RS57789B1 - Antisens polinukleotidi za indukovanje preskakanja egzona i postupci lečenja distrofija - Google Patents

Antisens polinukleotidi za indukovanje preskakanja egzona i postupci lečenja distrofija

Info

Publication number
RS57789B1
RS57789B1 RS20181053A RSP20181053A RS57789B1 RS 57789 B1 RS57789 B1 RS 57789B1 RS 20181053 A RS20181053 A RS 20181053A RS P20181053 A RSP20181053 A RS P20181053A RS 57789 B1 RS57789 B1 RS 57789B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sgcg
exon
muscle
mini
approximately
Prior art date
Application number
RS20181053A
Other languages
English (en)
Inventor
Elizabeth Mcnally
Original Assignee
Univ Chicago
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Chicago filed Critical Univ Chicago
Publication of RS57789B1 publication Critical patent/RS57789B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3535—Nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetna prijava se odnosi na antisens polinukleotide i njihovu upotrebu u farmaceutskim kompozicijama za indukovanje preskakanja u ciljnim egzonima gena za gama sarkoglikan (SGCG), korisnim u lečenju raznih oblika mišićne distrofije.
STANJE TEHNIKE
[0002] Mišićna distrofija (MD) je grupa više od 30 genetskih poremećaja koje karakterišu slabost i degeneracija skeletnih mišića. Udno-pojasni oblik mišićne distrofije (LGMD od engl. Limb-girdle Muscular Dystrophy) je autozomalna klasa MD. Najteže pogođeni mišići u LGMD-u su mišići udova, uključujući ruku i nogu, kao i mišići trupa koji utiču na položaj tela i disanje. MD pacijenti se rađaju sa normalnom funkcijom mišića, ali razvijaju srčanu insuficijenciju i probleme sa disanjem usled gubitka mase i snage srčanog i respiratornih mišića. Udno-pojasnu mišićnu distrofiju tipa 2C (LGMD2C) prouzrokuju mutacije u genu za γ-sarkoglikan (Sgcg) [Noguchi i saradnici, Science 270: 819-822 (1995); McNally i saradnici, Am J Hum Genet 59: 1040-1047 (1996); Lasa i saradnici, Eur J Hum Genet 6: 396-399 (1998)]. γ-Sarkoglikan je protein koji se udružuje sa distrofinom [Allikian i saradnici, Traffic 8: 177-183 (2007)]. Distrofin je veliki štapićasti citoplazmatski protein koji se može naći duž unutrašnje površine plazma membrane mišićnih ćelija. Distrofin je kodiran DMD genom, najvećim do sada poznatim genom, koji se prostire duž 2,4 MB na X hromozomu [Hoffman i saradnici, Biotechnology 24: 457-466 (1992)]. Mutacije u DMD genu su najčešći uzrok mišićne distrofije, sa učestalošću od 1 na svakih 3500 novorođenih dečaka širom sveta [Moser, Hum Genet 66: 17-40 (1984)].
[0003] Distrofinski kompleks lokalizuje na mišićnoj membrani, poznatoj kao sarkolema, gde povezuje unutarćelijske snopove aktina sa vanćelijskim matriksom. Distrofinski kompleks ima ključnu ulogu u stabilizaciji sarkoleme tokom mišićne kontrakcije. Mutacija ili gubitak distrofina ili asociranih sarkoglikana dovodi do destabilizacije sarkoleme i posledičnih događaja kao što su povreda mišićne ćelije, nekroza mišićne ćelije i deponovanja vezivnog ili masnog tkiva.
[0004] Kod miševa i ljudi kompleks distrofina je visoko evolutivno očuvan. Mišiji model bez Sgcg gena (null miš, Sgcg<-/->) je bio prvi uspostavljen model za LGMD, delecijom egzona 2 Sgcg-a, što je rezultiralo anuliranjem alela [Hack i saradnici, J Cell Biol 142: 1279-1287 (1998)]. Miševi sa mutiranim γsarkoglikanom razvijaju progresivnu patologiju oboljenja koja podseća na onu prisutnu kod LGMD2C pacijenata. Sgcg<-/->miševi se rađaju u očekivanim proporcijama prema pravilu nasleđivanja po Mendelu. Medjutim, do starosti od 20 nedelja, polovina Sgcg<-/->miševa umire, a preživeli miševi su sa značajno manjom telesnom težinom u odnosu na miševe iz legla koji su bez mutacija (miševi divljeg tipa, engl. wild type). Distrofične promene skeletnih mišića, kao što su široke varijacije u veličine vlakana, infiltracija imunih ćelija i deponovanje fibrotičnog i masnog tkiva, očigledne su kod životinja starih 3 nedelje, a promene postaju upadljive kod životinja starih oko 8 nedelja. U skladu sa obrascem progresije bolesti kod pacijenata, kardiomiopatija kod Sgcg<-/->se takođe razvija u kasnijoj fazi. U 20-toj nedelji života, Sgcg<-/->srca karakteriše značajna fibroza i redukovana srčana funkcija.
[0005] Remećenje distrofinskog kompleksa čini mišićnu membranu krhkijom i osetljivijom na pucanje prilikom delovanja sile zatezanja tokom kontrakcije. Kao rezultat navedenih pucanja, skeletni mišići bez distrofina ili sarkoglikana pokazuju povećanu propustljivost koja omogućava da rastvorljivi enzimi, kao što je kreatin kinaza, izađu iz ćelije, kao i da proteini krvi, kao što su albumini, ili joni, kao što je kalcijum, uđu u ćeliju. Inicijalno, aktivira se ćelijska mašinerija za popravku membrane, uključujući proteine familije disferlina, da bi se ponovo zatvorila oštećena membrana [Bansal, Nature 423: 168-172 (2003); Doherty i saradnici, Development 132: 5565-5575 (2005)]. Ipak, navedena nejasna granica ćelije i okolne sredine, kao i povećan sadržaj kalcijuma u citoplazmi, dovode do niza štetnih ćelijskih događaja, poput povećanog nivoa reaktivnih vrsta kiseonika i aktivacije proteazne kaskade, koji konačno dovode do nekrotične smrti ćelija [Goldstein i saradnici, J Gen Phisiol 136: 29-34 (2010)].
[0006] Gubitak mišićnih vlakana takođe aktivira mišićne matične ćelije koje se nazivaju satelitskim ćelijama. Satelitske ćelije se dele i pokušavaju da obnove povređena mišićna vlakna. Kako mioblaste karakteriše samo ograničen potencijal deoba, trend degeneracije postepeno prevazilazi napore regeneracije što dovodi do nepovratnog gubitka mišića. Gubitak mišićne mase prati zamena vezivnim i masnim tkivom. Slično ljudima, mutantni miševi takođe razvijaju kardiomiopatiju usled gubitka kardiomiocita i taloženja fibroznog tkiva. Srca sa kardiomiopatijom ne uspevaju da pumpaju pravilno, što dalje dovodi do neuspešne isporuke kiseonika i hranljivih materija u tkivo.
[0007] Kod Drosophila-e je prisutan pojednostavljen distrofinski kompleks, evolutivno očuvan u odnosu na isti kod sisara. γ/δ-Sarkoglikan Drosophila-e (Sgcd) je podjednako sličan i γ-sarkoglikanu i δ-sarkoglikanu sisara. Prethodna istraživanja su rezultirala stvaranjem modela mišićne distrofije na vinskoj mušici indukcijom velike delecije u Sgcd lokusu putem nepreciznog isecanja P-elemenata [Allikian i saradnici, Hum Mol Genet 16: 2933-2943 (2007)]. Linija Sgcd<840>je izabrana i dalje okarakterisana, pošto je imala definisanu deleciju koja je anulirala ekspresiju jedinstvenog γ/δsarkoglikanskog gena. Slično progresivnoj prirodi MD kod sisara, Sgcd mutantne mušice su normalne do adultnog doba, nakon čega se, tokom vremena, razvijaju srčane i skeletne abnormalnosti. Za razliku od četvorokomornog srca kod sisara, vinske mušice imaju jednostavnu srčanu cev koja potpomaže cirkulaciju krvi. U odnosu na mušice divljeg tipa, Sgcd mutantne vinske mušice su veće i sa defektima u kontrakciji. Slabost u skeletnim mišićima se manifestuje kao poremećena sposobnost penjanja mutantnih mušica. Histološki pregled mišića za letenje mutantnih mušica je ukazao na odvajanje mišićnih vlakana od egzoskeleta, što se samo retko viđa kod mušica divljeg tipa.
[0008] Najčešći uzroci mišićne distrofije su mutacije u genu za distrofin. Različite mutacije u distrofinu dovode do različitih težina kliničke slike. Na primer, mutacija koja pomera okvir čitanja kao što je delecija od egzona 43 do egzona 48 [Doriguzzi i saradnici, Eur Neurol 33: 454-460 (1993)], dovodi do mnogo težeg oboljenja od onog sa većom delecijom koja se proteže od egzona 13 do 48 [Passos-Bueno i saradnici, Hum Mol Genet 3: 919-922 (1994)]. Pomeranje okvira čitanja u prethodnom slučaju dovodi do gubitka C-kraja distrofina koji je odgovoran za normalnu lokalizaciju sarkoglikana i drugih proteina koji se udružuju sa distrofinom. Štaviše, nivo distrofinskog proteina je takođe značajno smanjen, verovatno usled propadanja proteina do kog dolazi zbog gubitka informativnosti ili usled neadekvatnog uvijanja proteina i potonje degradacije. U drugom slučaju, velika delecija redukuje broj spektrinskih ponovaka u središnjem regionu proteina uz očuvanje kritičnih C- i N-krajeva intaktnim. Navedeno ukazuje da interno skraćen protein može biti delimično funkcionalan. Navedene blaže mutacije su poznate kao oblici Bekerove mišićne distrofije (BMD).
[0009] Većina eukariotskih gena se sastoji od egzona koji kodiraju proteine i nekodirajućih introna. Obrada transkripta je neophodna za povezivanje egzona kako bi se obrazovala zrela iRNK. Da bi se postigao ispravan obrazac obrade, neophodno je prepoznavanje donorskih, akceptorskih i mesta obrade egzonskih pojačivača (ESE od enl. Exonic Splicing Enhancer) od strane ćelijskog aparata za obradu transkripta. Blokiranje esencijalnih mesta obrade transkripta antisens polinukleotidima (AON) dovodi do iskrajanje određenih egzona iz zrele iRNK [Aartsma-Rus i saradnici, RNA 13: 1609-1624 (2007)]. Navedeni događaj se označava kao preskanje egzona (“exon skipping”).
[0010] Sprovedene su faza I i faza II kliničkih ispitivanja terapeutika za preskakanje egzona koje su dokazale bezbednost primene AON i efikasnu obnovu distrofina [Bertoni, Front Biosci 13: 517-527 (2008); Cirak i saradnici, Lancet 378: 595-605 (2011)]. U fazi II kliničnog ispitivanja, u studiji je učestvovalo 19 pacijenata starosti 5-15 godina. Oni su bili podeljeni u više grupa koje su primale rastuće doze AVI-4568 (AON lek) svake nedelje, intravenskom infuzijom, tokom 12 nedelja. Nisu zabeleženi ozbiljni neželjeni efekti leka. Ciljno preskakanje egzona je uočeno kod svih pacijenata i detektovana je nova proizvodnja distrofina na dozno-zavisan način. Tri pacijenta sa najvećim odgovorom na lek su imala 15%, 21% i 55% vlakana pozitivnih na distrofin. U skladu sa umnožavanjem funkcionalnog distrofina, na plazma membrani mišićnih ćelija je utvrđen i obnovljen nivo proteina koji asociraju sa distrofinom.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0011] Pronalazak je kao što je to definisano u pridruženim patentnim zahtevima. Prijava je usmerena na kompozicije za preskakanje egzona koje sadrže dva ili više antisens polinukleotida i njihovu upotrebu u farmaceutskim kompozicijama, u strategijama za indukovanje preskakanja egzona u genu za gama sarkoglikan kod pacijenata koji boluju od udno-pojasne mišićne distrofije tipa 2C (tj. LGMD2C) ili kod pacijenata sa rizikom od ove bolesti. Prijava takođe obezbeđuje kompozicije za upotrebu u prevenciji ili lečenju mišićne distrofije, npr. LGMD2C, preskakanjem egzona u genu za gama sarkoglikan, upotrebom antisens polinukleotida.
[0012] Jedan aspekt prijave obezbeđuje kompoziciju za preskakanje egzona koja sadrži dva ili više antisens polinukleotida, pri čemu svaki polinukleotid specifično hibridizuje sa ciljnim regionom egzona gama sarkoglikanske RNK i pri čemu je egzon izabran iz grupe koju čine egzon 4 (SEQ ID NO: 1), egzon 5 (SEQ ID NO: 2), egzon 6 (SEQ ID NO: 3), egzon 7 (SEQ ID NO: 4) i njihova kombinacija. U pojedinim primerima primene, antisens polinukleotid ne može obrazovati supstrat za RNazu H, dok u daljim primerima primene, antisens polinukleotid sadrži modifikovanu okosnicu polinukleotidnog lanca. U pojedinim primerima primene, modifikovana okosnica predstavlja 2'-O-metiloligoribonukleotid.
Tabela 1. Sekvence egzona gama sarkoglikana.
[0013] U daljim primerima primene, prijava razmatra da modifikovana okosnica polinukleotidnog lanca sadrži modifikovanu grupu koja supstituiše najmanje jedan šećer najmanje jednog od polinukleotida. U specifičnom primeru primene, modifikovana grupa je Morfolino.
[0014] Prijavom se dodatno razmatra da, u pojedinim primerima primene, modifikovana polinukleotidna okosnica polinukleotida sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleotidnu vezu, a u pojedinim primerima primene, modifikovana internukleotidna veza sadrži modifikovani fosfat. Modifikovani fosfat je, u raznim primerima primene, izabran iz grupe koju čine metil fosfonat, metil fosforotioat, fosforomorfolidat, fosforopiperazidat i fosforoamidat.
[0015] Prijava takođe obezbeđuje primere primene u kojima polinukleotid sadrži peptidnu nukleinsku kiselinu.
[0016] U još daljim primerima primene, razmatra se da je polinukleotid hemijski vezan za jedan ili više konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje antisens polinukleotida. U srodnim primerima primene, konjugat je peptid koji pojačava ćelijsko preuzimanje, a u daljim primerima primene, peptid je izabran iz grupe koju čine signalni peptid lokalizacije u nukleus (NLS od enlg. nuclear localization signal), HIV-1 TAT protein, peptid koji sadrži domen koji se vezuje za integrin, oligolizin, adenovirusni fibrilni protein i peptid koji sadrži domen za endocitozu posredovanu receptorom (RME od engl. receptor-mediated endocytosis).
[0017] U pojedinim primerima primene, polinukleotid je hemijski vezan za molekul polietilenglikola.
