JP2020513811A - 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2017年3月17日に出願された米国仮特許出願第62/473,148号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、本開示の別個の部分として、以下のように識別されるコンピューター可読形式の配列表を含み、その全体が参照により組み込まれる:ファイル名:51475_Seqlisting.txt;サイズ:29,519バイト、作成;2018年3月13日。
DMDおよびその他の筋ジストロフィーに苦しむ患者の機能改善には、疾患の初期段階での遺伝子修復が必要である。筋力を増加させ、DMDに苦しむ患者の筋肉損傷から保護する治療が必要である。
本発明の組換えAAVゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する1つ以上のAAV ITRを含む。rAAVゲノムのAAV DNAは、AAV血清型AAVrh.74、AAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6、AAV−7、AAV−8、AAV−9、AAV−10、AAV−11、AAV−12、およびAAV−13を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導できる任意のAAV血清型に由来し得る。偽型rAAVの産生は、例えばWO01/83692に開示されている。他のタイプのrAAV変異体、例えば、カプシド変異を有するrAAVも企図される。例えば、Marsic et al.,Molecular Therapy,22(11):1900−1909(2014)を参照されたい。上述の背景技術のセクションに記載されるように、様々なAAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、AAV1、AAV6、AAV8またはAAVrh.74を使用することができる。
pAAV.MHCK7.マイクロジストロフィン構築物の生成
pAAV.MHCK7.マイクロジストロフィンプラスミドには、AAV2末端逆位配列(ITR)が隣接するヒトマイクロジストロフィンcDNA発現カセットが含まれている(図1を参照されたい)。マイクロジストロフィン構築物は、インフレームロッド欠失(R4〜R23)を特徴とし、ヒンジ1、2、および4、ならびにシステインリッチドメインが138kDaタンパク質を産生することを維持する。マイクロジストロフィンタンパク質(3579bp)の発現は、MHCK7プロモーター(795bp)によって誘導された。pAAV.MCK.マイクロジストロフィンプラスミドからMCKプロモーターを除去し、MHCK7プロモーターを挿入することにより、プラスミドを構築した。コアプロモーターの後、53bpの内因性マウスMCKエクソン1(非翻訳)が効率的な転写開始のために存在し、その後にSV40後期16S/19Sスプライスシグナル(97bp)および小さな5’UTR(61bp)が続く。イントロンおよび5’UTRは、プラスミドpCMVβ(Clontech)に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ATG開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、mRNA終了のための小さな53bpの合成ポリAシグナルを有していた。Harper et al.(Nature Medicine 8,253−261(2002))によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、(R4〜R23/Δ71〜78)ドメインを含んでいた。相補的DNAは、ヒトでの使用のためにコドン最適化され、GenScript(Piscataway,NJ)によって合成された(Mol Ther 18,109−117(2010))。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスDNAの複製とパッケージングの両方に必要なAAV2の末端逆位配列であった。マイクロジストロフィンカセットは、mRNA終結のための小さな53bpの合成ポリAシグナルを有する。
表1は、プラスミドpAAV.MHCK7.マイクロジストロフィン(配列番号3)の分子の特徴を示す。
rAAV.MHCK7.マイクロジストロフィンを使用した筋肉内発現研究
発現研究は、筋肉内注射により、ヒトマイクロジストロフィン構築物(rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィン;実施例1に記載)で実施された。mdxマウス(ジストロフィンを発現しない自発的なDmdmdx変異体マウス)の前脛骨筋に1×1011vgのカセット(群あたりn=5)を注射した。6週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン発現についてジストロフィンのN末端抗体で(Dys3)ならびにヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色で染色した。図2は、未処理の筋肉と比較して1×1011vgの用量での拡散した遺伝子発現と中心に配置された核の減少を示す。さらに、平均繊維/フレームの増加に伴う中心核形成の減少が、マイクロジストロフィン構築物での処理後に観察された。rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィン構築物の発現レベルは約73%と定量化された。
rAAVrh.74.MHCK7.マイクロジストロフィンのmdxマウスへの全身送達
mdxマウスのコホートに、6週齢で、2×1012vg(8×1013vg/kg)または高用量(計画された臨床用量)6×1012vg(2×1014vg/kg)のいずれかのrAAVrh.74.MHCK7.マイクロジストロフィンを尾静脈を介して注射した。12週間の治療後、全ての筋肉を採取し、ジストロフィンとDAPC成分の回復について染色した。全身注射(尾静脈)マウスは、全ての筋肉にわたってジストロフィンの高レベルの染色を示した。図4Aは、6×1012vg(2×1014vg/kg)の全身投与後の骨格、横隔膜、および心筋線維の広範な形質導入を表している。図4Bは、各組織でマイクロジストロフィンを発現している筋線維の割合の定量化を示している。最後に、横隔膜の機能改善を試験した(図4C)。低用量では顕著な差は見られなかったが、高用量では顕著な改善があった。重要なことに、図5は、DAPCの他の成分がマイクロジストロフィンの送達後に完全に復元されたことを示している。示されているのはベータサルコグリカン(B−SG)である。
pAAV.MCK.マイクロジストロフィン構築物の生成
