CN103476399A - 药剂递送粒子及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于开发和提供一种在保持病毒的初期感染活性的状态下在中空衣壳内简便地含有核酸、肽和/或低分子化合物的方法。提供一种药剂递送粒子的制造方法，其包含在含有0.1～20%的表面活性剂的溶液中混合中空衣壳或中空粒子和含有核酸、肽和/或低分子化合物的药剂的工序和将得到的混合液在-5～50℃下保持并将所述药剂导入中空衣壳或中空粒子内的工序。

Description

药剂递送粒子及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种药剂递送粒子及其制造方法以及含有该药剂递送粒子作为有效成分的药物组合物。
背景技术
为了向细胞、组织或个体导入目标基因并使其表达，开发有各种基因导入技术。利用了病毒的感染能力及复制能力的病毒载体也是其中之一，已知有源自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒等的各种载体。其中，近年来，腺伴随病毒载体在基因治疗中作为有用的基因导入载体备受期待。
腺伴随病毒(AAV；Adeno-Associated Virus，以下，在本说明书中，用“AAV”表示。)为属于细小病毒的非病原性的病毒，由于缺失自复制能力，因此，无法自律性增殖，增殖需要需要腺病毒及疱疹病毒的共感染，因此，感染性低。另外，也具有在宿主中免疫原性低的性质。根据这样的特征，作为基因导入的载体，具有安全性高这样的优点。另外，也开发有一种由于宿主范围宽可感染各种细胞，并且源自1～9型的各血清型AAV的载体(非专利文献1)，因此，应用各自的血清型中的感染靶细胞的特异性，可以在神经细胞、肌肉细胞、肝细胞等特定的细胞、组织及器官中进行基因表达。
但是，以AAV为代表的现有的病毒载体相对于给药个体均存在如下各种问题：在体内的基因表达的短暂性、野生型病毒混入的可能性、基因表达和其作用的表达需要时间、无法植入较大的基因、出现副反应时需要控制表达的机制等等。
为了解决上述问题，Samulski等提倡使用AAV衣壳的表达质粒使衣壳表达并将其用作药剂的递送载体(非专利文献2)。在衣壳内部不含病毒基因组的空衣壳、即中空衣壳具有靶细胞的特异性识别、吸附、侵入、脱壳等病毒的初期感染活性，但完全不具有源自病毒的基因，因此，不具有病毒的增殖活性。因此，中空衣壳可成为兼备药剂的靶细胞特异递送性和相对于给药个体的安全性的理想的药剂递送系统(DDS；Drug Delivery System)的载体。因此，为了将中空衣壳用作DDS的载体，向衣壳内部导入目标药剂的技术非常重要。
Samulski等出示有一种将中空衣壳在尿素、热或pH的条件下暂时变性，将药剂植入内部后进行再构成的导入方法(非专利文献2)。但是，若使尿素等变性剂作用于衣壳，则存在如下问题：衣壳所具有的初期感染活性消失，无法作为递送载体发挥作用。结果是，在保持衣壳的初期感染活性的状态下将作为递送物质的药剂导入中空衣壳的技术从提倡开始经过7年以上的现在也仍然未被确立。例如，在专利文献1中提出AAV中空粒子作为递送载体的有用性，但关于将中空衣壳用作递送载体的具体的实例没有任何记载。因此，该领域从业人员等认为Samulski提倡的技术是不可能实现的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特愿2005-314476
非专利文献
非专利文献1:Okada T.and Takeda S.,Gene therapy for Duchennemuscular dystrophy.in A Guide to Human Gene Therapy(ed.by Roland W.Herzog and Sergei Zolotukhin),World Scientific,NJ.2010,5(1),pp113-123.
非专利文献2:Samulski,et al.,1995,Appl.No.:08/472;594
发明内容
发明要解决的问题
为了解决上述问题，本发明的目的在于，开发并提供一种在保持病毒的初期感染活性的状态下向中空衣壳导入核酸、肽和/或低分子化合物的方法。
另外，本发明的目的在于，提供一种通过所述方法制造的可以向靶细胞内特异性地递送目标药剂的药剂递送粒子。
进而，本发明的目的在于，开发并提供一种提高用于所述方法的源自AAV的中空衣壳的宿主细胞内生产效率的方法及病毒中空粒子的精制方法。
用于解决问题的手段
本发明人反复进行了潜心研究，结果成功地通过简便且有效的方法在维持病毒的初期感染活性的状态下向中空衣壳内部导入任意的核酸、肽和/或低分子化合物。另外，通过混合包含该药剂的衣壳和宿主细胞，也确认到可以将衣壳中所内包的药剂有效地导入该细胞内。进而，开发了一种增加宿主细胞内的中空衣壳的生产量的方法及中空衣壳的精制方法。本发明是基于这些见解而完成的，提供以下内容。
(1)一种由含有药剂的衣壳或被膜粒子构成的药剂递送粒子的制造方法，所述制造方法包含如下(a)及(b)：(a)在含有0.1～20%的表面活性剂的溶液中混合中空衣壳或中空粒子和药剂的工序；(b)将所述混合工序后的混合液在-5～50℃下保持并将药剂导入中空衣壳或中空粒子内的工序。
(2)根据(1)所述的制造方法，其中，在所述导入工序中将混合液保持5分钟～120分钟。
(3)根据(1)或(2)所述的制造方法，所述制造方法还包含(c)在所述导入工序后除去溶液中的表面活性剂的工序。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的制造方法，其中，表面活性剂为选自由Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、吐温20、吐温80、辛基β-葡糖苷、OTG、SDS、CHAPS、CHAPSO、及PEG和PPG的共聚物构成的组中的一种以上的表面活性剂。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的制造方法，其中，药剂为核酸、肽和/或低分子化合物。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的制造方法，其中，核酸为选自由功能性核酸、mRNA、mRNA片段以及含有任意的基因或其片段的载体构成的组中的一种以上的核酸。
(7)根据(6)所述的制造方法，其中，功能性核酸为选自由siRNA、miRNA、shRNA、核酸适体、反义DNA、U1接头、核酶、分子信标及核糖开关构成的组中的一种以上的核酸。
(8)根据(6)所述的制造方法，其中，载体选自由质粒、粘粒以及人工染色体构成的组。
(9)根据(1)～(8)中任一项所述的制造方法，其中，将中空衣壳或中空粒子进行修饰。
(10)根据(1)～(9)中任一项所述的制造方法，其中，中空衣壳或中空粒子具有对于特定的细胞的初期感染活性。
(11)根据(1)～(10)中任一项所述的制造方法，其中，中空衣壳源自腺病毒或腺伴随病毒。
(12)一种在衣壳或被膜粒子内含有药剂而成的药剂递送粒子，其中，所述药剂为不含该衣壳或被膜粒子所源自的病毒自身的基因的外源性的核酸、肽和/或低分子化合物。
(13)根据权利要求12所述的药剂递送粒子，其中，所述外源性的核酸为选自由功能性核酸、mRNA、mRNA片段以及含有任意的基因或其片段的载体构成的组中的一种以上的核酸。
(14)根据(13)所述的药剂递送粒子，其中，功能性核酸为选自由siRNA、miRNA、shRNA、核酸适体、反义DNA、U1接头、核酶、分子信标及核糖开关构成的组中的一种以上的核酸。
(15)根据(13)所述的药剂递送粒子，其中，载体选自由质粒、粘粒及人工染色体构成的组。
(16)根据(12)～(15)中任一项所述的药剂递送粒子，其中，将衣壳或被膜粒子进行修饰。
(17)根据(11)～(16)中任一项所述的药剂递送粒子，其中，衣壳源自腺病毒或腺伴随病毒。
(18)根据(11)～(17)中任一项所述的药剂递送粒子，其中，衣壳或被膜粒子具有对于特定的细胞的初期感染活性。
(19)一种药物组合物，所述药物组合物含有通过(1)～(11)中任一项所述的制造方法得到的药剂递送粒子和/或(12)～(18)中任一项所述的药剂递送粒子中的至少一种作为有效成分。
(20)根据(19)所述的药物组合物，所述药物组合物用于预防或者治疗疾病或者病症。
(21)一种中空衣壳或者被覆粒子或病毒粒子的精制方法，所述精制方法包含对生产中空衣壳或者被覆粒子或病毒粒子的宿主细胞的培养液和/或该宿主细胞的提取液进行加热的工序，其中，在加热温度为45℃以上且低于55℃的情况下，加热时间为10分钟～90分钟，或在加热温度为55℃以上且60℃以下的情况下，加热时间为3分钟～30分钟。
(22)一种腺伴随病毒生产能力增强细胞株的制造方法，所述制造方法包含向HEK293细胞株导入源自腺病毒的E1A基因区域、E1B19基因、E2A基因区域、E4orf6基因及编码VA RNA的基因的工序。
(23)根据(22)所述的制造方法，所述制造方法还含有选择稳定地表达导入的所有基因的细胞株的工序。
(24)根据(22)或(23)所述的制造方法，所述制造方法还含有导入源自人的Bcl-xL基因的工序、选择稳定地表达导入的Bcl-xL基因的细胞株的工序。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2011-092252号说明书和/或附图中所记载的内容。
发明效果
本发明的药剂递送粒子可以在保持病毒的初期感染活性的状态下包含核酸、肽和/或低分子化合物作为药剂。另外，根据本发明的药剂递送粒子，可以向靶细胞特异性地递送药剂。