[0018] Drugi aspekt prijave obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži dva ili više antisens polinukleotida koji su ovde opisani i fiziološki kompatibilan fosfatni pufer. U pojedinim primerima primene, farmaceutska kompozicija dalje sadrži dodatni antisens polinukleotid, pri čemu dodatni polinukleotid specifično hibridizuje sa egzonom gama sarkoglikanske nukleinske kiseline.
[0019] Naredni aspekt prijave obezbeđuje upotrebu za indukovanje preskakanja egzona u RNK gama sarkoglikana, koja podrazumeva isporuku terapijski efektivne ili profilaktički efektivne količine kompozicije prijave u ćeliju, čime se indukuje preskakanje egzona u RNK gama sarkoglikana.
[0020] U pojedinim primerima primene, ćelija je mišićna ćelija čoveka, a u daljim primerima primene, humana mišićna ćelija se nalazi u pacijentu. Pacijent, u raznim primerima primene, označava pacijenta koji boluje od mišićne distrofije. U narednim primerima primene, mišićna distrofija je udnopojasna mišićna distrofija tipa 2C (LGMD2C).
[0021] U još daljem aspektu prijave, obezbeđena je upotreba za poboljšanje kliničke slike udnopojasne mišićne distrofije tipa 2C (LGMD2C) kod pacijenta kome je to potrebno, a koja podrazumeva korak primene terapijski efektivne količine kompozicije prijave pacijentu, čime se ublažava LGMD2C.
[0022] Prijava takođe obezbeđuje upotrebu za inhibiciju progresije distrofične patologije udružene sa LGMD2C kod pacijenta kome je to potrebno i podrazumeva korak primene terapijski efektivne količine kompozicije prijave pacijentu, čime se inhibira progresija distrofične patologije.
[0023] U pojedinim aspektima, prijava obezbeđuje upotrebu za poboljšanje mišićne funkcije kod pacijenta koji boluje od udno-pojasne mišićne distrofije tipa 2C (LGMD2C), upotrebu koja podrazumeva korak primene terapijski efektivne količine kompozicije prijave pacijentu čime se poboljšava mišićna funkcija. U pojedinim primerima primene, poboljšanje podrazumeva poboljšanje srčanog mišića, a u daljim primerima primene, poboljšanje mišićne funkcije označava poboljšanje mišićne snage. U narednim primerima primene, poboljšanje mišićne snage označava poboljšanje snage respiratornih mišića, dok u dodatnim primerima primene, poboljšanje mišićne funkcije podrazumeva poboljšanje motoričke stabilnosti. U bilo kom od primera primene predmetne prijave, poboljšanje respiratorne mišićne snage se meri kao smanjenje noćnih desaturacionih događaja ili poboljšanje u plućnim funkcionalnim testovima. U bilo kojom od primera primene prijave, poboljšanje motoričke stabilnosti rezultuje poboljšanim vremenom stajanja ili penjanja uz stepenice u odnosu na prethodno izmereno vreme stajanja ili penjanja uz stepenice.
[0024] Poboljšanje motoričke stabilnosti, u pojedinim primerima primene, rezultira poboljšanjem u šestominutnom testu hoda kod pacijenta u odnosu na prethodno dobijen rezultat u šestominutnom testu hoda kod tog pacijenta. Dodatna poboljšanja koja se razmatraju prijavom su procenjivana kroz poboljšanje histopatološkog nalaza ili kroz dokaze poboljašanja, dobijene neivanzivnim tehnikama medicinskih snimanja, kao što su redukovana infiltracija fibroznog/masnog tkiva i smanjenje dokaza o ožiljcima. Razmatra se i poboljšanje funkcije srčanog mišića koje se dokumentuje poboljšanjem funkcije leve i desne komore, smanjenjem prečnika desne i leve komore i smanjenjem broja dokaza o oštećenju srca.
[0025] Sledeći aspekt prijave se svodi na komercijalni komplet koji sadrži kompoziciju koja je ovde opisana, opciono u kontejneru, kao i samo pakovanje, oznaku pakovanja, uputstva ili druga obeležja.
U pojedinim primerima primene, komplet dalje sadrži dodatni polinukleotid, pri čemu dodatni polinukleotid specifično hibridizuje sa egzonom iz RNK gama sarkoglikana.
KRATAK OPIS NACRTA
[0026]
Nacrt 1 prikazuje okvir čitanja Sgcg gena sisara pre (A) i nakon (C) postupka preskakanja egzona 4-7. Delecija jednog timina u egzonu 6 remeti okvir čitanja i najčešća je mutacija u LGMD2C. (B). Preskakanje egzona 4-7 vraća okvir čitanja. Egzoni koji slede egzon "E8" i oni koji su označeni "E1" predstavljaju regione koji nisu translatirani.
Nacrt 2 prikazuje strukturu γ-sarkoglikana pune dužine (levo) i interno skraćeni γ-sarkoglikan nakon preskakanja egzona 4-7 (desno). Prikazane su evolutivno očuvane aminokiseline.
Nacrt 3 prikazuje vektorske mape mini-Sgcg konstrukata u transgenim mušicama (A) i transgenim miševima (B). UAS označava sekvencu pojačavača koju specifično prepoznaje Gal4. Promotor dezmina (Des) je specifičan za mišiće. Preliminarni podaci su pokazali da se mini-Sgcg proizvodi u UAS-mini-Sgcg transgenim mušicama i Des-mini-Sgcg transfektovanim mišićnim ćelijama u kulturi. Bitno je zapaziti da je mini-Sgcg koji je proizveden sa oba transgena obeležen tzv. Xpress obeleživačem epitopa.
Nacrt 4 pokazuje da srčana cev Drosophila-e predstavlja strukturu tankog zida koja se prostire duž dorzuma adultne mušice (A). B prikazuje EM sliku srčane cevi (h i strelice). A i B su preuzeti iz publikacije Curtis, Morphology 240: 225 (1999). C prikazuje membranski lokalizovano bojenje mini-Sgcg transgena koji eksprimira mini-Sgcg u Sgcg<840>mušicama, u srčanoj cevi, upotrebom Tinman GAL4.
Nacrt 5 pokazuje da su Sgcg pune dužine i mini-Sgcg eksprimirani i pravilno lokalizovani na plazma membrani ćelija skeletnih mišića transgenih mušica. Mišićne ćelije su postavljene paralelno jedne u odnosu na druge.
Nacrt 6 prikazuje poboljšanu funkciju srca kod Sgcd<840>mišica koje su izlečene upotrebom mini-Sgcg. Sa leve strane je prikazana krajnja sistolna dimenzija (ESD od engl. End Systolic Dimension). Sgcd<840>mušice imaju povećan ESD, što ukazuje na dilataciju srčane cevi. Navedeno proširenje se gubi kada se mini-Sgcg protein uvede u Sgcd<840>mušice transgenezom.
Nacrt 7 prikazuje konstrukte za proizvodnju mini-Sgcg kod miševa. Naznačena je pozitivna reakcija dobijena za osnivačku liniju transgenog miša (# 23, nazvan "MJ").
Nacrt 8 pokazuje da se mini-Sgcg protein proizvodi u miotubama u kulturi kada se one transfektuju Des-mini-Sgcg vektorom, kao i da protein lokalizuje na mišićnoj membrani.
Nacrt 9 prikazuje povratak sposobnosti hodanja Sgcd -/<->mušica upotrebom mini-Sgcg. Na levom panelu, na Y osi je prikazan broj prekida snopova zraka po satu, dok su na X osi sati, pri čemu je ponoć označena kao 0. Na desnom panelu, na Y osi je ukupan broj prekida svetlosnih zraka od ponoći do 8 sati ujutru.
Nacrt 10 pokazuje da ekspresija mini-Sgcg kod Sgcd<840>mušica znatno poboljšava noćnu aktivnost.
Nacrt 11 pokazuje da mini-Sgcg proteini mogu biti stabilno proizvodeni u skeletnom mišiću sisara (Skeletni m.) i srcu (Srce).
Nacrt 12 prikazuje ekspresiju mini-Sgcg u dve različite transgene linije. Gornji panel pokazuje ekspresiju tri različite koncentracije kod transgene linije 50 ili transgene linije 84.
Nacrt 13 prikazuje da mini-Sgcg protein lokalizuje na plazma membrane skeletnog mišića kada se eksprimira kod normalnih miševa divljeg soja (Tg<+>). Isti signal nije detektovan u mišiću koji je negativan na transgen (Tg-) što ukazuje da navedeni signal potiče od transgena.
Nacrt 14 pokazuje da je ekspresija endogenog γ-sarkoglikanskog proteina (Sgcg) pune dužine na plazma membrane umanjena kada je prisutan mini-Sgcg (Tg<+>(levi panel), a u odnosu na situaciju u kojoj je mini-Sgcg odsutan (Tg<->(desni panel)).
Nacrt 15 prikazuje model povezivanja sarkoglikana.
Nacrt 16 pokazuje da je mini-Sgcg obogaćen u teškoj mikrozomalnoj frakciji mišića.
Nacrt 17 prikazuje dve humane ćelijske linije sa SGCG mutacijama, inficirane retrovirusima koji eksprimiraju telomerazu i MyoD. U gornjem redu su prikazane ćelije LGMD 2C pacijenta čija je bolest posledica mutacije tipa delecije egzona 7 u SGCG. U donjem redu su prikazane ćelije dobijene iz LGMD 2C pacijenta kome je deletiran egzon 6 SGCG-a.
Nacrt 18 prikazuje LGMD 2C ćelijske linije diferencirane u mišićnu liniju (6 dana diferencijacije). Gornji red prikazuje ćelije dobijene iz LGMD 2C pacijenta čija je bolest nastala usled delecije egzona 6 u SGCG, a u donjem red su ćelije dobijene iz LGMD 2C pacijenta kod koga je prisutna delecija egzona 7 SGCG-a. MyoD, mišićni marker, je eksprimiran sa restrovirusa (srednji panel), dok je dezmin, mišićni marker, indukovan sa MyoD (desni panel), a što ukazuje da su ove ćelije vijabilni modeli mišićnih oboljenja. Panel na levoj strani (Hoechst) prikazuje jedra.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0027] Mutacije u genu koji kodira γ-sarkoglikan, Sgcg, dovode do mišićne distrofije, oboljenja sa degeneracijom mišića, neuspešnom regeneracijom i slabošću mišića. Jedna od strategija koja je ovde ispitivana za lečenje genetskih oblika mišićne distrofije je preskakanje egzona. Isključivanje određenog/određenih egzona iz finalnih transkripata, ili preskakanja egzona, može biti postignuto blokiranjem esencijalnih mesta obrade upotrebom jednog ili više antisens polinukleotida (AON). Indukovanjem obrade oko egzona koji nose mutacije se proizvodi interno deletiran, ali potencijalno funkcionalan protein γ-sarkoglikana koji predstavlja protein asociran sa membranom koji je deo distrofinskog proteinskog kompleksa, kompleksa koji stabilizuje mišićnu membranu tokom mišićne kontrakcije. Sgcg gen se sastoji od 8 egzona. Najčešća mutacija u Sgcg je delecija timidina 525 u egzonu 6 (525ΔT) koja dovodi do proizvodnje proteina sa 19 izmenjenih aminokiselina (mutacija tipa promene smisla – engl. missense) i prevremenim stop kodonom. Preskakanje egzona 4-7 obnavlja ispravan okvir čitanja proteina što rezultira interno skraćenim γ-sarkoglikanskim proteinom. Navedeni skraćeni oblik γ-sarkoglikana smanjuje protein pune dužine od aminokiseline 291 do aminokiseline 157, pri čemu se zadržava unutarćelijski region, transmembranski domen i ključan motiv bogat cisteinom na karboksilnom kraju.
[0028] Gen γ-sarkoglikana je evolutivno očuvan kod ljudi, miševa i Drosophila-e, a prethodno su napravljeni modeli mutacija u genu za γ-sarkoglikan i kod mušica i kod miševa. Aminokiselinska sekvenca humanog gama sarkoglikana je navedena kao SEQ ID NO: 5, dok je aminokiselinska sekvenca mišijeg gama sarkoglikana navedena kao SEQ ID NO: 6. Skraćeni mišji ili humani γsarkoglikan koji je rezultat preskakanja egzona 4-7 je označen kao "mini-Sgcg". Aminokiselinska sekvenca humanog mini-Sgcg koja je rezultat preskakanja egzon 4-7 je navedena kao SEQ ID NO: 7, dok je aminokiselinska sekvenca mini-Sgcg miša koja je rezultat preskakanja egzona 4-7 navedena kao SEQ ID NO: 8.
[0029] Ovde navedeni podaci pokazuju da je mini-Sgcg protein proizveden u transgenoj Drosophila-i i da normalno lokalizuje na plazma membrani. Strukture γ-sarkoglikana pune dužine i skraćenog proteina nakon preskakanja egzona su prikazane na Nacrtima 1 i 2, tim redom.
[0030] Prijava stoga obezbeđuje kompozicije za preskakanje egzona koje sadrže dva ili više izolovanih antisens polinukleotida, pri čemu svaki polinukleotid specifično hibridizuje sa ciljnim regionom egzona u RNK gama sarkoglikana i pri čemu je egzon izabran iz grupe koju čine egzon 4 (SEQ ID NO: 1), egzon 5 (SEQ ID NO: 2), egzon 6 (SEQ ID NO: 3), egzon 7 (SEQ ID NO: 4) i njihova kombinacija.
[0031] U tekstu prijave, "hibridizacija" označava interakciju između dva ili tri lanca nukleinskih kiselina posredstvom vodoničnih veza, u skladu sa pravilima Votson-Krikove komplementarnosti DNK, Hugštajnovog vezivanja i drugih specifičnih vezivanja sekvenci koja su poznata u stanju tehnike. Hibridizacija se može ostvariti pod uslovima različitog stepena strogosti koji su poznati u stanju tehnike. "Specifično hibridizovanje", kako se ovde upotrebljava, označava hibridizaciju koja omogućava obrazovanje stabilnog dupleksa između polinukleotidnih lanaca koji su komplementarni ili suštinski komplementarni. Na primer, polinukleotidni lanac sa 21 nukleotidnom jedinicom može spariti baze sa drugim polinukleotidom od 21 nukleotidne jedinice, pri čemu je samo 19 baza svakog lanca komplementarno ili suštinski komplementarno, tako da "dupleks" sadrži 19 baznih parova. Preostale baze mogu, na primer, biti prisutne kao viškovi na 5' i/ili 3' kraju. Nadalje, u dupleksu, nije neophodna komplementarnost od 100%; dozvoljena je značajna komplementarnost u dupleksu. Značajna komplementarnost se odnosi na komplementarnost od 75% ili više. Na primer, rasparenost u dupleksu koji sadrži 19 baznih parova rezultira komplementarnošću od 94,7% koja dupleks čini suštinski komplementarnim.
[0032] Ovde je potrebna napomena da, a kao što se to upotrebljava u predmetnoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, forme jednine takođe uključuju množinu pojmova ukoliko kontekst jasno ne ukazuje na drugačije.
[0033] Takođe se napominje da pojam "oko", kako se ovde koristi, označava “približno”.
