JPH11512923A - アデノ関連ウイルスｄｎａのインビトロパッケージング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アデノ関連ウイルス粒子をインビトロパッケージする方法が記載される。その手順は、パッケージングに不可欠な成分を全て含有する無細胞抽出物の調製を含む。パッケージング用の相同な精製基質ＤＮＡは、別個に調製され得る。インビトロパッケージされたＡＡＶ粒子は、哺乳類細胞の形質導入および動物の遺伝子治療に有用である。１つの記載される方法においては、ＡＡＶ粒子内にパッケージされるＤＮＡは、インビトロパッケージされるＡＡＶ粒子のサイズ制限特徴によって制限されない。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノ関連ウイルスＤＮＡのインビトロパッケージング 謝辞 本発明は部分的にNational Institute of General Medical Science（ＲＯｌ ＧＭ３５７２３０２）およびNational Heart，Blood，and Lung Institute（Ｒ Ｏｌ ＨＬ／ＤＫ５０２５７）からの助成金によって支援された。米国政府は、 本発明に関する権利を享受し得る。 序論 技術分野 本発明は、特定の哺乳類形質導入ベクター、ならびにインビトロでカプシド形 成された哺乳類形質導入ベクターの産生および使用方法に関する。背景 アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する(Muzyczka，N. ，Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129 1992)。パルボ ウイルスビリオンは、３つの構造タンパク質と、直線状の１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ ゲノムとによって構成される。粒子は、正１２面体対称性を有し、１８〜２６ｎ ｍの直径を有する。ＡＡＶの５つの血清型が同定されているが、最も広く特徴付 けられているのはＡＡＶ−２である。ＡＡＶ−２の完全なヌクレオチド配列が報 告されているが(Srivastavaら、J．Virol．45:555-564 1983)、これは４６８０ 個の塩基を有する。このＡＡＶゲノムは、１４５個の塩基からなる末端逆方向反 復(terminal inverted repeats)（ＴＲ）を有する。 変異研究によって、ＡＡＶゲノム中少なくとも３つの領域が同定されている。 ｒｅｐ領域は、ＡＡＶ ＤＮＡの複製および／またはレスキューに必要な４つの タンパク質をコードする。Ｒｅｐタンパク質は、４つの重複するポリペプチド、 即ちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０で構成される。ｃａ ｐ領域は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードすると思われ、これらの領域にお ける変異体は、ＤＮＡの複製を行うことができるが、感染性粒子は形成しない。 変異研究によって、ＤＮＡの複製には逆方向末端反復がシスで必要であることが 分かっている。 ＡＡＶの３つのカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、９ ０、７２および６２ｋＤａの分子量を有し、１：１：１０の比率でビリオン中に 存在する。遺伝子研究によって、ＶＰ２およびＶＰ３はそれら自身によって子孫 ＤＮＡをカプシド形成し得ることが分かっている（Hermonattら 1984 J．Virol ．51:329-333; Tratschinら 1984 J．Virol．51:611-619）。しかし、カプシド タンパク質の完全補体を有するものに比べて、ＶＰ１を欠くビリオン粒子は感染 性が低い。ＡＡＶ、Ｂ１９および昆虫細胞中で発現するアリューシャン病ウィル スのものを含むパルボウイルス構造タンパク質は、空のカプシドにアセンブル可 能である(Ruffingら 1992 J．Virol．66:6922-6930，1992; Brownら 1991 J．Vi rol．65:2702-2706; Christensenら 1993 J．Virol．67:229-238)。核の蓄積(nu clear accumulation)およびその後の粒子アセンブリを効率的に行うためにはサ ブユニットが複合体を形成しなければならないことが、ＡＡＶカプシドタンパク 質の細胞下分布に関する結果によって示唆されている（Wistubaら 1995、印刷中 ）。 ＡＡＶは、組込みプロウィルスとして、あるいは溶解性感染によって繁殖され 得る（Atchisonら 1965 Science 149:754-756; Hogganら 1972 Proceedings of the Fourth Lepetite Colloquium，Cocoyac，Mexico，North-Holland，Amsterda m，pp．243-249）。潜伏感染を形成する能力は、ＡＡＶのライフサイクルの一部 であるように思われる。特別な状況下以外において（Yacobsonら 1987 J．Virol ．61:972-981; Schlehoferら 1986 Virology 152:110-117; Yalkinogluら 1988 Cancer Res．48:3123-3125）、ＡＡＶは、生産的ウィルス感染を開始するための ヘルパーウィルスの存在を必要とする。ヘルペス科またはアデノウイルス科のい ずれかのメンバーは、必要なヘルパー機能を提供でき（Atchisonら 1965 Scienc e 149:754-756; Melnick 1965 J．Bacteriol 90:271-274; McPherson 1985 Viro logy 147:217-222）、また、ワクシニアウィルスは少なくとも部分的なヘルパー 機能を提供することができる（Schlehoferら 1986 Virology 152:110-117）。ヘ ルパーウィルスが存在しない場合、ＡＡＶは子孫を全く産生せず、代わりに、宿 主染色体に組み込まれてプロウィルスを形成する（Hogganら 1972; Bernsら 197 5 Virology 68:556-560; Handaら 1977 Virology 82:84-92; Cheungら 1980 J． Virol．33:739-748）。希に例外もあるが、ＡＡＶプロウィルスは安定なようで ある。しかし、ＡＡＶプロウィルスを有する細胞株が、後にヘルパーウィルスに 重複感染した場合、ＡＡＶゲノムは切除されて通常の生産的感染を経る（Hoggan ら 1972; Cheungら 1980 J．Virol．33:739-748）。後にレスキューされ得る潜 伏感染を確立するこの能力は、ヘルパーウィルスが存在しない場合にＡＡＶの生 存を確実にするメカニズムであるように思われる。 感染性ＡＡＶビリオンのインビトロアセンブリには、パッケージされたＤＮＡ 上における逆方向末端反復の存在が必要であり、これは、インビボでのパッケー ジングのシグナルがＴＲ配列内にあることを示唆している（Samulskiら 1989 J ．Virol．63:3822-3828; McLaughlinら 1988 J．Virol．62:1963-1973）。野生 型ＡＡＶの１１０％を越えるゲノムの大きさは、低いカプシド形成効率につなが る。インビボにおけるＡＡＶアセンブリに関する動力学的な研究によって、完全 な粒子が現れる前に空のカプシドが産生されることが明らかになった（Myersお よびCarter 1980 J．Virol．102:71-82）。随伴性のＤＮＡ複製(concomitant DN A replication)が無い場合に、予備形成したカプシド内に子孫ＤＮＡをパッケー ジすることが提案されている。また、アリューシャン病ウィルスＤＮＡのパッケ ージングモデルによれば、カプシド形成は、子孫ＤＮＡと空のウィルスカプシド との相互作用、その後の置換合成、そしてＤＮＡの最終的パッケージングによっ て開始されることが示唆される（WillwandおよびKaaden 1980 J．Virol．64:159 8-1605。 ウイルス形質導入ベクターとしてのＡＡＶの使用は、HermonatおよびMuzyczka （Proc．Natl Acad．Sci．81:6466-6470 1984）によって初めて実証された。マ ップ位置５２と９２との間において、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠失させてベクタ ーｄ１５２−９１を作り、ＳＶ４０制御下における細菌性ネオマイシン耐性遺伝 子を挿入した。アデノウィルスに感染させておいたヒト細胞内に組換えプラスミ ドをトランスフェクトすることによって、ｄ１５２−９１／ネオウィルスストッ クを得た。野生型ｃａｐ遺伝子を有するプラスミドで同時トランスフェクトする ことによって、欠けているカプシドタンパク質を供給した。この方法により、１ ０⁶までの感染単位／ｍｌを有するｄ１５１−９１／ネオウィルスストックを生 成した（Hermonatら 1984 J．Virol.，51:329-333）。これらのストックの形質 導入頻度は、野生型ウィルスの組込み頻度、０．５％〜５．０％とほぼ同じであ った（Laughlinら 1986 J.Virol．60:515-524(1986); Handaら 1977 Virology 8 2:84-92）。ＡＡＶ ＴＲ配列および変化量の非反復ＡＡＶ配列を有する他のＡＡ Ｖベクターは、外来ＤＮＡをヒト細胞内に効率的に形質導入できることが実証さ れている（McLaughlinら 1988 J．Virol．62:1963-1973; Samulskliら 1987 J． Vlrol．61:3096-3101; Samulskiら 1989 J．