DE10056210A1 - Virales Expressionssystem - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft virale Expressionssysteme, die einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-Vektoren umfassen, die jeweils zwei ITR-Sequenzen und das E4-Gen und gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus enthalten sowie ein zu exprimierendes heterologes Gen. Die Vektoren des Systems unterscheiden sich voneinander bezüglich der Anwesenheit mindestens einer der genannten Gensequenzen, wobei das E4-Gen, das E1-Gen sowie das heterologe Gen von ITR-Sequenzen flankiert und somit nach Transfektion in eukaryontische Zellen in Virionen verpackt werden. Die Erfindung betrifft ferner unter anderem Verfahren zur Herstellung rekombinanter Virionen und zur Expression eines Transgens in eukaryontischen Zellen unter Verwendung des genannten Vektorsystems sowie nach den genannten Verfahren erhältliche Virus-Stocks.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem ein Plasmid-Vektoren umfassendes
Vektorsystem zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, Verfahren zur Herstellung
rekombinanter AAV-Partikel unter Verwendung des genannten Vektorsystems, Virus-
Stocks rekombinanter AAV-Partikel erhältlich gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren sowie Verfahren zur Expression eines heterologen Gens in eukaryontischen
Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Virus-Stocks.
Das adeno-assoziierte Virus (AAV) gehört zur Familie der Parvoviren und besitzt eine
ikosaedrische Hüllkapsel von ca. 25-30 nm Durchmesser, die das Virusgenom in Form
einer linearen, einzelsträngigen DNA (ssDNA) mit einer Länge von ca. 4,5 kb enthält.
Gegenwärtig sind 6 Serotypen beschrieben (AAV 1-6), die untereinander eine große
Homologie aufweisen (Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 3428-3432;
Chiorini et al., 1 Virol. (1999) 73, 4293-4298; Chiorini et al., J. Virol. (1997) 71,
6823-6833).
Die Eignung, spezifisch in das Wirtsgenom integrieren zu können, das Fehlen jeglicher
Pathogenität beim Menschen, die Fähigkeit, nicht nur proliferierende, sondern auch
ruhende Zellen zu infizieren, und die Tatsache, dass sich das Virus nur in Gegenwart
eines Helfervirus (insbesondere Adenovirus) vermehren kann, lassen AAV als potentiell
besonders geeigneten Vektor für die somatische Gentherapie erscheinen. Rekombinant
hergestellte AAV-Vektoren (rAAV-Vektoren) für gentherapeutische Applikationen
werden heutzutage nicht nur "in vitro" in der Zellkultur, sondern auch "in vivo" in
Geweben wie Lunge (Flotte et al., J. Biol. Chem. (1993) 268, 3781-3790; Conrad et al.,
Gene Ther. (1996) 3, 658-668; Halbert et al., J. Virol. (1997) 71, 5932-5941), Gehirn
(Kaplitt et al.; Nat. Genet. (1994) 8, 148-154); Muskel (Xiao et al., J. Virol. (1996)
8098-8108), Retina (Ali et al., Hum. Mol. Genet. (1996) 5, 591-594; Flannery et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 6916-6921), ZNS (Peel et al., Gene Ther. (1997)
4, 16-24) und Leber (Xiao et al., J. Virol. (1998) 72, 10222-10226) verwendet.
Das Genom des AAV umfasst 2 offene Leserahmen (open reading frames, ORFs),
welche für die rep-(Replikation) und cap-(Verpackung bzw. Capsid) Proteine kodieren
(siehe Abb. 1).
Das virale Genom flankierend findet sich an dessen beiden Enden jeweils eine lange
invertierte Basensequenz (inverted terminal repeat; ITR) von 145 bp Länge (Samulski et
al., Cell (1983) 33, 135-143). Die ITRs des AAV-Genoms enthalten palindromische
Sequenzen, welche als sogenannte Haarnadelstrukturen während der DNA-Replikation
als Primer fungieren. Zusätzlich tragen die ITRs die für Replikation, Verpackung und
Integration in das Wirtszellgenom notwendigen "cis"-E1emente und sind von essentieller
Bedeutung bei der Virusintegration (Collaco et al., Gene (1999) 238, 397-405).
Im AAV-Genom wurden drei Hauptpromotoren (P5, P19 und P40) identifiziert, von
denen aus alle essentiellen Virusproteine transkribiert werden (siehe Abb. 1).
Die rep-Proteine (rep78, rep68, rep52 und rep40, benannt nach dem jeweiligen
Molekulargewicht) sind auf der linken Seite des AAV-Genoms lokalisiert. Sie werden
von den Promotoren p5 (rep78 und die Splicing-Variante rep68) und p19 (rep52 und die
Splicing-Variante rep40) transkribiert. Alle vier Proteine besitzen eine identische mittlere
Region, unterscheiden sich jedoch in ihren amino- und carboxyterminalen Regionen
(Bueler, Biol. Chem. (1999) 380, 613-622).
Sowohl rep78 als auch rep68 sind an der AAV-DNA-Replikation beteiligt (Hermonat
und Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 6466-6470; Hermonat et al., J.
Yirol. (1984) 51, 329-339; Ni et al., J. Virol. (1994) 68, 1128-1138). Beide sind in der
Lage, an die Haarnadelstrukturen der ITRs zu binden (Im und Muzyczka, J. Virol. (1989)
63, 3095-3104; McCarty et al., J. Virol. (1994) 68, 4988-4997) und besitzen zusätzlich
ATPase- und Helikase-Aktivität (Walker et al., J. Yirol. (1997) 71; 2722-2730). Darüber
hinaus vermitteln sie die Spezifität der Integrationsstelle auf dem humanen Chromosom
19 (Weitzman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 5808-5812; Linden et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 7966-72; Surosky et al., J. Virol. (1997) 71, 7951-7959).
Die zwei kleineren Transkripte rep52 und rep40 werden für die Akkumulation von
einzelsträngiger viraler DNA benötigt, welche in virale Partikel verpackt wird (Hermonat
et al., loc. cit.; Berns und Linden, Bioessays (1995) 17, 237-245).
Die drei viralen Capsidproteine werden vom p40-Promotor aus transkribiert und sind auf
der rechten Seite des AAV Genoms lokalisiert (Berns, Microbiol. Rev. (1990) 54, 316-329;
siehe auch Abb. 1). Die Transkripte besitzen eine gemeinsame Intron- und poly-
Adenylierungssequenz, werden aber von verschiedenen Startkodons aus kodiert. Das
Capsid setzt sich zu ca. 90% aus Vp3 (62 kD) und zu jeweils ungefähr 5% aus Vp1 (87 kD)
und Vp2 (62 kD) zusammen.
Der AAV-Lebenszyklus unterteilt sich in zwei Lebenszyklen, die latente und die lytische
Phase.
In Abwesenheit von zusätzlichen Helferviren wird eine Zelle zwar von AAV infiziert,
das Virus ruht aber anschließend als integriertes Genom in dieser Zelle (latente Phase).
Dabei erfolgt die Integration des AAV-Genoms spezifisch im Chromosom 19, q13.3-pter
(Berns et al., Virology (1975) 68, 556-560; Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1990) 87, 2211-2215; Linden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 11288-11294;
Samulski et al., EMBO J. (1991) 10, 3941-3950). Replikation und Produktion
von infektiösem Virus erfolgt erst, wenn die Zelle zusätzlich mit einem lytischen
Helfervirus infiziert wird (z. B. Herpesvirus, Cytomegalovirus und insbesondere
Adenovirus; Berns and Linden, loc, cit.). Wenn Adenovirus als Helfervirus fungiert,
aktiviert das Adenovirus-E1A-Protein die Transkription des PS- und des p19-Promotors
von AAV, was eine 5 bis 20fache Erhöhung der Synthese der rep-Proteine zur Folge hat.
Die rep-Proteine wiederum aktivieren alle drei AAV-Promotoren (p5, p19 und p40) um
mindestens das 50fache.
Zusätzlich zu E1A sind auch die Adenovirus-E1B- und die Adenovirus-E4-Region für
eine effiziente AAV-Replikation erforderlich. Die durch diese Adenovirus-Regionen
kodierten Proteine führen zu einer Akkumulation der AAV-mRNA, während
Adenovirus-E2A- und Adenovirus-VA-RNA das Spleißen der AAV-RNA und die
Translation stimuliert (West et al., Virology (1987) 160, 38-47; Janik et al., Virology
(1989) 168, 320-329; Samulski und Shenk, J. Virol. (1988) 62, 206-210; Richardson und
Westphal, J. Virol. (1984) 51, 404-410).
Auch bei einer adenoviralen Infektion einer Zelle sind die E1A- und E1B-Gene von
essentieller Bedeutung. Als Untereinheiten des E1-Gens sind sie für die Umstellung des
Zellstoffwechsels auf Virusproduktion zuständig. Das E1A-Gen dient zur
transkriptionellen Aktivierung der Adenovirus-Gene. Das E1B-Gen kodiert zwei
Untereinheiten: Das E1B19K- und das E1B55K-Protein. Dabei unterdrückt die
Expression von E1B19K durch Komplexbildung mit E1A die frühe Genexpression, die
sonst kontinuierlich weiterlaufen und somit vor Fertigstellung neuer Viruspartikel den
Zelltod auslösen würde. Gleichzeitig schützt E1B19kD die virale und zelluläre DNA vor
Abbau. Die zelluläre RNA-Translation wird gehemmt, wohingegen die späte virale
Genexpression durch eine Kombination der adenoviralen Genfunktionen von E1B55K
und E4orf6 beschleunigt wird.
