用量，氧化反应条件，氧化试剂种类和用量，硫化反应条件，硫化试剂和用量采用本领域中常规使用的各种试剂、用量和条件。
本领域技术人员容易理解的是，由于与亚磷酰胺固相合成方法中所使用的核苷单体类似地，由式(I)表示的缀合分子单体化合物同样具有亚磷酰胺基团和羟基保护基团，因此可将式(I)化合物视为一个核苷单体，应用本领域公知的亚磷酰胺固相合成方法，通过脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化反应，将其连接至固定相，并可随后继续连接另一式(I)化合物或者另一核苷单体，直至获得目标产物的核苷酸序列。相应地，以下涉及缀合分子的反应的描述中，当提及“脱保护”、“偶联”、“盖帽”、“氧化”、“硫化”等反应时，应当理解为本领域公知的亚磷酰胺核酸固相合成方法中所涉及的反应条件和试剂也同样适用于这些反应。示例性的反应条件和试剂如下所述。
上述方法中，固相载体可以是本领域中公知的可用于核酸固相合成的固相载体，例如，可以是市售的通用固相载体(
HL UnyLinkerTM 300 OligonucleotideSynthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，结构如式B80所示)：
在一个实施方式中，上述方法中所述固相合成可使用如下条件：
脱保护条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃；反应时间为30-300秒，例如为50-150秒。脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中，脱保护试剂为二氯乙酸。脱保护试剂与固定相上的4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基(DMTr)的的摩尔比为2:1-100:1，例如为3:1-50:1。通过进行所述脱保护，在所述固相载体表面上、连接在固相载体上的缀合分子上或通过缀合分子与固相载体连接的核酸序列的末端核苷上获得具有反应活性的游离羟基，从而便于进行下一步的偶联反应。
偶联反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，固相载体上连接的核酸序列(在固相合成初期，列入计算的是上述脱保护步骤中形成的具有反应活性的游离羟基)与核苷单体(在连接缀合分子单体的情况下，为式(I)化合物)的摩尔比为1:1-1:50，例如为1:5-1:15；固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，例如为1:50-1:80；反应时间为200-3000秒，例如为500-1500秒。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，例如为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，例如为无水乙腈。相对于式(I)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，例如可以为5-20L/mol。通过进行该偶联反应，脱保护反应中形成的游离羟基与核苷单体或式(I)化合物上的亚磷酰胺基团反应形成亚磷酸酯连接。
盖帽反应的作用在于，通过过量盖帽试剂将前述偶联反应中尚未反应完全的活性反应官能团钝化，以避免在后续反应中产生不必要的副产物。盖帽反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，反应时间为5-500秒，例如为10-100秒，所述盖帽反应在盖帽试剂存在下进行。盖帽试剂可以使用siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂，siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，所述盖帽试剂例如可以为盖帽试剂A(capA)和盖帽试剂B(capB)，其中，盖帽试剂A为N-基甲基咪唑，在一些实施方式中，N-基甲基咪唑以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶与乙腈的体积比为1:10-1:1，例如为1:3-1:1，吡啶与乙腈的总体积与N-甲基咪唑的体积为1:1-10:1，例如为3:1-7:1。所述盖帽试剂B为乙酸酐，在一些实施方式中，乙酸酐以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的体积为1:1-1:10，例如为1:2-1:6。在所述步骤(i)和(ii)中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的体积与式(II)化合物的质量之比为5ml/g-50ml/g，例如为15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的体积与式(II)化合物的质量之比为0.5ml/g-10ml/g，例如为1ml/g-5ml/g。在一个实施方式中，盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑。在所述步骤(2)和(3)中，盖帽试剂的总量与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:100-100:1，例如为1:10-10:1。在盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑的情况下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:10-10:10:1，例如为1:1:2-2:2:1。
当序列中目标位置处的相邻核苷之间为磷酸酯键连接时，经偶联反应，连接上较后一个核苷单体之后，在氧化反应条件、氧化试剂存在下进行氧化反应。氧化反应条件包括温度为0-50℃，例如可以为15-35℃，反应时间为1-100秒，例如可以为5-50秒，氧化试剂例如可以为碘(在一些实施方式中，以碘水的形式提供)。氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1-100:1，例如可以为5:1-50:1。在一些具体的实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。
当序列中目标位置处的相邻核苷之间为硫代磷酸酯键连接时，经偶联反应，连接上较后一个核苷单体之后，在硫化反应条件、硫化试剂存在下进行硫化反应。硫化反应条件包括温度为0-50℃，例如可以为15-35℃，反应时间为50-2000秒，例如可以为100-1000秒，硫化试剂例如可以为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为10:1–1000:1，例如可以为10:1-500:1。在一些具体的实施方式中，所述硫化反应在乙腈:吡啶＝1:3-3:1的混合溶剂中进行。通过所述氧化/硫化反应，将前述获得的亚磷酸酯连接氧化为稳定的磷酸酯或硫代磷酸酯连接，完成本次亚磷酰胺固相合成循环。
