JPH11512923A - アデノ関連ウイルスdnaのインビトロパッケージング - Google Patents
アデノ関連ウイルスdnaのインビトロパッケージングInfo
- Publication number
- JPH11512923A JPH11512923A JP9501621A JP50162197A JPH11512923A JP H11512923 A JPH11512923 A JP H11512923A JP 9501621 A JP9501621 A JP 9501621A JP 50162197 A JP50162197 A JP 50162197A JP H11512923 A JPH11512923 A JP H11512923A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aav
- extract
- dna
- cell culture
- packaging
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 58
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 102
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 91
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 21
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 20
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 19
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 18
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 13
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 11
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 claims description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 3
- 102100038238 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035075 Tyrosine decarboxylase Proteins 0.000 claims description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000026683 transduction Effects 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 12
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 12
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- NOFOAYPPHIUXJR-APNQCZIXSA-N aphidicolin Chemical compound C1[C@@]23[C@@]4(C)CC[C@@H](O)[C@@](C)(CO)[C@@H]4CC[C@H]3C[C@H]1[C@](CO)(O)CC2 NOFOAYPPHIUXJR-APNQCZIXSA-N 0.000 description 4
- SEKZNWAQALMJNH-YZUCACDQSA-N aphidicolin Natural products C[C@]1(CO)CC[C@]23C[C@H]1C[C@@H]2CC[C@H]4[C@](C)(CO)[C@H](O)CC[C@]34C SEKZNWAQALMJNH-YZUCACDQSA-N 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241001135972 Aleutian mink disease virus Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241001351225 Sergey Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700015342 adenovirus terminal Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150067977 ap gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000013627 low molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000004942 nuclear accumulation Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- VMXUWOKSQNHOCA-UKTHLTGXSA-N ranitidine Chemical compound [O-][N+](=O)\C=C(/NC)NCCSCC1=CC=C(CN(C)C)O1 VMXUWOKSQNHOCA-UKTHLTGXSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical group [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
アデノ関連ウイルス粒子をインビトロパッケージする方法が記載される。その手順は、パッケージングに不可欠な成分を全て含有する無細胞抽出物の調製を含む。パッケージング用の相同な精製基質DNAは、別個に調製され得る。インビトロパッケージされたAAV粒子は、哺乳類細胞の形質導入および動物の遺伝子治療に有用である。1つの記載される方法においては、AAV粒子内にパッケージされるDNAは、インビトロパッケージされるAAV粒子のサイズ制限特徴によって制限されない。
Description
【発明の詳細な説明】
アデノ関連ウイルスDNAのインビトロパッケージング
謝辞
本発明は部分的にNational Institute of General Medical Science(ROl
GM3572302)およびNational Heart,Blood,and Lung Institute(R
Ol HL/DK50257)からの助成金によって支援された。米国政府は、
本発明に関する権利を享受し得る。
序論 技術分野
本発明は、特定の哺乳類形質導入ベクター、ならびにインビトロでカプシド形
成された哺乳類形質導入ベクターの産生および使用方法に関する。背景
アデノ関連ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科に属する(Muzyczka,N.
,Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97-129 1992)。パルボ
ウイルスビリオンは、3つの構造タンパク質と、直線状の1本鎖(ss)DNA
ゲノムとによって構成される。粒子は、正12面体対称性を有し、18〜26n
mの直径を有する。AAVの5つの血清型が同定されているが、最も広く特徴付
けられているのはAAV−2である。AAV−2の完全なヌクレオチド配列が報
告されているが(Srivastavaら、J.Virol.45:555-564 1983)、これは4680
個の塩基を有する。このAAVゲノムは、145個の塩基からなる末端逆方向反
復(terminal inverted repeats)(TR)を有する。
変異研究によって、AAVゲノム中少なくとも3つの領域が同定されている。
rep領域は、AAV DNAの複製および/またはレスキューに必要な4つの
タンパク質をコードする。Repタンパク質は、4つの重複するポリペプチド、
即ちRep78、Rep68、Rep52およびRep40で構成される。ca
p領域は、AAVカプシドタンパク質をコードすると思われ、これらの領域にお
ける変異体は、DNAの複製を行うことができるが、感染性粒子は形成しない。
変異研究によって、DNAの複製には逆方向末端反復がシスで必要であることが
分かっている。
AAVの3つのカプシドタンパク質、即ちVP1、VP2およびVP3は、9
0、72および62kDaの分子量を有し、1:1:10の比率でビリオン中に
存在する。遺伝子研究によって、VP2およびVP3はそれら自身によって子孫
DNAをカプシド形成し得ることが分かっている(Hermonattら 1984 J.Virol
.51:329-333; Tratschinら 1984 J.Virol.51:611-619)。しかし、カプシド
タンパク質の完全補体を有するものに比べて、VP1を欠くビリオン粒子は感染
性が低い。AAV、B19および昆虫細胞中で発現するアリューシャン病ウィル
スのものを含むパルボウイルス構造タンパク質は、空のカプシドにアセンブル可
能である(Ruffingら 1992 J.Virol.66:6922-6930,1992; Brownら 1991 J.Vi
rol.65:2702-2706; Christensenら 1993 J.Virol.67:229-238)。核の蓄積(nu
clear accumulation)およびその後の粒子アセンブリを効率的に行うためにはサ
ブユニットが複合体を形成しなければならないことが、AAVカプシドタンパク
質の細胞下分布に関する結果によって示唆されている(Wistubaら 1995、印刷中
)。
AAVは、組込みプロウィルスとして、あるいは溶解性感染によって繁殖され
得る(Atchisonら 1965 Science 149:754-756; Hogganら 1972 Proceedings of
the Fourth Lepetite Colloquium,Cocoyac,Mexico,North-Holland,Amsterda
m,pp.243-249)。潜伏感染を形成する能力は、AAVのライフサイクルの一部
であるように思われる。特別な状況下以外において(Yacobsonら 1987 J.Virol
.61:972-981; Schlehoferら 1986 Virology 152:110-117; Yalkinogluら 1988
Cancer Res.48:3123-3125)、AAVは、生産的ウィルス感染を開始するための
ヘルパーウィルスの存在を必要とする。ヘルペス科またはアデノウイルス科のい
ずれかのメンバーは、必要なヘルパー機能を提供でき(Atchisonら 1965 Scienc
e 149:754-756; Melnick 1965 J.Bacteriol 90:271-274; McPherson 1985 Viro
logy 147:217-222)、また、ワクシニアウィルスは少なくとも部分的なヘルパー
機能を提供することができる(Schlehoferら 1986 Virology 152:110-117)。ヘ
ルパーウィルスが存在しない場合、AAVは子孫を全く産生せず、代わりに、宿
主染色体に組み込まれてプロウィルスを形成する(Hogganら 1972; Bernsら 197
5 Virology 68:556-560; Handaら 1977 Virology 82:84-92; Cheungら 1980 J.
Virol.33:739-748)。希に例外もあるが、AAVプロウィルスは安定なようで
ある。しかし、AAVプロウィルスを有する細胞株が、後にヘルパーウィルスに
重複感染した場合、AAVゲノムは切除されて通常の生産的感染を経る(Hoggan
ら 1972; Cheungら 1980 J.Virol.33:739-748)。後にレスキューされ得る潜
伏感染を確立するこの能力は、ヘルパーウィルスが存在しない場合にAAVの生
存を確実にするメカニズムであるように思われる。
感染性AAVビリオンのインビトロアセンブリには、パッケージされたDNA
上における逆方向末端反復の存在が必要であり、これは、インビボでのパッケー
ジングのシグナルがTR配列内にあることを示唆している(Samulskiら 1989 J
.Virol.63:3822-3828; McLaughlinら 1988 J.Virol.62:1963-1973)。野生
型AAVの110%を越えるゲノムの大きさは、低いカプシド形成効率につなが
る。インビボにおけるAAVアセンブリに関する動力学的な研究によって、完全
な粒子が現れる前に空のカプシドが産生されることが明らかになった(Myersお
よびCarter 1980 J.Virol.102:71-82)。随伴性のDNA複製(concomitant DN
A replication)が無い場合に、予備形成したカプシド内に子孫DNAをパッケー
ジすることが提案されている。また、アリューシャン病ウィルスDNAのパッケ
ージングモデルによれば、カプシド形成は、子孫DNAと空のウィルスカプシド
との相互作用、その後の置換合成、そしてDNAの最終的パッケージングによっ
て開始されることが示唆される(WillwandおよびKaaden 1980 J.Virol.64:159
8-1605。
ウイルス形質導入ベクターとしてのAAVの使用は、HermonatおよびMuzyczka
(Proc.Natl Acad.Sci.81:6466-6470 1984)によって初めて実証された。マ
ップ位置52と92との間において、AAVカプシド遺伝子を欠失させてベクタ
ーd152−91を作り、SV40制御下における細菌性ネオマイシン耐性遺伝
子を挿入した。アデノウィルスに感染させておいたヒト細胞内に組換えプラスミ
ドをトランスフェクトすることによって、d152−91/ネオウィルスストッ
クを得た。野生型cap遺伝子を有するプラスミドで同時トランスフェクトする
ことによって、欠けているカプシドタンパク質を供給した。この方法により、1
06までの感染単位/mlを有するd151−91/ネオウィルスストックを生
成した(Hermonatら 1984 J.Virol.,51:329-333)。これらのストックの形質
導入頻度は、野生型ウィルスの組込み頻度、0.5%〜5.0%とほぼ同じであ
った(Laughlinら 1986 J.Virol.60:515-524(1986); Handaら 1977 Virology 8
2:84-92)。AAV TR配列および変化量の非反復AAV配列を有する他のAA
Vベクターは、外来DNAをヒト細胞内に効率的に形質導入できることが実証さ
れている(McLaughlinら 1988 J.Virol.62:1963-1973; Samulskliら 1987 J.
