CN114763547A - 靶向血管紧张素原的核酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种靶向血管紧张素原的核酸及其用途。本发明的核酸能够有效抑制AGT的表达，从而能够治疗和/或预防高血压等与ATG表达升高相关的疾病。

Description

靶向血管紧张素原的核酸及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及靶向血管紧张素原的核酸及其用途。
背景技术
肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)是一种由多种蛋白酶和短肽组成的复杂网络调节系统，是心血管和肾功能的一种重要调节因素，该系统的过度激活是很多常见病理状况的中心环节，包括高血压、心力衰竭和肾脏疾病(Lu H et al.Hypertension Res.39:492-500，2016)。RAAS途径始于肾素使其底物血管紧张素原(Angiotensinogen)分解，产生无活性肽血管紧张素I(Angiotensin I,Ang I)，随后内皮细胞中的血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)将AngⅠ转化为血管紧张素Ⅱ(Angiotensin II,Ang II)，AngⅡ的ACE活化在肺部最为广泛，AngⅡ介导血管收缩以及肾上腺释放醛固酮，从而导致钠潴留和血压升高。
RAAS抑制剂包括ACE抑制剂、AngⅡ受体拮抗剂(angiotensin II receptorblockers，ARBs)、醛固酮拮抗剂和直接肾素抑制剂等，RAAS抑制剂是目前高血压治疗、心力衰竭预防和治疗的重要药物，临床上应用广泛(Schmieder RE et al.Lancet.369(9568):1208-1219；Antonaccio MJ.J Pharmcol.14:29-45,1983；Ruiz-Ortega M et al.TrendsCardiovasc Med.17(1):19-25,2007；Matsubara H.Cric Res.83(12):1182-1191,1998)。ACE抑制剂及AngⅡ受体拮抗剂能够激活代偿通路从而导致血管紧张素再度活化和醛固酮突围造成血液Ang II及醛固酮浓度回到治疗前甚至更高的水平(Nobakht N et al.NatRev Nephrol.7:356-359,2011；Bomback AS and Klemmer PJ.Nat Clin PractNephrol.3:486-492,2007)。这可能是顽固性高血压和心衰病人对RAAS抑制药物反应不佳的重要因素(Narayan H and Webb DJ.Curr Hypertens Rep.18:34,2016,Roig E etal.Eur Heart J.21:53-57,2000)，所以，更为有效的治疗策略应该是靶向RAAS酶和受体的上游，避免限制治疗效果的代偿机制和胞内分泌通路(Mullick AE etal.Hypertension.70(3):566-576,2017)。
血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT，又为SERPINA8，ANHU,hFLT1)是所有血管紧张素的共同前体(Wu C et al.Am J Med Sci.4:183-190,2011；Lu H et al.HypertensRes 39：492-500，2016)，肝脏是血液AGT的主要来源(Yiannilouris G etal.Hypertension.66:836-842,2015；Matsusaka T et al.J Am Soc Nephrol.23:1181-1189,2012)。多项研究证实，血液AGT浓度升高和高血压呈显著正相关(Fasola AF et al.JAppl Physiol.21:1709-1712,1966)，降低血液AGT浓度能够抑制RAAS通路的活性并导致血压下降(Olearczyk J et al.Hypertension Res.37:405-412,2014)，静脉输注AGT给大鼠能增高血压，并可通过采用抗AGT抗体治疗逆转(Menard J et al.Hypertension.18:705-707,1991)，AGT-基因敲除小鼠血压降低，而AGT-过度表达导致血压上升(Kim HS etal.Proc Natl Acad Sci USA 92:2735-2739,1995；Kimura S et al.Embo J.11:821-827,1982)。通过调控AGT的水平治疗高血压是很有希望的研发靶点，然而采用传统手段靶向AGT遇到诸多困难(Morgan L et al.Int J Biochem Cell Biol.28:1211-1222,1996)。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)指在进化过程中高度保守的、由双链小干扰核糖核酸(small interference RNA，siRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。因此，研究开发靶向AGT的siRNA具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种新的靶向AGT的核酸及其用途。
本发明第一方面提供了一种核酸，该核酸包括正义链和反义链，其中，所述正义链含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ IDNO：59或SEQ ID NO：61所示的序列具有80％以上的序列同一性的序列，所述反义链含有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：62所示的序列具有80％以上的序列同一性的序列。
本发明第二方面提供了一种靶向药物递送系统，该靶向药物递送系统包括靶向基团、连接基团和通过连接基团与靶向基团连接的如上所述的核酸。
本发明第三方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸或靶向药物递送系统和药学上可接受的载体。
本发明第四方面提供了如上所述的核酸、靶向药物递送系统或药物组合物在制备用于治疗和/或预防肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)过度激活相关疾病的药物中的用途。
本发明第五方面提供了如上所述的核酸、靶向药物递送系统或药物组合物在制备用于降低ATG表达水平的药物中的用途。
本发明的发明人发现，肾素-血管紧张素-醛固酮系统中，AGT是RNAi最适合的靶点，因此，本发明提供了一种新的靶向AGT的核酸及其用途。本发明的核酸能够有效降低AGT水平，且能有效降低RAAS激活程度以起到降低血压的作用。
附图说明
图1显示了siRNA在人源化AGT小鼠中降低AGT mRNA表达中的作用。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种(被修饰或未被修饰的)核酸，该核酸包括正义链和反义链，所述正义链含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQID NO：59或SEQ ID NO：61所示的序列具有80％以上的序列同一性的序列，所述反义链含有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ IDNO：60或SEQ ID NO：62所示的序列具有80％以上的序列同一性的序列。
其中，具有80％以上的序列同一性的序列是指包括与目标序列有0、1、2、3或4个碱基不一致的情况，也包括与目标序列相比存在0、1、2、3或4个碱基不一致的基础上还额外连接有更多碱基的情况。而且，不一致的碱基可以在目标序列的任意位置，但优选地，沿5’-3’的方向上，在正义链中，不一致的碱基位于正义链的倒数第1-4位，在反义链中，不一致的碱基位于反义链的第1-4位。
更优选地，所述正义链具有16-30(如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)个核苷酸(碱基)。
更优选地，所述反义链具有16-30(如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)个核苷酸(碱基)。
本发明中，所述正义链和反义链可以具有相同的长度，也可以具有不同的长度。
上述核酸中所有核苷酸基团可以是未经化学修饰的，也可以含有至少一个修饰的核苷酸基团，且修饰可以在任意位置的核苷酸上。
在本发明的优选实施方式中，如表1所示，所述核酸选自正义链序列为SEQ ID NO：1且反义链序列为SEQ ID NO：2的siRNA-1、正义链序列为SEQ ID NO：3且反义链序列为SEQID NO：4的siRNA-2、正义链序列为SEQ ID NO：5且反义链序列为SEQ ID NO：6的siRNA-3、正义链序列为SEQ ID NO：7且反义链序列为SEQ ID NO：8的siRNA-4、正义链序列为SEQ IDNO：9且反义链序列为SEQ ID NO：10的siRNA-5、正义链序列为SEQ ID NO：11且反义链序列为SEQ ID NO：12的siRNA-6、正义链序列为SEQ ID NO：13且反义链序列为SEQ ID NO：14的siRNA-7、正义链序列为SEQ ID NO：15且反义链序列为SEQ ID NO：16的siRNA-8、正义链序列为SEQ ID NO：17且反义链序列为SEQ ID NO：18的siRNA-9、正义链序列为SEQ ID NO：19且反义链序列为SEQ ID NO：20的siRNA-10、正义链序列为SEQ ID NO：21且反义链序列为SEQ ID NO：22的siRNA-11、正义链序列为SEQ ID NO：23且反义链序列为SEQ ID NO：24的siRNA-12、正义链序列为SEQ ID NO：25且反义链序列为SEQ ID NO：26的siRNA-13、正义链序列为SEQ ID NO：27且反义链序列为SEQ ID NO：28的siRNA-14、正义链序列为SEQ ID NO：29且反义链序列为SEQ ID NO：30的siRNA-15、正义链序列为SEQ ID NO：31且反义链序列为SEQ ID NO：32的siRNA-16、正义链序列为SEQ ID NO：33且反义链序列为SEQ ID NO：34的siRNA-17、正义链序列为SEQ ID NO：35且反义链序列为SEQ ID NO：36的siRNA-18、正义链序列为SEQ ID NO：37且反义链序列为SEQ ID NO：38的siRNA-19、正义链序列为SEQ ID NO：39且反义链序列为SEQ ID NO：40的siRNA-20、正义链序列为SEQ ID NO：41且反义链序列为SEQ ID NO：42的siRNA-21、正义链序列为SEQ ID NO：43且反义链序列为SEQ ID NO：44的siRNA-22、正义链序列为SEQ ID NO：45且反义链序列为SEQ ID NO：46的siRNA-23、正义链序列为SEQ ID NO：47且反义链序列为SEQ ID NO：48的siRNA-24、正义链序列为SEQ ID NO：49且反义链序列为SEQ ID NO：50的siRNA-25、正义链序列为SEQ ID NO：51且反义链序列为SEQ ID NO：52的siRNA-26、正义链序列为SEQ ID NO：53且反义链序列为SEQ ID NO：54的siRNA-27、正义链序列为SEQ ID NO：55且反义链序列为SEQ ID NO：56的siRNA-28、正义链序列为SEQ ID NO：57且反义链序列为SEQ ID NO：58的siRNA-29、正义链序列为SEQ ID NO：59且反义链序列为SEQ ID NO：60的siRNA-30、正义链序列为SEQ ID NO：61且反义链序列为SEQ ID NO：62的siRNA-31中的至少一种。
