JPH11514853A - 遺伝子治療のための改良されたａａｖベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高力価の、汚染のない、組換えＡＡＶベクターを作成するための方法、ＡＡＶ組換えベクターを便利にかつ大量に産生するための方法および遺伝的作製体、高収率の組換えＡＡＶのためにトランスで必要なすべての必須のウイルスタンパク質を提供するための方法、遺伝子治療で使用するための組換えＡＡＶベクター、ベクターとヘルパープラスミドの同時トランスフェクションの必要のない新規のパッケージング細胞株、ヘルパープラスミドおよびベクタープラスミド骨格作製体、ＡＡＶ収率を測定するためのレポーター測定法、を提供する。さらに、薬剤学的に許容される担体中の組換えＡＡＶベクター、目的のトランス遺伝子を細胞に提供するための方法、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を細胞に提供するための組成物と方法、およびヒト第１９染色体ＡＡＶ組み込み座を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子治療のための改良されたＡＡＶベクター 発明の背景 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約４．６kbの１本鎖ＤＮＡゲノムを有する パルボウイルスである。他のウイルスと異なり、ＡＡＶは、天然には欠損のある ウイルスであり、ウイルス産生性感染を樹立するためにはヘルパーウイルス（例 えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との同時感染を必要とする。Ａ ＡＶ感染との関連が見いだされているヒトの疾患はない（ブラックロウ（Blackl ow）ら、１９６８）。ＡＡＶの宿主の範囲は広い。レトロウイルスと異なり、Ａ ＡＶは、インビトロおよびインビボで休止細胞および分裂細胞の両方に感染する ことができ（フロッテ（Flotte）ら、１９９３；カプリット（Kaplitt）ら、１ ９９４：ポドサコフ（Podsakoff）ら、１９９４；ラッセル（Russell）ら、１０ ０４）、また異なる種や組織タイプに由来する細胞にインビトロで感染すること ができる（レブコウスキー（Lebkowski）ら、１９８８；マクローリン（McLaugh lin）ら、１９８８）。ヘルパーウイルスが存在しないところで感染が起きると 、野生型ＡＡＶは、アデノウイルスとの重複感染によりレスキュー（rescure） されるまで、プロウイルスとして細胞のゲノム内に組み込まれる（ハンダ（Hand a）ら、１９７７；チェウング（Cheung）ら、１９８０；ローリン（Laughlin） ら、１９８６）。 ＡＡＶゲノムは比較的単純であり、短い逆末端繰り返し配列(inverted termin al repeat)（ＩＴＲ）が隣接する２つの読みとり枠（ＯＲＦ）を含有する。ＩＴ Ｒは、特にウイルス複製、レスキュー、パッケージングおよび組み込みに必要な シス作用性配列を含有する。ＩＴＲの組み込み機能により、ＡＡＶゲノムが、感 染後に細胞の染色体に組み込まれることが可能になる。 非構造タンパク質または複製（Ｒｅｐ）タンパク質およびキャプシド（Ｃａｐ ）タンパク質は、それぞれ５’ＯＲＦと３’ＯＲＦによりコードされる。ｒｅｐ 遺伝子から４つの関連するタンパク質が発現される。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８は 、 ｐ５プロモーターから転写され、下流のプロモーター（ｐ１９）は、Ｒｅｐ５２ とＲｅｐ４０の発現を指令する。大きいＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／６８） は、ＡＡＶ複製ならびにウイルス遺伝子発現の制御に直接関与する（総説につい ては、ムジクズカ（Muzyczka）、１９９２を参照されたい）。ｃａｐ遺伝子は、 第３のウイルスプロモーター（ｐ４０）から転写される。キャプシドは、重複す る配列の３つのタンパク質から構成され、最も小さいもの（ＶＰ−３）が最も豊 富に存在する。逆末端繰り返し配列は、複製、パッケージ、および組み込みのた めにシスで必要な唯一のＡＡＶ配列である（サムルスキー（Samulski）ら、１９ ８９）ため、多くのＡＡＶベクターは、Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク 質をコードするウイルス遺伝子を含有せず、末端繰り返し配列の間に挿入された 外来遺伝子のみを含有する。 ＡＡＶが遺伝子治療におけるベクターとして興味があるのは、その生物学のい くつかの特徴的な性質に由来する。このＡＡＶベクターを使用することにより、 遺伝子治療の多くの目標について理想的な、安定な遺伝的形質転換が達成される かも知れない。さらに、ＡＡＶの組み込み部位は、ヒトの第１９染色体上にある ことは、充分確立されている。この予測可能性により、宿主の遺伝子を活性化も しくは不活性化するかまたはコード配列を妨害する可能性のある、細胞ゲノムへ のランダムな挿入（このような現象のために、組み込みがランダムなレトロウイ ルスのようなベクターの使用が限定される）という危険性を避けることができる 。ｒｅｐタンパク質はＡＡＶの組み込みを仲介するため、ＡＡＶベクターの作成 時にこのタンパク質を除去すると、組み込みパターンが変化してしまう。さらに 、ＡＡＶはヒトの疾患と関係がなく、ウイルス由来の遺伝子治療ベクターの場合 のような多くの心配をしなくてよい。 ＡＡＶを基礎とするベクターのこの魅力的な面にもかかわらず、組換えウイル スのストックを大量かつ高力価で産生することができないため、遺伝子治療のた めのその評価における急速な進歩は妨げられている。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ） ベクターの産生のための従来法は、アデノウイルスに感染した２９３細胞への、 ベクターを含有するプラスミドとＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコー ドする第２のヘルパープラスミドとの同時感染である（例えば、レブコウスキー （Lebkowski）ら、１９８８；サムルスキー（Samulski）ら、１９８９、エヌ・ ムジクズカ（Muzyczka，N.）、１９９２、カプリット（Kaplitt）ら、１９９４ ；エイナーハンド（Einerhand）ら、１９９５）。この方法は面倒であり、ｒＡ ＡＶの収率が低く、典型的には１０⁴〜１０⁵感染単位または形質導入単位／mlで ある。この方法を改良する方法としては、ポリリジンを介してプラスミドＤＮＡ とアデノウイルス粒子の複合体を作成してトランスフェクション効率を上げ（マ モウナス（Mamounas）ら、１９９５）、ベクター配列を組換えアデノウイルスの 一部として提供し（スラシャー（Thrasher）ら、１９９５）、そしてＳＶ４０レ プリコンに結合させてヘルパープラスミドのコピー数を増幅させる方法があった （チオリニ（Chiorini）ら、１９９５）。 前記アプローチを使用して高力価の組換えＡＡＶのストックを産生することが できないため、遺伝子治療ベクターとしてのＡＡＶの開発の進展は制限されてき た。この制限は今日まで、組換えＡＡＶゲノムの複製とパッケージングにトラン スで必要なＡＡＶタンパク質の産生不足に由来すると考えられてきた。ベクター 産生のためのトランスに基づく方法は、トランスで必要なタンパク質のレベルを 調節してＡＡＶベクターを産生させることである。これらのタンパク質のレベル を上げる試みには、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子をＨＩＶ ＬＴＲプロモーター（エフ ・アール・フロッテ（Flotte，F.R.）ら、Gene Therapy 2: 29-37，1995）の制 御下に置いて、タンパク質レベルを上げること、およびｒｅｐタンパク質を発現 する細胞株を開発する（キュー・ヤング（Yang，Q.）ら、J．Virol．68: 4847-4 856，1994）ことがあった。 高力価のＡＡＶベクターのストックの産生が制限されることはまた、組換えＡ ＡＶベクターの設計にＡＡＶシス要求（cis-required）成分を含有させることが できないことにも由来する。ベクター産生のためのシスに基づく方法は、ＡＡＶ ベクター粒子にパッケージングされる組換えＤＮＡに、シス（縦列）で必要なＤ ＮＡ配列を与えるものである。このトランスとシス機能は関連している。トラン スで必要なタンパク質は、ベクターの産生に必要であるが、これは機能活性を有 するためには、組換えＡＡＶゲノム中にシス作用性配列を必要とする。従って、 ＡＡＶベクターの高収率の産生には、標準的な遺伝子治療ビヒクルとしてのＡＡ Ｖの開発を進行させるために、トランスに基づく改良とシスに基づく改良の共同 作用が必要である。 従って、野生型ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパーの汚染のない、高力価の 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）調製物の産生を可能にする方法および組成物に対する ニーズが当該分野に存在する。発明の要約 本発明は、高力価の、汚染のない、組換えＡＡＶベクターを作成するための方 法に関する。 本発明は、ＡＡＶ組換えベクターを便利にかつ大量に産生するための方法およ び遺伝的作製体を提供する。 本発明はさらに、高収率の組換えＡＡＶのためにトランスで必要なすべての必 須のウイルスタンパク質を提供するための方法を提供する。 本発明は、トランスおよびシスに基づく方法を使用する、遺伝子治療で使用す るための組換えＡＡＶベクターを提供する。 本発明はまた、ベクターとヘルパープラスミドの同時トランスフェクションの 必要のない、新規のパッケージング細胞株を提供する。 本発明はまた、これらの方法で使用されるヘルパープラスミドおよびベクター プラスミド骨格作製体に関する。 本発明は、ＡＡＶベクターの収率を測定するためのレポーター測定法を提供す る。 さらに、薬剤学的に許容される担体中の組換えＡＡＶベクターが提供される。 本発明はまた、目的のトランス遺伝子を細胞に提供するための方法を提供する 。 目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を細胞に提供するための組成物と方 法が、本発明により提供される。 さらに、ヒト第１９染色体のＡＡＶ組み込み座を発現するトランスジェニック 非ヒト哺乳動物が提供される。図面の説明 図１は、ＡＡＶベクター産生に必要なアデノウイルス遺伝子を含有する、複製 しているヘルパープラスミドの略図を示す。 図２は、ＡＡＶベクター産生に必要なＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含 有する、複製しているヘルパープラスミドの略図を示す。 図３は、ＡＡＶベクター産生に必要なＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含 有する、複製していないヘルパープラスミドの略図を示す。 図４は、ＡＡＶベクター産生に必要なアデノウイルス遺伝子およびＡＡＶ ｒ ｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する、複製しているヘルパープラスミドの略図を 示す。 図５は、ＡＡＶベクター産生のためのベクタープラスミド作製体に使用される ＡＡＶサブゲノム断片の略図を示す。参照は、断片の境界を規定するｐＩＭ４５ 中の制限部位を示す。 図６は、ｐＴＲＣＡＴレポータープラスミドの略図を示す。 図７は、ＡＡＶベクター産生に使用されるＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子 を含有するヘルパープラスミドの略図を示す。 図８は、ｐＴＲｌａｃＺレポータープラスミドの略図を示す。 図９は、ＡＡＶの複製していないヘルパープラスミドからの、ｒｅｐタンパク 質発現のウェスタンブロット解析を示す。ｒｅｐタンパク質（kdで表示）は右に 示す。 図１０は、ＡＡＶの複製していないヘルパープラスミドからのｃａｐタンパク 質発現のウェスタンブロット解析を示す。ｃａｐタンパク質（ＶＰ、kdで表示） は右に示す。 図１１は、骨格プラスミドＤＮＡを示す細い線（記載してある部分のみ）で線 状型でＡＡＶヘルパープラスミドを示し、太い棒はＲｅｐおよびＣａｐコード領 域とその関連する制御領域を示し、棒の上の矢印は、内因性ＡＡＶプロモーター （ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０）の位置を示し、「Ｘ」は、ｐ４０プロモーター が突然変異により不活性化されていることを示す。 図１２は、抗Ｒｅｐ（パネルＡ）と抗Ｃａｐ（パネルＢ）一次抗体を使用して ウェスタンブロット解析により解析したＡＡＶヘルパープラスミドからのＲｅｐ およびＣａｐ遺伝子発現を示す。各パネル中のレーンは、以下のヘルパーＤＮＡ でトランスフェクションした細胞から得られた試料に対応する：レーン１（に せ）、レーン２（ｐＩＭ４５）、レーン３（ｐＩＭＲＳＶ）、レーン４（ｐ５ｒ ｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐ）、レーン５（ｐＲＳＶ ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐ）、レ ーン６（ｐ５ｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐ）、レーン７（ｐＲＳＶｒｅｐΔ−ｐ４０ ｃａｐ）、レーン８（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ）、レーン９（ｗｔＡＡＶ） ＭＯＩ ＝１０。分子量サイズ標準物質（kDで表示）は各パネルの左に記載してある：Ａ ＡＶ ＲｅｐとＣａｐタンパク質は、それぞれ右に記載してある。 図１３は、ｃａｐ遺伝子のダウンレギュレーションの機構の解析である。アデ ノウイルス（ＡＤ５ｔｓ１４９、ＭＯＩ＝２０）の非存在下（−）または存在下 （＋）で適切なＤＮＡ（全部で１０μｇ）でトランスフェクションした２９３細 胞から得られた試料のウェスタンブロット解析を示す。パネルＡとパネルＢは、 それぞれ抗Ｒｅｐおよび抗Ｃａｐ−次抗体を使用して発色させたブロットを示す 。各パネル中のレーンは以下に対応する：レーン１（擬トランスフェクション細 胞）、レーン２（ｐＩＭ４５）、レーン３（ｐＩＭＲＳＶ）、レーン４（ｐＩＭ ＲＳＶ−ａｍ）、レーン５（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍとサプレッサーｔＲＮＡプラス ミド）、レーン６（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍとｐＲＳＶＲｅｐ）、レーン７（ｐＲＳ ＶＲｅｐのみ；「ｗｔ」＝アデノウイルス（Ａｄｔｓ１４９、ＭＯＩ＝２０）の 存在下でｗｔＡＡＶ（ＭＯＩ＝１５）で感染させた細胞）。分子量サイズマーカ ー（kDで表示）は左に記載し、ＡＡＶ ＲｅｐとＣａｐタンパク質は、右に記載 してある。 図１４は、図１３に記載のトランスフェクションから得られた総ＲＮＡの解析 である。パネルＡはノーザンであり、パネルＢは、各レーンで等量のＲＮＡをの せたことを示すための、エチジウム染色したゲルである。