Vlrol.61:3096-3101; Samulskiら 1989 J.Virol.63:3822-3828)。
rAAV形質導入ベクターを使用する際の困難点の1つは、組換えウィルスス
トックを増殖させるために必要とされる煩雑な手順である。組換えストックの増
殖には、AAVおよびヘルパーウィルス遺伝子両方が存在する必要があり、産生
される組換えウィルスストックはしばしば、混入物としてアデノウィルスおよび
野生型AAVウィルス粒子の両方を有する。トランスのAAV Repおよびc
ap遺伝子産物を供給するための野生型AAV感染性プラスミドを使用すると、
許容不可能に高いレベルの野生型AAVウィルス、即ち約10:1の野生型対組
換え体比率を有するストックが産生される(HermonatおよびMuzyczka 1984; McL
aughlinら 1988; Tratschinら 1985 Mol.Cell Biol.5:3251:3260; Lebkowski
ら 1988 Mol.Cell Blol.8:3988-3996; Vincentら 1988 Vaccine 90:353-359)
。理由は明らかではないが、野生型ウィルスの増幅に対する強い選好性がある。
野生型AAVウィルスを用いた相補性によって組換えウィルスストックを増幅さ
せる場合にも同じことが言える。関連文献
組換えストックにおける野生型AAVウィルスのレベルを低減するべく、いく
つかの方策が試されている。HermonatおよびMuzyczka(1984)は、λバクテリオフ
ァージDNAの2.5kbフラグメントを野生型AAVプラスミドの非必須領域
内に挿入することによって、組換えゲノムins96λ/Mを産生した。これは
、
トランスにおいてAAV遺伝子産物の全てを複製および供給し得たが、それ自身
が大き過ぎてパッケージできなかった。105〜106/mlの組換え力価を得る
ことができたが、ストックには5%〜10%レベルの野生型ウィルスが混入して
いた(HermonatおよびMuzyczka 1984 Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 91:6466-647
0; McLaughlinら 1988 J.Virol.62:1963-1973)。明らかに、混入野生型AA
Vウィルスは、相補ヘルパープラスミドins96λ/MとAAVベクター配列
との間の組換えの結果であった。いくつかの研究所は、末端反復の一部を欠き、
あるいはrep変異を含み、それ故に、パッケージ不可能な相補AAVプラスミ
ドの使用を試みている。(Tratschinら 1985 Mol.Cell Biol.5:3251-3260; Le
bkowskiら 1988 Mol.Cell Biol.8:3988-3996。この方法によっても、相当なレ
ベルの野生型混入(1%〜50%)が生じるが、これは、おそらく、rAAVお
よび相補プラスミドの重複部分の相同な組換えに起因する。さらに、この組換え
ストックの力価は少ない(102〜103/ml)。
Samulskiら(1989)は、組換えAAVゲノムと相補ヘルパーAAVプラスミドと
の間に相同配列が無い相補プラスミド(pAAV/Ad)を構築した。このプラ
スミドは、アデノウィルス5末端反復を側面に有するAAVコード配列で構成さ
れていた。明らかに、これらのアデノウィルス末端は、通常アデノウィルスDN
A複製に用いられるメカニズムによって、アデノウィルス感染細胞内へのトラン
スフェクションの後に、相補AAVプラスミドに制限された増幅を受けさせた。
pAAV/Ad相補プラスミドは、104〜105/mlの組換えウィルス力価を
生じ、検出可能な野生型AAVの混入が全く無かった(Samulskiら 1989 J.Vir
ol.63:3822-3828)。
Vincentら(Vaccine 90:353-359 1990)は、末端反復を欠くAAVゲノムの組
込みコピーを有するいくつかのHeLa細胞株を単離した。末端反復が無いこと
によって、細胞がアデノウィルスに重複感染した際の、組込みAAV配列のレス
キューおよびパッケージングが防がれた。これらの株の中の1つ(HA25a)
は、103〜104/mlの力価を有する組換えストックを生成することが可能で
あった。明らかに、産生されたウィルスの力価が少なかったのは、パッケージン
グ細胞株内における野生型AAV遺伝子のコピー数が少なかったためであった。
Mendelsonら(Virology 166:154-165 1988)もまた、構成的にAAV Repタ
ンパク質を発現する細胞株をいくつか単離した。
ChejanovskyおよびCarter(Virology 171:239-147 1989)は、AAV Rep
遺伝子内におけるアンバー変異体(pNTC3)の単離を報告している。この変
異は、誘導可能ヒトセリンtRNAアンバーサプレッサーを有するサル細胞株上
でそれを増殖させることによって効率的に抑制することができた。得られたウィ
ルス力価は107〜108/ml(同じサルの株で得られる野生型力価の約10%
)であったが、アンバー変異の復帰頻度は約10-5であり、従って、許容不可能
なレベルのwtAAVの混入を生じた。
rAAVストックを増殖させる現在の方法は、HermonatおよびMuzyczka(1984)
によって考案され、Samulskiら(1989)によって記載されているpAAV/Adを
用いて、あるいは、AAVまたはアデノウィルス末端配列を有しないヘルパーA
AVプラスミドを用いて改変されたものである。これらの方法は、約106/m
lのrAAV力価を生成し、そして依然として、検出可能な量のwtAAVを含
有し得る。さらに、この方法によって調製されるrAAVは、顕著なアデノウィ
ルス混入、ならびに、宿主細胞株内に存在する外因性ウィルスの混入を含む。こ
れらの困難点の全ては、AAVのインビトロパッケージング系を開発することに
よって解決され得る。Mollaら(Science 254:1647-1651,1991)がRNAウィル
スであるポリオウィルスのインビトロパッケージング系を報告しているものの、
哺乳類DNAウィルスのインビトロパッケージング系が記載されていない。
発明の要旨
本発明の目的は、インビトロ反応においてDNA基質をパッケージして、哺乳
類細胞に形質導入し得るアデノ関連ウイルス(AAV)粒子を産生する方法を提
供することである。本発明の別の目的は、形質導入し得るAAV粒子内にDNA
基質をインビトロパッケージするのに有用な無細胞抽出物を産生する方法を提供
することである。インビトロパッケージされるAAV粒子、ならびに哺乳類細胞
の形質導入においてそれを使用する方法も提供される。
以下においてすぐに明らかになるように、本発明の上記および他の目的は、イ
ンビトロにおいてDNA基質をAAVカプシド内にパッケージすることによりパ
ッケージされたDNA基質を受容哺乳類細胞に導入し得るウィルス粒子あるいは
組換えウィルス粒子を産生し、結果的に、受容細胞内で基質DNAあるいは基質
DNAの一部を発現あるいは機能させる方法を提供することによって達成される
。具体的には、本発明の方法は、(a)AAV複製を許容する哺乳類細胞培養物
を、AAVカプシドおよびRep遺伝子コード配列を持つdAAVベクターでト
ランスフェクトする工程と、(b)上記細胞培養物をヘルパーウィルスに感染さ
せる工程と、(c)上記トランスフェクトされた細胞培養物から抽出物を調製す
る工程と、(d)上記抽出物をDNA基質と合わせる工程と、(e)上記基質D
NAのパッケージングを促進する条件下で上記抽出物をインキュベートする工程
とを包含する。より特定の実施形態において、本発明の方法は、上記パッケージ
された抽出物を高い温度で加熱する工程をさらに包含し、そして必要に応じて、
上記パッケージされた抽出物をクロロホルムで抽出する工程を包含する。
他の実施形態において、本発明は、受容哺乳類細胞に形質導入し得るインビト
ロパッケージされたAAV粒子を提供する。このような実施形態の1つにおいて
、AAV粒子内にパッケージされた基質DNAは、インビボパッケージング方法
によって作られる以前のrAAVベクターの大きさおよび配列という典型的制約
によって制限されない。
本発明はまた、インビトロでパッケージされたAAV粒子を用いて基質DNA
を受容哺乳類細胞に移入する方法、ならびに、基質DNAのAAV粒子内へのイ
ンビトロパッケージングを行い得る組成物を調製する方法を提供する。
本発明をよりよく理解できるように、以下の定義を示す。
ヘルパーウィルス:アデノウィルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイル
ス、エプスタイン−バールウイルス、あるいはワクシニアウイルス等の、適切な
真核細胞内に感染したときに生産的AAV感染を生じさせるウィルス。
ヘルパーAAV DNA:AAV複製および/またはインビトロパッケージン
グに不可欠な機能を欠く組換えAAVに対して、トランスでAAV機能を提供す
るために用いられるAAV DNA配列。
rAAV:組換えAAV;AAV配列の一部、通常最低でも逆方向末端反復あ
るいはWO9413788に記載される2重D配列(double-D sequences)、およ
び一部の外来(即ち、非AAV)DNAを有するDNA分子。
dAAV:欠損AAV;本願の目的において、dAAVはAAVのRepおよ
びカプシドコード領域を有するが、インタクトな逆方向末端反復を欠いているの
で、これらをインビボでパッケージすることはできない。
AAV粒子:インビボあるいはインビトロでDNAをAAVカプシド内にパッ
