CN111377985B - 化合物和缀合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

一种可与寡核苷酸形成缀合物的化合物，该化合物具有如式(101)所示的结构。本公开还提供了相应的寡核苷酸缀合物。本公开的寡核苷酸缀合物能够特异性地靶向肝细胞，从而有效解决寡核苷酸药物的体内递送问题，毒性低，所递送的寡核苷酸具有高度的稳定性。

Description

化合物和缀合物及其制备方法和用途
技术领域
本公开涉及一种用于药物递送的化合物和缀合物及它们的制备方法和用途。
背景技术
递送系统是小核酸药物开发中的核心关键技术之一，目前全球范围内对小核酸递送系统研究最广泛的一类递送系统是靶向缀合递送技术。
发明内容
在一个实施方式中，本公开提供了一种缀合分子及其制备方法，该缀合分子具有式(101)所示的结构：
n1为选自2-5的整数，每个n2独立地为选自2-5的整数；
m1为选自1-5的整数；
R1为能够通过共价键与活性药物结合的基团；
每个R2各自独立地为选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
每个L1的长度为6-20个原子，所述L1的长度是指与含氮骨架中的N原子连接的原子到与S1连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；
每个S1独立地为M1，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一个实施方式中，本公开提供了一种缀合物，该缀合物具有式(201)所示的结构：
其中：
每个L1长度独立地为6-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地由具有以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
n1为选自2-5的整数，每个n2独立地为选自2-5的整数；
m1为选自1-5的整数；
每个R2各自独立地为H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
R6为活性药物；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，R2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个M1选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，提供了本公开的化合物在用于制备治疗和/或预防由特定基因的表达而引起的病理状态或疾病的药物中的应用。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗因肝细胞中某一特定基因表达而引起的病理状态或疾病的方法，包括向受试者提供本公开的有效剂量的缀合物。
在一些实施方式中，本公开提供了一种在肝细胞中抑制特定基因表达的方法，该方法包括和本公开的缀合物接触。
在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的缀合物。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利以及专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
本公开的详细说明
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，尤指乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸核苷酸(以下实施例中以P表示)或5'-硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
在本文的上下文中，“互补”或“反向互补”一词可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可能推断出链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，基本上反向互补是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；基本上完全反向互补是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全互补指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在核苷酸差异，指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或者核苷酸类似物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的缀合分子的制备方法或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的RNA序列，所述“未修饰或修饰RNA亚磷酰胺(unmodified or modified RNA phosphoramidite)”，分别用于所谓的固相亚磷酰胺合成，固相亚磷酰胺合成是本领域合成RNA众所周知的方法。在本文中RNA亚磷酰胺同时也指核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidites)。除非另有说明，本公开所使用的核苷单体均可商购得到。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)是用于指示取代基附着点的位置。例如：-C1-C10烷基-NH2通过C1-C10烷基而附着。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或状况发生的情况和其中不发生的情况。例如，“任选地取代的(optinally substituted)烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或内在不稳定的任何取代或取代型式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1到20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当对具有特定数量的碳的烷基残基进行命名时，旨在涵盖所有具有该数量的碳的支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个附着点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一个氢分子而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(即，烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个附着点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两个氢分子而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个附着点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥附着的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥附着的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指衍生自芳香族单环或多环烃环系统、通过从环碳原子中除去氢原子而形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，其根据Hückel理论包含环状、离域的(4n+2)π-电子系统。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的一个子集，指与芳基相同、但具有两个附着点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香碳环，通常具有3至7个环状碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤代”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指一个稳定的3-到18-元非芳香环基，包含2-12个碳原子和1-6个杂原子，所述杂原子选自氮、氧和硫。除非说明书中另有说明，杂环基是单环、双环、三环或四环系统，可包括稠环或桥环系统。杂环自由基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过环的任何原子附着。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异恶唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂嘧啶基、恶唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基、四氢吡喃基、硫吗啉基、硫杂吗啉基、1-氧杂硫吗啉基和1,1-二氧杂硫吗啉基。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，其包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，根据Hückel理论，包含环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过环中的任何原子附着。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二恶唑基、苯并呋喃基、苯并恶唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二恶唑基、苯并[b][1,4]恶唑基、1,4-苯并二恶唑基、苯并萘并呋喃基、苯并二唑基、苯并二氧杂苯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、环戊基[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊基[4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基、5,6-二氢苯并[h]辛诺林基、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环庚烷[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛酸[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛酸[d]吡啶基、异噻唑基、吲唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢氮茚基、异喹啉基、吲哚嗪基、异恶唑基、5,8-甲基-5,6,7,8-四氢喹唑啉基、萘啶酮基、1,6-萘啶酮基、恶二唑基、2-氧氮杂庚基、恶唑基、恶草酰基、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、邻苯二甲酰基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9四氢-5H-环庚烷[4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩[2,3-d]嘧啶基、噻吩[3,2-d]嘧啶基、噻吩[2,3-c]普萘基和噻吩基。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上附加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗方法”、“治疗”减轻、或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物或组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种病理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
缀合分子
在一个方面，公开了一种用于递送活性剂或活性药物的缀合分子。在一些实施方式中，本公开的缀合分子有利于组织特异性靶向。在一些实施方式中，本公开的缀合分子与细胞表面受体结合。为此目的，任何细胞表面受体或生物标志物或其一部分都被认为是合适的。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地结合到特定组织的特有受体，从而实现组织特异性靶向。在一些实施方式中，本公开的缀合分子专门针对肝细胞表面受体，从而专利针对肝组织。在一些实施方式中，本公开的缀合分子专门针对肝细胞特有的细胞表面受体。在一些实施方式中，本公开的缀合分子专门针对肝表面的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptors，ASGPR)。
如本文所使用的，“活性剂”和“活性药物”可互换使用，都是指能够通过本公开的缀合分子递送的分子。在一些实施方式中，活性剂为能够递送到肝细胞的试剂。这些试剂为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于功能性核苷酸，如功能性寡核苷酸，特别是本文公开的那些。
在一些实施方式中，本公开提供了一种缀合分子，该缀合分子具有式(101)所示的结构：
其中：
每个L1长度独立地为6-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地由具有以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
n1为选自2-5的整数，每个n2独立地为选自2-5的整数；
m1为选自1-5的整数；
R1为能够通过共价键与活性药物结合的基团；
每个R2各自独立地为选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
每个S1独立地为M1，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
L1的作用是将M1配体与含氮骨架上的N连接。在一些实施方式中，L1的长度为6-20个原子，例如可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子。为了使由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，M1配体之间的空间位置更适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合和/或节省成本，在一些实施方式中，每个或所有L1的长度为6-15个原子；在一些实施方式中，每个或所有L1的长度为7-13个原子。
除非另有说明，在本文的上文及下文中，所述L1的长度是指与含氮骨架中的N原子连接的原子到与S1或M1连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数。技术人员会理解，尽管为了方便起见，L1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或置换而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L1的长度是连接两个附着点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
在一些实施方式中，每个L1独立地选自或所有L1选自式A1-A4基团中的一种：
在一些实施方式中，m1可以为1-6的整数，从而保证所述缀合分子中S1基团的个数至少为2；在一个实施方式中，m1为选自2-6的整数，这样可以使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，M1配体的个数至少为3，从而使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，m1为2。
在一些实施方式中，n1为选自2-5的整数，每个n2独立地为选自2-5的整数时，可以使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，多个M1配体之间的空间位置适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合分子更为简单，更容易合成和/或降低成本，根据本公开的一个实施方式中，n1＝n2＝3。
本领域技术人员可能理解，当每个R2各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基时，不会改变本公开提供的缀合分子的性质，均可能实现本公开的目的。在一些实施方式中，每个R2独立的选自H、甲基或乙基。在一些实施方式中，每个R2均为H。
R1为能够被本公开的缀合分子递送并结合到活性药物(也称作活性剂)的基团。在一些实施方式中，R1为能够结合到寡核苷酸的部分，该寡核苷酸将由本公开的缀合分子递送。在一些实施方式中，R1为能够通过共价键与寡核苷酸结合的部分。在一些实施方式中，R1为能够通过磷酸二酯键与寡核苷酸结合的部分。在一些实施方式中，R1的选择是为了实现与含氮骨架上的N的连接，并且为合成寡核苷酸缀合物提供合适的反应位点。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R2的碳原子与N互相连接的链状结构。在一些实施方式中，R1可能为能够以适当方式连接至含氮骨架上的N原子的部分。在一些实施方式中，R1基团上含有与含氮骨架上的N连接的连接位点以及可能经反应而通过磷酸二酯键缀合至寡核苷酸的任意官能团。
在一些实施方式中，R1还含有第2官能团，所述第2官能团能够和羟基基团或氨基基团形成共价键，或者为可通过与羟基基团或氨基基团形成的共价键连接的固相载体；再一项实施方式中，第1官能团为亚磷酰胺、羟基或受保护的羟基，在一些实施方式中，第2官能团为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐；在一些实施方式中，所述羧酸盐为带有金属阳离子的羧酸盐、羧酸铵盐、羧酸三级胺盐或羧酸季铵盐；在一些实施方式中，所述羧酸盐为三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐。在一些实施方式中，可通过与羟基基团或氨基基团形成的共价键连接的固相载体为通过磷酸酯键、羧酸酯键和/或酰胺键连接的固相载体。在一些实施方式中，所述固相载体为树脂。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有羟基、-ORk或式(C3)所示的基团；和/或所述第2官能团含有式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)所示的结构：
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，SPS表示固相载体，表示基团共价连接的位点。
在一些实施方式中，第1官能团含有亚磷酰胺官能团，如式(C3)所示，该亚磷酰胺官能团可以与核苷酸上的任意位置的羟基，如2'位羟基或3'位羟基发生偶联反应，并经氧化形成磷酸二酯键，将缀合分子缀合至寡核苷酸。此时，即使第2官能团不存在，本公开的缀合分子也能够缀合到核苷酸上。此时，本公开的缀合分子适合于与核苷酸序列中末端核苷酸上的羟基反应，并在后续的氧化过程中形成磷酸二酯键连接，从而将本公开的缀合分子缀合至寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有被保护的羟基。在一些实施方式中，所述第2官能团含有对固相载体反应的基团，以提供含有固相载体的缀合分子。在一些实施方式中，第2官能团含有羧酸官能团、羧酸盐官能团或亚磷酰胺官能团，如式(C1)、(C2)或(C3)所示，羧酸官能团或羧酸盐官能团可以与固相载体，例如树脂上的羟基或氨基进行酯化反应或酰胺化反应，形成含有经羧酸酯键连接的固相载体或经酰胺键连接的固相载体的缀合分子。亚磷酰胺官能团可以与通用固相载体，例如树脂上的羟基发生偶联反应，并经氧化形成经磷酸二酯键连接的固相载体。此时，根据本发明的一方面，提供了一种用这种缀合分子来制备本公开的缀合物的方法。在一些实施方式中，该方法包括首先将缀合分子与固相载体通过冷凝或偶联反应进行连接，然后按照固相亚磷酰胺合成方法加入核苷单体，从而得到将本公开缀合分子缀合至寡核苷酸的本公开的缀合物。在一些实施方式中，在亚磷酰胺固相合成过程中，第1官能团发生脱保护，随后在偶联反应条件下与核苷酸上的亚磷酰胺基团发生偶联。
在一些实施方式中，R1含有第1官能团和第2官能团，所述第1官能团含有羟基或被保护的羟基；所述第2官能团含有羧酸酯键、酰胺键或磷酸二酯键，或者通过羧酸酯键、酰胺键或磷酸二酯键连接的固相载体。在一些实施方式中，第2官能团为如式(C1’)或(C3’)所示的部分。在一些实施方式中，当第2官能团含有固相载体时，含有所述固相载体的缀合分子有利于本公开缀合物的制备。因此，在本发明的一方面，提供了一种用所述缀合分子制备本公开的缀合物的方法。在一些实施方式中，该方法包括将含有固相载体的缀合分子与核苷单体按照亚磷酰胺固相合成方法进行反应，从而将本公开的缀合分子缀合到寡核苷酸上。在一些实施方式中，所述含有固相载体的缀合分子可能通过缀合分子与固相载体反应在内部得到，所述缀合分子与羧基、羧酸盐或亚磷酰胺发生反应。在一些实施方式中，缀合分子可能有商购得到。
在一些实施方式中，羧酸盐官能团可以表示为—COO-M+，其中，M+是阳离子，例如选自金属阳离子，铵阳离子NH4 +，有机铵阳离子中的一种。在一些实施方式中，所述金属离子选自碱金属离子中的一种，如K+或Na+。出于提高溶解性、使反应顺利进行的考虑，在一些实施方式中，有机铵离子为三级胺形成的铵阳离子或季铵阳离子，如，三乙胺形成的铵离子或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。在一些实施方式中，羧酸盐是三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐。
在本公开的一些实施方式中，R1具有式(B9)、(B10)、(B9’)、(B10’)、(B11)、(B12)、(B11’)或(B12’)所示的结构：
其中，q1为1-4的整数，q2为1-10的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，表示基团共价键连接的位点。在一些实施方式中，q1为1或2。在一些实施方式中，q2为1-5的整数。在一些实施方式中，R1含有式(B9)或(B10)所示的结构。在一些实施方式中，R1含有式(B11)或(B12)所示的结构。在一些实施方式中，Rk为Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-双甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4’,4’-三甲氧基苯甲基)中的一种或多种。在一些实施方式中，Rk可以是DMTr。
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体集合的配体。在一些实施方式中，至少一种M1为能够和肝表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个M1为能够和肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。
在一些实施方式中，M1可能是任何与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲合力的配体，这些配体的种类为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，至少一个M1为糖类。在一些实施方式中，每个M1为糖。在一些实施方式中，至少一个M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，每个M1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，至少一个M1是修饰的糖。在一些实施方式中，每个M1为修饰的糖。在一些实施方式中，每个M1独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖或单糖衍生物。在一些实施方式中，每个或至少一个M1可能独立地选自由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖和麦芽糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物以及唾液酸。