根据本发明所述的核酸，其中，所述核酸含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，优选情况下，所述核酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。所述修饰不会导致所述核酸抑制AGT的功能的丧失，或者说，被修饰后的核酸对AGT的抑制效率不低于修饰前的核酸的95％(如95％、96％、97％、98％或99％)。
根据本发明所述的核酸，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团和/或核糖基团被修饰的核苷酸基团。带修饰的位点可以在正义链和/或反义链的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30位核苷酸中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30位上。
例如，磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)等。如下式所示分别用硫、硼烷、胺基、烷基或烷氧基置换磷酸基团中的氧。这几种修饰都能稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
Figure BDA0003466633560000041
Figure BDA0003466633560000051
以上结构式中，BASE表示碱基A、U、C、G或T。X可以是氧(O)或硫(S)。R在以上结构中可以是相同的，也可以是不同的，比如：氢(H)、氟(F)、甲氧基(OME)或甲氧乙基(MOE)、羟基、烯丙基、乙基胺基、炔丙基、氨基、氰基乙基、乙酰基等，R’和R”可以各自独立地是氢(H)、甲基(CH3)、乙基(CH2CH3)、丙基(CH2CH3)、异丙基(CH(CH3)2)、烯丙基、炔丙基、酰氧基苄基、酰氧乙基。
核糖基团的修饰是指对核糖基团中2′-羟基(2′-OH)的修饰。在核糖基团的2′-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使核酸不易被核糖核酸酶切割，由此增加了核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中2′-羟基的修饰包括2′-氟修饰(2′-fluoro modification,如2’-arabino-fluoro modification)、2′-甲氧基修饰(2′-OME)、2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)、2′-2,4-二硝基苯酚修饰(2′-DNPmodification)、环锁乙基修饰(2′,4′-constrained ethyl modification)、2′-氨基修饰(2′-Amino modification)、2′-脱氧修饰(2′-Deoxy modification)、BNA、无环核酸修饰、错位核酸修饰、L型核酸修饰等。BNA(内环桥接核苷酸)是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C 3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥并入该核糖环的2'-、4'-位处以提供2',4'-BNA核苷酸，如锁乙基修饰(LNA)、环锁乙基修饰(ENA)和乙基锁核酸修饰(cET BNA)。无环核酸是核苷酸的糖环被打开形成的核苷酸，如解锁核酸(UNA)核苷酸和甘油核酸(GNA)核苷酸。错位核酸修饰是指3’,5’-磷酸键链接被2’,5’-磷酸键链所代替。L型核酸修饰是指天然存在的D型核酸被替换为其镜像立体对应体L型核酸。
Figure BDA0003466633560000061
Figure BDA0003466633560000071
其中，BASE表示碱基A、U、C、G或T。R在以上结构中可以是相同的，也可以是不同的，比如：氢(H)、氟(F)、甲氧基(OME)或甲氧乙基(MOE)、羟基、烯丙基、乙基胺基、炔丙基、氰基乙基、乙酰基等。
根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’-OH被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述核酸的正义链中含有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团为所述核糖基团被修饰的核苷酸基团，即，所述核酸的正义链中含有尿嘧啶碱基或胞嘧啶碱基的核苷酸基团中的核糖基团的2’-OH被甲氧基或氟取代。更优选地，所述核酸的正义链和反义链的3’端均可以连接有dTdT；或者，所述核酸的反义链的3’端可以连接有AA或UU或任何两个核酸的组合(可以是但不局限于CC，GG或UG)，使序列具有特异性对mRNA降解的诱因。具有以上修饰的核酸表现出更为优异的体内抑制效果，且上述修饰能够进一步降低本发明的核酸在体内的免疫原性。
本发明的核酸还可以包括在反义链5’端连接一单磷酸核苷的修饰。由于siRNA导链终端的5’-单磷酸对于RISC识别是重要的。其中5’-羟基的磷酸化对siRNA能否有效地装载到细胞内部的Ago2上起了一定程度的作用。在siRNA中的导链5’端单磷酸盐与Argonaute-2(Ago2)有H键的相互作用，从而确保对mRNA的靶标有准确定位和精确切割。常用的5’-单磷酸核苷的衍生物有如下几种，此类磷酸核苷的衍生物已被证实在生物代谢介质中具有一定稳定性，对促进siRNA导链装载到细胞内部的Ago2有一定作用(NucleicAcids Research,2015,43,2993–3011)。根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下，反式-乙烯基磷酸酯(VP)作为首选，也可以包括上面所述以外的单磷酸核苷的衍生物。
Figure BDA0003466633560000081
Figure BDA0003466633560000091
以上结构中，BASE表示碱基A、U、C、G或T。R在以上结构中可以是相同的，也可以是不同的，比如：氢(H)、氟(F)、甲氧基(OME)或甲氧乙基(MOE)、羟基、烯丙基、乙基胺基、炔丙基、氰基乙基、氨基、乙酰基等。
根据本发明更优选的实施方式，被修饰的核酸的碱基序列以及修饰的方式如表3所示(f、s、下划线)，也即被修饰的核酸siRNA-2、siRNA-6、siRNA-7、siRNA-8、siRNA-11、siRNA-18、siRNA-19、siRNA-21和siRNA-22的正义链和反义链具有表3中所示出的f、s和下划线所标示的修饰，且反义链的3’端进一步连接有UU。
在特别优选的实施方式中，所述核酸选自正义链碱基序列为SEQ ID NO：3且反义链碱基序列为3’端进一步连接有UU的SEQ ID NO：4的siRNA、正义链碱基序列为SEQ ID NO：35且反义链碱基序列为3’端进一步连接有UU的SEQ ID NO：36的siRNA、或正义链碱基序列为SEQ ID NO：37且反义链碱基序列为3’端进一步连接有UU的SEQ ID NO：38的siRNA，且核苷酸上具有的修饰如下：
5’-GsCsUAGUCfGCfUfGfCAAAACUU-3’(SEQ ID NO:3)
5’-AsAfsGUfUUfUGCAGCfGAfCUAGCsUsU-3’(SEQ ID NO:4+UU)
5’-GsCsAAAGGfCCfAfGfCAGCAGAUAA-3’(SEQ ID NO:35)
5’-UsUfsAUfCUfGCUGCUGGfCCfUUUGCsUsU-3’(SEQ ID NO:36+UU)
5’-AsGsCCGUUfUCfUfCfCUUGGUCUAA-3’(SEQ ID NO:37)
5’-UsUfsAGfACfCAAGGAGAfAAfCGGCUsUsU-3’(SEQ ID NO:38+UU)
其中，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸(即核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代)；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接(即磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代)；下划线标记的核苷酸代表该核苷酸的2’羟基被甲氧基取代。
根据本发明所述的核酸，可以通过本领域常规的方法获得，例如通过固相合成和液相合成得到，所述固相合成已经有商业的订制服务，因此可以通过商购获得。所述修饰的核苷酸基团可以通过具有相应修饰的核苷酸单体引入。
基于如上合成的核酸(siRNA)，本发明可以进一步构建与上述siRNA具有相同或相似功能的shRNA表达质粒，构建该表达质粒的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明还提供了如上所述的核酸的靶向基因序列。在一些实施方式中，所述靶向基因序列如表1第2列中的任意一项所示。