ケージすることによって産生される感染性粒子であり、パッケージされたDNA
はwtAAVゲノムでもrAAVでもよい。
AAV(TRLacZ):パッケージされたDNAがTRLacZ(CMVプ
ロモーターの制御下におけるAAV末端反復およびLacZコード配列)を有す
るAAV粒子。
形質導入:細胞内で遺伝子が発現されるように、ウィルス粒子を用いた遺伝子
の細胞への移入(transfer)。
トランスフェクション:他のあらゆる物理的あるいは化学的方法を用いたDN
Aの細胞への移入。
図面の簡単な説明
以下に示す具体的な実施形態の詳細な説明を参照し、本出願書類の一部をなす
図面と合わせて考慮することによって、本発明がよりよく理解されるであろう。
図1:pTRLacZ、pAB11、野生型AAV、pIM45およびd16
3−87/45の図。pTRLacZおよびpAB11における特定の制限エン
ドヌクレアーゼの切断部位を示す。これらの制限フラグメントは、表IIに記載
されるインビトロパッケージング実験で基質として使用される。この図には、d
163−87/45におけるカプシド遺伝子の欠失位置も図示されている。pT
RLacZおよびpAB11(Goodmanら、1994 Blood 84:1492-1500)は、CM
V初期プロモーターおよびSV40初期ポリアデニル化シグナル(図示せず)の
制御下においてLacZコード配列を有するrAAVプラスミドである。pAB
11は、CMV配列とLacZ遺伝子との接合部近傍のPstI部位を欠いてい
る点、ならびにLacZコード配列内に核局在化シグナルを有する点でpTRL
acZとは異なる。両プラスミドともに、145bpの逆方向反復配列以上のA
AV配列を持っていない。d163−87/45には、点線で示す領域の欠失が
ある。pIM45あるいはd163−87/45のどちらも、pTRLacZあ
るいはpAB11と相同な配列を全く持っていない。pIM45あるいはd16
3−87/45のどちらも、AAV TR配列を全く持っていない。
図2:インビトロパッケージング細胞抽出物のウェスタン分析。アデノウィル
スのみに感染させた、あるいはアデノウィルスに感染させ、かつd163−87
/45またはpIM45プラスミドDNAでトランスフェクトした293細胞か
ら、実施例1に記載されるように抽出物を調製した。pIM45+Ad抽出物由
来のRepタンパク質の部分的な枯渇は、タンパク質G−ビーズ(protein G-bea
ds)に結合したマウスモノクローナル抗Rep78/68抗体とともに抽出物を
インキュベートすることによって達成された。10μlの各抽出物を、ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルラー膜に移入し、そして、4つのR
epタンパク質を全て認識する抗Repマウスモノクローナル抗体あるいは3つ
のカプシドタンパク質を全て認識するモルモットポリクローナル抗カプシド抗体
(右パネル)を用いて、Repタンパク質(左パネル)についてプローブした。
図3:インビトロでパッケージされたpTRLacZウィルスおよびインビボ
でパッケージされた野生型AAVの塩化セシウム密度勾配遠心分離。インビトロ
でパッケージされたpTRLacZウィルスおよびインビボで産生された野生型
AAVウィルスを、実施例3に記載の平行塩化セシウム密度勾配で遠心分離した
。pTRLacZ(黒丸)ウィルスは、β−ガラクトシダーゼ染色法によって力
価測定し、野生型AAV(白丸)は、感染性センターアッセイ(infectious cent
er assay)によって力価測定した。両ウィルス調製物とも、55℃で30分間加
熱したが、クロロホルムでの抽出は行わなかった。
図4:インビボでパッケージされたwtAAVおよびインビトロでパッケージ
されたAAV(TRLacZ)のショ糖勾配遠心分離。CsCl勾配からのピー
ク画分を、15〜30%のショ糖勾配で沈澱させた。このウィルスを、図3のよ
うに力価測定した。pTRLacZ(黒丸)、wtAAV(白丸)、−X−屈折
率。
具体的な実施形態の説明
組換えAAVベクターには、それをヒト遺伝子治療の有力な候補にする特徴が
いくつかある。第1に、5kbのクローニング容量により、様々なcDNAに対
応することができる。第2に、ヒト細胞内における形質導入の頻度は高い。これ
までのところ、AAV形質導入に対して耐性を示したヒトの細胞株あるいは組織
はない。第3に、ヒトあるいは動物集団のいずれにおいても、AAVに関連する
疾患はない。さらに、一般に、rAAVベクターは、増殖するためには、2つの
異なるヘルパーウィルスゲノムを必要とするので、AAVベクターの自然伝染(n
atural spread)には固有の限界がある。さらに、プロウィルス細胞がアデノウィ
ルスに重複感染した場合、野生型AAVゲノムも供給されない限り、Rep-A
AVプロウィルスがDNAの複製を行うことができない(McLaughlinら 1988 J
.Virol.62:1963-1973(1988))。ワクチン接種によって、AAVプロウィルス
を持つ固体をアデノウィルス感染から守ることができる。第4に、AAVプロウ
ィルスは安定なようである。第5に、Rep遺伝子が存在しない場合、AAV末
端反復は転写的に中立なようである。従って、外来遺伝子をそれら自身のエンハ
ンサーおよびプロモーターエレメントの制御下において有することが不可欠であ
る場合、AAVベクターは有用であり得る。最後に、AAVベクターに関する重
複感染免疫性は存在しない。細胞株は、いくつかの異なるAAVベクターを用い
て、複数回形質導入され得る(Lebkowskiら 1988 Mol.Cell Biol.8:3988-3996
; McLaughlinら 1988 J.Virol.62:1963-1973)。
組換えAAV(rAAV)ベクターの感染性ウィルスストックの産生を行う以
前の方法では、生産的感染の途中に、インビボでのrAAVゲノムのパッケージ
ングを採用していた。rAAVの生産的感染およびインビボパッケージングには
、アデノウィルスのようなヘルパーウィルス、ならびにrAAVゲノムから欠失
した必須AAV機能を用いた相補性が必要である。結果的に、インビボで産生さ
れたrAAVウィルスストックは、相当なレベルのヘルパーウィルスおよび野生
型(Wt)AAVを有し得る。さらに、インビボでパッケージされたrAAV粒
子の力価は、典型的に、wtAAVについて得られるものよりも大幅に少ない。
また、細胞培養物内で調製されたAAVベクターは全て、外来性のウィルスの混
入
を受け易く、この外来性のウィルスは、rAAVを増殖させるために使用される
細胞内に存在し得る。
本発明は、インビトロにおけるrAAVゲノムのパッケージング方法を提供す
ることによりこれらの困難点を克服する。インビトロとは、細胞内環境以外で起
こることを意味する。rAAVゲノムが存在する唯一のDNAであり、それ故に
、インビトロでパッケージされたrAAVウィルスストックへのwtAAVある
いはヘルパーウィルスの混入が排除される条件下において、インビトロでのパッ
ケージングを行うことができる。さらに、実施形態の1つにおいて、本発明の方
法は、wtAAVゲノムよりも少なくとも2倍大きく且つ基質DNA上のAAV
TR配列の存在を必要としない、基質DNAの形質導入可能なAAV粒子の産生
を可能にする。
本発明の方法においては、欠損AAV(dAAV)ベクターでトランスフェク
トし、ヘルパーウィルスに感染させた宿主細胞からパッケージング成分細胞抽出
物(PCCE)を調製する。dAAVベクターは、AAVからのRepおよびカ
プシド遺伝子コード配列を有するが、逆方向末端反復配列を全く欠いている。ヘ
ルパーウィルスの感染が有る場合、AAV Repおよびカプシドタンパク質が
産生されるが、dAAV DNAは複製あるいはパッケージされない。選択され
たベクターがAAV Repおよびカプシド遺伝子を発現させることができ且つ
パッケージされ得ない限り、数あるdAAVベクターのどれを用いてもよい。こ
のようなdAAVベクターは、当該技術分野において周知であり、ここではこれ
以上詳細には説明しない(例えば、Samulskiら 1989を参照)。好ましくは、d
AAVベクターはpIM45である(McCartyら J.Virol.65:2936-2945 1991
)。ヘルパーウィルスは、哺乳類細胞においてAAVの生産的ウィルス感染を促
進することが知られている数あるウィルスのいずれであってもよい。ヘルペス科
あるいはアデノウィルス科のいずれかのメンバーでも、必要なヘルパーウィルス
機能を提供することができる。いくつかの条件下では、ワクチニアウィルスがヘ
ルパーウィルスとして有用であり得る。好ましくは、ヘルパーウィルスはアデノ
ウィルスであり、最も好ましくは、ヘルパーウィルスはアデノウィルス5である
。PCCEの調製に有用な宿主細胞には、AAV複製を許容するあらゆる哺乳
類細胞が含まれ、これには、HeLa細胞あるいはヒト293細胞が含まれるが
、これらに限定されるものではない。特に有用なのは、ヘルパーウィルスに感染
させたヒト細胞株である。好ましくは、このPCCEの調製に使用される細胞株
は、ヒト293細胞である(Grahamら、1977 J.Gen.Virol.36:59-72)。
PCCEの調製は、当該技術分野において周知の手順によって、宿主細胞株を
、dAAVベクターでトランスフェクトし、そして、ヘルパーウィルスに感染さ
せることによって行われる。トランスフェクションは、DEAE−デキストラン