在一些实施方式中，每个或至少一个M1可能独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在一些实施方式中，至少一个或每个M1均为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施方式中，配体选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
CN105378082A公开了一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团及1个或多个配体，每个配体选自多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。据称，该化合物可以降低细胞中核酸转录物的量或活性。
WO2016077321A1公开了众多特异性靶向HBV基因的siRNA以及对其进行递送的方法，并通过对siRNA的核苷酸进行修饰，从而增强了其血清稳定性。该文献还公开了siRNA缀合物，并且进一步具体公开了数种具有特定结构的siRNA缀合物。
WO2016168286A1公开了众多特异性靶向ANGPTL3基因的siRNA以及对其进行递送的方法，并通过对siRNA的核苷酸进行修饰，从而增强了其血清稳定性。该文献还公开了siRNA缀合物。
N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)，是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的配体。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了较好的效果。例如，阿尔尼拉姆公司(Alnylam pharmaceuticals,Inc.)首次报道了基于GalNAc缀合技术的siRNA在小鼠体内发挥干扰活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)。文章报道了三簇GalNAc缀合的siRNA，在体内外实验中均展现了良好的递送活性。通过皮下给药的小鼠体内实验，单一剂量的ED50为1mg/kg，单次注射剂量小于1ml。在长期给药实验中，每周皮下注射一次，可获得长达9个月的稳定干扰活性。
在一些实施方式中，S1独立的为M1。在一些实施方式中，S1独立地是M1中至少一个活性羟基被羟基保护基团取代而形成的基团。在一些实施方式中，S1独立地是M1中全部羟基被羟基保护基团取代而形成的基团。在一些实施方式中，任何本领域技术人员熟知的羟基保护基团可能被用于保护M1上的活性羟基。在一些实施方式中，被保护的羟基由式YCOO-表示，其中每个Y独立地选自于由C1-C10烷基和C6-C10芳基组成的组，其可任选地由一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素取代基和C1-C6烷基。在一些实施方式中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤苯基和C1-C6烷基苯基。
在一些实施方式中，每个S1各自独立地式A46-A54基团中的一种：
在一些实施方式中，S1为式A49或A50。
在一些实施方式中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；出于简化本公开的缀合分子的目的，在一些实施方式中，Y为甲基。
在一些实施方式中，本公开的缀合分子具有式(301)、(302)、(303)或(304)所示的结构：
以上式(301)-(304)中，其中，Rk为羟基保护基团，M+选自金属阳离子、铵阳离子、三级胺阳离子或季铵阳离子中的一种。在一些实施方式中，M+为
在一些实施方式中，本公开的缀合分子可具有式(501)、(502)、(503)或(504)所示的结构：
以上式(501)-(504)中，其中，X为O或NH，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体。
根据本公开的一些具体实施方式，本公开的缀合分子具有式(601)、(602)、(603)或(604)所示的结构：
以上式(601)-(604)中，DMTr表示4,4’-双甲氧基三苯甲基，结构表示相应羧酸与三乙胺形成的盐。
在一些具体的实施方式中，本公开的缀合分子可具有式(701)、(702)、(703)或(704)所示的结构：
以上式(701)-(704)中，SPS表示固相载体，DMTr表示4,4’-双甲氧基三苯甲基。
缀合分子的制备
本领域技术人员可采用任意合理的合成路线制备本公开的缀合分子。
在本公开的一些实施方式中，式(101)所示缀合分子的制备方法包括在有机溶剂中，在酯化反应条件下，以及在碱和成酯催化剂存在下，将式(102)所示化合物与环状酸酐接触，离子交换，分离得到式(101)所示化合物：
其中：
R7为提供式(101)中R1的基团。在一些实施方式中，例如，R7具有式(A61)所示的结构：
n1、n2、m1、R2、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述，Ri为能够实现与含氮骨架上的N连接、与RkO连接并且连接有一个游离羟基的任意基团，Rk为羟基保护基团。此时，所获得的是R1中含有作为羟基保护基团的第1官能团和第2官能团，第2官能团含有如式(C1)或(C2)所示结构的式(101)化合物。在一些实施方式中，R7为B7或B8所示结构：
其中，q2和Rk各自的定义如前所述。
所述酯化反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为8-48小时，在一个实施方式中，所述酯化反应条件为反应温度为10-40℃，反应时间为20-30小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一个实施方式中，所述环氧类溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一个实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于所述式(102)所示化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一个实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述环状酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐或庚二酸酐中的一种，在一个实施方式中为丁二酸酐。所述环状酸酐与所述式(102)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一个实施方式中为2:1-5:1。
所述成酯催化剂可以是任何对该酯化反应起到催化作用的催化剂，例如该催化剂可以是4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式(102)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一个实施方式中为2:1-5:1。
在一些实施方式中，所述碱可以是任意的无机碱，有机碱或者它们的结合。考虑溶解性和产物稳定性，所述碱可以是例如三级胺类有机碱。在一个实施方式中，所述三级胺类有机碱为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺类有机碱与式(102)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一个实施方式中为3:1-10:1。
所述离子交换作用是将式(101)化合物转化为期望的羧酸或羧酸盐的形式，离子交换的方法为本领域技术人员所公知，可以使用合适的离子交换溶液和交换条件，得到前述阳离子为M+的缀合分子，在此不做详述。在一个实施方式中，所述离子交换反应使用三乙胺磷酸盐溶液进行，所述三乙胺磷酸盐溶液的浓度为0.2-0.8M，在一个实施方式中为0.4-0.6M，相对于式(102)化合物，所述三乙胺磷酸盐溶液的用量为3-6L/mol，在一个实施方式中为4-5L/mol。
可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(101)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(101)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱；或者(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可直接除去溶剂得到式(101)化合物粗产品，该粗产品可直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(101)化合物的制备方法还进一步包括在缩合反应条件下，在有机溶剂中，在缩合剂和三级胺类有机碱的存在下，将上述离子交换反应得到的产物进一步与含有氨基或羟基的固相载体进行接触。此时，所获得的是R1中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有羟基保护基团，第2官能团含有如式(C1’)所示结构的式(101)化合物。
所述固相载体为固相合成siRNA中所用的载体中的一种，其中的一些为本领域技术人员所公知。例如,所述固相载体可以选自含有活性羟基或氨基官能团的固相载体，在一个实施方式中为氨基树脂或羟基树脂。在一些实施方式中，所述氨基或羟基树脂在一个实施方式中具有如下参数：粒径100-400目(mesh)，表面氨基或羟基载量为0.2-0.5mmol/g。式(101)所示化合物与固相载体的用量比为10-400μmol化合物/每克固相载体(μmol/g)。在一些实施方式中，所述式(101)所示化合物与固相载体的用量比为50-200μmol/g。
所述有机溶剂可以是本领域技术人员已知的任何合适的溶剂或混合溶剂。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述环氧类溶剂为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(102)化合物，所述有机溶剂的用量为20-200L/mol，在一个实施方式中为50-100L/mol。
在一些实施方式中，所述缩合剂可以是六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮和/或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，在一个实施方式中，所述缩合剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯。所述缩合剂与式(102)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一个实施方式中为1:1-5:1。
在一些实施方式中，所述三级胺类有机碱为三乙胺和/或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N,N-二异丙基乙胺；所述三级胺类有机碱与式(102)所示化合物的摩尔比为1:1-20:1，在一个实施方式中为1:1-5:1。
在一些实施方式中，式(101)化合物的制备方法还可以包括将得到的缩合产物在盖帽反应条件下，在有机溶剂中，与盖帽试剂和酰化催化剂接触，分离得到式(101)所示化合物。所述盖帽反应的作用在于除去任何尚未反应完全的活性反应官能团，以避免在后续反应中产生不必要的副产物。所述盖帽反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应的时间为1-10h，在一些实施方式中为3-6h。盖帽试剂可使用siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂，siRNA固相合成中所使用的盖帽试剂为本领域技术人员所公知。
在一些实施方式中，所述盖帽试剂由盖帽试剂A(capA)和盖帽试剂B(capB)组成，其中，盖帽试剂A为N-甲基咪唑，在一些实施方式中以N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液形式提供，其中，吡啶与乙腈的体积比为1:10-1:1。在一些实施方式中为1:3-1:1。在一些实施方式中，吡啶与乙腈的总体积与N-甲基咪唑的体积为1:1-10:1，在一些实施方式中为3:1-7:1。在一些实施方式中，所述盖帽试剂B为乙酸酐，在一些实施方式中，盖帽试剂B以乙酸酐的乙腈溶液形式提供，其中，乙酸酐和乙腈的体积为1:1-1:10，在另一些实施方式中为1:2-1:6。
在一些实施方式中，所述N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液的体积与式(102)化合物的质量之比为5ml/g-50ml/g，在一些实施方式中为15ml/g-30ml/g。所述乙酸酐的乙腈溶液的体积与式(102)化合物的质量之比为0.5ml/g-10ml/g，在一些实施方式中为1ml/g-5ml/g。
在一些实施方式中，盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(102)化合物，所述有机溶剂的用量为10-50L/mol，在一些实施方式中为5-30L/mol。
在一些实施方式中，所述酰化催化剂可以选自任何可用于成酯缩合或成酰胺缩合的催化剂，例如碱性杂环化合物。在一些实施方式中，所述酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶。所述催化剂与式(102)所示化合物的质量之比为0.001:1-1:1，在一个实施方式中为0.01:1-0.1:1。
在一些实施方式中，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(101)化合物。在一些实施方式中，可通过以有机溶剂充分洗涤，并过滤，去除未反应的反应物、过量的盖帽试剂及其它杂质，得到式(101)化合物，所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷、甲醇，在一些实施方式中为乙腈。
在一些实施方式中，式(101)所示缀合分子的制备方法包括在有机溶剂中，在偶联反应条件下，以及在偶联试剂存在下，将式(102)所示化合物与亚磷酰二胺接触，分离得到式(101)所示化合物。此时，所获得的是R1中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有羟基保护基团，第2官能团含有如式(C3)所示结构的式(101)化合物。
在一些实施方式中，偶联反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，式(102)化合物与亚磷酰二胺的摩尔比为1:1-1:50，例如为1:5-1:15；式(102)化合物和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，例如为1:50-1:80；反应时间为200-3000秒，例如为500-1500秒。所述亚磷酰二胺例如可使用双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦，其可商购获得或按照本领域中公知的方法合成获得。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，例如为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，例如为无水乙腈。在一些实施方式中，相对于式(102)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，例如可以为5-20L/mol。通过进行该偶联反应，式(102)化合物中的羟基与亚磷酰二胺反应形成亚磷酰胺基团。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(101)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(101)化合物的制备方法还进一步包括以下步骤：在偶联反应条件下，在有机溶剂中，以及在偶联试剂存在下，将分离得到的产物进一步与含有羟基的固相载体进行接触。随后，经盖帽反应、氧化反应，分离得到式(101)化合物。此时，所获得的是R1中含有第1官能团和第2官能团，第1官能团含有羟基保护基团，第2官能团具有如式(C3’)所示结构的式(101)化合物。
在一些实施方式中，所述固相载体为本领域中公知的可用于核酸固相合成的固相载体，例如，可以是经脱保护反应后的市售的通用固相载体(HL UnyLinkerTM 300Oligonucleotide Synthesis Support，Kinovate Life Sciences公司，结构如式B80所示)：
脱保护反应为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，脱保护条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃；反应时间为30-300秒，例如为50-150秒。脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中，脱保护试剂为二氯乙酸。脱保护试剂与固定相上的-DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)保护基的摩尔比为2:1-100:1，例如为3:1-50:1。通过进行所述脱保护，在所述固相载体表面上获得具有反应活性的游离羟基，从而便于进行下一步的偶联反应。
偶联反应条件以及偶联试剂的选择如上所述。通过进行该偶联反应，脱保护反应中形成的游离羟基与亚磷酰胺基团反应形成亚磷酸酯连接。
在一些实施方式中，盖帽反应条件包括温度为0-50℃，例如为15-35℃，反应时间为5-500秒，例如为10-100秒，所述盖帽反应在盖帽试剂存在下进行。盖帽试剂的选择和用量如上所述。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，例如可以为15-35℃，反应时间为1-100秒，例如可以为5-50秒，氧化试剂例如可以为碘(在一些实施方式中，以碘水的形式提供)。在一些实施方式中，氧化试剂与亚磷酸酯基团的摩尔比为1:1-100:1，例如可以为5:1-50:1。在一些具体的实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。
在一些实施方式中，式(102)所示化合物可以通过以下制备方法得到：在有机溶剂中，在成酰胺反应缩合剂和三级胺类有机碱存在下，在缩合反应条件下，将式(103)所示化合物与式(104)所示化合物接触，分离得到式(102)所示化合物：
其中，n1、n2、m1、R2、R7、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述。
式(104)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公开的化合物，或者，式(104)化合物可由本领域技术人员通过各种方法制备，例如，可参照US8106022B2实施例1中所公开的方法制备某些式(104)化合物，以引用的方式将以上文献的全部内容整体并入本文。
在一些实施方式中，所述缩合反应条件包括反应温度为0-100℃，反应时间为0.1-24小时，在一个实施方式中为反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-16小时。
所述式(104)所示化合物与所述式(103)所示化合物的摩尔比为2:1-10:1，在一个实施方式中为2.5:1-5:1。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种，所述环氧类溶剂在一个实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂在一个实施方式中为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一个实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(103)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一个实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述成酰胺反应缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在一个实施方式中为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。所述成酰胺反应缩合剂与式(103)所示化合物的摩尔比为2:1-10:1，在一个实施方式中为2.5:1-5:1；
所述三级胺类有机碱为N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一个实施方式中为N-甲基吗啉；所述三级胺类有机碱与式(103)所示化合物的摩尔比为3:1-20:1，在一个实施方式中为5:1-10:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(102)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(102)化合物例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(102)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(103)化合物与足量的一种式(104)化合物一次反应即生成期望的式(102)化合物，此时，各个S1-L1部分彼此相同。在一些实施方式中，可根据需要，通过使式(103)化合物分批与不同的式(104)化合物，即L1和/或S1不同的式(104)化合物发生反应，从而使得生成的式(102)化合物中含有两种以上的S1和/或L1。例如，对于1eq的式(103)化合物，可先使其与2eq的第一式(104)化合物接触，从而在式(103)化合物中的两个末端伯胺基团上连接第一S1-L1部分，随后，使其继续与(m1-1)eq的第二式(104)化合物接触(m1的定义和取值范围如前所述)，从而在式(103)化合物中的(m1-1)个仲胺基团上连接第二S1-L1部分。
在一个实施方式中，R7为式B7或B8基团中的一种，此时，式(103)所示化合物可以通过以下制备方法得到：在有机溶剂中，在成酰胺反应条件下，以及在成酰胺反应缩合剂和三级胺类有机碱存在下，将式(105)所示化合物与式(A-1)所示化合物或式(A-2)所示化合物接触，分离得到式(103)所示化合物：
其中，n1、n2、m1、R2、R7、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述成酰胺反应条件为反应温度为0-100℃，反应时间为1-48小时，在一些实施方式中，所述成酰胺反应条件为反应温度为10-40℃，反应时间为2-16小时。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为醇类溶剂、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。所述醇类溶剂在一个实施方式中为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或多种，在一些实施方式中为乙醇。所述环氧类溶剂在一些实施方式中为为二氧六环和/或四氢呋喃。所述醚类溶剂在一些实施方式中为为乙醚和/或甲基叔丁基醚。所述卤代烷类溶剂在一些实施方式中为为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。相对于式(105)化合物，有机溶剂用量为3-50L/mol，在一实施方式中为3-20L/mol。
在一些实施方式中，所述成酰胺反应缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，在一个实施方式中为3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮。所述成酰胺反应缩合剂与式(105)所示化合物的摩尔比为1:1-10:1，在一个实施方式中为2.5:1-5:1。