表1
Figure BDA0003466633560000101
Figure BDA0003466633560000111
注：第3-4列中(1)表示SEQ ID NO：1，第2列中“817-835”表示AGT基因序列中的第817-835位核苷酸，以此类推。
人AGT的编码序列(NM_001382817.3，SEQ ID NO：63)：
Figure BDA0003466633560000112
本发明还提供了一种靶向药物递送系统，其特征在于，该靶向药物递送系统包括靶向基团、连接基团和通过连接基团与靶向基团连接的如上所述的核酸。其中，所述靶向基团能够进一步提高小核酸的靶向性，可以由单糖(例如葡萄糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、他洛糖、果糖、艾杜糖等)和/或多肽(例如蛋白质、单克隆抗体、纳米体)提供。所述连接基团可以选自-O-[CH2CH2O]n-、-[CH2]m-CONH-[CH2]nO-、-O-[CH2CH2O]m-CONH-[CH2]nO-、-O-[CH2]m-CONH-[CH2H2O]nO-。其中，m和n可以各自独立地为1到10的整数。
根据本发明的一种优选实施方式，所述靶向药物递送系统具有如下所示的结构，其中，Nu表示本发明的核酸(siRNA)，化合物部分可以通过磷酸二酯键与siRNA的正义链的5’端或3’端相连，也可以通过磷酸二酯键与siRNA的反义链的5’端或3’端相连。该靶向药物递送系统利用其左侧的结构特性能提高核酸药物(Nu)的细胞穿透能力，增强其在细胞内的稳定性，且制备工艺简单，实用性强。
Figure BDA0003466633560000121
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸或靶向药物递送系统以及药学上可接受的载体。可以通过常规的方法由所述核酸和所述药学上可接受的载体制备得到所述药物组合物。例如，所述药物组合物可以为注射液。所述注射液可以用于皮下、肌肉或静脉的注射。
根据本发明所述的药物组合物，其中，对核酸或靶向药物递送系统以及药学上可接受的载体的量没有特别的要求，一般地，相对于1重量份的所述核酸(或1重量份的以核酸计的靶向药物递送系统)，所述药学上可接受的载体的含量可以为1-100000重量份(如1重量份、5重量份、10重量份、50重量份、100重量份、500重量份、1000重量份、5000重量份、10000重量份、50000重量份、100000重量份或以上任意两个数值之间的任意值)。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体可以为本领域常规采用的各种载体，例如，可以包括pH值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH值缓冲液可以为pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇和蔗糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％(如0.01重量％、0.05重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％或以上任意两个数值之间的任意值)。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以确定所述渗透压调节剂的含量。
根据本发明一种优选的实施方式，所述药学上可接受的载体为脂质体。脂质体可以为任何一种能包裹核酸的脂质体，其直径可以是25-1000nm，可以包括但不限于胆固醇及其类似物或衍生物。
本发明所述药物组合物的使用剂量可以为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其根据受试者的年龄、体重和性别来确定。例如，对于雌性，3-4月龄，体重25-30g的小鼠，以所述药物组合物中的所述核酸的量计，所述药物组合物的用量可以为0.01-100mg/kg体重，优选为1-10mg/kg体重。
本发明还提供了如上所述的核酸、靶向药物递送系统或药物组合物在制备用于治疗和/或预防RAAS系统过度激活相关疾病的药物中的应用。在所述用于治疗和/或预防RAAS系统过度激活相关疾病的药物中，如上所述的核酸主要通过RNA干扰的机制发挥作用。
本发明还提供了如上所述的核酸、靶向药物递送系统或药物组合物在制备用于降低(如血清或肝脏中)ATG表达水平的药物中的用途。
本发明还提供了一种抑制AGT的方法，该方法包括上述核酸和/或药物组合物对RAAS系统过度激活相关疾病的患者进行给药。“抑制”意指沉默AGT的基因表达。其中，所述患者可以为哺乳动物，优选为灵长类动物，更优选为人。可以通过多种途径给药，取决于是需要局部治疗还是全身治疗。给药的方式可以为但不限于静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、腹膜内给药、经皮给药(如通过植入器械)和软组织内给药。给药量可以参照前述，在此不再赘述。
“RAAS系统过度激活相关疾病”可以包括高血压、心力衰竭、肾脏疾病、早老性痴呆、眼科疾病等。
此外，本发明还提供了一种在体外抑制AGT的方法，该方法包括将用上述核酸和/或药物组合物导入细胞。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品、本发明所用的核酸电泳等操作均按常规方案进行。
实施例1
通过固相合成方法得到表1中所列的siRNA-1至siRNA-31。在24孔细胞培养皿内加入0.5毫升细胞培养液(DMEM,10％FBS)含105Hep3B细胞(购自ATCC)，在37℃、5％CO2的细胞培养器内过夜培养。在无血清细胞培养液内加入
Figure BDA0003466633560000131
RNAiMAX(1-2微升/孔)和表1所示的小干扰核酸siRNA-1至siRNA-31，加入细胞培养孔使最后每孔小干扰核酸的浓度为33nM或100nM，继续在37℃，5％CO2的细胞培养期内培养48小时。为提取RNA，将细胞培养上清液吸净，用PBS冲洗，吸净后，根据RNAeasy Mini试剂盒(QIAGEN,货号74104)的操作指示提取RNA。根据High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher,货号：4368814)的建议做RT-PCR,每个反应内含0.5或1微克RNA。用实时荧光PCR法测基因表达定量，人AGT的TaqMan探针为Hs00174854_m1，内参基因(人HPRT1)的探针为Hs02800695_m1(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。PCR条件为95℃ 20秒1个循环，95℃ 1秒和60℃ 20秒40个循环，实时荧光PCR仪为StepOne Plus(Thermo Fisher)。AGT基因表达是以2^-ΔΔCt计算，人HPRT1基因表达作为内参。AGT基因表达量以和仅有RNAiMAX的细胞组为对照的百分比表达(见表2)。
表2
编号 33nM(％) 100nM(％)
1 11.8 12.3
2 3.9 2.8
3 21.3 18.8
4 4 3.4
5 19.2 21.3
6 11.2 5.2
7 5.3 2.8
8 11 10.7
9 9.9 8.9
10 4.8 4.6
11 5.2 5.4
12 9.8 6.1
13 21.3 22.6
14 4.8 5.1
15 11.8 12.9
16 31.5 32.6
17 9 10.1
18 1.5 1.6
19 1.6 2.1
20 1.7 2
21 2.3 2.9
22 2.5 3.3
23 58 70
24 28.8 30
25 48.7 55.1
26 48.5 55.9
27 62.7 71
28 62.3 47.2
29 50.2 58.3
30 42.2 41.7
31 59 56.6
实施例2
(一)按照以下步骤制备：siRNA药物
缀合物(603A)的合成
1、化合物7按照以下路线制备
Figure BDA0003466633560000151
化合物恶唑啉5的合成
N-乙酰半乳糖胺四乙酸盐4(10g,25.68mmol)室温溶解在二氯乙烷(60mL)中，将三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(8.6g,38.66mmol)搅拌加入到上述溶液中，继续搅拌并将此溶液加热到50℃。在50℃下反应2小时后，停止加热，继续在室温下搅拌12小时。将溶液倒入含饱和碳酸氢钠的冰水中，用二氯甲烷萃取，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸干，得到棕黄色泡沫糖稀状化合物5。此化合物5直接用于下一步反应。
化合物6的合成
化合物恶唑啉5(4.26g,12.9mmol)室温溶解在二氯甲烷(20mL)中，在0℃条件下与溶解有叠氮-三聚乙二醇(3.4g,19mmol)的干燥二氯甲烷(20mL)的溶液混合搅拌。在0℃条件下缓慢加入三甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf,1.4g,6.45mmol)至上述溶液中并持续搅拌一小时。混合溶液继续在室温下搅拌14小时，然后将溶液到入含饱和碳酸氢钠的冰水中，用二氯甲烷萃取(2×50mL)，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至半干。用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用混合溶剂(乙酸乙酯/甲醇，10:1,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到近白色的化合物6(5.3g,81％)1H NMR(CDCl3):δ,6.15(d,1H,NH),5.32(d,1H,sugar-H-4’),5.07(dd,1H,J＝11.2Hz,J＝3.3Hz,sugar-H-3’),4.76(d,1H,J＝8.6Hz,sugar-H-1’),4.17(m,3H,sugar-H-2’,sugar-H-6’),3.91(m,2H,-CH2O),3.89(m,1H,suager-H-5’),3.76-3.61(m,8H,-CH2O),3.47(m,2H,-CH2N3),2.16(s,3H,-CH3,NHAc),1.99,2.00,2.05(3xs,9H,-CH3,Ac).HRMS(ESI)m/z,C20H32N4O11(M+H+)理论值：505.49,实测值:505.20.
