JP7461687B2

JP7461687B2 - 筋強直性ジストロフィー１型治療薬

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Publication number: JP7461687B2
Application number: JP2023517588A
Authority: JP
Inventors: 雅之中森; 祐介八木; 崇喜今井; 英里香沖井; 喬之玉井; 理紗二宮
Original assignee: EDITFORCE, INC.
Current assignee: EDITFORCE, INC.
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2024-04-04
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN117597151A; IL308029A; JP2024069430A; JPWO2022230924A1; WO2022230924A1; CA3216313A1; TW202304948A; BR112023022129A2; KR20240004715A; EP4331619A1; AU2022265246A1

Description

本発明は、筋強直性ジストロフィー１型の治療用医薬組成物または治療方法に関する。

筋強直性ジストロフィー１型（ＭｙｏｔｏｎｉｃＤｙｓｔｒｏｐｈｙｔｙｐｅＩ、以下、「ＤＭ１」と略記する場合がある）は、成人で最も多い筋疾患である。ＤＭ１は、骨格筋、平滑筋とともに眼球、心臓、内分泌系、中枢神経系に影響する常染色体優性多臓器障害であり、その症状は、筋萎縮、筋力低下、筋強直（ミオトニア）、白内障、インスリン抵抗性、性腺機能低下、心伝導系障害、前部禿頭、知能障害等多岐にわたる。ＤＭ１はミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲ（３’側非翻訳領域）のＣＴＧ繰り返し配列の異常伸長が原因である。異常伸長したＣＵＧ繰り返し配列を持つ転写産物（ｍＲＮＡ）に特定のスプライシング制御因子が結合し、結果として正常なスプライシングに必要なスプライシング制御因子が不足することによりスプライシング異常を惹起する。

現在、低分子化合物や核酸医薬等、様々なアプローチでＤＭ１の治療薬の開発が進められている（例えば、非特許文献１、２）が、現段階で根本的な治療薬はなく、ＤＭ１の治療は主に対症療法にとどまっている。

Nakamori et al. Ann Clin Transl Neurol. (2015) Overby et al. Drug Discov. Today (2018)

本発明は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の治療に有効な医薬組成物または方法を提供することを課題とした。

ペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）タンパク質は、約３５アミノ酸長からなるＰＰＲモチーフの繰り返しを含むタンパク質であり、ＰＰＲモチーフ１つが１つの塩基と特異的または選択的に結合することが知られている。近年、ＰＰＲモチーフがＲＮＡ結合特性を発揮する際に機能するアミノ酸が同定され、ＰＰＲモチーフの構造と標的塩基との関係が明らかにされたことで、ＰＰＲタンパク質を利用したＲＮＡ編集／改変技術が開発されつつある（例えば、ＷＯ２０１３／０５８４０４）。

本発明者らは、ＤＭ１を治療し得る新規な化合物・物質を探索した結果、改変されたＰＰＲタンパク質を利用することによってＤＭ１を治療し得ることを見出した。

本発明は、上記知見に基づくものであり、以下の特徴を有してよい。

［１］：筋強直性ジストロフィー１型治療用の医薬組成物であって、
前記医薬組成物はＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸を含み、
前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質は、式１で表される３０～３８アミノ酸長のポリペプチドからなるペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを少なくとも６個含み、
（式１中：
ＨｅｌｉｘＡは、１２アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式２で表され、
式２中、Ａ_１～Ａ_１２はそれぞれ独立にアミノ酸を表し；
Ｘは、存在しないか、または、１～９アミノ酸長からなる部分であり；
ＨｅｌｉｘＢは、１１～１３アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり；
Ｌは、２～７アミノ酸長の、式３で表される部分であり；
式３中、各アミノ酸は、“ｉ”（－１）、“ｉｉ”（－２）、とＣ末端側からナンバリングされ、
ただし、Ｌ_ｉｉｉ～Ｌ_ｖｉｉは存在しない場合がある。）
前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせ、又はＡ_４、Ｌ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、前記の各ＰＰＲモチーフがＣ、ＵまたはＧに結合するように選択され、それにより前記タンパク質が前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するように構成されている、
医薬組成物。

［２］：［１］に記載の医薬組成物であって、前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質は、前記ＰＰＲモチーフを９～３０個含む、
医薬組成物。

［３］：［２］に記載の医薬組成物であって、前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質は、前記ＰＰＲモチーフを１２～２４個含む、
医薬組成物。

［４］：［１］～［３］のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ_１、Ａ_４、およびＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＡ（アデニン）である場合には、Ａ_１、Ａ_４、およびＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（バリン、トレオニン、アスパラギン）、（フェニルアラニン、セリン、アスパラギン）、（フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、または（トレオニン、トレオニン、アスパラギン）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ_１、Ａ_４、およびＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸）、（バリン、トレオニン、アスパラギン酸）、（リジン、トレオニン、アスパラギン酸）、または（ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ_１、Ａ_４、およびＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）、（フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸）、または（チロシン、プロリン、アスパラギン酸）であり；または、
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ_１、Ａ_４、およびＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（バリン、アスパラギン、セリン）、または（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）である、
医薬組成物。

［５］：［１］～［３］のいずれかに記載の医薬組成物であって、前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ_４およびＬ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＡ（アデニン）である場合には、Ａ_４およびＬ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン）、
（セリン、アスパラギン）、または（グリシン、アスパラギン）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ_４およびＬ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン酸）
または（グリシン、アスパラギン酸）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ_４およびＬ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン酸）、（プロリン、アスパラギン酸）、（メチオニン、アスパラギン酸）、または（バリン、トレオニン）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ_４およびＬ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン）、
（アスパラギン、セリン）、または（ロイシン、アスパラギン酸）である、
医薬組成物。

［６］：［１］～［５］のいずれかに記載の医薬組成物であって、
前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸が発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする、
医薬組成物。

［７］：［１］～［５］のいずれかに記載の医薬組成物であって、
前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸がウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、
医薬組成物。

［８］：［７］に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターが、筋組織に対する指向性を有するウイルスベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。

［９］：［８］に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または、単純ヘルペスウイルスベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。

［１０］：［９］に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。

［１１］：［１０］に記載の医薬組成物であって、
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクターまたはＡＡＶ１２ベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。

［１２］：［１］において定義されるＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。

［１３］：［１２］に記載の発現ベクターを含む、細胞。

［１４］：［１３］に記載の細胞から産生される、ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質。

［１５］：［１］において定義されるＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸を含む、ウイルス発現ベクター。

［１６］：［１５］に記載のウイルス発現ベクターを含む、細胞。

［１７］：［１６］に記載の細胞から産生される、ウイルスベクター。

［１８］：筋強直性ジストロフィー１型治療用の医薬の製造における、［１］において定義されるＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸の使用。

［１９］：筋強直性ジストロフィー１型の治療方法であって、
対象に治療上有効量の［１］に記載の医薬組成物を適用するステップを含む、
方法。

なお、上記の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。

本発明により、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）の症状を治療または軽減し得る。

図１は、本発明のＰＰＲタンパク質がＣＵＧリピート配列に特異的に結合したことを示す。図２は、本発明のＰＰＲタンパク質がＤＭ１モデル細胞においてＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成を抑制したことを示す。図３は、本発明のＰＰＲタンパク質がＤＭ１モデル細胞においてスプライシング異常を改善したことを示す。図４は、本発明のＰＰＲタンパク質がＤＭ１モデル動物において筋分化効率を改善したことを示す。図５は、本発明のＰＰＲタンパク質がＤＭ１モデル動物においてＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成を抑制したことを示す。図６は、本発明のＰＰＲタンパク質がＤＭ１モデル動物においてスプライシング異常を改善したことを示す。図７は、本発明のＰＰＲタンパク質がＤＭ１モデル動物における筋強直を改善したことを示す。図８は、本発明による異常スプライシングの改善効果と筋強直の改善効果との関連を示す。図９は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１がＤＭ１モデル動物において用量依存的にＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成を抑制したことを示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群、「ＬＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量投与群、「ＭＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量投与群、「ＨＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量投与群を示す。縦軸は、ＲＮＡ－ｆｏｃｉ陽性細胞率を示す。図１０は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１がＤＭ１モデル動物において用量依存的にスプライシング異常を改善したことを示す。左図はＣｌｃｎ１、右図はＡｔｐ２ａ１の異常スプライシング検出系における結果を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群、「ＬＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量投与群、「ＭＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量投与群、「ＨＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量投与群を示す。縦軸は、それぞれ正常スプライシングアイソフォームの含有率（％）を示す。図１１は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１がＤＭ１モデル動物において用量依存的に筋強直を改善したことを示す。縦軸はミオトニアスコアを示し、スコア３、２、１、０の順で筋強直放電の頻度は減少する。筋強直放電回数の頻度と重篤度は相関する。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群、「ＬＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量投与群、「ＭＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量投与群、「ＨＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量投与群を示す。図１２は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１の投与用量とＰＰＲｍＲＮＡ発現量との関係を示す。内部標準はＧＡＰＤＨを使用している。それぞれの個別点は各マウス個体の大腿筋におけるＰＰＲｍＲＮＡ発現量を示す。縦軸はＬｏｇ表示で表示している。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群、「ＬＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量投与群、「ＭＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量投与群、「ＨＤ」はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量投与群を示す。図１３は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１がＤＭ１モデル動物において時間依存的にＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成を抑制したことを示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群を示す。「２ｗ」「４ｗ」「８ｗ」「１６ｗ」は、それぞれＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後の試験期間を示す。縦軸はＲＮＡ－ｆｏｃｉ陽性細胞率を示す。図１４は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１がＤＭ１モデル動物において時間依存的にスプライシング異常を改善したことを示す。左図はＣｌｃｎ１、右図はＡｔｐ２ａ１の異常スプライシング検出系における結果を示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群を示す。「２ｗ」「４ｗ」「８ｗ」「１６ｗ」は、それぞれＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後の試験期間を示す。縦軸はそれぞれ正常スプライシングアイソフォームの含有率を示す。図１５は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１がＤＭ１モデル動物において時間依存的に筋強直を改善したことを示す。縦軸はミオトニアスコアを示し、スコア３、２、1、０の順で筋強直放電の頻度は減少する。筋強直放電回数の頻度と重篤度は相関する。図中、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ投与群を示す。「２ｗ」「４ｗ」「８ｗ」「１６ｗ」は、それぞれＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後の試験期間を示す。図１６は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後、包括的にスプライシング異常が正常化することを示す。図１６ａは、ＷＴとＰＢＳ投与ＨＳＡ－ＬＲマウス間で、ＰＳＩ（Ｐｅｒｃｅｎｔｓｐｌｉｃｅｄｉｎ）０．２以上の変化があったスプライシングイベント（左）が、ＰＰＲ投与ＨＳＡ－ＬＲマウス（右）でどのように変化したかを示した図である。図１６ｂは、Ｔａｎｎｅｒｅｔａｌ．（２０２１）において同定されたＤＭ１関連スプライシングイベントについての変化を示した図である。黒丸が正常マウスのシグナル、青四角がＰＢＳ投与した薬効マウス群のシグナル、赤三角がＰＰＲ投与薬効マウス群のシグナルを示す。図１６ｃは、ａ図の各点の遺伝子についてのＧｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ解析の結果を示す。Ｐ－ｖａｌｕｅは、各ＧｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙｔｅｒｍのＰ値を示す。ＰＰＲ投与ＨＳＡ－ＬＲマウスにおいて、エクソンスキッピング改善率が５０％より大きい，２０～５０％，２０％以下の３段階における遺伝子の数を表記している。図１７は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与マウスの各臓器におけるＰＰＲｍＲＮＡ発現量を示す。縦軸は１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ投与マウスの発現量を１とした時の相対発現量をＬｏｇ表示で示している。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現量を内部標準としている。横軸はＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与量（ｖｇ／ｋｇマウスの体重）を示している。それぞれのマウス個体の値を丸点でプロットしており、中央値を線で結んでいる。図１８は、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与マウスの各臓器におけるｍＲＮＡ発現の持続性を示す。縦軸はＡＡＶ投与２週（Ｄａｙ１４）マウス１個体の発現量を１とした時の相対発現量を表示している。ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現量を内部標準としている。横軸は、「Ｃｔｒｌ」はＰＢＳ群を示し、「１４」「２８」「５６」「１１２」「１８３」は投与後の日数を示している。それぞれのマウス個体の値を丸点でプロットしており、平均値を線で結んでいる。

