CN115996758A

CN115996758A - 使sgcg在肌肉和心脏中充分表达的基因治疗表达系统

Info

Publication number: CN115996758A
Application number: CN202180045580.4A
Authority: CN
Inventors: 伊莎贝尔·理查德; 热罗姆·普皮奥特
Original assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Current assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2023-04-21
Also published as: JP2023530171A; WO2021255245A3; US20230256117A1; CA3182313A1; WO2021255245A2; EP4168052A2

Abstract

本发明涉及一种用于全身施用的表达系统，所述表达系统包括置于启动子控制下的编码γ‑肌聚糖蛋白(SGCG)的序列，使SGCG在骨骼肌和心脏中充分表达，以及其用于治疗肢带型肌营养不良症C型的用途。

Description

使SGCG在肌肉和心脏中充分表达的基因治疗表达系统

技术领域

本发明基于鉴定在骨骼肌和心脏中充分表达SGCG(γ-肌聚糖蛋白(sarcoglycan))的好处，有利的是骨骼肌中SGCG蛋白的数量高于或等于心脏中的数量。它提供了一种结合转基因和启动子序列的表达系统，避免了在心脏中的过度产生。然后，它为治疗新命名为肢带型肌营养不良症R5型(LGMD R5)的肢带型肌营养不良症2C型(LGMD2C)提供了一种有价值和安全的治疗工具。这种表达谱也对其他的肌聚糖蛋白有用，即α-肌聚糖蛋白(SGCA)、β-肌聚糖蛋白(SGCB)和δ-肌聚糖蛋白(SGCD)。

背景技术

术语肌聚糖蛋白病(SG)包括属于更大的肢带型肌营养不良症(LGMD)群体的四种不同的罕见疾病：LGMD2C或γ-SG，LGMD2D或α-SG，LGMD2E或β-SG，以及LGMD2F或δ-SG。有趣的是，每种形式的相对频率在不同的地理区域有很大的不同。例如，LGMD2F在巴西约占SG的14％，而在其他地方则极为罕见(Moreira E.S.et al.,J.Med.Genet.2003；40:E12)，LGMD2C在北非和罗马人群中几乎是唯一出现的形式(

C.G.et al.,Neuromuscul.Disord.1998；8:193-197；Dalichaouche I.et al.,Muscle Nerve.2017；56:129-135；Piccolo F.et al.,Hum.Mol.Genet.1996；5:2019-2022；Ben Othmane K.et al.,Am.J.Hum.Genet.1995；57:732-734)。

LGMD2C(LGMD R5)是由于编码γ-肌聚糖蛋白(SGCG)的γ-肌聚糖蛋白基因发生突变所致。SGCG是一种单通道跨膜糖蛋白，分子量为35kDa；它由定位在N末端的小的细胞内结构域、跨膜结构域和大的细胞外结构域组成，含有N-糖基化位点。它与α-肌聚糖蛋白、β-肌聚糖蛋白和δ-肌聚糖蛋白一起构成存在于横纹肌中的肌聚糖蛋白亚复合物的一部分。该亚复合物是肌营养不良蛋白(dystrophin)相关糖蛋白复合物(DGC)的重要成员，是维持肌纤维膜下细胞骨架和细胞外基质之间联系的关键角色。任何一种肌聚糖蛋白的突变都会扰乱DGC复合物的形成，导致肌纤维膜上其他肌聚糖蛋白出现不同水平的继发性缺陷。

这种复合物的不稳定引起了肌纤维膜稳定性的丧失以及肌肉纤维对收缩引起的损伤的保护的丧失(Petrof B.J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1993；90:3710-3714；Cohn R.D.and Campbell K.P,Muscle Nerve.2000；23:1456–1471)。

这种保护的丧失导致LGMD2C的遗传缺陷诱发了坏死性的退行性-再生性过程，造成了进行性的肌肉消耗。该病的特点是以四肢近端肌无力为主，几乎总是从下肢开始，常见小腿肥大和早期关节挛缩。出现呼吸功能不全和扩张型心肌病的频率是可变的。临床严重程度通常与残留蛋白的数量有关，可以观察到基因型与表型的相关性。空白突变通常与蛋白质缺失和严重的杜氏肌营养不良症(DMD)样表型有关，而错义突变与蛋白质数量减少和较温和的LGMD样表型有关(Semplicini C.et al.,Neurology.2015；84:1772-1781；MagriF.et al.,Muscle Nerve.2017；55:55-68)。

到目前为止，LMGD2C还没有治疗方法。

最近，在缺乏γ-SG的小鼠模型中证明了一种纠正病理的基因治疗方法(CordierL.et al.,Mol.Ther.2000；1:119-129)。2012年，报道了肌肉内注射在desmin启动子控制下表达人类γ-SG基因的AAV1针对LGMD2C的I-II期临床试验结果(Herson S.et al.,Brain.2012；135:483-492)。在这项试验之后，Israel等人(Mol Ther Methods ClinDev.2019；13:494-502)报告了一项剂量效应研究的结果，该研究的重点是在Sgcg^-/-中全身施用携带相同构建体(即在desmin启动子控制下表达γ-SG)的AAV2/8后的肌肉恢复。

另一方面，文件WO2019/152474公开了编码SGC的密码子优化序列，其由AAVrh74载体携带并在MHCK7启动子控制下表达。

因此，基于SGCG的基因替代疗法似乎是对FKRP缺陷引起的病理的一种有希望的治疗。然而，仍然需要安全有效的治疗。

关于基因疗法，安全表达系统被定义为确保在靶组织中产生治疗有效量的蛋白质的表达系统，即在需要所述蛋白质以治愈与天然蛋白质缺陷相关的异常的组织中，而没有任何毒性，特别是在基本和重要的器官或组织中。

发明内容

本发明的目的是通过提供一种确保在骨骼肌和心脏中产生足够量，即没有毒性的治疗有效量的蛋白质的表达系统，来缓解或治愈与γ-肌聚糖蛋白(SGCG)缺乏有关的破坏性病理，如肢带型肌营养不良症2C型(LGMD2C)。

即使已经确定在心脏中需要一定水平的SGCG表达，考虑到在相对较多的患者中观察到的心脏表型(Calvo et al.,Neuromuscul.Disord.2000；10(8):560-6；Van der Kooiet al.,Heart 1998；79(1):73-7)，非常希望有一种表达系统，使SGCG在骨骼肌中的表达达到足够的水平，而不导致心脏中的过度生产，以尊重内源性平衡并避免任何毒性。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。

冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。

在提及可测量的值(例如数量、持续时间等)时，本文所用的“约/大约(about)”或“约/大约(approximately)”是指涵盖指定值的±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、并且还更优选±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。

范围：在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本发明范围的不可更改的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1到6的范围的描述应该被认为已经具体公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

“分离的”是指从天然状态改变或取出。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，而从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。

在本发明的背景中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是指尿苷。

“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA或cDNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，以至于编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可以包含内含子。

“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列用作合成生物过程中的具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物学特性。因此，如果基因所对应的mRNA能在细胞或其他生物系统中转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。

如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员的常识是，核酸是可以水解成单体“核苷酸”的多核苷酸。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方法(包括但不限于重组方法，即使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列，以及通过合成方法)获得的所有核酸序列。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指短链，其在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体，也指更长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

蛋白质可能会被“改变”并包含氨基酸残基的缺失、插入或取代，这种氨基酸残基的缺失、插入或取代产生沉默的变化并导致功能等同。只要保留生物活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸可以包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可以包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的含有不带电荷的极性头基团的氨基酸可以包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。

如本文所用，“变体”是指被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。变体可以具有“保守”变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。变体也可以具有“非保守”变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或两者。可以使用本领域众所周知的计算机程序找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物学或免疫学活性的指导。

“同一的”或“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性或序列相似性。当所比较的两个序列的每一个中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，那么分子在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性/同一性百分比是两个序列共有的匹配位置数除以所比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，则两个序列是60％同一的。通常，当比对两个序列时进行比较，以获得最大同源性/同一性。

“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用的术语“启动子”被定义为由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，这对于启动多核苷酸序列的特异性转录是必需的。

如本文所用，术语“启动子/调控序列”是指与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，该序列还可以包括基因产物的表达所需的增强子序列和其他调控元件。启动子/调控序列可以例如是一种以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子是一种核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致基因产物在细胞的大部分或所有生理条件下在细胞中产生。

“诱导型”启动子是一种核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在与该启动子相对应的诱导物时，才会导致基因产物在该细胞中产生。

“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列，当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，如果细胞是与该启动子相对应的组织类型的细胞，则导致基因产物优先在该细胞中产生。

当在生物体、组织、细胞或其成分的背景中使用时，术语“异常的”是指与那些表现出“正常的”(预期的)各自特征的生物体、组织、细胞或其成分相比，在至少一个可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、一天中的时间等)上不同的那些生物体、组织、细胞或其成分。一种细胞或组织类型的正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，是指任何动物或其细胞，无论在体外还是在体都适用于本文所述的方法。受试者可以是哺乳动物，例如人、狗，还可以是小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。

“疾病”或“病理”是受试者的这样一种健康状况，其中受试者不能维持体内平衡，并且如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。相反，受试者的“病症(disorder)”是这样一种健康状况，其中受试者能够维持体内平衡，但受试者的健康状况不如没有病症时那样良好。如果不进行治疗，病症不一定会导致受试者的健康状况进一步下降。

如果疾病或病症的症状的严重程度、患者经历这种症状的频率或两者都降低，则疾病或病症“减轻”或“改善”。这还包括阻止疾病或病症的进展。如果疾病或病症的症状的严重程度、患者经历这种症状的频率或两者都被消除，则疾病或病症被“治愈”。

“治疗性”治疗是对表现出病理体征的受试者施用的治疗，目的是减少或消除这些体征。“预防性”治疗是对未表现出病理体征或尚未诊断出病理的受试者施用的治疗，目的是预防或推迟这些体征的发生。

如本文所用，“治疗疾病或病症”是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。在治疗的背景中，疾病和病症在本文中可互换使用。

化合物的“有效量”是足以为施用化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。如本文所用，短语“治疗有效量”是指足以或有效预防或治疗(延迟或预防其发作、阻止其进展、抑制、减少或逆转)疾病或病况(包括减轻此类疾病的症状)的量。递送载体的“有效量”是足以有效结合或递送化合物的量。

附图说明

图1：

A/使用γ-肌聚糖蛋白抗体(Ab203113-Abcam)对小鼠或猕猴的胫骨前肌(TA)和心脏中的γ-肌聚糖蛋白(SGCG)表达进行蛋白质印迹检测

B/根据(A)中检测到的信号，以图表形式展示SGCG在各组织中的表达。

统计学方差分析检验：

(*)表示P值小于0.05(统计学显著)。

ns：不显著

图2：用AAV9-prom-GFP-Luc(Des、CK8和tMCK)注射的C57Bl6白化小鼠的TA肌和心脏中GFP-Luc转基因的荧光素酶活性，通过总蛋白量归一化。

