CN112390835A - 肝靶向化合物及缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种化合物，该化合物具有如式(3)所示的结构，本公开还提供了该化合物与活性剂共价连接形成的缀合物。本公开的缀合物能够靶向肝细胞，从而有效解决活性剂的体内递送相关问题，毒性低，并且保持所递送的活性剂的稳定性和活性不受显著影响。
Figure DDA0002166913140000011

Description

肝靶向化合物及缀合物
技术领域
本发明涉及使用靶向配体递送活性剂的领域。具体的，本发明涉及一种新的肝靶向化合物，以及包含该化合物的缀合物、以及它们的制备方法和用途。
背景技术
寡核苷酸化合物在医学上具有重要的治疗应用。寡核苷酸可用于对特定基因进行调控。这类寡核苷酸化合物包括但不限于siRNA、反义RNA，saRNA和微小RNA等寡核苷酸化合物。在具体治疗应用中，可选择仅在特定组织或位置表达的寡核苷酸及其类似物，从而针对特定靶点处的相关疾病或症状进行治疗。
尽管以特定寡核苷酸和寡核苷酸类似物为代表的组织特异性活性剂在作为治疗剂的应用方面已取得部分进展，但是仍然存在对其药理特性的改进的需求，例如使其靶向性地递送至病灶以提高治疗剂的选择性，提高其生物活性及功效。最近靶向缀合递送技术成为一类研究最广泛的递送系统，主要集中于肝靶向递送。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种新的缀合分子，其结构如式(3)所示：
Figure BDA0002166913120000011
其中：
每个n1为选自2-6的整数，优选2-4的整数；每个n2为选自1-6的整数，优选1-4的整数；
m1为选自1-6的整数，优选2-4的整数；
每个R2选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
R4为能够通过共价键与寡核苷酸结合的部分；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地由以下基团组成的组中的任何一个或多个取代：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一方面，本公开提供了一种缀合物，该缀合物具有式(1)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000021
其中：
每个n1为选自2-3的整数，和/或每个n2为选自1-3的整数；
m1为选自1-6的整数，优选2-4的整数；
每个R2选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
R1包含经共价键连接的活性剂基团，在一些实施方式中，R1包含连接基团以及通过所述连接基团共价连接的活性剂基团；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地由以下基团组成的组中的任何一个或多个取代：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC10-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，本公开提供了一种将活性剂靶向递送至受试者肝细胞的方法，所述方法包括将活性剂与本公开的化合物形成本公开的缀合物，并向所述受试者给予所述缀合物。
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的缀合物和/或在用于制备治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的生理状况或疾病的药物中的应用。
在一些实施方式中，本公开提供了一种在肝细胞中抑制特定基因表达的方法，该方法包括将本公开的缀合物与所述肝细胞进行接触。
在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的缀合物。
本公开的其他特征和有益效果将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
附图说明
所附的权利要求中详细的阐述了本发明的新颖特征。本发明的特点和优点将通过以下详细描述以及附图得到更好的理解，其中所述详细描述对利用了本发明原理的说明性实施方式进行了阐述，所述附图为：
图1示出了本公开的缀合物在小鼠体内对HBV mRNA的抑制作用。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，而非旨在在任何方面限制本公开。
定义
在上文及下文中，特别是在描述本公开的缀合分子的制备方法或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的RNA序列，所述“未修饰或修饰RNA亚磷酰胺(unmodified or modified RNA phosphoramidite)”，分别用于所谓的固相亚磷酰胺合成，固相亚磷酰胺合成是本领域合成RNA众所周知的方法。在本文中，RNA亚磷酰胺同时也指核苷亚磷酰胺(nucleoside phosphoramidites)。除非另有说明，本公开所使用的核苷酸单体均可商购得到。
如本文所使用的，不介于两个字母之间或两个符号之间的短横(“-”)是用于指示取代基连接点的位置。例如：-C1-C10烷基-NH2通过C1-C10烷基而连接。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且所述描述包括事件或状况发生的情况和其中不发生的情况。例如，“任选的取代的烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或内在不稳定的任何取代或取代型式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1到20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当对具有特定数量的碳的烷基残基进行命名时，旨在涵盖所有具有该数量的碳的支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一个氢分子而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基直链亚烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两个氢分子而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳。亚炔基是炔基的一个子集，指与炔基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指衍生自芳香族单环或多环烃环系统、通过从环碳原子中除去氢原子而形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，其根据Hückel理论包含环状、离域的(4n+2)π-电子系统。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的一个子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“环烷基”是指非芳香碳环，通常具有3至7个环状碳原子。环可以是饱和的，或具有一个或多个碳-碳双键。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基和环己烯基，以及桥联和笼状环基团，如降冰片烷(norbornane)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤素”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
“杂环基”是指稳定的3至18元非芳香族环基，其包含2-12个碳原子和选自氮、氧和硫的1-6个杂原子。除非说明书中另有说明，否则杂环基是单环、双环、三环或四环系统，可包括稠环或桥环系统。杂环基中的杂原子可以任选地被氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1oxo thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1dioxo thiomorpholinyl)。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，其包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，根据Hückel理论，包含环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过环中的任何原子连接至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三甲苯基)、DMTr(4,4’-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、大鼠、猪、马、驴、牛、绵羊和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗方法”、“治疗”、“减轻”、或“改善”可在此处互换使用。这些术语指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的，“防止”和“预防”可互换使用。这些术语指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将缀合物或组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
缀合分子
在一个方面，公开了一种用于递送活性剂或者活性药物的缀合分子。在一些实施方式中，本公开的缀合分子有利于组织特异性靶向。在一些实施方式中，本公开的缀合分子与细胞表面受体结合。为此目的，任何细胞表面受体或者生物标志物或其一部分都被认为是合适的。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地结合到特定组织的特有受体，从而实现组织特异性靶向。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地靶向至肝细胞表面受体，从而特异性地靶向至肝组织。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地靶向至肝细胞特有的细胞表面受体。在一些实施方式中，本公开的缀合分子特异性地靶向至肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptors，ASGPR)。
如本文所使用的，“活性剂”和“活性药物”可互换使用，都是指能够通过本公开的缀合分子递送的分子。在一些实施方式中，活性剂为能够地送到肝细胞的试剂。这些试剂为本领域技术人员所熟知的，包括但不限于功能性寡核苷酸，特别是本文公开的那些。相应地“活性剂基团”和“活性药物基团”可互换使用，都是指缀合分子递送的分子与坠河分子连接后形成的基团。
在一些实施方式中，本公开提供了一种缀合分子，该缀合分子具有式(3)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000081
其中：
每个n1为选自2-10的整数，优选2-6的整数，每个n2为选自1-6的整数，优选1-4的整数；
m1为选自1-6的整数，优选2-4的整数；
每个R2独立地为H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；本领域技术人员可能理解，当每个R2独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基时，不会改变本公开提供的缀合分子的性质，均可能实现本公开的目的。在一些实施方式中，每个R2独立地为H、甲基或乙基。在一些实施方式中，每个R2均为H；
R4为含有能够通过共价键与寡核苷酸结合的部分；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，当n1选自2-6的整数，和当n2选自1-6的整数时，可能使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，多个M1配体之间的空间位置适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合分子更为简单，更容易合成和/或降低成本，根据本公开的一些具体实施方式，n1选自2-6的整数，在一些实施方式中选自2-4的整数；在一些实施方式中，n2为1-6的整数，在一些实施方式中，选自1-4的整数。
在一些实施方式中，m1可选自1-6的整数，从而保证所述缀合分子中S1基团的个数至少为2；在一些实施方式中m1≥3，这样可以使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，M1配体的个数可能至少为3，从而使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进寡核苷酸缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，m1为1-6的整数，在一些实施方式中，m1选自2-4的整数。
本领域技术人员可能理解，每个R2选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基时，不会改变本公开提供的缀合分子的性质，均可能实现本公开的目的。在一些实施方式中，每个R2选自H、甲基或乙基。在一些实施方式中，每个R2均为H。
在一些实施方式中，所述活性药物包含活性反应基团，R4具有能够结合到活性药物的基团，从而使得活性药物以共价连接的形式缀合至本公开的缀合分子，从而被本公开的缀合分子递送至靶组织或靶细胞。在一些实施方式中，R4包含能够结合到寡核苷酸的基团，使得寡核苷酸通过共价连接至R4而可被本公开的缀合分子递送至肝细胞。在一些实施方式中，R4包含能够通过共价键与寡核苷酸结合的基团。在一些实施方式中，R4包含能够通过磷酸二酯键与寡核苷酸结合的基团。在一些实施方式中，R4是为了实现与酰基的连接，并且为合成缀合物提供合适的反应位点。在一些实施方式中，R4可包含能够以适当方式连接至酰基碳链的包含。在一些实施方式中，R4基团上含有与酰基所在的碳链连接的连接位点以及可能经反应而通过磷酸二酯键缀合至寡核苷酸的任意官能团。
在一些实施方式中，R4包含第1官能团，所述第1官能团可与活性药物上的活性反应基团发生反应以形成共价键连接。在一些实施方式中，所述活性反应基团为氨基，所述第1官能团为亚胺酯基；或者，所述活性反应基团为羟基，所述第1官能团为亚磷酰胺；或者，所述活性反应基团为羧基、酯基或酰卤，所述第1官能团为羟基或受保护的羟基。
在一些实施方式中，所述活性药物包含寡核苷酸或核苷酸，所述寡核苷酸或核苷酸上的基团可与第1官能团和第2官能团形成共价键连接，在一些实施方式中，寡核苷酸或核苷酸上的基团包含氨基，R4含有可与寡核苷酸或核苷酸上的基团反应形成共价键连接的第1官能团，以及可与羟基或氨基反应形成共价键的第2官能团，或者所述第2官能团进一步包含由所述共价键连接的固相载体。在一些实施方式中，第1官能团为亚胺酯基、亚磷酰胺、羟基或被保护的羟基。在一些实施方式中，第2官能团为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐。在一些实施方式中，第2官能团为经共价键连接的固相载体，所述共价键由羟基或氨基形成。在一些实施方式中，所述固相载体经由磷酸酯键、羧酸酯键或酰胺键连接。在一些实施方式中，所述固相载体为树脂。
在一些实施方式中，R4包括羟基、-ORk、由式(C3)表示的基团或者由式(A56)表示的基团：
Figure BDA0002166913120000101
其中，Rk为羟基保护基团，L2为连接基团，
Figure BDA0002166913120000103
表示基团共价连接的位点。
在一些实施方式中，R4包括由式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000102
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure BDA0002166913120000104
表示基团共价连接的位点。
在一些实施方式中，第1官能团含有亚磷酰胺官能团，如式(C3)所示，该亚磷酰胺官能团可以与核苷酸上的任意位置的羟基，如2'位羟基或3'位羟基发生偶联反应，并经氧化形成磷酸二酯键，将缀合分子缀合至寡核苷酸。此时，即使第2官能团不存在，本公开的缀合分子也能够缀合到核苷酸上。此时，本公开的缀合分子适合于与核苷酸序列中末端核苷酸上的羟基反应，并在后续的氧化过程中形成磷酸二酯键连接，从而将本公开的缀合分子缀合至寡核苷酸。
在一些实施方式中，第1官能团含有亚胺酯基官能团，如式(A56)所示，该亚胺酯基官能团可以与氨基修饰的寡核苷酸上的氨基基团发上酰胺化反应，形成酰胺键，将缀合分子缀合至寡核苷酸。此时，即使第2官能团不存在，本公开的缀合分子也能够缀合到核苷酸上。此时，本公开的缀合分子适合于与核苷酸序列中末端核苷酸上另外连接的氨基发生反应，并在后续的酰胺化过程中形成酰胺键连接，从而将本公开的缀合分子缀合至寡核苷酸。
在一些实施方式中，所述第1官能团含有被保护的羟基。在一些实施方式中，所述第2官能团含有可与固相载体反应的基团，以提供含有固相载体的缀合分子。在一些实施方式中，第2官能团含有羧酸官能团、羧酸盐官能团或亚磷酰胺官能团，如式(C1)、(C2)或(C3)所示，羧酸官能团或羧酸盐官能团可以与固相载体，例如树脂上的羟基或氨基进行酯化反应或酰胺化反应，形成含有经羧酸酯键连接的固相载体或经酰胺键连接的固相载体的缀合分子。亚磷酰胺官能团可以与通用固相载体，例如树脂上的羟基发生偶联反应，并经氧化形成经磷酸二酯键连接的固相载体。此时，根据本发明的一方面，提供了一种用这种缀合分子来制备本公开的缀合物的方法。在一些实施方式中，该方法包括首先将缀合分子与固相载体通过冷凝或偶联反应进行连接，然后按照固相亚磷酰胺合成方法加入核苷单体，从而得到将本公开缀合分子缀合至寡核苷酸的本公开的缀合物。在一些实施方式中，在亚磷酰胺固相合成过程中，第1官能团发生脱保护，随后在偶联反应条件下与核苷酸上的亚磷酰胺基团发生偶联，
在一些实施方式中，R4含有第1官能团和第2官能团，所述第1官能团含有羟基或被保护的羟基；所述第2官能团含有羧酸酯键、酰胺键或磷酸二酯键，或者通过羧酸酯键、酰胺键或磷酸二酯键连接的固相载体。在一些实施方式中，第2官能团为如式(C1)或(C3’)所示的部分。在一些实施方式中，当第2官能团含有固相载体时，含有所述固相载体的缀合分子有利于本公开缀合物的制备。因此，在本发明的一方面，提供了一种用所述缀合分子制备本公开的缀合物的方法。在一些实施方式中，该方法包括将含有固相载体的缀合分子与核苷单体按照亚磷酰胺固相合成方法进行反应，从而将本公开的缀合分子缀合到寡核苷酸上。在一些实施方式中，所述含有固相载体的缀合分子可能通过缀合分子与固相载体反应在内部得到，所述缀合分子与羧基、羧酸盐或亚磷酰胺发生反应。在一些实施方式中，缀合分子可能由商购得到。
在一些实施方式中，羧酸盐官能团可以表示为—COO-M+，其中，M+是阳离子，例如选自金属阳离子，铵阳离子NH4+，有机铵阳离子中的一种。在一些实施方式中，所述金属离子选自碱金属离子中的一种，如K+或Na+。出于提高溶解性、使反应顺利进行的考虑，在一些实施方式中，有机铵离子为三级胺形成的铵阳离子或季铵阳离子，如，三乙胺形成的铵离子或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。在一些实施方式中，羧酸盐是三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐。