法(McCutchenおよびPagano,1968,J.Natl.Cancer Inst.41:351-357)、リ
ン酸カルシウム法(Grahamら 1973,J.Virol.33:739-748)、または、これら
に限定はされないがマイクロインジェクション、リポフェクション、およびエレ
クトロポレーションを含む、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る
。トランスフェクションは、ヘルパーウィルス感染細胞を用いて行うことができ
、または、ウィルス感染と同時にあるいはその前に行うことができる。ヘルパー
ウィルスの感染は、従来の方法によって行われる。アデノウィルスをヘルパーウ
ィルスとして用いる場合、望ましい感染多重度は5から10の間であり得る。ト
ランスフェクションに使用されるdAAVベクター(および/または他のベクタ
ー)の量は、細胞106個あたりDNA約0.2〜10μgであるが、異なるD
NA構築物および細胞型によって変動し得る。
典型的に、PCCEの調製を行う際には、約60%のコンフルーエンシーに増
殖させた宿主細胞を、150mmプレートあたり約20ugのdAAVでトラン
スフェクトし、そして、約5から10の感染多重度でヘルパーウィルスに感染さ
せる。感染/トランスフェクト後の細胞を、感染/トランスフェクションから約
48時間〜数日後に収集し、これを先ず冷リン酸緩衝食塩水で洗浄し、その後、
冷低張液で洗浄する。洗浄された細胞を、遠心分離によって収集し、少量の低張
液中で再懸濁し、そして、4℃でインキュベートする。これらの細胞を、例えば
静かな(dounce)ホモゲナイゼーションによって破裂し、NaCl濃度を0.2M
にまで高める。4℃でのインキュベーションの後、遠心分離によって懸濁液を清
澄にし、上清を保存緩衝液に透析し、そして、低温、好ましくは−80℃で保存
する。巨大分子の低温保存に適した保存緩衝液は、当該技術分野においては周知
であり、典型的には、グリセロールのような凍結防止剤を緩衝液中に含有する。
好ましくは、保存緩衝液は20mMのTrisCl(pH7.4)、0.1mM
のEDTA、25mMのNaCl、10%のグリセロールおよび1mMのDTT
である。
PCCEは、上記の方法によって最も簡便に調製されるが、例えば、ヘルパー
ウィルスに感染した細胞から調製した細胞抽出物に精製AAV Repおよびカ
プシドタンパク質を添加するか、あるいは、Repおよび/またはcapタンパ
ク質を構成的に発現する宿主細胞を用いる等の他の方法によって適切なPCCE
が調製され得ることは明らかである。(例えば、Yangら 1994 J.Virol.68:484
7)。あるいは、抽出物中に存在するパッケージングに必須な細胞成分を、標準
的な生化学的な技法によって単離し、これを精製されたAAV Repおよびカ
プシドタンパク質と再結合させて完全なパッケージング抽出物を提供することが
可能である。
本発明のインビトロパッケージ方法は、PCCEと適切なDNA基質を合わせ
、そしてパッケージングを促進する条件下でインキュベートすることによって行
われる。パッケージングを促進する条件には、適切な濃度のMgCl2、デオキ
シリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、ATPを再生する系
および緩衝液が含まれる。必要に応じて、インキュベーション工程の後で、PC
CE内に存在し得るヘルパーウィルスを全て不活性化するために、インビトロで
パッケージされたウィルス粒子を加熱し得る。熱処理によって、インビトロでパ
ッケージされた粒子に非特異的に結合し得る細胞タンパク質も全て不活性化され
る。(インビボで産生されたAAVビリオンと同様に)インビトロでパッケージ
されたAAV粒子は熱に安定である。本発明の方法の1つの実施形態においては
、熱処理したインビトロパッケージ粒子をクロロホルムで抽出する。本発明の第
2の実施形態においては、このクロロホルム抽出を省略する。
典型的に、本発明のインビトロパッケージングのインキュベーションは以下の
ように行われる。約7mMのMgCl2と、約30mMのヘペス緩衝液(pH7
.5)と、約0.5mMのジチオスレイトールあるいは類似の還元剤と、それぞ
れ約0.1mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPと、約4mMの
A
TPと、それぞれ約0.2mMのCTP、UTPおよびGTPと、約40mMの
クレアチンリン酸と、約37.5ug/mlのクレアチンキナーゼと、約0.1
〜100ug/mlの基質DNAとでPCCEのアリコート(最終反応溶液の約
0.5容量)を調製する。反応物を37℃で4時間インキュベートする。これら
の条件の改変例のいくつかが許容的且つ適切であり、また、それを、得られた感
染性粒子の歩留まりをアッセイすることによって容易に決定することができるこ
とは、当業者には明らかである。AAV粒子に非特異的に結合し得る外来性の細
胞タンパク質を全て除去するために、そして、残留ヘルパーウィルスを全て不活
性化するために、インキュベーションの後で反応産物を任意に加熱し得る。典型
的に、約55℃、約30分間の加熱で十分である。クロロホルム耐性粒子の産生
が望まれる場合、熱処理反応物をクロロホルムで数回抽出する。クロロホルム抽
出を省略した場合は概して、パッケージされた特定の基質DNAに依存して、ク
ロロホルム感受性粒子とクロロホルム耐性粒子の混合物が産生される。
本発明のインビトロパッケージング法は、2種類のインビトロでパッケージさ
れたAAV粒子、即ち、クロロホルム耐性粒子(CRP)およびクロロホルム感
受性粒子(CSP)を産生するのに有用である。本発明のCRPおよびCSPは
共に、パッケージされた基質DNAを受容細胞に移入することができる。これら
は、インビトロパッケージング反応における基質DNAの構造的な要件、および
ショ糖勾配沈澱速度によって決定される大きさにおいて互いに異なる。CRPお
よびCSPは、CSPを調製する場合にクロロホルム抽出工程が省略される以外
は、上記本発明のインビトロパッケージング法に従って同一の方法で調製される
。
塩化セシウム勾配遠心分離によって測定される密度、ならびにクロロホルム、
熱あるいはDNaseIを用いた処理に対する耐性を含むいくつかの基準におい
て、クロロホルム耐性粒子はインビボでパッケージされたAAV粒子と同じであ
る。CRPを産生する場合、基質DNAは、wtAAVのゲノムサイズの約12
0%よりも大きくなってはならない。好ましくは、基質DNAは、wtAAVゲ
ノムの大きさの50%〜110%の間であり、最も好ましくは、基質DNAは、
wtAAVゲノムの大きさの80%〜105%の間である。さらに、CRP産生
用の基質は、インタクトなAAV逆方向末端反復配列あるいはWO941378
8に記載される2重D配列を有する。最適には、CRP産生用の基質DNAは、
1本鎖または2本鎖のいずれかの複製型(RF)DNAである。本発明のインビ
トロパッケージング法の基質として使用されるRF−rAAVは、当該技術分野
において周知の技術を用いて産生することができる(例えば、Hermonatら 1984;
Snyderら 1990 J.Virol.64:6204-6213; およびHongら 1994 J.Virol.68:20
11-2015を参照)。典型的に、RF−rAAVは、AAV複製を許容する哺乳類
宿主細胞を、rAAVプラスミドDNAおよびアデノウィルスのようなヘルパー
ウィルスで同時トランスフェクトすることによって調製される。トランスフェク
ションは、上記と同様の手順によって行われる。rAAV上に存在する特定のA
AV配列に応じて、要求性のAAV遺伝子を有するがTR配列を欠いているAA
Vヘルパープラスミドを用いてトランスフェクトすることによって、AAV複製
およびパッケージング機能に不可欠な欠けているAAV機能をトランスで提供す
ることができる。好ましくは、wtAAV RFを形成する組換えの可能性を低
くするために、上記AAVヘルパープラスミドおよびrAAVは、共通の配列を
持たない。最も好ましくは、上記ヘルパーAAVプラスミドは、pIM45であ
る(McCarty 1991)。他のヘルパーAAVプラスミド、例えば、AAV TRあ
るいはpHIVrep(Antoniら 1991 J.Virol.65:396-404)の代わりにアデ
ノウィルス5末端配列を有するpAAV/Ad(Samulskiら 1989)もまた適切
である。RF−rAAV DNAは、改変型Hirt手順(J.Mol.Biol.26:36
5-369 1967)のような、当該技術分野において周知の手順によって、トランスフ
ェクトした細胞から単離することができる。これらの手順によって単離されたD
NAには、他の細胞成分およびウィルス成分を実質的に含有しない。RF−rA
AVは、化学的にあるいは酵素学的に合成することもでき(Snyderら 1993 J.V
irol.67:6096-6104を参照)、あるいは、AAV TRを有し且つ細菌内で増殖
した(progated)円形プラスミドから作ることもできる(Hongら 1994を参照)。
本発明のCSPの産生において、基質DNAは、大きさによって、あるいはA
AV TR配列の有無によって制限されない。wtAAVゲノムの大きさの最大
2倍までのインビトロパッケージ基質DNAは、効率的に、受容哺乳類細胞に移
入されその中で発現する。CSP産生用の基質DNAの大きさは、大型のDNA
を破損することなく操作する能力によってのみ限定される。CSP産生用の基質
DNAは、wtAAVゲノムの大きさの50%〜500%の間であり得る。好ま