图3：通过QPCR测量的3组Sgcg-/-小鼠的组织(TA、心脏和肝脏)中的单位二倍体基因组的载体基因组拷贝数(VGCN)，该小鼠静脉注射携带SGCG的AAV8载体，该载体在desmin启动子(AAV8-Des-SGCG)或CK8启动子(AAV8-CK8-SGCG)或tMCK启动子(AAV8-tMCK-SGCG)控制下。

图4：

A/通过RT-QPCR测量的3组Sgcg-/-小鼠的组织(TA、心脏和肝脏)中的SGCG mRNA，通过P0内源水平进行归一化，该小鼠静脉注射携带SGCG的AAV8载体，该载体在desmin启动子(AAV8-Des-SGCG)或CK8启动子(AAV8-CK8-SGCG)或tMCK启动子(AAV8-tMCK-SGCG)控制下。

B/每个组织中SGCG/P0 mRNA的相对丰度与VGCN之间的比率。

C/SGCG mRNA在心脏与TA肌中的相对丰度的比率。虚线对应的比率为1(心脏和TA肌中表达水平相同)。

统计学方差分析检验：

(*)表示P值小于0.05(统计学显著)。

图5：

A/使用人类特异性的γ-肌聚糖蛋白抗体(Ab203112-Abcam)对各组5只小鼠(Sgcg-/-小鼠静脉注射携带SGCG的AAV8载体，该载体在desmin启动子(AAV8-Des-SGCG)或CK8启动子(AAV8-CK8-SGCG)或tMCK启动子(AAV8-tMCK-SGCG)控制下)的TA肌和心脏中的人类γ-肌聚糖蛋白表达进行蛋白质印迹检测。

B/根据(A)中检测到的信号，以图表形式展示SGCG在各组织(Ht：心脏；TA：胫骨前肌)中的表达。

统计学方差分析检验：

(*)表示P值小于0.05(统计学显著)。

ns：不显著

图6：在Sgcg-/-小鼠的TA和心脏中进行抗SGCG的免疫染色，该小鼠静脉注射携带SGCG的AAV8载体，该载体在desmin启动子(AAV8-Des-SGCG)或CK8启动子(AAV8-CK8-SGCG)或tMCK启动子(AAV8-tMCK-SGCG)控制下。

比例尺＝100μm。

图7：

A/SGCG表达的百分比与中心成核纤维(centronucleated fiber)的百分比之间的图形相关性。

黑色点对应WT小鼠的肌肉，白色点对应KO-Sgcg小鼠的肌肉。灰色点对应注射有不同水平的AAV转导效率(5e12 vg/kg、1e13 vg/kg和5e13 vg/kg的AAV8-Des-SGCG)的KO-Sgcg的肌肉。

B/使用γ-肌聚糖蛋白抗体(Ab203113-Abcam)对静脉注射PBS或AAV8-Des-SGCG(3^e14 vg/kg)的WT小鼠的TA肌和心脏中的γ-肌聚糖蛋白表达进行蛋白质印迹检测

C/根据(B)中检测到的信号，以图表形式展示SGCG在各组织(Ht：心脏；TA：胫骨前肌)中的表达。

图8：

A/使用人类特异性γ-肌聚糖蛋白抗体(Ab203112-Abcam)对各组大鼠(Spraguedawley静脉注射携带SGCG的AAV8载体，该载体在tMCK启动子(AAV8 tMCK)、Desmin启动子(AAV8 Desmin)和MHCK7启动子(AAV8 MHCK7)控制下)的TA肌和心脏中的人类γ-肌聚糖蛋白表达进行蛋白质印迹检测。

B/根据(A)中检测到的信号，以图表形式展示SGCG在各组织(心脏；TA：胫骨前肌)中的表达。

统计学学生检验：

(*)表示P值小于0.05，

(***)表示P值小于0.001(统计学显著)

ns：不显著

图9：通过RT-QPCR测量的3组Sprague Dawley大鼠的心脏中的转录物的分子比率rMyh6/rMyh7，该大鼠静脉注射PBS或携带SGCG的AAV8载体，该载体在tMCK启动子(AAV8-tMCK-SGCG)、desmin启动子(AAV8-Desmin-SGCG)和MHCK7启动子(AAV8-MHCK7-SGCG)控制下。

统计学方差分析检验：

(**)表示P值小于0.001。

具体实施方式

本发明基于本发明人的发现，即心脏中SGCG的内源性数量一般与骨骼肌中的相似甚至更低。因此，由表达系统产生的SGCG的表达，如果在心脏中比在骨骼肌中高得多，可能是有害的，应该避免。

本发明为这个新发现的问题提供了技术解决方案，特别是关于除了SGCG转基因和更普遍的肌聚糖蛋白的骨骼肌表达之外的过度心脏表达。

因此，总的来说，本发明涉及一种用于全身施用的表达系统，所述表达系统包括置于启动子控制下的编码γ-肌聚糖蛋白(SGCG)的序列，使SGCG在骨骼肌和心脏中充分表达。

换句话说，本发明涉及一种包含编码SGCG蛋白的序列的表达系统，所述表达系统允许：

-在靶组织中以治疗上可接受的水平表达该蛋白，有利地在骨骼肌和心脏中；但

-与其在骨骼肌中的表达水平相比，该蛋白在心脏中的表达水平充分，以避免任何潜在的心脏毒性。

在本发明的框架中，表达系统通常被定义为允许体内产生SGCG的多核苷酸。根据一方面，所述系统包含编码SGCG蛋白的核酸以及其表达所需的调控元件(至少包含启动子)。所述表达系统然后可以对应于表达盒。或者，所述表达盒可以由载体或质粒携带。本文中使用的“表达系统”一词覆盖了所有方面。

根据本发明，靶组织被定义为蛋白质将在其中发挥治疗作用的组织或器官，尤其是在编码该蛋白质的天然基因有缺陷的情况下。根据本发明的特定实施方案，靶组织包括横纹骨骼肌，以下称为骨骼肌，即运动能力中涉及的所有肌肉和膈肌，以及平滑肌。靶标骨骼肌的非限制性实例是胫骨前肌(TA)、腓肠肌、比目鱼肌、四头肌、腰大肌、三角肌、膈肌、臀肌、长伸肌(EDL)、肱二头肌、......。

如上所述，在与SGCG缺陷有关的各种疾病中，心脏也可能受到影响，因此也是潜在的靶组织。然而，在本申请的框架中，表明现有的表达系统产生的SGCG数量过高时，会达到过高的水平，这在心脏中可能是有毒的。因此，就基因转移而言，表达系统应有利于SGCG在心脏和骨骼肌中充分表达，优选地与内源性观察到的情况相当，即与天然基因相当。

那么，即使SGCG在心脏中具有治疗作用，其表达水平也应受到严格调控，因为该组织中过量的这种蛋白质可能是有害的，甚至是致命的，因此是有毒的。

因此，根据特定的方面，本发明涉及一种用于全身施用的表达系统，所述表达系统包含置于启动子控制下的编码γ-肌聚糖蛋白(SGCG)的序列，使SGCG在骨骼肌和心脏中充分表达。

根据第一个特征，本发明的表达系统包含编码γ-肌聚糖蛋白(SGCG或γ-SG)的序列，所述序列对应于转基因。在本发明的背景中，术语“转基因”是指使用本发明的表达系统反式提供的序列，优选开放阅读框。

根据特定实施方案，该序列是引入表达系统的相同或等同于机体基因组中存在的内源序列的拷贝。

根据另一个实施方案，所述内源序列具有一个或多个使蛋白质部分或完全无功能或甚至不存在(缺乏内源蛋白质的表达或活性)或未正确定位在期望的亚细胞区室中的突变。换言之，本发明的表达系统旨在施用于具有编码蛋白质的序列的缺陷拷贝并具有相关病理的受试者。

因此，本发明的表达系统携带的序列可以被定义为编码在与SGCG缺陷相关的病理的背景中具有治疗活性的蛋白质。治疗活性的概念结合术语“治疗上可接受的水平”被定义如下。

编码SGCG的序列(也称为“开放阅读框”的ORF)是核酸序列或多核苷酸，尤其可以是单链或双链DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或cDNA(互补脱氧核糖核酸)。

有利地，所述序列编码功能性蛋白质，即能够确保其天然或基本功能的蛋白质，尤其是在骨骼肌中。这意味着使用本发明的表达系统产生的蛋白质被适当地表达和定位，并且是有活性的。

根据优选实施方案，所述序列编码天然蛋白质，所述蛋白质优选是人类来源的。它也可以是该蛋白质的衍生物或片段，只要衍生物或片段保留所需的活性。优选地，术语“衍生物”或“片段”是指与人SGCG序列具有至少50％、优选60％、甚至更优选70％或甚至80％、85％、90％、95％或99％同一性的蛋白质序列。例如，来自另一来源(非人类哺乳动物等)的蛋白质或截短的、甚至突变的但有活性的蛋白质也包含在内。因此，在本发明的背景中，术语“蛋白质”被理解为全长蛋白质(无论其来源如何)，以及其功能衍生物和片段。

本发明的背景中的目的蛋白质有利地是人类来源的SGCG，即使例如可以使用鼠、大鼠或犬的版本(其序列可从数据库中获得)。

根据具体实施方案，SGCG蛋白是由SEQ ID NO:1(对应于291aa的蛋白质)或SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO:1(对应于291aa的蛋白质)或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的蛋白质，其在一个位置(一个残基)上与SEQ ID NO:1有差异，并对应于其天然变体。

根据具体实施方案，SGCG是具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2编码的天然人类SGCG相同功能的蛋白质，特别是与α-肌聚糖蛋白、β-肌聚糖蛋白和δ-肌聚糖蛋白相互作用以形成肌聚糖蛋白亚复合物的一部分的能力，其是肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物(DCG)的成员，和/或至少部分地缓解与SGCG缺陷(特别是上述公开的LGMD2C表型)相关的一个或多个症状的能力。它可以是片段和/或其衍生物。根据一个实施方案，所述SGCG序列与序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的同一性大于或等于50％、60％、70％、80％、90％、95％甚至99％。作为实例，Gao等人(The Journal of Clinical Investigation,2015；125(11):4186-95)公开了由mRNA编码的所谓Mini-γ，其中第4至7外显子被跳过。

编码这些蛋白质、功能性治疗衍生物或其片段的任何序列都可以作为本发明的表达系统的一部分来实现。例如，相应的核苷酸序列(cDNA)是WO2019/152474中鉴定的序列。

根据具体实施方案，编码SGCG的序列包括序列SEQ ID NO:3或由其组成，或对应于序列SEQ ID NO:5的核苷酸1186至2061或序列SEQ ID NO:6的核苷酸1357至2232。同样值得关注的是任何与序列SEQ ID NO:3具有大于或等于80％、90％、95％甚至99％同一性并编码SGCG蛋白的序列，优选地是序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