Das E4-Gen des Adenovirus ist ein ca. 3 kb großes Fragment am rechten Ende des
Adenovirusgenoms, welches in Linksrichtung transkribiert wird. Die Transkripte des E4-
Promotors werden vielfach gespleißt, was zu insgesamt 18 verschiedenen mRNAs führt,
die für 7 verschiedene Peptide (orf 1-7) kodieren (Leppard, K.N., J. Gen. Virol. (1997)
78, 2131-2138).
Die Aufgaben und Funktionen der einzelnen "open reading frames" (Orfs) von E4 sind
allerdings nur teilweise bekannt. Während die Funktionen von E4 sind
gut beschrieben sind, weiß man über die anderen Orfs von E4 nur sehr wenig. Derzeit
vollkommen unbekannt sind etwa die Eigenschaften von E4orf2 und E4orf3/4. Über
E4orf1 ist nur bekannt, dass es "transformierende Eigenschaften" besitzt (Javier, J. Virol.
(1994) 68, 3917-3924). E4orf4 scheint die E1A-Aktivität und E4-Transkription negativ
zu regulieren (Muller et al., J. Virol. (1992) 66, 5867-5878; Kleinberger und Shenk, J.
Virol. (1993) 67, 7556-7560). E4orf6/7 bildet einen Komplex mit dem
Zelltranskriptionsfaktor E2F und hat damit einen entscheidenden Einfluss auf den
Zellzyklus der Zelle (Helm und Harlow, J. Virol. (1994) 68, 5027-5035).
Huang und Hearing (J. Virol. (1989) 63, 2605-2615) analysierten als Erste die Aufgaben
der unterschiedlichen Orfs von E4. Dabei untersuchten sie anhand von
Deletionsmutanten die Effekte auf die lytische Infektion beim Adenovirus und die
Virusproduktion beim AAV. Sie konnten zeigen, dass obwohl E4orf6 mit 34 kD
wesentlich größer ist als E4orf3 (21 kD), beide bei der Adenovirus-Infektion annähernd
gleiche Funktionen besitzen.
Insbesondere werden beide genannten E4-Proteine für die Stabilisierung der Virus-
mRNA im lytischen Zellzyklus gebraucht, steuern darüber hinaus die Proteinbiosynthese
und sind für die Reduzierung der Wirtszellfunktionen verantwortlich. Dabei bilden
E4orf6 und E4orf3 einen Komplex mit dem adenoviralen Genprodukt von E1B (55 kD).
Diese Komplexe werden in den Zellkern transportiert und sind dort direkt am Splicing
und dem Export der mRNAs aus dem Zellkern beteiligt (RNA-Transport; Leppard, loc.
cit.).
Den Einfluss der einzelnen E4-Orfs auf den AAV-Lebenszyklus untersuchten Huang et
al. (loc. cit.). Dabei analysierten sie deren Einfluss auf die AAV-Replikation und die
Virusvermehrung. Es ergab sich bei der Virusproduktion, dass Adeno-Mutanten, bei
denen E4orf3, E4orf1-3 oder E4orf1-4 deletiert waren, eine mit dem E4-Wildtyp
vergleichbare Menge an AAV-DNA produzierten. Dagegen war die Menge an
replikationsfähiger DNA bei allen anderen Mutanten (einschließlich der E4orf6-Mutante)
drastisch reduziert oder überhaupt nicht nachweisbar.
Bei der Analyse der Virusreplikation zeigte sich ein ähnliches Bild, so dass die Autoren
daraus folgerten, dass E4orf6 der entscheidende open reading frame für die AAV-
Helferfunktion ist.
Die Generierung eines rekombinanten AAV (rAAV) ohne die Verwendung eines
Wildtyp-Adenovirus als Helfervirus wird in der US-PS 5,436,146 und der US-PS 5,753,500
beschrieben. Dabei wird ein rekombinanter AAV-Vektor, bestehend aus einer
Expressionskassette flankiert von AAV-ITRs, mit einem Helferplasmid kotransfiziert. In
diesem sind die rep- und cap-Gene von AAV zwar von den Replikationsursprüngen
(origins of replication) des Adenovirus flankiert, nicht jedoch von AAV-ITRs. Das so
exprimierte Konstrukt weist entsprechend keine gemeinsamen Sequenzen mit dem AAV-
Vektor auf. Durch die zusätzliche Infektion der Zellen mit Adenovirus werden alle für
den lytischen Zyklus des rAAV notwendigen Helfervirus-Funktionen bereitgestellt.
Das genannte Verfahren liefert allerdings mit 104 bis 105 infektiösen Partikeln/ml
Virustiter, die deutlich unter dem mit wt AAV-Viren erhaltenen Titer liegen (ca. 1012/ml)
und kommt somit für eine effiziente Genexpression eines gewünschten Proteins nur
bedingt in Frage.
Zahlreiche weitere Patente beschäftigen sich damit, die Expression der rep-cap-Gene so
zu modifizieren, dass höhere Virustiter generiert werden können. Dabei werden diese
Gene von verschiedenen heterologen oder viralen Promotoren exprimiert. So beschreibt
z. B. die US-PS 5,658,776 eine 10fach erhöhte Verpackungseffizienz, wenn der p5-
Promotor durch den HIV-LTR ersetzt wird. Daneben ist die jeweilige Expressionsrate
der rep- und cap-Proteine von entscheidender Bedeutung. So hat eine erhöhte Expression
der rep78/68-Proteine eine verringerte Expression der Capsidproteine zur Folge, was sich
wiederum negativ auf den Virustiter auswirkt. Auf der anderen Seite hat eine verringerte
rep78/68-Proteinexpression den umgekehrten Effekt (siehe die US-PS 6,037,177), so
dass die Capsid-Produktion ein limitierender Faktor für die rAAV-Produktion zu sein
scheint.
Verschiedene Gruppen beschreiben die Generierung stabiler Verpackungszelllinien
(Clark et al., Hum. Gene Ther. (1995) 6, 1329-1341; Tamayose et al., Hum. Gene Ther.
(1996) 7, 507-513; Gao et al., J. Virol. (1996) 70, 8934-8943; Wang und Finer, Gene
Ther. (1995) 2, 755-783). Gao et al. (Hum. Gene Ther. (1998) 9, 2353-2362) infizierten
HeLa-Zellen, welche das rep-cap Plasmid stabil integriert hatten, mit einem E2B-
defekten Adenovirus, um die rep-cap-Expression zu induzieren. Mit einer weiteren
Infektion infizierten sie die Zellen mit einem Adenovirus, welches das rAAV Genom in
der E1A Region stabil integriert hatte. Das Verfahren führte zu einem hohen rAAV-Titer.
Ein Problem der genannten Verfahren besteht darin, dass neben der Produktion von
rAAV-Viren auch Adenoviren erzeugt werden, welche in einem aufwendigen Prozess
(CsCl2-Gradient, Hitzeinaktivierung) von den rAAV-Partikeln getrennt werden müssen.
Zusätzlich kommt es während des Reinigungsprozesses zu einer Reduzierung des rAAV-
Titers.
Es wurden Versuche unternommen, anstatt der Infektion mit Adeno-Helfervirus nur noch
die E1emente des Adenovirus-Genoms zu verwenden, welche für die AAV-Produktion
notwendig sind.
So wird in der US-PS 6,040,183 und der US-PS 6,093,570 ein Verfahren beschrieben,
bei dem die Helfervirus-Funktionen mittels Transfektion der einzelnen adenoviralen
Gene bereitgestellt werden.
Die US-PS 6,004,797 (Colosi) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von
rekombinantem AAV, bei dem ein Plasmid alle wichtigen adenoviralen Helferfunktionen
(VA, E2A und E4orf6) besitzt. Ferner wird ein Konstrukt verwendet, welches neben den
rAAV-Sequenzen auch noch die Sequenzen für die rep-cap-Gene aufweist.
Ein ähnlicher Ansatz wird bei Grimm et al. beschrieben (Hum. Gene Ther. (1998) 9,
2745-2760). Hier wird zusätzlich zum rAAV-Konstrukt ebenfalls ein Plasmid mit allen
adenoviralen Helferfunktionen verwendet, wobei in diesem Falle das Helfer-Plasmid die
rep-cap-Gene beinhaltet.
Bei beiden Verfahren wird die Bildung von kontaminierendem Helfervirus vermieden.
Auch bei diesen Verfahren ist jedoch für eine effiziente Infektion der Zielzellen und
anschließende Transduktion ein sehr hoher rAAV-Titer notwendig. Daraus folgt, dass die
Menge des mit Hilfe dieser rAAV-Konstrukte in den Zielzellen exprimierten Proteins im
Verhältnis zum hierzu benötigten rAAV-Virustiter nur sehr gering ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht entsprechend darin, ein auf AAV
basierendes Expressionssystem mit verbesserter Effizienz bereitzustellen, mit dem große
Mengen eines interessierenden heterologen Proteins in eukaryontischen Zellen exprimiert
werden können, und das ohne die Verwendung von Adeno-Helferviren auskommt. Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines
effizienten Verfahrens zur Genexpression in eukaryontischen Zellen mittels
rekombinanter Viren.
Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand von Anspruch 1 und den der
weiteren Ansprüche gelöst.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Vektorsystem zur Herstellung
rekombinanter AAV-Partikel, umfassend
- a) einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-Vektoren, die jeweils zwei
ITR-Sequenzen von AAV enthalten, wobei die Plasmid-Vektoren ferner folgende
Sequenzen umfassen:
- a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens;
- b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
- c) gegebenenfalls ein zu exprimierendes heterologes Gen X;
- d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y;
- e) gegebenenfalls das VA-Gen von Adenovirus;
- f) gegebenenfalls das E2A-Gen von Adenovirus;
wobei das E4-Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. der für E1B oder der für E1B55K kodierende Teil des E1-Gens sowie Gen X und Gen Y so angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen des jeweiligen Plasmid-Vektors flankiert werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden können; und gegebenenfalls - b) einen oder mehrere Plasmid-Vektoren ohne ITR-Sequenzen, enthaltend die für die Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung rekombinanter
AAV-Partikel umfassend die Co-Transfektion der Plasmid-Vektoren des
erfindungsgemäßen Vektorsystems in eukaryontische Zellen und Ernten der von den
transfizierten Zellen hergestellten Virionen. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur
Expression eines Gens in eukaryontischen Zellen, dass die vorstehend genannten Schritte
der Herstellung rekombinanter AAV-Partikel umfasst sowie die Infektion
eukaryontischer Zellen mit den so hergestellten Virionen und Isolieren des oder der
mittels der rekombinanten Virionen hergestellten Genprodukts/Genprodukte des/der in
den Virionen enthaltenen heterologen Gens/Gene.
Die Erfindung betrifft ferner Virus-Stocks rekombinanter AAV-Virionen, erhalten bzw.
erhältlich gemäß dem vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung rekombinanter
AAV-Partikel.
Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung von Plasmid-Vektoren, die jeweils zwei
ITR-Sequenzen von AAV enthalten, in dem erfindungsgemäßen Vektorsystem bzw. den
vorstehend genannten Verfahren.
Die Erfindung betrifft ferner Plasmid-Kits, enthaltend einen ersten und einen oder
mehrere weitere Plasmid-Vektoren mit jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV wie
vorstehend definiert, wobei wenigstens zwei der Plasmid-Vektoren in unterschiedlichen
Kompartimenten bzw. Behältern vorliegen. Vorzugsweise liegt dabei ein Plasmid-
Vektor, der das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil
des E4-Gens, gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B
und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, flankiert von zwei
ITR-Sequenzen von AAV sowie gegebenenfalls das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von
Adenovirus enthält, zusammen mit einem Plasmid-Vektor ohne ITR-Sequenzen, der die
für die Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV enthält,
in einem Gemisch vor.
Schließlich betrifft die Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend
Virus-Stocks gemäß der vorstehend genannten Art zusammen mit einem oder mehreren
pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und/oder einem pharmazeutisch
verträglichen Puffer.
Ein Hauptaspekt der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung liegt in der
Bereitstellung eines "2-Virionensystems" oder auch eines "3-Virionensystems" (wobei
auch Systeme, die eine darüber hinausgehende Anzahl verschiedener Virionen liefern
bzw. enthalten durchaus möglich und von der Erfindung umfasst sind).
Damit ist gemeint, dass das erfindungsgemäße Plasmid-Vektorsystem nach Transfektion
in eukaryontische Zellen gemäß den in diesem Zusammenhang beschriebenen Verfahren
zur Bildung von Virionen bzw. Virus-Stocks führt, die 2 oder 3 (oder auch mehr)
verschiedene Populationen von rAAV-Viren enthalten, nämlich eine erste und eine oder
mehrere weitere Populationen nicht-replikationskompetenter rAAV-Partikel, wobei die
rAAV-Viren der erfindungsgemäßen Virus-Stocks folgende Sequenzen auf der in ihnen
enthaltenen rekombinanten AAV-DNA aufweisen:
- a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4- Gens;
- b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
- c) ein zu exprimierendes heterologes Gen X;
- d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y; und
wobei sich die verschiedenen rAAV-Partikel in den Virus-Stocks bezüglich der
Anwesenheit mindestens einer der unter i)-iv) genannten Sequenzen unterscheiden.
Vorzugsweise sind die unter i)-vi) genannten Sequenzen in der rAAV-DNA jeweils nur
eines der 2 oder 3 oder mehreren von den erfindungsgemäßen Virus-Stocks umfassten
unterschiedlichen rAAV-Partikel enthalten.
Das hier beschriebene erfindungsgemäße Expressionssystem auf Basis rekombinanter
AAV-Plasmide bzw. -Virionen erlaubt die Expression großer Mengen an Protein
innerhalb relativ kurzer Zeit. Da die Expression der Proteine in Säugerzellen
durchgeführt werden kann, erlaubt es insbesondere die Expression großer Mengen an
Glykoproteinen mit intakten Oligosaccharidstrukturen, was Vorteile gegenüber
mikrobiellen Expressionssystemen bietet.
Diesbezügliche Vorteile des hier beanspruchten Expressionssystems ergeben sich auch
gegenüber anderen viralen Expressionssystemen, die eukaryontische Zellen verwenden.
Beispielsweise erfolgen bei Expressionssystemen auf der Grundlage von Baculovirus
posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen an den exprimierten Proteinen
nur sehr unvollständig, obwohl die dabei verwendeten Insektenzellen zu solchen
Modifikationen grundsätzlich in der Lage sein sollten. So analysierten Grabenhorst et al.
(Eur. J. Biochem. (1993) 215, 189-197) mit Hilfe des Baculovirus-System hergestelltes
rekombinantes Interleukin 2 (IL-2) und stellten fest, dass nur 25% des synthetisierten
Proteins von den Insektenzellen in das Medium abgegeben wurden. Darüber hinaus
zeigten von diesen 25% bis zu 85% der Moleküle N-terminale Trunkierungen, wobei die
Aminosäuren Alanin und Prolin bei der Mehrzahl dieser trunkierten Formen fehlten.
Entsprechend weist das Baculovirus-Expressionssystem jedenfalls bei der Expression
von Glykoproteinen einige Nachteile auf.
Demgegenüber erhält man mit dem erfindungsgemäßen viralen Expressionssystem
innerhalb kurzer Zeit große Mengen an intakten Glykoproteinen, die die entsprechenden
posttranslationalen Modifikationen wie Glykosylierungen aufweisen, was das
erfindungsgemäße Expressionssystem zum System der Wahl für die Expression großer
Glykoproteinmengen macht. Da das System kaum toxisch auf die Wirtszellen wirkt und
auch nicht zu einer Lyse der Wirtszellen führt, haben die gebildeten rekombinanten
Proteine ferner eine außergewöhnlich hohe proteinchemische Qualität.
Das erfindungsgemäße Expressionssystem bietet ferner Vorteile gegenüber bekannten
auf rAAV basierenden Systemen im Hinblick auf die Effizienz der Expression des
rekombinant zu exprimierenden Gens.
Im Zusammenhang mit auf AAV-basierenden Systemen wurde bereits die Generierung
von Zelllinien beschrieben, die bestimmte notwendige Helferfunktionen von Adenovirus,
nämlich die Adenovirus-E1A- und E1B-Funktionen, stabil exprimieren (HEK293-
Zellen). Darüber hinaus ist das E4-Gen für eine effiziente Transduktion bzw.
Produktbildung absolut notwendig. Das E4-Genprodukt ist in großen Mengen jedoch
toxisch für Zellen. Es ist deshalb nicht möglich, eine Zelllinie zu generieren, die das E4-
Gen permanent exprimiert. Mittlerweile existieren diesbezüglich induzierbare Zelllinien
(Gao et al., loc. cit.; Krougliak und Graham, Hum. Gen. Ther. (1995) 6, 1575-1586; Yeh
et al., J. Virol. (1996) 70, 559-565).
Nachteil dieser bekannten rAAV-Systeme ist allerdings, dass die Generierung solcher
Zelllinien aufwändig ist und die darauf abgestimmten rAAV-Systeme anschließend an
die Verwendung gerade dieser Zelllinien gebunden sind.
Eine lediglich transiente Expression des E4-Gens und des E1-Gens bzw. der von ihnen
kodierten notwendigen Helferfunktionen für AAV durch transiente Transfektion dieser
Funktionen in die mit dem rAAV-System zu verwendenden Zellen erscheint ebenfalls
sehr aufwändig und birgt zudem die Gefahr, dass abhängig von der
Transfektionseffizienz Schwankungen in der Proteinexpression zwischen verschiedenen
Ansätzen auftreten können.
Beim erfindungsgemäßen Vektorsystem kann hingegen auf E1- bzw. E4-exprimierende
Zelllinien bzw. auf eine Vortransfektion verzichtet werden, da die Adenovirus-
Helferfunktionen des E4- und, falls gewünscht, des E1-Gens auf Plasmid-Vektoren
lokalisiert sind, die nach Transfektion zur Bildung nicht-replikationskompetenter rAAV-
Viren führen, die ihrerseits wiederum die genannten Helferfunktionen enthalten und
exprimieren. Damit sind die mit dem erfindungsgemäßen Vektorsystem
durchzuführenden Verfahren zur rekombinanten Proteinexpression gegenüber bekannten
auf rAAV basierenden Verfahren schneller, effektiver und universeller einsetzbar.
Die Aufnahmekapazität von auf AAV-basierenden Vektoren ist beschränkt, da lediglich
rekombinante AAV-Konstrukte mit einer Länge bis zu ca. 4,9 kb in Virionen verpackt
werden können (siehe z. B. Dong et al., Human Gene Therapy (1996) 7, 2101-2112).
Neben den vorstehend genannten Vorteilen erlaubt das erfindungsgemäße Vektorsystem
ferner die Ausnutzung der gesamten Aufnahmekapazität von AAV-Konstrukten, da
durch die Aufteilung der für eine effiziente Virusproduktion und Proteinexpression
notwendigen Adenovirus- und AAV-Funktionen auf mehrere rAAV-Plasmid-Vektoren
die Möglichkeit gegeben ist, jedenfalls bei einem der Plasmid-Vektoren des Systems den
gesamten von den ITRs flankierten Bereich für zu exprimierende heterologe Sequenzen
auszunutzen.
