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Einleitung
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Technisches Fachgebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Säuger-Transduktionsvektoren
und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von in vitro-encapsidierten
Säuger-Transduktionsvektoren.
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Stand der Technik
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Das
Adeno-assoziierte Virus (AAV) gehört zur Familie Parvoviridae
(Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology 158:
97–129,
1992). Das Parvovirus-Virion besteht aus drei Strukturproteinen und
einem linearen, einzelsträngigen
(ss) DNA-Genom. Das Partikel weist eine ikosaedrische Symmetrie
und einen Durchmesser von 18 bis 26 nm auf. Fünf Serotypen von AAV wurden
identifiziert, wobei jedoch AAV-2 der am besten charakterisierte
Typ ist. Von der vollständigen
Nucleotidsequenz von AAV-2 wurde berichtet (Srivastava et al., J.
Virol. 45: 555–564,
1983) und sie enthält
4680 Basen. Das AAV-Genom enthält
terminale invertierte Sequenzwiederholungen (TR) von 145 Basen.
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Mindestens
drei Regionen wurden im AAV-Genom durch Mutationsstudien identifiziert.
Die rep-Region codiert vier Proteine, die für die AAV-DNA-Replikation und/oder
-Rettung erforderlich sind. Rep-Proteine bestehen aus vier überlappenden
Polypeptiden: Rep78, Rep68, Rep52 und Rep40. Die cap-Region scheint
die AAV-Capsidproteine
zu codieren; Mutanten in diesen Regionen sind zur DNA-Replikation
fähig,
bilden jedoch keine infektiösen
Partikel. Mutationsstudien haben gezeigt, dass die invertierten
terminalen Sequenzwiederholungen für die DNA-Replikation in cis
erforderlich sind.
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Die
drei Capsidproteine von AAV, VP1, VP2 und VP3, haben Molekulargewichte
von 90, 72 und 62 kDa und liegen im Virion in einem Verhältnis von
1:1:10 vor. Durch genetische Untersuchung wird gezeigt, dass VP2
und VP3 selbst Nachkommen-DNA encapsidieren können (Hermonat et al., J. Virol.
51: 329– 333,
1984; Tratschin et al., J. Virol. 51: 611–619, 1984). Jedoch sind Virionpartikel,
denen VP1 fehlt, weniger infektiös
als diejenigen, bei denen die Capsidproteine vollständig vorliegen.
Parvovirus-Strukturproteine, einschließlich derjenigen von AAV, B19
und dem Virus der Aleutenkrankheit („Aleutian Disease Virus"), exprimiert in
Insektenzellen, sind in der Lage, sich zu leeren Capsiden zusammenzulagern
(Ruffing et al., J. Virol. 66: 6922–6930, 1992; Brown et al.,
J. Virol. 65: 2702–2706,
1991; Christensen et al., J. Virol. 67: 229–238, 1993). Ergebnisse der
subzellulären
Verteilung von AAV-Capsidproteinen legen nahe, dass die Untereinheiten
für eine
effiziente Kernakkumulation und einen anschließenden Partikel-Zusammenbau
Komplexe bilden müssen
(Wistuba et al., 1995, im Druck).
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AAV
kann entweder als ein integriertes Provirus oder durch lytische
Infektion vermehrt werden (Atchison et al., Science 149: 754–756, 1965;
Hoggan et al., 1972, Proceedings of the Fourth Lepetite Colloquium, Cocoyac,
Mexiko, North-Holland, Amsterdam, S. 243–249). Die Fähigkeit
zur Bildung einer latenten Infektion scheint ein Bestandteil des
Lebenszyklus von AAV zu sein. AAV benötigt, außer unter speziellen Umständen (Yacobson
et al., J. Virol. 61: 972–981,
1987; Schlehofer et al., Virology 152: 110–117, 1986; Yalkinoglu et al., Cancer
Res. 48: 3123–3125,
1988), das Vorliegen eines Helfervirus, um eine produktive virale
Infektion zu initiieren. Mitglieder entweder der Herpes- oder der
Adenovirus-Familien können
die erforderlichen Helferfunktionen bereitstellen (Atchison et al.,
Science 149: 754–756,
1965; Melnick, J. Bacteriol. 90: 271–274, 1965; McPherson, Virology
147: 217–222,
1985), und Vaccinia-Virus kann mindestens eine teilweise Helferfunktion
bereitstellen (Schlehofer et al., Virology 152: 110–117, 1986).
In Abwesenheit eines Helfervirus produziert AAV kein Nachkommen-Virus,
integriert sich jedoch stattdessen in ein Wirtschromosom, wodurch
ein Provirus gebildet wird (Hoggan et al., 1972; Berns et al., Virology
68: 556–560,
1975; Handa et al., Virology 82: 84–92, 1977; Cheung et al., J.
Virol. 33: 739–748,
1980). Mit wenigen Ausnahmen scheinen AAV-Proviren stabil zu sein.
Wenn jedoch eine Zelllinie, welche ein AAV-Provirus trägt, anschließend mit
einem Helfervirus superinfiziert wird, wird das AAV-Genom ausgeschnitten
und durchläuft
eine normale produktive Infektion (Hoggan et al., 1972; Cheung et
al., J. Virol. 33: 739–748,
1980). Diese Fähigkeit,
eine latente Infektion zu etablieren, die später gerettet werden kann, scheint
ein Mechanismus zu sein, mit dem das Überleben von AAV in Abwesenheit
eines Helfervirus sichergestellt wird.
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Für die in
vivo-Zusammenlagerung eines infektiösen AAV-Virions ist das Vorliegen
der invertierten terminalen Sequenzwiederholungen auf der verpackten
DNA erforderlich; dies legt nahe, dass das Signal für die Verpackung
in vivo innerhalb der TR-Sequenzen liegt (Samulski et al., J. Virol.
63: 3822–3828,
1989; McLaughin et al., J. Virol. 62: 1963–1973, 1988). Eine Genomgröße, die über 110
% des Wildtyp-AAV hinausgeht, führt
zu einer geringen Effizienz bei der Encapsidation. Die Untersuchung
der Kinetik des AAV-Zusammenbaus in vivo hat gezeigt, dass leere
Capside produziert werden, bevor volle Partikel zu sehen sind (Myers und
Carter, J. Virol. 102: 71–82,
1980). Man hat vermutet, dass Nachkommen-DNA in vorher gebildete
Capside verpackt wird, ohne dass eine gleichzeitige DNA-Replikation stattfindet.
Alternativ schlägt
ein Modell für
die Verpackung von DNA des Aleutenkrankheit-Virus vor, dass die
Encapsidation durch eine Wechselwirkung der Nachkommen-DNA mit leeren
Viruscapsiden initiiert wird, worauf eine Ersatzsynthese und schließlich die
Verpackung der DNA folgen (Willwand und Kaaden, J. Virol. 64: 1598–1605, 1980).
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Die
Verwendung von AAV als viraler Transduktionsvektor wurde erstmals
von Hermonat und Muzyczka gezeigt (Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6466–6470, 1984).
Das AAV-Capsidgen wurde zwischen den Kartenpositionen 52 und 92
deletiert, um den Vektor dI52-91 herzustellen, außerdem wurde
das bakterielle Neomycin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors
eingefügt.
Ein dI52-91/neo-Virusstamm wurde
erhalten, indem das rekombinante Plasmid in menschliche Zellen transfiziert
wurde, die mit Adenovirus infiziert worden waren. Die fehlenden
Capsidproteine wurden durch die Co-Transfektion mit einem Plasmid, welches
Wildtyp-cap-Gene enthielt, geliefert. Durch diese Vorgehensweise
wurden dI51-91/neo-Virusstämme erzeugt,
die bis zu 106 infektiöse Einheiten pro ml enthielten
(Hermonat et al., J. Virol. 51: 329–333, 1984). Die Transduktionshäufigkeit
dieser Stämme
war etwa die gleiche wie die Einbauhäufigkeit bei Wildtypvirus,
nämlich
0,5 % bis 5,0 % (Laughlin et al., J. Virol. 60: 515–524, 1986;
Handa et Ia., Virology 82: 84–92,
1977). Für andere
AAV-Vektoren, welche die AAV-TR-Sequenzen und verschiedene Mengen
von nicht-wiederholten AAV-Sequenzen enthielten, wurde gezeigt,
dass sie zu einer effizienten Transduktion fremder DNA in menschliche
Zellen fähig
sind (McLaughlin et al., J. Virol. 62: 1963–1973, 1988; Samulski et al.,
J. Virol. 61: 3096–3101, 1987;
Samulski et al., J. Virol. 63: 3822–3828, 1989).
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Eine
der Schwierigkeiten bei der Verwendung von rAAV-Transduktionsvektoren bestand in dem schwierigen
Verfahren, das zum Züchten
eines rekombinanten Virusstamms erforderlich ist. Für das Züchten eines
rekombinanten Virusstamms ist das Vorliegen von sowohl AAV- als
auch Helfervirus-Genen
erforderlich, und außerdem
enthält
der rekombinante Virusstamm, der erzeugt wird, häufig sowohl Adenovirus als
auch Wildtyp-AAV-Viruspartikel als Verunreinigungen. Durch die Verwendung
eines infektiösen
Wildtyp-AAV-Plasmids zum Bereitstellen der AAV-Rep- und cap-Genprodukte
in trans werden Stämme
mit inakzeptabel hohen Spiegeln von Wildtyp-AAV-Virus von etwa 10:1
Wildtyp zu Rekombinanten erzeugt (Hermonat und Muzyczka, 1984; McLaughlin
et al., 1988; Tratschin et al., Mol. Cell Biol. 5: 3251–3260, 1985;
Lebkowski et al., Mol. Cell Biol. 8: 3988–3996, 1988; Vincent et al.,
Vaccine 90: 353–359,
1988). Aus Gründen,
die unklar sind, besteht eine starke Neigung zur Amplifikation des
Wildtypvirus. Das gleiche trifft zu, wenn ein rekombinanter Virusstamm
anhand einer Ergänzung
mit dem Wildtyp-AAV-Virus amplifiziert wird.