Virol．63:3822-3828）。 ｒＡＡＶ形質導入ベクターを使用する際の困難点の１つは、組換えウィルスス トックを増殖させるために必要とされる煩雑な手順である。組換えストックの増 殖には、ＡＡＶおよびヘルパーウィルス遺伝子両方が存在する必要があり、産生 される組換えウィルスストックはしばしば、混入物としてアデノウィルスおよび 野生型ＡＡＶウィルス粒子の両方を有する。トランスのＡＡＶ Ｒｅｐおよびｃ ａｐ遺伝子産物を供給するための野生型ＡＡＶ感染性プラスミドを使用すると、 許容不可能に高いレベルの野生型ＡＡＶウィルス、即ち約１０：１の野生型対組 換え体比率を有するストックが産生される（HermonatおよびMuzyczka 1984; McL aughlinら 1988; Tratschinら 1985 Mol．Cell Biol．5:3251:3260; Lebkowski ら 1988 Mol．Cell Blol．8:3988-3996; Vincentら 1988 Vaccine 90:353-359) 。理由は明らかではないが、野生型ウィルスの増幅に対する強い選好性がある。 野生型ＡＡＶウィルスを用いた相補性によって組換えウィルスストックを増幅さ せる場合にも同じことが言える。関連文献 組換えストックにおける野生型ＡＡＶウィルスのレベルを低減するべく、いく つかの方策が試されている。HermonatおよびMuzyczka(1984)は、λバクテリオフ ァージＤＮＡの２．５ｋｂフラグメントを野生型ＡＡＶプラスミドの非必須領域 内に挿入することによって、組換えゲノムｉｎｓ９６λ／Ｍを産生した。これは 、 トランスにおいてＡＡＶ遺伝子産物の全てを複製および供給し得たが、それ自身 が大き過ぎてパッケージできなかった。１０⁵〜１０⁶／ｍｌの組換え力価を得る ことができたが、ストックには５％〜１０％レベルの野生型ウィルスが混入して いた（HermonatおよびMuzyczka 1984 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 91:6466-647 0; McLaughlinら 1988 J．Virol．62:1963-1973）。明らかに、混入野生型ＡＡ Ｖウィルスは、相補ヘルパープラスミドｉｎｓ９６λ／ＭとＡＡＶベクター配列 との間の組換えの結果であった。いくつかの研究所は、末端反復の一部を欠き、 あるいはｒｅｐ変異を含み、それ故に、パッケージ不可能な相補ＡＡＶプラスミ ドの使用を試みている。（Tratschinら 1985 Mol．Cell Biol．5:3251-3260; Le bkowskiら 1988 Mol．Cell Biol．8:3988-3996。この方法によっても、相当なレ ベルの野生型混入（１％〜５０％）が生じるが、これは、おそらく、ｒＡＡＶお よび相補プラスミドの重複部分の相同な組換えに起因する。さらに、この組換え ストックの力価は少ない（１０²〜１０³／ｍｌ）。 Samulskiら(1989)は、組換えＡＡＶゲノムと相補ヘルパーＡＡＶプラスミドと の間に相同配列が無い相補プラスミド（ｐＡＡＶ／Ａｄ）を構築した。このプラ スミドは、アデノウィルス５末端反復を側面に有するＡＡＶコード配列で構成さ れていた。明らかに、これらのアデノウィルス末端は、通常アデノウィルスＤＮ Ａ複製に用いられるメカニズムによって、アデノウィルス感染細胞内へのトラン スフェクションの後に、相補ＡＡＶプラスミドに制限された増幅を受けさせた。 ｐＡＡＶ／Ａｄ相補プラスミドは、１０⁴〜１０⁵／ｍｌの組換えウィルス力価を 生じ、検出可能な野生型ＡＡＶの混入が全く無かった（Samulskiら 1989 J．Vir ol．63:3822-3828）。 Vincentら（Vaccine 90:353-359 1990）は、末端反復を欠くＡＡＶゲノムの組 込みコピーを有するいくつかのＨｅＬａ細胞株を単離した。末端反復が無いこと によって、細胞がアデノウィルスに重複感染した際の、組込みＡＡＶ配列のレス キューおよびパッケージングが防がれた。これらの株の中の１つ（ＨＡ２５ａ） は、１０³〜１０⁴／ｍｌの力価を有する組換えストックを生成することが可能で あった。明らかに、産生されたウィルスの力価が少なかったのは、パッケージン グ細胞株内における野生型ＡＡＶ遺伝子のコピー数が少なかったためであった。 Mendelsonら（Virology 166:154-165 1988）もまた、構成的にＡＡＶ Ｒｅｐタ ンパク質を発現する細胞株をいくつか単離した。 ChejanovskyおよびCarter（Virology 171:239-147 1989）は、ＡＡＶ Ｒｅｐ 遺伝子内におけるアンバー変異体（ｐＮＴＣ３）の単離を報告している。この変 異は、誘導可能ヒトセリンｔＲＮＡアンバーサプレッサーを有するサル細胞株上 でそれを増殖させることによって効率的に抑制することができた。得られたウィ ルス力価は１０⁷〜１０⁸／ｍｌ（同じサルの株で得られる野生型力価の約１０％ ）であったが、アンバー変異の復帰頻度は約１０^-5であり、従って、許容不可能 なレベルのｗｔＡＡＶの混入を生じた。 ｒＡＡＶストックを増殖させる現在の方法は、HermonatおよびMuzyczka(1984) によって考案され、Samulskiら(1989)によって記載されているｐＡＡＶ／Ａｄを 用いて、あるいは、ＡＡＶまたはアデノウィルス末端配列を有しないヘルパーＡ ＡＶプラスミドを用いて改変されたものである。これらの方法は、約１０⁶／ｍ ｌのｒＡＡＶ力価を生成し、そして依然として、検出可能な量のｗｔＡＡＶを含 有し得る。さらに、この方法によって調製されるｒＡＡＶは、顕著なアデノウィ ルス混入、ならびに、宿主細胞株内に存在する外因性ウィルスの混入を含む。こ れらの困難点の全ては、ＡＡＶのインビトロパッケージング系を開発することに よって解決され得る。Mollaら（Science 254:1647-1651，1991）がＲＮＡウィル スであるポリオウィルスのインビトロパッケージング系を報告しているものの、 哺乳類ＤＮＡウィルスのインビトロパッケージング系が記載されていない。 発明の要旨 本発明の目的は、インビトロ反応においてＤＮＡ基質をパッケージして、哺乳 類細胞に形質導入し得るアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）粒子を産生する方法を提 供することである。本発明の別の目的は、形質導入し得るＡＡＶ粒子内にＤＮＡ 基質をインビトロパッケージするのに有用な無細胞抽出物を産生する方法を提供 することである。インビトロパッケージされるＡＡＶ粒子、ならびに哺乳類細胞 の形質導入においてそれを使用する方法も提供される。 以下においてすぐに明らかになるように、本発明の上記および他の目的は、イ ンビトロにおいてＤＮＡ基質をＡＡＶカプシド内にパッケージすることによりパ ッケージされたＤＮＡ基質を受容哺乳類細胞に導入し得るウィルス粒子あるいは 組換えウィルス粒子を産生し、結果的に、受容細胞内で基質ＤＮＡあるいは基質 ＤＮＡの一部を発現あるいは機能させる方法を提供することによって達成される 。具体的には、本発明の方法は、（ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類細胞培養物 を、ＡＡＶカプシドおよびＲｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでト ランスフェクトする工程と、（ｂ）上記細胞培養物をヘルパーウィルスに感染さ せる工程と、（ｃ）上記トランスフェクトされた細胞培養物から抽出物を調製す る工程と、（ｄ）上記抽出物をＤＮＡ基質と合わせる工程と、（ｅ）上記基質Ｄ ＮＡのパッケージングを促進する条件下で上記抽出物をインキュベートする工程 とを包含する。より特定の実施形態において、本発明の方法は、上記パッケージ された抽出物を高い温度で加熱する工程をさらに包含し、そして必要に応じて、 上記パッケージされた抽出物をクロロホルムで抽出する工程を包含する。 他の実施形態において、本発明は、受容哺乳類細胞に形質導入し得るインビト ロパッケージされたＡＡＶ粒子を提供する。このような実施形態の１つにおいて 、ＡＡＶ粒子内にパッケージされた基質ＤＮＡは、インビボパッケージング方法 によって作られる以前のｒＡＡＶベクターの大きさおよび配列という典型的制約 によって制限されない。 本発明はまた、インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子を用いて基質ＤＮＡ を受容哺乳類細胞に移入する方法、ならびに、基質ＤＮＡのＡＡＶ粒子内へのイ ンビトロパッケージングを行い得る組成物を調製する方法を提供する。 本発明をよりよく理解できるように、以下の定義を示す。 ヘルパーウィルス：アデノウィルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイル ス、エプスタイン−バールウイルス、あるいはワクシニアウイルス等の、適切な 真核細胞内に感染したときに生産的ＡＡＶ感染を生じさせるウィルス。 ヘルパーＡＡＶ ＤＮＡ：ＡＡＶ複製および／またはインビトロパッケージン グに不可欠な機能を欠く組換えＡＡＶに対して、トランスでＡＡＶ機能を提供す るために用いられるＡＡＶ ＤＮＡ配列。 ｒＡＡＶ：組換えＡＡＶ；ＡＡＶ配列の一部、通常最低でも逆方向末端反復あ るいはＷＯ９４１３７８８に記載される２重Ｄ配列(double-D sequences)、およ び一部の外来（即ち、非ＡＡＶ）ＤＮＡを有するＤＮＡ分子。 ｄＡＡＶ：欠損ＡＡＶ；本願の目的において、ｄＡＡＶはＡＡＶのＲｅｐおよ びカプシドコード領域を有するが、インタクトな逆方向末端反復を欠いているの で、これらをインビボでパッケージすることはできない。 ＡＡＶ粒子：インビボあるいはインビトロでＤＮＡをＡＡＶカプシド内にパッ ケージすることによって産生される感染性粒子であり、パッケージされたＤＮＡ はｗｔＡＡＶゲノムでもｒＡＡＶでもよい。 ＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）：パッケージされたＤＮＡがＴＲＬａｃＺ（ＣＭＶプ ロモーターの制御下におけるＡＡＶ末端反復およびＬａｃＺコード配列）を有す るＡＡＶ粒子。 形質導入：細胞内で遺伝子が発現されるように、ウィルス粒子を用いた遺伝子 の細胞への移入(transfer)。 トランスフェクション：他のあらゆる物理的あるいは化学的方法を用いたＤＮ Ａの細胞への移入。 図面の簡単な説明 以下に示す具体的な実施形態の詳細な説明を参照し、本出願書類の一部をなす 図面と合わせて考慮することによって、本発明がよりよく理解されるであろう。 図１：ｐＴＲＬａｃＺ、ｐＡＢ１１、野生型ＡＡＶ、ｐＩＭ４５およびｄ１６ ３−８７／４５の図。ｐＴＲＬａｃＺおよびｐＡＢ１１における特定の制限エン ドヌクレアーゼの切断部位を示す。これらの制限フラグメントは、表ＩＩに記載 されるインビトロパッケージング実験で基質として使用される。この図には、ｄ １６３−８７／４５におけるカプシド遺伝子の欠失位置も図示されている。ｐＴ ＲＬａｃＺおよびｐＡＢ１１（Goodmanら、1994 Blood 84:1492-1500）は、ＣＭ Ｖ初期プロモーターおよびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル（図示せず）の 制御下においてＬａｃＺコード配列を有するｒＡＡＶプラスミドである。ｐＡＢ １１は、ＣＭＶ配列とＬａｃＺ遺伝子との接合部近傍のＰｓｔＩ部位を欠いてい る点、ならびにＬａｃＺコード配列内に核局在化シグナルを有する点でｐＴＲＬ ａｃＺとは異なる。両プラスミドともに、１４５ｂｐの逆方向反復配列以上のＡ ＡＶ配列を持っていない。ｄ１６３−８７／４５には、点線で示す領域の欠失が ある。ｐＩＭ４５あるいはｄ１６３−８７／４５のどちらも、ｐＴＲＬａｃＺあ るいはｐＡＢ１１と相同な配列を全く持っていない。ｐＩＭ４５あるいはｄ１６ ３−８７／４５のどちらも、ＡＡＶ ＴＲ配列を全く持っていない。 図２：インビトロパッケージング細胞抽出物のウェスタン分析。アデノウィル スのみに感染させた、あるいはアデノウィルスに感染させ、かつｄ１６３−８７ ／４５またはｐＩＭ４５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした２９３細胞か ら、実施例１に記載されるように抽出物を調製した。ｐＩＭ４５＋Ａｄ抽出物由 来のＲｅｐタンパク質の部分的な枯渇は、タンパク質Ｇ−ビーズ(protein G-bea ds)に結合したマウスモノクローナル抗Ｒｅｐ７８／６８抗体とともに抽出物を インキュベートすることによって達成された。１０μｌの各抽出物を、ポリアク リルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルラー膜に移入し、そして、４つのＲ ｅｐタンパク質を全て認識する抗Ｒｅｐマウスモノクローナル抗体あるいは３つ のカプシドタンパク質を全て認識するモルモットポリクローナル抗カプシド抗体 （右パネル）を用いて、Ｒｅｐタンパク質（左パネル）についてプローブした。 図３：インビトロでパッケージされたｐＴＲＬａｃＺウィルスおよびインビボ でパッケージされた野生型ＡＡＶの塩化セシウム密度勾配遠心分離。インビトロ でパッケージされたｐＴＲＬａｃＺウィルスおよびインビボで産生された野生型 ＡＡＶウィルスを、実施例３に記載の平行塩化セシウム密度勾配で遠心分離した 。ｐＴＲＬａｃＺ（黒丸）ウィルスは、β−ガラクトシダーゼ染色法によって力 価測定し、野生型ＡＡＶ（白丸）は、感染性センターアッセイ(infectious cent er assay)によって力価測定した。両ウィルス調製物とも、５５℃で３０分間加 熱したが、クロロホルムでの抽出は行わなかった。 図４：インビボでパッケージされたｗｔＡＡＶおよびインビトロでパッケージ されたＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）のショ糖勾配遠心分離。ＣｓＣｌ勾配からのピー ク画分を、１５〜３０％のショ糖勾配で沈澱させた。このウィルスを、図３のよ うに力価測定した。ｐＴＲＬａｃＺ（黒丸）、ｗｔＡＡＶ（白丸）、−Ｘ−屈折 率。 具体的な実施形態の説明 組換えＡＡＶベクターには、それをヒト遺伝子治療の有力な候補にする特徴が いくつかある。第１に、５ｋｂのクローニング容量により、様々なｃＤＮＡに対 応することができる。第２に、ヒト細胞内における形質導入の頻度は高い。これ までのところ、ＡＡＶ形質導入に対して耐性を示したヒトの細胞株あるいは組織 はない。第３に、ヒトあるいは動物集団のいずれにおいても、ＡＡＶに関連する 疾患はない。さらに、一般に、ｒＡＡＶベクターは、増殖するためには、２つの 異なるヘルパーウィルスゲノムを必要とするので、ＡＡＶベクターの自然伝染(n atural spread)には固有の限界がある。さらに、プロウィルス細胞がアデノウィ ルスに重複感染した場合、野生型ＡＡＶゲノムも供給されない限り、Ｒｅｐ^-Ａ ＡＶプロウィルスがＤＮＡの複製を行うことができない（McLaughlinら 1988 J ．Virol．62:1963-1973(1988)）。ワクチン接種によって、ＡＡＶプロウィルス を持つ固体をアデノウィルス感染から守ることができる。第４に、ＡＡＶプロウ ィルスは安定なようである。第５に、Ｒｅｐ遺伝子が存在しない場合、ＡＡＶ末 端反復は転写的に中立なようである。従って、外来遺伝子をそれら自身のエンハ ンサーおよびプロモーターエレメントの制御下において有することが不可欠であ る場合、ＡＡＶベクターは有用であり得る。最後に、ＡＡＶベクターに関する重 複感染免疫性は存在しない。細胞株は、いくつかの異なるＡＡＶベクターを用い て、複数回形質導入され得る（Lebkowskiら 1988 Mol．Cell Biol．8:3988-3996 ; McLaughlinら 1988 J.Virol．62:1963-1973）。 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの感染性ウィルスストックの産生を行う以 前の方法では、生産的感染の途中に、インビボでのｒＡＡＶゲノムのパッケージ ングを採用していた。ｒＡＡＶの生産的感染およびインビボパッケージングには 、アデノウィルスのようなヘルパーウィルス、ならびにｒＡＡＶゲノムから欠失 した必須ＡＡＶ機能を用いた相補性が必要である。結果的に、インビボで産生さ れたｒＡＡＶウィルスストックは、相当なレベルのヘルパーウィルスおよび野生 型（Ｗｔ）ＡＡＶを有し得る。さらに、インビボでパッケージされたｒＡＡＶ粒 子の力価は、典型的に、ｗｔＡＡＶについて得られるものよりも大幅に少ない。 また、細胞培養物内で調製されたＡＡＶベクターは全て、外来性のウィルスの混 入 を受け易く、この外来性のウィルスは、ｒＡＡＶを増殖させるために使用される 細胞内に存在し得る。 本発明は、インビトロにおけるｒＡＡＶゲノムのパッケージング方法を提供す ることによりこれらの困難点を克服する。インビトロとは、細胞内環境以外で起 こることを意味する。ｒＡＡＶゲノムが存在する唯一のＤＮＡであり、それ故に 、インビトロでパッケージされたｒＡＡＶウィルスストックへのｗｔＡＡＶある いはヘルパーウィルスの混入が排除される条件下において、インビトロでのパッ ケージングを行うことができる。さらに、実施形態の１つにおいて、本発明の方 法は、ｗｔＡＡＶゲノムよりも少なくとも２倍大きく且つ基質ＤＮＡ上のＡＡＶ ＴＲ配列の存在を必要としない、基質ＤＮＡの形質導入可能なＡＡＶ粒子の産生 を可能にする。 本発明の方法においては、欠損ＡＡＶ（ｄＡＡＶ）ベクターでトランスフェク トし、ヘルパーウィルスに感染させた宿主細胞からパッケージング成分細胞抽出 物（ＰＣＣＥ）を調製する。ｄＡＡＶベクターは、ＡＡＶからのＲｅｐおよびカ プシド遺伝子コード配列を有するが、逆方向末端反復配列を全く欠いている。ヘ ルパーウィルスの感染が有る場合、ＡＡＶ Ｒｅｐおよびカプシドタンパク質が 産生されるが、ｄＡＡＶ ＤＮＡは複製あるいはパッケージされない。選択され たベクターがＡＡＶ Ｒｅｐおよびカプシド遺伝子を発現させることができ且つ パッケージされ得ない限り、数あるｄＡＡＶベクターのどれを用いてもよい。こ のようなｄＡＡＶベクターは、当該技術分野において周知であり、ここではこれ 以上詳細には説明しない（例えば、Samulskiら 1989を参照）。好ましくは、ｄ ＡＡＶベクターはｐＩＭ４５である（McCartyら J．Virol．65:2936-2945 1991 ）。ヘルパーウィルスは、哺乳類細胞においてＡＡＶの生産的ウィルス感染を促 進することが知られている数あるウィルスのいずれであってもよい。ヘルペス科 あるいはアデノウィルス科のいずれかのメンバーでも、必要なヘルパーウィルス 機能を提供することができる。いくつかの条件下では、ワクチニアウィルスがヘ ルパーウィルスとして有用であり得る。好ましくは、ヘルパーウィルスはアデノ ウィルスであり、最も好ましくは、ヘルパーウィルスはアデノウィルス５である 。ＰＣＣＥの調製に有用な宿主細胞には、ＡＡＶ複製を許容するあらゆる哺乳 類細胞が含まれ、これには、ＨｅＬａ細胞あるいはヒト２９３細胞が含まれるが 、これらに限定されるものではない。特に有用なのは、ヘルパーウィルスに感染 させたヒト細胞株である。好ましくは、このＰＣＣＥの調製に使用される細胞株 は、ヒト２９３細胞である（Grahamら、1977 J．Gen．Virol．36:59-72）。 ＰＣＣＥの調製は、当該技術分野において周知の手順によって、宿主細胞株を 、ｄＡＡＶベクターでトランスフェクトし、そして、ヘルパーウィルスに感染さ せることによって行われる。トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン 法（McCutchenおよびPagano，1968，J．Natl．Cancer Inst．41:351-357）、リ ン酸カルシウム法（Grahamら 1973，J．Virol．33:739-748）、または、これら に限定はされないがマイクロインジェクション、リポフェクション、およびエレ クトロポレーションを含む、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る 。トランスフェクションは、ヘルパーウィルス感染細胞を用いて行うことができ 、または、ウィルス感染と同時にあるいはその前に行うことができる。ヘルパー ウィルスの感染は、従来の方法によって行われる。アデノウィルスをヘルパーウ ィルスとして用いる場合、望ましい感染多重度は５から１０の間であり得る。ト ランスフェクションに使用されるｄＡＡＶベクター（および／または他のベクタ ー）の量は、細胞１０⁶個あたりＤＮＡ約０．２〜１０μｇであるが、異なるＤ ＮＡ構築物および細胞型によって変動し得る。 典型的に、ＰＣＣＥの調製を行う際には、約６０％のコンフルーエンシーに増 殖させた宿主細胞を、１５０ｍｍプレートあたり約２０ｕｇのｄＡＡＶでトラン スフェクトし、そして、約５から１０の感染多重度でヘルパーウィルスに感染さ せる。感染／トランスフェクト後の細胞を、感染／トランスフェクションから約 ４８時間〜数日後に収集し、これを先ず冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、その後、 冷低張液で洗浄する。洗浄された細胞を、遠心分離によって収集し、少量の低張 液中で再懸濁し、そして、４℃でインキュベートする。これらの細胞を、例えば 静かな(dounce)ホモゲナイゼーションによって破裂し、ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍ にまで高める。４℃でのインキュベーションの後、遠心分離によって懸濁液を清 澄にし、上清を保存緩衝液に透析し、そして、低温、好ましくは−８０℃で保存 する。巨大分子の低温保存に適した保存緩衝液は、当該技術分野においては周知 であり、典型的には、グリセロールのような凍結防止剤を緩衝液中に含有する。 好ましくは、保存緩衝液は２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ のＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロールおよび１ｍＭのＤＴＴ である。 ＰＣＣＥは、上記の方法によって最も簡便に調製されるが、例えば、ヘルパー ウィルスに感染した細胞から調製した細胞抽出物に精製ＡＡＶ Ｒｅｐおよびカ プシドタンパク質を添加するか、あるいは、Ｒｅｐおよび／またはcａｐタンパ ク質を構成的に発現する宿主細胞を用いる等の他の方法によって適切なＰＣＣＥ が調製され得ることは明らかである。（例えば、Yangら 1994 J．Virol．68:484 7）。あるいは、抽出物中に存在するパッケージングに必須な細胞成分を、標準 的な生化学的な技法によって単離し、これを精製されたＡＡＶ Ｒｅｐおよびカ プシドタンパク質と再結合させて完全なパッケージング抽出物を提供することが 可能である。 本発明のインビトロパッケージ方法は、ＰＣＣＥと適切なＤＮＡ基質を合わせ 、そしてパッケージングを促進する条件下でインキュベートすることによって行 われる。パッケージングを促進する条件には、適切な濃度のＭｇＣｌ₂、デオキ シリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰを再生する系 および緩衝液が含まれる。必要に応じて、インキュベーション工程の後で、ＰＣ ＣＥ内に存在し得るヘルパーウィルスを全て不活性化するために、インビトロで パッケージされたウィルス粒子を加熱し得る。熱処理によって、インビトロでパ ッケージされた粒子に非特異的に結合し得る細胞タンパク質も全て不活性化され る。（インビボで産生されたＡＡＶビリオンと同様に）インビトロでパッケージ されたＡＡＶ粒子は熱に安定である。本発明の方法の１つの実施形態においては 、熱処理したインビトロパッケージ粒子をクロロホルムで抽出する。本発明の第 ２の実施形態においては、このクロロホルム抽出を省略する。 典型的に、本発明のインビトロパッケージングのインキュベーションは以下の ように行われる。約７ｍＭのＭｇＣｌ₂と、約３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７ ．５）と、約０．５ｍＭのジチオスレイトールあるいは類似の還元剤と、それぞ れ約０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰと、約４ｍＭの Ａ ＴＰと、それぞれ約０．２ｍＭのＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰと、約４０ｍＭの クレアチンリン酸と、約３７．５ｕｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼと、約０．１ 〜１００ｕｇ／ｍｌの基質ＤＮＡとでＰＣＣＥのアリコート（最終反応溶液の約 ０．５容量）を調製する。反応物を３７℃で４時間インキュベートする。これら の条件の改変例のいくつかが許容的且つ適切であり、また、それを、得られた感 染性粒子の歩留まりをアッセイすることによって容易に決定することができるこ とは、当業者には明らかである。ＡＡＶ粒子に非特異的に結合し得る外来性の細 胞タンパク質を全て除去するために、そして、残留ヘルパーウィルスを全て不活 性化するために、インキュベーションの後で反応産物を任意に加熱し得る。典型 的に、約５５℃、約３０分間の加熱で十分である。クロロホルム耐性粒子の産生 が望まれる場合、熱処理反応物をクロロホルムで数回抽出する。クロロホルム抽 出を省略した場合は概して、パッケージされた特定の基質ＤＮＡに依存して、ク ロロホルム感受性粒子とクロロホルム耐性粒子の混合物が産生される。 本発明のインビトロパッケージング法は、２種類のインビトロでパッケージさ れたＡＡＶ粒子、即ち、クロロホルム耐性粒子（ＣＲＰ）およびクロロホルム感 受性粒子（ＣＳＰ）を産生するのに有用である。本発明のＣＲＰおよびＣＳＰは 共に、パッケージされた基質ＤＮＡを受容細胞に移入することができる。これら は、インビトロパッケージング反応における基質ＤＮＡの構造的な要件、および ショ糖勾配沈澱速度によって決定される大きさにおいて互いに異なる。ＣＲＰお よびＣＳＰは、ＣＳＰを調製する場合にクロロホルム抽出工程が省略される以外 は、上記本発明のインビトロパッケージング法に従って同一の方法で調製される 。 塩化セシウム勾配遠心分離によって測定される密度、ならびにクロロホルム、 熱あるいはＤＮａｓｅＩを用いた処理に対する耐性を含むいくつかの基準におい て、クロロホルム耐性粒子はインビボでパッケージされたＡＡＶ粒子と同じであ る。ＣＲＰを産生する場合、基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶのゲノムサイズの約１２ ０％よりも大きくなってはならない。好ましくは、基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲ ノムの大きさの５０％〜１１０％の間であり、最も好ましくは、基質ＤＮＡは、 ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの８０％〜１０５％の間である。さらに、ＣＲＰ産生 用の基質は、インタクトなＡＡＶ逆方向末端反復配列あるいはＷＯ９４１３７８ ８に記載される２重Ｄ配列を有する。最適には、ＣＲＰ産生用の基質ＤＮＡは、 １本鎖または２本鎖のいずれかの複製型（ＲＦ）ＤＮＡである。本発明のインビ トロパッケージング法の基質として使用されるＲＦ−ｒＡＡＶは、当該技術分野 において周知の技術を用いて産生することができる（例えば、Hermonatら 1984; Snyderら 1990 J．Virol．64:6204-6213; およびHongら 1994 J．Virol．68:20 11-2015を参照）。典型的に、ＲＦ−ｒＡＡＶは、ＡＡＶ複製を許容する哺乳類 宿主細胞を、ｒＡＡＶプラスミドＤＮＡおよびアデノウィルスのようなヘルパー ウィルスで同時トランスフェクトすることによって調製される。トランスフェク ションは、上記と同様の手順によって行われる。ｒＡＡＶ上に存在する特定のＡ ＡＶ配列に応じて、要求性のＡＡＶ遺伝子を有するがＴＲ配列を欠いているＡＡ Ｖヘルパープラスミドを用いてトランスフェクトすることによって、ＡＡＶ複製 およびパッケージング機能に不可欠な欠けているＡＡＶ機能をトランスで提供す ることができる。好ましくは、ｗｔＡＡＶ ＲＦを形成する組換えの可能性を低 くするために、上記ＡＡＶヘルパープラスミドおよびｒＡＡＶは、共通の配列を 持たない。最も好ましくは、上記ヘルパーＡＡＶプラスミドは、ｐＩＭ４５であ る（McCarty 1991）。他のヘルパーＡＡＶプラスミド、例えば、ＡＡＶ ＴＲあ るいはｐＨＩＶｒｅｐ（Antoniら 1991 J．Virol．65:396-404）の代わりにアデ ノウィルス５末端配列を有するｐＡＡＶ／Ａｄ（Samulskiら 1989）もまた適切 である。ＲＦ−ｒＡＡＶ ＤＮＡは、改変型Ｈｉｒｔ手順（J．Mol．Biol．26:36 5-369 1967）のような、当該技術分野において周知の手順によって、トランスフ ェクトした細胞から単離することができる。これらの手順によって単離されたＤ ＮＡには、他の細胞成分およびウィルス成分を実質的に含有しない。ＲＦ−ｒＡ ＡＶは、化学的にあるいは酵素学的に合成することもでき（Snyderら 1993 J．V irol．