Schließlich besteht ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen und beanspruchten
Expressionssystems mit 2 oder 3 (oder auch einer darüber hinausgehenden Anzahl)
verschiedener rAAV-Virionen darin, dass es erlaubt, zwei unterschiedliche Gene X und
Y in den eukaryontischen Zielzellen zu exprimieren. Auf diese Weise lassen sich etwa
heterodimere Glykoproteine in einer Zelle exprimieren, z. B. FSH (Follikel-
stimulierendes Hormon), TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon), LH (luteinisierendes
Hormon) und hCG (humanes Choriongonadotropin). Durch Verwendung induzierbarer
Promotoren kann die Expression von Gen X gegenüber der von Gen Y auch zeitversetzt
erfolgen, was z. B. für Rezeptor-Bindungsstudien von Vorteil sein kann.
Die Erfindung wird durch die Abbildungen näher erläutert.
Abb. 1 zeigt schematisch die genomische Organisation von AAV. Die rep-
Gensequenzen (rep = Replikation) kodieren für die Proteine rep78, rep68, rep52
und rep40, die von verschiedenen Transkripten kodiert werden (4,2 kb; 3;9 kb,
3,6 kb und 3,3 kb), die von den Promotoren p5 bzw. p19 aus transkribiert
werden. Die cap-Gensequenzen (cap = Capsid) kodieren für die Proteine VP1,
VP2 und VP3, die von Transkripten kodiert werden (2,3 kb), die vom p40-
Promotor aus transkribiert werden. Die ITR-Sequenzen, die u. a. essentiell für
die Virusintegration sind, sind so angeordnet, dass sie die rep- und cap-
Gensequenzen flankieren.
Abb. 2 zeigt zwei Beispiele (siehe 2a) und 2b) in der Abbildung) von
erfindungsgemäßen rAAV-Plasmidvektoren, die als 2-Virionensystem angelegt
sind, sowie deren Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur
Herstellung von rAAV-Partikeln und anschließender Expression eines Gens X
bzw. zweier Gene X und Y in eukaryontischen Zellen.
Abb. 3 zeigt eine Plasmidkarte des erfindungsgemäßen rAAV-Vektors pAdHelp (siehe
auch SEQ ID NO: 1)
Abb. 4 zeigt eine Plasmidkarte des erfindungsgemäßen rAAV-Vektors pAIM E1B55K
(siehe auch SEQ ID NO: 2)
Abb. 5 zeigt in Tabellenform die SEAP-Aktivität in HEK293-Zellen, die mit Plasmiden
vortransfiziert worden waren, die die in der Tabelle angegebenen Adenovirus-
E4-Gene exprimieren, und anschließend mit rAAV-Partikeln infiziert wurden
(basierend auf dem Vektor pAIC SEAP; siehe Beispiel 5), die SEAP
(menschliche sekretierte alkalische Phosphatase) exprimieren. Die Phosphatase-
Aktivität wurde sofort (0d) bzw. nach 3 Tagen (3d) im Zellüberstand gemessen.
Fehlerbalken geben die Standardabweichung für drei unabhängige Ansätze an.
Abb. 6 zeigt in Tabellenform die SEAP-Aktivität in HEK293-Zellen, bei denen keine
Vortransfektion mit Adenovirus-E4-Sequenzen exprimierenden Plasmiden
vorgenommen worden war. Die Zellen wurden mit rAAV-Partikeln infiziert, die
durch Co-Transfektion von pAIC SEAP mit weiteren Plasmid-Vektoren in
HEK293-Zellen erhalten wurden, wobei die Plasmid-Vektoren unter anderem
die in der Tabelle angegebenen Gensequenzen enthielten. Die Phosphatase-
Aktivität wurde sofort (0d) bzw. nach 3 Tagen (3d) und nach 7 Tagen (7d) im
Zellüberstand gemessen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung für drei
unabhängige Ansätze an.
Als ITR-Sequenzen und für AAV-rep- und cap-Proteine kodierende Sequenzen im Sinne
der vorliegenden Erfindung eignen sich grundsätzlich die ITR-Sequenzen bzw. die für
die rep- und cap-Proteine kodierenden Sequenzen aller AAV-Serotypen. Besonders
bevorzugt sind die von AAV Typ 2 und Typ 5, wobei jedoch die entsprechenden
Sequenzen anderer Serotypen einschließlich der Typen 1, 3 und 4 und 6 ebenfalls
verwendet werden können.
Ebenso eignen sich als E4-Gen bzw. für E4orf6 kodierende Sequenzen, E1-Gen bzw. für
E1B oder E1B55K kodierende Sequenzen, VA-Gen und E2A-Gen im Sinne der
vorliegenden Erfindung grundsätzlich die entsprechenden Sequenzen aller Adenovirus-
Serotypen. Besonders bevorzugt sind diesbezüglich die Sequenzen von Adenovirus Typ
2 und 5, wobei jedoch die entsprechenden Sequenzen anderer Serotypen ebenfalls gut
geeignet sind.
In dem erfindungsgemäßen Vektorsystem ist die Anwesenheit eines zu exprimierenden
Gens X oder zu exprimierender Gene X und Y optional. In einer bevorzugten
Ausführungsform enthält einer der ITR-Sequenzen enthaltenen Plasmid-Vektoren einen
Linker oder Polylinker zwischen den ITR-Sequenzen, wobei er bereits mit einer
Restriktionsendonuklease, die eine Erkennungsstelle im Linker oder Polylinker aufweist,
geschnitten sein oder noch zirkulär vorliegen kann. In diesen ITR-Sequenzen
enthaltenden Vektor des erfindungsgemäßen Systems kann (können) dann eine
gewünschte Gensequenz X (gewünschte Gensequenzen X und Y) kloniert werden,
gegebenenfalls nach Schneiden im Linker/Polylinker des betreffenden Plasmid-Vektors,
und der so erhaltene Plasmid-Vektor zusammen mit den anderen Vektoren des
erfindungsgemäßen Systems in eukaryontische Zellen transfiziert werden.
Der Begriff "heterologes Gen X" bzw. "heterologes Gen Y" meint Gene X und Y, die
bezüglich AAV heterolog sind. Es kann sich also auch um Gene handeln, die bezüglich
der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren transfizierten bzw. infizierten Zellen
endogen sind und dort normalerweise auch exprimiert werden. Vorzugsweise handelt es
sich bei den Genen X und Y um Gene, Gene die bezüglich der im Rahmen der
vorliegenden Erfindung transfizierten bzw. infizierten eukaryontischen Zellen nicht
endogen sind bzw. in diesen normalerweise nicht exprimiert werden.
Als Gen X bzw. Gen Y eignen sich grundsätzlich jegliche für Proteine kodierende
Gensequenzen soweit ihre Länge nicht die Verpackungskapazität des AAV-Systems
bzw. die Verpackungskapazität der AAV-Partikel betreffend die zu verpackende
rekombinante DNA übersteigt. Insbesondere geeignet als Gen X bzw. Gen Y sind
Sequenzen, die für Glykoproteine kodieren, etwa für Polypeptide, die als
Differenzierungs- bzw. Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Hormone wirken,
beispielsweise Erythropoietin, CSF (colony stimulating factor), G-CSF (granulocyte
colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating
factor), LIF (leukemia inhibitory factor), TNF (tumor necrosis factor), Lymphotoxin,
PDGF (platelet-derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), VEGF (vascular
endothelial cell growth factor), EGF (epidermal growth factor), TGF-α (transforming
growth factor α), TGF-β (transforming growth factor β), Thrombopoietin, SCF (stem
cell factor), Oncostatin M, Amphiregulin, Mullerian-Inhibiting Substance, B-CGF (B-
cell growth factor), MMIF (macrophage migration inhibitory factor) α-Interferon, β-
Interferon, γ-Interferon, IL- (Interleukin)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 und IL-17. Ebenfalls bevorzugt sind
Sequenzen, die für thrombolytisch wirkende Proteine bzw. Polypeptide, beispielsweise t-
PA und Urokinase; Thromboprophylaktika, beispielsweise Antithrombin III; und
Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise Faktor VIII und IX, kodieren.
Als Gen X bzw. Gen Y eignen sich jedoch auch Gensequenzen, bei denen nicht bekannt
ist, für welche Proteine sie kodieren bzw. welche Funktion die von ihnen kodierten
Proteine haben. Entsprechend eignet sich das erfindungsgemäße Vektorsystem auch für
das Screening nach Proteinen mit bestimmten biologischen Eigenschaften, die im
Rahmen des Systems exprimiert und anschließend hinsichtlich einer bestimmten
biologischen Aktivität getestet werden.
In den erfindungsgemäßen Plasmid-Vektoren und den Plasmid-Vektoren des
erfindungsgemäßen Vektorsystems bzw. den erfindungsgemäß enthaltenen rAAV-Partikel
sind das E4-Gen bzw. die für E4orf6 kodierenden Sequenzen, das E1-Gen bzw. die für
E1B oder E1B55K kodierenden Sequenzen, das VA-Gen, das E2A-Gen, die für die
AAV-rep- und cap-Proteine kodierenden Sequenzen und die zu exprimierenden Gene X
und Y mit den entsprechenden Transkriptions- und Translationssignalen versehen bzw.
mit ihnen operativ verbunden (z. B. mit permanenten oder induzierbaren Promotoren
bzw. mit Poly-Adenylierungssignalen), um eine effiziente Transkription und Translation
in den transfizierten bzw. infizierten eukaryontischen Zielzellen zu ermöglichen.
