JP7261494B2 - 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents
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Description
5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZ-3’(配列番号1)、
5’-Z’AGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(配列番号2)
ただし、ZはAであり、Z’はUである。
前記ヌクレオチド配列Aには、位置がZに対応するヌクレオチドZAが含まれ、前記ヌクレオチド配列Bには、位置がZ’に対応するヌクレオチドZ’Bが含まれ、前記Z’Bは、前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドである。
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
文脈において、特に説明がない限り、大文字C、G、U、Aは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字sの左右に隣接する2つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、P1は、当該P1の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字VPは、当該組合せ文字VPの右側に隣接する1つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Psは、当該組合せ文字Psの右側に隣接する1つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Pは、当該文字Pの右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’-リン酸ヌクレオチドであることを表す。
本開示は、ANGPTL3遺伝子発現を抑制できるsiRNAを提供する。
5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZ-3’(配列番号1)、
5’-Z’AGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(配列番号2)
ただし、ZはAであり、Z’はUである。
前記ヌクレオチド配列Aに、位置がZに対応するヌクレオチドZAが含まれ、前記ヌクレオチド配列Bに、位置がZ’に対応するヌクレオチドZ’Bが含まれ、前記Z’Bは、前記アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドである。
5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号3)、
5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(配列番号4)
ここで、前記Z’Bは、アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAは、A、U、G又はCから選択され、Z’Bは、ZAと相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、ZAはAであり、Z’BはUであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが19~23ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが20~26ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、19/20、19/21,19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25又は23/26であってもよい。いくつかの実施形態において、前記siRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が19/21、21/23又は23/25である。
5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号3)、
5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(配列番号4)
ここで、前記Z’Bは、アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAは、A、U、G又はCから選択され、Z’Bは、ZAと相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、ZAはAであり、Z’BはUであり、
前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが19~23ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが20~26ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、19/20、19/21,19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25又は23/26であってもよい。いくつかの実施形態において、前記siRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が19/21、21/23又は23/25である。
5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号3)、
5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU-3’(配列番号5)
或いは、前記siRNAのセンス鎖は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列を含み、前記siRNAのアンチセンス鎖は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む。
5’-AGCCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号6)、
5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG-3’(配列番号7)
ただし、前記Z’Bは、アンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAは、A、U、G又はCから選択され、Z’Bは、ZAと相補的なヌクレオチドである。
siAN1
センス鎖:5’-CCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(配列番号8)
アンチセンス鎖:5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU-3’(配列番号9)
siAN2
センス鎖:5’-AGCCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(配列番号10)
アンチセンス鎖:5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG-3’(配列番号11)
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第5、7、8及び9位のグリコシル基が2’-フルオロリボース基であり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’-メトキシリボース基であり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のグリコシル基が2’-フルオロリボース基であり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’-メトキシリボース基であり、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Aの第7、8及び9位のグリコシル基が2’-フルオロリボース基であり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’-メトキシリボース基であり、また、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Bの第2、6、14及び16位のグリコシル基が2’-フルオロリボース基であり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドのグリコシル基が2’-メトキシリボース基である。
siAN1-M1
センス鎖:5’-CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号13)
siAN2-M1
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号14)
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号15)
siAN1-M2
センス鎖:5’-CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号12)
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号16)
siAN2-M2
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号14)
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号17)
siAN1-M3
センス鎖:5’-CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号18)
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号16)
siAN2-M3
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号19)
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号17)
前記センス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間。
siAN1-M1S
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号20)
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号21)
siAN2-M1S
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号22)
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siAN1-M2S
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siAN2-M2S
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siAN1-M3S
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siAN2-M3S
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siAN2-M2SP1
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siAN1-M3SP1
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アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号34)
siAN2-M3SP1
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号27)
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号35)
本開示は、活性成分として上述したsiRNAと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
X101及びX102はそれぞれ独立してO、S、N-A又はC-Aであり、Aは水素又はC1-C20炭化水素鎖であり、
Y及びZがそれぞれ独立してC=O、C=S、S=O、CH-OH又はSO2であり、
R101、R102、R103、R104、R105、R106及びR107はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
xは1~10の整数であり、
nは1~3の整数であり、mは0~20の整数であり、pは0又は1であり、ここでm=p=0である場合、R102は水素であり、
n又はmの少なくとも1つが2である場合、R103と式(201)における窒素とが、式(202)又は式(203)に示される構造を形成する。
前記PEG化脂質は、1,2-ジパルミトアミド-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)]-2000(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000])である。
本開示は、上記siRNA及び当該siRNAに複合して結合される複合基を含むsiRNA複合体を提供する。
kは1~3の整数であり、
LAは、式(302)に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記LAは、その両端でそれぞれ1つの前記標的基及び前記LC部にエーテル結合により結合される。
n1は、1~3から選択される整数であり、n3は、0~4から選択される整数であり、
m1、m2及びm3は独立して、2~10から選択される整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15は、それぞれ独立して、Hであり、又はC1-C10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシ基からなる群から選択され、
R3は式A59に示される構造の基である。
任意の合理的な合成経路により式(308)に示されるsiRNA複合体を調製してもよい。
R4は、Nuに示されるsiRNAに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、R4は、共有結合によりNuに示されるsiRNAに結合することができる部分である。いくつかの実施形態において、R4は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりNuに示されるsiRNAの任意の官能基に複合されることができる部分であり、