67:6096-6104を参照）、あるいは、ＡＡＶ ＴＲを有し且つ細菌内で増殖 した(progated)円形プラスミドから作ることもできる（Hongら 1994を参照）。 本発明のＣＳＰの産生において、基質ＤＮＡは、大きさによって、あるいはＡ ＡＶ ＴＲ配列の有無によって制限されない。ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの最大 ２倍までのインビトロパッケージ基質ＤＮＡは、効率的に、受容哺乳類細胞に移 入されその中で発現する。ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡの大きさは、大型のＤＮＡ を破損することなく操作する能力によってのみ限定される。ＣＳＰ産生用の基質 ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの５０％〜５００％の間であり得る。好ま しくは、ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡは、ｗｔＡＡＶゲノムの大きさの１００％〜 ２００％の間である。ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡはいかなるＡＡＶ配列を含む必 要もない。具体的には、この基質ＤＮＡはＡＡＶ ＴＲ配列を含む必要はない。 しかし、ＡＡＶ ＴＲ配列を含めることは、形質導入後の移入された基質ＤＮＡ の効率的な組込みおよびレスキューに有用であり得る。最後に、ＣＳＰ産生用の 基質ＤＮＡはＡＡＶ ＲＦの形をとる必要はない。直線状あるいは円形のプラス ミドＤＮＡは、ＣＳＰ産生用の基質ＤＮＡとして適している。適切な基質には、 化学的にあるいは酵素学的に合成されたＤＮＡが含まれる。 本発明のインビトロパッケージング法に使用される特定の基質ＤＮＡの性質は 、受容細胞に移入しようとする特定の遺伝子あるいは他のＤＮＡ配列に主に依存 する。基質ＤＮＡは、特定の遺伝子、コード配列、プロモーター、あるいは、上 記以外のＤＮＡ配列のいずれにも限定されない。哺乳類受容体内で発現あるいは 機能することができるあらゆる遺伝子あるいは他の組換えＤＮＡが、基質ＤＮＡ に適切に含まれ得る。（当該技術分野において、マーカー、レコーダー、あるい はレポーター遺伝子として知られている）容易に検出可能な産物を有する遺伝子 を、基質ＤＮＡの一部として取り込むことが望ましい場合もあるが、本発明はこ のような構築物に限定されない。容易に検出可能なレポーター遺伝子は、腫瘍化 あるいは非腫瘍化産物を産生し得る。腫瘍化レポーター遺伝子は、使用可能では あるが、その発癌性のためにあまり望ましくない。非腫瘍化レポーター遺伝子は 、そのほんの一部を挙げると、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスホロト ランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジ ンキナーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびキサンチングアニ ンホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定はされない。イン ビボでパッケージされたＡＡＶ粒子を用いて移入されたＤＮＡの例の一部には、 ＳＶ４０初期プロモーターの制御下における細菌性ネオマイシンホスホロトラン スフエラーゼ遺伝子（HermonatおよびMuzyczka 1984）、ＡＡＶｐ４０プロモー ターの制御下における細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ 遺伝 子（Tratschinら 1984 Mol．Cell Biol．4:2072-2081）、ヒトβ−グロビンｃ− ＤＮＡ（Ohiら 1990 Gene 89:279-282）、およびヒト甲状腺剌激ホルモン（Wond isfordら 1988，Mol．Endocrinol．2:32-39）が含まれる。本発明の方法との組 合わせにおいて有用な他の遺伝子あるいはコード配列は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ ＳＦ、Ｍ−ＣＳＦのようなサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ −１３のようなインターロイキン、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦのような神経成 長因子および神経栄養因子、チロシンヒドロラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、 因子ＸＩＩＩおよび因子ＩＸである。上記および類似のＤＮＡが、インビトロで パッケージされたＡＡＶ粒子を用いた移入に適している。さらに、インビボでパ ッケージされたＡＡＶ粒子の場合に可能な大きさよりも大きい基質ＤＮＡを用い て本発明のＣＳＰを調製することができるので、本発明の方法によって移入され 得る遺伝子あるいは他のＤＮＡ配列の大きさについての制限は比較的少ない。 インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子の力価は、インビボで生成されたウ ィルスストックの組換えＡＡＶウィルス力価を決定する際に一般に用いられる方 法によって決定され得る。選択される特定の方法は、その基質ＤＮＡが持つ特定 の遺伝子あるいは他のＤＮＡに依存する。例えば、基質ＤＮＡがβ−ガラクトシ ダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を持つ場合、上記力価は、形質導入体中のβ−ガラク トシダーゼ遺伝子の発現の頻度を測定することによって推定され得る。あるいは 、ｒＡＡＶ力価は全て感染性センターアッセイによって決定され得る（McLaughl inら 1988）。ウィルス粒子力価は、ドットブロットアッセイによって、あるい は当該技術分野において周知の方法を用いて分光光度的に決定され得る。典型的 には、本発明のインビトロパッケージング法は、少なくとも１０⁵／ｍｌの感染 性ウィルス力価を提供する。これに対応して、粒子力価は少なくとも１０⁷／ｍ ｌである（ＡＡＶ感染性比は典型的に１００：１である）。 本発明のインビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子は、インビボでパッケージ されたＡＡＶ粒子を用いた形質導入のために用いられる方法と同じ方法で受容哺 乳類細胞の形質導入に用いられ得る。形質導入とは、基質ＤＮＡの受容細胞への 移入、およびその中における発現あるいは機能を意図したものである。このよう な形質導入手順は当該技術分野において周知である（例えば、McLaughlinら 198 8; HermonatおよびMuzyczka 1984; Tratschinら 1985を参照）。典型的に、受容 哺乳類細胞を、ヘルパーウィルス無しで、インビトロでパッケージされたＡＡＶ 粒子に感染させ得、特に、パッケージされた基質ＤＮＡはＡＡＶ ＴＲ配列を有 し、この結果、プロウィルスが形成される。これは、特に、例えば動物などの生 活体の形質導入の場合に、選択されるべき方法である。あるいは、上記受容哺乳 類細胞を、インビトロでパッケージされたＡＡＶ粒子およびヘルパーウィルスに 同時感染させる。 上記受容哺乳類細胞は、ＡＡＶによる感染を受けやすいいかなる特定の哺乳類 細胞でもあり得、ヒト、ウサギ、サル、マウス、ウシ、イヌ、およびサルを含む がこれらに限定はされない。受容哺乳類細胞は、１次細胞、確立された細胞株、 器官性組織(organized tissue)および生体を含む。ＡＡＶは、例えば、マウスお よび霊長類の脳細胞ならびにマウス、霊長類およびウサギの肺細胞を形質導入で きることが分かっている。 上記工程の具体的な例を、以下の実施例に示す。しかし、多数の改変例が可能 であること、ならびに、これらの実施例が説明の便宜上示されているに過ぎず、 そのように明記される場合を除いては本発明を限定するものではないことが当業 者には明らかである。 実施例 実施例１：ＡＡＶパッケージング成分（ＰＣＣＥ）を含む細胞抽出物の調製 材料：リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、クレアチンリン酸、ク レアチンリン酸キナーゼ、およびアフィジコリンをSigmaあるいはPharmaciaから 購入した。タンパク質Ｇ−セファロースはPharmaciaから入手した。抗Ｒｅｐモ ノクローナル抗体、抗ｒｅｐ５２／４０および抗ｒｅｐ７８／６８の腹水調製物 （HunterおよびSamulski 1992，J．Virol．66:317-324）は、Rockland Incによ って調製され、そして使用前にはタンパク質Ｇセファロース上で精製された。ウ ェスタン検出キットＥＣＬをAmershamから購入し、製造業者の指示に従って使用 した。モルモット抗ＡＡＶカプシドタンパク質ポリクローナル抗体は、Dr．R.J ．Samulski（University or North Carolina）によって提供された。カチオン性 リポソームを、記載（Gao 1991 Biochem．Biophys．Res．Comm．179:280-285） に従って調製および使用した。制限エンドヌクレアーゼは、New England BioLab sから購入した。 熱不活性化子ウシ血清および抗生物質を含むＤＭＥＭ培地中に２９３細胞を維 持した（Grahamら 1977 J．Gen．Virol．36:59-72）。１００継代未満を経た細 胞のみを使用し、そしてトランスフェクションあるいは感染の１日前にこれらの 細胞をプレートした。（ＡＴＣＣから得た）アデノウィルス５を従来の方法によ って調製した。