在本公开的一些实施方式中，R4含有式(B9)、(B10)、(B11)、(B12)、(B9’)、(B10’)、(B11’)或(B12’)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000121
其中，q1为1-4的整数，q2为1-10的整数，X为O或NH，M+为阳离子，SPS表示固相载体，Rk为羟基保护基团，
Figure BDA0002166913120000122
表示基团共价连接的位点。在一些实施方式中，q1为1或2。在一些实施方式中，q2为1-5的整数。在一些实施方式中，R4含有式(B9)或(B10)所示的结构。在一些实施方式中，R4含有式(B11)或(B12)所示的结构。在一些实施方式中，Rk为Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4’-双甲氧基三苯甲基)、TMTr(4,4’,4’-三甲氧基三苯甲基)中的一种或多种。在一些实施方式中，Rk可以是DMTr。
在一些实施方式中，L2为连接基团。在一些实施方式中，L2为是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L2可任选地由以下基团组成的组中的任何一个或多个取代：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；在一些实施方式中，L2为亚甲基。
在一些实施方式中，L1的作用是将M1配体与含氮骨架上的N原子连接，从而为本公开的缀合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26基团及其任意组合所组成的组。在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13及其任意组合所组成的组。在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，L1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。“含氮骨架”是指连接有R2碳原子与N互相连接的链状结构。
在一些实施方式中，L1的长度可能为3-25、3-20、4-15或5-12个原子。在一些实施方式中，L1的长度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55或60个原子。
根据本公开的一些实施方式中，每个j1独立地为2-10的整数，在一些实施方式中，每个j1独立地为3-5的整数。在一些实施方式中，每个j2独立地为2-10的整数，在一些实施方式中，每个j2独立地为3-5的整数。R’为C1-C4烷基，在一些实施方式中，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现M1配体与含氮骨架上的N原子连接，并使M1配体之间的空间位置更适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
每个S1独立地选自能够和细胞表面受体合的配体。在一些实施方式中，至少一种S1为能够和肝表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个S1为能够和哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个S1为能够和人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个S1为能够和肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。
在一些实施方式中，M1可能是任何与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲合力的配体，这些配体的种类为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中，至少一个S1为糖类。在一些实施方式中，每个S1为糖。在一些实施方式中，至少一个S1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，每个S1为单糖、二糖、三糖或多糖。在一些实施方式中，至少一个S1是修饰的糖。在一些实施方式中，每个S1为修饰的糖。在一些实施方式中，每个S1独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖或单糖衍生物。在一些实施方式中，每个或至少一个S1可能独立地选自由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖和麦芽糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物以及唾液酸。
在一些实施方式中，每个或至少一个S1可能独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。在一些实施方式中，每个M1均为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施方式中，配体选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
CN105378082A公开了一种包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团及1个或多个配体，每个配体选自多糖、修饰多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。据称，该化合物可以降低细胞中核酸转录物的量或活性。
N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalgactosamine，GalNAc)，是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的配体。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝细胞特异性表达的一种内吞型受体。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了较好的效果。例如，阿尔尼拉姆公司(Alnylam pharmaceuticals,Inc.)首次报道了基于GalNAc缀合技术的siRNA在小鼠体内发挥干扰活性(Nair等，J.Am.Chem.Soc.,2014，136，16958-16961)。文章报道了缀合有三簇GalNAc的siRNA，在体内和体外实验中均展现了良好的递送活性。通过皮下给药的小鼠体内实验，单一剂量的ED50确定为1mg/kg，单次注射剂量小于1ml。在长期给药实验中，每周皮下注射一次，可获得长达9个月的稳定干扰活性。
在一些实施方式中，S1独立地是至少一个活性羟基被羟基保护基团保护的基团。在一些实施方式中，S1独立的是全部羟基被羟基保护基团保护的基团。在一些实施方式中，任何本领域技术人员熟知的羟基保护基团可能被用于保护S1上的活性羟基。在一些实施方式中，被保护的羟基由式YCOO-表示，其中每个Y独立地选自于由C1-C10烷基和C6-C10芳基组成的组，其可任选地由一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素取代基和C1-C6烷基。在一些实施方式中，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤苯基和C1-C6烷基苯基。
在一些实施方式中，每个S1各自独立地选自于由式A46-A54基团中的一种：
Figure BDA0002166913120000151
Figure BDA0002166913120000161
在一些实施方式中，S1为式A49或A50。
在一些实施方式中，每个Y独立地选自甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基以及烷基苯基中的一种；出于简化本公开的缀合分子的目的，在一些实施方式中，Y为甲基。
在一些实施方式中，本公开的缀合分子具有(B113)-(B116)中任意一个所示的结构：
Figure BDA0002166913120000162
Figure BDA0002166913120000171
Figure BDA0002166913120000181
本公开的缀合分子的制备
本领域技术人员可采用任意合理的合成路线制备本公开的缀合分子。
在一些实施方式中，式(3)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在酰胺化反应条件下、在有机溶剂中，在缩合剂的存在下，将式(4)与酰胺化试剂接触，随后进行分离：
Figure BDA0002166913120000182
其中：
n1、n2、m1、R1、R2、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述，
R5具有式(A57)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000191
L2的定义可选择的范围如前所述；S5为羟基基团或卤素，在一些实施方式中，S5为羟基。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷(DCM)。所述酰胺化试剂在一些实施方式中为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，所述缩合剂在一些实施方式中为环己基碳二亚胺(DCC)。
在一些实施方式中酰胺化反应条件包括反应温度为10-40℃，反应时间为4-12小时，在一个实施方式中为反应温度为20-30℃，反应时间为6-10小时。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(3)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(3)化合物，例如，可使用如下两种色谱条件进行分离：(1)正相纯化：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:30-100:40梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(3)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(4)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在该方法包括在酰胺化反应条件下、在有机溶剂中，在胺类化合物和酰胺化合物的存在下，将式(5)与酸酐化合物充分接触，随后进行分离：
Figure BDA0002166913120000192
n1、n2、m1、R1、R2、L1和S1各自的定义和可选择的范围如前所述；
每个R3独立地为H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；R8为氨基。
在一些实施方式中，所述酰胺化反应条件包括反应温度为10-40℃，反应时间为2-6小时，在一个实施方式中为反应温度为20-30℃，反应时间为3-4小时。
一些实施方式中，每个R2、R3均为H；
在一些实施方式中，所述有机溶剂在一些实施方式中为二氯甲烷，所述酸酐化合物在反应后提供式(4)化合物中的R5基团，因此，当R5基团中的S5官能团为羟基时，所述酸酐化合物进一步优选为二酸酐；在一些实施方式中，所述酸酐化合物为丁二酸酐；所述胺类化合物在一些实施方式中为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)；所述酰胺化合物在一些实施方式中为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，所述式(5)化合物通过与酸酐进行酰胺化反应，获得具有R5基团的式(4)化合物。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(4)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、后使用酰胺类溶剂溶解过滤、随后通过色谱方法分离式(4)化合物例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇＝100:5-100:7梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用水(0.05％TFA):乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(4)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(5)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在脱保护反应条件下，有机溶剂中，在有机胺的存在下，将式(6)化合物与醇胺化合物充分接触，随后进行分离：
Figure BDA0002166913120000201
n1、n2、m1、R2、L1、S1各自的定义和可选择的范围如前所述；R1为经保护的氨基；在一些实施方式中，R9为Fmoc保护的氨基。
在一些实施方式中，所述化合物式(6)在与有机混合溶剂的充分接触后进行的脱保护的取代反应条件包括反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-6小时，在一个实施方式中为反应温度为20-30℃，反应时间为1-3小时。
在一些实施方式中，所述混合溶剂为有机溶剂和醇胺化合物的混合溶液；所述有机溶剂在一些实施方式中为乙腈，所述有机胺在一些实施方式中为二乙胺；所述式(6)化合物在与混合溶剂的充分接触后，进行取代反应。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(5)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂，之后重复加入醇类溶剂稀释后蒸发溶剂，随后通过色谱方法分离式(5)化合物例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝1:1:0.05-1:1:0.25梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(5)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(6)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在缩合反应条件下，在有机溶剂中，在酰胺化反应缩合剂和三级胺存在下，将式(7)所示化合物与式(A60)所示化合物接触，随后进行分离：
S1-L1-COOH (A60)
Figure BDA0002166913120000211
其中，n1、n2、m1、R2、R9、L1和S1各自的定义和可选择的范围如前所述。
式(A60)化合物可使用例如J.Am.Chem.Soc.2014,136,16958-16961中所公开的化合物，或者，式(A60)化合物可由本领域技术人员通过各种方法制备，例如，可参照US 8,106,022B2实施例1中所公开的方法制备某些式(A60)化合物，以引用的方式将以上文献的全部内容整体并入本文。
在一些实施方式中，所述缩合反应条件包括反应温度为0-60℃，反应时间为0.1-24小时，在一个实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为0.5-16小时。
所述式(A60)所示化合物与所述式(7)所示化合物的摩尔比为2:1-10:1，在一些实施方式中为2.5:1-5:1。
在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈、环氧类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基乙胺中的一种或多种，所述环氧类溶剂在一些实施方式中为二氧六环和/或四氢呋喃，所述醚类溶剂在一些实施方式中为乙醚和/或甲基叔丁基醚，所述卤代烷类溶剂在一个实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种，在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。相对于式(7)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一个实施方式中为5-20L/mol。
在一些实施方式中，所述成酰胺反应缩合剂为六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯或4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，在进一步的实施方式中为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。所述成酰胺反应缩合剂与式(7)所示化合物的摩尔比为2:1-10:1，在一些实施方式中为2.5:1-5:1；
所述三级胺为N-甲基吗啉、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺，在一些实施方式中为N-甲基吗啉；所述三级胺与式(7)所示化合物的摩尔比为3:1-20:1，在一些实施方式中为5:1-10:1。
可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(6)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取、后合并有机相后使用盐类溶剂洗涤、在硫酸盐干燥后、随后通过色谱方法分离式(6)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用含1wt‰三乙胺的二氯甲烷:甲醇＝100:18-100:20梯度洗脱；或者(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可直接除去溶剂得到式(6)化合物粗产品，该粗产品可直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(7)化合物与足量的一种式(A60)化合物一次反应即生成期望的式(6)化合物，此时，各个S1-L1部分彼此相同。在一些实施方式中，可根据需要，通过使式(7)化合物分批与不同的式(A60)化合物，即L1和/或S1不同的式(A60)化合物发生反应，使得生成的式(6)化合物中含有两种以上的S1和/或L1。例如，对于1eq的式(7)化合物，可先使其与1eq的第一式(A60)化合物接触，在式(7)化合物中的一个末端伯胺基团上连接第一S1-L1部分，随后，使其继续与(m1-1)eq的第二式(A60)化合物接触(m1的定义和取值范围如前所述)，从而在式(7)化合物中的(m1-1)个仲胺基团上连接第二S1-L1部分。
在一些实施方式中，式(7)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在脱保护反应条件下，在有机溶剂中，将式(8)所示化合物与盐酸和乙醇的混合溶液接触，分离得到式(7)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000231