本发明涉及一种SGCG蛋白，其突变导致一个或多个靶组织中，特别是骨骼肌中，可能是心脏中的疾病。

SGCG基因的突变，以一种已知的方式，可以产生整个范围的病理，被命名为肢带型肌营养不良症2C型(LGMD2C或LGMD R5)。临床严重程度通常与残余蛋白的数量相关，而且可以观察到基因型与表型的相关性：空白突变通常与严重的杜氏肌营养不良症(DMD)样表型有关，而错义突变则与较温和的LGMD样表型有关。因此，根据基因替换或转移的策略，在转基因中提供编码治疗性SGCG的序列，该序列例如是天然的，有助于治疗所述病理。

根据本发明，有利地，表达系统或存在于所述表达系统中的启动子必须使SGCG蛋白在骨骼肌中和可能在心脏中以治疗上可接受的水平表达。根据优选实施方案和如本申请中报告的，SGCG的治疗上可接受的水平相当于靶组织中，特别是在骨骼肌和可能在心脏中内源性蛋白数量的至少30％(0.3倍)。换句话说，有利地，SGCG的数量，特别是在骨骼肌中，与所述组织中内源性SGCG的数量之间的比率高于或等于0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1，或甚至可以达到2、3、4、5、6、7、8、9或10。

此外，根据另一个优选实施方案，本发明的表达系统或存在于所述表达系统中的启动子必须使SGCG在心脏中以毒性上可接受的水平表达。根据优选实施方案和如本申请中报告的，SGCG的毒性上可接受的水平不超过心脏中内源性蛋白数量的800％(8倍)。换句话说，有利地，心脏中SGCG的数量与所述组织中内源性SGCG的数量之间的比率低于或等于20、15、10或9，有利地低于或等于8、7、6、5、4、3、2甚至1。

在本发明的背景中，术语“蛋白质表达”可以理解为“蛋白质产生”。因此，表达系统必须允许蛋白质以上述水平进行转录和翻译。同样重要的是所述蛋白质的正确折叠和定位。

在本发明的背景中定义的水平，即“治疗上可接受的”和“毒性上可接受的”，与蛋白质的量或数量以及如下文所定义的其活性有关。

可以通过使用针对所述蛋白质的抗体进行免疫检测(例如通过蛋白质印迹或ELISA，或通过质谱法)对给定组织中产生的蛋白质的量进行评估。或者，可以对相应的信使RNA进行定量，例如通过PCR或RT-PCR。这种定量可以在一种组织样本或几种样本上进行。因此，在靶组织是骨骼肌的情况下，它可以在一种肌肉类型或几种肌肉类型(例如四头肌、膈肌、胫骨前肌、三头肌等)上进行。

在本发明的背景中，术语“治疗上可接受的水平”是指由本发明的表达系统产生的蛋白质有助于改善患者的病理状况(特别是在生活质量或寿命方面)的事实。因此，与影响骨骼肌的疾病有关，这涉及改善受疾病影响的受试者的肌肉状况或恢复与健康受试者相似的肌肉表型。如上所述，主要由肌肉的力量、大小、组织学和功能限定的肌肉状态可以通过本领域已知的不同方法进行评估，例如活检，测量肌肉的力量、肌张力、体积或活动性，临床检查，医学影像学，生物标志物等。

因此，有助于评估关于骨骼肌的治疗益处并且可以在治疗后的不同时间进行评估的标准特别是以下中的至少一种：

-增加的预期寿命；

-增加的肌肉力量；

-改善的组织学；和/或

-改善的膈肌功能。

在本发明的背景中，术语“毒性上可接受的水平”是指由本发明的表达系统产生的蛋白质不会引起组织的显著改变(特别是在组织学、生理学和/或功能上)的事实。特别是，蛋白质的表达可能不是致命的。可以从组织学、生理学和功能上评估组织中的毒性。

在心脏的特定情况下，蛋白质的任何毒性都可以通过形态学和心脏功能的研究、临床检查、电生理学、影像学、生物标志物、预期寿命监测或组织学分析来评估，包括检测纤维化和/或细胞浸润和/或炎症，例如通过用天狼星红或苏木精(例如苏木精-伊红-藏红花(HES)或苏木精-根皮红(Phloxin)-藏红花(HFS))染色。

有利地，根据本发明的表达系统的功效和/或毒性水平在动物体内进行评估，可能在具有编码蛋白质的基因的缺陷拷贝并因此受到相关病理影响的动物中进行评估。优选地，表达系统被全身施用，例如通过静脉内(i.v.)注射。

根据本发明，优选地，表达系统包括至少一个使SGCG在骨骼肌和心脏中充分表达的序列。

根据另一个实施方案，根据本发明的表达系统包括置于启动子控制下的编码γ-肌聚糖蛋白(SGCG)的序列，使SGCG在骨骼肌和心脏中充分表达。

适当地，本发明的表达系统包括控制编码蛋白质的序列的转录的启动子序列，优选位于转基因的5’并且与其功能性连接。优选地，这确保了蛋白质表达在骨骼肌和可能在心脏中处于治疗上可接受的水平，以及在心脏中处于毒性上可接受的水平，如上所定义。

按照根据本发明的特征方式，这样的启动子应进一步确保SGCG在心脏和骨骼肌(例如TA肌)中充分表达。

在本发明的框架中，术语“充分”相当于“适当”、“适应”或“平衡”，有利地指表达谱与内源性观察到的谱相当，即与天然基因相当。如实施例中所报告的，心脏中的SGCG蛋白的数量有利地不超过骨骼肌中的SGCG蛋白的数量。如前所述，所述数量可以通过本领域已知的任何技术进行评估，例如通过评估蛋白质印迹中相应条带的强度。

正如在内源性基因方面所观察到的，根据本发明的表达系统在骨骼肌中产生的SGCG的数量有利地优于或等于在心脏中产生的数量。

这可以通过计算心脏中的SGCG量与骨骼肌(例如TA肌)中的SGCG量之间的比率来评估。

根据一个实施方案，该比率不应超过5。有利地，该比率应小于或等于4、3、2或甚至1。更有利地，该比率小于1。

相反，所述比率可以表示为骨骼肌(例如TA肌)中的SGCG量与心脏中的SGCG量之间的比率。

根据一个实施方案，该比率不应小于0.2。有利地，该比率大于或等于0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或甚至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。更有利地，该比率至少等于0.9或甚至1。

这可以包括诱导型或组成型、天然或合成(人工)启动子。同样，它们可以是任何来源的，包括人类，与转基因相同的来源或其他来源的。

这包括在骨骼肌和心脏中显示上述表达谱的任何启动子，例如：

-肌肉肌酸激酶启动子的衍生物，特别是带有双倍(dMCK)或三倍(tMCK)串联MCK增强子的截断MCK启动子，或CK6启动子(Wang et al.,2008,Gene Therapy,Vol.15,pages1489-99)；

-肌肉杂合(MH)启动子(Piekarowicz et al.,2017,European Society Of Gene&Cell Therapy conference,poster P096；HUMAN GENE THERAPY 28:A44(2017),DOI:10.1089/hum.2017.29055.abstracts)；

-含有至少一个序列USE(上游增强子)的启动子，例如在肌钙蛋白I启动子序列中发现的(Corin et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.92,pages 6185-89)，或其100-bp的缺失(ΔUSE；Blain et al.,2010,Human Gene Therapy,Vol.21,pages 127-34)，可能为3(x3)或4(x4)拷贝。特别值得关注的是DeltaUSEx3(DUSEx3)启动子和DeltaUSEx4(DUSEx4)启动子；

-γ-肌聚糖蛋白基因的启动子；

-骨骼α-肌动蛋白(ACTA1)启动子或其衍生版本。

根据具体实施方案，这样的启动子不是desmin启动子，例如序列SEQ ID NO:13，也不是CK8启动子，例如序列SEQ ID NO:14。根据另一个实施方案，这样的启动子不是MHCK7启动子，例如WO2019/152474中所公开的。

有利地，在本发明的框架中要使用的启动子是tMCK启动子。根据优选实施方案，tMCK启动子的序列如SEQ ID NO:4所示。

衍生自所述序列或对应于其片段但具有相似的启动子活性(特别是在组织特异性和可能的有效性方面)的启动子序列也被覆盖在本发明内。优选地，术语“衍生物”或“片段”是指与所述序列，有利地与SEQ ID NO:4具有至少60％、优选70％、甚至更优选80％或甚至90％、95％或99％的同一性的序列。特别感兴趣的是如上文所定义的允许在心脏和骨骼肌中充分表达SGCG的启动子序列。

根据具体实施方案，本发明因此涉及一种表达系统，其包括编码SGCG的序列，优选地是序列SEQ ID NO:3，置于具有序列SEQ ID NO:4的启动子或其衍生物或片段的控制下，如上所定义。

有利地，本发明的表达系统包括对应于以下的序列：

-SEQ ID NO:5的核苷酸1至2061；或

-SEQ ID NO:6的核苷酸172至2232。

根据具体实施方案，目的启动子被进一步选择，因为它能够允许在非靶组织中低表达或不表达，即在SGCG没有治疗效果的组织中或SGCG没有自然表达的组织中。如上所述，有利地，肌肉(平滑肌和骨骼肌)和心脏被排除在所述非靶组织之外。相反，肝脏可以被视为非靶组织。

根据具体实施方案，使SGCG在骨骼肌和心脏中充分表达的启动子在非靶组织如肝脏中没有活性或活性较低。或者，根据本发明的表达系统进一步包括可以防止或减少SGCG在非靶组织中、特别是在肝脏中的表达的序列。

在本发明的背景中，术语“防止表达”优选地是指即使在没有所述序列时也没有表达的情况，而术语“降低表达水平”是指通过提供所述序列降低(或减少)表达的情况。

有利地，所述序列能够防止SGCG在非靶组织中的表达或降低SGCG在非靶组织中的表达水平，其中蛋白质表达可能是有毒的或不需要的。该行为可以根据各种机制发生，特别是：

-根据编码蛋白质的序列的转录水平；

-根据由编码蛋白质的序列转录产生的转录物，例如通过它们的降解；

-根据转录物向蛋白质的翻译。

这样的序列优选是例如选自以下组中的小RNA分子的靶标：

-microRNA；

-内源性小干扰RNA或siRNA；

-转运RNA(tRNA)的小片段；

-基因间区域的RNA；

-核糖体RNA(rRNA)；

-小核RNA(snRNA)；

-小核仁RNA(snoRNA)；

-与piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)。

根据一个实施方案，该序列不影响SGCG在靶组织中的表达，特别是在骨骼肌和心脏中的表达。

优选地，根据它在蛋白质表达没有治疗活性或甚至具有毒性的组织中的有效性选择这样的序列。由于该序列的有效性可能因组织而异，因此可能需要组合这些序列中的几个，根据它们在所述组织中的有效性选择。