按照本公开提供的方法，在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，并脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团可按照siRNA合成中常规的切割和脱保护方法进行。例如，将得到的连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触；在脱保护的过程中，A46-A54基团中的保护基团被脱除，A0转化为A，同时连接缀合分子的核苷酸序列从固相载体上切割下来。其中，所述浓氨水是指25-30重量％的氨水，浓氨水的用量与目标siRNA序列相比为0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2'-TBDMS保护时，所述方法还包括将已脱除固相载体的核苷酸序列与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除该2'-TBDMS保护。此时，所得到的目标siRNA序列中具有游离的2'-羟基的相应核苷。三乙胺三氢氟酸盐纯品的用量与目标siRNA序列相比为0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。
在合成过程中，可随时对核酸序列的纯度和分子量进行检测，从而更好地把控合成质量，检测的方法为本领域技术人员所公知。例如，可通过离子交换色谱检测核酸纯度，并通过液质联用色谱测定分子量。
退火的方法也是本领域技术人员熟知的。例如，可将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
在获得本公开的缀合物后，在一些实施方式中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的寡核苷酸缀合物进行表征，确定所合成的缀合物为目标设计的缀合物，且所合成的寡核苷酸的序列与欲合成的寡核苷酸的序列相符，例如与上述表1中所列的序列相符。
在一些实施方式中，可按照以下方法制备式(III-O-1)连接至固相载体的缀合分子。
例如，在本发明的一些实施方案中，所述制备方法按照常规的亚磷酰胺固相核酸合成法完成。制备方法通常包括以上述连接到固相载体的缀合分子(II)为起始物，按照固相亚磷酰胺固相核酸合成法依次按照所述功能性寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，从3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。
所述脱保护、偶联、盖帽、氧化、硫化或硼氢化反应可使用亚磷酰胺固相核酸合成法中相同的条件与试剂。
在一些实施方式中，该方法还包含脱除保护基并且与固相载体切割的步骤、分离纯化步骤。
本公开的缀合物的应用
如本公开所示，所述缀合物可向细胞递送某种活性剂，用于治疗或预防可能需要这种递送的疾病或状况。在不愿受任何理论束缚的情况下，我们认为缀合分子的空间排列在靶向细胞表面受体方面特别有效，从而使负载的活性剂与细胞接触。在一些实施方式中，这种缀合物是针对肝细胞的寡核苷酸缀合物。
本发明的寡核苷酸缀合物具有优异的肝靶向特异性，因此能够高效地将所缀合的功能性寡核苷酸和小分子药物同时递送至肝部，从而有效地对肝细胞内基因表达进行调控，并预期能够获得与小分子药物有关的协同效果。
本发明的寡核苷酸缀合物适用于制备预防和/或治疗由肝细胞中基因的表达引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
本发明的寡核苷酸缀合物适用于预防和/或治疗由肝细胞中基因的表达引起的病理状况或疾病的用途。
所述基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在一些实施方式中，所述基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。相应地，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
以下实施例仅示例性地说明本发明，并非限制性。
实施例
在以下实施例中所用的无水有机溶剂，例如无水二氯甲烷、无水二氧六环、无水吡啶、无水四氢呋喃，购自sigma-aldrich或将分析纯溶剂经4A分子筛浸泡过夜后使用。
一、制备实施例
制备例1：式(SE)化合物(缀合分子1)的制备
1.1合成SE-1
在氮气氛围中加入恩替卡韦(ETV，购自济南键峰化工,20g,72.1mmol,1.0eq)、叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl，购自安耐吉，33g,218.8mmol，3eq)、无水吡啶(400mL)，在室温下搅拌反应混合物24h。在不高于45℃下，减压蒸馏除去吡啶后，加入饱和氯化铵溶液，用二氯甲烷萃取2次。将有机相合并，经无水硫酸钠干燥，抽滤，母液浓缩后，浓缩物经柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱梯度为石油醚：乙酸乙酯＝5:1～1:1)纯化，得到目标分子SE-1为31g，收率86％。
MS m/z：C24H43N5O3Si2，[M+H]+，理论值：506.29，实测值：506.71。
1.2合成SE-2
将SE-1(20g,39.6mmol,1eq)溶于无水吡啶(购自国药，4A分子筛干燥过夜，200ml)。在冰水浴下，逐滴加入4-二甲胺基吡啶(DMAP，购自阿拉丁，2.4g,20mmol,0.5eq)和醋酸酐混合溶液(购自江苏强盛，56ml,600mmol,15eq)。滴加完毕，在室温下将反应混合物搅拌，继续反应1h，然后升温至70℃继续反应2h。减压蒸馏除去易挥发溶剂，加入二氯甲烷，用饱和氯化铵洗涤2～3次。将有机相用无水硫酸钠干燥后，抽滤，滤液浓缩后，浓缩物经柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱梯度：二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1～纯乙酸乙酯)纯化，得到目标分子SE-2为12g，收率55％。
MS m/z：C26H45N5O4Si2，[M+H]+，理论值：548.3，实测值：548.28。
1.3合成SE-3
将三氮唑(购自安耐吉，3.85g，55.7mmol,6eq)溶于无水吡啶(70ml)中。氮气保护下，冰浴中加入2-氯苯基二氯膦(购自Alfa Aesar，4.6ml,27.9mmol，3eq)的吡啶溶液(10mL)，加毕，继续在冰浴下加入SE-2(4.62g，9.3mmol,1eq)的吡啶(30ml)溶液。将反应混合物升到室温，并且搅拌反应18h。将反应混合物浓缩，油泵继续抽干30min，得到含中间体SE-3的溶液混合物。将其溶于无水二氧六环(购自江苏强盛，4A分子筛干燥过夜，200ml)，即刻进行下一步反应。
1.4合成SE-4
氮气保护下，向乙二醇(购自阿拉丁，400ml)中加入三乙胺(购自国药，40ml,28.5mmol,15eq)，加毕，继续加入上步反应得到的SE-3的二氧六环溶液。加毕，室温反应18h。反应结束后，将反应混合物倒入500ml二氯甲烷中，水洗2次，饱和食盐水洗1次。将有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩。将浓缩物经柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱梯度为二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1～纯乙酸乙酯)纯化，得到目标分子SE-4为3.8g，收率69.0％。MS m/z：C28H49N5O5Si2[M+H]+，理论值：592.33，实测值：592.72。
1.5合成SE-5