其中，n1、n2、m1、R2和R9各自的定义和可选择的范围如前所述。
所述脱保护反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为0.5-24小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为2-8小时。
所述有机溶剂选自醇，在一些实施方式中为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种，在一些实施方式中为乙醇；乙醇的浓度为30-40质量％，乙醇与式(8)所示化合物的摩尔比为10:1-500:1，在一些实施方式中为50:1-200:1。
所述盐酸溶液的浓度为30-40质量％，盐酸与式(8)所示化合物的摩尔比为10:1-500:1，在一些实施方式中为50:1-200:1。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(7)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(7)化合物例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用二氯甲烷:甲醇:氨水(25wt％)＝1:1:0.05-1:1:0.25梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(7)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(8)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在缩合反应条件下，在有机溶剂中，将式(9)和式(11)所示化合物与多胺缩合试剂和胺基化合物的混合溶液接触，分离得到式(8)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000232
其中，n1、n2和R2各自的定义和可选择的范围如前所述，m2选自1-3的整数，m2在一些实施方式中为选自1-2的整数，其在数值上等于m1-2。
所述缩合反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为1-72小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为3-10小时。
所述有机溶剂选自多胺缩合试剂、氨基化合物和卤代烷类溶剂。在一些实施方式中，所述多胺缩合试剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU),所述胺基化合物N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。所述使用的有机溶剂比例为HATU：DIPEA＝1.5eq：2.5eq。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(8)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取，随后通过色谱方法分离式(8)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用展开剂乙酸乙酯:甲醇＝100：1-5：1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(8)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(9)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在脱保护反应条件下，在有机溶剂中，将式(10)化合物与腈类极性非质子溶剂和胺类化合物的混合溶液接触，分离得到式(9)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000241
其中，n1、n2、m2和R2各自的定义和可选择的范围如前所述；R11为经保护的氨基；在一些实施方式中，R11为Fmoc保护的氨基
所述缩合反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为1-72小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为3-10小时。
所述有机溶剂选自腈类极性非质子溶剂和醇胺类化合物,在一些实施方式中，腈类极性非质子溶剂为乙腈(ACN)，所述胺类化合物为二乙胺(DEA)。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(9)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(9)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用展开剂乙酸乙酯:甲醇＝100：1-5：1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(9)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，m2＝1，此时，式(10)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在缩合反应的条件下，在有机溶剂中，在成卤代烷类溶剂、多胺缩合试剂和胺基化合物的存在下，将式(11)化合物与Boc半保护的二胺接触，分离得到式(10)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000251
其中，n1、R2和R11各自的定义和可选择的范围如前所述；
所述羧基和氨基的缩合反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为1-72小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为3-10小时；
所述有机溶液选自卤代烷类溶剂、多胺缩合试剂、胺基化合物和受Boc保护基保护的胺类化合物。在一些实施方式中，所述卤代烷类溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷，所述多胺缩合试剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU),所述胺基化合物N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，所述Boc半保护的二胺是指分子中具有两个氨基官能团，其中一个氨基被Boc保护的化合物。在一些实施方式中，所述Boc半保护的二胺为Boc-乙二胺。所述式(11)通过与该Boc半保护的二胺充分接触，进行缩合反应，生成式(10)化合物。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(10)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取、随后通过色谱方法分离式(10)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用展开剂乙酸乙酯:聚乙烯＝100：1-1：1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(10)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(11)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在催化氢解反应的条件下，在有机溶剂中在催化剂存在下，将式(12)化合物与氢接触，分离得到式(11)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000261
其中，n1、R2和R11各自的定义和可选择的范围如前所述；
所述催化氢解反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为1-72小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为2-10小时；
所述有机溶剂可以是醇类溶剂。在一些实施方式中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种，在一些实施方式中为甲醇；所述催化剂在一些实施方式中为Pd/C。在催化剂存在下，所述式(11)化合物中羧基上的的苄基保护剂被氢化还原脱除，得到游离羧基。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(11)化合物。在一些实施方式中，可通过蒸发除去溶剂、随后通过色谱方法分离式(11)化合物例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用甲醇:二氯甲烷＝0.01:1-0.5:1梯度洗脱；或者使用甲醇:二氯甲烷:乙酸乙酯:石油醚＝0.1:1:1:1-1:1:1:1梯度洗脱。以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(11)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(12)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在酰胺化反应条件下，在有机溶剂中，在胺类化合物存在下，将式(13)化合物与氨基保护剂接触，分离得到式(12)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000262
其中，n1、R2、R11各自的定义和可选择的范围如前所述；
所述酰胺化反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为1-72小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为2-10小时；
所述有机溶剂可使用卤代烷、醚或者酯，在一些实施方式中为二氯甲烷、三氯甲烷和1,2-二氯乙烷中的一种或多种。在一些实施方式中，所述有机溶剂为二氯甲烷。在一些实施方式中，所述氨基保护剂为二碳酸二叔丁酯，所述胺类化合物为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(319)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取、随后通过色谱方法分离式(319)化合物例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用甲醇:二氯甲烷＝0.01:1-0.5:1梯度洗脱；或者使用甲醇:二氯甲烷:乙酸乙酯:石油醚＝0.1:1:1:1-1:1:1:1梯度洗脱。以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(319)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
在一些实施方式中，式(13)所示化合物可以通过以下制备方法得到：该方法包括在缩合反应条件下，在有机溶剂中，在胺类化合物存在下将式(14)化合物与卤代苄酯类化合物接触，分离得到式(13)所示化合物：
Figure BDA0002166913120000271
其中，n1、R2和R11各自的定义和可选择的范围如前所述；
所述脱保护加成反应条件包括反应温度为0-80℃，反应时间为1-72小时，在一些实施方式中为反应温度为0-40℃，反应时间为2-10小时；
所述有机溶剂选自有机腈、卤代苄酯类化合物、胺基化合物。在一些实施方式中，所述有机溶剂为乙腈。在一些实施方式中，所述胺基化合物为N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。所述卤代苄酯类化合物是指卤代羧酸中羧基被苄基保护而得到的化合物，通过发生缩合反应，连接式(14)中的氨基，获得含有仲胺基团的含氮骨架。在一些实施方式中，所述卤代苄酯类化合物为2-溴乙酸苄酯(benzyl bromoacetate)。
与上述类似地，可使用任何合适的分离方法从反应混合物中分离式(11)化合物。在一些实施方式中，可通过水和卤代烷类溶剂萃取、随后通过色谱方法分离式(11)化合物，例如，可使用如下色谱条件进行分离：(1)正相纯化硅胶：200-300目硅胶填料，使用乙酸乙酯:聚乙烯＝100：1-1:1梯度洗脱；以及(2)反相纯化：C18、C8反相填料，使用甲醇:乙腈＝0.1:1-1:0.1梯度洗脱。在一些实施方式中，可以直接除去溶剂得到式(11)化合物粗产品，该粗产品可以直接用于后续反应。
缀合物
在另一方面，本公开提供了一种缀合物，该缀合物具有如式(1)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000281
其中：
每个n1为选自2-6的整数，优选地为2-4的整数，每个n2为选自1-6的整数，优选地选为1-4的整数；
m1为选自1-6的整数，优选地为2-4的整数；
R1包含经共价键连接的活性剂基团，或者R1包含连接基团以及通过所述连接基团共价连接的活性剂基团；
每个R2独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基，在一些实施方式中，每个R2均为H；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；在一些实施方式中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26基团及其任意组合所组成的组，A1-A26的定义如前所述；
每个M1选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，m1独立地选自1-6的整数，优选地选自1-4的整数，每个n1独立地选自2-6的整数，优选地选为2-4的整数，和/或每个n2独立地选自1-6的整数，优选地选为1-4的整数，从而保证所述缀合分子中S1基团的个数至少为2；在一些实施方式中m1≥3，这样可以使得由该缀合分子形成的寡核苷酸缀合物中，M1配体的个数可能至少为3，从而使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进寡核苷酸缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，m1为2-4的整数。
本领域技术人员可能理解，每个R2选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基时，不会改变本公开提供的缀合分子的性质，均可能实现本公开的目的。在一些实施方式中，每个R2选自H、甲基或乙基。在一些实施方式中，每个R2为H。
R1包含经共价键连接的活性剂基团，或者R1包含连接基团以及通过所述连接基团共价连接的活性剂基团。在一些实施方式中，R1为能够结合到寡核苷酸的基团，该寡核苷酸因而能够由本公开的缀合分子递送至靶组织或靶细胞。在一些实施方式中，R1包含能够通过共价键与寡核苷酸结合的基团。在一些实施方式中，R1包含磷酸二酯键以及能够通过磷酸二酯键与寡核苷酸结合的基团。在一些实施方式中，R1的选择是为了实现与酰基下的碳原子的连接，并且为合成寡核苷酸缀合物提供合适的反应位点。在一些实施方式中，R1包含能够以适当方式连接至酰基碳原子的基团。在一些实施方式中，R1基团上含有与酰基碳原子连接的连接位点以及可能经反应而通过磷酸二酯键缀合至寡核苷酸的任意官能团。在一些实施方式中，R1基团上含有与酰基碳原子连接的连接位点以及可能经反应而通过酰胺键连接亚烷基缀合至寡核苷酸的任意官能团。
在一些实施方式中，R1是由R4基团转化获得的基团。在一些实施方式中，R1具有式(A62)所示结构：
Figure BDA0002166913120000291
其中，Nu表示活性药物基团；L3包含磷酸二酯键或酰胺键，L2为连接基团。
Nu选自活性药物基团，在一些实施方式中，Nu为功能性寡核苷酸，
Figure BDA0002166913120000292
表示基团共价连接的位点。
在一些实施方式中，L3是式(3)化合物中的R4基团经反应连接至活性药物而形成的连接基团。在一些实施方式中，L3是式(3)化合物中的R4基团经反应连接至功能性寡核苷酸而形成的连接基团。在一些实施方式中，L3基团中同时含有与酰基中的碳原子的连接位点以及与Nu中的氨基相连接的连接位点。在一些实施方式中，L3与Nu和L2分别形成酰胺键，从而将Nu表示的活性药物基团连接至缀合分子。
在一些实施方式中，L3为式(A59)所示的磷酸二酯键或磷酸二酯键类似物，其中，E1为OH、SH或BH2，结构如式(A59)所示：
Figure BDA0002166913120000301
在一些实施方式中，式(A59)中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上；在一些实施方式中，氧原子可以连接到寡核苷酸序列中核苷酸的3'位上。在一些具体的实施方式中，式(A59)中的P原子连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，可将该P原子及相应的磷酸酯基团视为归属于双链寡核苷酸中的P原子和磷酸酯基团)。
在一些实施方式中，L3为式(B701)所示的酰胺键，结构如下所示：
Figure BDA0002166913120000302
在一些实施方式中，式(B701)中的氮原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上；在一些实施方式中，氧原子可以连接到寡核苷酸序列中核苷酸的3'位上。
在一些实施方式中，L3具有式(B702)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000303
其中，每个n3为选自1-6的整数；
在一些实施方式中，式(B702)中的氧原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上；在一些实施方式中，氧原子可以连接到寡核苷酸序列中核苷酸的3'位上。
在一些实施方式中，L3式(B703)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000311
其中，每个n3为选自1-6的整数；
在一些实施方式中，式(B703)中的P原子可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上；在一些实施方式中，氧原子可以连接到寡核苷酸序列中核苷酸的3'位上。在一些具体的实施方式中，式(B703)中的P原子连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，可将该P原子及相应的磷酸酯基团视为归属于双链寡核苷酸中的P原子和磷酸酯基团)。L2为连接基团，在一些实施方式中，L2为将L3基团连接至缀合分子的基团。在一些实施方式中，L2为连接L3基团及功能性寡核苷酸至缀合分子的连接基团。在一些实施方式中，L2为C0-C10亚烷基。在一些实施方式中，L2为C0-C5亚烷基。在另外的实施方式中，L2含有式B5、B6、B5’或B6’所示结构：
Figure BDA0002166913120000312