在一些实施方式中，所述三级胺类有机碱为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一个实施方式中为N,N-二异丙基乙胺。所述三级胺类有机碱与式(105)所示化合物的摩尔比为3:1-20:1，在一个实施方式中为5:1-10:1。
在一些实施方式中，式(A-1)和式(A-2)化合物可通过任何适当的方式制备。例如，当Rk为DMTr基团时，可通过甘油酸钙与DMTrCl反应制备式(A-1)化合物；类似地，可先将3-氨基-1,2-丙二醇与环状酸酐接触，随后再与DMTrCl反应制备式(A-2)化合物，所述环状酸酐可以是碳原子数为4-13、在一个实施方式中为4-8的环状酸酐。本领域技术人员容易理解的是，所述环状酸酐的选择对应于(A-2)化合物中q2的不同值，例如，当所述环状酸酐为丁二酸酐时，q2＝1，当所述环状酸酐为戊二酸酐时，q2＝2，以此类推。
在一些变型中，也可通过使式(105)所示化合物依次与所述环状酸酐、3-氨基-1,2-丙二醇和DMTrCl反应，制备式(103)化合物。本领域技术人员容易理解的是，这些变型不会影响式(103)化合物的结构与功能，并且这些变型是本领域技术人员在上述方法的基础上容易实现的。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(103)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(103)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺＝1:1:1:0.5-1:1:1:0.6梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(103)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，每个R2均相同，且每个n2与n1相等，此时，式(105)中的两个NH2基团在化学上是等价的。在一些实施方式中，使式(A-1)或(A-2)化合物与等摩尔的式(105)化合物反应，随后分离获得式(103)化合物；在一些实施方式中，使式(A-1)或(A-2)化合物与过量的式(105)化合物反应，随后分离获得式(103)化合物。
式(105)化合物可商购获得，或者由本领域技术人员使用已知的方法获得。例如，当m1＝2、n1和每个n2均为3、且每个R2均为H时，式(105)化合物可自阿法埃莎公司商购获得。
寡核苷酸缀合物
在另一方面，本公开提供了一种缀合物，该缀合物具有如式(201)所示的结构：
其中：
n1、n2、m1、L1、R2、M1各自的定义和可选择的范围如前所述。
R6为活性药物。在一些实施方式中，R6含有功能性寡核苷酸。
R5是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，R5可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
在一些实施方式中，R5是式(101)化合物中的R1基团经基团经反应连接至活性药物而形成的连接基团。在一些实施方式中，R5是式(101)化合物中的R1基团经反应连接至功能性寡核苷酸而形成的连接基团。在一些实施方式中，R5基团中同时含有与含氮骨架上的N连接的连接位点以及与R6中的P相连接的连接位点。在一些实施方式中，R5中所述与含氮骨架上的N连接的位点与N形成酰胺键，所述与R6中的P连接的位点与P形成磷酸酯键。在一些实施方式中，R5可以是B5、B6、B5’或B6’：
其中，表示基团共价键连接的位点，q2的选择和取值范围如前所述。
在一些实施方式中，R6为A59所示结构的基团：
其中，E1为OH、SH或BH2，在一些实施方式中，E1为OH或SH；Nu为寡核苷酸。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”基团或分子是指能够与相应的配位体形成共价键的基团或分子，且缀合基团或分子及其配位体都具有特定的功能。相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的缀合部分共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”可理解为可通过反应缀合至寡核苷酸、最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。在一些实施方式中，寡核苷酸是siRNA，此时，本公开的缀合物是siRNA缀合物。
在一些实施方式中，本公开的缀合物具有式(401)、(402)、(403)或(404)所示的结构：
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指这样的寡核苷酸：所述寡核苷酸能够通过与靶序列之间产生稳定且特异性的杂交，利用RNA激活(RNA activation，RNAa)、RNA干扰(RNA interference，RNAi)、反义核酸技术、外显子跳跃(exon skipping)技术等原理，上调或下调靶基因的表达，或导致mRNA可变剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸还可以是与靶蛋白之间产生稳定且特异性地结合的核酸结构。此外，本领域技术人员容易理解的是，多核苷酸(例如mRNA本身或其片段)也同样适用于与本公开提供的缀合分子缀合形成缀合物以实现靶向递送，比如肝靶向递送，从而调节mRNA转录出的蛋白质的表达。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵盖mRNA或其片段。
在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸能够与靶序列发生相互作用，从而影响靶序列分子的正常功能，如导致发生mRNA断裂或翻译阻遏或外显子跳跃引发mRNA可变剪接等。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以大体上与靶序列的碱基互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以与靶序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的碱基互补，或者与靶序列完全互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1个、2个或3个不与靶序列互补的碱基。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以是单链的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合体(chimera)，或者是双链的DNA、RNA或DNA-RNA杂交体(hybrids)。
由此，在一些实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、核酸适配体(Nucleic Acid Aptamer)、小激活RNA(small activating RNA，saRNA)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。WO2015/006740A2公开了一种不同配体缀合到寡核苷酸的缀合物，其中配体通过接头(linker)与寡核苷酸进行连接，所述寡核苷酸选自小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、适配体(aptamer)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。这些缀合物在寡核苷酸的体内递送上表现出好的稳定性。在进一步的实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公开的寡核苷酸，以引用的方式将其整体内容并入本文。
本公开的寡核苷酸缀合物可通过提高活性剂比如功能性寡核苷酸的肝靶向递送效率，来调节特定细胞如肝细胞中特定基因的异常表达，，从而增强功能性寡核苷酸和细胞中靶向序列之间的相互作用。在一些实施方式中，所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在肝细胞中异常表达的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述在肝细胞异常表达的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本公开的上下文中，HBV基因是指序列如Genbank注册号NC_003977.1所示的基因；ANGPTL3基因是指mRNA序列如Genbank注册号NM_014495.3所示的基因；APOC3基因是指mRNA序列如Genbank注册号NM_000040.1所示的基因。
在一些实施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本公开的上下文中，“靶mRNA”是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA，它既可以是过量表达的基因对应的mRNA，或者是表达不足的基因对应的mRNA。由于大部分疾病源于mRNA的过量表达，因此，在本公开中，靶mRNA尤其指过量表达的基因对应的mRNA。在本公开的一些实施方式中，相应于上述异常表达的基因，所述靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV等基因对应的mRNA。在一些实施方式中，所述靶mRNA可以是由对应HBV基因转录而得的mRNA、或者ANGPTL3基因所对应的mRNA、或者APOC3基因所对应的mRNA。
式A59中的P可以连接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以连接到寡核苷酸的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是单链寡核苷酸(例如，单链RNA或者适配体)，此时，式A59中的P可以连接到所述单链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P连接到所述单链寡核苷酸的末端。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是双链寡核苷酸(例如，siRNA、microRNA或者DNA)，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链。在一些实施方式中，所述式A59中的P连接到所述双链寡核苷酸中正义链或反义链的端部，所述端部指所述正义链或所述反义链中从一端起算的前4个核苷酸，在一个实施方式中，式A59中的P连接到所述正义链或所述反义链的末端；更在一个实施方式中，式A59中的P连接到所述正义链的3'末端。在式A59中的P连接至双链寡核苷酸的正义链的上述位置的情况下，本公开提供的寡核苷酸缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的双链寡核苷酸反义链，以阻断靶mRNA翻译蛋白质的过程，抑制特定基因的表达。
式A59中的P可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P可通过形成磷酸二酯键而连接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些具体实施方式中，式A59中的P连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上，或者式A59中的P通过取代双链寡核苷酸序列中正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P通过取代双链寡核苷酸序列中正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
在不愿受到限制的情况下，在下面的实施方式和实施例中，详细描述了本公开的缀合物中活性药物为功能性寡核苷酸，特别是小干扰RNA(siRNA)的情况。此时，本公开的寡核苷酸缀合物为siRNA缀合物。在本文的上下文中，为了描述方便，也将这些实施方式中的siRNA缀合物称为本公开的siRNA缀合物。这并不代表本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸仅可以是siRNA，相反，所述寡核苷酸可能是本公开的或者本领域技术人员所熟知的其它替代药物。根据siRNA缀合物的详细说明，可以设想功能性寡核苷酸与本公开提供的缀合分子缀合时也会有类似的作用。
本领域技术人员公知，siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常具有活性的，即功能性的siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方式中约为15-30个核苷酸，所述siRNA中的每个核苷酸可以独立地是修饰或未修饰的核苷酸，为了增加稳定性，所述siRNA中至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
本公开的发明人发现，下面的实施方式中所述的siRNA具有较高的活性和/或稳定性，因而可以作为本公开中siRNA的发明目的。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的siRNA(以下，也称为本公开的siRNA)中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成互补双链区，所述核苷酸序列2的至少一部分与第一段核苷酸序列互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是指在3mg/kg的浓度下，能够抑制至少50％乙型肝炎病毒基因表达、至少50％血管生成素样蛋白3基因表达或者至少50％载脂蛋白C3基因表达的siRNA。在一些实施方式中，本公开的siRNA指在浓度为3mg/kg时，能够抑制至少55％、60％、65％、70％、75％或80％HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因表达。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列。在不愿受到限制的情况下，这些特定的核苷酸差异并不会显著降低siRNA缀合物的靶基因抑制能力，而这些包含特定核苷酸差异的siRNA缀合物也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2上的第一个核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1上的最后一个核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，该第二段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。因此，所述正义链和反义链的长度可以是19-23个核苷酸。
在一个一些实施方式中，本公开的siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；在一些实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为1或2个核苷酸。这样，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、或者和所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一个实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的肝细胞mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA不含修饰的核苷酸基团；在一些实施方式中，本公开的siRNA含有修饰的核苷酸基团。
目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括骨架修饰(也称为核苷酸间连接修饰，如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基被修饰，比如2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。
在本公开的一些实施方式中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基(或修饰的磷酸酯基和/或修饰的核糖基)。在本公开的一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的结构。
非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(808)所示。2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(809)所示。2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(810)所示。2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(811)所示。
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶的基团。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物可以为如异核苷酸、桥联核酸(bridged nucleic acid，简称BNA)核苷酸或无环核苷酸。
BNA核苷酸是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖环的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(812)所示，ENA如式(813)所示，cET BNA如式(814)所示。
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)核苷酸或甘油核酸(GNA)核苷酸，其中，UNA如式(815)所示，GNA如式(816)所示。
其中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(817)或(818)所示。
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“2'-氟代核糖基”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代而形成的具有如式(807)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“2'-甲氧基核糖基”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成如式(808)所示的结构。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为-氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：或者按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在本公开所述siRNA的一些具体实施方式中，所述核苷酸含有磷酸基团修饰。在本公开的上下文中，磷酸基团修饰在一个实施方式中为如下式(801)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)修饰，即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。该修饰能稳定siRNA的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
根据本公开一个一些实施方式，所述siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置的组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。
按照本公开一个一些实施方式，所述siRNA分子的反义链序列5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸可具有式(802)所示结构：
同时，常用的所述5'-磷酸类似物修饰的核苷酸的种类是本领域技术人员公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开的如下如式(803)-(806)所示的4种核苷酸：
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；
Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一个实施方式中，5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(803)所示的含有乙烯基磷酸酯(E-vinylphosphonate，E-VP)的核苷酸、式(802)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸或式(805)所示的含有5'-硫代磷酸修饰的核苷酸。
本公开的发明人意外发现，本公开所述siRNA缀合物在具有显著提高的血清稳定性的同时，还表现出并未明显降低的靶mRNA沉默活性以及优异的基因表达抑制效果。按照本公开的一个实施方式，本公开的寡核苷酸缀合物为包含以下siRNA的siRNA缀合物，所述siRNA例如为表1A-4E中示出的siRNA：
表1A
表1B
表1C
表1D
表1E
表2A
表2B
表2C
表2D
/>
表2E
/>
表3A
表3B
表3C
表3D
/>
表3E
表4A
表4B
表4C
表4D
表4E
*S：正义链；AS：反义链
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一个实施方式中为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸修饰的核苷酸(以下实施例中以P表示)或硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
寡核苷酸缀合物的制备
可以采用任意合理的合成路线制备本公开的寡核苷酸缀合物。
例如，本公开的寡核苷酸缀合物可以采用如下方法制备，该方法包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照所述寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；在一些实施方式中，所述方法还包含在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(101)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，从而使式(101)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。
在一些实施方式中，该方法还包含脱除保护基并与固相载体切割的步骤、分离纯化步骤、以及任选的退火步骤。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(101)所示的化合物与正义链或反义链的3'端的第一个核苷单体接触，使式(101)所示的化合物连接上序列中第一个核苷酸，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成双链寡核苷酸的正义链或反义链；其中，(101)化合物为R2中含有第1官能团和第2官能团，所述第1官能团含有被保护的羟基，第2官能团具有如式(C1’)或(C3’)所示结构的式(101)所示的化合物，与第一个核苷单体连接前，式(101)化合物经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；得到连接有缀合分子的核酸的正义链或反义链；按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接来合成双链寡核苷酸另一条链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得核酸的正义链和反义链，退火。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：按照该双链寡核苷酸中正义链或反义链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成正义链和反义链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链和连接在固相载体上的反义链；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(101)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，从而将式(101)化合物连接至正义链或反义链，其中，式(101)化合物是R1中含有亚磷酰胺作为第1官能团的式(101)化合物；脱除保护基并与固相载体切割，分别分离纯化，获得寡核苷酸的正义链或反义链，退火，其中，所述寡核苷酸的正义链或反义链上连接有缀合分子。