在氮气氛围中，向100ml的两口烧瓶中，依次加入SE-4(4.5g，7.6mmol,1eq，由两批次产物合并获得)、4-二甲氨基吡啶(135mg,0.72mmol,0.1eq)、三乙胺(2.31g,23.4mmol,3eq)、无水四氢呋喃(购自安耐吉，4A分子筛干燥，450ml)，搅拌溶解。然后，冰浴下，向上述反应混合物中滴加三光气(购自麦克林，450mg，4.59mmol,0.6eq)的四氢呋喃(18ml)溶液。加毕，冰浴下继续搅拌反应1.5h，随后升至室温，继续搅拌15min(溶液由紫红色变为粉红色)。接着滴加N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺(购自麦克林，8.0g,41.4mmol,6eq)的四氢呋喃(45mL)溶液(溶液由粉红色变为橙粉色)，继续反应过夜。停止反应，将反应混合物水洗2～3次，分出有机层，经无水硫酸钠干燥，抽滤，母液浓缩后，柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱梯度石油醚:二氯甲烷:乙酸乙酯＝4:4:1～1:1:1)纯化，得到目标分子SE-5为2.4g，收率53％。
MS m/z：C37H65N7O8Si2，[M+H]+，理论值：792.44，实测值：792.23。
1.6合成SE-6
在250ml烧瓶中，室温下将SE-5(2.4g，3.0mmol,1eq)溶于无水二氯甲烷(15ml)。加入已配制好的包含2,6-二甲基吡啶(购自麦克林，3.5ml，10eq)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，购自麦克林，6.3ml，10eq)的二氯甲烷(10ml)溶液。室温下将反应混合物搅拌过夜。结束反应，减压蒸馏除去溶剂，并将浓缩物溶于二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠洗涤1次。有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩，经柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱梯度：二氯甲烷:甲醇＝50:1～10:1)纯化，目标产品SE-6为2.2g，收率63％。
MS m/z：C32H57N7O6Si2，[M+H]+，理论值：692.39，实测值：692.65。
1.7合成SE-7
加入SE-6(2.0g,2.89mmol,1.0eq)、GAL-5(参照US 8,106,022B2实施例1中所公开的方法，委托天津钧尧公司定制合成，1.29g,2.89mmol,1.0eq)、1-羟基苯并三唑(HOBt，购自麦克林，195mg,1.45mmol,0.5eq)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，购自麦克林，664mg,3.47mmol,1.5eq)以及无水二氯甲烷(30ml)。在室温下将反应混合物搅拌过夜。通过薄层色谱法(TLC)(二氯甲烷:甲醇＝15：1)监测反应进程。在反应结束后，将反应混合物水洗(30ml)1次，分出有机层，水层继续用二氯甲烷(30ml)萃取2次，合并有机层。将有机层用饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩。浓缩物经柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱剂:二氯甲烷:甲醇＝100:1～20:1)纯化，得淡黄色粉末SE-7为2.6g,产率81％。
MS m/z：C51H84N8O16Si2，[M+H]+，理论值：1121.55，实测值：1121.69
1.8合成SE-8
在室温下，将SE-7(2.6g,2.3mmol,1.0eq)溶于无水四氢呋喃(15ml)中，加入四丁基氟化铵(TBAF，购自安耐吉，5.8ml,5.8mmol,2.5eq，1.0M的四氢呋喃溶液)。室温下搅拌溶解，TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1以及LC-MS)监测反应进程。反应完全后，加入水(20ml)淬灭反应，分出有机层，水层继续用二氯甲烷(20ml)萃取2次，合并有机层。将有机层用饱和食盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱剂:二氯甲烷:甲醇＝100:1～20:1)纯化，得到白色固体SE-8为1.2g，产率60％。
MS m/z：C39H56N8O16，[M+H]+，理论值：893.38，实测值：893.66
1.9合成SE-9
加入SE-8(1.2g,1.0mmol,1.0eq)、4,4-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl,购自麦克林，339mg,0.9mmol,0.9eq)、无水吡啶(10ml)。氮气保护下，室温反应18h,浓缩反应混合物。将所得的粗品溶于二氯甲烷(30ml)中，加入饱和碳酸氢钠(30ml)洗涤，分出有机层，水层继续用二氯甲烷(30ml)萃取2次，合并有机层。将有机层用饱和食盐水洗涤，将无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩，柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱剂:二氯甲烷:甲醇＝100:1～30:1，所有流动相包含1％N,N-二异丙基乙胺)纯化，得到白色固体SE-9为830mg,产率56％。
MS m/z：C60H74N8O18，[M+H]+，理论值：1195.51，实测值：1194.88。
1.10合成SE
氮气保护下，加入SE-9(0.83g,0.69mmol,1.0eq),双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(购自Sigma-Aldrich，623mg,2.07mmol,3.0eq)和乙腈(15ml)，搅拌溶解。将四氮唑(购自麦克林，72mg,1.03mmol,1.5eq)，N,N-二异丙基乙胺(购自阿拉丁，267mg,2.07mmol,3.0eq)以及无水CH3CN(5mL)震荡溶解,完全溶解后将其加入到反应体系中。室温下反应3h,TLC(二氯甲烷:甲醇＝12：1,用磷钼酸显色)监测反应进程。反应完全后，将反应混合物浓缩，并加入二氯甲烷,用饱和碳酸氢钠萃取，分出有机层。有机层经无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得粗品。粗品通过柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱剂:纯二氯甲烷～二氯甲烷:甲醇＝100:1,所有流动相包含1％N,N-二异丙基乙胺)纯化，得白色固体SE为650mg，产率：67.7％。
31P NMR(150MHz，CDCl3)δ147.79,147.41；
MS m/z：C69H91N10O19P，[M+H]+，理论值：1395.62，实测值：1394.85。
制备例2：SE-SPS化合物(连接固相载体的缀合分子1，式(II-O-1)化合物)的制备
由通用固相载体(
HL UnyLinkerTM 300 Oligonucleotide SynthesisSupport，Kinovate Life Sciences公司，载量300μmol/g)起始，脱除固相载体上的保护基团，在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将SE化合物(即，制备例1中实施例1.10)与该固相载体进行接触，随后，进行盖帽反应，再进行氧化反应。然后，将所得的产物进行脱DMTr保护，随后与SE化合物再进行接触一次，接着进行盖帽反应，并进行氧化反应，得到两个SE缀合分子依次连接至固相载体的化合物。然后，将所得产物再次进行脱DMTr保护，随后与SE化合物再进行接触一次，接着进行盖帽反应，并进行氧化反应，得到三个SE缀合分子依次连接至固相载体的化合物。即，连接至固相载体的SE缀合分子，以下也称为SE-SPS化合物。该化合物具有式(II-O-1)所示的结构。