各S1は、独立してM1において全ての活性ヒドロキシ基がYCOO-基で置換された基であり、各Yは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される1つであり、いくつかの実施形態において、Yはメチル基である。
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。いくつかの実施形態において、q1は1又は2である。いくつかの実施形態において、q2は1~5の整数である。いくつかの実施形態において、R4は、式(B9)又は(B10)に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、R4は、式(B11)又は(B12)に示される構造を含む。
(1)式(321)の化合物(式(321)の化合物は、R4に、保護されたヒドロキシ基ORkを含む第1の官能基、及び式(C1’)又は(C3’)に示される構造を有する第2の官能基が含まれる化合物である)におけるヒドロキシ保護基Rkを除去し、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
(2)当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、3’-5’の方向に、ホスホルアミダイト固相合成方法によりsiRNAのセンス鎖を合成すること、
(3)ホスホルアミダイト固相合成方法により、siRNAのアンチセンス鎖を合成すること、
(4)siRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、式(308)に示されるsiRNA複合体を得ること、を含む。
R6は、式(321)におけるR4を提供する基である。いくつかの実施形態において、R6は、式(A61)に示される構造を有する。
この場合、式(313)に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下、及びアミド化反応縮合剤と第3級アミン類有機塩基の存在下で、式(314)に示される化合物を式(A~1)に示される化合物又は式(A~2)の化合物と接触させ、その後単離する、という調製方法により得ることができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のsiRNA、及び/又は薬物組成物及び/又はsiRNA複合体の、脂質異常の治療及び/又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
本開示は、本開示の修飾siRNA、薬物組成物及びsiRNA複合体の少なくとも1種の有効量を含むキットを提供する。
C57BL/6Nマウス:6~8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、以下単にc57マウスという。
BALB/cマウス:6~8週齢、北京維通利華実験動物技術有限公司から購入される。
ob/obマウス:6~8週齢、常州■文斯実験動物有限公司から購入される。
ヒトAPOC3トランスジェニックマウス:B6、CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J、米国Jackson Laboratoryから購入される。
メタボリックシンドロームのサル:北京大学分子医学研究所非ヒト霊長類研究センターにより提供される。
本調製例で、複合体1、複合体2及び複合体4(以下、それぞれL10-siAN1M3SVP、L10-siAN1M3SP及びL10-siAN1M3S複合体ともいう)を合成できた。また、複合体3(L10-siAN1M3SPs複合体という)を合成できると予期した。前述した複合体は、L-9複合分子がそれぞれ番号siAN1M3SVP、siAN1M3SP、siAN1M3S又はsiAN1M3SPsのsiRNAと連結した後に形成された複合体であった。当該複合体に複合されたsiRNAの配列は、表3に示される。
以下の方法に従い、L-10化合物を合成した。
100.0gのGAL-1(N-アセチル-D-ガラクトサミン塩酸塩、CAS番号:1772-03-8、寧波弘翔生化公司から購入、463.8mmol)を1000mlの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で540mlの酢酸無水物(Enox社から購入、5565.6mmol)を加え、室温で1.5時間攪拌反応した。反応液を10Lの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを2Lの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル/トルエン混合溶剤(アセトニトリル:トルエンの体積比=1:1)を加え、溶剤を蒸発乾固し、130.0gの白色固形製品GAL-2を得た。
工程(1-1-1a)で得られたGAL-2(35.1g、90.0mmol)を213mlの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、24.0gのTMSOTf(CAS番号:27607-77-8、Macklin社から購入、108.0mmol)を加え、室温で一晩反応させた。
工程(1-1-1b)で得られたGAL-3(26.9g、81.7mmol)を136mlの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した4Å分子篩粉30gを加え、9.0gの5-ヘキセン-1-オール(CAS番号:821-41-0、Adamas-beta社から購入、89.9mmol)を加え、室温で30分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で9.08gのTMSOTf(40.9mmol)を加え、室温で一晩攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に300mlのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて10分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を300mlのジクロロエタンで1回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び300mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、41.3gの黄色水飴状製品GAL-4を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(1-1-1c)に記載された方法により得られたGAL-4(14.9g、34.7mmol)を77mlのジクロロメタンと77mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ103mlの脱イオン水及び29.7gの過ヨウ素酸ナトリウム(CAS番号:7790-28-5、Aladdin社から購入、138.8mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、塩化ルテニウム(III)(CAS番号:14898-67-0、Energy社から購入、238mg、1.145mmol)を加え、室温で一晩反応させた。反応液に300mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを約7.5に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、6.85gの白色泡状固形製品GAL-5を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO) δ 12.01 (br,1H),7.83 (d,J = 9.2 Hz,1H),5.21 (d,J = 3.2 Hz,1H),4.96 (dd,J = 11.2,3.2 Hz,1H),4.49 (d,J = 8.4 Hz,1H),4.07 - 3.95 (m,3H),3.92 - 3.85 (m,1H),3.74 - 3.67 (m,1H),3.48 - 3.39 (m,1H),2.20 (t,J = 6.8 Hz,2H),2.11 (s,3H),2.00 (s,3H),1.90 (s,3H),1.77 (s,3H),1.55 - 1.45 (m,4H).
複合体1~4のセンス鎖配列が同じであるので、その調製方法も同じであった。
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたL-10化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い3’-5’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の4つの反応を行った。2個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を行った。2個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の4つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定された。
(1-3A)複合体1のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports、Kinovate Life Sciences社)を出発として循環させ、複合体1のアンチセンス鎖ASを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった。
以下の方法に従い、VP-U-2分子を合成した。
複合体2のアンチセンス鎖と複合体1のアンチセンス鎖の区別は、5’-末端の1番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが2’-メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー(Um)であり、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の4つの反応を行ってCPR-Iモノマー(蘇州吉瑪、番号Cat#13-2601-XX)をアンチセンス鎖の5’末端に結合し、5’-リン酸エステル修飾を形成した。
CPR-Iモノマーを結合した場合、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外、複合体2のアンチセンス鎖と同じ合成プロセスを採用した。5’-チオリン酸エステル修飾を有する複合体3のアンチセンス鎖を製造できると予期した。
複合体4のアンチセンス鎖と複合体1のアンチセンス鎖の区別は、5’-末端の1番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが2’-メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー(Um)であった。
複合体1に対して、S鎖とAS鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、40mg/mLの溶液を得、等モル比で混合し、50℃で15min加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水(Milli-Q超純水装置で自作、抵抗率18.2MΩ*cm(25℃))を用いて複合体を濃度が0.2mg/mLになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計(LC-MS、Liquid Chromatography-Mass Spectrometry、Waters社から購入、型番:LCT Premier)により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体1が、L-9複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
1)前記siRNAが、それぞれ表3に示される比較複合体1及び複合体5~21に対応する配列であり、2)目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、0.4ml/μmolのN-メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、0.3ml/μmolのトリエチルアミン及び0.6ml/μmolのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける2’-TBDMS保護を除去したこと以外、調製例1と同じ方法により、複合体5、6、7及び比較複合体1を合成した。複合体8~21を製造できると予期した。
(3-1)P-10化合物の合成
以下の方法に従い、P-10化合物を合成した。
40mlのN,N-ジメチルホルムアミドに上記(1-1-1)に記載された方法により得られたGAL-5(13.43g、30.0mmol)、4-アミノ酸tert-ブチルエステル塩酸塩(5.87g、30.0mmol)、O-ベンゾトリアゾール-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(13.65g、36.0mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(11.63g、90.0mmol)を加え、均一に溶解させた後に室温で5時間攪拌反応させた。反応液に300mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して30.3gの油状物粗製品GAL5-C4-1を得、そのまま次の反応を行った。
工程(3-1-1)で得られたGAL5-C4-1粗製品(30.3g、30mmol)を180mlギ酸に溶解させ、室温で16時間攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィーにより精製し(200~300メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶出した)、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計14.84gの目的生成物GAL5-C4-2を得た。
工程(1-1-4)に記載された方法により得られたM-18-Tr(2.02g、4.69mmol)と工程(3-1-2)で得られたGAL5-C4-2(8.24g、15.48mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN-メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。20mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、10mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計8.27gの純粋なP-6を得た。