根据优选实施方案，该序列是microRNA(miRNA)的靶序列。众所周知，这种审慎选择的序列有助于特异性抑制选定组织中的基因表达。

因此，根据特定的实施方案，本发明的表达系统包括在蛋白质表达没有治疗活性和/或具有毒性的组织中(例如在肝脏中)表达或存在的microRNA(miRNA)的靶序列。适当地，存在于靶组织，特别是骨骼肌和心脏中的这种miRNA的数量低于存在于SGC无用或甚至具有毒性的组织中的数量，或者这种miRNA甚至可以不在靶组织中表达。根据特定的实施方案，靶miRNA在骨骼肌和可能在心脏中不表达。根据另一个特定的实施方案，它在肝脏中特异性或甚至唯一表达。

如本领域技术人员已知的，miRNA的存在或表达水平(特别是在给定组织中)可以通过PCR(优选通过RT-PCR)或通过Northern印迹来评估。

不同的miRNA，以及它们的靶序列和它们的组织特异性，对于本领域技术人员来说是已知的，并且例如在文件WO 2007/000668中有所描述。在肝脏中表达的miRNA是例如miR-122。

根据具体实施方案，根据本发明的表达系统不包括在心脏中表达的miRNA如miR208a的任何靶序列。

根据本发明，表达系统或表达盒包括表达存在的转基因所必需的元件。除了如上文定义以确保和调节转基因表达的那些序列外，这样的系统可以包括其他序列，例如：

-用于稳定转录物的序列，例如编码人类β球蛋白(HBB2)的基因的内含子2/外显子3(修饰的)，例如对应于SEQ ID NO:5的核苷酸734至1179或SEQ ID NO:6的核苷酸905至1350。如所述序列所示，所述HBB2内含子后面有利地包括在mRNA内AUG起始密码子之前的共有Kozak序列(GCCACC)，以改善翻译的启动；

-多腺苷酸化信号，例如目的基因的polyA、SV40或β血红蛋白(HBB2)的polyA，有利地在编码SGCG的序列的3’处。作为优选的实例，HBB2的polyA对应于SEQ ID NO:5的核苷酸2072至2833或SEQ ID NO:6的核苷酸2243至3004；

-增强子序列。

可以将根据本发明的表达系统引入细胞、组织或身体中，特别是人类中。以本领域技术人员已知的方式，可以离体或体内进行引入，例如通过转染或转导。根据另一方面，本发明因此包含优选人类来源的细胞或组织，其包含本发明的表达系统。

根据本发明的表达系统(在该情况下是分离的核酸)可以在受试者中施用，即以裸DNA的形式。为了促进这种核酸向细胞中的引入，它可以与不同的化学方法相结合，例如胶体分散系统(大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒)或基于脂质的系统(水包油乳液、胶束、脂质体)。

或者，根据另一个优选实施方案，本发明的表达系统包含质粒或载体。有利地，这样的载体是病毒载体。通常用于哺乳动物(包括人类)基因治疗的病毒载体是本领域技术人员已知的。这样的病毒载体优选选自以下列表：源自疱疹病毒的载体、杆状病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)。

根据本发明的具体实施方案，包含表达系统的病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

腺相关病毒(AAV)载体已成为治疗各种病症的强大的基因递送工具。AAV载体具有许多使其理想地适合基因治疗的特征，包括致病性的缺乏、中等免疫原性以及以稳定和有效的方式转导有丝分裂后的细胞和组织的能力。通过选择AAV血清型、启动子和递送方法的适当组合，可以将AAV载体中包含的特定基因的表达特异性靶向至一种或多种类型的细胞。

在一个实施方案中，编码序列包含在AAV载体中。已知有100多种天然存在的AAV血清型。AAV衣壳中存在许多天然变体，允许鉴定和使用具有特别适合营养不良病理的特性的AAV。可以使用传统的分子生物学技术对AAV病毒进行工程化，从而可以优化这些颗粒以用于核酸序列的细胞特异性递送、最小化免疫原性、调节稳定性和颗粒寿命、有效降解、准确递送至细胞核。

如上所述，AAV载体的使用是DNA外源递送的常见模式，因为它相对无毒，可提供有效的基因转移，并且可以轻松针对特定目的进行优化。在从人类或非人类灵长类动物(NHP)分离并良好表征的AAV血清型中，人类血清型2是第一个被开发为基因转移载体的AAV。目前使用的其他AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh74、AAV11和AAV12。此外，非天然的工程化的变体和嵌合AAV也可以有用。

用于组装成载体的理想AAV片段包括cap蛋白(包括vp1、vp2、vp3和高变区)、rep蛋白(包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)以及编码这些蛋白质的序列。这些片段可以很容易地用于各种载体系统和宿主细胞。

这样的片段可以单独使用，与其他AAV血清型序列或片段组合使用，或与来自其他AAV或非AAV病毒序列的元件组合使用。如本文所用，人工AAV血清型包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这样的人工衣壳可以通过任何合适的技术产生，使用所选的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列相结合，所述异源序列可以从所选的不同AAV血清型、相同AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。因此，示例性AAV或人工AAV包括AAV2/8(US 7,282,199)、AAV2/5(可从美国国立卫生研究院获得)、AAV2/9(WO2005/033321)、AAV2/6(US 6,156,303)、AAVrh10(WO2003/042397)、AAVrh74(WO2003/123503)、AAV9-rh74杂合体或AAV9-rh74-P1杂合体(WO2019/193119)、PCT/EP2020/061380中公开的AAV变体等。在一个实施方案中，可用于本文所述的组合物和方法的载体至少包含编码所选AAV血清型衣壳(例如AAV8衣壳)的序列或其片段。在另一个实施方案中，有用的载体至少包含编码所选AAV血清型rep蛋白(例如AAV8 rep蛋白)的序列或其片段。任选地，这样的载体可以同时包含AAV cap和rep蛋白。在同时提供AAV rep和cap的载体中，AAV rep和AAV cap序列都可以是一种血清型来源，例如，所有AAV8来源。或者，可以使用其中rep序列来自AAV血清型的载体，其不同于提供cap序列的载体。在一个实施方案中，rep和cap序列从不同的来源(例如，不同的载体，或宿主细胞和载体)表达。在另一个实施方案中，这些rep序列在框内融合至不同AAV血清型的cap序列以形成嵌合AAV载体，例如AAV2/8(US 7,282,199)。

根据一个实施方案，组合物包含血清型2、5、8或9的AAV，或AAVrh74。有利地，要求保护的载体是AAV8或AAV9载体，尤其是AAV2/8或AAV2/9载体。

在本发明使用的AAV载体中，AAV基因组可以是单链(ss)核酸或双链(ds)/自互补(sc)核酸分子。

有利地，将编码SGCG的多核苷酸插入AAV载体的ITR(“反向末端重复”)序列之间。典型的ITR序列对应于SEQ ID NO:6的核苷酸1至145(5’ITR序列)和SEQ ID NO:6的核苷酸3005至3149(3’ITR序列)。

重组病毒颗粒可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得，例如通过单纯疱疹病毒系统和杆状病毒系统共转染293HEK细胞。载体滴度通常表示为每毫升病毒基因组(vg/mL)。

在一个实施方案中，载体包含调控序列，尤其是启动子序列，有利地如上所述。

关于编码序列SEQ ID NO:1的多核苷酸，本发明的载体可以包括SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的序列。

根据优选实施方案，本发明的表达系统包括具有适当趋向性的载体，在这种情况下，对靶组织，有利地对骨骼肌和心脏，以及可能地对平滑肌，比对蛋白质表达可能具有毒性的组织的趋向性要高。

本发明的进一步的方面涉及：

-如上所公开的包含本发明的表达系统的细胞或包含所述表达系统的载体。

细胞可以是任何类型的细胞，即原核细胞或真核细胞。细胞可用于载体的增殖或可以进一步引入(例如移植)到宿主或受试者中。可以通过本领域已知的任何方式将表达系统或载体引入细胞中，例如通过转化、电穿孔或转染。也可以使用源自细胞的囊泡。

-如上所公开的包含本发明的表达系统的转基因动物(有利地是非人类)、包含所述表达系统的载体、或包含所述表达系统或所述载体的细胞。

本发明的另一方面涉及包含如上所公开的表达系统、载体或细胞的组合物用作药物。

根据实施方案，组合物至少包含所述基因治疗产物(表达系统、载体或细胞)，以及可能的其他专门用于治疗同一种疾病或另一种疾病的活性分子(其他基因治疗产物、化学分子、肽、蛋白质……)。

根据具体实施方案，根据本发明的表达系统的使用与抗炎药物如皮质激素类的使用相结合。

本发明然后提供包含本发明的表达系统、载体或细胞的药物组合物。这样的组合物包含治疗有效量的治疗剂(本发明的表达系统或载体或细胞)以及药学上可接受的载体。在具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国或欧洲药典或其他公认的用于动物和人类的药典中列出。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物被静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等形式。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中进行了描述。这样的组合物将包含治疗有效量的治疗剂，优选以纯化形式，以及合适量的载体，以便为受试者提供适当施用的形式。

在优选实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适合于向人静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物适用于在人类中施用。组合物优选为液体形式，有利地为盐水组合物，更有利地为磷酸盐缓冲盐水(PBS)组合物或Ringer-乳酸溶液。

可以通过标准临床技术确定将有效治疗靶标疾病的本发明治疗剂(即表达系统或载体或细胞)的量。此外，可任选地采用体内和/或体外测定来帮助预测最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径、体重以及疾病的严重程度，应根据从业者的判断和每位患者的情况来决定。

合适的施用应该允许将治疗有效量的基因治疗产物递送至靶组织，尤其是骨骼肌和可能的心脏。在本发明的背景中，当基因治疗产物是包含编码人SGCG的多核苷酸的病毒载体时，治疗剂量被定义为向每千克(kg)受试者施用的含有SGCG序列的病毒颗粒的数量(对于病毒基因组是vg)。

可用的施用途径是局部、肠内(全系统作用，但通过胃肠道(GI)递送)或肠胃外(全身作用，但通过胃肠道以外的途径递送)。本文公开的组合物的优选施用途径是肠胃外，包括肌内施用(即进入肌肉)和全身施用(即进入循环系统)。在该背景中，术语“注射”(或“灌注”或“输注”)涵盖血管内，特别是静脉内(IV)、肌内(IM)、眼内、鞘内或脑内施用。通常使用注射器或导管进行注射。

在一个实施方案中，组合物的全身递送包括在局部治疗部位附近施用组合物，即在虚弱的肌肉附近的静脉或动脉中。在某些实施方案中，本发明包括组合物的局部递送，其产生全身作用。这种施用途径(通常称为“局部(限于局部)输注”、“通过孤立(isolated)肢体灌注施用”或“高压经静脉肢体灌注”)已成功用作肌营养不良症的基因递送方法。

根据一方面，通过输注或灌注将组合物施用于孤立肢体(限于局部)。换言之，本发明包括在压力下通过血管内施用途径(即静脉(经静脉)或动脉)在腿和/或手臂中局部递送组合物。这通常通过使用止血带暂时阻止血液循环同时允许注入产物的局部扩散来实现，例如Toromanoff等人(2008)披露的。

