KR20070085113A

KR20070085113A - Rna간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한유전자발현억제 방법

Info

Publication number: KR20070085113A
Application number: KR1020067025799A
Authority: KR
Inventors: 유키 나이토; 마사토 후지노; 시노부 오구치; 유키카즈 나토리
Original assignee: 가부시키가이샤 알파젠
Priority date: 2004-05-11
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2007-08-27
Also published as: AU2005248147A1; JPWO2005116204A1; EP1752536A1; WO2005116204A1; CA2566286A1; US20110054005A1; US20080113351A1; CN101052717A; EP1752536A4

Abstract

본 발명은 표적유전자에 대하여 높은 RNA간섭 효과를 갖는 동시에, 표적유전자와 관계가 없는 유전자에 대해서 RNA간섭이 생기는 위험성이 대단히 적은 폴리뉴클레오티드를 제공한다. RNA간섭의 표적유전자의 염기서열로부터 하기 (a)~(d)의 규칙에 따르는 서열 부위를 검색하고, 검색 결과에 근거해 RNAi를 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 설계, 합성 등을 행한다. (a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이다. (b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이다. (c) 3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부하다. (d) 염기수가 세포독성을 생기게 하지 않도록 RNA간섭을 생기게 할 수 있는 수이다.

Description

RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한 유전자발현억제 방법{POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME}

본 발명은 RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이하 본 명세서에 있어서 RNA간섭을 「RNAi」로 표기하는 경우가 있다.

RNA간섭은 기능 저해하고자 하는 유전자의 특정 영역과 상동인 센스 RNA와 안티센스 RNA로 이루어지는 2가닥(本鎖) RNA(double-stranded RNA, 이하 「dsRNA」로 칭한다) 가 표적유전자의 전사 산물인 mRNA의 상동부분을 간섭 파괴한다고 하는 현상으로, 1998년에 선충을 이용한 실험에 의해 처음으로 제창되었다. 그러나, 포유류에 있어서는, 약 30염기쌍 이상의 긴 dsRNA를 세포내에 도입하면, 인터페론 리스폰스가 유도되어 세포가 아포토시스에 의해 죽어버리기 때문에, RNAi법을 이용하는 것이 어려웠다.

한편, 마우스 초기배나 포유류배양세포에서는, RNA간섭이 일어날 수 있다는 것이 시사되어 RNA간섭의 유도 기구 자체는 포유류세포에도 존재하는 것을 알게 되었다. 현재로서는, 약 21~23염기쌍의 짧은 2가닥 RNA(short interfering RNA, siRNA) 가 포유류세포계에서도 세포독성을 나타내지 않고 RNA간섭을 유도할 수 있 다는 것이 시사되어, 포유류에 있어서도 RNAi법을 이용하는 것이 가능해져 오고 있다.

발명의 개시

RNAi법은 여러 가지 응용이 기대되는 기술이다. 그러나, 초파리나 선충에서는, 어떤 유전자의 특정 영역과 상동인 dsRNA 및 siRNA는 대부분의 서열에서 RNA간섭 효과를 나타내는 것에 비해서, 포유류에서는 무작위로 선택한(21염기의) siRNA의 70~80％는 RNA간섭 효과를 나타내지 않는다. 이것은, 포유류에 있어서 RNAi법을 이용한 유전자기능 해석을 행할 때에 큰 문제점으로 되어 있다.

또한, 종래 siRNA를 설계하는 것에 있어서는 시험자 등의 경험이나 센스에 의존하는 부분이 크고, 실제로 RNA간섭 효과를 나타내는 siRNA를 높은 확률로 설계하는 것이 곤란했다. 게다가, RNA합성은 비용, 시간 등을 요하는 것으로, RNA간섭을 행하기 위해 쓸모없는 siRNA를 합성해버리는 것은, RNA간섭의 새로운 연구나, RNA간섭을 이용한 수많은 이용법의 보급을 방해하는 요인으로 되어 있었다.

본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해, siRNA로서 유효하게 기능할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 그 설계 방법, 해당 폴리뉴클레오티드를 이용한 유전자 발현억제 방법, 해당 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약 조성물, 유전자발현억제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 인간 및 마우스에서 공통 서열인 siRNA의 설계를 나타내는 도면이다.

도 2는 RNAi효과를 나타내는 siRNA의 규칙성을 나타내는 도면이다.

도 3은 인간FBP1 및 마우스 Fbp1의 염기서열중의 규정서열을 갖는 공통 부위(굵은 글씨부분)를 나타내는 도면이다.

도 4는 인간FBP1 및 마우스Fbp1에서 공통인 규정서열을 열거한 도면이다.

도 5는 인간FBP1 및 마우스Fbp1에 공통인 규정서열에 스코어를 붙인 도면이다.

도 6은 표적이외의 유전자를 녹아웃되지 않도록 규정서열 중 1개를 BLAST검색한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7은 표적이외의 유전자를 녹아웃되지 않도록 규정서열 중 1개를 BLAST검색한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8은 프로그램의 출력 결과를 나타내는 도면이다.

도9는 RNA단편의 설계(a~p)를 나타내는 도면이다.

도10은 a~p의 siRNA가 RNAi효과를 나타내는지를 시험한 결과를 나타내는 도면이다.「B」는 초파리배양세포에 있어서의 결과를, 「C」는 인간 배양세포에 있어서의 결과를 나타내는 도면이다.

도11은 a~p의 siRNA의 서열의 특징을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 12는 본 발명의 기본원리를 나타내는 원리구성 도면이다.

도13은 본 발명이 적용되는 본 시스템의 염기서열 처리장치(100)의 구성의 일례를 나타내는 블록도이다.

도14는 표적유전자염기서열 파일(106a)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도15는 부분염기서열 파일(106b)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도16은 판정결과 파일(106c)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도17은 규정서열 파일(106d)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도18은 참조서열 데이타베이스(106e)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도19는 동일유사도 파일(106f)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도20은 평가결과 파일(106g)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

도21은 본 발명이 적용되는 본 시스템의 부분염기서열 작성부(102a)의 구성의 일례를 나타내는 블록도이다.

도22는 본 발명이 적용되는 본 시스템의 무관계 유전자표적 평가부(102h)의 구성의 일례를 나타내는 블록도이다.

도23은 본 실시형태에 있어서의 본 시스템의 메인 처리의 일례를 나타내는 플로우 챠트이다.

도24는 본 실시형태에 있어서의 본 시스템의 무관계 유전자표적평가 처리의 일례를 나타내는 플로우 챠트이다.

도25는 표적발현 벡터pTREC의 구조를 나타내는 도면이다.

도26은 실시예2의 2. (2)에 있어서의 프라이머의 한 방향이 인트론을 끼우는 모양으로 디자인되어 있지 않은 경우의 PCR의 결과를 나타내는 도면이다.

도27은 실시예2의 2. (2)에 있어서의 프라이머의 한 방향이 인트론을 끼우는 모양으로 디자인되어 있는 경우의 PCR의 결과를 나타내는 도면이다.

도28은 siRNA;siVIM35의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.

도 29는 siRNA;siVIM812의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.

도 30은 siRNA;siControl의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.

도31은 siVIM812 및 siVIM35의 RNAi활성을 엣세이한 결과를 나타내는 도면이다.

도32는 siControl, siVIM812 및 siVIM35의 비멘틴에 대한 RNAi활성을 나타내는 도면이다.

도33은 항체염색의 결과를 나타내는 도면이다.

도34는 프로그램에 의해 설계된 siRNA의 루시퍼라제 유전자에 대한 RNAi활성의 측정결과를 나타내는 도면이다.

도35는 프로그램에 의해 설계된 siRNA의 SARS바이러스가 갖는 서열에 대한 RNAi활성의 측정결과를 나타내는 도면이다.

도36은 프로그램에 의해 설계된 siRNA와의 미스매치수가 작은 서열을 포함하는 다른 유전자에 대한 RNAi활성의 측정결과를 나타내는 도면이다.

도37은 아포토시스에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 38은 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 39는 세포주기에 관계하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 40은 수용체에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 41은 이온채널을 코드하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 42는 시그널 전달계에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도 43은 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID의 관계를 나타내는 도면이다.

도 44는 전사제어에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도45는 G단백질 공역수용체(GPCR) 및 GPCR에 관여하고 있는 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 나타내는 도면이다.

도46은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 표적이 되는 표적서열, 유전자, 생물학적 기능 카테고리, 문헌정보에 근거하는 생물학적 기능, 관련되는 질환의 관계를 나타내는 도면이다.

도46의 「유전자명」 및 「refseqNO.」은 NCBI의 「RefSeq」(HYPERLINK"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 대응 하는 것이며, RefSeq에 엑세스하므로써, 각 유전자의 정보(유전자의 서열, 기능 등)을 취득할 수 있다.

도46중의 「표적서열」의 란에 기재된 서열에 있어서, 실제로 RNAi의 표적이 되는 서열은 5'말단으로부터 3번째의 염기에서 3'말단으로부터 3번째까지의 염기이다. 즉, 도46중의 「표적서열」의 서열에서는, 5'말단 및 3'말단에 2염기씩 RNAi의 표적이 되는 서열에 인접하는 서열이 기재되어 있다. 본원명세서 및 청구의 범위 중, 협의의 「규정서열」이란, 실제로 RNAi의 표적이 되는 서열을 의미하고, 예를 들면, 도46중의 「표적서열」의 5'말단으로부터 3번째의 염기에서 3'말단으로부터 3번째까지의 염기에 상당한다. 단지 편의를 위해, 본원명세서 및 청구의 범위 중, 「규정서열」「표적서열」은 함께, 문의에 의해 협의의 「규정서열」과 동일, 혹은, 도46중의 「표적서열」과 마찬가지로 협의의 「규정서열」에 5'말단 및 3'말단에 2염기씩 RNAi의 표적이 되는 서열에 인접하는 서열이 부가된 서열의 쌍방의 의미로 사용된다.

본 명세서 및 청구의 범위의 기재에 있어서, 특별히 명시하지 않는 한, 「5'말단의 염기」라는 것은 도46중의 「표적서열」에 기재된 서열의 5'말단으로부터 3번째의 염기, 그리고, 「3'말단의 염기」라는 것은 도46중의 「표적서열」에 기재된 서열의 3'말단으로부터 3번째의 염기를 의미한다. 따라서, 도46중의 「표적위치」라는 것은, 도46중의 「표적서열」의 란에 기재한 각 서열의 5'말단으로부터 3번째의 염기(예를 들면, 정리 번호 1의 표적서열에서는 「g」)의 각 유전자의 서열중에서의 상당하는 위치를 의미한다.

도46중의 「서열번호(인간)」 및 「서열번호(마우스)」는 본 명세서에 첨부된 서열표 중의 각 표적서열이 기재되어 있는 서열번호를 의미하고, 동일한 정리 번호에 있어서의 표적서열은 인간과 마우스에서 동일하다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서, RNAi법을 이용할 때 가장 노력, 시간, 비용을 요하는 부분중 하나인 siRNA의 입수를 용이하게 행하는 수법에 대해서 검토를 진행시켰다. siRNA의 조제는 포유류에 있어서 특히 문제가 되고 있는 것으로부터, 본 발명자들은 포유류 배양세포계를 이용하여, RNA간섭에 유효한 siRNA의 서열 규칙성을 동정하는 것을 시도한 바, 유효한 siRNA의 서열에는 소정의 규칙성이 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 다음과 같다.

〔1〕 목적생물의 유전자 중에서 선택되는 표적유전자에 대해서, RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드로서,

적어도 2가닥 영역을 가지고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열 중에 포함되는 하기 (a)~(d)의 규칙에 따르는 규정서열과 상동인 염기서열로 이루어지고, 그리고

상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 염기서열로 이루어지는

것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

(a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이며;

(b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이며;

(c) 3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부하고;

(d) 염기수가 세포독성을 생기게 하지않도록 RNA간섭을 생기게 할 수 있는 수이다.

〔2〕 상기 규정서열과 상동인 염기서열의 적어도 80％ 이상의 염기가 상기 규정서열의 염기서열과 일치하는 것을 특징으로 하는 〔1〕에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔3〕 상기 규칙(c)에 있어서, 7염기 중 적어도 3염기 이상이 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔4〕 상기 규칙(d)에 있어서, 염기수가 13~28인 것을 특징으로 하는 〔1〕~〔3〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔5〕 상기 규정서열이 아울러 하기 (e)의 규칙에 따르는 서열인 것을 특징으로 하는 청구항1~4 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(e) 10염기 이상 구아닌 또는 시토신이 연속하는 서열을 포함하지 않는다.

〔6〕 상기 규정서열이 아울러 하기 (f)의 규칙에 따르는 서열인 것을 특징으로 하는 〔5〕에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(f) 목적생물의 전체 유전자서열 중, 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기 서열중에 해당 규정서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는다.

〔7〕 상기 규정서열이 서열표 서열번호47~서열번호817081중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 〔6〕에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔8〕 상기 규정서열이 도46의 표적서열의 란에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는 〔6〕에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔9〕 서열번호817102~817651 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 〔6〕에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔10〕 2가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 〔1〕~〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔11〕 상기 2가닥 폴리뉴클레오티드의 한쪽 가닥이, 상기 규정서열과 상동인 염기서열의 3'말단에 오버행부를 갖는 염기서열로 이루어지고, 상기 2가닥 폴리뉴클레오티드의 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열의 3'말단에 오버행부를 갖는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 〔10〕에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔12〕 헤어핀 구조를 갖는 1가닥 폴리뉴클레오티드이며, 상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥의 3'말단과 상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥의 5'말단을 연결하는 루프부를 갖는 것을 특징으로 하는 〔1〕~〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드.

〔13〕 발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입하는 폴리뉴클레 오티드의 선택방법으로서,

적어도 2가닥 영역을 가지고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열중에 포함되는 하기 (a)~(f)의 규칙에 따르는 규정서열과 상동인 염기서열로 이루어지고, 그리고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 선택방법:

(a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이며;

(b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이고;

(c) 3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부하며;

(d) 염기수가 세포독성을 생기게 하지 않도록 RNA간섭을 생기게 할 수 있는 수이며;

(e) 10염기 이상 구아닌 또는 시토신이 연속하는 서열을 포함하지 않고;

(f) 목적생물의 전체 유전자서열 중, 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열중에 해당 규정서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는다.

〔14〕 상기 선택한 폴리뉴클레오티드로부터, 상기 표적유전자의 규정서열과 상동인 염기서열이 상기 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 적어도 3염기이고, 또한, 해당 적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 다른 유전자의 수가 가장 적은 서열인 폴리뉴클레오티드를 더 선택하는 것을 특징으로 하는 〔13〕에 기재된 폴리뉴클레오티드의 선택방법.

〔15〕〔1〕~〔12〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를, 발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입해서 표적유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유전자발현억제 방법.

〔16〕〔13〕 또는 〔14〕에 기재된 방법에 의해 선택된 폴리뉴클레오티드를, 발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입해서 표적유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유전자발현억제 방법.

〔17〕 50％ 이하로 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 〔15〕 또는 〔1

6 〕에 기재된 유전자발현억제 방법.

〔18〕 의약적으로 유효한 양의 〔1〕~〔12〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약용 조성물.

〔19〕 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 〔18〕에 기재된 의약용 조성물.

〔20〕 도46의 유전자명의 란에 기재된 유전자에 관련되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 〔18〕에 기재된 의약용 조성물.

〔21〕 이하 1)~9)중 어느 하나에 속하는 유전자가 관여하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 〔18〕에 기재된 의약조성물:

1) 아포토시스에 관여하고 있는 유전자;

2) 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자;

3) 세포주기에 관여하고 있는 유전자;

4) 수용체에 관여하고 있는 유전자;

5) 이온채널에 관여하고 있는 유전자;

6) 시그널 전달계에 관여하고 있는 유전자;

7) 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자;

8) 전사제어에 관여하고 있는 유전자; 혹은

9) G단백질 공역수용체 또는 G단백질 공역수용체에 관여하고 있는 유전자.

〔22〕 도46의 서열번호(인간) 또는 서열번호(마우스)의 란에 기재된 서열번호 중 어느 하나의 염기서열을 표적서열로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 〔18〕~〔21〕 중 어느 한 항에 기재된 의약조성물.

〔23〕 표1의 유전자명의 란에 기재된 유전자에 관련되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 〔18〕에 기재된 의약용 조성물.

〔24〕 방광암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 구강암, 피부암, 및 갑상선암으로부터 선택되는 어느 하나의 암을 치료 또는 예방하기 위한 〔18〕 또는 〔23〕에 기재된 의약조성물.

〔25〕 서열번호817102~817651중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 〔18〕, 〔23〕 또는 〔24〕 중 어느 한 항에 기재된 의약조성물.

〔26〕〔1〕~〔12〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 표적유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자발현억제용 조성물.

〔27〕 표적유전자가 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환중 어느 하나의 질환에 관련되는, 〔26〕에 기재된 유전자발현억제용 조성물.

〔28〕 표적유전자가 도46의 유전자명의 란에 기재된 유전자중 어느 하나인, 〔26〕에 기재된 유전자발현억제용 조성물.

〔29〕 표적유전자가 이하 1)~9)중 어느 하나에 속하는 유전자인, 〔26〕에 기재된 유전자발현억제용 조성물:

1) 아포토시스에 관여하고 있는 유전자;

2) 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자;

3) 세포주기에 관여하고 있는 유전자;

4) 수용체에 관여하고 있는 유전자;

5) 이온채널에 관여하고 있는 유전자;

6) 시그널 전달계에 관여하고 있는 유전자;

7) 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자;

8) 전사제어에 관여하고 있는 유전자; 혹은

〔30〕 표적유전자가 표1의 유전자명의 란에 기재된 유전자중 어느 하나인, 〔26〕에 기재된 유전자발현억제용 조성물.

〔31〕 표적유전자가 방광암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 구강암, 피부암 및 갑상선암으로부터 선택되는 어느 하나의 암에 관련되는 유전자인, 〔26〕에 기재된 유전자발현억제용 조성물.

〔32〕 의약적으로 유효한 양의 〔1〕~〔12〕 중 어느 한 항에 기재된 폴리 뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법.

발명의 효과

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 표적유전자에 대하여 높은 RNA간섭 효과를 갖는 동시에 표적유전자와 관계가 없는 유전자에 대해서 RNA간섭을 생기게 할 위험성이 대단히 작기 때문에 발현을 억제하고자 하는 표적유전자에만 특이적으로 RNA간섭을 생기게 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA간섭을 이용하는 시험, 치료방법 등에 적절하게 이용할 수가 있고, 포유류 등의 고등동물, 특히 인간을 대상으로 하는 RNA간섭을 행할 때에 특히 유효성을 발휘하는 것이다.

발명을 실시하기 위한 태양

본 발명의 실시형태를 이하의 ＜1＞~＜7＞의 순서에 따라 설명한다.

＜1＞ RNA간섭의 표적염기서열 검색방법

＜2＞ RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열설계 방법

＜3＞ 폴리뉴클레오티드의 제작 방법

＜4＞ 유전자의 발현억제 방법

＜5＞ siRNA서열설계 프로그램

＜6＞ siRNA서열설계 비지니스 모델시스템

＜7＞ siRNA서열설계 프로그램을 실행하는 염기서열 처리장치 등

＜8＞ 의약용 조성물

＜9＞ 유전자발현억제용 조성물

＜10＞ 치료 또는 예방방법

＜1＞ RNA간섭의 표적염기서열 검색방법

본 발명의 검색방법은 목적생물의 유전자중에서 선택되는 표적유전자의 염기서열중에서 RNA간섭을 일으키는 원인이 되는 염기서열을 찾아내는 방법이다. RNA간섭을 생기게 하는 대상이 되는 목적생물은, 특별히 한정되지 않고, 대장균을 비롯하여 원핵생물, 효모, 진균 등의 미생물, 포유류를 비롯한 동물, 곤충, 식물 등의 어느 것이라도 좋다.

구체적으로는, 본 발명의 검색방법에서는, RNA간섭의 표적유전자의 염기서열에서, 하기 (a)~(d)의 규칙을 따르는 서열 부위를 검색한다.

(a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이다.

(b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이다.

(c) 3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부하다.

「표적유전자」에 있어서의 「유전자」란 유전정보를 코드하는 매체를 말한다. 「유전자」는 DNA, RNA, DNA 및 RNA의 복합체 등 유전정보를 코드하는 물질에 의해 구성되지만, 유전정보로서는 물질 그 자체가 아니라 염기서열을 전자 데이타화한 것을 컴퓨터상 등에서 다루는 것이 가능하다.

「표적유전자」는 1개의 코드영역으로 해도 좋고, 복수의 코드영역에 걸쳐 표적으로 해도 좋고, 또한, 서열이 밝혀진 모든 폴리뉴클레오티드를 표적으로 해도 좋다. 특정한 기능을 갖는 유전자에 대해서 검색하고 싶은 경우에는, 그 특정 유전자만을 표적으로 함으로써, 해당 특정 유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 염기서열을 효율적으로 검색할 수 있다. 즉, RNA간섭은 mRNA를 간섭 파괴하는 현상으로서 알려져 있어, 특정한 코드영역을 선택함으로써 검색 부하를 경감할 수 있다. 또한, 전사 영역의 한 묶음을 표적유전자로서 검색해도 좋다. 또한, 본 명세서에 있어서 염기서열은 특별히 나타내지 않는 한 센스가닥, 즉, mRNA의 서열을 기준으로 하여 나타낸다. 또한, 본 명세서중에서는 상기(a)~(d)의 규칙을 만족하는 염기서열을 「규정서열」이라고 한다. 상기 규칙에 있어서는, 염기서열이 DNA의 서열이면 티민이, RNA의 서열이면 우라실이 대응한다.

규칙(c)는 3'말단근방의 서열에 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기가 풍부하게 포함되어 있는 것을 규정하고 있어, 구체적으로 검색을 행할 때의 1지표로서 3'말단부에서 7염기의 범위내에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로부터 선택되는 염기가 풍부한 서열인 것을 규정하고 있다.

규칙(c)에 있어서, 「풍부한 서열」이란 특정한 염기가 나타나는 빈도가 높은 것을 의미하고, 비율을 개략적으로 나타내면, 규정서열에 있어서의 3'말단측의 5~10염기, 바람직하게는 7염기의 서열중에 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 적어도 40％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상 포함되는 것을 의미한다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 약 19염기정도의 규정서열의 경우를 예로 들면, 3'말단측의 7염기 중 바람직하게는 적어도 3염기 이상, 보다 바람직하게는 4염기 이상, 특히 바람직하게는 5염기 이상이, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이다.

규칙(c)에 해당되는지의 여부를 확인하는 수단은, 특별히 제한은 없고, 7염기 중의 바람직하게는 3염기 이상, 보다 바람직하게는 4염기 이상, 특히 바람직하게는 5염기 이상이 아데닌, 티민 또는 우라실인 것을 확인할 수 있으면 좋다. 예를 들면, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이 3'말단측의 7염기의 서열중에 3개 이상 포함되는 것을 풍부하다고 정의했을 경우를 예로서 설명하면, 3'말단의 제1번째의 염기로부터 순차 상기 3종의 염기중 어느 하나에 있는지 대조하고, 제7번째의 염기에 이르기까지에 3개가 나타난 경우에, 규칙(c)에 적합하다고 판단할 수 있다. 예를 들면, 제3번째까지 3개가 나타나면, 3개의 염기를 조사하면 충분하다. 즉, 규칙(c)에 대해서 검색하는 경우, 반드시 3'말단측의 7염기에 대해 전부 대조할 필요는 없다. 반대로 제7번째까지 3개 이상 나타나지 않으면 풍부한 것이 아니고, 규칙(c)를 만족시키지 않는다고 판단된다.