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Relevante
Literatur
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Verschiedene
Strategien wurden versucht, um den Spiegel von Wildtyp-AAV-Virus in rekombinanten Stämmen zu
reduzieren. Hermonat und Muzyczka (1984) fügten ein 2,5-kb-Fragment von
Lambda-Bakteriophagen-DNA in eine nicht-essentielle Region des Wildtyp-AAV-Plasmids
ein, wodurch ein rekombinantes Genom, ins96λ/M, produziert wurde, das sich
replizieren und in trans alle AAV-Genprodukte liefern konnte, das jedoch
selbst zu groß war,
um verpackt zu werden. Titer von Rekombinanten von 105 bis
106/ml konnten erzielt werden, jedoch waren
die Stämme
mit Wildtypvirus in einem Spiegel von 5 % bis 10 % verunreinigt
(Hermonat und Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6466–6470, 1984;
McLaughlin et al., J. Virol. 62: 1963–1973, 1988). Das verunreinigende
Wildtyp-AAV-Virus
war offensichtlich das Ergebnis einer Rekombination zwischen dem
ergänzenden
Helferplasmid, ins96λ/M,
und den AAV-Vektorsequenzen. Verschiedene Laboratorien haben versucht,
ergänzende
AAV-Plasmide einzusetzen, denen Teile der terminalen Sequenzwiederholungen fehlen
oder die rep-Mutationen enthalten und die deshalb nicht verpackt
werden können
(Tratschin et al., Mol. Cell Biol. 5: 3251–3260, 1985; Lebkowski et al.,
Mol. Cell Biol. 8: 3988–3996,
1988). Auch durch diese Vorgehensweise werden signifikante Spiegel
einer Verunreinigung mit dem Wildtyp erzeugt (1 bis 50 %), dies
beruht vermutlich auf einer homologen Rekombination zwischen überlappenden
Teilen des rAAV und der ergänzenden
Plasmide. Außerdem
sind die Titer der rekombinanten Stämme niedrig (102 bis
103 pro ml).
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Samulski
et al. (1989) konstruierten ein ergänzendes Plasmid (pAAV/Ad),
in welchem keine homologen Sequenzen zwischen dem rekombinanten
AAV-Genom und dem ergänzenden
Helfer-AAV-Plasmid vorlagen. Dieses Plasmid bestand aus den codierenden
Sequenzen von AAV, flankiert von den 5'-terminalen Sequenzwiederholungen von
Adenovirus. Die Adenovirus-Termini machten es offensichtlich möglich, dass
das ergänzende
AAV-Plasmid nach der Transfektion in Adenovirus-infizierte Zellen
eine begrenzte Amplifikation durchlaufen konnte, und zwar durch
den Mechanismus, der normalerweise für die Adenovirus-DNA-Replikation verwendet
wird. Das ergänzende
Plasmid pAAV/Ad erzeugte rekombinante Virustiter von 104 bis
105/ml, wobei keine Verunreinigung mit Wildtyp- AVV nachweisbar war
(Samulski et al., J. Virol. 63: 3822–3828, 1989).
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Vincent
et al. (Vaccine 90:353–359.
1990) isolierten mehrere HeLa-Zelllinien, die eingebaute Kopien des
AAV-Genoms enthielten, denen die terminalen Sequenzwiederholungen
fehlten. Das Fehlen der terminalen Sequenzwiederholungen verhinderte
die Rettung und Verpackung der eingebauten AAV-Sequenzen, wenn die Zellen mit Adenovirus
superinfiziert wurden. Eine der Linien (HA25a) war in der Lage,
rekombinante Stämme
mit Titern von 103 bis 104/ml
zu erzeugen. Die produzierten niedrigen Virustiter beruhten offensichtlich
auf der niedrigen Kopienzahl der Wildtyp-AAV-Gene in den Verpackungszelllinien.
Auch Mendelson et al. (Virology 166: 154–165, 1988) isolierten mehrere
Zelllinien, welche die AAV-Rep-Proteine konstitutiv exprimierten.
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Chejanovsky
und Carter (Virology 171: 239–247,
1989) haben über
die Isolierung einer Amber-Mutante (pNTC3) in dem AAV-Rep-Gen berichtet.
Die Mutation konnte wirksam unterdrückt werden, indem die Mutante
auf einer Affen-Zelllinie
gezüchtet
wurde, die einen induzierbaren menschlichen Serin-tRNA-Amber-Suppressor enthielt.
Die erhaltenen Virustiter betrugen 107 bis
108/ml (etwa 10 % der Wildtyptiter, die
mit den gleichen Affenlinien erhalten wurden), jedoch betrug die
Reversionshäufigkeit
der Amber-Mutation etwa 10–5, wodurch inakzeptable
Spiegel einer Verunreinigung mit Wt-AAV erzeugt wurden.
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In
US 5139941 wird eine fremde
DNA (z.B. Neomycin-Resistenz-Gen) in ein AAV-Vektorplasmid eingefügt, so dass
cap-Gene fehlen, dieses wird sodann in eine mit Adenovirus 2 infizierte
Zelllinie mit einem AAV-Plasmid, welches cap-Gene in trans bereitstellt,
co-transfiziert, und danach wird hieraus ein Virusstamm produziert.
Dieser Virusstamm kann anschließend
für die
Transduktion von Säuger-Zelllinien
verwendet werden.
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Das übliche Verfahren
zum Züchten
von rAAV-Stämmen
ist dasjenige, das von Hermonat und Muzyczka (1984) eingeführt wurde,
modifiziert durch die Verwendung des pAAV/Ad, beschrieben von Samulski
et al. (1989), oder durch die Verwendung eines Helfer-AAV-Plasmids
ohne terminale AAV- oder Adenovirus-Sequenzen. Durch diese Verfahren werden
rAAV-Titer von etwa 106/ml erzeugt, wobei
noch nachweisbare Mengen von Wt-AAV enthalten sein können. Ferner
enthält
das auf diese Weise hergestellte rAAV eine signifikante Adenovirus-Verunreinigung und
außerdem
eine Verunreinigung mit zufälligen
Viren, die in der Wirtszelllinie vorliegen. Alle diese Schwierigkeiten
könnten
durch die Entwicklung eines in vitro-Verpackungssystems für AAV gelöst werden.
Keine in vitro-Verpackungssysteme
für Säuger-DNA-Viren
wurden beschrieben, jedoch haben Molla et al. (Science 254: 1647–1651, 1991)
ein in vitro-Verpackungssystem für
Poliovirus, ein RNA-Virus, beschrieben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Verpackung eines DNA-Substrats in einer in vitro-Reaktion,
um Adeno-assoziierte Virus- (AAV-) Partikel herzustellen, welche
zur Transduktion von Säugerzellen
fähig sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung
eines Verfahrens zur Herstellung zellfreier Extrakte, die nützlich sind
zur in vitro-Verpackung von DNA-Substraten in AAV-Partikel, welche
zur Transduktion fähig
sind. Außerdem
werden in vitro-verpackte AAV-Partikel und Verfahren zu ihrer Verwendung
in der Transduktion von Säugerzellen
bereitgestellt.
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Diese
und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die nachstehend
noch ganz deutlich werden, werden erreicht, indem ein Verfahren
zur Verpackung eines DNA-Substrats
in vitro in ein AAV-Capsid bereitgestellt wird, wodurch ein Viruspartikel
oder ein rekombinantes Viruspartikel produziert wird, welches zur Übertragung
des verpackten DNA-Substrats auf eine Empfänger-Säugerzelle fähig ist, wodurch es zur Expression oder
Funktion der Substrat-DNA oder eines gewissen Teils der Substrat-DNA in der Empfängerzelle
kommt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein wie in den beigefügten Ansprüchen beschriebenes
Verfahren. Insbesondere umfasst das wie in der vorliegenden Beschreibung
beschriebene Verfahren:
- (a) Transfizieren einer
Säugerwirt-Zellkultur,
die für
eine AAV-Replikation permissiv ist, mit einem dAAV-Vektor, der die
AAV-Capsid- und Repgen-codierenden Sequenzen enthält,
- (b) Infizieren der Zellkultur mit einem Helfervirus;
- (c) Herstellen eines Extrakts aus der transfizierten Zellkultur;
- (d) Kombinieren des Extrakts mit einem DNA-Substrat; und
- (e) Inkubieren dieses Extrakts unter Bedingungen, welche die
Verpackung eines DNA-Substrats fördern.
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Des
Weiteren wird beschrieben, dass das wie in der vorliegenden Beschreibung
beschriebene Verfahren zusätzlich
den Schritt des Erhitzens des verpackten Extrakts bei erhöhten Temperaturen
umfasst und gegebenenfalls den Schritt des Extrahierens des verpackten
Extrakts mit Chloroform umfasst.
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Die
Beschreibung beschreibt ferner in vitro-verpackte AAV-Partikel,
die zur Transduktion der Empfänger-Säugerzelle
in der Lage sind. Es wird auch beschrieben, dass das in AAV-Partikel
verpackte DNA-Substrat nicht durch Größen- und Sequenzbeschränkungen eingeschränkt ist,
die für
frühere
rAAV-Vektoren typisch sind, die durch in vivo-Verpackungsverfahren
hergestellt wurden.
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Die
vorliegende Beschreibung beschreibt auch ein Verfahren zur Übertragung von
DNA-Substrat auf eine Empfänger-Säugerzelle
durch Verwendung der in vitro-verpackten
AAV-Partikel und ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung,
die in der Lage ist, das Verpacken von DNA-Substrat in die AAV-Partikel in
vitro durchzuführen.
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Die
folgenden Definitionen werden zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt.
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Helfervirus:
Ein Virus, wie Adenovirus, Herpesvirus, Zytomegalie-Virus, Epstein-Barr-Virus
oder Vaccinia-Virus, das, wenn eine geeignete eukaryotische Zelle
damit infiziert wird, es ermöglicht,
dass eine produktive AAV-Infektion stattfindet.