Antisens polinukleotidi/dizajn polinukleotida
[0034] Za indukovanje preskakanja egzona u egzonima transkripta gena za sarkoglikan, antisens polinukleotid se bira na osnovu sekvenci egzona prikazanih u Tabelama 1 i 2. Prijava takođe obezbeđuje kombinaciju ili "koktel" dva ili više antisens polinukleotida sposobna da se vezuju za izabranu ciljnu sekvencu ili ciljne sekvence da bi se indukovalo preskakanje egzona. Preskakanje egzona koje je ovde predviđeno indukuje isključivanje egzona 4, 5, 6 i/ili 7 tako da se generiše interno skraćen protein gama sarkoglikana sa nepromenjenim okvirom čitanja. Isključivanje egzona 4, 5, 6 i 7 rezultuje obrazovanjem interno skraćenog proteina kome nedeostaje 135 aminokiselina, dok delecija egzona 5 rezultuje interno deletiranim proteinom sa nepromenjenim okvirom čitanja kome nedeostaje 40 amino kiselina. Interno skraćeni proteini, nazvani mini-Sgcg, zadržavaju sposobnost interakcije sa distrofinom i njegovim pridruženim proteinima i stabilizuju srčane i skeletne mišićne ćelije.
[0035] U kontekstu prijave, poželjna ciljna mesta predstavljaju ona koja su uključena u obradu iRNK (tj. donorska mesta obrade, akceptorska mesta obrade ili egzonske pojačivačke elemenate obrade). Obrada tačaka grananja i sekvenci prepoznavanja egzona ili pojačivača obrade takođe predstavljaju potencijalna ciljna mesta modulacije obrade iRNK.
[0036] Dakle, u raznim primerima primene, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest ili više antisens polinukleotida se upotrebljava za indukovanje preskakanja egzona u nukleinskoj kiselini gama sarkoglikana. Izbor broja antisens polinukleotida može biti empirijski određen od strane prosečno iskusnog stručnjaka. Prosečno iskusan stručnjak može pojedinačno testirati relativnu sposobnost kompozicija koje sadrže dva, tri, četiri ili više antisens polinukleotida da proizvedu proteinski proizvod od interesa in vitro. Ukratko, a u jednom referentnom primeru, kompozicija koja sadrži jedan antisens polinukleotid dizajniran tako da specifično hibridizuje sa akceptorskim mestom obrade u egzonu 4 nukleinske kiseline gama sarkoglikana (i blokira ga), se dodaje u kulturu fibroblasta dobijenih iz pacijenta koji ima mutaciju u gama sarkoglikanu. Fibroblasti se potom indukuju u miogenu liniju forsiranom ekspresijom MyoD (pogledati Primer 2 za detalje), a rezultujuće miotube se testiraju na prisustvo eksprimiranog mini-Sgcg proteina na površini, na primer i bez ograničavanja, eksperimentom imunofluorescencije. Dalja imunofluorescentna analiza miotuba se može sprovesti kako bi se utvrdilo da li dodatni sarkoglikani (tj. α-, β- i δ-sarkoglikan) kolokalizuju sa mini-Sgcg u miotubama. Navedena istovremena lokalizacija članova sarkoglikanskog kompleksa koji je asociran sa mišićnom membranom, ukazuje da je mini-Sgcg koji se proizvodi nakon primene kompozicije koji sadrži jedan antisens polinukleotid sposoban da efektivno indukuje preskakanje egzona u nukleinskoj kiselini gama sarkoglikana, a čega je rezultat bila sinteza skraćenog protiena koji zadržava svoju sposobnost da asocira sa drugim članovima sarkoglikanskog kompleksa, kao i da se ugradi u mišićnu membranu. Slični eksperimenti se mogu sprovesti sa kompozicijama koje pojedinačno sadrže dva, tri, četiri, pet ili više antisens polinukleotida, od kojih je svaki dizajniran tako da specifično hibridizuje sa egzonom nukleinske kiseline gama sarkoglikana.
[0037] Da bi se identifikovali i izabrali antisens polinukleotidi pogodni za upotrebu u modulaciji preskakanja egzona, najpre mora biti identifikovana sekvenca nukleinske kiseline čija će se funkcija modulisati. To može biti, na primer, gen (ili iRNK transkribovana sa gena) čiji je ekspresija udružena sa određenim stanjem poremećaja ili oboljenja, ili to može biti molekul nukleinske kiseline iz infektivnog agensa. U kontekstu prijave, pogodna ciljna mesta su ona koja su uključena u obradu iRNK (npr. donorska mesta obrade, akceptorska mesta obrade ili egzonski pojačivački elemenati obrade). Obrada tačaka grananja i sekvenci prepoznavanja egzona ili pojačivača obrade takođe su potencijalna ciljna mesta modulacije obrade iRNK koja se razmatra prijavom.
Tabela 2. Tabela koordinata egzona dobijenih sa UCSC Human Genome Build 19.
[0038] Stručnjaci iz oblasti lako mogu dizajnirati antisens polinukleotide u skladu sa predmetnom prijavom. Na primer, opšta znanja iz oblasti uključuju, ali nisu ograničena na, publikacije Aartsma-Rus i saradnici, Methods Mol Biol. 867: 117-29 (2012); Aartsma-Rus i saradnici, Methods Mol Biol. 867: 97-116 (2012); Van Roon-Mom i saradnici, Methods Mol Biol. 867: 79-96 (2012). Opšte smernice uključuju i pokušaj izbegavanja 3 uzastopna G ili C nukleotida, izbor dužine i sekvenci koje favorizuju samu strukturu (izbegavanje struktura “ukosnice”), kao i izbegavanje onih sekvenci za koje je verovatno da mogu dovesti do obrazovanja dimera prajmera. U pojedinim primerima primene, antisens polinukleotid prijave predstavlja onaj koji je dizajniran da specifično hibridizuje sa egzonom ili granicom introna i egzona tako da antisens polinukleotid specifično hibridizuje sa sekvencom koja je u potpunosti u okviru egzona nukleinske kiseline gama sarkoglikana ili tako da približno jedan nukleotid antisens polinukleotida prelazi preko navedene granice introna i egzona kada je antisens polinukleotid specifično hibridizovan sa nukleinskom kiselinom gama sarkoglikana. U pojedinim primerima primene, gde antisens polinukleotid specifično hibridizuje sa sekvencom koja je u potpunosti u okviru egzona, razmatra se da je kraj antisens polinukleotida približno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više nukleotida udaljen od kraja egzona. Granica introna i egzona za svaki od egzona 4, 5, 6 i 7 je prikazana u Tabeli 1. U daljim primerima primene, antisens polinukleotid prijave je onaj koji je dizajniran tako da specifično hibridizuje sa granicom introna i egzona u okviru nukleinske kiseline gama sarkoglikana tako da približno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više nukleotida antisens polinukleotidne granice prelazi preko navedene granice introna i egzona. Podrazumeva se da nukleotid može "prelaziti granicu introna i egzona" bilo na stranu egzona ili na stranu introna. Prema tome, antisens polinukleotid koji specifično i pretežno hibridizuje sa intronskom sekvencom i hibridizuje samo sa jednim nukleotidom susednog egzona "prelazi granicu introna i egzona" za jedan nukleotid. Slično navedenom, antisens polinukleotid koji specifično hibridizuje sa egzonskom sekvencom i hibridizuje samo sa jednim nukleotidom susednog introna "prelazi granicu introna i egzona" za jedan nukleotid. U bilo kom od prethodno navedenih primera primene, antisens polinukleotid je dužine od najmanje oko 10 nukleotida i više do oko 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više nukleotida. Dužine antisens polinukleotida koje se razmatraju prijavom su detaljnije diskutovane u nastavku teksta.
[0039] U pojedinim aspektima, prijava obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže dva ili više antisens polinukleotida za indukovanje preskakanja egzona u nukleinskoj kiselini gama sarkoglikana tako da se proizvede "mini-Sgcg" protein koji je sposobnan da (a) efektivno asocira sa drugim članovima sarkoglikanskog kompleksa (tj. sa α-, β- i δ-sarkoglikanom) i (b) pravilno se ugradi u mišićnu membranu. U pojedinim primerima primene, postupci koji su ovde opisani dovode do obnavljanja sarkoglikana na površini mišićne membrane, tako da se približno 1% proteina gama sarkoglikana obnovi u odnosu na količinu proteina gama sarkoglikana na mišićnoj membrani koja je prisutna u odsustvu primene farmaceutske kompozicije. U daljim primerima primene, upotreba koja je ovde opisana rezultira obnovom sarkoglikanskog proteina na površini mišićne membrane tako da je približno 2%, približno 3%, približno 4%, približno 5%, približno 6%, približno 7%, približno 8%, približno 9%, približno 10%, približno 11%, približno 12%, približno 13%, približno 14%, približno 15%, približno 16%, približno 17%, približno 18%, približno 19%, približno 20%, približno 22%, približno 23%, približno 24%, približno 25%, približno 26%, približno 27%, približno 28%, približno 29%, približno 30%, približno 31%, približno 32%, približno 33%, približno 34%, približno 35%, približno 36%, približno 37%, približno 38%, približno 39%, približno 40%, približno 41%, približno 42%, približno 43%, približno 44%, približno 45%, približno 46%, približno 47%, približno 48%, približno 49%, približno 50%, približno 51%, približno 52%, približno 53%, približno 54%, približno 55%, približno 56%, približno 57%, približno 58%, približno 59%, približno 60%, približno 61%, približno 62%, približno 63%, približno 64%, približno 65%, približno 66%, približno 67%, približno 68%, približno 69%, približno 70%, približno 71%, približno 72%, približno 73%, približno 74%, približno 75%, približno 76%, približno 77%, približno 78%, približno 79%, približno 80%, približno 81%, približno 82%, približno 83%, približno 84%, približno 85%, približno 86%, približno 87%, približno 88%, približno 89%, približno 90%, približno 91%, približno 92%, približno 93%, približno 94%, približno 95%, približno 96%, približno 97%, približno 98%, približno 99%, približno 2 puta, približno 3 puta, približno 4 puta, približno 5 puta, približno 6 puta , približno 7 puta, približno 8 puta, približno 9 puta, približno 10 puta ili više proteina gama sarkoglikana obnovljeno u odnosu na količinu proteina gama sarkoglikana na mišićnoj membrani koja se uočava u odsustvu primene farmaceutske kompozicije. Navedena obnova proteina gama sarkoglikana na mišićnoj membrani može biti određena od strane prosečno iskusnog stručnjaka iz oblasti, na primer i bez ograničavanja, uzimanjem biopsije mišića od pacijenta i sprovođenjem imunofluorescentnog eksperimenta sa antitelom koje karakteriše specifičan afinitet vezivanja za mini-Sgcg protein.
Polinukleotidi
[0040] Proizvodi, upotrebe i postupci prijave sadrže dva ili više polinukleotida. Kako se ovde upotrebljava, "polinukleotid" je oligomer koga čine nukleotidi. Polinukleotid može biti sastavljen od DNK, modifikovanih oblika njene RNK ili njihovih kombinacija.
[0041] Termin "nukleotid" ili njegova množina, a kao što se ovde upotrebljava, naizmenično označava modifikovane oblike koji su ovde diskutovani i inače poznati u stanju tehnike. U određenim slučajevima, u praksi se upotrebljava termin "nukleobaza" koja obuhvata nukleotide koji se javljaju u prirodi, kao i modifikacije nukleotida koji mogu biti polimerisani. Stoga, nukleotid ili nukleobaza označava nukleobaze koje se javljaju u prirodi kao što su adenin (A), guanin (G), citozin (C), timin (T) i uracil (U), kao i nukleobaze koje se ne javljaju u prirodi poput ksantina, diaminopurina, 8-okso-N6-metiladenina, 7-deazaksantina, 7-deazaguanina, N4,N4-etanocitozina, N',N'-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitozina (mC), 5-(C3-C6)-alkinil-citozina, 5-fluorouracila, 5-bromuracila, pseudoizocitozina, 2-hidroksi-5-metil-4-tr-iazolopiridina, izocitozina, izoguanina, inozina i nukleobaza "koje se ne javljaju u prirodi" koje su opisane u publikaciji Benner i saradnici, SAD patentni spis br.
5,432,272 i Susan M. Freier i Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: str. 4429-4443. Termin "nukleobaza" takođe uključuje ne samo poznate purinske i pirimidinske heterocikline, već i heterociklične analoge i njihove tautomere. Dalje nukleobaze koje se javljaju i ne javljaju u prirodi uključuju one koje su prijavljene u SAD patentnom spisu br.3,687,808 (Merigan i saradnici), u poglavlju 15 autora Sanghvi, u Antisense Research and Application, izd. S.T.Crooke i B. Lebleu, CRC Press, 1993, u publikaciji Englisch i saradnici, 1991, Angewandte Chemie, internacionalno izdanje, 30: 613-722 (posebno pogledati strane 622 i 623, kao i u Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz, izd. John Wiley & Sons, 1990, str. 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607). U raznim aspektima, polinukleotidi takođe uključuju jednu ili više "nukleozidnih baza" ili "baznih jedinica" koji uključuju jedinjenja kao što su heterociklična jedinjenja koja mogu poslužiti kao nukleobaze, uključujući i određene "univerzalne baze" koje nisu nukleozidne baze u najklasičnijem smislu, ali služe kao nukleozidne baze. Univerzalne baze uključuju 3-nitropirol, opciono supstituisane indole (npr. 5-nitroindol) i opciono supstituisani hipoksantin. Druge poželjne univerzalne baze uključuju derivate pirola i diazola ili triazola, uključujući i one univerzalne baze koje su poznate u stanju tehnike.
[0042] Polinukleotidi takođe mogu podrazumevati modifikovane nukleobaze. "Modifikovana baza" u stanju tehike podrazumeva onu koja se može upariti sa bazom koja se javlja u prirodi (npr. sa adeninom, guaninom, citozinom, uracilom i/ili timinom) i/ili koja se može upariti sa bazom koja se ne javlja u prirodi. Primeri modifikovanih baza su opisani u EP 1072679 i WO 97/12896. Modifikovane nukleobaze obuhvataju, bez ograničavanja, 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkilne derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkilne derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin i druge alkinilne derivate pirimidinskih baza, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseuduracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 2-F-adenin, 2-amino-adenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazaguanin i 7-deazaadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje, modifikovane baze uključuju triciklične pirimidine kao što su fenoksazin citidin (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoksazin-2(3H)-on), fenotiazin citidin (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-on), baze stege kao što je supstituisan fenoksazin citidin (npr. 9-(2-aminoetoksi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoksazin-2(3H)-on), karbazol citidin (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-on), piridoindol citidin (H-pirido[3',2':4,5]pirolo[2,3-d]pirimidin-2-on). Modifikovane baze mogu uključivati i one u kojima se purin ili pirimidinska baza zamenjuje drugim heterociklinima, na primer 7-deaza-adeninom, 7-deazaguanozinom, 2-aminopiridinom i 2-piridonom. Dodatne nukleobaze uključuju one koje su prijavljenje u SAD patentnom spisu br.3,687,808, one prijavljene u The Concise Encyclopedia of Polimer Science and Engineering, str.858-859, Krosvitz, J. I., izd. John Wiley & Sons, 1990, one prijavljene od strane Englisch-a i saradnika, 1991, Angewandte Chemie, internacionalno izdanje, 30: 613, i one prijavljene od strane Sanghvi, Y.S., poglavlje 15, Antisense Research and Application, str. 289-302, izd. S.T.Crooke i B. Lebleu, CRC Press, 1993. Određene od navedenih baza su korisne za povećanje afiniteta vezivanja polinukleotida i uključuju 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i O-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropiladenin, 5-propiniluracil i 5-propinilcitozin. Za supstitucije 5-metilcitozina je pokazano da povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2 °C i da se, u određenim aspektima, kombinuju sa modifikacijama 2'-O-metoksietil-šećera. Pogledati SAD patentni spis br. 3,687,808, SAD patentne spise br. 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,750,692 i 5,681,941.