［ＰＰＲモチーフ及びＰＰＲタンパク質］
本開示で「ＰＰＲモチーフ」というときは、特に記載した場合を除き、Ｗｅｂ上のタンパク質ドメイン検索プログラムでアミノ酸配列を解析した際に、ＰｆａｍにおいてＰＦ０１５３５、ＰｒｏｓｉｔｅにおいてＰＳ５１３７５で得られるＥ値が所定値以下（望ましくはＥ－０３）のアミノ酸配列をもつ３０～３８アミノ酸で構成されるポリペプチドをいう。本開示で定義するＰＰＲモチーフを構成するアミノ酸の位置番号は、ＰＦ０１５３５とほぼ同義である一方で、ＰＳ５１３７５のアミノ酸の場所から２引いた数（例；本発明の１番→ＰＳ５１３７５の３番）に相当する。ただし、“ｉｉ”（－２）番のアミノ酸というときは、ＰＰＲモチーフを構成するアミノ酸の後ろ（Ｃ末端側）から２番目のアミノ酸、又は次のＰＰＲモチーフの１番アミノ酸に対して２つＮ末端側、すなわち－２番目のアミノ酸とする。次のＰＰＲモチーフが明確に同定されない場合、次のヘリックス構造の１番目のアミノ酸に対して、２つ前のアミノ酸を“ｉｉ”とする。

ＰＰＲモチーフの保存アミノ酸配列は、アミノ酸レベルでの保存性は低いが、２次構造上で２つのαへリックスはよく保存されている。典型的なＰＰＲモチーフは３５アミノ酸で構成されるが、その長さは３０～３８アミノ酸と可変的である。

ＰＰＲモチーフの基本骨格は、式１で表されることが知られている。

（式中：
ＨｅｌｉｘＡは、１２アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式２で表され、

式２中、Ａ_１～Ａ_１２はそれぞれ独立にアミノ酸を表し；
Ｘは、存在しないか、または、１～９アミノ酸長からなる部分であり；
ＨｅｌｉｘＢは、１１～１３アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり；
Ｌは、２～７アミノ酸長の、式３で表される部分であり；

式３中、各アミノ酸は、“ｉ”（－１）、“ｉｉ”（－２）、とＣ末端側からナンバリングされ、
ただし、Ｌ_ｉｉｉ～Ｌ_ｖｉｉは存在しない場合がある。

本開示で「ＰＰＲタンパク質」というときは、特に記載した場合を除き、上述のＰＰＲモチーフを、１個以上、好ましくは２個以上有するＰＰＲタンパク質をいう。本開示で「タンパク質」というときは、特に記載した場合を除き、ポリペプチド（複数のアミノ酸がペプチド結合した鎖）からなる物質全般をいい、比較的低分子のポリペプチドからなるものも含まれる。本発明で「アミノ酸」という場合、通常のアミノ酸分子を指すことがあるほか、ペプチド鎖を構成しているアミノ酸残基を指すことがある。いずれを指しているかは、文脈から、当業者には明らかである。

本開示で、ＰＰＲモチーフのＲＮＡ塩基との結合性に関し、「選択的」または「特異的」というときは、特に記載した場合を除き、ＲＮＡ塩基のいずれか一つの塩基に対する結合活性が、他の塩基に対する結合活性より高いことをいう。この選択性または特異性は、当業者であれば公知の方法に基づいて実験を企画し、確認することができるほか、当業者が計算により求めることもできる。

本開示でＲＮＡ塩基というときは、特に記載した場合を除き、ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの塩基を指し、具体的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、又はウラシル（Ｕ）のいずれかをいう。なおＰＰＲタンパク質は、ＲＮＡ中の塩基に対して選択性を有しうるが、核酸モノマーに結合するわけではない。

ＰＰＲタンパク質は植物に多く存在し、シロイヌナズナでは５００タンパク質、約５０００モチーフが見いだせる。イネ、ポプラ、イワヒバ等、多くの陸上植物にも多様なアミノ酸配列のＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質が存在する。本発明においては、自然界に存在するＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質を用いてもよいし、例えばＷＯ２０１３／０５８４０４に開示された方法に基づいて設計されたＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質を利用してもよい。具体的には、ＷＯ２０１３／０５８４０４に開示された以下の情報に基づいて、所望のＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質を設計することができる。

（Ｉ）選択的結合のために重要なアミノ酸の位置に関する情報
ＰＰＲモチーフの、１、４、“ｉｉ”（－２）番の３つのアミノ酸の組み合わせ（Ａ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）、又は４、“ｉｉ”（－２）番の２つのアミノ酸の組み合わせ（Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）が、ＲＮＡ塩基との選択的な結合のために重要であり、これらの組み合わせにより、結合するＲＮＡ塩基がいずれであるかを決定できる。

本発明は、ＷＯ２０１３／０５８４０４に開示された、Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせ、および／またはＡ_４、及びＬ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせに関する知見を利用することができる。

（ＩＩ）Ａ _１、Ａ _４、及びＬｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせとＲＮＡ塩基との対応に関する情報
（３－１）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン及びアスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣに、その次にＡ又はＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－２）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧに、その次にＣに対して結合するが、Ｕには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－３）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＡ又はＵに対して結合するが、Ｇには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－４）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合するが、Ａ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－５）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵに、その次にＡに対して結合するが、Ｇには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－６）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＵに対して結合するが、ＡとＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－７）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、リジン、トレオニン、アスパラギン酸、の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＡに対して結合するが、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－８）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、セリン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＣに、その次にＧ及びＵに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－９）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、バリン、アスパラギン、セリンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵに対して結合するが、Ａ及びＧには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１０）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合するが、Ｇ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１１）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＡに対して結合するが、Ｇ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１２）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、トレオニン、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合するが、Ｇ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１３）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣに対して結合するが、Ａ及びＧには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１４）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸の場合ＰＰＲ、そのモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣに対して結合するが、Ａ及びＧには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１５）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、チロシン、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合するが、Ａ、Ｇ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（３－１６）Ａ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、順に、ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合するが、Ａ、Ｕ及びＣには結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。

（ＩＩ）Ａ _４、及びＬ _ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせとＲＮＡ塩基との対応に関する情報
（２－１）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、アスパラギン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＣ、その次にＡ及びＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－２）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、アスパラギン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵ、その次にＡ及びＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－３）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、トレオニン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧ、Ｕ及びＣに対して弱く結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－４）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、トレオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＡ、Ｕ及びＣに対して弱く結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－５）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、セリン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧ、Ｕ及びＣに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－６）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、グリシン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｇに強く結合し、次にＵ、その次にＡと結合するが、Ｃに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－７）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、アスパラギン、セリンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵ、その次にＡ及びＧに対して結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－８）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、プロリン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＧ、Ｃ及びＣに対して結合するが、Ａに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－９）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、グリシン、アスパラギンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ａに強く結合し、次にＧに対して結合するが、Ｃ及びＵに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－１０）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、メチオニン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＡ、Ｇ及びＣに対して弱く結合するという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－１１）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、ロイシン、アスパラギン酸の場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｃに強く結合し、次にＵに対して結合するが、Ａ及びＧに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。
（２－１２）Ａ_４、Ｌ_ｉｉが、順に、バリン、トレオニンの場合、そのＰＰＲモチーフは、Ｕに強く結合し、次にＡに対して結合するが、Ｇ及びＣに結合しないという、選択的なＲＮＡ塩基結合能を有する。

なお、上記の法則性は、ＰＰＲモチーフの（Ａ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）または（Ａ_４、Ｌ_ｉｉ）のアミノ酸の組み合わせにより、ＰＰＲモチーフが標的の塩基に結合する可能性を統計学的に有意に高め得ることを意味し、上記の法則によって１００％の確率で標的の塩基（または塩基配列）に結合するＰＰＲモチーフ（またはＰＰＲタンパク質）を製造し得る訳ではない。ただし、当業者であれば、上記の法則性に基づいて数種類～数十種類程度の候補ＰＰＲタンパク質を製造することで、高い確率で標的の塩基（または塩基配列）に結合するＰＰＲモチーフ（またはＰＰＲタンパク質）を取得することができる。なお、候補ＰＰＲタンパク質の製造および確認を通じた所望のＰＰＲタンパク質の選択は、当業者が通常の試行錯誤の範囲内において行い得るものであり、当業者に過度の負担となるものではない。