しくは、CSP産生用の基質DNAは、wtAAVゲノムの大きさの100%〜
200%の間である。CSP産生用の基質DNAはいかなるAAV配列を含む必
要もない。具体的には、この基質DNAはAAV TR配列を含む必要はない。
しかし、AAV TR配列を含めることは、形質導入後の移入された基質DNA
の効率的な組込みおよびレスキューに有用であり得る。最後に、CSP産生用の
基質DNAはAAV RFの形をとる必要はない。直線状あるいは円形のプラス
ミドDNAは、CSP産生用の基質DNAとして適している。適切な基質には、
化学的にあるいは酵素学的に合成されたDNAが含まれる。
本発明のインビトロパッケージング法に使用される特定の基質DNAの性質は
、受容細胞に移入しようとする特定の遺伝子あるいは他のDNA配列に主に依存
する。基質DNAは、特定の遺伝子、コード配列、プロモーター、あるいは、上
記以外のDNA配列のいずれにも限定されない。哺乳類受容体内で発現あるいは
機能することができるあらゆる遺伝子あるいは他の組換えDNAが、基質DNA
に適切に含まれ得る。(当該技術分野において、マーカー、レコーダー、あるい
はレポーター遺伝子として知られている)容易に検出可能な産物を有する遺伝子
を、基質DNAの一部として取り込むことが望ましい場合もあるが、本発明はこ
のような構築物に限定されない。容易に検出可能なレポーター遺伝子は、腫瘍化
あるいは非腫瘍化産物を産生し得る。腫瘍化レポーター遺伝子は、使用可能では
あるが、その発癌性のためにあまり望ましくない。非腫瘍化レポーター遺伝子は
、そのほんの一部を挙げると、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスホロト
ランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジ
ンキナーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびキサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定はされない。イン
ビボでパッケージされたAAV粒子を用いて移入されたDNAの例の一部には、
SV40初期プロモーターの制御下における細菌性ネオマイシンホスホロトラン
スフエラーゼ遺伝子(HermonatおよびMuzyczka 1984)、AAVp40プロモー
ターの制御下における細菌性クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝
子(Tratschinら 1984 Mol.Cell Biol.4:2072-2081)、ヒトβ−グロビンc−
DNA(Ohiら 1990 Gene 89:279-282)、およびヒト甲状腺剌激ホルモン(Wond
isfordら 1988,Mol.Endocrinol.2:32-39)が含まれる。本発明の方法との組
合わせにおいて有用な他の遺伝子あるいはコード配列は、GM−CSF、G−C
SF、M−CSFのようなサイトカイン、IL−2、IL−3、IL−7、IL
−13のようなインターロイキン、NGF、CNTF、BDNFのような神経成
長因子および神経栄養因子、チロシンヒドロラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、
因子XIIIおよび因子IXである。上記および類似のDNAが、インビトロで
パッケージされたAAV粒子を用いた移入に適している。さらに、インビボでパ
ッケージされたAAV粒子の場合に可能な大きさよりも大きい基質DNAを用い
て本発明のCSPを調製することができるので、本発明の方法によって移入され
得る遺伝子あるいは他のDNA配列の大きさについての制限は比較的少ない。
インビトロでパッケージされたAAV粒子の力価は、インビボで生成されたウ
ィルスストックの組換えAAVウィルス力価を決定する際に一般に用いられる方
法によって決定され得る。選択される特定の方法は、その基質DNAが持つ特定
の遺伝子あるいは他のDNAに依存する。例えば、基質DNAがβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子(LacZ)を持つ場合、上記力価は、形質導入体中のβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子の発現の頻度を測定することによって推定され得る。あるいは
、rAAV力価は全て感染性センターアッセイによって決定され得る(McLaughl
inら 1988)。ウィルス粒子力価は、ドットブロットアッセイによって、あるい
は当該技術分野において周知の方法を用いて分光光度的に決定され得る。典型的
には、本発明のインビトロパッケージング法は、少なくとも105/mlの感染
性ウィルス力価を提供する。これに対応して、粒子力価は少なくとも107/m
lである(AAV感染性比は典型的に100:1である)。
本発明のインビトロでパッケージされたAAV粒子は、インビボでパッケージ
されたAAV粒子を用いた形質導入のために用いられる方法と同じ方法で受容哺
乳類細胞の形質導入に用いられ得る。形質導入とは、基質DNAの受容細胞への
移入、およびその中における発現あるいは機能を意図したものである。このよう
な形質導入手順は当該技術分野において周知である(例えば、McLaughlinら 198
8; HermonatおよびMuzyczka 1984; Tratschinら 1985を参照)。典型的に、受容
哺乳類細胞を、ヘルパーウィルス無しで、インビトロでパッケージされたAAV
粒子に感染させ得、特に、パッケージされた基質DNAはAAV TR配列を有
し、この結果、プロウィルスが形成される。これは、特に、例えば動物などの生
活体の形質導入の場合に、選択されるべき方法である。あるいは、上記受容哺乳
類細胞を、インビトロでパッケージされたAAV粒子およびヘルパーウィルスに
同時感染させる。
上記受容哺乳類細胞は、AAVによる感染を受けやすいいかなる特定の哺乳類
細胞でもあり得、ヒト、ウサギ、サル、マウス、ウシ、イヌ、およびサルを含む
がこれらに限定はされない。受容哺乳類細胞は、1次細胞、確立された細胞株、
器官性組織(organized tissue)および生体を含む。AAVは、例えば、マウスお
よび霊長類の脳細胞ならびにマウス、霊長類およびウサギの肺細胞を形質導入で
きることが分かっている。
上記工程の具体的な例を、以下の実施例に示す。しかし、多数の改変例が可能
であること、ならびに、これらの実施例が説明の便宜上示されているに過ぎず、
そのように明記される場合を除いては本発明を限定するものではないことが当業
者には明らかである。
実施例
実施例1:AAVパッケージング成分(PCCE)を含む細胞抽出物の調製
材料:リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、クレアチンリン酸、ク
レアチンリン酸キナーゼ、およびアフィジコリンをSigmaあるいはPharmaciaから
購入した。タンパク質G−セファロースはPharmaciaから入手した。抗Repモ
ノクローナル抗体、抗rep52/40および抗rep78/68の腹水調製物
(HunterおよびSamulski 1992,J.Virol.66:317-324)は、Rockland Incによ
って調製され、そして使用前にはタンパク質Gセファロース上で精製された。ウ
ェスタン検出キットECLをAmershamから購入し、製造業者の指示に従って使用
した。モルモット抗AAVカプシドタンパク質ポリクローナル抗体は、Dr.R.J
.Samulski(University or North Carolina)によって提供された。カチオン性
リポソームを、記載(Gao 1991 Biochem.Biophys.Res.Comm.179:280-285)
に従って調製および使用した。制限エンドヌクレアーゼは、New England BioLab
sから購入した。
熱不活性化子ウシ血清および抗生物質を含むDMEM培地中に293細胞を維
持した(Grahamら 1977 J.Gen.Virol.36:59-72)。100継代未満を経た細
胞のみを使用し、そしてトランスフェクションあるいは感染の1日前にこれらの
細胞をプレートした。(ATCCから得た)アデノウィルス5を従来の方法によ
って調製した。pIM45に改名されたpIM29+45(McCartyら 1991 J.
Virol.65:2936-2945)をApaIを用いて消化し、得られたより大きなフラグ
メントを再連結することによって、プラスミドd163−87/45を構築した
。プラスミドpIM45は、AAVコード配列を全て有するが、AAV末端反復
を欠いている。プラスミドd163−87/45は、(pIM45に対して)1
103塩基の欠失をカプシドコード領域内に有し、これがフレームシフト変異を
引き起こす(図1参照)。
細胞抽出物の調製:コンフルーエンシー約60%の293細胞からなる150
mmのプレート10枚を、カチオン性リポソームを用いてプレート毎に20ug
のプラスミドDNAでトランスフェクトし(Gao 1991)、そして感染多重度(M
OI)5でアデノウィルス5に感染させた。これらの細胞を、感染から48時間
後に収集し、20mlの冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、その後、10
mlの冷低張緩衝液(20mMのヘペス(pH7.4)、5mMのKCl、1.