在一个具体实施方式中，式A59中的P连接至siRNA中的正义链的3'末端，本公开的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)脱除连接有固相载体的式(101)化合物(以下，也称为连接固相载体的缀合分子)中的羟基保护基团Rk；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将该连接固相载体的缀合分子与核苷单体接触，得到通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以该通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得本公开的siRNA缀合物。
其中，在步骤(1)中，脱除该连接固相载体的缀合分子中的保护基团Rk的方法包括在脱保护条件下，将式(101)化合物与脱保护试剂接触。脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与式(101)化合物的摩尔比为10:1-1000:1，在一些实施方式中为50:1-500:1。
所述偶联反应条件和偶联试剂可使用任何能够实现上述偶联反应的条件和试剂。在一些实施方式中，使用与所采用的固相合成方法中的偶联反应相同的条件与试剂。
在一些实施方式中，所述偶联反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃。式(101)化合物与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:2-1:5；式(101)化合物和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:3-1:10，反应时间为200-3000秒，在一些实施方式中为500-1500秒。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，在一些实施方式中为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，在一些实施方式中为无水乙腈。相对于式(101)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在步骤(2)中，通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用上述步骤制备的通过缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向合成siRNA缀合物的正义链S。此时，缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端。
步骤(2)和(3)中所述固相合成的其它条件，包括核苷单体脱保护条件，脱保护试剂种类和用量，偶联反应条件，偶联试剂的种类和用量，盖帽反应的条件，盖帽试剂的种类和用量，氧化反应条件，氧化试剂种类和用量，硫化反应条件，硫化试剂和用量采用本领域中常规使用的各种试剂、用量和条件。
例如，在一些实施方式中，步骤(2)和(3)中所述固相合成可使用如下条件：
核苷单体脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的的摩尔比为2:1-100:1，在一些实施方式中为3:1-50:1。
偶联反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:5-1:15；固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，在一些实施方式中为1:50-1:80，反应时间和偶联试剂的选择与前述相同。
盖帽反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为5-500秒，在一些实施方式中为10-100秒，盖帽试剂的选择与前述相同。盖帽试剂的总量与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:100-100:1，在一些实施方式中为1:10-10:1。在盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑的情况下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:10-10:10:1，在一些实施方式中为1:1:2-2:2:1。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为1-100秒，在一些实施方式中为5-50秒，氧化试剂在一些实施方式中为碘(在进一步实施方式中，以碘水的形式提供)。氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1-100:1，在一些实施方式中为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。硫化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为50-2000秒，在一些实施方式中为100-1000秒，硫化试剂在一些实施方式中为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为10:1–1000:1，在一些实施方式中为10:1-500:1。在一些实施方式中，所述硫化反应在乙腈:吡啶＝1:3-3:1的混合溶剂中进行。
按照本公开提供的方法，在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，并脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团可按照siRNA合成中常规的切割和脱保护方法进行。例如，将得到的连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触；在脱保护的过程中，A46-A54基团的保护基团YCOO-转化为羟基，S1基团转化为相应的M1基团，从而生成式(201)所示的缀合物。其中，所述浓氨水是指25-30重量％的氨水，浓氨水的用量与目标siRNA序列相比为0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2'-TBDMS保护时，所述方法还包括将脱除了固相载体的核苷酸序列与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除该2'-TBDMS保护。此时，所得到的目标siRNA序列中具有游离的2'-羟基的相应核苷。三乙胺三氢氟酸盐纯品的用量与目标siRNA序列相比为0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。
在合成过程中，可随时对核酸序列的纯度和分子量进行检测，从而更好地把控合成质量，检测的方法为本领域技术人员所公知。例如，可通过离子交换色谱检测核酸纯度，并通过液质联用色谱测定分子量。
退火的方法也是本领域技术人员熟知的。例如，可简单地将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
在获得本公开的缀合物后，在一些实施方式中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的siRNA缀合物进行表征，确定所合成的siRNA缀合物为目标设计的siRNA缀合物，且所合成的siRNA的序列与欲合成的siRNA的序列相符，例如与上述表1A-4E中所列的序列相符。
缀合物的应用
如本公开所示，所述缀合物可向细胞递送某种活性剂，用于治疗或预防可能需要这种递送的疾病或状况。在不愿受任何理论束缚的情况下，我们认为缀合分子的空间排列在靶向细胞表面受体方面特别有效，从而使负载的活性剂与细胞接触。在一些实施方式中，这种缀合物是针对肝细胞的寡核苷酸缀合物。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物具有优异的肝靶向特异性，因此能够高效地将所缀合的功能性寡核苷酸递送至肝部，从而有效地对肝细胞内特定基因表达进行调控。从而，本公开的寡核苷酸缀合物具有广泛的应用前景。
按照本公开的一些实施方式，本公开提供了本公开的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达引起的病理状况或疾病的药物中的用途。所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在一些实施方式中，所述特定基因选自ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。相应地，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物也可用于治疗其它肝脏疾病，包括以不需要的细胞增殖为特征的疾病、血液疾病、代谢疾病和以炎症为特征的疾病。肝脏的增殖疾病可以是良性或恶性疾病，例如癌症、肝细胞癌(HCC)、肝转移或肝母细胞瘤。肝脏血液学或炎症疾病可以是涉及凝血因子、补体介导的炎症或纤维化的疾病。肝脏的代谢疾病包括血脂异常和葡萄糖调节的不规则性。在一些实施方案中，通过施用一种或多种具有与参与肝病的基因序列高度同源的寡核苷酸来治疗肝病。
按照本公开另外一种实施方式，本公开提供了一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，该方法包括将本公开的siRNA缀合物与所述肝细胞进行接触。
通过将本公开的寡核苷酸缀合物给予有需要的患者，可以通过对基因表达进行调控的机制达到预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的目的。因此，本公开的寡核苷酸缀合物可用于预防和/或治疗所述病理状况或疾病、或用于制备用于预防和/或治疗所述病理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将缀合物如寡核苷酸缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将缀合物放置入患者体内。适于本公开方法的给药途径包括但并不仅限于局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与患者整个身体相比将更多寡核苷酸缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述寡核苷酸缀合物递送至患者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的手段，在一些实施方式中为能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向患者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的寡核苷酸缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是患者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中，指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸的量计：对于功能性寡核苷酸与缀合分子形成的寡核苷酸缀合物，被缀合物递送的寡核苷酸用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，在一个具体的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的寡核苷酸缀合物时，可参考上述用量。
另外，通过将本公开的寡核苷酸缀合物导入特定基因异常表达的肝细胞，还可以通过基因表达调控的机制达到抑制肝细胞中该特定基因的表达这一目的。在一些实施方式中，所述肝细胞为肝炎细胞，在一些实施方式中为HepG2.2.15细胞。在一些实施方式中，所述肝细胞可以选自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌细胞系或分离的肝原代细胞，在一些实施方式中为Huh7肝癌细胞。
采用本公开提供的方法抑制特定基因在肝细胞中表达，所提供的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如，在一些实施方式中，所述寡核苷酸缀合物是siRNA缀合物，所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
在另一方面，本文提供了包含如上所述的缀合物的试剂盒。
在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包括含有缀合物的容器。在一些实施方式中，这里提供的试剂盒包含一个药学上可接受辅料的容器。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒进一步包括药学上可接受的辅料，比如稳定剂或防腐剂。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包含至少一个附加的治疗剂。在一些实施方式中，该试剂盒包含至少一个不同于本公开所述缀合物的容器中的附加治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将缀合物与药学上可接受的辅料(对于有辅料而言)或其它成分进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述缀合物和任选的药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述寡核苷酸缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，在本公开的试剂盒中提供无菌水。
有益效果
根据本公开的一个实施方式，当所述寡核苷酸为一种抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因表达的siRNA时，本公开提供的siRNA缀合物能够有效地将siRNA递送到肝脏，并表现出优异的抑制HBV基因表达的特性：在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中79.8％-82.4％的HBV基因表达。同时，本公开的siRNA缀合物还能够有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，在3mg/kg的剂量下可以达到91.0％的HBV表面抗原表达抑制率和86.3％的HBV DNA抑制率。
根据本公开的一个实施方式，当所述寡核苷酸为一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的siRNA时，本公开提供的siRNA缀合物能够有效地将siRNA递送到肝脏，并表现出优异的抑制HBV基因表达的特性：在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg单次给药的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中74％以上的HBV基因表达。同时，本公开的siRNA缀合物还能够有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，在3mg/kg的剂量下可以达到94.5％的HBV表面抗原表达抑制率和89.1％的HBV DNA抑制率。根据本公开的一个实施方式，当所述寡核苷酸为一种抑制血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的siRNA时，本公开提供的siRNA缀合物能够有效地将siRNA递送到肝脏，并表现出优异的抑制ANGPTL3基因表达的特性：在1mg/kg的剂量下抑制高脂模型小鼠肝脏中至少46.4％的ANGPTL3基因表达；3mg/kg剂量下，基因抑制率高达78.2％。根据本公开的一个实施方式，当所述寡核苷酸为一种抑制载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的siRNA时，本公开提供的siRNA缀合物能够有效地将siRNA递送到肝脏，并表现出优异的抑制APOC3基因表达的特性：在3mg/kg的剂量下抑制高脂模型小鼠肝脏中至少75.4％的APOC3基因表达。
在某些实施方式中，本公开所述的siRNA缀合物还表现出低的动物水平毒性和良好的安全性，例如，在一些实施方式中，对于本公开的缀合物，即使在C57BL/6J小鼠中给予高达起效浓度的100倍(按起效浓度3mg/kg计)，也未观察到明显的毒性反应。
上述实例说明，本公开提供的寡核苷酸缀合物能够有效地将功能性寡核苷酸递送到肝脏并在体内长时间保持活性，从而可有效治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况和疾病。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
实施例
以下将通过实施例对本公开进行详细描述。除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照MolecularCloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。
HEK239A细胞由北京大学分子医学研究所核酸技术实验室提供，用含由20％胎牛血清(FBS，Hyclone)的DMEM完全培养基(Hyclone)、0.2v％蓝莓素双抗(青霉素-链霉素，Gibco，Invitrogen)培养。于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
Huh7细胞购自ATCC，用含有10％的胎牛血清(FBS，Hyclone)的DMEM完全培养基(Hyclone)、1％非必需氨基酸(NEAA，Corning)，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
若无其它说明，用以下制备例6-制备例8中合成的siRNA缀合物转染细胞时，使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
若无其它说明，所使用的动物模型如下：
C57BL/6J小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限公司；
HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J：购自北京大学医学部实验动物科学部。于实验前选择S/CoV＞10的小鼠；
AAV-HBV转基因小鼠：按照文献方法(董小岩等，Chin J Biotech 2010,May 25；26(5):679-686)制备AAV-HBV模型。将rAAV8-1.3HBV，D型(ayw)病毒(购于北京五加和分子医学研究所有限公司，1×1012viral genome(v.g.)/mL，批号2016123011)用无菌PBS稀释至5×1011v.g./mL，每只小鼠注射200μL稀释后的rAAV8-1.3HBV，(即每只小鼠注射1×1010v.g).。病毒注射后第28天，所有小鼠通过眼眶采血(约100μL)用于收集血清检测HBsAg和HBV DNA；
低浓度AAV-HBV转基因小鼠：采用与上述基本相同的造模方法，区别之处在于，病毒在实验前用无菌PBS稀释至1×1011v.g./mL，每只小鼠注射100μL病毒，即每只小鼠注射1×1010v.g.；
BALB/c小鼠：6-8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；
人APOC3转基因小鼠：B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于Jackson Lab；
制备例1J-5缀合分子(缀合分子1)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子1的化合物(以下，也称为J-5缀合分子)。
(1-1)缀合末端段GAL-5的合成(J-5缀合分子的末端分子)
(1-1a)GAL-2的合成
将100.0g GAL-1(N-乙酰-D-半乳糖胺盐酸盐，CAS号：1772-03-8，购自宁波弘翔生化公司，463.8mmol)溶于1000ml无水吡啶，冰水浴下加入540ml乙酸酐(购自Enox公司，5565.6mmol)，室温搅拌反应1.5小时。将反应液倒入10L冰水中，减压抽滤，滤饼用2L冰水洗涤后，加乙腈/甲苯混合溶剂(体积比乙腈:甲苯＝1:1)至完全溶解，蒸干溶剂，得到白色固体产品GAL-2 130.0g。
(1-1b)GAL-3的合成
将步骤(1-1a)中获得的GAL-2(35.1g，90.0mmol)溶解于213ml无水1,2-二氯乙烷中，在冰水浴且氮气保护条件下，加入24.0g TMSOTf(CAS号：27607-77-8，购自麦克林公司，108.0mmol)，室温反应过夜。
在反应液中加入400ml二氯甲烷稀释，以硅藻土过滤，再加入1L饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌均匀，分出有机相，水相用二氯乙烷萃取两次，每次300ml，合并有机相，分别用300ml饱和碳酸氢钠水溶液和300ml饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到浅黄色粘稠糖稀状产品GAL-3 26.9g。
(1-1c)GAL-4的合成
将步骤(1-1b)中获得的GAL-3(26.9g，81.7mmol)溶于136ml无水1,2-二氯乙烷中，加入干燥的分子筛粉末30g，再加入9.0g 5-己烯-1-醇(CAS号：821-41-0，购自Adamas-beta公司，89.9mmol)，室温下搅拌30分钟，冰浴和氮气保护下加入9.08g TMSOTf(40.9mmol)，室温下搅拌反应过夜。过滤除去/>分子筛粉末，滤液中加入300ml二氯乙烷稀释，以硅藻土过滤，再加入500ml饱和碳酸氢钠水溶液搅拌10分钟洗涤，分出有机相，水相用300ml二氯乙烷萃取一次，合并有机相并分别用300ml饱和碳酸氢钠水溶液和300ml饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到黄色糖稀状产品GAL-441.3g，不进行纯化直接进行下一步氧化反应。
(1-1d)GAL-5的合成
将按照步骤(1-1c)中描述的方法得到的GAL-4(14.9g，34.7mmol)溶于77ml二氯甲烷和77ml乙腈的混合溶剂中，分别加入103ml去离子水和29.7g高碘酸钠(CAS号：7790-28-5，购自阿拉丁公司，138.8mmol)，冰水浴下搅拌10分钟，加入三氯化钌(CAS号：14898-67-0，购自安耐吉公司，238mg，1.145mmol)，室温反应过夜。反应液加入300ml水稀释搅拌，加饱和碳酸氢钠调pH约为7.5，分出并弃去有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，弃去有机相。水相用柠檬酸固体调节pH约为3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到白色泡沫状固体产品GAL-5 6.5g。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.01(br,1H),7.83(d,J＝9.2Hz,1H),5.21(d,J＝3.2Hz,1H),4.96(dd,J＝11.2,3.2Hz,1H),4.49(d,J＝8.4Hz,1H),4.07–3.95(m,3H),3.92–3.85(m,1H),3.74–3.67(m,1H),3.48–3.39(m,1H),2.20(t,J＝6.8Hz,2H),2.11(s,3H),2.00(s,3H),1.90(s,3H),1.77(s,3H),1.55–1.45(m,4H).