其中，
Figure BDA0002166913120000313
表示基团共价连接的位点，q2为1-10的整数。在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”基团或分子是指能够与相应的配位体形成共价键的基团或分子，且缀合基团或分子及其配位体都具有特定的功能。相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的缀合部分共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”可理解为可通过反应缀合至寡核苷酸、最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。在一些实施方式中，寡核苷酸是siRNA，此时，本公开的缀合物是siRNA缀合物。
在一些实施方式中，本公开的缀合物具有式(B107)、(B108)、(B109)、(B110)或(B111)所示的结构：
Figure BDA0002166913120000321
Figure BDA0002166913120000331
Figure BDA0002166913120000341
其中，Nu表示活性剂基团。
在一些实施方式中，本公开的缀合物中的活性剂基团是寡核苷酸。此时，本公开的缀合物也被称为本公开的寡核苷酸缀合物。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸是功能性寡核苷酸。功能性寡核苷酸是指这样的寡核苷酸：所述寡核苷酸能够通过与靶序列之间产生稳定且特异性的杂交，利用RNA激活(RNA activation，RNAa)、RNA干扰(RNA interference，RNAi)、反义核酸技术、外显子跳跃(exon skipping)技术等原理，上调或下调靶基因的表达，或导致mRNA可变剪接。在一些方面，功能性寡核苷酸还可以是与靶蛋白之间产生稳定且特异性地结合的核酸结构。此外，本领域技术人员容易理解的是，多核苷酸(例如mRNA本身或其片段)也同样适用于与本公开提供的缀合分子缀合形成缀合物以实现靶向递送，比如肝靶向递送，从而调节mRNA转录出的蛋白质的表达。因此，在上下文中，“功能性寡核苷酸”的概念也可涵盖mRNA或其片段。
在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸能够与靶序列发生相互作用，从而影响靶序列分子的正常功能，如导致发生mRNA断裂或翻译阻遏或外显子跳跃引发mRNA可变剪接等。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以大体上与靶序列的碱基互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以与靶序列80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的碱基互补，或者与靶序列完全互补。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以含有1个、2个或3个不与靶序列互补的碱基。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、以及具有修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述功能性寡核苷酸可以是单链的DNA、RNA或DNA-RNA嵌合体(chimera)，或者是双链的DNA、RNA或DNA-RNA杂交体(hybrids)。
由此，在一些实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、核酸适配体(Nucleic Acid Aptamer)、小激活RNA(small activating RNA，saRNA)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。WO2015/006740A2公开了一种不同配体缀合到寡核苷酸的缀合物，其中配体通过接头(linker)与寡核苷酸进行连接，所述寡核苷酸选自小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、抗微小RNA(antimiR)、微小RNA拮抗剂(antagomir)、微小RNA模拟物(microRNA mimics)、诱饵寡核苷酸(decoy)、免疫刺激物(immune stimulatory)、G-四极子(G-quadruplex)、可变剪接体(splice altering)、单链RNA(ssRNA)、反义核酸(antisense)、适配体(aptamer)、茎环RNA(stem-loop RNA)或DNA中的一种。这些缀合物在寡核苷酸的体内递送上表现出好的稳定性。在进一步的实施方式中，适合包含于本公开的寡核苷酸缀合物的功能性寡核苷酸可以是WO2009082607A2、WO2009073809A2或WO2015006740A2中公开的寡核苷酸，以引用的方式将其整体内容并入本文。
本公开的寡核苷酸缀合物可通过提高活性剂比如功能性寡核苷酸的肝靶向递送效率，来调节特定细胞如肝细胞中特定基因的异常表达，，从而增强功能性寡核苷酸和细胞中靶向序列之间的相互作用。在一些实施方式中，所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在肝细胞中异常表达的基因可以是例如ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述在肝细胞异常表达的基因是HBV基因、ANGPTL3基因或APOC3基因。在本公开的上下文中，HBV基因是指序列如Genbank注册号NC_003977.1所示的基因；ANGPTL3基因是指mRNA序列如Genbank注册号NM_014495.3所示的基因；APOC3基因是指mRNA序列如Genbank注册号NM_000040.1所示的基因。
在一些实施方式中，“靶序列”是靶mRNA。在本公开的上下文中，“靶mRNA”是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA，它既可以是过量表达的基因对应的mRNA，或者是表达不足的基因对应的mRNA。由于大部分疾病源于mRNA的过量表达，因此，在本公开中，靶mRNA尤其指过量表达的基因对应的mRNA。在本公开的一些实施方式中，相应于上述异常表达的基因，所述靶mRNA可以是ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV等基因对应的mRNA。在一些实施方式中，所述靶mRNA可以是由对应HBV基因转录而得的mRNA、或者ANGPTL3基因所对应的mRNA、或者APOC3基因所对应的mRNA。
当本公开的寡核苷酸缀合物中的R1具有式(A62)所示的结构时，连接基团L3可以连接到寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，可以连接到寡核苷酸的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸是单链寡核苷酸(例如，单链RNA或者适配体)，此时，连接基团L3可以连接到所述单链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式(A62)中的碳链连接到所述单链寡核苷酸的末端。
在一些实施方式中，连接基团L3可以连接到寡核苷酸序列中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，L3可通过形成磷酸二酯键而连接至所述寡核苷酸序列中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，L3通过酰胺键连接至寡核苷酸中的具有氨基修饰的核苷酸。在一些具体实施方式中，连接基团L3连接在双链寡核苷酸序列中正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上，或者连接基团L3通过取代双链寡核苷酸序列中正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者连接基团L3通过取代双链寡核苷酸序列中正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接，又或者连接基团L3通过与双链寡核苷酸正义链3'末端核苷酸上连接的氨基形成酰胺键而与核苷酸连接。
在不愿受到限制的情况下，在下面的实施方式和实施例中，详细描述了本公开的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸为小干扰RNA(siRNA)的情况。此时，本公开的寡核苷酸缀合物为siRNA缀合物。在本文的上下文中，为了描述方便，也将这些实施方式中的siRNA缀合物称为本公开的siRNA缀合物。这并不代表本公开的寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸仅可以是siRNA，相反，所述寡核苷酸甚至活性药物可能是本公开的或者本领域技术人员所熟知的其它替代药物。根据siRNA缀合物的详细说明，可以设想其它活性药物或者功能性寡核苷酸与本公开提供的缀合分子缀合时也会有类似的作用。
本领域技术人员公知，siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。通常具有活性的，即功能性的siRNA的长度约为12-40个核苷酸，在一些实施方式中约为15-30个核苷酸，所述siRNA中的每个核苷酸可以独立地是修饰或未修饰的核苷酸，为了增加稳定性，所述siRNA中至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
本公开的发明人发现，下面的实施方式中所述的siRNA具有较高的活性和/或稳定性，因而可以作为本公开中siRNA的发明目的。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的siRNA(以下，也称为本公开的siRNA)中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成互补双链区，所述核苷酸序列2的至少一部分与第一段核苷酸序列互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是指在3mg/kg的浓度下，能够抑制至少50％乙型肝炎病毒基因表达、至少50％血管生成素样蛋白3基因表达或者至少50％载脂蛋白C3基因表达的siRNA。在一些实施方式中，本公开的siRNA指在浓度为3mg/kg时，能够抑制至少55％、60％、65％、70％、75％或80％HBV基因表达。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列。在不愿受到限制的情况下，这些特定的核苷酸差异并不会显著降低siRNA缀合物的靶基因抑制能力，而这些包含特定核苷酸差异的siRNA缀合物也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括，所述核苷酸序列2上的5'末端核苷酸Z'位置上的差异。在一些实施方式中，所述核苷酸序列1上的3'末端核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，该第二段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补。因此，所述正义链和反义链的长度可以是19-23个核苷酸。
在一个一些实施方式中，本公开的siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；在一些实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为1或2个核苷酸。这样，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比可以是19/20、19/21、20/21、20/22、21/22、21/23、22/23、22/24、23/24或23/25。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列相邻、或者和所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。在一个实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的肝细胞mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA不含修饰的核苷酸基团；在一些实施方式中，本公开的siRNA含有修饰的核苷酸基团。
目前，本领域存在多种可用于修饰siRNA的方式，包括骨架修饰(也称为核苷酸间连接修饰，如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(例如，请参见Watts，J.K.，G.F.Deleavey and M.J.Damha，Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today，2008.13(19-20)：p.842-55，以引用的方式将其整体内容并入本文)。
在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基被修饰，比如2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。
在本公开的一些实施方式中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基(或修饰的磷酸酯基和/或修饰的核糖基)。本公开的一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链和反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(207)所示的结构。
非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(208)所示。2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(209)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(210)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(211)所示。
Figure BDA0002166913120000391
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶的基团。在一些实施方式中，所述核苷酸类似物可以为如异核苷酸、桥联核酸(bridged nucleic acid，简称BNA)核苷酸或无环核苷酸。
BNA核苷酸是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖环的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸，如LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(212)所示，ENA如式(213)所示，cET BNA如式(214)所示。
Figure BDA0002166913120000401
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸，如解锁核酸(UNA)核苷酸或甘油核酸(GNA)核苷酸，其中，UNA如式(215)所示，GNA如式(216)所示。
Figure BDA0002166913120000402
其中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物，例如，碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(217)或(218)所示。
Figure BDA0002166913120000403
其中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代而形成的具有如式(207)所示的结构；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代，而形成如式(208)所示的结构。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为-氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：或者按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中所述核苷酸序列1的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中所述核苷酸序列2的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在本公开所述siRNA的一些具体实施方式中，所述核苷酸含有磷酸基团修饰。在本公开的上下文中，磷酸基团修饰在一个实施方式中为如下式(201)所示的硫代磷酸(phosphorthioate)修饰，即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。在一些实施方式中，该修饰能稳定siRNA的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
Figure BDA0002166913120000411
根据本公开一个一些实施方式，所述siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置的组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间的连接；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间的连接。
按照本公开一个一些实施方式，所述siRNA分子的反义链序列5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸可具有式(202)所示结构：
Figure BDA0002166913120000421
同时，常用的所述5'-磷酸类似物修饰的核苷酸的种类是本领域技术人员公知的，例如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution ofoligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开的如下如式(203)-(206)所示的4种核苷酸：
Figure BDA0002166913120000422
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团；
Base表示选自A、U、C、G或T的碱基。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为式(203)所示的含有乙烯基磷酸酯(E-vinylphosphonate，E-VP)的核苷酸、式(202)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸或式(205)所示的含有5'-硫代磷酸修饰的核苷酸。