［ＰＰＲモチーフおよびＰＰＲタンパク質の利用］
１つのＰＰＲモチーフは、ＲＮＡの特定の塩基を認識しうる。そして、本発明に基づけば、特定の位置のアミノ酸を適切に選択することで、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃそれぞれに選択的なＰＰＲモチーフを選択または設計することができる。さらに、そのようなＰＰＲモチーフの適切な連続を含むタンパク質は、対応する塩基配列を特異的または選択的に認識しうる。さらに、上述の知見により、所望のＲＮＡ塩基に選択的に結合可能なＰＰＲモチーフ、および所望のＲＮＡに配列特異的に結合可能な、複数個のＰＰＲモチーフを有するタンパク質を設計することができる。設計に際し、ＰＰＲモチーフ中の重要な位置のアミノ酸以外の部分は、天然型のＰＰＲモチーフの配列情報を参考にしてもよい。また、全体として天然型のＰＰＲモチーフを用い、前記の重要な位置のアミノ酸だけを置換することにより、設計してもよい。ＰＰＲモチーフの繰り返し数は、標的配列に応じ、適宜とすることができるが、例えば２個以上とすることができ、２～３０個とすることができる。

［ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するＰＰＲタンパク質］
本発明は、ＤＭ１の原因となる異常伸長したＣＵＧリピート配列を含むｍＲＮＡに特異的に結合するＰＰＲタンパク質に関する。本発明に係るＰＰＲタンパク質は、前述の理論に基づいて、［Ｃに結合するＰＰＲモチーフ、Ｕに結合するＰＰＲモチーフ、Ｇに結合するＰＰＲモチーフ］のセットを、複数連結させることで作製することができる。なお、本発明に係るＰＰＲタンパク質の最初のＰＰＲモチーフが必ずしもＣに結合するＰＰＲモチーフである必要はなく、ＰＰＲタンパク質全体としてＣＵＧリピート配列に特異的に結合する限り、最初のＰＰＲモチーフはＵに結合するＰＰＲモチーフであってもＧに結合するＰＰＲモチーフであってもよい。また、当然ながら、本発明に係るＰＰＲタンパク質が全体としてＣＵＧリピート配列に特異的に結合する構成となっている限り、ＰＰＲタンパク質に含まれるＰＰＲモチーフの数が３の倍数である必要もない。

本発明において用いてよいＣ結合性ＰＰＲモチーフの非限定的な例として、以下の配列を有するＰＰＲモチーフを挙げることができる。

本発明においては、上記の配列のＡ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸、またはＡ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸が保存されるという条件で、上記の配列と８０％以上（好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列相同性（または、配列同一性）を有し、Ｃに対する結合性を有するＰＰＲモチーフを用いてもよい。

本発明においては、上記の配列のＡ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸、またはＡ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸が保存されるという条件で、上記の配列に対して７塩基以内（すなわち、１、２、３、４、５、６、または７塩基）の置換、付加、および／または欠失を有し、Ｃに対する結合性を有するＰＰＲモチーフを用いてもよい。なお、アミノ酸の置換は、例えば本分野において知られているアミノ酸の保存的置換であってよい。

本発明において用いてよいＵ結合性ＰＰＲモチーフの非限定的な例として、以下の配列を有するＰＰＲモチーフを挙げることができる。

本発明においては、上記の配列のＡ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸、またはＡ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸が保存されるという条件で、上記の配列と８０％以上（好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列相同性（または、配列同一性）を有し、Ｕに対する結合性を有するＰＰＲモチーフを用いてもよい。

本発明においては、上記の配列のＡ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸、またはＡ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸が保存されるという条件で、上記の配列に対して７塩基以内（すなわち、１、２、３、４、５、６、または７塩基）の置換、付加、および／または欠失を有し、Ｕに対する結合性を有するＰＰＲモチーフを用いてもよい。なお、アミノ酸の置換は、例えば本分野において知られているアミノ酸の保存的置換であってよい。

本発明において用いてよいＧ結合性ＰＰＲモチーフの非限定的な例として、以下の配列を有するＰＰＲモチーフを挙げることができる。

本発明においては、上記の配列のＡ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸、またはＡ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸が保存されるという条件で、上記の配列と８０％以上（好ましくは、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列相同性（または、配列同一性）を有し、Ｇに対する結合性を有するＰＰＲモチーフを用いてもよい。

本発明においては、上記の配列のＡ_１、Ａ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸、またはＡ_４、Ｌ_ｉｉ位のアミノ酸が保存されるという条件で、上記の配列に対して７塩基以内（すなわち、１、２、３、４、５、６、または７塩基）の置換、付加、および／または欠失を有し、Ｇに対する結合性を有するＰＰＲモチーフを用いてもよい。なお、アミノ酸の置換は、例えば本分野において知られているアミノ酸の保存的置換であってよい。

本発明で塩基配列（ヌクレオチド配列ということもある。）又はアミノ酸配列に関し「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致した塩基又はアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、有償または無償で頒布されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３－４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列又はアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＣｌｕｓｔａｌＷ）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。

アミノ酸の保存的置換とは、例えば性質の似たアミノ酸への置換であってよい。性質の似たアミノ酸とは、例えばハイドロパシー、荷電、ｐＫａ、溶解性等の物性が似ているアミノ酸をいい、例えば、次のようなものを指す。
・疎水性アミノ酸；アラニン、バリン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン；
・非疎水性アミノ酸；アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、トレオニン、システイン、ヒスチジン；
・親水性アミノ酸；アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、セリン、トレオニン；
・酸性アミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；
・塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；
・中性アミノ酸：アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン；
・含硫アミノ酸：メチオニン、システイン；
・含芳香環アミノ酸：チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン。

［本発明によるＤＭ１の治療］
本発明の効果は、本発明のＰＰＲタンパク質が対象の細胞内において異常伸長したＣＵＧリピート配列を含むｍＲＮＡに結合することにより発揮される。対象の細胞内へのＰＰＲタンパク質の送達手段は限定されず、本発明のＰＰＲタンパク質をコードする核酸を対象の細胞内へ送達し、対象の細胞内で本発明のＰＰＲタンパク質を発現させてもよいし、本発明のＰＰＲタンパク質自体を対象の細胞内へ送達してもよい。タンパク質や核酸の送達手段は限定されず、本分野において知られている様々な手段を用いることができる。本発明に用いることができる、対象の細胞内への核酸またはタンパク質の送達手段の非限定的な例としては、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、高分子ミセル、エマルジョン、高分子マイクロカプセル、抗体－核酸複合体、抗体－薬物複合体、ウイルス、等を挙げることができる。

本発明に用いてよいウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または、単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができ、細胞または組織への指向性、宿主ゲノムへの核酸組み込みの要否等によって、当業者が適宜選択することできる。

ＡＡＶベクターは分裂細胞と静止状態の細胞の何れにも感染できる能力があり、遺伝物質を非常に多様な細胞種に移送することができるため、本発明において特に好適に用いることができる。現在までにＡＡＶの１２種類の血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）が報告されており、既知の血清型のすべてが様々な種類の組織細胞に感染することができる。本発明に用いてよいＡＡＶベクターの血清型は限定されないが、例えば筋組織（骨格筋、心筋、および／または平滑筋）に対する指向性を有することが知られている、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクターまたはＡＡＶ１２ベクターを用いてよい。

本発明を用いたＤＭ１の治療は、ＤＭ１に罹患する対象の生体内に本発明を直接適用する態様（ｉｎｖｉｖｏ）であってもよく、本発明を用いて生体外で細胞または組織を処理し、対象の生体内に導入する態様（ｅｘｖｉｖｏ）であってもよい。

本発明のＰＰＲタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターの製造方法は限定されず、当業者が常法（例えば、市販のタンパク質発現ベクター製造キットの使用、市販のウイルス発現ベクター製造キットの使用、製造業者への委託、等）により製造することができる。

本発明のＰＰＲタンパク質の製造方法は限定されないが、例えば、本明細書に記載の方法によって設計されたＰＰＲタンパク質をコードする発現ベクター（例えば、プラスミド、トランスポゾン、ウイルス、等）を含む細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母、等）から、常法によってＰＰＲタンパク質を選択的に抽出および／または精製することにより、所望のＰＰＲタンパク質を得ることができる。

本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

[実施例１：ＣＵＧ繰り返しＲＮＡ配列に結合するＰＰＲタンパク質の作製及びＲＮＡに対する結合解析]

ＣＵＧ繰り返しＲＮＡ配列に結合するＰＰＲタンパク質（以降、ＣＵＧ－ＰＰＲと略する。）の作製、及びその結合解析のために組換えタンパク質を作製し、ＲＮＡ結合実験を実施した。

＜実験材料および方法＞
（１）ＰＰＲ発現プラスミドベクターの調製
大腸菌発現プラスミドベクターｐＥＴ－２２ｂのＭｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅへ、ルシフェラーゼ、ＰＰＲタンパク質、３ｘヘキサヒスチジンタグの順番で融合した遺伝子をクローニングした。融合遺伝子の発現はＴ７プロモーターに制御される。ＰＣＲ法にて正しいサイズの遺伝子のクローニングを確認し、遺伝子配列をシーケンシングにて確認をした（配列番号１１～１４）。Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１、Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２、Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ３、Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ４とし、以降の試験に用いた。

上記の表１中のＰＰＲタンパク質に含まれるＰＰＲモチーフの配列の詳細を以下に示す。いずれのＰＰＲタンパク質も１８個のＰＰＲモチーフを含む。

（２）ＰＰＲタンパク質の調製
上記で構築した発現プラスミドベクターを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株へ遺伝子導入した。この大腸菌を２ｍＬの１００μｇ／μＬアンピシリン入りＬＢ培地で３７℃で１２時間培養した。ＯＤ_６００が、０．５から０．８に到達した時に１５℃のインキュベーターに培養液を移し、３０分間静置させた。その後、１００μＬ（終濃度０．１ｍＭＩＰＴＧ）を加え、１５℃で１６時間培養を行った。５，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、大腸菌ペレットを回収し、１．５ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭＰＭＳＦ、２μｌのＤＮａｓｅ）を添加し、－８０℃で２０分間凍結させた。２５℃、３０分間振盪しながら細胞の凍結破砕を実施した。続いて、３７００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心操作を行い、可溶性のＰＰＲタンパク質を含む上清（大腸菌ライセート）を回収し、以下の実験に用いた。

