JPH09509564A

JPH09509564A - 高力価組換えａａｖベクターの生成

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Publication number: JPH09509564A
Application number: JP7513877A
Authority: JP
Inventors: アール．フロッティ，テレンス; ジェイ．カーター，バリー; ビー．グギーノ，ウィリアム; ソロー，リッキー
Original assignee: ターゲテッドジェネティックスコーポレイション; ジョンズホップキンズユニバーシティ
Priority date: 1993-11-09
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 1997-09-30
Also published as: JP2005110694A; DK0733103T3; DE69433592T2; AU1129395A; PT733103E; US5658776A; EP0733103A1; CA2176117A1; AU688428B2; EP0733103A4; DE69433592D1; WO1995013365A1; ATE260980T1; CA2176117C; ES2216005T3; EP0733103B1

Abstract

(57)【要約】 AAVベクターは、遺伝子治療で有用性を有し得るが、以前から、ヒト遺伝子治療の適用に臨床的に有用量で、十分な量のこのような組換えベクターを生成できないことが重大な障害であった。安定で、ヘルパーがいらないAAVパッケージング細胞株は、主にそれ自身の発現を下方調節し、そして細胞の不死化を完全に変えるRepタンパク質の活性のためにわかりにくい。本発明は、AAVp5プロモーターを異種プロモーターで（図に示したように）置き換えることによりこれらの問題を効率的に回避し、そして実質的にパッケージング効率を増加し得る、AAVベクターをパッケージングするためのパッケージングシステムおよびプロセスを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】高力価組換えAAVベクターの生成発明の技術分野本発明は、遺伝子治療、およびさらに詳細には遺伝子治療手順に使用するための高力価組換えAAVベクターの生成に使用される物質および方法に関する。発明の背景 AAVベクターは、遺伝子治療に有用性を有し得るが、これ以前にはヒトへの遺伝子治療の適用のための臨床的に有用な量で、このような組換えベクターの十分量を生成する能力がないという重大な障害がある。これは、肺に直接送達するようなインビボでの適用に特に問題である。アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、インビボの遺伝子転移剤として有用性を有することが示された数少ない組換えウイルスベクターシステムの中のものであり（Carter、1992、Current Opinion in Biotechnology、3:533-539;Muzcyzka、1 992、Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:97-129に総説されている）、従って潜在的にヒトの遺伝子治療に大変重要である。AAVベクターは、嚢胞性線維症(CF)気管支および鼻上皮細胞（Flotteら、1992a、Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356 ;Eganら、1992、Nature、358:581-584;Flotteら、1993a、J.Biol.Chem.268:3781-3790 ;Flotteら、1993b、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、印刷中）、ヒト骨髄由来赤白血病細胞(Walshら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:7257-7261)、およびいくつかの別のものを包含する種々の細胞で、高頻度の安定なDNA組込みおよび発現をし得る。AAVは、安定な発現のために活発な細胞分裂を必要とし得ず、これはレトロウイルスに対して、特に大部分の細胞が最終的に分化を終えており、そして非分裂であるヒトの気道上皮のような組織では明らかに有利である。 AAVは、特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞においてのみ増殖する欠陥パルボウイルスである（図１参照）。一般的なAAVの総説は、Carter、1989、Handbook of Parvoviruses、第I巻、169-228ページ、Berns、1990、 Virology 、1743-1764ページ、Raven Press、(New York)に見出され得る。AAVの増殖および複製に対するヘルパー機能を提供する同時感染ウイルスの例は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびある場合にはワクシニアのような天然痘ウイルスである。ヘルパー機能の性質は知られていないが、細胞でAAV複製を可能にするヘルパーウイルスの間接的な効果であるようである。この概念は、細胞を遺伝子毒性のある(genotoxic)薬剤または細胞周期を中断させる薬剤のいずれかで処理すると、特定の場合に、ヘルパーウイルスの同時感染なしでAAV複製が低レベルの効率で生じ得る観察により支持される。 AAVは、特定の異常な状態でヘルパーウイルス非存在下で限られた程度複製され得るにもかかわらず、上記のように、より一般的な結果は、ヘルパー機能非存在下での細胞のAAVウイルスでの感染が、AAVの宿主細胞ゲノムへの組込みをもたらすことである。組込まれたAAVゲノムは、組込まれたAAVプロウイルスを含有する細胞をアデノウイルスのようなヘルパーウイルスで追いうち感染した場合、感染性の子孫AAV粒子のバーストを与えるために回収および複製され得る。なぜなら、AAVの組込みは効果的な反応と思われることから、このことはAAVがヒトの遺伝子治療のような用途のために細胞に遺伝子を導入し、安定に発現させる有用なベクターであることを示唆する。さらに最近の結果（KotinおよびBerns、1989、Vi rology 170:460-467;Kotinら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87:2211-2215;Samu lskiら、1991、EMBO J.10:3941-3950）では、AAVは、ヒト第19染色体上の部位での組込みがいくらか好ましいことが示唆されているが、しかしこの現象の一般性および機構は完全には解明されていない。 AAVは、明らかな種特異性も組織特異性も伴わない非常に広い宿主域を有し、そして事実上、適切なヘルパーの存在が提供されるヒト、サル、齧歯類起源の任意の細胞株で複製される。AAVは遍在し、そして大部分の哺乳動物およびいくつかのトリ種を包含する広範囲の動物種から単離されている。 AAVは、任意の疾患の原因とは関係しない。AAVは、形質転換ウイルスまたは腫瘍ウイルスではない。ヒト細胞株の染色体へのAAVの組込みによって、細胞の増殖特性または形態的特徴におけるいずれの顕著な変化も生じない。また、これらのAAVの特性から、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクターとしてAAVが勧められる。なぜなら、この適用に提案されるレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスのような他の大部分のウイルス系は、疾患を引き起こすウイルスであるからである。 AAV粒子は、３つのキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を有するタンパク質キャプシドからなっており、そしてDNAゲノムを囲んでいる。AAVのDNAゲノムは、約1.5×10⁶ダルトンの分子量またはおよそ4680ヌクレオチドの長さを有する直鎖状一本鎖DNA分子である。相補的センスの「プラス」または「マイナス」鎖のいずれかの鎖が個々の粒子にパッケージされるが、それぞれの粒子は１つの DNA分子しか有しない。同数のAAV粒子は、プラス鎖またはマイナス鎖のいずれかを含有する。どちらの鎖も同等に感染性であり、複製は親の感染一本鎖を二本鎖の形態に変換し、次に二本鎖分子の大きなプールの増幅が起き、その二本鎖から子孫の一本鎖がはずされ、そしてキャプシドにパッケージされる。細菌プラスミドまたはファージミドに挿入された二本鎖または一本鎖コピーのAAVゲノムは、アデノウイルス感染細胞にトランスフェクトされた場合に感染性であり、そしてこれはAAV遺伝学の研究およびAAVベクターの開発を可能にしている。AAVの複製周期を、図１に示す。 AAV2ゲノムは、１コピーの145ヌクレオチド長のITR（逆方向末端反復）を各末端に有し、そしてrepおよびcap遺伝子(Hermonatら、J.Virol.51:329-339;Tratsch inら、1984a、J.Virol.、51:611-619)の２つの主要なオープンリーディングフレームを含有する4470ヌクレオチド長(Srivastavaら、1983、J.Virol.、45;555-564)の非反復配列部分を有する。非反復部分は、repおよびcap遺伝子を発現させるために使用される３つの転写プロモーターP₅、P₁₉およびP₄₀(Laughlinら、1979、Proc. Natl.Acad.Sci.USA、 76:5567-5571)を含有する。ITR配列は、シスで必要とされ、そして機能的な複製開始点(ori)を提供するのに十分であり、そしてまた細胞ゲノムへの組込みおよび宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよび回収に必要とされるシグナルを供給するのに十分である。さらに、 ITRは、AAVベクターの転写プロモーターとして直接機能し得ることが示されている(Flotteら、1993、上記参照)。 repおよびcap遺伝子は、それぞれウイルスゲノムの複製およびキャプシド化機能を提供するためにトランスで必要とされる。rep遺伝子は、２つのプロモーターP₅およびP₁₉から発現される。