各パネルのレーンは、 以下に対応する：レーン１（擬トランスフェクション細胞）、レーン２（ｐＩＭ ４５）、レーン３（ｐＩＭＲＳＶ）、レーン４（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ）、レーン ５（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍとサプレッサーｔＲＮＡプラスミド）、レーン６（ｐＩ ＭＲＳＶ−ａｍとｐＲＳＶＲｅｐ）、レーン７（ｐＲＳＶＲｅｐのみ；「ｗｔ」 ＝アデノウイルス（Ａｄｔｓ１４９、ＭＯＩ＝２０）の存在下でｗｔＡＡＶ（Ｍ ＯＩ＝１５）で感染させた細胞）。トランスフェクションは、アデノウイルス（ ＳＤ５ｔｓ１４９、ＭＯＩ２０）の非存在下（−）または存在下（＋）で行な った。ＲＮＡサイズ標準物質（キロ塩基で表示）はパネルＡの左とパネルＢの右 に記載し；ＡＡＶ ｍＲＮＡはパネルＡの右に記載される。 図１５は、ベクター複製とｗｔＡＡＶ汚染のレーンの解析である。アデノウイ ルス（Ａｄ５ｔｓ１４９）に感染した２９３細胞を、１．５μｇのベクター（ｐ ＴＲｌａｃＺ）と１５μｇの記載のヘルパーＤＮＡでトランスフェクションした 。次に複製したウイルスＤＮＡをサザンブロットで解析した。二重測定でフィル ターを、ｌａｃＺプローブとプローブ結合させた。パネルＣとＤは、それぞれＡ ＡＶ断片とプローブ結合させた一次および２次Ｈｉｒｔ ＤＮＡを示す。一次Ｄ ＮＡ（パネルＡとＣ）については、レーンは以下の試料に対応する：レーン１（ 擬トランスフェクション細胞）、レーン２（ｐＩＭ４５）、レーン３（ｐＩＭＲ ＳＶ）、レーン４（ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐ）、レーン５（ＲＳＶｒｅｐΔ −ＣＭＶｃａｐ）、レーン６（ｐ５ｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐ）、レーン７（ＲＳ ＶｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐ）、レーン８（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ）。２次ＤＮＡ（ パネルＢとＤ）については、レーン８の試料がｗｔＡＡＶ（ＭＯＩ＝０．００１ ）とアデノウイルス（Ａｄ５ｔｓ１４９、ＭＯＩ＝２０）で感染された細胞由来 であること以外は、レーンは同じである。ＤＮＡサイズ標準物質（キロ塩基対） の位置は、各パネルの左に記載し、ダイマー複製型（ｄＲＦ）とモノマー複製型 （ｍＲＦ）に対応するハイブリダイズしているバンドは右に示してある。発明の詳細な説明 本明細書で引用されるすべての出願、特許、および文献は、参考のためその全 体が本明細書に組み込まれる。矛盾または不一致がある場合は、定義を含め本明 細書に従う。 定義： ２９３細胞 − アデノウイルスＥ１領域を含むアデノウイルスゲノムの一部 を有し発現するヒト胚腎細胞株。 ２９３−ＭＴ−ＤＢＰ細胞 − Ｅ１とＥ２Ａが欠失した組換えアデノウイル スベクターを補足するアデノウイルスゲノムの一部を発現するように修飾したヒ ト胚腎細胞株。１９９６年８月２８日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（ＡＴＣＣ）（１２３０１ パークローンドライブ（Parklwan Drive）、ロッ クビル（Rockville）、メリーランド州）に寄託され、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２ １８１を割り当てられた。 ２Ｃ４細胞 − Ｅ１とＥ４が欠失した組換えアデノウイルスベクターを補足 するアデノウイルスゲノムの一部を発現するように修飾したヒト胚腎細胞株。１ ９９６年８月２８日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ １２３０１ パークローンドライブ（Parklwan Drive）、ロックビル（Rockvill e）、メリーランド州）に寄託され、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１８２を割り当て られた。 ３Ｂ１細胞 − Ｅ１とＥ２Ａが欠失した組換えアデノウイルスベクターを補 足するアデノウイルスゲノムの一部を発現するように修飾したヒト胚腎細胞株。 １９９６年８月２８日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ） （１２３０１ パークローンドライブ（Parklwan Drive）、ロックビル（Rockvi lle）、メリーランド州）に寄託され、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２１８３を割り当 てられた。 Ｃｆｕ − コロニー形成単位。抗生物質耐性遺伝子を有するレトロウイルス およびアデノ随伴ウイルスベクターについては、感染後の抗生物質耐性細胞コロ ニーの数。１つの感染細胞から１つのコロニーが生成すると仮定する。 発現プラスミド − プラスミド中で運搬される遺伝子が細胞内で発現される ように作成した、細胞内で自律的に増殖することができる染色体外遺伝成分。 シスで − 同じＤＮＡ分子から。 トランスで − 異なるＤＮＡ分子から。 挿入突然変異誘発 − 宿主細胞ゲノムへの外来遺伝子（例えば、ウイルスＤ ＮＡ）の挿入による、標的遺伝子への突然変異の導入。細胞への外来ＤＮＡの導 入の結果としての細胞性遺伝子の突然変異の出現。 ＩＴＲ − 逆末端繰り返し配列。ウイルスの両端で逆転した形で繰り返され るＤＮＡ配列。 プロモーター−トランス遺伝子カセット − 遺伝子産物の産生を指令するの に必要な成分を含有するＤＮＡ配列と、遺伝子自身のＤＮＡ配列の組合せ。 形質導入 − 生物の細胞への外来ＤＮＡの導入（インビボ）。 トランスフェクション − 培養細胞への外来ＤＮＡの導入（インビトロ）。 化学的手段を使用する外来ＤＮＡの導入による真核細胞の遺伝的修飾。一過性ト ランスフェクションでは、組み込みされていない外来ＤＮＡから発現が起き、ト ランスフェクション後数日間検出される。 トランス遺伝子 − 別の生物に安定に取り込まれた遺伝子。 休止細胞 − 活発な分裂をしていない細胞。 組換え − ２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子（この場合はウイルス配列）の 間の物理的相互作用であり、分子の間でＤＮＡ配列の交換が起きる。 力価 − １ml当たりに産生されるウイルス粒子の数。産生されたウイルス粒 子の数の測定系は、問題のウイルスにより大きく異なる。最大数の細胞への、ウ イルスにより運搬される治療用遺伝子の導入を可能にするため、遺伝子治療の成 功には一般的に高力価が必要である。 ベクター − 生物に遺伝子を提供するために使用される、通常は生物物質（ 例えば、ウイルス）であるビヒクル。細胞への外来遺伝子の導入を促進する試薬 。 ＬａｃZ遺伝子 − 細胞性遺伝子マーカーとして使用される細菌の遺伝子。 その発現は、基質Ｘ−ｇａｌの存在下での青い発色により検出される。 パッケージング細胞 − ＡＡＶからのｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を含有する プラスミドでトランスフェクションされた細胞。 本明細書に記載の研究の目的は、ｒＡＡＶパッケージングに必要な律速成分を 決定することであった。基礎的なレベルでこの過程が理解できれば、ｒＡＡＶ産 生のすべての方法にとって有益であろう。ｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子（または両 方）の発現を選択的に増加させることにより、Ｃａｐタンパク質産生がｒＡＡＶ 産生の１つの律速因子であることが証明される。 Ａ．トランス産物の準備 １．アデノウイルスタンパク質 前述のように、アデノウイルスタンパク質は、ウイルス産生性ＡＡＶ感染を引 き起こすのに必要である。ヘルパーアデノウイルスの非存在下では、ＡＡＶは細 胞性ゲノム中に組み込まれ、細胞がアデノウイルスで感染されるまで潜伏する。 ヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子には、特にＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２ Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、およびＶＡ ＲＮＡがある（エヌ・ムジカ（Muzycka，N. ）、Curr．Top．Micro．Immunol．158: 97-129，1992）。組換えＡＡＶベクター を作成するための標準的方法は、必要なヘルパータンパク質の充分なレベルを提 供できるようにするために、標的細胞のアデノウイルス感染に依存してきた。Ａ ＡＶベクター産生中に起きる野生型アデノウイルスの好ましくない産生を避ける ために、欠失を含むアデノウイルスが、必須のアデノウイルスタンパク質をトラ ンスで提供する細胞株で使用される。あるいは、温度感受性アデノウイルス複製 突然変異体が、非許容温度で使用される。 本発明の１つの実施態様において、プラスミドの複製を可能にするＡＡＶ Ｉ ＴＲ配列が結合した必須のアデノウイルスヘルパー遺伝子を含有するヘルパープ ラスミドが提供される。ヘルパープラスミドは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子を含有する。これらの各遺伝子はまた、 それ自身のプロモーターを含有し、これにより転写が起きる。ヘルパープラスミ ドで使用できる別のプロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、ＥＩＡ、Ｅ Ｆ１ａ、アクチン、サイトケラチン１４、サイトケラチン１８、ＰＧＫならびに 当業者に公知の他のものがあるが、これらに限定されない。 複製しているプラスミドへの必須のアデノウイルス遺伝子の提供は、宿主細胞 をアデノウイルスで感染させることの代替法である。プラスミド中のＡＡＶ Ｉ ＴＲ配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の制御下の複製開始点として機能して、 プラスミドのコピー数を増加させる。コピー数の増加により、プラスミド上の遺 伝子によりコードされるタンパク質のレベルが増加する。すなわち、本発明のヘ ルパープラスミドは、ＡＡＶベクター産生に必要なアデノウイルスタンパク質を 提供し、アデノウイルス産生の可能性を排除する。さらなる利点は、プラスミド の複製は遺伝子コピー数を投入レベルより上昇させるため、アデノウイルスタン パク質のレベルは、投入したプラスミドＤＮＡの量により限定されないことであ る。 別の実施態様において、複製開始点には、ＳＶ４０複製開始点、エプスタイン バー（ＥＢＶ）複製開始点、ならびに当業者に公知の他の複製開始点があるが、 これらに限定されない。例えば複製開始点が活性化タンパク質（例えば、Ｔ抗原 を必要とするＳＶ４０複製開始点、ＥＢＮＡタンパク質を必要とするＥＢＶ複製 開始点）を必要とする場合、その活性化タンパク質は、細胞株供給源を作成する ために安定なトランスフェクションにより提供されるか、または適切な遺伝子を 含有するプラスミドによる一過性トランスフェクションにより提供される。 本発明のヘルパープラスミドを作製するために、標準的組換えＤＮＡ技術が使 用できる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，エフ・アウスベ ル（Ausubel.，F.）ら、ワイリーアンドサンズ（Wiley and Sons）、ニューヨー ク州 １９９５を参照）。このような方法には、アデノウイルス遺伝子とＩＴＲ 配列の境界の適合性のある制限部位、または制限部位を含有するＤＮＡリンカー 配列を使用するもの、ならびに当業者に公知の他の方法がある。アデノウイルス ＤＮＡ情報については、アール・ジェイ・ロバーツ（Robert，R.J.，）、Adenov irus DNA: The Viral Genome and Its Expression、ダブリュー・オーバーフラ ー（Overfler，W.）編、マチヌス・ニホフ・パブリッシング（Matinus Nihoff P ublishing）、ボストン、１９８６）を参照されたい。例えば、ｐＢＲ３２２（ ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー、マサチ ューセッツ州）、ｐＲｅｐ９（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カ リホルニア州）またはｐＢＳ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイヤ、カリ ホルニア州）のような分子生物学の分野で日常的に使用されるプラスミドが、ア デノウイルス遺伝子やＡＡＶ ＩＴＲが挿入されるヘルパープラスミドの基礎と して使用できる。アデノウイルス遺伝子は、任意の位置でヘルパープラスミド中 に入れられる。本発明のこのような複製しているヘルパープラスミドの具体的な 実施態様を、図１に示す。 ヘルパープラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の供給源と組 合せると、組換えＡＡＶ、ならびに組換えＡＡＶゲノムの作成に使用される。当 該分野で公知の技術を用いてプラスミドにより細胞をトランスフェクションする と、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子発現の開始に必要なアデノウイルス遺伝子産物が得ら れる。 ２．ＡＡＶタンパク質 組換えＡＡＶベクターのストックを作成するために、標準的アプローチにより 、ＡＡＶベクタープラスミドとともに標的細胞を同時トランスフェクションする ために使用されるプラスミド上でＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が提供され る。トランスフェクションの結果として産生されるｒｅｐおよびｃａｐタンパク 質のレベルは、ＡＡＶベクターの産生を最大にすることと関係がある。これは、 ｒｅｐタンパク質がｃａｐ遺伝子の転写を活性化し、組換えゲノムのパッケージ ングに関与するＡＡＶ構造タンパク質が産生されるためである。 これらのＡＡＶタンパク質のレベルを上昇させてベクター産生を増強する試み は、問題がある（アール・エム・コチン（Kotin，R.M．）、Human Gene Therapy 5: 793-81，1994）。問題の１つは、細胞に対する高レベルのｒｅｐタンパク質 の毒性のようである。 本発明のこの面において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ Ｉ ＴＲ配列を含有する複製しているヘルパープラスミド上で提供される。ｒｅｐタ ンパク質は複製開始点としてＩＴＲを活性化し、プラスミドを複製させ、その結 果コピー数が増加する。この方法の利点は、ｒｅｐタンパク質レベルは、プラス ミドを用いるトランスフェクションの効率に依存するのみでなく、トランスフェ クション後のプラスミドの複製の機能に依存することである。ＡＡＶ ｒｅｐお よびｃａｐ遺伝子を含有する複製しているヘルパープラスミドの例を図２に示す 。本発明のこの面の他の実施態様において、複製開始点には、ＳＶ４０複製開始 点、エプスタインバー（ＥＢＶ）複製開始点、ならびに当業者に公知の他の複製 開始点があるが、これらに限定されない。例えば複製開始点が活性化タンパク質 （例えば、Ｔ抗原を必要とするＳＶ４０複製開始点、ＥＢＮＡタンパク質を必要 とするＥＢＶ複製開始点）を必要とする場合、その活性化タンパク質は、細胞株 供給源を作成するために安定なトランスフェクションにより提供されるか、また は適切な遺伝子を含有するプラスミドによる一過性トランスフェクションにより 提供される。 