所述偶联、盖帽、氧化、脱保护条件与以下亚磷酰胺固相合成方法相同。
制备例3：SE-siRNA化合物(缀合物1)的制备
在本实施例中，siRNA缀合物(缀合物1)的siRNA为编号为siHB2M2SVP的序列：
正义链(S)：
5'-CmsCmsUmUmGfAmGfGfCfAmUmAmCmUmUmCmAmAmAm-3'
(SEQ ID NO:140)
反义链(AS)：
5'-VPUmsUfsUmGmAmAfGmUfAfUmGmCmCmUfCmAfAmGmGmsUmsUm-3'；
(SEQ ID NO:141)
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；VP表示该VP右侧的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
3.1合成正义链(S)
通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用制备例2获得的SE-SPS化合物起始循环，按照上述序列顺序以3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应。合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的CapA和CapB的混合溶液，CapA为20体积％N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；CapB为20体积％乙酸酐的乙腈溶液；盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
其中，乙烯基磷酸酯修饰的2'-甲氧基修饰尿嘧啶核苷单体(VP-Um)按照以下方法合成：
(3a-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
将2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷(2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol)、叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)、咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶于450ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应20h。蒸除DMF，用600ml二氯甲烷溶解后，加入300ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml，合并有机相。将所述合并的有机相用5％草酸洗涤至所分离的水相pH<5，蒸发有机相中的溶剂至干后获得VP-U-1粗品直接用于随后VP-U-2的合成。
将VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解后，冰浴下搅拌10分钟，再加入预先在4℃冰箱冷藏的450ml、2％对甲苯磺酸溶液(溶剂为体积比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶剂)，反应10分钟。再加入200ml饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，分离有机相和水相。向有机相中加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至有机相pH＝8，合并水相。将合并的水相用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，将萃取液与经前述洗涤的有机相合并。再将合并的有机相用200ml饱和食盐水洗涤一次，蒸发溶剂至干。残留物通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶柱，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱)，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.79(d,J＝4.7Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.94(t,J＝7.0Hz,1H),4.12(td,J＝4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J＝4.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理论：497.21，实测：497.45。
(3a-2)VP-U-4的合成：
将VP-U-2(19.84g，40.0mmol)、二环己基碳二亚胺(DCC，16.48g，80.0mmol)、吡啶(4.20g，53.2mmol)、三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶于200ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应20h。另外，将亚甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶于120ml THF，冰浴降温，在冰浴温度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴温度下反应10min，再升至室温反应0.5h，然后加入至前述反应液中，约1h加完，冰浴温度下再反应1h，然后升至室温反应18h。加水淬灭反应，水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合并有机相，用200ml饱和食盐水洗涤一次后，蒸发溶剂至干。残留物通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶柱，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:4梯度洗脱)，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-4共14.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.82–6.71(m,2H),5.90(ddd,J＝25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.36–4.21(m,3H),4.18(t,J＝4.9Hz,1H),4.05(ddq,J＝9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J＝4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J＝6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理论：629.24，实测：629.51。
(3a-3)VP-U-5的合成：
将VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶于100ml四氢呋喃，加入三乙胺三氢氟酸(17.96g，111.45mmol)，并且在室温下搅拌20h反应完全。直接蒸发溶剂至干，随后用二氯甲烷溶解再蒸干2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。粗品通过柱层析纯化(200-300目正相硅胶柱，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱)，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-5共6.70g。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),6.77(dd,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.99–5.82(m,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.1Hz,1H),5.10(dd,J＝5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J＝9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J＝6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12–3.98(m,3H),3.39(s,2H),1.32(td,J＝6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理论：391.13，实测：391.38。
(3a-4)VP-U-6的合成：
在氩气保护条件下向10ml无水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)、双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室温搅拌反应5小时。蒸除溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:乙腈(含0.5wt％三乙胺)＝3:1-1:3梯度洗脱)，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理论：591.23，实测：591.55。VP-U-6是目标产物VP-Um，作为核苷单体参与RNA链合成。
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，脱除核糖上的2'-TBDMS保护。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测，纯度为67％；采用液质联用(LC-MS)分析分子量，理论值8616.3，实测值8614.5。
从而，该步骤中将三个SE缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端，得到(SE)3缀合分子缀合在siRNA 3'末端的siRNA正义链。
3.2合成反义链(AS)
通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，其反义链使用商品化的通用固相载体(
HL UnyLinkerTM300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate LifeSciences公司，载量300μmol/g)作为起始物料。固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化反应条件，脱保护和切割，分离条件与合成正义链相同，得到反义链AS。
检测：纯度采用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测，其结果，纯度85％。分子量采用液质联用(LC-MS)进行分析。反义链：7037.1，实测值：7036.2。
3.3合成本发明寡核苷酸缀合物(siHB2M2SVP-SE)
将上述得到的正义链(S)与反义链(AS)以等摩尔比混合，溶于注射用水中并加热至50℃，室温冷却后，使它们通过氢键形成双链结构。即得到目标siHB2M2SVP-SE化合物(以下也称为缀合物1)。
二、应用实施例：本发明的寡核苷酸缀合物(siHB2M2SVP-SE)活性测试
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均按本领域技术人员熟知的方案进行。例如，可按MolecularCloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
应用实验例1:寡核苷酸缀合物在体内(in vivo)对HBV mRNA表达量的抑制效率
在本实施例中，对本发明的寡核苷酸缀合物(siHB2M2SVP-SE)以及阴性对照1×PBS(NS)在HBV转基因小鼠44BriHBV中对HBV X mRNA表达量的抑制效率进行了考察。
本实验例中所使用的HBV转基因小鼠44BriHBV购自北京大学医学部实验动物科学部,约8-12周，雄性。
首先，对于C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠，选择血清HbsAg含量COI>104的小鼠随机分组(均为雌性)，每组4只小鼠，对照组给予PBS溶液，分别以缀合物1以及对照组进行编号。所有动物根据体重计算药量，单次给药(采用皮下给药)，给药剂量分别为1mg/kg体重和0.1mg/kg体重，给药体积为5ml/kg体重。为获得不同剂量，缀合物以0.2mg/ml和0.02mg/ml溶于0.9％氯化钠水溶液。给药后第7天将动物处死，收集肝脏，用RNAlater(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见下表2。
表2检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组HBV基因的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算mRNA抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于以下表3中。
表3 siRNA缀合物在小鼠肝脏中HBV X mRNA表达的抑制
由表3的结果可以看出，应用实施例中本发明的寡核苷酸缀合物对于HBV X mRNA表达的抑制具有很高的抑制率；尤其是在较高浓度1mg/kg时，抑制活性更为显著。
本文已公开了示例实施方式，并且虽然采用特定术语，但是它们仅以一般和描述性含义使用和说明，并非出于限制的目的。在一些情况下，如本领域技术人员自提交本申请起显而易见的是，结合特定实施方式描述的特性、特征和/或元件可以单独地使用或与结合其他实施方式描述的特性、特征和/或元件的组合使用，除非另有明确指示。因此，本领域技术人员应理解，可在不偏离权利要求书中阐述的本发明的精神和范围下作出形式和细节的各种变化。
序列表
<120> 肝靶向化合物及寡核苷酸缀合物
<160> 141
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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uuugaaguau gccucaaggu u 21
Claims (27)
1.一种化合物，该化合物具有式(I)所示的结构：
其中，
R7代表羟基保护基团；
