DE10056210A1

DE10056210A1 - Virales Expressionssystem

Info

Publication number: DE10056210A1
Application number: DE2000156210
Authority: DE
Inventors: Christian Wagener; Klaus Hellmuth; Georg Orberger
Original assignee: ARIMEDES BIOTECHNOLOGY GmbH
Current assignee: ARIMEDES BIOTECHNOLOGY GmbH
Priority date: 2000-11-13
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2002-05-29
Also published as: WO2002038782A3; WO2002038782A2; AU2002224845A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft virale Expressionssysteme, die einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-Vektoren umfassen, die jeweils zwei ITR-Sequenzen und das E4-Gen und gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus enthalten sowie ein zu exprimierendes heterologes Gen. Die Vektoren des Systems unterscheiden sich voneinander bezüglich der Anwesenheit mindestens einer der genannten Gensequenzen, wobei das E4-Gen, das E1-Gen sowie das heterologe Gen von ITR-Sequenzen flankiert und somit nach Transfektion in eukaryontische Zellen in Virionen verpackt werden. Die Erfindung betrifft ferner unter anderem Verfahren zur Herstellung rekombinanter Virionen und zur Expression eines Transgens in eukaryontischen Zellen unter Verwendung des genannten Vektorsystems sowie nach den genannten Verfahren erhältliche Virus-Stocks.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem ein Plasmid-Vektoren umfassendes Vektorsystem zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel unter Verwendung des genannten Vektorsystems, Virus- Stocks rekombinanter AAV-Partikel erhältlich gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie Verfahren zur Expression eines heterologen Gens in eukaryontischen Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Virus-Stocks.

Das adeno-assoziierte Virus (AAV) gehört zur Familie der Parvoviren und besitzt eine ikosaedrische Hüllkapsel von ca. 25-30 nm Durchmesser, die das Virusgenom in Form einer linearen, einzelsträngigen DNA (ssDNA) mit einer Länge von ca. 4,5 kb enthält. Gegenwärtig sind 6 Serotypen beschrieben (AAV 1-6), die untereinander eine große Homologie aufweisen (Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 3428-3432; Chiorini et al., 1 Virol. (1999) 73, 4293-4298; Chiorini et al., J. Virol. (1997) 71, 6823-6833).

Die Eignung, spezifisch in das Wirtsgenom integrieren zu können, das Fehlen jeglicher Pathogenität beim Menschen, die Fähigkeit, nicht nur proliferierende, sondern auch ruhende Zellen zu infizieren, und die Tatsache, dass sich das Virus nur in Gegenwart eines Helfervirus (insbesondere Adenovirus) vermehren kann, lassen AAV als potentiell besonders geeigneten Vektor für die somatische Gentherapie erscheinen. Rekombinant hergestellte AAV-Vektoren (rAAV-Vektoren) für gentherapeutische Applikationen werden heutzutage nicht nur "in vitro" in der Zellkultur, sondern auch "in vivo" in Geweben wie Lunge (Flotte et al., J. Biol. Chem. (1993) 268, 3781-3790; Conrad et al., Gene Ther. (1996) 3, 658-668; Halbert et al., J. Virol. (1997) 71, 5932-5941), Gehirn (Kaplitt et al.; Nat. Genet. (1994) 8, 148-154); Muskel (Xiao et al., J. Virol. (1996) 8098-8108), Retina (Ali et al., Hum. Mol. Genet. (1996) 5, 591-594; Flannery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 6916-6921), ZNS (Peel et al., Gene Ther. (1997) 4, 16-24) und Leber (Xiao et al., J. Virol. (1998) 72, 10222-10226) verwendet.

Das Genom des AAV umfasst 2 offene Leserahmen (open reading frames, ORFs), welche für die rep-(Replikation) und cap-(Verpackung bzw. Capsid) Proteine kodieren (siehe Abb. 1).

Das virale Genom flankierend findet sich an dessen beiden Enden jeweils eine lange invertierte Basensequenz (inverted terminal repeat; ITR) von 145 bp Länge (Samulski et al., Cell (1983) 33, 135-143). Die ITRs des AAV-Genoms enthalten palindromische Sequenzen, welche als sogenannte Haarnadelstrukturen während der DNA-Replikation als Primer fungieren. Zusätzlich tragen die ITRs die für Replikation, Verpackung und Integration in das Wirtszellgenom notwendigen "cis"-E1emente und sind von essentieller Bedeutung bei der Virusintegration (Collaco et al., Gene (1999) 238, 397-405).

Im AAV-Genom wurden drei Hauptpromotoren (P5, P19 und P40) identifiziert, von denen aus alle essentiellen Virusproteine transkribiert werden (siehe Abb. 1).

Die rep-Proteine (rep78, rep68, rep52 und rep40, benannt nach dem jeweiligen Molekulargewicht) sind auf der linken Seite des AAV-Genoms lokalisiert. Sie werden von den Promotoren p5 (rep78 und die Splicing-Variante rep68) und p19 (rep52 und die Splicing-Variante rep40) transkribiert. Alle vier Proteine besitzen eine identische mittlere Region, unterscheiden sich jedoch in ihren amino- und carboxyterminalen Regionen (Bueler, Biol. Chem. (1999) 380, 613-622).

Sowohl rep78 als auch rep68 sind an der AAV-DNA-Replikation beteiligt (Hermonat und Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 6466-6470; Hermonat et al., J. Yirol. (1984) 51, 329-339; Ni et al., J. Virol. (1994) 68, 1128-1138). Beide sind in der Lage, an die Haarnadelstrukturen der ITRs zu binden (Im und Muzyczka, J. Virol. (1989) 63, 3095-3104; McCarty et al., J. Virol. (1994) 68, 4988-4997) und besitzen zusätzlich ATPase- und Helikase-Aktivität (Walker et al., J. Yirol. (1997) 71; 2722-2730). Darüber hinaus vermitteln sie die Spezifität der Integrationsstelle auf dem humanen Chromosom 19 (Weitzman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 5808-5812; Linden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 7966-72; Surosky et al., J. Virol. (1997) 71, 7951-7959).

Die zwei kleineren Transkripte rep52 und rep40 werden für die Akkumulation von einzelsträngiger viraler DNA benötigt, welche in virale Partikel verpackt wird (Hermonat et al., loc. cit.; Berns und Linden, Bioessays (1995) 17, 237-245).

Die drei viralen Capsidproteine werden vom p40-Promotor aus transkribiert und sind auf der rechten Seite des AAV Genoms lokalisiert (Berns, Microbiol. Rev. (1990) 54, 316-329; siehe auch Abb. 1). Die Transkripte besitzen eine gemeinsame Intron- und poly- Adenylierungssequenz, werden aber von verschiedenen Startkodons aus kodiert. Das Capsid setzt sich zu ca. 90% aus Vp3 (62 kD) und zu jeweils ungefähr 5% aus Vp1 (87 kD) und Vp2 (62 kD) zusammen.

Der AAV-Lebenszyklus unterteilt sich in zwei Lebenszyklen, die latente und die lytische Phase.

In Abwesenheit von zusätzlichen Helferviren wird eine Zelle zwar von AAV infiziert, das Virus ruht aber anschließend als integriertes Genom in dieser Zelle (latente Phase). Dabei erfolgt die Integration des AAV-Genoms spezifisch im Chromosom 19, q13.3-pter (Berns et al., Virology (1975) 68, 556-560; Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87, 2211-2215; Linden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 11288-11294; Samulski et al., EMBO J. (1991) 10, 3941-3950). Replikation und Produktion von infektiösem Virus erfolgt erst, wenn die Zelle zusätzlich mit einem lytischen Helfervirus infiziert wird (z. B. Herpesvirus, Cytomegalovirus und insbesondere Adenovirus; Berns and Linden, loc, cit.). Wenn Adenovirus als Helfervirus fungiert, aktiviert das Adenovirus-E1A-Protein die Transkription des PS- und des p19-Promotors von AAV, was eine 5 bis 20fache Erhöhung der Synthese der rep-Proteine zur Folge hat. Die rep-Proteine wiederum aktivieren alle drei AAV-Promotoren (p5, p19 und p40) um mindestens das 50fache.

Zusätzlich zu E1A sind auch die Adenovirus-E1B- und die Adenovirus-E4-Region für eine effiziente AAV-Replikation erforderlich. Die durch diese Adenovirus-Regionen kodierten Proteine führen zu einer Akkumulation der AAV-mRNA, während Adenovirus-E2A- und Adenovirus-VA-RNA das Spleißen der AAV-RNA und die Translation stimuliert (West et al., Virology (1987) 160, 38-47; Janik et al., Virology (1989) 168, 320-329; Samulski und Shenk, J. Virol. (1988) 62, 206-210; Richardson und Westphal, J. Virol. (1984) 51, 404-410).

Auch bei einer adenoviralen Infektion einer Zelle sind die E1A- und E1B-Gene von essentieller Bedeutung. Als Untereinheiten des E1-Gens sind sie für die Umstellung des Zellstoffwechsels auf Virusproduktion zuständig. Das E1A-Gen dient zur transkriptionellen Aktivierung der Adenovirus-Gene. Das E1B-Gen kodiert zwei Untereinheiten: Das E1B19K- und das E1B55K-Protein. Dabei unterdrückt die Expression von E1B19K durch Komplexbildung mit E1A die frühe Genexpression, die sonst kontinuierlich weiterlaufen und somit vor Fertigstellung neuer Viruspartikel den Zelltod auslösen würde. Gleichzeitig schützt E1B19kD die virale und zelluläre DNA vor Abbau. Die zelluläre RNA-Translation wird gehemmt, wohingegen die späte virale Genexpression durch eine Kombination der adenoviralen Genfunktionen von E1B55K und E4orf6 beschleunigt wird.