[0043] Modifikovani polinukleotidi se razmatraju za upotrebu, pri čemu se i jedan i više šećera i/ili jedna ili više internukleotidnih veza nukleotidnih jedinica u polinukleotidu zamenjuju sa šećerima "koji se ne javljaju u prirodi" (tj. šećerima različitim od riboze ili deoksribroze) ili međukleotidnim vezama "koji se ne javljaju u prirodi", tim redom. Jedan aspekt predmetnog primer primene razmatra peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA od engl. Peptide nucleic acid). U PNA jedinjenjima, okosnica koju čine šećeri polinukleotida je zamenjena okosnicom koja sadrži amide (npr. peptidne veze između N-(2-aminoetil)-glicinskih jedinica). Pogledati, na primer, SAD patentne spise br.5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262, kao i publikaciju Nielsen i saradnici, Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0044] Modifikovani polinukleotidi takođe mogu sadržavati jednu ili više supstituisanih ugljenohidratnih grupa. Jedan aspekt se odnosi na modifikaciju šećera koja uključuje zaključane nukleinske kiseline (LNA od engl. Locked Nucleic Acids) u kojima je 2'-hidroksilna grupa vezana za 3 'ili 4' atom ugljenika u prstenu šećera, čime se obrazuje biciklična grupa šećera. Veza, u određenim aspektima, podrazumeva metilen (-CH2-)ngrupu koja premošćuje 2' atom kiseonika i 4' atom ugljenika, pri čemu je n 1 ili 2. LNA i njihova priprema su opisani u WO 98/39352 i WO 99/14226.
[0045] Da bi se izbegla degradacija pre-iRNK prilikom obrazovanja dupleksa sa antisens polinukleotidima, antisens polinukleotidi koji se koriste u postupku mogu biti prilagođeni tako da se minimizuje ili spreči cepanje endogenom RNazom H. Navedeno svojstvo predstavlja prednost pošto tretman RNK sa nemetilovanim polinukleotidima bilo intracelularno ili u neprečišćenim ekstraktima koji sadrže RNazu H dovodi do degradacije pre-iRNK:antisens polinukleotidnih dupleksa. Prijavom se razmatra i bilo koji oblik modifikovanog antisens polinukleotida koji je otporan na navedenu degradaciju ili ne indukuje navedenu degradaciju. Neograničavajući primeri antisens molekula koji, kada su u dupleksu sa RNK, ne podležu razlaganju dejstvom RNaze H, predstavljaju polinukleotide koji sadrže 2'-O-metil derivate nukleotida. 2'-O-metil-oligoribonukleotidi su veoma stabilni u ćelijskoj sredini i životinjskim tkivima, a njihovi dupleksi sa RNK imaju veće Tmvrednosti od njihovih ribo- ili dezoksiribo-parnjaka.
[0046] Antisens polinukleotidi koji ne aktiviraju RNazu H se mogu pripremiti u skladu sa poznatim tehnikama (pogledati, na primer, SAD patentni spis br. 5,149,797). Navedeni antisens polinukleotidi, koji mogu predstavljati dezoksiribonukleotidne ili ribonukleotidne sekvence, jednostavno sadrže bilo koju strukturnu modifikaciju koja sterički otežava ili sprečava vezivanje RNaze H za molekul dupleksa koji sadrži polinukleotid kao jedan od njegovih članova, pri čemu strukturna modifikacija suštinski ne ometa ili ne remeti obrazovanje dupleksa. Pošto su delovi polinukleotida koji su uključeni u obrazovanje dupleksa suštinski različiti od onih delova koji su uključeni u povezivanje sa RNazom H, dostupni su brojni antisens molekuli koji ne aktiviraju RNazu H. (Aktivacija kao termin se upotrebljava tako da se odnosi na razlaganje RNazom H, bilo da je to rezultat činjenice da supstrat nije podložan takvoj razgradnji ili toga što takav supstrat ne dovodi do degradacije). Na primer, navedeni antisens molekuli mogu biti polinukleotidi u kojima bar jedan, ili svi od povezujućih modifikovanih fosfata predstavljaju modifikovane fosfate kao što su metil fosfonati, metil fosforotioati, fosforomorfolidati, fosforopiperazidati i/ili fosforamidati. Na primer, bilo koji drugi od povezujućih modifikovanih fosfata mogu biti modifikovani kao što je to opisano. U drugom neograničavajućem primeru, navedeni antisens polinukleotidi su polinukleotidi u kojima bar jedan ili svi nukleotidi sadrže 2' ugljenik vezan za niži alkilni ostatak (npr. C1-C4, linearni ili razgranati, zasićeni ili nezasićeni alkil kao što je metil, etil, etenil, propil, 1-propenil, 2-propenil i izopropil ostatak). Na primer, bilo koji drugi od nukleotida može biti modifikovan kao što je to opisano.
[0047] Postupci pripreme polinukleotida unapred određene sekvence su dobro poznati. Pogledati, npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. izdanje, 1989) i F. Eckstein (izd.) Oligonucleotides and Analogues, 1. izd. (Oxford University Press, New York, 1991). Postupci sinteze na čvrstoj fazi su prioritenti i za poliribonukleotide i polidezoksiribonukleotide (dobro poznati postupci sinteze DNK su takođe korisni za sintezu RNK). Polinukleotidi mogu biti pripremljeni i enzimski. Nukleobaze koje se ne javljaju u prirodi mogu takođe biti ugrađene u polinukleotid. Pogledati, npr. SAD patentni spis br. 7,223,833; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane i saradnici, J. Am. Chem. Soc., 83: 2599 (1961); Kosturko i saradnici, Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang i saradnici, J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); i Zimmermann i saradnici, J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002).
[0048] Polinukleotidi koji se ovde razmatraju su opsega dužine od približno 5 nukleotida do približno 50 nukleotida. U pojedinim primerima primene, polinukleotid je opsega između najmanje 5 nukleotida i najmanje 20 nukleotida, između najmanje 5 nukleotida i najmanje 30 nukleotida ili između najmanje 5 nukleotida i najmanje 50 nukleotida.
[0049] U daljim primerima primene, polinukleotid koji je obuhvaćen prijavom je dužine od približno 5 do približno 60, 70, 80, 90, 100 ili više nukleotida, od približno 5 do približno 90 nukleotida, od približno 5 do približno 80 nukleotida, od približno 5 do približno 70 nukleotida, od približno 5 do približno 60 nukleotida, od približno 5 do približno 50 nukleotida, od približno 5 do približno 45 nukleotida, od približno 5 do približno 40 nukleotida, od približno 5 do približno 35 nukleotida, od približno 5 do približno 30 nukleotida, od približno 5 do približno 25 nukleotida, od približno 5 do približno 20 nukleotida, od približno 5 do približno 15 nukleotida, od približno 5 do približno 10 nukleotida, a svi polinukleotidi su dužine koja je intermedijerna veličinama koje su specifično prijavljene do opsega koji omogućava da polinukleotid postigne željeni rezultat. Prema tome, razmatraju se polinukleotidi dužine od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 282929323233 3435 36 3738 3940 41 4243 44 4647 4849 50 5152, 53535456 57 5859 6061 62 6364 6566 67 6869 7071 7273 74 7576 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili više nukleotida.
[0050] Polinukleotidi prijave su približno sa od 40% GC do približno 60% GC i sa Tm od približno 48 °C ili više.
[0051] Druga modifikacija polinukleotida predmetnog pronalaska podrazumeva hemijsko povezivanje polinukleotida sa jednom ili sa više grupa ili konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje polinukleotida. Navedene grupe uključuju, ali nisu ograničene na, lipidne grupe kao što su holesterolska grupa, holinska kiselina, tioetar, npr. heksil-S-tritiltiol, tioholesterol, alifatični lanac, npr. ostatak dodekandiola ili andecila, fosfolipid, npr. di-heksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-O-heksadecil-rac-glicerero-3-H-fosfonat, poliamin ili polietilenglikolni lanac ili adamantanska sirćetna kiselina, palmitilna grupa ili oktadecilamin ili heksilamino-karboniloksiholesterolni ostatak.
Terapijski agensi
[0052] Jedinjenja prijave se takođe mogu upotrebljavati kao profilaktička ili terapijska, a što se može upotrebiti u svrhu lečenja genetskog oboljenja.
[0053] U jednom primeru primene, prijava obezbeđuje kompozicije koje sadrže dva ili više antisens polinukleotida koji se vezuju za izabranu ciljnu sekvencu pre-iRNK gama sarkoglikana da bi indukovalo efikasno i konzistentno preskakanje egzona koje je ovde opisano, u terapijski ili profilaktički efektivnoj količini, pomešano sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, diluentom ili ekscipijensom.
[0054] Farmaceutski prihvatljiv nosač se generalno odnosi na materijale koji su pogodni za primenu kod subjekta, pri čemu nosač nije biološki štetan ili na drugi neki način uzrokuje neželjene efekte. Navedeni nosači su obično inertni sastojci leka. Uobičajeno je da se nosač primenjuje subjektu zajedno sa aktivnim sastojkom bez izazivanja neželjenih bioloških efekata ili interakcije na štetan način sa bilo kojom drugom komponentom farmaceutske kompozicije u kojoj je sadržan. Pogodni farmaceutski nosači su opisani u publikaciji Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990).
[0055] U specifičnijem obliku prijave su obezbeđeni farmaceutske kompozicije koje sadrže terapijski efektivne količine dva ili više antisens polinukleotida zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentima, konzervansima, solubilizatorima, emulgatorima, adjuvansima i/ili nosačima. Navedene kompozicije uključuju diluente različitog sadržaja pufera (npr. fosfatnog, Tris-HCl, acetatnog), pH i jonske jačine, kao i aditive poput deterdženata i solubilizujućih agenasa (npr. Tween-a 80, Polisorbata 80), antioksidanasa (npr. askorbinske kiseline, natrijum metabisulfita), konzervanasa (npr. Timersola, benzil alkohola) i sredstava za povećanje mase (npr. laktoze, manitola). Materijal može biti inkorporiran u čestične kompozicije polimernih jedinjenja kao što su, na primer i bez ograničavanja, polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina ili u lipozome. Moguća je upotreba i hijaluronske kiseline. Navedene kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu in vivo klirensa prijavljenih kompozicija. Kompozicije mogu biti pripremljene u tečnom obliku ili mogu biti u vidu suvog praha kao što je liofilizovana forma.
[0056] Potrebno je napomenuti da farmaceutske kompozicije koje su obezbeđene prijavom mogu biti primenjene na bilo koji način koji je poznat u stanju tehnike. Prioritetno, farmaceutske kompozicije za primenu se primenjuju injeciranjem, oralno ili kroz pluća, ili pak nazalnim putem. Antisens polinukleotidi se, u raznim primerima primene, isporučuju intravenskim, intra-arterijskim, intraperitonealnim, intramuskularnim ili subkutanim načinima primene.
[0057] Antisens molekuli pronalaska obuhvataju sve farmaceutski prihvatljive soli, estre ili soli navedenih estara ili bilo koje drugo jedinjenje koje je, nakon primene kod životinje uključujući i čoveka, sposobno da obezbedi (direktno ili indirektno) biološki aktivni metabolit ili njegov ostatak. Prema tome, na primer, prijava se takođe svodi na prolekove i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja pronalaska, farmaceutski prihvatljive soli navedenih prolekova i druge bioekvivalente.
[0058] Termin "farmaceutski prihvatljive soli" se odnosi na fiziološki i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja pronalaska: tj. soli koji zadržavaju željenu biološku aktivnost jedinjenja iz koga su izvedene i ne doprinose njegovim neželjenim toksilnim efektima.
[0059] Za polinukleotide, poželjni primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na: (a) soli obrazovane sa kationima kao što su natrijum, kalijum, amonijum, magnezijum, kalcijum, poliamini poput spermina i spermidina; (b) kisele adicione soli obrazovane sa neorganskim kiselinama, na primer, hlorovodoničnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, fosfornom kiselinom, azotnom kiselinom; (c) soli obrazovane sa organskim kiselinama kao što su, na primer, sirćetna kiselina, oksalna kiselina, vinska kiselina, sukcinska kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, glukonska kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, askorbinska kiselina, benzoeva kiselina, tanična kiselina, palmitinska kiselina, alginska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, naftalendisulfonska kiselina, poligalakturonska kiselina; i (d) soli obrazovane od elementalnih anjona kao što su hlor, brom i jod. Farmaceutske kompozicije prijave mogu biti primenjene na brojne načine u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i u zavisnosti od površina koja se tretira. Primena može biti topikalna (uključujući i oftalmološku i na mukozne membrane, uključujući rektalnu primenu), preko pluća, npr. inhalacijom praha ili aerosola, (uključujući upotrebu nebulizatora, intratrahealnu, intranazalnu, epidermalnu i transdermalnu primenu), oralno ili parenteralno. Parenteralna primena uključuje intravensku, intra-arterijsku, subkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; ili intrakranijalnu, npr. intratekalnu ili intraventrikularnu primenu. Polinukleotidi sa najmanje jednom 2'-O-metoksietil modifikacijom se smatraju posebno korisnim za oralnu primenu.
[0060] Farmaceutske formulacije prijave koje konvencionalno mogu biti u jediničnom doznom obliku, mogu biti pripremljene upotrebom konvencionalnih tehnika koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Navedene tehnike uključuju korak dovođenja u vezu aktivnih sastojaka sa farmaceutskim nosačem/nosačima ili ekscipijensom/ekscipijensima. U principu, formulacije se pripremaju uniformnim dovođenjem u vezu aktivnih sastojaka sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, a zatim, ukoliko je neophodno, oblikovanjem proizvoda.
[0061] Prijava razmatra i kombinovanu terapiju sa dodatnim terapijskim agensom. Primeri terapijskih agenasa koji se mogu istovremeno isporučivati sa kompozicijom prijave uključuju, bez ograničavanja, glukokortikoidni steroid (na primer i bez ograničavanja, prednizon i deflazakort), inhibitor enzima za konvertovanje angiotenzina, blokator beta adrenergičnog receptora, anti-fibrotični agens i njihove kombinacije.
Komercijalni kompleti
[0062] Prijava takođe obezbeđuje komplete za lečenje pacijenta sa genetskim oboljenjem kao što je LGMD2C. U jednom aspektu, komplet sadrži kompoziciju koja je ovde prijavljena, opciono u kontejneru, kao i pakovanje, oznaku pakovanja, uputstva ili druga obeležja.
[0063] U daljim primerima primene, obezbeđen je komplet koji sadrži dodatni polinukleotid, pri čemu dodatni polinukleotid specifično hibridizuje sa egzonom u RNA gama sarkoglikana.
[0064] Za prosečno iskusne stručnjake je bitna napomena da primena prethodno navedenog postupka ima široku primenu za identifikaciju antisens molekula pogodnih za upotrebu u lečenju mnogih drugih bolesti.
PRIMERI
Primer 1
Efikasnost oporavka γ-sarkoglikanom pune dužine sisara i mini-Sgcg u sarkoglikan-/<->mušicama.
[0065] Sarkoglikani su evolutivno očuvani između Drosophila i sisara, a γ-sarkoglikan-/<->mušice razvijaju simptome slične simptomima kod sisara. Napravljene su transgene mušice koje eksprimiraju mišiji γ-sarkoglikan pune dužine i mini-Sgcg i utvrđeno je da mini-Sgcg protein pravilno lokalizuje na plazma membrani mišićnih ćelija mušica.
[0066] γ/δ-Sarkoglikan-/<->mušice (Sgcd<840>) su prethodno generisane i okarakterisane [Allikian i saradnici, Hum Mol Genet 16: 2933-2943 (2007)]. Upotrebom PCR i Southern blot postupaka, pokazano je da su egzoni od 1 do 3 i parcijalni egzon 4 od 6 egzona u Sgcd genu Drosophila-e deletirani kod Sgcd<840>mušica.
[0067] Da bi se odredilo da li mini-Sgcg zadržava funkciju proteina pune dužine, upotrebljen je UAS-GAL4 sistem [Brand i saradnici, Development.118: 401-15 (1993)] da bi se eksprimirala dva različita konstrukta sarkoglikana. GAL4 je transkripcioni faktor koji prepoznaje specifičnu sekvencu pojačivača koja se naziva UAS.
[0068] Prvi konstrukt eksprimira kodirajuću sekvencu pune dužine mišijeg Sgcg gena od egzona 2 do egzona 8 koji je označen kao UAS-Sgcg. Drugi konstrukt, označen kao UAS-mini-Sgcg, sadrži samo sekvencu tzv. Xpress epitopskog obeleživača i egzon 2, egzon 3 i egzon 8 mišijeg Sgcg gena (Nacrt 1). Kraći konstrukt zadržava kodirajuću sekvencu intaktnog unutarćelijskog domena, transmembranskog domena i dela ekstracelularnog domena uključujući i esencijalni karboksilni terminus (Nacrt 2). Poređenje konstrukata upotrebljenih u Drosophila-i i mišu je prikazano na Nacrtu 3. Jedna UAS-Sgcg i jedna UAS-mini-Sgcg transgena linija su sintetisane na istooj genetskoj osnovi. Obezbeđen je i štok Mef2-GAL4. Mef2 je promotor specifičan za mišiće koji pospešuje ekspresiju GAL4 i u tkivu srca i skeletnih mišića. Mušice sa oba konsturkta, i Mef2-GAL4 i UAS-Sgcg ili UAS-mini-Sgcg, specifično proizvode Sgcg ili mini-Sgcg protein u srčanoj cevi i mišićnom tkivu. Da bi se eksprimirali Sgcg pune dužine i mini-Sgcg u mutantnim mušicama, Sgcd<840>, naivne ženke Mef2-GAL4 su ukrštene bilo sa UAS-Sgcg/+ ili UAS-mini-Sgcg/+ muškim mušicama. Kako se Sgcd gen nalazi na X hromozomu, svo muško potomstvo iz svakog ukrštanja je bilo Sgcd-/-, pri čemu je polovina mušica nosila i GAL4 i UAS transgene. Druga polovina je poslužila kao interna negativna kontrola. Navedeno poređenje je minimalizovalo efekte sredine i genetske osnove u testovima ponašanja. Mušice divljeg tipa odgovarajućeg uzrasta i genetske osnove su poslužile kao pozitivna kontrola.
[0069] Podaci su pokazali da mini-Sgcg ima jasno različitu lokalizaciju na plazma membrane u srčanim tubama (Nacrt 4) i telesnim mišićima Sgcd<840>mušica (Nacrt 5). Navedeni obrazac je bio sličan obrascu lokalizacije Sgcg pune dužine (Nacrt 5). Studije sa humanim mišićima, miševima i sistemima za ćelijsku ekspresiju sugerišu da je za tranport γ-sarkoglikana na plazma membranu neophodno obrazovanje sarkoglikanskog komleksa [Allikian i saradnici, Traffic 8: 177-83 (2007); Chen i saradnici, Exp Cell Res. 312: 1610-25 (2006); Crosbie i saradnici, Hum Mol Genet. 9: 2019-27 (2000)]. Stoga, pravilna subćelijska lokalizacija oba proteina podrazumeva interakciju sa sarkoglikanskim subjedinicama mušice, naglašavajući evolutivnu očuvanost između mišjeg i γ-sarkoglikana mušice. Još važnije, rezultati su ukazali da mini-Sgcg protein zadržava funkciju interakcije sa drugim komponentama distrofinskog kompleksa.
Struktura i funkcija skeletnog mišića kod transgenom oporavljenjih mušica.
[0070] Pacijente sa LGMD2C karakteriše jasno različit nalaz mišićne histologije od zdravih osoba, uključujući gubitak zrelih mišićnih vlakana, abnormalno deponovanje fibroznog ili masnog tkiva i infiltraciju imunih ćelija [Dubowitz, Muscle disorders in childhood. Saunders, Philadelphia, xiii, 282 (1978)]. Sgcd<840>mušice pokazuju povećano odvajanje mišića za letenje od egzoskeleta, a navedeni nalaz je izraženiji ukoliko se mušicama dozvoli da vežbaju [Goldstein i saradnici, Hum Mol Genet.20: 894-904 (2011)]. Da bi se podstakla upotreba mišića, mušice su držane u kutiji veličine 20x20x20 cm umesto u standardnim bočicama da bi mogle lako da lete. Mušice su gajene do starosti od 28 dana, kada su prikupljane za histološki pregled. Preciznije, prikupljeni su trupovi, koji su dalje issecirani i obojeni hematoksilinom i eosinom (H&E) upotrebom Karnojevog protokola fiksacije. Dalje je upoređena učestalost frakture mišića za letetnje između mutantnih mušica, transgenih mušica i mušica divljeg tipa.
[0071] Slično humanim pacijentima, Sgcd<840>mušice razvijaju poremećaj lokomotorne sposobnosti tokom vremena [Allikian i saradnici, Hum Mol Genet 16: 2933-43 (2007)]. Defekti pokretljivosti se mere upotrebom negativnog testa geotaksije. Za razliku od većine aparata za merenje u masi, dizajniran je "individualizovaniji" aparat koji može obezbediti merenje sposobnosti hodanja pojedinačne mušice sa preciznošću od 0,5 cm [Goldstein i saradnici, Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. Aparat se sastoji od 16 vertikalnih plastičnih cevi dužine 13 cm sa čije obe strane je postavljena merna skala. Ukratko, svaka pojedinačna mušica se postavlja u svaku tubu nakon anestezije, dozvoljava se oporavak od 30 minuta i zatim se mušica testira. Da bi ispitala sposobnost hodanja, mušice su tapkanjem spuštane na dno i dozvoljeno im je da se penju tokom 5 sekundi. Zabeležena je razdaljina koju svaka mušica pređe na kraju 5 sekundi. Urađeno je šest ponavljanja sa intervalom pauze u trajanju od jednog minuta. Za analizu podataka je korišćena analiza varijanse (ANOVA) sa Tuki post-hok testom, upotrebom kompjuterskog programa PRISM.
Procena oporavka funkcije srca upotrebom optičke koherentne tomografije (OCT)
[0072] Pacijenti sa mišićnom distrofijom razvijaju dilatacionu kardiomiopatiju usled oštećenja kontraktilnosti srčanih mišićnih ćelija. Sgcd<840>mušice takođe karakteše nepravilnost u radu srca kako stare, na šta ukazuju povećanje dimenzija srčane cevi i redukcija skraćenja frakcija [Allikian i saradnici, Hum Mol Genet 16: 2933-43 (2007); Goldstein i saradnici, Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. Funkcija srca mušica se ispituje sa OCT [Wolf i saradnici, Proc Natl Acad Sci USA.103: 1394-9 (2006)]. OCT kod mušica je pandan ehokardiografiji (ECHO) koja se koristi kod sisara. Glavna razlika između OCT-a i ECHO-a je što OCT meri odbijenu svetlost umesto zvuka. Upotrebom OCT se određuje krajnji sistolni prečnik (ESD), krajnji dijastolni prečnik (EDD), frakciono skraćivanje (FS) i puls srca. Iz svakog genotipa je testirano dvadeset do četrdeset mušica starih od 7-10 dana. Podaci su pokazali da je ekspresija mini-Sgcg smanjila abnormalnu dilataciju srčane cevi kod Sgcd<840>mušica (Nacrt 6), što ukazuje da je mini-Sgcg bio funkcionalan. Mušice će biti procenjivane i kada budu starije i kada kardiomiopatija bude prevladavajuća. Važno je napomenuti da će se rezultati upoređivati sa rezultatima dobijenim kod transgenih mušica koje eksprimiraju mišiji γ-sarkoglikan pune dužine da bi se utvrdilo da li je stepen korekcije sličan između mini-Sgcg i Sgcg-a pune dužine.
[0073] Očekuje se da ekspresija bilo mini-Sgcg ili Sgcg pune dužine dovede do oporavka od progresije bolesti kod mutantnih mušica. Preciznije, očekuje se da će smanjenje poremećenosti mišića, poboljšanje sposobnost hodanja i obnova srčane funkcije biti uočljive kod mutantnih mušica sa mini-Sgcg ili Sgcg. Moguće je da postupci pripreme mišićnog tkiva mogu ometati identifikaciju stepena “cepanja” mišića. Oštećenje mišića indukuje TGFβ signalizaciju oko mesta povrede koja može biti vizualizovana, aktivnošću dad-lacZ reportera [Goldstein i saradnici, Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. Očekuje se da dad-lacZ reporterski konstrukt obezbedi bolju vizualizaciju “cepanja” mišića [Goldstein i saradnici, Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. Ukoliko test hodanja nije dovoljno osetljiv da bi se detektovalo poboljšanje do koga dolazi usled ekpresije mini-Sgcg, sprovešće se alternativni test pokretljivosti koji omogućava istovremeno ispitivanje većeg broja mušica [Shcherbata i saradnici, EMBO J 26: 481-93 (2007)]. Mutantne mušice su skraćenog životnog veka [Allikian i saradnici, Hum Mol Genet 16: 2933-43 (2007)]. Stoga, utvrđen je životni vek mušica sa mini-Sgcg koji je obezbedio dodatne dokaze o prednostima ekspresije mini-Sgcg, a povećanje životnog veka će biti kvantifikovano. Podaci su pokazali da ekspresija mini-Sgcg značajno poboljšava srčanu funkciju kod Sgcd<840>mušica, što je uzrok očekivanja da će mini-Sgcg ili Sgcg pune dužine ispoljiti pozitivne efekte u prevenciji ili lečenju distrofičnih oboljenja kao što je LGMD (npr. LGMD2C). Kao poređenje, napravljene su i mušice koje eksprimiraju Sgcd Drosophila-e u svrhu upoređivanja.
Primer 2
Mini-Sgcg može zameniti Sgcg pune dužine u mišijem modelu mutiranog γ-sarkoglikana
[0074] Karakterizacijom korekcije mutantnog fenotipa u uspostavljenom mišijem modelu, može se preciznije predvideti efekat zamene γ-sarkoglikana pune dužine sa skraćenim γ-sarkoglikanom kod humanih pacijenata.
Transgeni miš koji eksprimira mini-Sgcg u mišićima upotrebom promotora za humani dezmin sa mini-Sgcg kodirajućom sekvencom
[0075] Da bi se ispitala funcija mini-Sgcg kod miševa, napravljeni su transgeni miševi koji eksprimiraju mišiji mini-Sgcg, upotrebom promotora za dezmin koji se eksprimira i u srcu i u mišićnim ćelijama [Pacak i saradnici, Genet Vaccines Ther 6: 13 (2008)]. Za pravilnu funkciju i mišića srca i skeletnih mišića je neophodan γ-sarkoglikan [Zhu i saradnici, FASEB J 16: 1096-1098 (2002)]. Dakle, da bi se procenila efikasnost oporavka pod-domena γ-sarkoglikana u oba mišićna tkiva, upotrebljen je promotor humanog dezmina. Dezmin je intermedijerni filamentozni protein koji se eksprimira u svim mišićnim tkivima, uključujući srce i skeletni mišić [Su i saradnici, Proc Natl Acad Sci USA 101: 6062-6067 (2004)]. Pored toga što je specifičan za tkivo, gen za dezmin postaje aktivan i tokom diferencijacije mišića u približno istom vremenu kao i sarkoglikani [Li i saradnici, J Cell Biol 124: 827-841 (1994); Noguchi i saradnici, Eur J Biochem 267: 640-648 (2000)]. Nivo ekspresije dezmina ostaje nizak u mioblastima koji se dele i dostiže trajno visok nivo ekspresije u terminalno diferenciranim mišićnim vlaknima. Klonirane su minimalne sekvence regulatornog regiona gena za humani dezmin i pokazano je da one pospešuju visok nivo ekspresije ciljnog gena, specifično i u srcu i skeletnim mišićima [Pacak i saradnici, Genet Vaccines Ther 6: 13 (2008)].
[0076] Upotrebom CMV-mini-Sgcg konstrukta u pcDNK™ 3.0 vektoru (Invitrogen), CMV promotor je zamenjen promotorom dezmina. Obeleživač epitopa, Xpress, je insertovan na N-kraj mini-Sgcg. Prečišćen dezmin-mini-Sgcg konstrukt (videti Nacrt 3B) je injeciran i tako je stvorena muška linija osnivač koja je bila pozitivna na transgen (Nacrt 7). Muška linija osnivač je ukrštena sa Sgcg<-/->miševima. Nastavljeno je i sa injeciranjima trangena i proizvedeno je pet dodatnih linija osnivača. Da bi se ispitala funkcija promotora dezmina, C2C12 ćelije (linija mišićnih ćelija u kulturi) su transfektovane sa dezmin-mini-Sgcg konstruktom, i utvrđeno je da je mini-Sgcg bio proizveden u diferenciranim miotubama (Nacrt 8).