5mMのMgCl2、1mMのDTT)で洗浄した。細胞懸濁液を遠心分離し、
細胞ペレットを、最終容量4.8mlの低張緩衝液中で再懸濁し、氷上で10分
間インキュベートした。細胞懸濁液を静かにホモゲナイズし(タイプBの内筒で
20ストローク)、そして、5MのNaClを0.2ml加えて、NaCl濃度
を0.2Mにまで高めた。懸濁液を氷上で1時間インキュベートし、そして、1
5,000×gの遠心分離を20分間行うことによって抽出物を清澄にした。2
0mMのTrisCl(pH7.4)、0.1mMのEDTA、25mMのNa
Cl、10%のグリセロール、1mMのDTTを含有する緩衝液に対して透析を
行った後、抽出物を−80℃で保存した。
AAVパッケージング抽出物は、アデノウィルスに感染させ、かつpIM45
あるいは陰性コントロールプラスミドd163−87/45でトランスフェクト
した細胞から調製した。これまでの研究により、プラスミドd163−87/4
5中での変異は、パッケージングには完全に欠損であるが、AAV DNA複製
には実行可能であることが実証されている(HermonatおよびMuzyczka 1984)。
最後に、アデノウィルスのみに感染させた細胞からも抽出物が作られた。
上記抽出物のサンプルに対してウェスタン分析を行った。それぞれ10マイク
ロリットルの細胞抽出物を、8〜14%のポリアクリルアミド勾配ゲル上で電気
泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移入し、Repおよびカプシドタ
ンパク質を、それぞれ、抗Repモノクローナル抗体、抗rep52/40およ
びモルモット抗カプシドポリクローナル抗体を用いて検出した。製造業者のプロ
トコルに従ってECLキットを使用して、10個のウェスタンブロットを可視化
した。
予想通り、pIM45由来の抽出物は、全てのAAVコードタンパク質、即ち
非構造的タンパク質Rep78、Rep68、Rep52、Rep40、と3つ
のAAVカプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3とを有していた(図2
)。対照的に、d163−87/45に感染した細胞から調製した抽出物は、検
出可能なレベルのAAVカプシドタンパク質を有していなかったが、通常レベル
のRepタンパク質を有していた。d163−87/45抽出物中に切形カプシ
ドタンパク質が存在しなかったことは、おそらく、タンパク質の不安定性もしく
は抗体認識に必要なエピトープが存在しなかったことのいずれかに起因するもの
であった。アデノウィルスのみに感染した細胞から調製した抽出物は、Repタ
ンパク質もカプシドタンパク質も有していなかった。
実施例2:パッケージング反応用DNA基質の調製
(好意により、Dr.R.J.Samulski,University of North Carolinaによって
提供された)プラスミドpTRLacZおよびpAB11は、サイトメガロウイ
ルス(CMV)即時初期プロモーターの制御下においてE.coli β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子(LacZ)を有する組換えAAVベクターである(図1)。この
2つのプラスミドは、pAB11が内的Pst1部位(internal Pstl site)を欠
き、そのLacZ遺伝子のコード配列内に核局在化シグナルを有する点において
のみ互いに異なる。
pTRLacZは、HindIII末端においてpBS−CMV(Pharmacia
より入手)由来の0.9KBのBamHI/HindIII CMVプロモータ
ーフラグメントに連結され、かつ、pTRのBglII部位にクローニングされ
る、pCH110(Pharmaciaより入手)由来のLacZコード領域を有する、
3.7KBのBamHI/HindIIIフラグメントを含む。
pTRは、以下のような段階的な連結によって構築した。プラスミドd13−
94(McLaughlinら 1988)由来の左AAVTRを持つ160bpのPStI/
BglIIフラグメントを1270bpAd2フラグメント(スタッファーフラ
グメント)に連結させた。得られた1430bpのフラグメントを、SV40初
期ポリアデニル化シグナルの配列を有する50bpの合成DNAフラグメントに
、BamHIおよびBglII適合性末端で連結させた。得られた1480bp
のフラグメントを、左AAV TRを有する160bpのPstI/BglII
フラグメントの別のコピーに連結させた。得られた1640bpのフラグメント
をPstIで消化し、ゲル精製し、そして、pBR322のPstI部位に連結
させた。
2つの理由から、パッケージング実験用にpTRLacZを選択した。第1に
、あらゆる混入野生型AAVウィルスから容易に区別可能である。第2に、イン
ビトロパッケージング反応の効率を測定する容易な方法を提供した。これは、イ
ンビトロ反応の産物を細胞に付与し、その後、感染した細胞をβ−ガラクトシダ
ーゼ活性に対して染色することによって行われた。
pTRLacZ複製型DNAの調製のために、293細胞を、カチオン性リポ
ソームを用いて、100mmのプレート毎に10ugのpIM45およびpTR
LacZ DNA(3:1)で同時トランスフェクトし、そして、5MOIでア
デノウィルスに感染させた。レスキューされ複製されたAAV(TRlacZ)
DNAを、Hirt(J.Mol.Biol.26:365-369 1967)の方法を用いて、48
時間後に抽出した。アガロースゲル中での電気泳動および臭化エチジウムを用い
た染色の後で、AAVプラスミドDNAの既知量と比較することによって、AA
V(TRlacZ)DNAの濃度を決定した。
実施例3:基質DNAのインビトロパッケージング
完全なインビトロパッケージング反応物は30ul中に、30mMのヘペス(
pH7.5)と、7mMのMgCl2と、0.5mMのDTTと、それぞれ0.
1mMのdATP、dGTP、dCTPおよびdTTPと、4mMのATPと、
それぞれ0.2mMのCTP、GTPおよびUTPと、40mMのクレアチンリ
ン酸と、37.5ug/mlのクレアチンホスホキナーゼと、0.17ug/m
lのpTRLacZ RF DNAと、実施例1の15ulの細胞抽出物(PCC
E)とを有していた。反応物を、37℃で4時間インキュベートした。反応産物
を次に、55℃で30分間インキュベートし、そして、他に指示されない限りに
おいて、クロロホルムで2回抽出した。pTRLacZ RFの代わりに他のD
NA基質を用いて、さらなるインビトロパッケージング反応を行った(表II)
。
インビトロパッケージング反応の効率を、パッケージされたウィルスのアリコ
ートで細胞を感染させることによって評価した。パッケージング反応の産物を、
ウェル当たり5×104個の細胞を有する96ウェルプレートの293細胞に加
えた。この細胞をアデノウィルス5に同時感染させて、AAV導入遺伝子の一過
性発現を高め、そして、感染から48時間後に、記載されているように(Dhawan
ら 1991 Science 254:1509-1512)、X−galを用いて、細胞をβ−ガラクト
シダーゼに対して染色した。
野生型AAVの力価を、感染性センターアッセイによって決定した(McLaughl
inら 1988)。ウィルスストックのアリコートを用いて、ウェルあたり細胞5×
104個の密度の96ウェルプレートの293細胞を感染させた。これらの細胞
を、アデノウィルス5を用いてMOI5で同時感染させた。37℃での30時間
のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理し、濾過デバイスを有する
ナイロン膜上に移した。0.5NのNaOHおよび1.5MのNaClを含有す
る溶液で飽和させた3MMペーパー上で、膜を3分間湿らせた。膜がブロットさ
れて乾燥した後に、この工程をもう一度繰り返した。膜を、1MのTrisCl
(pH7.5)、1.5MのNaClで中性化し、そして、マイクロ波中で5分
間加熱した。膜を、野生型AAVプローブでハイブリダイズした。プローブにハ
イブリダイズする膜上のスポットのそれぞれが、AAVによって溶菌的に感染し
た細胞1個を表していた。
pTRLacZ DNAをpIM45およびアデノウィルスでトランスフェク
トした細胞から得た粗抽出物と共にインキュベートすると、反応産物で処理され
た細胞の相当数がLacZ遺伝子を発現できた(表I)。このことは、d163
−87/45とアデノウィルスとでトランスフェクトした細胞、あるいは、アデ
ノウィルスのみに感染させた細胞由来の抽出物とともにインキュベートした反応
産物については言えなかった。d163−87/45抽出物は(pIM45抽出
物と比較して)カプシドタンパク質のみを欠いていたので、TRLacZ DN
Aの移入および発現を、AAVカプシドタンパク質を必要とするなんらかのプロ
セスによって促進した。pTRLacZベクターの以前の研究によって、β−ガ
ラクトシダーゼ活性に対して染色することによって得たウィルス力価が、感染性
センターアッセイによって決定した感染性ウィルスの力価の約20分の1の少な
さであることが示唆されていた。従って、インビトロパッケージング反応の産物
から得たβ−ガラクトシダーゼ形質導入の頻度は、反応混合液1ml当たり、1
05個もの感染性ウィルスが合成されていたことを示唆した。粒子対感染性の比
を100:1と仮定すると、これは、反応物1ml当たり107個のAAV組換
え粒子の産生を表す。
実施例4:インビトロでパッケージされたAAV(TRlacZ)粒子の密度の
決定
ウィルス粒子の密度は、その粒子のタンパク質およびDNA含有量の関数であ
るので、我々は、インビトロでパッケージされたAAV(TRlacZ)粒子の
密度は野生型AAVウィルスと区別不可能であると予測した。AAVビリオン粒
子の密度を塩化セシウム勾配遠心分離法によって決定した。インビトロでパッケ
ージされたAAV(TRlacZ)を4mlの塩化セシウム溶液に加え、最終的
な屈折率を1.3720とした。この溶液をSW50.1ローター中、40kr
pmで、20時間、4℃で遠心分離した。インビボでパッケージされた野生型A
AVを平行CsCl勾配で行った。勾配の一番上から200マイクロリットルの
画分を取り出して、各画分の屈折率を決定した。その後、画分をPBSに対して
透析し、野生型AAV、あるいはAAV(TRlacZ)の力価を、それぞれ、
感染性センターアッセイによって、あるいはβ−ガラクトシダーゼ活性に対して
染色することによって決定した。
インビトロで合成した粒子は、本物の野生型AAVと同じ密度を有していた。
pTRLacZゲノムは、野生型AAVゲノムに近い大きさ(野生型AAVの1
04%)であった。図3に示されるように、両方の種類の粒子はともに単一の活
性ピークを生じ、この2種類の粒子の密度は事実上同じであった。野生型および
βgal粒子はともに、1.38g/mlの密度と等価な1.3698のピーク
屈折率を有していた。
実施例5:インビトロパッケージング基質DNAの構造的要件
インビトロパッケージング反応がインタクトな末端反復を必要としたかどうか
を決定するために、末端反復中に欠失を含むかあるいは各末端反復に付いた付加
的な配列を有する基質とともに、(実施例2に記載したように調製した)1本鎖
および2本鎖RF基質を用いた(表II)。プラスミドの末端反復あるいはベク
ター配列内で切断されたがCMVおよびLacZ配列をインタクトに残したいく
つかの制限酵素の中の1つを用いて、pTRLacZプラスミドDNAあるいは
pAB11DNAを消化することによって、上記改変基質を生成した(図1)。
さらに、我々は、反応の産物についてクロロホルム抽出の影響を調べた。
産物をクロロホルム抽出すると、完全な末端反復を有するインビボ由来のRF
基質のみが効率的にパッケージされた(表II、dsおよびssRF DNA)
。1本鎖ゲノムはAAV粒子内にパッケージされるにもかかわらず、1本鎖(s
s)RF AAV(TRLacZ)DNAに対する選好性は見られなかった。末
端反復の端部に付いたプラスミドベクター配列を有する基質(BamHI基質)
は、23個だけの付加的な塩基がpTRLacZゲノムの各端部に付いたもの(