以下，使用按照上述方法得到的GAL-5，通过以下工艺路线合成了J-5缀合分子：
将DMTrCl(4,4'-双甲氧基三苯甲基氯，38.12g，112.5mmol)溶于450ml无水吡啶中，加入DL-甘油酸钙水合物(12.88g，45.0mmol)，在45℃下反应22h，将反应液过滤，滤饼用200ml的二氯甲烷淋洗，滤液减压浓缩至干，剩余物用500ml二氯甲烷重新溶解，0.5M三乙胺磷酸盐(pH＝7-8)洗涤2次，每次200ml，水相以二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，200-300目正相硅胶柱纯化，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.35-1:1:1:0.55梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，用500ml二氯甲烷重新溶解，以200ml 0.5M三乙胺磷酸盐洗涤1次，水相用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，真空油泵抽滤至干过夜，得到白色固体产品A-1 20.7g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(ddd,J＝6.5,2.3,1.1Hz,1H),7.40–7.28(m,7H),6.89–6.81(m,4H),4.84(d,J＝5.0Hz,1H),4.36–4.24(m,1H),4.29(s,6H),3.92(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.67(dd,J＝12.3,7.0Hz,1H),2.52(q,J＝6.3Hz,6H),1.03(t,J＝6.3Hz,9H).MS m/z：C24H23O6，[M-H]-，理论：407.15，实测：406.92。
(1-2b)J-1的合成：
将步骤(1-2a)得到的A-1(3.0g，6.0mmol)溶于60ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(6.2g，12.0mmol)、1-羟基苯并三唑(1.6g，12.0mmol)、N,N-二异丙基乙胺(3.9g，30.0mmol)，溶解均一后搅拌10分钟，随后将J-0(5.6g，30.0mmol，商购自阿法埃莎公司)加入反应液，室温下搅拌反应2小时。将反应液倒入30mL饱和氯化钠溶液中洗涤，用二氯甲烷萃取3次，每次20ml，合并有机相无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇:氨水＝10:2:0.1～4:4:1洗脱，收集产品点浓缩，油泵拉干发泡，得到白色固体产品J-1 2.2g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02(s,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,2H),7.34–7.17(m,7H),6.87(d,J＝8.6Hz,4H),4.05(d,J＝5.2Hz,1H),3.74(s,6H),3.20–3.01(m,5H),2.60–2.38(m,12H),1.60–1.39(m,8H),1.24(s,1H).MS m/z：C33H47N4O5，[M+H]+，理论：579.35，实测：579.26。
(1-3)J-2的合成：
将A-3(芴甲氧羰酰基-6-氨基己酸，2.0g，5.7mmol，商购自阿法埃莎公司)溶于20ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(3.2g，6.2mmol)、1-羟基苯并三唑(837mg，6.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.35g，18.2mmol)，溶解均一后搅拌30分钟，随后加入步骤(1-2)得到的J-1 2.2g，室温下搅拌反应6小时。将反应液倒入10mL饱和碳酸氢钠溶液中洗涤，二氯甲烷萃取3次，每次10ml，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇:石油醚:乙酸乙酯＝1:0.3:1:1洗脱，得到白色固体产品J-2 3.1g。MS m/z：C96H112N8O14，[M+H]+，理论：1600.83，实测：1598.46。
(1-4)J-3的合成：
将步骤(1-2)得到的J-2(1.6g，1.0mmol)溶于6ml二氯甲烷，搅拌下加入哌啶(2.6g，30.0mmol)，室温搅拌40分钟反应完全。反应液中加入4mL甲苯带蒸浓缩除去溶剂。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇:氨水＝1:1:0～1:1:0.5洗脱，得到白色固体产品J-3 690mg。多氨类化合物，质谱难出信号，LC-MS无明显产物峰。
(1-5)J-4的合成：
将步骤(1-1d)得到的GAL-5(644mg，1.44mmol)溶于4ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(479mg，1.60mmol)和N,N-二异丙基乙胺(413mg，3.20mmol)，溶解均一后搅拌30分钟，随后加入J-3(367mg，0.40mmol)，室温下搅拌反应22小时。将反应液倒入3mL饱和碳酸氢钠溶液中洗涤，用二氯甲烷萃取3次，每次2ml，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝20:1洗脱，收集产品点浓缩得到褐色固体产品J-4 756mg。MS m/z：C87H143N10O36，[M-DMTr+H]+(质谱打掉DMTr基团)，理论：1903.97，实测：1904.32。
(1-6)J-5的合成：
将步骤(1-5)得到的J-4(441mg，0.2mmol)溶于2ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解丁二酸酐(40mg，0.4mmol)、DMAP(49mg，0.4mmol)、N,N-二异丙基乙胺(129mg，1.0mmol)，室温搅拌反应23小时。反应液用10ml二氯甲烷稀释后，用0.5M三乙胺磷酸盐溶液洗涤3次，每次3ml，合并水相并用5ml二氯甲烷萃取，合并有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩。用硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇:氨水＝40:4:1洗脱，收集产品浓缩得到浅褐色固体产品J-5 429mg。MS m/z：C91H147N10O39，[M-DMTr+H]+，理论：2005.21，实测：2005.18。
制备例2T-2缀合分子(缀合分子2)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子2(以下，也称为T-2缀合分子)：
(2-1)GAL5-C2-1的合成
向200ml二氯甲烷中加入按照上述(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(10.90g，24.36mmol，由两批次产物合并而得)、甘氨基酸叔丁酯盐酸盐(3.88g，23.14mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(14.45g，27.77mmol)和二异丙基乙胺(8.97g，69.42mmol)，溶解均一后室温搅拌反应4小时。向反应液中加入200ml饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次，每次100ml，合并有机相，用200ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂并用油泵抽滤至干得到18.4g油状物粗品GAL5-C2-1，直接进行下一步反应。
(2-2)GAL5-C2-2的合成
将步骤(2-1)中获得的GAL5-C2-1粗品(18.4g，25.35mmol)溶于139ml甲酸中，室温搅拌反应8小时。蒸发溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝20:1-5:1梯度洗脱)，收集反应洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物GAL5-C2-2共8.6g。MS m/z：C21H33N2O12，[M+H]+，理论：505.20，实测：505.42。
(2-3)T-1的合成：
将步骤(2-1)得到的GAL5-C2-2(999mg，1.98mmol)溶于6ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(718mg，2.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(620mg，4.8mmol)，溶解均一后搅拌30分钟，随后加入步骤(1-2b)得到的J-1(348mg，0.60mmol)，室温搅拌反应21小时。将反应液倒入5mL饱和碳酸氢钠溶液中洗涤，用二氯甲烷萃取3次，每次2ml，合并有机相并用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝20:1洗脱，收集产品浓缩得到白色固体产品T-1 487mg。MS m/z：C75H119N10O36，[M-DMTr+H]+(质谱打掉DMTr基团)，理论：1735.78，实测：1736.54。
(2-4)T-2的合成：
将步骤(2-3)得到的T-1(487mg，0.24mmol)溶于2.4ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解丁二酸酐(48mg，0.48mmol)、DMAP(59mg，0.48mmol)、N,N-二异丙基乙胺(155mg，1.20mmol)，室温搅拌反应16.5小时。反应液用10ml二氯甲烷稀释后，0.5M三乙胺磷酸盐溶液洗涤3次，每次3ml，合并水相用5ml二氯甲烷萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝8:1洗脱，收集产品浓缩得到白色固体产品T-2 191mg。MS m/z：C79H123N10O39，[M-DMTr+H]+，理论：1835.79，实测：1835.59。
制备例3 U-2缀合分子(缀合分子3)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子3(以下，也称为U-2缀合分子)
(3-1)GAL-C7-1的合成
将步骤(1-1b)中描述的方法得到的GAL-3(26.4g，80.2mmol)溶于134ml无水1,2-二氯乙烷中，加入分子筛粉末60g，再加入7-辛烯-1-醇(11.3g，88.2mmol)，室温下搅拌反应10分钟，冰浴和氮气保护下加入三氟甲基磺酸三甲基硅酯(8.9g，40.1mmol)，室温搅拌反应24小时。300ml二氯甲烷稀释反应液，过滤除去/>分子筛粉末，滤液中加入500ml饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，分液漏斗分出有机相，水相用100ml二氯甲烷萃取一次，合并有机相并分别用250ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机相，用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂并用油泵抽滤至干得到黄色糖稀状产品GAL-C7-1 33.3g，不进行纯化直接进行下一步氧化反应。
(3-2)GAL-C7-2的合成
将按照步骤(3-1)中描述的方法得到的GAL-C7-1(33.3g，72.8mmol)溶于160ml二氯甲烷和160ml乙腈的混合溶剂中，加入216ml水和高碘酸钠固体(62.3g，291.2mmol)，冰水浴下搅拌10分钟，加入催化剂三氯化钌(498mg，2.4mmol)升至室温搅拌反应23小时。反应液加入200ml水稀释搅拌，加饱和碳酸氢钠调节pH值为7.5，分掉有机相，水相再用二氯甲烷萃取三次，弃去有机相，水相用柠檬酸固体调节pH约为3，用二氯甲烷萃取三次，每次200ml，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后柱层析(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱)纯化得到白色泡沫状固体产品GAL-C7-2 22.4g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(s,1H),6.05–5.94(m,2H),5.18(t,J＝7.0Hz,1H),4.52(q,J＝7.0Hz,1H),4.30(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.98(t,J＝7.0Hz,1H),3.85(dd,J＝12.4,6.9Hz,1H),3.35–3.23(m,1H),2.88(td,J＝12.3,3.1Hz,1H),2.69–2.58(m,1H),2.30–2.14(m,2H),2.13–1.95(m,13H),1.80(dddt,J＝13.7,12.5,9.5,1.2Hz,1H),1.52(dt,J＝12.2,9.2Hz,1H),1.41–1.24(m,1H),1.28–1.14(m,1H).MS m/z：C21H32NO11，[M+H]+，理论：476.50，实测：475.94。
(3-3)U-1的合成：
将步骤(3-2)得到的GAL-C7-2(1084mg，2.28mmol)溶于7ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(826mg，2.76mmol)和N,N-二异丙基乙胺(713mg，5.52mmol)，溶解均一后搅拌30分钟，随后加入步骤(1-2b)得到的J-1(400mg，0.69mmol)，室温搅拌反应2.5小时。将反应液倒入5mL饱和碳酸氢钠溶液中洗涤，二氯甲烷萃取3次，每次2ml，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。硅胶柱纯化，石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.1-1:1:1:0.5洗脱，收集产品点浓缩得到白色固体产品U-1 1.07g。MS m/z：C75H122N7O33，[M-DMTr+H]+，理论：1648.81，实测：1648.62。
(3-4)U-2的合成：
将步骤(3-3)得到的U-1(781mg，0.4mmol)溶于4ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解丁二酸酐(80mg，0.8mmol)、DMAP(98mg，0.8mmol)和N,N-二异丙基乙胺(258mg，2.0mmol)，室温搅拌反应23小时。反应液用10ml二氯甲烷稀释后，0.5M三乙胺磷酸盐溶液洗3ml*3，合并水相用5ml二氯甲烷反萃，合并有机相无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝10:1洗脱，收集产品浓缩得到白色固体产品U-2 496mg。MS m/z：C79H126N7O36，[M-DMTr+H]+，理论：1748.82，实测：1748.72。
制备例4 S-2缀合分子(缀合分子4)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子4(以下，也称为S-2缀合分子)。
(4-1)GAL5-C4-1的合成
向300ml二氯甲烷中加入按照上述(1-1)中描述的方法得到的GAL-5(13.43g，30.0mmol，由多批次产物合并而得)、4-氨基酸叔丁酯盐酸盐(5.87g，30.0mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(13.65g，36.0mmol)和二异丙基乙胺(11.63g，90.0mmol)，溶解均一后室温搅拌反应5小时。向反应液中加入300ml饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次，每次200ml，合并有机相，用200ml饱和食盐水洗涤一次，分出有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂并用油泵抽滤至干得到30.3g油状物粗品GAL5-C4-1，直接进行下一步反应。
(4-2)GAL5-C4-2的合成
将步骤(4-1)中获得的GAL5-C4-1粗品(30.3g，30mmol)溶于180ml甲酸中，室温搅拌反应16小时。蒸发溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱)，收集反应洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物GAL5-C4-2共14.84g。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.89(s,1H),7.46(s,1H),6.05–5.94(m,2H),5.25(t,J＝7.0 Hz,1H),4.53–4.35(m,2H),4.14(t,J＝7.0Hz,1H),3.81(dd,J＝12.1,6.8 Hz,1H),3.46(td,J＝12.1,3.3 Hz,1H),3.30(td,J＝12.4,3.0 Hz,1H),3.01(td,J＝12.1,2.8 Hz,1H),2.75(td,J＝12.4,3.0 Hz,1H),2.45–2.08(m,6H),2.07–1.95(m,12H),1.81–1.49(m,3H),1.35–1.20(m,1H).MS m/z：C23H35N2O12，[M-H]-，理论：531.22，实测：531.15。
(4-3)S-1的合成：
将步骤(4-2)得到的GAL5-C4-2(1390mg，2.61mmol)溶于8ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(945mg，3.16mmol)和N,N-二异丙基乙胺(817mg，6.32mmol)，溶解均一后搅拌30分钟，随后加入按照步骤(1-2b)中方法描述得到的J-1(460mg，0.79mmol)，室温搅拌反应5小时。将反应液倒入5mL饱和碳酸氢钠溶液中洗涤，二氯甲烷萃取3次，每次2ml，合并有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝10:1-8:1洗脱，收集产品浓缩得到白色固体产品S-1970mg。MS m/z：C81H131N10O36，[M-DMTr+H]+，理论：1819.87，实测：1819.89。
(4-4)S-2的合成：
将步骤(4-2)得到的S-1(724mg，0.34mmol)溶于3.4ml二氯甲烷，室温搅拌下溶解丁二酸酐(68mg，0.68mmol)、DMAP(83mg，0.68mmol)和N,N-二异丙基乙胺(220mg，1.70mmol)，室温搅拌反应17.5小时。反应液用10ml二氯甲烷稀释后，0.5M三乙胺磷酸盐溶液洗涤3次，每次3ml，合并水相用5ml二氯甲烷反萃，合并有机相无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱纯化，二氯甲烷:甲醇＝10:1-6:1洗脱，收集产品浓缩得到浅褐色固体产品S-2 430mg。MS m/z：C85H135N10O39，[M-DMTr+H]+，理论：1919.89，实测：1920.06。
制备例5 J6-siHBa1缀合物(缀合物1)的制备
本制备例中，以J-5缀合分子(缀合分子1)出发，按照以下方法制备了J6-siHBa1缀合物(以下，也称为缀合物1)
(5-1)J-6化合物的合成：
此步骤中，通过将J-5缀合分子连接至固相载体，制备了J-6化合物。
将步骤(1-6)中获得的J-5缀合分子(241mg，0.10mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，76mg，0.20mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA，74mg，0.57mmol)混合，溶于5ml乙腈，室温搅拌5分钟，加入氨甲基树脂(H2NResin，1.0g，100-200目，氨基载量400μmol/g，购自南开和成公司)至反应液中，25℃下进行摇床反应，转速220转/分钟，反应15h后过滤，滤饼以二氯甲烷淋洗2次，每次30ml，乙腈淋洗3次，每次30ml，30ml乙醚淋洗1次，真空油泵干燥2h，得到连接J-5的固相载体，随后再按照表5中示出的投料配比进行盖帽反应。
表5盖帽反应投料配比
原料 用量 规格 批号 生产厂家
Cap1 20ml —— —— ——
Cap2 2.3ml —— —— ——
DMAP 0.01g 分析纯 I1422139 Aladdin
乙腈 2.3ml 光谱纯 O15161001 上海星可
其中，Cap1和Cap2为盖帽试剂溶液，Cap1为20体积％N-甲基咪唑的吡啶/乙腈混合溶液，吡啶与乙腈的体积比为3:5；Cap2为20体积％乙酸酐的乙腈溶液；
将Cap1、Cap2、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和乙腈加入到上述连接J-5的固相载体中，25℃下开始摇床反应，转速200转/分钟，反应5h，反应液过滤，滤饼用乙腈淋洗3次，每次30ml，抽滤至干，真空油泵干燥过夜，得到J-6化合物(即，连接固相载体的J-5缀合分子)1.14g，载量82.0μmol/g。J-6化合物的结构如式(501)所示。
(5-2)合成J6-siHBa1缀合物正义链
本步骤中，siRNA缀合物的siRNA为编号为siHBa1的序列：
siHBa1
正义链：5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3'(SEQ ID NO:1)，
反义链：5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3'(SEQ ID NO:2)；
通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用上述步骤制备的J-6化合物起始循环，按照上述序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应。合成条件给定如下：核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
切割和脱保护条件如下：将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，脱除核糖上的2'-TBDMS保护。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
检测：使用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测，纯度为92.4％；采用液质联用(LC-MS)分析分子量，理论值7253.96，实测值7253.12。
从而，该步骤中将J-6缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端，得到J-6缀合分子缀合在siRNA3'末端的siRNA正义链S。
(5-3)合成反义链
本步骤中，利用通用固相载体(UnyLinkerTM loadedHL SolidSupports，Kinovate Life Sciences公司)，合成了J6-siHBa1缀合物的反义链AS。固相合成方法中的脱保护、偶联、盖帽、氧化反应条件，脱保护和切割，分离条件与合成正义链相同，得到siRNA反义链AS。
检测：纯度采用离子交换色谱(IEX-HPLC)进行检测，其结果，纯度93.2％；分子量采用液质联用(LC-MS)进行分析。理论值6675.04，实测值6674.50。
(5-4)合成J6-siHBa1缀合物
将S链与AS链以等摩尔比混合，溶于注射用水中并加热至95℃，室温冷却后，使它们通过氢键形成双链结构。
在上述合成完成后，用超纯水(Milli-Q超纯水仪自制，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将缀合物稀释至0.2mg/mL的浓度。利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-MassSpectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，理论值S：7253.96，AS：6675.04，实测值S：7253.24，AS：6674.61，实测值与理论值一致，从而确定所合成的缀合物是目标设计的带有D-6缀合分子的双链核酸序列。J6-siHBa1缀合物(缀合物1)的结构如式(401)所示。
制备例6缀合物2-21、26-27、29-91、96-97、99-127、132-133、135-151和156-157的siRNA缀合物的制备
采用与制备例6相同的方法制备题述各实施例的siRNA缀合物，不同的是：1)缀合的siRNA具有表6A-6D中所示的对应于缀合物2-21、26-27、29-91、96-97、99-127、132-133、135-151和156-157的序列；2)当目标序列中两个核苷酸之间为硫代磷酸酯连接时，用以下硫化反应步骤代替该两个核苷酸中后一个核苷酸的连接中的氧化反应步骤；每一步硫化反应的条件相同，包括温度为25℃，反应时间为300秒，硫化试剂为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为120:1。反应在乙腈:吡啶＝1:1的混合溶剂中进行；并且3)当目标序列中的全部核苷酸的2'-位均为修饰的羟基基团时，切割与脱保护条件中，不包括脱除核糖上的2'-TBDMS保护的步骤。从而，制备得到本公开的缀合物2-21、26-27、29-91、96-97、99-127、132-133、135-151和156-157的siRNA缀合物，按照表6A-6D对其分别进行编号。通过液质联用仪检测分子量，上述缀合物分子量实测值与理论值相符，它们的结构均如式(401)所示。
表6A siRNA缀合物
/>
表6B
/>
/>
/>
表6C
/>
/>
表6D
/>
*S：正义链；AS：反义链
注：大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；VP表示该字母VP右侧的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；P表示该字母P右侧的一个核苷酸为磷酸酯修饰的核苷酸；Ps表示该字母Ps右侧的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
其中，乙烯基磷酸酯修饰的2'-甲氧基修饰尿嘧啶核苷单体(VP-Um)按照以下方法合成：
(7-1)VP-U-2的合成
按照以下方法，合成了VP-U-2分子：
将2'-甲氧基修饰的尿嘧啶核苷酸(2'-OMe-U，51.30g，91.6mmol)，叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl，50.35g，183.2mmol)，咪唑(12.47g，183.2mmol)混合溶于450ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温下搅拌反应20h。蒸除DMF，用600ml二氯甲烷溶解后加300ml饱和碳酸氢钠洗涤，水相再用二氯甲烷(DCM)萃取3次，每次300ml，合并有机相，用5％草酸洗涤至水相pH<5，蒸发溶剂至干后获得VP-U-1粗品直接用于随后VP-U-2的合成。
将VP-U-1粗品用100ml二氯甲烷溶解后，外加冰浴搅拌10分钟，再加入预先在4℃冰箱冷藏好的450ml 2％对甲苯磺酸溶液(溶剂为体积比3:7的甲醇-二氯甲烷混合溶剂)，反应10分钟。再加入200ml饱和碳酸氢钠淬灭反应，有机相加入饱和碳酸氢钠水溶液洗涤至pH＝8。合并水相，用二氯甲烷萃取2次，每次200ml，合并有机相，再用200ml饱和食盐水洗涤一次，蒸发溶剂至干。200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-2共40.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.79(d,J＝4.7Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.94(t,J＝7.0Hz,1H),4.12(td,J＝4.6,3.9Hz,1H),4.05(dd,J＝4.8,4.0Hz,1H),3.96(t,J＝4.7Hz,1H),3.68(ddd,J＝11.8,7.0,4.6Hz,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(s,3H),1.05(s,8H).MS m/z：C26H33N2O6Si，[M+H]+，理论：497.21，实测：497.45。
(7-2)VP-U-4的合成：
将VP-U-2(19.84g，40.0mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，16.48g，80.0mmol)，吡啶(4.20g，53.2mmol)，三氟乙酸(6.61g，53.2mmol)混合溶于200ml二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应20h。另取亚甲基二磷酸四乙酯(21.44g，74.4mmol)溶于120ml THF，冰浴降温，在冰浴温度下加入t-BuOK(11.36g，101.2mmol)，先在冰浴温度下反应10min，再升至室温反应0.5h，然后加入至前述反应液中，约1h加完，冰浴温度下反应1h，再升至室温反应18h。加水淬灭反应，水相以二氯甲烷提取3次，每次200ml。合并有机相，用200ml饱和食盐水水洗一次后蒸发溶剂至干。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1-1:4梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-4共14.00g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(dtd,J＝5.1,4.0,2.2Hz,4H),7.41–7.30(m,6H),6.82–6.71(m,2H),5.90(ddd,J＝25.9,15.0,1.0Hz,1H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),4.36–4.21(m,3H),4.18(t,J＝4.9Hz,1H),4.05(ddq,J＝9.7,8.5,6.9Hz,2H),3.87(t,J＝4.8Hz,1H),3.39(s,3H),1.32(td,J＝6.9,0.7Hz,6H),1.05(s,8H).MS m/z：C31H42N2O8PSi，[M+H]+，理论：629.24，实测：629.51。
(7-3)VP-U-5的合成：
将VP-U-4(14.00g，22.29mmol)溶于100ml四氢呋喃，加入三乙胺三氢氟酸(17.96g，111.45mmol)，室温搅拌20h反应完全。直接蒸发溶剂至干，再用二氯甲烷溶解随后蒸干2次，每次使用50ml二氯甲烷，得到粗品。用200-300目正相硅胶柱纯化，石油醚装柱，以石油醚:乙酸乙酯:二氯甲烷:甲醇＝1:1:1:0.05-1:1:1:0.25梯度洗脱，收集产物洗脱液，减压蒸干溶剂，真空油泵发泡干燥得到纯品VP-U-5共6.70g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.96(d,J＝7.8Hz,1H),6.77(dd,J＝15.0,6.2Hz,1H),5.99–5.82(m,2H),5.73(d,J＝7.6Hz,1H),5.27(d,J＝5.1Hz,1H),5.10(dd,J＝5.3,4.7Hz,1H),4.29(ddq,J＝9.8,8.6,7.0Hz,2H),4.17(ddd,J＝6.2,5.2,1.0Hz,1H),4.12–3.98(m,3H),3.39(s,2H),1.32(td,J＝6.9,0.6Hz,6H).MS m/z：C15H24N2O8P，[M+H]+，理论：391.13，实测：391.38。
(7-4)VP-U-6的合成：
在氩气保护条件下向10ml无水二氯甲烷中加入VP-U-5(391mg，1.0mmol)、三氟乙酸吡啶盐(0.232g，1.2mmol)、N-甲基咪唑(0.099g，1.2mmol)，双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.452g，1.5mmol)，室温搅拌反应5小时。蒸除溶剂至干，柱层析纯化(200-300目正相硅胶，二氯甲烷:乙腈(含0.5wt％三乙胺)＝3:1-1:3梯度洗脱)，收集产物洗脱液，浓缩除去溶剂，得到目标产物VP-U-6共508mg。31P NMR(161MHz,DMSO-d6)δ150.34,150.29,17.07,15.50.MS m/z：C24H41N4O9P2，[M+H]+，理论：591.23，实测：591.55。表明VP-U-6是目标产物VP-Um，作为核苷单体参与RNA链合成。
使用如下方法将5'-磷酸酯修饰连接至反义链5'端：
原料为具有如下式CPR-I结构的磷酸化结构单体，由苏州吉玛提供，货号Cat#13-2601-XX：
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在反义链全部核苷单体连接完毕后，按照亚磷酰胺核酸固相合成的方法，经脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应将CPR-I单体连接至反义链5'末端。随后按照如下条件进行切割与脱保护，获得反义链：
将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16h，除去液体，真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，用0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，脱除核糖上的2'-TBDMS保护。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25，以去离子水洗脱。
对于目标产物具有5'-硫代磷酸酯修饰的情况，使用与上述同样的步骤，区别在于在连接时，以硫化反应条件代替上述氧化反应条件，进行硫化反应。
对于上述合成的正义链和反义链，使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测纯度，并以液质联用色谱(LC-MS)分析分子量，确认所合成的核酸序列是对应于表6A-6D中各缀合物与对比缀合物的siRNA。
制备例7缀合物22-24、91-93、126-128和149-151的siRNA缀合物的合成
采用与制备例6中相同的方法制备缀合物22-24、91-93、126-128和149-151的siRNA缀合物，不同之处在于：1)以上述制备例2-4获得的缀合物2-4的缀合分子代替J-6缀合分子(例如，以缀合物2的T-2缀合分子代替J-6缀合分子时，获得的是缀合物22、91、126和149的T3缀合物，以缀合物3的U-2缀合分子代替J-6缀合分子时，获得的是缀合物23、92、127和150的U3缀合物，以此类推)；2)缀合的siRNA具有表6A-6D中所示的对应于缀合物22-24、91-93、126-128和149-151的序列；3)当目标序列中两个核苷酸之间为硫代磷酸酯连接时，用制备例5中描述的硫化反应步骤代替该两个核苷酸中后一个核苷酸的连接中的氧化反应步骤；并且4)当目标序列中的全部核苷酸的2'-位均为修饰的羟基基团时，切割与脱保护条件中，不包括脱除核糖上的2'-TBDMS保护的步骤。从而，制备得到本公开的缀合物22-24、91-93、126-128和149-151的siRNA缀合物，按照表6A-6D对其分别进行编号。随后，通过液质联用仪分别检测单链及双链的分子量，实测值与理论值相符，确认所合成的各缀合物siRNA缀合物结构分别如式(402)、(403)、(404)所示。
实验例1本实验说明本公开的siRNA缀合物的动物水平毒性。
在C57BL/6J小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)上，分别向每只小鼠皮下单次给予300mg/kg(以siRNA计)的缀合物15-26、78、120和147的siRNA缀合物，连续观察14天，未出现动物死亡，也未观察到与药物不良反应相关的临床症状，大体解剖未发现异常。从而，上述结果表明本公开的siRNA缀合物具有较低的动物水平毒性。
以下实验例2-实验例5中，按照siRNA靶点位置和序列关联性，对表6A-表6D的siRNA缀合物的性质和效果分别进行实验验证。
实验例2表6A的siRNA缀合物的效果实验
实验例2-1本实验说明表6A的siRNA缀合物在体外(in vitro)对HBV mRNA表达量的抑制效率。
用缀合物1-2、7-9、15-16、18-26的siRNA缀合物体外转染HepG2.2.15细胞，siRNA终浓度分别为50nM、10nM、1nM。每个浓度3个复孔，至少重复3次实验。转染48小时后，采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent qPCR)测定以上收获的细胞中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，货号Cat.74106)试剂盒，按其说明书进行总RNA的提取，并将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR法检测siRNA对HepG2.2.15细胞的HBV mRNA表达的抑制效率。
在该荧光定量PCR法中，以GAPDH基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对GAPDH的引物分别对HBV和GAPDH进行检测，引物序列如表7A所示：
表7A检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组GAPDH的拷贝数)/(mock组HBV基因的拷贝数/mock组GAPDH的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算siRNA对mRNA的抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，各测试组为分别经表6A中所列的siRNA缀合物处理的HepG2.2.15细胞，mock组为未经任何siRNA处理的HepG2.2.15细胞。
以下表8A示出了表6A中所列的siRNA缀合物与对比缀合物在HepG2.2.15细胞中对HBV mRNA表达抑制活性的检测结果。
表8A siRNA缀合物体外活性测试
从表8A的结果可以看出，表6A中的各个siRNA缀合物在细胞水平上均显示出了优异的HBV基因表达抑制活性。
实验例2-2本实验说明表6A的siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性
将缀合物7-8和15-19的siRNA缀合物(均为0.9％NS溶液，siRNA浓度均为20μM，12μl)分别与108μL 90％人血浆(Human plasma，PBS稀释)混匀。37℃恒温孵育。分别在0、8、24、48小时取出10μL样本，立即进行液氮速冻于-80℃冰箱中冻存。待各时间点取样完毕后，1×PBS(pH7.4)稀释5倍后每一样品取10μL；同时，取等摩尔量的siRNA缀合物(siRNA浓度为2μM，2μl)，与8μl1×PBS(pH7.4)混匀，制备成10μL未经人血浆处理的样品，记为“未处理”。配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成像，结果如表9A所示。
表9A示出了表6A中所列的测试siRNA缀合物与对照siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性半定量检测结果。该结果以测试siRNA缀合物和对照siRNA缀合物与人血浆孵育后残留的最长片段与未经处理的siRNA最长片段的比例(ratio of the longest fragments，RL)表示。
表9A siRNA缀合物的血浆稳定性定量结果
/>
由表9A的结果可以看出，各个siRNA缀合物在血浆中均具有优异的稳定性。
实验例2-3本实验说明表6A的siRNA缀合物在体内(in vivo)对HBV mRNA表达量的抑制效率
在本实验例中，对实施例7-8、15-16和25-26的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中对HBV mRNA表达量的抑制效率进行了考察。
本实验例中所使用的HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J购自北京大学医学部实验动物科学部。
首先，将C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量随机分组(均为雌性)，每组5只小鼠，按照表6A中的siRNA缀合物进行编号，并增加PBS对照组。所有动物根据体重计算药量，单次给药(采用皮下给药)，给药剂量为1mg/kg，体积为5ml/kg。给药后第14天将动物处死，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表10A。
表10A检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组HBV基因的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算mRNA抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于以下表11A中。
表11A siRNA缀合物在小鼠肝脏中HBV mRNA表达的抑制
由上述结果可见，一方面，本公开各个实施例的缀合物均显示出了高的小鼠体内HBV mRNA抑制活性，这说明本公开的siRNA缀合物具有良好的体内递送效率。
实验例2-4本实验说明表6A的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠中siRNA对血清HBsAg表达量和HBV DNA的抑制效率的时间相关性测试
按照文献方法(董小岩等，Chin J Biotech 2010,May 25；26(5):679-686)制备AAV-HBV模型，rAAV8-1.3HBV，D型(ayw)，购于北京五加和分子医学研究所有限公司，1×1012viral genome(v.g.)/mL，批号2016123011。实验前用无菌PBS稀释至5×1011v.g./mL。每只小鼠注射200μL，即每只小鼠注射1×1011v.g.。病毒注射后第28天，所有小鼠通过眼眶采血(约100μL)用于收集血清检测HBsAg和HBV DNA。动物造模成功后，按血清HBsAg含量随机分组(每组5只)，分别给予实施例7-8、15-16、18和25的siRNA缀合物，以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，给药剂量为3mg/kg，体积为5ml/kg。在给药前与给药后第7、14、21、28、56、84、112、140天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清HBsAg水平。
眼眶取血每次约100μl，离心后血清不少于20μl。利用HBsAg CLIA试剂盒(安图生物，CL0310)检测血清中HBsAg的表达水平；参照QIAamp 96DNA Blood Kit说明书提取血清中DNA，进行定量PCR，检测HBV DNA的表达水平。
HBsAg抑制率按如下等式计算：
HBsAg抑制率＝(1-给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少当量(UI)HBsAg表示。
HBV DNA抑制率按如下等式计算：
HBV DNA抑制率＝(1-给药后HBV DNA含量/给药前HBV DNA含量)×100％。
其中，HBV DNA含量用每毫升(ml)血清含多少拷贝HBV DNA表示。
结果如以下表12A和表13A所示。
表12A siRNA缀合物在小鼠血清中HBsAg表达的抑制
由表12A的结果可以看出，在给药后不同时间点，PBS阴性对照组未显示出任何抑制作用；与之相比，各实施例的siRNA缀合物在给药后不同时间点对HBsAg均体现出了优异的HBsAg抑制效果。特别是缀合物15和25的siRNA缀合物在长达140天的时间内持续显示出高的血清HBsAg抑制率，表明其能够在较长时间内稳定高效地抑制HBV基因的表达。
表13A siRNA缀合物在小鼠血清中HBV DNA表达的抑制
由表13A的结果可以看出，各实施例的siRNA缀合物同样显示出高效的HBV DNA表达抑制，并且在长达84天的时间内均保持了较高的抑制率。
实验例3表6B的siRNA缀合物的效果实验
实验例3-1本实验说明表6B的siRNA缀合物在体外(in vitro)对HBV mRNA表达量的抑制效率。
用实施例48-51、76-87的siRNA缀合物体外转染HepG2.2.15细胞，siRNA终浓度分别为50nM、10nM、1nM。每个浓度3个复孔，至少重复3次实验。转染48小时后，采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent qPCR)测定以上收获的细胞中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，货号Cat.74106)试剂盒，按其说明书进行总RNA的提取，并将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR法检测siRNA对HepG2.2.15细胞的HBV mRNA表达的抑制效率。
在该荧光定量PCR法中，以GAPDH基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对GAPDH的引物分别对HBV和GAPDH进行检测，引物序列如表7B所示：
表7B检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组GAPDH的拷贝数)/(mock组HBV基因的拷贝数/mock组GAPDH的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算siRNA对mRNA的抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，各测试组为分别经表6B中所列的siRNA缀合物处理的HepG2.2.15细胞；mock组为未经任何siRNA处理的HepG2.2.15细胞。
以下表8B示出了表6B中所列的测试siRNA缀合物在HepG2.2.15细胞中对HBV mRNA表达抑制活性的检测结果。
表8B siRNA缀合物体外活性测试
从表8B的结果可以看出，表6B中的各个siRNA缀合物在细胞水平上均显示出了优异的HBV基因表达抑制活性。
实验例3-2本实验说明表6B的siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性
将缀合物48-53、78-83的siRNA缀合物(siRNA浓度均为20μM，12μl)分别与108μL90％人血浆(Human plasma，PBS稀释)混匀。37℃恒温孵育。分别在0、8、24、48小时取出10μL样本，立即进行液氮速冻于-80℃冰箱中冻存。待各时间点取样完毕后，1×PBS(pH7.4)稀释5倍后每一样品取10μL，配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成像，结果如表9B所示。
表9B示出了表6B中所列的siRNA缀合物与对比缀合物在体外人血浆中的稳定性半定量检测结果。该结果以实施例siRNA缀合物和对比例siRNA缀合物与人血浆孵育后残留的最长片段与未经处理的siRNA最长片段的比例(RL)表示。
表9B siRNA缀合物的血浆稳定性定量结果
由表9B的结果可以看出，各个siRNA缀合物在血浆中均具有优异的稳定性。
实验例3-3本实验说明表6B的siRNA缀合物在体内(in vivo)对HBV mRNA表达量的抑制效率
在本实验例中，对缀合物48-49、52-53、78-83的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中对HBV mRNA表达量的抑制效率进行了考察。
本实验例中所使用的HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J购自北京大学医学部实验动物科学部。
首先，将C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J小鼠按血清HbsAg含量随机分组(均为雌性)，每组5只小鼠，按照表6B中的siRNA缀合物进行编号，并增加PBS对照组。所有动物根据体重计算药量，单次给药(采用皮下给药)，给药剂量为1mg/kg，体积为5ml/kg。给药后第14天将动物处死，收集肝脏，用RNAlater(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对HBV和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表10B。
表10B检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组HBV基因的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算mRNA抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于以下表11B中。
表11B siRNA缀合物在小鼠肝脏中HBV mRNA表达的抑制
由上述结果可见，一方面，本公开各个实施例的缀合物均显示出了高的小鼠体内HBV mRNA抑制活性，这说明本公开的siRNA缀合物具有良好的体内递送效率。
实验例3-4本实验说明表6B的siRNA缀合物在HBV转基因小鼠中siRNA对血清HBsAg表达量和HBV DNA的抑制效率的时间相关性测试
按照文献方法(董小岩等，Chin J Biotech 2010,May 25；26(5):679-686)制备AAV-HBV模型，rAAV8-1.3HBV，D型(ayw)，购于北京五加和分子医学研究所有限公司，1×1012viral genome(v.g.)/mL，批号2016123011。实验前用无菌PBS稀释至5×1011v.g./mL。每只小鼠注射200μL，即每只小鼠注射1×1011v.g.。病毒注射后第28天，所有小鼠通过眼眶采血(约100μL)用于收集血清检测HBsAg和HBV DNA。动物造模成功后，按血清HBsAg含量随机分组(每组5只)，分别给予缀合物82、83和94的siRNA缀合物，以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，皮下单次给药，给药剂量为3mg/kg，体积为5ml/kg。在给药前与给药后第7、14、21、28、56、84天对小鼠眼眶静脉丛取血，在各时间点检测血清HBsAg水平。
眼眶取血每次约100μl，离心后血清不少于20μl。利用HBsAg CLIA试剂盒(安图生物，CL0310)检测血清中HBsAg的表达水平；参照QIAamp 96DNA Blood Kit说明书提取血清中DNA，进行定量PCR，检测HBV DNA的表达水平。
HBsAg抑制率按如下等式计算：
HBsAg抑制率＝(1-给药后HBsAg含量/给药前HBsAg含量)×100％。其中，HBsAg含量用每毫升(ml)血清含多少当量(UI)HBsAg表示。
HBV DNA抑制率按如下等式计算：
HBV DNA抑制率＝(1-给药后HBV DNA含量/给药前HBV DNA含量)×100％。
其中，HBV DNA含量用每毫升(ml)血清含多少拷贝HBV DNA表示。
结果如以下表12B和表13B所示。
表12B siRNA缀合物在小鼠血清中HBsAg表达的抑制
由表12B的结果可以看出，在给药后不同时间点，PBS阴性对照组未显示出任何抑制作用；与之相比，各缀合物的siRNA缀合物在给药后不同时间点对HBsAg均体现出了优异的HBsAg抑制效果。
表13B siRNA缀合物在小鼠血清中HBV DNA表达的抑制
由表13B可以看出，与HBsAg抑制效果类似地，各实施例的siRNA缀合物同样显示出高效的HBV DNA表达抑制，并且在长达84天的时间内抑制率保持基本稳定。
实验例4表6C的siRNA缀合物的效果试验
实验例4-1本实验说明表6C的siRNA缀合物在体外(in vitro)对ANGPTL3mRNA表达量的抑制效率。
用缀合物96-103、112-113和120-125的siRNA缀合物体外转染人类肝癌细胞株Huh7，siRNA缀合物终浓度(以siRNA的量计)分别为5nM、0.5nM、0.05nM，每个浓度3个复孔，至少重复3次试验。
具体地，将Huh7用含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基接种细胞于24孔板，接种密度为4×105细胞/孔，每孔0.5mL培养基，37℃培养过夜。
将24孔板中细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL Opti-MEM无血清培养基。分别将1.5μL浓度(以siRNA的量计)为0.02μM、0.2μM和2μM siRNA缀合物，用50μL Opti-MEM无血清培养基稀释；将1μL LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)稀释于50μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀后室温下孵育5分钟；混合稀释的siRNA缀合物和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温静置20分钟，以便允许转染复合物的形成。在接种有Huh7细胞的24孔板中按照每孔100μL加入上述最终混合溶液。siRNA缀合物的最终浓度为0.05nM、0.5nM、5nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了各siRNA缀合物的Huh7细胞中ANGPTL3mRNA的表达量。具体步骤为：培养转染的细胞24小时后，使用RNAVzol(Vigorous公司，货号N002)提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA按照反转录试剂盒(Promega公司，货号A3500)的使用方法反转录得到cDNA。使用2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0956)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行ANGPTL3mRNA的表达量的检测。其中，用于扩增ANGPTL3和作为内参基因的β-actin的PCR引物如表7C所示。
表7C检测引物的序列