ｐＩＭ４５に改名されたｐＩＭ２９＋４５（McCartyら 1991 J． Virol．65:2936-2945）をＡｐａＩを用いて消化し、得られたより大きなフラグ メントを再連結することによって、プラスミドｄ１６３−８７／４５を構築した 。プラスミドｐＩＭ４５は、ＡＡＶコード配列を全て有するが、ＡＡＶ末端反復 を欠いている。プラスミドｄ１６３−８７／４５は、（ｐＩＭ４５に対して）１ １０３塩基の欠失をカプシドコード領域内に有し、これがフレームシフト変異を 引き起こす（図１参照）。 細胞抽出物の調製：コンフルーエンシー約６０％の２９３細胞からなる１５０ ｍｍのプレート１０枚を、カチオン性リポソームを用いてプレート毎に２０ｕｇ のプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし（Gao 1991）、そして感染多重度（Ｍ ＯＩ）５でアデノウィルス５に感染させた。これらの細胞を、感染から４８時間 後に収集し、２０ｍｌの冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、１０ ｍｌの冷低張緩衝液（２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＫＣｌ、１． ５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ）で洗浄した。細胞懸濁液を遠心分離し、 細胞ペレットを、最終容量４．８ｍｌの低張緩衝液中で再懸濁し、氷上で１０分 間インキュベートした。細胞懸濁液を静かにホモゲナイズし（タイプＢの内筒で ２０ストローク）、そして、５ＭのＮａＣｌを０．２ｍｌ加えて、ＮａＣｌ濃度 を０．２Ｍにまで高めた。懸濁液を氷上で１時間インキュベートし、そして、１ ５，０００×ｇの遠心分離を２０分間行うことによって抽出物を清澄にした。２ ０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａ Ｃｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液に対して透析を 行った後、抽出物を−８０℃で保存した。 ＡＡＶパッケージング抽出物は、アデノウィルスに感染させ、かつｐＩＭ４５ あるいは陰性コントロールプラスミドｄ１６３−８７／４５でトランスフェクト した細胞から調製した。これまでの研究により、プラスミドｄ１６３−８７／４ ５中での変異は、パッケージングには完全に欠損であるが、ＡＡＶ ＤＮＡ複製 には実行可能であることが実証されている（HermonatおよびMuzyczka 1984）。 最後に、アデノウィルスのみに感染させた細胞からも抽出物が作られた。 上記抽出物のサンプルに対してウェスタン分析を行った。それぞれ１０マイク ロリットルの細胞抽出物を、８〜１４％のポリアクリルアミド勾配ゲル上で電気 泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移入し、Ｒｅｐおよびカプシドタ ンパク質を、それぞれ、抗Ｒｅｐモノクローナル抗体、抗ｒｅｐ５２／４０およ びモルモット抗カプシドポリクローナル抗体を用いて検出した。製造業者のプロ トコルに従ってＥＣＬキットを使用して、１０個のウェスタンブロットを可視化 した。 予想通り、ｐＩＭ４５由来の抽出物は、全てのＡＡＶコードタンパク質、即ち 非構造的タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、と３つ のＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３とを有していた（図２ ）。対照的に、ｄ１６３−８７／４５に感染した細胞から調製した抽出物は、検 出可能なレベルのＡＡＶカプシドタンパク質を有していなかったが、通常レベル のＲｅｐタンパク質を有していた。ｄ１６３−８７／４５抽出物中に切形カプシ ドタンパク質が存在しなかったことは、おそらく、タンパク質の不安定性もしく は抗体認識に必要なエピトープが存在しなかったことのいずれかに起因するもの であった。アデノウィルスのみに感染した細胞から調製した抽出物は、Ｒｅｐタ ンパク質もカプシドタンパク質も有していなかった。 実施例２：パッケージング反応用ＤＮＡ基質の調製 （好意により、Dr．R.J．Samulski，University of North Carolinaによって 提供された）プラスミドｐＴＲＬａｃＺおよびｐＡＢ１１は、サイトメガロウイ ルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーターの制御下においてE.coli β−ガラクトシ ダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を有する組換えＡＡＶベクターである（図１）。この ２つのプラスミドは、ｐＡＢ１１が内的Ｐｓｔ１部位(internal Pstl site)を欠 き、そのＬａｃＺ遺伝子のコード配列内に核局在化シグナルを有する点において のみ互いに異なる。 ｐＴＲＬａｃＺは、ＨｉｎｄＩＩＩ末端においてｐＢＳ−ＣＭＶ（Pharmacia より入手）由来の０．９ＫＢのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＣＭＶプロモータ ーフラグメントに連結され、かつ、ｐＴＲのＢｇｌＩＩ部位にクローニングされ る、ｐＣＨ１１０（Pharmaciaより入手）由来のＬａｃＺコード領域を有する、 ３．７ＫＢのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含む。 ｐＴＲは、以下のような段階的な連結によって構築した。プラスミドｄ１３− ９４（McLaughlinら 1988）由来の左ＡＡＶＴＲを持つ１６０ｂｐのＰＳｔＩ／ ＢｇｌＩＩフラグメントを１２７０ｂｐＡｄ２フラグメント（スタッファーフラ グメント）に連結させた。得られた１４３０ｂｐのフラグメントを、ＳＶ４０初 期ポリアデニル化シグナルの配列を有する５０ｂｐの合成ＤＮＡフラグメントに 、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ適合性末端で連結させた。得られた１４８０ｂｐ のフラグメントを、左ＡＡＶ ＴＲを有する１６０ｂｐのＰｓｔＩ／ＢｇｌＩＩ フラグメントの別のコピーに連結させた。得られた１６４０ｂｐのフラグメント をＰｓｔＩで消化し、ゲル精製し、そして、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に連結 させた。 ２つの理由から、パッケージング実験用にｐＴＲＬａｃＺを選択した。第１に 、あらゆる混入野生型ＡＡＶウィルスから容易に区別可能である。第２に、イン ビトロパッケージング反応の効率を測定する容易な方法を提供した。これは、イ ンビトロ反応の産物を細胞に付与し、その後、感染した細胞をβ−ガラクトシダ ーゼ活性に対して染色することによって行われた。 ｐＴＲＬａｃＺ複製型ＤＮＡの調製のために、２９３細胞を、カチオン性リポ ソームを用いて、１００ｍｍのプレート毎に１０ｕｇのｐＩＭ４５およびｐＴＲ ＬａｃＺ ＤＮＡ（３：１）で同時トランスフェクトし、そして、５ＭＯＩでア デノウィルスに感染させた。レスキューされ複製されたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ） ＤＮＡを、Ｈｉｒｔ（J．Mol．Biol．26:365-369 1967）の方法を用いて、４８ 時間後に抽出した。アガロースゲル中での電気泳動および臭化エチジウムを用い た染色の後で、ＡＡＶプラスミドＤＮＡの既知量と比較することによって、ＡＡ Ｖ（ＴＲｌａｃＺ）ＤＮＡの濃度を決定した。 実施例３：基質ＤＮＡのインビトロパッケージング 完全なインビトロパッケージング反応物は３０ｕｌ中に、３０ｍＭのヘペス（ ｐＨ７．５）と、７ｍＭのＭｇＣｌ₂と、０．５ｍＭのＤＴＴと、それぞれ０． １ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰと、４ｍＭのＡＴＰと、 それぞれ０．２ｍＭのＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰと、４０ｍＭのクレアチンリ ン酸と、３７．５ｕｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼと、０．１７ｕｇ／ｍ ｌのｐＴＲＬａｃＺ ＲＦ ＤＮＡと、実施例１の１５ｕｌの細胞抽出物（ＰＣＣ Ｅ）とを有していた。反応物を、３７℃で４時間インキュベートした。反応産物 を次に、５５℃で３０分間インキュベートし、そして、他に指示されない限りに おいて、クロロホルムで２回抽出した。ｐＴＲＬａｃＺ ＲＦの代わりに他のＤ ＮＡ基質を用いて、さらなるインビトロパッケージング反応を行った（表ＩＩ） 。 インビトロパッケージング反応の効率を、パッケージされたウィルスのアリコ ートで細胞を感染させることによって評価した。パッケージング反応の産物を、 ウェル当たり５×１０⁴個の細胞を有する９６ウェルプレートの２９３細胞に加 えた。この細胞をアデノウィルス５に同時感染させて、ＡＡＶ導入遺伝子の一過 性発現を高め、そして、感染から４８時間後に、記載されているように（Dhawan ら 1991 Science 254:1509-1512）、Ｘ−ｇａｌを用いて、細胞をβ−ガラクト シダーゼに対して染色した。 野生型ＡＡＶの力価を、感染性センターアッセイによって決定した（McLaughl inら 1988）。ウィルスストックのアリコートを用いて、ウェルあたり細胞５× １０⁴個の密度の９６ウェルプレートの２９３細胞を感染させた。これらの細胞 を、アデノウィルス５を用いてＭＯＩ５で同時感染させた。