P₅からの転写は、タンパク質Rep78をコードするスプライシングされない4.2kbのmRNA、およびタンパク質Rep68をコードするスプライシングされた3.9kbのmRNAを生成する。P₁₉からの転写は、Rep52をコードするスプライシングされないmRNA、およびRep40をコードするスプライシングされない3.3kbのmRNAを生成する。従って、４つのRepタンパク質全てが、共通する内部領域配列を含むが、それらのアミノ末端およびカルボキシル末端領域については異なる。Rep78およびRep68のみが、AAV二本鎖DNAの複製に必要とされるが、Re p52およびRep40は、子孫の一本鎖DNAの蓄積に必要とされるようである。Rep78およびRep68の変異は、表現型がRep^-であり、一方Rep52およびRep40のみに影響する変異はRep⁺であるがSsd^-である。Rep68およびRep78は、AAVのITRのヘアピン立体構造に特異的に結合し、そしてAAV末端で複製を決定するのに必要ないくつかの酵素活性を有する。Rep52およびRep40は、これらの特性を有さない。 Repタンパク質、主としてRep78およびRep68は、AAV遺伝子の正の調節または負の調節、ならびにいくつかの異種プロモーターからの発現を包含するいくつかの多面的調節活性、および細胞増殖に対する阻害効果を示す(Tratschinら、1986、Mo l.Cell.Biol. 6:2884-2894;Labowら、1987、Mol.Cell.Biol.7:1320-1325;Khleifら、Virology、 181:738-741)。AAVのp₅プロモーターは、Rep78またはRep68によって負に自己調節される(Tratschinら、1986、Mol.Cell.Biol.6:2884-2894)。細胞増殖に対するrepの発現阻害効果ゆえに、細胞株でのrepの構成的発現は、容易に達成されていない。例えば、Mendelsonら(1988、Virology、166:154-165)は、AAVゲノムの安定な組込み後の特定の細胞株でのいくつかのRepタンパク質の非常に低レベルな発現を報告した。タンパク質VP1、VP2、およびVP3は全て共通の重復配列を共有するが、VP1およびVP2が付加的なアミノ末端配列を含むという点で異なっている。全て３つのタンパク質とも、P₄₀プロモーターから転写された2.3kbのスプライシングされたmR NAから発現される同じcap遺伝子のリーディングフレームからコードされる。VP2 およびVP3は、別の開始コドンを使用して同じmRNAから生成される。VP1は、VP2 およびVP3をコードする主なmRNAに使用される3'ドナーから30ヌクレオチド上流の3'ドナー部位を使用する微量のmRNAからコードされる。VP1、VP2、およびVP3 は、全てキャプシド産生に必要とされる。３つ全てのタンパク質を除去する変異 (Cap^-)は、一本鎖子孫AAVのDNAの蓄積を妨げる一方、VP1アミノ末端内の変異(Li p^-、Inf^-)は、一本鎖の産生を可能にするが、安定な感染性粒子の会合を妨げる。上記のAAVの遺伝解析は、細菌のプラスミドに分子的にクローン化されたAAVゲノムの変異解析に基づいていた。初期の研究では、AAVの感染性ゲノムの分子クローンは、GCテーリング(Samulskiら、1982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79:2077-20 81)、制限エンドヌクレアーゼを含有する合成リンカーの付加(Laughlinら、1983、Gene、 23:65-73)または直接平滑末端連結(SenapathyおよびCarter、1984、J.Biol.C hem.、 259:4661-4666)のような手順でプラスミドにAAVの二本鎖分子を挿入することにより構築した。次に、アデノウイルスのような適当なヘルパーウイルスでもまた感染させた哺乳動物細胞にこのようなAAV組換えプラスミドをトランスフェクトすると、任意のプラスミド配列を含まないAAVゲノムの回収および切り出し、および回収されたゲノムの複製ならびに一定量の子孫の感染性AAV粒子の産生をもたらした（図１参照）。これは、上記で概略したようにAAVの遺伝解析を行うための基礎を提供し、そしてAAV形質導入ベクターの構築を可能にした。遺伝解析に基づくAAVベクター構築の一般原理は、最近考察されたように定義された(Carter、1992、Current Opinions in Biotechnology、3:533-539;Muzyczka、 1992、Current Topics in Microbiology and Immunology、158:97-129)。AAVベクターは、ベクタープラスミドを生成するためにAAVをコードする配列部分を外来D NAに置換することによりAAV組換えプラスミド内に構築される。ベクタープラスミドでは、AAV配列の末端(ITR)部分は完全に保持されていなければならない。なぜなら、これらの領域はトランスフェクション後のプラスミドからの切り出し、ベクターゲノムの複製、ならびに宿主細胞ゲノムから組込みおよび回収を含むいくらかの機能がシスで要求されるからである。次に、AAV形質導入ウイルスの生成のために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような適切なヘルパーウイルスで感染した細胞にベクタープラスミドをトランスフェクトすることにより、ベクターはAAV粒子にパッケージされ得る。複製およびベクターゲノムのAAV粒子へのキャプシド化を達成するために、ベクタープラスミドは、ベクタープラスミドの構築物に欠失しているトランスで必要な任意のAAV機能、すなわちrepおよび capを相補しなければならない。ヒトの遺伝子治療に使用するために設計した任意のAAVベクターの所望の特徴は少なくとも２つある。第１に、形質導入ベクターは、送達システムとして実用的な十分に高い力価で生成されねばならない。これは、インビボでのベクター送達を目的とした遺伝子治療ストラテジーでは特に重要である。気道へのインビボでの直接送達による嚢胞性線維症の処置のようなAAVベクターの多くの所望される適用については、10¹⁰を越える形質転換ベクターの量を必要とするようである。第２に、ベクター調製物には、野生型のAAVウイルスが存在してはならない。高力価AAVベクターの達成は、野生型AAVゲノムが存在するまたは組換えにより生成される場合、野生型AAVゲノムを優先的にキャプシド化すること、およびrepまたはcapのような十分に相補的な機能を生成することが不可能であることを包含するいくつかの理由から困難である。このような相補的機能を発現する有用な細胞株は、部分的にはrep遺伝子のいくつかの阻害機能のため、生成されていない。記載された最初のAAVベクターは、AAV転写プロモーターまたはSV40プロモーターから発現されるneoまたはcatまたはdhfrのような外来レポーター遺伝子を含有していた(Tratschinら、l984b、Mol.Cell.Biol.4:2072-2081;HermonatおよびMuzyc zka、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6466-6470；Tratschinら、1985、Mol.Cell. Biol. 5:3251-3260;McLaughlinら、1988、J.Virol.、62:1963-1973;Lebkowskiら、19 88、Mol.Cell.Biol.、7:349-356)。これらのベクターは、アデノウイルス感染細胞に、天然の野生型AAV転写プロモーターから発現されるAAVのrepおよびcap遺伝子を含有する第２のパッケージングプラスミドとともに同時トランスフェクションすることにより、AAV形質導入粒子中にパッケージされた。パッケージングプラスミドのパッケージを妨げる試みにおいては、プラスミドは天然の野生型AAV転写プロモーターから発現されるAAVのrepおよびcap遺伝子を含有していた。パッケージングプラスミドのAAV粒子へのパッケージを妨げる試みでは、いくつかのアプローチが行われた。いくつかの場合(HermonatおよびMuzyczka、1984;McLaugh linら、1988)、パッケージングプラスミドは、AAV配列内のバクテリオファージラムダDNAの大きな領域を挿入し、パッケージされ得ない過剰サイズのゲノムを生成した。他の場合において（Tratschinら、1984b;Tratschinら、1985、Lebkowskiら、 1988)、パッケージングプラスミドは、切り出しおよび複製ができず、そのためパッケージできないように、AAVのITR領域を欠失した。これらの全てのアプローチは、野生型AAVのDNAを含有する粒子の生成を妨げず、そしてまた効果的な高力価のAAV形質導入粒子を生成しなかった。実際、10⁴mlを越えない力価は、Hermon atおよびMuzyczka、1984により引用されなかった。これらの研究での野生型AAV粒子の生産は、おそらくベクターおよびパッケージングプラスミドに存在するAAV 配列間の重複する相同性の存在によるものであった。SenapathyおよびCarter(19 84、J.Biol.Chem.、259:4661-4666)により、このようなシステムの組換えの程度が、配列の重復の程度とほぼ同等であることが示された。初期の研究の総説(Carte r 1989、Handbook of Parvoviruses、第11巻、247-284ページ、CRC Press、Boca Rato n、FL)で、1mlあたり10⁶の力価が得られたことが示唆されたが、これはベクター調製物に大量の野生型AAVが混入している上記の研究に基づいていた。野生型AAV を含有するこれらのベクター調製物は、ヒトの遺伝子治療には有用でない。さらに、これらの初期のベクターは、低い形質導入効率を表し、そして細胞あたり50 ,000粒子までの多重度でベクターを供給したとしても、様々なヒトの細胞株培養物中で１％より多いまたは２％の細胞を形質導入しなかった。これは、部分的には野生型AAV粒子の混入およびベクター中のAAVのrep遺伝子の存在を反映し得た。さらに、Samulskiら(1989、J.Virol.63:3822-3828)は、野生型AAVの存在は、パッケージされたベクターの収量を著しく高めることを示した。従って、野生型AA Vの生産が除去されるパッケージングシステムでは、パッケージされたベクターの収量は実際に減少し得る。