pAAV.MCK.マイクロジストロフィンプラスミドは、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンcDNA配列を駆動するMCK発現カセットをAAVクローニングベクターpsub201(Samulski et al.,J.Virol.61(10):3096−3101)に挿入することにより構築された。筋肉特異的な遺伝子発現を駆動するために、筋肉特異的な調節エレメントが構築物に含まれていた。この調節エレメントは、351bpのMCKコアプロモーター(近位)に融合したマウスMCKコアエンハンサー(206bp)で構成されていた。コアプロモーターの後、構築物には、効率的な転写開始のための53bpの内因性マウスMCKエクソン1(非翻訳)が含まれ、その後にSV40後期16S/19Sスプライスシグナル(97bp)および小さな5’UTR(61bp)が続く。イントロンおよび5’UTRは、プラスミドpCMVβ(Clontech)に由来した。マイクロジストロフィンカセットは、ATG開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、mRNA終了のための小さな53bpの合成ポリAシグナルを有している。Harper et al.Nat.Med.8(3):253−61,2002によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、(R4〜R23/Δ71〜78)ドメインを含んでいる。
rAAV.MCK.マイクロジストロフィンを使用した効力と用量の分析
発現研究は、筋肉内注射により、ヒトマイクロジストロフィン構築物(rAAV.MCK.マイクロジストロフィン;実施例1に記載)で実施された。mdxマウス(ジストロフィンを発現しない自発的なDmdmdx変異体マウス)の前脛骨(TA)筋に3×109、3×1010、または1×1011vgのカセット(群あたりn=3)を注射した。4週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン発現についてN末端Dys3に特異的な抗体を使用してならびにヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色で染色した。図8は、3×109vgでの非常にわずかな発現(効果なしのレベル)と1×1011vgでの89%の発現による、発現と用量の間には線形相関を示す。
rAAV.MCK.マイクロジストロフィンのmdxマウスへの血管送達
分離式肢灌流モデル(Rodino−Klapac et al.,J.Trans.Med.5(45):1−11,2007)を使用して、mdxマウス(n=10)に1×1011vgのrAAVrh.74.MCK.マイクロジストロフィンを大腿動脈から注射し、実施した結果の分析を実施した。遺伝子導入の3ヵ月後、下肢の筋肉が採取され、有効性の研究により、力と伸張性収縮誘発損傷に対する抵抗性の両方で大幅な改善が示された(図9)。
霊長類研究
マウスにおける前臨床所見を臨床パラダイムに適用するため、非ヒト霊長類(NHP)が、将来の臨床試験の安全性と有効性を評価するために全身投与された。AAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィン.FLAGの2×1014vg総用量の、頭部静脈を介して静脈内送達された効果を、非ヒト霊長類で研究した。この用量は、マウスに与えられた全身用量に比例し(動物の体重に基づいて)、マウスに与えられた中用量(6.0×1012vg総用量)に対応した。
有効性を実証する前臨床研究
mdxマウスの骨格および心筋の欠損の処理におけるrAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンの全身送達の有効性を実証するために、前臨床研究が実施された。実施例1に記載される筋肉および心臓特異的プロモーターMHCK7により駆動されるコドン最適化ヒトマイクロジストロフィン導入遺伝子を含むAAVrh74ベクターをこの研究に使用した。
rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィン試験試料の効力決定は、注射後3か月および6か月の時点で全身に送達されたときの導入遺伝子発現およびベクターの有効性を評価するために、低、中、および高用量(2.0×1012vg総用量;6.0×1012vg総用量;1.2×1013vg総用量)での用量漸増で、mdxマウス(遺伝子型:C57BL/10ScSn−DMDmdx/J)における全身注射を行うことによって達成された。マウスに生後4〜5週間で注射し、注射後3ヶ月と6ヶ月の両方で完全な剖検を実施した。群あたりの平均動物体重に基づいて、これらの用量は8×1013vg/kg、2×1014vg/kgおよび6×1014vg/kgに等しい。等量の乳酸リンゲル液の注射が陰性対照として機能した。C57BL/6マウスへの乳酸リンゲル液の同量の注射は、陽性対照として機能した。安全性は、6.0×1012vg総用量の用量でWTマウスに全身注射(WT TX−中用量群と呼ばれる)を行うことによって決定された。骨格筋、前脛骨筋(TA)、腓腹筋(GAS)、大腿四頭筋(QUAD)、殿筋(GLUT)、腰筋、上腕三頭筋(TRI)、横隔膜(DIA)、および心臓の免疫蛍光染色を実施して、ジストロフィンの回復を判定し、rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンのウイルスベクターの有効性を確認した。
骨格筋、横隔膜、および心臓のヘマトキシリン&エオシン(H&E)染色を行って、各用量において注射後12週間で安楽死を伴う、2×1012vg総用量(低用量;n=1)、6×1012vgの総用量(中用量;n=8)1.2×1013vgの総用量(高用量;n=8)でのrAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンの全身注射後のジストロフィー病理の反転と改善を判定した。注射後24週間で、中用量(6×1012vg総用量)で処理した動物の2番目のコホートを、ジストロフィンの病理の反転と改善について評価した(n=5)。
マイクロジストロフィン遺伝子導入が疾患を有する筋肉に機能的強度の利益を提供するかどうかを判断するために、mdxマウス、WTマウス、および3つの用量レベルでのベクター投与マウスの横隔膜と前脛骨筋の両方の機能特性を評価した。用量漸増には、低用量(8×1013vg/kg)、中用量(2×1014vg/kg)、および高用量(6×1014vg/kg)が含まれた。6×1012vg総用量(中用量)でrAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンを全身注射した動物では、TAの伸張性収縮後の比力と力出力の減少のエクスビボ評価を使用したrAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンによる全身処理の機能評価を注射後24週間に利用した。さらに、横隔膜での比力の出力は、同一の動物で評価された。
筋肉内注射による生体力価の最初の実証後、骨格筋、横隔膜、および心臓に形質導入しながら、血管送達によりマイクロジストロフィンの同等または増加した回復が達成された。有効性は、炎症の減少、変性線維の減少、および前脛骨筋と横隔膜の伸張性収縮から保護することによる機能回復の改善による、用量依存的なジストロフィー機能の反転を実証した。ベクターの機能的な利点には、横隔膜とTAの力の生成における野生型レベルの段階的な改善が含まれる。
rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンによる全身処理の毒性と体内分布
rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンの全身注射を与えられたmdxマウスからの臓器および組織は、ベクターDNAの特定の配列を検出するためのリアルタイム定量PCRのために収集された。収集された全ての臓器および組織から抽出されたタンパク質をウェスタンブロットで分析し、オフターゲット臓器のマイクロジストロフィンを検出した。
rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンの静脈内注射は、検査されたいずれの骨格筋でも筋線維の顕微鏡的変化をまったく誘発しなかった。さらに、組織学的に評価された組織のいずれにも治療関連の病変は見られなかった。注目されたいずれの変化も、処理マウスと対照マウスの両方で見られ、偶発的な所見とみなされた。まとめると、これらのデータは、この試験試料が試験対象によって十分に許容されたことを示している。さらに、年齢を一致させた未処理のmdxマウスからの参照標本と比較して、rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンの投与は、処理されたmdxマウスの筋線維萎縮を減少させたため、試験試料がmdxの欠乏に関連するミオパチーの程度を改善できることを示している。
リアルタイムの定量的PCRアッセイ(qPCR)を使用して、試験試料特異的なDNA配列の存在を調べた。生体内分布解析は、用量レベルごとに3匹のベクター投与mdx動物から収集した組織試料で実施した。陽性シグナルは、検出されたゲノムDNA1μgあたり100以上の一本鎖DNAコピーであった。剖検時に組織を採取し、MHCK7プロモーターの配列に特異的なベクター特異的プライマープローブセットを使用した。以下の図22および表6は、rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィン注射マウスの各組織試料で検出されたベクターゲノムコピーを示している。
病理組織学的調査により、mdx−LRコホートは、評価された7つの骨格筋全ておよび心臓の右心室壁に影響を及ぼす広範なミオパチーを示したと結論付けられた。組織病理学レビューの主要な発見には、顕著な広範囲の筋線維萎縮(正常な筋線維サイズの30〜75%)、最小限から軽度の単核細胞炎症、間質腔の増加、および細胞質ミネラル沈着の増加が含まれた。横隔膜は、単核細胞浸潤および筋線維萎縮の最も顕著な変化を示した。心臓は、心室心筋に最小の単核細胞蓄積の小さな焦点を示した。ベクター投与コホートでは、全ての骨格組織と心臓のミオパチーが大幅に減少した。病理組織学的所見における減少は用量依存的であり、高用量群では変性と炎症が実質的に少なかった。WT処理コホートおよびベクター投与mdxコホートで実証されているように、rAAVrh74.MHCK7.マイクロジストロフィンによるベクター処理による有害作用はなかった。処理に関係なく、マウスが肝細胞細胞質の軽度の空胞化を示したmdxおよびWTマウスの肝臓および肺に偶発的な所見があった。したがって、試験試料は安全かつ有効であり、保護効果は用量依存的であった。
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配列表
<110>ネーションワイド・チルドレンズ病院の研究所
<120>筋肉特異的なアデノ随伴ウイルスベクター送達
筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィン
<130> 28335/51475A PCT
<150> US62/473,148
<151> 2017−03−17
<160> 5
<170> PatentInバージョン3.5
<210> 1
<211> 3579
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgctgtggt gggaggaggt ggaggattgt tatgaaaggg aggacgtgca gaagaagact 60
tttaccaagt gggtgaacgc tcagttcagc aaatttggga agcagcacat cgagaatctg 120
ttttccgacc tgcaggatgg gagacggctg ctggatctgc tggaaggact gactggccag 180
aagctgccca aagagaaggg gagcactagg gtgcacgccc tgaacaacgt gaacaaagct 240
ctgagagtgc tgcagaacaa caacgtggat ctggtgaata ttggcagtac tgatatcgtg 300
gacgggaacc acaaactgac actgggcctg atctggaaca ttattctgca ctggcaggtg 360
aaaaatgtga tgaagaacat catggccggg ctgcagcaga ccaattccga gaagatcctg 420
ctgtcttggg tgcggcagag cacccgcaac tatccccagg tgaacgtgat taacttcact 480
acatcctgga gcgacgggct ggccctgaat gctctgattc acagccacag gcctgatctg 540
ttcgactgga atagcgtggt gtgccagcag tctgccacac agcgcctgga acatgccttc 600
aatatcgctc ggtaccagct ggggatcgaa aaactgctgg acccagagga tgtggacact 660
acatacccag ataaaaagtc tattctgatg tacattacta gcctgttcca ggtgctgcca 720
cagcaggtgt ctattgaagc cattcaggag gtggaaatgc tgccccgccc ccccaaagtg 780
actaaagagg agcattttca gctgcatcat cagatgcatt acagccagca gattaccgtg 840
agcctggctc agggatatga gcgcaccagt agtccaaaac cacggttcaa gtcctacgct 900
tatacccagg ctgcctacgt gacaactagc gaccctacta gatccccctt tccatcccag 960
cacctggagg ccccagagga caagagcttt gggtccagcc tgatggaaag cgaggtgaat 1020
ctggatcggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgag tgctgaagac 1080
acactgcagg cccagggcga aatttccaat gacgtggaag tggtgaagga tcagttccac 1140
acacacgagg gctatatgat ggacctgaca gctcaccagg ggcgcgtggg caatatcctg 1200