３７℃での３０時間 のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理し、濾過デバイスを有する ナイロン膜上に移した。０．５ＮのＮａＯＨおよび１．５ＭのＮａＣｌを含有す る溶液で飽和させた３ＭＭペーパー上で、膜を３分間湿らせた。膜がブロットさ れて乾燥した後に、この工程をもう一度繰り返した。膜を、１ＭのＴｒｉｓＣｌ （ｐＨ７．５）、１．５ＭのＮａＣｌで中性化し、そして、マイクロ波中で５分 間加熱した。膜を、野生型ＡＡＶプローブでハイブリダイズした。プローブにハ イブリダイズする膜上のスポットのそれぞれが、ＡＡＶによって溶菌的に感染し た細胞１個を表していた。 ｐＴＲＬａｃＺ ＤＮＡをｐＩＭ４５およびアデノウィルスでトランスフェク トした細胞から得た粗抽出物と共にインキュベートすると、反応産物で処理され た細胞の相当数がＬａｃＺ遺伝子を発現できた（表Ｉ）。このことは、ｄ１６３ −８７／４５とアデノウィルスとでトランスフェクトした細胞、あるいは、アデ ノウィルスのみに感染させた細胞由来の抽出物とともにインキュベートした反応 産物については言えなかった。ｄ１６３−８７／４５抽出物は（ｐＩＭ４５抽出 物と比較して）カプシドタンパク質のみを欠いていたので、ＴＲＬａｃＺ ＤＮ Ａの移入および発現を、ＡＡＶカプシドタンパク質を必要とするなんらかのプロ セスによって促進した。ｐＴＲＬａｃＺベクターの以前の研究によって、β−ガ ラクトシダーゼ活性に対して染色することによって得たウィルス力価が、感染性 センターアッセイによって決定した感染性ウィルスの力価の約２０分の１の少な さであることが示唆されていた。従って、インビトロパッケージング反応の産物 から得たβ−ガラクトシダーゼ形質導入の頻度は、反応混合液１ｍｌ当たり、１ ０⁵個もの感染性ウィルスが合成されていたことを示唆した。粒子対感染性の比 を１００：１と仮定すると、これは、反応物１ｍｌ当たり１０⁷個のＡＡＶ組換 え粒子の産生を表す。 実施例４：インビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）粒子の密度の 決定 ウィルス粒子の密度は、その粒子のタンパク質およびＤＮＡ含有量の関数であ るので、我々は、インビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）粒子の 密度は野生型ＡＡＶウィルスと区別不可能であると予測した。ＡＡＶビリオン粒 子の密度を塩化セシウム勾配遠心分離法によって決定した。インビトロでパッケ ージされたＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）を４ｍｌの塩化セシウム溶液に加え、最終的 な屈折率を１．３７２０とした。この溶液をＳＷ５０．１ローター中、４０ｋｒ ｐｍで、２０時間、４℃で遠心分離した。インビボでパッケージされた野生型Ａ ＡＶを平行ＣｓＣｌ勾配で行った。勾配の一番上から２００マイクロリットルの 画分を取り出して、各画分の屈折率を決定した。その後、画分をＰＢＳに対して 透析し、野生型ＡＡＶ、あるいはＡＡＶ（ＴＲｌａｃＺ）の力価を、それぞれ、 感染性センターアッセイによって、あるいはβ−ガラクトシダーゼ活性に対して 染色することによって決定した。 インビトロで合成した粒子は、本物の野生型ＡＡＶと同じ密度を有していた。 ｐＴＲＬａｃＺゲノムは、野生型ＡＡＶゲノムに近い大きさ（野生型ＡＡＶの１ ０４％）であった。図３に示されるように、両方の種類の粒子はともに単一の活 性ピークを生じ、この２種類の粒子の密度は事実上同じであった。野生型および βｇａｌ粒子はともに、１．３８ｇ／ｍｌの密度と等価な１．３６９８のピーク 屈折率を有していた。 実施例５：インビトロパッケージング基質ＤＮＡの構造的要件 インビトロパッケージング反応がインタクトな末端反復を必要としたかどうか を決定するために、末端反復中に欠失を含むかあるいは各末端反復に付いた付加 的な配列を有する基質とともに、（実施例２に記載したように調製した）１本鎖 および２本鎖ＲＦ基質を用いた（表ＩＩ）。プラスミドの末端反復あるいはベク ター配列内で切断されたがＣＭＶおよびＬａｃＺ配列をインタクトに残したいく つかの制限酵素の中の１つを用いて、ｐＴＲＬａｃＺプラスミドＤＮＡあるいは ｐＡＢ１１ＤＮＡを消化することによって、上記改変基質を生成した（図１）。 さらに、我々は、反応の産物についてクロロホルム抽出の影響を調べた。 産物をクロロホルム抽出すると、完全な末端反復を有するインビボ由来のＲＦ 基質のみが効率的にパッケージされた（表ＩＩ、ｄｓおよびｓｓＲＦ ＤＮＡ） 。１本鎖ゲノムはＡＡＶ粒子内にパッケージされるにもかかわらず、１本鎖（ｓ ｓ）ＲＦ ＡＡＶ（ＴＲＬａｃＺ）ＤＮＡに対する選好性は見られなかった。末 端反復の端部に付いたプラスミドベクター配列を有する基質（ＢａｍＨＩ基質） は、２３個だけの付加的な塩基がｐＴＲＬａｃＺゲノムの各端部に付いたもの（ ｐｓｔＩ基質）でさえも、効率的にパッケージされなかった（表ＩＩおよび図 １）。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を培養細胞に移入する効率が約８分の１の低 さであった。同様に、１４５ｂｐの末端反復の末端から欠失した４６ｂｐを有す る基質（ＳｍａＩ基質）あるいは１２１ｂｐを有する基質（ＭｓｃＩ基質）も、 パッケージされにくかった。 これとは対照的に、β−ｇａｌ移入活性について試験する前にクロロホルムで 処理をしなかったインビトロ反応産物は異なる挙動を見せた（表ＩＩ）。先ず、 この産物は、クロロホルム抽出産物について見られたものの約２倍の移入活性量 を有していたが、このことは、β−ｇａｌ移入活性の相当量がクロロホルム中で 安定ではない粒子に起因したことを示唆する。さらに、付加的なβ−ｇａｌ移入 活性は、大部分が、ＤＮＡ基質の大きさに不感受性であった。ＢａｍＨＩを用い て消化したプラスミド基質は、野生型ＡＡＶゲノムの大きさの約２倍であったが 、それでも効率的に移入された。驚いたことに、付加的なβ−ｇａｌ移入活性は 、インタクトなＡＡＶ末端反復配列を必要とせず、ＭｓｃＩあるいはＳｍａＩに よって消化された基質は効率的に移入された。最後に、クロロホルム感受性β− ｇａｌ移入産物はＤＮａｓｅＩによる消化に対して感受性を有していた。 実施例６：Ｒｅｐタンパク質および特定の補因子の要件 インビトロでのＡＡＶ ＤＮＡ複製には、Ｒｅｐ７８あるいはＲｅｐ６８の存 在が必要であり（Imら 1989 J．Virol．63:3095-3104; Imら 1990 Cell 61:447- 457; Snyderら 1993 J．Virol．67:6090-6104）、ＡＡＶ ＤＮＡ合成はアフィジ コリンによって阻害される。Ｒｅｐ７８あるいはＲｅｐ６８がインビトロパッケ ージングに必要であるかどうかを決定するために、タンパク質−Ｇセファロース ビーズに結合した抗７８／６８モノクローナル抗体を用いた抽出物の免疫沈降に よって、パッケージング抽出物からＲｅｐタンパク質を枯渇させた（Harlowおよ びLane 1988，in Antibodies: a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labo ratories，pp．522-523）。Ｒｅｐタンパク質を免疫沈降させるために、３容量 の細胞抽出物を、１容量の抗Ｒｅｐ７８／６８−タンパク質Ｇビーズとともに、 ４℃で１時間揺らしながら２回インキュベートした。この手順は、抽出物中のカ プシドタンパク質の濃度に重大な影響を及ぼすことなく、Ｒｅｐ７８および６８ 濃度を約１０分の１に低減させることに成功した（図２）。抗Ｒｅｐ７８／６８ 抗体によって認識されなかったＲｅｐ５２および−４０もまた、おそらくより大 きなＲｅｐタンパク質との相互作用によって部分的に枯渇した。枯渇した抽出物 をパッケージング活性について試験したところ、その活性が、完全な抽出物に比 べて大幅に（約４分の１）低減していたことがわかった（表ＩＩＩ）。１０ｕｇ ／ｍｌのアフィジコリンを完全な抽出物を有する反応産物に加えることによって 、活性が約９分の１に低減した。最後に、枯渇した抽出物にアフィジコリンを加 えることによって、パッケージング活性がさらに、約２０分の１に低減した。我 々はまた、低減したＲｅｐ濃度およびアフィジコリン処理の条件下においてＤＮ Ａ合成のレベルを測定し、そしてＤＮＡ合成のレベルが、インビトロパッケージ ングのレベルとほぼ同程度に低減したことを見出した（データは示していない） 。これらの結果によって、１つ以上のＲｅｐタンパク質の存在および活性ＤＮＡ 合成がインビトロのＡＡＶパッケージングに必要であったことが示される。 二価カチオンＭｇ⁺⁺およびＡＴＰは、パッケージング活性に不可欠であること が分かった(表IV)。このことはＣＲＰあるいはＣＳＰのどちらについても言えた 。Ｍｇイオンの省略によりパッケージング活性が完全に除去され、一方、ＡＴＰ あるいはＡＴＰ再生系、クレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼの省 略によりパッケージング反応が激しく阻害された（約２０分の１）。ＡＴＰある いは上記再生系がない場合に見られる残留活性は、おそらく、無細胞パッケージ ング抽出物が相当な量のＡＴＰを有していた事実を反映している。ＡＡＶ ＤＮ Ａ複製にはＭｇおよびＡＴＰの両方が必要であるので、これらの補因子に対する 必要は意外なことではない。このことはまた、おそらく、４つのデオキシヌクレ オシド三リン酸を反応物から省略したときに見られた活性の穏やかな減少（約４ ０％）を説明する。やはり、デオキシヌクレオシド三リン酸はＤＮＡ複製に不可 欠であるが、無細胞パッケージング抽出物は、これらのヌクレオチドを相当量有 していたようである。この反応は、部分的に、他の３つのリボヌクレオシド三リ ン酸、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰの有無にも依存する。 