それにもかかわらず、任意のヒトの臨床適用で使用するためには、野生型AAVの生産を除去することが必須である。 AAVのrepまたはcap遺伝子を含有しないAAVベクターを生成するための別の研究 (McLaughlinら、1988;Lebkowskiら、1988)では、未だに野生型AAVの生成をうけ、そして未だにヒト細胞株での非常に低い形質導入頻度を生産していた。従って、 McLaughlinら(1988)は、neo遺伝子を含有するAAVのrep^-cap^-ベクターが、Hermon atおよびMuzyczka(1984)により初期に使用された、未だに野生型AAVを含有する、同じパッケージングプラスミドと共にパッケージしたことを報告した。結果として、ベクターおよび野生型粒子の二重ヒットを避けるために、このウイルスを細胞あたり0.03粒子の多重度（すなわち、10,000細胞あたり300感染単位）でしか使用し得なかった。1000感染単位で32,000細胞を感染させることによる方法で実験を行った場合、平均800個のゲネチシン耐性コロニーが得られた。これは、ウイルスが80％の形質導入頻度を得ることができることを示すと解釈されるが、実際は細胞の2.5％のみが形質導入された。従って、このベクターの効果的な有用な力価は制限されていた。さらに、この研究は、このベクター調製物の実際の力価が、HermonatおよびMuzyczka(1984)により以前に得られた力価より少しでも高いことを示していなかった。同様に、Lebkowskiら、1988は、repまたはcap遺伝子のどちらも含有しないAAVベクターをパッケージし、そしてTratschinら、(1984b、 1985)によって初期に使用されたものと同一のori^-パッケージングプラスミドpBa 1Aを使用し、そして同様に低い形質導入頻度（最も濃縮したベクターストックでも、数種のヒト細胞株では１％より多い細胞がゲネチシン耐性に形質導入され得ない）を報告した。Lebkowskiら、(1988)は、意味のある方法で実際のベクター力価を報告しなかった。しかし、３mlのベクター調製物に５×10⁶細胞を曝した場合、１％より高くない形質導入頻度を示す生物学的アッセイは、力価が２×10⁴ 以下であることを示した。pBalパッケージングプラスミドはまた、ベクター中に ITR配列との重復する相同性を含有し、そして、野生型AAVの組換えによる生成をもたらす。 Lafaceら、(1988)は、HermonatおよびMuzyczka(1984)で使用されたのと同じベクターを使用して同じ方法で調製し、そしてまた非常に低い力価を示すネズミ骨髄細胞培養物中で1.5％の形質導入頻度を得た。 Samulskiら(1987、J.Virol.61:3096-3101)は、pSub201と呼ばれるプラスミドを構築した。これは、細菌プラスミド中の完全なAAVゲノムであるが、各ITRの末端で13ヌクレオチドの欠失を有し、従ってAAVゲノム全体を含有する他のAAVプラスミドよりも低い効率で回収および複製された。Samulskiら(1989、J.Virol.63:382 2-3828)は、pSub201に基づくが、repおよびcapを欠失していて、そしてSV40初期遺伝子プロモーターから発現するhygまたはneo遺伝子のいずれかを含有するAAV ベクターを構築した。彼らは、アデノウイルスITRの１コピーとともにいずれかの各末端を囲むヌクレオチド190-4490のAAVヌクレオチド配列全体からなるpAAV/ Adと呼ばれるパッケージングプラスミドでの同時トランスフェクションにより、これらのベクターをパッケージした。このパッケージングプラスミドでは、AAV のrepおよびcap遺伝子は、天然のAAVプロモーターp₅、p₁₉、およびp₄₀から発現された。pAAV/AdでのアデノウイルスITRの機能は、AAVキャプシドタンパク質の発現レベルを高めることであると考えられた。しかし、repは、その相同なプロモーターから発現され、そして負に調節されており、従ってその発現は制限されている。これらのキャプシド化システムを使用して、Samulskiら、1989は、AAVベクターストックを生成した。これは、実質的に野生型AAVを含まないが、上清１m lあたりのハイグロマイシン耐性単位が３×10⁴のみの形質導入力価を有する。野生型AAVゲノムをパッケージングプラスミドに使用した場合、AAVベクター調製物の力価は、５×10⁴に増加した。従ってこのシステムで生産される低力価は、そして部分的にはベクター構築に使用された基本的なpSub201プラスミドのITR配列の欠損により、そして部分的にはpAAV/AdからのAAV遺伝子の制限された発現によるようである。AAVneoベクター調製物の力価を増加させる試みでは、Samulskiら、 1989は、293細胞の30枚の10cm皿に大量にトランスフェクトし、そしてCsClでのバンド形成によりベクターストックを濃縮させることにより、ベクターストックを生成した。これは、DNAドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで測定したところ、合計10⁸粒子を含有するAAVneoベクターストックを生産した。このベクターストックを細胞あたり1,000までの多重度で使用した場合、70％の形質導入頻度が得られた。これは、細胞あたり１形質導入単位の比では、形質導入されるべき細胞の予想された比率が、ポアソン分布によれば63％であることから、粒子対形質導入の比が、約500〜1,000粒子であることを示唆している。ベクタープラスミドpSub201およびパッケージングプラスミドpAAV/Adを用いる Samulskiら(1989)のシステムは、２つのプラスミドの間に重複するAAV配列の相同性を有さなかったが、XbaI部位で重複する相同性があり、そしてこれらの部位の組換えにより完全な野生型AAVを生成する。すなわち、AAV配列の重複する相同性は存在しないが、完全なAAV配列は２つのプラスミド内に含有され、そしてこのように組換えにより野生型AAVを生成し得るが、これは望ましくない。このクラスの組換えがAAVプラスミド中で起こることはSenapathyおよびCarterにより示された(1984,J.Biol.Chem.259:4661-4666)。それゆえ、低力価および野生型組換え体を生成する能力の問題のためSamulskiら(1989)により説明されたシステムはヒト遺伝子治療において有用性を有さない。他のいくつかの報告がAAVベクターについて記載している。Srivastavaら(1989 ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:8078-8082)は、Samulskiら(1987)はpSub201プラスミドに基づくAAVベクターについて記載した。そこではAAVのコーディング配列は他のパルボウイルスB19のコーディング配列に置き換えられた。このベクターはp AAV/Adパッケージングプラスミドを用いてAAV粒子にパッケージされ、機能的ベクターを生成したが、力価は報告されなかった。このシステムはpSub201に基づいていたので、このプラスミドの上記の欠陥をこうむる。第２に、ベクターおよびパッケージングプラスミドは両方とも重複するAAV配列(ITR領域)を含有していたので、野生型ウイルスの混入をもたらす組換えが非常によく起こる。 Chatterjeeら(1991,Vaccines 91,Cold Spring Harbor Laboratory Press,85-8 9ページ)、Wongら(1991 Vaccines 91,Cold Spring Harbor Laboratoy Press,183 -189ページ)、およびChatterjeeら(1992,Science,258;1485-1488)は、HIVあるいは単純ヘルペスウイルスのような感染性ウイルスに対するアンチセンスRNAを発現するよう設計されたAAVベクターについて記載している。しかし、これらの著者はそのAAVベクターストックの力価についてなにも報告しなかった。さらに、彼らは、Tratschinら(1984b,1985)により使用された、AAVゲノムのBalAフラグメントを含有するプラスミドに類似のOri^-パッケージングプラスミドを用いてベクターをパッケージし、それ故彼らのパッケージングプラスミドは、ベクター構築物中に存在するAAV配列に相同性を有するAAVベクター配列を含有した。これはまた、野生型AAVの生成を生じる。このように、Chatterjeeら、およびWongらは低力価しか示さないことが公知のパッケージングシステムを使用した。そして、それはベクターおよびパッケージング配列の重複する相同性のため、野生型AAVゲノムの生成を生じ得る。他の報告は、ヒトリンパ球(Muro-Cachoら,1992,J.Immunotherapy,11:231-237) あるいはヒト赤白血病細胞株(Walshら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:7257-7 261)中で遺伝子を発現するAAVベクターの、pSub201ベクタープラスミドおよびpA AV/Adパッケージングプラスミドに基づいたベクターとの使用を記載している。また、ベクターストックの力価は報告されず、そして明らかに低い。なぜなら、選択マーカー遺伝子がベクターで首尾よく形質導入された細胞を同定するために使用されたからである。嚢胞性線維症患者由来のインビトロで増殖したヒト気道上皮細胞の、AAV p₅プロモーターから選択マーカー遺伝子neoを発現するAAVベクターでの形質導入が報告された(Flotteら,1992,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol. 7:349-356)。この研究では、AAVneoベクターはpAAV/Adパッケージングプラスミドを用いてAAV粒子にパッケージされた。培養物中の細胞の70%までがゲネチシン耐性に形質導入され得、そして粒子対形質導入の割合は、Samulskiら(1989)により報告されたものと同等であった。このように細胞の70%の形質導入を得るためには、細胞当たり数百までのベクター粒子の多重度が必要であった。AAV ITRプロモーターからCFTR遺伝子を発現するAAV形質導入ベクターを用いるインビトロ培養でのヒト気道上皮細胞の形質導入は、この細胞が嚢胞性線維症患者由来の細胞に存在する塩素チャンネル機能の電気生理学的欠陥を機能的に修正し得ることを示した(Eganら,Nature ,1992,358:581-584;Flotteら,J.Biol.Chem.268:3781-3790)。