（３）ＰＰＲタンパク質のＲＮＡへの結合試験
ＰＰＲタンパク質とＲＮＡとの結合試験は、ストレプトアビジンプレート上でのＰＰＲタンパク質とビオチン化ＲＮＡとの結合実験方法を用いて実施した。標的であるＣＵＧ×７配列を含む３０塩基のＲＮＡ（GACACUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGAUGCA（配列番号１５））、並びに非標的であるＣＡＧ×６を含む３０塩基のＲＮＡ（GACAUGCCAGCAGCAGCAGCAGCAGGACUG（配列番号１６））に、５’末端にビオチンを修飾したＲＮＡプローブをそれぞれ合成した（Ｇｒｅｉｎｅｒ社に依頼）。２．５ｐｍｏｌビオチン化ＲＮＡプローブをストレプトアビジンコーティングプレート（ＣａｔＮｏ．１５５０２、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に添加し、３０分間、室温で反応させた。プローブ洗浄バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭＤＴＴ、０．１％ＢＳＡ）で洗浄した。バックグラウンド測定のために、ビオチン化ＲＮＡを加えずに溶解バッファーを加えたウェルも準備した（“－Ｐｒｏｂｅ”とする）。その後、ブロッキングバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭＤＴＴ、１％ＢＳＡ）を加え、３０分間、室温でプレート表面のブロッキングを行った。１．５×１０^８ＬＵ／μＬ発光量を有するルシフェラーゼ融合ＰＰＲタンパク質が含まれる大腸菌ライセートを１００μＬをウェルに添加し、３０分間、室温で結合反応を行った。２００μＬの洗浄バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭＤＴＴ）で５回洗浄を行い、洗浄バッファーを用いて２５００倍に希釈したルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５１Ａ）４０μＬをウェルへ加えて５分間反応させた後、発光量をプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＣａｔＮｏ．５１０３－３５）で測定した。

＜結果＞
結果を図１に示した。Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１、Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２、Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ３、Ｌｕｃ－ＣＵＧ－ＰＰＲ４の全てについて、ＣＵＧプローブに対する結合性を有し、ＣＡＧプローブには結合性を有しなかった。すなわち、いずれのＰＰＲタンパク質も、ＣＵＧリピート配列に対する高い結合特異性を有していた。

[実施例２：ＤＭ１モデル細胞におけるＲＮＡ凝集体形成に対するＰＰＲの効果]
ＤＭ１モデル細胞にＰＰＲタンパク質を作用させ、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法にてＲＮＡ凝集体の数を測定した。

＜実験材料および方法＞
（１）ＤＭ１モデル細胞
ＤＭ１細胞モデルとして、Ｃ２Ｃ１２細胞に８００ＣＴＧリピートを含むＤＭＰＫ遺伝子領域を導入した細胞（Ｃ２Ｃ１２－ＤＭＰＫ８００Ｒ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４２（１０），６５９１－６６０２）を使用した。Ｃ２Ｃ１２－ＤＭＰＫ８００は以下の手順で作製した。すなわち、ＤＭＰＫ遺伝子３’非翻訳領域に８００ＣＴＧを挿入した配列を含むプラスミド（ｐＬＣ１６）とＰｈｉＣ３１インテグラーゼを発現するプラスミドを、共にマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２にＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商品名、Ｌｏｎｚａ社）を用いてトランスフェクションした後、ピューロマイシンを添加した選択培地を用いて安定発現株を選択した。続いて、安定発現株にＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドをトランスフェクションし、ハイグロマイシンを添加した選択培地を用いて、８００のＣＵＧリピートをもつｍＲＮＡの転写が誘導されるクローンを選択した。

（２）細胞トランスフェクション用のＰＰＲタンパク質発現プラスミドベクターの作製
哺乳類発現プラスミドベクターへ、順に緑色蛍光タンパク質ｍＣＬｏｖｅｒ３遺伝子、ＰＰＲタンパク質遺伝子、３×核局在性シグナル、３×ＦＬＡＧエピトープタグの融合遺伝子をクローニングした。融合遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ｐｏｌｙ－Ａシグナルにより制御される。ＰＣＲ法にて正しいサイズの遺伝子のクローニングを確認し、遺伝子の配列をシーケンシングにて確認をした。また、コントロールとしてＰＰＲタンパク質遺伝子を含まない融合遺伝子、即ち、緑色蛍光タンパク質ｍＣＬｏｖｅｒ３遺伝子、３×核局在性シグナル、３×ＦＬＡＧエピトープタグの融合遺伝子についても同手法にて調製を行なった。順に、ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１，ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２，ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ３，ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ４，ｍＣLｏ－ｅｍｐｔｙとし、以降の試験に用いた。なお、各発現プラスミドベクターにおいてコードされるＰＰＲタンパク質（ＰＰＲ１～ＰＰＲ４）の配列は、表１に記載の各ＰＰＲタンパク質の配列と同一である。

（３）ＲＮＡ凝集体形成数の計測
ＤＭ１モデル細胞は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。上記で構築した２００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、０．６μＬＦｕｇｅｎｅ（登録商標）－ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２３１１）、２００μＬＯｐｔｉ－ＭＥＭを混ぜ合わせ、全量ウェルへ加え、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で７２時間培養したのちに３％パラホルムアルデヒドで１５分間室温にて固定した。固定後、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで５分間透過処理した。次に３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで１０分間プレハイブリダイゼーション処理した。その後、３０％ホルムアミド、２μｇ／ｍＬＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬｙｅａｓｔｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル複合体（ｖａｎａｄｙｌｃｏｍｐｌｅｘ）、１ｎｇ／μＬＴｅｘａｓＲｅｄＣＡＧｐｒｏｂｅ含有の２×ＳＳＣバッファーで３７℃、１時間ハイブリダイゼーション処理した。３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで４２℃、３０分間ポストハイブリダイゼーション処理した後に、１×ＳＳＣバッファーで１回洗浄し、その後にＰＢＳで２回洗浄した。ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｗｉｔｈＤＡＰＩ（商品名、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて固定した後、蛍光顕微鏡（ＫｅｙｅｎｃｅＰＺ－９０００）で核内のＲＮＡ凝集体の数を計測した。

＜結果＞
結果を図２に示した。図２から明らかなように、未処理群のＤＭ１モデル細胞では、ＲＮＡ凝集体陽性細胞率が４０％を超えていたが、ＰＰＲタンパク質を適用した４実験群では、ＲＮＡ凝集体陽性細胞率は有意に低下した。

[実施例３：ＤＭ１モデル細胞におけるスプライシング異常に対するＰＰＲタンパク質の効果]
ＤＭ１モデル細胞にＰＰＲタンパク質を適用し、Ａｔｐ２ａ１遺伝子のｅｘｏｎ２２におけるスプライシング異常が改善するか否かを検証した。

＜実験材料および方法＞
（１）ＤＭ１モデル細胞
実施例２と同じＤＭ１モデル細胞（Ｃ２Ｃ１２－ＤＭＰＫ８００Ｒ）を使用した。

（２）ＰＰＲタンパク質
実施例２と同じ発現プラスミドベクターを使用した。

（３）スプライシング産物の定量
ＤＭ１モデル細胞に実施例２と同手法にてＰＰＲタンパク質発現プラスミドベクターを遺伝子導入し、７２時間後にＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＰｌｕｓＫｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。コントロールとして、ＰＰＲタンパク質発現プラスミドベクターを遺伝子導入していないＤＭ１モデル細胞を用い、同様にｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｍｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅＨ処理した後、以下のＡｔｐ２ａ１ｅｘｏｎ２２ＲＴプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄを用いて染色した後、イメージアナライザー（ＣｈｅｍｉＤｏｃＴｏｕｃｈイメージングシステム、ＢｉｏＲａｄ）で正常型のＰＣＲ産物と異常型のＰＣＲ産物をそれぞれ定量した。
Ａｔｐ２ａ１ｅｘｏｎ２２ＲＴプライマー
Ｆｗ： GCTCATGGTCCTCAAGATCTCAC （配列番号２２）
Ｒｖ： GGGTCAGTGCCTCAGCTTTG （配列番号２３）

＜結果＞
結果を図３に示した。下段はＲＴ－ＰＣＲ産物の電気泳動の結果であり、上段はＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を示すグラフである。ＰＰＲタンパク質未処理群では異常型の比率が正常型より多かった。ＰＰＲタンパク質を作用させることにより、ＤＭ１モデル細胞における正常型の比率が有意に増加し、スプライシング異常が改善することが示された。

[実施例４：ＤＭ１モデル細胞における筋分化異常に対するＰＰＲタンパク質の効果]
ＤＭ１モデル細胞にＰＰＲタンパク質を作用させ、ＤＭ１モデル細胞の筋分化効率が改善するか否かを検証した。

（２）ＰＰＲタンパク質
実施例２と同じＰＰＲタンパク質の発現プラスミドベクターを使用した。

（３）筋分化効率の定量
ＤＭ１モデル細胞に実施例２と同手法にてＰＰＲタンパク質発現プラスミドベクターを遺伝子導入した。翌日に分化培地に交換をし、トランスフェクション７２時間後にＤＡＰＩのよる核染色、並びに抗ＭｙＨＣ抗体を用いた抗体染色を実施した。まず抗体染色され、さらに細胞内の核数が２以上の細胞を筋管細胞と定め、観測視野で確認された筋管細胞中の核の総数を計測した（以下、値Ａとする。）。続いて、前文の筋管細胞だけでなく、未分化細胞も含んだ視野全体の核の総数を計測する（以下、値Ｂとする。）。Ｆｕｓｉｏｎｉｎｄｅｘは、値Ａを値Ｂで除した百分率を表し、筋分化効率を意味する。

＜結果＞
結果を図４に示した。空ベクター投与群（図中で“ｎｏ”と表示）ではＦｕｓｉｏｎｉｎｄｅｘは３程度を示した。一方、ＰＰＲ投与群ではいずれもＦｕｓｉｏｎｉｎｄｅｘが５～１５程度であり、筋分化効率の有意な改善が認められた。

[実施例５：ＤＭ１モデルマウスにおけるＰＰＲの効果]
ＤＭ１モデルマウスにＣＵＧ－ＰＰＲ遺伝子を搭載したＡＡＶ６を前脛骨筋へ単回投与し、前脛骨筋における筋強直症状に対する効果、Ａｔｐ２ａ１遺伝子と骨格筋型クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果、並びにＲＮＡ凝集体形成数を検証した。

＜実験材料および方法＞
（１）使用動物
ＤＭ１モデルマウスとしてＨＳＡ^ＬＲマウス（Ｄｒ．ＣｈａｒｌｅｓＴｈｏｒｎｔｏｎ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＲｏｃｈｅｓｔｅｒ）より譲渡され、大阪大学の実験動物施設で繁殖させたもの）を使用した。ＨＳＡ^ＬＲマウスはｈＡＣＴＡ遺伝子（筋細胞で恒常的に発現するヒト遺伝子）３’側非翻訳領域にＣＴＧ反復配列を２２０回に伸長したものをゲノム中に組み込んだトランスジェニック動物で、筋細胞でＣＵＧ配列が伸長したｍＲＮＡが発現することによって、ＤＭ１の症状が現れる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９（５４８５），１７６９－７３）。コントロールとして、野生型マウス（ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウス、日本クレアより購入）を使用した。実験には、１４週齢の雌雄マウスを用いた。