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Helfer-AAV-DNA:
AAV-DNA-Sequenzen, die zur Bereitstellung von AAV-Funktionen in trans
in einem rekombinanten AAV verwendet werden, dem die Funktionen
fehlen, die für
eine AAV-Replikation und/oder in vivo-Verpackung essentiell sind.
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rAAV:
Rekombinantes AAV; DNA-Molekül,
enthaltend einige AAV-Sequenzen, üblicherweise mindestens die
invertierten terminalen Sequenzwiederholungen oder die Doppel-D-Sequenzen,
die in WO 9413788 beschrieben sind, und eine gewisse fremde (d.h.
Nicht-AAV-) DNA.
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dAAV:
Defektes AAV: für
Zwecke der vorliegenden Anmeldung enthalten dAAVs die Rep- und Capsid-codierenden
Regionen von AAV, ihnen fehlen jedoch intakte invertierte terminate
Sequenzwiederholungen, so dass sie in vivo nicht mehr verpackt werden
können.
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AAV-Partikel:
Infektiöse
Partikel, die durch in vivo- oder in vitro-Verpackung von DNA in
ein AAV-Capsid hergestellt werden, wobei die verpackte DNA entweder
das Wt-AAV-Genom oder ein rAAV sein kann.
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AAV(TRLacZ):
AAV-Partikel, in denen die verpackte DNA TRLacZ terminate AAV-Sequenzwiederholungen
und die LacZ-codierende Sequenz unter der Kontrolle des CMV-Promotors)
enthält.
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Transduktion:
Die Übertragung
eines Gens (von Genen) auf eine Zelle mit Hilfe eines Viruspartikels, so
dass das Gen in der Zelle exprimiert wird.
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Transfektion:
Die Übertragung
einer DNA auf eine Zelle durch ein beliebiges anderes physikalisches oder
chemisches Verfahren.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die
vorliegende Erfindung ist mit Bezug auf die folgende ausführliche
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen noch besser zu
verstehen, wenn diese in Kombination mit den Zeichnungen betrachtet werden,
welche einen Teil der vorliegenden Anmeldung darstellen, worin:
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1:
Diagramme von pTRLacZ, pAB11, Wildtyp-AAV, pIM45 und d163-87/45. Spaltstellen
von bestimmten Restriktionsendonucleasen in pTRLacZ und pAB11 sind
dargestellt. Diese Restriktionsfragmente wurden als Substrate für die in
Tabelle II beschriebenen in vitro-Verpackungsexperimente verwendet.
Das Diagramm zeigt außerdem
die Position der Capsidgen-Deletion in d163-87/45. pTRLacZ und pAB11
(Goodman et al., Blood 84: 1492–1500,
1994) sind rAAV-Plasmide,
welche die LacZ-codierende Sequenz unter der Kontrolle des frühen CMV-Promotors und die
frühen
SV40-Polyadenylierungssignale enthalten (nicht gezeigt). pAB11 unterscheidet
sich von pTRLacZ darin, dass ihm eine PstI-Stelle in der Nähe des Übergangs
der CMV-Sequenz und des LacZ-Gens fehlt und es ein Kernlokalisierungssignal
in der LacZ-codierenden Sequenz enthält. Beide Plasmide enthalten
keine weitere AAV-Sequenz als die 145 bp großen invertierten Wiederholungssequenzen.
d163-87/45 enthält
eine Deletion der Region, dargestellt durch die gepunktete Linie.
Weder pIM45 noch d163-87/45 weisen homologe Sequenzen mit pTRLacZ
oder pAB11 auf. Weder pIM45 noch d163-87/45 enthalten irgendwelche
AAV-TR-Sequenzen.
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2:
Western-Analyse von in vitro-Verpackungs-Zellextrakten. Die Extrakte
wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus 293-Zellen hergestellt,
die mit Adenovirus alleine infiziert waren oder die mit Adenovirus infiziert
und entweder mit d163-87/45- oder
mit pIM45-Plasmid-DNA transfiziert waren. Eine teilweise Entfernung
von Rep-Proteinen
aus pIM45 + Ad-Extrakt wurde erreicht, indem der Extrakt mit dem
gegen Rep78/68 gerichteten monoclonalen Antikörper der Maus, gekoppelt an
Protein-G-Perlen,
inkubiert wurde. 10 μl
von jedem Extrakt wurden einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel
unterworfen, auf eine Nitrocellulose-Membran überführt und unter Verwendung des
monoclonalen anti-Rep-Antikörpers
der Maus, der alle vier Rep-Proteine erkennt, auf Rep-Proteine (linke
Abbildung) oder unter Verwendung des polyclonalen anti-Capsid-Antikörpers des
Meerschweinchens, der alle drei Capsidproteine erkennt (rechte Abbildung),
getestet.
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3:
Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation
von in vitro-verpacktem
pTRLacZ-Virus und von in vivo-verpacktem Wildtyp-AAV. Das in vitro-verpackte pTRLacZ-Virus
und das in vivo-erzeugte Wildtyp-AAV-Virus wurden, wie in Beispiel
3 beschrieben, in parallelen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten
zentrifugiert. pTRLacZ-Virus (gefüllte Kreise) wurde mit dem β-Galactosidase-Färbeverfahren
titriert; Wildtyp-AAV (leere Kreise) wurde durch den Test auf infektiöse Zentren
(„infectious
center assay") titriert.
Beide Viruspräparate
wurden 30 Min. bei 55°C
erhitzt, nicht jedoch mit Chloroform extrahiert.
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4:
Saccharosegradienten-Zentrifugation von in vivo-verpacktem Wt-AAV und
in vitro-verpacktem AAV(TRLacZ). Peakfraktionen aus dem CsCl-Gradienten
wurden in 15 bis 30 % Saccharosegradienten sedimentiert. Das Virus
wurde wie in 3 titriert. pTRLacZ (gefüllte Kreise);
Wt-AAV (leere Kreise); -x- Brechungsindex.
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Beschreibung spezifischer
Ausführungsformen
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Rekombinante
AAV-Vektoren haben mehrere Merkmale, die sie zu attraktiven Kandidaten
für die
Gentherapie beim Menschen machen. Erstens kann die Clonierungskapazität von 5
kb einer Vielfalt von cDNAs Platz bieten. Zweitens ist die Transduktionshäufigkeit
in menschlichen Zellen hoch. Bisher wurde noch für keine menschliche Zelllinie
oder für
kein menschliches Gewebe gezeigt, dass sie/es resistent gegenüber einer AAV-Transduktion
ist. Drittens wurde keine Krankheit mit AAV assoziiert, und zwar
weder in menschlichen noch in tierischen Populationen. Da außerdem rAAV-Vektoren
im Allgemeinen zwei verschiedene Helfer-Virusgenome benötigen, um
sich zu vermehren, ist damit hier eine eigene Beschränkung für die natürliche Ausbreitung
eines AAV-Vektors enthalten. Wenn ferner eine provirale Zelle mit
Adenovirus superinfiziert wird, ist ein Rep–-AAV-Provirus
nicht zur DNA-Replikation
fähig,
wenn nicht außerdem
ein Wildtyp-AAV-Genom bereitgestellt wird (McLaughlin et al., J.
Virol. 62: 1963–1973,
1988). Individuen, die ein AAV-Provirus tragen, können vor
einer Adenovirus-Infektion durch Impfung geschützt werden. Viertens scheinen
AAV-Proviren stabil zu sein. Fünftens
scheinen die terminalen AAV-Sequenzwiederholungen in Abwesenheit
des Rep-Gens transkriptionell neutral zu sein. Somit können AAV-Vektoren
nützlich
sein, wenn es essentiell ist, dass fremde Gene unter der Kontrolle
ihrer eigenen Enhancer- und Promotorelemente gehalten werden. Schließlich gibt
es keine Suberinfektions-Immunität
für AAV-Vektoren. Eine Zelllinie
kann mehrmals mit mehreren unterschiedlichen AAV-Vektoren transduziert werden (Lebkowski
et al., Mol. Cell Biol. 8: 3988–3996,
1988; McLaughlin et al., J. Virol. 62: 1963–1973, 1988).
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Bei
früheren
Verfahren zur Produktion von infektiösen Virusstämmen von rekombinanten AAV-
(rAAV-) Vektoren erfolgte die Verpackung der rAAV-Genome in vivo
während
des Verlaufs einer produktiven Infektion. Für eine produktive Infektion
und in vivo-Verpackung von rAAV ist das Vorliegen eines Helfervirus
wie Adenovirus und außerdem
die Ergänzung
mit essentiellen AAV-Funktionen, die aus dem rAAV-Genom entfernt wurden,
erforderlich. Das Ergebnis ist, dass die in vivo produzierten rAAV-Virusstämme signifikante
Spiegel von Helfervirus und von Wildtyp-AAV (Wt-AAV) enthalten können. Außerdem ist der Titer der in
vivo verpackten rAAV-Partikel typischerweise signifikant niedriger
als der für
Wt-AAV erhaltene Titer. Weiterhin kann es bei in Zellkultur hergestellten
AAV-Vektoren zu einer Verunreinigung mit zufälligen Viren kommen, die möglicherweise
in den Zellen, die für
die Züchtung
des rAAV eingesetzt werden, vorliegen.