本公开的发明人意外发现，本公开所述siRNA缀合物在具有显著提高的血清稳定性的同时，还表现出并未明显降低的靶mRNA沉默活性以及优异的基因表达抑制效果。从而显示出，本公开的siRNA缀合物具有较高的体内递送效率。按照本公开的一些实施方式，本公开的寡核苷酸缀合物为包含以下siRNA的siRNA缀合物，所述siRNA例如为表1A-1F中示出的siRNA：
表1一些实施方式中的siRNA序列
表1A
Figure BDA0002166913120000423
Figure BDA0002166913120000431
Figure BDA0002166913120000441
表1B
Figure BDA0002166913120000442
Figure BDA0002166913120000451
表1C
Figure BDA0002166913120000452
表1D
Figure BDA0002166913120000461
表1E
Figure BDA0002166913120000462
Figure BDA0002166913120000471
Figure BDA0002166913120000481
表1F
Figure BDA0002166913120000482
Figure BDA0002166913120000491
*S：正义链；AS：反义链
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以VP表示)、5'-磷酸修饰的核苷酸(以下实施例中以P表示)或硫代磷酸酯修饰的核苷酸(以下实施例中以Ps表示)。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
缀合物的制备
可以采用任意合理的合成路线制备本公开的缀合物。
例如，在本公开的缀合物为寡核苷酸的情况下，本公开的缀合物可以采用如下方法制备，该方法包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照所述寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；在一些实施方式中，所述方法还包含在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(3)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，从而使式(3)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。
在一些实施方式中，该方法还包含脱除保护基并与固相载体切割的步骤、分离纯化步骤。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(3)所示的化合物与正义链的3'端或反义链的5’端的第一个核苷单体接触，使式(3)所示的化合物连接上序列中第一个核苷酸，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成双链寡核苷酸的正义链或反义链；其中，式(3)化合物为R4具有式(A56)的结构，
Figure BDA0002166913120000501
与第一个核苷单体连接前，式(3)化合物经过脱保护；每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；得到连接有缀合分子的核酸的正义链或反义链；按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接来合成双链寡核苷酸另一条链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；脱除保护基并与固相载体切割，分离纯化获得核酸的正义链和反义链，退火。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述制备方法包含以下步骤：按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，合成连有式(3)化合物的正义链或反义链和其中一条链，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应，得到连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将式(3)所示的化合物与连接在固相载体上的正义链或连接在固相载体上的反义链接触，从而将式(3)化合物连接至正义链或反义链，其中，式(3)化合物是R4中结构为式(A56)化合物的式(3)化合物；脱除保护基并与固相载体切割，分别分离纯化，获得寡核苷酸的正义链或反义链，其中，所述寡核苷酸的正义链或反义链上连接有缀合分子，退火。
在一些具体实施方式中，式(A62)中L3为磷酸二酯键，基团(A62)通过L3连接至siRNA中的正义链的3'末端，本公开的siRNA缀合物的制备方法包括：
(1)脱除连接有固相载体的式(3)化合物(以下，也称为连接固相载体的L缀合分子)中的羟基保护基团Rk；在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将该连接固相载体的L缀合分子与核苷单体接触，得到通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体；
(2)以该通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向通过亚磷酰胺固相合成方法合成siRNA的正义链；
(3)通过亚磷酰胺固相合成方法，合成siRNA的反义链；
(4)分离出siRNA的正义链和反义链并退火，获得本公开的siRNA缀合物。
其中，在步骤(1)中，脱除该连接固相载体的L缀合分子中的保护基团Rk的方法包括在脱保护条件下，将式(3)化合物与脱保护试剂接触。脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与式(3)化合物的摩尔比为10:1-1000:1，在一些实施方式中为50:1-500:1。
所述偶联反应条件和偶联试剂可使用任何适于上述偶联反应的条件和试剂。在一些实施方式中，使用与所采用的固相合成方法中的偶联反应相同的条件与试剂。
在一些实施方式中，所述偶联反应的条件包括反应温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃。式(3)化合物与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:2-1:5；式(3)化合物和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:3-1:10，反应时间为200-3000秒，在一些实施方式中为500-1500秒。偶联试剂选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑、5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种，在一些实施方式中为5-乙硫基1H-四氮唑。所述偶联反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自无水乙腈、无水DMF、无水二氯甲烷中的一种或多种，在一些实施方式中为无水乙腈。相对于式(3)化合物，所述有机溶剂的用量为3-50L/mol，在一些实施方式中为5-20L/mol。
在步骤(2)中，通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用上述步骤制备的通过L缀合分子连接至固相载体的核苷单体起始，按照3'-5'的方向合成siRNA缀合物的正义链S。此时，L缀合分子连接至所得到的正义链的3'末端。
步骤(2)和(3)中所述固相合成的其它条件，包括核苷单体脱保护条件，脱保护试剂种类和用量，偶联反应条件，偶联试剂的种类和用量，盖帽反应的条件，盖帽试剂的种类和用量，氧化反应条件，氧化试剂种类和用量，硫化反应条件，硫化试剂和用量采用本领域中常规使用的各种试剂、用量和条件。
例如，在一些实施方式中，步骤(2)和(3)中所述固相合成可使用如下条件：
核苷单体脱保护条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为30-300秒，在一些实施方式中为50-150秒，脱保护试剂可以选自三氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸、中的一种或多种，在一些实施方式中为二氯乙酸。脱保护试剂与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的的摩尔比为2:1-100:1，在一些实施方式中为3:1-50:1。
偶联反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:1-1:50，在一些实施方式中为1:5-1:15；固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:1-1:100，在一些实施方式中为1:50-1:80，反应时间和偶联试剂的选择与前述相同。
盖帽反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为5-500秒，在一些实施方式中为10-100秒，盖帽试剂的选择与前述相同。盖帽试剂的总量与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:100-100:1，在一些实施方式中为1:10-10:1。在盖帽试剂使用等摩尔量的乙酸酐与N-甲基咪唑的情况下，乙酸酐、N-甲基咪唑以及固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1:10-10:10:1，在一些实施方式中为1:1:2-2:2:1。
氧化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为1-100秒，在一些实施方式中为5-50秒，氧化试剂在一些实施方式中为碘(在进一步实施方式中，以碘水的形式提供)。氧化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为1:1-100:1，在一些实施方式中为5:1-50:1。在一些实施方式中，所述氧化反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1-1:1:3的混合溶剂中进行。硫化反应条件包括温度为0-50℃，在一些实施方式中为15-35℃，反应时间为50-2000秒，在一些实施方式中为100-1000秒，硫化试剂在一些实施方式中为氢化黄原素。硫化试剂与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为10:1–1000:1，在一些实施方式中为10:1-500:1。在一些实施方式中，所述硫化反应在乙腈:吡啶＝1:3-3:1的混合溶剂中进行。
按照本公开提供的方法，在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，并脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团可按照siRNA合成中常规的切割和脱保护方法进行。例如，将得到的连接有固相载体的核苷酸序列与浓氨水接触；在脱保护的过程中，A46-A54基团的保护基团YCOO-转化为羟基，S1基团转化为相应的M1基团，从而生成式(1)所示的缀合物。其中，所述浓氨水是指25-30重量％的氨水，浓氨水的用量与目标siRNA序列相比为0.2ml/μmol-0.8ml/μmol。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2'-TBDMS保护时，所述方法还包括将脱除了固相载体的核苷酸序列与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除该2'-TBDMS保护。此时，所得到的目标siRNA序列中具有游离的2'-羟基的相应核苷。三乙胺三氢氟酸盐纯品的用量与目标siRNA序列相比为0.4ml/μmol-1.0ml/μmol。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。
在合成过程中，可随时对核酸序列的纯度和分子量进行检测，从而更好地把控合成质量，检测的方法为本领域技术人员所公知。例如，可通过离子交换色谱检测核酸纯度，并通过液质联用色谱测定分子量。
退火的方法也是本领域技术人员熟知的。例如，可简单地将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即可得到本公开的siRNA缀合物。
在获得本公开的缀合物后，在一些实施方式中，还可利用例如液质联用色谱等方法，通过分子量检测等方式对所合成的siRNA缀合物进行表征，确定所合成的siRNA缀合物为目标设计的siRNA缀合物，且所合成的siRNA的序列与欲合成的siRNA的序列相符，例如与上述表1中所列的序列相符。
在另外的实施方式中，本公开的缀合物可以通过以下方法制备：
按照如上所述的亚磷酰胺固相合成方法，合成寡核苷酸，其中，寡核苷酸序列中至少一个核苷酸是连接有氨基基团的氨基修饰核苷酸；
在缩合反应条件下，在溶剂中，将所合成的寡核苷酸与本公开的缀合分子相接触，其中，本公开的缀合分子中，R4具有亚胺酯基团，使寡核苷酸与本公开的缀合分子之间形成酰胺键连接，分离获得本公开的缀合物。
在一些实施方式中，溶剂可以是有机溶剂或水，在一些实施方式中，使用二甲亚砜、乙腈和碳酸氢钠水溶液的混合溶液。在一些实施方式中，使用二甲亚砜:乙腈:0.1M碳酸氢钠水溶液＝(400-500):(20-40):(10-30)(体积比)的混合溶剂。本领域技术人员容易理解的是，所使用的寡核苷酸是经保护的寡核苷酸。在一些实施方式中，所使用的寡核苷酸中仅存在一个未经保护的氨基，即所述氨基修饰核苷酸中的氨基。在一些实施方式中，与寡核苷酸相比，本公开的缀合分子的用量是至少为足量的。在一些实施方式中，寡核苷酸与本公开的缀合分子的摩尔用量比为1:(1-1.2)。所述分离可使用本领域公知的方法进行。例如，可将得到的缀合物与足量浓氨水接触，脱除缀合物中的羟基保护基团和氨基保护基团，随后使用离子色谱法纯化产物，冻干获得本公开的寡核苷酸缀合物。必要情况下，所述工艺还包括对产物进行检测表征的步骤。例如，可使用核酸定量仪或质谱对产物进行检测。
本公开的缀合物的应用
如本公开所示，所述缀合物可向细胞递送某种活性药物，用于治疗或预防可能需要这种递送的疾病或状况。在不愿受任何理论束缚的情况下，我们认为缀合分子的空间排列在靶向细胞表面受体方面特别有效，从而使负载的活性剂与细胞接触。因此，在一些实施方式中，本公开提供了一种将活性剂靶向递送至受试者肝细胞的方法，所述方法包括将活性剂与本公开的化合物形成本公开的缀合物，并向所述受试者给予所述缀合物。在一些实施方式中，这种缀合物是特异性地靶向至肝细胞的寡核苷酸缀合物。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物具有优异的肝靶向特异性，因此能够高效地将所缀合的功能性寡核苷酸递送至肝部，从而有效地对肝细胞内特定基因表达进行调控。从而，本公开的寡核苷酸缀合物具有广泛的应用前景。
按照本公开的一些实施方式，本公开提供了本公开的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达引起的生理状况或疾病的药物中的用途。所述特定基因可以是肝脏中表达的内源性基因，也可以是在肝脏中繁殖的病原体基因。在一些实施方式中，所述特定基因选自ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV等基因。在一些实施方式中，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。相应地，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。在一些实施方式中，本公开提供的缀合物也可用于治疗其它肝脏疾病，包括以不需要的细胞增殖为特征的疾病、血液疾病、代谢疾病和以炎症为特征的疾病。肝脏的增殖疾病可以是良性或恶性疾病，例如癌症、肝细胞癌(HCC)、肝转移或肝母细胞瘤。肝脏血液学或炎症疾病可以是涉及凝血因子、补体介导的炎症或纤维化的疾病。肝脏的代谢疾病包括血脂异常和葡萄糖调节的不规则性。在一些实施方案中，通过施用一种或多种具有与参与肝病的基因序列高度同源的寡核苷酸来治疗肝病。
按照本公开另外一种实施方式，本公开提供了一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，该方法包括将本公开的siRNA缀合物与所述肝细胞进行接触。
通过将本公开的寡核苷酸缀合物给予有需要的患者，可以通过对基因表达进行调控的机制达到预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的生理状况或疾病的目的。因此，本公开的寡核苷酸缀合物可用于预防和/或治疗所述生理状况或疾病、或用于制备用于预防和/或治疗所述生理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将缀合物如寡核苷酸缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将缀合物放置入患者体内。适于本公开方法的给药途径包括但并不仅限于局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与患者整个身体相比将更多寡核苷酸缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述寡核苷酸缀合物递送至患者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的生理状况或疾病的手段，在一些实施方式中为能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向患者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的寡核苷酸缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是患者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中，指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J小鼠，以所述寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸的量计：对于功能性寡核苷酸与缀合分子形成的寡核苷酸缀合物，被缀合物递送的寡核苷酸用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，在一个具体的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的寡核苷酸缀合物时，可参考上述用量。
另外，通过将本公开的寡核苷酸缀合物导入特定基因异常表达的肝细胞，还可以通过基因表达调控的机制达到抑制肝细胞中该特定基因的表达这一目的。在一些实施方式中，所述肝细胞为肝炎细胞，在一些实施方式中为HepG2.2.15细胞。在一些实施方式中，所述肝细胞可以选自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌细胞系或分离的肝原代细胞，在一些实施方式中为Huh7肝癌细胞。