根据本发明的药剂递送粒子的制造方法，可以不需要病毒基因而简便且有效地将目标药剂导入中空衣壳或中空粒子内。由此，可以提供一种安全性高，且具有靶细胞特异性的药剂递送粒子。
根据本发明的组合物，可以向给药个体的目标细胞内递送疾病预防用或者治疗用药剂、品种改良用药剂、或标记用药剂等。
根据本发明的细胞，可以增加每单位细胞的中空衣壳的产量。
根据本发明的中空衣壳的精制方法，可以在所述药剂递送粒子的制造方法中有效地除去杂质。
附图说明
图1是表示以不同的分量向HEK293细胞导入E1基因区域(包含E1A基因区域、E1B19k基因及E2A基因区域)表达质粒时的导入量和AAV生产量的关系的图；
图2是表示稳定地表达E1基因区域及Bcl-xL基因的HEK293EB细胞和正常HEK293细胞中的AAV的生产量的比较的图；
图3是表示荧光标记的吗啉代寡核苷酸向人横纹肌肉瘤细胞(RD)株的摄入的图。A表示未处理的RD株、B表示用远藤-波特交付试剂进行了处理的RD株、而且C表示用本发明的药剂递送粒子进行了处理的RD株。另外，D以及E分别表示用远藤-波特交付试剂进行处理及用药剂递送粒子进行处理后120小时的RD细胞的形态。图A以及B中的比例尺为50μm，另外，D以及E的比例尺为100μm；
图4是表示向AAV中空衣壳内的荧光标记吗啉代寡核苷酸的导入中的表面活性剂的浓度效果的图；
图5是表示荧光标记的9型AAV中空衣壳的肌肉细胞亲和性的图。A表示未肌肉分化诱导处理的人成纤维细胞(WI-38)株，B表示肌肉分化诱导处理后的WI-38株。图A以及B中的比例尺为100μm。
图6是表示通过本发明的方法进行了处理的AAV中空衣壳(AAV-EC)和由FITC标记siRNA、Alexa标记BSA或Alexa标记IgG构成的药剂递送粒子向人横纹肌肉瘤细胞(RD)株的摄入的图。在各栏中，最上面的图表示利用微分干涉显微镜(DIC)得到的RD细胞，中央的图表示FITC或Alexa发出的荧光，另外，最下面的图表示使用图像软件(Olympus DP Managerversion3.1.1.208)融合了前2个图的图。
具体实施方式
1.药剂递送粒子
1-1.概要
本发明的第一实施方式为药剂递送粒子。本发明的药剂递送粒子含有药剂和衣壳或被膜粒子作为构成因子，具有将内包的药剂导入宿主细胞内的能力。
1-2.构成
本发明的“药剂递送粒子”含有衣壳(1)或被膜粒子(2)和其中所包含的药剂(3)作为构成因子。下面，分别进行说明。
(1)衣壳
“衣壳(capsid)”为在病毒粒子(virion)中，由包围病毒核酸或核心的多个单位蛋白质(壳粒：capsomere)构成的外皮(coat)或壳(shell)。在本说明书中，在仅标记为“衣壳”的情况下是指该结构体。另外，在衣壳中，将仅由在其内部不含任何病毒核酸、核心或其它的物质的衣壳蛋白构成的衣壳在本说明中称为“中空衣壳(empty capsid)”。与此相对，将其内部含有病毒核酸或核心的衣壳称为“核衣壳(nucleocapsid)”。
本发明的药剂递送粒子的衣壳只要根据应用药剂递送粒子的生物种进行选择即可。例如在将应用的生物种设为动物的情况下，使用源自动物病毒的衣壳即可，在设为植物的情况下，使用源自植物病毒的衣壳即可，而且在设为细菌的情况下，使用源自噬菌体的衣壳即可。优选为源自动物病毒或源自植物病毒的衣壳。
在衣壳为源自动物病毒的情况下，动物病毒可以为RNA病毒组或DNA病毒组。具体而言，例如若为RNA病毒，则可以为源自属于反转录病毒科、微小病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠孤病毒科或双核糖核酸病毒科的任一病毒的衣壳。另外，若为DNA病毒，则可以为源自属于腺病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、虹彩病毒科、嗜肝病毒科、圆环病毒科、细小病毒科或乳多空病毒科的任一病毒的衣壳。属于RNA病毒组的逆转录病毒科的病毒、属于DNA病毒组的腺病毒科、属于细小病毒科或疱疹病毒科的病毒可优选用作上述衣壳的来源病毒。逆转录病毒科的肿瘤病毒、慢病毒或者泡沫病毒、腺病毒科的腺病毒、或细小病毒科的AAV可特别优选用作上述衣壳的来源病毒。
在衣壳为源自植物病毒的情况下，植物病毒也可以为RNA病毒组或DNA病毒组。具体而言，例如若为RNA病毒，则可以为源自属于纤细病毒属、烟草花叶病毒组、马铃薯Y病毒科、香石竹病毒组、雀麦草花叶病毒组、黄瓜花叶病毒组、弹状病毒科、呼肠孤病毒科或潜隐病毒组的任一病毒的衣壳。另外，若为DNA病毒，则可以为源自花椰菜病毒属、杆状DNA病毒属或双生病毒属的任一病毒的衣壳。
构成衣壳的壳粒可以在能够构成衣壳的范围内含有氨基酸突变。在此所谓的“突变”是指在构成壳粒的氨基酸序列中，1～多个氨基酸置换、缺失、附加或插入。在氨基酸置换的情况下，优选类似氨基酸间的置换。“类似氨基酸”是指在将氨基酸基于电荷、侧链、极性、芳香族性等性质进行分类的情况下，属于同一集团的氨基酸。作为这样的集团，例如可以举出：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸组(天冬氨酸、谷氨酸)、非极性氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、极性无电荷氨基酸组(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、酪氨酸、半胱氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、酪氨酸)、异节环状氨基酸组(组氨酸、色氨酸、脯氨酸)、脂肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)。
在本说明书中，衣壳包含后述的药剂，作为将其向靶细胞内递送的递送载体发挥作用。若大致区分衣壳，则已知有正20面体型和螺旋型，但本发明的药剂递送粒子的衣壳可以为任一形态，只要包含药剂。
在本发明的药剂递送粒子由后述的未缠绕囊膜的裸衣壳构成的情况下，该衣壳自身具有病毒原本具有的初期感染活性。
在本说明书中，“感染”是指如下一系列过程：在病毒的生活周期中，病毒粒子吸附(adsorption)于宿主细胞的细胞表面，使其在宿主细胞内增殖后，向细胞外放出(release；不具有囊膜的裸衣壳的情况)或出芽(budding；具有囊膜的衣壳、即后述的被膜粒子的情况)。所谓“初期感染”是指病毒粒子向宿主细胞的侵入阶段。具体而言，是指病毒向宿主细胞表面的吸附、向宿主细胞内的侵入(penetration)及宿主细胞内的衣壳的破坏引起的脱壳(uncoating)。与此相对，“后期感染”是指病毒感染中的增殖阶段，具体而言，例如是指在宿主细胞内游离的病毒基因的转录或病毒基因的逆转录、通过向作为原病毒的宿主染色体植入后的转录、病毒蛋白质的翻译、病毒核酸的复制、利用壳粒形成的衣壳的构建和向病毒核酸向衣壳内的包装、及子代病毒粒子从宿主细胞的放出或出芽。
上述吸附可通过衣壳表面上的蛋白质识别在宿主细胞的细胞表面露出的受体作为靶分子并吸附于该受体来实现。因此，衣壳的宿主细胞的特异性可通过宿主细胞上有无受体来确定。例如，以CD4作为受体的人免疫缺陷病毒(HIV)以在细胞表面具有CD4的辅助性T细胞作为靶细胞。因此，为了对本发明的药剂递送粒子赋予靶细胞的特异性，只要使用可识别、吸附靶细胞所具有的受体的病毒的衣壳即可。如上述的例子所述，在要将本发明的药剂递送粒子的靶细胞特定为辅助性T细胞的情况下，只要将识别、吸附存在于辅助性T细胞的细胞表面的受体CD4蛋白质的HIV的衣壳作为药剂递送粒子的构成因子即可。简言之，本发明的药剂递送粒子的特征在于，利用中空衣壳或后述的中空粒子原本具有的靶细胞特异性递送活性，将其内部所包含的目标药剂递送至该靶细胞内。
衣壳可以进行修饰。在此所谓的修饰包含功能上的修饰或标记上的修饰。“功能上的修饰”是指在使衣壳和其靶细胞间的特异性结合活性增强或稳定化方面有用的修饰。例如可以举出：糖基化、去糖基化、PEG化。“标记上的修饰”是指在体内检测药剂递送粒子或其靶细胞方面有用的修饰。例如可以举出：利用荧光色素(荧光素、FITC、若丹明、得克萨斯红、Cy3，Cy5、Alexa Fluor公司(注册商标))、荧光蛋白(例如、PE、APC、GFP、Venus、YFP、DsRed，Sirius)、酶(例如、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、放射性同位素(例如3H、14C、35S)或生物素或者链霉亲和素的标记。衣壳的修饰没有特别限定，只要为可对蛋白质进行修饰，且不会对衣壳所具有的病毒的初期感染活性造成影响的方法。另外，也可以使用是市售的修饰试剂盒。例如可以举出：Alexa Fluor 568蛋白标记试剂盒(A10238)(Molecular Probes公司)。
(2)被膜粒子
在本说明书中，“被膜粒子”是指缠绕了囊膜的衣壳。另外，在本说明书中，在被膜粒子中，将缠绕了囊膜的中空衣壳称为“中空粒子”。以后，在本说明书中，将衣壳及被膜粒子总称为“衣壳等”，将中空衣壳及中空粒子总称为“中空衣壳等”。
“囊膜(envelope)”为存在于衣壳的外侧的外被，一部分病毒具有。由脂质双层膜构成，到处嵌入有被称为突起蛋白或囊膜蛋白的源自病毒的糖蛋白。囊膜的脂质双层膜为病毒在从宿主细胞出芽时缠绕了宿主细胞的细胞质膜或核膜的一部分的膜，源自宿主细胞。
在本发明的药剂递送粒子中，被膜粒子为根据用于本发明的药剂递送粒子的衣壳的来源病毒种进行加入的选择性构成因子。即，在用于本发明的药剂递送粒子的衣壳的来源病毒为原本具有囊膜的种类的情况下，作为原则成为必需的构成因子。在原本具有囊膜的病毒种中，通常囊膜担负向宿主细胞的初期感染活性中的吸附及侵入的功能。作为这样的病毒种的具体例，例如可以举出：正粘病毒科的流感病毒、疱疹病毒科的单纯疱疹病毒、及逆转录病毒科的HIV。另一方面，在即使为如腺病毒或AAV那样原本不具有囊膜的病毒种或原本具有囊膜的病毒种，仅衣壳中也具有全部初期感染活性的病毒种的情况下，囊膜只要根据需要适宜选择即可。