（２）ＰＰＲタンパク質
（ＡＡＶベクターの製造）
ＡＡＶベクター（ＡＡＶｐｒｏ（商標）ＨｅｌｐｅｒＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ６），Ｔａｋａｒａ，６６５１構成品）のマルチクローニングサイトに、順に、緑色蛍光タンパク質ｍＣＬｏｖｅｒ３、ＰＰＲタンパク質、３×核局在シグナル、３×ＦＬＡＧエピトープタグが順に融合した遺伝子を挿入した。ＰＣＲでの構築遺伝子の発現サイズの確認、およびシーケンシングによって挿入配列の確認を行なった。ＣＭＶプロモーター、およびＨｕｍａｎｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｐｏｌｙＡシグナルにより融合遺伝子の発現は制御される。

（ＡＡＶベクターの調製）
前項で構築したＡＡＶベクターをｐＲＣ６ベクター、並びにｐｈｅｌｐｅｒベクター（共にＡＡＶｐｒｏ（商標）ＨｅｌｐｅｒＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ（ＡＡＶ６），Ｔａｋａｒａ，６６５１の構成品）のそれぞれ２０μｇをＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，Ｌｉｎｅａｒ，ＭＷ２５０００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，２３９６６－１）を用いて２．５×１０^８細胞数のＡＡＶｐｒｏ（商標）ＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｌｉｎｅ（Ｔａｋａｒａ，６３２２７３）に遺伝子導入した。トランスフェクション３日後にＡＡＶ産生細胞を取得した。ＡＡＶ精製はＡＡＶｐｒｏ（商標）ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＭａｘｉ（ａｌｌｓｅｒｏｔｙｐｅ）（Ｔａｋａｒａ，６６６６）を用いた。ＡＡＶｐｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎｋｉｔｆｏｒｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ，６２３３）を用いてタイター測定を実施し、５×１０^１１ｖｇ／ｍＬにＤ－ＰＢＳで希釈し投与溶液とした。順に、ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１、ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２、ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ｅｍｐｔｙとし、以降の試験に用いた。なお、各ＡＡＶベクターにおいてコードされるＰＰＲタンパク質（ＰＰＲ１、ＰＰＲ２）の配列は、表１に記載の各ＰＰＲタンパク質の配列と同一である。

（３）群分け、投与スケジュール
ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与ＤＭ１群、ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２投与ＤＭ１群、ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ｅｍｐｔｙ投与ＤＭ１群、ＰＢＳ投与ＤＭ１群の４群を設けた（各群ｎ＝５（♂３、♀２の左右の肢を使用）。ＡＡＶの投与量は１×１０^１０ｖｇ／ｌｅｇとし、単回投与した。ＰＢＳ投与ＤＭ１群には、同容量のＰＢＳを単回投与した。

（４）ＲＮＡ凝集体形成数の計測
最終投与の５６日後に、マウスから前脛骨筋を採取し切片を作製した。ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで５分間透過処理した。次に３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで１０分間プレハイブリダイゼーション処理した。その後、３０％ホルムアミド、２μｇ／ｍＬＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬｙｅａｓｔｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル複合体（ｖａｎａｄｙｌｃｏｍｐｌｅｘ）、１ｎｇ／μＬＴｅｘａｓＲｅｄＣＡＧｐｒｏｂｅ含有の２×ＳＳＣバッファーで３７℃、１時間ハイブリダイゼーション処理した。３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで４２℃、３０分間ポストハイブリダイゼーション処理した後に、１×ＳＳＣバッファーで１回洗浄し、その後にＰＢＳで２回洗浄した。ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｗｉｔｈＤＡＰＩ（商品名、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて固定した後、蛍光顕微鏡（ＫｅｙｅｎｃｅＰＺ－９０００）で核内のＲＮＡ凝集体の数を計測した。

（５）スプライシング産物の定量
最終投与の５６日後に、マウスから前脛骨筋を採取した。ＴＲＩＲｅａｇｅｎｔ（商品名、ＭＲＣ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｍｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅＨ処理した後、実施例２と同様のＡｔｐ２ａ１ｅｘｏｎ２２ＲＴプライマーと、以下のＣｌｃｎ１ｅｘｏｎ７ａＲＴプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄを用いて染色した後、イメージアナライザー（ＣｈｅｍｉＤｏｃＴｏｕｃｈイメージングシステム、ＢｉｏＲａｄ）で正常型のＰＣＲ産物と異常型のＰＣＲ産物をそれぞれ定量し、ＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を算出した。統計解析にはｔ－ｔｅｓｔを用いた。
Ｃｌｃｎ１ｅｘｏｎ７ａＲＴプライマー
Ｆｗ：TGAAGGAATACCTCACACTCAAGG （配列番号２４）
Ｒｖ：CACGGAACACAAAGGCACTG （配列番号２５）

（６）筋強直（ミオトニア）の測定
最終投与の５６日後に、麻酔下にてマウス前脛骨筋の電気的筋強直現象を針筋電図で解析した。具体的には、マウス前脛骨筋へ２０回の針電極を刺入した時の電気的筋強直現象の発生頻度を次の４段階に分けて評価した。
重症度０：電気的筋強直現象が全くみられない。
重症度１：全体の５０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
重症度２：全体の５０％以上、９０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
重症度３：電気的筋強直現象が９０％以上みられる。

＜結果＞
ＲＮＡ－ｆｏｃｉの解析結果を図５に示した。ＰＢＳ投与群とＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ｅｍｐｔｙ投与群ではＲＮＡ－ｆｏｃｉの陽性細胞率が３０％程度を示した。一方、ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１、並びにＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２投与群では有意なＲＮＡ－ｆｏｃｉ陽性率の減少が認められた。

スプライシング異常の評価結果を図６に示した。Ａｔｐ２ａ１について、ＰＢＳ投与ＤＭ１群、並びにＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－Ｅｍｐｔｙ投与ＭｙｏＤ群では、正常型の割合が約６０％を示した。ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与ＤＭ１群とＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２投与ＤＭ１群では、正常型ＲＴ－ＰＣＲ産物の割合が有意に増加したことから、ＰＰＲタンパク質投与によりＡｔｐ２ａ１遺伝子のスプライシング異常が改善されることが明らかになった。Ｃｌｃｎ１についても同様にＰＰＲ投与によりＣｌｃｎ１遺伝子のスプライシング異常が改善されることが認められた。

筋強直の解析結果を図７に示した。ＰＢＳ投与群とＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ｅｍｐｔｙ投与群は５匹中５匹ともに重症度２の筋強直が検出された。ＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ１とＡＡＶ６－ｍＣＬｏ－ＣＵＧ－ＰＰＲ２投与ＤＭ１投与群ではいずれも５匹中２匹が重症度１、残りに３匹が重症度２を示した。また、改善した２例はＣｌｃｎ１のスプライシング異常改善効果が高い実験群であった（図８）。

以上の結果より、本発明によってＣＴＧ反復配列の異常伸長に基づくスプライシング異常が改善され、その結果ＤＭ１における筋強直症状が改善されることが示された。

［実施例６：ＤＭ１モデルマウスを用いた薬効の用量依存性試験］
ＤＭ１モデルマウスを用いた薬効の用量依存性を評価するために、ＤＭ１モデルマウスにＣＵＧ－ＰＰＲ遺伝子を搭載したＡＡＶ９を３×１０^１３，１×１０^１４，３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ量をそれぞれ尾静脈内へ単回投与し、大腿筋における筋強直症状に対する効果、Ａｔｐ２ａ１遺伝子と骨格筋型クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果、並びにＲＮＡ凝集体形成数を検証した。

＜実験材料および方法＞
（１）使用動物
ＤＭ１モデルマウスとしてＨＳＡ^ＬＲマウス（Ｄｒ．ＣｈａｒｌｅｓＴｈｏｒｎｔｏｎ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＲｏｃｈｅｓｔｅｒ）より譲渡され、大阪大学の実験動物施設で繁殖させたもの）を使用した。ＨＳＡ^ＬＲマウスはｈＡＣＴＡ遺伝子（筋細胞で恒常的に発現するヒト遺伝子）３’側非翻訳領域にＣＴＧ反復配列を２２０回に伸長したものをゲノム中に組み込んだトランスジェニック動物で、筋細胞でＣＵＧ配列が伸長したｍＲＮＡが発現することによって、ＤＭ１の症状が現れる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９（５４８５），１７６９－７３）。コントロールとして、野生型マウス（ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウス、日本クレアより購入）を使用した。実験には１４週齢の雌雄マウスを用いた。

（２）ＰＰＲタンパク質
（ＡＡＶベクターの製造）
ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター（ＡＡＶｐｒｏ（商標）ＨｅｌｐｅｒＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ，Ｔａｋａｒａ，６６５１構成品）のマルチクローニングサイトに、ＰＰＲタンパク質、３×核局在シグナルが順に融合した遺伝子を挿入した。ＰＣＲでの構築遺伝子の発現サイズの確認、およびシーケンシングによって挿入配列の確認を行なった。ＣＭＶプロモーター、およびＨｕｍａｎｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｐｏｌｙＡシグナルにより融合遺伝子の発現は制御される。

（ＡＡＶベクターの調製）
前項で構築したＡＡＶベクターをＳｉｇｎａＧｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（以下、ＳＧ社と略す）で外部委託製造した。パッケージングは、ＳＧ社保有のＲｅｐ／ＣａｐプラスミドとＨｅｌｐｅｒプラスミド、並びに弊社から送付したＡＡＶベクターをパッケージング細胞株へコトランスフェクションして実施した。パッケージングされたＡＡＶを含む細胞破砕液を密度勾配遠心法にて精製しタイターを測定した。取得されたＡＡＶは、１．１６×１０^１４ｖｇ／ｍｌであり容量は５ｍｌであった。これをＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１として以降の実験に用いた。なお、各ＡＡＶベクターにおいてコードされるＰＰＲタンパク質（ＰＰＲ１）の配列は、表１に記載のＰＰＲタンパク質の配列と同一である。

（３）群分け、投与スケジュール
ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量投与群（以下、Ｌｏｗｄｏｓｅ：ＬＤと略する）、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量投与群（以下、Ｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅ：ＭＤと略する）、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量投与群（以下、Ｈｉｇｈｄｏｓｅ：ＨＤと略する）、ＰＢＳ投与群（以下、ＰＢＳと略する）の４群を設けた。各群ｎ＝５（♂３、♀２のマウス）。ＡＡＶの投与量は、ＬＤが３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、ＭＤが１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、ＨＤが３×１０^１４ｖｇ／ｋｇとし、尾静脈内に単回投与した。ＰＢＳ投与群には、同容量のＰＢＳを単回投与した。