Nivo ekspresije i subćelijska lokalizacija mini-Sgcg upotrebom obeleživača epitopa
[0077] Pokazano je da prekomerna ekspresija γ-sarkoglikana izaziva ozbiljnu mišićnu distrofiju kod miševa divljeg soja kada su nivoi ekspresije oko 20 puta iznad normalnih nivoa [Zhu i saradnici, FASEB J 16: 1096-8 (2002)]. Navedeni rezultat je verovatno dobijen usled obrazovanja abnormalnih citoplazmatskih proteinskih agregata koji interferiraju sa obrazovanjem sarkoglikanskog kompleksa i ciljnom lokalizacijom na membranu. Broj kopija trenutno sintetisane pojedinačne transgene linije deluje nizak, tako da se ne predviđaju problemi zbog prekomerne ekspresije. Normalna membranska lokalizacija u mišiću dezmin-mini-Sgcg transgenih miševa je ispitana upotrebom Xpress obeleživača. Eksperimenti su urađeni sa istim konstruktom u C2C12 ćelijama, mišićnoj ćelijskoj liniji. U navedenim ćelijama, mini-Sgcg je bio slično lokalizovan kao i endogeni protein γ-sarkoglikana.
[0078] Da bi se dalje odredio nivo mini-Sgcg proizvodnje, prikupljena su i obrađena tkiva i srca i skeletnih mišića iz raznih transgenih linija za eksperiment imunoblotovanja. Obeleživač epitopa Xpress omogućava da se mini-Sgcg protein lako detektuje imunoblot analizom upotrebom anti-Xpress antitela. γ-Sarkoglikan pune dužine se detektuje upotrebom anti-NCL-g-sarc antitela (Novocastra). Zbog činjenice da je navedeno monoklonsko antitelo sintetisano tako da bude specifično za peptid od 12 aminokiselina unutar egzona 6, biće detektovan samo Sgcg pune dužine, ali ne i mini-Sgcg. Sintetisana su takođe poliklonska antitela koja prepoznaju i Sgcg pune dužine i mini-Sgcg. Nakon sinteze dodatnih transgenih linija, izabrana je linija koju karakteriše nivo ekspresije sličan ekspresiji kod divljeg tipa.
Oporavak γ-sarkoglikanskih mutanata ukrštanjem transgena sa Sgcg<-/->miševima
[0079] Da bi se utvrdilo da li mini-Sgcg može zameniti Sgcg pune dužine kod sisara, mini-Sgcg Tg<+>(transgen pozitivni) miševi su ukršani sa Sgcg<-/->miševima kako bi se utvrdilo da li se disfunkcija srca i mišića kod Sgcg<-/->može oporaviti. Zarad sprečavanja fenotipskog drifta, Sgcg<-/->miševi su zadržani tako da budu heterozigoti, a da bi se smanjila selekcija spotano razvijenih modifikatora. Zarad uvođenja mini-Sgcg transgena u Sgcg<-/->miševe, Sgcg<-/+>miševi su ukršteni sa mini-Sgcg Tg<+>miševima. Tg<+>Sgcg<-/+>mužjaci F1 generacije su ukršteni sa ženkama. U F2 generaciji, proizvedeni su Tg<+>Sgcg<-/->miševi. Među jedinkama iz istog legla, Tg<+>miševi divljeg tipa su upotrebljeni kao pozitivne kontrole, dok su Tg<->Sgcg<-/->miševi korišćeni kao negativne kontrole. Da bi se izmerilo da li mini-Sgcg može poboljšati poremećenu funkciju mišića u Sgcg<-/->miševima, između kohorti su upoređeni sledeći parametri: subćelijska lokalizacija sarkoglikanskih proteina, direktna interakcija između mini-Sgcg i drugih sarkoglikana, permeabilnost plazma membrane mišićnih ćelija, depoziti vezivnog tkiva (fibroza), kao i funkcija skeletnih mišića i funkcije srca. Histopatologija je analizirana kod miševa koji su oporavljeni transgenom i to je upoređeno sa Sgcg<-/->i miševima divljeg tipa. Mišići su ispitani na varijacije u veličini vlakana, centralnu nukleaciju i zamenu fibroza i masti. Svi Sgcg<-/->i transgeni miševi su bili na C57B16/J genetskoj osnovi.
Subćelijska lokalizacija
[0080] U srcu i mišićnim ćelijama kojima nedostaje γ-sarkoglikan, α-, β- i δ-sarkoglikani su takođe značajno smanjeni na mišićnoj membrani, dok nivo njihove iRNK ostaje normalan, što ukazuje da je prisustvo γ-sarkoglikana neophodno za stabilnu membransku lokalizaciju drugih sarkoglikana u kompleksu [Hack i saradnici, J Cell Sci. 113 (14): 2535-44 (2000)]. Kako bi se ispitalo da li mini-Sgcg protein može povratiti pravilnu lokalizaciju drugih sarkoglikana u odsustvu γ-sarkoglikana pune dužine, preseci zamrznutog mišićnog tkiva Tg<+>Sgcg<-/->životinja su ispitani i urađena je imunofluorescentna mikroskopija upotrebom anti-α-, -β- i -δ-sarkoglikanskih antitela, tim redom. Sva antitela su komercijalno dostupna ili su ona koja su prethodno sintetisana.
Interakcija
[0081] U mišićnim ćelijama divljeg soja, α-, β-, γ- i δ- sarkoglikani obrazuju čvrst kompleks koji lokalizuje na plazma membrani, tako da γ-sarkoglikan može biti koimunoprecipitiran (co-IP) sa βsarkoglikanom iz mišićnog tkiva [Hack i saradnici, J Cell Sci.113(14): 2535-44 (2000)]. Da bi se ispitalo da li mini-Sgcg takođe može interagovati sa β-sarkoglikanom, co-IP je urađena na proteinskim preparatima prikupljenim od Tg<+>Sgcg<-/->miševa. Mišić je frakcionisan da bi se izolovale membrane iz miofibrilarnih komponenti. Navedeni mikrozomalni preparati su dobijeni iz celokupnih mišića, a samo je mikrozomalna frakcija korišćena za co-IP.
Propustljivost membrane
[0082] U Sgcg<-/->životinjama, mišićna plazma membrana je oslabljena i postaje propustljivija za velike proteinske molekule. Evans plava boja (EBD) je boja tipa malog molekula koja se čvrsto vezuje za albumin i koja može poslužiti za merenje propustljivost sarkoleme [Matsuda i saradnici, J Biochem 118: 959-64 (1995)]. Miševi se injeciraju sa EBD i žrtvuju 40 sati nakon injekcije. EBD se meri inkubacijom tkiva u 1 mililitru formamida na 55 °C tokom 2,5 sata i određivanjem apsorbance dobijenog eluata na 620nm. Nivo serumske kreatin kinaze (CK) je takođe izmeren upotrebom EnzyChrom™ kompleta za testiranje kreatin kinaze (BioAssay Systems).
Fibroza
[0083] Kolagen je glavna komponenta fibroznog tkiva u višku. Da bi se kvantifikovao depozit kolagena, urađeni su hidroksiprolinski testovi (HOP) za kvantifikaciju sadržaja kolagena. Hidroksiprolin je modifikovana amino kiselina koja čini veliki deo kolagena. Prikupljena su srca i mišićna tkiva i urađene su HOP analize praćenjem opisanih postupaka [Heidemann i saradnici, Neuromuscul Disord 15: 601-9 (2005)].
Funkcija srca
[0084] Disfunkcija srca je glavni direktni uzrok invaliditeta i smrti kod pacijenata sa mišićnom distrofijom. Miševi kojima nedostaje γ-sarkoglikan takođe razvijaju dilatacionu kardiomiopatiju. Da bi se ispitala funkcija srca, urađena je ehokardiografija (ECHO) i izmereni su krajnja dijastolna dimenzija (EDD), krajnja sistolna dimenzija (ESD) i frakciono skraćenje (FS).
Analiza miševa
[0085] Miševi su analizirani kada su bili stari 12 i 24 nedelje pošto se u navedenim vremenskim tačkama može jasno detektovati oboljenje mišića i srca. Upotrebljeni brojevi odražavaju uzorak fizioloških studija koje su sprovedene i koje su obično zahtevale kohorte sa između 5 i 10 životinja da bi se pokazala značajnost (t-test). Dodatne životinje su takođe upotrebljene da bi se obezbedilo dovoljno tkiva za mikroskopiju i imunoblot analizu.
[0086] Miševi su upotrebljavani pošto obezbeđuju dobar model mišićnog i srčanog oboljenja i odražavaju situaciju koja se uočava kod ljudi sa sličnim genskim mutacijama. Ispitano je preko 500 miševa navedenog genotipa (Sgcg) i ustanovljene su kvantitativne metode fenotipizacije [Heydemann i saradnici, Neuromuscul Disord 15(9-10): 601-9 (2005); Heydemann i saradnici, J. Clin. Invest 119(12): 3703-12 (2009); Swaggart i saradnici, Physiol Genomics 43(1): 24-31 (2011)]. Imajući u vidu razliku u fenotipu koja se očekuje na osnovu studije na Drosophila-i, pretpostavilo se da će kohorte sa po 5-10 miševa biti dovoljne.
Očekivani rezultati
[0087] Očekuje se nekoliko linija miševa koji nose des-mini-Sgcg transgen i eksprimiraju različite nivoe mini-Sgcg proteina u mišićnom tkivu, sa pojedinim linijama kod kojih su nivoi približni endogenim nivoima γ-sarkoglikana. Očekuje se takođe da je mini-Sgcg nedetektabilan u drugim tkivima. Očekuje se i da je mini-Sgcg protein obogaćen na plazma membrani kod miševa bez mutacija. Moguće je i da se uoči određeno citoplazmatsko ili perinuklearno bojenje mini-Sgcg zbog prisustva Sgcg pune dužine koji može kompetirati sa mini-Sgcg prilikom uključivanja u kompleks sarkoglikana. Jasno različito bojenje mini-Sgcg na plazma membrane kod Sgcg<-/->miševa se takođe očekuje. Sličan obrazac ekspresije je utvrđen u studijama na Drosophila-i. U Tg<+>Sgcg<-/->mišićima se stoga očekuje da će mini-Sgcg ekspresija povratiti membransku lokalizaciju drugih sarkoglikana. Takođe se očekuje da mini-Sgcg bude prisutan među proteinima koji su asocirani sa β-sarkoglikanom i koji sa njime precipitiraju. Poboljšana histopatološka slika, smanjeno preuzimanje EBD-a, smanjen nivo CK, manji HOP i poboljšana funkcija srca se očekuju kod Tg<+>Sgcg<-/->u odnosu na Tg-Sgcg<-/->miševe iz legla bez transgena. Navedeno bi predstavljalo poboljšanje u mišićnim i srčanim defektima, uspostavljanjem oporavka poremećaja uzrokovanih Sgcg mutacijom sa mini-Sgcgs, a kao što se i očekuje.
[0088] Na osnovu studija na Drosophila-i koja su ovde opisane, očekuje se da mini-Sgcg ima mnoge od funkcija Sgcg. Transgeni miševi će takođe omogućiti ispitivanje interakcije sa drugim važnim komponentama distrofinskog kompleksa kao što su distrofin, sarkospan, kao i interakcije sa drugim transmembranskim komponentama.
[0089] Za preskakanje egzona, fibroblasti su obezbeđeni iz humanih LGMD2C pacijenata. Prisilna MyoD ekspresija, koji je opisana u nastavku teksta, se upotrebljava za indukovanje ovih ćelija u miogenu liniju [Kimura i saradnici, Hum Mol Genet 17: 2507-17 (2008)]. Navedene ćelije će obezbediti ćelijsko okruženje za testiranje preskakanja egzona u humanom Sgcg.
Primer 3
Preskakanje egzona u kulturi mišićnih ćelija dobijenih iz humanih pacijenata
[0090] Obrazloženje za eksperimenate koji su opisani u nastavku teksta je da preskakanje egzona zahteva optimizaciju antisens polinukleotida i dokaze funkcije in vitro.
Upotreba MyoD transformacije za indukovanje konverzije kulture primarnih humanih fibroblasta u mioblaste
[0091] Obezbeđeni su fibroblasti izolovani iz dva LGMD2C pacijenta sa delecijom egzona 6 u Sgcg genu. MyoD je glavni regulator programa diferencijacije mišića. Prinudna ekspresija MyoD u fibroblastima može konvertovati fibroblaste u mišićnu liniju [Lattanzi i saradnici, J Clin Invest 101: 2119-2128 (1998)].
[0092] MyoD je ključni inicijator programa diferencijacije skeletnih mišića [Weintraub i saradnici, Science 251: 761-766 (1991)]. MyoD je odgovoran za aktiviranje drugih bitnih mišićnih regulatora, kao što su faktor pojačavanja miocita-2 (MEF2) i miogenin. Pokazano je da je prinudna ekspresija MyoD u fibroblastima u stanju da konvertuje fibroblaste u mioblaste in vitro i in vivo [Kimura i saradnici, Hum Mol Genet 17: 2507-2517 (2008)]. Prema tome, uvođenje MyoD u fibroblaste je dovoljno za konvertovanje fibroblasta do mioblastne linije. Nakon uspostavljanja linije, mioblasti pod odgovarajućim uslovima mogu biti indukovani da se dalje diferenciraju u miotube. Navedeni proces se primenjuje kod humanih fibroblasta, a "fibroblasti koji prinudno eksprimiraju MyoD" su korisni za dijagnozu bolesti mišića kod ljudi. Mioblasti izvedeni iz humanih pacijenata sa mutacijama u γsarkoglikanu koje su ovde opisane su neophodni da bi se ispitala efikasnost preskakanja egzona indukovana različitim potencijalnim AON. Upotrebom dermalnih fibroblasta iz LGMD2C pacijenata se izbegava potreba za bolnim biopsijama mišića koje su potrebne za dobijanje mioblasta.
[0093] Kimura i saradnici su napravili MyoD konstrukt koji se može indukovati tamoksifenom i sa kojim se MyoD gen može insertovati u genome fibroblasta upotrebom lentiviralnog vektora. Autori su pronašli da su transfektovani fibrobasti sposobni da obrazuju miotube in vivo i in vitro nakon primene tamoksifena. MyoD vektor se koristi za transfekciju fibroblasta dobijenih iz pacijenata sa LGMD2C. Transfektovani fibroblasti se propagiraju bez indukcije tamoksifenom i zamrzavaju u malim alikvotima za dalju upotrebu.