上記の研究は、AAVベクターが遺伝子治療によるヒト疾病の治療のためのベクターとしての潜在的な有用性を有し得ることを示唆する。しかし、十分な量のAA Vベクターを生成する能力は、AAVベクターを使用するヒト遺伝子治療の発展における厳しい制限であった。また、この制限の１つの局面は、インビボ動物モデルでAAVベクターを使用する前研究がない結果になった。これは一般的に、インビボでの送達および遺伝子発現に有用な高い力価を有するAAVベクターストックを十分量生成することに関する困難の反映である。AAV遺伝子治療の制限要素の１つは、使用されるベクターパッケージングシステムが比較的効率的でないことである。repおよびcapのようなAAVトランス補足機能を発現する細胞株の欠如のため、AAVベクターのパッケージングは、パッケージングプラスミドおよびベクタープラスミドの同時トランスフェクションによってアデノウイルス感染細胞中で達成されている。このプロセスの効率は、それぞれのプラスミド構築物のトランスフェクションの効率により、および今まで記載されたパッケージングプラスミド由来のRepタンパク質の発現レベルにより制限され得る。これらの問題はそれぞれ、AAV Repタンパク質の生物学的活性に関連しているようである。さらに、上記のように、上述の全てのパッケージングシステムは組換えによる野生型AAV を生成する能力を有する。機能的Repを安定して発現する細胞株の欠如は、明らかにRepによるneo ^-耐性コロニー形成の阻害(Labowら,1987;Trempeら,1991)により示されるように、Repの細胞傷害性あるいは細胞増殖抑制性の機能を反映する。また、これは培養細胞中の不死化表現型を逆転させるRepの傾向に関連するようであり、それが安定して機能的Repを発現する細胞株の生成を極めて困難にしている。Repを発現する細胞株を生成する試みはいくつか行われている。Mendelsonら(1988,Virology,166:15 4-165)は、１つの細胞株で、AAV rep遺伝子を含有するプラスミドでのHeLaあるいは293細胞の安定なトランスフェクション後、AAVRep52タンパク質のいくつかの低レベルの発現を得たが、Rep78あるいはRep68タンパク質の発現を得なかったことを報告した。Rep78およびRep68タンパク質が存在しないため、細胞株でベクターは生成され得なかった。別の細胞株はかろうじて検出できる量の非機能性Re p78を生成した。 Vincentら(1990,Vaccines 90,Cold Spring Harbor Laboratory Press,353-359 ページ)は正常AAVプロモーターから発現するAAV repおよびcap遺伝子を含有する細胞株の生成を試みた。しかし、これらの試みはベクターが100倍の過剰の野生型AAV粒子が混入したからか、あるいはベクターが４×10³より小さい非常に低い力価でしか生成されなかったからかのいずれかのために成功しなかった。他のアプローチでは、Lebkowskiら(米国特許第5,173,414号,1992年12月22日発行)がエピソーマルプラスミドでAAVベクターを含有する細胞株を構築した。次いで、これらの細胞株はアデノウイルスで感染され、トランス補足AAV機能性repおよびcapでトランスフェクションされAAVベクターの調製物を生じ得た。このことから高力価のAAVストックの生成を可能にしたことが主張される。しかし、示された例において、示された力価に関する唯一の情報は、１つのヒト細胞株K562がわずか１％あるいはそれより低い効率で形質導入され得たということであり、それはいかなる高力価のAAVベクターの生成をも示してない。このシステムにおいて、ベクターはエピソーマル（非組込み構築物）として運ばれ、そしてベクターの組込まれたコピーが好ましくないと述べられる。 Lebkowskiら、(1992)により記載されたAAVベクターのパッケージングのアプローチはいくつかの望ましくない局面を有する。第１に、細胞株中の組込まれていない多くのコピー数のエピソーマルプラスミドとしてベクターを維持することは望ましくない。なぜなら、細胞当たりのコピー数は厳密に制御され得ず、そしてエピソーマルDNAはおそらく欠陥ベクターの生成を導く再配列を受けるからである。第２に、このシステムにおいては、まだ、ベクターはアデノウイルスによって細胞を感染させ、そしてAAV repおよびcap遺伝子を含有するプラスミドを導入することによりパッケージされなければならない。Lebkowskiら(1992)により再び使用されたプラスミドはpBalであり、これは、上記のように、ベクターITR配列と重複する相同性を有し、そして結果として野生型AAVを生成する。第３に、L ebkowskiら(1988,1992)により使用されたpBalパッケージングプラスミド中で、r ep遺伝子はその相同なP₅プロモーターから離れて発現し、このように負に自己調節され、それ故にrepの発現は制限されるようである。プラスミドのトランスフェクション後のrep発現のやや最適のレベルの問題は、これらのタンパク質の別の生物学的活性に関連し得る。AAV-Repタンパク質は、pAAV/Ad(Samulskiら,1989)あるいはpBal(Lebkowskiら,1988,1992)のような前述の全てのパッケージング構築物に使用されたAAV-p₅プロモーターからのそれ自体の発現を下方調節するという証拠がある(Tratschinら,1986,Mol.Cell.Biol.6: 2884-2894)。発明の要旨遺伝子治療の基本的挑戦の１つは，エクスビボで容易に操作し得ず，活発に分裂しない細胞および組織の形質導入の方策の発展であった。例えば、AAVベクターは気道でのインビボ遺伝子移転を達成し得るが、可能な限り少量の十分に高い多重度のベクターの送達を可能にするように、高力価が重要である。これは、AA Vに基づく遺伝子治療の可能性を決定するにおいて、中心的に重要な最適のパッケージングの方法論を作り出す。安定でヘルパーを含まないAAVパッケージング細胞株は、主にRepタンパク質の活性のためにわかりにくかったが、Repタンパク質はそれ自体の発現を下方調節し、そして細胞の不死化を完全に変える。本発明において記載されるアプローチは効果的にこれらの問題を回避し、そしてパッケージング効率を実質的に改良している。高レベルのAAV-Repタンパク質を発現するHIV-LTRプロモーターの使用は、他で報告されている(Antoniら,1991)が、この発現システムの組換えAAVベクターのパッケージングへの適用は新たな発展である。実際、Repの発現レベルが同時トランスフェクションにおいてAAVベクターのパッケージングプロセスを制限することは以前に示されていない。パッケージング力価の10倍の上昇が、Rep発現の増加により達成されたという事実は、Repのレベルがこの環境において制限していることの直接的な証拠を提供する。pARtat同時トランスフェクションがパッケージング効率をさらに上昇させなかったという事実は、以下のいずれかを示し得る：(1)293細胞におけるHIVプロモーターからの発現レベルは、tatの非存在下において最大に引き上げられた、あるいは(2)pRS5のみによって達成されたRepのレベルは、Rep発現がパッケージング効率をもはや制限していなかったことを確実にするに十分であった。現在、pRS5に類似のパッケージングプラスミド中でRepを生成するために他の非AAVプロモーターが使用され得ることは明らかである。同様に、組込まれた組換えAAVゲノムの回収の現象は公知である(Tratschinら，1985;Flotteら,1993a)が、本明細書で記載されているようなベクター産生細胞株の生産に適用されたことは未だかつてない。 pRS5-ベクター細胞株システムの全体的なパッケージング効率は、パッケージング細胞当たり少なくとも10⁴粒子であった。これは臨床用グレードのAAV組換えベクター試薬を生産させるに十分以上である。野生型AAVの生成はこの方法においては観察されておらず、これはほとんどの同時トランスフェクションよりもさらに有利な点である。これらの改良は遺伝子治療で使用される臨床用グレードの AAV組換えベクター生成を可能にする。野生型AAVの非存在下での高力価のAAVベクターを産生させる手順および構築物が本明細書中で記載されている。従って、本発明の１つの実施態様は、高力価のAAV組換えベクター生成のプロセスであり、以下の工程を包含する： (a)安定に組込まれた組換えAAVベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞を提供する工程であって、このAAVベクターがAAV逆方向末端反復(ITR )領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そして細胞においてrep遺伝子の発現が制限されている、工程； (b)このrep遺伝子の産物の発現を可能にするAAVパッケージングプラスミドを提供する工程であって、このプラスミドにおいて、rep遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結し、そしてこのパッケージングプラスミドが工程(a)で提供される細胞中のベクターのAAV配列との重複する相同性を欠く、工程； (c)AAVパッケージングプラスミドを細胞に挿入する工程およびAAVの複製を可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程；および (d)工程(c)で生産された組換えAAVベクターを単離する工程。この実施態様に含有されるプロセスでは、Repが作動可能に連結されているパッケージングプラスミドのプロモニターはHIV-LTRであり、そしてこのプロセスにおいてパッケージングプラスミドはPRS5である。また、この実施態様に含有されるプロセスでは、標的ポリヌクレオチドは嚢胞性線維症トランスメンブランココンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする。本発明の他の実施態様は高力価のAAV組換えベクターを生成するためのパッケージングシステムであり、以下を包含する： (a)安定に組込まれた組換えAAVベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞であって、このAAVベクターがAAV逆方向末端反復(ITR)領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そしてrep 遺伝子の発現が細胞において制限されている、細胞；および (b)rep遺伝子の産物の発現を可能にするAAVパッケージングプラスミドであって、このプラスミドにおいて、rep遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結し、そしてパッケージングプラスミドが(a)で提供される細胞中のベクターのAAV 配列と重複する相同性を欠く、プラスミド。本発明のさらに他の実施態様は、rep遺伝子の産物の発現を可能にする高力価のAAV組換えベクターの生成の生産で使用するためパッケージングプラスミドであり、このプラスミドは異種プロモーターに作動可能に連結されるrep遺伝子を含む。図面の簡単な説明図１は、AAVのライフサイクルの図である。図２は、パッケージングプラスミドpRS5の産生、ならびにHIVI-LTRプロモーターとAAV2 repおよびcap遺伝子のコーディング配列との関係を示すスキームである。図３は、安定な細胞株に存在する回収可能な完全なAAV-neoゲノムを示すHirt 抽出DNAサンプルのサザンブロットの網版複写物である。図４は、コントロールおよびパッケージされたAAV-neoゲノムにおけるneoの検出を比較するドットブロットハイブリダイゼーションの網版複写物である。図５は、293細胞、ベクター産生クローンからのAAV CFTRベクター(TRF42)の回収を示す、Hirt抽出DNAサンプルのサザンブロットの網版複写物である。図６は、抗体染色およびFACS分析により決定される、CD44マーカーで染色された肺癌種細胞の割合のグラフである。発明の詳細な説明 AAVベクターは、ヒトの遺伝子治療、特に嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血症のような疾患に関係がある。本明細書で記載される発明は、遺伝子治療で使用するための高力価の組換えAAVベクターの産生に使用する方法および物質を提供する。本発明の実施には、他に示されていなければ、分子生物学、微生物学、組換え DNA、および免疫学の従来の技術が使用されており、それらは当業者の技術範囲内である。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook,F ritsch,およびManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版(1989) ,Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編,1984),Animal Cell Culture(R.I.Fres h ney編,1987),Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press,Inc.);Gene Tran sfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.MillerおよびM.P.Calos編,1987),Handb ook of Experimental Immunology ,(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編),Current P rotocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore ,J.G.Siedman,J.A.Smith,およびK.Struhl編,1987),およびCurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.ShevachおよびW.St rober編,1991)を参照のこと。本明細書中の前記および後記の全ての特許、特許出願、および出版物は本明細書中で参照として援用されている。転写を必要とする異種ポリヌクレオチドを含有する高力価の組換えAAVベクターの生成は以下の方法によって達成される。この方法において、適切なAAVベクタープラスミドを含有するクローン細胞が提供される。AAVベクタープラスミドはAAV ITR領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結される転写プロモーターを含有する。標的プロモーターに連結される転写プロモーターは転写物の形成を可能にし、そして例えば、非AAVプロモーターならびにP₅、P₁₉、P₄₀のようなAAVプロモーターおよびAAV ITRプロモーターを含む。標的ポリヌクレオチドの転写および/または翻訳産物は、好ましくは遺伝子治療に使用される。従って、標的ポリヌクレオチドは遺伝子治療のために送達される遺伝子を含み、例えば、ヘモグロビンのサブユニット鎖、酵素、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)のようなタンパク質などをコードする遺伝子である。標的ポリヌクレオチドはまた、転写されたときにアンチセンス分子として、転写あるいは翻訳因子に結合するデコイとして、リボザイムとしてなどの活性を有するポリヌクレオチドであり得る。この方法で提供されるクローン細胞の不可欠な特徴は、この細胞が安定に細胞に組込まれ、そしてまた相補的AAVrepまたはrepおよびcap機能がまた提供される時にアデノウイルスのようなヘルパーウイルスでトランスフェクトされた細胞の感染により回収され得る、AAVベクタープラスミドの少なくとも１つの完全なコピーを含有していることである。以下の実施例において、発明者らはAAVneoベクターを使用し、そこではベクター含有細胞株の初期選択をゲネチシン選択により行った。しかし、全く選択マーカーを含有しないCFTR遺伝子含有AAVベクターのようなベクターを含有する細胞株を生成するために、所望のベクタープラスミドおよび選択マーカーを含有する第２のプラスミドで共に細胞をトランスフェクトすることが簡単であることは当業者には明らかである。選択マーカーに基づく細胞クローンの選択後、高力価でベクターが回収され得るクローン細胞が直接スクリーニングを用いて容易に同定されることは明らかである。この１つの例がFlotteら(1993a)により報告されているが、その例では、AAVウイルスおよびアデノウイルスでの感染により細胞が回収された。Flotteら(1993a)の記録によれば、選択マーカーを含有しない回収可能なAAVベクターを含有する産生細胞株がまた得られ得た。その例では、AAVベクタープラスミドは、ITRを含有するAAVプロモターに作動可能に連結されたヒト CFTR cDNAを含有する構築物を含有していた。これらのベクターの安定に組込まれたコピーを含有する細胞株は、AAV-CFTRベクタープラスミドおよび選択マーカーneoを含有する第２のプラスミドでのヒト上皮細胞株IB-3の同時トランスフェクションにより得られた。ゲネチシンでのコロニーの選択後、個々のクローンは、安定に組込まれたベクターを含有するものを得た。そのベクターは、ヘルパーアデノウイルスおよび野生型AAV粒子による併発感染により回収され得る。これは、それ自体には選択マーカーを有さないベクターの安定に組込まれたコピーを有するクローンの生成を明らかに可能にする。この方法はまた、補足パッケージングプラスミドを提供することを包含する。このプラスミドによりRepまたはRepおよびCapタンパク質がrepまたはrepおよびc ap遺伝子から発現され得る。パッケージングプラスミドは、ベクター間の配列の重複する相同性が欠けており、そしてAAV ITR配列を含む。さらに、パッケージングプラスミドとベクターとの組み合わせは、完全なAAVゲノムを生じ得ない。下記の実施例では、AAV P₅プロモーターの周囲の120ヌクレオチド長の配列が、パッケージングプラスミドとベクターの両方で欠けている。さらに、パッケージングプラスミドでは、rep遺伝子は、AAV P₅プロモーターから転写されないが、むしろ異種の転写プロモーターに作動可能に連結されており、repからの発現による負の様式で強く自己調節されない。パッケージングプラスミドの好ましい例（例えば、pRS5によって示される）において、本発明者らは、異種のプロモーターとしてHIV-LTRを用いたが、いずれの異種のプロモーターも用い得、そして好ましくは、構成性または誘導性のプロモーターが用いられ得る。HIV-LTRは、両タイプのプロモーターの一例である。一般に、このプロモーターは、tatタンパク質の作用により非常に高レベルの発現を誘導し得る。しかし、本明細書で示される好ましい例では、HIV-LTRプロモーターは、293細胞において用いられる場合、repの高レベルの構成性発現を示す。これは、293細胞が、HIV-LTRプロモーターをトランス作用活性化することが知られているアデノウイルスEIA遺伝子産物を発現するためである。従って、293細胞（ベクターを含む細胞を樹立するのに好ましい細胞株である）においては、pR S5中のHIV-LTRプロモーターをさらにトランス作用活性化することは、最大レベルの機能的rep発現を得るために必ずしも必要ではあり得ない。ベクター産生細胞株が別の細胞で作製される場合には、pARtat(Antoniら、1991)のようなtat発現プラスミドの追加によるpRS5のトランス作用活性化を所望し得る。このような細胞株は、任意のヒト細胞株（例えば、HeLa、A549、KB、Detroit、WI38）または適切なヘルパー機能が発現され得る任意の細胞株を含み得る。ヒトアデノウイルスをヘルパーとして用いる場合、これはサルの所望の細胞株VEROも含み得る。あるいは、ヘルペスウイルスあるいはワクシニアまたは鳥類のポックスのようなポックスウイルスを用いてヘルパー機能を提供する場合、任意の適切なヒト、齧歯類、またはサル細胞株はベクター産生細胞として十分であり得る。 pRS5パッケージングプラスミドは誘導性または構成性プロモーターのいずれかのモデルとして役立つ。他の多くの誘導性または構成性プロモーターがパッケージングプラスミド構築物において用いられ得ることは当業者には明らかである。このパッケージングプラスミドの主な特徴は、それが野生型AAV p₅プロモーターを含まず、それ故repにより強く負に自己調節されないということである。そのようなプロモーターの他の例は、野生型P₅プロモーターの変異である。この変異により親の野生型プロモーターとの相同性が除かれるか、またはこのプロモーターの負の調節エレメント（例えば、P₅プロモーターのYYI領域）が不活化される。