siRNA对ANGPTL3mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(测试组ANGPTL3mRNA的表达量/测试组β-Actin mRNA的表达量)/(mock组ANGPTL3mRNA的表达量/mock组β-ActinmRNA的表达量)]×100％。其中，各测试组为分别经表6C中所列的siRNA缀合物处理的Huh7细胞，所述siRNA缀合物为缀合物98-133；mock组为未经任何siRNA缀合物处理的Huh7细胞。以下表8C中示出了表6C中所列的实施例siRNA缀合物与对比例siRNA缀合物在Huh7细胞中对ANGPTL3mRNA表达抑制活性的检测结果。
表8C siRNA缀合物体外活性测试
从表8C的结果可以看出，在各个浓度下，表6C中的各个siRNA缀合物在细胞水平上均显示出了优异的ANGPTL3mRNA表达抑制活性，5nM浓度下，siRNA缀合物抑制率达到60％以上，有些缀合物可达到70％以上的抑制率。
实验例4-2本实验说明表6C的siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性
将缀合物120-121的siRNA缀合物(以siRNA浓度计，20μM，12μl)分别与108μL 90％人血浆(Human plasma，PBS稀释)混匀。37℃恒温孵育。分别在0、8、24、48小时取出10μL样本，立即进行液氮速冻于-80℃冰箱中冻存。待各时间点取样完毕后，1×PBS(pH7.4)稀释5倍后每一样品取10μL，配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成相，结果如表9C所示。
表9C示出了表6C中所列的siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性半定量检测结果。该结果以实施例siRNA缀合物与人血浆孵育后残留的最长片段与未经处理的siRNA最长片段的比例(RL)表示。
表9C siRNA缀合物的血浆稳定性定量结果
由表9C的结果可以看出，本公开的siRNA缀合物在血浆中具有优异的稳定性，48小时内几乎不降解。
实验例4-3本实验说明表6C的siRNA缀合物在体内(in vivo)对ANGPTL3mRNA表达量的抑制效率
在本实验例中，考察缀合物116-117、120和130的siRNA缀合物在正常BALB/c小鼠体内对肝脏组织中ANGPTL3表达水平的抑制率。
将6-8周龄正常BALB/c小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分组，每组6只(雌雄各半)，分别向每组小鼠给予缀合物116-117、120和130的siRNA缀合物以及PBS。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg，给药体积为10mL/kg。给药后14天处死小鼠，收集肝脏，用RNAlater(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中ANGPTL3mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的ANGPTL3mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对ANGPTL3的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对ANGPTL3和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表10C。
表10C检测引物的序列
siRNA对ANGPTL3mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(测试组ANGPTL3mRNA的表达量/测试组β-Actin mRNA的表达量)/(对照组ANGPTL3mRNA的表达量/对照组β-Actin mRNA的表达量)]×100％。其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于以下表11C中。
表11C siRNA缀合物在小鼠肝脏中ANGPTL3mRNA表达的抑制
由表11C的结果可见，一方面，与PBS相比，本公开的缀合物116-117、120和130的siRNA缀合物均显示出极高的ANGPTL3mRNA的抑制活性，这表明本公开的siRNA缀合物具有良好的体内递送效率。
实验例4-4本实验说明表6C的siRNA缀合物在体内(in vivo)对ANGPTL3mRNA表达量的抑制效率及对血脂的影响
在本实验例中，考察缀合物116(J6-siAN1M1SP)及实施例120(J6-siAN1M3SP)的siRNA缀合物在ob/ob模型小鼠体内对肝脏组织中ANGPTL3表达水平的抑制率和对血清中总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-c)含量的影响。
将6-8周龄ob/ob雌性小鼠(购于常州卡文斯实验动物有限公司)随机分成5组，每组5只，分组如下：(1)PBS对照组；(2)缀合物116 3mg/kg组；(3)缀合物120 3mg/kg组；(4)缀合物116 1mg/kg组；(5)缀合物120 1mg/kg组。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，给药体积为10mL/kg。
分别于给药前2天(记为-2天)，及给药后第7、14、21、28、35、42、49天眼眶采血(约100μL)用于检测血脂水平。
第49天处死小鼠，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用与实验例4-3相同的方法，进行实时荧光定量PCR检测肝组织中ANGPTL3mRNA的表达水平。结果示于以下表12C中。
表12C siRNA缀合物对小鼠肝脏中ANGPTL3mRNA表达的抑制
将眼眶采集的血液进行离心得到血清，进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-c)的含量，血脂结果进行标准化处理，血脂水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。血脂指总胆固醇、甘油三酯或低密度脂蛋白。检测结果示于以下表13C、14C和15C中。表13C siRNA缀合物对小鼠血清中总胆固醇表达水平的影响
表14C siRNA缀合物对小鼠血清中甘油三酯表达水平的影响
表15C siRNA缀合物对小鼠血清中低密度脂蛋白表达水平的影响
由上述表13C、表14C和表15C的结果可见，不同剂量下的缀合物116和120的siRNA缀合物均能显著抑制小鼠肝脏组织中ANGPTL3的表达，且存在明显的剂量响应；缀合物116的siRNA缀合物(J6-siAN1M1SP)在1mg/kg的低剂量下，对ANGPTL3基因表达的抑制率为46.4％；在3mg/kg的高剂量下，对ANGPTL3基因表达的抑制率高达78.2％；同时对小鼠血清中CHO、TG和LDL-c的含量进行了监测，结果显示经缀合物116或120的siRNA缀合物治疗后的小鼠血清中的CHO、TG和LDL-c的含量明显下降，并且至少在49天时仍显示出较高的血脂降低效果。
实验例5表6D的siRNA缀合物的效果试验
实验例5-1本实验说明表6D的siRNA缀合物在体外(in vitro)对APOC3 mRNA表达量的抑制效率。
用缀合物131-132、143-148和152的siRNA缀合物体外转染人类肝癌细胞株Huh7，siRNA缀合物终浓度(以siRNA的量计)分别为5nM、0.5nM、0.05nM，每个浓度3个复孔，至少重复3次试验。
具体地，将Huh7用含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基接种细胞于24孔板，接种密度为4×105细胞/孔，每孔0.5mL培养基，37℃培养过夜。
将24孔板中细胞培养液吸弃，每孔加入0.5mL Opti-MEM无血清培养基。分别将1.5μL浓度(以siRNA的量计)为0.02μM、0.2μM和2μM siRNA缀合物，用50μL Opti-MEM无血清培养基稀释；将1μL LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)稀释于50μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀后室温下孵育5分钟；混合稀释的siRNA缀合物和稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温静置20分钟，以便允许转染复合物的形成。在接种有Huh7细胞的24孔板中按照每孔100μL加入上述最终混合溶液。siRNA缀合物的最终浓度为0.05 nM、0.5 nM、5nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了各siRNA缀合物的Huh7细胞中APOC3 mRNA的表达量。具体步骤为：培养转染的细胞24小时后，使用RNAVzol(Vigorous公司，货号N002)提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA按照反转录试剂盒(Promega公司，货号A3500)的使用方法反转录得到cDNA。使用2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0956)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行APOC3 mRNA的表达量的检测。其中，用于扩增APOC3和作为内参基因的β-actin的PCR引物如表7D所示。
表7D检测引物的序列
siRNA对APOC3 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(测试组ANGPTL3mRNA的表达量/测试组β-Actin mRNA的表达量)/(mock组APOC3 mRNA的表达量/mock组β-Actin mRNA的表达量)]×100％。其中，各测试组为分别经表6D中所列的siRNA缀合物处理的Huh7细胞；mock组为未经任何siRNA缀合物处理的Huh7细胞。以下表8D中示出了表6D中所列的实施例siRNA缀合物在Huh7细胞中对APOC3 mRNA表达抑制活性的检测结果。
表8D siRNA缀合物体外活性测试
从表8D的结果可以看出，在各个浓度下，表6D中的各个siRNA缀合物在细胞水平上均显示出了优异的APOC3 mRNA表达抑制活性。
实验例5-2本实验说明表6D的siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性
将缀合物147-153的siRNA缀合物(以siRNA浓度计，20μM，12μl)分别与108μL 90％人血浆(Human plasma，PBS稀释)混匀。37℃恒温孵育。分别在0、8、24、48小时取出10μL样本，立即进行液氮速冻于-80℃冰箱中冻存。待各时间点取样完毕后，1×PBS(pH7.4)稀释5倍后每一样品取10μL，配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将上述样品与4μL上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成相，结果如表9D所示。
表9D示出了表6D中所列的实施例siRNA缀合物在体外人血浆中的稳定性半定量检测结果。该结果以实施例siRNA缀合物和对比例siRNA缀合物与人血浆孵育后残留的最长片段与未经处理的siRNA最长片段的比例(RL)表示。
表9D siRNA缀合物的血浆稳定性定量结果
由表9D的结果可以看出，本公开的siRNA缀合物在血浆中具有优异的稳定性，48小时内几乎不降解。
实验例5-3本实验说明表6D的siRNA缀合物在体内(in vivo)对APOC3 mRNA表达量的抑制效率
在本实验例中，考察缀合物145、147和152的siRNA缀合物在人APOC3转基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于Jackson Lab)体内对肝脏组织中APOC3表达水平的抑制率。
将6-8周龄人APOC3转基因小鼠随机分组，每组6只(雌雄各半)，分别向每组小鼠给予缀合物145、147和152的siRNA缀合物以及PBS。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg，给药体积为10mL/kg。给药后28天处死小鼠，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司)根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中APOC3 mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的APOC3mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，使用针对APOC3的引物和针对β-肌动蛋白的引物分别对APOC3和β-肌动蛋白进行检测。
检测引物的序列参见表10D。
表10D检测引物的序列
siRNA对APOC3 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝[1-(测试组APOC3 mRNA的表达量/测试组β-Actin mRNA的表达量)/(对照组APOC3 mRNA的表达量/对照组β-Actin mRNA的表达量)]×100％。其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于以下表11D中。
表11D siRNA缀合物在小鼠肝脏中APOC3 mRNA表达的抑制
由表11D的结果可见，一方面，与PBS相比，本公开的实施例145、147和152的siRNA缀合物均显示出优异的APOC3 mRNA的抑制活性，这表明本公开的siRNA缀合物具有良好的体内递送效率。
实验例5-4本实验说明缀合物147的siRNA缀合物在体内(in vivo)对血脂含量的影响
在本实验例中，考察缀合物147的siRNA缀合物(J6-siAP1M2SP)在人APOC3转基因小鼠(B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J，购于Jackson Lab)体内对血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)含量的影响。
将6-8周龄人APOC3转基因小鼠随机分为3组，每组6只(雌雄各半)，分组如下：(1)PBS对照组；(2)缀合物147 3mg/kg组；(3)缀合物147 1mg/kg组。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，siRNA缀合物给药体积为10mL/kg。
分别于给药前1天(记为-1天)，及给药后第7、14、21、28、35、42、49、65天进行眼眶采血(约100μL)，离心得到血清，进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量，血脂结果进行标准化处理，血脂水平的抑制率按如下等式计算：抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。血脂指总胆固醇或甘油三酯。检测结果示于以下表12D中。
表12D siRNA缀合物对小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯表达水平的影响
由表12D可见，缀合物150所示的siRNA缀合物对小鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的含量有明显下调作用，并且至少在65天时仍显示出较高的血脂降低效果。
以上详细描述了本公开的具体实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术有限公司
<120> 化合物和缀合物及其制备方法和用途
<130> 12716RIBO
<160> 590
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 149
<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gaaaguaugu caacgaaua 19
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
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<210> 151
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaguaugu caacgaauu 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaguaugu caacgaauu 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaguaugu caacgaaua 19
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 246
uucuugucca gcuuuauugg g 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 248
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 249
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 250
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 250
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 251
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 251
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 252
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 252
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 253
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 253
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 254
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 257
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 257
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 258
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<210> 259
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 259
ccuugaggca uacuucaaa 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 260
uuugaaguau gccucaaggu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 261
gaccuugagg cauacuucaa a 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
<210> 263
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 263
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 264
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 264
uuugaaguau gccucaaggu cgg 23
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccuugaggca uacuucaaa 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 266
uuugaaguau gccucaaggu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 504
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 505
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 505
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 506
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 506
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 507
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 507
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 508
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 508
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 509
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 509
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 510
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 510
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 511
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 511
ccaagagcac caagaacua 19
<210> 512
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 512
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
<210> 513
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 513
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 514
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 514
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 515
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 515
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 516
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 516
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 517
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 517
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 518
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 518
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 519
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 519
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 520
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 520
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 521
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 521
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 522
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 522
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 523
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 523
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 524
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 524
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 525
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 525
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 526
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 526
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 527
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 527
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 528
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 528
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 529
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 529
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 530
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 530