2가닥 폴리뉴클레오티드에 있어서는 아데닌과 티민 또는 우라실이 상보적으로 수소결합 하는 것은 주지이다. 또한, 구아닌과 시토신의 상보적인 수소결합(G-C수소결합)에 있어서는 3개의 수소결합 부위가 형성되는 것에 대해, 아데닌과 티민 또는 우라실과의 상보적 수소결합(A-(T/U) 수소결합)에 있어서는 2개의 수소결합 부위로 이루어지고, 일반적으로 말해서 G-C수소결합에 대하여, A-(T/U) 수소결합의 쪽이 결합력은 약하다.

규칙(d)에 있어서는, 검색하는 염기서열의 염기수를 규정하고 있다. 검색하는 염기서열의 염기수는 RNA간섭을 생기게 할 수 있는 염기수이다. 또한, 생물의 종류 등의 조건에 따라, 염기수가 너무나 지나치게 큰 siRNA에서는 세포독성이 생겨버리는 것이 알려져 있다. 염기수의 상한은 RNA간섭을 생기게 하고자 하는 생물의 종류 등에 따라 다르지만, siRNA를 구성하는 1가닥의 염기수는 어느 쪽의 종으로든지 30 이하인 것이 바람직하다. 또한, 포유동물의 염기수에 있어서는, 바람직하게는 24 이하, 보다 바람직하게는 22 이하이다. 또한, 하한은 RNA간섭을 생기게 하는 한 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 15 이상, 보다 바람직하게는 18 이상, 더욱 바람직하게는 20 이상이다. siRNA를 구성하는 1가닥으로서의 염기수는 21에서 검색하는 것이 특히 바람직하다.

또한, 하기에 있어서도 설명하지만, siRNA에는 규정서열의 3'말단에 오버행부가 설치된다. 오버행부는 염기수 2인 것이 적당하다. 따라서, 오버행부를 포함시키지 않고, 규정서열만의 염기수의 상한으로서는, 바람직하게는 28 이하, 보다 바람직하게는 22 이하, 더욱 바람직하게는 20 이하이며, 하한으로서는, 바람직하게는 13 이상, 보다 바람직하게는 16 이상, 더욱 바람직하게는 18 이상이다. 규정서열의 가장 바람직한 염기수는 19이다. RNAi의 표적염기서열의 검색은 오버행부를 포함시키는 경우 및 포함시키지 않는 경우의 어느 것으로 검색해도 좋다.

규정서열을 따르는 염기서열은 RNA간섭을 생기게 하는 확률이 지극히 높다. 따라서, 본 발명의 검색방법에 의해 RNA간섭을 생기게 하는 서열을 지극히 높은 확률에서 검색하는 것이 가능해서, RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 설계 를 간편화할 수 있다.

또한, 다른 바람직한 예로서, 규정서열이 하기의 규칙(e)을 더 따르는 서열인 것을 들 수 있다. (e) 10염기 이상 구아닌 또는 시토신이 연속하는 서열을 포함하지 않는다.

규칙(e)에 있어서는, 검색하는 염기서열이 10염기 이상 구아닌(G) 및/또는 시토신(C)이 연속한 서열을 포함하지 않는 서열인 것을 규정하고 있다. 10염기 이상 구아닌 및/또는 시토신이 연속한다는 것은, 예를 들면, 구아닌 또는 시토신의 일방만을 연속하는 경우와, 구아닌 및 시토신이 혼재하는 서열로 이루어지는 경우의 쌍방을 포함하고, 보다 구체적으로는, GGGGGGGGGG, CCCCCCCCCC외에, G 및 C의 혼합 서열인 GCGGCCCGCG 등도 포함된다.

또한, 표적유전자와 관계가 없는 유전자에 대해서까지 RNA간섭을 생기게하지 않도록 하기 위해서는, 설계한 서열과 동일 또는 유사한 서열이 다른 유전자에 포함되어 있지 않은지 검색하는 것이 바람직하다. 설계한 서열과 동일 또는 유사한 서열의 검색은 일반적인 호몰로지 검색을 행할 수 있는 소프트웨어 등을 이용해서 하면 좋다. 이 때, siRNA의 2가닥(센스가닥 및 안티센스가닥)에 의한 RNAi효과를 고려하고, 「설계한 서열」 및 「설계한 서열과 상보적인 염기서열을 갖는 서열(상보 서열)」의 양쪽에 대해서, 동일 또는 유사한 서열이 다른 유전자에 포함되어 있지 않은지 검색하는 것이 보다 바람직하다. 설계한 서열 중, 설계한 서열 또는 그 상보 서열과 동일/유사서열을 갖는 서열을 제외하는 것에 의해, 표적으로 하는 유전자에만 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 서열을 설계할 수 있다.

따라서, 설계한 서열 중, 다른 유전자에 염기서열의 미스매치수가 적은 유사서열이 존재하는 것과 같은 서열을 제외함으로써, 특이성이 높은 서열을 선별할 수 있다. 예를 들면, 염기수19의 염기서열을 설계하는 경우, 다른 유전자에 미스매치가 2염기 이하인 유사서열이 존재하는 서열은, 제외하는 것이 바람직하다. 여기에서 유사성 판단의 역치가 되는 미스매치수의 값을 크게 설정할수록, 설계하는 서열의 특이성이 높아진다. 염기수19의 염기서열을 설계하는 경우, 보다 바람직하게는, 다른 유전자에 미스매치가 3염기 이하인 유사서열이 존재하는 서열을 제외하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 다른 유전자에 미스매치가 4염기 이하인 유사서열이 존재하는 서열을 제외하는 것이 바람직하다. 또한, 해당 규정서열을 갖는 서열 및 그 상보 서열의 양쪽에 대해서, 염기서열의 미스매치수가 적은 유사서열이 다른 유전자에 존재하는 것 같은 서열을 제외함으로써, 보다 특이성이 높은 서열을 설계할 수가 있기 때문에 바람직하다.

서열의 유사성을 판단하는 기준이 되는 미스매치수는 설계하는 서열의 염기수에 따라서도 다르기 때문에 일률적으로 규정하는 것은 어렵다. 염기서열의 미스매치수를 상동성으로 규정하는 것으로 한다면 하기의 규칙(f)에 따르는 서열인지를 검색하면 좋다. (f)목적생물의 전체 유전자서열 중, 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열중에, 해당 규정서열을 갖는 서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는다.

규칙(f)에 있어서, 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열중에, 규정서열과 85％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는 것이 바람직하고, 규정서열 과 80％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는 것이 보다 바람직하고, 규정서열과 75％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는 것이 바람직하다. 또한, 여기에서, 해당 규정서열을 갖는 서열 및 그 상보 서열의 양쪽에 대해서, 염기서열의 상동성이 높은 유사서열이 다른 유전자에 존재하는 것과 같은 서열을 제외함으로써 보다 특이성이 높은 서열을 설계할 수 있기 때문에 바람직하다.

또한, 규정서열의 검색은 염기수를 정한후에 상기의 (a)~(c)의 규칙 등에 따르는 부분을 검색하는 것 같은 프로그램을 탑재하는 컴퓨터를 이용해서 효율적으로 검출가능하다. 보다 구체적인 실시형태는 하기 ＜5＞siRNA서열설계 프로그램 및 ＜7＞siRNA서열설계 프로그램을 실행하는 염기서열 처리장치 등의 란에 나타낸다.

본원의 서열표 서열번호47~817081에 기재된 폴리뉴클레오티드는 상기(a)~(f)의 규칙을 만족하는 규정서열(을 포함하는 표적서열)로서, 선택된 인간 및 마우스의 서열이다.

＜2＞RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열설계 방법

본 발명의 염기서열설계 방법은 상기의 검색방법에 의해 검색된 염기서열에 근거해서 RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 설계하는 것이다. RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드는 상기의 검색방법에 의해 검색된 규정서열에 근거해서 설계된 2가닥 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드이며, 표적유전자에 있어서, RNA간섭을 생기게 할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다.

RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드로서는, 주로, siRNA 등의 2가닥 폴리뉴클레오티드형과, 헤어핀 구조를 갖는 RNA(short hairpin RNA:shRNA) 등의 1가 닥 폴리뉴클레오티드형으로 분류할 수 있다.

siRNA나 shRNA는 주로 RNA로 이루어지지만, 일부에 DNA가 포함되어 있는 혼성 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 본 발명의 염기서열설계 방법에서는, 상기(a)~(d)의 규칙을 따르는 염기서열을 표적유전자의 염기서열로부터 검색하고, 검색된 염기서열과 상동인 염기서열을 설계한다. 또한, 다른 바람직한 설계예로서는, 상기 (e) 및 (f)의 규칙 등을 고려해도 좋다. (a)~(d)의 규칙 및 검색 수법 등에 관해서는, 상기 본 발명의 검색방법에 대해서 설명한 바와 같다.

RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드에 있어서의 2가닥 영역은 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열중에 포함되는 상기(a)~(d)의 규칙을 따르는 규정서열과 상동인 염기서열로 이루어지고, 다른 쪽 가닥이, 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 염기서열로 이루어진다. 「상동인 서열」이란 동일한 서열 및 해당 RNA간섭을 생기게 하는 기능을 잃지 않는 범위에서 동일서열에 대하여 결실, 치환, 삽입 등의 변이를 포함하는 서열의 것을 말한다. 표적유전자의 종류, 서열 등의 조건에도 의하지만, 허용되는 변이를 상동성(호몰로지)으로 예시하면, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상이다. 허용되는 변이의 정도로서의 상동성을 산출하는 경우, 동일한 검색 알가닥즘을 사용하여 산출된 수치끼리를 비교하는 것이 바람직하다. 검색 알가닥즘은 특별히 한정되지 않지만, 국소적인 서열의 검색에 알맞은 것이 적당하고, 보다 구체적으로는 BLAST, ssearch 등을 적합하게 사용할 수 있다.

보다 상세하게는, 핵산(폴리뉴클레오티드)의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정하는 것이 가능하다. 혹은, 2개의 핵산서열의 퍼센트 동일성은 눈으로 검사하는 것과 수학적 계산에 의해 결정가능하거나, 또는 보다 바람직하게는, 이 비교는 컴퓨터·프로그램을 사용해서 서열 정보를 비교함으로써 이루어진다. 대표적인 바람직한 컴퓨터·프로그램은, 유전학 컴퓨터·그룹(GCG;위스콘신주 매디슨)의 위스콘신·패키지, 버젼10.0프로그램 「GAP」이다(Devereux 등, 1984, Nucl. Acids Res. 12 : 387).

이 「GAP」프로그램의 사용에 의해, 2개의 핵산서열의 비교 이외에, 2개의 아미노산서열의 비교, 핵산서열과 아미노산서열과의 비교가 가능하다. 여기에서, 「GAP」프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터(default parameter)로는 : (1) 뉴클레오티드에 대한(동일물에 대해서 1 및 비동일물에 대해서 0의 값을 포함한다) 일원(unary) 비교 매트릭스의 GCG실행과, Schwartz 및 Dayhoff감수 「폴리펩티드의 서열 및 구조의 아틀라스(Atlas of Polypeptide Sequence 및 Structure)」국립 바이오 의학연구 재단, 353~358페이지, 1979에 기재된 바와 같은 Gribskov 및 Burgess, Nucl. Acids Res. 14 : 6745, 1986의 가중 아미노산 비교 매트릭스; 또는 다른 비교가능한 비교 매트릭스; (2) 아미노산의 각 갭에 있어서 30의 페널티와 각 갭중의 각 기호에 있어서 추가의 1의 페널티; 또는 뉴클레오티드 서열의 각 갭에 있어서 50의 페널티와 각 갭중의 각 기호에 있어서 추가의 3의 페널티;(3) 말단 갭의 노 페널티: 및 (4) 긴 갭은 최대 페널티 없음이 포함된다. 당업자에 의해 사용되는 것 외의 서열 비교 프로그램으로는, 예를 들면, 국립의학 라이브러리의 웹사이트:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html에 의해 사용이 이용가능 한 BLASTN 프로그램, 버젼2.2.7, 또는 UW-BLAST 2.0알가닥즘이 사용가능하다. UW-BLAST 2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은 이하의 인터넷 사이트:http://blast.wustl.edu에 기재되어 있다. 또한, BLAST알가닥즘은 BLOSUM62 아미노산 스코아 첨부된 매트릭스를 사용하고, 사용가능한 선택 파라미터는 이하와 같다 : (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 퀘리 서열의 세그먼트(Wootton 및 Federhen의 SEG프로그램(computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다 ; Wootton 및 Federhen, 1996「서열 데이타베이스에 있어서의 조성편중영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol.266:544~71도 참조되었으면 한다), 또는, 단주기성의 내부 리피트로 이루어지는 세그먼트(Claverie 및 States(computers and Chemistry, 1993)의 XNU프로그램에 의해 결정된다)를 마스크 하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이타베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 역치, 또는 E-스코ㅇ어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단지 우연에 의해 찾아내어지는 적합의 기대 확률 ; 어떤 적합에 기인하는 통계학적 유의차이가 E-스코어 역치보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다) ; 바람직한 E-스코어 역치의 수치는 0.5일지, 또는 바람직함이 증가하는 순서로 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75 또는 1e-100이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한, 상기(a)~(d)의 규칙을 따르는 규정서열과 「상동인 염기서열」로서, 규정서열에 엄격한 조건하, 예를 들면, 중간정도 또 는 높은 정도로 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 것이 가능하고, 그리고, 바람직하게는, RNA간섭을 생기게 하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

「엄격한 조건하」라는 것은, 중간정도 또는 높은 정도로 엄격한 조건에 있어서 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 구체적으로는, 중간정도로 엄격한 조건은, 예를 들면, DNA의 길이에 근거하여, 일반적인 기술을 갖는 당업자에 의해, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 기본적인 조건은 Sambrook들, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 제3판, 제6~7장, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001에 나타나 있고, 그리고 니트로셀룰로오스 필터에 관해, 5 ×SSC, 0.5％SDS, 1.OmM EDTA(pH8.0) 전 세정용액, 약40~50℃에서의, 약 50％ 포름아미드, 2×SSC-6×SSC(또는 약 42℃에서의 약 50％ 포름아미드 중의 스탁 용액(Stark's solution) 등 이외의 같은 하이브리다이제이션 용액)의 하이브리다이제이션 조건 및 약 60℃, 0.5×SSC, 0.1％ SDS의 세정 조건의 사용이 포함된다. 바람직하게는 중간정도로 엄격한 조건은 약 50℃, 6×SSC의 하이브리다이제이션조건을 포함한다.

고도로 엄격한 조건도 또한, 예를 들면, DNA의 길이에 근거하여, 당업자에 의해, 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 일반적으로, 이러한 조건은 중간정도로 엄격한 조건보다도 높은 온도 및/또는 낮은 염농도에서의 하이브리다이제이션(예를 들면, 약 65℃, 6×SSC~0.2×SSC, 바람직하게는 6×SSC, 보다 바람직하게는 2×SSC, 가장 바람직하게는 0.2×SSC의 하이브리다이제이션) 및/또는 세정을 포함하고, 예를 들면, 상기와 같은 하이브리다이제이션 조건, 및 약 68℃, 0.2×SSC, 0.1％ SDS의 세정을 수반한다고 정의된다. 하이브리다이제이션 및 세정의 완충 액에서 는, SSC(1×SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 구연산 나트륨이다)에 SSPE(1×SSPE는 0.15M NaCl, 10mM NaH₂PO₄ 및 1.25mM EDTA, pH7.4이다)를 대용하는 것이 가능하며, 세정은 하이브리다이제이션이 완료한 후에 15분간 행한다.

당업자에 알려져 있고, 이하에 더욱 기재한 것과 같이, 하이브리다이제이션반응과 2가닥의 안정성을 지배하는 기본원리를 적용함으로써 바람직한 정도의 엄격성을 달성하기 위해서는, 세정 온도와 세정 염농도를 필요에 따라서 조정하는 것이 가능하다고 이해해야 한다(예를 들면, Sambrook 등, 2001을 참조하기 바란다). 핵산을 미지서열의 표적핵산에 하이브리다이즈시키는 경우, 하이브리드의 길이는 하이브리다이즈하는 핵산의 그것이라고 가정된다. 기지서열의 핵산을 하이브리다이즈시킬 경우, 하이브리드의 길이는 핵산의 서열을 병렬하고, 알맞은 서열 상보성을 갖는 단수 또는 복수의 영역을 동정함으로써 결정가능하다. 50염기쌍 미만의 길이인 것이 예측되는 하이브리드의 하이브리다이제이션온도는 하이브리드의 융해 온도성(Tm) 보다 5~25℃ 낮지 않으면 안되고, Tm은 이하의 등식에 의해 결정된다. 길이 18염기쌍 미만의 하이브리드에 관해서, Tm(℃)=2(A+T염기수)+4(G+C염기수). 18염기쌍을 넘는 길이의 하이브리드에 관해서는, Tm=81.5℃＋16.6(log₁₀[Na⁺])+41(몰분율 [G+C])-0.63％포름아미드)-500/n이며, 여기에서, N은 하이브리드 중의 염기수이며, 그리고 [Na⁺]는 하이브리다이제이션 완충액 중의 나트륨 이온 농도이다(1×SSC의 [Na+]=0.165M).

상기한 바와 같이, 검색된 서열은 약간의 개변이 허용되지만, 설계되는 염기서열의 염기수는 검색된 서열과 동일한 것이 특히 바람직하다. 염기수를 동일하다 했을 경우에 대해서 개변의 허용도를 예시하면, 설계되는 염기서열의 염기가 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상 검색된 서열과 일치하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 염기수 19의 염기서열을 설계하는 경우이면, 바람직하게는 16염기 이상, 보다 바람직하게는 18염기 이상이, 검색된 염기서열과 일치하는 것이 바람직하다. 또한, 검색된 염기서열과 상동인 서열을 설계하는 경우, 검색된 염기서열의 3'말단의 염기와 설계되는 염기서열의 3'말단의 염기는 동일한 것이 바람직하고, 또한, 검색된 염기서열의 5'말단의 염기와 설계되는 염기서열의 5'말단의 염기가 동일한 것이 바람직하다.

통상 siRNA분자에는, 오버행부가 설치된다. 오버행부는 2가닥의 siRNA분자에 있어서, 각 가닥의 3'말단에 설치된 1가닥의 상태에서 돌출한 부분이다. 오버행부는 생물의 종류 등에도 의하지만, 염기수는 2가 특히 적합하다. 오버행부의 염기서열은 기본적으로는 임의이지만, 검색원의 표적유전자와 동일한 염기서열, TT, 혹은 UU 등이 바람직하게 이용되는 경우가 있다. 상기한 바와 같이 검색된 염기서열과 상동인 서열로 되도록 설계된 규정서열의 3'말단에, 오버행부를 설치함으로써, siRNA를 구성하는 센스가닥이 설계된다.

또한, 처음부터 규정서열 및 오버행부를 포함해서 검색을 행하여, 설계할 수도 있다. 오버행부의 바람직한 염기수는 2이다. 따라서, 예를 들면, 염기수19의 규정서열 및 염기수2의 오버행부에서 이루어지는 siRNA를 구성하는 1가닥의 설계를 하는 경우에는, 오버행부를 포함시킨 siRNA의 염기수로서는 염기수21의 서열을 표적유전자로 부터 검색하면 좋고, 또한 2가닥의 상태에 대해서 검색하는 경우에는 염기수23의 서열을 검색해도 좋다.

shRNA는 상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥의 3'말단과, 상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥의 5'말단을 루프부에서 연결함으로써 1가닥 폴리뉴클레오티드로 한 것이다. shRNA는 상기 한쪽 가닥의 5'말단 및/또는 상기 다른 쪽 가닥의 3'말단에 1가닥의 상태로 돌출한 부분을 갖고 있어도 좋다. 이러한 shRNA는 WO01/49844 등 공지의 수법에 따라 설계할 수 있다.

본 발명의 염기서열설계 방법에서는, 상기한 바와 같이 원하는 표적유전자로부터 소정의 서열을 검색해 왔지만, RNA간섭을 생기게 하고자 하는 대상은 표적유전자의 유래와 반드시 일치하지 않더라도 좋고, 유사종 등에 적용가능하다. 예를 들면, 제1의 종으로부터 단리된 유전자를 표적유전자로 해서 제1 종의 유사종인 제2의 종에 이용하는 siRNA를 설계할 수도 있다. 아울러, 예를 들면, 복수종의 포유류로부터 공통 서열을 검색하고, 이 공통 서열로부터 상기 규정서열을 검색해서 설계하는 것에 의해, 포유류에 폭넓게 적용가능한 siRNA의 설계가 가능하다. 복수의 포유류에 공통되는 서열은 다른 포유류에 있어서도 보존되어 있을 확률이 높다고 생각되기 때문이다.

본 발명의 설계 방법에 의해, RNA간섭을 생기게 하는 RNA분자를, 높은 확률에서 더군다나 용이하게 설계할 수 있다. RNA의 합성은 아직 노력, 시간, 비용을 요하지만, 본 발명의 설계 방법에 의해 그것들을 대폭 경감하는 것이 가능하다.

＜3＞폴리뉴클레오티드의 제작 방법

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 제작 방법은 RNA간섭을 생기게 하는 확률이 높은 폴리뉴클레오티드를 제작하는 방법이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 염기서열이 상기 본 발명의 염기서열설계 방법에 따라 설계되고, 그 서열설계에 따르도록 폴리뉴클레오티드가 합성된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 상술한 바와 같이, siRNA 등의 2가닥 폴리뉴클레오티드형과 shIRNA 등의 1가닥 폴리뉴클레오티드형이 있지만, 이하, 2가닥 폴리뉴클레오티드를 중심으로 설명한다.

서열의 설계에 있어서의 바람직한 형태는 상기 염기서열설계 방법에 관한 설명과 동일하다. 또한, 본 발명의 제조법에 의해 제조되는 2가닥 폴리뉴클레오티드는 RNA에 의해 구성되는 것이 바람직하지만, 일부에 DNA를 포함하는 혼성 폴리뉴클레오티드이어도 좋다. 본 명세서에서는 일부에 DNA를 포함하는 것도 siRNA의 개념에 포함시킨다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 구성하는 RNA 및 DNA는, 예를 들면, 당의 수산기의 메틸화 등, 화학수식이 실시된 것이어도 좋다. 예를 들면, 본 명세서에 있어서의 siRNA는 DNA가닥과 RNA가닥과의 하이브리드 구조를 가져도 좋다. 이러한 하이브리드 구조는 피도입체에 도입했을 때에 표적유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는 것이면 구조는 특별히는 한정되지 않지만, 센스가닥이 DNA로 구성되고 안티센스가닥이 RNA로 구성된 2가닥 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

또한, 본 명세서에 있어서의 siRNA는 키메라 구조를 가져도 좋다. 키메라 구조는 1가닥 폴리뉴클레오티드 중에 DNA와 RNA를 모두 포함하는 구조이다. 이러한 키메라 구조는 피도입체에 도입했을 때에 표적유전자의 발현을 억제하는 활성을 갖는 것이면 구조는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명자들의 연구에 의하면, siRNA는 구조·기능적으로 어시메트리성(비대칭성)을 갖는 경향이 확인되고, RNA간섭을 생기게 한다는 목적으로 한다면, 센스가닥의 5'말단측의 반, 안티센스가닥의 3'말단측의 반은 RNA로 구성되는 것이 바람직하다.

그런데, 키메라 구조를 갖는 siRNA에서는, 피도입체 내에 있어서의 안정성이나 제조 코스트 등의 점으로부터, RNA의 함량을 될 수 있는 한 적게 하는 것이 바람직하다. 그래서, 높은 표적유전자의 발현억제 효과를 유지하면서 RNA함량을 저감 가능한 siRNA에 대해서 발명자들이 예의 검토한 바, 센스가닥의 5'말단으로부터 9~13폴리뉴클레오티드의 부분 및 안티센스가닥의 3'말단으로부터 9~13폴리뉴클레오티드의 부분(예를 들면, 센스가닥 및 안티센스가닥의 상기 각 말단으로부터 11폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 10폴리뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 9폴리뉴클레오티드의 부분)은 RNA로 구성되는 것이 바람직하고, 특히, 안티센스가닥의 3'말단측이 해당 구성을 갖는 것이 바람직하다는 결과가 얻어졌다.