在本发明的药剂递送粒子由被膜粒子构成的情况下，被膜粒子的囊膜在其自身原本具有的病毒的初期感染活性中，至少具有吸附活性及侵入活性。另一方面，被膜粒子的衣壳在初期感染活性中，只要至少具有脱壳活性即可。
被膜粒子的囊膜中所嵌入的病毒糖蛋白可以具有突变，另外，也可以进行修饰。
(3)药剂
在本说明书中，“药剂”为本发明的药剂递送粒子中所内包的递送物质，具体而言，其为核酸、肽、低分子化合物或其组合。药剂可对靶细胞及应用的生物体造成生物学、物理学或化学效果。对生物学效果而言，例如可以举出：靶基因表达的增强或者抑制等基因表达控制、蛋白质的功能控制、免疫激活或者免疫抑制等免疫系统控制或细胞或者生物体的生理功能的控制。对物理学或化学效果而言，例如可以举出：衣壳等或药剂在标记的靶细胞的生物体内的成像(例如，FITG、GFP、X射线、PET、MRI或CT成像)或跟踪效果。下面，对各自的药剂进行说明。
(a)核酸
在本说明书中，“核酸”包含天然型核酸、化学修饰核酸、人工核酸、核酸类似物及它们的组合。
“天然型核酸”是指仅自然界存在的天然型核苷酸连结而成的DNA及RNA。但是，本实施方式的天然型核酸为不含构成药剂递送粒子的衣壳的来源病毒自身的基因的全部或其一部分的外源性的核酸。“含有来源病毒的基因的全部或一部分的核酸”例如相对于来源病毒的病毒核酸或基于来源病毒的基因构建的病毒载体。
“化学修饰核酸”是指人工进行化学修饰的核酸。例如可以举出：甲基膦酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸酯型DNA/RNA、氨基磷酸酯型DNA/RNA、2′-O-甲基型DNA/RNA等。
“人工核酸”是指对天然型核酸的一部分仅连结含有非天然型核苷酸的核酸或非天然型核苷酸而成的核酸。在此所谓的“非天然型核苷酸”是指具有与上述天然型核苷酸类似的形式和/或结构的人工构建的人工进行化学修饰的自然界不存在的核苷酸。
“核酸类似物”是指具有与天然型核酸类似的结构和/或性质的人工构建的高分子化合物。例如可以举出：肽核酸(PNA：Peptide Nucleic Acid)、具有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、交联化核酸(BNA/LNA：Bridged NucleicAcid/Locked Nucleic Acid)、吗啉代核酸(包含吗啉代寡核苷酸)等。
核酸可以根据需要标记磷酸基、糖和/或碱基。标记可以利用该领域中公知的标记物质。例如可以举出：放射性同位元素(例如，32P、3H、14C)、DIG、生物素、荧光色素(例如，FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA)、或发光物质(例如，吖啶酯)。
作为药剂递送粒子中所包含的核酸的具体例，可以举出：功能性核酸、包含任意的基因的载体、mRNA或者其片段、或其组合。
“功能性核酸”是指在生物体内或细胞内、优选在细胞内具有特定的生物学功能、例如酶功能、催化功能或生物学抑制或者增强功能(例如，转录、翻译的抑制或增强)的核酸。具体而言，例如可以举出：RNA干扰剂、核酸适体(包含RNA适体及DNA适体)、反义DNA、核酶(包含脱氧核酶)、U1接头、分子信标、核糖开关、或转录因子结合区域等。特别是RNA干扰剂可以优选用作药剂递送粒子的药剂。在此，“RNA干扰剂”是指在生物体内诱导RNA干扰(RNA inteference：RNAi)，可以通过靶基因的转录产物的分解来抑制其基因的表达(沉默)的物质。例如可以举出：siRNA(smallinterfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)或miRNA(micro RNA)(包含pri-miRNA及pre-miRNA)。RNA干扰剂虽然确认到基因表达的抑制效果和其有用性，但裸RNA分子在生物体内受到核酸酶的分解从而不稳定，因此，未充分确立向靶细胞内递送的有效的方法。但是，根据本发明的药剂递送粒子，药剂被保护在衣壳内，因此，在生物体内给药后也可以避免核酸酶等的分解直至递送至靶细胞内。药剂递送粒子可以在中空内衣壳等内含有2种以上功能性核酸。
“载体”例如包含病毒载体、质粒、粘粒及人工染色体。人工染色体包含人类人工染色体(HAC;Human Artificial Chromosome)、酵母人工染色体(YAC;Yeast Artificial Chromosome)、细菌人工染色体(BAC;BacterialArtificial Chromosome)、及P1来源的人工染色体(PAC;P1-derived ArtificialChromosome)。优选为HAC。如上所述，病毒载体不含基于衣壳的来源病毒的基因构建的病毒载体。
各载体可以含有构成药剂递送粒子的衣壳的来源病毒基因以外的任意的基因或其片段。例如可以举出：转录因子、信号传递因子、编码细胞外分泌性蛋白质或酶的基因、或具有这些活性的片段。所包含的基因可以为野生型基因或突变基因。另外，可以包含含有不同的基因的二种以上的载体作为药剂。
在本发明的药剂递送粒子中，优选在可在靶细胞内表达基因或其片段的状态下包含各载体。在此，“可表达的状态”是指以载体中所含的基因或其片段可在靶细胞内表达的方式在核酸表达系统内的启动子和终止子的控制下进行配置。“核酸表达系统”是指在可发挥功能的状态下具有一组基因的表达所需要的表达调节元件的体系。除启动子和终止子以外，表达调节元件中根据需要包含增强子及聚A附加信号。
启动子需要可在导入有核酸的靶细胞内工作。因此，优选源自应用药剂递送粒子的生物种或其近缘种的启动子。例如，若为以对人的给药为目的的药剂递送粒子，则启动子优选源自人。启动子根据表达模式已知有过量表达型启动子、构成性启动子、部位特异性启动子、阶段特异性启动子、或诱导性启动子等，药剂递送粒子也可以使用任一启动子。只要根据导入的细胞内的期望的表达模式适宜选择即可。
终止子没有特别限定，只要为可以终止通过所述启动子转录的基因的转录的序列。优选为源自与启动子同一生物种的终止子，更优选为在启动子所来源的生物种的基因组上与该启动子成组而成的终止子。
增强子没有特别限定，只要可以增强载体内的基因或其片段的表达效率。优选为源自与启动子同一生物种的终止子。
作为具有如上所述的构成的核酸表达系统的具体例，可以举出表达载体。
另外，各载体也可以含有用于确认将作为药剂的核酸递送至靶细胞内的选择或标记基因。对标记或者选择标记基因而言，例如可以举出：耐药性基因、荧光或发光报告基因(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、或GFP)或酶基因。
进而，本发明的药剂递送粒子也可以含有编码任一的蛋白质的“mRNA”或其片段。mRNA也可以为mRNA前体或成熟mRNA中的任一种。优选为成熟mRNA。另外，mRNA或其片段可以在5’末端含有m7G帽子结构，和/或在3’末端含有聚A链。mRNA编码的蛋白质野生型或突变型均可。
核酸的尺寸没有限定，只要为可包含在衣壳中的尺寸，衣壳的内容量根据来源病毒的种类而不同，因此，所包含的核酸的碱基数也受衣壳的来源病毒种控制。通常为50kb以下，优选为20kb以下，更优选为10kb以下，进一步优选为5kb以下。
(b)肽
本说明书中的肽也包含寡肽、多肽中的任一种。作为寡肽的具体例，可以举出：肽激素及多肽片段。作为多肽具体例，可以举出抗体、转录因子、信号传导因子、酶。
抗体例如包含单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、合成抗体、抗体片段。
在抗体为多克隆抗体或单克隆抗体的情况下，免疫球蛋白分子可以为任意的类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及IgY)或任意的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。在使用单克隆抗体或多克隆抗体作为药剂的情况下，抗体优选为与给药药剂递送粒子的生物种同种来源的抗体。例如在对人给药药剂递送粒子的情况下，作为药剂的单克隆抗体或多克隆抗体优选为人抗体。
所谓“重组抗体”是指嵌合抗体、人源化抗体或多重特异性抗体。所谓“嵌合抗体”为组合源自不同的动物的抗体的氨基酸序列而制作的抗体，是将某种抗体的恒定区(C区)用其它的抗体的C区置换的抗体。例如，将小鼠单克隆抗体的C区置换为人抗体的C区而成的抗体符合。由此，可以减少相对于人体内的该抗体的免疫反应。所谓“人源化抗体”为将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的V区中的互补决定区(CDR)和人抗体的CDR置换而成的镶嵌抗体。所谓“多重特异性抗体”是指在多价抗体、即在一分子内具有多个抗原结合部位的抗体中，各个抗原结合部位与不同的表位结合的抗体。例如可以举出：在如IgG那样具有2个抗原结合部位的抗体中，各个抗原结合部位与不同的表位结合的双重特异性抗体(双特异抗体)。
所谓“合成抗体”是指通过使用化学或重组DNA法来合成的抗体。例如可以举出：使用重组DNA法重新合成的抗体。具体而言，例如可以举出：单链抗体(scFv：single chain Fragment of variable region)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)或四链抗体(tetrabody)等。
所谓“抗体片段”，例如Fab、F(ab’2)、Fv等符合。