R8代表任何能与羟基反应形成亚磷酸酯基的基团；
Rj代表小分子药物基团；
A0表示全部活性羟基被保护的靶向基团。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，
Rj代表核苷类小分子药物基团；可选地，所述核苷类小分子药物选自于由以下化合物所组成的组：恩替卡韦、克拉夫定、替比夫定、利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、西多福韦、更昔洛韦、三氟胸苷、碘苷、阿糖腺苷、喷昔洛韦；可选地，Rj选自式(I-Rj-N)、(I-Rj-O)或(I-Rj-C)所示结构的任意一种：
A0为由式-L-S表示的全部活性羟基基团被保护的靶向基团，其中，
S代表对哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体M1，其中，所述配体M1中的活性羟基全部被羟基保护基团保护；可选地，所述被保护的羟基具有YCOO-的形式，其中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及C1-C6烷基苯基；
可选地，所述配体M1选自下述中的任意一种：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖；
L是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且，
其中，L任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，L代表选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合：
其中，j1为1-20的整数；
j2为1-20的整数；
R’为C1-C10烷基；
Ra选自式A27-A45基团中的一种：
Rb为C1-C10烷基；
可选地，L选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一种或多种的连接组合；可选地，L选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；可选地，L选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合；
可选地，L的长度为3-25个原子，所述L的长度是指与所述基团S连接的原子到与所述基团Rj连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；可选地，L的长度为4-15个原子。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中，j1为2-10的整数，j2为2-10的整数，R’为C1-C4烷基，Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，Rb为C1-C5烷基；
可选地，j1为3-5的整数，j2为3-5的整数，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种，Ra为A27或A28，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。
5.根据权利要求2所述的化合物，其中，每个S独立地选自于由式A46-A54基团所组成的组：
每个Y独立地选自以下组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤素取代的苯基和C1-C6烷基苯基；可选地，S为式A49或A50，Y为甲基。
6.根据权利要求1所述的化合物，该化合物具有以下(I-O-1)、(I-N-1)、(I-N-2)、(I-N-3)、(I-N-4)、(I-N-5)或(I-C-1)中的任意一者所表示的结构：
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中，R7选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基和4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基中的任意一种；和/或
R8为具有式(R8-1)所示结构的亚磷酰胺基团：
其中，B1选自取代或未取代的C1-C5烃基，可选地，B1为甲基、乙基或异丙基；B2选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基中的一种，可选地，B2为氰乙基；
可选地，所述R8具有式(C3)所示的结构：
8.一种化合物，该化合物具有式(II)所示的结构：
其中，
A0为全部活性羟基基团被保护的靶向基团；
Rj代表小分子药物基团；
R7代表羟基保护基团；
n代表选自0-7的整数；
SPS代表固相载体；
W0具有如式(A59)所示的结构：
其中，E0独立地为O、S或BH；
B2独立地选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基中的一种；
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，
A0为由式-L-S表示的全部活性羟基基团被保护的靶向基团，其中，S代表对哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体M1，其中，所述配体M1中的活性羟基全部被羟基保护基团取代；可选地，所述羟基保护基团具有YCOO-的形式，其中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；
可选地，所述配体M1选自下述中的任意一种：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖；
L是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；和/或L任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
n为1-4的整数，可选地为1-2的整数；
Rj代表核苷类小分子药物基团；可选地，所述核苷类小分子药物选自于由以下化合物所组成的组：恩替卡韦、克拉夫定、替比夫定、利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、西多福韦、更昔洛韦、三氟胸苷、碘苷、阿糖腺苷、喷昔洛韦；可选地，Rj选自式(I-Rj-N)、(I-Rj-O)或(I-Rj-C)所示结构的任意一种：
R7选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基和4,4’,4’-三甲氧基三苯甲基中的任意一种；
SPS表示树脂；
10.根据权利要求9所述的化合物，其中，L代表选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合：
其中，j1为1-20的整数；j2为1-20的整数；R’为C1-C10烷基；
Ra选自式A27-A45基团中的一种：
Rb为C1-C10烷基；
可选地，L选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一种或多种的连接组合；
可选地，L选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；
可选地，L选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合；