在一个实施方案中，将组合物注射到受试者的肢体中。当受试者是人时，肢体可以是手臂或腿。根据一个实施方案，组合物在受试者身体的下部(例如膝盖以下)或在受试者身体的上部(例如肘部以下)施用。

根据本发明的优选施用方法是全身施用。全身注射开辟了注射整个身体以到达受试者身体的整个肌肉(包括心脏和膈肌)以及然后真正治疗这些全身性的且仍然无法治愈的疾病的途径。在某些实施方案中，全身递送包括将组合物递送至受试者，使得组合物可遍及受试者的身体。

根据优选实施方案，全身施用通过在血管中注射组合物(即血管内(静脉内或动脉内)施用)进行。根据一个实施方案，组合物通过外周静脉通过静脉注射施用。

全身施用通常在以下条件下进行：

-1至10mL/min之间的流速，有利地1至5mL/min之间的流速，例如3mL/min；

-总注射量可以在1至20mL之间变化，优选为每kg受试者5mL的载体制剂。注射量不应超过总血量的10％，优选约为6％。

当全身递送时，组合物优选以小于或等于10¹⁵vg/kg或甚至10¹⁴vg/kg、有利地高于或等于10¹⁰、10¹¹或甚至10¹²vg/kg的剂量施用。具体而言，剂量可以在5.10¹²vg/kg和10¹⁴vg/kg之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9.10¹³vg/kg。也可以考虑例如1、2、3、4、5、6、7、8或9.10¹²vg/kg的较低剂量以避免潜在的毒性和/或免疫反应。如本领域技术人员所知，在效率方面给出令人满意的结果的尽可能低的剂量是优选的。

在具体实施方案中，治疗包括组合物的单次施用。

这样的组合物主要旨在用于基因治疗，特别是用于治疗受试者的肢带型肌营养不良症2C型(LGMD2C或LGMD R5)或γ-肌聚糖蛋白病。

可以从本发明的组合物受益的受试者包括所有被诊断患有此类疾病或有发展此类疾病的风险的患者。然后可以通过本领域技术人员已知的任何方法(包括例如SGCG基因测序)基于SGCG基因中的突变或缺失的鉴定，和/或通过本领域技术人员已知的任何方法评估SGCG表达水平或活性，来选择待治疗的受试者。因此，所述受试者包括已经表现出这种疾病的症状的受试者和有患上所述疾病的风险的受试者。在一个实施方案中，所述受试者包括已经表现出此类疾病的症状的受试者和有发展此类疾病的风险的受试者。在另一个实施方案中，所述受试者是能走动的患者和早期不能走动的患者。

更一般地和根据进一步的实施方案，根据本发明的表达系统可用于：

-增加受试者的肌肉力量、肌肉耐力和/或肌肉质量；

-减少受试者的纤维化；

-减少受试者的收缩引起的损伤；

-治疗受试者的肌营养不良症；

-减少患有肌营养不良症的受试者的退化纤维或坏死纤维；

-减少患有肌营养不良症的受试者的炎症；

-降低患有肌营养不良症的受试者的肌酸激酶(或任何其他营养不良标志物)的水平；

-治疗患有肌营养不良症的受试者的肌纤维萎缩和肥大；

-减少患有肌营养不良症的受试者的营养不良性钙化；

-减少受试者的脂肪浸润；

-减少受试者的中心成核现象。

根据一个实施方案，本发明涉及一种治疗此类病况的方法，其包括向受试者施用上述公开的基因治疗产品(表达系统、载体或细胞)。

有利地，表达系统在体内全身施用，特别是在动物中，有利地在哺乳动物中并且更优选在人类中。

除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的视界内。此类技术在文献中得到了充分解释，例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,fourthedition(Sambrook,2012)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Culture ofAnimal Cells”(Freshney,2010)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1997)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller andCalos,1987)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,2002)；“PolymeraseChain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,2011)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,2002)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，因此可以在制备和实践本发明时被考虑。用于特定实施方案的特别有用的技术将在以下部分中讨论。

本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。

在没有进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。

实验性实施例

参考下面的实验性实施例和附图对本发明作进一步详细描述。提供这些实施例仅用于说明目的，并不旨在进行限制。

具体地，本发明涉及一种AAV8载体，该载体包含置于tMCK启动子控制下的编码SGCG的序列。

材料和方法：

动物模型

动物研究是根据现行的欧洲动物护理和实验法规(2010/63/EU)进行的，并经法国Evry的Centre d’Exploration et de Recherche Fonctionnelle Expérimentale的机构伦理委员会批准(方案APAFIS DAP 2018-024-B#19736)。

本研究使用了Sgcg^-/-小鼠品系(Hack et al.,J.Cell.Biol.1998；142:1279-87)。这些小鼠是在纯正的C57BL/6J背景下通过与C57BL/6J背景杂交10次而繁殖的。C57Bl/6J和C57Bl6白化小鼠是向Charles River机构订购的。来自猕猴的样本由Inserm UMR 1089,Atlantic Gene Therapies,Institut de Recherche Thérapeutique(IRT 1)Universitéde Nantes(法国)和Silabe(67207Niederhausbergen，法国)提供。

本研究还使用了1月龄的雄性Sprague Dawley大鼠。

表达盒和AAV介导的基因转移

使用相同的ITR序列、转基因GFP-Luc和polyAHBB2设计了三种不同的AAV盒。启动子是各构建体之间唯一不同的元件。在本研究中，对人desmin(Des)启动子(SEQ ID NO:13)、CK8启动子(

et al.,Mol Ther.2011；19(7):1331-41；SEQ ID NO:14)和tMCK启动子(Wang et al.,Gene Therapy 2008；15:1489-99；SEQ ID NO:4)进行了比较。血清型9被用于生产GFP-Luc重组腺相关病毒(AAV9-prom-GFP-Luc)。

还设计了另外三种AAV盒，使用相同的启动子，但带有SGCG转基因(见与tMCK启动子相关的SEQ ID NO:6)。此外，WO2019/152474中公开的MHCK7启动子(SEQ ID NO:15)也在此背景下进一步测试。血清型8被用于生产重组SGCG腺相关病毒(AAV8-prom-SGCG)。

使用对polyA HBB2序列具有特异性的引物对和TaqMan^TM探针通过TaqMan^TM实时PCR测定来对病毒基因组进行定量：

FWD：5’-CCAGGCGAGGAGAAACCA-3’(SEQ ID NO:7)，

REV：5’-CTTGACTCCACTCAGTTCTCTTGCT-3’(SEQ ID NO:8)，和

探针：5’-CTCGCCGTAAAACATGGAAGGAACACTTC-3’(SEQ ID NO:9)。

通过在尾静脉中单次全身施用注射不同的载体，以便在1月龄的雄性C57Bl6Albino小鼠中表达GFP-Luc转基因，或恢复5周龄的雌性Sgcg-/-小鼠的肌肉中的γ-肌聚糖蛋白表达。AAV9-prom-GFP-Luc的5e13vg/kg或AAV8-prom-SGCG的5e12 vg/kg、1e13 vg/kg、5e13 vg/kg或3e14 vg/kg时，所注射的载体剂量按小鼠体重进行归一化。治疗后三周或两周，处死小鼠并收集组织。选择胫骨前肌(TA)作为代表性骨骼肌。

此外，1月龄的雄性Sprague Dawley大鼠，以3e14 vg/kg的剂量在尾静脉内静脉注射三种AAV8载体MHCK7-hSGCG、Desmin-hSGCG和tMCK-hSCGC。另一个注射PBS的大鼠组也包括在内作为对照。注射后一个月，处死大鼠。收集心脏和胫骨前肌(TA)。

通过荧光素酶测定对荧光素酶进行定量

首先用500μL含有0.2％的Triton X-100和蛋白酶抑制剂cocktail PIC(罗氏)的测定缓冲液(Tris/磷酸盐，25mM；甘油15％；DTT，1mM；EDTA1mM；MgCl2 8mM)对样本进行均质化，加入。将10μL裂解液加样到白色不透明的96孔板的平底孔中。Enspire分光光度计被用来对发光进行定量。泵送系统将D-荧光素(167μM；Interchim)和含有ATP(40nM)的测定缓冲液(Sigma-Aldrich)递送到平板的每个孔中。在每次分配D-荧光素和ATP后，测量相对光单位(RLU)的信号，每个样本之间有2秒的延迟。进行BCA蛋白定量(Thermo Scientific)，以使每个样本中的蛋白量归一化。结果表示为RLU水平按蛋白量进行归一化。

组织学和免疫组织化学分析

从液氮冷却的异戊烷冷冻TA肌或心脏上切下8微米的横向冷冻切片。然后用含有20％胎牛血清(FCS)的PBS封闭横向冷冻切片1小时，用针对人类γ-肌聚糖蛋白的兔单克隆一抗(Abcam-ab203112)在4℃下孵育过夜。用PBS清洗后，将切片和与AlexaFluor 594染料(Thermo Fisher Scientific)缀合的山羊抗兔二抗在室温下孵育1小时。

用PBS清洗后，用Fluoromount-G和DAPI(SouthernBiotech)安装切片，并在荧光显微镜(Zeiss-Zeiss Axiophot 2)上观察。最后用AXIOSCAN显微镜(Zeiss)对所有切片进行完整的图像采集。

为了确定中心成核纤维的数量，用兔抗层粘连蛋白抗体(DAKO-Z0097)标记切片，使用与AlexaFluor 488染料(Thermo Fisher Scientific)缀合的山羊抗兔抗体作为二抗，并用Fluoromount-G和DAPI(SouthernBiotech)安装。最后用AXIOSCAN显微镜(Zeiss)对所有切片进行图像采集。如下对骨骼肌进行形态学分析，以确定中心成核纤维的数量(CNF/mm²)：

用FIJI软件处理在10倍放大率下捕获的含有8bits通道的层粘连蛋白免疫荧光和DAPI染色的RGB扫描图像，进行细胞核和纤维的分割。细胞核的分割是根据DAPI强度使用全局阈值(IsoData)和颗粒分析进行的。纤维的分割是根据层粘连蛋白染色使用MorphoLib插件“形态学分割”工具(边界图像选项)和ImageJ颗粒分析工具(对象圆度>.2，对象大小过滤器取决于肌肉类型和物种)进行的。

使用R软件(RImageJROI、spatstat和sp文库)将细胞核和纤维目的区域(ROI)转换为空间对象，并通过细胞核和纤维对象的交集确定纤维内的细胞核。对于纤维内的细胞核，计算它们与纤维重心和最近的膜点的距离。

进行大小、形状、荧光强度过滤，以排除假象(被识别为纤维的神经、分裂或合并的纤维......)。

根据细胞核和最近的膜之间的距离(相对于纤维Feret直径或绝对距离，用户选择)，确定中心成核纤维。

组织中病毒基因组拷贝数(VGCN)的测量

根据制造商的说明，使用NucleoMag Pathogen试剂盒(Macherey Nagel)和KingFisher机器人(Thermo Fisher Scientific)从冷冻组织中提取基因组DNA。使用qPCR从20ng的基因组DNA中确定载体基因组拷贝数。携带每个扩增子的一个拷贝的质粒的DNA样本的连续稀释被用作标准曲线。根据Absolute QPCR Rox Mix(Thermo FisherScientific)的方案，使用LightCycler480(罗氏)进行实时PCR，每个引物0.2μM，探针0.1μM。位于盒的polyAHBB2中的序列被用于病毒基因组的定量。对polyA HBB2序列具有特异性的引物对和Taqman^TM探针与上面公开的相同(SEQ ID NO:7-9)。