肽可以进行修饰。肽的修饰包含功能上的修饰或标记上的修饰。功能的修饰例如包含糖基化、乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化、或PEG化等。标记上的修饰可以举出：利用荧光色素(荧光素、FITC、若丹明、得克萨斯红、Cy3、Cy5、)、荧光蛋白(例如PE、APC、GFP、)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、放射性同位元素(例如3H、14C、35S)或生物素或者链霉亲和素的标记。
肽的尺寸没有限定，只要为可包含在衣壳中的尺寸。通常，衣壳的内容量根据来源病毒的种类而不同，另外，即使为相同氨基酸数的肽，根据其立体结构的不同能否向衣壳内部导入也有不同，因此，只要考虑这些情况适宜确定即可。通常为500kDa以下，优选为100kDa以下，更优选为80kDa以下，进一步优选为50kDa以下。
(c)低分子化合物
在本说明书中，“低分子化合物”为分子量5000以下、优选2000以下、更优选1000以下的化合物，上述核酸及肽以外的物质符合。例如可以举出：激素(例如雄激素、雌激素、孕酮、醛甾酮、皮质醇等类固醇激素)、神经递质(例如，肾上腺素、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺)、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂及免疫抑制剂等各种医药化合物等。另外，也包含具有与特定的低分子化合物同等的药理活性的低分子化合物的衍生物或其盐。
1-3.效果
根据本发明的药剂递送粒子，由于不含如病毒载体之类的病毒来源的基因，因此，应用后的安全性高，且可以包含以往难以向衣壳内导入的肽或低分子化合物作为药剂。另外，可以通过基于构成药剂递送粒子的衣壳或囊膜的血清型的靶细胞特异性递送活性来向特定的细胞内递送药剂。
本发明的药剂递送粒子通过作为构成因子的衣壳等而具有病毒向宿主细胞的侵入阶段且初期感染活性，但由于未包含含有衣壳等的来源病原的全部或一部分基因的核酸，因此，缺失病毒的增殖阶段即后期感染性。因此，通过应用本发明的药剂递送粒子，可将内包的药剂经由内吞作用或膜融合递送至靶细胞内，不存在伴随靶细胞内的病毒粒子的增殖的靶细胞的生理功能的失败及伴随病毒粒子自宿主细胞的放出或出芽的宿主细胞的细胞膜的损伤。因此，可以在不对细胞的功能造成影响的情况下进行各种分子及基因的功能分析。
2.药剂递送粒子的制造方法
2-1.概要
本发明的第二实施方式为药剂递送粒子的制造方法。
如上所述，使AAV的中空衣壳表达并将其用作药剂的递送载体的想法在以往就已存在，但在保持病毒的初期感染活性的状态下将作为递送物质的药剂导入中空衣壳的技术迄今为止尚未确立。根据本制造方法，可以在维持中空衣壳等的病毒的初期感染活性的状态下通过简便的方法向其内部导入药剂来制造第一实施方式的药剂递送粒子。
2-2.制造方法
本发明的制造方法包含(1)混合工序及导入工序(2)。进而，可以根据需要包含除去工序(3)。以下，对各工序具体地进行说明。另外，在本制造方法中，为了防止污染(汚染)等，优选在无菌条件下进行。
(1)混合工序
作为“混合工序”为在含有表面活性剂的溶液中混合中空衣壳等和药剂的工序。
中空衣壳等可以使用上述第一实施方式中记载的源自各病毒的衣壳等。对中空衣壳等的制备进行后述。本工序中使用的中空衣壳等优选精制处理后的衣壳。在以宿主细胞的蛋白质为代表的杂质混杂的情况下，在以下导入工程中药剂的导入效率降低。
药剂只要使用上述第一实施方式中记载的药剂即可。也可以在一个中空衣壳等中导入不同的2种以上的药剂。此时，只要在上述溶液中加入不同的2种以上的药剂即可。与第一实施方式不同，在本实施方式中，可以根据需要将使用的中空衣壳等来源病毒自身的基因的全部或其一部分用作药剂。例如，也可以将基于来源病毒的病毒核酸或来源病毒的基因而构建的病毒载体用于药剂。
本工序中使用的表面活性剂没有特别限定。例如可以为如TritonX-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、吐温20、吐温80、辛基-β-葡糖苷或OTG之类的非离子性表面活性剂、如PEG和PPG的共聚物之类的高分子非离子性表面活性剂、如SDS之类的阴离子性表面活性剂、如CHAPS或CHAPSO之类的两性离子性表面活性剂或它们的组合。优选为非离子性表面活性剂。
“包含表面活性剂的溶液”是指将上述表面活性剂溶解于适当的溶剂而成的溶液。对溶剂而言，例如可以举出：水(包含蒸馏水、无菌水、去离子水)、生理盐水或磷酸盐缓冲液。优选为水。溶液中的表面活性剂的浓度以容量%为0.1%～20%，优选为1%～20%，更优选为3%～18%，进一步优选为5%～15%。
在含有表面活性剂的溶液中混合的中空衣壳等和药剂的(容量比或质量比)只要根据导入中空衣壳等的药剂的种类适宜确定即可。
只要在含有表面活性剂的溶液中加入中空衣壳等及药剂后，根据需要用PBS等缓冲液调节分量，利用搅拌器或搅拌棒等进行搅拌使其充分混合来制备混合液即可。
(2)导入工序
所谓“导入工序”是指在规定的温度下保持上述混合工序后得到的混合液并将药剂导入中空衣壳等内的工序。
保持温度只要在-5～50℃的范围内即可。这是因为在低于-5℃的情况下，混合液结冰的可能性高，在高于50℃的情况下，中空衣壳等和/或药剂变性和/或失活的可能性高。优选为0～40℃或4～35℃。
混合液的保持时间没有限定，优选混合后5分钟～120分钟。这是因为若比5分钟短，则药剂的导入不充分，即使比120分钟长地进行保持，也无法期待导入效率增大。更优选为10分钟～90分钟或15分钟～60分钟。
在本工序中，只要将混合液在上述保持温度下静置上述保持时间即可。根据需要也可以轻轻地搅拌。
本工序中，在进行了表面活性剂处理的中空衣壳等内导入药剂，可得到本发明的药剂递送粒子。
(3)除去工序
所谓“除去工序”为在上述导入工序之后除去溶液中的表面活性剂的工序。本工序为选择工序，只要根据需要进行即可。
在本发明的药剂递送粒子的制造方法中，药剂向中空衣壳等的导入使用表面活性剂。药剂递送粒子可通过上述导入工序制造，但在含有药剂递送粒子的导入工序后的溶液中混杂有使用的表面活性剂。在将药剂递送粒子应用于生物体的情况下，该表面活性剂通常对生物体造成有害的影响。因此，在将所制造的药剂递送粒子用作后述的组合物的有效成分的情况下，优选在本工序中预先除去表面活性剂。
表面活性剂的除去方法只要使用可以从溶剂中除去表面活性剂的该领域中公知的方法即可，没有特别限定。例如可以举出：利用超滤膜的除去方法、使用利用透析膜或透析盒的透析操作的除去方法。药剂递送粒子的衣壳以及被膜粒子的大小通常为10nm以上。因此，通过使用细孔径比10nm小、即截流分子量100kMW以下的超滤膜使导入工序后的混合液流过，可以分离、除去导入工序后的溶液中的表面活性剂来回收药剂递送粒子。另外，中空衣壳等中所摄入的游离的药剂也根据其种类对应用有药剂递送粒子的生物体造成有害的影响。但是，根据该方法，可以同时分离、除去导入工序后的溶液中的游离的药剂，因此较为便利。另外，在使用超滤膜的方法中，无法除去导入工程中未摄入药剂的中空衣壳等。但是，中空衣壳等如上所述具有初期感染活性，但缺失后期感染活性，因此，即使混杂于药剂递送粒子也没有问题。
2-3.中空衣壳等的制备方法
本实施方式的混合工序中使用的中空衣壳等可以由被病毒感染的宿主细胞直接制备。另外，在出于仅得到中空衣壳的目的的情况下，也可以以重组衣壳的形式制备。
(由被病毒感染的宿主细胞制备的方法)
通常病毒在被病毒感染的宿主细胞内增殖，构建子病毒粒子时，同时形成中空衣壳等。因此，中空粒子等可以由被病毒感染的宿主细胞的提取液或病毒粒子的放出或者出芽后的培养液直接制备。此时，病毒也与中空衣壳等一起混杂在宿主细胞的提取液或培养液中。因此，优选从宿主细胞的提取液或培养液中分离病毒粒子或使其失活来精制中空衣壳等。这些只要采用公知的方法即可。例如，病毒粒子的分离和中空衣壳等的制备方法可以举出：使用氯化铯的密度梯度离心法及日本特开2007-117003中记载的使用离子交换膜的方法。
另一方面，如AAV的病毒无法自主性增殖，增殖原则上需要宿主细胞中的辅助病毒的共感染。因此，即使使辅助病毒未感染细胞感染这样的病毒，在该细胞内也不会增殖，可以不需要在宿主细胞提取后使病毒粒子失活或除去。因此，优选作为本发明的药剂递送粒子的制造方法中使用的中空衣壳的来源病毒。特别是对AAV自身还未知有病原性，因此，安全性高而更优选。在宿主细胞内生产源自不需要辅助病毒的病毒的中空衣壳等的情况下，需要使宿主细胞共感染辅助病毒或在宿主细胞内预先或同时表达辅助病毒的一部分基因(辅助基因)。
以下，作为一个例子，对由宿主细胞制备源自AAV的中空衣壳的方法进行说明。
在宿主细胞内使AAV增殖的情况下，自然需要AAV自身的基因。即，是编码参与AAV复制的Rep基因及衣壳蛋白的Cap基因以及位于这些基因的5′末端及3′末端的ITR(Inverted Terminal Repeat)。通过公知的转化或转染法将含有这些基因的表达载体等导入AAV可感染的任意的宿主细胞使AAV感染，由此，可以从感染的宿主细胞或其培养液中回收中空衣壳。从宿主细胞中回收中空衣壳的方法只要使用公知的方法即可。例如，只要通过后述的实施例中记载的方法从粉碎宿主细胞而得到的细胞提取液中回收即可。
另外，AAV的复制及增殖也可以利用内在有一部分腺病毒基因的宿主细胞。例如可以举出利用作为内在有腺病毒的E1A基因区及E1B19k基因(在本说明书中，常将它们总称为“E1基因区”。)的人胚胎肾细胞株(HumanEmbryonic Kidny Cell line)的HEK293细胞(在本说明书中，常略为“293细胞”)。在使用293细胞复制及增殖AAV的情况下，只要仅将作为辅助基因的腺病毒的E2A基因区域、E4orf6基因及编码VA RNA的基因导入293细胞即可，不需要导入E1基因区，因此，适于源自AAV的中空衣壳的生产。