Fibroblasti koji prinudno eksprimiraju MyoD su tretirani antisens polinukleotidima za indukovanje preskakanja egzona 4-7 Sgcg
[0094] Za ciljanje specifičnih egzona, antisens polinukleotidi (AONs) su dizajnirani tako da blokiraju donorsko mesto obrade, akceptorsko mesto obrade ili mesto egzonskog pojačivača obrade (ESE). Donorsko i akceptorsko mesto obrade se nalaze na granici ezona i introna i visoko su evolutivno očuvanih sekvenci. Na osnovu nukleotidne sekvence i sekundarne strukture RNK transkripata, ESE mesta se mogu precizno predvideti upotrebom kompjuterskog programa poput ESEfinder koji anticipira mesta vezivanja za četiri najčešća proteina bogata serinom/argininom koji su uključeni u regulaciju obrade (SR proteini). Serija AON je dizajnirana na osnovu predikcija dostupnih kompjuterskih programa. Dalje je ispitana efikasnost i specifičnost različitih AON u miotubama koje su dobijene iz fibroblasta pacijenata, praćenjem protokola koji se upotrebljava za ispitivanje efikasnosti preskakanja egzona kod primarnih humanih miotuba [Aartsma-Rus i saradnici, Hum Mol Genet 12: 907-914 (2003)]. Preciznije, fibroblasti su tretirani tamoksifenom tokom 24 sata da bi se indukovala ekspresija MyoD pre prebacivanja fibroblasta u medijum za diferenciranje i indukovanje obrazovanja miotuba. Nakon 7-14 dana deprivacije seruma, miotube su transfektovane sa AON upotrebom polietilenimina (PEI) u trajanju od 3 sata, u medijumu sa niskom koncentracijom seruma. Nakon 24 sata od transfekcije, ukupna RNK je ekstrahovana iz kultura miotuba. Odnos kraćeg iRNK transkripta, sastavljenog samo od egzona 1, 2, 3 i 8, i transkripta pune dužine je kvantifikovan reverznom transkripcijom i dalje lančanom reakcijom polimeraze (RT-PCR-om). Proizvod PCR-a je frakcionisan na agaroznom gelu, a odnos kratkih i dugih proizvoda je izračunat upotrebom kompjuterskog programa Photoshop. Izabrani su AON sa najvećom efikasnošću preskakanja egzona.
Upotreba imunofluorescentne (IF) mikroskopije za ispitivanje prisustva karboksilnog kraja γsarkoglikana nakon antisens tretmana i da li su drugi sarkoglikani stabilizovani upotrebom ovog pristupa
[0095] Mutacije tipa promene okvira čitanja u Sgcg genu kod pacijenata dovode do obrazovanja prevremeno završenog proteina, bez C-terminusa. Prethodno ispitivanje je takođe pokazalo da proteinski proizvod Sgcg gena sa 525ΔT mutacijom nije detektovan zečjim poliklonskim antitelom specifičnim za celokupan Sgcg protein [McNally i saradnici, Am J Hum Genet 59: 1040-1047 (1996)]. Navedeni rezultat je ukazao da mutiran Sgcg gen nije bio u mogućnosti da proizvede stabilan proteinski proizvod. To je verovatno slučaj i kod LGMD2C bolesnika od kojih su fibroblasti dobijeni.
[0096] Obnova okvira čitanja dovodi do translacije interno skraćenog proteina sa normalnim C-terminusom. Za vizuelizaciju proizvodnje proteina indukovanu sa AON, urađena je IF mikroskopija upotrebom poliklonskog antitela specifičnog za γ-sarkoglikanski protein pune dužine u miotubama sa i bez tretmana sa AON. Upotrebom IF se takođe može utvrditi da li manji γ-sarkoglikanski protein lokalizuje na membrani. IF se takođe radi da bi se detektovali drugi sarkoglikani (npr. α-, β- i δsarkoglikan) i procenilo da li su oni obnovljeni na membrani Tg<+>Sgcg<-/->miševa.
Očekivani rezultati
[0097] Očekuje se da se fibroblasti konvertuju u ćelije slične mioblastima koje su sposobne da obrazuju miotube nakon primene tamoksifena. Alternativno, mioblasti se dobijaju iz humanih pacijenata. Očekuje se da će nekoliko AON tretmana konverovati značajan deo Sgcg transkripta pune dužine u manji, interno skraćen protein. Očekuje se takođe da nije moguće detektovati Sgcg bojenje upotrebom poliklonskog antitela u miotubama pacijenata bez AON tretmana, kao što se očekuje i da interno skraćeni γ-sarkoglikanski protein bude lokalizovan na membranama značajnog procenta tretiranih miotuba. Nadalje, očekuje se obnova ostalih komponenti distrofinskog kompleksa na plazma membrani miotuba koje karakteriše pozitivo membransko bojenje na γ-sarkoglikan. Za slučaj da je poliklonsko antitelo u stanju da detektuje ostatak produkta 525ΔT Sgcg gena, sintetisano je antitelo specifično za C-kraj γ-sarkoglikanskog proteina, a da bi se specifično detekovao skraćeni protein γ-sarkoglikana.
Primer 4
Ponašanje Sgcd<-/->mušica prilikom hodanja
[0098] Ovaj eksperiment je dizajniran tako da se ispita da li gubitak Sgcd kod Drosophila-e negativno utiče na njihovu aktivnost hodanja.
[0099] Za snimanje kretanja je korišćen monitor dizajniran specifično za ispitivanje aktivnosti hodanja (Trikinetics, Waltham, MA), pri čemu je meren broj prekida snopova zraka od strane pojedinačne Drosophila-e tokom perioda od 24 sata. Kod normalnih Drosophila je uočen izražen pik aktivnosti u zoru i u sumrak, nezavisno od vrste genotipa. Podaci su prikazani na Nacrtu 9. Da bi se procenila bazalna aktivnost, podaci su analizirani od ponoći do 8:00 časova ujutru, što je uokvireno kao region od interesa na levom panelu Nacrta 9. Mušice divljeg soja su pokazivale značajno veću aktivnost, izmerenu kroz broj prekida infracrvenih zraka, nego Sgcd<840>mušice kojima nedostaje γ-sarkoglikan, a koje služe kao model udno-pojasne mišićne distrofije tipa 2C. Navedni pad aktivnosti odražava situaciju koja se viđa kod pacijenata sa mišićnom distrofijom kod kojih je prisutna redukovana pokretljivost usled slabosti mišića.
Ekspresija mini-Sgcg u Sgcd<840>mušicama je znatno poboljšala noćnu aktivnost
[0100] Nacrt 10 pokazuje da ekspresija mini-Sgcg in Sgcd<840>mušicama značajno poboljšava noćnu aktivnost mutantnih Drosophila, izmerenu posredstvom broja prekida infracrvenog snopa (upoređeni su Sgcd<840>i Scgd<840>, mini-Sgcg, levi panel). Navedeni podaci pokazuju da mini-Sgcg može funkcionisati na mestu delovanje γ/δ-sarkoglikana pune dužine koji je deletiran kod Sgcd<840>mušica. Desni panel pokazuje da je noćna aktivnost jednako oporavljena sa Sgcg, što je mišiji γ-sarkoglikanski protein pune dužine, kao i sa mini-Sgcg (Sgcg<840>, Sgcg u poređenju sa Sgcd<840>, mini-Sgcg). Navedeni podaci ukazuju da je mini-Sgcg funkcionalan kao Sgcg pune dužine za oporavak aktivnosti hodanja.
Primer 5
Mini-Sgcg protein se stabilno proizvodi u skeletnom mišiću i srcu sisara
[0101] Transgen u kome je promotor dezmina upotrebljen za indukciju ekspresije Mini-Sgcg, je uveden u normalne miševe divljeg tipa (Tg+). Podaci su prikazani na Nacrtu 11. Izolacija skeletnih mišića (kvadricepsa) i imunoblot analiza su urađeni kao što je opisano u publikaciji Hack i saradnici [J Cell Sci.113: 2535-44 (2000)]. Mini-Sgcg protein je robusno detektovan u skeletnim mišićima i srcu sa očekivanom molekulskom težinom od 18 KDa (Nacrt 11, strelica). Detekcija nije bila prisutna u drugim tipovima ćelija kao što su jetra, slezina i bubreg. Navedeni obrazac ekspresije ukazuje da je promotor dezmina aktivan samo u srcu i mišićima. Mini-Sgcg nije bio detektovan u miševima divljeg tipa, netransgenim miševima (Tg-) (pogledati Nacrt 11). Obeleživač epitopa Xpress (Invitrogen) je bio postavljen na Mini-Sgcg, a zečje poliklonsko antitelo prečišćeno afinitetnom hromatografijom, specifično za Xpress epitop je upotrebljeno u razblaženju od 1:1000 za detekciju ekspresije sa transgena. Navedeni podaci pokazuju da je mini-Sgcg protein stabilan u mišićima i srcu sisara, a dalje i da je protein sposoban da se pravilno translocira na mišićnu membranu.
Karakterizacija transgenih miševa
[0102] Uspostavljene su dve različite transgene linije koje eksprimiraju mini-Sgcg. Transgene životinje su napravljene upotrebom standardnih protokola. Kao što je prikazano na Nacrtu 12, linija 50 eksprimira više nivoe od linije 84. Gornji panel Nacrta 12 prikazuje ekspresiju tri različite koncentracije za liniju 50 ili liniju 84. Navedeni podaci pokazuju da je mini-Sgcg stabilan protein u skeletnim mišićima i srčanom mišiću. Antitelo specifično za endogeni protein γ-sarkoglikana je upotrebljen da se pokaže ekspresija Sgcg proteina (pune dužine) u istim ovim uzorcima. Zečje poliklonsko antitelo specifično za Xpress, prečišćeno afinitetnom hromatografijom, je sintetisano u firmi Pocono Rabbit Farms. Korišćeno je u razblaženju od 1:1000 za imunoblot analizu i detekciju mini-Sgcg (Nacrt 12, gornji paneli). Antitelo specifično za γ-sarkoglikan je ranije opisano [McNally i saradnici, Hum Mol Genet.5: 1841-7 (1996)] i upotrebljeno je za detekciju endogenog γ-sarkoglikana u razblaženju od 1:1000.
Mini-Sgcg protein lokalizuje na plazma membrani skeletnih mišića
[0103] Nacrt 13 pokazuje da mini-Sgcg protein lokalizuje na plazma membrani skeletnih mišića kada se eksprimira u normalnim miševima divljeg tipa (Tg+). Anti-Xpress antitelo je upotrebljeno za detekciju ekspresije na periferiji svakog mišićnog vlakna u skladu sa lokalizacijom na plazma membrani, ili sarkolemi, skeletnog mišića. Navedeni unutarćelijski obrazac distribucije je identičan obrascu za normalan γ-sarkoglikanski (Sgcg) protein i ukazuje da se mini-Sgcg pravilno translocira. Isti signal nije detektovan u mišiću negativnom na transgen (Tg-) (Nacrt 13, desni panel) što pokazuje da navedeni signal potiče od transgena. Imunobojenje je urađeno kao što je opisano u publikaciji Hack i saradnici [J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. Anti-Xpress poliklonsko antitelo, prečišćeno afinitetnom hromatografijom, je korišćeno u razblaženju od 1:200.
Ekspresija endogenog γ-sarkoglikanskog proteina pune dužine je umanjena na plazma membrani kada je prisutan mini-Sgcg
[0104] Nacrt 14 prikazuje rezultate eksperimenta dizajniranog za ispitivanje da li mini-Sgcg protein može da bude u kompeticiji sa endogenim γ-sarkoglikanskim proteinom in vivo. Potrebno je zapaziti da je intenzitet signala endogenog Sgcg pune dužine smanjen na levom panelu Nacrta 14 u poređenju sa desnim panelom. Navedeni podaci pokazuju da je mini-Sgcg u kompeticiji sa endogenim normalnim Sgcg i da mini-Sgcg stoga može zameniti Sgcg pune dužine. Imunobojenje je urađeno kao što je opisano u Hack i saradnici [J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. Poliklonsko anti-γ-sarkoglikan antitelo je upotrebljeno u razblaženju od 1:200.
[0105] Nacrt 15 prikazuje model udruživanja sarkoglikana. Publikovana literatura opisuje sastav sarkoglikanskog kompleksa [Chan i saradnici, J Cell Biol. 143: 2033-44 (1998); Chen i saradnici, Exp Cell Res.312: 1610-25 (2006); Hack i saradnici, J Cell Sci.113: 2535-44 (2000)]. U mišićima sisara, gde postoje četiri subjedinice sarkoglikana, α-, β-, γ- i δ-sarkoglikan, subjedinice β-sarkoglikana i δsarkoglikana asociraju najpre u endoplazmatskom retikulumu (ER)/Goldži aparatu. Navedeni korak prati dodavanje α-sarkoglikana i γ-sarkoglikana. Obrazovanje kompleksa sarkoglikana je neophodno, ali nije dovoljno za translokaciju do plazma membrane [Chen i saradnici, Exp Cell Res. 312: 1610-25 (2006)]. Mutacije u subjedinicama sarkoglikana remete normalnu translaciju sarkoglikanskog kompleksa sa ER/Goldži aparata do plazma membrane. Translokacija na plazma membranu zahteva interakciju sa distrofinom i povezana je sa stabilizacijom plazme membrane. Sarkoglikanski kompleksi koji sadrže γ-sarkoglikan (γ) ili Mini-Sgcg (my) se uspešno prenose do plazma membrane. U mišiću Drosophila-e, gde postoji samo jedna γ/δ-sarkoglikanska jedinica, mini-Sgcg sisara može dovesti do oporavka usled gubitka jedinstvenog γ/δ-sarkoglikanskog dela i time dovesti do ublažavanja defekata u funkciji srca i mišića (kao što je ovde prikazano).
Mini-Sgcg obogaćuje tešku mikrozomalnu frakciju mišića
[0106] Mišić može biti frakcionisan na citoplazmatsku (C) i membransku frakciju. Membranska frakcija se dalje može podeliti na lake (L) i (H) mikrozome. Sarkoglikanski kompleks se obično nalazi u teškom mikrozomalnom kompleksu koji sadrži plazma membranu. Mišić iz miševa koji eksprimiraju mini-Sgcg (T+) je frakcionisan da bi se odvojila citoplazma od lake i teške mikrozomalne frakcije. Teška mikrozomalna frakcija sadrži ER, Goldži aparat i frakcije plazma membrane. U dve različite transgene linije (84 i 50), mini-Sgcg se u velikoj meri obogaćuje u teškoj mikrozomalnoj frakciji (Nacrt 16). Navedeno pokazuje da se mini-Sgcg nalazi u odgovarajućoj intracelularnoj frakciji. Postupak izolacije mikrozoma je bio kao što je to prethodno opisano [Ohlendieck i saradnici, J Cell Biol. 112: 135-48 (1991)] uz modifikaciju koja je opisana u [Duclos i saradnici, J Cell Biol. 142: 1461-71 (1998); Hack i saradnici, J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. Antitelo upotrebljeno za slike na gornjem panelu Nacrta 16 je bilo anti-Xpress epitop anitelo prečišćeno afinitetnom hromatografijom. Antitelo koje je bilo upotrebljeno za slike na donjem panelu Nacrta 16 je bilo zečje poliklonsko anti-γ-sarkoglikansko antitelo [McNally i saradnici, Hum Mol Genet. 5: 1841-7 (1996)]. Antitela su korišćena u razblaženju od 1:500. Sva sekundarna antitela su bila firme Jackson Immunochemicals (kozje anti-zečje-HRP) i upotrebljena su u razblaženju od 1:1000.