化合物7的合成
叠氮化合物6(522mg,1.04mmol)溶解于10mL的乙酸乙酯中，Pd/C(80mg)，在氮气的保护下加入30mL的乙酸乙酯中。将反应瓶接通氢气球，经过多次氢气置换，在室温下，反应瓶与氢气球接通，反应溶液持续搅拌3小时。将Pd/C通过Celite过滤后，在反应瓶中缓慢滴加0.5mL的盐酸(2M),溶液在持续搅拌下反应30分钟，反应温度为0℃。在反应溶液中加入10mL的乙腈，共沸减压浓缩两次。将浓缩的溶液与二氯甲烷(10mL)混合，再次减压浓缩两次，得到一油状泡沫状粗产物7(500mg)，该粗产物将直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3):δ,8.25(m,2H,-NH2),5.34(d,1H,sugar-H-4’),5.21(dd,1H,J＝11.2Hz,J＝3.3Hz,sugar-H-3’),4.91(d,1H,J＝8.5Hz,sugar-H-1’),4.12(m,3H,sugar-H-6’,sugar-H-2’),4.07(m,2H,sugar-H-5’,-NH),3.76(m,2H,-CH2O),3.68(m,2H,-CH2O),3.61(m,2H,-CH2O),3.58(m,4H,2x-CH2O),3.20(m,2H,NH2),2.09(s,3H,-NHCO2CH3),2.04,1.96,1.89(3x s,9H,-CO2CH3).HRMS(ESI)m/z,C20H34N2O11(M+H+)理论值：479.49,实测值:479.20.
2、化合物12按照以下路线制备
Figure BDA0003466633560000161
化合物9的合成
三羟甲基氨基甲烷8(10g,82.6mmol)溶解在15mL的二恶烷中，在反应溶液中搅拌滴加1.26mL的40wt％氢氧化钾水溶液，并继续在室温下加入20mL的二恶烷。在0℃下，向反应瓶中慢慢滴加丙烯腈(18mL,272mmol)，整个滴加过程大约1小时。反应溶液继续在室温下搅拌24小时。将反应溶液倒入饱和氯化钠的水溶液中，用二氯甲烷萃取(2×50mL)，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至半干。用硅胶色谱柱继续纯化，先用二氯甲烷淋洗，然后使用一个混合溶剂(二氯甲烷/甲醇，10:1,v/v)淋洗，收集产物组分。经过旋蒸减压浓缩，得到浅黄色油状物9(20g,86％)。1H NMR(CDCl3):δ,3.68(t,6H,J＝7.1Hz,3x-CH2O),3.44(s,6H,3x-CH2CNH2),2.61(t,6H,J＝6.2Hz,3x–CH2CN),1.70(s,2H,-NH2).HRMS(ESI)m/z,C13H20N4O3(M+H+)理论值：281.32,实测值:281.20.
化合物10的合成
三[(氰基乙氧基)甲基]氨基甲烷9(1.2g,4.28mmol)溶解在10mL的无水乙醇中，在室温下，缓慢向反应瓶中的溶液滴加2mL的浓硫酸和10mL的无水乙醇。反应溶液加热至80℃，保持反应溶液呈回流状态约36小时。将反应溶液冷却至室温后，加入25mL饱和碳酸氢钠冰溶液。减压旋蒸，将乙醇蒸出。水溶液用乙酸乙酯(2×50mL)进行萃取，所得的有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到浅黄色的油状物10(0.8g,46％)，此粗产物直接用于下一步反应，不需进一步纯化。
化合物11的合成
将粗产物化合物10(0.8g,1.9mmol)溶解在20mL的二氯甲烷中。在反应溶液中加入二碳酸二叔丁酯(2mL,8.8mmol)和5mL的三乙胺。在室温下，搅拌反应溶液14小时。将反应溶液倒入含饱和碳酸氢钠的水溶液中，用二氯甲烷萃取(2×50mL)，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至半干，用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用二氯甲烷溶剂洗涤，然后用(二氯甲烷/甲醇，96:4,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到近白色的油状物11(0.5g,51％),1H NMR(CDCl3):δ,4.92(b,1H,-CONH-),4.14(m,3x2H,-CO2CH2-),3.69(m,3x2H,-OCH2-),3.63(s,3x2H,-OCH2-),2.53(m,3x2H,-COCH2-),1.45(s,3x3H,-CH3),1.26(t,3x3H,-CH2CH3).HRMS(ESI)m/z,C24H43NO11(M+H+)理论值:522.60,实测值:522.40.
化合物12的合成
将Boc保护的化合物11(0.6g,1.43mmol)溶解在20mL的无水乙醇中，缓慢向反应溶液中滴加4mL的氢氧化钠(4M)，保持反应溶液在0℃，并搅拌14小时。用液质时时监控反应进程，待反应物的峰消失，减压旋蒸，将乙醇蒸出后，将10mL硫酸氢钾(1M)加入反应溶液中继续搅拌15分钟在0℃。上述反应溶液用乙酸乙酯(2×50mL)进行萃取，所得的有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到一个粘稠状物12(0.5g,81％)，此粗产物直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1HNMR(CDCl3):d,9.40(b,3H,-CO2H),5.0(b,1H,-CONH-),3.70(m,m,3x2H,-OCH2-),3.65(s,3x2H,-OCH2-),2.60(m,3x2H,-COCH2-),1.42(s,3x3H,-CH3).HRMS(ESI)m/z,C18H31NO11(M+H+)理论值:438.32,实测值:438.20.