为了提高单位宿主细胞的源自AAV的中空衣壳的生产效率，可以与上述辅助基因一起向293细胞进一步导入腺病毒的E1基因区来制备AAV生产能力增强细胞株。如上所述，293细胞由于已经包含腺病毒E1基因区域，因此，通常不需要导入E1基因区。但是，本发明人等发现，如后述的实施例1所示，在将E1基因区表达质粒与包含辅助基因等的其它的质粒同时导入293细胞的情况下，AAV的效价比仅导入辅助基因的293细胞进一步提高，AAV生产增强。该机制的详细情况尚未确定，推测是E1基因产物作为腺病毒初期基因的表达的主开关起作用(Matsushita,T.,等,2004,J.Gen.Virol.,85:2209-2214)，因此，E1基因区的细胞内表达量比正常293细胞内表达量增强，由此，腺病毒的下游的基因组的表达量进一步增强，作为结果，可由宿主细胞生产更多的源自AAV的中空衣壳。
上述AAV生产能力增强细胞株的制备可通过在分别可表达E1基因区、E2A基因区、E4orf6基因及编码VA RNA的基因的状态下，例如在插入于表达载体的状态下向293细胞导入来实现。也可以根据需要在将含有上述各基因或基因区的表达载体导入293细胞后，选择可稳定地表达由E1基因区、E2A基因区、E4orf6基因及编码VA RNA的基因构成的组中的一种以上的293细胞且利用该制备的新的细胞系列。
在使用上述AAV生产能力增强细胞株生产AAV的情况下，只要在可表达或起作用的状态下向该细胞株导入上述必要的AAV基因(Rep基因、Cap基因、ITR等)即可。
进而，可以将含有Bcl-xL基因的表达载体与上述含有E1基因区的表达载体一起导入宿主细胞的生物种中。根据现有的研究，已知Bcl-xL补充E1B19k基因的功能(Matsushita等、J.Gen.Virol.,2004,85:2209-2214)，如后述的实施例2所示，可以使E1基因区进一步活化。另外，Bcl-xL也具有抑制细胞死亡(细胞凋亡)的效果(Yamaguchi等，Gene Ther.,2003,10:375-85)，也可以抑制伴随基因导入操作的细胞毒性。
另外，也可以使用向293细胞导入E1基因区表达载体和/或Bcl-xL基因表达载体后，以可稳定地表达它们的方式线化（ライン化）的细胞株。例如可以举出后述的实施例2中记载的HEK293EB株等。
(以重组中空衣壳等的形式制备的情况)
在仅制备中空衣壳等的情况下，可以在适当的宿主细胞内表达含有期望的病毒的Cap基因的表达载体。例如，若需要AAV的重组中空衣壳等，则只要将含有期望的血清型AAV的Cap基因(具体而言，例如，若为1型，则为由SEQ ID NO:1所示的碱基序列构成的Cap基因，若为2型，则为由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的Cap基因、若为5型，则为由SEQ IDNO:3所示的碱基序列构成的Cap基因，若为6型，则为由SEQ ID NO:4所示的碱基序列构成的Cap基因，若为7型，则为由SEQ ID NO:5所示的碱基序列构成的Cap基因，若为8型，则为由SEQ ID NO:6所示的碱基序列构成的碱基序列构成的Cap基因，或若为9型，则为由SEQ ID NO:7所示的碱基序列构成的Cap基因)的核苷酸插入于适当的表达载体即可。在宿主细胞内表达Cap基因后，可以从粉碎其宿主细胞而得到的细胞提取液或其宿主细胞的培养液中得到重组中空衣壳等。从细胞提取液或培养液中的回收方法只要通过该领域中公知的方法进行即可。
在本方法中，不需要源自腺病毒的辅助基因，若使用可在宿主细胞内表达的表达载体，则也不论其种类。例如可以使用细菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞。此时，作为大肠杆菌用表达载体，例如只要利用pET21α系、pGEX4T系、pC118系、pC119系、pC18系、pC19系即可，作为源自枯草杆菌的表达载体，例如只要利用pUB110系、pTP5系即可，作为源自酵母的表达载体，例如只要利用YEp13系、YEp24系、YCp50系，作为昆虫细胞用表达载体，只要利用杆状病毒即可，作为动物细胞用表达载体，只要利用pC18系或pC19系的(例如pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)即可，作为植物细胞用表达载体，只要利用pRI系或者pGW系的双元载体等即可。这样的表达载体也可以从各制造商(Novagen公司、宝酒造、第一化学药品、Qiagen公司、Stratagene公司、Promega公司、Roche Diagnositics公司、Invitrogen公司、GeneticsInstitute公司、GE Healthcare公司等)获得。
上述Cap基因向表达载体的插入只要使用该领域中公知的重组基因技术进行即可。例如只要参考Sambrook,J.等,(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York等中记载的方法即可。
2-4.中空衣壳精制方法
细胞粉碎物中精制源自AAV的中空衣壳的方法只要基于该领域中公知的方法进行精制即可。例如可以通过作为一般的方法的铯密度梯度超离心法来精制。或者，使用了包含离子交换色谱的各种色谱的精制方法例如公开于日本专利第3313117、日本特表2000-510682、日本特表平11-511326、日本特表2001-513644、日本特表2001-514845号、或美国专利第6,593,123号等，也可以利用这些方法进行精制。进而，也可以利用日本特开2007-117003中所公开的使用离子交换膜分离、精制中空衣壳和病毒粒子的方法。
然而，利用铯密度梯度超离心法的精制方法由于中空衣壳等和病毒粒子的比重接近，因此，存在难以将两者充分分离的问题。上述使用了各种色谱法的精制方法由于使用微珠填充柱，因此，样品的扩散不充分，另外，样品向柱的吸附效率低，且柱的容积大，因此，存在吸附及洗脱耗费时间等精制效率方面的问题。进而，使用了离子交换膜的上述方法存在在精制后也较多地混入可溶性蛋白质等杂质的问题。
本发明人开发了一种通过将宿主细胞提取液或培养液在规定的温度下加热使混杂的可溶性蛋白质凝固来简便地除去可溶性蛋白质的新型精制方法。本精制方法不仅可用于中空衣壳等的精制，而且也可用于包含如病毒载体那样的病毒基因组的病毒粒子的精制。通过加热使可溶性蛋白质凝固并除去的方法为众所周知的方法，但在下述所示的温度及加热时间条件下进行中空衣壳等及病毒粒子的精制来除去可溶性蛋白质的方法迄今为止尚未得知。用于精制上述中空衣壳等及病毒粒子的规定的加热温度优选为45～60℃的范围。这是因为温度低于45℃时，可溶性性蛋白质的变性有可能不充分且不会凝固，另外，温度超过60℃时，目标中空衣壳等及病毒粒子有可能变性使病毒的初期感染活性失活。更优选的温度范围为48～58℃，进一步优选的温度范围为50～55℃。
另外，加热时间根据加热温度改变。例如，在加热温度为55～60℃的情况下，优选的加热时间为3分钟～30分钟，更优选为5分钟～20分钟，进一步优选为5分钟～10分钟。这是因为在55～60℃的范围内比30分钟更长地进行加热时，中空衣壳等有可能热变形使初期感染活性失活。另一方面，在加热温度为45℃以上且低于55℃的情况下，优选的加热时间为10分钟～90分钟，优选为15分钟～60分钟，进一步优选为20分钟～40分钟。这是因为在45℃以上且低于55℃的温度范围、短于10分钟的加热时间时，可溶性蛋白质的变性有可能不充分且不会凝固。因此，加热时间只要考虑加热温度在上述范围内适宜确定即可。
加热处理的方法没有特别限定。只要通过明火、热板、微波(微波炉)或感应加热(IH)、热水等对宿主细胞提取液或培养液进行加热即可。通过加热处理凝固或凝聚的可溶性蛋白质的除去可通过该领域中公知的方法进行。例如可以举出：通过离心使凝固蛋白质沉淀并回收上清液的方法或通过过滤除去凝固蛋白质的方法。也可以将通过本发明的加热处理精制中空衣壳等及病毒粒子的精制方法与上述的一种以上的公知精制方法组合。例如通过本发明的加热处理精制中空衣壳等及病毒粒子的精制方法对于除去作为杂质的可溶性蛋白质有效，但无法分离中空衣壳等和病毒粒子。但是，可以通过组合本发明的精制方法和例如上述日本特开2007-117003中记载的使用离子交换膜的方法来以高浓度仅精制中空衣壳。
2-5.效果
根据本发明的制造方法，可以在不丧失中空衣壳等的初期感染活性的情况下简便且有效地将药剂导入中空衣壳等，制造药剂递送粒子。本制造方法中得到的药剂递送粒子由于使用的中空衣壳等丧失病毒的后期感染活性，因此，没有病毒的增殖活性，安全性高。
根据本发明的AAV中空粒子的制备方法，可以增强单位宿主细胞的AAV生产量，因此，可以制备更多的中空粒子。
根据本发明的中空粒子等及病毒粒子的精制方法，可以简便地除去宿主细胞提取液或宿主细胞培养液中以往难以充分除去的可溶性蛋白质。
3.药物组合物
3-1.概要
本发明的第三实施方式为药物组合物。本发明的药物组合物的特征在于，含有第一实施方式的药剂递送粒子或第二实施方式的制造方法中得到的药剂递送粒子中的至少一种作为有效成分。
3-2.构成
在本说明书中，“药物组合物”为以通过作为有效成分的药剂递送粒子中所含的药剂的作用对应用其的生物或其细胞赋予某些生理性作用为目的的组合物。这样的生理作用例如可以举出：疾病或者病症抵抗性、药物抵抗性或者敏感性、生理活性的增强或者抑制、和/或新型性状。在应用的生物为动物、特别是人，且以通过有效成分的作用预防、诊断、和/或治疗疾患的为目的的情况下，在本说明书中，特别称为“医药组合物”。在本说明书中，“预防”是指防止疾病或病症的发病。”治疗”是指缓和或除去发病的疾病或病症和/或伴随其的症状。