无处不在的酸性核糖体磷蛋白(P0)被用于基因组DNA的定量。用于P0扩增的引物对和Taqman^TM探针是：

FWD：5’-CTCCAAGCAGATGCAGCAGA-3’(SEQ ID NO:10)，

REV：5’-ATAGCCTTGCGCATCATGGT-3’(SEQ ID NO:11)，和

探针：5’-CCGTGGTGCTGATGGGCAAGAA-3’(SEQ ID NO:12)。

二倍体基因组的数量是P0基因拷贝数量的一半。组织的转导水平由每个二倍体基因组的VGCN决定。

mRNA的定量

按照

RNASet for NucleoZOL方案(Macherey Nagel)从冷冻组织中提取总RNA。提取的RNA在60μl的无RNase水中洗脱，并用TURBO^TM DNase试剂盒(Ambion)处理以去除残留的DNA。使用Nanodrop分光光度计(ND8000 Labtech)对总RNA进行定量。

为了对转基因的表达进行定量，使用RevertAid H minus逆转录酶试剂盒(ThermoFisher Scientific)和随机寡核苷酸和oligo-dT的混合物对1μg的RNA进行逆转录。使用LightCycler480(罗氏)进行实时PCR，使用商业引物对和探针来对人类γ-肌聚糖蛋白进行定量(Hs00165089_m1；Thermo Fisher Scientific)。对于小鼠样本，无处不在的酸性核糖体磷蛋白(P0)被用来对不同样本的数据进行归一化，以及之前描述的VGCN定量。

每个实验都是一式两份进行。定量周期(Cq)值用

480SW 1.5.1使用第2次派生最大值法计算。以原始Cq表示的RT-qPCR结果被归一化到P0。使用2^-ΔCt Livak方法计算相对表达。

Myh6/Myh7转录比的测量

Myh6和Myh7的转录物通过RT-QPCR进行定量，使用商业化的引物对和探针来对rMyh6(Rn00691721_g1；Thermo Fisher Scientific)和rMyh7(Rn01488777_g1；ThermoFisher Scientific)进行定量。结果以Myh6与Myh7的转录物的分子比表示。

蛋白质印迹分析

将约1mm的组织(肝脏、心脏或TA肌)的冷冻切片溶解在含有蛋白酶抑制剂cocktail的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液中。蛋白质提取物通过BCA(二喹啉甲酸)蛋白质测定法(Pierce)进行定量。30μg的总蛋白被处理为蛋白质印迹分析，使用抗γ-肌聚糖蛋白抗体(人类特异性：Ab203112和用于共同识别小鼠人类和猕猴的形式：Abcam；Ab203113)。

二抗的荧光信号在Odyssey成像系统上读取，并通过Odyssey应用软件(LI-CORBiosciences，2.1版本)测量条带强度。

统计分析

统计分析使用GraphPad Prism 6.04版本(GraphPad Software，San Diego，CA)进行。统计分析采用统计学上的方差分析或学生检验进行，如所示。数据以平均值±SD表示。P值小于0.05被认为统计学显著(*)。

结果

I/小鼠和猕猴中的内源性SGCG表达谱：

为了确定不同物种中内源性SGCG在心脏和骨骼肌中的相对比率，研究了野生型小鼠或猕猴的不同组织(作为骨骼肌的代表的TA肌和心脏)中SGCG蛋白的相对丰度。

图1显示，在小鼠中，SGCG在TA肌和心脏中的产生水平相似。在猕猴(人类的哺乳动物模型)中，观察到心脏中的SGCG数量大大低于TA肌中的SGCG数量。

II/对C57BL6小鼠中的不同启动子进行评估：

我们进行了一项研究，以确定一种在心脏和TA肌中显示表达谱的表达构建体，其尽可能与内源性基因观察到的相似，即在TA肌中的表达水平与心脏相似或甚至高于心脏。

为此，使用报告基因GFP-Luc测试了已知具有肌肉活性的不同启动子。

进行实验以比较desmin启动子、CK8启动子和tMCK启动子。选择desmin启动子，因为它与Israel等人(Mol Ther Methods Clin Dev.2019；13:494-502)测试的启动子相对应，他们报告了其恢复肌肉活性的效率。

图2显示：

-AAV9-CK8-GFP-Luc载体对转导心脏和TA肌更有效；

-AAV9-tMCK-GFP-Luc在启动子强度方面似乎较弱，但在心脏和骨骼肌的表达方面更平衡。

显然，tMCK启动子是一个有希望的候选者，它能确保在心脏和TA肌中的充分表达，正如在小鼠和猕猴中的内源性基因方面所观察到的。相反，desmin和CK8启动子在心脏中引起非常高的表达，优于在TA肌中观察到的表达，并可能有相关的心脏毒性。

III/在Sgcg-/-小鼠中验证tMCK启动子：

为了验证这些观察结果，进行了进一步的研究以比较3种不同的SGCG AAV8载体，该载体静脉注射到SGCG缺陷小鼠体内。将有希望的tMCK启动子与上述测试的其他两个启动子，即Desmin启动子和CK8启动子进行比较。

首先，在3个构建体之间比较了转导功效。

如图3所示，3个载体的感染性没有偏差，因为它们在相同的组织上有相同的转导水平。肝脏显然是转导最多的器官(～1VGCN/二倍体基因组)。心脏和TA肌的类似转导达到约0.01VGCN/二倍体基因组。在这种低水平的感染下，没有达到可能干扰下面的分析的饱和效应的风险。

然后，对3个启动子的转录活性进行了比较。

SGCG mRNA在TA肌中的水平在3组小鼠之间没有明显差异。相反，与其他两组小鼠相比，tMCK启动子的活性在心脏中显得低得多，至少与CK8启动子有统计学上的显著差异。由于肝脏中转导的细胞的数量非常高，SGCG mRNA的水平也很高(图4A)。

通过VGCN对mRNA SGCG丰度进行归一化，证实tMCK启动子的活性与Des和CK8启动子的活性都有明显差异(图4B)。

最后，用tMCK启动子得到的心脏与TA肌的SGCG mRNA比率(约0.6)似乎与内源性条件更充分(图4C)，即TA肌中的表达高于心脏中的表达。

这些观察结果通过调查SGCG蛋白在这些不同组织中的表达得到了证实：

如图5所示，在注射AAV8-CK8-SGCG载体和AAV8-Des-SGCG载体的小鼠组中，心脏中的转基因蛋白量明显高于TA肌，而注射AAV8-tMCK-SGCG载体的小鼠则不是这种情况：心脏和TA肌中的SGCCG数量没有明显差异。此外，需要注意的是，无论使用何种启动子，TA肌中的Sgcg蛋白水平都是相似的。基于这些结果，证实了tMCK具有充分的表达谱，即：

-在TA肌中具有与desmin和CK8启动子类似的高活性；

-在心脏中的活性比desmin和CK8启动子低。

对TA和心脏组织的直接观察(图6)证实，SGCG在TA肌中的表达在3组小鼠之间没有明显差异。相反，与其他两组小鼠相比，注射AAV8-tMCK-SGCG载体的小鼠的心脏显示出较少的阳性纤维。

IV/确定肌肉和心脏中SCGC的临界量：

为了确定肌肉中SGCG的最小治疗有效量和心脏中SGCG的最大无毒量，使用AAV8-Des-SGCG载体进行了进一步的实验，该载体已在上文被证明在TA肌中的表达水平充分，但在心脏中的表达水平过高，可能具有毒性。

从图7A可以得出结论，为了达到可接受的中心成核水平(与WT小鼠肌肉中观察到的中心成核水平相当或甚至略高，即高达20％)，表达系统应允许在骨骼肌中表达至少30％的正常水平的SGCG。

另一方面，图7B和7C显示，所述系统在心脏中具有潜在的毒性，导致心脏中的SGCG水平比在WT小鼠心脏中观察到的SGCG水平高8倍。

V/在大鼠中对不同的启动子进行评估：

V-1/蛋白质SGCG的表达谱：

上述在小鼠中公开的实验进一步在大鼠中进行，增加了一个新的测试启动子MHCK7启动子(AAV8-MHCK7-SGCG载体)。

图8显示，在大鼠中，在注射AAV8 Desmin-SGCG载体和AAV8MHCK7-SGCG载体的大鼠组中，心脏中的转基因蛋白量明显高于TA肌。

相反，使用AAV8 tMCK-SGCG载体时，转基因蛋白在TA肌和心脏中的表达相同。

需要指出的是，用AAV8 Desmin-SGCG载体和AAV8 tMCK-SGCG载体得到的表达谱比率在小鼠和大鼠中是相似的。

V-2/对心脏的影响：

测量Myh6/Myh7的转录比是检测伴随着压力引起的心脏病理状况的心脏组织改变的一个很好的指标(Scheuermann et al.,EMBO J.2013；32(13):1805-16)。

图9显示，与PBS对照组(10.2)相比，注射载体AAV8 tMCK-SGCG的大鼠组(8.3)中的这一比率没有明显改变。它进一步显示，即使没有统计学差异，在注射AAV8 Desmin-SGCG载体的大鼠心脏中，该比率也强烈降低(1.8)。最后，与PBS对照和AAV8-tMCK组大鼠相比，在注射AAV8 MHCK7-SGCG载体的大鼠心脏中，该比率明显降低(0.8)。

总的来说，tMCK启动子在心脏和骨骼肌之间的表达是相等的，而在其他两个启动子Desmin和MHCK7中，SGCG在心脏中的表达比在骨骼肌中的表达多，这在大鼠和小鼠中都有观察到。此外，只有tMCK启动子能保持Myh6/Myh7的正确比率，而其他两个启动子则改变了这一比率，表明心脏中的细胞压力。

结论

如本领域已知，靶向治疗LGMD2C患者所需的两个最重要的器官是骨骼肌和心脏。

根据对野生型小鼠和猕猴中的内源性SGCG蛋白的测量，可以得出结论，心脏中的表达水平优选地与骨骼肌中的表达水平相同，甚至低于骨骼肌中的表达水平。

关于这些不同的方面，AAV8-tMCK-SGCG载体被证实是一个非常有希望的候选者。与其他三个启动子相比，其在心脏中的表达水平明显降低。此外，在TA肌中，转基因的表达接近于用AAV8-Des-SGCG载体获得的表达，该载体被广泛描述为有效地转导骨骼肌并恢复肌肉活性(参见例如，Israeli et al.,Mol Ther Methods Clin Dev.2019；13:494-502)。

序列表

<110> 吉尼松公司

国家健康与医学研究院

埃夫里-瓦尔德艾松大学

<120> 使SGCG在肌肉和心脏中充分表达的基因治疗表达系统

<130> G143-B-59609 PCT

<150> EP20315308.5

<151> 2020-06-19

<160> 15

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类SGCG

<400> 1

Met Val Arg Glu Gln Tyr Thr Thr Ala Thr Glu Gly Ile Cys Ile Glu

1 5 10 15

Arg Pro Glu Asn Gln Tyr Val Tyr Lys Ile Gly Ile Tyr Gly Trp Arg

20 25 30

Lys Arg Cys Leu Tyr Leu Phe Val Leu Leu Leu Leu Ile Ile Leu Val

35 40 45

Val Asn Leu Ala Leu Thr Ile Trp Ile Leu Lys Val Met Trp Phe Ser

50 55 60

Pro Ala Gly Met Gly His Leu Cys Val Thr Lys Asp Gly Leu Arg Leu

65 70 75 80

Glu Gly Glu Ser Glu Phe Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Lys Glu Ile His

85 90 95

Ser Arg Val Asp Ser Ser Leu Leu Leu Gln Ser Thr Gln Asn Val Thr

100 105 110

Val Asn Ala Arg Asn Ser Glu Gly Glu Val Thr Gly Arg Leu Lys Val

115 120 125

Gly Pro Lys Met Val Glu Val Gln Asn Gln Gln Phe Gln Ile Asn Ser

130 135 140

Asn Asp Gly Lys Pro Leu Phe Thr Val Asp Glu Lys Glu Val Val Val

145 150 155 160

Gly Thr Asp Lys Leu Arg Val Thr Gly Pro Glu Gly Ala Leu Phe Glu

165 170 175

His Ser Val Glu Thr Pro Leu Val Arg Ala Asp Pro Phe Gln Asp Leu

180 185 190

Arg Leu Glu Ser Pro Thr Arg Ser Leu Ser Met Asp Ala Pro Arg Gly

195 200 205

Val His Ile Gln Ala His Ala Gly Lys Ile Glu Ala Leu Ser Gln Met

210 215 220

Asp Ile Leu Phe His Ser Ser Asp Gly Met Leu Val Leu Asp Ala Glu

225 230 235 240

Thr Val Cys Leu Pro Lys Leu Val Gln Gly Thr Trp Gly Pro Ser Gly

245 250 255

Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Glu Ile Cys Val Cys Pro Asp Gly Lys Leu

260 265 270

Tyr Leu Ser Val Ala Gly Val Ser Thr Thr Cys Gln Glu His Ser His

275 280 285

Ile Cys Leu

290

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类SGCG变体

<400> 2

Met Val Arg Glu Gln Tyr Thr Thr Ala Thr Glu Gly Ile Cys Ile Glu

1 5 10 15

Arg Pro Glu Asn Gln Tyr Val Tyr Lys Ile Gly Ile Tyr Gly Trp Arg

20 25 30

Lys Arg Cys Leu Tyr Leu Phe Val Leu Leu Leu Leu Ile Ile Leu Val

35 40 45

Val Asn Leu Ala Leu Thr Ile Trp Ile Leu Lys Val Met Trp Phe Ser

50 55 60

Pro Ala Gly Met Gly His Leu Cys Val Thr Lys Asp Gly Leu Arg Leu

65 70 75 80

Glu Gly Glu Ser Glu Phe Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Lys Glu Ile His

85 90 95

Ser Arg Val Asp Ser Ser Leu Leu Leu Gln Ser Thr Gln Asn Val Thr

100 105 110

Val Asn Ala Arg Asn Ser Glu Gly Glu Val Thr Gly Arg Leu Lys Val

115 120 125

Gly Pro Lys Met Val Glu Val Gln Asn Gln Gln Phe Gln Ile Asn Ser

130 135 140

Asn Asp Gly Lys Pro Leu Phe Thr Val Asp Glu Lys Glu Val Val Val

145 150 155 160

Gly Thr Asp Lys Leu Arg Val Thr Gly Pro Glu Gly Ala Leu Phe Glu

165 170 175

His Ser Val Glu Thr Pro Leu Val Arg Ala Asp Pro Phe Gln Asp Leu

180 185 190

Arg Leu Glu Ser Pro Thr Arg Ser Leu Ser Met Asp Ala Pro Arg Gly

195 200 205

Val His Ile Gln Ala His Ala Gly Lys Ile Glu Ala Leu Ser Gln Met

210 215 220

Asp Ile Leu Phe His Ser Ser Asp Gly Met Leu Val Leu Asp Ala Glu

225 230 235 240

Thr Val Cys Leu Pro Lys Leu Val Gln Gly Thr Trp Gly Pro Ser Gly

245 250 255

Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Glu Ile Cys Val Cys Pro Asp Gly Lys Leu

260 265 270

Tyr Leu Ser Val Ala Gly Val Ser Thr Thr Cys Gln Glu His Asn His

275 280 285

Ile Cys Leu

290

<210> 3

<211> 876

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类SGCG

<400> 3

atggtgcgtg agcagtacac tacagccaca gaaggcatct gcatagagag gccagagaat 60

cagtatgtct acaaaattgg catttatggc tggagaaagc gctgtctcta cttgtttgtt 120

cttcttttac tcatcatcct cgttgtgaat ttagctctta caatttggat tcttaaagtg 180

atgtggtttt ctccagcagg aatgggccac ttgtgtgtaa caaaagatgg actgcgcttg 240

gaaggggaat cagaattttt attcccattg tatgccaaag aaatacactc cagagtggac 300

tcatctctgc tgctacaatc aacccagaat gtgactgtaa atgcgcgcaa ctcagaaggg 360

gaggtcacag gcaggttaaa agtcggtccc aaaatggtag aagtccagaa tcaacagttt 420

cagatcaact ccaacgacgg caagccacta tttactgtag atgagaagga agttgtggtt 480

ggtacagata aacttcgagt aactgggcct gaaggggctc tttttgaaca ttcagtggag 540

acaccccttg tcagagccga cccgtttcaa gaccttagat tagaatcccc cactcggagt 600

ctaagcatgg atgccccaag gggtgtgcat attcaagctc acgctgggaa aattgaggcg 660

ctttctcaaa tggatattct ttttcatagt agtgatggaa tgctcgtgct tgatgctgaa 720

actgtgtgct tacccaagct ggtgcagggg acgtggggtc cctctggcag ctcacagagc 780

ctctacgaaa tctgtgtgtg tccagatggg aagctgtacc tgtctgtggc cggtgtgagc 840

accacgtgcc aggagcacag ccacatctgc ctctaa 876

<210> 4

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tMCK

<400> 4

ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60

ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120

gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 180

cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtggc cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga 240

ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta accccaacac ctgctgcccc 300

ccccccccca acacctgctg cctgagcctg agcggttacc ccaccccggt gcctgggtct 360

taggctctgt acaccatgga ggagaagctc gctctaaaaa taaccctgtc cctggtggcc 420

actacgggtc taggctgccc atgtaaggag gcaaggcctg gggacacccg agatgcctgg 480

ttataattaa ccccaacacc tgctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctgagcctga 540

gcggttaccc caccccggtg cctgggtctt aggctctgta caccatggag gagaagctcg 600

ctctaaaaat aaccctgtcc ctggtggccc tccctgggga cagcccctcc tggctagtca 660

caccctgtag gctcctctat ataacccagg ggcacagggg ctgcccccgg gtca 714

<210> 5

<211> 2833

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K7启动子-polyA

<400> 5

ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60

ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc aacacctgct gcctgagcct 120

gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg aggagaagct 180

cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtggc cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga 240

ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta accccaacac ctgctgcccc 300

ccccccccca acacctgctg cctgagcctg agcggttacc ccaccccggt gcctgggtct 360

taggctctgt acaccatgga ggagaagctc gctctaaaaa taaccctgtc cctggtggcc 420

actacgggtc taggctgccc atgtaaggag gcaaggcctg gggacacccg agatgcctgg 480

ttataattaa ccccaacacc tgctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctgagcctga 540

gcggttaccc caccccggtg cctgggtctt aggctctgta caccatggag gagaagctcg 600

ctctaaaaat aaccctgtcc ctggtggccc tccctgggga cagcccctcc tggctagtca 660

caccctgtag gctcctctat ataacccagg ggcacagggg ctgcccccgg gtcacaccgg 720

tgctagcgtt aacgtacaca tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa 780

aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa 840

tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag 900

aataacagtg ataatttctg ggttaaggca atagcaatat ttctgcatat aaatatttct 960

gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc 1020

taccattctg cttttatttt ttggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag 1080

gcccttttgc taatcttgtt catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg 1140

ctggtctctg tgctggccca tcactttggc aaagaattcg ccaccatggt gcgtgagcag 1200

tacactacag ccacagaagg catctgcata gagaggccag agaatcagta tgtctacaaa 1260

attggcattt atggctggag aaagcgctgt ctctacttgt ttgttcttct tttactcatc 1320

atcctcgttg tgaatttagc tcttacaatt tggattctta aagtgatgtg gttttctcca 1380

gcaggaatgg gccacttgtg tgtaacaaaa gatggactgc gcttggaagg ggaatcagaa 1440

tttttattcc cattgtatgc caaagaaata cactccagag tggactcatc tctgctgcta 1500

caatcaaccc agaatgtgac tgtaaatgcg cgcaactcag aaggggaggt cacaggcagg 1560

ttaaaagtcg gtcccaaaat ggtagaagtc cagaatcaac agtttcagat caactccaac 1620

gacggcaagc cactatttac tgtagatgag aaggaagttg tggttggtac agataaactt 1680

cgagtaactg ggcctgaagg ggctcttttt gaacattcag tggagacacc ccttgtcaga 1740

gccgacccgt ttcaagacct tagattagaa tcccccactc ggagtctaag catggatgcc 1800

ccaaggggtg tgcatattca agctcacgct gggaaaattg aggcgctttc tcaaatggat 1860

attctttttc atagtagtga tggaatgctc gtgcttgatg ctgaaactgt gtgcttaccc 1920

aagctggtgc aggggacgtg gggtccctct ggcagctcac agagcctcta cgaaatctgt 1980

gtgtgtccag atgggaagct gtacctgtct gtggccggtg tgagcaccac gtgccaggag 2040

cacagccaca tctgcctcta agggcgaatt caccccacca gtgcaggctg cctatcagaa 2100

agtggtggct ggtgtggcta atgccctggc ccacaagtat cactaagctc gctttcttgc 2160

tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc aactactaaa ctgggggata 2220

ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa aacatttatt ttcattgcaa 2280

tgatgtattt aaattatttc tgaatatttt actaaaaagg gaatgtggga ggtcagtgca 2340

tttaaaacat aaagaaatga agagctagtt caaaccttgg gaaaatacac tatatcttaa 2400

actccatgaa agaaggtgag gctgcaaaca gctaatgcac attggcaaca gccctgatgc 2460

ctatgcctta ttcatccctc agaaaaggat tcaagtagag gcttgatttg gaggttaaag 2520

ttttgctatg ctgtatttta cattacttat tgttttagct gtcctcatga atgtcttttc 2580

actacccatt tgcttatcct gcatctctca gccttgactc cactcagttc tcttgcttag 2640

agataccacc tttcccctga agtgttcctt ccatgtttta cggcgagatg gtttctcctc 2700

gcctggccac tcagccttag ttgtctctgt tgtcttatag aggtctactt gaagaaggaa 2760

aaacaggggg catggtttga ctgtcctgtg agcccttctt ccctgcctcc cccactcaca 2820

gtgacccgga atc 2833

<210> 6

<211> 3149

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K7 ITR-ITR

<400> 6

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttcctacgcg tgcggccgcg gatccgtcga cccactacgg 180

gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat 240

taaccccaac acctgctgcc cccccccccc caacacctgc tgcctgagcc tgagcggtta 300

ccccaccccg gtgcctgggt cttaggctct gtacaccatg gaggagaagc tcgctctaaa 360

aataaccctg tccctggtgg ccactacggg tctaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc 420

tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aaccccaaca cctgctgccc cccccccccc 480

aacacctgct gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg 540

tacaccatgg aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtggc cactacgggt 600

ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta 660

accccaacac ctgctgcccc ccccccccca acacctgctg cctgagcctg agcggttacc 720

ccaccccggt gcctgggtct taggctctgt acaccatgga ggagaagctc gctctaaaaa 780

taaccctgtc cctggtggcc ctccctgggg acagcccctc ctggctagtc acaccctgta 840

ggctcctcta tataacccag gggcacaggg gctgcccccg ggtcacaccg gtgctagcgt 900

taacgtacac atattgacca aatcagggta attttgcatt tgtaatttta aaaaatgctt 960

tcttctttta atatactttt ttgtttatct tatttctaat actttcccta atctctttct 1020

ttcagggcaa taatgataca atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa gaataacagt 1080

gataatttct gggttaaggc aatagcaata tttctgcata taaatatttc tgcatataaa 1140

ttgtaactga tgtaagaggt ttcatattgc taatagcagc tacaatccag ctaccattct 1200

gcttttattt tttggttggg ataaggctgg attattctga gtccaagcta ggcccttttg 1260

ctaatcttgt tcatacctct tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt gctggtctct 1320

gtgctggccc atcactttgg caaagaattc gccaccatgg tgcgtgagca gtacactaca 1380

gccacagaag gcatctgcat agagaggcca gagaatcagt atgtctacaa aattggcatt 1440

tatggctgga gaaagcgctg tctctacttg tttgttcttc ttttactcat catcctcgtt 1500

gtgaatttag ctcttacaat ttggattctt aaagtgatgt ggttttctcc agcaggaatg 1560

ggccacttgt gtgtaacaaa agatggactg cgcttggaag gggaatcaga atttttattc 1620

ccattgtatg ccaaagaaat acactccaga gtggactcat ctctgctgct acaatcaacc 1680

cagaatgtga ctgtaaatgc gcgcaactca gaaggggagg tcacaggcag gttaaaagtc 1740

ggtcccaaaa tggtagaagt ccagaatcaa cagtttcaga tcaactccaa cgacggcaag 1800

ccactattta ctgtagatga gaaggaagtt gtggttggta cagataaact tcgagtaact 1860

gggcctgaag gggctctttt tgaacattca gtggagacac cccttgtcag agccgacccg 1920

tttcaagacc ttagattaga atcccccact cggagtctaa gcatggatgc cccaaggggt 1980

gtgcatattc aagctcacgc tgggaaaatt gaggcgcttt ctcaaatgga tattcttttt 2040

catagtagtg atggaatgct cgtgcttgat gctgaaactg tgtgcttacc caagctggtg 2100

caggggacgt ggggtccctc tggcagctca cagagcctct acgaaatctg tgtgtgtcca 2160

gatgggaagc tgtacctgtc tgtggccggt gtgagcacca cgtgccagga gcacagccac 2220

atctgcctct aagggcgaat tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga aagtggtggc 2280

tggtgtggct aatgccctgg cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtccaatt 2340

tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg 2400

gccttgagca tctggattct gcctaataaa aaacatttat tttcattgca atgatgtatt 2460

taaattattt ctgaatattt tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc atttaaaaca 2520

taaagaaatg aagagctagt tcaaaccttg ggaaaataca ctatatctta aactccatga 2580

aagaaggtga ggctgcaaac agctaatgca cattggcaac agccctgatg cctatgcctt 2640

attcatccct cagaaaagga ttcaagtaga ggcttgattt ggaggttaaa gttttgctat 2700

gctgtatttt acattactta ttgttttagc tgtcctcatg aatgtctttt cactacccat 2760

ttgcttatcc tgcatctctc agccttgact ccactcagtt ctcttgctta gagataccac 2820

ctttcccctg aagtgttcct tccatgtttt acggcgagat ggtttctcct cgcctggcca 2880

ctcagcctta gttgtctctg ttgtcttata gaggtctact tgaagaagga aaaacagggg 2940

gcatggtttg actgtcctgt gagcccttct tccctgcctc ccccactcac agtgacccgg 3000

aatcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact 3060

gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 3120

gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaa 3149

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PolyA HBB2 FWD

<400> 7

ccaggcgagg agaaacca 18

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PolyA HBB2 REV

<400> 8

cttgactcca ctcagttctc ttgct 25

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PolyA HBB2探针

<400> 9

ctcgccgtaa aacatggaag gaacacttc 29

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0 FWD

<400> 10

ctccaagcag atgcagcaga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0 REV

<400> 11

atagccttgc gcatcatggt 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P0探针

<400> 12

ccgtggtgct gatgggcaag aa 22

<210> 13

<211> 1052

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> desmin启动子

<400> 13

tacccccaca gctcctctcc tgtgccttgt ttcccagcca tgcgttctcc tctataaata 60

cccgctctgg tatttggggt tggcagctgt tgctgccagg gagatggttg ggttgacatg 120

cggctcctga caaaacacaa acccctggtg tgtgtgggcg tgggtggtgt gagtaggggg 180

atgaatcagg gagggggcgg gggacccagg gggcaggagc cacacaaagt ctgtgcgggg 240

gtgggagcgc acatagcaat tggaaactga aagcttatca gaccctttct ggaaatcagc 300

ccactgttta taaacttgag gccccaccct cgacagtacc ggggaggaag agggcctgca 360

ctagtccaga gggaaactga ggctcagggc tagctcgccc atagacatac atggcaggca 420

ggctttggcc aggatccctc cgcctgccag gcgtctccct gccctccctt cctgcctaga 480

gacccccacc ctcaagcctg gctggtcttt gcctgagacc caaacctctt cgacttcaag 540

agaatattta ggaacaaggt ggtttagggc ctttcctggg aacaggcctt gaccctttaa 600

gaaatgaccc aaagtctctc cttgaccaaa aaggggaccc tcaaactaaa gggaagcctc 660

tcttctgctg tctcccctga ccccactccc ccccacccca ggacgaggag ataaccaggg 720

ctgaaagagg cccgcctggg ggctgcagac atgcttgctg cctgccctgg cgaaggattg 780

gtaggcttgc ccgtcacagg acccccgctg gctgactcag gggcgcaggc ctcttgcggg 840

ggagctggcc tccccgcccc cacggccacg ggccgccctt tcctggcagg acagcgggat 900

cttgcagctg tcaggggagg ggaggcgggg gctgatgtca ggagggatac aaatagtgcc 960

gacggctggg ggccctgtct cccctcgccg catccactct ccggccggcc gcctgcccgc 1020

cgcctcctcc gtgcgcccgc cagcctcgcc cg 1052

<210> 14

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CK8启动子

<400> 14

ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt 60

tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat 120

aaccctgcat gccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca 180

cttagtttag gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg 240

ctgggcaagc tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag 300

ctcatctgct ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt 360

aggctcctct atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca 420

gcacagacag acactcagga gccagccagc 450

<210> 15

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MHCK7启动子

<400> 15

aagcttgcat gtctaagcta gacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt 60

aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga 120

ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga 180

cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtctagcatg ccccactacg ggtctaggct 240

gcccatgtaa ggaggcaagg cctggggaca cccgagatgc ctggttataa ttaacccaga 300

catgtggctg cccccccccc cccaacacct gctgcctcta aaaataaccc tgtccctggt 360

ggatcccctg catgcgaaga tcttcgaaca aggctgtggg ggactgaggg caggctgtaa 420

caggcttggg ggccagggct tatacgtgcc tgggactccc aaagtattac tgttccatgt 480

tcccggcgaa gggccagctg tcccccgcca gctagactca gcacttagtt taggaaccag 540

tgagcaagtc agcccttggg gcagcccata caaggccatg gggctgggca agctgcacgc 600

ctgggtccgg ggtgggcacg gtgcccgggc aacgagctga aagctcatct gctctcaggg 660

gcccctccct ggggacagcc cctcctggct agtcacaccc tgtaggctcc tctatataac 720

ccaggggcac aggggctgcc ctcattctac caccacctcc acagcacaga cagacactca 780

ggagcagcca gc 792

Claims

1.一种用于全身施用的表达系统，所述表达系统包括置于启动子控制下的编码γ-肌聚糖蛋白(SGCG)的序列，使SGCG在骨骼肌和心脏中表达，其中SGCG在骨骼肌中的表达与SGCG在心脏中的表达之间的比率高于或等于0.9。

2.根据权利要求1所述的表达系统，其中它允许SGCG在骨骼肌中的表达的数量高于或等于内源数量的0.3倍。

3.根据前述权利要求中任一项所述的表达系统，其中它允许SGCG在心脏中的表达的数量低于或等于内源数量的8倍。

4.根据前述权利要求中任一项所述的表达系统，其中所述启动子是tMCK启动子，有利地是序列SEQ ID NO:4。

5.根据前述权利要求中任一项所述的表达系统，其中所述SGCG蛋白具有序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2，有利地是SEQ ID NO:1。

6.根据权利要求5所述的表达系统，其中编码所述SGCG蛋白的序列具有序列SEQ IDNO:3。

7.根据前述权利要求中任一项所述的表达系统，其中它包括SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6。

8.根据前述权利要求中任一项所述的表达系统，其中它包括病毒载体，有利地是腺相关病毒载体(AAV)，优选地是血清型8或9。

9.根据权利要求8所述的表达系统，其中它包括AAV2/8或AAV2/9载体。

10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的表达系统。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的表达系统或根据权利要求10所述的药物组合物，用于基因治疗。

12.根据权利要求1至9中任一项所述的表达系统或根据权利要求10所述的药物组合物，用于治疗由SGCG缺陷引起的病理。

13.根据权利要求12所述的表达系统或药物组合物，其中所述由SGCG缺陷引起的病理是肢带型肌营养不良症C型(LGMD2C或LGMD R5)。

14.根据权利要求12或13所述的表达系统或药物组合物，其中它被全身施用，优选地通过静脉注射。