化合物14按照以下路线制备
Figure BDA0003466633560000171
化合物13的合成
将三羧酸12(0.5g,1.14mmol)溶解在20mL的二氯甲烷，并加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.3g,3.42mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.2g,3.95mmol),同时加入8mL的二甲基甲酰胺。将化合物胺7(2.19g,4.08mmol)溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，并加入1mL的N,N-二异丙基乙胺。将上述两种溶液在室温下混合搅拌，并持续搅拌14小时。经过层析色谱检测，确定反应物完全消失。将20mL的饱和碳酸氢钠水溶液加入反应溶液中，并用2×50mL的二氯甲烷进行萃取，有机相经过旋蒸浓缩至半干，用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用二氯甲烷溶剂洗涤，然后用(二氯甲烷/甲醇，85:15,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到近黄色的油状粗品13(2g,86％).将粗产物13进一步用反相色谱柱纯化，淋洗溶剂为(H2O/MeOH,1:1,v/v),收集产物组分，经过旋蒸浓缩至全干，得到化合物13(1.24g,60％)。1H NMR(CDCl3):δ,5.32(d,3H,J＝3.0Hz,sugar-H-4’),5.18(dd,3H,sugar-H-3’),4.78(d,3H,sugar-H-1’),4.18-4.06(m,24H,-OCH2,sugar-H-5’),3.93(m,9H,sugar-2xH-6’,sugar-H-2’),3.77,3.64,3.46(m,6H,-CH2NH-),2.44,2.20(m,6H,-COCH2-),2.15(s,9H,-NHCOCH3),2.09(s,2H,-CH2-),2.05,1.99,1.95(3xs,27H,-OCOCH3),1.81(s,9H,CH3,Boc).HRMS(ESI)m/z,C78H127N7O41(M+2H+)/2,理论值:910.1,实测值:910.0.
化合物14的合成
将纯化的化合物13(2g,1.1mmol)溶解在30mL的二氯甲烷中，缓慢将1mL的盐酸溶液(4M)和1mL的二恶烷在0℃的温度下加入至上述的二氯甲烷反应液中。上述反应溶液在0℃的温度下持续搅拌30分钟，然后在室温下继续搅拌30分钟。旋蒸浓缩至全干，得到白色泡沫状粗产物14(1.7g,90％),粗产物直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3):δ,8.20(b,2H,-NH2),5.35(d,3H,J＝3.0Hz,sugar-H-4’),5.22(dd,3H,sugar-H-3’),4.80(d,3H,sugar-H-1’),4.13(m,9H,sugar-2xH-6’,sugar-H-2’),3.94-3.44(m,24H,-OCH2,sugar-H-5’),3.77,3.64,3.46(m,6H,-CH2NH-),2.55,2.43(m,6H,-COCH2-),2.15(s,9H,-NHCOCH3),2.09(s,2H,-CH2-),2.05,1.98,1.96(3xs,27H,-OCOCH3).HRMS(ESI)m/z,C73H119N7O39(M+H+)/2,理论值:860.4,实测值:860.0.
化合物21按照以下路线制备
Figure BDA0003466633560000181
化合物16的合成
将4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.8g,5.3mmol)溶解在5mL的二氯甲烷中，在室温条件下，将此溶液缓慢滴加入含有3-羟基-2-羟基甲基-2-甲基-丙酸15(0.8g,5.97mmol)的无水吡啶(10mL)溶液中。在室温条件下持续搅拌上述溶液14小时。将20mL水加入到反应混合物中，用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取。有机相经过旋蒸浓缩至半干，用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用正己烷溶剂洗涤，然后用(正己烷/乙酸乙酯，1:1,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到黄色固体16(1.5g,58％).产物16直接用于下一步反应。
化合物19的合成
将己二酸单甲酯17(0.16g,1mmol)和N-(叔丁氧羰基)-1,3-二氨基丙烷N-(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯18(0.174g，1mmol)在室温条件下溶解在5mL的无水四氢呋喃中。将上述溶液与0.892mL的1-丙基磷酸环酐(0.892mL，1.5mmol，在50％(体积比例1:1)乙酸乙酯)和0.522mL的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.522mL,3mmol)混合。将上述混合的反应溶液在室温下持续搅拌30分钟，然后向反应溶液中加入20mL的乙酸乙酯稀释，同时加入20mL的饱和食盐水，并用2×20mL的乙酸乙酯进行萃取。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至全干，得到淡黄色泡沫状粗产物19(0.29g,91％),粗产物19直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3),δ,5.89(b,1H,-CONH-),4.97(b,1H,-NHCO-),3.75(s,3H,-CH3),3.27(m,2H),3.15(m,2H),2.34(m,2H),2.19(m,2H),1.67(m 2x2H),1.64(m,2H),1.4(s,9H).HRMS(ESI)m/z,C15H28N2O5,理论值:316.39,实测值:316.40.
化合物20的合成
将化合物19(0.8g,2.5mmol)溶解在5mL的乙酸乙酯中，将此反应溶液与3.2mL的盐酸(4M)水溶液混合，再加入5mL的二恶烷。在室温条件下，将此混合反应溶液持续搅拌30分钟。经过旋蒸浓缩后，得到粘稠状得粗产品20(0.5g,92％)，直接用于下一步反应。
化合物21的合成
将上述粗产品化合物20(0.252g,1mmol)溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，在0℃下，将上述反应液与3-O-4,4'-二甲氧基三苯甲基-2-羟基-2-甲基丙酸16(0.45g,0.9mmol)混合，并加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.46g,1.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.52mL)，搅拌20分钟。缓慢将上述反应溶液的温度升至室温，持续搅拌14小时。反应溶液与20mL的饱和氯化钠水溶液混合，并用2×50mL的乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到粗产物21。用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用乙酸乙酯溶剂洗涤，然后用(乙酸乙酯/甲醇，90:10,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到化合物21(0.38g,61％)。1H NMR(CDCl3):δ,8.01(b,1H,-CONH-),7.26(m,4H,Trityl),7.05(m,4H,Trityl),6.67(m,4H,Trityl),6.48(b,1H,-NHCO-),5.25(s,3H,-OCH3),3.78(s,6H,2x-OCH3),3.64(s,4H,2X-CH2-),3.26(m,2H,-NHCH2-),3.17(m,2H,-CH2NH-),2.79(m,3H,-OCH3),2.31(m,2H),2.18(m,2H),1.65-1.56(m,6H),1.25(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C36H46N2O8,(M+Na+)理论值:657.34,实测值:657.40.
化合物(603A)按照以下路线制备
Figure BDA0003466633560000201
化合物22的合成
将纯化的化合物21(0.7g,1.1mmol)溶解在5mL的无水甲醇中，然后将1.5mL的氯化锂的甲醇溶液(2M)在0℃下缓慢加入反应溶液中。在0℃的条件下搅拌30分钟，然后将反应溶液升温至室温，继续在室温条件下搅拌2小时。在室温条件下，将反应溶液与2mL的水混合后，经过旋蒸浓缩至半干，将甲醇除去，然后用制备反相高压液相色谱进行分离，流动相溶剂是甲醇和水(MeOH:H2O,1:1,v/v)。收集产物组分，减压抽干溶剂得到黄色固体化合物22(0.66g,93％)。1H NMR(CDCl3):δ,7.38(m,4H,Trityl),7.29(b,1H,-CONH-),7.28(m,5H,Trityl),7.16(b,1H,-NHCO-),6.79(m,4H,Trityl),3.76(s,10H,2x-OCH3,2x–CH2),3.71(m,2H,-CH2-),3.21(m,2H,-NHCH2-),2.07(m,2H,-CH2NH-),1.87(m,2H),1.50(m,2H),1.27(m,2H),1.21(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C35H43N2O8,(M+H++Na+)理论值:643.72实测值:643.20.