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 531
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 531
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 532
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 532
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 533
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 533
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 534
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 534
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 535
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 535
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 536
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 536
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 537
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 537
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 538
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 538
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 539
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 539
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 540
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 540
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 541
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 541
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 542
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 542
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 543
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 543
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 544
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 544
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 545
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 545
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 546
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 546
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 547
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 547
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 548
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 548
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 549
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 549
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 550
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 550
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 551
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 551
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 552
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 552
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 553
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 553
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 554
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 554
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 555
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 555
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 556
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 556
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 557
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 557
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 558
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 558
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 559
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 559
ccgtctgtgc cttctcatct 20
<210> 560
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 560
taatctcctc ccccaactcc 20
<210> 561
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 561
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 562
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 562
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 563
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 563
ccgtctgtgc cttctcatct 20
<210> 564
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 564
taatctcctc ccccaactcc 20
<210> 565
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 565
agcttctttg cagctccttc gttg 24
<210> 566
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 566
ttctgaccca ttcccaccat caca 24
<210> 567
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 567
cgtttctcct ggctcagttt a 21
<210> 568
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 568
cagcggtaaa aagggactca a 21
<210> 569
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 569
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 570
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 570
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 571
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 571
cgtttctcct ggctcagttt a 21
<210> 572
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 572
cagcggtaaa aagggactca a 21
<210> 573
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 573
agcttctttg cagctccttc gttg 24
<210> 574
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 574
ttctgaccca ttcccaccat caca 24
<210> 575
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 575
accaactata cgctacat 18
<210> 576
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 576
cctcctgaat aaccctct 18
<210> 577
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 577
ccaaccgcga gaagatga 18
<210> 578
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 578
ccagaggcgt acagggatag 20
<210> 579
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 579
gaggagcagc taaccaactt aat 23
<210> 580
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 580
tctgcatgtg ctgttgactt aat 23
<210> 581
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 581
agcttctttg cagctccttc gttg 24
<210> 582
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 582
ttctgaccca ttcccaccat caca 24
<210> 583
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 583
gtgaccgatg gcttcagttc 20
<210> 584
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 584
atggataggc aggtggactt 20
<210> 585
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 585
ccaaccgcga gaagatga 18
<210> 586
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 586
ccagaggcgt acagggatag 20
<210> 587
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 587
gtgaccgatg gcttcagttc 20
<210> 588
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 588
atggataggc aggtggactt 20
<210> 589
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 589
agcttctttg cagctccttc gttg 24
<210> 590
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 590
ttctgaccca ttcccaccat caca 24

Claims (18)

1.一种化合物，该化合物具有式（101）所示的结构：
式（101）
其中，每个L1独立地选自式A1-A4基团中的一种：
、/>
（A1）（A2）
、/>
（A3）（A4）
n1为选自2-3的整数，每个n2独立地为选自2-3的整数；
m1为选自2-4的整数；
R1为式（B9）或（B11）所示的结构：
（B9）, />（B11）,
其中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，SPS表示固相载体，Rk为羟基保护基团，表示基团通过共价键连接的位点；
每个R2各自独立地为选自H、甲基或乙基；
每个S1独立地是M1中全部羟基被羟基保护基团取代而形成的基团，
每个M1均为N-乙酰基半乳糖胺（GalNAc）。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，m1为2。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，受保护的羟基具有YCOO-的结构式，每个Y独立地为甲基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，该化合物具有式（301）、（302）、（303）、（304）、（501）、（502）、（503）或（504）所示的结构：
式（301）/>式（302）
式（303）/>式（304）
式（501）/>式（502）
式（503）/>式（504）；
其中，M+为碱金属阳离子、铵阳离子、三级胺阳离子和季铵阳离子中的一种，Rk选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-双甲氧基三苯甲基和4,4’,4’-三甲氧基苯甲基中的一种，SPS为树脂。
5.一种缀合物，其中，该缀合物具有式（201）所示的结构：
式（201）
其中：
每个L1独立地选自式A1-A4基团中的一种：
、/>
（A1）（A2）
、/>
（A3）（A4）
n1为选自2-3的整数，每个n2独立地为选自2-3的整数；
m1为选自2-4的整数；
每个R2各自独立地为H、甲基或乙基；
R6为式A59所示的基团：
(A59)
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu为功能性寡核苷酸；
R5与R6中的P原子形成磷酸酯键，并且R5为式（B5）所示的基团：
（B5）；
其中，表示通过共价键连接的位点；
每个M1为N-乙酰基半乳糖胺（GalNAc）；
所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述式A59中的P通过形成磷酸二酯键连接到所述双链寡核苷酸的所述正义链的3'末端核苷酸的3'位；所述双链寡核苷酸为siRNA，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列2与第一段核苷酸序列至少部分互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列，所述靶mRNA是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA；所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸长度相等且序列完全反向互补的核苷酸序列；
所述靶mRNA选自以下基因对应的mRNA中的一种：ApoC3、ANGPTL3、HBV。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中，m1为2。
7.根据权利要求5所述的缀合物，其中，该缀合物具有式（401）、（402）、（403）或（404）所示的结构：
式（401）/>式（402）
式（403）/>式（404）。
8.根据权利要求5所述的缀合物，其中，所述靶mRNA选自乙型肝炎病毒的mRNA、血管生成素样蛋白3基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3基因表达的mRNA。
9.根据权利要求5所述的缀合物，其中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。
10.根据权利要求5所述的缀合物，其中，所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。
11.根据权利要求5或10所述的缀合物，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式（801）所示结构的硫代磷酸酯基：
式（801）；
所述硫代磷酸酯键存在于以下至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，所述非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物；
所述核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种；
所述ENA如式（813）所示；
所述GNA如式（816）所示；
式（813）/>式（816）；
其中，R’选自H、OH或烷氧基；Base表示选自A、U、G、C或T的碱基。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中，正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸中的一种。
14.根据本权利要求13所述的缀合物，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸是指所述核苷酸中核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
15.根据权利要求12所述的缀合物，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸；所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为具有由以下式（802）-式（806）中的一个表示的核苷酸：
式（802）式（803）式（804）式（805）式（806）
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团，Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由式（802）、式（803）或式（805）表示的核苷酸。
17.权利要求5-16中任意一项所述的缀合物在制备用于治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途；
所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因；所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病和肝增生性疾病；或者，
所述特定基因选自血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因；所述疾病是血脂异常，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
18.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求5-16中任意一项所述的寡核苷酸缀合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112048509B (zh) * 2020-09-19 2024-03-26 湖南中医药大学 一种抑制NLRP3基因表达的siRNA分子及其应用
CN112063624A (zh) * 2020-09-19 2020-12-11 湖南中医药大学 一种抑制caspase 1基因表达的siRNA分子及其应用
CN114432262A (zh) * 2020-10-16 2022-05-06 四川大学华西医院 肝脏靶向小核酸药物缓释递送系统及其应用
CN114807154A (zh) * 2020-12-10 2022-07-29 深圳市瑞吉生物科技有限公司 一种修饰的核酸及其应用
CN114632089A (zh) * 2020-12-16 2022-06-17 北京瑞博开拓医药科技有限公司 含酰基糖胺基团化合物在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用及疾病的治疗方法
CN115282283A (zh) * 2022-06-21 2022-11-04 浙江浥眸生物科技有限公司 一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6620916B1 (en) * 1996-09-26 2003-09-16 Ajinomoto Co., Inc. Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same
CN102006890A (zh) * 2007-12-04 2011-04-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向脂质
CN104080794A (zh) * 2011-11-18 2014-10-01 阿尔尼拉姆医药品有限公司 RNAi试剂、组合物及其用于治疗甲状腺素运载蛋白(TTR)相关疾病的使用方法
WO2015006740A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN104717982A (zh) * 2012-08-06 2015-06-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 碳水化合物共轭物及其制备改进工艺
CN105164261A (zh) * 2013-05-01 2015-12-16 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
CN105378085A (zh) * 2013-05-01 2016-03-02 Isis制药公司 用于调节hbv和ttr表达的组合物和方法
WO2016206626A1 (zh) * 2015-06-26 2016-12-29 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用
CN108064293A (zh) * 2014-11-10 2018-05-22 阿尔尼拉姆医药品有限公司 D型肝炎病毒(HDV)iRNA组合物及其使用方法
CN109069529A (zh) * 2016-03-07 2018-12-21 箭头药业股份有限公司 用于治疗性化合物的靶向配体

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6620916B1 (en) * 1996-09-26 2003-09-16 Ajinomoto Co., Inc. Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same
CN102006890A (zh) * 2007-12-04 2011-04-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向脂质
CN104080794A (zh) * 2011-11-18 2014-10-01 阿尔尼拉姆医药品有限公司 RNAi试剂、组合物及其用于治疗甲状腺素运载蛋白(TTR)相关疾病的使用方法
CN104717982A (zh) * 2012-08-06 2015-06-17 阿尔尼拉姆医药品有限公司 碳水化合物共轭物及其制备改进工艺
CN105164261A (zh) * 2013-05-01 2015-12-16 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
CN105378085A (zh) * 2013-05-01 2016-03-02 Isis制药公司 用于调节hbv和ttr表达的组合物和方法
WO2015006740A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN108064293A (zh) * 2014-11-10 2018-05-22 阿尔尼拉姆医药品有限公司 D型肝炎病毒(HDV)iRNA组合物及其使用方法
WO2016206626A1 (zh) * 2015-06-26 2016-12-29 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用
CN107849567A (zh) * 2015-06-26 2018-03-27 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用
CN109069529A (zh) * 2016-03-07 2018-12-21 箭头药业股份有限公司 用于治疗性化合物的靶向配体

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