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Die
vorliegende Erfindung überwindet
diese Schwierigkeiten, indem sie ein Verfahren zur Verpackung des
rAAV-Genoms in vitro bereitstellt. Mit in vitro ist gemeint, dass
diese in einem anderen als einem intrazellulären Milieu stattfindet. Die
in vitro-Verpackung kann unter Bedingungen durchgeführt werden,
bei denen das rAAV-Genom die einzige DNA ist, die vorliegt, so dass
es zu keiner Verunreinigung des in vitro-verpackten rAAV-Virusstamms
mit Wt-AAV oder mit Helfervirus kommen kann. Außerdem ermöglicht das Verfahren der vorliegenden
Erfindung in einer Ausführungsform
die Produktion von AAV-Partikeln, die zur Transduktion von Substrat-DNA
fähig sind,
die mindestens zweimal größer ist
als das Wt-AAV-Genom, und hierfür
ist nicht das Vorliegen von AAV-TR-Sequenzen auf der Substrat-DNA
erforderlich.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Verpackungskomponenten-Zellextrakt
(„packaging
component cellular extract",
PCCE) aus Wirtszellen hergestellt, die mit einem defekten AAV- (dAAV-) Vektor
transfiziert und mit einem Helfervirus infiziert sind. Der dAAV-Vektor
enthält
die Rep- und Capsidgen-codierenden
Sequenzen von AAV, ihm fehlen jedoch jegliche der invertierten terminalen
Wiederholungssequenzen. In Gegenwart einer Helfervirus-Infektion werden
AAV-Rep- und Capsidproteine produziert, die dAAV-DNA jedoch wird
nicht repliziert oder verpackt. Ein beliebiger von verschiedenen
dAAV-Vektoren kann eingesetzt werden, so lange der gewählte Vektor
in der Lage ist, die AAV-Rep- und
Capsidgene zu exprimieren, und er nicht verpackt werden kann. Solche
dAAV-Vektoren sind
dem Fachmann bekannt und werden hier nicht ausführlicher beschrieben (vgl.
z.B. Samulski et al., 1989). Vorzugsweise ist der dAAV-Vektor pIM45
(McCarty et al., J. Virol. 65: 2936–2945, 1991). Das Helfervirus
kann ein beliebiges von verschiedenen Viren sein, von denen bekannt
ist, dass sie eine produktive virale Infektion von AAV in Säugerzellen
fördern.
Mitglieder entweder der Herpes- oder der Adenovirusfamilien können die
erforderlichen Helfervirusfunktionen bereitstellen. Unter einigen
Bedingungen kann Vaccinia-Virus als ein Helfervirus nützlich sein.
Vorzugsweise ist das Helfervirus ein Adenovirus; am stärksten bevorzugt
ist das Helfervirus Adenovirus 5. Die Wirtszellen, die für die Herstellung von
PCCE nützlich
sind, schließen
beliebige Säugerzellen
ein, die für
die Replikation von AAV permissiv sind, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf HeLa-Zellen oder menschliche 293-Zellen. Besonders geeignet sind
menschlichen Zelllinien, die mit einem Helfervirus infiziert wurden.
Vorzugsweise handelt es sich bei der für die Herstellung des PCCE
verwendeten Zelllinie um menschliche 293-Zellen (Graham et al.,
J. Gen. Virol. 36: 59–72,
1977).
-
Die
Herstellung des PCCE wird durchgeführt, indem die Wirtszelllinie
mit dem dAAV-Vektor transfiziert und mit einem Helfervirus infiziert
wird, wobei Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt
sind. Die Transfektion kann durch das DEAE-Dextran-Verfahren (McCutchen
und Pagano, J. Natl. Cancer Inst. 41: 351–357, 1968), das Calciumphosphat-Verfahren
(Graham et al., J. Virol. 33: 739–748, 1973) oder durch ein beliebiges
anderes Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf Mikroinjektion, Lipofektion und Elektroporation, erfolgen. Die
Transfektion kann unter Verwendung von Helfervirus-infizierten Zellen
erreicht werden, oder sie kann gleichzeitig mit der Virusinfektion
oder vorher durchgeführt werden.
Die Infektion mit dem Helfervirus erfolgt durch herkömmliche
Verfahren. Wenn ein Adenovirus als Helfervirus verwendet wird, kann
eine wünschenswerte
Infektionsmultiplizität
zwischen etwa 5 und 10 liegen. Die bei der Transfektion verwendeten
Mengen des dAAV-Vektors (und/oder anderer Vektoren) betragen etwa
0,2 bis 10 μg
DNA pro 106 Zellen, sie können jedoch
bei unterschiedlichen DNA-Konstrukten und Zelltypen variieren.
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Für die Herstellung
des PCCE werden die Wirtszellen, die bis zu einer Konfluenz von
etwa 60 % gezüchtet
wurden, typischerweise mit etwa 20 μg eines dAAV pro 150-mm-Platte
transfiziert und mit Helfervirus bei einer Infektionsmultiplizität von etwa
5 bis 10 infiziert. Die infizierten/transfizierten Zellen werden
etwa 48 Stunden bis mehrere Tagen nach der Infektion/Transfektion
geerntet und zuerst mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und
dann mit einer kalten hypotonischen Lösung gewaschen. Die gewaschenen
Zellen werden abzentrifugiert, in einer kleinen Menge der hypotonischen
Lösung
resuspendiert und bei 4°C
inkubiert. Die Zellen werden aufgeschlossen, z.B. durch Dounce-Homogenisation,
und die NaCl-Konzentration wird auf 0,2 M erhöht. Nach einer Inkubation bei
4°C wird
die Suspension durch Zentrifugation geklärt und der Überstand gegen einen Aufbewahrungspuffer
dialysiert und sodann bei niedrigen Temperaturen, vorzugsweise bei –80°C, aufbewahrt.
Geeignete Aufbewahrungspuffer für
die Lagerung bei niedriger Temperatur von Makromolekülen sind
dem Fachmann bekannt und enthalten typischerweise ein Kälteschutzmittel,
wie Glycerin, in einer gepufferten Lösung. Vorzugsweise handelt
es sich bei dem Aufbewahrungspuffer um 20 mM TrisCl (pH 7,4), 0,1
mM EDTA, 25 mM NaCl, 10 % Glycerin und 1 mM DTT.
-
Obwohl
PCCE durch die oben beschriebenen Verfahren sehr einfach hergestellt
werden kann, beschreibt die Beschreibung ferner, dass geeigneter
PCCE auf andere Art und Weise hergestellt werden kann, zum Beispiel
durch Zugabe gereinigeter AAV-Rep- und Capsid-Proteine zu einem
Zellextrakt, der von Helferzellen infizierten Zellen oder durch
Verwendung von Wirtszellen hergestellt wurde, die das Rep- und/oder Cap-Protein
konstitutiv exprimieren (siehe zum Beispiel Yang et al., 1994, J.
Virol. 68:4847). Als Alternative beschreibt die Beschreibung, dass
zelluläre
Bestandteile, die für
die im Extrakt vorliegende Verpackung essentiell sind, durch biochemische
Standardverfahren isoliert und mit gereinigten AAV-Rep- und Capsid-Proteinen
rekombiniert werden können,
um einen vollständigen
Verpackungsextrakt bereitzustellen.
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Das
in vitro-Verpackungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird durchgeführt, indem
der PCCE und ein geeignetes DNA-Substrat vereinigt und unter Bedingungen
inkubiert werden, welche die Verpackung fördern. Die Bedingungen zur
Förderung
der Verpackung umfassen geeignete Konzentrationen von MgCl2, Desoxyribonucleotidtriphosphaten, Ribonucleotidtriphosphaten,
einem ATP-regenerierenden
System und Puffer. Gegebenenfalls können die in vitro-verpackten
Viruspartikel nach dem Inkubationsschritt erhitzt werden, um jegliche
Helferviren, die möglicherweise
im PCCE vorliegen, zu inaktivieren. Die Hitzebehandlung inaktiviert
auch jegliche zellulären
Proteine, die möglicherweise
mit den in vitro-verpackten Partikeln unspezifisch assoziiert sind.
In vitro-verpackte AAV-Partikel sind hitzestabil (wie dies auch
bei in vivo hergestellten AAV-Virionen der Fall ist). In einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die hitzebehandelten,
in vitro-verpackten Partikel mit Chloroform extrahiert. In einer
zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Chloroform-Extraktion weggelassen.
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Typischerweise
wird die Inkubation des in vitro-Verpackungsverfahrens der vorliegenden
Erfindung wie folgt durchgeführt.
Ein Aliquot (etwa 0,5 Volumina der endgültigen Reaktionslösung) des
PCCE wird auf etwa 7 mM MgCl2, etwa 30 mM
Hepes-Puffer (pH 7,5), etwa 0,5 mM Dithiothreit oder ähnliches
Reduktionsmittel, etwa 0,1 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP,
etwa 4 mM ATP, etwa 0,2 mM von jeweils CTP, UTP und GTP, etwa 40
mM Kreatinphosphat, etwa 37,5 μg/ml
Kreatinkinase und etwa 0,1 bis 100 μg/ml Substrat-DNA gebracht.
Das Reaktionsgemisch wird etwa vier Stunden bei 37°C inkubiert.
Für den
Fachmann wird es offensichtlich sein, dass eine gewisse Modifikation
dieser Bedingungen zulässig
und geeignet ist und einfach bestimmt werden kann, indem die erhaltene
Ausbeute von infektiösen
Partikeln getestet wird. Nach der Inkubation kann das Reaktionsgemisch
gegebenenfalls erhitzt werden, um außen vorliegendes zelluläres Protein
zu entfernen, das möglicherweise
mit den AAV-Partikeln unspezifisch assoziiert ist, und um restliches
Helfervirus zu inaktivieren. Typischerweise ist ein Erhitzen auf
etwa 55°C
für etwa
30 Minuten ausreichend. Wenn die Produktion von Chloroform-resistenten
Partikeln gewünscht
ist, wird das hitzebehandelte Reaktionsgemisch mehrmals mit Chloroform
extrahiert. Durch Weglassen der Chloroform-Extraktion wird im Allgemeinen ein
Gemisch aus Chloroform-sensitiven und Chloroform-resistenten Partikeln
erhalten, abhängig
von der bestimmten verpackten Substrat-DNA.