誘導性プロモーターの例には以下のものが挙げられる：金属イオン誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）；ステロイドホルモン誘導性プロモーター（例えば、MMTVプロモーター）；あるいは、成長ホルモンプロモーター；ヘルパーウイルスによって誘導され得るプロモーター（例えば、アデノウイルスE1Aタンパク質によって誘導され得るアデノウイルス初期遺伝子プロモーター）、またはアデノウイルス主要後期プロモーター；VP16または1CP4のようなヘルペスウイルスタンパク質によって誘導され得るヘルペスウイルスプロモーター、あるいはワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモーター、あるいはポックスウイルスRNAポリメラーゼによって誘導され得るプロモーター、あるいはポックスウイルスRNAポリメラーゼによって誘導され得るT7ファージ由来のプロモーターのような細菌プロモーター、あるいはT7 RNAポリメラーゼ由来のプロモーターのような細菌プロモーター。パッケージングプラスミドにおけるrep発現のための異種プロモーターとしての使用に適切な多くの強力な構成性プロモーターがあり、それらには、アデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、βアクチン(action)プロモーター、またはβグロビンプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIIIによって活性化されるプロモーターもまた用いられ得る。 AAVベクタープラスミドをパッケージングするためのRepおよびCap機能の補足に関するパッケージングプラスミドの効率は、Repおよび／またはCap機能を欠き、さらにマーカーを含むAAV発現ベクターを用いてテストされ得る。このような発現ベクターは当該分野で公知であり、例えば、pAAVp₅neo構築物を含む(Flotte ら、1992)。実施例では、記載されたパッケージング技術のそれぞれをテストするためにpAAVp₅neoをベクター構築物として用いた。なぜなら、pAAVp₅neoはDNA ドットブロットによる粒子数(Samulskiら、1989)およびneo ^-形質導入力価による粒子数についての両方の力価を測定し得るからである。パッケージングプラスミドを、当該分野で公知の任意の適切な技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどを含む）によって、組み込まれたAAVベクタープラスミドを含む細胞に導入する。パッケージングプラスミドの導入後、この細胞をAAVの複製を可能にする条件下で３〜５日間増殖させ、細胞溶解物を調製し、そして組換えAAVベクター粒子を当該分野で公知の技術により精製する。以下の実施例は、当該分野に従事する当業者に対するさらなる指針として提供され、どのような方法によっても本発明を限定するものとして解釈されない。 E.coli DH5細胞株中のプラスミドpRS5(E.coli::pRS5株)は、1993年11月9日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301 Parklawn Dr.,Rockvill e，Mary1and 20852)に寄託され、受託番号69483を付与された。寄託はブダペスト条約に基づいて行われた。本出願が米国特許として査定され、発行されるに際し、この寄託に関する全ての入手可能性の制限は変更不能に除かれる；そして指定された寄託物へのアクセスは、米国特許法施行規則§1.14および米国特許法§ 1.22に基づき特許商標庁長官によって権利が付与されることが決められた者に上記名称の出願が係属している間は利用可能である。さらに、指定された寄託物は、寄託の日から30年間、または寄託の最終申請後５年間；あるいは米国特許を実施し得る期間、のいずれかより長い期間、維持される。本明細書で言及する寄託された物質は、簡便さのみを目的としており、本明細書の記載を考慮して本発明を実施するためには必要とされない。さらに、これらの物質は本明細書中で参考として援用される。実施例実施例１パッケージングプラスミドpRS5 パッケージングプラスミドpRS5において、AAV p₅プロモーターは、rep遺伝子ポリペプチドの発現がそれ自身の合成を負に自己調節しないように異種のプロモーターで置換される。プラスミドpRS5を、以前に記載されたpHIVrep(Antoniら、J.Virol.,65:396-40 4)プラスミドの大きな(5kb)HindIIIからSphIまでのフラグメント（HIV-LTRプロモーターおよびpBR322プラスミド配列に隣接したAAVヌクレオチドの263〜1886を含むrep遺伝子配列を含む）をpcap1と呼ばれるプラスミド由来のHindIIIからSph Iまでのフラグメント（pBR322プラスミド配列に隣接し、AAV-ITRを有さないヌクレオチド1886〜4491に由来するAAVcap遺伝子を含む）に連結することにより構築した（図２参照）。これらの２つのフラグメントの連結後、パッケージングプラスミドpRS5を産生した。このプラスミドでは、AAV-rep遺伝子(Rep68および78タンパク質)がHIV-LTRプロモーターから転写され、より小さなRep産物（40kDおよび52kD Repタンパク質）およびキャプシドタンパク質をそれぞれ内在的なAAV p₁ ₉ プロモーターおよびp₄₀プロモーターが転写する。従って、pRS5は、全AAVコーディング配列をヌクレオチド263〜4491のAAVヌクレオチド配列内に含む。それは、異種HIV-LTRプロモーターに作動可能に連結したRep78およびRep68のrepコーディング配列を含み、AAV p₁₉プロモーターからRep52およびRep40を、そしてP₄₀プロモーターからAAVキャプシドタンパク質を発現する。この構築物のマップを図１に示す。記載されたパッケージング技術のそれぞれをテストするためにpAAVp₅neo構築物(Flotteら、1992)をベクター構築物として用いた。なぜなら、pAAVp₅neoは、D NAドットブロットによる粒子数(Samulskiら、1989)およびneo ^-形質導入力価による粒子数についての両方の力価を測定し得るからである。実施例２細胞株ヒト293-31細胞(Grahamら、1967，J.Gen.Virol.,36:59-72)を、10％ウシ胎児血清を含むEagle改変必須培地で37℃にて５％CO₂下で増殖した。この293細胞株を、ベクター調製物のパッケージングおよびneo形質導入力価の評価のためのneo 形質導入実験の両方に用いた。実施例３ HIV-LTRプロモーター−rep遺伝子プラスミドを用いる AAVビリオンのパッケージング pRS5構築物を用いて、アデノウイルス５型(Ad5)感染293細胞に同時トランスフェクションすることによりpAAVp₅neoベクタープラスミドをパッケージした(Flot teら、1992)。全部で10枚の10cm皿（それぞれ２×10⁶個の293細胞を含む（準集密的））を、それぞれ12.5μgのpRS5およびpAAVp5neoでトランスフェクションする前に、２×10⁶p.f.u.のAd5(m.o.i.=1)で１時間感染させた。次いで、採取の前に細胞を３日間37℃でインキュベートした。次いで、細胞を掻き採って低速遠心分離(4000rpm×10分)によりプールした。次いで、細胞ペレットを４mlの10mM Tris-HCl、pH8.0に再懸濁し、３回の凍結 −融解により溶解し、25ゲージ針で数回押出して粘性を減少させ、そしてミクロコッカスヌクレアーゼで処理した（40μlの300μ/μlストック、37℃で20分間、次いで４℃で10分間インキュベートした）。次いで、最終密度が1.41g/ccとなるようにCsClを添加した。各試験管に0.5〜1.0mlの鉱油を重層し、スウィングバケットローター(SW50)で35,000rpmで４℃にて12時間遠心分離した。次いで、0.5mlの画分を連続して回収し、そして各々をDNAドットブロットハイブリダイゼーションによって力価測定した(Samulskiら、1989)。各画分を10倍に希釈し、ニトロセルロースフィルター上にブロットし、2.3kbのneo遺伝子フラグメントからBoehringer Mannheimのランダムプライミングキットを用いて調製した³²P標識DNAプローブとハイブリダイズさせた。次いで、選択された画分をRing er平衡食塩溶液、pH7.4に対して透析し、形質導入力価実験における使用のために-20℃で保存した。実施例４ AAV-neoベクターストックの形質導入力価の測定上記で概説したようにして作製されたAAV-neoベクターストックを、１細胞当たり10〜1000粒子の範囲の10倍漸増粒子多重度で293-31細胞を感染することにより、293-31細胞において力価測定した。各場合、細胞を１ウェル当たり10⁴細胞でマイクロタイターウェルに播種し、次いで、ベクターを直接培地に接種することにより２時間感染させた。次に、各ウェルの細胞を24時間後にトリプシン処理し、４〜100mm皿上にプレートした。次いで、各セットのうち３枚の皿を200μg/ mlの用量のG418で選択した（活性、最初の感染から４８時間後に開始）。各セットの４番目の皿を平板効率についてのコントロールとしてG418なしで生育させた。細胞を10日から14日間選択し、サフラニンレッドで染色した。ゲネチシン耐性コロニーを計数して各セットの遺伝子コロニーの平均数を平板効率コントロールプレート内で見られるコロニー数で除すことにより形質導入頻度を決定した。次いで、このアッセイにおける形質導入単位(t.u.)を、63％の細胞をゲネチシン耐性に形質導入するのに必要な１細胞当たりの接種容量として規定した。実施例５ HIV-LTRプロモーター発現ベクターを用いることによる同時トランスフェクションAAVベクターパッケージングの改良表１（実験１〜３）に、以前に確立されたpAAV/Ad同時トランスフェクション技術および並行したpRS5同時トランスフェクションによって産生されたAAV-neo 粒子調製物のDNAドットブロット力価測定の結果を示す。表１の結果は、同時トランスフェクションによって導入されたpRS5構築物によって達成される力価（実験例４）が、pAAV/Adパッケージングプラスミドを用いて得られる力価より約５〜10倍高かったことを示す。