또한, 센스가닥의 RNA부분과 안티센스가닥의 RNA부분과는, 그 위치가 반드시 일치하지 않고 있어도 좋다.

2가닥 폴리뉴클레오티드는 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열중에 포함되는 (a)~(d)의 규칙에 따르는 규정서열과 상동인 염기서열의 3'말단에 오버행부를 설치해서 형성되고, 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열의 3'말단에 오버행부를 설치해서 형성된다. 각 가닥의 염기수는 오버행부를 포함 시켜 18~24이며, 보다 바람직하게는 20~22, 특히 바람직하게는 21이다. 또한, 오버행부의 염기수는 2인 것이 바람직하다. 전체의 염기수가 21, 그중 오버행부가 염기수2로 구성되는 siRNA는 포유류에서도 세포독성을 생기게 하지 않도록, 고확률로 RNA간섭을 생기게 하는 siRNA로서 적합이다.

RNA의 합성은, 예를 들면, 화학합성에 의해 합성해도 좋고, 또한, 통상의 바이오테크놀로지 등의 수법에 따라서 할 수도 있고, 소정의 서열을 갖는 DNA가닥을 제작하고, 이를 주형으로 하여 전사 효소를 이용해서 1가닥 RNA를 합성하고, 1가닥 RNA를 2가닥화하는 등의 수법에 의해 합성할 수 있다.

또한, 분자생물학적인 기본적 수법에 대해서는, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1986);Sambrook 등, MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), 세포공학 핸드북, 쿠로키 토시오 등 편, 양토사(1992), 새유전자공학 핸드북 개정 제3판, 무라마츠 등 편, 양토사 (1999) 등, 많은 표준적인 실험 매뉴얼이 있다.

상기 본 발명의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 바람직한 형태를 나타내면, RNA간섭의 표적유전자의 염기서열중에서 상기 (a)~(d)의 규칙을 따르는 염기수13~28의 서열 부위를 검색하고, 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열중에 포함되는 상기 (a)~(d)의 규칙을 따르는 규정서열과 상동인 염기서열의 3'말단에 오버행부를 설치해서 형성되고, 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열의 3'말단에 오버행부를 설치해서 형성되고, 각 가닥의 염기수가 15~30이 되도록 합성된 2가닥 폴리뉴클레오티드가 예시된다. 해당 폴리뉴 클레오티드는 RNA간섭을 생기게 하는 확률이 높은 폴리뉴클레오티드이다.

또한, siRNA를 발현하는 것과 같은 발현 벡터를 조제할 수도 있다. 규정서열을 포함하는 서열을 발현하는 벡터를, 발현이 행하여질 수 있는 무세포계 또는 세포계의 조건하에 둠으로써, 발현 벡터를 이용해서 소정의 siRNA를 공급할 수 있다.

종래, siRNA의 설계는 시험자의 경험이나 감에 의존하고 있었기 때문에 시행 착오를 반복하는 것이 많았다. 그러나, 본 발명의 2가닥 폴리뉴클레오티드의 제작 방법에 의해, RNA간섭을 생기게 하는 2가닥 폴리뉴클레오티드를 높은 확률로 제조하는 것이 가능하다. 상기 본 발명의 검색방법, 서열설계 방법 또는 폴리뉴클레오티드의 제작 방법에 의하면, RNA간섭을 이용한 각종의 시험이나 제조 등에 필요한 노력, 시간, 코스트를 대폭 삭감하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명은 유전자해석, 신약개발 타겟의 탐색, 신약개발, 유전자치료, 생물종간의 차이의 연구 등 RNA간섭을 이용하는 다양한 시험, 연구, 개발, 제조 등을 대폭 간편하게 하여 효율의 향상을 도모할 수 있다.

본 발명은 또한 1태양으로서, 상술한 본 발명의 폴리펩티드의 선택방법도 제공한다. 구체적으로는, 발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입하는 폴리뉴클레오티드의 선택방법으로서,

적어도 2가닥 영역을 갖고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 선택방법이 제공된다:

(a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이며;

(b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이며;

(d) 염기수가 세포독성을 생기게 하지 않고 RNA간섭을 생기게 할 수 있는 수이며, ;

본 발명의 선택방법에 의해 얻어지는 폴리펩티드의 표적이 되는 서열은 전술한 (a)~(f)의 규칙을 만족하는 규정서열로서, 선택된 서열이다. 바람직하게는, 서열번호47~서열번호817081중 어느 것이어도 좋다.

본 발명의 선택방법은, 상기 선택한 폴리뉴클레오티드로 부터, 상기 표적유전자의 규정서열과 상동인 염기서열이 상기 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 적어도 3염기이며, 또한, 해당 적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 다른 유전자의 수가 가장 적은 서열인 폴리뉴클레오티드를 더 선택하는 것을 포함해도 좋다.

즉, 해당 표적서열이 표적유전자에 높은 특이성을 갖는 서열이면, 폴리뉴클레어티드가 해당 표적서열을 포함하는 표적유전자에 대하여만 선택적으로 발현억제효과를 나타내고, 그 이외의 유전자에 대하여는 발현억제를 생기지 않게 하므로(즉, 오프 타겟 효과가 보다 낮다), 부작용의 영향 등을 저감할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드의 표적서열은 표적유전자에 특이성이 높은 것이 보다 바람직하고, 전술한 (a)~(f)의 규칙을 만족하는 규정서열로서, 선택된 서열(예를 들면, 서열번호47~서열번호817081) 중에서도, 보다 오프 타겟 효과를 저감가능한 서열인 것이 바람직하다. 바람직한 표적유전자의 규정서열로서, 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 적어도 3염기이며, 또한, 적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 그 외의 유전자의 수가 가장 적은 서열을 선택할 수 있다. 「그 밖의 유전자의 수가 가장 적은」이라는 것은 「적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 기타의 유전자」, 즉, 유사한 유전자가 가능한한 존재하지 않는 것, 예를 들면, 바람직하게는 10개 이내, 보다 바람직하게는 6개 이내, 더욱 보다 바람직하게는 1개만 존재하는, 혹은, 가장 바람직하게는 전혀 존재하지 않는 것을 의미한다.

예를 들면, 서열번호47~서열번호817081중에서, 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 3염기이며(바꿔 말하면, 19염기로 이루어지는(협의의) 규정서열 중 해당 미스매치 3염기 이외의 16염기가 일치하는), 또한 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 기타의 유전자의 수가 가장 적은 서열을 선택해서 얻어진 것이, 도46에 나타내는 53998종의 서열이다. 따라서, 이들 서열 중 어느 하나인 것이 특히 바람직하다.

＜4＞유전자의 발현억제 방법

본 발명의 유전자발현억제 방법은, 소정의 염기서열을 검색하는 공정과, 검색된 염기서열에 근거해서 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 설계해서 합성하는 공정과, 얻어진 폴리뉴클레오티드를 표적유전자를 포함하는 발현계에 도입하는 공정을 포함한다.

소정의 염기서열을 검색하는 공정은 상기 RNA간섭의 표적염기서열 검색방법에 따른다. 바람직한 태양도 상기와 같다. 또한, 검색된 염기서열에 근거해서 siRNA의 염기서열을 설계해서 합성하는 공정은, 상기 RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열설계 방법, 폴리뉴클레오티드의 제작 방법에 따라 행할 수 있고, 바람직한 형태도 동일하다.

얻어진 폴리뉴클레오티드는 표적유전자의 발현계에 첨가해서 표적유전자의 발현을 억제한다. 표적유전자의 발현계라는 것은 표적유전자가 발현되고 있는 체계의 것이며, 보다 구체적으로는, 적어도 표적유전자의 mRNA가 형성되는 반응계를 구비한 계이다. 표적유전자의 발현계로서는, In vitro, In vivo 모두 포함된다. 표적유전자의 발현계로서는, 배양세포, 배양 조직, 생체 이외에, 무세포계에서 이용하는 것도 가능하다. 발현억제를 하고자 하는 표적유전자(억제 표적유전자)는 반드시 검색된 서열의 유래와 일치하는 생물종의 것에 한하지 않아도 좋지만, 검색 대상유전자와 억제 대상유전자의 유래가 근연(近緣)일수록, 특이적으로 그리고 효과적으로 특정 유전자의 억제를 행할 수 있다.

표적유전자의 발현계에 도입한다는 것은 표적유전자의 발현반응계 중에 취입 시킨다는 것이다. 구체적으로 예를 들면, 표적유전자를 갖는 배양세포에 2가닥 폴리뉴클레오티드를 트랜스펙트하고, 세포내에 취입시키는 규정서열 및 오버행부로 이루어지는 염기서열을 갖는 발현 벡터를 제작하여, 표적유전자를 갖는 세포내에 도입하는(WO01/36646, WO01/49844) 등의 수법을 들 수 있다.

본 발명의 유전자억제 방법에 의하면, 효율적으로 RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있기 때문에, 효율적이고, 또한 간편하게 유전자를 억제하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들면, 대상유전자가 질환관련 유전자인 경우, 해당 질환관련 유전자를 표적으로 하는 siRNA(또는 shRNA)나, 이러한 siRNA(또는 shRNA)를 발현하는 벡터를 질환관련 유전자발현세포에 도입하므로써 질환관련 유전자를 불활성화 할 수 있다.

본 명세서에 있어서 후술하는 실시예 2~5에서는 인간비멘틴, 루시퍼라제, SARS바이러스 등의 유전자에 대한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 RNAi효과를 mRNA의 대조에 대한 상대적 발현량으로 조사했다. 도31, 32 및 35는 mRNA의 발현량을 정량 PCR로 측정한 결과가 나타나 있다. mRNA의 상대 발현량은 도31, 32 및 35에 있어서, 각각 약 7~8％(실시예 2, 도31), 약 12~13％(실시예3, 도32), 수％~약 15％ 미만(실시예5, 도35)으로 감소하고, 각 유전자의 발현억제 효과가 확인되었다. 또한, 실시예 4의 도34는 RNAi효과로서의 mRNA의 발현량을 루시퍼라제 활성으로 조사한 결과이지만, 동일하게, 대조와 비교해서 수％~약 20％미만으로 감소했다.

아울러, 실시예8에서는 관련 질환이나 생물학적 기능이 밝혀진 도46에 나타내는 유전자 중, 무작위적으로 선택한 약 300종의 유전자에 대해서, 인간 유래 HeLa세포에서의 mRNA의 발현량을 상대적 발현량으로 조사했다. 표1에서 나타낸 바와 같이, 해당 유전자의 발현억제 효과, 즉 RNAi효과를 평가하기 위해서 산출한 후술의 RQ값은 모두 1미만이며, 거의 모두가 0.5미만이었다.

본 발명의 유전자발현억제 방법에 있어서, 「표적유전자의 발현을 억제한다」는 것은 표적유전자의 mRNA발현량이 실질적으로 감소하는 것을 의미한다. mRNA 발현량이 실질적으로 감소하고 있으면, 그 변화의 폭의 대소에 관계없이 발현억제가 실현되어 있다. 특히, 해당 감소량이 클수록 발현억제의 효과가 크기때문에, 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 약 80％ 이하, 보다 바람직하게는 약 50％ 이하, 더욱 보다 바람직하게는 약 20％ 이하, 더욱 또한 바람직하게는 약 15％ 이하, 더욱 바람직하게는 약 8％ 이하로 감소하는 경우가 발현억제의 판정 기준으로서도 좋다. 본 발명의 규칙에 따라 선택된 폴리뉴클레오티드를 이용하는 본 발명의 유전자억제 방법에 의하면, 표적유전자의 mRNA발현량을 바람직하게는 적어도 50％ 이하로 감소시키는 것이 가능해진다.

＜5＞siRNA서열설계 프로그램

이하, siRNA서열설계 프로그램의 실시형태예를 설명한다.

(5-1) 프로그램의 개요

본 프로그램은 게놈 시퀀스가 진행되어 있지 않는 종, 예를 들면, 말, 돼지 등에 대하여 RNA간섭을 행할 때에, 이미 공개되어 있는 인간과 마우스의 호몰로그의 서열 정보를 바탕으로, 목적하는 종에서 사용가능한 siRNA의 서열을 계산하는 것이다. 본 프로그램으로 siRNA를 설계하면, 표적유전자를 시퀀스하는 일없이 신속 하게 RNA간섭을 행할 수 있다. siRNA의 설계(계산)에 있어서 G 또는 C배분의 규칙(상기 (a)~(d)로 표시되는 규칙)을 고려해서 RNAi활성을 갖는 확률이 높은 서열을 선택하는 동시에, 표적유전자와는 무관계한 유전자에 대하여 RNA간섭이 일어나지 않도록 호몰로지 서치에 의한 체크를 행하고 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 「G 또는 C」를 「G/C」로, 「A 또는 T」를 「A/T」로 각각 표기하는 경우가 있다. 또한, 「A/T(U)」라는 것은 데옥시리보 핵산에 의한 서열의 경우 T(티민)이며, 리보핵산에 의한 서열의 경우 U(우라실)인 것을 나타낸다.

(5-2) siRNA설계의 방침

인간의 유전자X 및 그 호몰로그인 마우스의 유전자X의 서열이 알려져 있다고 한다. 본 프로그램은 그들의 서열을 숙독하고, 코드영역(CDS) 부분에서 23염기 이상이 완전하게 공통인 서열을 찾아낸다. 이 공통 부분에서 siRNA를 설계하면, 그 siRNA는 인간과 마우스의 유전자X를 함께 표적하는 것이 가능하다(도 1).

인간과 마우스에서 완전히 공통인 부분은 다른 포유류에서도 보존되어 있을 확률이 높다고 생각되므로, 상기의 siRNA는 인간과 마우스의 유전자X뿐만 아니라, 다른 포유류의 유전자X에 대하여도 기능하는 것이 기대된다. 즉, 표적유전자의 서열이 미지인 동물종이어도, 대응하는 인간과 마우스의 호몰로그에 대해서 서열 정보가 알려져 있다면, 본 프로그램을 이용해서 siRNA를 설계할 수 있다.

또한, 포유류에 있어서는, 실제로 기능하는 siRNA는 서열에 규칙성이 있다는 것이 판명되었다(도 2). 본 프로그램에서는, 그 규칙에 적합한 서열만을 선택하도록 했다. 도 2는 RNAi효과를 나타내는 siRNA의 서열의 규칙성(siRNA의 G/C배분의 규칙)을 나타내는 도이다. 도 2에 있어서, 21염기의 길이를 갖는 2개의 RNA가닥이 각각 3'측에 2염기의 오버행을 가지도록 5'측의 19염기끼리로 염기쌍를 형성하고 있는 것 같은 siRNA로, 염기쌍를 형성하고 있는 19염기 중 코딩측의 서열의 1) 3'말단이 A/U일 것, 2) 5'말단이 G/C일 것, 3) 3'측의 7문자는, A/U의 비율이 높을 것이 요구된다. 특히, 1) 및 2)의 조건은 중요하다.

(5-3) 프로그램의 구조

본 프로그램은 3개 부분으로 구성되어 있다. 즉, (5-3-1) 인간과 마우스에서 공통 부위의 서열(부분서열)을 검색하는 부분, (5-3-2) G/C배분의 규칙에 근거해서 서열에 스코어를 붙이는 부분, (5-3-3) 무관계인 유전자를 표적으로 하지 않도록 호몰로지 서치에 의해 체크하는 부분이다.

(5-3-1) 공통 서열을 검색하는 부분

복수의 염기서열 파일(file1, file2, file3,...)을 숙독하는 전체 파일에 공통으로 출현하는 23문자의 서열을 전부 찾아낸다.

(계산예)

file1로서 인간의 유전자FBP1(NM000507:Homo sapiens fructose-1,6-bisphosphatase1), file2로서 마우스의 유전자Fbp1(NM019395:Mus musculus fructose bisphosphatase 1)의 서열을 프로그램에 입력했다. 그 결과, 양자의 서열(도 3)로부터 양자에 공통인 23문자의 서열(인간FBP1과 마우스Fbp1에 공통인 서열)이 15개 찾아내어졌다(도 4).

(5-3-2) 서열에 스코어를 붙이는 부분

전술의 G/C 배분의 규칙에 적합한 서열만을 선택하기 위해서, 23문자의 서열에 대하여 스코어를 붙인다.

(방법)

23문자의 서열에 대하여, 아래와 같이 스코어를 붙인다.

스코어1:선두로부터 21번째 문자가 A/U인가? [no=0, yes=1]

스코어2:선두로부터 3번째 문자가 G/C인가?[no=0, yes=1]

스코어3:선두로부터 15번째 문자로부터 21번째 문자까지의 7문자 중, A/U의 수. [0-7]

종합 스코어:스코어1~3의 곱(績). 단지 곱이 3 이하인 경우는 0으로 한다.

(계산예) 도 4에 나타낸 15개의 서열에 대하여 계산을 한 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 인간FBP1과 마우스Fbp1에 공통인 서열에 스코어를 붙인 도면이다. 또한, 도 5에 나타내는 서열의 다음에는, 스코어1, 스코어2, 스코어3, 종합 스코어가 순차로 기재되어 있다.

(5-3-3) 무관계의 유전자를 표적으로 하지 않도록 체크하는 부분

설계한 siRNA가 표적유전자와는 무관계의 유전자에 대하여 기능하지 않도록, 공개되어 있는 인간·마우스의 전체 mRNA에 대하여 호몰로지 서치를 행하고, 무관계의 유전자가 히트하는 정도를 평가한다. 호몰로지 서치에는 각종 알가닥즘이 사용가능하지만, 여기에서는, BLAST를 사용한 예를 나타낸다. 또한, BLAST를 이용하는 경우는 검색 서열이 23염기로 짧은 것을 고려하여, Word Size를 충분히 작게 하는 것이 바람직하다.

BLAST의 결과, E value가 10.0 이하인 히트 중, 표적유전자 이외의 모든 히트에 대해서, E value의 역수의 총합을 구한다(이하, 이 값을 호몰로지·스코어라 부른다). 즉, 호몰로지·스코어(X)는 하기식에 의해 구해진다.

주의점:E value가 낮은 히트일수록, query의 23문자와 호몰로지가 높고, siRNA의 표적이 될 위험성이 높다. 또한, 히트의 수가 많을 수록, 보다 많은 무관계한 유전자를 표적으로 하는 확률이 높다. 이 2점을 고려하여, siRNA가 표적유전자와 무관계의 유전자를 표적으로 할 위험성을 상기식을 이용해서 평가하고 있다.

(계산예)

23문자의 서열에 대하여, 상기의 호몰로지 서치를 행한 결과와, 호몰로지·스코어를 나타낸다(도 6, 도 7). 또한, 도 6에는, 인간FBP1과 마우스Fbp1에 공통인 서열 「caccctgacccgcttcgtcatgg」을 BLAST 한 결과가 나타내지고 있어, 최초의 2행은 마우스Fbp1과 인간FBP1이 히트한 것이다. 호몰로지·스코어는 5,9로, 히트가 적은 예이다. 이 서열의 siRNA는 다른 유전자를 표적으로 할 위험성이 낮다. 또한, 도 7에는, 인간FBP1과 마우스Fbp1에 공통인 서열 「gccttctgagaaggatgctctgc」을 BLAST 한 결과가 나타내져 있다. 히트가 많은 예로, 호몰로지·스코어는 170.8이다. 다른 유전자를 표적으로 할 위험성이 높기 때문에, siRNA로서 적합하지 않다.

실제로는, 상기의 (5-3-1), (5-3-2), (5-3-3) 부분은 일체로서 구성해도 좋고, 도 3에 나타낸 인간과 마우스의 서열을 입력하면, 도 8과 같은 출력이 직접 얻 어진다. 여기에서, 도 8에 나타내는 서열의 다음에는, 스코어1, 스코어2, 스코어3, 종합 스코어, 및 호몰로지·스코어를 10배로 한 값이 순차로 기재되어 있다. 또한, 처리시간 단축을 위해, 종합 스코어가 O의 서열은 호몰로지·스코어를 계산하지 않도록 해도 좋다. 이 결과로부터, siRNA로서 「36 caccctgacccgcttcgtcatgg」의 부분을 사용하면 좋다는 것을 알았다. 또한, (5-3-1), (5-3-2), (5-3-3) 부분 중 1개의 기능을 단독으로 이용할 수도 있다.

(5-4) 실제의 계산

인간·마우스간의 호몰로그 중 약 6400유전자의 쌍에 대하여, 실제로 본 프로그램으로 siRNA의 설계를 행하였다. 그 결과, 약 7할에 있어서, 인간과 마우스에 공통인 서열로, 또한 유효한 siRNA의 서열 규칙성의 규칙을 만족하고, 무관계한 유전자를 표적으로 하지 않는 siRNA를 설계할 수 있었다.

이들 siRNA는 인간과 마우스뿐만 아니라, 다양한 포유류에서 효과적으로 표적유전자를 억제하는 효과가 있을 것으로 기대되고, 가축이나 애완 동물 등에서의 응용 등 산업적 가치가 높다고 생각된다. 또한, 본 프로그램을 이용하여, 동종내의 복수의 유전자, 예를 들면, eIF2C1과 eIF2C2를 동시에 표적으로 하는 siRNA를 설계하는 것도 가능해서, 본 프로그램이 제공하는 siRNA설계의 수법은 응용범위가 넓고 매우 강력한 것이라 할 수 있다. 게다가, 인간과 마우스의 공통인 부분의 서열을 이용해서 PCR프라이머(PCR primer)를 설계하면, 다양한 포유류에서 목적의 유전자를 증폭할 수 있다고 한 이용법도 있다.

또한, siRNA서열설계 프로그램을 실행하는 장치의 실시형태는 하기 ＜7＞ siRNA 서열설계 프로그램을 실행하는 염기서열 처리장치 등의 란에 상세하게 나타낸다.

＜6＞siRNA서열설계 비지니스 모델 시스템

본 발명의 siRNA서열설계 비지니스 모델 시스템은 siRNA서열설계 프로그램을 적용하는데 있어서, 게놈 데이타베이스, EST데이타베이스, 진화 계통수 데이타베이스를 본 프로그램의 로직에 첨가하여 단독으로 혹은 조합시켜서 참조하고, 유전자서열정보의 available한 상태에 따른 효과적인 siRNA를 고객에 제안하는 시스템이다. available한 상태란, 정보가 이용가능한 상태인 것을 말한다.

(1) 게놈 정보가 available하지만 ORF의 특정이 곤란한 것에 있어서는, EST정보 등을 기초로 엑손 상정 부위에 대하여 효과적인 siRNA후보를 추출하고, 스플라이싱 밸리언트를 고려한 siRNA서열과 그 평가결과를 표시한다.

(2) 유전자서열, 유전자명이 분명한 것은, 유전자서열 또는 유전자명을 입력 후, 효과적인 siRNA후보를 추출하고, siRNA 서열과 그 평가결과를 표시한다.

(3) 게놈 정보가 available하지 않는 것에 대해서는, 동종의 유전자기능을 보존하고 있는 유사관계(동속, 내지는 기원을 같도록 한다)에 있는 생물종의 유전자서열 혹은 진화 계통수적으로 끼워져 있던 게놈 서열이 available한 2종류 이상의 생물종의 유전자서열을 이용해서 효과적인 siRNA후보를 추출하고, siRNA 서열과 그 평가결과를 표시한다.

(4) 감염증의 유전자기능 해석, 신약개발 타겟 발굴에는, 미생물의 게놈 데이타베이스·진화 계통수 데이타베이스에 미생물의 아포토시스 유도 부위정보, 기 능 발현부위정보를 더 조합시켜서 망라적인 siRNA후보서열을 구하는 수법이 유효하다.