Die ITR-Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren des erfindungsgemäßen
Vektorsystems führen nach Transfektion in geeignete eukaryontische Zellen zur Bildung
nicht-replikationskompetenter rAAV-Virionen. Nicht-replikationskompetente rAAV-
Virionen unterscheiden sich von Wildtyp-AAV-Virionen dadurch, dass die für die
Replikation und Verpackung von AAV notwendigen cis-Sequenzen teilweise oder
vollständig fehlen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel bzw.
zur Expression eines Gens in eukaryontischen Zellen erfolgt eine Co-Transfektion der
Plasmid-Vektoren des erfindungsgemäßen Vektorsystems in die eukaryontischen Zellen,
wobei der in diesem Zusammenhang verwendete Begriff "Co-Transfektion" ein
zeitversetztes Transfizieren der Plasmid-Vektoren in die selben eukaryontischen Zellen
nicht ausschließt. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden dabei vorzugsweise an
Zellkulturen in vitro vorgenommen.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-
Partikel bzw. zur Expression eines Gens erfolgt die Transfektion bzw. Infektion unter
Verwendung geeigneter eukaryontischer Zellen, d. h. Zellen, die für AAV permissiv sind.
Bevorzugt sind diesbezüglich neben HEK293-Zellen insbesondere CHO-Zellen und
BHK-Zellen. Die Wahl jeweils geeigneter eukaryontischer Zellen hängt davon ab,
welche Adenovirus-Helferfunktionen durch das erfindungsgemäße Plasmid-
Vektorsystem bzw. die erfindungsgemäßen Virus-Stocks bereitgestellt werden, und von
welchem AAV- bzw. Adenovirus-Serotyp die darin enthaltenen AAV-Sequenzen und
Adenovirus-Sequenzen stammen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde unter anderem überraschenderweise
gefunden, dass die Expression des E4-Gens oder seines für E4orf6 kodierenden Teils in
Kombination mit dem E1-Gen bzw. dessen für E1B oder E1B55K kodierenden Teil im
Rahmen der Infektion eukaryontischer Zellen mit rAAV-Partikeln, die ein heterologes
Gen bzw. heterologe Gene enthalten, ausreicht, um eine effiziente Expression dieses
Gens bzw. dieser Gene in beliebigen eukaryontischen Zelllinien zu erhalten.
Entsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Vektorsystem
zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, dass einen ersten und einen zweiten
Plasmid-Vektor bzw. einen ersten und zwei weitere Plasmidvektoren umfasst, die jeweils
zwei ITR-Sequenzen von AAV enthalten, wobei die Plasmid-Vektoren folgende
Sequenzen umfassen:
- a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4- Gens;
- b) das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere bevorzugt den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
- c) gegebenenfalls ein zu exprimierendes heterologes Gen X; und
- d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y;
wobei das E4-Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. der für
E1B oder der für E1B55K kodierende Teil des E1-Gens sowie Gen X und Gen Y so
angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen des jeweiligen Plasmid-Vektors
flankiert werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den
ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden
können, und bei dem die unter i)-iv) genannten Sequenzen jeweils nur in einem der ITR-
Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind.
Vorzugsweise werden bei Verwendung des erfindungsgemäßen Vektorsystems nach
Transfektion in geeignete eukaryontische Zellen zwei Arten AAV-ähnlicher Partikel (d. h.
rAAV-Virionen) gebildet. Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Vektorsystem in
einer bevorzugten Ausführungsform einen ersten und einen zweiten Plasmid-Vektor, die
wie folgt aufgebaut sind: 1) der erste Plasmid-Vektor enthält alle für die Transduktion
erforderlichen und hinreichenden Helfersequenzen, nämlich E4orf6 und E1B55K,
flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion in eukaryontische
Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und E1B55K kodierenden
Sequenzen enthalten; und 2) der zweite Plasmid-Vektor enthält das (die) zu
exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise,
dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die
für das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y kodierenden Sequenzen
enthalten. Diese Ausführungsform ist beispielhaft in Abb. 2a) dargestellt.
In der speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform gemäß Abb. 2a) wird ein
Helferplasmid verwendet, das die Adenovirussequenzen betreffend E2A, VA, E1B55K
und E4orf6 enthält, wobei das E4orf6-Gen zusammen mit dem E1B55K-Gen von AAV-
ITRs flankiert werden. Beide Gene stehen unter der Kontrolle von unterschiedlichen
heterologen Promotoren, wobei diese permanent und/oder induzierbar sein können.
Ferner wird ein Vektorplasmid verwendet, das das Gen X unter der Kontrolle eines
permanenten oder induzierbaren Promotors enthält und auf beiden Seiten von ITRs
flankiert ist, die von AAV abstammen. Schließlich wird noch ein Verpackungsplasmid
für AAV eingesetzt, das die rep-Gene und die cap-Gene von AAV enthält, nicht jedoch
AAV-ITRs.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße
Vektorsystem einen ersten und einen zweiten Plasmid-Vektor, die wie folgt aufgebaut
sind: 1) der erste Plasmid-Vektor enthält für E4orf6 kodierende Sequenzen sowie das zu
exprimierende Gen X, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion
in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und Gen X
kodierenden Sequenzen enthalten; und 2) der zweite Plasmid-Vektor enthält für E1B55K
kodierende Sequenzen sowie das zu exprimierende Gen Y, flankiert von ITR-Sequenzen
in der Weise, dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet
werden, die die für E1B55K und Gen Y kodierenden Sequenzen enthalten. Diese
Ausführungsform ist beispielhaft in Abb. 2b) dargestellt.
In der speziellen Ausführungsform von Abb. 2b) wird ein Vektor-Plasmid verwendet,
das die Adenovirussequenzen für E2A, VA, E4orf6 und das zu exprimierende Gen X
enthält, wobei das E4orf6-Gen und das Gen X von AAV-ITRs flankiert werden. Beide
Gene stehen unter der Kontrolle von unterschiedlichen heterologen Promotoren, wobei
diese permanent und/oder induzierbar sein können. Ferner wird ein Vektorplasmid
verwendet, das die für E1B55K und ein zu exprimierendes Gen Y kodierenden
Sequenzen jeweils unter der Kontrolle verschiedener permanenter oder induzierbarer
Promotors enthält, die ebenfalls von AAV-ITRs flankiert werden. Auch im Falle der
Ausführungsform von Abb. 2b) wird zusätzlich ein Verpackungsplasmid für AAV
eingesetzt, das die rep-Gene und die cap-Gene von AAV enthält, nicht jedoch AAV-
ITRs.
Im Falle der Ausführungsform gemäß Abb. 2a) werden nach Transfektion zwei Arten
bzw. Populationen von rAAV-Partikeln gebildet: Die erste Art rAAV-Partikel enthält das
E4orf6-Gen und das E1B55K Gen; und die zweite Art rAAV-Partikel enthält das Gen X.
Mit dem so erhaltenen "2-Virionen"-Stock kann eine beliebige Zelllinie infiziert werden,
woraufhin in diesen Zellen das Gen X außergewöhnlich effizient exprimiert wird.
Im Falle der Ausführungsform gemäß Abb. 2b) werden nach Transfektion ebenfalls zwei
Arten bzw. Populationen von rAAV-Partikeln gebildet: Die erste Art rAAV-Partikel
enthält das E4orf6 Gen mit dem Gen X; und die zweite Art rAAV-Partikel enthält das
E1B55K-Gen mit dem Gen Y. Mit dem so erhaltenen "2-Virionen"-Stock kann ebenfalls
eine beliebige Zelllinie infiziert werden, woraufhin in diesen Zellen die Gene X und Y
außergewöhnlich effizient exprimiert werden.
Ebenfalls bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Vektorsysteme, bei
deren Verwendung nach Transfektion in geeignete eukaryontische Zellen drei Arten
AAV-ähnlicher Partikel gebildet werden. Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße
Vektorsystem in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform einen ersten und zwei
weitere Plasmid-Vektoren, die wie folgt aufgebaut sind: 1) der erste Plasmid-Vektor
enthält für ein zu exprimierendes Gen X kodierende Sequenzen, flankiert von ITR-
Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion rAAV-Partikel gebildet werden, die die
für Gen X kodierenden Sequenzen enthalten; 2) der zweite Plasmid-Vektor enthält für
E4orf6 kodierende Sequenzen, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach
Transfektion rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 kodierenden Sequenzen
enthalten; und 3) der dritte Plasmid-Vektor enthält für E1B55K kodierende Sequenzen,
flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion rAAV-Partikel
gebildet werden, die die für E1B55K kodierenden Sequenzen enthalten. Diese
Ausführungsform ist in Beispiel 9 durch die Kombination der Vektoren pAIC SEAP,
pAIM E1B55K und pAIC4 E4ORF6 exemplifiziert.
Im Falle der vorstehend genannten bevorzugten Ausführungsform werden nach
Transfektion drei Arten bzw. Populationen von rAAV-Partikeln gebildet: Die erste Art
rAAV-Partikel enthält das zu exprimierende Gen X; die zweite Art rAAV-Partikel
enthält das E4orf6-Gen; und die dritte Art rAAV-Partikel enthält das E1B55K-Gen. Mit
dem so erhaltenen "3-Virionen"-Stock kann ebenfalls eine beliebige Zelllinie infiziert
werden, woraufhin in diesen Zellen das Gen X außergewöhnlich effizient exprimiert
wird.