プラスミドの３重トランスフェクションによるHIVの転写のトランスアクチベーター(tat)遺伝子の追加によってもパッケージング効率はほとんど増加しなかった。図３に示した実験において、pRS5単独での3.0×10¹⁰からpRS5＋pARtatによる4.0×10¹⁰まで、最大力価画分の粒子力価において30％のみ増加していた。これらの結果に基づいて、repおよびcap発現レベルは、もはやこの技術において制限しないように思われた。図３の実験は以下のように行った。実施例６安定な細胞株に存在する完全なAAV-neoゲノムの回収この実施例では、２×10⁶のヒト293細胞の培養物を、５μgのAAVベクタープラスミドpAAVp₅neo(pSA206)でトランスフェクトした。個々のコロニーを、培地1ml 当たり200μgの活性なG418(Gibco-BRL)を用いて、トランスフェクションの48時間目からゲネチシン耐性を選択した。個々のG418耐性コロニーを滅菌クローニングシリンダーによって単離し、安定な細胞株に拡大した。これらの細胞株のいくつかから、２×10⁶細胞をアデノウイルス５型(moi=2)および野生型AAV2(moi=2) の両方で感染した。48時間後、低分子量DNAをHirt高塩界面活性剤手法を用いて選択し、そして0.7％アガロースゲル電気泳動およびランダムプライム³²P標識ne oDNAプローブによるサザンブロッティングにより分析した。Hirt抽出DNAのサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図３に示す。図は、７〜８個の個別の細胞株を試験し（トラックＡ〜Ｇ）、ベクター配列が回収され複製され得たことを示す。トラックＨは、１つのゲネチシン耐性細胞株の一例を示し、それからはベクターは回収され得なかった。ベクターゲノムの予想された細胞内複製種（RFmはモノマー二本鎖複製型およびRFdは二本鎖ダイマー複製型）およびその子孫の一本鎖ゲノム(SS)を示す。８例のうち少なくとも６例（トラックＡ〜Ｄ、ならびにトラックＦおよびＧ）において、再配列されなかったベクターのコピーを回収した。実施例７組込まれた回収可能なAAVベクターを有する細胞株の使用はパッケージング効率を改良する pRS5構築物のAAV-repおよびcap遺伝子の発現を改良した後、本発明者らは、組込まれているが回収可能なAAV-neoベクターゲノムのコピーを含む均一な細胞集団を産生することによりパッケージング効率をさらに改良しようとした。repおよびcapのpRS5トランスフェクションと細胞株へのpAAVp₅neoベクターの安定な添加との組み合せにより、パッケージング効率を顕著に改良した。細胞株を、野生型AAV2およびAd5の両方で各ウイルスにつき５m.o.i.で感染されたAAV-p_sneoをトランスフェクトすることにより産生した。Hirt抽出を用いて、複製ウイルスDNAを単離し、そしてこれらのDNAサンプルを電気泳動および³²P 標識したneoプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。図３に示すように、回収可能なAAV-neo組換え体は、ほぼ全てのこれらの細胞株に存在していた。予想通りのバンドのパターンは、一本鎖（ゲル底付近のぼやけたバンド)、2.7kbサイズの二本鎖モノマー、5.4kbのダイマー、より大きなマルチマー形態を含んでいた。同様の様式で作製し、neo4-6およびneo4-9と命名した２つの細胞株を構築し、そして続いてのパッケージング実験に用いた。直接的な比較を、293細胞へのpRS 5およびpAAVp₅neoの同時トランスフェクションとneo4-6またはneo4-9細胞株のいずれかへのpRS5の単一トランスフェクションとの間で行った。表１に示すように、neo4-6細胞株は、力価が2.6×10¹¹であるパッケージされたAAV-neoを産生した。この粒子力価は、293細胞同時トランスフェクション法の数倍の改良を示し、そして任意の方法または用いた方法の組み合せの最も高い力価を生じた。ほぼ2.6 ×10¹¹粒子の全粒子力価は、２×10⁷細胞から始まって達成され、そして１細胞につき10⁴粒子を生じることを示す。上記のアッセイは、AAV粒子中にパッケージされていないAAV-neoゲノムのコピーも理論的には検出し得るDNA/ドットブロット法に全て基づいている。２つの型のコントロール実験の結果は、この可能性を排除した。まず、AAVp₅neoおよびpR S5プラスミドを、上記のとおりではあるが、Ad5感染の非存在下で293細胞に同時トランスフェクトした。これらの細胞の溶解物を、上記の任意の他の調製物とともに処理した。図４に示すように、コントロールのドットブロットハイブリダイゼーションは、neoシグナルがパッケージしたAAV-neoゲノムを反映していることを示した。 DNAドットブロットハイブリダイゼーションを、以下のように行った：最初に5 0マイクロリットルの各画分を用いて、５回の10倍の連続希釈をPBSで行った。ビリオンを溶解するために、1/10容量(５μl)の３N NaOHを添加し、そして混合物を65℃で１時間インキュベートした。等量(50μl)の２M NH₄OAc、pH7.0を添加して、合計100μl容量を、Schleicher and Schuell Minifold Iマイクロサンプル濾過マニホルドを用いて0.45μmナイロンフィルター上に移した。次いで、これらのフィルターを標準条件下でランダムプライム³²P標識neoDNAプローブでハイブリダイズした。上記のように調製したコントロールストックの10倍連続希釈物を、アデノウイルス感染後、neo4-9細胞株のpRS5トランスフェクションにより調製されたAAV-ne oストックの希釈物と比較した（カラムＡに示す）。カラムＢは、アデノウイルス感染のないneo4-9細胞株のpRS5トランスフェクションを示す。カラムＣは、pR S5トランスフェクションをしていないneo4-6細胞株のアデノウイルス感染を示す。カラムＤは、pRS5同時トランスフェクションをしていないpSA206トランスフェクト293細胞のアデノウイルス感染を示す。存続した細胞またはプラスミドDNAが顕著なneoシグナルを提供する場合はなかった。図４の結果は、検出可能なAAV-n eoシグナルが、この実験のDNA/ドットブロットハイブリダイゼーションに存在しないことを示し、これはプラスミドDNAがこれらの精製調製物中に存在しないことを明確に示す。次いで、直接的な比較を、２つのプラスミドトランスフェクション系で、または安定な株からのベクターの回収により産生されるAAV-neoベクターストックの形質導入力価について行った。表２に示すとおり、いずれかの系で産生された等数のベクター粒子を用いて得た形質導入の頻度は同様であった。これは、安定な細胞株からベクターを回収することにより生じたベクター粒子が、２つのトランスフェクションで生じた粒子と等しい生物学的効率および形質導入能力であったことを示す。従って、細胞株から回収したベクターは、顕著な生物学的改変を有さなかった。上記の結果は、本明細書に記載の組み合わせた改変が、約50〜100倍のベクター力価で増加を生じ得ることを示す。また、既に公表された報告と比較して（例えば、Samulskiら、1989)、この手順は、少なくとも２×10¹¹のベクター粒子力価を与え得、これは、同数の細胞(すなわち、合計10枚の10cm細胞培養皿で増殖したヒト293細胞)から既に達成されたベクター粒子力価よりも３オーダー大きい。実施例８ CFTRをコードするAAVベクターのパッケージング AAV-CFTRベクターpTRF42は、選択マーカーの非存在下でプロモーターとしてAA V ITRから発現したCFTR cDNAを含み、pSVneoプラスミドとの同時トランスフェクションにより293細胞株中に安定なベクター産生株を生じるために用いた。このベクターは、安定な細胞株から回収可能であり、そして回収したベクターは完全であり、再配列されなかった。 pTRF42の構築は記載されている(Flotteら、1993a，J．Biol．Chem. 268:3781- 3790)。この構築物は、AAV 5'末端(ITR)の145ヌクレオチド、それに続くインフレームのATG(Met)開始コドンからなるAAV-CFTRベクターを含み、アミノ酸1119からのCFTRコーディング配列を直接的に読み取る。CFTR cDNAの残りは、天然の終結コドンより下流および元の配列のヌクレオチド4629までで完全である。これに、合成ポリアデニル化シグナルが続き、次いでAAVヌクレオチド4490-4681(3’IT R)が続く。４マイクログラムのこのベクターを、２×10⁶個のヒト293細胞に１マイクログラムのpSV2neoプラスミドで同時トランスフェクトし、次いで、これを、トランスフェクション48時間後に初めて、200μgの活性なG-418で選択した。次いで、G-418耐性クローンをクローニングシリンダーで単離し、そして増大した。neoベクター含有株について行ったように、クローンを、組み合わせた野生型AAV2およびAd5感染(それぞれ、moi=２)で回収することにより分析した。低分子量DNA(Hirt)抽出物を、再び0.7％アガロースゲル電気泳動およびランダムプライム³²P標識CFTR cDNAプローブを用いるサザンブロッティングにより分析した。再度、細胞株は、モノマーおよびダイマーの複製形態(RF)について推測されたサイズ(それぞれ約4.6および9.2kb)の回収可能な完全なベクター配列を有することが見出された。これは、回収可能なベクターを含む細胞株を臨床的に重要な例の AAV-CFTRベクターとともに利用するアプローチの有用性を確認した。上記の原理および技術は、本発明のさらなる例を作るために適応され、そのうちのいくつかを後述し、本発明の有用性をさらに示す。実施例９肺気道上皮へのlacZ遺伝子の組込み前記の方法によりパッケージされたベクターのインビボ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素をコードするlacZ遺伝子を用いてテストした。AAVp₅l acZベクターを、pAAVp₅neo構築物をHindIIIおよびBamHIで切断し、そしてHindII Iを有する大きなフラグメント(AAVp₅プロモーターに隣接するAAV ITRおよび合成ポリアデニル化配列を含む)をE. coli lacZ遺伝子を含むpSVBgal由来のBamHIフラグメントに連結することにより作製した。次いで、この最初の構築物をHindII IおよびKpnIで切断し、T4ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)で平滑末端にし、そして大きなフラグメントを再連結することにより改変した。