さらに別の実施態様において、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、複製し ていないプラスミド上で提供され、これは複製開始点を含有しない。このような 複製していないプラスミドはさらに、ウイルスの産生を最適化するために、細胞 の複製器官が、複製している組換えＡＡＶゲノムに向いていることを確実にする 。さらにある研究は、高レベルｒｅｐタンパク質は細胞に毒性があり（ムジカ（ Muzycka）、N.，Curr．Top．Micro．Immunol．158: 97-129，1992）、複製して いないプラスミド上にｒｅｐ遺伝子を提供することはこの可能性を低下させるか も知れないことを示唆している。このような複製していないプラスミドによりコ ードされるＡＡＶタンパク質のレベルは、これらの遺伝子の発現を指令するため の特定のプロモーターの使用により調節される。このようなプロモーターには、 ＡＡＶプロモーター、ならびに外来性のプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ 、ＭＭＴＶ、ＥＩＡ、ＥＦ１ａ、アクチン、サイトケラチン１４、サイトケラチ ン１８、ＰＧＫ）、ならびに当業者に公知の他のものがあるが、これらに限定さ れない。複製していないＡＡＶヘルパープラスミドの例を図３に示す。 これらのヘルパープラスミドにより産生されるｒｅｐおよびｃａｐタンパク質 のレベルは、目的のタンパク質のレベルに最適の各遺伝子のプロモーターを選択 することにより、個々に制御される。特定の遺伝子（例えば、ｒｅｐ遺伝子）の 具体的な調節は、誘導性プロモーターの使用により達成することもできる。この ような誘導性プロモーターには、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン、ならびに当業者 に公知の他のものがあるが、これらに限定されない。 ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶゲノム配列のパッケージングを防 ぐに、ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡ断片を含有するプラスミドが、最適なパッケ ージングの長さ以上にＤＮＡを伸長させる「詰め物」（"stuffer"）断片をＡＡ Ｖゲノムに導入することにより修飾される。すなわち、ヘルパー断片はＡＡＶウ イルス粒子中にパッケージングされない。これは安全な特徴であり、最適なパッ ケージングサイズを超えない組換えＡＡＶベクターゲノムのみがウイルス粒子中 にパッケージングされることを確実にする。詰め物配列を取り込むＡＡＶヘルパ ー断片は、野生型のゲノムの４．６kbの長さを超え、野生型の１０５％を超える 長さはパッケージングされない。詰め物断片は、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺 伝子のような非ウイルス供給源から得られる。 本発明のヘルパープラスミドを作製するために、標準的組換えＤＮＡ技術が使 用され（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，エフ・アウスベル （Ausubel.，F.）ら、ワイリーアンドサンズ（Wiley and Sons）、ニューヨーク 州 １９９５を参照）、遺伝子とＡＡＶ ＩＴＲ配列（使用される場合）の間の 境界の適合性のある制限部位、または制限部位を含有するＤＮＡリンカー配列の 利用、ならびに当業者に公知の他の方法がある。アデノウイルスＤＮＡ配列情報 については、エー・ストリバスタバ（Strivastava，A．）ら、J．Virol．45: 55 5-564，1983 を参照されたい。分子生物学の分野で日常的に使用されるプラスミ ドが、骨格として使用できる。例えば、ＡＡＶ遺伝子の挿入については、ｐＢＲ ３２２（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー 、マサチューセッツ州）、ｐＲｅｐ９（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジ エゴ、カリホルニア州）またはｐＢＳ（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイ ヤ、カリホルニア州）、および複製しているプラスミドの場合は、ＡＡＶ ＩＴ Ｒがある。 ３．ハイブリッドヘルパープラスミド 組換えＡＡＶベクターのストックの作成には、組換えＡＡＶゲノムの転写活性 化、複製およびパッケージングを促進するために、トランスで提供されるＡＡＶ とアデノウイルスタンパク質の両方が必要である。標準的方法は、標的細胞への ＡＡＶ遺伝子の、プラスミドをベースにした提供を利用してきた。アデノウイル スによる標的細胞の感染は、アデノウイルス遺伝子を提供するために使用される 。この多工程プロトコールには、トランスフェクションと感染の共同が必要であ る。さらに、アデノウイルスによる細胞の感染は、アデノウイルスの産生を可能 にし、これは純粋なＡＡＶベクターのストックを作成しようとする場合は好まし くない。さらに、ベクターの作成に必要とされない多くのウイルス遺伝子の導入 は、ＡＡＶ産生に必須のタンパク質のより効率的な産生に向かうはずの転写およ び複製機構を迂回させる。ＡＡＶベクターは感染により導入されたアデノウイル ス遺伝子を使用して産生されているが、高収率のベクター産生にはまだ問題があ る。従って、トランスで必要なタンパク質をコードする遺伝子のより効率的な提 供は、ＡＡＶベクターの産生を改良するであろう。 本発明は、ＡＡＶの高収率のためにトランスで必要なすべての必須のウイルス タンパク質の単純な提供方法を与える。必須のタンパク質をコードするＡＡＶお よびアデノウイルス遺伝子を運搬するために、ハイブリッドプラスミドが作製さ れる。このようなプラスミドの利点は、特にトランス作用性タンパク質をコード するすべての遺伝子を提供する細胞への単一の侵入、そのようなすべての細胞の 調和した供給、および不要なアデノウイルス遺伝子の排除に由来するアデノウイ ルス産生を避けることができること、などである。このようなプラスミドを図４ に示す。このプラスミドは、必須のアデノウイルス遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、およびＶＡ ＲＮＡ）を含有する。このプラスミドはま た、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにプラスミドの複製に必要なＡ ＡＶ ＩＴＲ配列を含有する。この遺伝子は、それ自身のプロモーターを使用し て転写される。またプロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、Ｅ１Ａ、Ｅ Ｆ１ａ、アクチン、サイトケラチン１４、サイトケラチン１８、ＰＧＫ、並びに 当業者に公知の他のプロモーターがあるが、これらに限定されない。アデノウイ ルス遺伝子は、図４に示す順序でプラスミド中に挿入されるか、または任意の数 の異なる位置に、当業者に公知の方法により挿入される。 トランスで必要とされるすべての必須の遺伝子は、クローニングを簡単にする ために２つのプラスミド上で提供される。すなわち、ハイブリッドヘルパープラ スミド上のＡＡＶおよびアデノウイルス遺伝子は、クローニングのための任意の 最適な配置で、２つのプラスミドにより運搬される。すなわち、ＡＡＶおよびア デノウイルス遺伝子は、別々のプラスミド上にある必要はない。 本発明のヘルパープラスミドを作製するために、遺伝子とＩＴＲ配列の間の境 界の適合性のある制限部位、または制限部位を含有するＤＮＡリンカー配列の利 用、ならびに当業者に公知の他の方法などの、標準的組換えＤＮＡ技術（例えば 、Current Protocols in Molecular Biology，エフ・アウスベル（Ausubel.，F. ）ら、ワイリーアンドサンズ（Wiley and Sons）、ニューヨーク州 １９９５を 参照）が使用された。アデノウイルスＤＮＡ配列の情報の文献は、前記で引用さ れている。例えば、ｐＢＲ３２２（ニューイングランドバイオラボズ（New Engl and Biolabs）、ビバリー、マサチューセッツ州）、ｐＲｅｐ９（インビトロゲ ン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州）またはｐＢＳ（ストラタジー ン（Stratagene）、ラホイヤ、カリホルニア州）のような日常的に使用され るプラスミドが、アデノウイルスやＡＡＶ遺伝子およびＡＡＶ ＩＴＲの挿入の ために使用できる。アデノウイルス遺伝子は、任意の位置でヘルパープラスミド 中に入れられる。 ４．組換えＡＡＶベクターの産生 トランスで必要な必須のタンパク質を提供するヘルパープラスミドは、組換え ＡＡＶベクターのストックを作成するために使用される。これらのプラスミドは 、任意の数のトランスフェクション方法（特に、リン酸カルシウムトランスフェ クション、リポフェクチンまたは当業者に公知の他の方法）を使用して標的細胞 に導入される。ヘルパープラスミド対目的の遺伝子を含有するベクタープラスミ ドの量の比率は、１：１〜１：１０の範囲である。この方法では、組換えＡＡＶ ベクターが産生され、このベクタープラスミドは、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する組 換えＡＡＶゲノムを含有する。 組換えＡＡＶベクターは、８個のローラーボトル中で２９３細胞を使用して産 生される（１Ｘ１０⁹細胞／ml）。細胞は、ヘルパープラスミドとＡＡＶベクタ ープラスミドの両方により、ベクター：ヘルパー比１：１０でトランスフェクシ ョンされる。プラスミドは、任意の数のトランスフェクション方法（リン酸カル シウム、リポフェクチンまたは当業者に公知の他の方法があるが、これらに限定 されない）を使用して標的細胞に導入される（例えば、Current Protocols in M olecular Biology,エフ・アウスベル（Ausubel.，F.）ら、ワイリーアンドサン ズ（Wiley and Sons）、ニューヨーク州 １９９５を参照）。好適な実施態様に おいて、リポフェクチンがトランスフェクションに使用される。アデノウイルス 感染は、感染多重度（ＭＯＩ）２０で開始される。アデノウイルス株は欠失ウイ ルスでもよく、この場合、補足性遺伝子が、細胞株または非許容性温度（３９℃ ）で複製できない温度感受性突然変異体（例えば、ｔｓ１４９）中に組み込まれ る。トランスフェクション／感染された細胞は、次に適切な温度で２日間インキ ュベートされる。インキュベート後、細胞を採取し、次にベンゾナーゼ（benzon ase）（アメリカンインターナショナルケミカル（American International Chem ical）、ナチック（Natick）、マサチューセッツ州）の存在下で、３回の凍結融 解サイクルを行って溶解する。次に溶解物に１％デオキシコール酸と０．２ ５％トリプシンを加え、次に３７℃で３０分インキュベートする。次に細胞溶解 物（２個のローラーボトル／勾配）を、ＳＷ２８ロータ中でＣｓＣｌ段階勾配（ １．５μｇ／ml〜１．３６ｇ／ml）にかけ、２６Ｋで４℃で６時間遠心分離する 。画分を得て、次にＮＶＴ６５ロータを用いて２回の平衡勾配で精製し、６０Ｋ で４℃で２０時間遠心分離する。平衡勾配からの画分を屈折計でスクリーニンク 化、プールする。プールした画分を、１％ショ糖含有ＰＢＳで４℃で２時間の透 析を３回行う。 ５．組換えＡＡＶベクター産生のための測定法 トランスで必要なタンパク質の供給源としてのヘルパープラスミドの効率は、 ＡＡＶベクターのストックの収率から測定される。ウイルスの収率を測定するた めに、ＡＡＶ感染中心測定法を用いて、感染性子孫の産生について測定する。組 換えＡＡＶベクターは、産生後、前述の精製プロトコールを使用して回収される 。測定法は、感染性ＡＡＶ子孫が産生プロトコールで産生されるかどうかを示す 。 この測定法は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびグル タミンを補足したＤＭＥ培地中の０．１ml／ウェルでウェル当たり１×１０⁵細 胞の密度で、２９３細胞を１日目にプレートに蒔く。２４時間後、細胞をＭＯＩ ２０のアデノウイルスとＭＯＩ ２の野生型ＡＡＶで感染させる。ウイルスを 同じ培地に懸濁し、各ウェルに０．１mlを加えて感染を開始させる。ＡＡＶベク ターの試料をウェルに加え（２５〜１００μｌの溶解物または希釈物）、プレー トを適切な温度（野生型については３７℃、アデノウイルス温度感受性突然変異 体については３９℃）で２４〜３０時間インキュベートする。感染の翌日、培地 を注意深く細胞から除去する。５mM ＥＤＴＡを含有する０．２mlの冷ＰＢＳを 各ウェルに加え、プレートを氷の上に置く。 次にろ過装置の準備をして、ＰＢＳであらかじめ湿らせたニトロセルロースフ ィルターを所定の位置に置き、ろ過装置の上の部分に５mlのＰＢＳを加える。プ レート中の細胞を、ピペットで再懸濁する。ろ過装置のＰＢＳ緩衝液に０．０５ mlの細胞懸濁液を加え、回転させて混合する。装置に吸引をかけて、細胞をフィ ルター上に沈着させる。フィルターを１０分間風乾する。変性溶液、次に中和溶 液を使用して、フィルター上で細胞を直接溶解する。各溶解後５分間紙の上でフ ィルターを乾燥し、次に１０分間風乾する。フィルターを２×ＳＳＣで洗浄し、 １０分間風乾し、真空オーブン中で２時間焼く。上記のように調製し２×ＳＳＣ で湿らせたフィルターを使用して、目的の遺伝子を検出するプローブへのハイブ リダイゼーションを行う。３０〜４０mlのクイック−ハイブ（Quick-Hyb）（登 録商標）（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイヤ（La Jolla）、カリホルニ ア州）を使用して、回転水浴中で６８℃で２〜４時間インキュベートして、フィ ルターをプレハイブリダイゼーションすることができる。標識したプローブを、 次にクイックーハイブ（Quick-Hyb）（登録商標）溶液に加え、６８℃で一晩イ ンキュベートする。翌日フィルターを洗浄する（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで 室温で５分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温で１５分間、次に０．１×Ｓ ＳＣ、０．５％ＳＤＳで６５℃で２時間）。フィルターを−８０℃で一晩フィル ムに感光させて、オートラジオグラフィーを作成する。 オートラジオグラフィーでフィルター上の感染中心の数を数える。感染中心の 数に、試料の調製物に使用した希釈率を掛けて、出発物質の力価を決定する。 産生されたＡＡＶベクターがレポーター遺伝子を含有する場合、ＡＡＶベクタ ーの力価を決定するための別の方法が使用できる。例えば、ｌａｃＺ遺伝子を使 用する場合、遺伝子産物（β−ガラクトシダーゼ）の発現についてＸ−ｇａｌを 使用して、感染細胞を染色することができる。力価は、例えばプレートのウェル 中の青く染色された細胞を数えることにより定量される。 Ｂ．シス作用性配列を含有するＡＡＶベクタープラスミド作製体 本発明はまた、効率的な複製とパッケージングのために必要なＡＡＶゲノム中 のシス作用性配列を利用するベクタープラスミド設計により、組換えＡＡＶベク ターの産生を増加させる手段を提供する。本発明はまた、このようなシス作用性 配列を提供するように設計されたベクタープラスミドを提供する。 現在のベクタープラスミドの設計では、組換えゲノムを作成するためにおよび 他のＡＡＶ配列を提供しないようにするために、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の間に目的 の遺伝子を置く。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ベクター産生中の組換えゲノムの複製 とパッケージング、ならびにＡＡＶベクターによる導入後の細胞へのベクターＤ ＮＡの組み込みを促進する、シス作用性機能を有する。すなわち、ＩＴＲ配列は 、 組換えＡＡＶベクターの設計では維持される。しかしＡＡＶベクターの高力価の 産生が困難なことは、ＩＴＲ自身は、高力価のベクターのストックの産生に必要 なすべてのシス作用性機能を提供するには不充分であることを示す。従って、組 換えＡＡＶゲノムの複製および／またはパッケージングの効率を向上させるため に、ベクター作製体内にＩＴＲ以外に他のシス作用性ＡＡＶ配列が必要である。 ＡＡＶゲノム内のシス作用性成分は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質との相互作用 を介してゲノムのレスキューと複製を促進すると考えられている。ｒｅｐタンパ ク質がＡＡＶ ＩＴＲ内の部位ならびにＡＡＶ ｐ５およびｐ１９プロモーター 内の部位に結合することは公知である（ディー・エム・マカーティー（McCarty ，D.M．）ら、J．Virol．65: 2936-2945，1991 ；ディー・エム・マカーティー （McCarty，D.M．）ら、J．Virol．68: 4988-4997，1995）。シス作用性パッケ ージング成分はまた、最大の粒子産生のために組換えＡＡＶベクターゲノム中で 必要であるようである。 本発明は、ＩＴＲ配列以外にＡＡＶ配列を含有するベクター骨格作製体を使用 してＡＡＶベクター産生を改良するための方法を提供する。ＡＡＶベクター骨格 は、ｒｅｐ結合部位または決定的に重要なパッケージング配列を含有するＡＡＶ ゲノム断片を含有してもよい。すべてのシス作用性ＡＡＶ配列の正確な数と位置 はまだ規定されていないため、すべてのシス作用性配列（まだ規定されていない ものも含む）を含むために、ＡＡＶゲノムのかなりの部分を含有するベクタープ ラスミドの作製が重要である。これらのベクタープラスミド作製体は組換えＡＡ Ｖベクターのストックの産生を改良するが、本発明のさらなる有用性は、改良さ れたベクター産生により必須のシス作用性配列が機能的に同定されることである 。 このようなシス作用性配列を含有するベクター作製体は、公知の技術を用いて 調製される。（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，エフ・アウ スベル（Ausubel.，F.）ら、ワイリーアンドサンズ（Wiley and Sons）、ニュー ヨーク州 １９９５を参照）。ＡＡＶゲノム中の既知の制限部位の存在は、組換 えＡＡＶベクター内に挿入するためのサブゲノム断片を得るのに使用される。組 換えゲノムがＡＡＶ粒子のパッケージング能力を超えないように、断片の長さが 選択される。必要であれば、「詰め物」ＤＮＡ配列を作製体に加えて、比較のた めに標準的なＡＡＶゲノムのサイズを維持する。このような断片は、非ウイルス 性供給源、例えばｌａｃＺ、または公知の他の遺伝子から得られ、これらを当業 者は利用することができる。 本発明は、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する目的の遺伝子を含有するベクタープラス ミドにＡＡＶサブゲノム断片を加える一連のベクタープラスミド作製体を提供す る。図５を参照されたい。これらの断片のサイズは、１．７〜２．１kbの範囲で ある。これらの断片はＡＡＶゲノムのコード領域または非コード領域を含有する ため、パッケージングへの作用は、トランスおよびシスで作用する成分に起因す るかも知れない。記載した作製体のさらなる修飾物（例えば、より小さいＡＡＶ 断片の挿入）は、本発明の範囲内にあり、当業者はこれを容易に作成することが できる。ゲノム中のコード領域より小さいサブゲノム断片を使用すると、ベクタ ー産生について観察される作用は、シス作用性が特徴である。例えば、サブゲノ ム断片を最適のベクター産生のために必要な最小の長さにするには、標準的欠失 解析法が適している。規定されたＡＡＶシス作用性断片（例えば、ｒｅｐ応答性 成分）は、ベクタープラスミド内に特異的にクローン化される。 本発明は、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターの収率を決定するための、 効率的なレポーター測定法を提供する。こうして、高力価のストックの産生によ り、最も効率的な作製体の設計が同定される。 ＡＡＶ配列が加えられる場合、産生効率の改良を測定するために、レポーター 遺伝子とＡＡＶ ＩＴＲ配列を含有するプラスミドが使用される。このプラスミ ドは、追加の作製体（例えば、プラスミドｐＴＲ−ＣＡＴ、図６に示す）を作成 するために、ＡＡＶサブゲノム断片の挿入により修飾することができる。このプ ラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下のクロラムフェニコールアセチルトラ ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ハイブリッドイントロンおよびＢＧＨポリＡ 部位を含む発現カセットを含有する。発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ領域をｐ ＵＣ１９にクローニングすることにより得られる高コピー数プラスミドであるｐ ＵＣ−ＴＲ中にクローン化された。（ニューイングランドバイオラボズ（New En gland Biolabs）、ビバリー、マサチューセッツ州）。ｐＵＣ−ＴＲに発現カセ ットを挿入すると、ｐＴＲ−ＣＡＴが得られた。リンカーを挿入するかまたは 当業者に公知の他の技術を使用して、ＣＡＴカセットの５’末端および３’末端 に、制限部位を付加してもよい。ＡＡＶサブゲノム断片は、これらの制限部位で 挿入される。このレポータープラスミドは、発現カセットの５’末端または３’ 末端に位置する、図５に示すサブゲノム断片を収容できるであろう。最適化する ためには、両端への断片の挿入を試験して、挿入体の位置による位置的影響を調 べることが必要であろう。断片はまた、ベクタープラスミドの両端に挿入するこ とができる。規定されたシス作用性成分の１つまたはそれ以上のコピーは、産生 されるベクターの量を増加させることができる。 新規の作製体のパッケージングには、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（例 えば、例１に記載のｐＩＭ４５を使用して）、ならびに必須のアデノウイルス遺 伝子のパッケージングが提供されることが必要である。ＡＡＶゲノムを含有する プラスミドは、新規の作製体と同時トランスフェクションされる。本発明のアデ ノウイルス感染またはアデノウイルスヘルパープラスミド（セクション１を参照 、前述）は、他の必要な遺伝子を提供する。 感染性子孫（前記セクション５を参照）の量を測定するために、適切なプロー ブを利用する感染中心測定法が使用される。あるいは、ＡＡＶベクター中のレポ ーター遺伝子産物を直接測定できる（例えば、このレポーター遺伝子が存在する 場合は、ＣＡＴ酵素測定法が使用される、例えばｐＴＲ−ＣＡＴ（Current Prot ocols in Molecular Biology，エフ・アウスベル（Ausubel.，F.）ら、ワイリー アンドサンズ（Wiley and Sons）、ニューヨーク州 １９９５））。 レポーター遺伝子とＡＡＶシス作用性断片を含有する最終のプラスミド作製体 が、ＡＡＶ粒子のためのパッケージング長さを超えないという条件下で、ベクタ ープラスミド作製体を測定するのに別のレポーター遺伝子を使用してもよい。他 のレポーター遺伝子産物は、適切な生化学的測定法を使用して、感染性ＡＡＶ粒 子中に検出される。 本発明は、ヒト第１９染色体上のＡＡＶ組み込み座を発現することができる非 ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。非ヒトトランスジェニック哺乳動 物の例には、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラットお よびマウスがある。 本発明のポリペプチドの生理学的および行動的役割を解明する動物モデル系は 、種々の方法を用いて目的のポリペプチドの発現が変更または修飾されているト ランスジェニック動物を作成することにより、産生される。このような方法の例 には、トランスジェニック動物を産生するために、微量注入法、レトロウイルス 感染または当業者に公知の他の手段により、適切な受精した胚への、目的のポリ ペプチドをコードする核酸の正常なまたは突然変異体の挿入がある。例えば、カ ーバー（Carver）ら、Bio/Technology 11: 1263-1270，1993：カーバー（Carver ）ら、Cytotechnology 9: 77-84，1992 ；クラーク（Clark）ら、Bio/Technolog y 7: 487-492，1989 ；シモンズ（Simons）ら、Bio/Technology 6: 179-183，19 88 ；スワンソン（Swanson）ら、Bio/Technology 10: 557-559，1992；ベランダ ー（Velander）ら、Proc．Natl．Acad.Sci．USA 89: 12003-12007，1992 ；ハマ ー（Hammer）ら、Nature 315: 680-683，1985 ；クリンペンフォルト（Krimpenf ort）ら、Bio/Technology 9: 844-847，1991 ；エバート（Ebert）ら、Bio/Tech nology 9: 835-838，1991 ；シモンズ（Simons）ら、Nature 328: 530-532，198 7 ；ピッチウス（Pittius）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 5874-5878，1 988；グリーンバーグ（Greenberg）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 8327- 8331，1991；ホワイトロー（Whitelaw）ら、Transg．Res．1: 3-13，1991；ゴー ドン（Gordon）ら、Bio/Technology 5: 1183-1187，1987 ；グロスベルト（Gros veld）ら、Cell 561: 975-985，1987 ；ブリンスター（Brinster）ら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 88: 478-482，1991；ブリンスター（Brinster）ら、Proc． Natl．Acad．Sci．USA 85: 836-840，1988；ブリンスター（Brinster）ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 82: 4438-4442，1985；アル−シャウィ（Al-Shawi）ら 、Mol．Cell．Biol．10(3): 1192-1198，1990 ；バン・デル・プッテン（Van De r Putten）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: 6148-6152，1985；トンプソン （Thompson）ら、Cell 56: 313-321，1989；ゴードン（Gordon）ら、Science，2 14: 1244-1246，1981 ；およびホーガン（Hogan）ら、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual（コールドスプリングハーバーラボラトリー（Col d Spring Harbor Laboratory）、1986）を参照されたい。 目的のポリペプチドの発現または構造の制御を変化させるために、別の方法 （トランスジェニック動物での未変性の遺伝子座との、これらの遺伝子の突然変 異体または正常なものとの相同的組換え）が使用できる（カペッチ（Capecchi） ら、Science 244: 1288，1989 ；チマー（Zimmer）ら、Nature 338: 150，1989 を参照）。相同的組換え法は当該分野で公知である。相同的組換えは、未変性の （内因性）遺伝子を組換えまたは突然変異遺伝子で置換して、未変性の（内因性 ）タンパク質を発現できないが、例えばヒトＡＡＶ組み込み座を発現させる組換 えタンパク質を発現することができる動物を産生することができる。 相同的組換えに比較して、微量注人法は、宿主遺伝子を取り出すことなく、宿 主ゲノムに遺伝子を付加する。微量注入法は、内因性および外因性ポリペプチド の両方を発現することができるトランスジェニック動物を産生する。トランス遺 伝子の発現を制御する手段を提供するために、誘導性プロモーターを核酸のコー ド領域に結合することができる。組織特異的制御成分はコード領域に結合して、 トランス遺伝子の組織特異的発現を引き起こすことを可能にする。トランスジェ ニック動物モデル系は、組み込みおよび長期のトランス遺伝子発現の同定と確認 のためのベクター組成物のインビボスクリーニングに有用である。 Ｃ．ＡＡＶヘルパープラスミドの作製 ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の発現レベルによりｒＡＡＶパッケージン グが制限されるかどうかを調べるために、一連のヘルパープラスミドを作製した （図１１）。ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、内因性ＡＡＶプロモータ ー（ｐ５とｐ４０）を、それぞれＲＳＶ ＬＴＲとＣＭＶ ＩＥプロモーターで 置換することにより増加させた。出発のヘルパープラスミドであるｐＩＭ４５（ マカーティー（McCarty）ら、１９９１）は、野生型ＡＡＶゲノムを包含するが 末端繰り返しを持たない配列を含有する（ヌクレオチド１４５〜４４９３）。ｐ ＩＭＲＳＶは、ｐＩＭ４５を修飾したもの（ＲＳＶ ＬＴＲがｐ５を置換してい る）である。ｐ４０はＲｅｐコード領域内に位置するため、ｐ４０をＣＭＶ Ｉ Ｅプロモーターで置換できるようにするために（ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐの ように）、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を分離した。この方法により、ｐ４０と ＣＭＶプロモーターの下流に４３１塩基対の配列の直接の繰り返しを有するベク ターが作成された。組換えによる野生型ＡＡＶの生成を防ぐために、この作製 体のｒｅｐ ＯＲＦ内に存在するｐ４０プロモーターを、部位特異的突然変異誘 発により不活性化した。ｐＩＭ４５のように内因性ＡＡＶプロモーターからｒｅ ｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するように、しかしｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐに 直接比較できるように、ｐ５ｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐを作製したが、Ｒｅｐおよ びＣａｐコード領域は分離した。ＲＳＶｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐとＲＳＶｒｅｐ Δ−ｐ４０ｃａｐは、それぞれｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐとｐ５ｒｅｐΔ−ｐ ４０ｃａｐの誘導体であり、ｐ５はＲＳＶ ＬＴＲで置換されている。 Ｄ．ＡＡＶヘルパープラスミドからのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子発現 各ＡＡＶヘルパープラスミドから発現されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の 量を、ウェスタンブロット解析により推定した（図１２）。Ａｄｔｓ１４９感染 （ＭＯＩ＝２０）の存在下で２９３細胞にトランスフェクションして産生された ４つのＲｅｐタンパク質は、２９３細胞を野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）とＡｄｔ ｓ１４９で同時感染した後に検出される対応するタンパク質と一緒に泳動する。 各ヘルパープラスミドについて、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ５２が、産生される主要な タンパク質である。スプライスされたメッセージから翻訳されるＲｅｐ６８とＲ ｅｐ４０は、低レベルで観察された。これらはまた、ｗｔＡＡＶ感染で主要でな いタンパク質として検出された。 ｐ５プロモーターをＲＳＶ ＬＴＲで置換すると、Ｒｅｐ７８のレベルの上昇 が観察された。これは、３つのすべてのヘルパー（ｐＩＭＲＳＶ、ＲＳＶｒｅｐ Δ−ＣＭＶｃａｐおよびＲＳＶｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐ）についてであった。す べての作製体でＲｅｐ５２はｐ１９転写体から得られたため、Ｒｅｐ５２の量に 変化はなかった。 ３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）は、すべてのヘ ルパープラスミドから、ｗｔＡＡＶ感染で観察された１：１：１０の比で産生さ れた（図１２）。ｐ４０をＣＭＶ ＩＥプロモーターで置換すると、すべての３ つのカプシドタンパク質の合成が増加した（図１２レーン２対レーン４）。しか し、ＲＳＶ ＬＴＲからのｒｅｐ遺伝子の発現は、ｐ４０からのｃａｐ発現に対 してダウンレギュレーション作用を有するようであった。すなわち、ｒｅｐのプ ロモーター制御性発現としてｐ５を含有する親プラスミドに対して、ｐＩＭＲＳ Ｖについてはカプシドタンパク質のレベルが低下した（ｐＩＭ４５；レーン３と ２を比較されたい）。ＣＭＶ ＩＥプロモーターからのカプシドタンパク質発現 について、同様のしかしあまり顕著ではない作用が観察された（レーン５対レー ン４）。後者の場合、ｃａｐ ｍＲＮＡにもノーザン解析で対応する低下が見ら れ、Ｒｅｐ７８の過剰発現により、ＣＭＶプロモーターの転写性ダウンレギュレ ーションを引き起こすことを示唆していた。ＡＡＶｐＡシグナルがｒｅｐおよび ｃａｐ ＯＲＦを分離しているｐ５ｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐ中のように、ｒｅｐ およびｃａｐ遺伝子を、別の転写単位から発現した時、Ｃａｐタンパク質合成も またｐＩＭ４５に対して低下した。 一過性トランスフェクションで産生されるＡＡＶタンパク質の全レベルは、Ｍ ＯＩ １０でｗｔＡＡＶ感染で観察されたものと匹敵したことに注目されたい。 Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２およびカプシドタンパク質は、ＡＡＶプロモーター（そ れぞれ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０）から発現した時、ｗｔＡＡＶ感染中で没さ れたものと類似のレベルで現れ、異種プロモーターであるＲＳＶ ＬＴＲとＣＭ Ｖ ＩＥからの発現は、ウイルス感染で観察される以上の量に増加させた。これ は、トランスフェクション効率は２０〜５０％の範囲であるのに、ＭＯＩ １０ での感染はより高い効率で起きることを考慮すると、特に重要である。これはト ランスフェクションされた細胞当たりの各ウイルス遺伝子産物の濃度は、ｗｔＡ ＡＶ感染より一過性トランスフェクションにおいて高いことを示唆する。 Ｅ．ｐＩＭ−ＲＳＶａｍの作製およびｃａｐ遺伝子ダウンレギュレーションの解 析 ＲＳＶ ＬＴＲ−ｒｅｐ遺伝子カセットを含有するヘルパープラスミドでのカ プシドタンパク質の発現のダウンレギュレーションの機構をさらに解析するため に、ｒｅｐ ＯＲＦ内にアンバー突然変異を有するｐＩＭＲＳＶの誘導体を作成 した（ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ）。もしダウンレギュレーションがシスの変化（すな わち、ｐ５をＲＳＶ ＬＴＲで置換）によるなら、これはアンバー突然変異体中 で保持されるはずである。これに対して、もしこれが完全長Ｒｅｐタンパク質の 合成に依存するなら、ダウンレギュレーション作用は、突然変異体中で緩和され るはずである。 アデノウイルス（Ａｄ）感染の存在下および非存在下でヘルパーとしてｐＩＭ ＲＳＶ−ａｍを使用して、２９３細胞中で一過性トランスフェクションを行なっ た。核タンパク質を単離し、ウェスタンブロットで解析した（図１３）。ｐＩＭ ４５をヘルパーとして使用すると、２９３細胞中でＥＩＡとＥＩＢ遺伝子の発現 のために、Ａｄの非存在下で高レベルのＲｅｐ７８が現れ、従ってＡｄの添加に より見かけ上誘導がなくなったことを示した（この作製体によるＲｅｐ７８の誘 導はＨｅＬａ細胞で観察される）。Ａｄで感染させると、スプライスされたＲｅ ｐタンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０が出現し、Ｒｅｐ５２のレベルがわ ずかに上昇する。予測されるように、ＲＳＶプロモーターからのＲｅｐ７８の発 現は、Ａｄ感染には応答せず、ヘルパーウイルスの同時感染の存在下および非存 在下で同じ高レベルが現れる。ｐＩＭＲＳＶ−ａｍでトランスフェクションした 細胞では、少量の完全長Ｒｅｐ７８が観察され、突然変異が必ずしも完全でない ことを示している。細胞をｐＩＭＲＳＶ−ａｍとアンバーサプレッサーｔＲＮＡ とで同時トランスフェクションすると、ｐＩＭＲＳＶで観察されたレベルまでＲ ｅｐ７８の産生が回復する。ｐＩＭＲＳＶ−ａｍをＲｅｐ発現性プラスミドであ るｐＲＳＶｒｅｐと同時トランスフェクションすると、高レベルのＲｅｐ７８が トランスで得られる。 カプシドタンパク質発現を平行して解析した（図１３）。ｐＩＭ４５でトラン スフェクションした細胞をＡｄで感染すると、カプシドタンパク質の合成が有意 に増加した。この増加はｐＩＭＲＳＶでは観察されない（レーン５と６）が、ｐ ＩＭＲＳＶ−ａｍ突然変異体では起きる。ｐＩＭＲＳＶ−ａｍをサプレッサーｔ ＲＮＡと同時トランスフェクションするか、またはｐＲＳＶｒｅｐで同時トラン スフェクションしてトランスでＲｅｐタンパク質を供給すると、ｐＩＭＲＳＶ表 現型が回復する。 同じ実験の試料についてノーザン解析を行って、ＲＮＡレベルでこの現象を調 べた（図１４）。ｐＩＭ４５では、比較的低レベルのｐ５転写体（４．２kb）が 観察されたが、ｐ１９転写体（３．６kb）の方がより多く存在し、Ａｄ感染で増 加した。ｐ５とｐ１９からのスプライスされた転写体（それぞれ３．９および３ ．３kb）は検出されなかった。ｐ５をＲＳＶ ＬＴＲで置換すると、この作製体 に より産生されるＲｅｐ７８のより高レベルに寄与する４．２kbの転写体が増加し た。興味深いことに、アンバー突然変異を導入するとこの転写体の量はさらに増 加した。サプレッサーｔＲＮＡ（レーン５）の同時トランスフェクションにより Ｒｅｐの合成を回復するか、またはｐＲＳＶｒｅｐ（レーン６）との同時トラン スフェクションによりトランスで供給すると、４．２kbの転写体の合成は再度低 下した。これらの結果は、ＲＳＶ ＬＴＲからの転写はＲｅｐによりダウンレギ ュレーションされていることを示唆する。 ｐＩＭ４５では、Ａｄ感染により、完全長（２．６kb）およびスプライスされ た（２．３kb）ｐ４０ ｍＲＮＡの両方が顕著に増加し、カプシドタンパク質合 成の増加を反映する。ｐ５やｐ１９から得られるものよりｐ４０転写体が多いこ とは、アデノウイルス感染ＫＢ細胞でｗｔＡＡＶからラボウ（Labow）ら（１９ ８６）により観察されたものと類似している。一般に２つのｐ４０ ｍＲＮＡの 比率は、Ａｄ感染によりスプライスされた２．３kb転写体の方が多くなっている 。ｐＩＭ４５に対して、ｐＩＭＲＳＶ作製体ではＡｄ感染によりｐ１９またはｐ ４０転写体のレベルの増加は観察されない。顕著なことは、ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ では、ウェスタン解析（図１３、レーン１４）で観察されたＡｄ感染によるカプ シドタンパク質合成の増加は、ｃａｐ ｍＲＮＡのレベルの増加により反映され ないことである。ｐＩＭＲＳＶ−ａｍで観察されるカプシドｍＲＮＡのレベルは 、親のプラスミドであるｐＩＭＲＳＶのレベルと似ている。ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ とサプレッサーｔＲＮＡ、およびｐＩＭＲＳＶ−ａｍとＲｅｐを発現するプラス ミドｐＲＳＶｒｅｐとの同時トランスフェクションで、同じ低レベルが観察され る。ノーザン解析は、ｐＩＭＲＳＶで観察される低レベルのカプシドタンパク質 合成は、Ａｄ感染に応答してｐ４０からの転写を活性化することができないこと によるＲＮＡレベルで説明できるかも知れないことを示唆する。さらに、これら の結果は、ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ突然変異体によりＡｄ感染した後のカプシドタン パク質産生の増加は翻訳後の作用であり、突然変異がカプシド合成に対するＲｅ ｐ介在性の翻訳阻害作用を緩和したことを、示唆する。 Ｆ．ｒＡＡＶパッケージング：ＲＳＶｒｅｐとＣＭＶｃａｐヘルパープラスミド の比較 ヘルパープラスミドのシリーズを、ｒＡＡＶを産生する能力について比較した 。ｐＴＲｌａｃＺベクタープラスミドとともにそれぞれをＡｄ感染２９３細胞に トランスフェクションし、粗溶解物中のｒＡＡＶの収率（表１）を、力価測定法 により測定した。ｃａｐ遺伝子をＣＭＶプロモーター（ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃ ａｐ）の制御下に置いてカプシドタンパク質発現を増加させると、ｒＡＡＶ収率 が約９倍増加した。これに対して、ｒｅｐ遺伝子発現を増強するためにｐ５をＲ ＳＶ ＬＴＲで置換すると、ｒＡＡＶ収率が低下した。ｐ４０を含有する作製体 （ｐＩＭＲＳＶまたはＲＳＶｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐ）にＲＳＶ ＬＴＲを加え ると、ｒＡＡＶの力価が１０〜２０倍低下し、一方ＲＳＶｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａ ｐヘルパーは、ｐ５を含有する同等の作製体よりｒＡＡＶのパッケージング効率 が５倍低かった。これらの結果は、ウェスタン解析で観察されたカプシドタンパ ク質発現の差と相関する。前述のように、ｐ４０−ｃａｐ作製体とのＲｅｐ７８ の過剰産生の結果として、カプシドタンパク質産生の大幅な低下が観察され、Ｃ ＭＶプロモーターからのカプシドタンパク質発現でより小さな作用が観察された 。異なるヘルパー作製体を比較するこれらの実験の結果は、ｒＡＡＶの産生にお いてＣａｐ（しかし、Ｒｅｐタンパク質合成ではない）が律速因子であることを 示唆する。表は、プラスミド上で必要なアデノウイルス初期遺伝子（Ｅ１Ａおよ びＥ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ２Ａ、ＶＡ）を提供することにより、アデノウイルスの非存 在下で組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供することの実現可能性を示す実験の結果 を提供する。 表１は、アデノウイルスの存在下での従来の産生法（２９３標準条件）からの ｒＡＡＶの収率の、アデノウイルスの非存在下で得られたものとの比較である。 「アデノウイルスの非存在下」の場合では、いくつかの異なる細胞株を使用した 。各細胞株は、アデノウイルスＥ４遺伝子も含有するように作成した２９３細胞 株（これはアデノウイルスＥ１遺伝子を含有する）の誘導体である。ＶＫ２−２ ０細胞株は、フランク・グラハム（Frank Graham）から得、他のＯＲＦ６株（２ Ｃ４と３Ｂ１）は実験室で作成した。ＶＫ２−２０株とＯＲＦ６株は、ｒＡＡＶ を産生するために、すでにＥ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ４遺伝子を含有するため、Ｅ ２ＡとＶＡ遺伝子は、Ｅ２Ａプラスミドでトランスフェクションして供給する必 要 がある。Ｅ２ＶＡ５’→３’およびＥ２ＶＡ３’→５’は、このプラスミドの２ つのクローンである（挿入体は反対の方向にある）。（細胞はまた、ｒＡＡＶを 産生できるように、ｒＡＡＶベクタープラスミドとヘルパープラスミドでトラン スフェクションされる）。この実験の結論は、アデノウイルスの非存在下でｒＡ ＡＶを産生することは可能であり、この方法は、従来法と（より多くではなくて も）同程度に多い収率がある、というものである。 表２は、ヘルパーＤＮＡとしてｐＩＭ４５とｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐを使 用する大規模ｒＡＡＶ産生の結果である。修飾ヘルパーを使用すると、ｒＡＡＶ IU／細胞の収率はほとんど１０倍増加することが顕著である。この結果はまた 、精製された物質の高力価（IU／mlと粒子／mlの両方で）に反映されている。表 には、アデノウイルス（Ａｄｔｓ１４９）の存在下および非存在下で測定したIU ／mlを示す。他の研究者（フェラーリ（Ferrari）ら、１９９６、フィッシャー （Fisher）ら、１９９６）が報告しているように、ｒＡＡＶの力価は、Ａｄ感染 の存在下では約１０００倍高い。これらの調製物の粒子：ＩＵ比は、２０〜１２ ０（ＩＵ＋Ａｄ）または４〜７×１０⁴（ＩＵ−Ａｄ）である。前者の値は、す でに報告されている範囲内である（サムルスキー（Samulski）ら、１９８９）。 精製法により、持続しているが可変レベルのＡｄｔｓ１４９汚染（＜１０³ IU／ ml〜１０⁷ IU／ml）を与えるが、ストックはｗｔＡＡＶの汚染がない（下記参照 ）。 Ｈ．ｗｔＡＡＶの複製と汚染レベルの解析 ベクターの複製を測定し、ｗｔＡＡＶ汚染のレベルを評価するために、前述の ような小規模の一過性トランスフェクションからの試料について、ハート（Hirt ）解析を行なった。すべてのヘルパーＤＮＡは、ＴＲｌａｃＺベクターの複製を 支持した（図１５、パネルＡ）が、ＲＳＶ ＬＴＲ−ｒｅｐカセットを含有する ヘルパープラスミドを用いる各トランスフェクションでは、ベクターの複製レベ ルは低下しているようであった（臭化エチジウムで染色したゲルは、等量のＤＮ Ａが各レーンにあることを示した）。これは、ＲＳＶ−ｒｅｐを含有するヘルパ ーで得られたウイルス収率の低下を説明する助けになるかも知れない。アンバー 突然変異体であるｐＩＭＲＳＶ−ａｍをヘルパーとして用いると低レベルの複製 が観察され、図１３のパネルＡに示すように、少量の完全長Ｒｅｐタンパク質が この突然変異体により合成されることを確認していた。同じブロットをｗｔＡＡ Ｖゲノムからの断片とプローブ結合させると、ｗｔＡＡＶウイルスＤＮＡがウイ ル ス複製している証拠は観察されなかった（図１５、パネルＣ）。しかし、あるレ ーンで高分子量ＤＮＡへのハイブリダイゼーションがあった。これは、ｗｔＡＡ Ｖプローブとある程度の相同性を有する細胞性配列との交差ハイブリダイゼーシ ョンであるかも知れない。