可选地，L的长度为3-25个原子，所述L的长度是指与所述基团S连接的原子到与所述基团Rj连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；
可选地，L的长度为4-15个原子。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中，j1为2-10的整数，j2为2-10的整数，R’为C1-C4烷基，Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，Rb为C1-C5烷基；
可选地，j1为3-5的整数，j2为3-5的整数，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种，Ra为A27或A28，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。
12.根据权利要求9所述的化合物，其中，每个S独立地选自式A46-A54基团中的一种：
每个Y独立地选自以下组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤素取代的苯基和C1-C6烷基苯基；可选地，S为式A49或A50，Y为甲基。
13.根据权利要求8所述的化合物，其中，该化合物具有以下式(II-O-1)、(II-N-1)、(II-N-2)、(II-N-3)、(II-N-4)、(II-N-5)或(II-C-1)中的任意一者所表示的结构：
其中，SPS表示固相载体，R7为羟基保护基团，选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基和4,4’,4’-三甲氧基三苯甲基中的一种；每个B2独立地选自C1-C5烷基、氰乙基、氰丙基和氰丁基，每个E0独立地为O、S或BH。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的化合物，其中B2为氰乙基且E0为O；和/或
R7选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基和4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基中的任意一种。
15.一种寡核苷酸缀合物，该缀合物具有式(III)所示的结构：
其中，
n代表选自0-7的整数；
R16和R15各自为H或具有式(A60)所示结构的基团，并且其中至少一个为具有式(A60)所示结构的基团；
W具有如式(A61)所示的结构：
其中，E1为OH、SH或BH2，
Nu为功能性寡核苷酸；
Rj代表小分子药物基团；
可选地，所述小分子药物基团与所述功能性寡核苷酸用于治疗或预防相同或相关疾病或状况；
A代表靶向基团。
16.根据权利要求15所述的寡核苷酸缀合物，其中，A为M1-L-表示的靶向基团，
其中，所述M1选自下述中的任意一种：D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖；
L是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且
L任选地具有选自于由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
可选地，L代表选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合：
其中，j1为1-20的整数；
j2为1-20的整数；
R’为C1-C10烷基；
Ra选自式A27-A45基团中的一种：
Rb为C1-C10烷基；
可选地，L选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一种或多种的连接组合；
可选地，L选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；
可选地，L选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合；
可选地，L的长度为3-25个原子，所述L的长度是指与基团M1连接的原子到与基团Rj连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；
可选地，L的长度为4-15个原子；
Rj代表核苷类小分子药物基团；可选地，Rj衍生自核苷类小分子药物，所述核苷类小分子药物选自于由以下化合物所组成的组：恩替卡韦、克拉夫定、替比夫定、利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、西多福韦、更昔洛韦、三氟胸苷、碘苷、阿糖腺苷、喷昔洛韦；可选地，Rj选自式(I-Rj-N)、(I-Rj-O)或(I-Rj-C)所示结构的任意一种：
17.根据权利要求16所述的寡核苷酸缀合物，其中，j1为2-10的整数，j2为2-10的整数，R’为C1-C4烷基，Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，Rb为C1-C5烷基；
可选地，j1为3-5的整数，j2为3-5的整数，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种，Ra为A27或A28，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种；
n为1-4的整数；可选地，n为2或3。
18.根据权利要求14所述的寡核苷酸缀合物，其具有以下所示结构中的任意一种：
其中，Nu代表功能性寡核苷酸；可选地，Nu表示对病毒基因表达具有抑制作用的功能性寡核苷酸。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中所述功能性寡核苷酸选自小干扰RNA、微小RNA、抗微小RNA、微小RNA拮抗剂、微小RNA模拟物、诱饵寡核苷酸、免疫刺激物、G-四极子、可变剪接体、单链RNA、反义核酸、核酸适配体、茎环RNA、mRNA片段、激活RNA或DNA中的一种；可选地，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸或者双链寡核苷酸；可选地，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸，式(A60)中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸；可选地，式(A60)中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的末端；可选地，式(A60)中的P原子连接到所述单链寡核苷酸的3'末端；
可选地，所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述式(A60)中的P原子连接到所述双链寡核苷酸的端部，所述双链寡核苷酸的端部指所述正义链或所述反义链中从一端起算的前4个核苷酸；可选地，式(A60)中的P原子连接到所述正义链或所述反义链的末端；可选地，式(A60)中的P原子连接到所述正义链的3'末端；可选地，式(A60)中的P原子通过形成磷酸二酯键连接至所述寡核苷酸缀合物中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。
20.根据权利要求19所述的缀合物，所述双链寡核苷酸为siRNA；
可选地，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列2与第一段核苷酸序列至少部分互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列，所述靶mRNA是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA；