＜7＞siRNA서열설계 프로그램을 실행하는 염기서열 처리장치 등

이하, 상술한 siRNA서열설계 프로그램을 실행하는 장치인 본 발명에 있어서 염기서열 처리장치, 염기서열 처리 방법을 컴퓨터에 실행시키는 프로그램, 기록 매체, 및 염기서열 처리 시스템의 실시형태를 도면에 근거해서 상세하게 설명한다. 또한, 이 실시형태에 의해 이 발명이 한정되는 것은 아니다.

[발명의 개요]

이하, 본 발명의 개요에 대해서 설명하고, 그 후, 본 발명의 구성 및 처리 등에 있어서 상세하게 설명한다. 도 12는 본 발명의 기본원리를 나타내는 원리구성 도이다.

본 발명은, 개략적으로, 이하의 기본적 특징을 갖는다. 즉, 본 발명은 RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보를 취득하여, 염기서열 정보의 이미 규정된 염기수의 서열 부위인 부분염기서열 정보를 작성한다(스텝S-1).

여기에서, 스텝S-1에 있어서, 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터, 이미 규정된 염기수의 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 또한, 다른 생물에 유래하는 복수의 염기서열 정보(예를 들면, 인간의 염기서열 정보 및 마우스의 염기서열 정보 등)의 사이에서 공통되는 이미 규정된 염기수의 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 또한, 같은 생물종에 있어서의 유사한 복수의 염기서열 정보의 사이에서 공통하는 이미 규정된 염기수의 공통인 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 또한, 다른 생물에 유래되는 복수의 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터, 이미 규정된 염기수의 공통인 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 또한, 같은 생물종에 있어서의 유사한 복수의 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터, 이미 규정된 염기수의 공통인 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 이것에 의해, 표적유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 규정서열을 효율적으로 선택할 수가 있고, 계산 부하를 경감할 수 있다.

또한, 스텝S-1에 있어서, 오버행 부위를 포함하는 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 오버행 부위가 포함되어 있는 것을 나타내는 오버행 부위 함유 정보가 부가된 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 즉, 부분염기서열 정보와 오버행 부위 함유 정보를 서로 관련되게 만들어도 좋다. 이것에 의해, 처음부터 규정서열 및 오버행 부위를 포함해서 선택을 행하고, 설계할 수 있게 된다.

또한, 상술의 이미 규정된 염기수의 상한은 오버행 부위를 포함하지 않는 경우는, 바람직하게는 28 이하, 보다 바람직하게는 22 이하, 더욱 바람직하게는 20 이하이며, 오버행 부위를 포함하는 경우는, 바람직하게는 32 이하, 보다 바람직하게는 26 이하, 더욱 바람직하게는 24 이하이다. 또한, 이미 규정된 염기수의 하한은 오버행 부위를 포함하지 않는 경우는, 바람직하게는 13 이상, 보다 바람직하게는 16 이상, 더욱 바람직하게는 18 이상이며, 오버행 부위를 포함하는 경우는 바람직하게는 17 이상, 보다 바람직하게는 20 이상, 더욱 바람직하게는 22 이상이다. 그리고, 가장 바람직한 이미 규정된 염기수는 오버행 부위를 포함하지 않는 경우는 19이며, 오버행 부위를 포함하는 경우는 23이다. 이것에 의해, 포유류에 있어서도 세포독성을 생기게 하지 않도록 RNA간섭을 생기게 하는 규정서열을 효율적으로 선택할 수 있다.

다음에, 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실인가 아닌가를 판정한다(스텝S-2). 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실일 때에는 「1」을, 그렇지 않을 때는 「0」을 판정결과로서 출력해도 좋다.

이어서, 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신인가 아닌가를 판정한다(스텝S-3). 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신일 때에는 「1」을, 그렇지 않을 때에는 「0」을 판정결과로서 출력해도 좋다.

다음에, 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민 및 우라실로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인가 아닌가를 판정한다 (스텝S-4). 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보에 포함되는 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기의 수를 판정결과로서 출력해도 좋다. 스텝S-4에 있어서의 판정의 규칙은 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단근방의 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택 되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인 것을 규정하고 있고, 구체적으로 검색을 행할 때의 1지표로서 3'말단으로부터 7염기의 범위내의 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인 것을 규정하고 있다.

여기에서, 스텝S-4에 있어서, 「풍부한 염기서열 정보」는, 상술의 ＜1＞RNA간섭의 표적염기서열 검색방법에 기술되어 있는 「풍부한 서열」이며, 구체적으로는, 예를 들면, 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보가 19염기 정도로 이루어지는 경우, 해당 부분염기서열 정보의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 적어도 바람직하게는 3염기 이상, 보다 바람직하게는 4염기 이상, 특히 바람직하게는 5염기 이상 포함되는 염기서열 정보이다.

또한, 스텝S-2에서 스텝S-4에 있어서, 오버행 부위를 포함하는 부분염기서열 정보를 판정하는 경우, 부분염기서열 정보의 오버행 부위를 제외한 서열 부위를 판정 대상으로서 판정한다.

다음에, 스텝S-2, 스텝S-3, 및 스텝S-4에서 판정된 결과에 근거하여, 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보로부터 표적유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 규정서열 정보를 선택한다(스텝S-5).

구체적으로는, 예를 들면, 스텝S-2에서 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실이라고 판정되고, 스텝S-3에서 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신인 것으로 판정되고, 또한, 스텝S-14에서 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루 어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인 것으로 판정된 부분염기서열 정보를 규정서열 정보로서 선택한다. 여기에서, 구체적으로는, 예를 들면, 스텝S-2, 스텝S-3, 및 스텝S-4에서 출력되는 수치의 곱을 산출하고, 해당 산출값에 근거하여, 스텝S-1에서 작성된 부분염기서열 정보로부터 규정서열 정보를 선택해도 좋다.

이에 따라, 포유류 등에 있어서, RNA간섭을 생기게 하는 확률이 극도로 높은, 요컨대 RNA간섭에 유효한 siRNA의 서열을 효율좋고, 용이하게 작성할 수 있다.

여기에서, 스텝S-5에서 선택된 규정서열 정보의 적어도 한쪽 말단에 오버행 부위를 부가해도 좋다. 또한, 예를 들면, 타겟측을 검색하는 경우는 규정서열 정보의 양쪽말단에 오버행 부위를 부가해도 좋다. 이에 따라, RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 설계를 간편화할 수 있다.

또한, 상술의 오버행 부위의 염기수는 상술의 ＜2＞RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열설계 방법에 기술되어 있는 염기수이며, 구체적으로는, 예를 들면, 2가 특히 바람직하다.

또한, 스텝S-5에서 선택된 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 다른 염기서열 정보(예를 들면, NCBI의 RefSeq(Reference Sequence project) 등의 공적 데이타베이스로 공개되어 있는 염기서열 정보)로 부터, 예를 들면, BLAST, FASTA, ssearch 등의 기존의 호몰로지 검색 수법을 이용해서 검색하고, 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보에 근거하여, 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관 계의 유전자를 표적으로 할 것인지의 여부를 평가해도 좋다.

구체적으로는, 예를 들면, 스텝S-5에서 선택된 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 다른 염기서열 정보(예를 들면, NCBI의 RefSeq등의 공적 데이타베이스에서 공개되어 있는 염기서열 정보)로부터, 예를 들면, BLAST, FASTA, ssearch 등의 기존의 호몰로지 검색 수법을 이용해서 검색하고, 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보 중 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보의 총수 및 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보에 붙여진 동일유사의 정도를 나타내는 값(예를 들면, BLAST, FASTA 및 ssearch의 경우는, 「E value」)에 근거하여, 동일유사의 정도를 나타내는 값의 역수의 총합을 산출하고, 산출된 총합에 근거해서(예를 들면, 산출된 총합의 대소 등에 근거해서), 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 할 것인지의 여부를 평가해도 좋다.

이에 따라, 규정서열 정보로부터, 표적으로 하는 유전자에만 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 서열을 선출할 수 있다.

이상, 본 발명에 의해 선택되는 표적유전자와 관계가 없는 유전자에 대해서까지 RNA간섭을 생기게 하지 않는 규정서열 정보에 근거해서 RNA의 합성을 행하면, 그것에 걸리는 노력, 시간, 비용을 종래와 비교해 대폭 경감할 수 있다.

[시스템 구성]

우선, 본 시스템의 구성에 대해서 설명한다. 도13은 본 발명이 적용되는 본 시스템의 구성의 일례를 나타내는 블록도이며, 해당 구성 중 본 발명에 관계되는 부분만을 개념적으로 나타내고 있다.

본 시스템은, 개략적으로, RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보를 처리하는 염기서열 처리장치(100)와, 서열 정보나 구조정보 등에 관한 외부 데이타베이스나 호몰로지 검색 등의 외부 프로그램 등을 제공하는 외부 시스템(200)을 네트워크(300)을 통해서 통신가능하게 접속해서 구성되어 있다.

도13에 있어서, 네트워크(300)는 염기서열 처리장치(100)와 외부 시스템(200)을 서로 접속하는 기능을 가지며, 예를 들면, 인터넷 등이다.

도13에 있어서, 외부 시스템(200)은 네트워크(300)를 통하고, 염기서열 처리장치(100)와 서로 접속되어, 이용자에 대하여 서열 정보나 구조정보 등에 관한 외부 데이타베이스나 호몰로지 검색이나 모티프 검색 등의 외부 프로그램을 실행하는 웹사이트를 제공하는 기능을 갖는다.

여기에서, 외부 시스템(200)은 웹서버나 ASP서버 등으로서 구성해도 좋고, 그 하드웨어 구성은 일반적으로 시판되는 워크스테이션, 퍼스널 컴퓨터 등의 정보처리장치 및 그 부속 장치에 의해 구성해도 좋다. 또한, 외부 시스템(200)의 각기능은 외부 시스템(200)의 하드웨어 구성중의 CPU, 디스크 장치, 메모리 장치, 입력장치, 출력장치, 통신제어장치 등 및 그것들을 제어하는 프로그램 등에 의해 실현된다.

도13에 있어서 염기서열 처리장치(100)는, 개략적으로, 염기서열 처리장치(100)의 전체를 통괄적으로 제어하는 CPU 등의 제어부(102), 통신회선 등에 접속되는 라우터 등의 통신장치(도시하지 않음)에 접속되는 통신제어 인터페이스부(104), 입력장치(112)이나 출력장치(114)에 접속되는 입출력 제어 인터페이스부(108), 및 각종 데이타베이스나 테이블 등을 저장하는 기억부(106)를 구비해서구성되고 있고, 이들 각부는 임의인 통신로를 통해서 통신가능하게 접속되어 있다. 아울러 이 염기배열 처리장치(100)는 라우터 등의 통신장치 및 전용선 등의 유선 또는 무선의 통신회선을 통하여, 네트워크(300)에 통신가능하게 접속되어 있다.

기억부(106)에 저장되는 각종의 데이타베이스나 테이블(표적유전자 염기배열 파일(106a)~표적유전자 어노테이션 데이타베이스(106h))은 고정데스크 장치 등의 저장수단이며, 각종 처리에 이용하는 각종의 프로그램이나 이블이나 파일이나 데이타베이스나 웹페이지용 파일 등을 저장한다.

이들 기억부(106)의 각 구성 요소 중, 표적유전자 염기서열 파일(106a)은 RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보를 저장하는 표적유전자염기서열 저장 수단이다. 도14는 표적유전자염기서열 파일(106a)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

표적유전자염기서열 파일(106a)에 저장되는 정보는 도14에 나타낸 바와 같이, RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보를 일의(一意)로 식별하는 염기서열 식별정보(예를 들면, 도14의 「NM_0005p7」)와 염기서열 정보(예를 들면, 도14의 「ATGGCTGA…AGTGA」)를 서로 관련시키도록 구성되어 있다.

또한, 부분염기서열 파일(106b)은 RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보의 이미 규정된 염기수의 서열 부위인 부분염기서열 정보를 저장하는 부분염기서열 저장 수단이다. 도15는 부분염기서열 파일(106b)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

부분염기서열 파일(106b)에 저장되는 정보는 도15에 나타낸 바와 같이, 부분염기서열 정보를 일의로 식별하는 부분염기서열 식별정보(예를 들면, 도15의 「NM_OOO507:36」)와 부분염기서열 정보(예를 들면, 도15의 「caccct…tcatgg」)와 오버행 부위가 포함되어 있는 것을 나타내는 오버행 부위 함유 정보(예를 들면, 도15의 「함유」)를 서로 관련시키도록 구성되어 있다.

또한, 판정결과 파일(106c)은 후술하는 3'말단 염기판정부(102b), 5'말단 염기판정부(102c), 및 특정 염기함유 판정부(102d)에서 판정된 결과를 저장하는 판정결과수단이다. 도16은 판정결과 파일(106c)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

판정결과 파일(106c)에 저장되는 정보는 도16에 나타낸 바와 같이, 부분염기서열 식별정보(예를 들면, 도16의 「NM_000507:36」)와 3'말단 염기판정부(102b)에서 판정된 결과인 3'말단 염기판정결과(예를 들면, 도16의 「1」)와 5'말단 염기판정부(102c)에서 판정된 결과인 5'말단 염기판정결과(예를 들면, 도16의 「1」)와 특정 염기함유 판정부(102d)에서 판정된 결과인 특정 염기함유 판정결과(예를 들면, 도16의 「4」)와 3'말단 염기판정부(102b), 5'말단 염기판정부(102c), 및 특정 염기함유 판정부(102d)에서 판정된 결과를 종합한 결과인 종합 판정결과(예를 들면, 도16의 「4」)를 서로 관련시키도록 구성되어 있다.

또한, 도16에 있어서, 3'말단 염기판정결과 및 5'말단 염기판정결과는 3'말단 염기판정부(102b), 5'말단 염기판정부(102c)의 각각에서 「포함한다」고 판정되었을 경우 「1」을 설정하고, 「포함하지 않는다」라고 판정되었을 경우 「0」을 설정한 경우의 일례이다. 또한, 도16에 있어서, 특정 염기함유 판정결과는 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보에 포함되는 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기의 수를 설정했을 경우의 일례이다. 아울러, 도16에 있어서, 종합 판정결과는, 3'말단 염기판정결과, 5'말단 염기판정결과 및 특정 염기함유 판정결과의 곱을 설정했을 경우의 일례이다. 또한, 구체적으로는, 예를 들면, 해당 곱이 3 이하의 경우는 「0」을 설정해도 좋다.

또한, 규정서열 파일(106d)은 표적유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 부분염기서열 정보인 규정서열 정보를 저장하는 규정서열 저장수단이다. 도17은 규정서열 파일(106d)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

규정서열 파일(106d)에 저장되는 정보는, 도17에 나타낸 바와 같이, 부분염기서열 식별정보(예를 들면, 도17의 「NM_000507:36」)와 표적유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 부분염기서열 정보인 규정서열 정보(예를 들면, 도17의 「caccct…tcatgg」)를 서로 관련시켜 구성되어 있다.

또한, 참조서열 데이타베이스(106e)는 후술하는 동일유사 염기서열 검색부(102g)에서 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 검색하기 위해서 참조하는 염기서열 정보인 참조 염기서열 정보를 저장하는 데이타베이스이다. 또한, 참조서열 데이타베이스(106e)는 인터넷을 경유해서 엑세스하는 외부의 염기서열 정보 데이타베이스이어도 좋고, 또한, 이들 데이타베이스를 복사하거나, 오리지날인 서열 정보를 저장하거나, 아울러 독자의 어노테이션 정보 등을 부가하거나 하 여 작성한 인-하우스 데이타베이스이어도 좋다. 도18은 참조서열 데이타베이스(106e)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

참조서열 데이타베이스(106e)에 저장되는 정보는 도18에 나타낸 바와 같이, 참조서열 식별정보(예를 들면, 도18의 「ref│NM_015820. 1│」)와 참조 염기서열 정보(예를 들면, 도18의 「caccct…gcatgg」)를 서로 관련시켜 구성되어 있다.

또한, 동일유사도 파일(106f)은 후술하는 동일유사 염기서열 검색부(102g)에서 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보에 붙여진 동일유사의 정도를 나타내는 값인 동일유사도를 저장하는 동일유사도 저장 수단이다. 도19는 동일유사도 파일(106f)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

동일유사도 파일(106f)에 저장되는 정보는 도19에 나타낸 바와 같이, 부분염기서열 식별정보(예를 들면, 도19의 「NM_000507:36」)와 참조서열 식별정보(예를 들면, 도19의 「ref│NM_015820. 1│」 및 「ref│NM_003837. 1│」)와, 동일유사도 (예를 들면, 도19의 「0.52」)를 서로 관련시켜 구성되어 있다.

또한, 평가결과 파일(106g)은 후술하는 무관계 유전자 표적평가부(102h)에서 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 할 것인지 여부를 평가한 결과를 저장하는 평가결과 저장수단이다. 도20은 평가결과 파일(106g)에 저장되는 정보의 일례를 나타내는 도면이다.

평가결과 파일(106g)에 저장되는 정보는 도20에 나타낸 바와 같이, 부분염기서열 식별정보(예를 들면, 도20의 「NM_000507:36」 및 「NM_000507:441」)와 후술하는 총합 산출부(102m)에서 산출된 총합(예를 들면, 도20의 「5.9」 및 「170 .8 」)과 평가결과(예를 들면, 도20의 「비표적」 및 「표적」)를 서로 관련시켜 구성되어 있다. 또한, 도20에 있어서, 「비표적」은 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 하지 않는 것을 의미하고, 또한, 「표적」은 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 하는 것을 의미한다.

또한, 표적유전자 어노테이션 데이타베이스(106h)는 표적유전자에 관한 어노테이션정보를 저장하는 표적유전자 어노테이션 저장수단이다. 또한, 표적유전자 어노테이션 데이타베이스(106h)는 인터넷을 경유해서 엑세스하는 유전자에 관한 어노테이션정보를 저장하는 외부의 어노테이션 데이타베이스이어도 좋고, 또한, 이들 데이타베이스를 복사하거나, 오리지날인 서열 정보를 저장하거나, 독자의 어노테이션정보 등을 더 부가하거나 해서 작성한 인-하우스 데이타베이스이어도 좋다.

표적유전자 어노테이션 데이타베이스(106h)에 저장되는 정보는 표적유전자를 식별하는 표적유전자식별정보(예를 들면, 표적유전자의 유전자명, 엑세션(Accession) 번호 등(예를 들면, 도 3의 최상부에 기재된 「NM_OOO507」, 「FBP1」))과 표적유전자에 관한 간략적인 정보(예를 들면, 도 3의 최상부에 기재된 「Homo sapiens fructose-1, 6-bisphosphatase 1」)을 서로 관련시켜 구성되어 있다.

또한, 도13에 있어서, 통신제어 인터페이스부(104)는 염기서열 처리장치(100)와 네트워크(300)(또는 라우터 등의 통신장치)의 사이에 있어서의 통신제어를 행한다. 즉, 통신제어 인터페이스부(104)는 다른 단말과 통신회선을 통해서 데이타를 통신하는 기능을 갖는다.

또한, 도13에 있어서, 입출력 제어 인터페이스부(108)는 입력장치(112)나 출 력장치(114)의 제어를 행한다. 여기에서, 출력장치(114)로서는, 모니터(가정용 텔레비전을 포함한다)외, 스피커를 이용할 수 있다(또한, 이하에 있어서는 출력장치(114)를 모니터로서 기재하는 경우가 있다). 또한, 입력장치(112)로서는, 키보드, 마우스, 및 마이크 등을 이용할 수 있다. 또한, 모니터도 마우스와 협동해서 포인팅 디바이스(pointing device) 기능을 실현한다.

또한, 도13에 있어서, 제어부(102)는 OS(Operating System) 등 제어 프로그램, 각종의 처리 순서 등을 규정한 프로그램 및 소요 데이타를 저장하기 위한 내부 메모리를 갖고, 이들 프로그램 등에 의해 각종 처리를 실행하기 위한 정보처리를 행한다. 제어부(102)는 기능 개념적으로, 부분염기서열 작성부(102a), 3'말단 염기판정부(102b), 5'말단 염기판정부(102c), 특정 염기함유 판정부(102d), 규정서열 선택부(102e), 오버행 부위 부가부(102f), 동일유사 염기서열 검색부(102g), 및 무관계 유전자 표적평가부(102h)를 구비해서 구성되어 있다.

이 중, 부분염기서열 작성부(102a)는 RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보를 취득하여, 염기서열 정보의 이미 규정된 염기수의 서열 부위인 부분염기서열 정보를 작성하는 부분염기서열 작성수단이다. 여기에서, 부분염기서열 작성부(102a)는 도21에 나타낸 바와 같이, 영역지정 염기서열 작성부(102i), 공통 염기서열 작성부(102j), 및 오버행 부위 함유 염기서열 작성부(102k)를 포함해서 구성된다.

도21은 본 발명이 적용되는 본 시스템의 부분염기서열 작성부(102a)의 구성의 일례를 나타내는 블록도이며, 해당 구성 중 본 발명에 관계되는 부분만을 개념적으로 나타내고 있다.

도21에 있어서, 영역지정 염기서열 작성부(102i)는 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터, 이미 규정된 염기수의 부분염기서열 정보를 작성하는 영역지정 염기서열 작성수단이다.

또한, 공통 염기서열 작성부(102j)는 다른 생물에 유래하는 복수의 염기서열 정보의 사이에서 공통되는 이미 규정된 염기수의 부분염기서열 정보를 작성하는 공통 염기서열 작성수단이다.

또한, 오버행 부위 함유 염기서열 작성부(102k)는 오버행 부위를 포함하는 부분염기서열 정보를 작성하는 오버행 부위 함유 염기서열 작성수단이다.

다시 도13으로 돌아가서 3'말단 염기판정부(102b)는 부분염기서열 정보의 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실인가 아닌가를 판정하는 3'말단 염기판정 수단이다.

또한, 5'말단 염기판정부(102c)는 부분염기서열 정보의 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신인가 아닌가를 판정하는 5'말단 염기판정 수단이다.

또한, 특정 염기함유 판정부(102d)는 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인가 아닌가를 판정하는 특정 염기함유 판정 수단이다.

또한, 규정서열 선택부(102e)는 3'말단 염기판정부(102b), 5'말단 염기판정부(102c) 및 특정 염기함유 판정부(102c)에서 판정된 결과에 근거하여 부분염기서열 정보로부터 표적유전자에 특이적으로 RNA 간섭을 생기게 하는 규정서열 정보를 선택하는 규정서열 선택 수단이다.

또한, 오버행 부위 부가부(102f)는 규정서열 정보의 적어도 한 쪽의 말단에 오버행 부위를 부가하는 오버행 부위부가 수단이다.

또한, 동일유사 염기서열 검색부(102g)는 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 다른 염기서열 정보로부터 검색하는 동일유사 염기서열 검색수단이다.

또한, 무관계 유전자 표적평가부(102h)는 동일 또는 유사의 염기서열 정보에 근거하여, 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 할 것인지의 여부를 평가하는 무관계 유전자표적평가 수단이다. 여기에서, 무관계 유전자 표적평가부(102h)는, 도22에 나타낸 바와 같이, 총합 산출부(102m) 및 총합기준 평가부(102n)를 더 포함해서 구성된다.

도22는 본 발명이 적용되는 본 시스템의 무관계 유전자 표적평가부(102h)의 구성의 일례를 나타내는 블록도이며, 해당 구성 중 본 발명에 관계되는 부분만을 개념적으로 나타내고 있다.

도22에 있어서, 총합 산출부(102m)는 동일 또는 유사의 염기서열 정보 중 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보의 총수, 및 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보에 부가된 동일유사의 정도를 나타내는 값(동일유사도)에 근거하여, 동일유사의 정도를 나타내는 값의 역수의 총합을 산출하는 총합산출 수단이다.

또한, 총합기준 평가부(102n)는 총합 산출부(102m)에서 산출된 총합에 근거 하여, 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 할 것인지의 여부를 평가하는 총합기준 표적평가수단이다.

또한, 이들 각부에 의해 행하여지는 처리의 상세에 대해서는 후술한다.