cagctgggct ctaaactgat cggcaccggg aaactgagtg aggacgagga aacagaagtg 1260
caggagcaga tgaacctgct gaacagccgc tgggagtgtc tgagagtggc tagtatggag 1320
aagcagtcca acctgcaccg ggtgctgatg gacctgcaga accagaaact gaaagagctg 1380
aacgactggc tgacaaagac tgaggaacgc acaaggaaga tggaggagga gccactggga 1440
cccgacctgg aggatctgaa gagacaggtg cagcagcata aggtgctgca ggaggatctg 1500
gaacaggagc aggtgcgggt gaactccctg acacatatgg tggtggtggt ggacgaatct 1560
agtggagatc acgccaccgc cgccctggag gaacagctga aggtgctggg ggaccggtgg 1620
gccaacattt gccggtggac cgaggacagg tgggtgctgc tgcaggacat cctgctgaaa 1680
tggcagaggc tgaccgagga gcagtgtctg tttagtgctt ggctgagcga gaaagaggac 1740
gccgtgaaca agatccacac aaccggcttt aaggatcaga acgaaatgct gtctagcctg 1800
cagaaactgg ctgtgctgaa ggccgatctg gagaaaaaga agcagagcat gggcaaactg 1860
tatagcctga aacaggacct gctgagcacc ctgaagaaca agagcgtgac ccagaagaca 1920
gaagcctggc tggataactt tgcccgctgc tgggacaacc tggtgcagaa actggagaaa 1980
agtacagctc agatctctca ggctgtgacc acaacccagc ctagcctgac ccagacaacc 2040
gtgatggaaa ccgtgaccac cgtgacaacc cgcgaacaga tcctggtgaa acatgcccag 2100
gaagagctgc cacctccacc tccccagaag aagagaaccc tggagcggct gcaggagctg 2160
caggaagcca ctgacgaact ggacctgaag ctgaggcagg ccgaagtgat taaggggtct 2220
tggcagcctg tgggcgatct gctgattgat tccctgcagg accacctgga aaaggtgaag 2280
gctctgagag gcgaaattgc tccactgaag gagaacgtga gtcatgtgaa cgatctggct 2340
agacagctga caacactggg catccagctg agcccataca atctgagcac actggaggac 2400
ctgaatacca ggtggaagct gctgcaggtg gctgtggaag accgggtgcg gcagctgcat 2460
gaggcccatc gcgacttcgg accagccagc cagcactttc tgagcacatc cgtgcagggg 2520
ccctgggaga gggccatttc tcccaacaag gtgccctact atattaatca cgagacccag 2580
accacttgtt gggaccatcc caagatgaca gaactgtacc agtccctggc cgatctgaac 2640
aacgtgaggt ttagcgctta cagaaccgct atgaagctga gacggctgca gaaggccctg 2700
tgcctggatc tgctgtccct gtccgccgcc tgcgatgccc tggatcagca taatctgaag 2760
cagaacgatc agccaatgga tatcctgcag atcatcaact gcctgaccac tatctacgac 2820
aggctggagc aggagcacaa caacctggtg aacgtgcctc tgtgcgtgga tatgtgcctg 2880
aactggctgc tgaacgtgta tgacactggg cgcaccggcc ggatcagagt gctgagtttt 2940
aaaactggga ttatctccct gtgtaaggcc cacctggagg acaagtacag gtacctgttc 3000
aagcaggtgg ctagtagcac tggattttgt gaccagcgcc gcctgggact gctgctgcat 3060
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gaacccagcg tgcgcagctg tttccagttt gccaataaca aacctgaaat cgaggctgct 3180
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<212> DNA
<213>アデノ随伴ウイルス
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gtttaaacaa gcttgcatgt ctaagctaga cccttcagat taaaaataac tgaggtaagg 60
gcctgggtag gggaggtggt gtgagacgct cctgtctctc ctctatctgc ccatcggccc 120
tttggggagg aggaatgtgc ccaaggacta aaaaaaggcc atggagccag aggggcgagg 180
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tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt 300
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tccctggtgg atcccctgca tgcgaagatc ttcgaacaag gctgtggggg actgagggca 420
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ttccatgttc ccggcgaagg gccagctgtc ccccgccagc tagactcagc acttagttta 540
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<212> DNA
<213>アデノ随伴ウイルス
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gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcgcg 60
ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc 120
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ccttgtagtt aatgattaac ccgccatgct aattatctac gtagccatgt ctagagttta 240
aacaagcttg catgtctaag ctagaccctt cagattaaaa ataactgagg taagggcctg 300
ggtaggggag gtggtgtgag acgctcctgt ctctcctcta tctgcccatc ggccctttgg 360
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agacctttca tgggcaaacc ttggggccct gctgtctagc atgccccact acgggtctag 480
gctgcccatg taaggaggca aggcctgggg acacccgaga tgcctggtta taattaaccc 540
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tcaggctgtg accacaaccc agcctagcct gacccagaca accgtgatgg aaaccgtgac 3060
caccgtgaca acccgcgaac agatcctggt gaaacatgcc caggaagagc tgccacctcc 3120
acctccccag aagaagagaa ccctggagcg gctgcaggag ctgcaggaag ccactgacga 3180
actggacctg aagctgaggc aggccgaagt gattaagggg tcttggcagc ctgtgggcga 3240
tctgctgatt gattccctgc aggaccacct ggaaaaggtg aaggctctga gaggcgaaat 3300
tgctccactg aaggagaacg tgagtcatgt gaacgatctg gctagacagc tgacaacact 3360
gggcatccag ctgagcccat acaatctgag cacactggag gacctgaata ccaggtggaa 3420
gctgctgcag gtggctgtgg aagaccgggt gcggcagctg catgaggccc atcgcgactt 3480
cggaccagcc agccagcact ttctgagcac atccgtgcag gggccctggg agagggccat 3540
ttctcccaac aaggtgccct actatattaa tcacgagacc cagaccactt gttgggacca 3600
tcccaagatg acagaactgt accagtccct ggccgatctg aacaacgtga ggtttagcgc 3660
ttacagaacc gctatgaagc tgagacggct gcagaaggcc ctgtgcctgg atctgctgtc 3720
cctgtccgcc gcctgcgatg ccctggatca gcataatctg aagcagaacg atcagccaat 3780
ggatatcctg cagatcatca actgcctgac cactatctac gacaggctgg agcaggagca 3840
caacaacctg gtgaacgtgc ctctgtgcgt ggatatgtgc ctgaactggc tgctgaacgt 3900
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cctgtgtaag gcccacctgg aggacaagta caggtacctg ttcaagcagg tggctagtag 4020
cactggattt tgtgaccagc gccgcctggg actgctgctg catgatagta tccagattcc 4080
tagacagctg ggagaggtgg ctagtttcgg aggatctaac atcgaaccca gcgtgcgcag 4140
ctgtttccag tttgccaata acaaacctga aatcgaggct gctctgttcc tggattggat 4200
gcgcctggaa ccacagagca tggtgtggct gcctgtgctg cacagagtgg ctgccgccga 4260
aactgccaag caccaggcta aatgcaacat ctgcaaggaa tgtcccatta tcggctttcg 4320
ctacaggagt ctgaaacatt ttaactacga tatttgccag agctgcttct tttccggaag 4380
agtggccaaa ggacacaaga tgcactaccc tatggtggaa tattgcaccc caactacatc 4440
tggcgaagat gtgcgcgatt ttgccaaggt gctgaagaat aagtttcgga ctaagaggta 4500
cttcgccaag cacccccgca tggggtatct gccagtgcag acagtgctgg aaggagacaa 4560
tatggagacc gatacaatgt gagcggccgc aataaaagat ctttattttc attagatctg 4620
tgtgttggtt ttttgtgtgt ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 4680
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cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 4800
cagtgagcga gcgagcgcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 4860
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaagttcc agacgattga gcgtcaaaat 4920
gtaggtattt ccatgagcgt ttttcctgtt gcaatggctg gcggtaatat tgttctggat 4980
attaccagca aggccgatag tttgagttct tctactcagg caagtgatgt tattactaat 5040
caaagaagta ttgcgacaac ggttaatttg cgtgatggac agactctttt actcggtggc 5100
ctcactgatt ataaaaacac ttctcaggat tctggcgtac cgttcctgtc taaaatccct 5160
ttaatcggcc tcctgtttag ctcccgctct gattctaacg aggaaagcac gttatacgtg 5220
ctcgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 5280
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 5340
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ccctttaggg ttccgattta gtgatttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 5460
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 5520
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ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 5640
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atttgcttat acaatcttcc tgtttttggg gcttttctga ttatcaaccg gggtacatat 5760
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aggcaatgac ctgatagcct ttgtagagac ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatg 5880
aatttatcag ctagaacggt tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt 5940
tctcacccgt ttgaatcttt acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag 6000
ggttctaaaa atttttatcc ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag 6060
ggtcataatg tttttggtac aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat 6120
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cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 6360
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gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 7980
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ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 8220
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 8280
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gggtttgagt 8340
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaccaag 8400
cggaagagc 8409
Claims (40)
- 筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列と、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、を含む、組換えAAVベクター。
- 前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、
a)配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも85%同一であり、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または
b)配列番号1のヌクレオチド配列、を含む、請求項1に記載の組換えAAVベクター。 - 前記筋肉特異的制御エレメントが、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子(MEF)、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)、短縮型MCK(tMCK)、ミオシン重鎖(MHC)、ハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー/MCKエンハンサープロモーター(MHCK7)、C5−12、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー因子、速筋骨格筋トロポニンc遺伝子エレメント、遅筋心臓トロポニンc遺伝子エレメント、遅筋トロポニンi遺伝子エレメント、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性エレメント、または糖質コルチコイド応答エレメント(GRE)である、請求項1または2に記載の組換えAAVベクター。
- 前記筋肉特異的制御エレメントが、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)またはハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー/MCKエンハンサープロモーター(MHCK7)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 前記筋肉特異的制御エレメントが、配列番号4のヌクレオチド配列を含む筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)、または配列番号2のヌクレオチド配列を含むハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー/MCKエンハンサープロモーター(MHCK7)である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 配列番号1および2のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 配列番号1のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号2のMHCK7プロモーター配列を含む、組換えAAVベクター。
- 配列番号3のpAAV.MHCK7.マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、組換えAAVベクター。
- 配列番号1および4のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 配列番号5のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜5または10のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 前記ベクターが、血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、またはAAV13である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 前記筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列が、マイクロジストロフィンヌクレオチド配列に動作可能に連結されている、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組換えAAVベクター。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
- 筋ジストロフィーを患っている対象において筋力または筋肉量を増加させる方法であって、治療有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターまたは請求項14に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 筋ジストロフィーを患っている対象において線維症を軽減または予防する方法であって、治療有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターまたは請求項14に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 筋ジストロフィーを治療する方法であって、治療有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターまたは請求項14に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 筋ジストロフィーを治療する方法であって、配列番号1のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号2のMHCK7プロモーターヌクレオチド配列を含む、治療有効量の組換えAAVベクターを投与することを含む、方法。
- 筋ジストロフィーを治療する方法であって、配列番号3のpAAV.MHCK7.マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、治療有効量の組換えAAVベクターを投与することを含む、方法。
- 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えAAVベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射または静脈内注射により投与される、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えAAVベクターまたは前記組成物が全身投与される、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えAAVベクターまたは前記組成物が注射、注入、または移植により非経口投与される、請求項22に記載の方法。
- 筋ジストロフィーを患っている対象において筋力または筋肉量を増加させるための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターを含む組成物。
- 筋ジストロフィーの治療のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターを含む組成物。
- 筋ジストロフィーの治療のための、配列番号1のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号2のMHCK7プロモーター配列を含む組換えAAVベクターを含む組成物。
- 筋ジストロフィーの治療のための、配列番号3のpAAV.MHCK7.マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む組換えAAVベクターを含む組成物。
- 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項24〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 筋肉内注射または静脈内注射のために製剤化された、請求項24〜28のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組換えAAVベクターまたは前記組成物が全身投与される、請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えAAVベクターまたは前記組成物が、注射、注入、または移植による非経口投与である、請求項30に記載の方法。
- 筋ジストロフィーを患っている対象において筋力または筋肉量を増加させるための薬剤の調製のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターまたは請求項14に記載の組成物の使用。
- 筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターまたは請求項14に記載の組成物の使用。
- 筋ジストロフィーを患っている対象において線維症を軽減または予防するための薬剤の調製のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組換えAAVベクターまたは請求項14に記載の組成物の使用。
- 筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、配列番号1のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号2のMHCK7プロモーターヌクレオチド配列を含む、組換えAAVベクターの使用。
- 筋ジストロフィーの治療のための、配列番号3のpAAV.MHCK7.マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、組換えAAVベクターの使用。
- 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項32〜36のいずれか1項のいずれか1項に記載の使用。
- 前記薬剤が筋肉内または静脈内投与のために製剤化される、請求項32〜37のいずれか1項に記載の使用。
- 前記薬剤が全身送達のために製剤化される、請求項32〜37のいずれか1項に記載の使用。
- 前記薬剤が、注射、注入、または移植による非経口投与のために製剤化される、請求項39に記載の使用。
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