しかし、陰性対照（にれ）レーンにシグナルは現れな かったため、別の説明は、このシグナルは２９３細胞ゲノムへのヘルパーＤＮＡ の組み込みの証拠であるというものである。興味深いことに、この高分子量バン ドは、ＲＳＶ ＬＴＲ−ｒｅｐではなくｐ５−ｒｅｐカセットを有するヘルパー でトランスフェクションした細胞でのみ現れ、ｒｅｐの過剰発現は組み込みを阻 害するか、またはｐ５内の配列（すなわち、Ｒｅｐ結合部位またはＲＲＳ）が組 み込みにはシスで必要であるかも知れないことを示唆している。この組み込み仮 説を支持するのは、突然変異体ｐＩＭＲＳＶ−ａｍでトランスフェクションした 細胞ではシグナルは現れないという観察であり、この現象がＲｅｐ合成に依存す ることを示唆している。これらのトランスフェクションから平行して採取した溶 解物を使用して、Ａｄｔｓ１４９の存在下で２９３細胞の第２のプレートを感染 させ、Ｈｉｒｔ試料を調製した。もし実際に少量の混入ｗｔＡＡＶが存在するな ら、ウイルスは再感染で増幅されているであろう。サザン解析とｗｔＡＡＶプロ ーブを用いるハイブリダイゼーション（図１５、パネルＤ）は、ｗｔＡＡＶウイ ルスＤＮＡが複製している証拠を示さなかった。二重測定のブロットをｌａｃＺ 断片（図１５、パネルＢ）とプローブ結合させても、複製しているベクターＤＮ Ａは観察されなかった。これらの条件下でｗｔＡＡＶ（すなわち、ｒｅｐ遺伝子 発現）の存在はベクター複製を可能にしたであろうから、この後者の結果は、ｗ ｔＡＡＶが欠如していることのさらなる証拠である。 ｒＡＡＶパッケージングに必要なＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現を別々 に増強するために、標準的ヘルパープラスミド中のＡＡＶプロモーターを強い異 種プロモーターで置換した。これらの実験は、ｃａｐ遺伝子の発現が増加すると ｒＡＡＶの収率が約１０倍改善されることを示し、カプシドタンパク質のレベル がｒＡＡＶの産生の１つの律速因子であることを示唆した。これに対して、ｒｅ ｐの過剰発現はｒＡＡＶの収率を増加させなかったため、ｒｅｐ遺伝子の発現は おそらく律速因子ではない。しかし、Ｒｅｐタンパク質合成の増加はいつもカプ シドタンパク質産生の低下と一緒であったため、この点に関して結論づけをする ことはできない。しかしプラスミドｐＲＳＶｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐの場合は、 ｃａｐタンパク質の産生は、ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐで観察されたものに比 較してほんのわずかに低下（せいぜい２倍、しかしそのレベルはｐＩＭ４５で得 られたものよりまだ高かった）しており、一方Ｒｅｐ７８発現は有意に増加して いた（約５倍）。これらの条件下で、ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐに対してｒＡ ＡＶの収率の増加はなく、実際パッケージング効率は、わずかに低下していた。 これらの結論は、ｐ５がｒｅｐ発現を制御した作製体（ｐＡＡＶ／Ａｄ）に比較 して、ＨＩＶ ＬＴＲからｒｅｐを発現する作製体（ｐＨＩＶｒｅｐ／ｐ４０ｃ ａｐ）を使用するとｒＡＡＶの収率が１０倍増加したという従来の研究（フロッ テ（Flotte）ら、１９９５）に基づく結論と矛盾する。 ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質合成の全体のレベルは、ＤＮＡを有する細胞の 数および各細胞内に存在するＤＮＡ分子の数の両方により制限されるため、標準 的プロトコールによるＡＡＶベクター産生を制限する別の関連する因子は、トラ ンスフェクション効率である。トランスフェクション効率を上昇させるため、プ ラスミドＤＮＡを、ポリリジンで修飾した複製コンピタントなアデノウイルスと 複合体を形成させると、ｒＡＡＶパッケージングが、標準的リン酸カルシウム法 （マモウナス（Mamounas）ら、１９９５）に対して４０〜２４０倍上昇した。標 準的ｒＡＡＶ産生法に対する多くの修飾は、チオリニ（Chiorini）ら（１９９５ ）により行われ、２９３細胞をリン酸カルシウムでトランスフェクションする代 わりに、ＣＯＳ細胞を、９０％までの報告されたトランスフェクション効率で電 気穿孔した。これらの研究で使用されたヘルパープラスミドはまた、ＳＶ４０レ プリコンを含有し、おそらく各トランスフェクション細胞内のｒｅｐおよびｃａ ｐ遺伝子のコピー数を増加させた。この方法で、１０³ ｒＡＡＶ粒子／細胞を超 えるパッケージング効率が達成された。あるいは、非効率的なトランスフェクシ ョン工程を避けるために、パッケージング細胞株が作製されている。ベクターＤ ＮＡを安定な細胞株に導入した時、ｒＡＡＶの収率が同時トランスフェクション に対して５倍上昇し、１０⁴粒子／細胞が得られたことが報告されている（フロ ッテ（Flotte）ら、１９９５）。クラーク（Clark）ら（１９９５）は、アデノ ウ イルスの感染のみでｒＡＡＶの産生を可能にする、ベクターとＡＡＶ ｒｅｐ／ ｃａｐ遺伝子を含有する細胞株を作製した。この系は３０ＩＵ／細胞（約４００ 粒子／細胞）を与え、これは本明細書に記載の改良されたヘルパープラスミドで 達成されたものに匹敵する値である。他の研究者の経験を考えると、これらの実 験で使用されたパッケージングプロトコールは、トランスフェクションした細胞 内のヘルパープラスミドを複製するか、または新しいヘルパー作製体を使用して パッケージング細胞株を作成することにより、さらに改良できる可能性がある。 ｐ５をＲＳＶ ＬＴＲで置換して得られたカプシドタンパク質発現に対して観 察された作用は、ＡＡＶ遺伝子セグメントに関して他の研究者の研究を確認した 。複製での機能以外に、ＡＡＶＲｅｐタンパク質（主にＲｅｐ７８／６８；キョ スチオ（Kyostio）ら、１９９４；ホラー（Horer）ら、１９９５）は、転写レギ ュレーターとして作用することが知られている。アデノウイルス感染がないと、 Ｒｅｐタンパク質はＡＡＶプロモーターからの転写を抑制し（トラッチン（Trat schin）ら、１９８６、トレンペとカーター（Trempe and Carter）、１９８８、 ビートン（Beaton）ら、１９８９、キョスチオ（Kyostio）ら、１９９４）、一 方逆に、アデノウイルス感染に応答してこれらのプロモーターからの転写を活性 化する（ラボウ（Labow）ら、１９８６、トラッチン（Tratschin）ら、１９８６ ）。マカーティ（McCarty）ら（１９９１）は、アデノウイルスの存在下でのｐ １９とｐ４０プロモーターのＲｅｐ介在活性化は、ｐ５とｐ１９の両方の上流に 存在する配列にシスで依存することを証明した。この知見と一致するのは、ｐ５ を欠失させＲＳＶ ＬＴＲで置換（ｐＩＭＲＳＶプラスミドのように）するとア デノウイルス感染でｐ４０転写の誘導がなかったことである。同様にこの作製体 ではｐ１９ ＲＮＡのレベルの増加もなかった。誘導が観察されないのは、これ はｒｅｐ遺伝子の発現とは無関係に起きたため、シスで必要な配列が除去された ためであった。Ｒｅｐタンパク質合成をアンバー突然変異で妨害した時またはＲ ｅｐタンパク質をトランスで供給した時、ｐ４０の転写活性化は回復しなかった （図４）。ｐＩＭ４５に対して、ｐＩＭＲＳＶはｐ５の上流に８４塩基対（塩基 対１９１〜２７５）のみ欠如し、この欠失は、マカーティ（McCarty）ら（１９ ９１）により報告されたもの（塩基対１９１〜３２０）より限定されて おり、従ってＲｅｐ活性化に必要な推定の制御領域の位置をさらに規定している 。塩基対１９１と２７５の間の領域は、主要後期転写因子（ＵＳＦ；チャン（Ch ang）ら、１９８９）、ＹＹ１（シ（Shi）ら、１９９１）およびＲｅｐ（マカー ティ（McCarty）ら、１９９４；キョスチオ（Kyostio）ら、１９９５）ならびに ｐ５ ＴＡＴＡボックスの結合部位を含有することが知られている。 ｐＩＭＲＳＶ−ａｍ突然変異体のｐ４０プロモーターからの転写は、アデノウ イルス感染に応答してＲｅｐにより活性化されなかったが、カプシドタンパク質 合成は増加することが観察された。この作用は、Ｒｅｐの翻訳阻害活性に起因す るかも知れない。アデノウイルス感染の非存在下の２９３細胞では、トレンペと カーター（Trempe and Carter）（１９８８）は、ｒｅｐ遺伝子含有ベクターに 比較してＲｅｐの非存在下では、ｐ４０ ｍＲＮＡのレベルが低下し、ＣＡＴタ ンパク質発現が増加することを観察した。ｐＩＭＲＳＶａｍでトランスフェクシ ョンした細胞では、アデノウイルス感染によりカプシドタンパク質の合成は有意 に上昇している。しかしこの増加は、ｐ４０ ｍＲＮＡの定常状態に変化無しで 起き、これは翻訳作用であることを示している。これと比較して、ｐＩＭ４５で トランスフェクションした細胞ではカプシドタンパク質産生も増加するが、この 場合２．６kbおよび２．３kbのｐ４０ ｍＲＮＡのレベルも同時に増加する。ｐ ＩＭＲＳＶａｍによるカプシドタンパク質の合成の見かけの誘導は、Ｒｅｐタン パク質が発現される場合は起きないため、ｒｅｐ遺伝子の突然変異のトランス作 用である。Ｒｅｐ７８はｐＩＭＲＳＶにより産生される主要なＲｅｐタンパク質 であるため、これはおそらく阻害作用の主要なメディエーターであるが、Ｒｅｐ ６８の役割は排除できない。これらは結果は、アデノウイルス感染はｐ４０ ｍ ＲＮＡの翻訳の効率を有意に上昇させることができる（ウェスト（West）ら、１ ９８７；ジャニク（Janik）ら、１９８９）が、この作用はＲｅｐタンパク質に より打ち消されることを示唆する。アデノウイルスの存在下での翻訳阻害が、Ｒ ｅｐの正常な機能として起きるのか、またはｐＩＭＲＳＶ作製体中のｒｅｐ遺伝 子の過剰発現のアーティファクトであるのかは不明である。あるいは、阻害は、 ｐ４０ ｍＲＮＡのレベルが低い時にのみ起き、ｐ４０からの転写がアデノウイ ルス感染により普通に増加する時打ち消されるのかも知れない。ｐ４０からの転 写の誘導は、この場合ｐ５の上流の配列の除去により妨害された。 これらの実験は、Ｒｅｐタンパク質が異種プロモーターからの発現のレプレッ サーとして作用できることのさらなる証拠を提供する。Ｒｅｐタンパク質は、い くつかの異種遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることが知られている（ ラボウ（Labow）ら、１９８７；アントニ（Antoni）ら、１９９１；リットナー （Rittner）ら、１９９２；オエルゼ（Oelze）ら、１９９４；ホラー（Horer） ら、１９９５）。前述の実験では、ＣＭＶ ＩＥプロモーターからのｃａｐ遺伝 子の発現ならびにＲＳＶ ＬＴＲからのｒｅｐ遺伝子の発現の両方とも、Ｒｅｐ によりダウンレギュレーションされた。Ｒｅｐは、ＣＭＶ ＩＥプロモーターか らのｃａｔ遺伝子の発現のレベルを低下させることがすでに証明されており（ヘ イルブロン（Heilbronn）ら、１９９０）、本明細書で得られた結果と同様に、 この作用は小さかった（約２倍）。ＣＭＶ ＩＥとＲＳＶ ＬＴＲプロモーター の両方について、阻害はＲＮＡレベルで起きたが、ＲＮＡの定常状態はノーザン 解析により測定されたため、この作用は転写またはｍＲＮＡ安定性のレベルであ るかも知れない。ＲＮＡレベルでのダウンレギュレーションもまた、ＨＩＶ Ｌ ＴＲとＨＰＶ１８ ＵＲＲプロモーターの場合に証明されており、主にＲｅｐ７ ８／６８が原因であるとされている（アントニ（Antoni）ら、１９９１；ホラー （Horer）ら、１９９５）。 以下の例は、本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものではない 。例１：ＡＡＶヘルパー遺伝子を含有する複製していないヘルパープラスミドを使 用する組換えＡＡＶ産生 複製していないプラスミド上のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供し、遺 伝子発現のために異種プロモーターを使用するヘルパープラスミドが、ｒｅｐお よびｃａｐ遺伝子がそれ自身のプロモーターから発現される対照から得られるも のより高く、ＡＡＶベクターの力価を増加させるかどうかを調べるために、実験 を行なった。試験したヘルパープラスミドを図７に示す。 ｐＩＭ４５は、未変性のＡＡＶプロモーターの制御下のＡＡＶ ｒｅｐおよび ｃａｐ遺伝子を含有し、３’末端にＡＡＶポリＡ部位を含有する（ディー・エム ・マカーティ（McCarty，D.M．）ら、J．Virol．65: 2936-2945，1991）。 ＡＡＶゲノム中のヌクレオチド２２８７〜４０４９を削除するために、ＰＣＲ を用いてｐＩＭ４５からｃａｐ領域を削除して、ｐＲｅｐ＊３０を作成すること により、ｐＲＳＶｒｅｐ−ｐ４０ｃａｐとｐＲＳＶｒｅｐ−ＣＭＶｃａｐを作製 した。ＮｈｅＩとＮｏｔＩ末端を含有する、ｐＲｅｐ＊３０から単離したＰＣＲ 断片のヌクレオチド２７５〜４４６４を、ｐＲｅｐ９（インビトロゲン（Invitr ogen）、サンジエゴ、カリホルニア州）のＮｈｅＩとＮｏｔＩ部位の間にクロー ン化して、ｐＲＳＶｒｅｐを作成した。ＳｍａＩとＳｆｉＩで消化したｐＩＭ４ ５中に、ｐＲＳＶｒｅｐからのＸｂａＩ（代用）−ＳｆｉＩ断片をクローン化し て、ｐＲＳＶｒｅｐ−ｐ４０ｃａｐを作成した。ｐＲＳＶｒｅｐからのこの同じ ＸｂａＩ（代用）−ＳｆｉＩ断片を、ＳｍａＩとＳｆｉＩで消化したｐＩＭ−Ｃ ＭＶｃａｐ（後述）にクローン化して、ｐＲＳＶｒｅｐ−ＣＭＶｃａｐを作成し た。 ｐ４０プロモーターを不活性化するためにＡＡＶゲノムに１８２３位（Ｔ：Ｃ ）、１８２６位（Ａ：Ｃ）、および１８３２位（Ｇ：Ａ）で３点突然変異を導入 して、ｐＩＭ−ＣＭＶｃａｐを作製した。ＡＡＶゲノムからのヌクレオチド１８ ５０〜４４６０とＢａｍＨＩ末端を含有するＰＣＲ断片をｐＣＭＶＢのＢａｍＨ Ｉ部位に挿入して、ｐＣＭＶｃａｐＢを作成した（クローンテク（Clonteck）、 パロアルト、カリホルニア州）。ＣＭＶプロモーターを含有するＳｐｈＩ断片を ｐＣＭＶｃａｐＢから単離し、ｐＩＭ４５内の９３０位のＳｐｈＩ部位に挿入し て、ｐＩＭ−ＣＭＶｃａｐを作成した。 ヘルパー／ベクターの比１０：１で２９３細胞にヘルパープラスミドをトラン スフェクションした（１６．５μｇ／総ＤＮＡ）。使用したＡＡＶベクタープラ スミドはｐＴＲ−ｌａｃＺであり、これは、フロリダ大学のニコラス・ムジクズ カ（Nicholas Muzyczka）博士により開発された。このプラスミドを図８に示す 。ＡＡＶベクターの単離と精製は、セクション４（前述）に記載のように行なっ た。 ２９３細胞をヘルパーアデノウイルスとＡＡＶで同時感染させて、ＡＡＶの収 率を測定した。これにより感染時間が減少し、従って測定の感度が上昇した。力 価測定のために、２９３細胞を９６ウェルプレートに、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ （ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミンを含有）中で５×１０⁵細 胞／ml（１００μｌ／ウェル）で蒔き、３７℃で１日間増殖させた。次にＭＯＩ ２０を使用してＡｄｔｓ１４９ウイルスと、ウイルス準備ストックの１：１０ ０、１：２００および１：４００などの希釈率のＡＡＶを用いて細胞を同時感染 させた。力価を確認するために、異なる希釈率を使用した。 ３９℃で２日間感染を進行させた後、培地を吸引し、細胞を３．７％ホルムア ルデヒドで５分間インキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄 した。次に細胞をＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β− Ｄ−ガラクトピラノシド）を用いて３７℃で１〜２４時間染色し、細胞中の青色 の着色の存在についてスクリーニングして、ＡＡＶベクター中に含有されるｌａ ｃＺ遺伝子の発現を検出した。