本发明的药物组合物含有药剂递送粒子作为有效成分，此外，可以含有载体、和/或具有相同或者不同的药理效果的其它的药剂。
(药剂递送粒子)
本实施方式的药剂递送粒子为第一实施方式的药剂递送粒子或通过第二实施方式的制造法得到的药剂递送粒子。一种药物组合物中所含的药剂递送粒子可以为不同的二种以上的粒子。此时，药剂递送粒子可以为衣壳等相互不同的病毒来源，和/或也可以为药物相互不同的种类。例如也可以含有靶细胞不同的药剂递送粒子。
药物组合物中的药剂递送粒子的含量根据该药剂递送粒子中所含的药剂的种类和/或其有效量、应用对象细胞、疾病或病症的种类、药剂组合物的剂型(包含形态、尺寸)以及后述的载体的种类而不同，可考虑各自的条件适宜确定。
在本说明书中，“有效量”是指药剂递送粒子所包含的药剂发挥作为有效成分的功能所必需的量，且相对于应用其的生物体体几乎或完全未附加不期望的有害的副作用的量。该有效量可根据受试体的信息及给药经路等各种条件改变。
在此，所谓“受试体”是指应用药物组合物的生物体(包含动物、植物)。在受试体为人的情况下，特别称为“受试者”。另外，所谓“受试体的信息”是指应用药物组合物的生物体的各种个体信息，例如在受试者的情况下，包含全身的健康状态、在疾病/病症发病的情况下包含其进行度及重症度、年龄、体重、性别、饮食生活、药剂敏感性、并用药物的有无及相对于治疗的耐性等。药剂递送粒子的最终的有效量、及基于其算出的应用量可根据各个受试体的信息等，最终由医生、牙医、兽医或植物医师等的判断来确定。
(载体)
“载体”是指药物组合物容易制剂化或在生物体中应用，另外，为了维持药剂递送粒子中所包含的药剂的效果，在不阻碍或抑制其作用的范围内添加的物质。
在药剂组合物应用于动物的情况下，对载体而言，例如可以举出：赋形剂、结合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂或润滑剂。
作为“赋形剂”例如可以举出：如单糖、二糖类、环糊精及多糖类之类的糖(具体而言，没有限定，包含葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露糖、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉及纤维素)、金属盐(例如磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、高分子量的聚乙二醇(PEG)、Pluronic(プルロニック)、或者它们的组合。
作为“结合剂”，例如可以举出：使用了玉米、小麦、大米、或者土豆的淀粉的淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮等。
作为“崩解剂”，例如可以举出：上述淀粉、羧甲基淀粉、交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠或它们的盐。
作为“填充剂”，例如可以举出：上述糖和/或磷酸钙(例如，磷酸三钙、或者磷酸氢钙)。
作为“乳化剂”，例如可以举出：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯。
作为“流动添加调节剂”及“润滑剂”，例如可以举出：硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙二醇。
这样的载体只要根据需要适宜使用即可。本发明的药物组合物除上述的添加剂以外，也可以根据需要含有矫味矫臭剂、溶解辅助剂(增溶剂)、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂、吸收促进剂(例如季铵盐类、月桂硫酸钠等)、增量剂、赋湿剂、保湿剂(例如甘油、淀粉等)、吸附剂(例如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶态硅酸等)、崩解抑制剂(例如白糖、硬脂精、可可脂、氢化油等)、涂层剂、着色剂、保存剂、抗氧化剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂等。
在药物组合物应用于植物的情况下，对载体而言，例如可以举出：粉碎天然矿物、粉碎合成矿物、乳化剂、分散剂及表面活性剂等。
作为“粉碎天然矿物”，例如高岭土、粘土、滑石及白垩是符合的。
作为“粉碎合成矿物”，例如高分散二氧化硅及硅酸盐是符合的。
作为“乳化剂”，非离子性乳化剂、阴离子性乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇酯、烷基磺酸盐及芳基磺酸盐)是符合的。
作为“分散剂”，例如可以举出：木素亚硫酸废液及甲基纤维素。
作为“表面活性剂”，例如可以举出：木素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸的碱金属盐、碱土类金属盐及铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪酸及硫酸化脂肪醇乙二醇醚、以及磺化萘及萘衍生物和甲醛的缩合物、萘或萘磺酸和苯酚及甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯基醚、乙氧基化异辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基苯基聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇/环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨醇酯、木素亚硫酸盐废液及甲基纤维素是合适的。
本实施方式的药物组合物可在一药物组合物中含有一种以上上述载体。
另外，载体在用于医药组合物的情况下，可使用制药上可容许的载体，另外，在用于植物的情况下，可使用农学上可容许的载体。
(其它的药剂)
本发明的药剂组合物可以在不阻碍或抑制作为有效成分的药剂递送粒子的作用的范围内含有一种以上具有与药剂递送粒子中所包含的药剂相同或不同的药理作用的其它的药剂。例如，在受试者的情况下，存在相对于治疗对象疾病并发的可能性高的其它的疾病时，也可以含有对于其它的疾病的治疗剂。另外，在受试体为植物的情况下，例如也可以含有杀虫剂、杀菌剂、肥料。
3-3.剂型
药剂组合物的剂型根据应用方法和/或处方条件而不同。
在对动物给药药物的情况下，给药方法通常可以大致分为经口给药法或非经口给药法。对其进行后述。
作为适于经口给药的剂型，例如可以举出：固体制剂(包含片剂、丸剂、舌下片、胶囊剂、滴剂、含剂)、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂等。进而，固体制剂可以根据需要采用该领域中实施了公知的包衣的剂型、例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、膜包衣片、双层片、多层片。
非经口给药可细分为全身给药及局部给药，局部给药可进一步细分为组织内给药、经皮给药、经粘膜给药及经直肠给药，药物组合物可形成适于各个给药方法的剂型。作为适于全身或组织内给药的剂型，例如可以举出作为液剂的注射剂。作为适于经皮给药或经粘膜给药的剂型，例如可以举出：液剂(包含搽剂、滴眼剂、滴鼻剂、吸入剂)、悬浮剂(包含乳剂、霜剂)、粉剂(滴鼻剂、吸入剂)、糊剂、凝胶剂、软膏剂、硬膏剂等。作为适于经直肠给药的剂型，例如可以举出栓剂等。
在对植物给药药物的情况下，药剂组合物的剂型可以举出：液体、固体(包含半固体)或其组合。可以采用溶液剂、油性分散液剂、乳液剂、悬浮制剂、粉剂、散剂、糊剂、凝胶剂、颗粒剂、片剂及粒剂。
另外，关于上述各剂型的具体的形状、大小，只要均在各自的剂型中在该领域中公知的剂型的范围内即可，没有特别限定。
3-4.药物组合物的制造
为了将本发明的药物组合物制剂化，原则上可利用该领域中公知的方法。例如只要使用Remington’s Pharmaceutical Sciences(Merck PublishingCo.，Easton，Pa.)中记载的方法即可。
例如在注射剂的情况下，将第一实施方式的药剂递送粒子溶解于制剂上可容许的溶剂，根据需要加入制剂上可容许的载体，通过该领域中惯用的方法来制造。
作为“药学上可容许的溶剂”，例如可以举出：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。这些优选进行杀菌，优选根据需要调整为与血液等渗压。
3-5.药物组合物的应用方法
作为药物组合物的有效成分的药剂递送粒子利用病毒的靶细胞特异性感染活性。因此，药物组合物的应用方法只要为药剂组合物中所含的药剂递送粒子可与其靶细胞接触的方法就可以应用在该领域中公知的单位形态。
在应用对象生物为动物的情况下，该领域中公知的给药单位形态如上所述，例如可以举出经口给药法及非经口给药法。非经口给药法可进一步细分为局部给药法(例如如皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药之类的组织内给药法、经皮给药、经粘膜给药或经直肠给药等)。本发明的药物组合物也可以使用这些给药单位形态中的任一种。虽然没有限定，但优选的方法为注射、经口给药或经粘膜给药。
注射可以向靶部位或其附近直接给药药物组合物，另外，可以经血液将药剂递送粒子遍布全身。进而，侵袭性较低，对受试体造成的负担小。注射的药物组合物的注入部位没有特别限定。例如可以举出：静脉内、动脉内、肝脏内、肌肉内、关节内、骨髓内、椎管内、心室内、经皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、肠内、舌下等。优选为静脉内注射、动脉内注射等向血管内的注射。
经口给药及经粘膜给药在经由肠管粘膜、口腔粘膜、咽头粘膜、鼻腔粘膜等将药剂递送粒子摄入到体内的情况下，侵袭性低，给药容易。
在应用对象生物为植物的情况下，该领域中公知的给药单位形态只要为药物组合物中所含的药剂递送粒子可与植物体接触的方法就可以使用该领域中公知的惯用的方法。作为对植物体的接触方法，例如可以举出：对植物体的喷雾、散布、涂布、注入、浸渍、有伤接种(包含针接种)、从根部的吸收等方法。对应用对象植物体的接触部位若为地上部，则为叶、花芽、果实、茎、枝等，另外，若为地下部，则为根、根茎、根块等，可以为期望的地点，没有特别限定。只要根据药剂递送粒子的来源病毒的感染路径适宜考虑即可。
实施例
<实施例1：源自AAV的中空衣壳的大量制造(1)>
(目的)
在向包含现有的内源性E1基因区域的HEK293细胞进一步导入E1基因区域表达质粒的情况下，检验其导入量引起的AAV的产生量的变化。
(方法)
使用16个225cm2烧瓶，每个烧瓶用10%FBS＋/DMEM/F12培养基在5%CO2下37℃下培养2×107个的293细胞。培养48小时后，用磷酸钙法在每个烧瓶中导入含有AAV的ITR(Inverted Terminal Repeat)和LacZ基因的AAV载体质粒23μg、在每个烧瓶中导入克隆了2型AAV的rep基因及8型AAV的cap基因的AAV辅助质粒23μg、在每个烧瓶中导入克隆了2型腺病毒的E2A基因区域、E4orf6基因、编码VA-RNA的基因的腺病毒辅助质粒23μg、及在每个烧瓶中导入E1基因区域表达质粒(pE1△55)0、2.3、6.9或23μg(各n=4)，在细胞内复制AAV粒子。在以0、2.3、6.9μg使用pE1△55的情况下，以质粒内的总量相同的方式用对照质粒(pCMV)制备。另外，pE1Δ55为从E1B基因区域中仅缺失了E1B55k基因的E1基因区域表达质粒。在6小时后用10%FBS+/DMEM/F12培养基进行培养基交换。在72小时后回收细胞，重复六次细胞团块的冷冻融化，每次通过涡流操作充分混合。将DNaseI处理中残存的质粒消化后，用Q-PCR法对AAV的拷贝数(g.c.)进行定量。
另外，关于细胞培养方法和转染方法的详细情况，基于Okada T.,等,Methods Enzymol.,Vol346:Gene Therapy Methods(ed.by M.Ian Phillips),2002,378-393;Okada T.,等,Methods.,2002,28:237-247；及びOkada T.,等,Hum.Gene Ther.,2005,16:1212-1218中记载的方法进行。
(结果)
将结果示于图1。如该图所示，表明在向HEK293细胞导入E1基因区域表达质粒的情况下，AAV产生量依赖于导入的表达质粒的量而提高。
<实施例2：源自AAV的中空衣壳的大量制造(2)>
(目的)
构建稳定地表达E1基因区域及Bcl-xL基因的293细胞，检验Bcl-xL基因的表达增强引起的AAV的产生量。
(方法)
首先，构建稳定地表达E1基因区域及Bcl-xL基因的293细胞株。将E1基因表达质粒pE1△55、Bcl-xL基因表达质粒、及新霉素表达质粒20：20：1的比率导入于293细胞，分离10个新霉素耐性的细胞株的克隆使其增殖。其中，选择增殖率最高的克隆进行线化（ライン化），制成“HEK293EB细胞株”(在本说明中，常略为“293EB细胞株”)。
接着，使用28个225cm2烧瓶，每个烧瓶分别用10%FBS＋/DMEM/F12培养基在培养2×107个的293细胞及293EB细胞。关于293EB细胞，在培养48小时后用磷酸钙法在每个烧瓶中以23μg导入含有AAV的ITR-LacZ基因的AAV载体质粒、在每个烧瓶中以23μg导入克隆了2型AAV的rep基因及8型AAV的cap基因的AAV辅助质粒、在每个烧瓶中以23μg导入克隆了2型腺病毒的E2A、E4、VA-RNA基因的腺病毒辅助质粒，关于293细胞，再在每个烧瓶中以23μg导入E1基因表达质粒pE1△55。在6小时后用10%FBS＋/DMEM/F12培养基进行培养基交换。在72小时后将各个细胞离心并回收，重复六次细胞团块的冷冻融化，每次通过涡流操作充分地混合。将DNaseI处理中残存的质粒消化后，用Q-PCR法对载体的基因组拷贝数进行定量。
需要说明的是，细胞培养方法和转染方法的详细情况依据实施例1。
(结果)
将结果示于图2。如该图所示，表明与293细胞相比，在稳定地表达E1基因区域及Bcl-xL基因的293EB细胞中，AAV产生量增加至2.1倍。
<实施例3：源自AAV的中空衣壳的大量制造(3)>
(目的)
在细胞破碎物中精制AAV及源自AAV的中空衣壳的情况下，常规方法中，通过密度梯度超离心或离子交换精制进行，但杂质混入较多，不能说精制效率充分。
本发明人发现，通过在55℃下对上述细胞破碎物加热30分钟使可溶性蛋白质凝固，然后进行沉淀并除去，可简单地精制病毒粒子及中空衣壳。而且，为了研究，进行了以下研究。
因此，对可有效地从含有AAV及中空衣壳的细胞破碎物中除去杂质，且尽可能地保持AAV及中空衣壳的初期感染活性的最适条件进行研究。
(方法)
使用28个225cm2烧瓶(或1个6320cm2的10层烧瓶)用10%FBS＋/DMEM/F12培养基在5%CO2下37℃下培养1.4×108个293EB细胞。培养48小时后，用磷酸钙法向293EB细胞分别导入插入了含有AAV的ITR(Inverted Terminal Repeat)的荧光素酶基因的AAV载体质粒、克隆了AAV的2型rep及9型cap基因的AAV辅助质粒、及克隆了2型腺病毒的E2A、E4、VA-RNA基因的腺病毒辅助质粒各650μg，在该细胞内复制AAV粒子及AAV中空衣壳。在6小时后用10%FBS＋/DMEM/F12培养基进行培养基交换。在72小时后将细胞离心并回收，将细胞团块在30mL的TBS缓冲液中悬浮。重复4～6次该样品的冷冻融化，每次通过涡流充分地混合。
添加150μL的1M MgCl2和20μL的250U/μL核酸酶，在37℃下反应30分钟后，添加300μL的0.5M EDTA终止反应。加入900μL的5M NaCl充分混合，在4℃下以10,000×g离心10分钟，回收上清液。
将核酸酶处理后的样品分注于24个微管各1.0mL，在未处理、50℃/30分钟、50℃/60分钟、55℃/10分钟、55℃/20分钟及55℃/30分钟的各条件(分别为n=4)下加热，将产生的凝固物在4℃、10,000×g的条件下离心10分钟，回收沉淀物，算出其平均值(mg)。另外，在用24孔板培养的293细胞中在1×1011基因组拷贝/孔的条件下混合在上述各条件下处理后的衣壳。通过细胞的基因表达检验初期感染活性，作为其评价，使用Bright-GloLuciferase Assay System(Promega公司)且使用Thermo Electric公司制发光酶标仪Appliskan对荧光素酶活性进行定量。
需要说明的是，细胞培养方法和转染方法的详细情况依据实施例1。
(结果)
将结果示于表1。在该表中，将荧光素酶活性用RLU(relative light unit)表示。由该结果表明，在任一条件下与未处理相比，可以多30%地除去可溶性蛋白质。另一方面，在55℃下处理20分钟以上的情况下，基因表达降低。若比较各条件，则显示在50℃下60分钟以下、在55℃下低于20分钟的较短的时间是合适的。
[表1]
Figure BDA0000396523030000331
<实施例4：药剂递送粒子的制造(1)>
(目的)
检验利用本发明的药剂递送粒子的制造方法的药剂递送方法的制造的实施和其细胞内递送能力的效果。
(方法)
(1)中空衣壳的制造
使用28个225cm2烧瓶(或1个6320cm2的10层烧瓶)用10%FBS＋/DMEM/F12培养基在5%CO2下在37℃下培养4×108个293EB细胞。在培养48小时后，用磷酸钙法向293EB细胞分别导入插入了含有AAV的ITR的eGFP基因的AAV载体质粒、克隆了9型AAV的rep及cap基因的AAV辅助质粒、及克隆了2型腺病毒的E2A、E4、VA RNA基因的腺病毒辅助质粒各650μg，在该细胞内复制AAV粒子及AAV中空衣壳。在72小时后将细胞离心并回收，将细胞团块在30mL的TBS缓冲液中悬浮。重复4～6次该样品的冷冻融化，每次通过涡流充分地混合。
添加150μL的1M MgCl2和20μL的250U/μL核酸酶，在37℃下反应30分钟后，添加300μL的0.5M EDTA终止反应。添加900μL的5M NaCl充分混合，在4℃下以10,000×g离心10分钟并回收上清液。
进而，在50℃下对样品加热30分钟，使可溶性蛋白质凝固后，在4℃以10,000×g离心10分钟并回收上清液。
(2)通过超离心的粗精制
在1.50g/mL氯化铯溶液上重叠1.25g/mL氯化铯溶液，再在其上重叠上述(1)中回收的上清液。在16℃下以25,000×g离心3小时后，从离心管下方各回收0.5mL氯化铯层。测定各组分的折射率(RI：refractive index：)，回收RI为1.365～.368的组分后，相对于样品的约100倍量的MHN缓冲液(3.33mM MES、3.33ｍM HEPES(pH6.5)、3.33mM NaOAc)透析30分钟。用得到的样品的约5倍量的MHN缓冲液稀释样品。
(3)中空衣壳的分离及精制