化合物(603A)的合成
将纯化的化合物22(0.65g,1.04mmol)溶解在15mL的二氯甲烷中，然后在室温下，将上述溶液与0.723mL的N,N-二异丙基乙胺(4.16mmol)混合。在0℃条件下，将此混合溶液与纯化的化合物14(1.83g,1.04mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.435g,1.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.723mL,4.16mmol)混合并搅拌30分钟。继续在0℃条件，向反应溶液中加入1mL的N,N-二异丙基乙胺，并持续搅拌反应溶液1小时。将反应温度从0℃逐渐升至室温，然后继续搅拌2小时。反应溶液与5mL的饱和氯化钠水溶液混合，并用2×50mL的二氯甲烷萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到粗产物603A。用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用二氯甲烷溶剂洗涤，然后用(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，94:5:1,v/v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到黄色固体化合物603A(1.56g,65％)。1H NMR(CDCl3):δ,7.38(m,3H,-NH-),7.28(m,4H,trityl),7.26(m,1H,-NH-),7.18(m,1H,-NH-),6.84(m,5H,trityl),6.37(m,4H,trityl),5.33(m,3H,sugar-H-4’),5.16(dd,J＝3.4Hz,J＝11.3Hz,3H,sugar-H-3’),4.77(d,J＝8.4Hz,3H,sugar-H-1’),4.18-4.07(m,3x2H,3x1H,sugar-H-5’,sugar-H-6’),3.94(m,3H,sugar-H-2’),3.77-3.53(m,14H),3.42(m,2H,-NHCH2-),3.30-3.19(m,2H,-CH2NH-),2.42(m,2H),2.19(m,4H),2.15(s,9H),2.07(m,2H),2.05(s,9H,2.01(s,9H),1.96(s,9H),1.20(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C87H143N9O44,(M-trityl+H+)/2,理论值:1010.55,实测值:1010.4.
按照以下路线制备缀合物(603B)三乙胺羧酸盐
Figure BDA0003466633560000211
将化合物(603A)(1.5g,0.646mmol)溶解在30mL的干燥二氯甲烷，然后加入5mL的三乙胺。将4-二甲氨基吡啶(0.159g,1.3mmol)搅拌溶解在反应溶液中，在室温下将丁二酸酐(0.13g,1.3mmol)搅拌溶解在反应溶液中，搅拌反应8小时。继续加入丁二酸酐(32mg,0.32mmol),并在室温下继续搅拌14小时。将上述反应后的溶液倒入饱和食盐水中，用2×50mL的二氯甲烷萃取，分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸到半干。用硅胶色谱纯化，使用一个梯度淋洗，先用混合溶剂(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，100:2；1,v/v/v)淋洗，继续用混合溶剂(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，100:5:1,v/v/v)淋洗，最后用混合溶剂(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，100:5:1,v/v/v)淋洗出终产物，减压抽干溶剂得到一个白色的化合物(603B)(1.56g,65％)。1H NMR(CDCl3)δ,1H NMR(CDCl3):δ,7.39(m,3H,-NH-),7.28(m,5H,trityl),7.22(m,1H,-NH-),7.10(m,1H,-NH-),6.80(m,4H,trityl),6.37(m,4H,trityl),5.32(m,3H,sugar-H-4’),5.29(s,2H),5.15(dd,J＝3.4Hz,J＝11.3Hz,3H,sugar-H-3’),4.77(d,J＝8.4Hz,3H,sugar-H-1’),4.18-4.07(m,3x2H,3x1H,sugar-H-5’,sugar-H-6’),3.94(m,3H,sugar-H-2’),3.67(m,9H),3.61-3.53(m,42H),3.42(m,2H,-NHCH2-),3.30-3.19(m,2H,-CH2NH-),2.42(m,2H),2.19(m,4H),2.15(s,9H),2.07(m,2H),2.05(s,9H,2.01(s,9H),1.96(s,9H),1.23(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C112H165N9O49,(M-H+)/2,理论值：1209.27实测值:1209.83。
按照以下工艺路线通过将(603B)缀合分子连接至固相载体，制备(603C)缀合分子的固相载体
Figure BDA0003466633560000221
将缀合物半丁二酸酯(603B)(50mg,0.021mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(10mg,0.026mmol)在室温下溶解于1.25mL的无水乙腈。将N,N-二异丙基乙胺(10μL)加入反应溶液中，待所有试剂溶解后，将125mg的长链胺基烷烃玻璃沙(500°A,native lcaa-CPG,厂商Chemgenes,USA)加入到上述反应溶液中。在室温下，将固、液两相旋转搅拌300转/分钟。反应持续2小时后，将残留液滤出，用乙腈洗涤长链胺基烷烃玻璃沙固相载体三次(3×1mL)。将0.5mL的盖帽试剂A(乙酸酐)的四氢呋喃溶液，浓度为(10％,v/v)和0.5mL的盖帽试剂B(N-甲基咪唑在吡啶和乙腈的混合溶剂，浓度为(15:10:75,v/v/v))与长链胺基烷烃玻璃沙在室温下旋转搅拌1小时。过滤出反应液，将长链胺基烷烃玻璃沙固相载体用乙腈淋洗3次，用真空油泵使长链胺基烷烃玻璃沙固相载体在减压下干燥2小时。得到玻璃沙固相载体(603C,130mg)。称量长链胺基烷烃玻璃沙603C固相载体(8.3mg),加入到100mL的3％的三氯乙酸的二氯甲烷溶液中，旋转搅拌30秒，静置1分钟。取上清液在498nm处测量可见光吸收，其光吸收度为0.309，计算出缀合物603C的载量(也即(603B)在CPG上的载量)为53.25μmol/g。
siRNA正义和反义序列的制备(siRNA药物的制备)
按照亚磷酰胺固相合成的方法，根据上述序列顺序按照从3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、和氧化四步反应。
固相合成试剂配制：
脱保护试剂为三氯乙酸或二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％,v/v).核苷单体溶解在无水乙腈，浓度为(0.05M-0.1M)，适量加入少量分子筛3A°做无水处理。耦联活化剂为5-乙基硫基1H-四氮唑(5-Ethylthio-1H-Tetrazole)的无水乙腈，浓度为(0.25M,或0.45M)，活化剂也可选1H-四氮唑(Tetrazole)；5-苄硫基四氮唑(5-Benzylthio-1H-Tetrazole)；4,5-二氰基咪唑(4,5-Dicyanoimidazole)。盖帽试剂A为乙酸酐的四氢呋喃溶液，浓度为(10％,v/v)。盖帽试剂B为N-甲基咪唑在吡啶和乙腈的混合溶剂，浓度为(15:10:75,v/v/v)。氧化试剂为碘的水和吡啶溶液(0.05M,95wt％的吡啶水溶液)。硫化试剂为N-Dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione((二甲基氨基-亚甲基)氨基-3H-1-2,4-噻唑-3-硫酮),浓度为(0.05M,吡啶/乙腈,2:3,v/v)。切割脱保护试剂为28wt％浓氨水。
其中，核苷酸固相合成的固相载体为市售的通用固相载体(
Figure BDA0003466633560000231
HLUnyLinkerTM 300，或500°A,native lcaa-CPG,厂商Chemgenes,USA)。
固相合成的步骤：
在合成仪上固相载体或与载体相联的核苷单体上的4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基与三氯乙酸的二氯甲烷的溶液(3％,v/v),摩尔比为(1:30)。室温固相反应1.5分钟，反复操作三次，待固相载体的洗脱液颜色由红色变成无色停止滴加脱保护液。经过用无水乙腈反复洗涤后，加入核苷单体和活化剂(耦联活化剂,5-乙硫基四氮唑)(核苷单体和活化剂的比例(摩尔比为1:20)，固相载体和核苷单体的摩尔比为1:(5-6)。室温试剂和固相反应时间为3-4分钟为一个循环，两个循环后，停止反应。用无水乙腈洗涤后，加入氧化试剂溶液，固相载体和氧化剂的摩尔比为1:6。室温下氧化试剂与固相载体反应时间约为2分钟，重复操作两次。在耦合反应之后，如需硫化反应步骤，加入硫化试剂溶液，固相载体和硫化剂的摩尔比为1:6。室温下氧化试剂与固相载体反应时间约为4-5分钟，重复操作两次。盖帽保护反应，加入盖帽反应试剂，固相载体和盖帽试剂的摩尔比为1:80。室温下盖帽试剂与固相载体反应时间大约为1-2分钟，重复操作两次。循环上述脱保护、耦合、氧化、盖帽步骤，直到完成最后一个核苷酸的耦合。将在由载有核酸序列正义链或反义链的固相载体转移至小玻璃瓶中，加入28％氨水溶液，并将玻璃盖旋紧密封，在55℃的温度下，将正义链或反义链中的碱基保护基水解脱掉，同时将正义链或反义链与固相载体水解分离。反应持续16个小时。将所得到的小核酸序列链溶液与固相载体过滤分离。经过浓缩后，得到小核酸序列链的粗产物。
用制备高压液相色谱纯化分离和脱盐
使用制备型阴离子交换色谱柱(Source 15Q)，通过NaBr的梯度洗脱纯化小核酸。流动相A:20mM磷酸钠(pH 8.0),流动相B:20mM磷酸钠(pH 8.0),1M溴化钠在10％乙腈的水溶液。柱温是65℃。流速为10mL/min。淋洗梯度是起始为流动相A，随后流动相B从0％在12分钟增至20％。之后的15分钟，将流动相B从20％增至到50％。收集产品洗脱液，并进行组分分析和组分合并。采用反相色谱纯化柱进行脱盐，或透析脱盐。经过浓缩和冷冻干燥，得到纯化的小核苷酸。对于上述合成的正义链和反义链，使用阴离子交换液相色谱(AEX-HPLC)检测纯度，并以反相液质联用色谱(LC-MS)鉴定分析全序列分子量，分子量的实测值与理论值相符，确认所合成的核酸序列。
退火
将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用生理盐水中，在90℃温度下加热5分钟，随后缓慢至冷却至室温，保存在4℃冰箱中12小时，使其通过氢键形成双链结构，即可得到siRNA药物32-40(核苷酸的序列和修饰方式如表3所示)。
表3
Figure BDA0003466633560000241