（４）ＲＮＡ凝集体形成数の計測
最終投与の２８日後に、マウスから大腿筋を採取し切片を作製した。ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで５分間透過処理した。次に３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで１０分間プレハイブリダイゼーション処理した。その後、３０％ホルムアミド、２μｇ／ｍＬＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬｙｅａｓｔｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル複合体（ｖａｎａｄｙｌｃｏｍｐｌｅｘ）、１ｎｇ／μＬＴｅｘａｓＲｅｄＣＡＧｐｒｏｂｅ含有の２×ＳＳＣバッファーで３７℃、１時間ハイブリダイゼーション処理した。３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで４２℃、３０分間ポストハイブリダイゼーション処理した後に、１×ＳＳＣバッファーで１回洗浄し、その後にＰＢＳで２回洗浄した。ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｗｉｔｈＤＡＰＩ（商品名、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて固定した後、蛍光顕微鏡（ＫｅｙｅｎｃｅＰＺ－９０００）で核内のＲＮＡ凝集体の数を計測した。

（５）スプライシング産物の定量
最終投与の２８日後に、マウスから大腿筋を採取した。ＴＲＩＲｅａｇｅｎｔ（商標）（ＭＲＣ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｍｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅＨ処理した後、実施例２と同様のＡｔｐ２ａ１ｅｘｏｎ２２ＲＴプライマーと、以下のＣｌｃｎ１ｅｘｏｎ７ａＲＴプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄを用いて染色した後、イメージアナライザー（ＣｈｅｍｉＤｏｃＴｏｕｃｈイメージングシステム、ＢｉｏＲａｄ）で正常型のＰＣＲ産物と異常型のＰＣＲ産物をそれぞれ定量し、ＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を算出した。統計解析にはｔ－ｔｅｓｔを用いた。

Ｃｌｃｎ１ｅｘｏｎ７ａＲＴプライマー
Ｆｗ：TGAAGGAATACCTCACACTCAAGG （配列番号２４）
Ｒｖ：CACGGAACACAAAGGCACTG （配列番号２５）

（６）筋強直（ミオトニア）の測定
最終投与の２８日後に、麻酔下にてマウス大腿筋の電気的筋強直現象を針筋電図で解析した。具体的には、マウス大腿筋へ２０回の針電極を刺入した時の電気的筋強直現象の発生頻度を次の４段階に分けて評価した。
重症度０：電気的筋強直現象が全くみられない。
重症度１：全体の５０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
重症度２：全体の５０％以上、９０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
重症度３：電気的筋強直現象が９０％以上みられる。

（７）ＡＡＶ投与マウス組織内におけるＰＰＲｍＲＮＡ発現量の計測
摘出した大腿筋臓器片をＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ８００μＬに湿潤した。破砕用ビーズ（ＴＯＭＹ，ＳＵＢ－３０）を２粒添加し、ビーズ式細胞破砕装置ＭｉｃｒｏＳｍａｓｈ（トミー精工，ＭＳ－１００Ｒ）を用いて臓器破砕した。４℃、１５，０００ｇで５分間遠心して取得された上澄みを６００μＬ回収し、クロロホルム溶液１６０μＬを添加して室温で５分間の転倒混和を行った。その後、４℃、１５，０００ｇで５分間遠心し、水相と有機相に分離した。水相を３００μＬ回収し、核酸精製装置ＭａｘｗｅｌｌＲＳＣＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔに供し、Ｔｏｔａｌ－ＲＮＡの精製物を取得した。ＲＮＡの濃度と純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００で吸光度測定を実施した。取得されたＲＮＡの分解度を確認するために、２０～２５０ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ－ＲＮＡを使用してＬａｂＣｈｉｐＧＸＴｏｕｃｈＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＣＬＳ１３７０３１Ｊ）による電気泳動を行い、２８Ｓと１８ＳｒＲＮＡのバンド強度比から分解が進んでいないことを確認した。ｃＤＮＡの合成は、取得されたＲＮＡ２０～１００ｎｇ／μＬをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ライフテクノロジーズ），１８０８００８５）の製品手順書に従い逆転写反応を行なった。ＰＰＲｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡ量は、作成したｃＤＮＡ，ＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＩＵｌｔｒａ－ＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＱＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ，６００８８２）と下記に記したプライマーをマニュアルに従い混合後、リアルタイムＰＣＲシステムＡｒｉａＭＸ（アジレント）を用いて増幅し定量解析を行った。

PPR定量PCR用プライマー
Ｆｗ：GATGAGGCTTTGGAACTGTTTG （配列番号２６）
Ｒｖ：TCTCTGGCTCTGCCGGCCTTGC （配列番号２７）

GAPDH定量PCR用プライマー
Ｆｗ：ATCATCCCTGCCTCTACTGG （配列番号２８）
Ｒｖ：CTGCTTCACCACCTTCTTGA （配列番号２９）

＜結果＞
ＲＮＡ－ｆｏｃｉの解析結果を図９に示した。取得した大腿筋臓器切片を用いてＲＮＡ－ＦＩＳＨ法を実施し、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１によるＲＮＡ－ｆｏｃｉ形成抑制効果を検証した結果、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与群で用量依存的にＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成抑制効果が確認された。ＰＢＳ投与群ではＲＮＡ－ｆｏｃｉ陽性細胞率が３９％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量群では１８％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量群では２３％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量投与群では１７％の形成抑制効果が観察された。

スプライシング異常の評価結果を図１０に示した。採取した臓器からｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、逆転写ＰＣＲを行い、Ｃｌｃｎ１遺伝子とＡｔｐ２ａ１遺伝子の異常スプライシングを評価した。Ｃｌｃｎ１の異常スプライシング現象は筋強直放電現象の直接的な原因として知られているＣｌチャネルである。Ａｔｐ２ａ１は同じく筋強直放電に関係するＣａトランスポーターで鋭敏なマーカー遺伝子として知られている。スプライシング解析の結果、Ｃｌｃｎ１の検出系では、ＰＢＳ投与群は５８％の正常スプライシングを示したところ、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量群では７２％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量群では７８％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量群では８２％を示し、用量依存的なスプライシング改善が確認された。Ａｔｐ２ａ１の検出系では、ＰＢＳ投与群は２５％の正常スプライシングを示したところ、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量群では５６％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１中用量群では６０％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１高用量群では６４％を示し、用量依存的なスプライシング改善が見られた。

筋強直放電のＰＰＲによる減少改善効果は、ミオトニア放電数に基づいた４段階でのスコアで表示した。すなわち、スコア０は２０回のうち０回、スコア１は２０回のうち１から９回、スコア２は２０回のうち１０から１９回、スコア３は２０回のうち２０回の筋強直放電の検出を意味する。大腿筋を用いた筋強直放電解析の結果、ＰＢＳ投与群ではスコア３、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量群では１／５例がスコア３、４／５例がスコア２を示し、中用量群では４／５例がスコア２、１／５例がスコア１を示し、低用量群では３／５例がスコア２、２／５例がスコア１への改善を示した（図１１）。

薬物動態を調べるため、解析臓器の大腿筋よりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＰＰＲｍＲＮＡの定量ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果、用量依存的なＰＰＲｍＲＮＡの発現が確認された（図１２）。各群のＰＰＲｍＲＮＡの発現量は、内部標準にＧＡＰＤＨを用いてＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１低用量投与群の一番シグナルが低い個体の値を１とした時の相対値を使用した。それぞれの群の中央値をとると、ＰＢＳ投与群は０．２，低用量投与群は０．７，中用量投与群は１．８，高用量投与群は２．６であり、用量依存的なＰＰＲの発現が確認された（図１２）。

以上の結果より、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１の用量依存的な筋強直放電の抑制、ＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成抑制効果、異常スプライシング改善効果が確認された。

［実施例７：ＤＭ１モデルマウスにおける薬効における時間軸変化］
ＤＭ１モデルマウスを用いた薬効における時間軸変化を評価するために、ＤＭ１モデルマウスにＣＵＧ－ＰＰＲ遺伝子を搭載したＡＡＶ９を尾静脈内へ単回投与し、各タイムポイントで大腿筋における筋強直症状に対する効果、Ａｔｐ２ａ１遺伝子と骨格筋型クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果、並びにＲＮＡ凝集体形成数を検証した。

＜実験材料および方法＞
（１）使用動物
ＤＭ１モデルマウスとしてＨＳＡ^ＬＲマウス（Ｄｒ．ＣｈａｒｌｅｓＴｈｏｒｎｔｏｎ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＲｏｃｈｅｓｔｅｒ）より譲渡され、大阪大学の実験動物施設で繁殖させたもの）を使用した。ＨＳＡ^ＬＲマウスはｈＡＣＴＡ遺伝子（筋細胞で恒常的に発現するヒト遺伝子）３’側非翻訳領域にＣＴＧ反復配列を２２０回に伸長したものをゲノム中に組み込んだトランスジェニック動物で、筋細胞でＣＵＧ配列が伸長したｍＲＮＡが発現することによって、ＤＭ１の症状が現れる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９（５４８５），１７６９－７３）。コントロールとして、野生型マウス（ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウス、日本クレアより購入）を使用した。実験には１２週齢の雌雄マウスを用いた。

（２）ＰＰＲタンパク質
（ＡＡＶベクターの製造）
ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター（ＡＡＶｐｒｏ（商標）ＨｅｌｐｅｒＦｒｅｅＳｙｓｔｅｍ，Ｔａｋａｒａ，６６５１構成品）のマルチクローニングサイトに、順に、ＰＰＲタンパク質、３×核局在シグナルが順に融合した遺伝子を挿入した。ＰＣＲでの構築遺伝子の発現サイズの確認、およびシーケンシングによって挿入配列の確認を行なった。ＣＭＶプロモーター、およびＨｕｍａｎｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｐｏｌｙＡシグナルにより融合遺伝子の発現は制御される。

（ＡＡＶベクターの調製）
前項で構築したＡＡＶベクターをＳｉｇｎａＧｅｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（以下、ＳＧ社と略す）に製造を委託した。パッケージングは、ＳＧ社保有のＲｅｐ／ＣａｐプラスミドとＨｅｌｐｅｒプラスミド、並びに弊社から送付したＡＡＶベクターをパッケージング細胞株へコトランスフェクションして実施した。パッケージングされたＡＡＶを含む細胞破砕液を密度勾配遠心法にて精製しタイターを測定した。取得されたＡＡＶは、１．１６×１０^１４ｖｇ／ｍｌであり容量は５ｍｌであった。これをＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１として以降の実験に用いた。なお、各ＡＡＶベクターにおいてコードされるＰＰＲタンパク質（ＰＰＲ１）の配列は、表１に記載のＰＰＲタンパク質の配列と同一である。