pstI基質)でさえも、効率的にパッケージされなかった(表IIおよび図
1)。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を培養細胞に移入する効率が約8分の1の低
さであった。同様に、145bpの末端反復の末端から欠失した46bpを有す
る基質(SmaI基質)あるいは121bpを有する基質(MscI基質)も、
パッケージされにくかった。
これとは対照的に、β−gal移入活性について試験する前にクロロホルムで
処理をしなかったインビトロ反応産物は異なる挙動を見せた(表II)。先ず、
この産物は、クロロホルム抽出産物について見られたものの約2倍の移入活性量
を有していたが、このことは、β−gal移入活性の相当量がクロロホルム中で
安定ではない粒子に起因したことを示唆する。さらに、付加的なβ−gal移入
活性は、大部分が、DNA基質の大きさに不感受性であった。BamHIを用い
て消化したプラスミド基質は、野生型AAVゲノムの大きさの約2倍であったが
、それでも効率的に移入された。驚いたことに、付加的なβ−gal移入活性は
、インタクトなAAV末端反復配列を必要とせず、MscIあるいはSmaIに
よって消化された基質は効率的に移入された。最後に、クロロホルム感受性β−
gal移入産物はDNaseIによる消化に対して感受性を有していた。
実施例6:Repタンパク質および特定の補因子の要件
インビトロでのAAV DNA複製には、Rep78あるいはRep68の存
在が必要であり(Imら 1989 J.Virol.63:3095-3104; Imら 1990 Cell 61:447-
457; Snyderら 1993 J.Virol.67:6090-6104)、AAV DNA合成はアフィジ
コリンによって阻害される。Rep78あるいはRep68がインビトロパッケ
ージングに必要であるかどうかを決定するために、タンパク質−Gセファロース
ビーズに結合した抗78/68モノクローナル抗体を用いた抽出物の免疫沈降に
よって、パッケージング抽出物からRepタンパク質を枯渇させた(Harlowおよ
びLane 1988,in Antibodies: a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labo
ratories,pp.522-523)。Repタンパク質を免疫沈降させるために、3容量
の細胞抽出物を、1容量の抗Rep78/68−タンパク質Gビーズとともに、
4℃で1時間揺らしながら2回インキュベートした。この手順は、抽出物中のカ
プシドタンパク質の濃度に重大な影響を及ぼすことなく、Rep78および68
濃度を約10分の1に低減させることに成功した(図2)。抗Rep78/68
抗体によって認識されなかったRep52および−40もまた、おそらくより大
きなRepタンパク質との相互作用によって部分的に枯渇した。枯渇した抽出物
をパッケージング活性について試験したところ、その活性が、完全な抽出物に比
べて大幅に(約4分の1)低減していたことがわかった(表III)。10ug
/mlのアフィジコリンを完全な抽出物を有する反応産物に加えることによって
、活性が約9分の1に低減した。最後に、枯渇した抽出物にアフィジコリンを加
えることによって、パッケージング活性がさらに、約20分の1に低減した。我
々はまた、低減したRep濃度およびアフィジコリン処理の条件下においてDN
A合成のレベルを測定し、そしてDNA合成のレベルが、インビトロパッケージ
ングのレベルとほぼ同程度に低減したことを見出した(データは示していない)
。これらの結果によって、1つ以上のRepタンパク質の存在および活性DNA
合成がインビトロのAAVパッケージングに必要であったことが示される。
二価カチオンMg++およびATPは、パッケージング活性に不可欠であること
が分かった(表IV)。このことはCRPあるいはCSPのどちらについても言えた
。Mgイオンの省略によりパッケージング活性が完全に除去され、一方、ATP
あるいはATP再生系、クレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼの省
略によりパッケージング反応が激しく阻害された(約20分の1)。ATPある
いは上記再生系がない場合に見られる残留活性は、おそらく、無細胞パッケージ
ング抽出物が相当な量のATPを有していた事実を反映している。AAV DN
A複製にはMgおよびATPの両方が必要であるので、これらの補因子に対する
必要は意外なことではない。このことはまた、おそらく、4つのデオキシヌクレ
オシド三リン酸を反応物から省略したときに見られた活性の穏やかな減少(約4
0%)を説明する。やはり、デオキシヌクレオシド三リン酸はDNA複製に不可
欠であるが、無細胞パッケージング抽出物は、これらのヌクレオチドを相当量有
していたようである。この反応は、部分的に、他の3つのリボヌクレオシド三リ
ン酸、UTP、CTPおよびGTPの有無にも依存する。
実施例7:wtAAVおよびインビトロでパッケージされたAAV(TRLac
Z)のショ糖勾配遠心分離
15%〜30%(wt/wt)のショ糖の直線状勾配を、10mMのTris
Cl(pH8.8)中で調製した。CsCl勾配からのピーク画分を、PBSに
対して透析し、100ulに調整し、そしてショ糖勾配の上にのせた。この勾配
を2.5時間、20℃、110,000gで遠心分離した。画分を収集し、PB
Sに対して透析し、そして、CsCl勾配について記載したように、wtAAV
あるいはAAV(LacZ)について分析した。
概ね、2つの粒子調製物の沈澱プロファイルは類似していた。両者とも、成熟
110S AAV粒子の位置において沈澱した種を有していた。さらに、両調製
物ともに、比較的低いあるいは比較的高い沈澱係数で沈澱した材料を有していた
。分子量が比較的大きい種は、1つよりも多いAAVウィルス粒子からなる集合
体であると思われる。分子量が比較的小さい種は、MyersおよびCarterによって
インビボで同定されたものに類似のパッケージング中間体であり得る。本グルー
プはAAVパッケージング中の潜在的な中間体を報告しており、これは、成熟A
AVウィルス粒子と密度はほぼ同じであるが、そのショ糖勾配における沈澱係数
は、成熟粒子の110Sに対して66Sである。MyersおよびCarterによって報
告された66S粒子は、完全なAAVゲノムを有するようであり、そしてDNa
seIに対して感受性を有していた。
*CPはクレアチンリン酸、CPKはクレアチンホスホキナーゼ。
本明細書において言及されている刊行物および特許出願の全ては、各刊行物ま
たは特許出願が具体的且つ個別に参考として援用されているのと同程度に、参考
として本明細書に援用される。
これで本発明を完全に記載したが、添付の請求の範囲の主旨あるいは範囲から逸
脱することなく本発明に対して多数の変更および改変を行うことが可能であるこ
とは当業者には明らかである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ムジッカ,ニコラス
アメリカ合衆国 フロリダ 32608,ガイ
ネスビル,サウスウエスト 67ティーエイ
チ ドライブ 9837
(72)発明者 ゾロツキン,サーゲイ
アメリカ合衆国 フロリダ 32608−2580,
ガイネスビル,サウスウエスト 34ティー
エイチ ストリート ナンバー59 3611
(72)発明者 ニ,テイファ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ
02148,マルデン,ケネディ ドライブ
252,アパートメント 212
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.受容哺乳類細胞に形質導入し得るAAV粒子内にDNA基質をインビトロパ ッケージする方法であって、 (a)AAV複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、AAVカプシドおよび Rep遺伝子コード配列を持つdAAVベクターでトランスフェクトする工程と 、 (b)該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 (c)該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 (d)該抽出物を該DNA基質と合わせる工程と、 (e)該DNA基質のパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 を包含する方法。 2.前記インキュベーション工程の後に、前記ヘルパーウィルスを不活性化する のに十分な温度で十分な時間前記抽出物を加熱する工程をさらに包含する、請求 項1に記載の方法。 3.前記加熱工程の後に、前記抽出物をクロロホルムで抽出する工程をさらに包 含する、請求項2に記載の方法。 4.前記DNA基質がAAV末端反復配列を有する、請求項1に記載の方法。 5.前記DNA基質が、GM−CSF、G−CSF、M−CSF、IL−2、I L−3、IL−7、IL−13、NGF、CNTF、BDNF、チロシンヒドロ ラーゼ、ドパデカルボキシラーゼ、因子XIIIおよび因子IXからなる群より 選択される1つ以上の遺伝子またはコード配列を含む、請求項1に記載の方法。 6.前記dAAVベクターがpIM45である、請求項1に記載の方法。 7.前記ヘルパーウィルスがアデノウィルスである、請求項1に記載の方法。 8.前記ヘルパーウィルスがアデノウィルス5である、請求項7に記載の方法。 9.前記哺乳類宿主細胞培養物がヒト細胞培養物である、請求項1に記載の方法 。 10.前記哺乳類宿主細胞培養物がヒト293細胞である、請求項9に記載の方 法。 11.前記パッケージングを促進する条件が、 約7mMのMgCl2と、それぞれ約0.1mMのdATP、dCTP、dG TPおよびdTTPと、約4mMのATPと、それぞれ約0.2mMのCTP、 UTPおよびGTPと、約40mMのクレアチンリン酸と、約37.5ug/m lのクレアチンホスホキナーゼと、約0.10〜100ug/mlの基質DNA と、約0.5容量の前記抽出物と、約30mMのpH約7.5のヘペス緩衝液と を含む、請求項1に記載の方法。 12.(a)AAV複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、AAVカプシドお よびRep遺伝子コード配列を持つdAAVベクターでトランスフェクトする工 程と、 (b)該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 (c)該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 (d)該抽出物を該DNA基質と合わせる工程と、 (e)該基質DNAのパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 を包含する方法によって調製される、受容哺乳類細胞に形質導入し得るAAV粒 子。 13.(a)AAV複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、AAVカプシドお よびRep遺伝子コード配列を持つdAAVベクターでトランスフェクトする工 程と、 (b)該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 (c)該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 (d)該抽出物を該DNA基質と合わせる工程と、 (e)該基質DNAのパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 (f)該ヘルパーウィルスを不活性化するのに十分な温度で十分な時間該抽出 物を加熱する工程と、 を包含する方法によって調製される、受容哺乳類細胞に形質導入し得るAAV粒 子。 14.