上記(3-1-3)で得られたP-6(6.82g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。100mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7~8になるように調節し、水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200~300メッシュの順相シリカゲルで精製し、10重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1重量‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計4.82gのP-7を得た。MS m/z:C78H127N10O33,[M+H]+、理論値:1732.91、実測値:1735.73。
P-8(490mg、0.231mmol)、コハク酸無水物(69mg、0.693mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、68mg、0.554mmol)を混合して2.3mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIEA、149mg、1.155mmol)を加え、25℃で21h攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに100mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、80gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1重量‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計200mgの純粋なP-9複合分子を得た。MS m/z:C106H153N10O41,[M-DMTr]+、理論値:1921.05、実測値:1920.97。
L-9複合分子の代わりにP-9複合分子を用い、固相担体に結合されたP-9複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1-1-9)と同じ方法により、P-10を調製した。
出発としてL-10化合物の代わりにP-10化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3A)、(1-4)と同じ方法により、複合体22を調製した。構造が式(404)に示されるP10-siAN1M3SVP複合体を得た。
(4-1)R-5化合物の合成
以下の方法に従い、R-5化合物を合成した。
工程(1-1-1b)に記載された方法により得られたGAL-3(26.4g、80.2mmol)を134mlの無水1,2-ジクロロエタンに溶解させ、60gの4Å分子篩粉を加え、さらに7-オクテン-1-オール(11.3g、88.2mmol)を加え、室温で10分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(8.9g、40.1mmol)を加え、室温で24時間攪拌反応させた。4Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に500mlの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、水相を100mlのジクロロメタンで1回抽出し、有機相をあわせ、250mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥させるまで溶剤を減圧留去して33.3gの黄色水飴状製品GAL-C7-1を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
工程(4-1-1)で得られたGAL-C7-1(33.3g、72.8mmol)を160mlのジクロロメタンと160mlのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ216mlの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム(62.3g、291.2mmol)を加え、氷水浴下で10分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム(III)(498mg、2.4mmol)を加えて自然に室温まで昇温し23時間攪拌反応させた。反応液に200mlの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7.5に調節し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで3回抽出し、有機相を捨て、水相を固形クエン酸でpHを約3に調節し、ジクロロメタンで1回あたり200mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマトグラフィー(200~300メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶出した)により精製して22.4gの白色泡状固形製品GAL-C7-2を得た。MS m/z:C21H32NO11,[M+H]+、理論値:476.50、実測値:475.94。
工程(1-1-4)に記載された方法により得られたM-18-Tr(2.02g、4.69mmol)とGAL-C7-2(7.36g、15.48mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにN-メチルモルホリン(3.13g、30.96mmol)を加え、最後に4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、4.28g、15.48mmol)を加え、室温で2h攪拌反応させた。200mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、100mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、100mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して7.82gの純粋なR-1を得た。
R-1(6.23g、3.456mmol)を69mlのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸(13.367g、103.67mmol)を加え、室温で2h反応させた。100mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しpH=7~8になるように調節し、水相をジクロロメタンで1回あたり30mlで6回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200~300メッシュの順相シリカゲルを用いて、10重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1重量‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.49gの純粋なR-2を得た。
R-2(2.391g、1.532mmol)とA-1(2.342g、4.596mmol)を混合して16mlのジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリル-1,2,3-ベンゾオキサゾール4(3H)-オン(DEPBT)(1.375g、4.596mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.188g、9.191mmol)を加え、25℃で2h攪拌反応させた。10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、10mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、120gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1重量%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.5~1:1:1:0.6で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.642gの純粋なR-3を得た。
R-3(795mg、0.4074mmol)、コハク酸無水物(82mg、0.8148mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、100mg、0.8148mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIEA、100mg、0.8148mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、30gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1重量‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して505mgの純粋なR-4複合分子を得た。
L-9複合分子の代わりにR-4複合分子を用い、固相担体に結合されたR-4複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1-1-9)と同じ方法により、R-5を調製した。
出発としてL-10化合物の代わりにR-5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3A)、(1-4)と同じ方法により、複合体23を調製した。構造が式(407)に示されるR5-siAN1M3SVP複合体を得ることができると予期した。
以下のプロセス経路により、LA-5化合物を合成できると予期した。
(6-1)LB-5化合物の合成
以下の方法に従い、LB-5化合物を合成した。
工程(1-1-6)に記載された方法により得られたL-8(5.0g、3.386mmol)、アジピン酸無水物(870mg、6.772mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、827mg、6.772mmol)を混合して130mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(DIEA、2.2g、16.931mmol)を加え、25℃で4h攪拌反応させた。70mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで4回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、120gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:メタノール=1:1:1:0.2~1:1:1:1で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して4.267gの純粋なLB-1を得た。
工程(6-1-1)に記載された方法により得られたLB-1(4.697g、2.753mmol、2バッチの生成物をあわせたもの)、3-アミノ-1,2-プロパンジオール(313mg、3.442mmol)、4-(4,6-ジメトキシトリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩酸塩(DMTMM、953mg、3.442mmol)及びN-メチルモルホリン(700mg、6.884mmol)を順に30mlのアセトニトリルと3mlのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。乾燥させるまで溶剤を蒸発し、カラムクロマトグラフィー(200~300メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン:メタノール=1:0.07~1:0.5で勾配溶出した)により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、3.27gの目的生成物LB-2を得た。
LB-2(2.27g、1.353mmol)を14mlの無水ピリジンで溶解させた。さらに4,4’-ビスメトキシトリチルクロリド(688mg、2.03mmol)を加えて室温で一晩攪拌反応させた。150mlのメタノールを加えてクエンチングし、乾燥させるまで溶剤を蒸発した。カラムクロマトグラフィー(200~300メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン:メタノール=1:0.05~1:0.2で勾配溶出した)により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、1.647gの目的生成物LB-3を得た。
LB-3(822mg、0.415mmol)、コハク酸無水物(83g、0.83mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、102mg、0.83mmol)を混合して4mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(270mg、2.075mmol)を加え、25℃で一晩攪拌反応させた。0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を3回洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり2mlで3回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、5重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、1重量‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:5~100:20で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して787mgの純粋なLB-4複合分子を得た。
L-9複合分子の代わりにLB-4複合分子を用い、固相担体に結合されたLB-4複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1-1-9)と同じ方法により、LB-5を調製した。
出発としてL-10化合物の代わりにLB-5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3A)、(1-4)と同じ方法により、複合体25を調製した。構造が式(413)に示されるLB5-siAN1M3SVPを得ることができると予期した。
以下のプロセス経路により、V-8化合物を合成できると予期した。
(8-1)W-8化合物の合成
以下の方法に従い、W-8化合物を合成した。
W-0(2.024g、10mmol)を25mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン(4.048g、40mmol)を加え、氷水浴で0℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル(5.683g、40mmol)を加え、室温で22h反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで18h発泡乾燥させ、5.835gの固形粗製品W-1を得た。