この最終操作により、lacZコーディング配列とフレームが合わない４つのATGコドンを含む配列の介在セグメントの除去が可能になった。次いで、ベクターを、上記のようにpRS5 プラスミドを用いてパッケージした。 0.2〜0.5ml中に10¹⁰粒子を含むパッケージされたAAVp₅lacZのアリコートを、３匹の離乳したC57BLマウスに腹腔内注射により投与した。ベクターを透析する同じ媒体溶液のアリコートを、コントロールとして用いた３匹の別のマウスに注射した。これらのマウスの体重は、それぞれ約30gmであり、10⁸細胞と10⁹細胞との間の推定総体細胞数を有する。従って、１細胞当たりの平均ベクター用量は、血流に依存して１細胞当たり10粒子と100粒子との間であった。動物をペントバルビタールの過剰用量により４日後に屠殺し、そして腹部壁、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および膵臓のサンプルを採取し、2.5％グルタルアルデヒドで固定した。インサイチュPCRアッセイを、５ミクロンのパラフィン包埋組織切片で、ベクター特異的プライマーおよび非放射活性ジゴキシゲニン-dUTP、抗ジゴキシゲニン、上記のようなアルカリホスファターゼ免疫検出系(Flotteら、1993)を用いて行った。プライマーをlacZ配列内から選択した(5'-プライマー：5'-ACAACTTTAAC GCCGTGCGCT-3'；3'-プライマー：5'TGCAGGAGCTCGTTATCGCTA-3')。82℃で高熱スタートした後、40サイクルのPCRを、反応産物中のジゴキシゲニン標識dUTP(Boeh ringer Mannheim)の直接組込みを用いて行った。次いで、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで標識した抗ジゴキシゲニン抗体(Geniu s IIIキット、Boehringer Mannheim)および免疫組織化学染色(NBT,.X-phos)を用いて検出した。ベクター注射およびコントロール注射したマウスの種々の組織切片を光学顕微鏡により試験した。ベクターDNA含有細胞を、核を重層する暗紫色−褐色反応産物により示した。染色は、ベクター注射したマウス由来の切片で明らかに観察されるが、コントロール由来の切片では観察されなかった。ベクターDNAを、肺の全ての細胞型、ならびにほとんどの肝細胞および膵臓腺房細胞で検出した。リンパ管を介した吸収後、ベクター粒子は、静脈循環に入り、そして肺循環に遭遇する。これは、肺における非常に効果的な遺伝子移動の原因のようである。肺を介して全身循環への通過後、ベクター粒子は、高血流の他の組織に最も効果的に分布したようである。実施例10 インビボでのlacZ遺伝子の発現インサイチュPCR検出のために用いた同じ組織サンプルの一連の切片を、X-gal 試薬とともにβ-ガラクトシダーゼ活性について染色した(0.2％、37℃、16時間) 。AAVp₅lacZで注射したマウス由来の切片を、媒体コントロールで注射したマウス由来の切片と比較した。コントロール動物の肺、脾臓、肝臓、膵臓、腎臓、または腹膜から採取した切片では、内因性β−ガラクトシダーゼ活性を検出し得なかった。肺の切片は、ベクター注射動物の気道上皮のセグメント全体にlacZ発現を示したが、コントロールでは示さなかった。気道のいくつかでは、試験した200細胞の75％より多くが、陽性に染色した。気道の約25％はこの程度の陽性の染色を示した(１切片につき４〜６の試験した気道、１匹の動物につき１〜２の切片)が、肺の他の領域はより低いレベルの発現であった。脾臓切片は、ベクター注射動物の非リンパ系領域にβ−ガラクトシダーゼ活性を示したが、コントロールでは示さなかった。脾臓内のリンパ小節は本質的に陰性であった。肺内の非上皮細胞またはベクター処理した動物の肝臓、腹部壁、および腎臓の細胞で染色はまれに見られるが、膵臓では発現は検出され得なかった。ベクターDNAの分布を、インサイチュPCRアッセイにより検出したように、以下のとおり、表３のβ−ガラクトシダーゼ活性の分布と比較する(n=3)：(--)非染色、(＋)X-gal染色した細胞＜１％、(++)１〜25％の染色、(+++)＞25％染色、(n d)行わず。従って、β−ガラクトシダーゼ活性の発現は、DNAベクターの分布およびプロモーターの組織特異性の両方に依存する。例えば、p₅プロモーターは、気道上皮細胞で非常に活性であるが、テストした他の細胞、例えば、膵臓由来の細胞ではあまり活性でない。実施例11 肺癌腫細胞におけるCD44遺伝子の組込みおよび発現 p₅プロモーター由来の細胞表面マーカーCD44を発現するpSAcd44ベクターを、p SA206(AAVp₅neo)構築物から直接的にサブクローニングした。粒子数を、ドットブロット分析により決定した。このベクターおよびpRS5パッケージングプラスミドを、肺癌腫細胞株H209およびH82に同時トランスフェクトした。種々の用量のベクターを、アリコートにつき４×10⁴細胞でテストした。トランスフェクションの48〜72時間後、細胞を抗CD44抗体を用いて細胞表面遺伝子の発現を蛍光染色した。次いで、細胞を蛍光活性化細胞計測器に通し、陽性染色した割合を決定した。この分析の結果を図６に示す。ウイルス力価を10⁴の単位で表す；従って、横軸上の「1000」は、１癌腫細胞につき250ベクター粒子を示す。高頻度のCD44発現は、1細胞につき100粒子程度の低い用量で達成された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フロッティ，テレンスアール. アメリカ合衆国メリーランド 21060, グレンバーニー，アメリカンサークル 7853，アパートメントティー３ (72)発明者カーター，バリージェイ. アメリカ合衆国ワシントン 98109，シアトル，サードアベニューノース 1218 (72)発明者グギーノ，ウィリアムビー. アメリカ合衆国メリーランド 21210, バルチモアー，ポプラーヒルロード 1005 (72)発明者ソロー，リッキーアメリカ合衆国メリーランド 20879, バルチモアー，リッジラインドライブ 10267

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を包含する高力価のAAV組換えベクターを生成するためのプロセス：（ａ）安定に組込まれた組換えAAVベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞を提供する工程であって、該AAVベクターがAAV逆方向末端反復(I TR)領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そしてrep遺伝子の発現が該細胞において制限されている、工程；（ｂ）該rep遺伝子の産物の発現を可能にするAAVパッケージングプラスミドを提供する工程であって、該プラスミドにおいて、該rep遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結し、そして該パッケージングプラスミドが工程（ａ）で提供される細胞中の該ベクターのAAV配列との重複する相同性を欠く、工程；（ｃ）該AAVパッケージングプラスミドを該細胞に挿入する工程およびAAVの複製およびパッケージングを可能にする条件下で該細胞をインキュベートする工程；および（ｄ）工程（ｃ）で生産された組換えAAVベクターを単離する工程。２．工程（ｂ）の前記異種プロモーターがHIV-LTRである、請求項１に記載のプロセス。３．前記パッケージングプラスミドがpRS5である、請求項１に記載のプロセス。４．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする、請求項１に記載のプロセス。５．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする、請求項２に記載のプロセス。６．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする、請求項３に記載のプロセス。７．以下を包含する高力価のAAV組換えベクターを生成するためのパッケージングシステム：（ａ）安定に組込まれた組換えAAVベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞であって、該AAVベクターがAAV逆方向末端反復(ITR)領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み；そしてre p遺伝子の発現が該細胞において制限されている、細胞；および（ｂ）該rep遺伝子の産物の発現を可能にするAAVパッケージングプラスミドであって、該プラスミドにおいて、該rep遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結し、そして該パッケージングプラスミドが（ａ）で提供される細胞中の該ベクターのAAV配列との重複する相同性を欠く、プラスミド。８．（ｂ）の前記異種プロモーターがHIV-LTRである、請求項７に記載のパッケージングシステム。９．前記パッケージングプラスミドがpRS5である、請求項７に記載のパッケージングシステム。１０．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする、請求項７に記載のパッケージングシステム。１１．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする、請求項８に記載のパッケージングシステム。１２．前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(CFTR)として機能し得るポリペプチドをコードする、請求項９に記載のパッケージングシステム。１３．前記rep遺伝子の産物の発現を可能にする高力価のAAV組換えベクターの生成の生産で使用するためのパッケージングプラスミドであって、該プラスミドが異種プロモーターに作動可能に連結されるrep遺伝子を含む、パッケージングプラスミド。１４．repが作動可能に連結される前記パッケージングプラスミドの前記プロモーターがHIV-LTRである、請求項１３に記載のパッケージングプラスミド。１５．前記プラスミドがpRS5である、請求項１３に記載のパッケージングプラスミド。