[시스템의 처리]

다음에, 이렇게 구성된 본 실시형태에 있어서의 본 시스템의 처리의 일례에 대해서, 이하에 도23 및 도24를 참조해서 상세하게 설명한다.

[메인 처리]

우선, 메인 처리의 상세에 대해서 도23 등을 참조해서 설명한다. 도23은 본 실시형태에 있어서의 본 시스템의 메인 처리의 일례를 나타내는 플로우 챠트이다.

우선, 염기서열 처리장치(100)는 부분염기서열 작성부(102a)에서 행하여지는 부분염기서열 작성 처리에 의해 RNA간섭의 표적유전자의 염기서열 정보를 취득해서 표적유전자염기서열 파일(106a)의 소정의 기억 영역에 저장하고, 염기서열 정보의 이미 규정된 염기수의 서열 부위인 부분염기서열 정보를 작성하고, 작성된 부분염기서열 정보를 부분염기서열 파일(106b)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SA-1).

여기에서, 스텝SA-1에 있어서, 부분염기서열 작성부(102a)는 영역지정 염기서열 작성부(102i)의 처리에 의해, 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터, 이미 규정된 염기수의 부분염기서열 정보를 작성하고, 작성된 부분염기서열 정보를 부분염기서열 파일(106b)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다.

또한, 스텝SA-1에 있어서, 부분염기서열 작성부(102a)는 공통 염기서열 작성부(102j)의 처리에 의해 다른 생물에 유래하는 복수의 염기서열 정보(예를 들면, 인간의 염기서열 정보 및 마우스의 염기서열 정보 등)의 사이에서 공통되는 이미 규정된 염기수의 부분염기서열 정보를 작성하고, 작성된 부분염기서열 정보를 부분염기서열 파일(106b)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다. 또한, 같은 생물종에 있어서의 유사한 복수의 염기서열 정보 사이에서 공통되는 이미 규정된 염기수의 공통인 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다.

또한, 스텝SA-1에 있어서, 부분염기서열 작성부(102a)는 영역지정 염기서열 작성부(102i), 및 공통 염기서열 작성부(102j)의 처리에 의해, 다른 생물에 유래하는 복수의 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터, 이미 규정된 염기수의 공통인 부분염기서열 정보를 작성하고, 작성된 부분염기서열 정보를 부분염기서열 파일(106b)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다. 또한, 같은 생물종에 있어서의 유사한 복수의 염기서열 정보의 표적유전자의 코드영역, 또는, 전사 영역에 대응하는 부위로부터 이미 규정된 염기수의 공통인 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다.

아울러, 스텝SA-1에 있어서, 부분염기서열 작성부(102a)는 오버행 부위 함유 염기서열 작성부(102k)의 처리에 의해, 오버행 부위를 포함하는 부분염기서열 정보를 작성해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 부분염기서열 작성부(102a)는 오버행 부위 함유 염기서열 작성부(102k)의 처리에 의해, 오버행 부위가 포함되어 있는 것을 나타내는 오버행 부위 함유 정보가 부가된 부분염기서열 정보를 작성하고, 작성 된 부분염기서열 정보와 오버행 부위 함유 정보와 서로 관련되게 하여 부분염기서열 파일(106b)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다.

또한, 상술한 이미 규정된 염기수의 상한은 오버행 부위를 포함하지 않는 경우는, 바람직하게는 28 이하, 보다 바람직하게는 22 이하, 더욱 바람직하게는 20 이하이며, 오버행 부위를 포함하는 경우는, 바람직하게는 32 이하, 보다 바람직하게는 26 이하, 더욱 바람직하게는 24 이하이다. 또한, 이미 규정된 염기수의 하한은, 오버행 부위를 포함하지 않는 경우는, 바람직하게는 13 이상, 보다 바람직하게는 16 이상, 더욱 바람직하게는 18 이상이며, 오버행 부위를 포함하는 경우는, 바람직하게는 17 이상, 보다 바람직하게는 20 이상, 더욱 바람직하게는 22 이상이다. 그리고, 가장 바람직한 이미 규정된 염기수는 오버행 부위를 포함하지 않는 경우는 19이며, 오버행 부위를 포함하는 경우는 23이다.

이어서, 염기서열 처리장치(100)는 3'말단 염기판정부(102b)의 처리에 의해, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실인가 아닌가를 판정하고, 판정한 결과를 판정결과 파일(106c)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SA-2). 구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 3'말단 염기판정부(102b)의 처리에 의해, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실일 때에는 「1」을, 그렇지 않을 때에는 「0」을 판정결과 파일(106c)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다.

다음에, 염기서열 처리장치(100)는 5'말단 염기판정부(102c)의 처리에 의해 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신 인가 아닌가를 판정하고, 판정한 결과를 판정결과 파일(106c)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SA-3). 구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 5'말단 염기판정부(102c)의 처리에 의해, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신일 때에는 「1」을 그렇지 않을 때에는 「0」를 판정결과 파일(106c)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다.

이어서, 염기서열 처리장치(100)는 특정 염기함유 판정부(102d)의 처리에 의해 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인가 아닌가를 판정하고, 판정한 결과를 판정결과 파일(106c)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SA-4). 구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 특정 염기함유 판정부(102d)의 처리에 의해, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보에 포함되는 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기의 수를 판정결과 파일(106c)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다. 스텝SA-4에 있어서의 판정의 규칙은 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보의 3'말단 근방의 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인 것을 규정하고 있고, 구체적으로 검색을 할 때의 1지표로서 3'말단으로부터 7염기의 범위내의 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부한 염기서열 정보인 것을 규정하고 있다.

여기에서, 스텝SA-4에 있어서, 「풍부한 염기서열 정보」는 상술의 ＜1＞RNA간섭의 표적염기서열 검색방법에 기술되어 있는 「풍부한 서열」이며, 구체적으로는, 예를 들면, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보가 19염기 정도로 이루어진 경우, 해당 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 적어도 바람직하게는 3염기 이상, 보다 바람직하게는 4염기 이상, 특히 바람직하게는 5염기 이상 포함되는 염기서열 정보이다.

또한, 스텝SA-2에서 스텝SA-4에 있어서, 오버행 부위를 포함하는 부분염기서열 정보를 판정하는 경우, 부분염기서열 정보의 오버행 부위를 제외한 서열 부위를 판정 대상으로 삼아서 판정한다.

다음에, 염기서열 처리장치(100)는 규정서열 선택부(102e)의 처리에 의해 스텝SA-2, 스텝SA-3, 및 스텝SA-4에서 판정된 결과에 근거하여, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보로부터 표적유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 규정서열 정보를 선택하고, 규정서열 파일(106d)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SA-5).

구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 규정서열 선택부(102e)의 처리에 의해 스텝SA-2에서 3'말단의 염기가 아데닌, 티민, 또는, 우라실인 것으로 판정되고, 스텝SA-3에서 5'말단의 염기가 구아닌, 또는, 시토신으로 판정되고, 또한 스텝SA-4에서 부분염기서열 정보의 3'말단의 7염기로 이루어지는 염기서열 정보가 아데닌, 티민, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이 상의 염기가 풍부한 염기서열 정보로 판정된 부분염기서열 정보를 규정서열 정보로서 선택하고, 규정서열 파일(106d)의 소정의 기억 영역에 저장한다. 여기에서, 구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 규정서열 선택부(102e)의 처리에 의해, 스텝SA-2, 스텝SA-3, 및 스텝SA-4에서 출력되는 수치의 곱을 산출하고, 해당 곱의 값에 근거하여, 스텝SA-1에서 작성된 부분염기서열 정보로부터 규정서열 정보를 선택해도 좋다.

여기에서, 염기서열 처리장치(100)는 오버행 부위 부가부(102f)의 처리에 의해, 스텝SA-5에서 선택된 규정서열 정보의 적어도 한쪽 말단에 오버행 부위를 부가하여, 규정서열 파일(106d)의 소정의 기억 영역에 저장해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 오버행 부위 부가부(102f)의 처리에 의해, 규정서열 파일(106d)의 규정서열 정보의 항에 기억되어 있는 규정서열 정보를, 적어도 한쪽 말단에 오버행 부위가 부가된 규정서열 정보에 개시해도 좋다. 또, 예를 들면, 타겟측을 검색하는 경우는, 규정서열 정보의 양쪽말단에 오버행 부위를 부가해도 좋다.

또한, 상술의 오버행 부위의 염기수는, 상술의 ＜2＞RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열설계 방법에 기술되어 있는 염기수이며, 구체적으로는, 예를 들면, 2가 특히 바람직하다.

또한, 염기서열 처리장치(100)는 동일유사 염기서열 검색부(102g)의 처리에 의해, 스텝SA-5에서 선택된 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 다른 염기서열 정보(예를 들면, NCBI의 RefSeq 등의 공적 데이타베이스로 공개되어 있는 염기서열정보)로부터, 예를 들면, BLAST, FASTA, ssearch 등의 기존의 호몰로지 검색 수법을 이용해서 검색하고, 무관계유전자 표적평가부(102h)에서 행하여지는 무관계유전자 표적평가처리에 의해 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보에 근거하여, 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 하는지 여부를 평가해도 좋다.

구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 동일유사 염기서열 검색부(102g)의 처리에 의해, 스텝SA-5에서 선택된 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 다른 염기서열 정보(예를 들면, NCBI의 RefSeq 등의 공적 데이타베이스에서 공개되어 있는 염기서열 정보)로부터, 예를 들면, BLAST, FASTA, ssearch 등의 기존의 호몰로지 검색 수법을 이용해서 검색하고, 무관계유전자 표적평가부(102h)는 총합 산출부(102m)의 처리에 의해 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보 중 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보의 총수 및 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보에 붙여진 동일유사의 정도를 나타내는 값(예를 들면, BLAST, FASTA 및 ssearch의 경우는 「E value」)에 근거하여, 동일유사의 정도를 나타내는 값의 역수의 총합을 산출하고, 무관계유전자 표적평가부(102h)는 총합기준 평가부(102n)의 처리에 의해, 산출된 총합에 근거하여, 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 할 것인지 여부를 평가해도 좋다.

여기에서, 무관계유전자 표적평가부(102h)에서 행하여지는 무관계유전자 표적평가처리의 상세에 대해서 도24를 참조해서 설명한다.

도24는 본 실시형태에 있어서의 본 시스템의 무관계유전자 표적평가처리의 일례를 나타내는 플로우 챠트이다.

우선, 염기서열 처리장치(100)는 동일유사 염기서열 검색부(102g)의 처리에 의해 스텝SA-5에서 선택된 규정서열 정보와 동일 또는 유사의 염기서열 정보를 다른 염기서열 정보(예를 들면, NCBI의 RefSeq 등의 공적 데이타베이스에서 공개되어 있는 염기서열 정보)로부터, 예를 들면, BLAST, FASTA, ssearch 등의 기존의 호몰로지 검색 수법을 이용해서 검색하고, 규정서열 정보의 식별정보(도19에 있어서의 「부분염기서열 식별정보」)와 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보의 식별정보(도19에 있어서의 「참조 서열 식별정보」)와 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보에 부가된 동일유사의 정도를 나타내는 값(예를 들면, BLAST, FASTA 및 ssearch의 경우는, 「E value」) (도19에 있어서의 「동일유사도」)을 서로 관련시켜 동일유사도 파일(106f)의 소정의 기억 영역에 저장한다.

다음에, 무관계유전자 표적평가부(102h)는 총합 산출부(102m)의 처리에 의해 검색된 동일 또는 유사의 염기서열 정보 중 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보의 총수 및 표적유전자와는 무관계의 유전자의 염기서열 정보에 부가된 동일유사의 정도를 나타내는 값(예를 들면, BLAST, FASTA 및 ssearch의 경우는 「E value」)에 근거하여, 동일유사의 정도를 나타내는 값의 역수의 총합을 산출하고, 규정서열 정보의 식별정보(도20에 있어서의 「부분염기서열 식별정보」로 산출된 총합(도20에 있어서의 「총합」)을 서로 관련시켜 평가 결과 파일(106g)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SB-1).

다음에, 무관계유전자 표적평가부(102h)는 총합기준 평가부(102n)의 처리에 의해 스텝SB-1에서 산출된 총합에 근거해서(예를 들면, 스텝SB-1에서 산출된 총합의 대소 등에 근거해서), 규정서열 정보가 표적유전자와는 무관계의 유전자를 표적으로 할 것인지 여부를 평가하고, 평가 결과(도20에 있어서의 「비표적」 및 「표적」)를 평가 결과 파일(106g)의 소정의 기억 영역에 저장한다(스텝SB-2).

이것으로, 메인 처리가 종료한다.

＜8＞의약용 조성물

본 발명은, 또한, 의약적으로 유효한 양의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약용 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약용 조성물의 용도는 특별히 한정되지 않고, 유효 성분이라고 할만한 각 폴리뉴클레오티드의 표적서열을 포함하는 유전자의 발현을 RNAi에 의해 억제하기 때문에 이들 유전자가 관여하는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

본 발명의 의약용 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드의 표적이 되는 서열은 전술의 (a)~(f)의 규칙을 만족하는 규정서열로서 선택된 서열이다. 바람직하게는 서열번호47~서열번호817081의 어느 것이어도 좋다. 특히, 해당 표적서열이 표적유전자에 높은 특이성을 갖는 서열이면, 폴리뉴클레오티드가 해당 표적서열을 포함하는 표적유전자에 대하여만 선택적으로 발현억제 효과를 나타내는 것 이외의 유전자에 대하여는 발현억제를 생기게 하지 않으므로(즉, 오프 타겟 효과가 보다 낮다), 부작용의 영향 등을 저감할 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드의 표적서열은 표적유전자에 특이성이 높은 것이 보다 바람직하고, 전술한 (a)~(f)의 규칙을 만족 하는 규정서열로서 선택된 서열(예를 들면, 서열번호47~서열번호817081)중에서도 보다 오프 타겟 효과를 저감가능한 서열인 것이 바람직하다. 바람직한 표적유전자의 규정서열로서, 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 적어도 3염기이며, 또한, 적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 그 밖의 유전자의 수가 가장 적은 서열을 선택할 수 있다. 「그 밖의 유전자의 수가 가장 적다」라는 것은 「적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 그 밖의 유전자」, 즉, 유사한 유전자가 가능한 존재하지 않는 것, 예를 들면, 바람직하게는 10개 이내, 보다 바람직하게는 6개 이내, 더욱 보다 바람직하게는 1개만 존재한다, 혹은, 가장 바람직하게는 전혀 존재하지 않는 것을 의미한다.

예를 들면, 서열번호47~서열번호817081중에서 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 3염기이며(바꿔 말하면, 19염기로 이루어지는 규정서열 중 해당 미스매치 3염기 이외의 16염기가 일치한다), 또한, 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 그 밖의 유전자의 수가 가장 적은 서열을 선택해서 얻어진 것이 도46에 나타내는 53998종의 서열이다. 따라서, 이들 서열중 어느 하나인 것이 특히 바람직하다. 이들 서열에 대해서, 해당 표적서열을 포함하는 유전자, 해당 유전자가 관련되는 질환명, 해당 유전자의 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID에 대한 생물학적 기능 카테고리, 문헌에 근거하는 생물학적 기능 등의 관계는 그 대부분이 밝혀져 있다. 도46에 이들 관계를 분명히 하였다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 표적서열을 포함하는 유전자의 발현을 RNAi에 의해 억제하기 때문에, 해당 유전자의 관련 질환의 치료 및/또는 예방, 생물학적 기능의 조절이 가능하다. 당업자는, 본 명세서, 도면 등의 개시에 근거하여, 폴리뉴클레오티드의 표적서열이 밝혀지면 해당 폴리뉴클레오티드가 효과를 나타낼 수 있는 질환 및/또는 생물학적 기능을 용이하게 파악하는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명의 의약조성물은 바람직하게는, 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환, 혹은, 도46의 생물학적 기능 카테고리 및/또는 문헌에 근거하는 생물학적 기능의 란에 기재된 유전자에 관련되는 생물학적 기능에 관계하는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해서 유용하다.

본 발명의 의약조성물은 보다 바람직하게는, 이하 1)~9)중 어느 하나에 속하는 유전자가 관여하는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해서 유용하다,

1) 아포토시스에 관여하고 있는 유전자;

2) 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자;

3) 세포주기에 관여하고 있는 유전자;

4) 수용체에 관여하고 있는 유전자;

5) 이온채널에 관여하고 있는 유전자;

6) 시그널 전달계에 관여하고 있는 유전자;

7) 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자;

8) 전사 제어에 관여하고 있는 유전자; 혹은

도46의 「생물학적 기능 카테고리」의 란은 상기 9개의 카테고리에 분류한 생물학적 기능을 기재했다. 상기 1)~9)의 각 그룹에 속하는 유전자가 보다 상세하 게 어떤 생물학적 기능을 가질지에 대해서, 도37~도45에 각 유전자와 유전자 온톨러지에 있어서의 GO_ID와의 관계를 분명히 했다. 도37~도45에 기재된 7자리수의 수치는 각 그룹에 속하는 유전자 온톨러지에서의 속성(구체적으로는, ID번호)을 나타낸다.

유전자 온톨러지에 대해서는, 예를 들면, Gene Ontology Consortium, "Gene Ontology Consortium 홈페이지", [online], 1999년, Gene Ontology Consortium, [평성 16년 10월25일 검색], 인터넷 ＜URL:http://www.geneontology.org/＞을 참조하기 바란다.

유전자 온톨러지에 있어서는, 예를 들면, 「signal transducter activity(GO:0004871)」「receptor activity(GO:0004872)」와 같은 유전자의 속성이 정의되고 있고, 아울러, 「receptor activity라는 속성은 signa1 transducter activity라는 속성을 계승한다」라는 것과 같은 속성간의 계승 관계가 정의되어 있다. 속성의 정의 및 속성간의 계승 관계는 진·온톨러지·콘소시엄:Gene Ontology Consortium(http://www.geneontology.org/)으로부터 입수가능하다. 또한, 인간이나 마우스의 각 유전자와 Gene Ontology의 속성과의 대응관계는 캔서·게놈·어나토미·프로젝트:Cancer genome Anatomy project(http://cgap.nci.nih.gov/) 등 각종 데이타베이스로부터 입수가능하다.

유전자의 Gene Ontology와의 대응 데이타로부터, 예를 들면, 인간 ZYX유전자(NM_003461)는 receptor, activity를 가지는 것을 알고, 또한 속성간의 계승 관계를 이용하여, ZYX유전자는 동시에 signal transducter activity를 가지는 것을 이 끌어낼 수 있다.

유전자 온톨러지에서는, 유전자의 속성(annotation)에 대해서, 각 속성의 정의나 속성간의 계승 관계의 정의가 되어 있다. 이 유전자의 온톨러지에 있어서의 속성간의 계승 관계는 비순환 유향(有向) 그래프(DAG)를 형성한다. 유전자 온톨러지에서는 「유전자의 기능(molecular function)」, 「생물학적 현상(biological process)」, 「세포내 국재(cellular component)」에 의해 유전자를 분류·정리하고 있다. 그리고, 각 분류 방법에 있어서, 속성간의 계승 관계가 정의되어 있다. 유전자 온톨러지에 있어서의 속성의 ID번호를 알면, 당업자는 해당 번호로부터 각속성의 내용을 파악하는 것이 가능하다.

또한, 도46에서는, 상기의 유전자 온톨로지에 관계한 9개의 생물학적 기능 카테고리 이외에, 문헌으로부터 취득된 각 유전자의 생물학적 기능 정보에 대해서도 기재하고 있다. 구체적으로는, 「문헌에 근거하는 생물학적 기능」의 란에, PubMed에서 취득되는 문헌에 근거한 각 유전자의 생물학적 기능 정보를 기재했다.

더욱 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 의약조성물은 보다 바람직하게는 도46의 서열번호(인간) 또는 서열번호(마우스)의 란에 기재된 서열번호의 어느 하나의 염기서열을 표적서열로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 각 폴리뉴클레오티드는 표적서열이 기재된 정리 번호와 같은 정리 번호의 「관련 질환명」의 란에 기재된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 혹은, 같은 정리 번호의 「생물학적 기능 category」 또는, 「문헌에 근거하는 생물학적 기능」의 란에 기재된 생물학적 기능의 조절(예를 들면, 억제 및 촉진), 해당 생물학적 기능이 관여하는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

본 명세서에 있어서, 후술하는 실시예8의 표1은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 구체적으로는, 이러한 폴리뉴클레오티드에 상당하는 siRNA의 센스가닥(표1중의 「siRNA-센스」의 란에 염기서열을 기재), 안티센스가닥(표1중의 「siRNA-안티센스」의 란에 염기서열을 기재: 다만, 여기에서는 3'에서 5'방향으로 서열을 나타낸다), 해당 siRNA의 RNAi대상이 되는 표적유전자(표1중의 「유전자명」의 란에 기재) 및 해당 유전자에 있어서의 표적서열의 위치를 나타내고 있다. 표1에 나타내는 것과 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 siRNA-센스 또는 siRNA-안티센스로서, 표1의 「유전자명」의 란에 기재된 유전자에 대하여 RNAi효과를 생기게 하고, 그것에 의해, 해당 유전자의 발현을 유의하여 억제했다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약조성물은 표1의 「유전자명」의 란에 기재된 유전자에 관련되는 질환, 구체적으로는, 도46의 「관련 질환명」의 란에 기재한 해당 유전자에 대응하는 질환이나, 도46의 「생물학적 기능 카테고리」의 란 및/또는 「문헌에 근거하는 생물학적 기능」의 란에 기재한 해당 유전자에 대응하는 생물학적 기능에 관련되는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 유용하다.

실시예8에 있어서, siRNA의 표적으로 한 서열(표1의 「표적서열」의 란 참조)은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 표적이 되는 표적서열 중, 도46에 나타내는 53998종의 표적서열 중에서 무작위적으로 선택한 것이다. 후술하는 것과 같이, 여기에서는 선택한 모든 표적서열에 있어서, RNAi효과가 확인되었다. 이렇게 얻어지는 실시예8에서의 결과를 통계학의 「모비율을 추정하는 방법」에 근거해 처 리한 바, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 구체적으로는, 서열번호47~817081에 나타내는 표적유전자의 규정서열과 상동인 서열을 2가닥 영역의 한쪽 가닥에 포함하는 폴리뉴클레오티드)이 표적유전자의 발현억제 효과를 나타내는 것은 통계적으로 타당하고, 또한, 특히, 상기 규정서열이 도46에 나타내는 53998종의 서열중 어느 하나인 폴리뉴클레오티드를 이용한 경우에는, 그것의 거의 전부가 표적유전자의 발현억제 효과를 나타내는 것은 통계적으로 타당하다고 하는 것이 분명해졌다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 표적이 되는 유전자는 도46기재의 질환중 어느 것에 관련하는 것이어도 좋지만, 특히, 방광암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 구강암, 피부암, 갑상선암을 포함하는 각종 암에 관련된 유전자라면 해당 유전자의 발현억제 효과에 의해 이들 각종 암을 치료 또는 예방하는 것이 가능해진다. 따라서, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 의약조성물은, 이것들로부터 선택되는 어느 하나의 암을 치료 또는 예방하기 위해 유용하다.

본 발명의 의약조성물은, 가장 바람직하게는, 서열번호817102~817651중 어느하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 각 폴리뉴클레오티드는 표적이 되는 유전자(표1의 「유전자명」의 란 참조)의 발현을 억제할 수 있기 때문에 해당 유전자에 관련되는 질환(구체적으로는, 해당 유전자에 관한 도46의 「관련 질환」의 란 참조)이나, 해당 유전자의 생물학적 기능(구체적으로는, 해당 유전자에 관한 도46의 「생물학적 기능 카테고리」 및/또는 「문헌에 근거하는 생물학적 기능」의 란 참조)에 관련되는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 이들 서열번호 의 염기서열에 대하여 상술한 것과 같은 미스매치 등의 변이를 갖는 서열도 RNAi효과를 손상하지 않는 범위에 있어서 이용가능하다.