Das E4-Gen des Adenovirus ist ein ca. 3 kb großes Fragment am rechten Ende des Adenovirusgenoms, welches in Linksrichtung transkribiert wird. Die Transkripte des E4- Promotors werden vielfach gespleißt, was zu insgesamt 18 verschiedenen mRNAs führt, die für 7 verschiedene Peptide (orf 1-7) kodieren (Leppard, K.N., J. Gen. Virol. (1997) 78, 2131-2138).

Die Aufgaben und Funktionen der einzelnen "open reading frames" (Orfs) von E4 sind allerdings nur teilweise bekannt. Während die Funktionen von E4 sind gut beschrieben sind, weiß man über die anderen Orfs von E4 nur sehr wenig. Derzeit vollkommen unbekannt sind etwa die Eigenschaften von E4orf2 und E4orf3/4. Über E4orf1 ist nur bekannt, dass es "transformierende Eigenschaften" besitzt (Javier, J. Virol. (1994) 68, 3917-3924). E4orf4 scheint die E1A-Aktivität und E4-Transkription negativ zu regulieren (Muller et al., J. Virol. (1992) 66, 5867-5878; Kleinberger und Shenk, J. Virol. (1993) 67, 7556-7560). E4orf6/7 bildet einen Komplex mit dem Zelltranskriptionsfaktor E2F und hat damit einen entscheidenden Einfluss auf den Zellzyklus der Zelle (Helm und Harlow, J. Virol. (1994) 68, 5027-5035).

Huang und Hearing (J. Virol. (1989) 63, 2605-2615) analysierten als Erste die Aufgaben der unterschiedlichen Orfs von E4. Dabei untersuchten sie anhand von Deletionsmutanten die Effekte auf die lytische Infektion beim Adenovirus und die Virusproduktion beim AAV. Sie konnten zeigen, dass obwohl E4orf6 mit 34 kD wesentlich größer ist als E4orf3 (21 kD), beide bei der Adenovirus-Infektion annähernd gleiche Funktionen besitzen.

Insbesondere werden beide genannten E4-Proteine für die Stabilisierung der Virus- mRNA im lytischen Zellzyklus gebraucht, steuern darüber hinaus die Proteinbiosynthese und sind für die Reduzierung der Wirtszellfunktionen verantwortlich. Dabei bilden E4orf6 und E4orf3 einen Komplex mit dem adenoviralen Genprodukt von E1B (55 kD). Diese Komplexe werden in den Zellkern transportiert und sind dort direkt am Splicing und dem Export der mRNAs aus dem Zellkern beteiligt (RNA-Transport; Leppard, loc. cit.).

Den Einfluss der einzelnen E4-Orfs auf den AAV-Lebenszyklus untersuchten Huang et al. (loc. cit.). Dabei analysierten sie deren Einfluss auf die AAV-Replikation und die Virusvermehrung. Es ergab sich bei der Virusproduktion, dass Adeno-Mutanten, bei denen E4orf3, E4orf1-3 oder E4orf1-4 deletiert waren, eine mit dem E4-Wildtyp vergleichbare Menge an AAV-DNA produzierten. Dagegen war die Menge an replikationsfähiger DNA bei allen anderen Mutanten (einschließlich der E4orf6-Mutante) drastisch reduziert oder überhaupt nicht nachweisbar.

Bei der Analyse der Virusreplikation zeigte sich ein ähnliches Bild, so dass die Autoren daraus folgerten, dass E4orf6 der entscheidende open reading frame für die AAV- Helferfunktion ist.

Die Generierung eines rekombinanten AAV (rAAV) ohne die Verwendung eines Wildtyp-Adenovirus als Helfervirus wird in der US-PS 5,436,146 und der US-PS 5,753,500 beschrieben. Dabei wird ein rekombinanter AAV-Vektor, bestehend aus einer Expressionskassette flankiert von AAV-ITRs, mit einem Helferplasmid kotransfiziert. In diesem sind die rep- und cap-Gene von AAV zwar von den Replikationsursprüngen (origins of replication) des Adenovirus flankiert, nicht jedoch von AAV-ITRs. Das so exprimierte Konstrukt weist entsprechend keine gemeinsamen Sequenzen mit dem AAV- Vektor auf. Durch die zusätzliche Infektion der Zellen mit Adenovirus werden alle für den lytischen Zyklus des rAAV notwendigen Helfervirus-Funktionen bereitgestellt.

Das genannte Verfahren liefert allerdings mit 10⁴ bis 10⁵ infektiösen Partikeln/ml Virustiter, die deutlich unter dem mit wt AAV-Viren erhaltenen Titer liegen (ca. 10¹²/ml) und kommt somit für eine effiziente Genexpression eines gewünschten Proteins nur bedingt in Frage.

Zahlreiche weitere Patente beschäftigen sich damit, die Expression der rep-cap-Gene so zu modifizieren, dass höhere Virustiter generiert werden können. Dabei werden diese Gene von verschiedenen heterologen oder viralen Promotoren exprimiert. So beschreibt z. B. die US-PS 5,658,776 eine 10fach erhöhte Verpackungseffizienz, wenn der p5- Promotor durch den HIV-LTR ersetzt wird. Daneben ist die jeweilige Expressionsrate der rep- und cap-Proteine von entscheidender Bedeutung. So hat eine erhöhte Expression der rep78/68-Proteine eine verringerte Expression der Capsidproteine zur Folge, was sich wiederum negativ auf den Virustiter auswirkt. Auf der anderen Seite hat eine verringerte rep78/68-Proteinexpression den umgekehrten Effekt (siehe die US-PS 6,037,177), so dass die Capsid-Produktion ein limitierender Faktor für die rAAV-Produktion zu sein scheint.

Verschiedene Gruppen beschreiben die Generierung stabiler Verpackungszelllinien (Clark et al., Hum. Gene Ther. (1995) 6, 1329-1341; Tamayose et al., Hum. Gene Ther. (1996) 7, 507-513; Gao et al., J. Virol. (1996) 70, 8934-8943; Wang und Finer, Gene Ther. (1995) 2, 755-783). Gao et al. (Hum. Gene Ther. (1998) 9, 2353-2362) infizierten HeLa-Zellen, welche das rep-cap Plasmid stabil integriert hatten, mit einem E2B- defekten Adenovirus, um die rep-cap-Expression zu induzieren. Mit einer weiteren Infektion infizierten sie die Zellen mit einem Adenovirus, welches das rAAV Genom in der E1A Region stabil integriert hatte. Das Verfahren führte zu einem hohen rAAV-Titer.

Ein Problem der genannten Verfahren besteht darin, dass neben der Produktion von rAAV-Viren auch Adenoviren erzeugt werden, welche in einem aufwendigen Prozess (CsCl₂-Gradient, Hitzeinaktivierung) von den rAAV-Partikeln getrennt werden müssen. Zusätzlich kommt es während des Reinigungsprozesses zu einer Reduzierung des rAAV- Titers.

Es wurden Versuche unternommen, anstatt der Infektion mit Adeno-Helfervirus nur noch die E1emente des Adenovirus-Genoms zu verwenden, welche für die AAV-Produktion notwendig sind.

So wird in der US-PS 6,040,183 und der US-PS 6,093,570 ein Verfahren beschrieben, bei dem die Helfervirus-Funktionen mittels Transfektion der einzelnen adenoviralen Gene bereitgestellt werden.

Die US-PS 6,004,797 (Colosi) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem AAV, bei dem ein Plasmid alle wichtigen adenoviralen Helferfunktionen (VA, E2A und E4orf6) besitzt. Ferner wird ein Konstrukt verwendet, welches neben den rAAV-Sequenzen auch noch die Sequenzen für die rep-cap-Gene aufweist.

Ein ähnlicher Ansatz wird bei Grimm et al. beschrieben (Hum. Gene Ther. (1998) 9, 2745-2760). Hier wird zusätzlich zum rAAV-Konstrukt ebenfalls ein Plasmid mit allen adenoviralen Helferfunktionen verwendet, wobei in diesem Falle das Helfer-Plasmid die rep-cap-Gene beinhaltet.

Bei beiden Verfahren wird die Bildung von kontaminierendem Helfervirus vermieden. Auch bei diesen Verfahren ist jedoch für eine effiziente Infektion der Zielzellen und anschließende Transduktion ein sehr hoher rAAV-Titer notwendig. Daraus folgt, dass die Menge des mit Hilfe dieser rAAV-Konstrukte in den Zielzellen exprimierten Proteins im Verhältnis zum hierzu benötigten rAAV-Virustiter nur sehr gering ist.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht entsprechend darin, ein auf AAV basierendes Expressionssystem mit verbesserter Effizienz bereitzustellen, mit dem große Mengen eines interessierenden heterologen Proteins in eukaryontischen Zellen exprimiert werden können, und das ohne die Verwendung von Adeno-Helferviren auskommt. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines effizienten Verfahrens zur Genexpression in eukaryontischen Zellen mittels rekombinanter Viren.

Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand von Anspruch 1 und den der weiteren Ansprüche gelöst.

Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Vektorsystem zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, umfassend

a) einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-Vektoren, die jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV enthalten, wobei die Plasmid-Vektoren ferner folgende Sequenzen umfassen:
- a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens;
- b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
- c) gegebenenfalls ein zu exprimierendes heterologes Gen X;
- d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y;
- e) gegebenenfalls das VA-Gen von Adenovirus;
- f) gegebenenfalls das E2A-Gen von Adenovirus;
wobei sich die Plasmid-Vektoren bezüglich der Anwesenheit mindestens einer der unter i)-iv) genannten Sequenzen unterscheiden; und
wobei das E4-Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. der für E1B oder der für E1B55K kodierende Teil des E1-Gens sowie Gen X und Gen Y so angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen des jeweiligen Plasmid-Vektors flankiert werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden können; und gegebenenfalls
b) einen oder mehrere Plasmid-Vektoren ohne ITR-Sequenzen, enthaltend die für die Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel umfassend die Co-Transfektion der Plasmid-Vektoren des erfindungsgemäßen Vektorsystems in eukaryontische Zellen und Ernten der von den transfizierten Zellen hergestellten Virionen. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Expression eines Gens in eukaryontischen Zellen, dass die vorstehend genannten Schritte der Herstellung rekombinanter AAV-Partikel umfasst sowie die Infektion eukaryontischer Zellen mit den so hergestellten Virionen und Isolieren des oder der mittels der rekombinanten Virionen hergestellten Genprodukts/Genprodukte des/der in den Virionen enthaltenen heterologen Gens/Gene.

Die Erfindung betrifft ferner Virus-Stocks rekombinanter AAV-Virionen, erhalten bzw. erhältlich gemäß dem vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel.

Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung von Plasmid-Vektoren, die jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV enthalten, in dem erfindungsgemäßen Vektorsystem bzw. den vorstehend genannten Verfahren.

Die Erfindung betrifft ferner Plasmid-Kits, enthaltend einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid-Vektoren mit jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV wie vorstehend definiert, wobei wenigstens zwei der Plasmid-Vektoren in unterschiedlichen Kompartimenten bzw. Behältern vorliegen. Vorzugsweise liegt dabei ein Plasmid- Vektor, der das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, flankiert von zwei ITR-Sequenzen von AAV sowie gegebenenfalls das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält, zusammen mit einem Plasmid-Vektor ohne ITR-Sequenzen, der die für die Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV enthält, in einem Gemisch vor.

Schließlich betrifft die Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Virus-Stocks gemäß der vorstehend genannten Art zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen und/oder einem pharmazeutisch verträglichen Puffer.

Ein Hauptaspekt der hier beschriebenen und beanspruchten Erfindung liegt in der Bereitstellung eines "2-Virionensystems" oder auch eines "3-Virionensystems" (wobei auch Systeme, die eine darüber hinausgehende Anzahl verschiedener Virionen liefern bzw. enthalten durchaus möglich und von der Erfindung umfasst sind).

Damit ist gemeint, dass das erfindungsgemäße Plasmid-Vektorsystem nach Transfektion in eukaryontische Zellen gemäß den in diesem Zusammenhang beschriebenen Verfahren zur Bildung von Virionen bzw. Virus-Stocks führt, die 2 oder 3 (oder auch mehr) verschiedene Populationen von rAAV-Viren enthalten, nämlich eine erste und eine oder mehrere weitere Populationen nicht-replikationskompetenter rAAV-Partikel, wobei die rAAV-Viren der erfindungsgemäßen Virus-Stocks folgende Sequenzen auf der in ihnen enthaltenen rekombinanten AAV-DNA aufweisen:

a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4- Gens;
b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
c) ein zu exprimierendes heterologes Gen X;
d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y; und

wobei sich die verschiedenen rAAV-Partikel in den Virus-Stocks bezüglich der Anwesenheit mindestens einer der unter i)-iv) genannten Sequenzen unterscheiden. Vorzugsweise sind die unter i)-vi) genannten Sequenzen in der rAAV-DNA jeweils nur eines der 2 oder 3 oder mehreren von den erfindungsgemäßen Virus-Stocks umfassten unterschiedlichen rAAV-Partikel enthalten.

Das hier beschriebene erfindungsgemäße Expressionssystem auf Basis rekombinanter AAV-Plasmide bzw. -Virionen erlaubt die Expression großer Mengen an Protein innerhalb relativ kurzer Zeit. Da die Expression der Proteine in Säugerzellen durchgeführt werden kann, erlaubt es insbesondere die Expression großer Mengen an Glykoproteinen mit intakten Oligosaccharidstrukturen, was Vorteile gegenüber mikrobiellen Expressionssystemen bietet.

Diesbezügliche Vorteile des hier beanspruchten Expressionssystems ergeben sich auch gegenüber anderen viralen Expressionssystemen, die eukaryontische Zellen verwenden. Beispielsweise erfolgen bei Expressionssystemen auf der Grundlage von Baculovirus posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen an den exprimierten Proteinen nur sehr unvollständig, obwohl die dabei verwendeten Insektenzellen zu solchen Modifikationen grundsätzlich in der Lage sein sollten. So analysierten Grabenhorst et al. (Eur. J. Biochem. (1993) 215, 189-197) mit Hilfe des Baculovirus-System hergestelltes rekombinantes Interleukin 2 (IL-2) und stellten fest, dass nur 25% des synthetisierten Proteins von den Insektenzellen in das Medium abgegeben wurden. Darüber hinaus zeigten von diesen 25% bis zu 85% der Moleküle N-terminale Trunkierungen, wobei die Aminosäuren Alanin und Prolin bei der Mehrzahl dieser trunkierten Formen fehlten. Entsprechend weist das Baculovirus-Expressionssystem jedenfalls bei der Expression von Glykoproteinen einige Nachteile auf.

Demgegenüber erhält man mit dem erfindungsgemäßen viralen Expressionssystem innerhalb kurzer Zeit große Mengen an intakten Glykoproteinen, die die entsprechenden posttranslationalen Modifikationen wie Glykosylierungen aufweisen, was das erfindungsgemäße Expressionssystem zum System der Wahl für die Expression großer Glykoproteinmengen macht. Da das System kaum toxisch auf die Wirtszellen wirkt und auch nicht zu einer Lyse der Wirtszellen führt, haben die gebildeten rekombinanten Proteine ferner eine außergewöhnlich hohe proteinchemische Qualität.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem bietet ferner Vorteile gegenüber bekannten auf rAAV basierenden Systemen im Hinblick auf die Effizienz der Expression des rekombinant zu exprimierenden Gens.

Im Zusammenhang mit auf AAV-basierenden Systemen wurde bereits die Generierung von Zelllinien beschrieben, die bestimmte notwendige Helferfunktionen von Adenovirus, nämlich die Adenovirus-E1A- und E1B-Funktionen, stabil exprimieren (HEK293- Zellen). Darüber hinaus ist das E4-Gen für eine effiziente Transduktion bzw. Produktbildung absolut notwendig. Das E4-Genprodukt ist in großen Mengen jedoch toxisch für Zellen. Es ist deshalb nicht möglich, eine Zelllinie zu generieren, die das E4- Gen permanent exprimiert. Mittlerweile existieren diesbezüglich induzierbare Zelllinien (Gao et al., loc. cit.; Krougliak und Graham, Hum. Gen. Ther. (1995) 6, 1575-1586; Yeh et al., J. Virol. (1996) 70, 559-565).

Nachteil dieser bekannten rAAV-Systeme ist allerdings, dass die Generierung solcher Zelllinien aufwändig ist und die darauf abgestimmten rAAV-Systeme anschließend an die Verwendung gerade dieser Zelllinien gebunden sind.

Eine lediglich transiente Expression des E4-Gens und des E1-Gens bzw. der von ihnen kodierten notwendigen Helferfunktionen für AAV durch transiente Transfektion dieser Funktionen in die mit dem rAAV-System zu verwendenden Zellen erscheint ebenfalls sehr aufwändig und birgt zudem die Gefahr, dass abhängig von der Transfektionseffizienz Schwankungen in der Proteinexpression zwischen verschiedenen Ansätzen auftreten können.

Beim erfindungsgemäßen Vektorsystem kann hingegen auf E1- bzw. E4-exprimierende Zelllinien bzw. auf eine Vortransfektion verzichtet werden, da die Adenovirus- Helferfunktionen des E4- und, falls gewünscht, des E1-Gens auf Plasmid-Vektoren lokalisiert sind, die nach Transfektion zur Bildung nicht-replikationskompetenter rAAV- Viren führen, die ihrerseits wiederum die genannten Helferfunktionen enthalten und exprimieren. Damit sind die mit dem erfindungsgemäßen Vektorsystem durchzuführenden Verfahren zur rekombinanten Proteinexpression gegenüber bekannten auf rAAV basierenden Verfahren schneller, effektiver und universeller einsetzbar.