Uspostavljanje humanih ćelijskih linija sa SGCG mutacijama
[0107] Uspostavljenje su dve humane ćelijske linije sa SGCG mutacijama u svrhu testiranja preskakanja egzona za proizvodnju mini-Sgcg. Navedene linije su izvedene iz dermalnih fibroblasta izolovanih iz ljudskih pacijenata sa primarnim mutacijama u SGCG genu. U gornjem redu Nacrta 17 su prikazane ćelije iz LGMD 2C pacijenta čija je bolest posledica mutacije tipa delecije egzona 7 u SGCG. Donji red Nacrta 17 pokazuje ćelije iz LGMD 2C pacijenta kome je deletiran 6 SGCG. Navedene ćelijske linije su bile inficirane retrovirusima koji eksprimiraju telomerazu i MyoD. Infekcija telomeraznim virusom je obezbedila imortalizovanu ćelijsku liniju, dok je infekcija MyoD virusom obezbedila način regulacije za indukovanje diferencijacije mišića pošto je nuklearna pozicija MyoD pod kontrolom tamoksifena [Kimura i saradnici, Hum Mol Genet. 17: 2507-17 (2008); Kendall i saradnici, Sci Transl Med. 4: 164ra160 (2012)]. Ova kombinacija stvara ćelijske linije koje su imortalizovane telomerazom, čime se obezbeđuje stalno snabdevanje ćelijama. Regulisana kontrola MyoD nuklearne ekspresije obezbeđuje mehanizam kojim se po volji može indukovati mišićna konverzija. Navedene ćelijske linije služe kao ćelijski modeli LGMD 2C i obezbeđuju format u kom indukovana ekspresija mini-Sgcg može biti ispitana u kontekstu ljudskih ćelija. Sa dodatkom tamoksifena, MyoD lokalizuje u jezgru, a ćelije prolaze kroz diferencijaciju do izduženih miotuba (Nacrt 17, srednji i desni panel).
LGMD 2C ćelijske linije diferenciraju u mišićnu liniju
[0108] Nacrt 18 pokazuje da se LGMD 2C ćelijska linija diferencira u mišićnu liniju nakon 6 dana diferencijacije. Uz dodavanje tamoksifena, LGMD 2C ćelijske linije prolaze kroz morfološke promene postajući izdužene i eksprimirajući miogene markere, čime se zapravo demonstrira diferencijacija u mišićnu liniju. MyoD, mišićni marker, je eksprimiran sa retrovirusa (Nacrt 18, srednji panel), dok je dezmin, mišićni marker, indukovan od strane MyoD (Nacrt 18, desni panel) što ukazuje da su navedene ćelije vijabilni modeli mišićnih oboljenja. Na levom panelu Nacrta 18 (Hoechst) su prikazana jedra. Postupci gajenja u kulturi ćelija su opisani u publikaciji Kendall i saradnici [Sci Transl Med. 4: 164ra160 (2012)]. Anti-dezmin i anti-MyoD antitela su nabavljena od firme ThermoFisher (PA5-17182 i MA1-41017, tim redom). Sekundarna antitela su bila firme Molecular Probes/Invitrogen (anti-mišje Cy3 antitelo iz koze i anti-mišje Alexa488 obeleženo antitelo iz koze).
Ċ

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija za preskakanje egzona koja sadrži dva ili više antisens polinukleotida, pri čemu svaki polinukleotid specifično hibridizuje sa ciljnim regionom egzona RNK gama sarkoglikana, gde je egzon izabran iz grupe koju čine egzon 4 (SEQ ID NO: 1), egzon 5 (SEQ ID NO: 2), egzon 6 (SEQ ID NO: 3), egzon 7 (SEQ ID NO: 4) i njihova kombinacija.
2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, gde antisens polinukleotidi ne mogu obrazovati supstrat za RNazu H.
3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde najmanje jedan od antisens polinukleotida sadrži modifikovanu polinukleotidnu okosnicu koja sadrži modifikovanu grupu koja supstituše šećer najmanje jednog od polinukleotida.
4. Kompozicija prema patentnom zahtevu 3, gde je modifikovana grupa Morfolino.
5. Kompozicija prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4, gde modifikovana polinukleotidna okosnica najmanje jednog od polinukleotida sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleotidnu vezu.
6. Kompozicija prema patentnom zahtevu 5, gde modifikovana internukleotidna veza sadrži modifikovani fosfat izabran iz grupe koju čine metil fosfonat, metil fosforotioat, fosforomorfolidat, fosforopiperazidat i fosforoamidat.
7. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3-6, gde najmanje jedan antisens polinukleotid predstavlja 2'-O-metil-oligoribonukleotid.
8. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, gde je najmanje jedan antisens polinukleotid hemijski vezan za jedan ili više konjugata koji pojačavaju aktivnost, ćelijsku distribuciju ili ćelijsko preuzimanje antisens polinukleotida.
9. Kompozicija prema patentnom zahtevu 8, gde je najmanje jedan antisens polinukleotid hemijski vezan za molekul polietilenglikola.
10. Kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili patentnom zahtevu 9, gde je konjugat peptid koji pojačava ćelijsko preuzimanje i gde je peptid izabran iz grupe koju čine signalni peptid jedarne lokalizacije (NLS), HIV-1 TAT protein, peptid koji sadrži domen vezivanja za integrin, oligolizin, adenovirusni fibrozni protein i peptid koji sadrži domen za endocitozu posredovanu receptorom (RME).
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži dva ili više antisens polinukleotida prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 i fiziološki kompatibilan fosfatni pufer.
12. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, za upotrebu u indukciji preskakanja egzona u RNK gama sarkoglikana u ćeliji (prioritetno humanoj mišićnoj ćeliji, a posebno gde je humana mišićna ćelija u pacijentu koji ima mišićnu distrofiju).
13. Kompozicija ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je ćelija u pacijentu koji boluje od udno-pojasne mišićne distrofije tipa 2C (LGMD2C).
14. Kompozicija ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13, za upotrebu u ublažavanju, inhibiciji ili poboljšanju kliničke slike udno-pojasne mišićne distrofije tipa 2C (LGMD2C) kod pacijenta kome je to potrebno, pri čemu se pacijentu primenjuje terapijski efektivna količina kompozicije čime se ublažava LGMD2C, inhibira progresija distrofične patologije ili poboljšava mišićna funkcija.
15. Kompozicija ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu poboljšanje podrazumeva poboljšanje funkcije srčanog mišića, poboljšanje snage respiratornih mišića ili poboljšanje motoričke stabilnosti.
RS20181053A 2012-09-06 2013-09-06 Antisens polinukleotidi za indukovanje preskakanja egzona i postupci lečenja distrofija RS57789B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261697766P 2012-09-06 2012-09-06
PCT/US2013/058636 WO2014039916A1 (en) 2012-09-06 2013-09-06 Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies
EP13835266.1A EP2892617B1 (en) 2012-09-06 2013-09-06 Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57789B1 true RS57789B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=50237661

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181053A RS57789B1 (sr) 2012-09-06 2013-09-06 Antisens polinukleotidi za indukovanje preskakanja egzona i postupci lečenja distrofija
RS20210656A RS61985B1 (sr) 2012-09-06 2013-09-06 Antisens polinukleotidi za indukovanje preskakanja egzona i postupci lečenja distrofija

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210656A RS61985B1 (sr) 2012-09-06 2013-09-06 Antisens polinukleotidi za indukovanje preskakanja egzona i postupci lečenja distrofija

Country Status (16)

Country Link
US (14) US9499817B2 (sr)
EP (2) EP3421602B1 (sr)
BR (1) BR112015005091B1 (sr)
CA (1) CA2884245C (sr)
CY (2) CY1121037T1 (sr)
DK (2) DK3421602T3 (sr)
ES (2) ES2878650T3 (sr)
HR (2) HRP20181458T1 (sr)
HU (2) HUE054260T2 (sr)
LT (1) LT3421602T (sr)
PL (1) PL3421602T3 (sr)
PT (2) PT2892617T (sr)
RS (2) RS57789B1 (sr)
SI (2) SI3421602T1 (sr)
TN (1) TN2015000079A1 (sr)
WO (1) WO2014039916A1 (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170045344A (ko) 2014-09-07 2017-04-26 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 항-바이러스 전달 벡터 면역 반응을 약화시키기 위한 방법 및 조성물
PT3283500T (pt) 2015-04-08 2021-01-28 Univ Chicago Composições e métodos para corrigir distrofia muscular das cinturas tipo 2c com utilização de salto do exão
KR102877920B1 (ko) 2015-11-16 2025-10-30 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 티틴-기반 근증 및 다른 티틴성병증의 치료를 위한 물질 및 방법
FI3442600T3 (fi) * 2016-04-15 2024-05-14 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adeno-assosioidulla virusvektorilla b-sarkoglykaanin ja mikro-rna-29:n toimittaminen ja lihasdystrofian hoito
BR112020001059A2 (pt) 2017-07-18 2020-07-14 Calimmune, Inc. composições e métodos para o tratamento de beta-hemoglobinopatias
BR112020007157A2 (pt) 2017-10-13 2020-09-24 Selecta Biosciences, Inc. métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral
WO2020006458A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus products and methods for treating limb girdle muscular dystrophy 2a
KR20210117271A (ko) 2018-12-21 2021-09-28 노쓰웨스턴유니버시티 근막 손상 예방 및 치료를 위한 아넥신의 사용근각 손상 예방 및 치료를 위한 아넥신의 사용
JP2022514954A (ja) 2018-12-23 2022-02-16 シーエスエル・ベーリング・エルエルシー キルスイッチを有するドナーｔ細胞
KR20210118402A (ko) 2018-12-23 2021-09-30 씨에스엘 베링 엘엘씨 위스콧-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군에 대한 조혈 줄기 세포-유전자 치료요법
US12377170B2 (en) 2019-02-26 2025-08-05 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of β-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
AU2020284555A1 (en) 2019-05-28 2021-12-23 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuated anti-viral transfer vector immune response
EP4017871B1 (en) 2019-08-21 2024-01-17 Research Institute at Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery of alpha-sarcoglycan and the treatment of muscular dystrophy
JP2023531729A (ja) 2020-06-26 2023-07-25 シーエスエル・ベーリング・エルエルシー キルスイッチを有するドナーｔ細胞
WO2023064367A1 (en) 2021-10-12 2023-04-20 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
JP2023059858A (ja) 2021-10-15 2023-04-27 リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル 自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター及び筋ジストロフィーの治療におけるその使用
US20230357437A1 (en) 2022-03-09 2023-11-09 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
ATE113059T1 (de) 1987-06-24 1994-11-15 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5328688A (en) 1990-09-10 1994-07-12 Arch Development Corporation Recombinant herpes simplex viruses vaccines and methods
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5849571A (en) 1990-10-10 1998-12-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Latency active herpes virus promoters and their use
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
CA2122365C (en) 1991-11-26 2010-05-11 Brian Froehler Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5879934A (en) 1992-07-31 1999-03-09 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains for gene transfer
US20040005707A1 (en) * 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of integrin beta 5 expression
US5661033A (en) 1992-11-25 1997-08-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Gene transfer using herpes virus vectors as a tool for neuroprotection
US5631237A (en) 1992-12-22 1997-05-20 Dzau; Victor J. Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
US5834441A (en) 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
ES2216005T3 (es) 1993-11-09 2004-10-16 Targeted Genetics Corporation Produccion de titulos elevados de vectores de aav recombinantes.
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
FR2716682B1 (fr) 1994-01-28 1996-04-26 Centre Nat Rech Scient Procédé de préparation de virus adéno-associés (AAV) recombinants et utilisations.
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5792453A (en) 1995-02-28 1998-08-11 The Regents Of The University Of California Gene transfer-mediated angiogenesis therapy
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
FR2732357B1 (fr) 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose
US5773289A (en) 1995-06-06 1998-06-30 University Of Pittsburgh AAV directed targeted integration
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
US5830727A (en) 1995-11-18 1998-11-03 Human Gene Therapy Research Institute Herpes simplex virus amplicon mini-vector gene transfer system
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
EP1072679A3 (en) 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
US7339051B2 (en) * 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
WO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
PT3283500T (pt) * 2015-04-08 2021-01-28 Univ Chicago Composições e métodos para corrigir distrofia muscular das cinturas tipo 2c com utilização de salto do exão

Also Published As

Publication number Publication date
US20160369277A1 (en) 2016-12-22
HUE039676T2 (hu) 2019-01-28
WO2014039916A1 (en) 2014-03-13
CY1124197T1 (el) 2022-05-27
SI3421602T1 (sl) 2021-08-31
LT3421602T (lt) 2021-05-25
DK2892617T3 (en) 2018-09-03
US20200040340A1 (en) 2020-02-06
US9499817B2 (en) 2016-11-22
PT3421602T (pt) 2021-05-31
US20230183700A1 (en) 2023-06-15
US20250179495A1 (en) 2025-06-05
ES2878650T3 (es) 2021-11-19
EP3421602A1 (en) 2019-01-02
PT2892617T (pt) 2018-10-18
TN2015000079A1 (en) 2016-06-29
US9777271B2 (en) 2017-10-03
BR112015005091A2 (pt) 2017-09-26
ES2686727T3 (es) 2018-10-19
US20240327844A1 (en) 2024-10-03
US20180327743A1 (en) 2018-11-15
BR112015005091B1 (pt) 2021-07-06
PL3421602T3 (pl) 2021-10-25
US20200291403A1 (en) 2020-09-17
EP2892617B1 (en) 2018-06-13
CA2884245C (en) 2023-03-14
HRP20210877T1 (hr) 2021-07-23
DK3421602T3 (da) 2021-05-10
EP3421602B1 (en) 2021-03-03
US20150225718A1 (en) 2015-08-13
SI2892617T1 (sl) 2018-11-30
HK1212272A1 (en) 2016-06-10
US20240076670A1 (en) 2024-03-07
EP2892617A1 (en) 2015-07-15
US20190194659A1 (en) 2019-06-27
US20220251559A1 (en) 2022-08-11
HUE054260T2 (hu) 2021-08-30
CY1121037T1 (el) 2019-12-11
US20180037889A1 (en) 2018-02-08
CA2884245A1 (en) 2014-03-13
EP2892617A4 (en) 2016-06-22
HRP20181458T1 (hr) 2018-11-02
RS61985B1 (sr) 2021-07-30
US20210147845A1 (en) 2021-05-20
US20210403910A1 (en) 2021-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240327844A1 (en) Antisense polynucleotides to induce exon skipping and method of treating dystrophies
ES2656904T3 (es) Método para el salto eficaz del exón (44) en la distrofia muscular de Duchenne y medios asociados
KR20240006019A (ko) 세포 투과 펩티드 접합체 및 이의 사용 방법
US20240301428A1 (en) Compositions and methods for correcting limb girdle muscular dystrophy type 2c using exon skipping
HK40002849A (en) Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies
HK40002849B (en) Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies
HK1250720B (en) Compositions and methods for correcting limb girdle muscular dystrophy type 2c using exon skipping
BR112017021485B1 (pt) Oligonucleotídeo antissentido modificado (aon), composição farmacêutica o compreendendo e seus usos, bem como kit o compreendendo