W-1粗製品(5.835g、10mmol)を50mlのジクロロメタンに溶解させ、反応液にTrCl(3.345g、12mmol)及びトリエチルアミン(1.518g、15mmol)を加え、室温で20h攪拌反応させた。20mlの飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を2回洗浄し、20mlの飽和食塩水で1回洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、8.012gの固形粗製品W-2を得た。処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
W-2粗製品(8.012g、10mmol)を100mlのメタノールに溶解させ、さらに100mlのメチルアミン水溶液(40重量%)を加え、50℃で23h攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、200mlの体積比1:1のDCM-メタノール混合溶剤を加え、50mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで3回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール:アンモニア水(25重量%)=1:1:0.05~1:1:0.25で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて3.062gの純粋なW-3を得た。
W-3(0.675g、1.517mmol)とGAL-C7-2(2.60g、5.46mmol)を混合して47mlのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.57g、12.14mmol)を加え、最後に3-ジエトキシホスホリル-1,2,3-ベンゾオキサゾール4(3H)-オン(DEPBT、1.816g、6.04mmol)を加え、室温で2.5h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=100:5~100:7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して1.610gの純粋なW-4を得た。
W-4(1.61g、0.886mmol)を125mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(3.5ml、42.43mmol)を加え、室温で1h反応させた。150mlのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。200~300メッシュの順相シリカゲルを用いて、10重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1重量‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=100:30~100:40で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.26gの純粋なW-5を得た。
W-5(1.25g、0.793mmol)と工程(1-1-7a)に記載された方法により得られたA-1(1.21g、2.38mmol)を混合して12mlのジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリル-1,2,3-ベンゾオキサゾール4(3H)-オン(DEPBT、0.712g、2.38mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(0.615g、4.76mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。80mlの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり10mlで3回抽出し、有機相をあわせ、10mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、185gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1重量%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル:酢酸エチル:ジクロロメタン:N,N-ジメチルホルムアミド=1:1:1:0.1~1:1:0.7で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.57gの純粋なW-6を得た。
W-6(1.238g、0.63mmol)、コハク酸無水物(0.189g、1.89mmol)及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.231g、1.89mmol)を混合して7mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにDIEA(0.407g、3.15mmol)を加え、25℃で24h攪拌反応させた。5mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり5mlで3回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、30gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1重量‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=100:18~100:20で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.033gの純粋なW-7複合分子を得た。MS m/z:C101H146N7O38,[M-DMTr]+、理論値:1763.92、実測値:1763.21。
L-9複合分子の代わりにW-7複合分子を用い、固相担体に結合されたW-7複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1-1-9)と同じ方法により、W-8を調製した。
出発としてL-10化合物の代わりにW-8化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3A)、(1-4)と同じ方法により、複合体27を調製した。構造が式(415)に示されるW8-siAN1M3SVPを得た。
以下のプロセス経路により、X-8化合物を合成できると予期した。
(10-1)Z-5化合物の合成
以下の方法に従い、Z-5化合物を合成した。
工程(8-1-3)に記載された方法により得られたW-3(1.50g、3.37mmol)と工程(3-1-2)に記載された方法により得られたGAL5-C4-2(7.18g、13.48mmol)を混合して34mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン(3.48g、26.96mmol)を加え、最後に3-ジエトキシホスホリル-1,2,3-ベンゾオキサゾール4(3H)-オン(DEPBT、4.04g、13.48mmol)を加え、室温で4.5h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、80mlの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、80mlの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、200~300メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン:メタノール=30:1~15:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して3.97gの純粋なZ-1を得た。MS m/z:C98H143N10O33,[M+H]+、理論値:1987.98、実測値:1987.90。
Z-1(3.97g、2.00mmol)を250mlのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸(10.941g、84.85mmol)を加え、室温で1h反応させた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。220gの200~300メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、10%ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、1‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=10:1~2:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して3.49gの純粋なZ-2を得た。MS m/z:C79H129N10O33,[M+H]+、理論値:1746.94、実測値:1746.90。
Z-2(3.49g、2.0mmol)と工程(1-1-7a)に記載された方法により得られたA-1(3.06g、6.0mmol)を混合して30mlのジクロロメタンに溶解させ、3-ジエトキシホスホリル-1,2,3-ベンゾオキサゾール4(3H)-オン(DEPBT、1.80g、6.0mmol)を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン(1.55g、12.0mmol)を加え、25℃で3h攪拌反応させた。100mlのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を1回あたり30mlで2回洗浄し、水相を10ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、50mlの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、200gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、20mlのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、1重量%トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン:メタノール=25:1~15:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して2.2gの純粋なZ-3を得た。MS m/z:C103H151N10O38,[M+H]+、理論値:2136.02、実測値:2136.20。
Z-3(2.10g、0.983mmol)をDIEA(0.635g、4.915mmol)を含む14.8mlのジクロロメタンに溶解させ、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、240mg、1.966mmol)を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物(197mg、1.966mmol)を加え、25℃で18h攪拌反応させた。50mlのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、80mlの0.5Mトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで1回あたり50mlで2回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、188gの200~300メッシュの順相シリカゲルを用い、1重量%トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、1重量‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン:メタノール=10:1~3:1で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して1.95gの純粋なZ-4複合分子を得た。MS m/z:C107H155N10O41,[M+H]+、理論値:1935.07、実測値:1935.29。
L-9複合分子の代わりにZ-4複合分子を用い、固相担体に結合されたZ-4複合分子を得たこと以外、調製例1における工程(1-1-9)と同じ方法により、Z-5を調製した。
出発としてL-10化合物の代わりにZ-5化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3A)、(1-4)と同じ方法により、複合体29を調製した。構造が式(422)に示されるZ5-siAN1M3SVP複合体を得た。
本調製例で複合体F1~F13を合成し、当該複合体に複合されたsiRNAの配列は、表3に示される。
Rajeevら、ChemBioChem 2015,16,903-908に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、FIN-2複合分子を合成した。
2.93gのPRO-6(L-ヒドロキシプロリン、CAS番号:51-35-4、Energy社から購入、22.4mmol)を22.5mlの1,4-dioxane(1,4-ジオキサン、CAS番号:123-91-1)に溶解させ、34mlの10%(w/w)Na2CO3の水溶液を加え、懸濁液状態にし、6.95gのFmoc-Cl(クロロギ酸-9-フルオレニルメチル、CAS番号:28920-43-6、Energy社から購入、26.8mmol)を34mlの1,4-dioxaneに溶解させ、氷浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を150mlの氷水に注入し、メチルtert-ブチルエーテルで1回あたり100mlで3回抽出し、有機相を捨て、水相を濃HClでpH≦5になるように調節し、100mlの酢酸エチルで2回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して7.83gの白色泡状固形製品PRO-7を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.91 (t,J = 7.2 Hz,2H),7.67 (d,J = 7.5 Hz,2H),7.48 - 7.39 (m,2H),7.38 - 7.27 (m,2H),5.17 (s,1H),4.27 (s,2H),4.23 - 4.11 (m,2H),3.55 - 3.41 (m,3H),2.31 - 2.10 (m,1H),2.08 - 1.88 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値 C20H19NO5 [M-H]-352.1190、実測値352.1033.