（３）群分け、投与スケジュール
ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１４日（２ｗ）、投与後２８日（４ｗ）、投与後５６日（８ｗ）、投与後１１２日（１６ｗ）の４群を設置した。各群ｎ＝５（♂２、♀３）のマウスを使用した。ＡＡＶの投与量を３×１０^１４ｖｇ／ｋｇとし、尾静脈内に単回投与した。

（４）ＲＮＡ凝集体形成数の計測
最終投与後１４、２８、５６、あるいは１１２日後に、マウスから大腿筋を採取し切片を作製した。ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで５分間透過処理した。次に３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで１０分間プレハイブリダイゼーション処理した。その後、３０％ホルムアミド、２μｇ／ｍＬＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬｙｅａｓｔｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル複合体（ｖａｎａｄｙｌｃｏｍｐｌｅｘ）、１ｎｇ／μＬＴｅｘａｓＲｅｄＣＡＧｐｒｏｂｅ含有の２×ＳＳＣバッファーで３７℃、１時間ハイブリダイゼーション処理した。３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで４２℃、３０分間ポストハイブリダイゼーション処理した後に、１×ＳＳＣバッファーで１回洗浄し、その後にＰＢＳで２回洗浄した。ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｗｉｔｈＤＡＰＩ（商品名、ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて固定した後、蛍光顕微鏡（ＫｅｙｅｎｃｅＰＺ－９０００）で核内のＲＮＡ凝集体の数を計測した。

（５）スプライシング産物の定量
最終投与後１４、２８、５６、あるいは１１２日後に、マウスから大腿筋を採取した。ＴＲＩＲｅａｇｅｎｔ（商標）（ＭＲＣ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｍｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅＨ処理した後、実施例２と同様のＡｔｐ２ａ１ｅｘｏｎ２２ＲＴプライマーと、以下のＣｌｃｎ１ｅｘｏｎ７ａＲＴプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄを用いて染色した後、イメージアナライザー（ＣｈｅｍｉＤｏｃＴｏｕｃｈイメージングシステム、ＢｉｏＲａｄ）で正常型のＰＣＲ産物と異常型のＰＣＲ産物をそれぞれ定量し、ＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を算出した。統計解析にはｔ－ｔｅｓｔを用いた。

（６）筋強直（ミオトニア）の測定
剖検直前に、麻酔下にてマウス大腿筋の電気的筋強直現象を針筋電図で解析した。具体的には、マウス大腿筋へ２０回の針電極を刺入した時の電気的筋強直現象の発生頻度を次の４段階に分けて評価した。
重症度０：電気的筋強直現象が全くみられない。
重症度１：全体の５０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
重症度２：全体の５０％以上、９０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
重症度３：電気的筋強直現象が９０％以上みられる。

＜結果＞
ＲＮＡ－ｆｏｃｉの解析結果を図１３に示した。取得した大腿筋臓器切片を用いてＲＮＡ－ＦＩＳＨ法を実施し、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１によるＲＮＡ－ｆｏｃｉ形成抑制効果を検証した結果、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与群で用量依存的にＲＮＡ－ｆｏｃｉの形成抑制効果が確認された。実施例６の用量依存性試験で用いたＰＢＳ投与群の値をコントロールとして用いた。コントロール群のＲＮＡ－ｆｏｃｉ陽性細胞率は３９％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１４日目の群では３６％、投与後２８日目の群では２３％、投与後５６日目の群では１９％、投与後１１２日目の群では１８％の形成抑制効果が確認された（図１３）。

スプライシング異常の評価結果を図１４に示した。採取した臓器からｔｏｔａｌＲＮＡを回収し、逆転写ＰＣＲを行い、Ｃｌｃｎ１遺伝子とＡｔｐ２ａ１遺伝子の異常スプライシングを評価した。Ｃｌｃｎ１の異常スプライシング現象は筋強直放電現象の直接的な原因として知られているＣｌチャネルである。Ａｔｐ２ａ１は同じく筋強直放電に関係するＣａトランスポーターで鋭敏なマーカー遺伝子として知られている。スプライシング解析の結果、Ｃｌｃｎ１の検出系では、実施例６で示したＰＢＳ投与群は５８％の正常スプライシングを示したところ、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１４日目の実験群では６２％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後２８日目では７６％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後５６日目では７９％を示し、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１１２日目では８０％のスプライシング改善が確認された。Ａｔｐ２ａ１の検出系では、実施例６で示したＰＢＳ投与群は２５％の正常スプライシングを示したところ、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１４日目の実験群では３０％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後２８日目では６３％、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後５６日目では７６％を示し、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１１２日目では７５％のスプライシング改善が確認された（図１４）。

筋強直放電のＰＰＲによる減少改善効果は、ミオトニア放電数に基づいた４段階でのスコアで表示した。すなわち、スコア０は２０回のうち０回、スコア１は２０回のうち１から９回、スコア２は２０回のうち１０から１９回、スコア３は２０回のうち２０回の筋強直放電の検出を意味する。大腿筋を用いた筋強直放電解析の結果、実施例６で示すＰＢＳ投与群ではスコア３、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後１４日目の実験群では４／５例がスコア３、１／５例がスコア２を示し、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後２８日目の実験群では５／５例がスコア２を示し、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後５６日目の実験群では３／５例がスコア2と２／５例がスコア1を示し、投与後１１２日目の実験群は３／５例がスコア2と２／５例がスコア1を示した（図１５）。

薬物動態を調べるため、解析臓器の大腿筋よりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＰＰＲｍＲＮＡの定量ＰＣＲを実施した。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果、投与後１１２日目においてもＰＰＲの持続的な発現が確認された（ｄａｔａｎｏｔｓｈｏｗｎ）。

以上の結果より、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与マウスは投与後１４日、２８日、５６日まで薬効が向上し、投与後１１２日目でも薬効が持続されていることが確認された。

［実施例８：ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与による、ＤＭ１関連スプライシング異常の包括的な改善］
＜実験材料および方法＞
（１）解析臓器
ＨＳＡＬＲマウス（１４週齢）にＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１を３×１０^１４ｖｇ／ｋｇで尾静脈内に単回投与し、投与後８週（Ｄａｙ５６）に摘出した大腿筋組織片をＰＰＲ治療群とした。同容量のＰＢＳを単回投与し摘出した大腿筋をＰＰＲ未処理群として設置した。遺伝的背景を揃えた野生型ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウスの大腿筋組織片を野生型群として用いた。

（２）異常スプライシングイベントの解析
実施例６に記述のｔｏｔａｌＲＮＡ抽出法に従い、ＰＰＲ治療群とＰＰＲ未処理群と野生型群の大腿筋からＴｏｔａｌ－ＲＮＡを抽出し、ＧＥＮＥＺＷＩＺ社に必要量を送付してＲＮＡシーケンス（ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ２×１５０ｂｐシークエンス）を実施した。送付したＲＮＡに対してＰｏｌｙＡセレクション法によって、トータルＲＮＡ中のｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡを除去した。ＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを合成しアダプター付きのライブラリーを調整した。シーケンシングを行い、取得されたリード情報に対してアダプタートリミングをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖ０．３３）５９を用いて実施した。トリミング処理後のリード配列について参照ゲノムにＧＲＣｍ３９（Ｅｎｓｅｍｂｌｅより入手）を用いてアライメント処理をＳＴＡＲ（ｖ２．７．９ａ）で行った。スプライシングイベントの特定は、ＳＴＡＲ－ａｌｉｇｎｅｄｆｉｌｅ（．ｂａｍ）を基に、ｒＭＡＴＳ（ｖ３．２．５）で検出した。変動したスプライシングイベントの特定は、野生型群とＰＰＲ未処理群（ＰＢＳを投与したＨＳＡＬＲマウス）の比較を行い、「ｐ－ａｄｊｕｓｔｅｄ－ｖａｌｕｅ」と「ＩｎｃｌＬｅｖｅｌＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ」を指標として変動の有無を判断し、変動していると定義した候補のみを抽出した。変動スプライシングイベントに対して、ＦＤＲ（ＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅ）－ａｄｊｕｓｔｅｄＰｖａｌｕｅ＜０．０５の閾値でカットオフを行い、群間の比較試験に用いた。Ｐｅｒｃｅｎｔｓｐｌｉｃｅｄｉｎｉｎｄｅｘ（ＰＳＩ）は、対象とする遺伝子の全リード数に対するスプライスドインされた転写物量の割合と定義した。Ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ解析は、Ｍｅｔａｓｃａｐｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｅｔａｓｃａｐｅ．ｏｒｇ／ｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃／ｍａｉｎ／ｓｔｅｐ１）を使用した。

＜結果＞
前項で記述した野生型マウス（１４週齢）から摘出した大腿筋（以降、野生型群とする），ＨＳＡＬＲマウスにＰＢＳを投与し８週間後に摘出した大腿筋（以降、ＰＰＲ未処理群とする），さらにＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１を投与し８週間後（Ｄａｙ５６）に摘出した大腿筋（以降、ＰＰＲ処理群）からトータルＲＮＡ抽出し、次世代シークエンシング技術により発現しているＲＮＡの網羅的解析を実施した。

得られたリード配列のマッピング後、隣り合うエクソン配列のリード数を比較し、ＰＳＩ（ｐｅｒｃｅｎｔｓｐｌｉｃｅｄｉｎｉｎｄｅｘ）を計算し、各遺伝子の各エクソンのインクルージョンレベルを算出した。野生型とＰＢＳ投与群のＰＳＩのうち、０．２以上の差があるものを、ＨＳＡＬＲマウスで異常になっているスプライシングイベントとした（ｎ＝４５５，図１６ａ左）。ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１投与後８週目の同スプライシングイベントのＰＳＩとＷＴにおけるＰＳＩを比較した結果（図１６ａ右）、全体的にＰＳＩが回復していることが分かった。

以下の文献において、Ａｔｐ２ａ１やＣｌｃｎ１以外のＨＳＡ－ＬＲでスプライシング異常が起きることが報告されているスプライシングイベントについても改善が見られた（図１６ｂ）。
参考文献：ＭａｔｔｈｅｗＫＴａｎｎｅｒｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ４９，Ｉｓｓｕｅ４（２０２１）

異常スプライシングが起きている遺伝子群についてＧｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ解析を行ったところ筋肉機能や筋肉分化に関連するタームであった。各Ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙにおいて改善が認められる遺伝子数について解析した結果、強く改善（５０％より大きい）が認められた遺伝子が４０％程度あり、改善（２０％より大きい）が認められたものを含めると、９０％であることが分かった（図１６ｃ）。

これらのことから、ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１の投与によって様々なスプライシング異常が改善することが分かった。