采用本公开提供的方法抑制特定基因在肝细胞中表达，所提供的寡核苷酸缀合物中的功能性寡核苷酸的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如，在一些实施方式中，所述寡核苷酸缀合物是siRNA缀合物，所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
有益效果
在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸、组合物或寡核苷酸缀合物可在体内具有更高的稳定性、更低的毒性和/或更高的活性。在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸是saRNA。在一些实施方式中，本公开提供的saRNA、saRNA组合物或saRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的靶基因表达提高率。在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸是siRNA。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、siRNA组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的靶基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、siRNA组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的HBV基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、siRNA组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的肝内HBV基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、siRNA组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的动物模型中肝内HBV基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、siRNA组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的HBV表面抗原表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸、组合物或寡核苷酸缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。据认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。
根据本公开的一些实施方式，本公开的siRNA、siRNA组合物和siRNA缀合物显示出优异的抑制效果。例如，根据本公开的一个实施方式，本公开提供的siRNA缀合物表现出优异的抑制HBV基因表达的特性：在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中87.4％-92.2％的HBV基因表达。同时，本公开的siRNA缀合物还能够有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，在3mg/kg的剂量下可以达到96.9％的HBV表面抗原表达抑制率和95.4％的HBV DNA抑制率。特别地，与现有技术提供的相比，通过本公开提供的特定修饰的siRNA和特定缀合分子形成的特定siRNA缀合物，能够在低给药剂量的同时，在高达140天的实验时间内持续显示出优异的HBV表达抑制作用。
根据本公开的一个实施方式，本公开提供的siRNA缀合物表现出优异的抑制HBV基因表达的特性：在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中至少69.3％、在一个实施方式中为78.1-89.1％的HBV基因表达。同时，本公开的siRNA缀合物还能够有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，在3mg/kg的剂量下可以达到98.4％的HBV表面抗原表达抑制率和95.8％的HBV DNA抑制率。特别地，与现有技术提供的缀合分子形成的缀合物相比，通过本公开提供的特定修饰的siRNA和特定缀合分子形成的特定siRNA缀合物，能够在低给药剂量的同时，在高达84天的实验时间内持续显示出优异的HBV表达抑制作用。
根据本公开的一个实施方式，本公开提供的siRNA缀合物表现出优异的抑制HBV基因表达的特性：在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中至少48.5％、在一个实施方式中为76.8-80.0％的HBV基因表达。同时，本公开的siRNA缀合物还能够有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，甚至在3mg/kg的剂量下可以达到84.6％的HBV表面抗原表达抑制率和85.6％的HBV DNA抑制率。特别地，与参比缀合物相比，通过本公开提供的特定修饰的siRNA和特定缀合分子形成的特定siRNA缀合物，能够在低给药剂量的同时，在21天的实验时间内持续显示出较高的HBV表达抑制作用。
根据本公开的一个实施方式，本公开提供的siRNA缀合物表现出优异的抑制HBV基因表达的特性：在具有低脱靶效应的同时，能够在1mg/kg的剂量下抑制乙肝模型小鼠肝脏中至少60.1％、在一个实施方式中为80.7-84.5％的HBV X基因区基因表达。同时，本公开的siRNA缀合物还能够有效地降低乙肝模型小鼠中的HBV表面抗原表达，甚至在3mg/kg的剂量下可以达到94.8％的HBV表面抗原表达抑制率和95.8％的HBV DNA抑制率。特别地，与现有技术提供的缀合分子形成的缀合物相比，通过本公开提供的特定修饰的siRNA和特定缀合分子形成的特定siRNA缀合物，能够在低给药剂量的同时，在长达56天的实验时间内持续显示出优异的HBV表达抑制效果。
在某些实施方式中，本公开所述的siRNA缀合物还表现出低的动物水平毒性和良好的安全性，例如，在一些实施方式中，对于本公开的缀合物，即使在44BriHBV小鼠中给予高达起效浓度的100倍(按起效浓度3mg/kg计)，也未观察到明显的毒性反应。
上述示例说明，本公开提供的缀合物对靶细胞表面受体有效，并将负载的活性剂递送到表达受体的细胞。可以设想缀合物分子可适应于额外的细胞表面受体和额外的活性剂，以靶向表达这些受体的细胞的活性剂。
试剂盒
在另一方面，本文提供了包含如上所述的缀合物的试剂盒。
在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包括含有缀合物的容器。在一些实施方式中，这里提供的试剂盒包含一个药学上可接受辅料的容器。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒进一步包括药学上可接受的辅料，比如稳定剂或防腐剂。在一些实施方式中，本文提供的试剂盒包含至少一个附加的治疗剂。在一些实施方式中，该试剂盒包含至少一个不同于本公开所述缀合物的容器中的附加治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将缀合物与药学上可接受的辅料(对于有辅料而言)或其它成分进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述缀合物和任选的药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述寡核苷酸缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，在本公开的试剂盒中提供无菌水。
实施例
以下将通过实施例对本公开进行详细描述。除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照MolecularCloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
若无其它说明，所使用的动物模型如下：
HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J：购自北京大学医学部实验动物科学部。于实验前选择S/CoV＞10的小鼠，以下实验中简称为44BriHBV小鼠；
制备例1PNA缀合分子(缀合分子1)的制备
本制备例中，按照以下方法，合成了缀合分子1(以下，也称为PNA缀合分子)。
Boc：叔丁氧羰基
Fmoc：9-芴甲氧羰基
DIPEA：N,N'-二异丙基乙胺
HATU：2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
EA：乙酸乙酯
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
DCC：二环己基碳二亚胺
(1-1)多氨骨架分子的合成(化合物-6)
Figure BDA0002166913120000591
(1-1a)化合物-1的合成
将64g 9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的乙二胺(盐酸盐)(64g，0.20mol，1.0eq)溶于400mL乙腈中，然后向其中加入N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA)(77.89g，0.6mol，3eq)和2-溴乙酸苄酯(46.08g，0.2mol，1.0eq)，室温下搅拌反应2小时。用液质联用仪(LC-MS，LiquidChromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)监测反应完全，取200Ml去离子水水洗，然后用二氯甲烷(DCM，200mLx2)萃取，有机相纯化得到化合物-1(76g，收率：88.4％)。MS m/z：C26H26N2O4，[M+H]+，理论：430.19，实测：431.20。
(1-1b)化合物-2的合成
将得到的化合物-1 66g(0.153mol，1.0eq)溶于300Ml二氯甲烷中，加入二碳酸二叔丁酯(50g，0.23mol，1.5eq)，再加入DIPEA(35g，0.276mol，1.8eq)，室温下搅拌反应2小时。用LC-MS监测反应完全，结束反应，取150mL去离子水水洗，然后二氯甲烷萃取2次，每次用600mL，合并有机层，浓缩得到粗品用硅胶柱层析(200～300目正相硅胶，洗脱梯度为石油醚:乙酸乙酯＝10:1～1:1)纯化收集目标分子，浓缩至干得到化合物-2(62g，收率：71.5％)。
(1-1c)化合物-3的合成
将得到的化合物-2(62g，0.117mol，1.0eq)溶于234mL甲醇中，加入Pd/C(6.2g，化合物-2质量的10％)，在氢气球保护反应体系中常温搅拌2小时，用LC-MS监测反应完全，抽滤并蒸干滤液，得到化合物-3粗品(43g，79.6％)。粗品浓缩至干，直接作为下一步原料。
(1-1d)化合物-4的合成
将化合物-3(32g，73mmol，1.0eq)与叔丁氧羰基(Boc)保护的乙二胺(18.1g，103mmol，1.6eq)溶于146mL二氯甲烷中，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，49.7g，131mmol，1.8eq)，在冰浴下加入DIPEA(23.5g，181mmol，2.5eq)，室温下搅拌3小时，用薄层色谱法TLC监测反应完全，加入73Ml去离子水水洗，分出有机层，继续向水相中加入580mL二氯甲烷进行萃取，合并有机相后进行旋干柱层析(200～300目正相硅胶，石油醚:乙酸乙酯＝20:1-1:1梯度洗脱)，纯化收集目标产物浓缩得到化合物-4(11.7g，收率：26.2％)。MS m/z：C31H42N4O7，[M+H]+，理论：583.31，实测：583.37。
(1-1e)化合物-5的合成
将化合物-4(11g，18.9mmol，1.0eq)和75.6mL二乙胺溶于378mL乙腈中，室温下搅拌3小时，用TLC和LC-MS监测反应完全，蒸干溶剂，得到化合物-5(6g，收率：88.2％)，直接用于下一步反应。MS m/z：C16H32N44O5，[M+H]+，理论：361.24，实测：361.33。
(1-1f)化合物-6的合成
将化合物-5(6g，7.7mmol，1.0eq)与化合物-3(3.37g，7.7mmol，1.0eq)溶于77mL二氯甲烷中，加入HATU(4.4g，11.55mmol，1.5eq)，冰水浴下加入DIPEA(2.5g，19.25mmol，2.5eq)，室温下搅拌3小时，用LC-MS监测反应完全，反应结束以后加入38mL去离子水，分出有机相，水相继续用二氯甲烷萃取2次，每次154mL，合并有机层。蒸干有机相过正向柱，用乙酸乙酯(EA)：甲醇＝5:1将产物分离出来，得到化合物-6(10g，收率：76.9％)。MS m/z：C40H58N6O10，[M+H]+，理论：783.42，实测：783.57。
(1-2)GalNAc分子簇的合成
Figure BDA0002166913120000611
(1-2a)化合物-7的合成
将化合物-6(10g，12.8mmol)加入至100mL盐酸/乙醇(30％)混合液，室温下搅拌2小时，固体沉淀消失变成透明反应液，用LC-MS监测反应完全，反应结束后，蒸去溶剂，油泵抽干得到化合物-7(6.18g，收率：100％)，直接作为下一步反应原料。
(1-2b)化合物-8的合成
将化合物-7(6.18g，12.8mmol，1.0eq)用80mL二氯甲烷溶解，加入Gal-5(22.9g，51.2mmol，4.0eq)，再加入HATU(21.89g，57.6mmol，4.5eq)，最后在冰水浴条件下加入DIPEA(16.5g，128mmol，10.0eq)，反应搅拌3小时，利用LC-MS监测反应完全，加去离子水进行淬灭反应，用160mL二氯甲烷萃取，合并有机相，用30mL饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤旋干，通过柱纯化硅胶(200-300目)正向柱，用展开剂二氯甲烷：甲醇＝5:1过柱得到黄色固体化合物-8(4g，收率：18.2％)。MS m/z：C82H115N9O34，[M+H]+，理论：1770.75，实测：1771.3。
(1-2c)化合物-9的合成
将化合物-8(2g，1.13mmol，1.0eq)溶于5mL无水乙腈，加入1.5mL二乙胺，室温下搅拌3小时，用TLC监测反应完全。将反应液蒸干，加入10mL甲醇稀释后再次蒸干，重复三次，后用油泵拉干发泡，得到化合物-9(1.7g，收率：100％)，直接作为下一步反应原料。MS m/z：C67H105N9O32，[M+H]+，理论：1548.69，实测：1548.86。
(1-2d)化合物-10的合成
将化合物-9(1.7g，1.1mmol，1.0eq)和丁二酸酐(0.08mL，1.3mmol，1.2eq)溶于DCM(10mL)的DIPEA(709.5mg，5.5mmol，5.0eq)溶液中，室温下搅拌反应4小时，用LC-MS监测反应完全，将反应液蒸干，用2.0mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解过滤，通过反相C18柱(流动相：水(含0.05％TFA):乙腈＝95％～5％)收集目标分子，并浓缩冻干得到化合物-10(1.2g，收率：66.7％)。MS m/z：C67H105N9O32，[M+H]+，理论：1548.69，实测：1548.86。
(1-3)活化酯的合成及连接核酸反应
Figure BDA0002166913120000621
(1-3a)化合物-11的合成
将化合物-10(600mg，0.36mmol，1.0eq)溶于5mL二氯甲烷中，室温下搅拌，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，46.8mg，0.4mmol，1.1eq)，环己基碳二亚胺(DCC，89.2mg，0.43mmol，1.2eq)，室温下搅拌10小时，用LC-MS监测，显示反应完全后结束抽滤，浓缩母液得到化合物-11(800mg，收率：137.9％)，直接进行下步反应。MS m/z：C71H109N9O35，[M+H]+，理论：1648.7，实测：1648.23。
(1-3b)合成siHBa1正义链
本步骤中，siRNA缀合物的siRNA为编号为siHBa1的序列：
siHBa1
正义链：5'-CCUUGAGGCAUACUUCAAA-3'(SEQ ID NO:1)，
反义链：5'-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3'(SEQ ID NO:2)；
通过亚磷酰胺核酸固相合成的方法，利用通用固相载体(UnyLinkerTMloaded
Figure BDA0002166913120000622
HL Solid Supports)起始循环，按照上述序列的正义链序列顺序按照3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应。合成条件给定如下：
核苷单体以0.1M浓度的乙腈溶液提供，每一步的脱保护反应的条件相同，即温度为25℃，反应时间为70秒，脱保护试剂为二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％v/v)，二氯乙酸与固相载体上4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基的摩尔比为5:1。
每一步偶联反应条件均相同，包括温度为25℃，固相载体上连接的核酸序列与核苷单体的摩尔比为1:10，固相载体上连接的核酸序列和偶联试剂的摩尔比为1:65，反应时间为600秒，偶联试剂为5-乙硫基-1H-四氮唑的0.5M乙腈溶液。
每一步盖帽条件均相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒。盖帽试剂溶液为摩尔比为1:1的Cap1和Cap2的混合溶液，盖帽试剂与固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为乙酸酐:N-甲基咪唑:固相载体上连接的核酸序列＝1:1:1。
每一步氧化反应条件相同，包括温度为25℃，反应时间为15秒，氧化试剂为浓度为0.05M的碘水。碘与偶联步骤中固相载体上连接的核酸序列的摩尔比为30:1。反应在四氢呋喃:水:吡啶＝3:1:1的混合溶剂中进行。
从而，该步骤中固相载体缀合在siRNA 3'末端的siRNA正义链S。
(1-3c)化合物-12的合成
加入3’C6-NH2修饰的核酸(267mg，0.04mmol，1.0eq)，溶解于混合溶剂(V100mmolNaHCO3水溶液：VCH3CN:VDMSO＝23：33：445ml)，室温下震荡。同时，向化合物-11(800mg未经纯化的样品)中加入混合溶剂，当有较多固体析出，进行抽滤。后将母液加入到溶解有核酸的的混合溶液中，25℃反应过夜，LC-MS显示反应结束，将样品浓缩，经反向纯化，收集主要核酸产物化合物-12(180mg，收率：55.7％)。M/Z[M+H]+，理论：8077.91，实测：8077.5。
(1-3d)化合物-13的合成