7.83gのPRO-7(22.2mmol)を80mlのTHF(CAS番号:109-99-9)に溶解させ、油浴で65℃に加熱し、還流状態で36.6mlの2mol/LのBH3-Me2SのTHF溶液(CAS番号13292-87-0、J&K Scientific社から購入、73.2mmol)を加え、3時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから30分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、石油エーテルで3回精製して7.1gの白色固形生成物PRO-8を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.91 (t,J = 6.7 Hz,2H),7.67 (d,J = 7.2 Hz,2H),7.49 - 7.39 (m,2H),7.38 - 7.26 (m,2H),5.18 (dd,J = 6.1,3.8 Hz,1H),4.28 (s,2H),4.23 - 4.13 (m,2H),3.55 - 3.38 (m,2H),2.32 - 2.11 (m,1H),2.08 - 1.89 (m,1H). HRMS (ESI) m/z 理論値 C20H21NO4 [M+Na]+362.1368、実測値362.1012.
7.1gのPRO-8(21mmol)を100mlのピリジンに溶解させ、14.2gのDMTr-Cl(4,4’-ビスメトキシトリチルクロリド、42mmol)を加え、室温で5時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化した後でDCMで粗製品を溶解させ負荷し、1%(v/v)ピリジンを含むDCMでDMTr-Clを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、8.2gの白色固形生成物PRO-9を得た。HRMS (ESI) m/z 理論値 C41H39NO6 [M+Na]+664.2675、実測値664.2348,C18 RP-HPLC(ロット番号JJS160324-1)純度94.20%。
8.2gのPRO-9(12.8mmol)を64mlのDMF(N,N-ジメチルホルムアミド)に溶解させ、40mlのピペリジン(384mmol)を加え、室温で30分間攪拌反応させた。反応液を300mlの氷水に注入し、酢酸エチルで1回あたり150mlで3回抽出し、有機相をあわせ、200mlの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化した後でDCMで粗製品を溶解させ負荷し、1%(v/v)ピリジンを含むDCMでFmocを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、4.65gの白色固形生成物PRO-10を得た。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 7.40 (d,J = 7.2 Hz,2H),7.35 - 7.18 (m,7H),6.93 - 6.84 (m,4H),4.56 (d,J = 3.9 Hz,1H),4.12 (s,1H),3.74 (s,6H),3.46 - 3.37 (m,1H),2.88 (ddd,J = 18.5,10.0,5.5 Hz,2H),2.75 (dd,J = 8.7,5.8 Hz,1H),2.62 (dd,J = 11.0,2.7 Hz,1H),1.74 - 1.65 (m,1H),1.40 (ddd,J = 12.9,8.5,5.9 Hz,1H),HRMS (ESI) m/z 理論値 C26H29NO4 [M+Na]+442.1994、実測値442.1999,C18 RP-HPLC(ロット番号JJS160329-1)純度97.07%。
核酸固相合成方法により、工程(11-1-3)で得られたFIN-2複合分子を3回循環させることにより、汎用の固相担体(UnyLinkerTM loaded NittoPhase(登録商標)HL Solid Supports)に結合し、複合基(FIN_FIN_FIN)のRNAセンス鎖の3’末端への結合を実現した。
1)工程(11-2)で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、2)複合siRNAが表3に示される複合体F1~F13に対応する配列を有すること以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3)、(1-4)と同じ方法により、表題複合体を調製した。
本調製例で比較複合体2を合成し、当該複合体に複合されたsiRNAの配列は、表3に示される。当該複合体は、WO2016168286A1における化合物AD-65695と構造が同じであった。
WO2014025805A1に記載された調製方法により化合物30、即ち、以上のようなリンカー-(LA)3トリヒドロキシメチルアミノメタン-LB-及び標的基であるN-アセチルガラクトサミン分子(ここで、各LAに1つのN-アセチルガラクトサミン分子が結合できるので、1つのリンカーに3個のN-アセチルガラクトサミン分子が結合できる)を含む複合分子((GalNAc)3複合分子とも呼ばれる)を合成し、前記化合物30の構造は、下式に示される。
調製例1における工程(1-1-9)と同じ方法により、(GalNAc)3複合分子を固相担体に結合し、固相担体に結合された(GalNAc)3複合分子を得た。
1)工程(12-2)で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、2)複合siRNAが表3において番号AD-65695に示される配列を有すること以外、調製例1における工程(1-2)、(1-3D)、(1-4)と同じ方法により、比較複合体2を調製した。
通常の固相合成方法により表4に示される本開示により提供されるsiRNA配列を得、DEPC水を用いて等モルのセンス鎖とアンチセンス鎖の混合物を溶解させた後、通常のアニールを行ってsiRNA二本鎖を形成した。
psiCHECKTM-2(PromegaTM)プラスミドにより4つの組換えプラスミドを構築した。そのうち、GSCMは、オンターゲットプラスミドを表し、PSCM、GSSM、PSSMは、オフターゲットプラスミドを表す。
(1)GSCMは、被験siRNAにおけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
(2)PSCMは、被験siRNAにおけるアンチセンス鎖の21個のヌクレオチド配列の全てと完全に一致している目的配列を含む。
(3)GSSMは、被験siRNAにおいてアンチセンス鎖の5’端から1~8位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残部が被験siRNAにおいてアンチセンス鎖の5’端から9~21位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的でない、即ち、被験siRNAにおいてアンチセンス鎖の5’端から9~21位のいずれかのヌクレオチドがG、C、A又はUである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれT、A、C又はGである目的配列を含む。
(4)PSSMは、被験siRNAにおいてセンス鎖の5’端から1~8位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残部が被験siRNAにおいてセンス鎖の5’端から9~19位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的でない、即ち、被験siRNAにおいてセンス鎖の5’端から9~19位のいずれかのヌクレオチドがG、C、A又はUである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれT、A、C又はGである目的配列を含む。GSSMの標的配列の長さに等しくするために、目的配列の3’末端に順にヌクレオチドT、Cを加えた。
96ウェルプレートに、LipofectamineTM 2000(Invitrogen社)の使用説明書により、それぞれsiRNAと、プラスミドごとに11群の特定の濃度のsiRNAが対応している上記各プラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり10ngずつトランスフェクションし、0.2μLのLipofectamineTM 2000を用いた。siRNA1、siRNA4、siRNA5及びsiRNA8の濃度が5nMから、0.00008nMに3倍ごとに希釈し、計11個の濃度であった。siRNA7の濃度が0.5nMから、0.0005nMに倍加希釈し、計11個の濃度であった。1群あたり3個の複製ウェルがあった。
24時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット(Dual luciferase reporter gene assay kit、Promega社、cat.E2940)を用い、使用明細書によりHEK293A細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度のsiRNA試験群では、siRNA未処理群を対照(con.)とした。ホタルルシフェラーゼ(Fir)タンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼ(Ren)タンパク質レベルで標準化した。
Yは、残存mRNAの発現レベルであり、
Xは、トランスフェクションsiRNAの濃度の対数値であり、
Botは、定常期の最低のY値であり、
Topは、定常期の最高のY値であり、
LogIC50は、Yが最低と最高との間の半分にある場合のX値であり、HillSlopeは、曲線の傾きである。
(実験例2-1)Huh7細胞におけるsiRNAによるANGPTL3 mRNA発現量に対する抑制効率の検出。
LipofectamineTM 2000を用いて被験siRNA(siRNA1、2、4、5、6、7)をヒト肝がん細胞株Huh7にトランスフェクションし、siRNAの最終濃度がそれぞれ5nM、0.25nM及び0.05nMであった。各濃度につき2つの複製ウェルがあった。いかなるsiRNAも処理されていない細胞をブランク対照(図3Aにおいて「ブランク」と記される)とした。
被験サンプルが複合体F1~F11であり、複合体の最終濃度(siRNAの量として)がそれぞれ50nM及び5nMであったこと以外、実験例2-1と同じ方法により検出した。各複合体の体外での抑制活性を図3Bに示した。
被験サンプルが複合体F3、F4、F8、F9であり、複合体の最終濃度(siRNAの量として)が50nMから、0.016nMに5倍ごとに希釈し、最低濃度を0.00001nMとし、計7個の濃度であり、1群あたり3個の複製ウェルがあったこと以外、実験例2-1と同じ方法により検出した。
(実験例3-1)siRNAのリソソームにおける安定性の検出。
本実験例では、siRNA 1、2、4、5、6、7のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調べた。
本実験例では、複合体1、4、5、7のマウス由来のリソソーム溶解液における安定性を調べた。
本実験例では、複合体1、4、5、7のヒト血漿における安定性を調べた。
(実験例4-1) 正常マウスc57体内におけるsiRNA複合体のANGPTL3 mRNAに対するED50の測定。
本実験例では、正常マウスc57体内における複合体F3、F4、F8、F9の抑制活性を調べた。
本実験例では、複合体F4、F12、F13による正常マウスBALB/c体内における肝臓組織中のANGPTL3 mRNAに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
6~8週齢の正常マウスBALB/cを10匹/群でランダムに分け、それぞれ各群のマウスに複合体F4、F12、F13、比較複合体2及びPBSを投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、siRNA複合体の用量(siRNAの量として)が3mg/kg(3mpkとも記す)及び0.3mg/kg(0.3mpkとも記す)の2つの用量群であり、投与体積が10mL/kgであった。各siRNA複合体は、それぞれPBS水溶液として提供され、用量と投与体積により、複合体について設定すべき薬物濃度を換算した。薬剤投与前及び薬剤投与後7日目と14日目に動物に対して眼窩静脈採血を行い、各時点で血清脂質レベルを検出した。薬剤投与後7日目と14日目にそれぞれ5匹のマウスを死亡させ、肝臓を回収し、肝臓におけるANGPTL3 mRNAの発現量を検出した。
標準化された脂質レベル=(薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)×100%。
脂質レベルの抑制率=(1-薬剤投与後の試験群における脂質の含有量/薬剤投与前の試験群における脂質の含有量)×100%。脂質は、総コレステロール又はトリグリセリドを指す。
本実験例では、ob/obマウス体内における複合体F2、F4による肝臓組織中のANGPTL3 mRNAに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
本実験例では、ヒトAPOC3トランスジェニックマウス体内における複合体1による肝臓組織中のANGPTL3 mRNAに対する抑制率及び脂質に対する影響を調べた。
メタボリックシンドロームのサル12匹(全て雄性)をランダムに分け、そのうちの8匹に複合体2を投与し、4匹に比較複合体1を投与した。各siRNA複合体をそれぞれ注射用生理塩水で溶解させ、薬物濃度(siRNAの量として)が100mg/mlであった。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、用量がいずれも9mg/kgであり、注射量が0.09ml/kgであり、各注射点が2ml以下であった。
Claims (29)
- siRNAであって、センス鎖と、アンチセンス鎖とを含み、前記siRNAの各ヌクレオチドがそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、
前記センス鎖はヌクレオチド配列Iを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列IIを含み、前記ヌクレオチド配列Iと前記ヌクレオチド配列IIとが、逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Iは、5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号3)のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列IIは、5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGG-3’(配列番号4)のヌクレオチド配列を含み、
ZAはA、U、G又はCから選択され、
Z’Bはアンチセンス鎖の5’末端の最初のヌクレオチドであって、ZAと相補的であり、且つ、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが19~23ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが20~26ヌクレオチドであり、
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
前記フルオロ修飾ヌクレオチドが配列番号3のヌクレオチド配列及び配列番号4のヌクレオチド配列に位置し、
5’末端から3’末端に向かって、前記配列番号3のヌクレオチド配列の第7、8、9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、かつ
5’末端から3’末端に向かって、前記配列番号4のヌクレオチド配列の第2、6、14、16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、siRNA。 - 前記ヌクレオチド配列Iがヌクレオチド配列IIIをさらに含み、前記ヌクレオチド配列IIがヌクレオチド配列IVをさらに含み、ヌクレオチド配列IIIとヌクレオチド配列IVの長さがそれぞれ独立して1~4ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列IIIが配列番号3のヌクレオチド配列の5’末端に結合され、ヌクレオチド配列IVが配列番号4のヌクレオチド配列の3’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列IIIと前記ヌクレオチド配列IVは、長さが等しく、逆相補的である、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも1ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列IIIの塩基がGである、
或いは、前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも2ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、ヌクレオチド配列IIIの塩基配列がAGである、
或いは、前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも3ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、ヌクレオチド配列IIIの塩基配列がAAGである、
或いは、前記ヌクレオチド配列IIIとIVは、長さがいずれも4ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、ヌクレオチド配列IIIの塩基配列がCAAGである、請求項2に記載のsiRNA。 - 前記ヌクレオチド配列IIがヌクレオチド配列Vをさらに含み、ヌクレオチド配列Vは、長さが1~3ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の3’末端に結合され、アンチセンス鎖の3’オーバーハング末端を構成する、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記ヌクレオチド配列Vの長さが2ヌクレオチドであり、かつ
前記ヌクレオチド配列Vが、連続した2個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した2個のウラシルリボヌクレオチドである、又は、前記ヌクレオチド配列Vが、標的mRNAの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項4に記載のsiRNA。 - 前記siRNAのセンス鎖が配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含み、
5’-CCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号3)、
5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU-3’(配列番号5)、
或いは、前記siRNAのセンス鎖が配列番号6に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含み、
5’-AGCCAAGAGCACCAAGAACUZA-3’(配列番号6)、
5’-Z’BAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG-3’(配列番号7)、
ただし、前記Z’Bはアンチセンス鎖の5’末端の1番目のヌクレオチドであり、ZAはA、U、G又はCから選択され、Z’BはZAと相補的なヌクレオチドである、請求項1に記載のsiRNA。 - 前記siRNAが、siAN1又はsiAN2である、請求項1に記載のsiRNA:
siAN1
センス鎖:5’-CCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(配列番号8)及びアンチセンス鎖:5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU-3’(配列番号9);