Schließlich basiert ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auf der Beobachtung,
dass sich die für die Helferfunktion des Adenovirus-VA-Gens notwendigen und
hinreichenden Sequenzen auf ein ca. 0,5 kb Minimal-Fragment von Adenovirus (Ad-2,
Genbank ID HACG; Nukleotide 10560 bis 11039) reduzieren lassen. Die Reduzierung
des VA-Gens auf dieses Fragment erlaubt eine höhere Flexibilität gegenüber bekannten
VA-Genkassetten, da die VA-Gensequenzen gemäß dem vorstehend genannten Aspekt
der Erfindung mit anderen Adenovirus-Helfersequenzen in Plasmid-Vektoren kombiniert
werden können ohne dass deren Größe im Hinblick auf eine Verwendung für die
Transfektion eukaryontischer Zellen dadurch unmittelbar limitierend werden würde.
Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch Plasmid-Vektoren, enthaltend ein
Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb,
dass in der Lage ist, die Helferfunktion betreffend AAV bereitzustellen. Vorzugsweise
handelt es sich bei dem Fragment um ein Fragment erhältlich durch PCR-Amplifikation
von Adenovirus-DNA-mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: Fund SEQ ID NO: 12,
insbesondere um das Fragment von Nukleotid 10560 bis 11039 von Adenovirus-Typ 2
bzw. das diesem entsprechende Fragment anderer Adenovirus-Serotypen.
Die Erfindung wird durch die bevorzugten Verfahren und Plasmid-Vektoren in den
nachstehenden Beispielen und dem Sequenzprotokoll näher erläutert, wobei diese jedoch
nicht als einschränkend zu verstehen sind.
HEK293-Zellen wurden über Nacht in DMEM Medium mit 7,5% FCS auf 10 cm2
Platten bis zu einer Konfluenz von 70% kultiviert. Die Zellen wurden nach
Standardprotokoll mit Superfect (Qiagen GmbH, Hilden) transfiziert. Dabei wurden 0,5 µg
von pAAVHelp, pAdHelp und pAIM E1B55K transfiziert. Zur Bestimmung der
SEAP-Aktivität wurde in einigen Fällen zusätzlich 1 µg pAIC SEAP hinzugegeben.
Die transfizierten Zellen wurden 3 Tage lang bei 37°C und 5% CO2 kultiviert, um die
Bildung von rAAV zu ermöglichen. Nach drei Tagen wurden die Zellen 2 × mit 1 × PBS
gewaschen und in sterile Eppendorfgefäße überführt. Nach Zentrifugation (3 min. 3000 U/min)
wurde der Überstand entfernt und zur Zelllyse 80 µl steriler AAV-Lysispuffer
hinzugegeben (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,5, 1 mM MgCl2). Nach drei
Gefrierzyklen in flüssigem Stickstoff (2 min) mit darauf folgendem Auftauen (37°C, 15 min)
wurden die Proben mit 5 U Benzonase (Roche, Mannheim) versetzt und bei 37°C
für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die zellulären Trümmer durch Zentrifugation
für 20 min bei 3800 U/min entfernt. Der klare Überstand wurde gesammelt und zur
Infektion eingesetzt.
HEK293-Zellen wurden über Nacht in DMEM-Medium mit 7,5% FCS auf 10 cm2
Platten bis zu einer Konfluenz von 50% kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit
je 50 µl nach Beispiel 1 erhaltener Virussuspension infiziert. Zur Bestimmung der
SEAP-Aktivität wurden nach 0, 1, 3 und 7 Tagen jeweils 100 µl Überstand entnommen
und analysiert.
50 µl Zellüberstand wurden bei 65°C für 10 min inkubiert und anschließend zentrifugiert
(2 min. 13000 U/min). 1-50 µl des Überstandes wurden mit 1 × SEAP-Probenpuffer auf
180 µl aufgefüllt (1,65 M Ethanolamin, 0.5 mM MgCl2, pH 9,8) und das Gemisch mit 40 µl
Substratlösung (60 mM p-Nitrophenolphosphat) versetzt. Die Farbentwicklung wurde
anschließend bei 405 nm über einen Zeitraum von 30 min gemessen.
Rekombinante AAV wurden von 4 × 108 infizierten HEK293-Zellen analog dem
Herstellungsprotokoll für rAAV präpariert. Mit CsCl2 wurde eine Dichte von 1,4 g/ml
hergestellt. Zur Einstellung eines Dichtegradienten wurde das Lysat für 24 Stunden bei
120.000 g zentrifugiert. Die rAAV enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und einer
weiteren Ultrazentrifugation unterzogen. Zum Schluss wurden die entsprechenden
Fraktionen gegen eine 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert. Das resultierende rAAV-Lysat
wurde zur Titerbestimmung verwendet.
Um erste Aussagen über die Anzahl der Viruspartikel zu erhalten, wurde der AAV
Titerbestimmungs-ELISA von Progen, Heidelberg verwendet. Die Titerbestimmung der
verpackten Viruspartikel wurde mit Hilfe des "infectious-center-assay" und Bestimmung
der β-gal-Aktivität in Verdünnungsassays bestimmt und ist analog der detaillierten
Anleitung bei Xiao et al., (J. Virol. (1996) 70, 8098-8108) bzw. Zhou und Muzyczka, (J.
Virol. (1998) 72, 3241-3247) durchgeführt worden.
Aus dem Plasmid pAAV/neo (ATCC 68065) wurde mit Hilfe der
Restriktionsendonuklease XbaI die Aminoglycosid-Phosphotransferase (Neomycin
resistenzgen) entfernt und durch eine 2,7 kb lange Expressionskassette, bestehend aus
Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, dem Gen für menschliche sekretierte alkalische
Phosphatase (SEAP) und Simianvirus 40 (SV40)-Polyadenylierungssignal (PolyA)
ersetzt. Das SEAP-Gen einschließlich SV40-PolyA stammten aus pSEAP-Basic
(Clontech 6049-1). Im resultierenden Plasmid pAIC SEAP wird die SEAP-
Expressionskassette links und rechts jeweils von 176 bp langen invertierten terminalen
Wiederholungen (ITR) aus dem Genom des Adeno-assoziierten Virus Typ 2 (AAV-2;
Genbank ID AF043303, Nukleotide 4489 bis 4664) flankiert.
Das Plasmid pAV2 (ATCC 37215) diente als Vorlage für eine Polymerase-
Kettenreaktion (PCR). Hierbei wurden mit Hilfe der Oligonukleotide oAMB0083 (5'-
ggttctagaGGTCCTGTATTAGAGGTCACG-3'; SEQ ID NO: 3) und oAMB0084 (5'-
ctatctagaCATGGAAACTAGATAAGAAAGAAAT-3'; SEQ ID NO: 4) die Nukleotide
190 bis 4492 des AAV-2-Genoms PCR-amplifiziert und nach Verdau mit der
Restriktionsendonuklease XbaI in den Vektor pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene
(1985) 33, 103-119) kloniert. Das resultierende Plasmid pAAVHelp enthält die AAV-2
rep- und cap-Gene unter der Kontrolle ihrer nativen Promotoren p5, p19 und p40.
Adenovirus Typ 2 (Ad-2, Genbank HACG)-DNA (Sigma D-3390) wurde jeweils mit
den Restriktionsendonukleasen HindIII und KpnI verdaut. Die Bruchstücke wurden in
die entsprechende Schnittstelle des Vektors pBluescriptII KS(+) (Stratagene 212207)
ligiert. Die-hieraus-entstandenen Plasmide pBS pBS pBS und pBS VA enthalten die
für die AAV-Helferfunktion hinreichenden Ad-2 Helferfragmente:
pBS E2A: 7,1 kb BamHI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 21606 bis 28658);
pBS E4: 2,3 kb SpeI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 34938 bis 32644), anschließend wurde die E4-Promotorregion mittels der Primer oAMB0034 (5'- ttttttctcgagTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3'; SEQ ID NO: 5) und oAMB0035 (5'- TAACCAGCGTAGCCCCTATGT-3'; SEQ ID NO: 6) PCR-amplifiziert und als 0,9 kb HindIII/XhoI-Fragment (Ad-2 Nukleotide 35835 bis 34933) hinzugefügt;
pBS VA: 1,7 kb SalI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 9831 bis 11555).
pBS E2A: 7,1 kb BamHI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 21606 bis 28658);
pBS E4: 2,3 kb SpeI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 34938 bis 32644), anschließend wurde die E4-Promotorregion mittels der Primer oAMB0034 (5'- ttttttctcgagTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3'; SEQ ID NO: 5) und oAMB0035 (5'- TAACCAGCGTAGCCCCTATGT-3'; SEQ ID NO: 6) PCR-amplifiziert und als 0,9 kb HindIII/XhoI-Fragment (Ad-2 Nukleotide 35835 bis 34933) hinzugefügt;
pBS VA: 1,7 kb SalI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 9831 bis 11555).
Das Plasmid pAI E4 enthält das E4-Gen (Ad-2 Nukleotide 34938 bis 32644) aus pBS E4,
flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4489 bis 4664). Es wurde
erhalten durch Austausch gegen die SEAP-Expressionskassette in pAIC SEAP.