(a)AAV複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、AAVカプシドお よびRep遺伝子コード配列を持つdAAVベクターでトランスフェクトする工 程と、 (b)該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 (c)該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 (d)該抽出物を該DNA基質と合わせる工程と、 (e)該基質DNAのパッケージングを促進する条件下で該抽出物をインキュ ベートする工程と、 (f)該ヘルパーウィルスを不活性化するのに十分な温度で十分な時間該抽出 物を加熱する工程と、 (g)該抽出物をクロロホルムで抽出する工程と、 を包含する方法によって調製される、受容哺乳類細胞に形質導入し得るAAV粒 子。 15.受容哺乳類細胞に形質導入する方法であって、該受容哺乳類細胞を請求項 12に記載のAAV粒子に感染させる工程を包含する方法。 16.受容哺乳類細胞に形質導入する方法であって、該受容哺乳類細胞を請求項 13に記載のAAV粒子に感染させる工程を包含する方法。 17.受容哺乳類細胞に形質導入する方法であって、該受容哺乳類細胞を請求項 14に記載のAAV粒子に感染させる工程を包含する方法。 18.前記受容哺乳類細胞が、1次細胞、細胞株、組織および生体からなる群よ り選択される、請求項16に記載の方法。 19.前記受容哺乳類細胞が、1次細胞、細胞株、組織および生体からなる群よ り選択される、請求項17に記載の方法。 20.受容哺乳類細胞に形質導入し得るAAV粒子内にDNA基質をインビトロ でパッケージし得る組成物を調製する方法であって、 (a)AAV複製を許容する哺乳類宿主細胞培養物を、AAVカプシドおよび Rep遺伝子コード配列を持つdAAVベクターでトランスフェクトする工程と 、 (b)該宿主細胞培養物をヘルパーウィルスに感染させる工程と、 (c)該トランスフェクション工程および該感染工程の後に、該トランスフェ クトされた細胞培養物から抽出物を調製する工程と、 を包含する方法。 21.請求項20に記載の方法によって調製される組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/476,018 US5688675A (en) | 1995-06-07 | 1995-06-07 | In vitro packaging of adeno-associated virus DNA |
US08/476,018 | 1995-06-07 | ||
PCT/US1996/009263 WO1996040270A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | In vitro packaging of adeno-associated virus dna |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11512923A true JPH11512923A (ja) | 1999-11-09 |
JP3944240B2 JP3944240B2 (ja) | 2007-07-11 |
Family
ID=23890161
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50162197A Expired - Fee Related JP3944240B2 (ja) | 1995-06-07 | 1996-06-05 | アデノ関連ウイルスdnaのインビトロパッケージング |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5688675A (ja) |
EP (1) | EP0836484B1 (ja) |
JP (1) | JP3944240B2 (ja) |
AT (1) | ATE336588T1 (ja) |
AU (1) | AU706266B2 (ja) |
CA (1) | CA2222534A1 (ja) |
DE (1) | DE69636456T2 (ja) |
WO (1) | WO1996040270A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020502997A (ja) * | 2016-11-04 | 2020-01-30 | バクスアルタ インコーポレイテッド | アデノ随伴ウイルスの精製法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020037867A1 (en) * | 1999-02-26 | 2002-03-28 | James M. Wilson | Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy |
JP2008503215A (ja) * | 2004-06-18 | 2008-02-07 | ザ ユニバーシティー オブ モンタナ | Aav媒介性の蝸牛細胞への遺伝子送達 |
CN103476399A (zh) * | 2011-04-18 | 2013-12-25 | 独立行政法人国立精神·神经医疗研究中心 | 药剂递送粒子及其制造方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US5139941A (en) * | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
-
1995
- 1995-06-07 US US08/476,018 patent/US5688675A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-05 WO PCT/US1996/009263 patent/WO1996040270A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-05 DE DE69636456T patent/DE69636456T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-05 CA CA002222534A patent/CA2222534A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-05 AU AU60947/96A patent/AU706266B2/en not_active Ceased
- 1996-06-05 AT AT96918243T patent/ATE336588T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-05 EP EP96918243A patent/EP0836484B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-05 JP JP50162197A patent/JP3944240B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020502997A (ja) * | 2016-11-04 | 2020-01-30 | バクスアルタ インコーポレイテッド | アデノ随伴ウイルスの精製法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU6094796A (en) | 1996-12-30 |
US5688675A (en) | 1997-11-18 |
DE69636456T2 (de) | 2007-04-19 |
EP0836484B1 (en) | 2006-08-16 |
ATE336588T1 (de) | 2006-09-15 |
DE69636456D1 (de) | 2006-09-28 |
EP0836484A4 (en) | 2002-03-27 |
JP3944240B2 (ja) | 2007-07-11 |
AU706266B2 (en) | 1999-06-10 |
WO1996040270A1 (en) | 1996-12-19 |
EP0836484A1 (en) | 1998-04-22 |
CA2222534A1 (en) | 1996-12-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5741683A (en) | In vitro packaging of adeno-associated virus DNA | |
US5688676A (en) | In vitro packaging of adeno-associated virus DNA | |
US5677158A (en) | In vitro packaging of adeno-associated virus DNA | |
US7439065B2 (en) | Helper virus-free AAV production | |
US6040183A (en) | Helper virus-free AAV production | |
US5622856A (en) | High efficiency helper system for AAV vector production | |
JP4108746B2 (ja) | ヘルパーウイルスを含まないaav産生 | |
Chiorini et al. | Cloning and characterization of adeno-associated virus type 5 | |
JP4573437B2 (ja) | アデノ随伴ウイルス血清型1核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞 | |
JP2655771B2 (ja) | 組換えアデノ随伴ウイルスベクター | |
EP0842287B1 (en) | High efficiency helper system for aav vector production | |
JP2001520050A (ja) | 遺伝子供給ベクター類及びそれらの使用 | |
US7091029B2 (en) | High titer recombinant AAV production | |
Shull et al. | Genomic clones of bovine parvovirus: construction and effect of deletions and terminal sequence inversions on infectivity | |
Su et al. | Differential suppression of the tumorigenicity of HeLa and SiHa cells by adeno-associated virus | |
JP3944240B2 (ja) | アデノ関連ウイルスdnaのインビトロパッケージング | |
US5627048A (en) | Aedes aegypti densovirus expression system | |
US20210340503A1 (en) | Recombinant aav production in mammalian cells | |
Conway | Herpes simplex virus type I based systems for the large scale production of recombinant adeno-associated virus type 2 vectors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060328 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20060627 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070313 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070409 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |