JP2023540095A - Ｇ－サルコグリカンを発現するアデノ随伴ウイルスベクターの全身送達および筋ジストロフィーの治療 - Google Patents

Abstract

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターを投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する方法、患者においてガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現させる方法、ｒＡＡＶを含む医薬組成物、およびｒＡＡＶを作製する方法が、本明細書に記載される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年９月８日に出願された米国仮特許出願第６３／０７５，６９７号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が、参照により本明細書に組み込れる。

配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表が含まれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、８１８６ＷＯ００＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズ２３キロバイトである。

γ－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターなどの治療ベクターおよびこれらのベクターを使用して、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減し、予防する方法が、本明細書に記載されている。

肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）２Ｃ型（ＬＧＭＤ２Ｃ）は、機能タンパク質の喪失を引き起こす、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）をコードする遺伝子の変異から生じる常染色体劣性障害である。これは、帯筋から始まり、その後、下肢および上肢の筋肉に拡張する進行性の筋ジストロフィーとして現れ、また横隔膜（ＤＩＡ）および心臓（ＨＲＴ）にも現れ、特定の患者において呼吸および心不全をもたらすことがある。ＬＧＭＤ２Ｃのための、承認された疾患修飾療法は存在しない。そのため、ＬＧＭＤ２Ｃ患者に有効な療法が必要である。

遺伝子治療ベクター、例えば、γ－サルコグリカン遺伝子を発現しているＡＡＶならびにγ－サルコグリカンを筋肉に送達して、線維症を低減し、および／もしくは予防する；ならびに／または筋力を増加させる、ならびに／または筋ジストロフィーに罹患している哺乳類対象を治療する方法が、本明細書に記載される。

一態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法が、本明細書に記載され、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量または定量標準としての直線化プラスミドに基づき３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され；対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。

別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含む、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法が提供され、対象の細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン遺伝子発現レベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加されるか；対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加されるか；または運動機能は、ｒＡＡＶの投与前の当該対象の運動機能と比較して、当該対象において改善され、運動機能は、１００メートル歩行時間テストおよび／またはＮＳＡＤにより決定される。実施形態では、ＮＳＡＤは、ｒＡＡＶの投与前の当該対象のＮＳＡＤと比較して、当該対象において増加される。

別の態様では、本開示は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの容量でｒＡＡＶ静脈内注入を対象に投与することを含む、必要とする対象における肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法を提供し、ｒＡＡＶは、配列番号１、配列番号７、または配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、対象に、配列番号７または１０に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を投与することを含む、対象の細胞においてガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を記載する。一態様では、本開示は、対象に、配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を投与することを含む、対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維を増加させる、および／またはＣＫレベルを減少する方法を提供する。

一態様では、対象に、配列番号１または配列番号７、または配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を含むｒＡＡＶを投与することを含む、それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンの発現を増加させる方法が、本明細書に記載される。別の態様では、対象に、配列番号１または配列番号７または配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を投与することを含む、それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンの細胞膜への局在化を増加させる方法が、本明細書において提供される。別の態様では、対象に、配列番号７または配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを投与することを含む、筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させるか、または対象の筋機能を改善する方法が提供される。別の態様では、本開示は、対象に、第一のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を投与すること、および当該第一のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜における少なくとも第二のサルコグリカンの発現の増加を検出することを含む、対象の筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法を提供する。

別の態様では、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクター、緩衝剤、イオン強度剤、および界面活性剤を含む、組成物が記載される。別の態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを含む医薬組成物が、本明細書に記載され、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧは、配列番号７または配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧは、配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、プラスミドを細胞に導入することを含む、組換えＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを生成する方法が提供され、プラスミドは、配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。特に、プラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、プラスミドは、配列番号７または配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、γ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターが、本明細書に記載される。一部の実施形態では、γ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一の配列を含み、γ－サルコグリカン活性を保持しているタンパク質をコードする。一部の実施形態では、γ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、γ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列からなる。

別の態様では、本明細書に記載される組換えＡＡＶベクターは、配列番号９のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、なおより典型的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一であるγ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含み、タンパク質は、γ－サルコグリカン活性を保持している。

別の態様では、機能的γ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターが、本明細書に記載される。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは配列番号１０の核酸配列、またはその相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

「ストリンジェント」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般的に理解される条件を指す。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度により決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（６５℃～６８℃）または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド（４２℃）である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）が使用されてもよいが、ハイブリダイゼーションの速度は、影響されるだろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する場合において、追加の典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基のオリゴのため）、４８℃（１７塩基のオリゴのため）、５５℃（２０塩基のオリゴのため）、および６０℃（２３塩基のオリゴのため）にて洗浄することを含む。

分子量、濃度、または投与量などの物理的特性についての範囲が、本明細書で使用されるとき、その中の範囲および特定の実施形態のすべての組み合わせおよびサブコンビネーションが含まれることが意図される。数または数値範囲を指すときの「約」という用語は、言及される数または数値範囲が、実験の変動性内（または統計的実験誤差内）の近似であり、したがって、数または数値範囲は、例えば、記載される数または数値範囲の１％～１５％変動し得ることを意味する。

他の薬剤が、非特異性および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを低減する目的のため、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に含まれてもよい。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ_４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハート液、超音波処理したサーモン精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適当な剤も使用することができる。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８～７．４で実施されるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を調節し、異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者により調整され得る。

別の態様では、本明細書に記載される組換えＡＡＶベクターは、筋特異的調節エレメントに作動可能に連結されてもよい。例えば、筋特異的調節エレメントは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（切断型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣとＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋心トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメントまたはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧは、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、もしくは約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号９に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、もしくは約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ベータおよび／またはアルファ－サルコグリカン活性を含む、サルコグリカン活性を保持しているタンパク質をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ガンマ－サルコグリカン活性を保持しているタンパク質をコードする。

一部の実施形態では、筋特異的プロモーターは、ｔＭＨＣＫ７（配列番号２）である。本明細書に記載される典型的なｒＡＡＶは、配列番号７または配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＧである。

ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶｒｈ．７４であってもよい。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されている。カプシド変異を有する、他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、ｒＡＡＶも、考慮される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。

本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物も企図される。

一部の実施形態では、本開示は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、もしくは約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号９に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、もしくは約８９％、より典型的には、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ ｒＡＡＶベクターを含む組成物または医薬組成物を提供する。さらに、本開示は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列、または配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ ｒＡＡＶベクターを含む組成物または医薬組成物を提供する。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含む、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法が提供され、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用し、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

筋ジストロフィーを治療するための組成物もまた提供され、組成物は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約２．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣを含み、組成物は、全身投与用に製剤化される。

さらに、筋ジストロフィーを治療するための医薬の製造のための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣの使用が提供され、医薬は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量でｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣを含み、医薬は、全身投与用に製剤化される。

提供される方法、組成物および使用のいずれかにおいて、対象の細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加され；対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少し；および／または対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加される。

別の実施形態では、提供される方法、組成物および使用のいずれかにおいて、運動機能は、ｒＡＡＶの投与前の当該対象の運動機能と比較して、当該対象において改善され、運動機能は、１００メートル歩行時間テストにより決定される。例えば、運動機能は、遺伝子導入後、１ヶ月もしくは３０日で少なくとも５％、遺伝子導入後、２ヶ月もしくは６０日で少なくとも１０％、または遺伝子導入後、３ヶ月もしくは９０日で少なくとも１５％改善される。一部の実施形態では、運動機能は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％改善される。

例えば、提供される方法、組成物および使用のいずれかにおいて、全身投与経路は、静脈内経路である。例えば、ｒＡＡＶは、静脈内経路を使用して投与され、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。

一部の実施形態では、静脈内経路を使用して投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５×１０^１４である。

さらに、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．５×１０^１３ｖｇ～約２×１０^１６ｖｇ、または１．５×１０^１３ｖｇ～１×１０^１６ｖｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ～約２×１０^１５ｖｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ～約１×１０^１５ｖｇである。さらに、方法、組成物および使用のいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される。提供される方法、組成物または使用のいずれかにおいて、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。

さらに、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含む、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法が提供され、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用し、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約２．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与されるか；対象の細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加されるか；対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少するか；または対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加される。例えば、提供される方法のいずれかにおいて、全身投与経路は、静脈内経路であり、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、投与されるｒＡＡＶの用量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。さらに、投与されるｒＡＡＶの総用量は、約１．５×１０^１３ｖｇ～約２×１０^１６ｖｇ、または１．５×１０^１３ｖｇ～１×１０^１６ｖｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ～約２×１０^１５ｖｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ～約１×１０^１５ｖｇである。さらに、方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される。提供される方法のいずれかにおいて、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。

一部の実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含む、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法を含み、運動機能は、ｒＡＡＶの投与前の当該対象の運動機能と比較して、当該対象において明らかに改善され、運動機能は、１００ｍ歩行時間テストおよび／またはＮＳＡＤにより決定される。一部の態様では、運動機能は、遺伝子導入後、１ヶ月もしくは３０日で少なくとも５％、遺伝子導入後、２ヶ月もしくは６０日で少なくとも１０％、または遺伝子導入後、３ヶ月もしくは９０日で少なくとも１５％改善される。一部の態様では、運動機能は、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約４５％、または約５０％改善される。

対象に、配列番号１または配列番号７または配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を投与することを含む、それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンのレベルを増加させる方法が提供される。さらに、必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンのレベルを増加させるための組成物が提供され、組成物は、配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を含む。それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンのレベルを増加させるための医薬の製造のための、配列番号１または配列番号７または配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物の使用がまた提供される。一部の態様では、アルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧによりコードされるガンマ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に局在化される。一部の態様では、ベータ－サルコグリカンは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧによりコードされるガンマ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に局在化される。

一部の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物は、イントロン配列を含む。一実施形態では、イントロン配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物は、ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物は、５’末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。一実施形態では、５’ＩＴＲ配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物は、３’末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。一実施形態では、３’ＩＴＲ配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

対象に、第一のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を投与すること、および当該第一のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜における少なくとも第二のサルコグリカンの発現の増加を検出することを含む、対象の筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法もまた提供される。一部の態様では、第一のサルコグリカンは、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）であり、当該第二のサルコグリカンは、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である。

提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用および組成物のいずれかにおいて、対象は、年齢４～１５歳であり、両方の対立遺伝子においてガンマ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）変異が確認され、ＡＡＶｒｈ７４抗体が陰性であり、および／または＞４０％もしくは正常な１００メートル歩行試験を有していた。提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用および組成物のいずれかにおいて、対象は、小児対象である。一部の実施形態では、対象は、年齢が１～１０歳の範囲の対象などの、小児対象である。一部の実施形態では、対象は、年齢４～１５歳である。対象は、一実施形態において、年齢が１０～１９歳の範囲の対象などの、青年対象である。さらに、対象は、一実施形態では、ハイティーンまたは２０代前半の範囲の対象などの、若年成人対象であり、例えば、対象は、年齢が１５～２９歳の範囲であってもよい。一部の実施形態では、対象は、中年の成人または年配の対象であり、例えば、中年の成人は、年齢が２５～５５歳の範囲であってもよく、年配の対象は、年齢が５０歳を超える範囲であってもよい。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、注射、注入または移植により投与される。例えば、ｒＡＡＶは、約１～２時間にわたる注入により投与される。さらに、ｒＡＡＶは、抹消肢静脈を介して静脈内経路により投与される。

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含む、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法において、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用し、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１のヒトγ－サルコグリカンヌクレオチド配列を含む。さらに、ｒＡＡＶは、配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである。さらに、ｒＡＡＶは、配列番号１または配列番号７または配列番号１０のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

典型的な実施形態では、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含み、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用し、定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、ｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき、約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量で、約１～２時間にわたり、静脈内注入により投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１または配列番号７または配列番号１０のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、肢帯型筋ジストロフィーの治療用医薬の製造のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの用量の使用を提供し、ｒＡＡＶの用量は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき、約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての直線化プラスミドに基づき、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、もしくは約７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇであり、医薬は、約１～２時間にわたり静脈内注入により用量を送達するために製剤化される。

本開示はさらに、対象に、配列番号１または７に対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む構築物を投与することを含む、対象の筋機能を改善する方法を提供する。さらに、対象の筋機能を改善するための組成物が提供され、組成物は、配列番号１または７または１０に対して、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む構築物を含む。対象の筋機能を改善するための医薬の製造のための、配列番号１または７または１０に対して、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む構築物の使用がまた提供される。

提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、対象は、サルコグリカンまたは筋ジストロフィーをコードする遺伝子における遺伝子変異に罹患している。一部の態様では、サルコグリカンは、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である。一部の態様では、サルコグリカンは、γ－サルコグリカンである。

提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、対象の細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加される。

さらに、提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｒＡＡＶの投与前および後に生検された筋肉において、ウエスタンブロットまたは免疫組織化学でガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、ガンマ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与後、少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３１％、または少なくとも３２％、または少なくとも３３％、または 少なくとも３４％、または少なくとも３５％、または少なくとも３６％、または少なくとも３７％、または少なくとも３８％、または少なくとも３９％、または少なくとも４０％、または少なくとも４１％、または少なくとも４２％、または少なくとも４３％、または少なくとも４４％、または少なくとも４５％、または少なくとも４６％、または少なくとも４７％、または少なくとも４８％、または少なくとも４９％、または少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％、または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６３％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％増加される。例えば、ガンマ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後に生検された筋肉において、ウエスタンブロットでガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される通り、少なくとも３３％増加されるか、またはガンマ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検における免疫組織化学によりガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される通り、少なくとも３８％または少なくとも３９％増加される。

本明細書に提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。例えば、対象における血清レベルのＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０～９０日後または６０日後もしくは９０日後までに、少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％、または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６３％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％減少される。

本明細書に提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加される。例えば、ガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検でウエスタンブロットまたは免疫組織化学によりガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって、検出される。例えば、対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与後に、少なくとも２５％、または少なくとも２６％、または少なくとも２７％、または少なくとも２８％、または少なくとも２９％、または少なくとも３０％、または少なくとも３１％、または少なくとも３２％、または少なくとも３３％、または少なくとも３４％、または少なくとも３５％、または少なくとも３６％、または少なくとも３７％、または少なくとも３８％、または少なくとも３９％、または少なくとも４０％、または少なくとも４１％、または少なくとも４２％、または少なくとも４３％、または少なくとも４４％、または少なくとも４５％、または少なくとも４６％、または少なくとも４７％、または少なくとも４８％、または少なくとも４９％、または少なくとも５０％、または少なくとも５１％、または少なくとも５２％、または少なくとも５３％、または少なくとも５４％、または少なくとも５５％、または少なくとも５６％、または少なくとも５７％、または少なくとも５８％、または少なくとも５９％、または少なくとも６０％、または少なくとも６３％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％増加される。

本明細書に提供される方法、組成物および使用のいずれかにおいて、対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加される。本明細書に提供される方法、組成物および使用のいずれかにおいて、対象におけるベータ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前のベータ－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。アルファ－サルコグリカンまたはベータ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検での免疫組織化学またはウエスタンブロットによりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって、検出される。

別の実施形態は、対象に、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を投与することを含む、細胞においてガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現させる方法を提供する。

細胞においてガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現させるための組成物がまた提供され、組成物は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、細胞においてガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現させるための医薬の製造のための、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

細胞においてガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現させるための、提供される方法、使用または組成物のいずれかにおいて、細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物の投与前および後の筋生検において、ウエスタンブロットまたは免疫組織化学でガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって、検出される。例えば、細胞は、１より多くのＡＡＶウイルスコピー数を有する。さらに、ガンマ－サルコグリカン遺伝子は、少なくとも１個の細胞において、１個の核当たりの１より多くのｒＡＡＶベクターゲノムを検出することによって、対象において測定される。一実施形態では、治療された対象の筋細胞における平均ｒＡＡＶコピー数は、１個の核当たり少なくとも０．０１コピーである。別の実施形態では、治療された対象の筋細胞における平均ｒＡＡＶコピー数は、１個の核当たり少なくとも０．１コピーである。別の実施形態では、治療された対象の筋細胞における平均ｒＡＡＶコピー数は、１個の核当たり少なくとも１コピーである。別の実施形態では、治療された対象の筋細胞における平均ｒＡＡＶコピー数は、１個の核当たり少なくとも１０コピーである。

それを必要とする対象における血清ＣＫレベルを減少するための組成物がまた提供され、組成物は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、それを必要とする対象における血清ＣＫレベルを減少するための医薬の製造のための、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

これらの方法、使用、および組成物のいずれかにおいて、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与の６０日後までに少なくとも８２％減少する。

これらの方法、使用、および組成物のいずれかにおいて、ガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検でウエスタンブロットまたは免疫組織化学によりガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって、検出される。さらに、方法、使用および組成物のいずれかにおいて、ガンマ－サルコグリカン陽性線維の数は、１個の核当たり１より多くのｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することによって、測定される。

別の実施形態は、対象に、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を投与することを含む、それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンの発現を増加させる方法を提供する。

それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンの発現を増加させるための組成物がまた提供され、組成物は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、対象におけるアルファ－サルコグリカンの発現を増加させるための医薬の製造におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

対象に、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を投与することを含む、それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化を増加させる方法がまた、提供される。

それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンの細胞膜への局在化を増加させるための組成物がまた提供され、組成物は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンの細胞膜への局在化を増加させるための医薬の製造のための、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

これらの方法、使用および組成物のいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学検査によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって、検出される。さらに、提供される方法、使用および組成物のいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧによりコードされるガンマ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に局在化される。

別の実施形態は、対象に、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を投与することを含む、それを必要とする対象の筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法を提供する。

それを必要とする対象における筋組織におけるサルコグリカン発現の発現を増加させるための組成物がまた提供され、組成物は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、それを必要とする対象の筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させるための医薬の製造のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１もしくは配列番号７もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。

筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させるためのこれらの方法、使用および組成物のいずれかにおいて、対象は、サルコグリカンまたは筋ジストロフィーをコードする遺伝子における遺伝子変異に罹患している。例えば、これらの方法、使用または組成物のいずれかにおいて、サルコグリカンは、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である。

本明細書に記載されるプラスミドを導入されている細胞を培養すること、および導入された細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することを含む、組換えＡＡＶベクター粒子を製造する方法がまた提供される。本明細書に記載される組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子がまた企図される。一実施形態では、ｒＡＡＶを製造する方法は、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に導入することを含む。別の実施形態では、プラスミドは、配列番号２４に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む細胞を提供する。本明細書に記載される細胞は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ細胞（例えば、Ｓ２細胞もしくはＫｃ細胞）、カイコ細胞（例えば、Ｂｍｅ２１細胞）、または蚊細胞（例えば、Ｃ６／３６細胞）；あるいは哺乳類細胞（好ましくは、ヒト細胞、例えば、ヒト初代細胞または確立された細胞株）を含む。一実施形態では、哺乳類細胞は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＫＢ細胞を含む。

別の実施形態では、プラスミドは、配列番号１、または７または配列番号１０に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、または７または１０のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定的に発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定的に担持する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを作製することができる。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ．ＫＡＮプラスミドである。

本明細書に提供される組換えＡＡＶベクター粒子を製造する方法は、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを宿主細胞に導入する工程をさらに含んでもよい。例えば、方法は、パッケージング細胞が、安定的に組み込まれたＡＡＶキャップ遺伝子を含み、および／またはパッケージング細胞が、安定的に組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む工程を含む。本発明はまた、配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミド、または配列番号８のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む細胞を提供する。配列番号１、または７のヌクレオチド配列を含む細胞がまた、提供される。

それを必要とする哺乳類対象における線維症を低減する方法がまた、提供される。これに関して、方法は、治療上有効量の本明細書に記載されるＡＡＶベクター（または本明細書に記載されるＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳類対象に投与することを含む。一部の実施形態では、哺乳類対象は、筋ジストロフィーに罹患している。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクター（または本明細書に記載されるＡＡＶベクターを含む組成物）の投与は、対象の骨格筋または心筋における線維症を低減する。

本明細書で使用される場合、「筋ジストロフィー」という用語は、強度および筋肉の塊が徐々に低下する障害を指す。筋ジストロフィー疾患の非限定的な例としては、ベッカー型筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、サルコグリカン異常症、部分的ＬＡＭＡ２欠損症による先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、１Ｄ型先天性筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、肢帯型１Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｂ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｄ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｅ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｆ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｇ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｈ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｊ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｋ型筋ジストロフィー、肢帯型ＩＣ型筋ジストロフィー、単純性表皮水疱症を伴う脊椎強直筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、およびウルリッヒ型拘縮過伸展筋ジストロフィーなどの先天性筋ジストロフィーが挙げられてもよい。一部の実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。一部の実施形態では、対象は、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ２Ｃ）に罹患している。

本明細書で使用される場合、「線維症」という用語は、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む、損傷時の組織における細胞外基質（ＥＣＭ）成分の過剰または制御されていない沈着および異常な修復過程を指す。沈着しているＥＣＭ成分は、コラーゲン、例えば、コラーゲン１、コラーゲン２またはコラーゲン３を含む。

別の態様では、治療上有効量の本明細書に記載されるＡＡＶベクター（または本明細書に記載されるＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象における筋力および／または筋量を増加させる方法が、本明細書に記載される。一実施形態では、対象は、ヒトである。

本発明の方法のいずれかにおいて、対象は、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーに罹患していてもよい。

治療上有効量の本明細書に記載されるＡＡＶベクター（または本明細書に記載されるＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳類対象に投与することを含む、哺乳類対象における筋ジストロフィーを治療する方法がまた、提供される。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。

本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、筋内注射または静脈注射により投与される。さらに、本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、注射、注入または移植による非経口投与など、全身投与される。

本発明の組成物は、筋内注射または静脈注射用に製剤化される。さらに、本発明の組成物は、注射、注入または移植による非経口投与などの、全身投与用に製剤化される。

提供される製剤または組成物のいずれかにおいて、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビストリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの一つまたは複数を含む。例えば、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度のｐＨ８．０のトリスを含むか、または緩衝剤は、約２０ｍＭのｐＨ８．０のトリスを含む。

提供される製剤または組成物のいずれかにおいて、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの一つまたは複数を含む。例えば、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２を含むか、またはイオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含むか、またはイオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含むか、またはイオン強度剤は、約１ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および約２００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。

提供される製剤または組成物のいずれかにおいて、界面活性剤は、スルホン酸塩、硫酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩、ポロクサマー、および陽イオン界面活性剤のうちの一つまたは複数を含む。例えば、ポロクサマーは、ポロクサマー１２４、ポロクサマー１８１、ポロクサマー１８４、ポロクサマー１８８、ポロクサマー２３７、ポロクサマー３３１、ポロクサマー３３８、およびポロクサマー４０７のうちの一つまたは複数を含む。ポロクサマーは、約０．００００１％～約１％の濃度であってもよい。典型的な界面活性剤は、約０．００１％の濃度のポロクサマー１８８である。

前述の段落は、本発明の全ての態様を定義することを意図しておらず、追加の態様は、発明の詳細な説明などの、他のセクションに記載されている。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせが、本文書の同じ文章、または段落、またはセクションにおいて一緒に見出されない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることが理解されるべきである。本発明は、上記の特定の段落により定義される変形以外のいずれかの点で範囲がより狭い本発明の全ての実施形態を、追加の態様として含む。例えば、本発明のある特定の態様が属として記載される場合、属のすべてのメンバーは、個別に、本発明の態様であることは、理解されるべきである。

図１は、マウスに低用量、中用量、および高用量のｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢＳＧＣＧを投与した後の、骨格筋の様々な部分におけるベクターゲノムコピーの生体分布を示す。 図２は、骨格筋におけるヒトγ－サルコグリカン発現を示す。図２Ａは、低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを静脈内注射したＳＧＣＧ^－／－マウスの骨格筋、横隔膜、および心臓の免疫蛍光画像を示す。図２Ｂは、低用量、中用量、および高用量でのＳＧＣＧタンパク質発現を有する線維の割合を示す。 図３は、低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＢＳＧＣＧを静脈内注射したＳＧＣＢＳＧＣＧ－／－マウスにおけるＤＡＰＣタンパク質の回復を示す。図３Ａは、ＤＡＰＣタンパク質発現の免疫蛍光画像を示す。図３Ｂは、低用量、中用量、および高用量でのＤＡＰＣタンパク質発現を有する線維の割合を示す。 図４は、筋病理に対するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを用いた全身処置の効果を示す。図４Ａは、ＢＬ／６ ＷＴ、ＳＧＣＧ－／－ならびに低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧで処置したマウス由来の四頭筋および横隔膜筋のＨ＆Ｅ染色を示し；図４Ｂは、線維症の定量のためのトリクローム染色を示す。 図５は、ＢＬ／６ ＷＴ、ＳＧＣＧ－／－、ならびに低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧで処置したマウス由来の骨格筋における定量的筋形態計測を示す。 図６は、低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを用いた処置後のマウスにおける力の出力の保護を示す。 図７は、低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを用いた処置後のマウスの身体活動性を示す。 図８は、低用量、中用量、および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを用いた処置後のマウスのＣＫおよび化学分析を提供する。 図９は、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ．ＫＡＮ ＡＡＶベクタープラスミドの模式的マップを提供する。 図１０Ａは、処置したマウスにおける筋組織にわたるγ－サルコグリカンタンパク質発現を確認するウエスタンブロットアッセイを示す。図１０Ｂは、野生型マウスと比較して、処置したマウスにおけるＳＧＣＧタンパク質の相対的発現を示す。

本開示は、γ－サルコグリカンを発現するポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの投与が、肢帯型筋ジストロフィー動物モデルにおいて、筋線維症の低減もしくは完全な逆転、またはサルコグリカン複合体タンパク質の回復をもたらすという発見に基づく。実施例に示される通り、本明細書に記載されるＡＡＶベクターの投与は、より少ない変性線維、歩行運動の増加、ＣＫレベルの低減、炎症の低減および増加した力の生成による伸張性収縮に対する保護による機能的回復の改善を含むジストロフィー特徴の逆転をもたらした。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの標準的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が共感染しているヘルパーウイルスによってもたらされている、細胞においてのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられたＡＡＶの血清型は１３種類存在する。ＡＡＶの一般的な情報およびレビューは、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９８９年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第１巻、１６９～２２８頁、およびＢｅｒｎｓ、１９９０年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７４３～１７６４頁、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見ることができる。しかしながら、様々な血清型が、構造的にも機能的にも、遺伝子レベルでさえ、非常に密接に関連していることは周知であるので、これらの同じ原理が、追加のＡＡＶ血清型にも適用可能であることが完全に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ、１９８８年、１６５～１７４、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編；およびＲｏｓｅ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１～６１（１９７４年）を参照）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により仲介される非常に類似した複製特性を明らかに示し、全てが、ＡＡＶ２において発現されるもののような三つの関連するキャプシドタンパク質を生じる。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーションを明らかにする、ヘテロ二本鎖解析、および「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によりさらに示唆される。同様の感染性パターンは、各血清型における複製機能が、同様の調節制御下にあることを示唆する。

「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接する対象の一つ以上のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードし、発現するベクターでトランスフェクションされた宿主細胞に存在するとき、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶキャプシドタンパク質および封入ポリヌクレオチドＡＡＶベクターから構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるべき導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ＡＡＶベクター粒子の産生は、ＡＡＶベクターの産生を必然的に含み、したがって、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有される。
ＡＡＶ

本発明の組み換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する一つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスがＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．１０およびＡＡＶ ｒｈ．７４を含むがこれに限定されないから生じる可能性があるＡＡＶ血清型であってもよい。シュードタイプｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されている。カプシド変異を有する、他の種類のｒＡＡＶバリアント、例えば、ｒＡＡＶも、考慮される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述の背景技術の項で述べたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９が使用されてもよい。

本発明のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移され、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に集合させる。パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野で標準である。ｒＡＡＶの産生は、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、非存在下の）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能という、単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に以下の構成要素が存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組み換えウイルスがｒＡＡＶゲノムＩＴＲよりも異なるＡＡＶ血清型からもたらされ得、由来し得る、非限定的にＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶ ｒｈ．７４を含む、任意のＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定的に発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７～２０８１）、制限酵素エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３年、Ｇｅｎｅ、２３：６５～７３）、または直接的なブラントエンドライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ、１９８４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１～４６６６）のような手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株は、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスに感染する。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適していることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくむしろアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５３３～５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７～１２９で概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；国際公開第９５／１３３６５号および対応する米国特許第５，６５８．７７６号；国際公開第９５／１３３９２号；国際公開第９６／１７９４７号；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；国際公開第９７／０９４４１号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；国際公開第９７／０８２９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；国際公開第９７／２１８２５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；国際公開第９７／０６２４３号（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；国際公開第９９／１１７６４号；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号。前述の文書は、参照によりその全体が本明細書に援用され、特にｒＡＡＶの生産に関する文書のこれらの項に重点が置かれる。

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同族体２９３株）のような安定的に形質転換された癌細胞であってもよい。別の実施形態では、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ベロ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル肺細胞）のような形質転換された癌細胞ではない細胞である。

本発明の組み換えＡＡＶ（すなわち、感染性キャプシド形成ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態には、配列番号１または配列番号７に記載されるポリヌクレオチド配列を含む、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧという名称のｒＡＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配のような当該技術分野における標準的な方法により精製されてもよい。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号および国際公開第９８／０９６５７号に記載される方法が挙げられる。

別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本明細書に記載される組成物は、医薬的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。組成物は、希釈剤及びアジュバント等の他の成分も含み得る。許容可能な担体、希釈剤及びアジュバントは、レシピエントにとって無毒性であり、使用される用量及び濃度では不活性であることが好ましく、リン酸塩、クエン酸塩、又はその他の有機酸；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；アミノ酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、プルロニックス又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

本発明の方法で投与されるべきｒＡＡＶのタイターは、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与形式、治療目標、個体、および標的とされる細胞タイプ（複数可）に応じて変化し得、当該技術分野の標準的な方法により決定され得る。ｒＡＡＶのタイターは、１ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲にあり得る。投薬量はまた、ウイルスゲノムの単位（ｖｇ）で表されてもよい。ｒＡＡＶのタイターは、スーパーコイルプラスミド定量標準または直線化プラスミド定量標準により決定されてもよい。

一実施形態では、本開示は、配列番号１３の第一のプライマーおよび配列番号１４の第二のプライマーを用いたＰＣＲで、ＡＡＶベクターをタイター決定することを含む、ＡＡＶベクターのタイターを測定する方法を提供する。別の実施形態では、ＡＡＶベクターのタイターを測定する方法は、配列番号１５の配列を含むプローブを使用することで、ＡＡＶベクターをタイター決定することを含む。プローブは、一実施形態では、５’－ＦＡＭ－ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ－Ｚｅｎ－ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ－３ＩＡＢＫＦＱを含む。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧである。

ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでｒＡＡＶで、標的細胞を形質導入する方法は、本発明により考慮される。ｉｎ ｖｉｖｏの方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量、または有効反復投与量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与する工程を含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与されるなら、投与は、予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与されるなら、投与は、治療である。 本発明の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患に関連する少なくとも一つの症状を緩和（除去または低減）する用量であり、障害／疾患状態への進行を遅延または予防し、障害／病状の進行を遅延または予防し、疾患の程度を減少し、疾患の寛解（部分的または全体）をもたらし、および／または生存期間を延長する用量である。本発明の方法を用いた予防または治療のため企図される疾患の例としては、肢帯型筋ジストロフィーなどの、筋ジストロフィーである。したがって、配列番号１または７のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを用いて標的細胞を形質導入する方法が提供される。本開示はまた、配列番号１１のプライマーを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号１２のプライマーを提供する。一実施形態では、本開示は、細胞または対象におけるＳＧＣＧ発現を測定する方法を提供し、方法は、配列番号１１および配列番号１２のプライマーを用いたＰＣＲ分析を含む。一実施形態では、対象は、ＬＧＭＤに罹患している。一実施形態では、方法は、細胞または患者におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターの発現を測定することを含む。

併用療法も、本発明により考慮される。本明細書に使用される組み合わせは、同時治療または連続治療の両方を含む。新規な療法との組合せでと同様に、本発明の方法の、標準的な医薬治療（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン；およびデフラザコートのうちの一つまたは複数を含むが、これらに限定されない、ステロイド、コルチコステロイド、および／またはグルココルチコイド）との組合せが、具体的に企図される。これに関して、組合せは、本発明の方法のｒＡＡＶの対象への投与前、ｒＡＡＶの対象への投与と同時、またはｒＡＡＶの対象への投与後に、プレドニゾン、プレドニゾロン；およびデフラザコートのうちの一つまたは複数を含むが、これらに限定されない、一つまたは複数のステロイド、コルチコステロイド、および／またはグルココルチコイドを対象に投与することを含む。

本発明により企図される併用療法の関連する実施形態では、グルココルチコイドとしては、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、またはトリアムシノロンが挙げられるが、これらに限定されない。

抗原特異的Ｔ細胞応答が、ｒＡＡＶベクターを投与された対象に存在し得ることは、認識される。これは、遺伝子導入の２～４週間後に予想される応答である。このような抗原特異的Ｔ細胞応答に対する一つの可能性のある結果は、形質導入された細胞のクリアランスおよび導入遺伝子発現の喪失である。療法の前、例えば、療法手法の２４時間前に、ｒＡＡＶベース療法に対する宿主免疫応答を弱めるために、対象は、経口により約１ｍｇ／ｋｇ／日の予防的プレドニゾンまたは同等のグルココルチコイドで開始し、最大用量６０ｍｇ／日を有することができる。１ｍｇ／ｋｇ／日のおよその用量での同等のグルココルチコイドのＩＶ投与も、必要に応じて許容される。治療は、約１ヶ月間継続する。プレドニゾンまたは同等のグルココルチコイドのテーパリングプロトコールは、遺伝子導入に対する個々の対象の免疫応答に基づき実行することができ、これは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよびＧＧＴを用いた肝機能のモニタリングにより評価される。

治療上有効量のｒＡＡＶベクターは、約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、９ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、２ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、３ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、４ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、９ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１６ｖｇ／ｋｇの範囲の用量のｒＡＡＶである。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含む。一実施形態では、投与量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づく。一実施形態では、投与量は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づく。

例えば、治療上有効量のｒＡＡＶベクターは、用量１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約７．４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、約１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約２ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約３ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約４ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約６ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約７ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約８ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、約９ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１６ｖｇ／ｋｇである。ＡＡＶベクターのタイターまたは投与量は、定量標準としてのプラスミドＤＮＡの物理的形態に基づき変動し得る。例えば、タイターまたは投与量の値は、スーパーコイルの標準的ｑＰＣＲ力価測定方法または線形の標準的ｑＰＣＲ力価測定方法に基づいて変動し得る。一実施形態では、治療上有効量のｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき用量５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての直線化プラスミドに基づき用量１．８５ｅ１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、治療上有効量のｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき用量２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としての直線化プラスミドに基づき用量７．４１ｅ１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、治療上有効量のｒＡＡＶは、定量標準としての直線化プラスミドに基づき用量約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、または定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、治療上有効量のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約６ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約７ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約８ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約９ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約３ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４～約４ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、または約１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ～約５ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、９ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、１ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、２ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、３ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、４ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、５ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、６ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、７ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、８ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、９ｅ１５ｖｇ／ｋｇ、または１ｅ１６ｖｇ／ｋｇの範囲の用量である。本発明はまた、これらの用量のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含む。

組成物の有効用量の投与は、限定されないが、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含む、当技術分野の標準的な経路によることができる。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、治療される感染および／または疾患状態、ならびにγ－サルコグリカンを発現することになる標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者により選択および／または適合され得る。

本発明は、ｒＡＡＶおよび本発明の組成物の有効用量の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、全身に影響を及ぼす循環系への投与である。全身投与には、胃腸管を介した吸収などの経腸投与、および注射、注入、または移植を介した非経口投与などが含まれる。

特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組み換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用して達成され得る。本発明による投与としては、筋肉、血流および／または直接的に肝臓への注射が挙げられるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩液に再懸濁するだけで、筋組織発現に有用なビークルを提供するのに充分なことが示されており、（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いた通常の方法では回避されるべきであるが）担体またはｒＡＡＶと共投与することができる他の成分に対する既知の制限はない。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉のような対象の特定の標的組織を標的とするように改変されてもよい。例えば、国際公開第０２／０５３７０３号を参照されたく、その開示は、参照により本明細書に援用される。

医薬組成物は、経皮輸送により筋肉にデリバリーされるべき、注射可能な製剤としてまたは局所製剤として調製され得る。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするための任意の医薬的に許容される担体とともに使用することができる。したがって、別の態様では、本出願は、ＡＡＶｒｈ７４由来カプシド、緩衝剤、イオン強度剤、および界面活性剤を含むｒＡＡＶを含む製剤に関する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、１．０×１０^１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０×１０^１６ｖｇ／ｍｌまたは約１．０×１０^１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約５．０×１０^１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としての直線化プラスミドに基づき約５．０×１０^１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約２．０×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度である。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターである。一実施形態では、組成物または製剤におけるｒＡＡＶの濃度は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき１×１０^１３ｖｇ／ｍｌ～２×１０^１４ｖｇ／ｍｌである。別の実施形態では、濃度は、定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき２×１０^１３ｖｇ／ｍｌ、４×１０^１３ｖｇ／ｍｌ、または５×１０^１３ｖｇ／ｍｌである。一実施形態では、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビストリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの一つまたは複数を含む。別の実施形態では、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度のｐＨ８．０を有するトリスを含む。一実施形態では、緩衝剤は、約２０ｍＭのｐＨ８．０を有するトリスを含む。一実施形態では、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの一つまたは複数を含む。一実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２を含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約１ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および約２００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。一実施形態では、界面活性剤は、スルホン酸塩、硫酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩、ポロクサマー、および陽イオン界面活性剤のうちの一つまたは複数を含む。一実施形態では、ポロクサマーは、ポロクサマー１２４、ポロクサマー１８１、ポロクサマー１８４、ポロクサマー１８８、ポロクサマー２３７、ポロクサマー３３１、ポロクサマー３３８、およびポロクサマー４０７のうちの一つまたは複数を含む。一実施形態では、界面活性剤は、約０．００００１％～約１％の濃度のポロクサマーを含む。別の実施形態では、界面活性剤は、約０．００１％の濃度のポロクサマー１８８を含む。筋肉内注射の目的で、ゴマ油もしくはピーナッツ油のようなアジュバント中の溶液、またはプロピレングリコール水溶液、ならびに無菌の水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、所望であれば緩衝することができ、液体希釈剤は、まず生理食塩水またはグルコースで等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または医薬的に許容される塩としてのｒＡＡＶ溶液は、ヒドロックスプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。ｒＡＡＶの分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびに油中に調製され得る。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含有する。この関連において、利用される無菌の水性媒体は、全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。

注射可能な使用に適した医薬品形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。いずれの場合でも、形態は、無菌でなければならず、容易に注射できる程度まで流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。

無菌の注射可能な溶液は、上で列挙された様々な他の成分と共に適当な溶媒中に必要な量のｒＡＡＶを取り込み、必要に応じて、その後フィルター滅菌することにより調製される。概して、分散液は、滅菌された有効成分を、基本分散媒体および上で列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する無菌の媒体に取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その既にフィルター滅菌された溶液から有効成分の粉末と任意の追加の所望の任意の成分とを生じる真空乾燥および凍結乾燥技術を含む。

ｒＡＡＶを用いた形質導入も、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施され得る。一つの実施形態では、所望の標的筋細胞は、対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種の筋細胞が、これらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じさせない場合に使用することができる。

形質導入された細胞の対象への形質導入および再導入の適当な方法は、当技術分野で公知である。一実施形態において、細胞は、例えば適切な培地中で、ｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、及びサザンブロット及び／又はＰＣＲ等の従来の技術を用いて、又は選択マーカーを用いて、対象のＤＮＡを有するそれらの細胞をスクリーニングすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入され得る。次いで、形質導入された細胞は、医薬組成物に製剤化され、組成物は、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射、または例えば、カテーテルを使用して、平滑筋および心筋への注射のような様々な技術により対象に導入することができる。

本発明のｒＡＡＶを用いた細胞の形質導入は、γ－サルコグリカンの持続的な発現をもたらす。したがって、本発明は、γ－サルコグリカンを発現するｒＡＡＶを対象、好ましくは、ヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の一つ以上のｒＡＡＶを用いて組織（筋肉のような組織、肝臓および脳のような器官、ならびに唾液腺のような腺を含むが、これらに限定されない）を形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的調節エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行われてもよい。例えば、本発明の一つの実施形態は、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーのようなアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６１～７６６（１９９１年）を参照）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（ＣｓｅｒｊｅｓｉおよびＯｌｓｏｎ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４～４８６２（１９９１年））、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する調節エレメント（Ｍｕｓｃａｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、７：４０８９～４０９９（１９８７年））、心アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：３３９３～３３９９（１９８９年））およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、骨格の速収縮性トロポニンＣ遺伝子、遅収縮性心筋トロポニンＣ遺伝子および遅収縮性トロポニンＩ遺伝子に由来する調節エレメント：低酸素誘発性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：５６８０～５６８４（１９９１年））、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むステロイド誘発性エレメントおよびプロモーター（ＭａｄｅｒおよびＷｈｉｔｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３～５６０７（１９９３年）を参照）、ならびに他の調節エレメントを含むが、これらに限定されない、筋特異的調節エレメントにより筋細胞および筋組織を形質導入する方法を提供する。

筋組織は、重要な器官ではなく、アクセスしやすいため、ｉｎ ｖｉｖｏＤＮＡデリバリーの魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのｍｉＲＮＡの持続的な発現を考慮する。

「筋細胞」または「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、骨格筋および平滑筋、例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織）に由来する細胞または細胞の群を意味する。かかる筋細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞および心筋芽細胞のような、分化または未分化であり得る。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるγ－サルコグリカンの発現をもたらす、記載される複製欠損ｒＡＡＶを介した、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉ ｔｒｏのいずれかでのレシピエント細胞への対象ポリヌクレオチド（例えば、γ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列）の投与／送達を指すために使用される。

したがって、有効な用量（または本質的に同時に投与されるよう用量もしくは間隔で与えられる用量）の、γ－サルコグリカンをコードするｒＡＡＶをそれを必要とする哺乳類対象に投与する方法がまた、本明細書に記載される。

本明細書中で言及される全ての刊行物および特許が、各々の個々の刊行物または特許が、具体的かつ個々に参照により組み込まれるように示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合では、任意の定義を含む本出願が、支配する。

本発明は、以下の実施例でさらに記載され、それは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。

別の実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に導入することを含む、ｒＡＡＶ ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを生成する方法を提供する。ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野で公知であり、当該方法には、トランスフェクション、感染、形質転換、エレクトロポレーション、および形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定的に発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定的に担持する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを作製することができる。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ．ＫＡＮプラスミドである。ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ．ＫＡＮプラスミドは、図９に説明される。

一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１または７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、または７のヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶを生成する方法は、一実施形態では、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを宿主細胞に導入することをさらに含む。パッケージングプラスミドは、一部の実施形態では、プロモーターに作動可能に連結されているＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはキャップ遺伝子を含む。プロモーターは、一実施形態では、ＡＡＶ転写プロモーターである。一実施形態では、宿主細胞は、パッケージング細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞は、安定的に組み込まれたＡＡＶキャップ遺伝子を含む。別の実施形態では、パッケージング細胞は、安定的に組み込まれたｒｅｐ遺伝子を含む。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、外来ＤＮＡ配列を発現するために使用することができる細胞を指す。宿主細胞の非限定的な例は、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および／または哺乳類細胞を含む。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、パッケージングプラスミド、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、または他のＤＮＡのレシピエントとして使用することができる。本明細書で使用される用語は、元の宿主細胞において外来ＤＮＡ配列を発現させた後の元の細胞の子孫を包含する。ＡＡＶ産生のための宿主細胞の非限定的な例としては、Ｓｆ９昆虫細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞が挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載される細胞は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ細胞（例えば、Ｓ２細胞もしくはＫｃ細胞）、カイコ細胞（例えば、Ｂｍｅ２１細胞）、または蚊細胞（例えば、Ｃ６／３６細胞）；あるいは哺乳類細胞（好ましくは、ヒト細胞、例えば、ヒト初代細胞または確立された細胞株）を含む。一実施形態では、哺乳類細胞は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＫＢ細胞を含む。ＡＡＶベクタープラスミドは、感染（ウイルスもしくはバキュロウイルス）、試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）もしくは物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）、または当該技術分野で公知の他の手段を使用した一過性トランスフェクションにより、宿主細胞、例えば、Ｓｆ９または２９３Ｔに導入することができる。別の実施形態では、宿主細胞株は、それらのゲノムにｒＡＡＶプラスミドが安定的に組み込まれる。かかる安定な細胞株は、選択マーカーをベクタープラスミドに組み込むことによって確立することができる。

一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶウイルス粒子の産生のためのパッケージング細胞である。したがって、別の態様では、本開示は、配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１、７または１０のヌクレオチド配列を含む。

ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを使用した前臨床試験は、国際特許公開第ＷＯ２０１９／１５２４７４号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例１
材料および方法

動物モデル：ＢＬ６の遺伝的バックグラウンドを有するＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスおよびＳＧＣＧ－／－マウスを、Ｓａｒｅｐｔａ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ＥｘｃｅｌｌｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅの標準化された条件下で、ホモ接合性動物として交配し、維持した。マウスを、１２：１２時間の暗：明サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（３．８％線維、１８．８％タンパク質、５％脂肪固形飼料）で維持した。全ての動物を、自由に餌および水に行ける標準的なマウスＰＨに収容した。全ての実験について、両方の性別のマウスを使用した：ＷＴ（ｎ＝６、５匹のオス［Ｍ］／１匹のメス［Ｆ］）；無処置のＳＧＣＧ－／－（ｎ＝６、４Ｍ／２Ｆ）；低用量（ｎ＝６、６Ｍ／０Ｆ）；中用量（ｎ＝６、４Ｍ／２Ｆ）；高用量（ｎ＝６、０Ｍ／６Ｆ）。

遺伝子型解析

ＤＮＡ遺伝子型解決を使用して、ＳＧＣＧ－／－マウスを特定した。尾部クリッピングからのＤＮＡを単離し、ＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用してＰＣＲにより分析した。一連のプライマーをＰＣＲ分析で使用して、ＳＧＣＧ－／－状態を決定した。以下のプライマーおよび条件を使用した：ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＣＣ ＴＡＴ Ｔ（配列番号１１）；ＣＡＡ ＡＴＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＣＡ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＣ； ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＣＴ ＣＴＴ Ｔ（配列番号１２）。反応を、ゲノムＤＮＡにおいて３０サイクル、以下の条件下：９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；６８℃、２５秒；続いて、６８℃で５分間、行った。

ｈＳＧＣＧ遺伝子構築物（ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ）およびベクター産生

全長ヒトＳＧＣＧ ｃＤＮＡ（ＮＣ＿００００１３．１１）をコドン最適化し、本試験のすべての実験に使用した。カセットは、コンセンサスコザック配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、および合成ポリアデニル化部位（５３ｂｐ）を含む。筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターを使用して、発現をもたらす。このプロモーターは、心臓および横隔膜の導入遺伝子発現を増強するために十分に確立されている。ＳＧＣＧ発現カセットを、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）の間でクローニングし、カセットを、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ ＴｈｅｒａｐｙのＶｅｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおける三重トランスフェクション法を使用して、ＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージングした。ＡＡＶｒｈ７４ウイルスは、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトにおいて、血管関門を横切って筋肉を形質導入する安全かつ高効率であることが示されている。ＡＡＶ遺伝子導入および続く導入遺伝子発現の速度制限工程のうちの一つは、ｃＤＮＡ鎖の合成を介して一本鎖ベクターゲノムを二本鎖ゲノムに変換することである。ＳＧＣＧ導入遺伝子のサイズが小さいため、本発明者らは、相補的塩基対形成および変異ヘアピンＩＴＲを介して二本鎖導入遺伝子をパッケージングする自己相補的ベクターカセットを使用することによって、この臨界速度制限工程をバイパスすることができる。

Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを使用して、ＭＨＣＫ７プロモーター領域に位置するプライマープローブセットを使用してベクターをタイター測定した。この方法を使用した標準的なＡＡＶ産生および精製由来の変動は存在しなかった。Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５，２００７）により既に報告された、改変クロスパッケージング法を使用して、ｒＡＡＶベクターを生成した。ここで、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａＰＯ_４沈殿を用いた三重トランスフェクション法により、ＡＡＶ２ ＩＴＲを異なるＡＡＶカプシド血清型にパッケージングすることが可能となる（２８、２９）。産生プラスミドは、（ｉ）ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ、（ｉｉ）キャップ血清型８様単離物ｒｈ．７４をコードするｒｅｐ２－ｃａｐｒｈ．７４改変ＡＡＶヘルパープラスミド；ならびに（ｉｉｉ）アデノウイルス Ｅ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６およびＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発現するアデノウイルス５型ヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）である。ベクターを精製し、ｖｇ力価をキャプシド化（Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ；ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡを利用）を決定した。プライマーおよび蛍光プローブを、ＭＨＣＫ７プロモーターを標的にし、以下の：ＭＨＣＫ７フォワードプライマー、５’－ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＡＡ－３’（配列番号１３）；ＭＨＣＫ７リバースプライマー、５’－ＧＴＣ ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＴＴ Ｃ－３’（配列番号１４）；およびＭＨＣＫ７プローブ、５’－ＦＡＭ－ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ－Ｚｅｎ－ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ－３ＩＡＢＫＦＱ－３’であった。

処置コホート

用量漸増試験において三つの異なる用量のベクターまたは生理食塩水の尾静脈への注射を介して、全身送達を投与した。線形ｑＰＣＲに基づき、ベクター用量を計算した。４週齢のＳＧＣＧ－／－マウスに、それぞれ、低用量、中用量、および高用量に対応する、総用量８．９４×１０^１０ｖｇ（４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ；ｎ＝６、６Ｍ／０Ｆ）、総用量３．６３×１０^１１ｖｇ（１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ；ｎ＝６、４Ｍ／２Ｆ）、または総用量１．２６×１０^１２ｖｇ（７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ；ｎ＝６、０Ｍ／６Ｆ）のＳＣＡＡＶＲＨ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＧを注入した。さらに、ＷＴマウス（ｎ＝６、５Ｍ／１Ｆ）およびＳＧＣＧ－／－対照マウス（ｎ＝６、４Ｍ／２Ｆ）に生理食塩水を注射した。４～５週齢でマウスに注射し、遺伝子送達の１２週間後に安楽死させた。

低用量、中用量、および高用量は、定量標準としての直線化プラスミドに基づく。ＡＡＶベクターを、３０ゲージの超微細インスリンシリンジを使用して生理食塩水中で希釈した。マウスを、注射を容易にするために血管を拡張するために、尾部スロットを介して尾部を後側に置く保持チューブに拘束して、尾部を温めた。動脈を尾部の中心線から位置決定した後、尾動脈に沿って走る紫色／青色の外側静脈の一つにおいて、注射を行った。処置したマウスの全てに、４～５週齢で注射し、注射の１２週後に観察のため安楽死させた。評価項目は、バイオマーカー発現（例えば、免疫蛍光）、形質導入（例えば、ｑＰＣＲベクターゲノム）、組織学（例えば、中心核、直径、線維症）、機能（例えば、活動ケージ、生理学）、および安全性（例えば、臨床化学）を含むが、これらに限定されない。

組織処理

骨格筋を、それぞれのマウスから抽出し、生理食塩水で湿らせたガーゼに置き、次いでクリオゲルを取り付けた木製チャックに置き、冷却したメチルブタン中で新鮮凍結した。器官を二分し、半分を１０％中性緩衝ホルマリンに入れ、続いて切片化のためパラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。器官の残りの半分を、その後の分子研究のため新鮮凍結した。

生体内分布ｑＰＣＲ分析

筋肉および器官における被験物質特異的ＤＮＡ配列の存在を、ＭＨＣＫ７プロモーターのすぐ下流のイントロン領域の配列を増幅するよう設計したベクター特異的プライマープローブセットを用いたリアルタイムｑＰＣＲアッセイを使用して評価した（Ｎ＝９；低、中、および高用量群当たりｎ＝３）。凍結した組織を、クリオスタット（厚さ２０ミクロンの１５個の切片）を使用して、予め冷却した微量遠心分離管に切片化した。ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用して単離した。得られたＤＮＡ試料を、分析まで－８０℃で保存した。試験ＤＮＡを、それぞれの試料を、無菌の超純水中で、最高可能濃度５ｎｇ／μＬまたは１０ｎｇ／μＬに希釈することによって調製した。ストックプラスミドを使用して、１×１０^６コピー／μＬの濃度で開始し、１０コピー／μＬまで連続希釈した、標準試料を調製した。すべての試料および標準試料を、三重に分析した。９５℃、２０秒間の開始変性工程、続いて９５℃、１秒間および６０℃、３０秒間を４０サイクルによって、行った。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏシステムおよびソフトウェアを使用してｑＰＣＲを実行した。本試験では、以下のプライマーおよびプローブを使用した：ＭＨＣＫ７イントロンフォワードプライマー５’－ ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＴ ＡＡＡ－３’（配列番号１３）、ＭＨＣＫ７イントロンリバースプライマー５’－ ＧＴＣ ＣＣＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＴＴ Ｃ －３’（配列番号１４）、およびＭＨＣＫ７イントロンプローブ５’－ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ －３’（配列番号１５）［５’６－ＦＡＭ、３’ Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ ＺＥＮ（登録商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。プライマーおよびプローブを、それぞれ、１回の反応当たり１００ｎＭ、１００ｎＭおよび２００ｎＭの最終濃度に希釈した。標準曲線を使用して、それぞれの反応におけるコピー数を計算した。１個の核当たりのベクターゲノムコピー数を決定するために、以下の方程式を使用した：

１個の核当たりのコピー＝１０＾（（ＣＴ－標準曲線Ｙ切片）／標準曲線の傾き）^＊（１０００／１個のウェル当たりの充填量（ｎｇ））^＊（５．９８×１０６）

免疫蛍光

筋組織にわたる導入遺伝子発現およびＤＡＰＣ修復を、免疫蛍光を使用して評価した。前脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、大腰筋、殿筋、三頭筋、横隔膜、および心筋由来の凍結切片（厚さ１２μｍ）を、本発明者らが既に使用したプロトコールを介して導入遺伝子についての免疫蛍光染色の対象にした。γ－サルコグリカンタンパク質検出のため、切片を、１：１００希釈のγ－サルコグリカンウサギポリクローナル一次抗体（Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号ＮＢＰ１－５９７４４）と共にインキュベートした。α－、β－、およびδ－サルコグリカンタンパク質検出のため、切片を、１：１００希釈のα－サルコグリカンウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８９２５４）、β－サルコグリカンマウスプロピルホスホン抗体（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号Ｂ－ＳＡＲＣ－Ｌ－ＣＥ）、およびδ－サルコグリカン一次抗体と共にインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）Ａｘｉ℃ａｍ ＭＲＣ５カメラを使用して、筋切片の四つの異なる四分円をカバーする四つの無作為な２０×画像を撮影した。対照と比較したα－、β－、δ－、およびγ－サルコグリカンタンパク質染色について陽性の線維の割合を、それぞれの画像について決定し、それぞれの筋について平均した。カウントした線維を、線維の断面の構造外観によって定義した。スコアリングを容易にするために、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒプラグインを備えたＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、総線維をカウントした。陽性線維の発現を、既に記載した通り、ビヒクル処理したＳＧＣＧ－／－生理食塩水対照よりも明るく染まっている、少なくとも５０％の線維を有すつものと定義した。陽性線維を、オリジナルの画像露出に基づいてスコア化した；陽性画像スコア化プロセス中に画像の輝度もコントラストも調整しなかった。残りの線維を、陰性とスコア化した。被験物質を、注射時にわからないようにした。注射を行ったオペレーターは、注射以外の分析を行わなかった。無処置群において発現または残りのタンパク質が存在しないため、どの動物が処置を受け、どの動物が顕微鏡下での観察を受けていないかったか明らかであり、免疫蛍光定量には無関係である。強度のばらつきを軽減するために、同じ露出で画像を撮影した。一つの処置群当たり６匹のマウスで、α－、δ－、およびγ－サルコグリカンタンパク質を発現している免疫蛍光陽性線維の定量データを、平均±ＳＥＭとして報告する。

ウエスタンブロット分析

組織切片（厚さ２０μｍ、１５切片）を微量遠心管に集め、１個のタンパク質分解酵素阻害剤カクテル錠剤の存在下でホモジナイズ緩衝液（１２５ｍＭ トリス－ＨＣｌ、４％ ＳＤＳ、４Ｍ尿素）１５０μＬを用いてホモジナイズした。ホモジナイズ後、試料を、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を集めた。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して決定した。タンパク質試料（２０μｇ）を、３～８％ポリアクリルアミドトリス－酢酸ゲル上、１５０Ｖで７０分間電気泳動し、次いで３５Ｖで９０分間ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、ＴＢＳＴ中の５％無脂肪乾燥乳において１時間ブロッキングし、次いで１：２０００希釈のモノクローナルウサギγ－サルコグリカン抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２０３１１３）、および１：５００００希釈のマウスα－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ７８１１）または１：５０００希釈のモノクローナルウサギビンクリン抗体（Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号７０００６２）のいずれかでインキュベートした。抗マウス（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＡＰ３０８Ｐ）および抗ウサギ二次ＨＲＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６５－６１２０）を、ＥＣＬ免疫検出のため使用した。Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｑ９ Ａｄｖａｎｃｅｄ化学発光画像化システムおよびソフトウェアを使用して、ウエスタンブロット検出および定量を行った。自動取得モードを使用して、試料の強度に応じて変動する露光時間を設定した。タンパク質バンドの体積を、ソフトウェアの分析モードを使用して、定義した範囲に含まれる全てのピクセル強度の総和として定量化し、対応する充填対照バンドに対して正規化した。相対的タンパク質発現を、ＷＴ体積比で割ることによって決定した。

形態計測分析

Ｈ＆Ｅ染色を行い、１６週齢のＷＴマウス（ｎ＝６）、ＳＧＣＧ－／－マウス（ｎ＝６）、およびＳＣＡＡＶＲＨ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＧで処置したＳＧＣＧ－／－マウス（１用量当たりｎ＝６、処置の１２週後）の筋（１２μｍ厚）の凍結切片上の線維サイズおよび中心核形成を含む、筋形態を可視化した。中心核形成を有する筋線維の割合を、前脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、殿筋、三頭筋、大腰筋筋で決定した。さらに、前脛骨筋、三頭筋、および腓腹筋のフェレット直径を使用して、筋線維の直径を測定した。それぞれの処置群および対照コホート由来の筋肉当たりで定量し、１６００～２０００線維と広範囲であった。１匹の動物当たり筋肉当たり四つの無作為な２０×画像を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉ℃ａｍ ＭＲＣ５カメラで撮影した。中心核線維を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量し、線維の直径を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェアを使用して測定した。

病理組織学的検査

剖検で、液体窒素冷却メチルブタン中で筋を新鮮凍結し、組織をＨ＆Ｅで染色した。他のすべての器官を回収し、ホルマリンにおいて固定し、パラフィンに包埋した。スライドおよびすべての組織を、獣医病理学者による正式なレビューのため、ＧＥＭＰａｔｈ，Ｉｎｃ．に送った。

線維症の定量のためのＭａｓｓｏｎのトリクローム染色

凍結筋組織切片（１２μｍ）を、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ荷電顕微鏡スライドにのせた。スライドを染色し、Ｂｏｕｉｎの固定液中で６０分間固定し、次いで水道水で洗浄し、続いて透明になるまで蒸留水で洗浄した。次いでスライドを、Ｗｅｉｇｅｒｔ Ｉｒｏｎヘマトキシリン溶液中で５分間インキュベートし、流水で５分間洗浄した。スライドを蒸留水中ですすぎ、その後、Ｂｉｅｂｒｉｃｈ Ｓｃａｒｌｅｔ ａｃｉｄ中に２分間入れ、再び蒸留水で洗浄した。スライドを、リンタングステン酸リンモリブデン酸に１０分間移し、アニリンブルーに２分間入れ、蒸留水で十分に洗浄した。酢酸（１％水溶液）中で７分間インキュベーションした後、スライドを勾配エタノール中で脱水し、キシレン中で透明化し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ；カタログ番号８３１０）のＣｙｔｏｓｅａｌ ６０培地を使用してカバーガラスを取り付けた。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｎｉ－Ｕ顕微鏡に取り付けたＪｅｎｏｐｔｉｋ Ｐｒｏｋｙｏｎカメラを用いて、Ｇｒｙｐｈａｘソフトウェア２．０．０．６８ｖを使用して、画像を取得した。筋切片の四つの異なる四分円をカバーする四つの無作為な２０×画像を、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム染色およびパーセントコラーゲン定量の分析のため撮影した。赤色（筋肉）と青色（コラーゲン面積）のコントラストについての閾値を、ＢＩＯＱＵＡＮＴ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（２０１９）を使用して個別に設定した。測定関数を使用して、コラーゲンおよび筋肉の面積を計算した。総組織面積を、筋肉の面積とコラーゲンの面積を足すことによって決定した。コラーゲンの割合を、コラーゲンの面積を総組織面積で割ることによって計算した。それぞれの個体の平均割合を計算した。

機能評価のための前脛骨筋の収縮

前脛骨筋評価法は、Ｈａｋｉｍ等に挙げられたプロトコールに従った。マウスを、腹腔内投与したケタミン／キシラジン混合物（それぞれ、１３７．５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔した。後肢の皮膚を取り除き、前脛骨筋および膝蓋骨を露出させた。筋肉の長さを、解剖後、マウスの配置前に測定し、長さをソフトウェアに入力する。生理食塩水に浸したキムワイプ覆布で露出した筋肉を常に水分補給することによって、露出した筋肉の乾燥を制限するためのケアを行った。次いで、前脛骨筋遠位腱を解剖し（１匹の動物当たり左側および右側、分析のため使用した両肢の平均〔１コホート当たりｎ＝１２］）、腱を切断する前に、できる限り筋肉近くで、４－０縫合糸を用いて腱周囲で二重にこま結びした。次いで、マウスを熱制御プラットフォームに移し、３７℃で維持した。肢を安定化させるために、膝蓋骨の腱の後ろに金属ピンを配置し、力変換器（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｒｏｒａ、Ｃａｎａｄａ）のレベルアームに縫合した前脛骨筋遠位腱で膝をプラットフォームに固定した。電極を坐骨神経の近くに置き、それを刺激した。Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが設計したウォームアッププロトコルを開始し、静止張力を３～４ｇの力に設定し、５分間維持し、１Ｈｚでの筋刺激（３回、３０秒間隔）、および１５０Ｈｚでの追加の筋刺激（３回、６０秒間隔）を行った。筋肉が安定化すると、静止張力を、痙攣の収縮が最大である長さ（最適な長さ）に設定した。３分間の休憩期間後、前脛骨筋を５０、１００、１５０および２００Ｈｚで刺激し、それぞれの刺激の間に１分間休憩した。５分間の休憩後、次いで筋を、１０％のストレッチ伸長法で１分間の間隔で１０回等量収縮させた。テタニック収縮の持続は、２００分間続く。伸張性収縮後、マウスを安楽死させ、両方の前脛骨筋を解剖し、組織学および分子研究のため凍結した。

式：

前脛骨筋肢固有の筋力＝絶対筋力／断面積

絶対力＝１５０Ｈｚでの力^＊９．８（９．８ｍＮ＝１グラム）

断面積＝筋肉重量（ｍｇ）／１．０６（筋肉密度）^＊長さ（ｍｍ）^＊１筋肉重量（ｇ）／［前脛骨筋肢筋線維長（ｃｍ）×１．０６（ｇ／ｃｍ３）］

機能評価のための横隔膜のテタニック収縮

マウスを安楽死させ、横隔膜を肋骨付着物および中心腱を無傷で切除し、既に記載されている、Ｋｒｅｂ’ｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（Ｋ－Ｈ））緩衝液（１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１１ｍＭグルコース）中に置いた。横隔膜の２～４ｍｍ幅の切片を、１コホート当たり動物毎に単離した（ｎ＝６）。横隔膜ストリップを、中心腱で製紐外科手術絹糸（６／０；Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）でしっかりと結び、ストリップの遠位端に固定した肋骨の一部を介して縫合した。それぞれの筋肉を、３７℃で維持した酸化Ｋ－Ｈ溶液で充填したウォーターバスに移した。筋肉を水平に並べ、固定したピンと二重モードの力変換器サーボモータ（３０５Ｃ；Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）の間で直接結んだ。二つのプラチナプレート電極を、筋肉の長さに隣接するように浴槽に位置付けた。筋肉を、単収縮の測定に最適な長さに伸ばし、次いでテタニックプロトコルの開始前に１０分間休憩させた。筋肉が安定したら、１ｇの最適な長さに設定し、３０秒毎に３回の１Ｈｚの単収縮、続いて１分毎に３回の１５０－Ｈｚの単収縮からなるウォームアップを行った。３分間の休息期間後、横隔膜を２０、５０、８０、１２０、１５０、１８０Ｈｚで刺激し、それぞれの刺激の間に２分間の休憩期間を設け、それぞれが、２５０ｍｓの持続時間で最大のテタニック筋力を決定した。筋肉の長さおよび筋重量を測定し、筋力を筋重量および長さに対して正規化した。

式：

横隔膜固有の筋力＝１５０Ｈｚでの絶対筋力／断面積

絶対力＝１５０Ｈｚでの力^＊９．８（９．８ｍＮ＝１グラム）

断面積＝筋肉重量（ｇ）／［横隔膜線維長（ｃｍ）×１．０６（ｇ／ｃｍ３）］

開放型フィールドケージ活動のレーザーモニタリング

身体活動のレベルを評価するために、ＳＧＣＧ－／－およびＷＴマウスを、以前の報告で使用されたものと類似する開放型フィールド活動プロトコールの対象にした。開放型フィールド活動チャンバーを使用して、実験マウスの全体的な活性を決定した。ＷＴ（ｎ＝６、５Ｍ／１Ｆ）および無処置のＳＧＣＧ－／－（ｎ＝６、４Ｍ／２Ｆ）対照群の４週齢のマウス、ならびにＳＣＡＡＶＲＨ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＧで処置したＳＧＣＧ－／－マウス（低用量［ｎ＝６、６Ｍ／０Ｆ］；中用量［ｎ＝６、４Ｍ／２Ｆ］；高用量［ｎ＝６、０Ｍ／６Ｆ］）を、いくつかの改変を伴った既に記載されたプロトコールに従った分析の対象にした。マウスを、４週齢で処置し、処置後、エンドポイント１２週齢であった。コホートを互いに１週間離して注射し、エンドポイントの年齢の変動を排除した。セッションを、コホート別に分類した。すべてのマウスを、マウスが最も活動的である、午前６時１０分から午前８時３０分の間に、同じ時刻に試験した。すべてのマウスを、隔離した部屋において、毎回同じ人で、暗所下で試験した。不安を軽減し、マウスの通常の活動および結果としてのアッセイの結果に影響を及ぼす可能性のある行動変数を最小化するために、本発明者等は、個別に収容していないマウスを試験した。マウスの活性を、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ活動システム（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してモニタリングした。このシステムは、動物チャンバーの前から後および左から右を横断する目に見えない赤外線ビームのグリッドを使用して、ｘ－ｙ－ｚ平面内のマウスの位置および動きをモニターする。活動を、５分間隔で１時間のサイクルについて記録した。マウスを、データ収集開始前３および４日間、最初の１時間のセッションの間活動試験室に順応させた。マウスを個別のチャンバーで試験した。結果を変化させる可能性のあるマウスの反応行動変数を低減するために、それぞれの使用の間に試験装置を清掃した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークシートに変換し、すべての計算を、Ｅｘｃｅｌプログラム内で行った。ｘ平面およびｙ平面の動きについての個々のビームブレークを、それぞれのマウスについて加算して、全歩行運動を表し、ｚ平面におけるビームブレークを加算して、１時間の間隔内の垂直方向の活動を得た。

血清化学および血液学

安全性の速度として、ベクターを投与したＳＧＣＧ－／－マウスおよびＷＴマウスにおいて血液化学および血液学試験を行った。処置したＷＴマウスおよびＳＧＣＧ－／－マウスの心臓穿刺から全血を取り出した。血液を血清分離管に集め、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を採取し、凍結し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）肝酵素レベルの処理および評価のためにＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌに送った。

血清クレアチンキナーゼ測定

製造元のプロトコール（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ； Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ、ＰＥ、Ｃａｎａｄａ；カタログ番号３２６－１０）に従い、クレアチンキナーゼＳＬアッセイを使用し、ＷＴマウス（ｎ＝６）、無処置のＳＧＣＧ－／－乳酸リンゲル溶液（ＬＲ）で処置したマウス（ｎ＝６）、ならびに中用量および高用量のＳＣＡＡＶＲＨ７４．ＭＨＣＫ７．ＨＳＧＣＧで処置したＳＧＣＧ－／－マウス（ｎ＝６）（試料容積が不十分なため、低用量のデータを集めなかった）の血清において、クレアチンキナーゼのレベルを測定した。簡潔に述べると、血清２５μＬを、作業試薬１ｍＬと混合し、キュベットに加えた。動態アッセイを、分光光度計に設定して、３４０ｎｍで３０秒毎に１８０秒間の吸光度を測定した。クレアチンキナーゼレベルを、吸光度の測定値および以下に挙げる式を使用して計算した：

Ｕ／Ｌ＝［（Δ吸光度／分）^＊１．０２５^＊１０００］／［１^＊６．２２^＊０．０２５］＝（Δ吸光度／分）^＊６５９２。

統計解析

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０１ソフトウェアを使用して、統計解析を行った。データを、平均±ＳＥＭ（エラーバー）として表した。血液化学、血清クレアチンキナーゼ、横隔膜および前脛骨筋生理学、ならびにケージ活動の分析のため、チューキー多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを行った。中央核形成および伸張性収縮の分析のため、チューキー多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを行った。線維の直径の分析のため、ダンの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定を行った。

ＳＣＡＡＶＲＨ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧの単回全身注射は、ベクターゲノムコピーの生体分布によって示すように、全身送達に成功した（図１）。筋肉における有意な病理組織の存在下でのＳＧＣＧ－／－マウスへのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ ＡＡＶベクターのＩＶ投与は、用量全体にわたり前脛骨筋（ＴＡ）肢、ＤＩＡ、およびＨＲＴ筋にわたって導入遺伝子発現をもたらした（図２）。

また、筋肉における有意な組織病理の存在下でのＳＧＣＧ－／－マウスへのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターの投与は、筋細胞膜でのＤＡＰＣタンパク質の用量依存性回復をもたらした（図３）。特に、処置前、ＳＧＣＧ－／－マウスは、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、およびδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）の筋細胞膜発現を示さないか、または低減した（図３）。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターを用いた処置は、免疫蛍光パーセント陽性線維によって測定した通り、ＳＧＣＧ－／－マウスの筋細胞膜においてＳＧＣＡ、ＳＧＣＢ、およびＳＧＣＤサブユニット発現を増加させた（図３）。

ＳＧＣＧ－／－マウスは、ＷＴと比較して高レベルの中心核形成を伴う、筋肉において有意な組織病理を呈した。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを用いた処置後、全体的な筋肉病理は改善し、中心核の減少を観察した（図４Ａ）。全体的な線維性組織沈着は改善し、無処置のＳＧＣＧ－／－マウスにおけるレベルと比較して、投与量が漸増するにつれて、線維症のレベルが低減した（図４Ｂ）。

三つの投与量すべてで線維の直径の増加が見られ、ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、および三頭筋（ＴＲＩ）におけるＷＴ線維と類似した正規化した線維サイズを示した（図５）。ＴＡ筋およびＤＩＡ筋における有意に増加した筋肉の強さ（力産生）および収縮誘発性損傷に対する抵抗性を含む、機能改善を観察した（図６）。固有筋力の欠損および収縮誘発性損傷に対する抵抗性を、ＷＴマウスと比較した、ＳＧＣＧ－／－マウスの前脛骨筋および横隔膜筋における固有筋力において特定した。中用量および高用量のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ処置は、無処置のＳＧＣＧ－／－マウスと比較して、両筋において固有筋力を有意に改善した（前脛骨筋：低用量ｐ＝０．５７１、中用量ｐ＝０．００８、高用量ｐ＝０．０００１；横隔膜：低用量ｐ＝０．３８８、中用量ｐ＝０．０８８、高用量ｐ＝０．００１；図６）。伸張性収縮の数値的改善も、高用量処置で観察した。

ＷＴ対照と比較して、ＳＧＣＧ－／－マウスモデルにおいて歩行運動および垂直飼育の低減を観察した（図７）。開放型フィールドケージ活動のレーザーモニタリングは、ＳＲＰ－９００５で処置したＳＧＣＧ－／－マウスにおいて、歩行運動および移動の増加を示した。

処置は、ＣＫレベルの減少と関連した。肝酵素（ＡＬＴおよびＡＳＴ）は、処置後マウスについて正常範囲内に戻った（図８）。定量的筋形態計測は、三種の投与量すべてで線維の直径の増加を示し、前脛骨筋、腓腹筋、および三頭筋におけるＷＴ線維と類似した正規化した線維のサイズを示している（表２）。

ウエスタンブロット分析。ガンマ－サルコグリカン

ウエスタンブロットにより、最低用量で処置したマウスにおいて、筋組織にわたって、γ－サルコグリカンタンパク質発現を確認した（図１０Ａ）。γ－サルコグリカン発現は、用量依存性であり、低用量、中用量、および高用量について、心臓において野生型（ＷＴ）発現の少なくとも１００％を維持した（図１０Ｂ）。

本開示は特定の実施形態に関して記載するが、当業者に変形及び修正がなされることが理解される。したがって、特許請求の範囲に記載されるような制限のみが、本開示になされるべきである。

本出願に言及されるすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (84)

1. それを必要とする対象における筋ジストロフィーを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを前記対象に投与する工程を含み、
   前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用し、定量標準としての直線化プラスミドに基づき約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され；前記対象における血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、方法。
2. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを投与する工程を含む、それを必要とする対象におけるジストロフィン関連タンパク質複合体を回復させる方法であって、前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用し、定量標準としての直線化プラスミドに基づき約２×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、方法。
3. 前記対象の細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加され；
   前記治療された対象の筋細胞における平均ｒＡＡＶコピー数が、１個の核当たり少なくとも０．０１コピーであり；
   中心にある核の割合および／または線維症が、前記ｒＡＡＶの投与前のレベルと比較して、前記治療された対象の筋肉において低減され；
   運動機能が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記対象の運動機能と比較して、前記対象において改善され；
   前記ＮＳＡＤが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記対象のＮＳＡＤと比較して、前記対象において増加され；および／または
   ＡＬＴおよびＡＳＴレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記対象のＡＬＴおよびＡＳＴレベルと比較して、前記対象において低減される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記運動機能が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、または５０％改善される、請求項３に記載の方法。
5. 前記ｒＡＡＶが、静脈内経路を使用して投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ｒＡＡＶが、定量標準としての直線化プラスミドに基づき４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇで投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. ｒＡＡＶが、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ｒＡＡＶが、注射、注入または移植により投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ｒＡＡＶが、約１～２時間にかけて注入により投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ｒＡＡＶが、末梢肢静脈を介した静脈内経路により投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヒトγ－サルコグリカンヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ｒＡＡＶが、配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ｒＡＡＶが、配列番号１または配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ｒＡＡＶが、配列番号６のイントロン配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ｒＡＡＶが、配列番号５のポリＡ配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ｒＡＡＶが、配列番号３の５’末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ｒＡＡＶが、配列番号４の３’末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記筋ジストロフィーが、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィーである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
21. それを必要とする対象における肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記対象に、定量標準としての直線化プラスミドに基づき約４．６３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは定量標準としてのスーパーコイルプラスミドに基づき約１．２５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇもしくは約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で、約１～２時間かけてｒＡＡＶ静脈内注入を投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を含む、方法。
22. 対象の細胞におけるガンマ－サルコグリカン遺伝子を発現させる方法であって、前記対象に、配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を投与することを含む、方法。
23. 対象の筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維を増加させ、および／またはＣＫレベルを減少する方法であって、前記対象に、配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶ ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
24. 前記ガンマ－サルコグリカン遺伝子の発現または陽性ガンマ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検においてウエスタンブロットでガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記ガンマ－サルコグリカンタンパク質の発現が、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０％増加される、請求項２２に記載の方法。
26. ガンマ－サルコグリカン遺伝子の発現またはガンマ－サルコグリカン陽性筋線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検において免疫組織化学により前記ガンマ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ガンマ－サルコグリカンタンパク質の発現が、ｒＡＡＶの投与後に少なくとも３９％増加される、請求項２２に記載の方法。
28. 前記対象の前記筋組織におけるガンマ－サルコグリカン陽性線維の前記数が、前記ｒＡＡＶの投与前のガンマ－サルコグリカン陽性線維の前記数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に少なくとも４０、４１、または４２％増加される、請求項２３に記載の方法。
29. 少なくとも一つの細胞が、一つより多くのＡＡＶウイルスコピー数を有する、請求項２２に記載の方法。
30. 前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの前記投与前の前記血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記対象における前記血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与の６０日～９０日、６０日、または９０日後までに少なくとも８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０％減少する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンの前記レベルが、前記ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカンの前記レベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンの発現を増加させる方法であって、前記対象に、配列番号１または配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物を含むｒＡＡＶを投与することを含む、方法。
34. それを必要とする対象におけるアルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンの細胞膜への局在化を増加させる方法であって、前記対象に、配列番号１または配列番号７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるｓｃＡＡＶ ｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧ構築物ヌクレオチド配列を投与することを含む、方法。
35. アルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンが、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検での免疫組織化学により前記アルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記アルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンが、前記ｒＡＡＶの投与前および後の筋生検でのウエスタンブロットにより前記アルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項３３または３４に記載の方法。
37. 前記アルファ－サルコグリカンおよび／またはベータ－サルコグリカンが、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧによりコードされるガンマ－サルコグリカンを発現する細胞の膜に局在化される、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させるか、または対象の筋機能を改善する方法であって、前記対象に、配列番号７と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを投与することを含む、方法。
39. 前記対象が、サルコグリカンをコードする遺伝子における遺伝子変異を有するか、または筋ジストロフィーに罹患する、請求項３８に記載の方法。
40. 前記サルコグリカンが、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）、およびδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）のうちの一つまたは複数である、請求項３８に記載の方法。
41. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号７のポリヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
42. 対象の筋組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法であって、前記対象に、第一のサルコグリカンをコードするヌクレオチド配列を含む構築物を投与すること、および前記第一のサルコグリカンを発現する細胞の細胞膜における少なくとも第二のサルコグリカンの発現の増加を検出することを含む、方法。
43. 前記第一のサルコグリカンが、γ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）であり、前記第二のサルコグリカンが、α－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）、β－サルコグリカン（ＳＧＣＢ）、および／またはδ－サルコグリカン（ＳＧＣＤ）である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記対象が、年齢が４～１５歳であるヒト対象である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記対象が、小児対象、青年対象または若年成人対象である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記対象が、年齢が４～１５歳であり、両方の対立遺伝子におけるガンマ－サルコグリカン（ＳＧＣＧ）変異を確認し、ＡＡＶｒｈ７４抗体について陰性であり、および／または＞４０％もしくは正常の１００メートル歩行試験を有していたヒト対象である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記対象が、中年の成人または年配の対象である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記対象が、年齢が２５～５５歳であるヒト対象である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記対象が、年齢が５０歳を超えているヒト対象である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
50. ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクター、
    緩衝剤、
    イオン強度剤；および
    界面活性剤を含む、組成物。
51. 前記ｒＡＡＶが、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｍｌ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｍｌ、または約５．０×１０^１２ｖｇ／ｍｌ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｍｌの濃度である、請求項５０に記載の組成物。
52. 前記ｒＡＡＶが、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｍｌ、４×１０^１３ｖｇ／ｍｌ、５×１０^１３ｖｇ／ｍｌの濃度である、請求項５０に記載の組成物。
53. 前記緩衝剤が、トリス、トリシン、ビストリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの一つまたは複数を含む、請求項５０に記載の組成物。
54. 前記緩衝剤が、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度のｐＨ８．０を有する前記トリスを含む、請求項５３に記載の組成物。
55. 前記緩衝剤が、約２０ｍＭのｐＨ８．０を有する前記トリスを含む、請求項５３に記載の組成物。
56. 前記イオン強度剤が、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの一つまたは複数を含む、請求項５０に記載の組成物。
57. 前記イオン強度剤が、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２を含む、請求項５０に記載の組成物。
58. 前記イオン強度剤が、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項５０に記載の組成物。
59. 前記イオン強度剤が、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項５０に記載の組成物。
60. 前記イオン強度剤が、約１ｍＭの濃度のＭｇＣｌ_２および約２００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項５０に記載の組成物。
61. 前記界面活性剤が、スルホン酸塩、硫酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩、ポロクサマー、および陽イオン界面活性剤のうちの一つまたは複数を含む、請求項５０に記載の組成物。
62. 前記ポロクサマーが、ポロクサマー１２４、ポロクサマー１８１、ポロクサマー１８４、ポロクサマー１８８、ポロクサマー２３７、ポロクサマー３３１、ポロクサマー３３８、およびポロクサマー４０７のうちの一つまたは複数を含む、請求項６１に記載の組成物。
63. 前記界面活性剤が、約０．００００１％～約１％の濃度の前記ポロクサマーを含む、請求項６１に記載の組成物。
64. 前記界面活性剤が、約０．００１％の濃度のポロクサマー１８８を含む、請求項６１に記載の組成物。
65. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを含む医薬組成物であって、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧが、配列番号７に対して少なくとも９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
66. 前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧが、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
67. 組換えＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧを作製する方法であって、プラスミドを細胞に導入することを含み、前記プラスミドが、配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
68. 前記プラスミドが、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項８３に記載の方法。
69. 前記プラスミドが、配列番号１、または７に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項６７に記載の方法。
70. 前記プラスミドが、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
71. パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを前記細胞に導入することをさらに含む、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 前記細胞が、安定的に組み込まれるＡＡＶキャップ遺伝子を含む、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
73. 前記細胞が、安定的に組み込まれるＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む、請求項６７～７０のいずれか一項に記載の方法。
74. 配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞。
75. 前記プラスミドが、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項７４に記載の細胞。
76. 配列番号７または１０のヌクレオチド配列を含む、請求項７４または７５に記載の細胞。
77. 前記細胞が、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳類細胞である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の細胞。
78. 細胞または対象におけるＳＧＣＧ発現を測定する方法であって、配列番号１１および配列番号１２のプライマーを用いたＰＣＲ分析を含む、方法。
79. 前記対象が、ＬＧＭＤに罹患している、請求項７８に記載の方法。
80. 前記方法が、前記細胞または前記対象におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターの発現を測定することを含む、請求項７８または７９に記載の方法。
81. ＡＡＶベクターのタイターを測定する方法であって、配列番号１３の第一のプライマーおよび配列番号１４の第二のプライマーを用いたＰＣＲ分析で前記ＡＡＶベクターをタイター決定することを含む、方法。
82. ＡＡＶベクターのタイターを測定する方法であって、配列番号１５の配列を含むプローブを用いて前記ＡＡＶベクターをタイター決定することを含む、方法。
83. 前記プローブが、５’－ＦＡＭ－ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ－Ｚｅｎ－ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＡＧＡ ＴＣ－３ＩＡＢＫＦＱを含む、請求項８２に記載の方法。
84. 前記ＡＡＶベクターが、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｈＳＧＣＧベクターである、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。