후술의 실시예1~8에 있어서, 본 발명에 따른 선택방법을 따라 선택된 다수의 폴리뉴클레오티드가 유의한 RNAi효과를 나타내는 것이 실증되었다. 따라서, 공통되는 규칙에 따라 선택되는 폴리뉴클레오티드가 동일한 RNAi효과를 나타내는 것은 당업자에게 있어서 용이하게 이해된다. 또한, 해당 규칙의 유효성은 전술한 통계적인 처리 결과로부터도 분명하다. 따라서, 예를 들면, 표1기재의 유전자에 있어서, 구체적으로 개시된 표적서열의 표적위치와는 다른 위치로부터, 개시된 표적서열과는 다른 서열을 본 발명에 따라 동일한 유전자중에서 선택하면, 동일한 유전자에 대하여 동일한 유전자발현억제 효과가 얻어지는 것은 용이하게 이해된다. 또한, 어떤 질환에 관여하는 유전자의 발현의 억제 효과가 나타나면, 본 발명에 따라 표적서열을 선택해서 폴리뉴클레오티드를 작성하면, 같은 질환에 관여하는 다른 유전자에 대해서도, 발현의 억제 효과에 근거하는 질환의 치료 및/또는 예방이 용이하게 이해된다.

아울러, 본 발명의 실시예7은 표적서열과 완전히 상동인 서열을 포함하는 유전자이외의 다른 유전자이어도, 해당 다른 유전자가 소수, 바람직하게는 2염기 이하의 미스매치를 갖는 유사서열을 포함하는 경우, 해당 유사서열 부분이 RNA간섭의 표적이 될 수 있는 것을 나타냈다. 따라서, 표적서열과 완전히 상동인 서열을 포함하는 유전자 이외의 유사서열을 포함하는 다른 유전자도, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 표적대상이 되어 RNA간섭에 근거하는 발현억제 효과가 기대된다. 따라서, 본 발명의 의약조성물은 이들 유전자가 관여하는 질환에 대한 치료·예방을 위해서 유용하다.

RNAi를 생기게 하는 폴리뉴클레오티드를 의약조성물에 이용하는 경우에는, 제약상 허용될 수 있는 담체 또는 희석제와 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 배합해서 의약조성물로서 이용해도 좋다. 이 경우의 유효성분의 담체 또는 희석제에 대한 비율은 약 0.01~약 99.9중량％의 사이이다.

상기의 담체 또는 희석제는 기체, 액체, 고체이어도 좋다. 예를 들면, 담체는, 수성 또는 알코올성의 액제나 현탁제, 유성의 액제나 현탁제, 수중유형이나 유중수형유제, 소수성 담체, 액체비히클, 미결정 등이어도 좋다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 의약조성물은, 예를 들어, 다른 치료용 약제, 계면활성제, 충전제, 완충제, 분산화제, 항산화제, 보존제중 적어도 하나를 더 포함해도 좋다. 이러한 의약조성물은 경구, 구내, 폐내, 직장내, 자궁내, 종양내, 두개내, 비용(鼻用), 근육내, 피하, 혈관내, 초내, 경피, 피내, 관절내, 강내(腔內), 접안용, 질용, 안용, 정맥내, 선내, 조직내, 림프관내, 매립형, 흡입형, 서방용 및 장용성 피복의 제제이어도 좋다.

예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 이용한 경구제제는 분말제, 당의환제, 타블렛, 캡슐제, 시럽제, 에어로졸제, 액제, 현탁제, 수중유형이나 유중수형 유제인 유제이어도 좋다. 또한, 국소제제로서, 담체가 크림제, 겔제, 연고제, 시럽제, 에어로졸제, 패치제, 액제, 현탁제, 유제이어도 좋다. 또한, 주사용 제제나 경피용 제제로서, 담체가 수성 및 알코올성의 액제나 현탁제, 유성의 액제나 현탁제, 수중유 형이나 유중수형 유제이어도 좋다. 또한 직장용 제제, 좌제이어도 좋다. 또한, 임플란트, 캡슐 또는 캇트리지로 공급되는 제제, 호흡용 또는 흡입용 제제, 에어로졸제이어도 좋다.

이러한 폴리뉴클레오티드를 이용한 의약조성물의 투여량은 환자의 증상, 연령, 체중 등에 따라 적절하게 선택된다. 또한, 피도입체로의 투여 방법으로서, 피도입체가 세포나 조직인 경우는 칼슘포스페이트법, 일렉트로포레이션(electroporation)법, 리포펙션(lipofection)법, 바이러스 감염, 폴리뉴클레오티드 용액침지법 등을 이용할 수 있고, 또한, 배(胚)에 도입하는 경우는 마이크로 인젝션법이나 일렉트로포레이션법이나 바이러스 감염 등을 이용할 수 있다. 투여에는 종래부터 이용되고 있는 시판의 시약, 기기, 장치, 키트 등을 이용해도 좋고, 예를 들면, TransIT(등록상표)-In Vivo Gene Delivery System이나 TransIT(등록상표)-QR Hydrodynamic Delivery Solution(모두 다카라바이오 주식회사제) 등의 도입 시약을 이용해서 생체내 세포로의 투여를 행해도 좋다. 또한, 바이러스 감염에 의한 방법으로서는 레트로바이러스 벡타(예를 들면, BD Biosciences Clontech사제의 RNAi Ready pSIREN-RetroQ Vector 등)나 아데노바이러스 벡타(예를 들면, 같은 회사제의 BD Knockout Adenoviral RNAi System 등)나 렌치 바이러스 벡타(예를 들면, 다카라 바이오 주식회사제의 레트로렉틴 등)을 이용해도 좋다.

피도입체가 식물인 경우에는, 식물체의 체강 또는 간질세포 등으로의 주입 또는 분무에 의한 방법 등을 이용할 수 있다. 또한, 피도입체가 동물개체인 경우에는 경구, 비경구, 경질, 경직장, 경비, 경안, 복막내 투여 등의 방법을 이용할 수 있다. 이러한 투여 방법에 의해, 1종 또는 2종 이상의 폴리뉴클레오티드가 동시 또는 시기를 달리하여, 전신 또는 국소적으로 투여된다. 경구투여의 예로서, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 도입한 약제 또는 식품을 직접 섭취해도 좋다. 또한, 경구, 경비투여의 예로서, 예를 들면, 흡입 장치를 이용해서 투여를 행해도 좋다. 또한, 비경구투여의 예로서, 예를 들면, 침(針) 또는 침이 없는 주사기를 이용하여, 피하, 근육내, 정맥내 등에 투여를 행해도 좋다.

＜9＞유전자발현억제용 조성물

본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자발현억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 밝혀진 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 각 표적서열을 포함하는 유전자에 대하여 발현억제 효과를 나타낸다. 해당 유전자의 발현억제에 의해, 해당 유전자의 생물학적 기능이 조절, 바람직하게는 억제된다.

바람직하게는, 표적유전자는 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환중 어느 하나의 질환에 관련된다.

바람직하게는, 표적유전자는 도46의 유전자명의 란에 기재된 유전자중 하나이다.

혹은, 표적유전자가, 이하 1)~9)중 어느 하나에 속하는 유전자이다:

1) 아포토시스에 관여하고 있는 유전자;

2) 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자;

3) 세포주기에 관여하고 있는 유전자;

4) 수용체에 관여하고 있는 유전자;

5) 이온채널에 관여하고 있는 유전자;

6) 시그널 전달계에, 관여하고 있는 유전자;

7) 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자;

8) 전사 제어에 관여하고 있는 유전자; 혹은

상기 의약조성물의 항에 있어서 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드(구체적으로는 siRNA)는 RNAi효과가 생기는 것이 실시예8의 결과 및 통계적 처리 결과에서 분명하다. 특히, 후술의 실시예8에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 표1의 유전자명의 란에 기재된 모든 유전자에 관해서 mRNA의 발현억제 효과(즉 RNAi효과)을 나타내는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자발현억제용 조성물은 도46에 나타내는 표적유전자중 어느 하나를 표적으로해도 좋지만, 보다 바람직하게는, 표적유전자가 표1의 유전자명의 란에 기재된 유전자중 어느 하나이다. 표1의 각 유전자에 대하여는 바람직하게는, 같은 행에 기재된 siRNA-센스 또는 siRNA-안티센스의 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 염기서열에 대하여 상술한 바와 같은 미스매치 등의 이변을 갖는 서열도, 발현억제 효과를 손상하지 않는 범위에 있어서 이용가능하다.

표적유전자가 표1의 유전자중 하나라면, 해당 유전자에 관련되는 질환(구체적으로는, 해당 유전자에 관한 도46의 「관련 질환」의 란 참조)이나, 해당 유전자의 생물학적 기능(구체적으로는, 해당 유전자에 관한 도46의 「생물학적 기능 카테 고리」 및/또는 「문헌에 근거하는 생물학적 기능」의 란 참조)에 관련되는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

예를 들면, 본 발명에 따른 유전자발현억제용 조성물의 표적이 되는 유전자는 도46에 기재된 질환중 어느 것에 관련되는 것이어도 좋지만, 특히, 방광암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 구강암, 피부암, 갑상선암을 포함하는 각종 암에 관련된 유전자라면, 해당 유전자의 발현억제 효과에 의해 이들의 각종 암을 치료 또는 예방하는 것이 가능해진다. 따라서, 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 의약조성물은 이들로부터 선택되는 어느 하나의 암을 치료 또는 예방하기 위해 유용하다.

본 명세서에 있어서 후술하는 실시예2~5에서는, 인간비멘틴, 루시퍼라제, SARS바이러스 등의 유전자에 대한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 RNAi효과를 mRNA의 대조에 대한 상대적 발현량으로 조사했다. 도31, 32 및 35는 mRNA의 발현량을 정량PCR로 측정한 결과가 나타내져 있다. mRNA의 상대 발현량은 도31, 32 및 35에 있어서 각각, 약 7~8％(실시예2, 도31), 약12~13％(실시예3, 도32), 수％~약 15％ 미만(실시예5, 도35)로 감소하고, 각 유전자의 발현억제 효과가 확인되었다. 또 실시예4의 도34는 RNAi효과로서의 mRNA의 발현량을 루시퍼라제 활성으로 조사한 결과이지만, 동일하게, 대조와 비교해서 수％~약 20％ 미만으로 감소했다.

또한, 실시예8에서는, 관련 질환이나 생물학적 기능이 분명하게 된 도46에 나타내는 유전자 중, 무작위적으로 선택한 약 300종의 유전자에 대해서, 인간 유래 HeLa세포에서의 mRNA의 발현량을 상대적 발현량으로 조사했다. 표1에서 나타낸 바 와 같이, 해당 유전자의 발현억제 효과, 즉 RNAi효과를 평가하기 위해서 산출한 후술의 RQ값은, 모두 1미만이며, 거의 모두가 0.5 미만이었다.

본 발명의 유전자발현억제용 조성물에 있어서, 「표적유전자의 발현억제」라는 것은 표적유전자의 mRNA발현량이 실질적으로 감소하는 것을 의미한다. mRNA 발현량이 실질적으로 감소하고 있으면, 그 변화의 폭의 대소에 관계없이, 발현억제가 실현되어 있다. 상기와 같은 실시예2~5 및 실시예8의 결과를 근거로, 본 발명의 유전자발현억제 조성물은 표적유전자의 mRNA발현량을 바람직하게는 적어도 50％이하로 감소시키는 것이 분명하다.

＜10＞치료 또는 예방 방법

본 발명은, 또한, 의약적으로 유효한 양의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법.

[다른 실시형태]

그런데, 지금까지 본 발명의 실시형태에 대해서 설명했지만, 본 발명은 상술한 실시형태 이외에도, 청구의 범위에 기재된 기술적 사상의 범위 내에 있어서 여러 가지의 다른 실시형태에서 실시되어서 바람직한 것이다.

예를 들면, 염기서열 처리장치(100)가 스탠드 얼론의 형태로 처리를 행하는 경우를 일례로 설명했지만, 염기서열 처리장치(100)와는 별광체로 구성되는 클라이언트 단말로부터의 요구에 따라 처리를 행하고, 그 처리 결과를 해당 클라이언트 단말에 반환하도록 구성해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 클라이언트 단말은 RNA간섭의 표적유전자의 명칭(예를 들면, 유전자명, 엑세션번호 등) 또는 표적유전자에 관한 염기서열 정보를 염기서열 처리장치(100)에 송신하고, 염기서열 처리장치(100)는 해당 명칭에 대응하는 염기서열 정보 또는 클라이언트 단말로부터 송신된 염기서열 정보에 대하여 제어부(102)에서 행하여지는 상술한 각 처리를 행하고, 표적유전자에 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 규정서열 정보를 선택해서 클라이언트 단말에 송신해도 좋다. 이 경우, 예를 들면, 퀘리의 유전자에 대하여 공공 데이타베이스로부터 서열 정보를 취득해서 siRNA를 선택해도 좋고, 또한, 예를 들면, 미리 전체 유전자의 siRNA를 계산해서 기억해 두고, 클라이언트 단말로부터의 요구(유전자의 명칭 또는 엑세션 번호 등)에 대하여 바로 siRNA를 선택하고, 선택한 siRNA를 클라이언트 단말에 돌려주어도 좋다.

또한, 염기서열 처리장치(100)는 표적유전자와는 무관계의 유전자에 대한 규정서열 정보의 특이성을 확인해도 좋다. 이것에 의해, 표적으로 하는 유전자에만 특이적으로 RNA간섭을 생기게 하는 규정서열 정보를 선출하는 것이 가능하다.

또한, 클라이언트 단말과 염기서열 처리장치(100)로 구성되는 본 시스템에는, 예를 들면, 웹페이지의 이용자에게서, siRNA의 RNA간섭 효과(예를 들면, 「듣는다」, 「듣지 않는다」등)의 결과를 웹상에서 피드백하게 해, 이용자에게서 피드백된 실험예를 염기서열 처리장치(100)에 축적하고, 상술한 RNA간섭에 유효한 siRNA의 서열 규칙성을 개선하기 위한 인터페이스 기능을 도입해도 좋다.

또한, 염기서열 처리장치(100)는 규정서열 정보로부터 siRNA의 센스가닥의 염기서열 정보 및 해당 센스가닥과 상보적(complementary)인 안티센스가닥의 염기 서열 정보를 계산해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 염기서열 처리장치(100)는 상술한 각 처리의 결과, 규정서열의 양단에 각 2염기의 오버행부를 부가한 23염기의 서열 정보로서 「caccctgacccgcttcgtcatgg」를 선택했을 경우, 센스가닥의 염기서열 정보 「5'-CCCUGACCCGCUUCGUCAUGG-3'」 및 안티센스가닥의 염기서열 정보 「5'-AUGACGAAGCGGGUCAGGGUG-3'」을 계산한다.

이것에 의해, 폴리뉴클레오티드를 발주할 때에 센스가닥, 안티센스가닥을 수작업으로 정리할 필요가 없어지고, 편리성이 높아진다.

또한, 실시형태에 있어서 설명한 각 처리 중, 자동적으로 행하여지는 것으로서 설명한 처리의 전부 또는 일부를 수동적으로 할 수도 있고, 혹은, 수동적으로 행하여지는 것으로서 설명한 처리의 전부 또는 일부를 공지의 방법으로 자동적으로 행할 수도 있다.

그 밖에, 상기 문서중이나 도면중에서 나타낸 처리 순서, 제어 순서, 구체적 명칭, 각종의 등록 데이타나 검색 조건 등의 파라메타를 포함하는 정보, 화면예, 데이타베이스 구성에 대해서는, 특별히 기재하는 경우를 제외하고 임의로 변경할 수 있다.

또한, 염기서열 처리장치(100)에 관해서, 도시의 각 구성 요소는 기능 개념적인 것이며, 반드시 물리적으로 도시한 것과 같이 구성되어 있을 것을 요하지 않는다.

예를 들면, 염기서열 처리장치(100)의 각부 또는 각 장치가 대비하는 처리 기능, 특히 제어부(102)에서 행하여지는 각 처리 기능에 대해서는, 그 전부 또는 임의의 일부를, CPU(Central Processing Unit) 및 해당 CPU에서 해석 실행되는 프로그램에서 실현할 수 있고, 혹은, 위어드 로직(wired logic)에 의한 하드웨어로서 실현하는 것도 가능하다. 또한, 프로그램은 후술하는 기록 매체에 기록되어 있고, 필요에 따라서 염기서열 처리장치(100)로 기계적으로 읽혀진다.

즉, ROM 또는 HD 등의 기억부(106) 등에는, OS(Operating System)와 협동해서 CPU에 명령을 주고, 각종처리를 하기 위한 컴퓨터 프로그램이 기록되어 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 RAM등에 로드 되는 것에 따라 실행되어, CPU와 협동해서 제어부(102)를 구성한다. 또한, 이 컴퓨터 프로그램은 염기서열 처리장치(100)에 대하여 임의의 네트워크(300)를 통해서 접속된 어플리케이션 프로그램 서버에 기록되어도 좋고, 필요에 따라서 그 전부 또는 일부를 다운로드하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 프로그램을 컴퓨터가 읽고 이해할 수 있는 기록 매체에 저장할 수도 있다. 여기에서, 이 「기록 매체」라는 것은 플렉서블 디스크(flexible disk), 광자기 디스크, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, DVD, 플래시 디스크 등 임의의 「가반용 물리매체」나, 각종 컴퓨터 시스템에 내장되는 ROM, RAM, HD등 임의의 「고정용 물리매체」, 혹은, LAN, WAN, 인터넷으로 대표되는 네트워크를 통해서 프로그램을 송신하는 경우인 통신회선이나 반송파와 같이, 단기로 프로그램을 유지하는 「통신 매체」를 포함하는 것으로 한다.

또한, 「프로그램 」이라는 것은 임의의 언어나 기술 방법에서 기술된 데이타 처리 방법이며, 소스 코드(source code)나 바이너리 코드(binary code) 등의 형식을 묻지 않는다. 또한, 「프로그램」은 반드시 단일적으로 구성되는 것에 한정되 지 않고, 복수의 모듈이나 라이브러리(library)로서 분산 구성되는 것이나, OS(Operating System)로 대표되는 별개의 프로그램과 협동해서 그 기능을 달성하는 것도 포함한다. 또한, 실시형태에 나타낸 각 장치에 있어서 기록 매체를 읽어내기 위한 구체적인 구성, 읽는 순서, 혹은 읽은 후의 인스톨 순서 등에 대해서는, 주지의 구성이나 순서를 이용할 수 있다.

기억부(106)에 저장되는 각종 데이타베이스 등(표적유전자염기서열 파일(106a)~표적유전자 어노테이션 데이타베이스(106h))은 RAM, ROM 등의 메모리 장치, 하드 디스크 등의 고정 디스크 장치, 플렉서블 디스크·광디스크 등의 저장 수단이며, 각종 처리나 웹 사이트 제공에 이용하는 각종의 프로그램이나 테이블이나 파일이나 데이타베이스나 웹페이지용 파일 등을 저장한다.

또한, 염기서열 처리장치(100)는 기지의 퍼스널 컴퓨터, 워크스테이션 등의 정보처리 단말 등의 정보처리장치에 프린터나 모니터나 이미지 스캐너 등의 주변 장치를 접속하고, 해당 정보처리장치에 본 발명의 방법을 실현시키는 소프트웨어(프로그램, 데이타 등을 포함한다)를 설치하는 것에 의해 실현해도 좋다.

또한, 염기서열 처리장치(100) 등의 분산·통합의 구체적 형태는 명세서 및 도면에 나타내는 것에 한정되지 않고, 그 전부 또는 일부를, 각종의 부하 등에 따른 임의의 단위로, 기능적 또는 물리적으로 분산·통합해서 구성할 수 있다(예를 들면, 그리드·컴퓨팅 등). 예를 들면, 각 데이타베이스를 독립한 데이타베이스 장치로서 독립적으로 구성해도 좋고, 또한, 처리의 일부를 CGI(Common Gateway Interface)를 이용해서 실현해도 좋다.

또한, 네트워크(300)는 염기서열 처리장치(100)와 외부 시스템(200)을 서로 접속하는 기능을 갖고, 예를 들면, 인터넷이나, 인트라넷이나, LAN(유선/무선의 쌍방을 포함한다)이나, VAN이나, 피시통신망이나, 공중 전화망(아날로그/디지털의 쌍방을 포함한다)이나, 전용 회선망(아날로그/디지털의 쌍방을 포함한다)이나, CATV망이나, IMT2000방식, GSM방식 또는 PDC/PDC-P 방식 등의 휴대 회선교환망/휴대 패킷 교환망이나, 무선호출망이나, Bluetooth 등의 국소무선망이나, PHS망이나, CS, BS 또는 ISDB 등의 위성통신망 등 중 어느 하나를 포함해도 좋다. 즉, 본 시스템은 유선·무선을 묻지 않고 임의의 네트워크를 통하여, 각종 데이타를 송수신할 수 있다.

이하, 실시예에 근거하여, 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1]

＜1＞RNAi효과를 측정하기 위한 유전자, 발현 벡터

siRNA에 의한 RNAi효과를 측정하기 위한 표적유전자로서는 반디(Photinus pyralis, P.pyralis)의 1uciferase(luc)유전자(P.pyralis luc유전자:accession number=U47296)를 이용하고, 이를 포함하는 발현 벡터로서는 pGL3-Control벡터(Promega사제)를 이용했다. P.pyralis luc유전자단편은 이 벡터중에서 SV40의 프로모터와 폴리A시그널로 끼워진 형태로 되어 있다. 또한, 내부 컨트롤 유전자는 우미시이타케(Renilla reniformis, R. reniformis)의 1uc유전자를 이용하고, 이를 포함 하는 발현 벡터로서 pRL-TK(Promega사제)를 이용했다.

＜2＞21염기 2가닥RNA(siRNA)의 합성

21염기 센스가닥과 21염기 안티센스가닥 RNA(도9에 나타나 있는 위치의 것;a~p)는 히타치계측기 서비스 주식회사를 통해서 젠셋토주식회사에 합성을 위탁했다.

P.pyralis luc 유전자의 발현을 저해하기 위해 이용한 2가닥RNA는, 센스가닥과 안티센스가닥을 회합시키는 것으로 제작했다. 회합은 센스가닥RNA와 안티센스가닥RNA를 10mM Tris-HCl(pH7.5), 20mM NaCl반응액중에서 90℃, 3분간 가열하고, 37 ℃에서 1시간 인큐베이터하고, 그 후, 실온이 될 때까지 방치하는 것으로 행하였다. 2가닥 폴리뉴클레오티드의 형성은 TBE완충액 중에서의 2％ 아가로스겔에서의 전기영동에서 검정하지만, 상기 조건에서는 거의 모든 1가닥 폴리뉴클레오티드가 2가닥 폴리뉴클레오티드로 회합하고 있었다.

＜3＞포유류세포배양법

포유류배양세포로서는, 인간의 HeLa세포와 HEK293세포, 차이니이즈 햄스터의 CHO-KI세포(RIKEN Cell bank)를 이용했다. 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium(Gibco BRL사제)에 비동화 10％ 소태아혈청(Mitsubishi Kasei사제) 및 항생 물질로서 penicillin(Meiji사제) 10units/ml, streptomycin(Meiji사제)50㎍/ml를 첨가한 것을 이용했다. 37℃, 5％ CO₂ 존재 하에서 배양했다.

＜4＞포유류배양세포로의 표적유전자, 내부 컨트롤 유전자, siRNA의 배양세 포로의 트랜스펙션

포유류세포는 0.2~0.3×10⁶cells/ml의 농도로 24구멍 플레이트에 뿌리고, 1일 후에 Ca-phosphate침전법(세포공학 핸드북, 쿠로키토시오 등 편, 양토사 (1992))으로 1.0㎍ pGL3-Control DNA, 0.5 또는 1.0㎍ pRL-TK DNA 및 0.01, 0.1, 1, 10, 100nM의 각 siRNA를 도입했다.