［実施例９：ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１を適用した正常マウスの各臓器におけるＰＰＲｍＲＮＡの発現量解析］

＜実験材料および方法＞
（１）解析臓器
ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１（投与用量：１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ，３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ，または３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）をｉｖ投与した正常マウスから摘出した４臓器片（心臓、大腿筋、腓腹筋、前脛骨筋）を使用した。

（２）投与スケジュールと剖検タイミング
週齢８週の雌の正常マウスを用いた。投与用量を１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ，３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ，または３×１０^１４ｖｇ／ｋｇとして尾静脈内投与を行い、容量は１０μＬ／ｇとして設定した。観察期間は投与後２８日とした。マウス各個体から心臓、大腿筋、腓腹筋、前脛骨筋を摘出しＰＰＲｍＲＮＡの解析を行なった。

（３）ＡＡＶ投与マウス組織内のＰＰＲｍＲＮＡ発現量の計測
摘出臓器片からＴｏｔａｌ－ＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成し定量ＰＣＲを実施した。まず、前項で取得した臓器片の５０ｍｇ（±５ｍｇ）片をＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ８００μＬに湿潤した。破砕用ビーズ（ＴＯＭＹ，ＳＵＢ－３０）を２粒添加し、ビーズ式細胞破砕装置ＭｉｃｒｏＳｍａｓｈ（トミー精工，ＭＳ－１００Ｒ）を用いて臓器破砕し、４℃、１５，０００ｇで５分間遠心した。取得された上澄みを６００μＬ回収し、クロロホルム溶液を１６０μＬ添加して室温で５分間の転倒混和を行った。その後、４℃、１５，０００ｇで５分間遠心し、水相と有機相に分離した。水相を３００μＬ回収し、核酸精製装置ＭａｘｗｅｌｌＲＳＣＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔに供し、Ｔｏｔａｌ－ＲＮＡの精製物を取得した。ＲＮＡの濃度と純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００で吸光度測定を実施した。取得されたＲＮＡの分解度を確認するために、２０～２５０ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ－ＲＮＡを使用してＬａｂＣｈｉｐＧＸＴｏｕｃｈＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＣＬＳ１３７０３１Ｊ）による電気泳動を行い、２８Ｓと１８ＳｒＲＮＡのバンド強度比から分解が進んでいないことを確認した。

ｃＤＮＡの合成は、取得されたＲＮＡ２０～１００ｎｇ／μＬをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ライフテクノロジーズ），１８０８００８５）の製品手順書に従い逆転写反応を行なった。

定量ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲシステムＡｒｉａＭＸ（アジレント）を用いてＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＩＵｌｔｒａ－ＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＱＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ，６００８８２）の汎用マニュアルに従い実施した。

＜結果＞
定量ＰＣＲの結果を図１７に示す。定量ＰＣＲの結果、各組織において用量依存的なＰＰＲ発現量の上昇が確認され、最大投与３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ投与群で最大発現量を示した。

以上より、全身にＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１を送達し、発現させることができることが示され、骨格筋、平滑筋に加え、心臓を冒す多臓器疾患であるＤＭ１に対して有効であることが示唆された。

［実施例１０：ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１を適用した正常マウスの各臓器におけるＰＰＲｍＲＮＡの発現持続性解析］

＜実験材料および方法＞
（１）解析臓器
ＡＡＶ９－ＣＵＧ－ＰＰＲ１（投与用量：１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）をｉｖ投与した正常マウスから摘出した４臓器片（心臓、大腿筋、腓腹筋、前脛骨筋）を使用した。

（２）投与スケジュールと剖検タイミング
週齢８週の雄の正常マウスを用いた。投与用量を１×１０^１４ｖｇ／ｋｇとして尾静脈内投与を行い、容量は１０μＬ／ｇとして設定した。観察期間は投与後１４日目、投与後２８日目、投与後５６日目、投与後１１２日目、投与後１８２日目とした。マウス各個体から心臓、大腿筋、腓腹筋、前脛骨筋を摘出しＰＰＲｍＲＮＡの解析を行なった。

（３）ＡＡＶ投与マウス組織内のＰＰＲｍＲＮＡ発現量の計測
摘出臓器片からＴｏｔａｌ－ＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成し定量ＰＣＲを実施した。まず、前項で取得した臓器片の５０ｍｇ（±５ｍｇ）片をＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ８００μＬに湿潤し、破砕用ビーズ（ＴＯＭＹ，ＳＵＢ－３０）を２粒添加し、ビーズ式細胞破砕装置ＭｉｃｒｏＳｍａｓｈ（トミー精工，ＭＳ－１００Ｒ）を用いて臓器破砕した。４℃、１５，０００ｇで５分間遠心し取得された上澄みを６００μＬ回収し、クロロホルム溶液を１６０μＬ添加して室温で５分間の転倒混和を行った。その後、４℃、１５，０００ｇで５分間遠心し、水相と有機相に分離した。水相を３００μＬ回収し、核酸精製装置ＭａｘｗｅｌｌＲＳＣＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔに供し、Ｔｏｔａｌ－ＲＮＡの精製物を取得した。ＲＮＡの濃度と純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００で吸光度測定を実施した。取得されたＲＮＡの分解度を確認するために、２０～２５０ｎｇ／μＬのｔｏｔａｌ－ＲＮＡを使用してＬａｂＣｈｉｐＧＸＴｏｕｃｈＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＣＬＳ１３７０３１Ｊ）による電気泳動を行い、２８Ｓと１８ＳｒＲＮＡのバンド強度比から分解が進んでいないことを確認した。ｃＤＮＡの合成は、取得されたＲＮＡ２０～１００ｎｇ／μＬをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ライフテクノロジーズ），１８０８００８５）の製品手順書に従い逆転写反応を行なった。定量ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲシステムＡｒｉａＭＸ（アジレント）を用いてＢｒｉｌｌｉａｎｔＩＩＩＵｌｔｒａ－ＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＱＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ，６００８８２）の汎用マニュアルに従い実施した。

＜結果＞
定量ＰＣＲの結果を図１８に示す。定量ＰＣＲの結果、投与後１８３日目においても発現持続が確認され、時間依存的な発現上昇も確認された。先行論文においては、ＡＡＶ９を尾静脈内投与した場合に、長期間（６ヶ月以上）に渡って発現を持続できることが示されているが、本実験の結果も当該知見と一致する。

以上より、本発明は、対象への少ない投与回数で、長期間に渡って所望の効果を奏し得ることが示唆された。

Claims

筋強直性ジストロフィー１型治療用の医薬組成物であって、
前記医薬組成物はＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸を含み、
前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質は、式１で表される３０～３８アミノ酸長のポリペプチドからなるペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを少なくとも６個含み、
（式１中：
ＨｅｌｉｘＡは、１２アミノ酸長の、αヘリックス構造を形成可能な部分であって、式２で表され、
式２中、Ａ_１～Ａ_１２はそれぞれ独立にアミノ酸を表し；
Ｘは、存在しないか、または、１～９アミノ酸長からなる部分であり；
ＨｅｌｉｘＢは、１１～１３アミノ酸長からなる、αヘリックス構造を形成可能な部分であり；
Ｌは、２～７アミノ酸長の、式３で表される部分であり；
式３中、各アミノ酸は、“ｉ”（－１）、“ｉｉ”（－２）、とＣ末端側からナンバリングされ、
ただし、Ｌ_ｉｉｉ～Ｌ_ｖｉｉは存在しない場合がある。）
前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ_１、Ａ_４、及びＬ_ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせ、又はＡ_４、Ｌ_ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、前記の各ＰＰＲモチーフがＣ、ＵまたはＧに結合するように選択され、それにより前記タンパク質が前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するように構成されており、
前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ _１、Ａ _４、およびＬ _ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ _１、Ａ _４、およびＬ _ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ _１、Ａ _４、Ｌ _ｉｉ）の順に、（グルタミン酸、グリシン、アスパラギン酸）、（バリン、トレオニン、アスパラギン酸）、（リジン、トレオニン、アスパラギン酸）、または（ロイシン、トレオニン、アスパラギン酸）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ _１、Ａ _４、およびＬ _ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ _１、Ａ _４、Ｌ _ｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸）、（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）、（フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン酸）、または（チロシン、プロリン、アスパラギン酸）であり；または、
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ _１、Ａ _４、およびＬ _ｉｉの３つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ _１、Ａ _４、Ｌ _ｉｉ）の順に、（バリン、アスパラギン、アスパラギン）、（イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン）、（バリン、アスパラギン、セリン）、または（イソロイシン、メチオニン、アスパラギン酸）である、
および／または、
前記の各ＰＰＲモチーフにおけるＡ _４およびＬ _ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＧ（グアニン）である場合には、Ａ _４およびＬ _ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ _４、Ｌ _ｉｉ）の順に、（トレオニン、アスパラギン酸）
または（グリシン、アスパラギン酸）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＵ（ウラシル）である場合には、Ａ _４およびＬ _ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ _４、Ｌ _ｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン酸）、（プロリン、アスパラギン酸）、（メチオニン、アスパラギン酸）、または（バリン、トレオニン）であり；
ＰＰＲモチーフの標的とする塩基がＣ（シトシン）である場合には、Ａ _４およびＬ _ｉｉの２つのアミノ酸の組み合わせが、（Ａ _４、Ｌ _ｉｉ）の順に、（アスパラギン、アスパラギン）、
（アスパラギン、セリン）、または（ロイシン、アスパラギン酸）である、
医薬組成物。
請求項１に記載の医薬組成物であって、前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質は、前記ＰＰＲモチーフを９～３０個含む、
医薬組成物。
請求項２に記載の医薬組成物であって、前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質は、前記ＰＰＲモチーフを１２～２４個含む、
医薬組成物。
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸が発現ベクターに組み込まれていることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸がウイルスベクターに組み込まれていることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項５に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターが、筋組織に対する指向性を有するウイルスベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項６に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または、単純ヘルペスウイルスベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項７に記載の医薬組成物であって、
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項８に記載の医薬組成物であって、
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクター、ＡＡＶ１１ベクター、または、ＡＡＶ１２ベクターであることを特徴とする、
医薬組成物。
請求項１において定義されるＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。
請求項１０に記載の発現ベクターを含む、細胞。
請求項１１に記載の細胞から産生される、ＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質。
請求項１において定義されるＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸を含む、ウイルス発現ベクター。
請求項１３に記載のウイルス発現ベクターを含む、細胞。
請求項１４に記載の細胞から産生される、ウイルスベクター。
筋強直性ジストロフィー１型治療用の医薬の製造における、請求項１において定義されるＣＵＧリピート配列に特異的に結合するタンパク質をコードする核酸の使用。