表3所示的序列中，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸(即核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代)；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接(即磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代)；下划线标记的核苷酸代表该核苷酸的2’羟基被甲氧基取代。TriGaNAc表示靶向递送的靶向基团和连接基团(也即式(603)中除Nu之外的部分)。
通过液质分析数据确认所合成siRNA药物的序列及结构。表3中修饰后的siRNA具有更稳定的核酸结构，具有碱基配对的高特异性和高亲和力；另外，具有以上修饰的核酸表现出更为优异的体内抑制效果，且能够进一步降低本发明的核酸在体内的免疫原性。
(二)雄性人源化AGT小鼠(8-10周年龄，河北理工大学)按照体重随机分组，在第0、2、4天注射10mg/kg siRNA药物32-40，对照组注射生理盐水，在第29天杀死小鼠后取肝脏组织，根据RNAeasy Mini试剂盒(QIAGEN，货号74104)的操作指示提取RNA。根据HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher,货号：4368814)的建议做RT-PCR，每个反应内含1微克RNA。用实时荧光PCR法测基因表达定量，人AGT的TaqMan探针为Hs01586213_m1，内参基因(鼠HPRT)的探针为Mm03024075_m1(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。PCR条件为95℃ 20秒1个循环，95℃ 1秒和60℃ 20秒40个循环，实时荧光PCR仪为StepOne Plus(Thermo Fisher)。AGT基因表达是以2^-ΔΔCt计算，鼠HPRT基因表达作为内参。AGT基因表达量以和对照组小鼠肝人源化AGT基因表达为对照(图1)。从图1可以看出，siRNA药物(尤其是36-40)在体内能够有效(显著)降低ATG的表达。
本说明书中提及的所有出版物以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物以及专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 施能康生物科技有限公司（Synerk Biotech Limited）
<120> 靶向血管紧张素原的核酸及其用途
<130> I67245SNKB-CJ
<150> 202110050924.2
<151> 2021-01-14
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
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<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 24
cuugagucac cgagaaguug u 21
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 25
gcugauccag ccucacuau 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 26
auagugaggc uggaucagc 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 27
cccucaacug gaugaagaa 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 28
uucuucaucc aguugaggg 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 29
ggugcugcaa ggaucuuau 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 30
auaagauccu ugcagcacc 19
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 31
gcugcaagga ucuuaugacc u 21
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 32
aggucauaag auccuugcag c 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 33
agucuaccca acagcuuaac a 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 34
uguuaagcug uuggguagac u 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 35
gcaaaggcca gcagcagaua a 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 36
uuaucugcug cuggccuuug c 21
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 37
agccguuucu ccuuggucua a 21
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 38
uuagaccaag gagaaacggc u 21
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 39
gccguuucuc cuuggucuaa g 21
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 40
cuuagaccaa ggagaaacgg c 21
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 41
ccguuucucc uuggucuaa 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 42
uuagaccaag gagaaacgg 19
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 43
ccaaccgacc agcuuguuu 19
<210> 44
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 44
aaacaagcug gucgguugg 19
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 45
aacaugaccu ccguguagug u 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 46
acacuacacg gaggucaugu u 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 47
gaccuccgug uagugucugu a 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 48
uacagacacu acacggaggu c 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 49
accuccgugu agugucugua a 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 50
uuacagacac uacacggagg u 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 51
agugucugua auaccuuagu u 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 52
aacuaaggua uuacagacac u 21
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 53
gugucuguaa uaccuuagu 19
<210> 54
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 54
acuaagguau uacagacac 19
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 55
gaacaauacg ugaaagaug 19
<210> 56
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 56
caucuuucac guauuguuc 19
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 57
gcggaaccau agcugguua 19
<210> 58
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 58
uaaccagcua ugguuccgc 19
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 59
aauaaacguc uugccacaau a 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 60
uauuguggca agacguuuau u 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 61
auaaacgucu ugccacaaua a 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The sequence is synthesized
<400> 62
uuauuguggc aagacguuua u 21
<210> 63
<211> 2148
<212> DNA
<213> 人AGT的编码序列
<400> 63
agaaagtaga ccctcaccag gcatggaatc tgccagtgcc ttgatcttgg acttccagct 60
tccagaactg gtatgcggaa gcgagcaccc cagtctgaga tggctcctgc cggtgtgagc 120
ctgagggcca ccatcctctg cctcctggcc tgggctggcc tggctgcagg tgaccgggtg 180
tacatacacc ccttccacct cgtcatccac aatgagagta cctgtgagca gctggcaaag 240
gccaatgccg ggaagcccaa agaccccacc ttcatacctg ctccaattca ggccaagaca 300
tcccctgtgg atgaaaaggc cctacaggac cagctggtgc tagtcgctgc aaaacttgac 360