＜5＞초파리세포배양법

초파리배양세포로서는 S2세포(Schneider, 1., et al., J. Embryol. Exp. Morph., 27, 353~365(1972))를 이용했다. 배지는 Schneider's Drosophila medium(GibcoBRL사제)에 비동화 10％ 소태아혈청(Mitsubishi Kasei사제) 및 항생물질로서 penicillin(Meiji사제)10units/ml, streptomycin(Meiji사제)50㎍/ml를 첨가한 것을 이용했다. 25℃, 5％ CO₂존재 하에서 배양했다.

＜6＞초파리배양세포로의 표적유전자, 내부 컨트롤 유전자, siRNA의 배양세포로의 트랜스펙션

이 S2세포는 1.0×10⁶cells/ml의 농도로 24구멍 플레이트에 뿌리고, 1일 후에 Ca-phosphate침전법(세포공학 핸드북, 쿠로키 토시오 등 편, 양토사(1992))로 1.0㎍ pGL-3 Control DNA, 0.1㎍ pRL-TK DNA 및 0.01, 0.1, 1, 10, 100nM의 각siRNA를 도입했다.

＜7＞RNAi효과의 측정

siRNA를 트랜스펙션한 세포는 트랜스펙션 후 20시간 후에 회수하고, Dual- Luciferase Reporter Assay System(Promega사제)을 이용하여, 2종류의 루시퍼라제(P. pyralis luc 및 R.reniformis luc) 단백의 발현량(루시퍼라제 활성)을 측정했다. 발광량의 측정은 Lumat LB9507 luminometer(EG＆G Berthold)를 이용하여 행하였다.

＜8＞결과

루시퍼라제 활성을 측정한 결과를 도10에 나타낸다. 또한, 루시퍼라제 활성과 각 염기서열과의 대응을 검토한 결과를 도11에 나타낸다.

도10중, B로 표시되는 그래프는 초파리에서의 결과이며, C로 표시되는 그래프는 인간에서의 결과를 나타낸다. 도10에 나타낸 바와 같이, 초파리에서는 염기수를 21의 RNA를 제작하는 것에 의해 대부분의 서열에 있어서 루시퍼라제 활성을 억제할 수 있었다. 다른 한편으로, 인간의 경우에 대해서는, 단지 염기수를 21로 한 것 만으로 루시퍼라제 활성을 억제할 수 있는 서열이 얻어지기 어려운 것으로 판명되었다.

그래서, a~p의 RNA의 염기서열의 규칙성을 분석했다. 서열의 분석은 도11에 나타낸 바와 같이, 2가닥RNA의 5개소에 있어서 염기서열을 분석했다. 도11의 표중 최상단의 a의 siRNA에 대해서 보면, 루시퍼라제 상대 활성(RLA)은 0.03, 안티센스가닥에 있어서 3'말단측에서 순차로 보면, 오버행부(OH)의 염기서열이 UC, 계속되는 7염기(도11중 3'-T)중의 G/C함유량(구아닌 또는 시토신의 함유량)은 57％, 더 계속되는 5염기(도11중M)의 G/C함유량은 20이며, 더 계속되는 7염기(도11중 5'-T)의 G/C함유량은 14％이며, 5'말단은 U이며, 합계의 G/C함유량은 32％이다.

표 중, RLA의 값이 낮을 수록, RLA의 활성이 낮고, 즉 루시퍼라제의 발현이 억제된 것을 나타낸다.

이 결과로부터, RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 3'말단이 아데닌 또는 우라실이며, 5'말단이 구아닌 또는 시토신인 확률이 극도로 높은 것이 밝혀졌다. 또한, 3'말단측의 7염기에 있어서는 아데닌 또는 우라실이 풍부한 상태인 것이 밝혀졌다.

[실시예2]

1. 표적발현 벡터-pTREC의 구축

하기와 같이 해서 표적발현 벡터를 구축했다. 표적발현분자는 RNAi의 표적이 되는 서열(이하, 「표적서열」로 부르는 경우가 있다)을 갖는 RNA를 발현시키는 분자이다.

pCI-neo(GenBank Accession No.U47120, 프로메가사제)의 CMV 인핸서/프로모터 하류에 표적mRNA서열을 구축했다(도25). 즉, 코작서열(Kozak), ATG서열, 표적이 되는 23염기쌍 서열 클로닝 사이트(target) 및 재조합을 위한 제한 효소(NheI, EcoRI, XhoI)인식 서열을 갖는 하기의 2가닥 올리고머를 합성했다. 2가닥 올리고머는 서열표의 서열번호1에 나타내는 서열과 그 상보적인 서열로 이루어진다. 합성한 2가닥 올리고머를 pCI-neo의 NheI, XbaI사이트에 삽입하여, 표적발현 벡터-pTREC를 구축했다(도25). 또한, 인트론은 pCI-neo에 당초부터 갖추어져 있는 β-글로빈 유래의 인트론 부위를 이용했다.

5'-gctagccaccatggattcacgcgtctcgagtctaga-3' (서열번호1)

도25에 나타내는 pTREC는 프로모터 및 인핸서(pro/enh)와 PCR프라이머에 대응하는 영역PAR(F)1 및 PAR(R)1을 갖출 수 있다. PAR(F)1에는 인트론(Intron)이 끼워져 있고, 발현 벡터 자체가 PCR의 주형으로 되지 않도록 설계되어 있다. pTREC는 RNA의 전사 후, 진핵생물의 배양세포 등의 스플라이싱이 행하여지는 환경하에서, 인트론 부위가 제거되어 PAR (F)1이 연결된다. pTREC로부터 형성된 RNA는 RT-PCR에 의해 증폭할 수 있다. 인트론은 pCI-neo에 당초부터 갖추어져 있는 β-글로빈 유래의 인트론 부위를 이용했다.

pTREC에는 컨트롤로서 네오마이신 내성유전자(neo)가 갖추어져 있어, 네오마이신 내성유전자내의 서열의 일부에 대응하는 PCR프라이머를 제작하고, 네오마이신 내성유전자의 일부에 대해서 RT-PCR를 행하므로써 네오마이신 내성유전자를 내부표준 컨트롤(인터널 컨트롤)로서 이용할 수 있다. PAR(F)2 및 PAR(R)2는 네오마이신 내성유전자중의 PCR프라이머 대응영역을 나타낸다. 또한, 도25의 예에 나타내지 않고 있지만, PAR(F)2 또는 PAR(R)2의 적어도 일방에도 인트론을 끼워두는 것도 가능하다.

2. 표적mRNA검출용 프라이머의 효과

(1) 배양세포에의 트랜스펙션

24구멍 플레이트의 1구멍 당 0.2~0.3×10⁶cells의 HeLa세포를 뿌리고, 1일 후에 Lipofectamine2000(lnvitrogen사제)을 이용하여, 메뉴얼에 따라 0.5㎍의 pTREC벡터를 트랜스펙트했다.

(2)세포의 회수 및 mRNA의 정량

트랜스펙션 1일 후 세포를 회수하고, Trizol(lnvitrogen사제)를 사용하여 전체 RNA를 추출했다. 이 RNA 100ng을 사용하여, 올리고(dT)를 프라이머로 하여 SuperScriptII RT(lnvitrogen사제)에 의해 역전사해서 cDNA합성 반응을 행하였다. 컨트롤로서, 역전사 효소를 가하지 않는 것을 준비했다. 얻어진 cDNA의 320분의 1양을 PCR템플릿으로 해서 SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems 사제)를 이용하여, 50㎕의 반응계에서 정량적 PCR을 행하고, 표적mRNA(mRNA(T)로 칭한다) 및 내부 컨트롤로서 pTREC상의 네오마이신 내성유전자에 유래하는 mRNA(mRNA(C)로 칭한다)를 정량했다. 정량적 PCR에는 리얼타임 모니터링 장치ABIPRIZM7000(Applied Biosystems사제)를 이용하고, mRNA(T)의 정량에는 프라이머 쌍 T(서열표 서열번호2, 3), mRNA(C)의 정량에는 프라이머 쌍 C(서열표 서열번호4, 5)을 각각 사용했다.

프라이머 쌍 T:

aggcactgggcaggtgtc (서열번호2)

tgctcgaagcattaaccctcacta (서열번호3)

프라이머 쌍 C

atcaggatgatctggacgaag (서열번호4)

ctcttcagcaatatcacgggt (서열번호5)

도26 및 도27에 PCR의 결과를 나타낸다. 도26 및 도27은 세로축에 각각의 PCR산물을, 가로축에 PCR의 사이클 회수를 잡아, 그래프로 나타낸 것이다. 네오마이신 내성유전자의 경우, 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한 것(+RT)과 역전사 효 소를 가하지 않는 컨트롤(-RT)에서, 얻어진 PCR산물량의 증폭의 차이는 작았다(도 26). 이것은 cDNA뿐만 아니라, 세포내에 남아있는 벡터도 PCR의 주형이 되어서 증폭된 것을 나타낸다.

다른 한편으로, 표적서열mRNA에서는, 역전사 효소를 첨가했을 경우(+RT)와 첨가하지 않는 경우(-RT)에 의한 차이가 컸다(도27). 이 결과는, 프라이머 쌍 T 중 한쪽이 인트론을 끼우는 형태로 디자인되어 있기 때문에, 인트론이 제거된 mRNA에 유래하는 cDNA가 효율적으로 증폭되는 한편, 인트론을 갖는 잔존 벡터가 주형이 되기 어려운 것을 나타내고 있다.

3. siRNA에 의한 표적 mRNA의 발현억제

(1)타겟 발현 벡터에의 평가 서열의 클로닝

인간비멘틴(VIM)유전자(RefSeqID:NM003380)코드영역의 812~834, 35~57에 상당하는 서열을 평가의 대상으로 삼았다. 이들의 서열 및 EcoRI, XhoI의 인식 서열을 갖는 하기 서열표 서열번호6 및 7의 합성 올리고머 뉴클레오티드(평가 서열 프래그먼트)를 제작했다.

평가 서열VIM35(VIM의 35~57에 상당)

5'-gaattcgcaggatgttcggcggcccgggcctcgag-3' (서열번호6)

평가 서열VIM812(VIM의 812~834에 상당)

5'-gaattcacgtacgtcagcaatatgaaagtctcgag-3'（서열번호7)

얻어진 평가 서열 프래그먼트의 양단에 있는 EcoRI, XhoI부위를 이용하여, pTREC의 EcoRI, XhoI부위 사이에, 새로운 표적서열로서 클로닝하여, pTREC-VIM35, pTREC-VIM812를 구축했다.

(2) siRNA의 제작

평가 서열VIM35(서열표 서열번호8, 도28), 평가 서열VIM812(서열번호9, 도 29), 및 컨트롤 서열(siContoro1, 서열번호10, 도 30)에 각각 상당하는 siRNA프래그먼트를 합성하여, 어닐링했다.

하기 siRNA의 각 서열에 있어서는, 3'말단에 오버행부를 설치하였다.

siVIM35 5'-aggauguucggcggcccgggc-3'（서열번호8)

siVIM812 5'-guacgucagcaauaugaaagu-3'（서열번호9)

컨트롤로서, 루시퍼라제 유전자에 대한 siRNA를 이용했다.

siControl 5'-cauucuauccgcuggaagaug-3'（서열번호10)

(3)배양세포로의 트랜스펙션

24구멍 플레이트의 1구멍 당에 0.2~0.3×10⁶cells의 HeLa세포를 뿌리고, 1일 후에 Lipofectamine2000(lnvitrogen사제)을 이용하여, 매뉴얼에 따라 0.5㎍의 pTREC-VIM35 또는 pTREC-VIM812와 각각의 VIM유래 서열에 상당하는 100nM의 siRNA(siVIM35, siVIM812)를 동시에 트랜스펙트했다. 컨트롤 세포에는, 0.5㎍의 pTREC-VIM35 또는 pTREC-VIM812와 100nM의 루시퍼라제 유전자에 대한 siRNA(siControl)를 동시에 트랜스펙트했다.

(4)세포의 회수 및 mRNA의 정량

트랜스펙션 1일 후, 세포를 회수하고, Trizol(lnvitrogen)을 이용해서 전체 RNA를 추출했다. 이 RNA100ng을 이용하여, 올리고(dT)를 프라이머로 해서 SuperScriptII RT(lnvitrogen사제)에 의해 역전사해서 cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA의 320분의 1량을 PCR템플릿으로 해서, SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems사제)를 이용하여 50㎕의 반응계에서 정량적 PCR을 행하고, 평가하고자 하는 VIM유래의 서열을 포함하는 mRNA(mRNA(T)라고 칭한다) 및 내부 컨트롤로서 pTREC상의 네오마이신 내성 유전자에 유래하는 mRNA(mRNA(C)라고 칭한다)를 정량했다.

정량적 PCR에는 리얼타임 모니터링 장치 ABI PRIZM7000(Applied Biosystems사제)을 이용하고, mRNA(T)의 정량에는 프라이머 쌍 T(서열표 서열번호2 및 3), mRNA(C)의 정량에는 프라이머 쌍 C(서열표 서열번호4 및 5)를 각각 사용했다. 얻어진 각각의 mRNA의 값의 비(T/C)를 세로축(표적 mRNA상대량％))으로서 그래프에 나타냈다(도31).

컨트롤 세포의 경우, 루시퍼라제 유전자에 대한 siRNA는 표적mRNA에 효과를 미치지 않기 때문에, T/C비는 거의 1이 되었다. VIM812 siRNA에서는, T/C비가 현저하게 하락하였다. 이것은, VIM 812 siRNA가 상당하는 서열을 갖는 mRNA를 절단 했기 때문이며, VIM812siRNA가 RNAi효과를 갖는다는 것이 판명되었다. 한편, VIM35 siRNA의 경우, T/C비는 컨트롤과 거의 같은 값이라는 것으로부터, VIM35의 서열에는 RNAi효과가 거의 없다는 것이 판명되었다.

[실시예3]

1. siRNA에 의한 내재성 비멘틴의 발현억제

(1)배양세포로의 트랜스펙션

24구멍 플레이트의 1구멍 당 0.2~0.3×10⁶cells의 HeLa세포를 뿌리고, 1일 후에 Lipofectamine2000(lnvitrogen사제)을 이용하여, 매뉴얼에 따라 VIM에 대한 siRNA(siVIM35 또는 siVIM812) 또는 컨트롤siRNA(siControl)100nM, 트랜스펙션효율의 컨트롤로서 0.5㎍의 pEGFP(Clontech사제)를 동시에 트랜스펙트했다. pEGFP는 EGFP가 갖추어져 있다.

(2)내재성 비멘틴mRNA의 측정

트랜스펙션의 3일 후, 세포를 회수하고, Trizol(lnvitrogen사제)을 이용해서 전체 RNA를 추출했다. 이 RNA100ng을 이용하여, 올리고(dT)를 프라이머로 해서 SuperScriptII RT(lnvitrogen사제)에 의해 역전사해서 cDNA합성 반응을 행했다. 얻어진 cDNA산물을 주형으로 해서, 비멘틴에 대한 프라이머VIM-F3-84, VIM-R3-274(서열번호11, 12)를 이용하여 PCR를 행하였다.·

VIM-F3-84;gagctacgtgactacgtcca(서열번호11)

VIM-R3-274;gttcttgaactcggtgttgat(서열번호12)

또한, 컨트롤로서, β-액틴에 대한 프라이머ACTB-F2-481, ACTB-R2-664(서열번호13, 14)를 이용하여 PCR를 행하고, 각 샘플간의 β-액틴의 정량값을 합친 뒤에, 비멘틴의 발현량을 평가했다.

ACTB-F2-481;cacactgtgcccatctacga(서열번호13)

ACTB-R2-664;gccatctcttgctcgaagtc(서열번호14)

결과를 도32에 나타낸다. 도32에서는, siControl(즉, 표적과는 무관계한 서열)을 넣었을 경우를 100％로 하여 비교하여, VIM에 대한 siRNA를 넣었을 경우에 VIM의 mRNA가 어느 정도 감소했는지를 나타내고 있다. siVIM-812는 효과적으로 VIM mRNA를 억제할 수 있는 것에 대해서, siVIM-35을 이용했을 경우는 대개 RNAi효과를 나타내지 않았다.

(3)세포의 항체염색

트랜스펙션의 3일 후, 세포를 3.7％의 포름알데히드에 의해 고정하고, 정법에 의해 블록킹을 행하였다. 그 후, 토끼 항비멘틴항체(α-VIM) 또는 내부 컨트롤로서 토끼항Yes항체(α-Yes)를 가하고, 실온에서 반응시켰다. 그 후, 세포표면을 PBS(Phosphate Buffered Saline;인산완충 생리식염수)로 세정하고, 2차 항체로서 형광표식항토끼IgG항체를 가해 실온에서 반응시켰다. 세포표면을 PBS로 세정한 후, 형광현미경에 의한 관찰을 행하였다.

형광현미경관찰의 결과를 도33에 나타낸다. 도33중, 9개의 각 틀내에 있어서 희게 나타난 부분이 형광부분이다. EGFP 및 Yes에 대해서는, 어느 세포에서도 같은 정도의 발현이 확인되었다. siControl, siVIM35을 도입한 세포에서는, 비멘틴의 항체염색에 의한 형광이 관찰되어, 내재성 비멘틴의 존재가 확인되었다. 한편, siVIM812를 도입한 세포에서는, siControl, siVIM35을 도입한 세포에 비교해서 형광이 현저하게 약했다. 이 결과는 siVIM812에 의해 내재성의 비멘틴mRNA가 간섭을 받은 결과, 비멘틴의 단백질의 발현량이 감소한 것을 나타내는 것이며, siVIM812는 내재성 비멘틴mRNA에도 RNAi효과를 갖는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 엣세이계에서 얻어진 결과 [실시예2]는, 실제로 내재성 유전자에 대하여 각각의 siRNA를 이용한 결과, [실시예3]과 잘 일치하고 있었기 때문에 이 엣세이계는 임의의 siRNA의 RNAi활성을 평가하는 방법으로서 유효한 것으로 판명되었다.

[실시예4]

상기 소정의 규칙(a)~(d)에 근거해서 염기서열을 설계했다. 염기서열의 설계는 상기 siRNA서열 설계 프로그램을 실행하는 염기서열 처리장치에 따라 행하였다. 염기서열은 RNAi활성을 갖는다고 예측되는 서열15종(서열번호15~29)과 RNAi활성을 갖지 않는다고 예측되는 서열5종(서열번호30~34)을 준비했다.

설계된 서열에 근거해서 표적서열 및 평가 대상의 siRNA를 조제하는 이외에는, 상기 실시예1과 동일하게 하여 루시퍼라제 활성을 측정하므로써, RNAi활성의 평가를 행하였다. 결과를 도34에 나타낸다. 루시퍼라제 상대 활성값이 낮은 것이 효과적인 상태, 즉 RNAi활성을 갖춘 siRNA이다.

상기 프로그램에 의해 RNAi활성을 갖는다고 예측된 siRNA는 모두 루시퍼라제의 발현을 효과적으로 억제했다.

[RNAi활성을 나타낸 서열;규정서열 부분, 오버행부를 포함하지 않는다]

5, gacgccaaaaacataaaga(서열번호15)

184, gttggcagaagctatgaaa(서열번호16)

272, gtgttgggcgcgttattta(서열번호17)

309, ccgcgaacgacatttataa(서열번호18)

428, ccaatcatccaaaaaatta(서열번호19)

515, cctcccggttttaatgaat(서열번호20)

658, gcatgccagagatcctatt(서열번호21)

695, ccggatactgcgattttaa(서열번호22)

734, ggttttggaatgtttacta(서열번호23)

774, gatttcgagtcgtcttaat(서열번호24)

891, gcactctgattgacaaata(서열번호25)

904, caaatacgatttatctaat(서열번호26)

1186, gattatgtccggttatgta(서열번호27)

1306, ccgcctgaagtctctgatt(서열번호28)

1586, ctcgacgcaagaaaaatca(서열번호29)

[RNAi활성을 나타내지 않은 서열;규정서열 부분, 오버행부를 포함하지 않는다]

14, aacataaagaaaggcccgg(서열번호30)

265, tatgccggtgttgggcgcg(서열번호31)

295, agttgcagttgcgcccgcg(서열번호32)

411, acgtgcaaaaaaagctccc(서열번호33)

1044, ttctgattacacccgaggg(서열번호34)

[실시예5]

SARS바이러스에 대한 siRNA를 설계하고, 그것들의 RNAi활성을 조사했다. 표 적서열 및 평가 대상의 서열을 각각 변경하는 이외에는, RNAi활성은 상기 실시예2와 동일한 엣세이를 하는 것에 의해 평가했다.

siRNA는 SARS바이러스의 게놈으로부터, 3CL-PRO, RdRp, Spike glycoprotein, Small envelope E protein, MembraneglycoproteinM, Nucleocapsid protein, s2m motif의 각처에 대해서, 상기 siRNA서열 설계 프로그램을 이용해 소정의 규칙성에 합치하는 것을 설계했다.

도35 엣세이의 결과, 규칙성에 합치하도록 설계한 11개의 siRNA는 각각 대응하는 siRNA의 서열을 타겟으로 해서 짜넣은 RNA를 효과적으로 억제했다. siControl(SARS와는 관계가 없는 서열)을 넣었을 경우를 100％로 해서, SARS의 각siRNA를 넣었을 경우의 상대 표적mRNA량을 나타낸다. 각 siRNA를 넣었을 경우, 표적의 RNA가 10％정도 혹은 그 이하까지 감소하고 있어, RNAi활성이 있다는 것이 확인되었다.

[설계한 siRNA의 서열(규정서열 부분, 오버행부를 포함하지 않는다)]

siControl;gggcgcggtcggtaaagtt(서열번호35)

3CL-PRO;SARS-10754;ggaattgccgtcttagata(서열번호36)

3CL-PRO;SARS-108101;gaatggtcgtactatcctt(서열번호37)

RdRp;SARS-14841;ccaagtaatcgttaacaat(서열번호38)

SPike glycoprotein;SARS-23341;gcttggcgcatatattcta(서열번호39)

Spike glycoprotein;SARS-24375;cctttcgcgacttgataaa(서열번호40)

Small envelope Eprotein;SARS-26233;gtgcgtactgctgcaatat(서열번호41)

Small envelope Eprotein;SARS-26288;ctactcgcgtgttaaaaat(서열번호42)

Membrane glycoproteinM;SARS-26399;gcagacaacggtactatta(서열번호43)

Membrane glycoproteinM;SARS-27024;ccggtagcaacgacaatat(서열번호44)

Nucleocapsid protein;SARS-28685;cgtagtcgcggtaattcaa(서열번호45)

s2m motif;SARS-29606;gatcgagggtacagtgaat(서열번호46)

[실시예6]

상기 「＜5＞siRNA서열 설계 프로그램」 및 「＜7＞siRNA서열 설계 프로그램을 실행하는 염기서열 처리장치 등」에 따라, 하기 siRNA를 설계했다. 또한, 프로그램 실행시의 설정 조건은 하기와 같다.

(설정 조건)

(a)3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이다.

(b)5'말단의 염기가, 구아닌 또는 시토신이다.

(c)3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 4염기 이상이 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상이다.

(d)염기수가 19이다.

(e)10염기 이상 구아닌 또는 시토신이 연속하는 서열을 포함하지 않는다.

(f)목적생물의 전체 유전자서열 중, 상기 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열중에, 해당 규정서열과의 미스매치수가 2염기 이하인 유사서열이 포함되지 않는다.