将上一步合成的连接有载体的核苷酸序列180mg核酸化合物-12，加入1ml氨水25wt％中，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16小时，除去液体，真空浓缩至干。，在40℃下反应18小时，LC-MS显示反应结束，利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH8.1)，溶剂为水/乙腈＝9：:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9：:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用葡聚糖凝胶柱进行脱盐，填料为葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)，以去离子水洗脱。收集纯品并冻干得到化合物-13(即，缀合有递送载体的正义链序列)。以核酸定量仪测定产物，确定所得核酸序列(按核酸部分计算为80mg，收率：46.8％)。M/Z[M+H]+，理论：7699.8，实测：7697.1。
(1-4)反义链的合成步骤与上述正义链的合成相同，区别在于，使用如下方法将5'-磷酸酯修饰连接至反义链5'端：
原料为具有如下式CPR-I结构的磷酸化结构单体，由苏州吉玛提供，货号Cat#13-2601-XX：
Figure BDA0002166913120000641
在反义链全部核苷单体连接完毕后，按照上述亚磷酰胺核酸固相合成的方法，经脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应将式CPR-I单体连接至反义链5'末端。
随后，按照如下条件进行切割与脱保护，获得反义链：
将合成的连接有载体的核苷酸序列加入浓度为25wt％的氨水中，相对于核苷酸序列，氨水用量为0.5ml/μmol，在55℃反应16小时，除去液体，残余物用真空浓缩至干。在氨水处理后，相对于单链核酸的量，以0.4ml/μmol N-甲基吡咯烷酮溶解产品，随后加入0.3ml/μmol三乙胺和0.6ml/μmol三乙胺三氢氟酸盐，从而脱除核糖上的2'-TBDMS保护。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱柱(Source 15Q)，通过NaCl的梯度洗脱纯化核酸。具体而言为：洗脱剂A：20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱剂B：1.5M氯化钠，20mM磷酸钠(pH 8.1)，溶剂为水/乙腈＝9:1(体积比)；洗脱梯度：洗脱剂A:洗脱剂B＝100:0-50:50梯度洗脱。收集产品洗脱液后合并，采用反相色谱纯化柱进行脱盐，具体条件包括采用Sephadex柱进行脱盐，填料为Sephadex-G25，以去离子水洗脱。
对于上述合成的正义链和反义链，使用离子交换色谱(IEX-HPLC)检测纯度，并以液质联用色谱(LC-MS)分析分子量，确认所合成的核酸序列分别是对应于表2中缀合物1的正义链与反义链的siRNA序列。
在制备出反义链后，将所得缀合有靶向基团的正义链(S链)与反义链(AS链)配对退火成双链。退火步骤包括将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用水中加热至70-95℃，随后室温冷却，使其通过氢键形成双链结构。这样即得到目标siRNA缀合物1。
表2siRNA缀合物
Figure BDA0002166913120000642
*S：正义链；AS：反义链
注：大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接；P表示该字母P右侧的一个核苷酸为磷酸酯修饰的核苷酸。
利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于WatersCorp.，型号：LCT Premier)进行分子量检测。其结果，实测值与理论值相符，从而确定所合成的缀合物1是目标设计的化合物，其结构如式(B107)所示。
实验例
本实验说明表2中siRNA缀合物在体内(in vivo)HBV mRNA表达量的抑制效率
在本实验例中，对缀合物1在HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(Alb1HBV)44Bri/J中对HBV mRNA表达量的抑制效率进行了考察。
首先，将44BriHBV小鼠按血清HbsAg含量随机分组(均为雌性)，每组6只小鼠，分别给予上述合成的缀合物1，并增加PBS对照组。所有动物根据体重计算药量，单次给药(采用皮下给药)，分别以1mg/kg和0.3mg/kg的剂量给药，使用浓度分别为0.2mg/ml以及0.06mg/ml的缀合物的0.9％氯化钠水溶液，给药体积为5mL/kg。给药后第14天将动物处死，收集肝脏，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol根据总RNA提取的标准操作步骤提取得到总RNA。
采用实时荧光定量PCR检测肝组织中HBV mRNA的表达水平，具体地：使用ImProm-IITM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)检测siRNA对肝组织中的HBV mRNA表达的抑制效率。在该荧光定量PCR法中，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，使用针对HBV的引物和针对GAPDH的引物分别对HBV和GAPDH进行检测。
检测引物的序列参见表3。
表3检测引物的序列
Figure BDA0002166913120000651
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用HBV基因表达剩余量表示，按如下等式计算：
HBV基因表达剩余量＝(测试组HBV基因的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组HBV基因的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)×100％，
随后根据下式计算mRNA抑制率：
mRNA抑制率＝(1-HBV基因表达剩余量)×100％，
其中，对照组为本实验中施以PBS的对照组小鼠，各测试组为分别施以不同siRNA缀合物的给药组小鼠。结果示于图1中。由图1可见，通过给予缀合物1，显著降低了小鼠体内的HBV基因表达水平。上述实验结果显示出，本公开的缀合物能够有效递送siRNA，具有优异的体内效果。
以上详细描述了本公开的具体实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 苏州瑞博生物技术有限公司
<120> 肝靶向化合物及缀合物
<130> 14517RIBO
<160> 140
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> RNA
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<400> 19
gaccuugagg cauacuucaa a 21
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
uuugaaguau gccucaaggu u 21
<210> 23
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<211> 23
<212> RNA
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<212> RNA
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<211> 21
<212> RNA
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uagaagauga ggcauagcag c 21
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<212> RNA
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ucugugccuu cucaucuga 19
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ucagaugaga aggcacagac g 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaagagcac caagaacua 19
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
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<212> RNA
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<400> 98
ccaagagcac caagaacua 19
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<212> RNA
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<400> 100
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
uaguucuugg ugcucuuggc u 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
uaguucuugg ugcucuuggc uug 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
uucuugucca gcuuuauugg g 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
uucuugucca gcuuuauugg g 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 119
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 120
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
cccaauaaag cuggacaaga a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 124
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
caauaaagcu ggacaagaa 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
cccaauaaag cuggacaaga a 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 129
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
uucuugucca gcuuuauugg g 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 133
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
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<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
ccgtctgtgc cttctcatct 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
taatctcctc ccccaactcc 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
aggggccatc cacagtcttc 20

Claims (30)

1.一种化合物，该化合物具有式(3)所示的结构：
Figure FDA0002166913110000011
其中，
每个n1独立地为选自2-10的整数，优选2-6的整数；每个n2独立地为选自1-6的整数，优选1-4的整数；
m1为选自1-6的整数；优选2-4的整数；
每个R2独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
R4为能够与活性药物形成共价连接的基团；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个S1独立地为M1，其中任何活性羟基，如果有的话，都被羟基保护基团保护；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个L1独立地选自于由式A1-A26基团及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0002166913110000021
Figure FDA0002166913110000031
其中，每个j1独立地为1-20的整数；每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自于由A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0002166913110000032
Figure FDA0002166913110000041
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure FDA0002166913110000042
表示基团共价连接的位点；
可选地，L1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13及中的一种或多种的连接组合；
可选地，L1为基团A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；
可选地，L1为基团A1、A8和A10中至少2个的连接组合；
可选地，L1的长度为3-25个原子，所述L1的长度是指与含氮骨架中的N原子连接的原子到与S1连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；
可选地，L1的长度为4-15个原子。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，每个j1独立地为2-10的整数，每个j2独立地为2-10的整数，每个R’独立地为C1-C4烷基，每个Ra独立地为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，每个Rb独立地为C1-C5烷基；
可选地，每个j1独立地为3-5的整数，每个j2独立地为3-5的整数，每个R’独立地为甲基、乙基和异丙基中的一种，每个Ra独立地为A27或A28，每个Rb独立地为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个n1独立地为2-6的整数，可选地为2-4的整数；和/或每个n2独立地为1-6的整数，可选地为1-4的整数；
m1为1-6的整数，可选地为2-4的整数。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述活性药物包含活性反应基团，R4包括第1官能团，所述第1官能团可与所述活性反应基团发生反应以形成共价键连接；
其中，可选地，所述活性反应基团为氨基，所述第1官能团为亚胺酯基；或者，所述活性反应基团为羟基，所述第1官能团为亚磷酰胺；或者，所述活性反应基团为羧基、酯基或酰卤，所述第1官能团为羟基或受保护的羟基；可选地，R4为能够通过酰胺键连接到寡核苷酸的基团。
6.根据权利要求1或5所述的化合物，其中，R4进一步包括第2官能团，所述第2官能团能够和羟基基团或氨基基团形成共价键，或者为可通过与羟基基团或氨基基团形成共价键而连接的固相载体；
可选地，所述第2官能团，为亚磷酰胺、羧基或羧酸盐；
可选地，所述羧酸盐为带有金属阳离子的羧酸盐、羧酸铵盐、三级胺形成的羧酸盐或带有季铵阳离子的羧酸盐；
可选地，所述羧酸盐为三乙胺羧酸盐或N,N-二异丙基乙胺羧酸盐；
所述共价键为磷酸酯键、羧酸酯键和/或酰胺键；可选地，所述固相载体为树脂。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中，R4包括羟基、-ORk、由式(C3)表示的基团或由式(A56)表示的基团：
Figure FDA0002166913110000051
其中，Rk为羟基保护基团，L2为连接基团，
Figure FDA0002166913110000053
表示基团共价连接的位点；
可选地，L2为C1-C20亚烷基、优选C1-C10亚烷基、更优选C2-C5亚烷基；
可选地，L2为亚乙基。
8.根据权利要求1或5所述的化合物，可选地，R4包括由式(C1)、(C2)、(C3)、(C1’)或(C3’)所示的结构：
Figure FDA0002166913110000052
Figure FDA0002166913110000061
式中，q1为1-4的整数，X为O或NH，M+为阳离子，Rk为羟基保护基团，SPS表示固相载体，
Figure FDA0002166913110000063
表示基团共价连接的位点；
可选地，R4含有式(B9)、(B10)、(B11)、(B12)、(B9’)、(B10’)、(B11’)或(B12’)所示的结构：
Figure FDA0002166913110000062
Figure FDA0002166913110000071
其中，每个q1独立地为1-4的整数，每个q2独立地为1-10的整数，可选地，每个q1独立地为1-2的整数；每个q2独立地为1或2；X为O或NH，M+为阳离子，SPS表示固相载体，Rk为羟基保护基团，
Figure FDA0002166913110000072
表示基团共价连接的位点。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中，受保护的羟基具有YCOO-的结构式，每个Y独立地选自以下组成的组：C1-C10烷基和C6-C10芳基，所述C1-C10烷基或C6-C10芳基任选地具有一个或多个取代基，所述取代基选自于由卤素取代基和C1-C6烷基所组成的组；
可选地，每个Y独立地选自于由以下基团所组成的组：甲基、三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、乙基、正丙基、异丙基、苯基、卤代苯基和C1-C6烷基苯基。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个M1独立地为糖；可选地，每个M1独立地为单糖、二糖、三糖或多糖；
可选地，至少一个M1为经修饰的；
可选地，每个M1独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种；
可选地，至少一个M1为N-乙酰基半乳糖胺GalNAc；
可选地，每个M1都是N-乙酰基半乳糖胺。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中，每个S1独立地选自式A46-A54基团中的一种：
Figure FDA0002166913110000081
可选地，S1为式A49或A50；可选地，Y为甲基。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个R2独立地为H、甲基或乙基；可选地，每个R2均为H。
13.根据权利要求1所述的化合物，其中，该化合物具有式(B113)-(B116)中任意一个所示的结构：
Figure FDA0002166913110000091
Figure FDA0002166913110000101
14.一种缀合物，该缀合物具有式(1)所示的结构：
Figure FDA0002166913110000111
其中：
每个n1为选自2-6的整数，优选2-4的整数，每个n2为选自1-6的整数，优选1-4的整数；
m1为选自1-6的整数，优选2-4的整数；
每个R2各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
R1包含经共价键连接的活性剂基团；
每个L1是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个M1独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其中，每个L1独立地选自于由基团A1-A26基团及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0002166913110000121
其中，每个j1独立地为1-20的整数；每个j2独立地为1-20的整数；
每个R’独立地为C1-C10烷基；
每个Ra独立地选自于由A27-A45及其任意组合所组成的组：
Figure FDA0002166913110000131
Figure FDA0002166913110000141
每个Rb独立地为C1-C10烷基；
Figure FDA0002166913110000143
表示基团共价连接的位点；
可选地，L1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13中的一种或多种的连接组合；
可选地，L1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；
可选地，L1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合；
可选地，L1的长度为3-25个原子，所述L1的长度是指与含氮骨架中的N原子连接的原子到与M1连接的原子形成的最长的原子链上的成链原子的个数；
可选地，L1的长度为4-15个原子。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中，每个j1独立地为2-10的整数，每个j2独立地为2-10的整数，每个R’独立地为C1-C4烷基，每个Ra独立地为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，每个Rb独立地为C1-C5烷基；
可选地，每个j1独立地为3-5的整数，每个j2独立地为3-5的整数，每个R’独立地为甲基、乙基和异丙基中的一种，每个Ra独立地为A27或A28，每个Rb独立地为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种；
每个R2独立地为H、甲基或乙基；可选地，每个R2均为H。
17.根据权利要求15所述的缀合物，其中，R1包含连接基团以及通过所述连接基团共价连接的活性剂基团，可选地，R1具有式(A62)的结构；
Figure FDA0002166913110000142
其中，Nu表示活性剂基团；L3包含磷酸二酯键或酰胺键，L2为连接基团，
Figure FDA0002166913110000154
表示基团共价连接的位点。
18.根据权利要求17所述的缀合物，其中，L3包含式A59所示的结构：
Figure FDA0002166913110000151
其中，E1为OH、SH或BH2；
L2具有式B5、B6、B5’或B6’所示的结构：
Figure FDA0002166913110000152
其中，
Figure FDA0002166913110000155
表示基团共价连接的位点，q2为1-10的整数；
可选地，L3包含酰胺键，L2为长度为1-20的亚烷基基团；
可选地，L3具有式B701所示的结构：
Figure FDA0002166913110000153
其中，
Figure FDA0002166913110000156
表示基团共价连接的位点；
可选地，L2为长度为1-5的亚烷基基团。
19.根据权利要求14所述的缀合物，其中，每个M1独立地为糖；
可选地，每个M1独立地为单糖、二糖、三糖或多糖；
可选地，至少一个M1为经修饰的；
可选地，每个M1独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种；
可选地，至少一个M1为N-乙酰基半乳糖胺；
可选地，每个M1都是N-乙酰基半乳糖胺。
20.根据权利要求14所述的缀合物，其中，该缀合物具有式(B107)-(B111)中任意一个所示的结构：
Figure FDA0002166913110000171
Figure FDA0002166913110000181
Figure FDA0002166913110000191
其中，Nu表示活性剂基团；
可选地，Nu为功能性寡核苷酸；
可选地，所述功能性寡核苷酸选自小干扰RNA、微小RNA、抗微小RNA、微小RNA拮抗剂、微小RNA模拟物、诱饵寡核苷酸、免疫刺激物、G-四极子、可变剪接体、单链RNA、反义核酸、核酸适配体、茎环RNA、mRNA片段、激活RNA或DNA中的一种；
可选地，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸或者双链寡核苷酸。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸，L3连接到所述单链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述单链寡核苷酸中从一端起算的前4个核苷酸；可选地，L3连接到所述单链寡核苷酸的末端；可选地，L3连接到所述单链寡核苷酸的3'末端或5'末端。
22.根据权利要求20所述的缀合物，其中，所述功能性寡核苷酸为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，L3连接到所述双链寡核苷酸的端部，所述单链寡核苷酸的端部指所述正义链或所述反义链中从一端起算的前4个核苷酸；可选地，L3连接到所述正义链或所述反义链的末端；可选地，L3连接到所述正义链的3'末端或5'末端；可选地，L3连接至所述寡核苷酸缀合物中的核苷酸的2'位、3'位或5'位；
可选地，所述双链寡核苷酸为siRNA；
可选地，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述siRNA含有正义链和反义链，其中，所述正义链包含核苷酸序列1，所述反义链包含核苷酸序列2，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2的长度均为19个核苷酸，并且至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列2与第一段核苷酸序列至少部分互补，所述第一段核苷酸序列为靶mRNA中的一段核苷酸序列，所述靶mRNA是指在肝细胞中异常表达的基因对应的mRNA；
可选地，所述靶mRNA选自以下基因对应的mRNA中的一种：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FXII、p53、HBV、HCV；
可选地，所述靶mRNA选自乙型肝炎病毒的mRNA、血管生成素样蛋白3基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3基因表达的mRNA；
可选地，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列2与核苷酸序列B长度相等，且不超过3个核苷酸差异；所述核苷酸序列B为与所述第一段核苷酸序列完全反向互补的核苷酸序列；
可选地，所述核苷酸序列1与所述第一段核苷酸序列不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B不多于1个核苷酸差异；
可选地，所述核苷酸序列2与所述核苷酸序列B之间的核苷酸差异包括所述核苷酸序列2上的5'末端核苷酸Z'位置上的差异；
可选地，所述核苷酸序列1上的3'末端核苷酸Z是与Z'互补的核苷酸；
可选地，所述核苷酸序列1和所述核苷酸序列2基本上反向互补、基本上完全反向互补或完全反向互补；
可选地，所述正义链还含有核苷酸序列3，所述反义链还含有核苷酸序列4，所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4的长度相等且均为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列3连接在所述核苷酸序列1的5'末端，并且所述核苷酸序列4连接在所述核苷酸序列2的3'末端，所述核苷酸序列4与第二段核苷酸序列互补，所述第二段核苷酸序列是指靶mRNA中和所述第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列4相同的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列3和所述核苷酸序列4基本上完全反向互补或完全反向互补；
可选地，所述siRNA还含有核苷酸序列5，所述核苷酸序列5的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端；
可选地，所述核苷酸序列5的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列5为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸、连续的2个尿嘧啶核苷酸、或者与第三段核苷酸序列互补，所述第三段核苷酸序列是指靶mRNA中与所述第一段核苷酸序列或所述第二段核苷酸序列相邻，并且长度与所述核苷酸序列5相等的核苷酸序列。
23.根据权利要求22所述的缀合物，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；
可选地，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，所述非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，核苷酸类似物为能够替换核酸上核苷的基团，具有与腺嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸或胸腺嘧啶核苷酸；
可选地，正义链和反义链均包含氟代修饰的核苷酸和非氟代修饰的核苷酸，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列1和核苷酸序列2中，所述核苷酸序列1中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列1的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列2中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；
可选地，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列1的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列2的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；
可选地，所述核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸(DNA)中的一种；所述核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种；
可选地，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸是指所述核苷酸中核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
24.根据权利要求22或23所述的缀合物，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；
可选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(201)所示结构的硫代磷酸酯基：
Figure FDA0002166913110000221
可选地，硫代磷酸酯键存在于以下至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
可选地，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为具有由以下式(202)-式(206)中的一个表示的核苷酸：
Figure FDA0002166913110000222
其中，R表示选自于由H、OH、F和甲氧基所组成的组的基团，Base表示选自A、U、C、G或T的碱基；
可选地，所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为由式(202)、式(203)或式(205)表示的核苷酸。
26.根据权利要求14-25中任意一项所述的缀合物在制备用于治疗和/或预防肝细胞功能异常而引起的生理状况或疾病的药物中的用途。
27.根据权利要求14-25中任意一项所述的缀合物在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的生理状况或疾病的药物中的用途；可选地，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。
28.根据权利要求27所述的用途，其中，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和血脂异常；
可选地，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
29.一种抑制或促进肝细胞中特定基因表达的方法，其中，所述方法包括将权利要求14-25中任意一个所述的缀合物与所述肝细胞进行接触；
可选地，所述特定基因选自以下基因中的一种：ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、FVII、p53、HBV、HCV；
可选地，所述特定基因选自乙型肝炎病毒基因、血管生成素样蛋白3基因或者载脂蛋白C3基因。
30.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求14-25中任意一个所述的缀合物。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022206946A1 (zh) * 2021-04-02 2022-10-06 上海拓界生物医药科技有限公司 乙型肝炎病毒siRNA和siRNA缀合物
WO2023274395A1 (zh) * 2021-07-02 2023-01-05 上海拓界生物医药科技有限公司 一种核酸配体及其缀合物、其制备方法和用途
WO2023088455A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
WO2023179773A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Hansoh Bio Llc Bicyclic heterocycles and their ligands for targeted delivery of therapeutic agents
WO2023198200A1 (zh) * 2022-04-14 2023-10-19 苏州瑞博生物技术股份有限公司 缀合物与组合物及制备方法和用途
WO2024040531A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-29 1Globe Health Institute, Nanjing Novel compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102083983A (zh) * 2008-08-01 2011-06-01 苏州瑞博生物技术有限公司 乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用
CN107109405A (zh) * 2014-06-06 2017-08-29 索尔斯蒂斯生物有限公司 具有生物可逆性和非生物可逆性基团的多核苷酸构建体
WO2019128611A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102083983A (zh) * 2008-08-01 2011-06-01 苏州瑞博生物技术有限公司 乙型肝炎病毒基因的小核酸干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用
CN107109405A (zh) * 2014-06-06 2017-08-29 索尔斯蒂斯生物有限公司 具有生物可逆性和非生物可逆性基团的多核苷酸构建体
WO2019128611A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
CN110959011A (zh) * 2017-12-29 2020-04-03 苏州瑞博生物技术有限公司 缀合物及其制备方法和用途

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022206946A1 (zh) * 2021-04-02 2022-10-06 上海拓界生物医药科技有限公司 乙型肝炎病毒siRNA和siRNA缀合物
WO2023274395A1 (zh) * 2021-07-02 2023-01-05 上海拓界生物医药科技有限公司 一种核酸配体及其缀合物、其制备方法和用途
WO2023088455A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
WO2023179773A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Hansoh Bio Llc Bicyclic heterocycles and their ligands for targeted delivery of therapeutic agents
WO2023198200A1 (zh) * 2022-04-14 2023-10-19 苏州瑞博生物技术股份有限公司 缀合物与组合物及制备方法和用途
WO2024040531A1 (en) * 2022-08-25 2024-02-29 1Globe Health Institute, Nanjing Novel compositions for conjugating oligonucleotides and carbohydrates

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