accgaagaca agttgagggc cgcaatggtc gggatgctgg ccaacttctt gggcttccgt 420
atatatggca tgcacagtga gctatggggc gtggtccatg gggccaccgt cctctcccca 480
acggctgtct ttggcaccct ggcctctctc tatctgggag ccttggacca cacagctgac 540
aggctacagg caatcctggg tgttccttgg aaggacaaga actgcacctc ccggctggat 600
gcgcacaagg tcctgtctgc cctgcaggct gtacagggcc tgctagtggc ccagggcagg 660
gctgatagcc aggcccagct gctgctgtcc acggtggtgg gcgtgttcac agccccaggc 720
ctgcacctga agcagccgtt tgtgcagggc ctggctctct atacccctgt ggtcctccca 780
cgctctctgg acttcacaga actggatgtt gctgctgaga agattgacag gttcatgcag 840
gctgtgacag gatggaagac tggctgctcc ctgatgggag ccagtgtgga cagcaccctg 900
gctttcaaca cctacgtcca cttccaaggg aagatgaagg gcttctccct gctggccgag 960
ccccaggagt tctgggtgga caacagcacc tcagtgtctg ttcccatgct ctctggcatg 1020
ggcaccttcc agcactggag tgacatccag gacaacttct cggtgactca agtgcccttc 1080
actgagagcg cctgcctgct gctgatccag cctcactatg cctctgacct ggacaaggtg 1140
gagggtctca ctttccagca aaactccctc aactggatga agaaactatc tccccggacc 1200
atccacctga ccatgcccca actggtgctg caaggatctt atgacctgca ggacctgctc 1260
gcccaggctg agctgcccgc cattctgcac accgagctga acctgcaaaa attgagcaat 1320
gaccgcatca gggtggggga ggtgctgaac agcatttttt ttgagcttga agcggatgag 1380
agagagccca cagagtctac ccaacagctt aacaagcctg aggtcttgga ggtgaccctg 1440
aaccgcccat tcctgtttgc tgtgtatgat caaagcgcca ctgccctgca cttcctgggc 1500
cgcgtggcca acccgctgag cacagcatga ggccagggcc ccagaacaca gtgcctggca 1560
aggcctctgc ccctggcctt tgaggcaaag gccagcagca gataacaacc ccggacaaat 1620
cagcgatgtg tcacccccag tctcccacct tttcttctaa tgagtcgact ttgagctgga 1680
aagcagccgt ttctccttgg tctaagtgtg ctgcatggag tgagcagtag aagcctgcag 1740
cggcacaaat gcacctccca gtttgctggg tttattttag agaatggggg tggggaggca 1800
agaaccagtg tttagcgcgg gactactgtt ccaaaaagaa ttccaaccga ccagcttgtt 1860
tgtgaaacaa aaaagtgttc ccttttcaag ttgagaacaa aaattgggtt ttaaaattaa 1920
agtatacatt tttgcattgc cttcggtttg tatttagtgt cttgaatgta agaacatgac 1980
ctccgtgtag tgtctgtaat accttagttt tttccacaga tgcttgtgat ttttgaacaa 2040
tacgtgaaag atgcaagcac ctgaatttct gtttgaatgc ggaaccatag ctggttattt 2100
ctcccttgtg ttagtaataa acgtcttgcc acaataagcc tccaaaaa 2148

Claims (9)

1.一种核酸，该核酸包括正义链和反义链，其特征在于，所述正义链含有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQID NO：61所示的序列具有80％以上的序列同一性的序列，所述反义链含有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60或SEQID NO：62所示的序列具有80％以上的序列同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中，具有90％以上的序列同一性是指序列之间存在1个碱基不一致，在正义链中，不一致的1个碱基位于正义链的倒数第一位，在反义链中，不一致的1个碱基位于反义链的第1位。
3.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述核酸选自正义链序列为SEQ ID NO：1且反义链序列为SEQ ID NO：2的siRNA-1、正义链序列为SEQ ID NO：3且反义链序列为SEQ ID NO：4的siRNA-2、正义链序列为SEQ ID NO：5且反义链序列为SEQ ID NO：6的siRNA-3、正义链序列为SEQ ID NO：7且反义链序列为SEQ ID NO：8的siRNA-4、正义链序列为SEQ ID NO：9且反义链序列为SEQ ID NO：10的siRNA-5、正义链序列为SEQ ID NO：11且反义链序列为SEQ IDNO：12的siRNA-6、正义链序列为SEQ ID NO：13且反义链序列为SEQ ID NO：14的siRNA-7、正义链序列为SEQ ID NO：15且反义链序列为SEQ ID NO：16的siRNA-8、正义链序列为SEQ IDNO：17且反义链序列为SEQ ID NO：18的siRNA-9、正义链序列为SEQ ID NO：19且反义链序列为SEQ ID NO：20的siRNA-10、正义链序列为SEQ ID NO：21且反义链序列为SEQ ID NO：22的siRNA-11、正义链序列为SEQ ID NO：23且反义链序列为SEQ ID NO：24的siRNA-12、正义链序列为SEQ ID NO：25且反义链序列为SEQ ID NO：26的siRNA-13、正义链序列为SEQ ID NO：27且反义链序列为SEQ ID NO：28的siRNA-14、正义链序列为SEQ ID NO：29且反义链序列为SEQ ID NO：30的siRNA-15、正义链序列为SEQ ID NO：31且反义链序列为SEQ ID NO：32的siRNA-16、正义链序列为SEQ ID NO：33且反义链序列为SEQ ID NO：34的siRNA-17、正义链序列为SEQ ID NO：35且反义链序列为SEQ ID NO：36的siRNA-18、正义链序列为SEQ ID NO：37且反义链序列为SEQ ID NO：38的siRNA-19、正义链序列为SEQ ID NO：39且反义链序列为SEQ ID NO：40的siRNA-20、正义链序列为SEQ ID NO：41且反义链序列为SEQ ID NO：42的siRNA-21、正义链序列为SEQ ID NO：43且反义链序列为SEQ ID NO：44的siRNA-22、正义链序列为SEQ ID NO：45且反义链序列为SEQ ID NO：46的siRNA-23、正义链序列为SEQ ID NO：47且反义链序列为SEQ ID NO：48的siRNA-24、正义链序列为SEQ ID NO：49且反义链序列为SEQ ID NO：50的siRNA-25、正义链序列为SEQ ID NO：51且反义链序列为SEQ ID NO：52的siRNA-26、正义链序列为SEQ ID NO：53且反义链序列为SEQ ID NO：54的siRNA-27、正义链序列为SEQ ID NO：55且反义链序列为SEQ ID NO：56的siRNA-28、正义链序列为SEQ ID NO：57且反义链序列为SEQ ID NO：58的siRNA-29、正义链序列为SEQ ID NO：59且反义链序列为SEQ ID NO：60的siRNA-30、正义链序列为SEQ ID NO：61且反义链序列为SEQ ID NO：62的siRNA-31中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的核酸，其中，所述核酸选自正义链碱基序列为SEQ ID NO：3且反义链碱基序列为3’端进一步连接有UU的SEQ ID NO：4的siRNA、正义链碱基序列为SEQ IDNO：35且反义链碱基序列为3’端进一步连接有UU的SEQ ID NO：36的siRNA、或正义链碱基序列为SEQ ID NO：37且反义链碱基序列为3’端进一步连接有UU的SEQ ID NO：38的siRNA，且核苷酸上具有的修饰如下：
5’-GsCsUAGUCfGCfUfGfCAAAACUU-3’
5’-AsAfsGUfUUfUGCAGCfGAfCUAGCsUsU-3’
5’-GsCsAAAGGfCCfAfGfCAGCAGAUAA-3’
5’-UsUfsAUfCUfGCUGCUGGfCCfUUUGCsUsU-3’
5’-AsGsCCGUUfUCfUfCfCUUGGUCUAA-3’
5’-UsUfsAGfACfCAAGGAGAfAAfCGGCUsUsU-3’
其中，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接；下划线标记的核苷酸代表该核苷酸的2’羟基被甲氧基取代。
5.一种靶向药物递送系统，其特征在于，该靶向药物递送系统包括靶向基团、连接基团和通过连接基团与靶向基团连接的权利要求1-4中任意一项所述的核酸。
6.根据权利要求5所述的靶向药物递送系统，其中，所述靶向药物递送系统的结构如下所示：
Figure FDA0003466633550000031
式(603)中，Nu表示核酸。
7.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-4中任意一项所述的核酸或权利要求5或6所述的靶向药物递送系统和药学上可接受的载体。
8.权利要求1所述的核酸、权利要求5活6所述的靶向药物递送系统或权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度激活相关疾病的药物中的用途。
9.权利要求1所述的核酸、权利要求5活6所述的靶向药物递送系统或权利要求7所述的药物组合物在制备用于降低血管紧张素原表达水平的药物中的用途。
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