Die Aufnahmekapazität von auf AAV-basierenden Vektoren ist beschränkt, da lediglich rekombinante AAV-Konstrukte mit einer Länge bis zu ca. 4,9 kb in Virionen verpackt werden können (siehe z. B. Dong et al., Human Gene Therapy (1996) 7, 2101-2112). Neben den vorstehend genannten Vorteilen erlaubt das erfindungsgemäße Vektorsystem ferner die Ausnutzung der gesamten Aufnahmekapazität von AAV-Konstrukten, da durch die Aufteilung der für eine effiziente Virusproduktion und Proteinexpression notwendigen Adenovirus- und AAV-Funktionen auf mehrere rAAV-Plasmid-Vektoren die Möglichkeit gegeben ist, jedenfalls bei einem der Plasmid-Vektoren des Systems den gesamten von den ITRs flankierten Bereich für zu exprimierende heterologe Sequenzen auszunutzen.

Schließlich besteht ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen und beanspruchten Expressionssystems mit 2 oder 3 (oder auch einer darüber hinausgehenden Anzahl) verschiedener rAAV-Virionen darin, dass es erlaubt, zwei unterschiedliche Gene X und Y in den eukaryontischen Zielzellen zu exprimieren. Auf diese Weise lassen sich etwa heterodimere Glykoproteine in einer Zelle exprimieren, z. B. FSH (Follikel- stimulierendes Hormon), TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon), LH (luteinisierendes Hormon) und hCG (humanes Choriongonadotropin). Durch Verwendung induzierbarer Promotoren kann die Expression von Gen X gegenüber der von Gen Y auch zeitversetzt erfolgen, was z. B. für Rezeptor-Bindungsstudien von Vorteil sein kann.

Die Erfindung wird durch die Abbildungen näher erläutert.

Abb. 1 zeigt schematisch die genomische Organisation von AAV. Die rep- Gensequenzen (rep = Replikation) kodieren für die Proteine rep78, rep68, rep52 und rep40, die von verschiedenen Transkripten kodiert werden (4,2 kb; 3;9 kb, 3,6 kb und 3,3 kb), die von den Promotoren p5 bzw. p19 aus transkribiert werden. Die cap-Gensequenzen (cap = Capsid) kodieren für die Proteine VP1, VP2 und VP3, die von Transkripten kodiert werden (2,3 kb), die vom p40- Promotor aus transkribiert werden. Die ITR-Sequenzen, die u. a. essentiell für die Virusintegration sind, sind so angeordnet, dass sie die rep- und cap- Gensequenzen flankieren.

Abb. 2 zeigt zwei Beispiele (siehe 2a) und 2b) in der Abbildung) von erfindungsgemäßen rAAV-Plasmidvektoren, die als 2-Virionensystem angelegt sind, sowie deren Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von rAAV-Partikeln und anschließender Expression eines Gens X bzw. zweier Gene X und Y in eukaryontischen Zellen.

Abb. 3 zeigt eine Plasmidkarte des erfindungsgemäßen rAAV-Vektors pAdHelp (siehe auch SEQ ID NO: 1)

Abb. 4 zeigt eine Plasmidkarte des erfindungsgemäßen rAAV-Vektors pAIM E1B55K (siehe auch SEQ ID NO: 2)

Abb. 5 zeigt in Tabellenform die SEAP-Aktivität in HEK293-Zellen, die mit Plasmiden vortransfiziert worden waren, die die in der Tabelle angegebenen Adenovirus- E4-Gene exprimieren, und anschließend mit rAAV-Partikeln infiziert wurden (basierend auf dem Vektor pAIC SEAP; siehe Beispiel 5), die SEAP (menschliche sekretierte alkalische Phosphatase) exprimieren. Die Phosphatase- Aktivität wurde sofort (0d) bzw. nach 3 Tagen (3d) im Zellüberstand gemessen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung für drei unabhängige Ansätze an.

Abb. 6 zeigt in Tabellenform die SEAP-Aktivität in HEK293-Zellen, bei denen keine Vortransfektion mit Adenovirus-E4-Sequenzen exprimierenden Plasmiden vorgenommen worden war. Die Zellen wurden mit rAAV-Partikeln infiziert, die durch Co-Transfektion von pAIC SEAP mit weiteren Plasmid-Vektoren in HEK293-Zellen erhalten wurden, wobei die Plasmid-Vektoren unter anderem die in der Tabelle angegebenen Gensequenzen enthielten. Die Phosphatase- Aktivität wurde sofort (0d) bzw. nach 3 Tagen (3d) und nach 7 Tagen (7d) im Zellüberstand gemessen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung für drei unabhängige Ansätze an.

Als ITR-Sequenzen und für AAV-rep- und cap-Proteine kodierende Sequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung eignen sich grundsätzlich die ITR-Sequenzen bzw. die für die rep- und cap-Proteine kodierenden Sequenzen aller AAV-Serotypen. Besonders bevorzugt sind die von AAV Typ 2 und Typ 5, wobei jedoch die entsprechenden Sequenzen anderer Serotypen einschließlich der Typen 1, 3 und 4 und 6 ebenfalls verwendet werden können.

Ebenso eignen sich als E4-Gen bzw. für E4orf6 kodierende Sequenzen, E1-Gen bzw. für E1B oder E1B55K kodierende Sequenzen, VA-Gen und E2A-Gen im Sinne der vorliegenden Erfindung grundsätzlich die entsprechenden Sequenzen aller Adenovirus- Serotypen. Besonders bevorzugt sind diesbezüglich die Sequenzen von Adenovirus Typ 2 und 5, wobei jedoch die entsprechenden Sequenzen anderer Serotypen ebenfalls gut geeignet sind.

In dem erfindungsgemäßen Vektorsystem ist die Anwesenheit eines zu exprimierenden Gens X oder zu exprimierender Gene X und Y optional. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält einer der ITR-Sequenzen enthaltenen Plasmid-Vektoren einen Linker oder Polylinker zwischen den ITR-Sequenzen, wobei er bereits mit einer Restriktionsendonuklease, die eine Erkennungsstelle im Linker oder Polylinker aufweist, geschnitten sein oder noch zirkulär vorliegen kann. In diesen ITR-Sequenzen enthaltenden Vektor des erfindungsgemäßen Systems kann (können) dann eine gewünschte Gensequenz X (gewünschte Gensequenzen X und Y) kloniert werden, gegebenenfalls nach Schneiden im Linker/Polylinker des betreffenden Plasmid-Vektors, und der so erhaltene Plasmid-Vektor zusammen mit den anderen Vektoren des erfindungsgemäßen Systems in eukaryontische Zellen transfiziert werden.

Der Begriff "heterologes Gen X" bzw. "heterologes Gen Y" meint Gene X und Y, die bezüglich AAV heterolog sind. Es kann sich also auch um Gene handeln, die bezüglich der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren transfizierten bzw. infizierten Zellen endogen sind und dort normalerweise auch exprimiert werden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Genen X und Y um Gene, Gene die bezüglich der im Rahmen der vorliegenden Erfindung transfizierten bzw. infizierten eukaryontischen Zellen nicht endogen sind bzw. in diesen normalerweise nicht exprimiert werden.

Als Gen X bzw. Gen Y eignen sich grundsätzlich jegliche für Proteine kodierende Gensequenzen soweit ihre Länge nicht die Verpackungskapazität des AAV-Systems bzw. die Verpackungskapazität der AAV-Partikel betreffend die zu verpackende rekombinante DNA übersteigt. Insbesondere geeignet als Gen X bzw. Gen Y sind Sequenzen, die für Glykoproteine kodieren, etwa für Polypeptide, die als Differenzierungs- bzw. Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Hormone wirken, beispielsweise Erythropoietin, CSF (colony stimulating factor), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), LIF (leukemia inhibitory factor), TNF (tumor necrosis factor), Lymphotoxin, PDGF (platelet-derived growth factor), FGF (fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial cell growth factor), EGF (epidermal growth factor), TGF-α (transforming growth factor α), TGF-β (transforming growth factor β), Thrombopoietin, SCF (stem cell factor), Oncostatin M, Amphiregulin, Mullerian-Inhibiting Substance, B-CGF (B- cell growth factor), MMIF (macrophage migration inhibitory factor) α-Interferon, β- Interferon, γ-Interferon, IL- (Interleukin)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 und IL-17. Ebenfalls bevorzugt sind Sequenzen, die für thrombolytisch wirkende Proteine bzw. Polypeptide, beispielsweise t- PA und Urokinase; Thromboprophylaktika, beispielsweise Antithrombin III; und Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise Faktor VIII und IX, kodieren.

Als Gen X bzw. Gen Y eignen sich jedoch auch Gensequenzen, bei denen nicht bekannt ist, für welche Proteine sie kodieren bzw. welche Funktion die von ihnen kodierten Proteine haben. Entsprechend eignet sich das erfindungsgemäße Vektorsystem auch für das Screening nach Proteinen mit bestimmten biologischen Eigenschaften, die im Rahmen des Systems exprimiert und anschließend hinsichtlich einer bestimmten biologischen Aktivität getestet werden.

In den erfindungsgemäßen Plasmid-Vektoren und den Plasmid-Vektoren des erfindungsgemäßen Vektorsystems bzw. den erfindungsgemäß enthaltenen rAAV-Partikel sind das E4-Gen bzw. die für E4orf6 kodierenden Sequenzen, das E1-Gen bzw. die für E1B oder E1B55K kodierenden Sequenzen, das VA-Gen, das E2A-Gen, die für die AAV-rep- und cap-Proteine kodierenden Sequenzen und die zu exprimierenden Gene X und Y mit den entsprechenden Transkriptions- und Translationssignalen versehen bzw. mit ihnen operativ verbunden (z. B. mit permanenten oder induzierbaren Promotoren bzw. mit Poly-Adenylierungssignalen), um eine effiziente Transkription und Translation in den transfizierten bzw. infizierten eukaryontischen Zielzellen zu ermöglichen.

Die ITR-Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren des erfindungsgemäßen Vektorsystems führen nach Transfektion in geeignete eukaryontische Zellen zur Bildung nicht-replikationskompetenter rAAV-Virionen. Nicht-replikationskompetente rAAV- Virionen unterscheiden sich von Wildtyp-AAV-Virionen dadurch, dass die für die Replikation und Verpackung von AAV notwendigen cis-Sequenzen teilweise oder vollständig fehlen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel bzw. zur Expression eines Gens in eukaryontischen Zellen erfolgt eine Co-Transfektion der Plasmid-Vektoren des erfindungsgemäßen Vektorsystems in die eukaryontischen Zellen, wobei der in diesem Zusammenhang verwendete Begriff "Co-Transfektion" ein zeitversetztes Transfizieren der Plasmid-Vektoren in die selben eukaryontischen Zellen nicht ausschließt. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden dabei vorzugsweise an Zellkulturen in vitro vorgenommen.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV- Partikel bzw. zur Expression eines Gens erfolgt die Transfektion bzw. Infektion unter Verwendung geeigneter eukaryontischer Zellen, d. h. Zellen, die für AAV permissiv sind. Bevorzugt sind diesbezüglich neben HEK293-Zellen insbesondere CHO-Zellen und BHK-Zellen. Die Wahl jeweils geeigneter eukaryontischer Zellen hängt davon ab, welche Adenovirus-Helferfunktionen durch das erfindungsgemäße Plasmid- Vektorsystem bzw. die erfindungsgemäßen Virus-Stocks bereitgestellt werden, und von welchem AAV- bzw. Adenovirus-Serotyp die darin enthaltenen AAV-Sequenzen und Adenovirus-Sequenzen stammen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde unter anderem überraschenderweise gefunden, dass die Expression des E4-Gens oder seines für E4orf6 kodierenden Teils in Kombination mit dem E1-Gen bzw. dessen für E1B oder E1B55K kodierenden Teil im Rahmen der Infektion eukaryontischer Zellen mit rAAV-Partikeln, die ein heterologes Gen bzw. heterologe Gene enthalten, ausreicht, um eine effiziente Expression dieses Gens bzw. dieser Gene in beliebigen eukaryontischen Zelllinien zu erhalten.

Entsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Vektorsystem zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, dass einen ersten und einen zweiten Plasmid-Vektor bzw. einen ersten und zwei weitere Plasmidvektoren umfasst, die jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV enthalten, wobei die Plasmid-Vektoren folgende Sequenzen umfassen:

a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4- Gens;
b) das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere bevorzugt den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
c) gegebenenfalls ein zu exprimierendes heterologes Gen X; und
d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y;

wobei das E4-Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. der für E1B oder der für E1B55K kodierende Teil des E1-Gens sowie Gen X und Gen Y so angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen des jeweiligen Plasmid-Vektors flankiert werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden können, und bei dem die unter i)-iv) genannten Sequenzen jeweils nur in einem der ITR- Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind.

Vorzugsweise werden bei Verwendung des erfindungsgemäßen Vektorsystems nach Transfektion in geeignete eukaryontische Zellen zwei Arten AAV-ähnlicher Partikel (d. h. rAAV-Virionen) gebildet. Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Vektorsystem in einer bevorzugten Ausführungsform einen ersten und einen zweiten Plasmid-Vektor, die wie folgt aufgebaut sind: 1) der erste Plasmid-Vektor enthält alle für die Transduktion erforderlichen und hinreichenden Helfersequenzen, nämlich E4orf6 und E1B55K, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und E1B55K kodierenden Sequenzen enthalten; und 2) der zweite Plasmid-Vektor enthält das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y kodierenden Sequenzen enthalten. Diese Ausführungsform ist beispielhaft in Abb. 2a) dargestellt.

In der speziellen erfindungsgemäßen Ausführungsform gemäß Abb. 2a) wird ein Helferplasmid verwendet, das die Adenovirussequenzen betreffend E2A, VA, E1B55K und E4orf6 enthält, wobei das E4orf6-Gen zusammen mit dem E1B55K-Gen von AAV- ITRs flankiert werden. Beide Gene stehen unter der Kontrolle von unterschiedlichen heterologen Promotoren, wobei diese permanent und/oder induzierbar sein können. Ferner wird ein Vektorplasmid verwendet, das das Gen X unter der Kontrolle eines permanenten oder induzierbaren Promotors enthält und auf beiden Seiten von ITRs flankiert ist, die von AAV abstammen. Schließlich wird noch ein Verpackungsplasmid für AAV eingesetzt, das die rep-Gene und die cap-Gene von AAV enthält, nicht jedoch AAV-ITRs.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Vektorsystem einen ersten und einen zweiten Plasmid-Vektor, die wie folgt aufgebaut sind: 1) der erste Plasmid-Vektor enthält für E4orf6 kodierende Sequenzen sowie das zu exprimierende Gen X, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und Gen X kodierenden Sequenzen enthalten; und 2) der zweite Plasmid-Vektor enthält für E1B55K kodierende Sequenzen sowie das zu exprimierende Gen Y, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E1B55K und Gen Y kodierenden Sequenzen enthalten. Diese Ausführungsform ist beispielhaft in Abb. 2b) dargestellt.

In der speziellen Ausführungsform von Abb. 2b) wird ein Vektor-Plasmid verwendet, das die Adenovirussequenzen für E2A, VA, E4orf6 und das zu exprimierende Gen X enthält, wobei das E4orf6-Gen und das Gen X von AAV-ITRs flankiert werden. Beide Gene stehen unter der Kontrolle von unterschiedlichen heterologen Promotoren, wobei diese permanent und/oder induzierbar sein können. Ferner wird ein Vektorplasmid verwendet, das die für E1B55K und ein zu exprimierendes Gen Y kodierenden Sequenzen jeweils unter der Kontrolle verschiedener permanenter oder induzierbarer Promotors enthält, die ebenfalls von AAV-ITRs flankiert werden. Auch im Falle der Ausführungsform von Abb. 2b) wird zusätzlich ein Verpackungsplasmid für AAV eingesetzt, das die rep-Gene und die cap-Gene von AAV enthält, nicht jedoch AAV- ITRs.

Im Falle der Ausführungsform gemäß Abb. 2a) werden nach Transfektion zwei Arten bzw. Populationen von rAAV-Partikeln gebildet: Die erste Art rAAV-Partikel enthält das E4orf6-Gen und das E1B55K Gen; und die zweite Art rAAV-Partikel enthält das Gen X. Mit dem so erhaltenen "2-Virionen"-Stock kann eine beliebige Zelllinie infiziert werden, woraufhin in diesen Zellen das Gen X außergewöhnlich effizient exprimiert wird.

Im Falle der Ausführungsform gemäß Abb. 2b) werden nach Transfektion ebenfalls zwei Arten bzw. Populationen von rAAV-Partikeln gebildet: Die erste Art rAAV-Partikel enthält das E4orf6 Gen mit dem Gen X; und die zweite Art rAAV-Partikel enthält das E1B55K-Gen mit dem Gen Y. Mit dem so erhaltenen "2-Virionen"-Stock kann ebenfalls eine beliebige Zelllinie infiziert werden, woraufhin in diesen Zellen die Gene X und Y außergewöhnlich effizient exprimiert werden.

Ebenfalls bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Vektorsysteme, bei deren Verwendung nach Transfektion in geeignete eukaryontische Zellen drei Arten AAV-ähnlicher Partikel gebildet werden. Entsprechend umfasst das erfindungsgemäße Vektorsystem in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform einen ersten und zwei weitere Plasmid-Vektoren, die wie folgt aufgebaut sind: 1) der erste Plasmid-Vektor enthält für ein zu exprimierendes Gen X kodierende Sequenzen, flankiert von ITR- Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion rAAV-Partikel gebildet werden, die die für Gen X kodierenden Sequenzen enthalten; 2) der zweite Plasmid-Vektor enthält für E4orf6 kodierende Sequenzen, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 kodierenden Sequenzen enthalten; und 3) der dritte Plasmid-Vektor enthält für E1B55K kodierende Sequenzen, flankiert von ITR-Sequenzen in der Weise, dass nach Transfektion rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E1B55K kodierenden Sequenzen enthalten. Diese Ausführungsform ist in Beispiel 9 durch die Kombination der Vektoren pAIC SEAP, pAIM E1B55K und pAIC4 E4ORF6 exemplifiziert.

Im Falle der vorstehend genannten bevorzugten Ausführungsform werden nach Transfektion drei Arten bzw. Populationen von rAAV-Partikeln gebildet: Die erste Art rAAV-Partikel enthält das zu exprimierende Gen X; die zweite Art rAAV-Partikel enthält das E4orf6-Gen; und die dritte Art rAAV-Partikel enthält das E1B55K-Gen. Mit dem so erhaltenen "3-Virionen"-Stock kann ebenfalls eine beliebige Zelllinie infiziert werden, woraufhin in diesen Zellen das Gen X außergewöhnlich effizient exprimiert wird.

Schließlich basiert ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auf der Beobachtung, dass sich die für die Helferfunktion des Adenovirus-VA-Gens notwendigen und hinreichenden Sequenzen auf ein ca. 0,5 kb Minimal-Fragment von Adenovirus (Ad-2, Genbank ID HACG; Nukleotide 10560 bis 11039) reduzieren lassen. Die Reduzierung des VA-Gens auf dieses Fragment erlaubt eine höhere Flexibilität gegenüber bekannten VA-Genkassetten, da die VA-Gensequenzen gemäß dem vorstehend genannten Aspekt der Erfindung mit anderen Adenovirus-Helfersequenzen in Plasmid-Vektoren kombiniert werden können ohne dass deren Größe im Hinblick auf eine Verwendung für die Transfektion eukaryontischer Zellen dadurch unmittelbar limitierend werden würde.

Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch Plasmid-Vektoren, enthaltend ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb, dass in der Lage ist, die Helferfunktion betreffend AAV bereitzustellen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Fragment um ein Fragment erhältlich durch PCR-Amplifikation von Adenovirus-DNA-mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: Fund SEQ ID NO: 12, insbesondere um das Fragment von Nukleotid 10560 bis 11039 von Adenovirus-Typ 2 bzw. das diesem entsprechende Fragment anderer Adenovirus-Serotypen.

Die Erfindung wird durch die bevorzugten Verfahren und Plasmid-Vektoren in den nachstehenden Beispielen und dem Sequenzprotokoll näher erläutert, wobei diese jedoch nicht als einschränkend zu verstehen sind.

Beispiel 1 Herstellung von rAAV

HEK293-Zellen wurden über Nacht in DMEM Medium mit 7,5% FCS auf 10 cm² Platten bis zu einer Konfluenz von 70% kultiviert. Die Zellen wurden nach Standardprotokoll mit Superfect (Qiagen GmbH, Hilden) transfiziert. Dabei wurden 0,5 µg von pAAVHelp, pAdHelp und pAIM E1B55K transfiziert. Zur Bestimmung der SEAP-Aktivität wurde in einigen Fällen zusätzlich 1 µg pAIC SEAP hinzugegeben.

Die transfizierten Zellen wurden 3 Tage lang bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert, um die Bildung von rAAV zu ermöglichen. Nach drei Tagen wurden die Zellen 2 × mit 1 × PBS gewaschen und in sterile Eppendorfgefäße überführt. Nach Zentrifugation (3 min. 3000 U/min) wurde der Überstand entfernt und zur Zelllyse 80 µl steriler AAV-Lysispuffer hinzugegeben (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,5, 1 mM MgCl₂). Nach drei Gefrierzyklen in flüssigem Stickstoff (2 min) mit darauf folgendem Auftauen (37°C, 15 min) wurden die Proben mit 5 U Benzonase (Roche, Mannheim) versetzt und bei 37°C für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die zellulären Trümmer durch Zentrifugation für 20 min bei 3800 U/min entfernt. Der klare Überstand wurde gesammelt und zur Infektion eingesetzt.

Beispiel 2 Infektion von Zellen

HEK293-Zellen wurden über Nacht in DMEM-Medium mit 7,5% FCS auf 10 cm² Platten bis zu einer Konfluenz von 50% kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit je 50 µl nach Beispiel 1 erhaltener Virussuspension infiziert. Zur Bestimmung der SEAP-Aktivität wurden nach 0, 1, 3 und 7 Tagen jeweils 100 µl Überstand entnommen und analysiert.

Beispiel 3 SEAP-Aktivitätsbestimmung

50 µl Zellüberstand wurden bei 65°C für 10 min inkubiert und anschließend zentrifugiert (2 min. 13000 U/min). 1-50 µl des Überstandes wurden mit 1 × SEAP-Probenpuffer auf 180 µl aufgefüllt (1,65 M Ethanolamin, 0.5 mM MgCl₂, pH 9,8) und das Gemisch mit 40 µl Substratlösung (60 mM p-Nitrophenolphosphat) versetzt. Die Farbentwicklung wurde anschließend bei 405 nm über einen Zeitraum von 30 min gemessen.

Beispiel 4 rAAV-Aufreinigung und Titerbestimmung

Rekombinante AAV wurden von 4 × 10⁸ infizierten HEK293-Zellen analog dem Herstellungsprotokoll für rAAV präpariert. Mit CsCl₂ wurde eine Dichte von 1,4 g/ml hergestellt. Zur Einstellung eines Dichtegradienten wurde das Lysat für 24 Stunden bei 120.000 g zentrifugiert. Die rAAV enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und einer weiteren Ultrazentrifugation unterzogen. Zum Schluss wurden die entsprechenden Fraktionen gegen eine 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert. Das resultierende rAAV-Lysat wurde zur Titerbestimmung verwendet.

Um erste Aussagen über die Anzahl der Viruspartikel zu erhalten, wurde der AAV Titerbestimmungs-ELISA von Progen, Heidelberg verwendet. Die Titerbestimmung der verpackten Viruspartikel wurde mit Hilfe des "infectious-center-assay" und Bestimmung der β-gal-Aktivität in Verdünnungsassays bestimmt und ist analog der detaillierten Anleitung bei Xiao et al., (J. Virol. (1996) 70, 8098-8108) bzw. Zhou und Muzyczka, (J. Virol. (1998) 72, 3241-3247) durchgeführt worden.

Beispiel 5 Konstruktion des AAV-Expressionsvektors

Aus dem Plasmid pAAV/neo (ATCC 68065) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonuklease XbaI die Aminoglycosid-Phosphotransferase (Neomycin resistenzgen) entfernt und durch eine 2,7 kb lange Expressionskassette, bestehend aus Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, dem Gen für menschliche sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) und Simianvirus 40 (SV40)-Polyadenylierungssignal (PolyA) ersetzt. Das SEAP-Gen einschließlich SV40-PolyA stammten aus pSEAP-Basic (Clontech 6049-1). Im resultierenden Plasmid pAIC SEAP wird die SEAP- Expressionskassette links und rechts jeweils von 176 bp langen invertierten terminalen Wiederholungen (ITR) aus dem Genom des Adeno-assoziierten Virus Typ 2 (AAV-2; Genbank ID AF043303, Nukleotide 4489 bis 4664) flankiert.

Beispiel 6 Konstruktion des AAV-Helferplasmids

Das Plasmid pAV2 (ATCC 37215) diente als Vorlage für eine Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Hierbei wurden mit Hilfe der Oligonukleotide oAMB0083 (5'- ggttctagaGGTCCTGTATTAGAGGTCACG-3'; SEQ ID NO: 3) und oAMB0084 (5'- ctatctagaCATGGAAACTAGATAAGAAAGAAAT-3'; SEQ ID NO: 4) die Nukleotide 190 bis 4492 des AAV-2-Genoms PCR-amplifiziert und nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease XbaI in den Vektor pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33, 103-119) kloniert. Das resultierende Plasmid pAAVHelp enthält die AAV-2 rep- und cap-Gene unter der Kontrolle ihrer nativen Promotoren p5, p19 und p40.

Beispiel 7 Konstruktion der Adenovirus-Helferplasmide

Adenovirus Typ 2 (Ad-2, Genbank HACG)-DNA (Sigma D-3390) wurde jeweils mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und KpnI verdaut. Die Bruchstücke wurden in die entsprechende Schnittstelle des Vektors pBluescriptII KS(+) (Stratagene 212207) ligiert. Die-hieraus-entstandenen Plasmide pBS pBS pBS und pBS VA enthalten die für die AAV-Helferfunktion hinreichenden Ad-2 Helferfragmente:
pBS E2A: 7,1 kb BamHI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 21606 bis 28658);
pBS E4: 2,3 kb SpeI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 34938 bis 32644), anschließend wurde die E4-Promotorregion mittels der Primer oAMB0034 (5'- ttttttctcgagTTTTAGGGCGGAGTAACTTGC-3'; SEQ ID NO: 5) und oAMB0035 (5'- TAACCAGCGTAGCCCCTATGT-3'; SEQ ID NO: 6) PCR-amplifiziert und als 0,9 kb HindIII/XhoI-Fragment (Ad-2 Nukleotide 35835 bis 34933) hinzugefügt;
pBS VA: 1,7 kb SalI/HindIII Fragment (Ad-2 Nukleotide 9831 bis 11555).

Das Plasmid pAI E4 enthält das E4-Gen (Ad-2 Nukleotide 34938 bis 32644) aus pBS E4, flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4489 bis 4664). Es wurde erhalten durch Austausch gegen die SEAP-Expressionskassette in pAIC SEAP.

Die Plasmide pTOPO E4ORF3 und pTOPO E4ORF6 enthalten Expressionskassetten für E4ORF3 und E4ORF6, bestehend aus CMV-Promotor, E4ORF3 (Ad-2 Nukleotide 34715 bis 34356) bzw. E4ORF6 (Ad-2 Nukleotide 34086 bis 33193) und BGH (bovine growth hormone)-PolyA, die durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Ad-2- DNA als Template mit den Primern oAMB0076 (5'-tttgcaatcATGATTCGCTGC-3'; SEQ ID NO: 7) und oAMB0077 (5'-TTATTCCAAAAGATTATCCAAAAC-3'; SEQ ID NO: 8) bzw. oAMB0078 (5'-tcaggaaatATGACTACGTCC-3'; SEQ ID NO: 9) und oAMB0079 (5'-CTACATGGGGGTAGAGTCAT-3'; SEQ ID NO: 10) und anschließendes Ligieren in den Vektor pcDNA3.1/His/V5-TOPO (Invitrogen) erhalten wurden.

Das Plasmid pAIC4 E4ORF6 enthält eine Expressionskassette für E4ORF6, bestehend aus CMV-Promotor, E4ORF6 (Ad-2 Nukleotide 34086 bis 33193) und SV40-PolyA, flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4498 bis 4664). Es wurde erhalten durch Austausch gegen das SEAP-Gen im Plasmid pAIC SEAP.

Das Plasmid pAdHelp (SEQ ID NO: 1; Abb. 3) enthält drei Ad-2-Helfergene für die effiziente Produktion rekombinanter AAV-Partikeln:

- eine Expressionskassette für E4ORF6, bestehend aus CMV-Promotor, E4ORF6 (Ad- 2 Nukleotide 34086 bis 33193) und SV40-PolyA, flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4498 bis 4664);
- ein 5,4 kb langes genomisches SmaI/NruI-Fragment von E2A (Ad-2 Nukleotide 27341 bis 21921) aus pBS E2A;
- ein 0,5 kb langes Minimalfragment von VA (Ad-2 Nukleotide 10560 bis 11039), das durch PCR-Amplifikation mittels der Primer oAMB64 (5'- tttatttcatatgatatcCGTGCGCAGTCGTTGACGC-3'; SEQ ID NO: 11) und oAMB065 (5'-tatttatcatatgatatcCTGGGAAAAGCAAAAAAGGGG-3'; SEQ ID NO: 12) erhalten worden ist.

Das Plasmid pAIM E1B55K (SEQ ID NO: 2; Abb. 4) enthält eine Expressionskassette für E1B55K, bestehend aus MPSV-Promotor mit sich anschließendem SV40-Intron (Artelt et al., Gene (1988) 68, 213-219), E1B55K (Ad-2 Nukleotide 2016 bis 3504) und SV40- PolyA, flankiert auf beiden Seiten von AAV-ITRs (AAV-2 Nukleotide 4489 bis 4662); der offene Leseraster von E1B55K wurde mit Hilfe der Primer oAMB0085 (5'- aaaggatccATGGAGCGAAGAAACCCA-3'; SEQ ID NO: 13) und oAMB0086 (5'- tttgaattcTCAATCTGTATCTTCATCGCT-3'; SEQ ID NO: 14) PCR-amplifiziert.

Beispiel 8 Bestimmung der SEAP Aktivität nach Vortransfektion

10 × 10⁶ HEK293-Zellen wurden mit pAIC SEAP und pAAVHelp, pBS E2A, pBS E4 und pBS VA transfiziert. Gleichzeitig wurden je 1 × 10⁶ HEK293-Zellen mit den in Abb. 5 angegebenen E4-Plasmide vortransfiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen des ersten Transfektionsansatzes lysiert (siehe Beispiel 1). Die Zellen des zweiten Ansatzes erhielten neues Nährmedium und wurden mit je 50 µl rAAV-haltigem Lysat versetzt und 3 Tage lang bei 37°C inkubiert. Sofort (0d) bzw. nach 3 Tagen (3d) wurden je 50 µl Zellüberstand entnommen und dessen Phosphatase-Aktivität gemessen (siehe Abb. 5). Zellen, die mit pBS E4 ("E4"), bzw. pTOPO E4ORF6 ("E4ORF6") vortransfiziert worden waren, zeigten aufgrund erhöhter Transduktionseffizienz eine höhere SEAP- Expression nach Infektion. Dieser Effekt ist spezifisch für E4ORF6, da mit pTOPO E4ORF3 ("E4ORF3") vortransfizierte Zellen eine Expressionsrate wie nicht vortransfizierte Zellen ("mock") zeigten. Daraus ergibt sich, daß für eine effiziente Proteinexpression die Expression von E4 oder E4ORF6 in den zu infizierenden Zellen wichtig ist.

Beispiel 9 Bestimmung der SEAP Aktivität ohne Vortransfektion

1 × 10⁶ HEK293-Zellen wurden mit pAIC SEAP und pAAVHelp, pBS E2A, pBS VA und den in Abb. 6 angegebenen E4-Helferplasmiden, d. h. mit pTOPO E4ORF6 ("E4ORF6"), pAI E4 ("ITR-E4-ITR"), pAIC4 E4ORF6 ("ITR-E4ORF6-ITR") bzw. pAdHelp ("ITR-E4ORF6-ITR-E2A-VA"), transfiziert. Bei Transfektion mit pAdHelp wurde nicht mit pBS E2A und pBS VA transfiziert, weil sich diese beiden Gene schon auf dem Tripelhelferplasmid zusammen mit E4ORF6 befinden. Bei Weglassen von Plasmiden ("mock transfiziert", "nur SEAP", "kein E4") wurde die DNA-Menge mit pBluescriptII KS- jeweils an die anderen Ansätze angeglichen. Nach 3 Tagen wurden die Zellen lysiert (siehe Beispiel 1). Frisch ausgesäte HEK293-Zellen wurden mit 50 µl rAAV-haltigem Lysat infiziert. Bei "mock infizierten" Zellen wurde nur Lysepuffer zugegeben. Sofort (0d) bzw. nach 3 und 7 Tagen (3d, 7d) wurden je 50 µl Zellüberstand entnommen und dessen Phosphatase-Aktivität gemessen (siehe Abb. 6).

Wie sich aus Abb. 6 ergibt, führte die Infektion mit den erfindungsgemäßen Virus- Präparationen, die rekombinante AAV-Partikel mit dem zu exprimierenden Gen (hier SEAP) zusammen mit rekombinanten AAV-Partikeln enthielten, die E4-Genabschnitte trugen, zu hohen SEAP-Proteinexpressionsraten, während dies bei Infektion mit SEAP- Gensequenzen enthaltenden rAAV-Partikeln allein nicht der Fall war. Es zeigte sich ferner, dass mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem eine effiziente Proteinexpression ohne Vortransfektion der Zellen mit E4-Genabschnitten erreicht wird.

Beispiel 10 Bestimmung der SEAP-Aktivität ohne Vortransfektion unter Einbeziehung von E1B55K

1 × 10⁶ HEK293-Zellen wurden mit pAIC SEAP, pAAVHelp, pAdHelp und pAIM E1B55K transfiziert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen lysiert (siehe Beispiel 1). 1,5 × 10⁶ frisch ausgesäte Zellen (CHO, BHK) wurden mit dem rAAV-haltigem Lysat infiziert. Sofort (0d) bzw. nach 3 und 7 Tagen (3d, 7d) wurden je 50 µl Zellüberstand entnommen und dessen Phosphatase-Aktivität gemessen.

Anhand der SEAP-Aktivitätsmessungen zeigte sich, dass die erhaltenen Präparationen rekombinanter AAV-Partikel, die zusätzlich zu den in Beispiel 9 beschriebenen Präparationen rekombinante AAV-Partikel mit E1B-Genabschnitten enthielten (3- Virionensystem), eine effiziente Proteinexpression in Zielzellen ermöglichten (z. B. CHO, BHK), die E1B nicht exprimieren.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Vektorsystem zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel, umfassend

2. Vektorsystem gemäß Anspruch 1, bei dem die unter i)-iv) genannten Sequenzen, und gegebenenfalls auch die unter v) und vi) genannten Sequenzen jeweils nur in einem der ITR-Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind.

3. Vektorsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die rep-Gene und/oder die cap-Gene von AAV, die für die Replikation und Verpackung rekombinanter AAV-Virionen erforderlich sind, im ersten oder einem der weiteren ITR-Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind, wobei sie dabei nicht von ITR-Sequenzen flankiert werden.

4. Vektorsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der die rep- und cap-Gene von AAV enthaltende Plasmid-Vektor bzw. die die rep- und cap-Gene von AAV enthaltenden Plasmid-Vektoren ferner das VA-Gen von Adenovirus und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthalten.

5. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den ITR- Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren um einen ersten und einen zweiten Plasmid-Vektor bzw. einen ersten und zwei weitere Plasmid-Vektoren handelt, und wobei die unter i)-iv) genannten Sequenzen jeweils nur in einem der ITR-Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren enthalten sind.

6. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem nach Transfektion in eukaryontische Zellen zwei bzw. drei Arten nicht-replikationskompetenter rAAV- Partikel gebildet werden.

7. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste ITR-Sequenzen enthaltende Plasmid-Vektor den für E4orf6 und E1B55K kodierenden Teil des E4- bzw. des E1-Gens enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und E1B55K kodierenden Sequenzen enthalten, und wobei ein weiterer ITR-Sequenzen enthaltender Plasmid- Vektor das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y, flankiert von ITR- Sequenzen enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV- Partikel gebildet werden, die die für das die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y kodierenden Sequenzen enthalten.

8. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der erste ITR-Sequenzen enthaltende Plasmid-Vektor den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens enthält sowie das zu exprimierende heterologe Gen X, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E4orf6 und das Gen X kodierenden Sequenzen enthalten, und wobei ein weiterer ITR-Sequenzen enthaltender Plasmid-Vektor den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens enthält sowie das zu exprimierende Gen Y, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die die für E1B55K und Gen Y kodierenden Sequenzen enthalten.

9. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei der erste ITR-Sequenzen enthaltende Plasmid-Vektor das zu exprimierende heterologe Gen X enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die das Gen X kodierende Sequenzen enthalten, und wobei ein zweiter ITR-Sequenzen enthaltender Plasmid-Vektor den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die für E4orf6 kodierende Sequenzen enthalten, und wobei ein dritter ITR- Sequenzen enthaltender Plasmid-Vektor den für E1B55K kodierenden Teil des E1- Gens enthält, so dass nach Transfektion in eukaryontische Zellen rAAV-Partikel gebildet werden, die für E1B55K kodierende Sequenzen enthalten.

10. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der erste ITR-Sequenzen enthaltende Plasmid-Vektor ferner das VA-Gen und das E2A-Gen von Adenovirus enthält.

11. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1-10, wobei es sich bei einem der ITR- Sequenzen enthaltenden Plasmid-Vektoren um einen Vektor mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 handelt.

12. Virus-Stock enthaltend eine erste und eine oder mehrere weitere Populationen nicht- replikationskompetenter rAAV-Partikel, wobei die in den rAAV-Partikeln enthaltene rAAV-DNA folgende Sequenzen umfasst:

a) das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens;
b) gegebenenfalls das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens;
c) ein zu exprimierendes heterologes Gen X; und
d) gegebenenfalls ein zusätzliches zu exprimierendes heterologes Gen Y; und

wobei sich die rAAV-Partikel bezüglich der Anwesenheit mindestens einer der unter i)-iv) genannten Sequenzen innerhalb der in ihnen enthaltenen rAAV-DNA unterscheiden.

13. Virus-Stock gemäß Anspruch 12, wobei die unter i)-iv) genannten Sequenzen jeweils nur in der rAAV-DNA eines der rAAV-Partikel enthalten sind.

14. Virus-Stock gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei wobei es sich bei den verschiedenen Populationen nicht-replikationskompetenter rAAV-Partikel um eine erste und eine zweite bzw. um eine erste und zwei weitere rAAV-Populationen handelt.

15. Virus-Stock gemäß Anspruch 14, wobei die in dem ersten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für E4orf6 und E1B55K kodierenden Sequenzen enthält, und wobei die im zweiten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für das (die) zu exprimierende(n) Gen(e) X bzw. X und Y kodierenden Sequenzen enthält.

16. Virus-Stock gemäß Anspruch 14, wobei die in dem ersten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für E4orf6 und das zu exprimierende Gen X kodierende Sequenzen enthält, und wobei die im zweiten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für E1B55K und das zu exprimierende Gen Y kodierenden Sequenzen enthält.

17. Virus-Stock gemäß Anspruch 14, wobei die indem ersten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für das zu exprimierende Gen X kodierenden Sequenzen enthält, und wobei die im zweiten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für E4orf6 kodierenden Sequenzen enthält, und wobei die in dem dritten rAAV-Partikel enthaltene rAAV-DNA die für E1B55K kodierenden Sequenzen enthält.

18. Vektorsystem oder Virus-Stock gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das E4- Gen bzw. sein für E4orf6 kodierender Teil, das E1-Gen bzw. sein für E1B oder E1B55K kodierender Teil, Gen X und Gen Y unter der Kontrolle eines heterologen Promotors stehen.

19. Vektorsystem oder Virus-Stock gemäß Anspruch 18, wobei die Promotoren jeweils verschieden voneinander sind.

20. Vektorsystem oder Virus-Stock gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei es sich bei dem Promotor oder den Promotoren um (einen) induzierbare(n) Promotor(en) handelt.

21. Vektorsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und 18 bis 20, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb handelt.

22. Vektorsystem gemäß Anspruch 21, wobei das Fragment erhältlich ist durch PCR- Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.

23. Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV-Partikel umfassend folgende Schritte:

a) Co-Transfektion der Plasmid-Vektoren des Vektorsystems gemäß einem der Ansprüche 1-11 oder 18-22 in eukaryontische Zellen;
b) Ernten der von den transfizierten Zellen hergestellten Virionen.

24. Virus-Stock rekombinanter AAV-Virionen erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 23.

25. Verfahren zur Expression eines Gens in eukaryontischen Zellen umfassend die Schritte a) und b) des Verfahrens gemäß Anspruch 23 sowie den folgenden Schritt:
c) Infektion eukaryontischer Zellen mit den gemäß Schritt b) hergestellten Virionen und Sammeln bzw. Isolieren des/der mittels der rekombinanten Virionen hergestellten Genprodukts/Genprodukte des/der in den Virionen enthaltenen heterologen Gens/Gene.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das/die in Schritt c) hergestellte/n Genprodukt/Genprodukte in einem weiteren Schritt im Hinblick auf eine enzymatische oder anderweitige biologische Aktivität hin getestet und die für das Genprodukt/die Genprodukte kodierende DNA gegebenenfalls anschließend isoliert wird.

27. Verwendung eines Plasmid-Vektors, der jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV enthält, in einem Vektorsystem bzw. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.

28. Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Plasmid-Vektor das E4-Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierenden Teil, und/oder das E1B-Gen, und/oder ein heterologes Gen X und gegebenenfalls ein heterologes Gen Y enthält, wobei die genannten Sequenzen so angeordnet sind, dass sie von den ITR-Sequenzen flankiert werden und nach Transfektion in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR- Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Virionen verpackt werden können.

29. Verwendung gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei der Plasmid-Vektor ferner die rep- Gene und/oder die cap-Gene von AAV enthält, die für die Replikation bzw. die Verpackung erforderlich sind.

30. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der Plasmid-Vektor ferner das VA-Gen von Adenovirus und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.

31. Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR-Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.

32. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend Virus-Stocks gemäß einem der Ansprüche 12-20 und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe und/oder einen pharmazeutisch verträglichen Puffer.

33. Plasmid-Kit, enthaltend einen ersten und einen oder mehrere weitere Plasmid- Vektoren mit jeweils zwei ITR-Sequenzen von AAV wie in Anspruch 1 und den davon abhängigen Ansprüchen definiert, wobei wenigstens zwei der Plasmid- Vektoren in unterschiedlichen Kompartimenten bzw. Behältern vorliegen.

34. Plasmid-Kit gemäß Anspruch 33, wobei ein Plasmid-Vektor, der das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, und/oder das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, flankiert von zwei ITR-Sequenzen von AAV sowie gegebenenfalls das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält, zusammen mit einem Plasmid-Vektor ohne ITR-Sequenzen, der die für die Replikation und Verpackung erforderlichen rep- und cap-Gene von AAV enthält, in einem Gemisch vorliegt.

35. Plasmid-Kit gemäß Anspruch 33 oder 34, wobei der Plasmid-Vektor ohne ITR- Sequenzen das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.

36. Plasmid-Kit gemäß einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von mehr als etwa 0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR- Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.

37. Plasmid-Vektor, enthaltend ein VA-Gen von Adenovirus, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR- Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.

38. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 37, der ferner das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, und/oder das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, flankiert von zwei ITR-Sequenzen von AAV sowie gegebenenfalls das VA-Gen und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.

39. Plasmid-Vektor enthaltend zwei ITR-Sequenzen von AAV und das E4-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E4orf6 kodierenden Teil des E4-Gens, und/oder das E1-Gen von Adenovirus, vorzugsweise den für E1B und insbesondere den für E1B55K kodierenden Teil des E1-Gens, wobei die ITR-Sequenzen das E4 Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierenden Teil und/oder das E1-Gen bzw. dessen für E1B oder E1B55K kodierenden Teil so flankieren, dass das E4 Gen bzw. dessen für E4orf6 kodierender Teil und/oder das E1-Gen bzw. dessen für E1B oder E1B55K kodierender Teil nach Transfektion des Plasmid-Vektors in eukaryontische Zellen zusammen mit den ITR-Sequenzen in nicht-replikationskompetente rAAV-Partikel verpackt werden kann/werden können, die keine weiteren bezüglich AAV heterologen kodierenden Sequenzen und vorzugsweise keine weiteren kodierenden Sequenzen zwischen den ITR-Sequenzen der in ihnen enthaltenen rAAV-DNA aufweisen.

40. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 39, wobei der Plasmid-Vektor ferner die rep-Gene und/oder die cap-Gene von AAV enthält.

41. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 39 oder 40, wobei der Plasmid-Vektor ferner das VA-Gen von Adenovirus und/oder das E2A-Gen von Adenovirus enthält.

42. Plasmid-Vektor gemäß Anspruch 41, wobei es sich bei dem VA-Gen um ein Fragment des VA-Gens von Adenovirus mit einer Länge von nicht mehr als etwa 0,5 kb handelt, insbesondere um ein Fragment erhältlich durch PCR-Amplifikation von Adenovirus-DNA, insbesondere Ad-2 DNA, mittels der Primer gemäß SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12.

43. Plasmid-Vektor mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.