可选地，所述靶mRNA选自以下基因对应的mRNA中的一种：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV；可选地，所述靶mRNA选自乙型肝炎病毒的mRNA、血管生成素样蛋白3基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3基因表达的mRNA；
可选地，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸长度相等且序列完全反向互补的核苷酸序列；
可选地，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异；
可选地，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异；
可选地，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸；
可选地，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补；
可选地，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，所述第二段核苷酸序列是指靶mRNA中和所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补；
可选地，所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；
可选地，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列或所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
可选地，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，所述非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物；
可选地，正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；
可选地，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；
可选地，所述核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种；所述核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种；
可选地，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸是指所述核苷酸中核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
22.根据权利要求21所述的缀合物，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；
可选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(201)所示结构的硫代磷酸酯基：
可选地，硫代磷酸酯键存在于以下至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
23.根据权利要求20-22中任意一项所述的缀合物，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸；
可选地，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为具有由以下式(202)-式(206)中的一个表示的核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团，Base表示选自A、U、C、G或T的碱基；
可选地，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由式(202)、式(203)或式(205)表示的核苷酸；
可选地，所述核苷酸序列选自表1A、1B、1C、1D、1E或1F中的一种。
24.权利要求15-23中任意一个所述的缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途；可选地，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。
25.根据权利要求24所述的用途，其中，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常；
可选地，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
26.一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，其中，所述方法包括将有效量的权利要求15-23中任意一个所述的缀合物与所述肝细胞进行接触；
可选地，所述特定基因选自以下基因中的一种：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV；
可选地，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。
27.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求15-23中任意一个所述的缀合物。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019120301A1 (zh) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 | 肝递送恩替卡韦前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用 |
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2019
- 2019-10-21 CN CN201911002183.XA patent/CN112759620A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019120301A1 (zh) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 | 肝递送恩替卡韦前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116655715A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-08-29 | 北京炫景瑞医药科技有限公司 | 一种GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途 |
| CN116655715B (zh) * | 2023-07-27 | 2023-10-20 | 北京炫景瑞医药科技有限公司 | 一种GalNAc衍生物、缀合物、组合物以及它们的用途 |
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