実施例７：ｗｔＡＡＶおよびインビトロでパッケージされたＡＡＶ（ＴＲＬａｃ Ｚ）のショ糖勾配遠心分離 １５％〜３０％（ｗｔ／ｗｔ）のショ糖の直線状勾配を、１０ｍＭのＴｒｉｓ Ｃｌ（ｐＨ８．８）中で調製した。ＣｓＣｌ勾配からのピーク画分を、ＰＢＳに 対して透析し、１００ｕｌに調整し、そしてショ糖勾配の上にのせた。この勾配 を２．５時間、２０℃、１１０，０００ｇで遠心分離した。画分を収集し、ＰＢ Ｓに対して透析し、そして、ＣｓＣｌ勾配について記載したように、ｗｔＡＡＶ あるいはＡＡＶ（ＬａｃＺ）について分析した。 概ね、２つの粒子調製物の沈澱プロファイルは類似していた。両者とも、成熟 １１０Ｓ ＡＡＶ粒子の位置において沈澱した種を有していた。さらに、両調製 物ともに、比較的低いあるいは比較的高い沈澱係数で沈澱した材料を有していた 。分子量が比較的大きい種は、１つよりも多いＡＡＶウィルス粒子からなる集合 体であると思われる。分子量が比較的小さい種は、MyersおよびCarterによって インビボで同定されたものに類似のパッケージング中間体であり得る。本グルー プはＡＡＶパッケージング中の潜在的な中間体を報告しており、これは、成熟Ａ ＡＶウィルス粒子と密度はほぼ同じであるが、そのショ糖勾配における沈澱係数 は、成熟粒子の１１０Ｓに対して６６Ｓである。MyersおよびCarterによって報 告された６６Ｓ粒子は、完全なＡＡＶゲノムを有するようであり、そしてＤＮａ ｓｅＩに対して感受性を有していた。 ＊ＣＰはクレアチンリン酸、ＣＰＫはクレアチンホスホキナーゼ。 本明細書において言及されている刊行物および特許出願の全ては、各刊行物ま たは特許出願が具体的且つ個別に参考として援用されているのと同程度に、参考 として本明細書に援用される。 これで本発明を完全に記載したが、添付の請求の範囲の主旨あるいは範囲から逸 脱することなく本発明に対して多数の変更および改変を行うことが可能であるこ とは当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ムジッカ，ニコラス アメリカ合衆国 フロリダ 32608，ガイ ネスビル，サウスウエスト 67ティーエイ チ ドライブ 9837 (72)発明者 ゾロツキン，サーゲイ アメリカ合衆国 フロリダ 32608−2580, ガイネスビル，サウスウエスト 34ティー エイチ ストリート ナンバー59 3611 (72)発明者 ニ，テイファ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02148，マルデン，ケネディ ドライブ 252，アパートメント 212

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．受容哺乳類細胞に形質導入し得るＡＡＶ粒子内にＤＮＡ基質をインビトロパ ッケージする方法であって、 （ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、ＡＡＶカプシドおよび Ｒｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工程と 、 （ｂ）該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 （ｃ）該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 （ｄ）該抽出物を該ＤＮＡ基質と合わせる工程と、 （ｅ）該ＤＮＡ基質のパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 を包含する方法。 ２．前記インキュベーション工程の後に、前記ヘルパーウィルスを不活性化する のに十分な温度で十分な時間前記抽出物を加熱する工程をさらに包含する、請求 項１に記載の方法。 ３．前記加熱工程の後に、前記抽出物をクロロホルムで抽出する工程をさらに包 含する、請求項２に記載の方法。 ４．前記ＤＮＡ基質がＡＡＶ末端反復配列を有する、請求項１に記載の方法。 ５．前記ＤＮＡ基質が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、Ｉ Ｌ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、チロシンヒドロ ラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、因子ＸＩＩＩおよび因子ＩＸからなる群より 選択される１つ以上の遺伝子またはコード配列を含む、請求項１に記載の方法。 ６．前記ｄＡＡＶベクターがｐＩＭ４５である、請求項１に記載の方法。 ７．前記ヘルパーウィルスがアデノウィルスである、請求項１に記載の方法。 ８．前記ヘルパーウィルスがアデノウィルス５である、請求項７に記載の方法。 ９．前記哺乳類宿主細胞培養物がヒト細胞培養物である、請求項１に記載の方法 。 １０．前記哺乳類宿主細胞培養物がヒト２９３細胞である、請求項９に記載の方 法。 １１．前記パッケージングを促進する条件が、 約７ｍＭのＭｇＣｌ₂と、それぞれ約０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ ＴＰおよびｄＴＴＰと、約４ｍＭのＡＴＰと、それぞれ約０．２ｍＭのＣＴＰ、 ＵＴＰおよびＧＴＰと、約４０ｍＭのクレアチンリン酸と、約３７．５ｕｇ／ｍ ｌのクレアチンホスホキナーゼと、約０．１０〜１００ｕｇ／ｍｌの基質ＤＮＡ と、約０．５容量の前記抽出物と、約３０ｍＭのｐＨ約７．５のヘペス緩衝液と を含む、請求項１に記載の方法。 １２．（ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、ＡＡＶカプシドお よびＲｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工 程と、 （ｂ）該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 （ｃ）該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 （ｄ）該抽出物を該ＤＮＡ基質と合わせる工程と、 （ｅ）該基質ＤＮＡのパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 を包含する方法によって調製される、受容哺乳類細胞に形質導入し得るＡＡＶ粒 子。 １３．（ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、ＡＡＶカプシドお よびＲｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工 程と、 （ｂ）該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 （ｃ）該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 （ｄ）該抽出物を該ＤＮＡ基質と合わせる工程と、 （ｅ）該基質ＤＮＡのパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 （ｆ）該ヘルパーウィルスを不活性化するのに十分な温度で十分な時間該抽出 物を加熱する工程と、 を包含する方法によって調製される、受容哺乳類細胞に形質導入し得るＡＡＶ粒 子。 １４．（ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、ＡＡＶカプシドお よびＲｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工 程と、 （ｂ）該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 （ｃ）該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 （ｄ）該抽出物を該ＤＮＡ基質と合わせる工程と、 （ｅ）該基質ＤＮＡのパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 （ｆ）該ヘルパーウィルスを不活性化するのに十分な温度で十分な時間該抽出 物を加熱する工程と、 （ｇ）該抽出物をクロロホルムで抽出する工程と、 を包含する方法によって調製される、受容哺乳類細胞に形質導入し得るＡＡＶ粒 子。 １５．受容哺乳類細胞に形質導入する方法であって、該受容哺乳類細胞を請求項 １２に記載のＡＡＶ粒子に感染させる工程を包含する方法。 １６．受容哺乳類細胞に形質導入する方法であって、該受容哺乳類細胞を請求項 １３に記載のＡＡＶ粒子に感染させる工程を包含する方法。 １７．受容哺乳類細胞に形質導入する方法であって、該受容哺乳類細胞を請求項 １４に記載のＡＡＶ粒子に感染させる工程を包含する方法。 １８．前記受容哺乳類細胞が、１次細胞、細胞株、組織および生体からなる群よ り選択される、請求項１６に記載の方法。 １９．前記受容哺乳類細胞が、１次細胞、細胞株、組織および生体からなる群よ り選択される、請求項１７に記載の方法。 ２０．受容哺乳類細胞に形質導入し得るＡＡＶ粒子内にＤＮＡ基質をインビトロ でパッケージし得る組成物を調製する方法であって、 （ａ）ＡＡＶ複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、ＡＡＶカプシドおよび Ｒｅｐ遺伝子コード配列を持つｄＡＡＶベクターでトランスフェクトする工程と 、 （ｂ）該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 （ｃ）該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 を包含する方法。 ２１．請求項２０に記載の方法によって調製される組成物。