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Das
in vitro-Verpackungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist für die Herstellung
von zwei Typen von in vitro-verpackten AAV-Partikeln geeignet, Chloroform-resistenten
Partikeln (CRPs) und Chloroform-sensitiven Partikeln (CSPs). Sowohl
CRPs als auch CSPs der vorliegenden Erfindung sind zur Übertragung
der verpackten Substrat-DNA auf Empfängerzellen fähig. Sie
unterscheiden sich in der strukturellen Erfordernissen der Substrat-DNA
für die
in vitro-Verpackungsreaktion und in der Größe, wie sie durch die Sedimentationgeschwindigkeit
im Saccharosegradienten bestimmt wird. CRPs und CSPs werden in identischer
Weise gemäß dem vorstehend
beschriebenen in vitro-Verpackungsverfahren der vorliegenden Erfindung
hergestellt, mit der Ausnahme, dass für die Herstellung von CSPs
der Schritt der Chloroform-Extraktion weggelassen wird.
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Chloroform-resistente
Partikel sind zu in vivo-verpackten AAV-Partikeln in mehreren Kriterien
identisch, umfassend die Dichte, gemessen durch Cäsiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation,
und die Resistenz gegenüber
einer Behandlung mit Chloroform, Hitze oder DNase I. Für die Herstellung
von CRPs sollte die Substrat-DNA
nicht größer als
etwa 120 % der Größe des Wt-AAV-Genoms
sein. Vorzugsweise liegt die Substrat-DNA zwischen 50 % und 110
% der Größe des Wt-AAV-Genoms; am stärksten bevorzugt
liegt die Substrat-DNA zwischen 80 % und 105 % der Größe des Wt-AAV-Genoms.
Außerdem
enthält
das Substrat für
die Herstellung von CRPs die intakten invertierten terminalen AAV-Wiederholungssequenzen
oder die Doppel-D-Sequenz, wie in WO 9413788 beschrieben. Am besten
ist die Substrat-DNA für
die Herstellung von CRPs entweder eine einzelsträngige oder eine doppelsträngige DNA
in replikativer Form (RF). RF-rAAV zur Verwendung als Substrat für das in
vitro-Verpackungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann durch
Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind (vgl.
z.B. Hermonat et al., 1984; Snyder et al., J. Virol. 64: 6204–6213, 1990;
und Hong et al., J. Virol. 68: 2011–2015, 1994).
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Typischerweise
wird RF-rAAV durch Co-Transfektion von Säuger-Wirtszellen, die für eine AAV-Replikation
permissiv sind, mit der rAAV-Plasmid-DNA und einem Helfervirus wie
Adenovirus hergestellt. Die Transfektion erfolgt durch Verfahren,
die den vorstehend beschriebenen ähnlich sind. Abhängig von
den bestimmten AAV-Sequenzen,
die auf dem rAAV vorliegen, können
beliebige fehlende AAV-Funktionen,
die für
die AAV-Replikations- und Verpackungsfunktionen essentiell sind,
in trans durch Transfektion mit einem AAV-Helferplasmid, welches
die erforderlichen AAV-Gene enthält,
dem jedoch die TR-Sequenzen fehlen, bereitgestellt werden. Vorzugsweise
enthalten das AAV-Helferplasmid und das rAAV keine gemeinsamen Sequenzen,
um die Möglichkeit
einer Rekombination unter Bildung von Wt-AAV-RF zu verringern. Am
stärksten
bevorzugt ist das Helfer-AAV- Plasmid
pIM45 (McCarty, 1991). Auch andere Helfer-AAV-Plasmide können eingesetzt
werden, z.B. pAAV/Ad (Samulski et al., 1989), das die terminalen
Sequenzen von Adenovirus 5 anstelle des AAV-TR enthält, oder
pHIVrep (Antoni et al., J. Virol. 65: 396–404, 1991). Die RF-rAAV-DNA
kann aus den transfizierten Zellen durch Verfahren isoliert werden,
die dem Fachmann bekannt sind, wie ein modifiziertes Hirt-Verfahren (J.
Mol. Biol. 26: 365–369,
1967). DNA, die durch diese Verfahren isoliert wurde, ist im Wesentlichen
frei von anderen zellulären
und viralen Komponenten. Außerdem
kann RF-rAAV chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden (vgl.
Snyder et al., J. Virol. 67: 6096–6104, 1993), oder es kann
aus zirkulären
Plasmiden hergestellt werden, die AAV-TR enthalten und in Bakterien
vermehrt wurden (vgl. Hong et al., 1994).
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Für die Herstellung
von CSPs der vorliegenden Erfindung ist die Substrat-DNA nicht durch
Größe oder durch
das Vorliegen von AAV-TR-Sequenzen eingeschränkt. In vitro-verpackte Substrat-DNAs,
die bis zu zweimal größer sind
als die Größe des Wt-AAV-Genoms,
werden auf Empfänger-Säugerzellen
effizient übertragen und
darin effizient exprimiert. Die Größe der Substrat-DNA für die Herstellung
von CSPs ist nur durch die Fähigkeit
eingeschränkt,
dass große
DNAs ohne Beschädigung
manipuliert werden können.
Die Substrat-DNA für
die Herstellung von CSPs kann zwischen 50 % und 500 % der Größe des Wt-AAV-Genoms
liegen. Vorzugsweise liegt die Substrat-DNA für die Herstellung von CSPs
zwischen 100 % und 200 % der Größe des wtAAV-Genoms.
Die Substrat-DNA für
die Herstellung von CSPs muss keinerlei AAV-Sequenzen enthalten, insbesondere
muss die Substrat-DNA nicht die AAV-TR-Sequenzen enthalten. Jedoch
kann der Einbau von AAV-TR-Sequenzen für eine effiziente Integration
und Rettung der übertragenen
Substrat-DNA nach der Transduktion nützlich sein. Schließlich muss
die Substrat-DNA für
die Produktion von CSPs nicht in Form einer AAV-RF vorliegen. Eine
lineare oder zirkuläre
Plasmid-DNA ist
als Substrat-DNA für
die Herstellung von CSPs geeignet. Geeignete Substrate schließen chemisch
oder enzymatisch synthetisierte DNAs ein.
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Die
Art der bestimmten Substrat-DNA, die für das in vitro-Verpackungsverfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hängt hauptsächlich von den bestimmten Genen
oder anderen DNA-Sequenzen ab, die auf die Empfängerzelle übertragen werden sollen. Die
Substrat-DNA ist nicht auf irgendwelche bestimmte Genen, codierende
Sequenzen, Promotoren oder andere DNA-Sequenzen, die sich von den
vorstehend beschriebenen unterscheiden, beschränkt. Ein beliebiges Gen oder
eine beliebige andere rekombinante DNA, die zur Expression oder
Funktion in dem Säugerempfänger fähig ist,
ist für
den Einbau in die Substrat-DNA geeignet. Es kann wünschenswert
sein, ein Gen mit einem leicht nachweisbaren Produkt (dem Fachmann
bekannt als Marker-, Rekorder- oder Reportergen) als Teil der Substrat-DNA
einzubauen, obwohl die Erfindung nicht auf solche Konstrukte beschränkt ist.
Leicht nachweisbare Reportergene können entweder tumorigene oder
nicht-tumorigene Produkte erzeugen. Tumorigene Reportergene können verwendet
werden, sind jedoch aufgrund ihrer Onkogenität weniger wünschenswert. Nicht-tumorigene
Reportergene würden
einschließen, sind
jedoch nicht beschränkt
auf β-Galactosidase,
Neomycin-Phosphotransferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase,
Thymidinkinase, Luciferase, β-Glucuronidase
und Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, um nur einige wenige
zu nennen. Einige Beispiele von DNAs, die unter Verwendung von in
vivo-verpackten AAV-Partikeln übertragen
wurden, umfassen das bakterielle Neomycin-Phosphotransferase-Gen unter der Kontrolle
des frühen
SV40-Promotors (Hermonat und Muzyczka, 1984); das bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen
unter der Kontrolle des AAV-p40-Promotors (Tratschin et al., Mol.
Cell Biol. 4: 2072–2081, 1984);
menschliche β-Globin-cDNA
(Ohi et al., Gene 89: 279–282,
1990); und menschliches Thyrotropin (Wondisford et al., Mol. Endocrinol.
2: 32–39,
1988). Andere Gene oder codierende Sequenzen, die in Kombination mit
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Cytokine
wie GM-CSF, G-CSF, M-CSF;
Interleukine wie IL-2, IL-3, IL-7, IL-13; Nervenwachstums- und neurotrophe
Faktoren wie NGF, CNTF, BDNF; Tyrosin-Hydrolase, Dopa-Decarboxylase,
Faktor XIII und Faktor IX. Diese und ähnliche DNAs sind für die Übertragung
unter Verwendung von in vitro-verpackten AAV-Partikeln geeignet.
Da außerdem
die CSPs der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Substrat-DNA
hergestellt werden können,
die größer ist,
als dies für in
vivo-verpackte AAV-Partikel möglich
ist, gibt es weniger Beschränkung
hinsichtlich der Größe des Gens
oder einer anderen DNA-Sequenz,
das/die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung übertragen
werden kann.
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Der
Titer der in vitro-verpackten AAV-Partikel kann durch Verfahren
bestimmt werden, die allgemein zur Bestimmung des Virustiters von
rekombinanten AAV für
in vivo-erzeugte Virusstämme
verwendet werden. Das jeweilige gewählte Verfahren hängt von
den bestimmten Genen oder der bestimmten anderen DNA ab, die auf
der Substrat-DNA enthalten sind. Wenn z.B. die Substrat-DNA das β-Galactosidase-Gen
enthält (LacZ),
kann der Titer bestimmt werden, indem die Häufigkeit der Expression des β-Galactosidase-Gens
in den Transduktanten gemessen wird. Alternativ können alle
rAAV-Titer durch den Test auf infektiöse Zentren (McLaughlin et al.,
1988) bestimmt werden. Viruspartikeltiter können durch einen Dot-Blot-Test
oder spektrophotometrisch durch Verfahren bestimmt werden, die dem
Fachmann bekannt sind. Typischerweise stellt das in vitro-Verpackungsverfahren
der vorliegenden Erfindung infektiöse Virustiter von mindestens
105/ml bereit. Die Partikeltiter betragen
entsprechend mindestens 107/ml (das AAV-Infektiositäts-Verhältnis beträgt typischerweise
100:1).
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Die
in vitro-verpackten AAV-Partikeln der vorliegenden Erfindung können für die Transduktion
von Empfänger-Säugerzellen
in identischer Weise wie bei der Transduktion unter Verwendung von
in vivo-verpackten AAV-Partikeln eingesetzt werden. Mit Transduktion
ist die Übertragung
einer Substrat-DNA auf Empfängerzellen
und deren Expression oder Funktion darin gemeint. Solche Transduktionsverfahren
sind dem Fachmann bekannt (vgl. z.B. McLaughlin et al., 1988; Hermonat
und Muzyczka, 1984; Tratschen et al., 1985). Typischerweise können die
Empfänger-Säugerzellen
mit den in vitro-verpackten AAV-Partikeln ohne Helfervirus infiziert werden,
insbesondere enthält
die verpackte Substrat-DNA AAV-TR-Sequenzen,
wodurch es zur Bildung eines Provirus kommt. Dies ist das Verfahren
der Wahl, insbesondere für
die Transduktion von lebenden Organismen, z.B. Tieren. Alternativ
werden die Empfänger-Säugerzellen
mit den in vitro-verpackten
AAV-Partikeln und einem Helfervirus co-infiziert.
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Die
Empfänger-Säugerzelle
kann eine bestimmte Säugerzelle
sein, die für
eine Infektion durch AAV empfänglich
ist, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Mensch, Kaninchen, Affe, Maus, Rind, Hund und Affe. Die Empfänger-Säugerzellen
umfassen primäre
Zellen, etablierte Zelllinien, organisiertes Gewebe und Organismen.
Es wurde gezeigt, dass AAV zur Transduktion von z.B. murinen und
Primaten-Gehirnzellen und murinen, Primaten- und Kaninchen-Lungenzellen
fähig ist.
-
Die
Beispiele erläutern
die Erfindung.
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Beispiele
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Beispiel 1: Herstellung
von Zellextrakten, die AAV-Verpackungskomponenten enthalten (PCCE)
-
Material:
Ribonucleotide, Desoxyribonucleotide, Kreatinphosphat, Kreatinphosphokinase
und Aphidicolin wurden von Sigma oder Pharmacia bezogen. Protein-G-Sepharose
stammte von Pharmacia. Aszitespräparate
der gegen Rep gerichteten monoclonalen Antikörper anti-Rep52/40 und anti-Rep78/68
(Hunter und Samulski, J. Virol. 66: 317–324, 1992) wurden von Rockland
Inc. hergestellt und vor der Verwendung auf Protein-G-Sepharose
gereinigt. Der Western-Nachweis-Kit, ECL, wurde von Amersham geliefert,
und wie vom Hersteller empfohlen, verwendet. Der gegen AAV-Capsidprotein
gerichtete polyclonale Antikörper
des Meerschweinchens wurde von Dr. R. J. Samulski (University of
North Carolina) zur Verfügung
gestellt. Kationische Liposomen wurden, wie beschrieben, hergestellt
und verwendet (Gao, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280–285, 1991).
Restriktionsendonucleasen wurden von New England BioLabs bezogen.
-
293-Zellen
wurden in DMEM-Medium gehalten, das hitzeinaktiviertes Kälberserum
und Antibiotika enthielt (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977).
Nur Zellen, die weniger als 100 Passagen durchlaufen hatten, wurden
verwendet, und sie wurden einen Tag vor der Transfektion oder Infektion
plattiert. Adenovirus 5 (erhalten von ATCC) wurde durch herkömmliche
Methoden zubereitet. Das Plasmid dI63-87/45 wurde durch Spaltung
von pIM29+45, das in pIM45 umbenannt worden war (McCarty et al.,
J. Virol. 65: 2936–2945,
1991), mit ApaI und Religierung des resultierenden größeren Fragments
konstruiert. Das Plasmid pIM45 enthält alle AAV-codierenden Sequenzen, ihm fehlen jedoch
die AAV-terminalen Sequenzwiederholungen. Das Plasmid dI63-87/45
enthält
eine 1103-Base-Deletion (bezogen auf pIM45) innerhalb der Capsid-codierenden
Region, wodurch eine Leserastermutation bewirkt wird (vgl. 1).
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Herstellung
von Zellextrakten: Zehn 150-mm-Platten von 293-Zellen wurden bei
einer Konfluenz von etwa 60 % mit 20 μg Plasmid-DNA pro Platte unter
Verwendung kationischer Liposomen transfiziert (Gao, 1991) und mit
Adenovirus 5 bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 infiziert. Die
Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion geerntet und mit 20
ml kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und danach mit 10
ml kaltem hypotonischem Puffer (20 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM KCl,
1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT) gewaschen. Die Zellsuspension
wurde zentrifugiert und der Zellniederschlag in einem Endvolumen
von 4,8 ml hypotonischem Puffer resuspendiert und sodann zehn Minuten
auf Eis inkubiert. Die Zellsuspension wurde Dounce-Homogenisator
homogenisiert (20 Schläge
mit einem Typ-B-Stöpel),
und 0,2 ml von 5 M NaCl wurden zugegeben, um die NaCl-Konzentration
auf 0,2 M zu erhöhen.
Die Suspension wurde eine Stunde auf Eis inkubiert und der Extrakt
durch Zentrifugation bei 15 000 × g für 20 Minuten geklärt. Nach
der Dialyse gegen einen Puffer, der 20 mM TrisCl (pH 7,4), 0,1 mM
EDTA, 25 mM NaCl, 10 % Glycerin und 1 mM DTT enthielt, wurde der
Extrakt bei –80°C gelagert.
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Der
AAV-Verpackungsextrakt wurde aus Zellen hergestellt, die mit Adenovirus
infiziert und mit pIM45 oder dem Plasmid für die negativen Kontrolle,
dI63-87/45, transfiziert waren. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass
die Mutation in Plasmid dI63-87/45 für die Verpackung vollständig defekt,
für die
AAV-DNA-Replikation jedoch lebensfähig war (Hermonat und Muzyczka,
1984). Schließlich
wurden auch Extrakte von Zellen hergestellt, die nur mit Adenovirus
infiziert worden waren.
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Die
Western-Analyse wurde an Proben der Extrakte durchgeführt. 10 μl von jedem
Zellextrakt wurden einer Elektrophorese auf 8–14 % Polyacrylamid- Gradienten-Gelen
unterworfen. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose-Membranen überführt und
die Rep- und Capsidproteine mit dem gegen Rep gerichteten monoclonalen
Antikörper
anti-Rep52/40 bzw. dem gegen Capsid gerichteten polyclonalen Antikörper des
Meerschweinchens nachgewiesen. Die Western-Blots wurden unter Verwendung
eines ECL-Kits nach den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht.
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Wie
erwartet enthielten die von pIM45 hergeleiteten Extrakte alle AAV-codierten Proteine:
die Nicht-Strukturproteine Rep78, Rep68, Rep52 und Rep40; und die
drei AAV-Capsidproteine VP1, VP2 und VP3 (2). Im Gegensatz
dazu wiesen Extrakte, die aus dI63-87/45-transfizierten Zellen hergestellt
worden waren, keine nachweisbaren Spiegel von AAV-Capsidproteinen
auf, zeigten jedoch normale Spiegel der Rep-Proteine. Die Abwesenheit
von verkürzten
Capsidproteinen in dem dI63-87/45-Extrakt beruhte vermutlich entweder
auf der Instabilität
der Proteine oder auf der Abwesenheit der Epitope, die für die Antikörpererkennung
erforderlich waren. Die Extrakte, die aus den mit Adenovirus alleine
infizierten Zellen hergestellt worden waren, enthielten weder Rep-
noch Capsidproteine.
-
Beispiel 2: Herstellung
von DNA-Substrat für
die Verpackungsreaktion
-
Die
Plasmide pTRLacZ und pAB11 (freundlicherweise von Dr. R. J. Samulski,
University of North Carolina, zur Verfügung gestellt) sind rekombinante
AAV-Vektoren, die
das β-Galactosidase-Gen
(LacZ) von E. coli unter der Kontrolle des sehr frühen Promotors
des Cytomegalie-Virus (CMV) enthalten (1). Die
zwei Plasmide unterscheiden sich nur darin, dass pAB11 eine innere
PstI-Stelle fehlt und dass es ein Kernlokalisierungssignal in der
codierenden Sequenz seines LacZ-Gens enthält.
-
pTRLacZ
enthält
das 3,7 kb große
BamHI/HindIII-Fragment, enthaltend die LacZ-codierende Region von
pCH110 (von Pharmacia), ligiert am HindIII-Ende an das 0,9-kb-BamHI/HindIII-CMV-Promotor-Fragment von
pBS-CMV (von Pharmacia) und cloniert in die BglII-Stelle von pTR.
-
pTR
wurde durch eine schrittweise Ligierung wie folgt konstruiert. Das
160-bp-PstI/BglII-Fragment, enthaltend
die linken AAV-TR von Plasmid dI3-94 (McLaughlin et al., 1988),
wurde mit einem 1270-bp-Ad-2-Fragment Stufferfragment) ligiert.
Das resultierende 1430-bp-Fragment wurde mit einem synthetischen
50-bp-DNA-Fragment
mit BamHI- und BglII-kompatiblen Enden, enthaltend die Sequenz für das frühe SV40-Polyadenylierungssignal,
ligiert. Das resultierende 1480-bp-Fragment wurde an eine weitere
Kopie des 160-bp-PstI/BglII-Fragments, enthaltend die linken AAV-TR,
ligiert. Das resultierende 1640-bp-Fragment wurde mit PstI gespalten,
Gelgereinigt und in die PstI-Stelle von pBR322 ligiert.
-
pTRLacZ
wurde aus zwei Gründen
für die
Verpackungsexerimente ausgewählt.
Erstens konnte es einfach von jedem beliebigen verunreinigenden
Wildtyp-AAV-Virus unterschieden werden. Zweitens stellte es ein einfaches
Verfahren für
die Messung der Wirksamkeit der in vitro-Verpackungsreaktion bereit.
Dies erfolgte, indem die Produkte der in vitro-Reaktion auf Zellen
appliziert wurden und danach die infizierten Zellen auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt wurden.
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Für die Herstellung
von pTRLacZ-DNA in replikativer Form wurden 293-Zellen mit 10 μg pro 100-mm-Platte
von pIM45- und pTRLacZ-DNA (3:1) unter Verwendung kationischer Liposomen
co-transfiziert und mit Adenovirus bei einer MOI von 5 infiziert.
Gerettete und replizierte AAV(TRLacZ)-DNA wurde 48 Stunden später unter
Verwendung des Verfahrens von Hirt extrahiert (J. Mol. Biol. 26:
365–369,
1967). Die Konzentration der AAV(TRLacZ)-DNA wurde durch Vergleich
mit bekannten Mengen der AAV-Plasmid-DNA nach der Elektrophorese
in einem Agarose-Gel und Färbung
mit Ethidiumbromid bestimmt.
-
Beispiel 3: In vitro-Verpackung
von Substrat-DNA
-
Das
vollständige
in vitro-Verpackungsreaktionsgemisch enthielt in 30 μl: 30 mM
Hepes (pH 7,5); 7 mM MgCl2; 0,5 mM DTT,
0,1 mM von jeweils dATP, dGTP, dCTP und dTTP; 4 mM ATP; 0,2 mM von
jeweils CTP, GTP und UTP; 40 mM Kreatinphosphat; 37,5 μg/ml Kreatinphosphokinase;
0,17 μg/ml
pTRLacZ-RF-DNA; und 15 μl
Zellextrakt (PCCE) aus Beispiel 1. Das Reaktionsgemisch wurde vier
Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Produkte der Reaktion wurden sodann 30 Min. bei 55°C inkubiert
und zweimal mit Chloroform extrahiert, sofern nichts anderes angegeben
ist. Zusätzliche
in vitro-Verpackungsreaktionen wurden unter Verwendung anderer DNA-Substrate
anstelle von pTRLacZ-RF durchgeführt
(Tabelle II).
-
Die
Wirksamkeit der in vitro-Verpackungsreaktion wurde durch Infektion
von Zellen mit Aliquoten des verpackten Virus festgestellt. Die
Produkte der Verpackungsreaktion wurden zu 293-Zellen in Platten
mit 96 Vertiefungen mit 5 × 104 Zellen pro Vertiefung zugegeben. Die Zellen
wurden mit Adenovirus 5 co-infiziert, um die transiente Expression
von AAV-Transgenen zu steigern, und die Zellen wurden 48 Stunden
nach der Infektion unter Verwendung von X-Gal, wie beschrieben,
auf β-Galactosidase gefärbt (Dhawan
et al., Science 254: 1509–1512,
1991).
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Der
Titer von Wildtyp-AAV wurde durch den Test auf infektiöse Zentren
bestimmt (McLaughlin et al., 1988). Aliquoten von Virusstämmen wurden
verwendet, um 293-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen bei einer
Dichte von 5 × 104 Zellen pro Vertiefung zu infizieren. Die
Zellen wurden mit Adenovirus 5 bei einer MOI von 5 co-infiziert.
Nach 30 Stunden Inkubation bei 37°C
wurden die Zellen trypsiniert und auf Nylonmembranen mit einer Filtrationsvorrichtung überführt. Die
Membranen wurden drei Minuten auf 3MM-Papier, gesättigt mit einer
Lösung,
enthaltend 0,5 N NaOH und 1,5 M NaCl, befeuchtet. Dieser Schritt
wurde einmal wiederholt, nachdem die Membranen trocken getupft worden
waren. Die Membranen wurden mit 1 M TrisCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl
neutralisiert und fünf
Minuten in einer Mikrowelle erhitzt. Die Membranen wurden mit einer
Wildtyp-AAV-Sonde hybridisiert. Jeder Punkt auf der Membran, der
mit der Sonde hybridisierte, stellte genau eine Zelle dar, die mit
AAV lytisch infiziert war.
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Wenn
die pTRLacZ-DNA mit dem Rohextrakt, der aus mit pIM45 und Adenovirus
transfizierten Zellen erhalten worden war, inkubiert wurde, war
eine signifikante Zahl der mit den Reaktionsprodukten behandelten Zellen
in der Lage, das LacZ-Gen zu exprimieren (Tabelle I). Dies traf
auf Reaktionen nicht zu, die mit Extrakten inkubiert wurden, die
aus mit dI63-87/45 plus Adenovirus transfizierten Zellen oder aus
mit Adenovirus alleine infizierten Zellen hergeleitet worden waren.
Da dem dI63-87/45-Extrakt nur die Capsidproteine fehlten (im Vergleich
zu dem pIM45-Extrakt), wurden die Übertragung und die Expression
der TRLacZ-DNA durch einen gewissen Prozess erleichtert, für den AAV-Capsidproteine
erforderlich waren. Frühere
Arbeiten mit dem pTRLacZ-Vektor hatten nahegelegt, dass der durch
Färbung
auf β-Galactosidase-Aktivität erhaltene
Virustiter etwa 20-mal niedriger war als der Titer von infektiösen Viren,
wie er durch den Test auf infektiöse Zentren bestimmt wurde.
Somit legte die Häufigkeit
der β-Galactosidase-Transduktion,
erhalten aus den Produkten der in vitro-Verpackungsreaktion, nahe,
dass so viele wie 105 infektiöse Viren
pro ml Reaktionsgemisch synthetisiert worden waren. Unter der Annahme
eines Partikel-zu-Infektiositäts-Verhältnisses
von 100:1 würde
dies die Produktion von 107 rekombinanten
AAV-Partikeln pro ml Reaktionsgemisch darstellen.
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Beispiel 4: Bestimmung
der Dichte der in vitro-verpackten AAV(TRLacZ)-Partikel
-
Da
die Dichte des Viruspartikels eine Funktion des Protein- und DNA-Gehalts
des Partikels ist, sagten wir voraus, dass die Dichte der in vitro-verpackten
AAV(TRLacZ)-Partikel nicht vom Wildtyp-AAV-Virus zu unterscheiden
sein sollte. Die Dichte der AAV-Virionpartikel wurde durch ein Verfahren
der Cäsiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation
bestimmt. In vitro-verpacktes AAV(TRLacZ) wurde zu 4 ml Cäsiumchloridlösung mit
einem endgültigen
Brechungsindex von 1,3720 zugegeben. Die Lösung wurde in einem SW50.1-Rotor
bei 40 kUpM für
20 Std. bei 4°C
zentrifugiert. In vivo-verpacktes Wildtyp-AAV wurde in einem parallelen
CsCl-Gradienten
laufen gelassen. 200-μl-Fraktionen
wurden oben vom Gradienten abgenommen und der Brechungsindex jeder
Fraktion wurde bestimmt. Danach wurden die Fraktionen gegen PBS
dialysiert und der Titer von Wildtyp-AAV oder AAV(TRLacZ) wurde
durch den Test auf infektiöse
Zentren bzw. durch Färbung
auf β-Galactosidase-Aktivität bestimmt.
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In
vitro-synthetisierte Partikel wiesen die gleiche Dichte wie authentische
Wildtyp-AAV auf. Das pTRLacZ-Genom besaß annähernd die gleiche Größe wie das
Wildtyp-AAV-Genom (104 % von Wildtyp-AAV). Wie in 3 dargestellt,
erzeugten beide Typen von Partikeln einen einzelnen Aktivitätspeak,
und die Dichte der zwei Typen von Partikeln war praktisch gleich.
Sowohl die Wildtyp- als auch die β-Gal-Partikel hatten einen Peak-Brechungsindex
von 1,3698, dies entsprach einer Dichte von 1,38 g/ml.
-
Beispiel 5: Strukturelle
Erfordernisse für
die in vitro-Verpackung von Substrat-DNA
-
Um
zu bestimmen, ob für
die in vitro-Verpackungsreaktion eine intakte terminate Sequenzwiederholung
erforderlich war, einzelsträngige
und doppelsträngige
RF-Substrate (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) mit Substraten,
die entweder Deletionen innerhalb der terminalen Sequenzwiederholungen
enthielten oder die zusätzliche
Sequenzen angefügt
an jede terminale Sequenzwiederholung aufwiesen (Tabelle II). Die modifizierten
Substrate wurden durch Spaltung von pTRLacZ-Plasmid-DNA oder pAB11-DNA
mit einem von mehreren Restriktionsenzymen erzeugt, welche innerhalb
der terminalen Sequenzwiederholung oder Vektorsequenzen des Plasmids
spalten, jedoch die CMV- und LacZ-Sequenzen intakt ließen (1).
Außerdem
untersuchten wir die Wirkung einer Chloroform-Extraktion auf die
Reaktionsprodukte.
-
Wenn
die Produkte mit Chloroform extrahiert wurden, wurden nur die in
vivo-hergeleiteten
RF-Substrate, die perfekte terminate Sequenzwiederholungen enthielten,
effizient verpackt (Tabelle II, ds und ss RF-DNA). Keine Bevorzugung
war für
einzelsträngige
(ss) RF-AAV(TRLacZ)-DNA zu sehen, obwohl in den AAV-Partikeln einzelsträngige Genome
verpackt werden. Substrate, die Plasmidvektorsequenzen enthielten, die
an den Enden der terminalen Sequenzwiederholungen angefügt waren
(BamHI-Substrat), sogar diejenigen, die nur 23 zusätzliche
Basen angefügt
an jedes Ende des pTRLacZ-Genoms enthielten (PstI-Substrat), wurden
nicht effizient verpackt (Tabelle II und 1). Diese
waren beim Übertragen
des β-Galactosidase-Gens
auf gezüchtete
Zellen etwa 8-mal weniger wirksam. Genauso wurden Substrate, die
46 bp (SmaI-Substrat) oder 121 bp (MscI-Substrat) von den Enden
der terminalen 145-bp-Sequenzwiederholungen deletiert hatten, auch
nur schlecht verpackt.
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Im
Gegensatz dazu verhielten sich diejenigen in vitro-Reaktionsprodukte
anders, die vor dem Testen auf β-Gal-Transferaktivität nicht
mit Chloroform behandelt wurden (Tabelle II). Erstens enthielten
die Produkte etwa die zweifache Menge an Transferaktivität, die bei
dem Chloroform-extrahierten Produkt zu sehen war, dies legt nahe,
dass eine signifikante Menge an β-Gal-Transferaktivität auf Partikel
zurückzuführen war,
die in Chloroform nicht stabil waren. Weiterhin war die zusätzliche β-Gal-Transferaktivität größtenteils
unempfindlich gegenüber
der Größe des DNA-Substrats.
Das mit BamHI gespaltene Plasmidsubstrat hatte etwa die doppelte Größe des Wildtyp-AAV-Genoms,
wurde jedoch noch effizient übertragen.
Erstaunlicherweise war für
die zusätzliche β-Gal-Transferaktivität keine
intakte terminate AAV-Sequenzwiederholung erforderlich; Substrate,
die entweder mit MscI oder mit SmaI gespalten wurden, wurden effizient übertragen.
Schließlich
war das Chloroform-empfindliche β-Gal-Transferprodukt
gegenüber
einer Spaltung mit DNase I empfindlich.
-
Beispiel 6: Bedarf für Rep-Proteine
und bestimmte Cofaktoren
-
Für die in
vitro-AAV-DNA-Replikation ist das Vorliegen von entweder Rep78 oder
Rep68 erforderlich (Im et al., J. Virol. 63: 3095–3104, 1989;
Im et al., Cell 61: 447–457,
1990; Snyder et al., J. Virol. 67: 6090–6104, 1993), und die AAV-DNA-Synthese wird durch
Aphidicolin gehemmt. Um zu bestimmen, ob Rep78 oder Rep68 für die in
vitro-Verpackung erforderlich war, wurden die Rep-Proteine aus dem
Verpackungsextrakt durch Immunfällung
des Extrakts mit einem monoclonalen anti-78/68-Antikörper, konjugiert an Protein-G-Sepharose-Perlen,
entfernt (Harlow und Lane, 1988, in: Antibodies: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratories, S. 522–523). Um Rep-Proteine immunzufällen, wurden
drei Volumina von Zellextrakt zweimal mit einem Volumen von anti-Rep78/68-Protein-G-Perlen
eine Stunde bei 4°C
unter Schütteln
inkubiert. Durch diese Prozedur wurde erfolgreich die Rep78- und 68-Konzentration
um etwa das 10-Fache reduziert, ohne dass die Konzentration von
Capsidprotein im Extrakt signifikant beeinflusst wurde (2).
Auch Rep52 und 40, die durch den anti-Rep78/68-Antikörper nicht
erkannt wurden, wurden teilweise entfernt, möglicherweise aufgrund ihrer Wechselwirkung
mit den größeren Rep-Proteinen. Wenn der
befreite Extrakt auf Verpackungsaktivität getestet wurde, wurde gefunden,
dass seine Aktivität
im Vergleich zu dem vollständigen
Extrakt signifikant reduziert war (etwa vierfach) (Tabelle III).
Die Zugabe von 10 μg/ml
Aphidicolin zu den Reaktionsgemischen, die den vollständigen Extrakt
enthielten, reduzierte die Aktivität um etwa das 9-Fache. Schließlich reduzierte
die Zugabe von Aphidicolin zu dem befreiten Extrakt die Verpackungsaktivität noch weiter,
etwa um das 20-Fache. Außerdem
maßen
wir den Spiegel der DNA-Synthese unter den Bedingungen der reduzierten
Rep-Konzentration und Aphidocolin-Behandlung und fanden, dass der
Spiegel der DNA-Synthese etwa im gleichen Ausmaß reduziert war wie der Spiegel
der in vitro-Verpackung (Werte nicht gezeigt). Diese Ergebnisse
machen deutlich, dass das Vorliegen von einem oder mehreren der
Rep-Proteine und eine aktive DNA-Synthese für die in vitro-AAV-Verpackung
erforderlich waren.
-
Es
wurde gefunden, dass das zweiwertige Kation Mg++ und
ATP für
die Verpackungsaktivität
essentiell sind (Tabelle IV). Dies traf sowohl auf CRP als auch auf
CSP zu. Durch Weglassen des Mg-Ions wurde die Verpackungaktivität vollständig eliminiert,
während
das Weglassen von ATP oder des ATP-regenerierenden Systems, Kreatinphosphat
und Kreatinphosphokinase, die Verpackungsreaktion stark hemmte (etwa
20-fach). Die restliche Aktivität,
die in Abwesenheit von ATP oder des regenerierenden Systems gefunden
wurde, spiegelt möglicherweise
die Tatsache wieder, dass der zellfreie Verpackungsextrakt wesentliche
Mengen an ATP enthielt. Da sowohl Mg als auch ATP für die AAV-DNA-Replikation erforderlich
sind, war der Bedarf für
diese Cofaktoren nicht erstaunlich. Dies erklärt möglicherweise auch die bescheidene
Abnahme in der Aktvität,
die festgestellt wurde, wenn die vier Desoxynucleosidtriphosphate
aus dem Reaktionsgemisch weggelassen wurden (etwa 40 %). Da die
Desoxynucleosidtriphosphate für
die DNA-Replikation essentiell sind, ist es wieder wahrscheinlich,
dass der zellfreie Verpackungsextrakt wesentliche Mengen dieser
Nucleotide enthalten hat. Die Reaktion ist auch teilweise vom Vorliegen
der anderen drei Ribonucleosidtriphosphate, UTP, CTP und GTP, abhängig.
-
Beispiel 7: Saccharosegradienten-Zentrifugation
von Wt-AAV und in vitro-verpacktem AAV(TRLacZ)
-
Ein
linearer Gradient von 15 % bis 30 % (Gew./Gew.) Saccharose wurde
in 10 mM TrisCl (pH 8,8) hergestellt. Peakfraktionen aus dem CsCl-Gradienten
wurden gegen PBS dialysiert, auf 100 μl eingestellt und oben auf die
Saccharosegradienten aufgetragen. Die Gradienten wurden 2,5 Stunden
bei 20°C
bei 110 000 g zentrifugiert. Fraktionen wurden gesammelt, gegen
PBS dialysiert und, wie für
die CsCl-Gradienten beschrieben, auf Wt-AAV oder AAV(LacZ) analysiert.
-
Im
Allgemeinen waren die Sedimentationsprofile der zwei Partikelpräparate ähnlich.
Beide enthielten Typen, die an der Position von reifen 110S-AAV-Partikeln
sedimentierten. Außerdem
enthielten beide Präparate
Material, das entweder mit niedrigeren oder mit höheren Sedimentationskoeffizienten
sedimentierte. Bei den Typen mit höherem Molekulargewicht handelt
es sich wahrscheinlich um Aggregate von mehr als einem AAV-Viruspartikel.
Die Typen mit niedrigerem Molekulargewicht stellen möglicherweise
ein Verpackungszwischenprodukt dar, das demjenigen ähnlich ist,
das von Myers und Carter in vivo identifiziert wurde. Diese Gruppe
berichtete über
ein mögliches
Zwischenprodukt während
der AAV-Verpackung, das etwa die gleiche Dichte wie reife AAV-Viruspartikel
aufwies, das jedoch einen Sedimentationskoeffizienten in Saccharosegradienten von
66S zeigte, im Gegensatz zu 110S für das reife Partikel. Das von
Myers und Carter beschriebene 66S-Partikel schien ein vollständiges AAV-Genom
zu haben und war gegenüber
DNAse I empfindlich.
-
Tabelle I
-
Capsidprotein-abhängige in
vitro-Verpackung von Substrat-DNA
-
pTRLacZ-DNA
in replikativer Form, hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben,
wurde unter Verwendung der nachstehend angegebenen Extrakte verpackt.
Die Reaktionsprodukte wurden mit Chloroform extrahiert und 30 Minuten
bei 55°C
erhitzt. Die Ausbeute an infektiösen
Einheiten pro 30-μl-Reaktion
wurde durch Infektion und Expression des Transgens in 293-Zellen
unter Verwendung der X-Gal-Färbung
bestimmt.
-
-
Tabelle II
-
Substrat-Erfordernisse
für die
in vitro-Verpackung
-
Verschiedene
DNA-Substrate, die im Text und in 1 beschrieben
sind, wurden in vitro in der 30-μl-Standardreaktion
verpackt. Die Produkte wurden entweder vor oder nach der Behandlung
mit Chloroform auf β-Galactosidase-Transduktion
getestet. Die Reaktionsprodukte wurden 30 Minuten bei 55°C erhitzt. Angegeben
ist jeweils die Anzahl von blauen Zellen, die durch die Produkte
jeder 30-μl-Reaktion
erzeugt wurden.
-
-
Tabelle III
-
Abhängigkeit der in vitro-Verpackung
von Rep und DNA-Synthese
-
Das
pTRLacZ-Substrat wurde mit dem angegebenen Extrakt in Gegenwart
oder in Abwesenheit von 10 μg/ml
Aphidicolin inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden hitzebehandelt
und mit Chloroform extrahiert.
-
-
Tabelle IV
-
Cofaktor-Erfordernisse
für die
in vitro-Verpackung
-
AAV-(TRLacZ)-DNA
wurde unter Bedingungen verpackt, bei denen eine oder mehrere Komponenten weggelassen
wurden. Die Reaktionsprodukte wurden 30 Minuten auf 55°C erhitzt
und mit Chloroform extrahiert. Die erhaltenen infektiösen Einheiten
wurden durch Infektion und Expression des Transgens in 293-Zellen bestimmt.
- *
CP ist Kreatinphosphat; CPK ist Kreatinphosphokinase