siAN2
センス鎖:5’-AGCCAAGAGCACCAAGAACUA-3’(配列番号10)及びアンチセンス鎖:5’-UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCUUG-3’
(配列番号11)。 - 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の2’-ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項1に記載のsiRNA。
- 5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における配列番号3のヌクレオチド配列の第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖における配列番号4のヌクレオチド配列の第2、6、8、9、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、或いは、
5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における配列番号3のヌクレオチド配列の第5、7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖における配列番号4のヌクレオチド配列の第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、
或いは、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのセンス鎖における配列番号3のヌクレオチド配列の第7、8及び9位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、5’末端から3’末端に向かって、前記siRNAのアンチセンス鎖における配列番号4のヌクレオチド配列の第2、6、14及び16位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、siRNAのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項8に記載のsiRNA。 - 前記siRNAがsiAN1-M1、siAN2-M1、siAN1-M2、siAN2-M2、siAN1-M3、またはsiAN2-M3のいずれか1つであり、
siAN1-M1:
センス鎖:5’-CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号12)、
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号13)、
siAN2-M1:
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号14)、
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号15)、
siAN1-M2:
センス鎖:5’-CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号12)、
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号16)、
siAN2-M2:
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号14)、
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号17)、
siAN1-M3:
センス鎖:5’-CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号18)、
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号16)、
siAN2-M3:
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号19)、
アンチセンス鎖:5’-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号17)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す、請求項1に記載のsiRNA。 - 前記siRNAにおいて、少なくとも1つのリン酸エステル基がチオリン酸エステル基であり、該チオリン酸エステル基が、
前記センス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の3’末端から1番目のヌクレオチドと2番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の3’末端から2番目のヌクレオチドと3番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも1つに結合されて存在する、請求項1に記載のsiRNA。 - 前記siRNAが、siAN1-M1S、siAN2-M1S、siAN1-M2S、siAN2-M2S、siAN1-M3S、またはsiAN2-M3Sのいずれか1つであり、
siAN1-M1S:
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号20)、
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号21)、
siAN2-M1S:
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号22)、
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号23)、
siAN1-M2S:
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号20)、
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号24)、
siAN2-M2S:
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号22)、
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号25)、
siAN1-M3S:
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号26)、
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号24)、
siAN2-M3S:
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号27)、
アンチセンス鎖:5’-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号25)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字の左右2ヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す、請求項1に記載のsiRNA。 - 前記アンチセンス鎖の5’末端のヌクレオチドが、5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項1に記載のsiRNA。
- 前記siRNAがsiAN1-M1P1、siAN2-M1P1、siAN1-M2P1、siAN2-M2P1、siAN1-M3P1、siAN2-M3P1、siAN1-M1SP1、siAN2-M1SP1、siAN1-M2SP1、siAN2-M2SP1、siAN1-M3SP1、またはsiAN2-M3SP1のいずれか1つであり、
siAN1-M1P1:
センス鎖:5’-CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号12)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号28)、
siAN2-M1P1:
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号14)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmAfGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号29)、
siAN1-M2P1:
センス鎖:5’-CmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号12)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号30)、
siAN2-M2P1:
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号14)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号31)、
siAN1-M3P1:
センス鎖:5’-CmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号18)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUm-3’(配列番号30)、
siAN2-M3P1:
センス鎖:5’-AmGmCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号19)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmAfGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmUmGm-3’(配列番号31)、
siAN1-M1SP1:
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号20)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号32)、
siAN2-M1SP1:
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号22)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUfGfGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号33)、
siAN1-M2SP1:
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号20)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号34)、
siAN2-M2SP1:
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGfAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号22)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号35)、
siAN1-M3SP1:
センス鎖:5’-CmsCmsAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号26)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmsCmsUm-3’(配列番号34)、
siAN2-M3SP1:
センス鎖:5’-AmsGmsCmCmAmAmGmAmGfCfAfCmCmAmAmGmAmAmCmUmAm-3’(配列番号27)、
アンチセンス鎖:5’-P1-UmsAfsGmUmUmCfUmUmGmGmUmGmCmUfCmUfUmGmGmCmUmsUmsGm-3’(配列番号35)
ただし、大文字C、G、U、Aはヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字mは、当該文字mの左側に隣接する1つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字fは、当該文字fの左側に隣接する1つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字sは、当該文字の左右2ヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、P1は、当該文字の右側に隣接する1つのヌクレオチドが5’-リン酸ヌクレオチド又は5’-リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す、請求項1に記載のsiRNA。 - 請求項1に記載のsiRNA及び薬学的に許容可能な担体を含み、前記siRNAと前記薬学的に許容可能な担体との重量比が1:(1~500)である、薬物組成物。
- 請求項1に記載のsiRNA及び当該siRNAに複合して結合される複合基を含む、siRNA複合体。
- 式(308)に示される構造を有する、請求項17に記載のsiRNA複合体:
n1は、1~3から選択される整数であり、n3は、0~4から選択される整数であり、
m1、m2及びm3は独立して、2~10から選択される整数であり、
R10、R11、R12、R13、R14及びR15はそれぞれ独立して、Hであり、又はC1-C10アルキル基、C1-C10ハロゲン化アルキル基及びC1-C10アルコキシ基からなる群から選択され、
R3は式A59に示される構造の基であり、
R2は、長さ1~20の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子は、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、R2は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロアルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各L1は、長さ1~70の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの1又は複数の炭素原子は、C(O)、NH、O、S、CH=N、S(O)2、C2-C10アルケニレン基、C2-C10アルキニレン基、C6-C10アリーレン基、C3-C18ヘテロシクリレン基及びC5-C10ヘテロアリーレン基からなる群から選択される1又は複数で任意に置換され、L1は、C1-C10アルキル基、C6-C10アリール基、C5-C10ヘテロアリール基、C1-C10ハロゲン化アルキル基、-OC1-C10アルキル基、-OC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-OH、-OC1-C10ハロゲン化アルキル基、-SC1-C10アルキル基、-SC1-C10アルキルフェニル基、-C1-C10アルキル-SH、-SC1-C10ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10アルキル-NH2、-N(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-NH(C1-C10アルキル基)、シアノ基、ニトロ基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10アルキル基)、-CON(C1-C10アルキル基)(C1-C10アルキル基)、-CONH(C1-C10アルキル基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10アルキル基)、-NHC(O)(フェニル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(C1-C10アルキル基)、-N(C1-C10アルキル)C(O)(フェニル基)、-C(O)C1-C10アルキル基、-C(O)C1-C10アルキルフェニル基、-C(O)C1-C10ハロアルキル基、-OC(O)C1-C10アルキル基、-SO2(C1-C10アルキル基)、-SO2(フェニル基)、-SO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10アルキル基)、-SO2NH(フェニル基)、-NHSO2(C1-C10アルキル基)、-NHSO2(フェニル基)及び-NHSO2(C1-C10ハロゲン化アルキル基)からなる群のいずれか1つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
M1は標的基を表す。 - L1は、A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11、A13から選択される1以上の結合の組合せである、又は、
L1は、A1、A4、A8、A10及びA11から選択される少なくとも2つの結合の組合せである、請求項19に記載のsiRNA複合体。 - L1の長さが3~25個又は4~15個の原子である、請求項18に記載のsiRNA複合体。
- m1、m2及びm3がそれぞれ独立して2~5の整数である、又は、
m1=m2=m3である、請求項18に記載のsiRNA複合体。 - 各前記標的基が独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と親和性のあるリガンドである、又は、
各前記標的基が、D-マンノピラノース、L-マンノピラノース、D-アラビノース、D-キシロフラノース、L-キシロフラノース、D-グルコース、L-グルコース、D-ガラクトース、L-ガラクトース、α-D-マンノフラノース、β-D-マンノフラノース、α-D-マンノピラノース、β-D-マンノピラノース、α-D-グルコピラノース、β-D-グルコピラノース、α-D-グルコフラノース、β-D-グルコフラノース、α-D-フルクトフラノース、α-D-フルクトピラノース、α-D-ガラクトピラノース、β-D-ガラクトピラノース、α-D-ガラクトフラノース、β-D-ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-トリフルオロアセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブチリルガラクトサミン、N-イソブチリルガラクトサミン、2-アミノ-3-O-[(R)-1-カルボキシエチル]-2-デオキシ-β-D-グルコピラノース、2-デオキシ-2-メチルアミノ-L-グルコピラノース、4,6-ジデオキシ-4-ホルムアミド-2,3-ジ-O-メチル-D-マンノピラノース、2-デオキシ-2-スルホアミノ-D-グルコピラノース、N-グリコリル-α-ノイラミン酸、5-チオ-β-D-グルコピラノース、メチル2,3,4-トリス-O-アセチル-1-チオ-6-O-トリチル-α-D-グルコピラノシド、4-チオ-β-D-ガラクトピラノース、エチル3,4,6,7-テトラ-O-アセチル-2-デオキシ-1,5-ジチオ-α-D-グルコヘプトピラノシド、2,5-アンヒドロ-D-アロニトリル、リボース、D-リボース、D-4-チオリボース、L-リボース、L-4-チオリボースから独立して選択される1つである、請求項18に記載のsiRNA複合体。 - 式A59におけるPが、siRNAのセンス鎖の3’末端に結合されている、請求項18に記載のsiRNA複合体。
- 脂質異常の治療のために用いられる組成物であって、、
請求項1~15のいずれか一項に記載のsiRNA、及び/又は請求項16に記載の医薬組成物、及び/又は請求項17~26のいずれか一項に記載のsiRNA複合体を含有する、組成物。 - 前記脂質異常が高コレステロール血症、高トリグリセリド血症又はアテローム性動脈硬化である、請求項27に記載の組成物。
- 肝細胞におけるANGPTL3遺伝子の発現の抑制のために用いられる組成物であって、請求項1~15のいずれか一項に記載のsiRNA、及び/又は請求項16に記載の医薬組成物、及び/又は請求項17~26のいずれか一項に記載のsiRNA複合体を含有する、組成物。
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