설계된 siRNA의 서열을 서열표의 서열번호47~서열번호817081에 나타낸다. 또 한, 서열표의 ＜213＞서열번호47~서열번호817081에 기재된 각 siRNA의 목적생물의 생물명은 서열표의 에 기재되어 있다. 또한, RNAi대상유전자의 유전자명, 대상유전자의 accession, 및 대상유전자의 염기서열에 있어서 규정서열에 해당하는 부분에 대해서는, 서열표의 ＜223＞ (Otherinfomation)에 기재되어 있다. 또한, 여기에서의 유전자명 및 accession정보는 NCBI의 「RefSeq」(HYPERLINK"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/"http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 대응하는 것이며, RefSeq에 엑세스함으로써, 각 유전자의 정보(유전자의 서열, 기능 등)를 취득할 수 있다.

서열번호47에 기재된 siRNA를 예로 해서 설명하면, 목적생물은 Homosapiens이며, 대상유전자의 유전자명은 ATBF1이며, 대상유전자의 accession은 NM_006885.2이며 규정서열에 해당하는 부분은 NM_006885.2의 염기서열 중 염기번호908~926의 19염기이다. RefSeq에 엑세스하면, 해당 대상유전자는 AT-bindingtranscription factor1에 관련되는 유전자라는 것을 알 수 있다.

[실시예7]

siRNA과의 미스매치수수가 적은 서열을 포함하는 것 외의 유전자에서의 영향을 조사하기 위해, 실시예5와 동일한 수법으로 반디 루시퍼라제에 대한 siRNA를 설계하고, 해당 siRNA와 미스매치수가 작은 유사서열에 대한 RNAi효과를 조사했다.

[설계한 siRNA의 서열(규정서열 부분, 염기수2의 오버행부를 포함한다)]

3-36 gccattctatccgctggaagatg(서열번호817082)

[설계한 siRNA의 유사서열(대문자로 표기한 염기가 미스매치 부위)]

3-36. R1 gccattctatccgcGggCGgatg(서열번호817083)

3-36. R2 gccattctatccgcCggGGgatg(서열번호817084)

3-36. R3 gccattctatccgcGggaCgatg(서열번호817085)

3-36. R4 gccattctatccgctggCGgatg(서열번호817086)

3-36·R5 gccattctatccgctggaGgatg(서열번호817087)

3-36. R6 gccattctatccgctgTaaTatg (서열번호817088)

3-36. R7gccattctatccgctAAaagatg (서열번호817089)

3-36. R8gccattctatccgctATaaAatg (서열번호817090)

3-36. L1 gccGGCcCGtccgctggaagatg (서열번호817091)

3-36. L2 gccCGtcCGtccgctggaagatg(서열번호817092)

3-36. L3 gccGtCctGtccgctggaagatg (서열번호817093)

3-36. L4 gccaCCcGatccgctggaagatg (서열번호817094)

3-36. L5 gccattAtatccgctggaagatg(서열번호817095)

3-36. 01A gcAattctatccgctggaagatg (서열번호817096)

3-36. 01G gcGattctatccgctggaagatg(서열번호817097)

3-36. 01U gcTattctatccgctggaagatg(서열번호817098)

3-36. 19G gccattctatccgctggaagGtg(서열번호817099)

3-36. 19C gccattctatccgctggaagCtg(서열번호817100)

3-36. 19U gccattctatccgctggaagTtg(서열번호817101)

도36에 나타내는 엣세이의 결과, 염기수19의 염기서열을 설계하는 경우, 표 적유전자 이외의 다른 유전자가 미스매치수 2염기 이하의 유사서열을 포함하는 경우, 해당 유사서열 부분이 RNA간섭의 표적이 될 수 있는 가능성이 높은 것이 확인되었다.

[실시예8]

본 실시예에 있어서는, 표1A-K기재의 염기서열을 갖는 21염기 길이의 센스가닥RNA(표1중의 「siRNA-센스」의 란에 염기서열을 기재)와 안티센스가닥RNA(표1중의 「siRNA-안티센스」의 란에 염기서열을 기재: 다만, 해당 염기서열은 3'에서 5'방향으로 서열을 기재하고 있다)로 이루어지는 siRNA를 이용했다. 표1에 나타낸 바와 같이, 각 siRNA는 RNAi의 대상이 되는 유전자 (「유전자명」의 란 참조:이하, 표적유전자로 부르는 경우가 있다)의 코드영역이 있는 소정위치(「표적위치」의 란 참조)에 배치된 표적서열(「표적서열」의 란 참조), 특히, 해당 표적서열 중의 5'말단으로부터 3번째의 염기에서 3'말단으로부터 3번째까지의 염기에 상당하는 소위 규정서열에 근거해서 적절히 설계를 행하였다.

그리고, 각 siRNA에 대해, 인간 유래의 HeLa세포를 이용해서 RNAi효과를 조사했다. 구체적으로는, 센스가닥(siRNA-센스)으로서 서열번호817102-817650중의 짝수번호의 서열번호의 염기서열을, 그리고, 안티센스가닥(siRNA-안티센스)으로서 서열번호817102-817650중의 홀수번호의 서열번호의 염기서열을 조사했다. 이하, 실시예에 있어서의 구체적 방법을 설명한다.

1. siRNA의 합성

센스가닥 및 안티센스가닥으로 이루어지는 2가닥 siRNA를 전술한 본 발명에 따른 규칙(실시태양 〔1〕등에 기재된 (a)~(d)의 규칙)에 따라서, 각 표적유전자의 상기 규정서열에 근거해서 적절하게 서열설계했다. 그리고, 이러한 설계에 근거해서 프롤리그·재팬 주식회사에 합성을 위탁해서 준비했다. 구체적인 합성 방법으로서, 여기에서는, 표기한 소정의 염기서열을 갖는 센스가닥과 안티센스가닥을 10mM의 Tris-HCl(pH7.5), 20mM의 NaCl반응 용액 중, 90℃에서 3분간 가열했다. 그리고, 37℃에서 1시간 인큐베이터한 후, 실온이 될 때까지 방치해서 회합시켜 2가닥 siRNA를 형성했다.

이렇게 형성한 2가닥 siRNA는 TBE완충액중에서 2％아가로스겔을 이용하는 전기영동에 올리고, 그것에 의해 센스가닥과 안티센스가닥과의 회합을 확인하였다.

2. 세포배양

실시예에서는, 인간 유래의 HeLa세포를 이용했다. HeLa세포의 배지(이하, 세포배지라 칭하는 일이 있다)로서는, Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM:Invitrogen사제)에 비동화 10％ 소태아혈청(FBS:Biomedicals, inc사제)을 첨가해서 조제한 배지를 이용했다. 이러한 배지중에서, HeLa세포를 37℃, 5％CO₂존재 하에서 배양했다.

3. RNAi의 대상이 되는 표적유전자

자궁경부암의 세포인 HeLa세포를 이용하고 있고, 여기에서는, 이러한 HeLa세포의 내재성 유전자로서. 해당 세포내에서 높게 발현하고 있는 표1의 각 유전자가 siRNA에 의한 RNAi의 대상, 즉, RNAi의 표적유전자로 된다. 본 실시예에서는 HeLa 세포를 이용해서 이들 각 유전자에 있어서의 각 siRNA의 RNAi효과를 조사하고, 그에 따라, 해당 유전자에 관련되는 질환이나 생물학적 기능(구체적으로는, 도46의 「관련 질환명」, 「생물학적 기능 카테고리」 및/또는 「문헌에 근거하는 생물학적 기능」의 란의 기재 참조)에 관한 siRNA의 효과, 즉, 질환의 예방 및 치료 효과나 생물학적 기능의 조절 효과를 검토했다. 또한, 여기에서는, 내부 컨트롤 유전자로서, HeLa세포의 내재성 유전자인 GAPDH를 이용했다.

4. siRNA의 세포로의 도입(트랜스펙션)

우선, HeLa세포를 5×10⁴세포/wel1의 밀도로 24구멍 플레이트에 뿌리고, 상기의 세포배양 조건에서 24시간 배양한 후에, 1we11에 붙이고, 5nM 의 siRNA를 도입했다. 이렇게 도입후, HeLa세포를 37℃에서 24시간 배양했다. 여기에서는, 이러한 도입에 관해, 도입 시약으로서 Lipofectamine2000(Invitrogen사제)을 이용하고, 도입시에 사용하는 배지로서 DMEM을 이용했다. 또한, 구체적인 도입 방법으로서는, Lipofectamine2000과 siRNA를 포함하는 Opti-MEM배지(Invitrogen사제)를 세포배지에 첨가하고, HeLa세포를 배양하는 것에 의해 siRNA를 세포내에 도입했다. 이렇게 siRNA가 도입된 HeLa세포를, 이하에서는 「평가샘플」이라 칭한다.

한편, 후술하는 PCR에 있어서의 표적유전자 유래 mRNA량의 보정용으로, 이하의 칼리브레이터 샘플(calibrator sample)을 준비했다. 칼리브레이터 샘플에서는, Lipofectamine2000을 포함하고 siRNA를 포함하지 않는 Opti-MEM배지를 상기 세포배지에 첨가해서 HeLa세포를 배양하고, 그 이외는, siRNA를 도입한 평가샘플에 대한 처리와 동일한 처리를 행하여 조제했다.

5. RNAi효과의 측정

상기의 도입을 행한 후, 상기 평가샘플 및 칼리브레이터 샘플에 대해서, HeLa세포를 회수했다. 그리고, 회수한 세포를 ABI PRISM(등록상표)6700Automated Nucleic Acid Workstation(Applied Biosystems사제)에 올리고, 메뉴얼에 따라 관련된 장치를 조작해서 RNA의 추출 및 역전사에 의한 cDNA의 합성을 행하였다.

이어서, 얻어진 cDNA를 주형으로 해서 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems사제)를 이용하여, 50㎕의 반응계에서 정량적 PCR을 행하였다. 이러한 정량적 PCR에는 리얼타임 모니터링 장치로서 ABI PRISM(등록상표) 7900HT Sequence Detection System을 이용하여, 매뉴얼을 따라 관련된 장치를 조작했다. 또한, PCR의 프라이머에는, 다양한 검토 결과 얻어진 최적 프라이머를 이용했다.

본 실시예에서는, 얻어진 PCR정량결과를 「비교Ct법」으로 불리는 방법에 따라 해석했다. 해당 방법에 대해서는, Applied Biosystems사의 홈페이지 http://www.appliedbiosystems.co.jp에 설명이 개시되어 있으므로, 여기에서는 상세설명은 생략하지만, 해당 방법의 개략을 설명하면, 이 방법은 칼리브레이터 샘플과 비교해서 평가샘플이 몇 사이클 빨리(또는 늦게) Thredhold Line에 도달할지에 주목해서 상대 정량하는 것이다.

구체적으로는, 우선, PCR에 의해, 평가샘플 및 칼리브레이터 샘플에 대해서, 표적유전자 유래의 염기서열을 포함하는 상대적인 mRNA량에 상당하는 Ct1과 내부 컨트롤 유전자 유래의 염기서열을 포함하는 상대적인 mRNA량에 상당하는 Ct2를 정 량 했다. 이하에 있어서는, 평가샘플의 상기 Ct1을 「Ct1(E)」로 칭하고, 상기 Ct2를 「Ct2(E)」로 칭한다. 또한, 칼리브레이터 샘플의 상기 Ct1을 「Ct1(C)」로 칭하고, 상기 Ct2를 「Ct2(C)」로 칭한다.

여기에서, 「Ct」는 Threshold Line에 달하는 사이클수이며, 구체적으로는, 하기 (1)식으로 정의된다. 또한, 여기에서는 증폭 효율을 1로 하고 있다. Ct에 첨부된 숫자는 「1」이 표적유전자 유래인 경우의 mRNA량인 것을 나타내고 있고, 「2」가 내부 컨트롤 유전자 유래인 경우의 mRNA량인 것을 나타내고 있다. 또한, Ct에 첨부된 (E) 및 (C)는 「E」가 평가샘플인 것을 나타내고 있고, 「C」가 칼리브레이션 샘플인 것을 나타내고 있다. 첨부 기재된 「1」, 「2」, 「E」, 「C」에 관계 없이 「Ct」는 하기와 같이 정의된다.

Ct=(log[DNA]t-log[DNA]0)/log2 ··(1)

단, (1)식중 [DNA]t는 Threshold Line에 달했을 때의 DNA량을 나타내고 있고, [DNA]0은 mRNA로부터 역전사한 cDNA의 초기량을 나타내고 있다.

이렇게 PCR에 의한 정량으로 취득한 Ct1(E), Ct2(E), Ct1(C), Ct2(C)을 비교Ct법으로 하여 해석하고, siRNA의 RNAi효과의 평가 지표가 되는 RQ값을 취득했다. RQ값은 칼리브레이션 샘플에 있어서의 표적유전자의 mRNA레벨을 1로 했을 때, 평가샘플에 있어서의 표적유전자의 mRNA레벨이 상대값이다. 구체적으로는, RQ값은 하기 (2)식으로 정의된다.

또한, (2)~(5)식에 있어서의 첨부 기재 「1」, 「2」, 「E」 및 「C」의 설명은 상기와 같다.

6. RNAi효과의 평가

상기한 바와 같이 해서 취득한 RQ값을 표1A-K에 나타낸다. 표1의 「유전자명」 란의 기재, 「refseq_NO.」 란의 기재, 「표적서열」 란에 기재된 서열에 있어서 실제로 RNAi의 표적이 되는 서열, 및 「표적위치」의 정의에 있어서는, 본 명세서중, 「도면의 간단한 설명」의 항목에 있어서, 도46에 관련하여 전술한 대로이다.

본 실시예에 있어서는, 상기한 바와 같이 해서 산출된 RQ값(표1의 「RQ값」의 란 참조)에 근거하여, 각 siRNA의 표적유전자에 대한 RNAi효과를 평가했다. 표에 판명된 것과 같이, 서열번호817102~817650중의 짝수번호의 서열번호의 염기서열을 갖는 센스가닥과 서열번호817102~817650중의 홀수번호의 서열번호의 염기서열을 갖는 안티센스가닥으로 이루어지는 siRNA에서는, RQ값이 모두 1 미만, 그리고 거의 모두가 0.5 미만이 되고, 따라서, 이들의 siRNA는 표1기재된 표적유전자의 발현을 50％ 이하로 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 각 siRNA의 RNAi효과는 COS세포를 이용해서 상기와 동일한 조작을 행한 경우에 있어서도 실현되었다.

게다가, 이용한 294종의 본 발명의 siRNA 모두가 RNAi효과를 나타내는 실시예8의 결과로부터 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드(siRNA)는 포유 동물세포에 있어서, 표적유전자에 대하여 RNAi효과를 유효하게 나타내는 유전자발현을 50％ 이하로 억제하는 것이 분명해졌다.

또한, 실시예1~8에 있어서는, 센스가닥 및 안티센스가닥이 모두 RNA로 구성된 siRNA를 이용하는 경우를 나타냈지만, 키메라 구조를 갖는 siRNA를 이용한 경우에 있어서도, 상기 실시예1~8과 동일한 결과가 얻어진다. siRNA가 키메라 구조를 갖는 경우의 상세한 상세한 설명은, 여기에서는 생략하지만, 예를 들면, 실시예8에 있어서 키메라 구조의 siRNA를 이용한 경우, 해당 siRNA는 서열번호817102~서열번호817651에서 나타내는 센스가닥 및 안티센스가닥으로 이루어지는 실시예8의 siRNA와 이하의 점에서 구성이 다르다.

즉, 키메라 구조의 siRNA는 표1에 나타내는 서열번호817102~서열번호817651에서 나타내는 센스가닥 및 안티센스가닥으로 이루어지는 siRNA와 동일한 염기서열을 갖지만, 센스가닥의 3'말단(예를 들면, 표1의 서열번호8102 기재된 센스가닥에서는 A)부터 8~12폴리뉴클레오티드(예를 들면, 10폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 11폴리뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 12뉴클레오티드)의 부분과 안티센스가닥의 5'말단(예를 들면, 표1의 서열번호8103기재의 안티센스가닥에서는 A)부터 8~12폴리뉴클레오티드(예를 들면, 10폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 11폴리뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 12뉴클레오티드)의 부분이 DNA로 구성되고 있고, 따라서, 표1에 나타내는 센스가닥 및 안티센스가닥의 염기서열 중, 해당 폴리뉴클레오티드 부분의 U가 T로 치환된 점이 서열번호817102~서열번호817651에서 나타내는 siRNA와 다르다.

표 1A

표 1B

표 1C

표 1D

표 1E

표 1F

표 1G

표 1H

표 1I

표 1J

표 1K

산업상의 이용의 가능성

이상과 같이, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 표적유전자에 대하여 높은 RNA간섭 효과를 갖는 동시에, 표적유전자와 관계가 없는 유전자에 대해서 RNA간섭이 생기는 위험성이 대단히 작기 때문에, 발현을 억제하고자 하는 표적유전자에만 특이적으로 RNA간섭을 생기게 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 RNA간섭을 이용하는 시험, 치료방법 등에 바람직하게 이용할 수 있고, 포유류 등의 고등동물, 특히 인간을 대상으로 하는 RNA간섭을 행할 때에 특히 유효성을 발휘하는 것이다.

또한, 본 출원의 서열표는 817651개의 서열의 정보를 포함한다. 전자 파일의 용량이 아주 크고(200MB근접), 컴퓨터 환경에 따라서는 작업이 현저하게 곤란, 또는 불가능해지기 때문에, 편의상 전자 파일을 2개로 나누었다. YCT1039 sequence listing(1)은 서지사항과 서열번호 1~70000의 정보를 YCT1039 sequence listing(2)은 서열번호700001~817651의 정보를 포함한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

목적생물의 유전자중에서 선택되는 표적유전자에 대해 RNA간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드로서,

적어도 2가닥 영역을 가지고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열중에 포함되는 하기(a)~(d)의 규칙에 따르는 규정서열과 상동인 염기서열로 이루어지고, 그리고

상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

(a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이며;

(b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이며;

(c) 3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부하며;

(d) 염기수가 세포독성을 생기게 하지 않도록 RNA간섭을 생기게 할 수 있는 수이다.
제1항에 있어서, 상기 규정서열과 상동인 염기서열의 적어도 80％ 이상의 염기가 상기 규정서열의 염기서열과 일치하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 규칙(c)에 있어서, 7염기 중 적어도 3염기 이상이 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 규칙(d)에 있어서, 염기수가 13~28인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 규정서열이 아울러 하기(e)의 규칙에 따르는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

(e) 10염기 이상 구아닌 또는 시토신이 연속하는 서열을 포함하지 않는다.
제5항에 있어서,

규정서열이 아울러 하기(f)의 규칙에 따르는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드:

(f) 목적생물의 전체 유전자서열 중, 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열중에, 해당 규정서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는다.
제6항에 있어서, 상기 규정서열이 서열표 서열번호47~서열번호817081중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제6항에 있어서, 상기 규정서열이 도46의 표적서열의 란에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제6항에 있어서, 서열번호817102~817651중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 2가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제10항에 있어서, 상기 2가닥 폴리뉴클레오티드의 한쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열의 3'말단에 오버행부를 갖는 염기서열로 이루어지고,

상기 2가닥 폴리뉴클레오티드의 다른쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열의 3'말단에 오버행부를 갖는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

헤어핀 구조를 갖는 1가닥 폴리뉴클레오티드이며,

상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥의 3'말단과, 상기 2가닥 영역에 있어 서의 다른쪽 가닥의 5'말단을 연결하는 루프부를 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입하는 폴리뉴클레오티드의 선택방법으로서,

적어도 2가닥 영역을 가지고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 한쪽 가닥이 표적유전자의 염기서열중에 포함되는 하기(a)~(f)의 규칙에 따르는 규정서열과 상동인 염기서열로 이루어지고, 그리고,

상기 2가닥 영역에 있어서의 다른 쪽 가닥이 상기 규정서열과 상동인 염기서열과 상보적인 서열을 갖는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 선택하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 선택방법:

(a) 3'말단의 염기가 아데닌, 티민 또는 우라실이며;

(b) 5'말단의 염기가 구아닌 또는 시토신이며;

(c) 3'말단의 7염기의 서열에 있어서, 아데닌, 티민 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 염기가 풍부하며;

(d) 염기수가 세포독성을 생기게 하지 않도록, RNA간섭을 생기게 할 수 있는 수이며;

(e) 10염기 이상 구아닌 또는 시토신이 연속하는 서열을 포함하지 않고;

(f) 목적생물의 전체 유전자서열 중, 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기 서열중에 해당 규정서열과 90％ 이상의 상동성을 갖는 서열이 포함되지 않는다.
제13항에 있어서, 상기 선택한 폴리뉴클레오티드로 부터, 상기 표적유전자의 규정서열과 상동인 염기서열이 상기 표적유전자 이외의 다른 유전자의 염기서열과의 미스매치수가 적어도 3염기이며, 또한, 해당 적어도 3염기의 미스매치를 갖는 염기서열을 갖는 다른 유전자의 수가 가장 적은 서열인 폴리뉴클레오티드를 더 선택하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 선택방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입해서 표적유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유전자발현억제 방법.
제13항 또는 제14항에 기재된 방법에 의해 선택된 폴리뉴클레오티드를 발현을 억제하고자 하는 표적유전자의 발현계에 도입해서 표적유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유전자발현억제 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 50％ 이하로 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 유전자발현억제 방법.
의약적으로 유효한 양의 제1항 내지 제12항중 어느 한항에 기재된 폴리뉴클 레오티드를 포함하는 의약용 조성물.
제18항에 있어서, 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약용 조성물.
제18항에 있어서, 도46의 유전자명의 란에 기재된 유전자에 관련되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약용 조성물.
제18항에 있어서,

이하 1)~9)중 어느 하나에 속하는 유전자가 관여하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물:

1) 아포토시스에 관여하고 있는 유전자;

2) 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자;

3) 세포주기에 관여하고 있는 유전자;

4) 수용체에 관여하고 있는 유전자;

5) 이온채널에 관여하고 있는 유전자;

6) 시그널 전달계에 관여하고 있는 유전자;

7) 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자;

8) 전사 제어에 관여하고 있는 유전자; 혹은

9) G단백질 공역수용체 또는 G단백질 공역수용체에 관여하고 있는 유전자.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 도46의 서열번호(인간) 또는 서열번호(마우스)의 란에 기재된 서열번호 중 어느 하나의 염기서열을 표적서열로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약조성물.
제18항에 있어서, 표1의 유전자명의 란에 기재된 유전자에 관련되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약용 조성물.
제18항 또는 제23항에 있어서, 방광암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 구강암, 피부암 및 갑상선암으로 부터 선택되는 어느 하나의 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물.
제18항 또는 제23항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호817102 내지 817651중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자발현억제용 조성물.
제26항에 있어서, 표적유전자가 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환중 어느 하나의 질환에 관련되는 유전자발현억제용 조성물.
제26항에 있어서, 표적유전자가 도46의 유전자명의 란에 기재된 유전자중 어느 하나인 유전자발현억제용 조성물.
제26항에 있어서, 표적유전자가 이하 1)~9)의 어느 하나에 속하는 유전자인 발현억제용 조성물:

1) 아포토시스에 관여하고 있는 유전자;

2) 포스파타제 및 포스파타제 활성에 관여하고 있는 유전자;

3) 세포주기에 관여하고 있는 유전자;

4) 수용체에 관여하고 있는 유전자;

5) 이온채널에 관여하고 있는 유전자;

6) 시그널 전달계에 관여하고 있는 유전자；

7) 키나아제 및 키나아제 활성에 관여하고 있는 유전자;

8) 전사 제어에 관여하고 있는 유전자; 혹은

9) G단백질 공역수용체 또는 G단백질 공역수용체에 관여하고 있는 유전자.
제26항에 있어서, 표적유전자가 표1의 유전자명의 란에 기재된 유전자 중 어느 하나인 유전자발현억제용 조성물.
제26항에 있어서, 표적유전자가 방광암, 유방암, 결장 직장암, 위암, 간세포암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 구강암, 피부암 및 갑상선암으로부터 선택되는 어느 하나의 암과 관련되는 유전자인 유전자발현억제용 조성물.
의약적으로 유효한 양의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 도46의 관련 질환명의 란에 기재된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법.