終点希釈の決定に基づく力価測定解析プログラム （Titer Analysis program）を使用する換算を用いて、力価（IU／ml）を測定し た。 図７に示す種々のヘルパープラスミド（および特異的クローン）を使用して、 ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質発現のレベルを測定するために、ウェスタンブロ ット解析を行なった。図９は、ｒｅｐタンパク質発現のウェスタンブロット解析 を示し、図１０はｃａｐタンパク質発現のウェスタンブロット解析を示す。ウェ スタンブロット解析において標準的方法を使用した（Current Protocols in Mol ecular Biology,エフ・アウスベル（Ausubel.，F.）ら編、ワイリーアンドサン ズ（Wiley and Sons）、ニューヨーク州 １９９５）。 力価データを表３に示す。ベクターのストックの力価をIU／mlで示す。実験は 、ウェスタンブロットで証明される特にｃａｐ発現のレベルの増加により、記載 の力価により証明されるように、ＡＡＶベクターであるｐＴＲｌａｃＺの産生が 増加することを証明する。 例２：細胞株、ウイルスおよびプラスミドＤＮＡ １０％胎児牛血清（ＦＢＳ：アービンサイエンティフィック（Irvine Scienti fic）、サンタアナ、カリホルニア州）、２０mMグルタミン、１００単位／ml ペニシリンおよび１００μｇ／ml ストレプトマイシン（ギブコビーアールエル （Gibco-BRL）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）を補足 したダルベッコー改変イーグル培地−高グルコース（ＤＭＥ：アービンサイエン ティフィック（Irvine Scientific））中で、２９３細胞細胞株であるアデノウ イルス５−形質転換ヒト胚腎細胞株（グラハム（Graham）ら、１９７７） を、３７℃で５％ＣＯ₂中で増殖させた。これらの実験でヘルパーウイルスとし て使用したアデノウイルス５型突然変異体であるｔｓ１４９（Ａｄ５ｔｓ１４９ ；エンシンガーとギンスバーグ（Ensinger and Ginsberg）、１９７２）は、ア デノウイルス初期領域２（スティルマン（Stillman）ら、１９８２）によりコー ドされるＤＮＡポリメラーゼ中の温度感受性突然変異のために、非許容性温度（ ３９℃）でウイルスＤＮＡを複製する能力が低下している。Ａｄ５ｔｓ１４９を 許容性温度（３３℃）で２９３細胞中で増殖させ、ＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離に より精製した。 組換えＡＡＶベクターであるｐＴＲｌａｃＺならびにヘルパープラスミドｐＩ Ｍ４５（マカーティ（McCarty）ら、１９９１）をコードするプラスミドＤＮＡ は、エヌ・ムジクズカ（N．Muzyczka）（フロリダ大学）により供与された。ｐ ＴＲｌａｃＺは、ＡＡＶの末端繰り返し配列の間に挿入された、ＣＭＶ ＩＥプ ロモーターの転写制御下にある大腸菌（E．coli）ＬａｃＺ遺伝子（細胞質性） から構成される。アンバーサプレッサーｔＲＮＡであるｐＳＶｔｓＳｕ⁺（アン バー）をコードするプラスミド（カポネ（Capone）ら、１９８５）は、ユー・エ ル・ラジバンダリー（U.L．RajBhandary）（ＭＩＴ）から得た。ｒｅｐコード領 域内にアンバー突然変異を含有するＡＡＶゲノムクローンであるｐＮＴＣ３（チ ェジャノブスキーとカーター（Chejanovsky and Carter）、１９８９）は、アー ル・オーエンス（Rl．Owens）（ＮＩＨ）により供与された。 Ａ．プラスミド作製 出発プラスミドとしてｐＩＭ４５を使用して、内因性ＡＡＶプロモーター（ｐ ５とｐ４０）を、それぞれラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＲＳＶ Ｌ ＴＲ）とＣＭＶ ＩＥプロモーターで置換した。すべての操作は、標準的クロー ニング法に従って行なった（サムブルーク（Sambrook）ら、１９８９）。すべて の制限酵素およびＤＮＡ修飾性酵素は、ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）、ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）から得て、製 造業者の説明書に従って使用した。プラスミドＤＮＡは、キアゲン（Quiagen） （チャッツワース（Chattsworth）、カリホルニア州）から得られるキットを用 いて精製した。 まず塩基対１８５２と４４４０の間のＡＡＶゲノム配列から構成されるＤＮＡ 断片（カプシドタンパク質をコードし、ＡＡＶ ｍＲＮＡポリアデニル化部位を 含む）をＶｅｎｔポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボズ（New Englan d Biolabs）、ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ州）を使用してＰＣＲ（ サイキ（Saiki）ら、１９８８）により増幅して、ＣＭＶ ＩＥ−ｃａｐカセッ トを作製した。この断片をｐＣＭＶβ（クローンテク（Clonteck）、パロアルト 、カリホルニア州）のＢａｍＨＩ部位の間に挿入して、プラスミドｐＣＭＶｃａ ｐを作成した。 Ｒｅｐをコードする最小の配列を得るために、ＢａｍＨＩ部位（塩基対１０４ ５）とＡｐａＩ（塩基対２２８３）の間のｒｅｐ遺伝子配列をＰＣＲで増幅し、 ＢａｍＨＩとＡｐａＩで消化したｐＩＭ４５プラスミド内に挿入した。その結果 は、塩基対２２８３（Ｒｅｐ停止コドンのすぐ下流）と塩基対４０４９のＡｐａ Ｉ部位の間の欠失である。このプラスミド（ｐＩＭｒｅｐΔ）を使用して、ＲＳ Ｖ ＬＴＲからＲｅｐ７８／６８ ｍＲＮＡが発現される作製体を得る。塩基対 ２７６（Ｒｅｐ７８／６８ｍＲＮＡ開始コドンのすぐ上流）から塩基対４４５９ に伸長する２．４kbのｒｅｐ遺伝子断片を、ｐＩＭｒｅｐΔからＰＣＲで増幅し 、ｐＲｅｐ９発現ベクター（インビトロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリ ホルニア州）のＮｈｅＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入してｐＲＳＶｒｅｐを作 成した。 ＡＡＶイントロンのこの領域中でＲｅｐおよびＣａｐタンパク質コード配列は 重複するため、ｐＩＭｒｅｐΔとｐＣＭＶｃａｐの間（塩基対１８５２と２２８ ３の間）に４３１塩基対が共通して存在する。ｐＩＭｒｅｐΔにＣＭＶ ＩＥ− ｃａｐ断片を挿入してｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐを作成する前に、ｐＩＭｒｅ ｐΔ内のｐ４０配列を突然変異させてプロモーターを不活性化させた。これは、 共通の配列の間の組換えの結果として、野生型ＡＡＶが作成されるのを防ぐため に行なった。重複伸長ＰＣＲ（ヒグチ（Higuchi）ら、１９８８）により突然変 異誘発を行なった。隣接するプライマー−１（5'-GGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCC -3’；ＡＡＶゲノムの塩基対１０２４〜１０５０）と突然変異誘発性プライマー −１（5'-GTTTGGGTTCACTGATGTCTGCGTCACTG-3’；ＡＡＶ塩基対１８２１〜１８４ １；突然変異したヌクレオチドに下線をしてある）を使用して、第１のＰＣＲの 鋳型としてｐＩＭｒｅｐΔを使用した。この結果は、ｐ４０ ＴＡＴＡボックス の領域中への３つの塩基対突然変異の導入である：TATAAGTGAGからCATCAGTGAA） 。ＧからＡへの変化は、ＢａｎII部位を除去して、制限解析によるスクリーニン グを可能にする。隣接するプライマー−２（5'-GTGTGGAATCTTTGCCCAGATGGGCCCGG TTT-GAGCTTC-3'；ＡＡＶ塩基対２２６０〜２２８３、４０４９〜４０６６）と突 然変異誘発性プライマー−２（5'-CAGTGACGCAGACATCAGTGAACCCAAACG-3'；ＡＡＶ 塩基対１８２１〜１８４１）を使用して、第２のＰＣＲの鋳型としてｐＩＭｒｅ ｐΔを使用した。上記ＰＣＲ産物をゲル精製後、最初の２つの生成物をアニーリ ングし、隣接プライマーのみを用いて最終増幅工程を行って第３のＰＣＲを行い 、こうして１２８５塩基対のＤＮＡ断片を作成した。この断片をＢａｍＨＩとＡ ｐａＩで消化し、ｐＩＭｒｅｐΔ骨格の対応する部位にクローン化した。得られ たプラスミドはｐＩＭｒｅｐΔ／ｐ４０Δである。ＣＭＶ ＩＥプロモーターと ｃａｐ遺伝子カセットを含有するｐＣＭＶｃａｐからのＳｐｈＩ断片を、ｐＩＭ ｒｅｐΔ／ｐ４０ΔのユニークなＳｐｈＩ部位に挿入して、ヘルパープラスミド ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐを作製した。同様にｐ５ｒｅｐΔ−ｐ４０ｃａｐを 作製するために、ＡＡＶ塩基対１７１５から４４６１に伸長するＳｐｈＩ末端を 有するＰＣＲ断片をｐＩＭ４５から作成し、ｐＩＭｒｅｐΔ／ｐ４０ΔのＳｐｈ Ｉ部位にクローン化した。 プラスミドｐＩＭ４５、ｐ５ｒｅｐΔ−ＣＭＶｃａｐおよびｐ５ｒｅｐΔ−ｐ ４０ｃａｐ中のｐ５プロモーター領域を、まずＸｂａＩでｐＲＳＶｒｅｐを切断 して、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターで置換した。ＤＮＡポリメラーゼＩ−クレノ ウ断片でＸｂａＩ部位を平滑末端にし、ＤＮＡをＳｆｉＩで制限切断して、ＲＳ Ｖプロモーターとｒｅｐ遺伝子の５’末端を含有する断片を放出させた。次にこ の断片を、親プラスミドのＳｍａＩ部位とＳｆｉＩ部位の間にクローン化した。 ｐＩＭＲＳＶへアンバー突然変異を導入するために、突然変異（ＡＡＶゲノム の塩基対１０３３で）を含有するＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩ断片を、プラスミドｐＮ ＴＣ３（チェジャノフスキー（Chejanovsky and Carter）、１９８９）から単離 し、ｐＩＭＲＳＶの対応する部位にクローン化した。例３：一過性トランスフェクションおよびｒＡＡＶ複製とパッケージングの解析 小規模実験のために、トランスフェクションの４８時間前に６cmのシャーレに １×１０⁶細胞の密度で２９３細胞を接種した。トランスフェクションの前に３ ７℃で１時間、感染多重度（ＭＯＩ）２０でＤＭＥ−１０％ＦＢＳ中のＡｄ５ｔ ｓ１４９で細胞を感染させた。トランスフェクション操作は、リン酸カルシウム プロフェクションキット（ProFection Kit）（プロメガ（Promega）、マジソン 、ウィスコンシン州）を使用して、製造業者の説明書に従って行なった。一般に 、ｒＡＡＶパッケージングのために、各シャーレに１．５μｇのベクターＤＮＡ （すなわち、ｐＴＲｌａｃＺ）と１５μｇのヘルパーＤＮＡの混合物を入れた。 ３７℃で５時間インキュベート後、培地を新鮮なＤＭＥ−１０％ＦＢＳで交換し て、感染／トランスフェクションを停止させた。次にシャーレを３９℃（Ａｄ５ ｔｓ１４９の非許容性温度）に移した。 ｒＡＡＶパッケージングのために、トランスフェクションの４８時間後に臨床 的遠心分離機で低速遠心分離により細胞を採取した。各シャーレからのペレット を１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、凍結−融解を４ 回行ってｒＡＡＶを放出させた。溶解物を５６℃で３０分インキュベートｉして 、アデノウイルスを熱不活性化した。溶解物を２回目の低速遠心分離を行い、細 胞破片をペレットにし、上清を集めた。終点希釈法により２９３細胞（＋／−Ａ ｄ５ｔｓ１４９による同時感染；ＭＯＩ＝２０）で、ｒＡＡＶの力価を測定した 。細胞をＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ クト−ピラノシド）を用いて２０〜２４時間染色後、カーバー（Karber）法に基 づくコンピュータープログラム（リン（Lynn）、１９９２）を使用して力価を計 算した。 トランスフェクションの４８時間後に、ランスフェクションされた細胞中のベ クターＤＮＡの複製を、ハート（Hirt）分画法（ハート（Hirt）、１９６７）に 従って、染色体外ＤＮＡを単離して測定した。ＤＮＡをＤｐｎＩで制限切断（導 入ＤＮＡを消化するため）してから、アガロースゲル電気泳動とサザン解析を行 なった。使用したｌａｃＺと野生型ＡＡＶプローブは両方とも５０量体オリゴヌ クレオチドであり、それぞれ5'-ACTGCTGCCAGGCGCTGATGTGCCCGGCTTCTGACCATGCGGT CGCGTTC-3'と5'-TCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAG-3'（Ａ ＡＶヌクレオチド１５０１〜１５５０）であった。これらを、標準的方法（サム ブルーク（Sambrook）ら、１９８９）に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを 使用して［γ−³²Ｐ］で標識した。フィルターをハイブリダイズさせ、ノーザン ブロット解析のために後述するように洗浄したが、プレハイブリダイゼーション 、ハイブリダイゼーションおよび最終洗浄工程は６０℃で行なった。Ａ．タンパク質抽出と免疫ブロッティング 種々のヘルパープラスミドからのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質発現の解析の ために、まず２９３細胞を前述のようにトランスフェクションした。メンデルソ ン（Mendelson）ら（１９８６）の記載した方法に従って、トランスフェクショ ンの４８時間後に核画分を調製した。試料の容量をＤＮＡ含量（２６０nmの光学 密度で）に対して標準化し、１５〜２０μｌの試料緩衝液（５００mMトリス−塩 酸（ｐＨ６．８）、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０mM ＥＤＴ Ａ、１０％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、および０．２％ブ ロモフェノールブルー）と混合し、５分間沸騰させてから使用した。 １０％ポリアクリルアミド／０．１％ＳＤＳゲルで電気泳動後、タンパク質を ゲルから、ハイボンド（Hybond）ポリビニルピロリドンジフルオリド（アマシャ ム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）膜 に移した。染色の前に、フィルターを、ＴＢＳＴ（１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８ ．０）、１５０mM ＮａＣｌ、および０．０５％ツイーン−２０）に溶解した５ ％ミルク粉末中で室温で１時間ブロッキングした。ＲｅｐおよびＣａｐウェスタ ンに使用した一次抗体は、いずれもマウスモノクローナル抗体（アメリカンリサ ーチプロダクツ（American Research Products）、ベルモント、マサチューセッ ツ州）である：それぞれ、抗ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、３０３．９（ＴＢＳＴ 中で１：１０希釈率で使用した）、およびＡＡＶの抗ＶＰ１、ＶＰ−２、および ＶＰ−３、Ｂ１（ＴＢＳＴ中で１：５の希釈率で使用した）。これらを、室温で ２時間フィルター上で激しく攪拌してインキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄（３ ×１５分）後、フィルターを、２次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異 的）ペルオキシダーゼ結合体（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州） で室 温で１時間インキュベートした。次にフィルターを前述のように洗浄し、ＥＣＬ キット（アマシャム（Amersham））を用いて発色させた。Ｂ．ＲＮＡの単離とノーザン解析 ＲＮＡｚｏｌ Ｂ（テルテスト社（Tel-Test，Inc.）、フリエンドスウッド（ Friendswood）、テキサス州）を用いて製造業者の説明書に従って、トランスフ ェクションした２９３細胞から総ＲＮＡを単離した。電気泳動の前に、１０μｇ の各ＲＮＡを変性カクテル（５０％ＤＭＳＯ、１０％ホルムアルデヒド、２０mM ＭＯＰＳ（モルホリンプロパンスルホン酸）、ｐＨ７．０、１０mM酢酸ナトリ ウム、１mM ＥＤＴＡ）とローディング（loading）色素（５％グリセロール、 ０．１mM ＥＤＴＡ、０．０４％ブロモフェノールブルー、０．０４％キシレン シアノール）と一緒にして、６５℃で１５分間加熱した。電気泳動は、１％アガ ロース／０．６５％ホルムアルデヒドゲルで、ＭＯＰＳ泳動緩衝液（２０mM Ｍ ＯＰＳ、ｐＨ７．０、１０mM酢酸ナトリウム、１mM ＥＤＴＡ）中で行なった。 毛細管作用により、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナ トリウム、サムブルーク（Sambrook）ら、１９８９）中で、ジーンスクリーン（ GeneScreen）ナイロン膜（エヌイーエヌ−デュポン（NEN-dupont）、ボストン、 マサチューセッツ州）に一晩移した。 フィルターを６５℃で４〜５時間プレハイブリダイズし、次にハイブリダイゼ ーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液（サムブル ーク（Sambrook）ら、１９８９）、１００μｇ／ml変性サケ精子ＤＮＡ）中で６ ５℃で一晩プローブとハイブリダイズさせた。プローブは、ランダムプライマー 標識キット（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイヤ（La Jolla）、カリホル ニア州）を使用して［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰ（比活性、３，０００Ci／mmol；エヌ イーエヌ−デュポン（NEN-dupont）、ボストン、マサチューセッツ州）で標識し たｐＩＭ４５の１．６kbのＨｉｎｃII断片（ＡＡＶ塩基対２３９７〜３９８７） である。フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で室温で５分間、２×ＳＳ Ｃ、０．１％ＳＤＳ中で室温で１５分間、次に０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ 中で６５℃で２時間洗浄して、フィルムに感光させた。Ｃ．大規模トランスフェクションとｒＡＡＶ精製 ｒＡＡＶの大規模増殖のための２９３細胞のトランスフェクションの前に、細 胞がトランスフェクションの日に６０〜８０％のコンフルエンスに達するように 、細胞をローラーボトルに接種した（最終密度は約１×１０⁸細胞／ボトル）。 トランスフェクションは、ボトル当たり脂質＃５３：ＤＯＰＥ（リー（Lee）ら 、１９９６）、２２μｇのベクターＤＮＡおよび２１８μｇのヘルパーＤＮＡを 使用して、ＯｐｔｉＭｅｍ培地（ギブコビーアールエルライフテクノロジーズ（ GibcoBRL Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーラ ンド州）中で行なった。細胞を、トランスフェクション時にＭＯＩ ２０でＡｄ ５ｔｓ１４９を感染させ、３９℃で４８時間インキュベートしてから、採取した 。 採取の時、静かに振盪してボトルから細胞をはがした。細胞を、ソーバル（So rvall）ＲＣ−３Ｂスイング型バケットロータで遠心分離（２５００rpm、４℃、 １５分間）し、凍結させた。ｒＡＡＶの精製のために、細胞を、２mM ＭｇＣｌ₂ 、０．７mM ＣａＣｌ₂、１０％グリセロール、および０．１％ツイーンを含有 するＰＢＳに再懸濁した。 ベンゾナーゼ(Benzonase)（登録商標）（ニコメッドファーマ社（Nycomed Pha rma A/S）、コペンハーゲン、デンマーク）（１０μｌ／１×１０⁸細胞）を加え 、懸濁液を室温で１時間振盪してインキュベートした。トリプシン（ギブコビー アールエルライフテクノロジーズ（GibcoBRL Life Technologies））を最終濃度 ０．２５％になるように加え、懸濁液を室温で１時間振盪してインキュベートし た。細胞破片を遠心分離（３０００rpm、１５分、４℃、ソーバル（Sorvall）Ｒ Ｃ−３Ｂ）して、溶解物を０．４５μＭフィルターでろ過した。 次に溶解物を、ＣｓＣｌの段階勾配（４時間、２６，０００rpm、４℃、ＳＷ ２８ロータ）で遠心分離し、ここで、上層と下層はそれぞれ、１．３７ｇ／mlと １．５ｇ／ml ＣｓＣｌであった。上層を集め（ＣｓＣｌ界面とＡｄ５ｔｓ１４ ９バンドの間）、１．４１ｇ／ml ＣｓＣｌに調整し、１．４１ｇ／mlのＣｓＣ ｌ平衡勾配で遠心分離した（１６〜２０時間、４℃、３５，０００rpm、ＮＶＴ ．６５ロータ）。画分を集め、屈折計で測定し、１．３６〜１．４１の密度を有 する画分をプールし、ＰＢＳ／１％ショ糖に対して４℃で６時間透析した。 ショ糖を最終濃度が５％になるように加え、精製したウイルスを分注して−８０ ℃で保存した。Ｄ．精製したｒＡＡＶストックの性状解析 精製したｒＡＡＶのストックを、前述の終点希釈法により、Ａｄ５ｔｓ１４９ （ＭＯＩ＝２０）の存在下および非存在下で力価を測定した。混入しているＡｄ ５ｔｓ１４９の力価は同様の方法で測定したが、染色は、抗アデノウイルス（ヘ キソン）／ＦＩＴＣ結合体（ケミコン（Chemicon）、テメキュラ（Temecula）、 カリホルニア州）を使用してヘキソンについて行なった。混入している野生型Ａ ＡＶのレベルは、既に記載されている（エイナーハンド（Einerhand）ら、１９ ９５）感染中心測定法を使用して測定した。 ＡＡＶ粒子力価は、サムルスキー（Samulski）ら、１９８９の修飾した方法を 使用して定量した。まず精製したｒＡＡＶ試料を、０．１％ＳＤＳ中のプロテイ ナーゼＫで処理した。適切な希釈物ならびに標準曲線ＤＮＡ（ＴＲｌａｃＺにつ いては、ｐＴＲｌａｃＺ ＤＮＡを標準物質として使用した）を、変性溶液（０ ．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）で室温で１０分間処理し、スロットブ ロット装置（シュレイチャーアンドシュエル（Schleicher and Schuell）、キー ン（Keene）、ニューハンプシャー州）を使用して、１mlの容量をジーンスクリ ーンプラス（GeneScreen Plus）（アマシャム（Amersham））膜に適用した。適 用後、スロットを３００μｌの０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）で洗浄 した。フィルターを乾燥し、前述のようにハイブリダイズした。プローブ（ｐＴ ＲｌａｃＺのＰｖｕII断片）を、プライムイットフルオア（Prime-It Fluor）標 識キット（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイヤ（La Jolla）、カリホルニ ア州）を使用して標識した。前述のように一連の洗浄（ただし、最後の洗浄は６ ５℃で１０分間行なった）後、フィルターをイルミネーター（Illuminator）検 出キット（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイヤ（La Jolla）、カリホルニ ア州）で発色させた。試料のシグナルを標準曲線と比較して、粒子濃度を推定し た。例４：細胞株の作成 ２９３−ＭＴ−ＤＢＰ：プラスミド作製。親プラスミドｐＲＥＰ−７（インビ トロゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州）は、プラスミド染色体 外維持のためにＥＢＶ複製開始点とＥＢＮＡ−遺伝子を、そしてＤＮＡ選択のた めにヒグロマイシン耐性遺伝子を含有する。ｐＲＥＰ／ＭＴ／ＤＢＰを作製する ために、ｐＲＥＰ−７のＲＳＶプロモーターをメタロチオネイン（ＭＴ）プロモ ーター（これは、重金属で誘導される）で置換した。ＤＮＡ結合タンパク質（Ｄ ＢＰ）をコードするＥ２Ａ遺伝子を、ＭＴプロモーターの下流にクローン化した 。 ２９３／ＭＴ／ＤＢＰ細胞株の作成。リン酸カルシウムトランスフェクション により、２９３細胞をｐＲＥＰ／ＭＴ／ＤＢＰクローン０．５でトランスフェク ションした。トランスフェクションした細胞をヒグロマイシンで６週間選択した 。選択した細胞をクローンで拡大し、誘導後のＤＢＰの発現（免疫蛍光法）とＥ ｌ−／Ｅ２Ａベクターを補足する能力に基づき判定した。 ３Ｂ１および２Ｃ４細胞株：親プラスミドは、アデノウイルスＥ４ ６と６／ ７読みとり枠（ＯＲＦ）の発現カセットを含有する。発現を進めるのに使用した プロモーターは、低レベルの基礎活性を有する突然変異ヒトメタロチオネインプ ロモーターである（マカロフ（Makarov）ら、Nuc．Acids Res．22(8): 1504-150 5(1994)）。 ３Ｂ１と２Ｃ４細胞株の両方とも、アデノウイルス２型のＥ１領域で形質転換 したヒト胚腎細胞である２９３細胞から得られた。３Ｂ１と２Ｃ４細胞株の両方 とも、Ｅ１とＥ４が欠如した組換えアデノウイルスベクターを補足する能力を有 する。この細胞株は、アデノウイルス２型のＥ４読みとり枠６と６／７（アデノ ウイルスヌクレオチド３４０８２〜３２９１３）の発現を進めるための、突然変 異ヒトメトロチオネインプロモーター、ＳＶ４０スプライス、およびポリアデニ ル化シグナルを含有する。Ｅ４機能の補足のために、ＯＲＦ６と６／７の発現は 、１００μＭ Ｚｎ²⁺、２μＭ Ｃｄ²⁺を添加して誘導できる。簡単に説明する と、２９３細胞を親プラスミドでトランスフェクションした。各クローンがＧ４ １８で選択できるように、細胞をｐＳＶ２Ｎｅｏで同時トランスフェクションし た。例５：ＡＡＶＳ１組み込み座を有するトランスジェニックマウス 非相同的組換えによるアデノ随伴ウイルスＤＮＡの組み込みのためのヒト第１ ９染色体上の好適な部位の性状解析。７００〜８００のＣＤ−１マウスに精製し たＤＮＡ断片（ＡＡＶＳ１の０．７kb ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片：コチン （Kotin）ら、EMBO J．11: 5071-5078）を注入した。５００〜６００個の卵は生 存し続け、分割した。注入した卵を１９匹のマウスに移植すると、１４８匹のマ ウスの子が産まれた。 染色体ＤＮＡをマウスの尾から単離し、サザン解析によりスクリーニングした 。６匹の陽性マウスが見つかった（＃６６、７３、８５、９３、１２３、１４７ ）（表４）。 陽性のＦ₀をｗｔＣＤ−１と交配させ、７２匹のＦ１子供を産ませた。Ｆ１子 孫から染色体ＤＮＡを単離し、ＰＣＲ（ＤＭＳＯの存在下で陽性試料から２５０ 塩基対の断片を産生した）（表５）を使用してスクリーニングした。スクリーニ ングの結果に基づき、全部で４３匹のマウスを飼育した（表６）。 Ａ．Ｆ１トランスジェニックの一次培養物の樹立 簡単に説明すると、尾の試料を切断し、前の試料のようにトリプシン処理した 。遊離している細胞と塊の細胞を、６ウェルプレートのＤＭＥＭ中の１０％子ウ シ血清に入れた（１ウェル／尾）。４日後に細胞を解析すると、いくつかの付着 した細胞は繊維芽細胞様の形態を有した。この時点で細胞の塊を除き、新鮮な培 地と交換した。一次Ｆ１培養物からの細胞をＡＡＶ（１０ ＭＯＩ）で感染させ る（ＡＡＶ力価 ９×１０Ｅ９／ml＝９×１０Ｅ６／μＬ）（１×１０⁶細胞／ プレート）。感染の４８時間後細胞を採取し、ハート（Hirt）解析を行なった。 開示された実施態様について本発明を説明したが、本発明の精神を逸脱するこ となく種々の変更が可能である。従って本発明は、以下の請求の範囲によりのみ 限定されるものである。 文献 Antoni,B.A.,A.B.Rabson,I.L.Miller,J.P.Trempe,N.Cheianovsky and B.J.Carte r.1991.Adeo-associated virus Rep protein inhibits human immunodeficiency virus type 1 production in human cells.J.Virol.65:396-404. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ピライノ，スーザン アメリカ合衆国01701 マサチューセッツ 州フラミンガム，ワーセスター ロード 1622，アパートメント 411ビー (72)発明者 キョスティオ，シルッカ アメリカ合衆国01701 マサチューセッツ 州フラミンガム，ウィンター ストリート 61

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．目的のポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を細胞に提供 するための組成物であって、 ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質またはＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードする核酸 配列；および目的のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列ま たは遺伝子転写体を含む遺伝的作製体；および第１のＡＡＶ ＩＴＲもしくはそ の一部、および第２のＡＡＶ ＩＴＲもしくはその一部（ここで、第１および第 ２のＡＡＶ ＩＴＲは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の端に存在 し、プロモーターは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を制御する）、 からなる上記組成物。 ２．ＡＡＶの第１および第２のＩＴＲと、細胞特異的発現を可能にするプロモ ーターを含む少なくとも１つのカセットとからなる、部位特異的組み込みと細胞 特異的発現のための発現ベクターであって、プロモーターは異種遺伝子に結合し 、カセットは逆末端繰り返し配列の間に存在することを特徴とする、上記ベクタ ー。 ３．ＩＴＲ配列は、他のプロモーターの非存在下で核酸の発現を促進する、Ａ ＡＶのＩＴＲ配列と核酸からなるＡＡＶベクター。 ４．薬剤学的に許容される担体中の請求の範囲第２項記載のベクター。 ５．請求の範囲第２項記載のベクターで細胞を感染させる、目的のポリペプチ ドを細胞に提供するための方法。 ６．パッケージング細胞株２９３−ＭＴ−ＤＢＰ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１２１８ １）。 ７．パッケージング細胞株２Ｃ４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１２１８２）。 ８．パッケージング細胞株３Ｂ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１２１８３）。 ９．ヒト第１９染色体のＡＡＶ組み込み座をコードするＤＮＡを発現する、非 ヒトトランスジェニック哺乳動物。