Die Plasmide pTOPO E4ORF3 und pTOPO E4ORF6 enthalten Expressionskassetten für
E4ORF3 und E4ORF6, bestehend aus CMV-Promotor, E4ORF3 (Ad-2 Nukleotide
34715 bis 34356) bzw. E4ORF6 (Ad-2 Nukleotide 34086 bis 33193) und BGH (bovine
growth hormone)-PolyA, die durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Ad-2-
DNA als Template mit den Primern oAMB0076 (5'-tttgcaatcATGATTCGCTGC-3';
SEQ ID NO: 7) und oAMB0077 (5'-TTATTCCAAAAGATTATCCAAAAC-3'; SEQ ID
NO: 8) bzw. oAMB0078 (5'-tcaggaaatATGACTACGTCC-3'; SEQ ID NO: 9) und
oAMB0079 (5'-CTACATGGGGGTAGAGTCAT-3'; SEQ ID NO: 10) und
anschließendes Ligieren in den Vektor pcDNA3.1/His/V5-TOPO (Invitrogen) erhalten
wurden.
Das Plasmid pAIC4 E4ORF6 enthält eine Expressionskassette für E4ORF6, bestehend
aus CMV-Promotor, E4ORF6 (Ad-2 Nukleotide 34086 bis 33193) und SV40-PolyA,
flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4498 bis 4664). Es wurde
erhalten durch Austausch gegen das SEAP-Gen im Plasmid pAIC SEAP.
Das Plasmid pAdHelp (SEQ ID NO: 1; Abb. 3) enthält drei Ad-2-Helfergene für die
effiziente Produktion rekombinanter AAV-Partikeln:
- - eine Expressionskassette für E4ORF6, bestehend aus CMV-Promotor, E4ORF6 (Ad- 2 Nukleotide 34086 bis 33193) und SV40-PolyA, flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4498 bis 4664);
- - ein 5,4 kb langes genomisches SmaI/NruI-Fragment von E2A (Ad-2 Nukleotide 27341 bis 21921) aus pBS E2A;
- - ein 0,5 kb langes Minimalfragment von VA (Ad-2 Nukleotide 10560 bis 11039), das durch PCR-Amplifikation mittels der Primer oAMB64 (5'- tttatttcatatgatatcCGTGCGCAGTCGTTGACGC-3'; SEQ ID NO: 11) und oAMB065 (5'-tatttatcatatgatatcCTGGGAAAAGCAAAAAAGGGG-3'; SEQ ID NO: 12) erhalten worden ist.
Das Plasmid pAIM E1B55K (SEQ ID NO: 2; Abb. 4) enthält eine Expressionskassette für
E1B55K, bestehend aus MPSV-Promotor mit sich anschließendem SV40-Intron (Artelt
et al., Gene (1988) 68, 213-219), E1B55K (Ad-2 Nukleotide 2016 bis 3504) und SV40-
PolyA, flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4489 bis 4662);
der offene Leseraster von E1B55K wurde mit Hilfe der Primer oAMB0085 (5'-
aaaggatccATGGAGCGAAGAAACCCA-3'; SEQ ID NO: 13) und oAMB0086 (5'-
tttgaattcTCAATCTGTATCTTCATCGCT-3'; SEQ ID NO: 14) PCR-amplifiziert.
10 × 106 HEK293-Zellen wurden mit pAIC SEAP und pAAVHelp, pBS E2A, pBS E4
und pBS VA transfiziert. Gleichzeitig wurden je 1 × 106 HEK293-Zellen mit den in Abb.
5 angegebenen E4-Plasmide vortransfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen des
ersten Transfektionsansatzes lysiert (siehe Beispiel 1). Die Zellen des zweiten Ansatzes
erhielten neues Nährmedium und wurden mit je 50 µl rAAV-haltigem Lysat versetzt und
3 Tage lang bei 37°C inkubiert. Sofort (0d) bzw. nach 3 Tagen (3d) wurden je 50 µl
Zellüberstand entnommen und dessen Phosphatase-Aktivität gemessen (siehe Abb. 5).
Zellen, die mit pBS E4 ("E4"), bzw. pTOPO E4ORF6 ("E4ORF6") vortransfiziert
worden waren, zeigten aufgrund erhöhter Transduktionseffizienz eine höhere SEAP-
Expression nach Infektion. Dieser Effekt ist spezifisch für E4ORF6, da mit pTOPO
E4ORF3 ("E4ORF3") vortransfizierte Zellen eine Expressionsrate wie nicht
vortransfizierte Zellen ("mock") zeigten. Daraus ergibt sich, daß für eine effiziente
Proteinexpression die Expression von E4 oder E4ORF6 in den zu infizierenden Zellen
wichtig ist.
1 × 106 HEK293-Zellen wurden mit pAIC SEAP und pAAVHelp, pBS E2A, pBS VA
und den in Abb. 6 angegebenen E4-Helferplasmiden, d. h. mit pTOPO E4ORF6
("E4ORF6"), pAI E4 ("ITR-E4-ITR"), pAIC4 E4ORF6 ("ITR-E4ORF6-ITR") bzw.
pAdHelp ("ITR-E4ORF6-ITR-E2A-VA"), transfiziert. Bei Transfektion mit pAdHelp
wurde nicht mit pBS E2A und pBS VA transfiziert, weil sich diese beiden Gene schon
auf dem Tripelhelferplasmid zusammen mit E4ORF6 befinden. Bei Weglassen von
Plasmiden ("mock transfiziert", "nur SEAP", "kein E4") wurde die DNA-Menge mit
pBluescriptII KS- jeweils an die anderen Ansätze angeglichen. Nach 3 Tagen wurden die
Zellen lysiert (siehe Beispiel 1). Frisch ausgesäte HEK293-Zellen wurden mit 50 µl
rAAV-haltigem Lysat infiziert. Bei "mock infizierten" Zellen wurde nur Lysepuffer
zugegeben. Sofort (0d) bzw. nach 3 und 7 Tagen (3d, 7d) wurden je 50 µl Zellüberstand
entnommen und dessen Phosphatase-Aktivität gemessen (siehe Abb. 6).
Wie sich aus Abb. 6 ergibt, führte die Infektion mit den erfindungsgemäßen Virus-
Präparationen, die rekombinante AAV-Partikel mit dem zu exprimierenden Gen (hier
SEAP) zusammen mit rekombinanten AAV-Partikeln enthielten, die E4-Genabschnitte
trugen, zu hohen SEAP-Proteinexpressionsraten, während dies bei Infektion mit SEAP-
Gensequenzen enthaltenden rAAV-Partikeln allein nicht der Fall war. Es zeigte sich
ferner, dass mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem eine effiziente
Proteinexpression ohne Vortransfektion der Zellen mit E4-Genabschnitten erreicht wird.
1 × 106 HEK293-Zellen wurden mit pAIC SEAP, pAAVHelp, pAdHelp und pAIM
E1B55K transfiziert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen lysiert (siehe Beispiel 1). 1,5 × 106
frisch ausgesäte Zellen (CHO, BHK) wurden mit dem rAAV-haltigem Lysat infiziert.
Sofort (0d) bzw. nach 3 und 7 Tagen (3d, 7d) wurden je 50 µl Zellüberstand entnommen
und dessen Phosphatase-Aktivität gemessen.
Anhand der SEAP-Aktivitätsmessungen zeigte sich, dass die erhaltenen Präparationen
rekombinanter AAV-Partikel, die zusätzlich zu den in Beispiel 9 beschriebenen
Präparationen rekombinante AAV-Partikel mit E1B-Genabschnitten enthielten (3-
Virionensystem), eine effiziente Proteinexpression in Zielzellen ermöglichten (z. B. CHO,
BHK), die E1B nicht exprimieren.
Claims (43)
1. Vektorsystem zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, umfassend
- a) einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-Vektoren, die jeweils zwei
ITR-Sequenzen von AAV enthalten, wobei die Plasmid-Vektoren ferner
folgende Sequenzen umfassen:
- a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens;
- b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
- c) gegebenenfalls ein zu exprimierendes heterologes Gen X;
- d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y;
- e) gegebenenfalls das VA-Gen von Adenovirus;
- f) gegebenenfalls das E2A-Gen von Adenovirus;
wobei das E4-Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. der für E1B oder der für E1B55K kodierende Teil des E1-Gens sowie Gen X und Gen Y so angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen des jeweiligen Plasmid-Vektors flankiert werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden können; und gegebenenfalls - b) einen oder mehrere Plasmid-Vektoren ohne ITR-Sequenzen, enthaltend die für die Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV.
2. Vektorsystem gemäß Anspruch 1, bei dem die unter i)-iv) genannten Sequenzen, und
gegebenenfalls auch die unter v) und vi) genannten Sequenzen jeweils nur in einem
der ITR-Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind.
3. Vektorsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die rep-Gene und/oder die cap-Gene
von AAV, die für die Replikation und Verpackung rekombinanter AAV-Virionen
erforderlich sind, im ersten oder einem der weiteren ITR-Sequenzen enthaltenden
Plasmid-Vektoren enthalten sind, wobei sie dabei nicht von ITR-Sequenzen flankiert
werden.
4. Vektorsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der die rep- und cap-Gene von AAV
enthaltende Plasmid-Vektor bzw. die die rep- und cap-Gene von AAV enthaltenden
Plasmid-Vektoren ferner das VA-Gen von Adenovirus und/oder das E2A-Gen von
Adenovirus enthalten.
5. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den ITR-
Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren um einen ersten und einen zweiten
Plasmid-Vektor bzw. einen ersten und zwei weitere Plasmid-Vektoren handelt, und
wobei die unter i)-iv) genannten Sequenzen jeweils nur in einem der ITR-Sequenzen
enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind.
6. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem nach Transfektion in
eukaryontische Zellen zwei bzw. drei Arten nicht-replikationskompetenter rAAV-
Partikel gebildet werden.
7. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste ITR-Sequenzen
enthaltende Plasmid-Vektor den für E4orf6 und E1B55K kodierenden Teil des E4-
bzw. des E1-Gens enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen
rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und E1B55K kodierenden
Sequenzen enthalten, und wobei ein weiterer ITR-Sequenzen enthaltender Plasmid-
Vektor das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y, flankiert von ITR-
Sequenzen enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-
Partikel gebildet werden, die die für das die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X
und Y kodierenden Sequenzen enthalten.
8. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste ITR-Sequenzen
enthaltende Plasmid-Vektor den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens enthält
sowie das zu exprimierende heterologe Gen X, so dass nach Transfektion in
eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und das
Gen X kodierenden Sequenzen enthalten, und wobei ein weiterer ITR-Sequenzen
enthaltender Plasmid-Vektor den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens enthält
sowie das zu exprimierende Gen Y, so dass nach Transfektion in eukaryontische
Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E1B55K und Gen Y kodierenden
Sequenzen enthalten.
9. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei der erste ITR-Sequenzen
enthaltende Plasmid-Vektor das zu exprimierende heterologe Gen X enthält, so dass
nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die das
Gen X kodierende Sequenzen enthalten, und wobei ein zweiter ITR-Sequenzen
enthaltender Plasmid-Vektor den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens enthält,
so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden,
die für E4orf6 kodierende Sequenzen enthalten, und wobei ein dritter ITR-
Sequenzen enthaltender Plasmid-Vektor den für E1B55K kodierenden Teil des E1-
Gens enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel
gebildet werden, die für E1B55K kodierende Sequenzen enthalten.
10. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der erste ITR-Sequenzen
enthaltende Plasmid-Vektor ferner das VA-Gen und das E2A-Gen von Adenovirus
enthält.
11. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1-10, wobei es sich bei einem der ITR-
Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren um einen Vektor mit der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 handelt.
12. Virus-Stock enthaltend eine erste und eine oder mehrere weitere Populationen nicht-
replikationskompetenter rAAV-Partikel, wobei die in den rAAV-Partikeln
enthaltene rAAV-DNA folgende Sequenzen umfasst:
- a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens;
- b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
- c) ein zu exprimierendes heterologes Gen X; und
- d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y; und
13. Virus-Stock gemäß Anspruch 12, wobei die unter i)-iv) genannten Sequenzen
jeweils nur in der rAAV-DNA eines der rAAV-Partikel enthalten sind.
14. Virus-Stock gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei wobei es sich bei den
verschiedenen Populationen nicht-replikationskompetenter rAAV-Partikel um eine
erste und eine zweite bzw. um eine erste und zwei weitere rAAV-Populationen
handelt.
15. Virus-Stock gemäß Anspruch 14, wobei die in dem ersten rAAV-Partikel enthaltene
rAAV-DNA die für E4orf6 und E1B55K kodierenden Sequenzen enthält, und wobei
die im zweiten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für das (die) zu
exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y kodierenden Sequenzen enthält.
16. Virus-Stock gemäß Anspruch 14, wobei die in dem ersten rAAV-Partikel enthaltene
rAAV-DNA die für E4orf6 und das zu exprimierende Gen X kodierende Sequenzen
enthält, und wobei die im zweiten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für
E1B55K und das zu exprimierende Gen Y kodierenden Sequenzen enthält.
17. Virus-Stock gemäß Anspruch 14, wobei die indem ersten rAAV-Partikel enthaltene
rAAV-DNA die für das zu exprimierende Gen X kodierenden Sequenzen enthält,
und wobei die im zweiten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für E4orf6
kodierenden Sequenzen enthält, und wobei die in dem dritten rAAV-Partikel
enthaltene rAAV-DNA die für E1B55K kodierenden Sequenzen enthält.
18. Vektorsystem oder Virus-Stock gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das E4-
Gen bzw. sein für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. sein für E1B oder
E1B55K kodierender Teil, Gen X und Gen Y unter der Kontrolle eines heterologen
Promotors stehen.
19. Vektorsystem oder Virus-Stock gemäß Anspruch 18, wobei die Promotoren jeweils
verschieden voneinander sind.
20. Vektorsystem oder Virus-Stock gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei es sich bei dem
Promotor oder den Promotoren um (einen) induzierbare(n) Promotor(en) handelt.
21. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und 18 bis 20, wobei es sich bei
dem VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von
nicht mehr als etwa 0,5 kb handelt.
22. Vektorsystem gemäß Anspruch 21, wobei das Fragment erhältlich ist durch PCR-
Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer
gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.
23. Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel umfassend folgende
Schritte:
- a) Co-Transfektion der Plasmid-Vektoren des Vektorsystems gemäß einem der Ansprüche 1-11 oder 18-22 in eukaryontische Zellen;
- b) Ernten der von den transfizierten Zellen hergestellten Virionen.
24. Virus-Stock rekombinanter AAV-Virionen erhältlich nach dem Verfahren gemäß
Anspruch 23.
25. Verfahren zur Expression eines Gens in eukaryontischen Zellen umfassend die
Schritte a) und b) des Verfahrens gemäß Anspruch 23 sowie den folgenden Schritt:
c) Infektion eukaryontischer Zellen mit den gemäß Schritt b) hergestellten Virionen und Sammeln bzw. Isolieren des/der mittels der rekombinanten Virionen hergestellten Genprodukts/Genprodukte des/der in den Virionen enthaltenen heterologen Gens/Gene.
c) Infektion eukaryontischer Zellen mit den gemäß Schritt b) hergestellten Virionen und Sammeln bzw. Isolieren des/der mittels der rekombinanten Virionen hergestellten Genprodukts/Genprodukte des/der in den Virionen enthaltenen heterologen Gens/Gene.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das/die in Schritt c) hergestellte/n
Genprodukt/Genprodukte in einem weiteren Schritt im Hinblick auf eine
enzymatische oder anderweitige biologische Aktivität hin getestet und die für das
Genprodukt/die Genprodukte kodierende DNA gegebenenfalls anschließend isoliert
wird.
27. Verwendung eines Plasmid-Vektors, der jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV
enthält, in einem Vektorsystem bzw. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden
Ansprüche.
28. Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Plasmid-Vektor das E4-Gen bzw.
dessen für E4orf6 kodierenden Teil, und/oder das E1B-Gen, und/oder ein
heterologes Gen X und gegebenenfalls ein heterologes Gen Y enthält, wobei die
genannten Sequenzen so angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen flankiert
werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR-
Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden
können.
29. Verwendung gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei der Plasmid-Vektor ferner die rep-
Gene und/oder die cap-Gene von AAV enthält, die für die Replikation bzw. die
Verpackung erforderlich sind.
30. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der Plasmid-Vektor
ferner das VA-Gen von Adenovirus und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.
31. Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein Fragment
des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb
handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR-Amplifikation von
Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID
NO: 11 und SEQ ID NO: 12.
32. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Virus-Stocks gemäß einem der
Ansprüche 12-20 und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe
und/oder einen pharmazeutisch verträglichen Puffer.
33. Plasmid-Kit, enthaltend einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-
Vektoren mit jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV wie in Anspruch 1 und den
davon abhängigen Ansprüchen definiert, wobei wenigstens zwei der Plasmid-
Vektoren in unterschiedlichen Kompartimenten bzw. Behältern vorliegen.
34. Plasmid-Kit gemäß Anspruch 33, wobei ein Plasmid-Vektor, der das E4-Gen von
Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, und/oder
das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für
E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, flankiert von zwei ITR-Sequenzen von
AAV sowie gegebenenfalls das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus
enthält, zusammen mit einem Plasmid-Vektor ohne ITR-Sequenzen, der die für die
Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV enthält, in
einem Gemisch vorliegt.
35. Plasmid-Kit gemäß Anspruch 33 oder 34, wobei der Plasmid-Vektor ohne ITR-
Sequenzen das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.
36. Plasmid-Kit gemäß einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei es sich bei dem VA-Gen
um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von mehr als
etwa 0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR-
Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer
gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.
37. Plasmid-Vektor, enthaltend ein VA-Gen von Adenovirus, wobei es sich bei dem
VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht
mehr als etwa 0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR-
Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer
gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.
38. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 37, der ferner das E4-Gen von Adenovirus,
vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, und/oder das E1-Gen
von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K
kodierenden Teil des E1-Gens, flankiert von zwei ITR-Sequenzen von AAV sowie
gegebenenfalls das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.
39. Plasmid-Vektor enthaltend zwei ITR-Sequenzen von AAV und das E4-Gen von
Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, und/oder
das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für
E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, wobei die ITR-Sequenzen das E4 Gen bzw.
dessen für E4orf6 kodierenden Teil und/oder das E1-Gen bzw. dessen für E1B oder
E1B55K kodierenden Teil so flankieren, dass das E4 Gen bzw. dessen für E4orf6
kodierender Teil und/oder das E1-Gen bzw. dessen für E1B oder E1B55K
kodierender Teil nach Transfektion des Plasmid-Vektors in eukaryontische Zellen
zusammen mit den ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Partikel
verpackt werden kann/werden können, die keine weiteren bezüglich AAV
heterologen kodierenden Sequenzen und vorzugsweise keine weiteren kodierenden
Sequenzen zwischen den ITR-Sequenzen der in ihnen enthaltenen rAAV-DNA
aufweisen.
40. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 39, wobei der Plasmid-Vektor ferner die rep-Gene
und/oder die cap-Gene von AAV enthält.
41. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 39 oder 40, wobei der Plasmid-Vektor ferner das
VA-Gen von Adenovirus und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.
42. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 41, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein
Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa
0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR-Amplifikation
von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID
NO: 11 und SEQ ID NO: 12.
43. Plasmid-Vektor mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.
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