作为离子交换膜，使用在基材表面保持有磺酸基的阳离子交换膜Mustang S(美国颇尔公司)。作为FPLC系统，使用AKTA explorer100(GEhealthcare)进行精制操作。用MHN缓冲液Mustang S Acrodisc平衡化后，以流速3mL/分钟将样品向Mustang S Acrodisc吸附中空衣壳，分离并除去AAV粒子。用10CV的MHN缓冲液清洗Mustang S Acrodisc，在0～100%B(2M NaCl)/50CV的浓度梯度条件下将峰的组分中所含的中空衣壳洗脱，以组分量1mL回收。利用电子显微镜确认为未进入在中心存在黑色部分的病毒基因组的中空衣壳。
(4)药剂递送粒子的制备
在最终浓度0.5%的Triton X-100(Wako)的存在下将(1)～(3)中制备的9型AAV(AAV9)的中空衣壳4μg、最终浓度10μM的3’-羧基荧光素标记化吗啉代寡核苷酸(Gene Tools公司)(以下设为“荧光素-PMO”)作为药剂混合后，用PBS将总量制成20μL。然后，轻轻地搅拌在冰上静置30分钟。
接下来，使用超滤膜Vivaspin500(30kDa MWCO)(GE Healthcare,Cat.#28-9322-35)除去Triton X-100及未导入的荧光素-PMO。具体而言，将上述混合样品20μL悬浮于500μL的PBS溶液，用Vivaspin 500以15,000转/分钟的速度在4℃下离心10分钟。重复2次该操作，将最终样品用PBS溶液调整为20μL。在此得到的药剂递送粒子为了简便设为“AAV9/PMO”。
(5)向靶细胞的导入
向人横纹肌肉瘤细胞(RD)株(从财团法人Human Science振兴财团、Human Science研究资源库获得；JCRB9072)给药(4)中制备的AAV9/PMO并混合，评价药剂向细胞内的摄入和局部存在。具体而言，将1.0×104个RD细胞与7μL的AAV9/PMO混合，在5%CO2、37℃的培养条件下培养。培养基使用含有青霉素(100IU/mL)及链霉素(100μg/mL)的DMEM/F12(1:1)培养基，血清设为最终浓度10%。另外，作为对照用，使用仅将荧光素-PMO与1.0×104个RD细胞混合的样品、及现有技术的PMO用传染试剂远藤-波特交付试剂(Gene Tools公司)，制备将荧光素-PMO导入了RD细胞的样品。此时，远藤-波特交付试剂的给药量相对于100μL的孔的培养基设为0.6μL，最终浓度设为6μM。
处理24小时后使用Olympus公司制IX70荧光显微系统进行荧光观察，评价AAV9/PMO向RD细胞内摄入和局部存在。另外，观察处理120小时后的RD细胞的形态。
(结果)
将结果示于图3。A～C为给药24小时后的荧光图。A表示仅用荧光素-PMO进行了处理的RD细胞、B表示用远藤-波特交付试剂进行了处理的RD细胞、C表示用PAAV9/PMO进行处理的RD细胞。另外，D及E分别表示用远藤-波特交付试剂进行了处理的RD细胞和用AAV9/PMO进行了处理的RD细胞的处理120小时后的RD细胞的形态。
在A中几乎未观察到荧光，显示即使仅混合荧光素-PMO也未摄入PMO与此相对，在B及C中，在细胞内观察到荧光，确认到在细胞内摄入有荧光素-PMO，但在C中，以核为中心，观察到超过B的较强的荧光，表示以高效率在细胞内、特别是核内摄入PMO。因此，使用图像分析软件BZ-II(KEYENCE)对B及C中的荧光强度进行测定，比较荧光素-PMO的摄入率。核内的荧光强度值(RFU)的平均值在使用远藤-波特交付试剂的情况下为55，与此相对，在使用PAAV9/PMO的情况下为414，PAAV9/PMO高约7.5倍。另外，核相对于细胞质的荧光强度的比率在远藤-波特交付试剂的情况下为2.0，在PAAV9/PMO的情况下为4.6，中空衣壳显示强2倍的值。
另一方面，对处理120小时后的RD细胞进行观察，结果在进行了远藤-波特交付试剂处理的样品中大部分的细胞死亡(图3D)，显示远藤-波特交付试剂的细胞毒性，与此相对，在PAAV9/PMO处理的情况下，几乎没有细胞的死亡，另外，也未确认到形态的变化(图3E)。
由以上的结果证实，使用了中空衣壳等的本发明的药剂递送粒子与远藤-波特交付试剂相比，PMO向细胞内、特别是核的递送效率高，相对于靶细胞的安全性。
<实施例5：药剂递送粒子的制造(2)>
(目的)
在实施例4中，将作为导入于中空衣壳等内的药剂的低分子化合物即用3’-羧基荧光素标记的核酸类似体的吗啉代寡核苷酸通过本发明的制造方法导入。因此，在本实施例中，验证了即使在将药剂制成其它的核酸或肽的情况下，也可以通过本发明的制造方法与实施例4同样地导入于中空衣壳等内，且所制造的该药剂递送粒子可导入于细胞内。
(方法)
(1)从中空衣壳的制造到分离及精制
从AAV中空衣壳的制造至分离及精制与实施例4中记载的方法相同，因此，省略其记载。
(2)药剂的制备
(i)FITC-siRNA
作为吗啉代寡核苷酸以外的其它的核酸，使用FITC标记的siRNA(FITC-siRNA)。FITC-siRNA为与在作为siRNA对照配列的有义链的siCont-s(Sigma Genosys)的5,末端进行了FITC标记的核酸(5′-Fluorescein(5,6-FAM)UUCUCCGAACGUCACGUUU-3′；SEQ ID NO:8)相同对照序列的反义链，使用由具有5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3′(SEQ IDNO:9)所示的碱基序列的siCont-as(Sigma Genosys)构成的siRNA。该FITC-siRNA的合成委托给Sigma genosys。
(ii)Alexa488-BSA及Alexa-IgG
作为肽，使用进行了Alexa488标记的牛血清白蛋白(BSA)(Alexa488-BSA;Molecular Probes,A13100)及抗小鼠Alexa-IgG(Molecular Probes,A21208)。
(3)药剂递送粒子的制备
在将AAV中空衣壳7.8μg(0.65mg/mL)12μL和PBS4μL并加入1μL作为表面活性剂的0.5%Pluronic F-68(PEG的共聚物即高分子非离子性表面活性剂)的溶液中加入100μM的FITC-siRNA3μL、50μM的Alexa488-BSA1μL或13μM的Alexa-IgG，用PBS定量至20μL，将得到的溶液在室温下放置30分钟。然后，用PBS定量至200μL后，用70%乙醇杀菌并使用超滤柱浓缩至30μL，进一步重复相同操作，除去游离的siRNA、BSA或IgG。
(4)向靶细胞的导入
基本的方法为实施例4中记载的方法相同。将用添加了10%FetalBovine Serum(CCB,Lot8D0264)及1%青霉素-链霉素(Sigma P4458)的DMEM/F12(1:1)培养基(Gibco,#11320)培养的人横纹肌肉瘤细胞RD细胞株(从财团法人Human Science振兴财团、Human Science研究资源库获得、JCRB9072)以10,000细胞/孔的方式接种于96孔板，在37℃、5%CO2下培养一晚。然后，在培养液中添加上述浓缩后的30μL溶液中的1/5量(6μL)，再在相同条件下培养20小时。
在培养后将培养液交换为PBS(+)，使用Olympus公司制IX70荧光显微系统进行荧光观察(激发330-385nm)，评价AAV9/PMO向RD细胞内的摄入和局部存在。
(结果)
将结果示于图6。由该结果确认，根据本发明的制造方法，即使为吗啉代寡核苷酸以外的酸FITC标记了的核酸即siRNA，另外，即使为用Alexa进行了标记的肽(BSA及IgG)，也可以向中空衣壳等内导入，进而，其药剂递送粒子可导入于细胞内。特别是在FITC-siRNA中也显示导入的FITC-siRNA被递送至核内。
由该结果证实，根据本发明的制造方法，可将核酸、肽、低分子化合物、及它们的组合导入于中空衣壳等内，进而，结果得到的药剂递送粒子可基于病毒衣壳等的感染性而导入于规定的细胞内。
<实施例6：表面活性剂的浓度效果>
(目的)
对用于将药剂有效地导入于中空衣壳等内的表面活性剂的浓度条件进行检验。
(方法)
药剂递送粒子的制备的基本的步骤依据上述实施例4(4)中记载的方法。其中，表面活性剂使用吐温20，其浓度设为0、0.5、0.75、1、3及10%，另外，药剂使用FITC标记PMO(以下，设为“FITC-PMO”)。进而，将AAV中空衣壳、及吐温20混合后，在4℃下静置30分钟。
将导入了FITC-PMO的中空衣壳、即药剂递送粒子和未导入的游离FITC-PMO用超滤膜Vivaspin 500(30kDa MWCO)进行离心分离，分离后，测定各自的样品的荧光强度，算出与施加于柱前的荧光量的比例，设为摄入率。
(结果)
将结果示于图4。表明摄入率浓度依赖性上升，10%可以半数以上的比例有效地摄入。
<实施例7：中空衣壳的细胞特异性递送活性>
(目的)
证实用于本发明的药剂递送粒子的中空衣壳等具有靶细胞特异性递送活性。
(方法)
使用Alexa Fluor 568蛋白标记试剂盒(Molecular Probes)荧光标记源自AAV9的中空衣壳。关于具体的标记方法依据所附带的方案。接下来，对使MyoD表达腺病毒载体(MOI=10)感染人成纤维细胞(WI-38)株而肌肉分化诱导而成的细胞和未诱导处理的细胞分别给药上述荧光标记的AAV9中空衣壳。距MyoD表达腺病毒载体下的感染4天后，在距AAV9中空衣壳给药16小时后观察细胞中的荧光。另外，AAV9的靶细胞为肌肉细胞。
(结果)
将结果示于图5。A表示未肌肉分化诱导处理的WI-38株、B表示肌肉分化诱导处理后的WI-38株。在未分化的WI-38细胞中，仅观察到微少的荧光(图5A)，但在肌肉分化的WI-38细胞中在细胞质及核膜周围观察到较强的荧光(图5B)。即，确认到荧光标记的AAV9中空衣壳对肌肉分化细胞的亲和性高，在细胞内中集聚于核膜周围。该结果表示中空衣壳等具有靶细胞特异性递送活性。
本说明书中引用的全部的发行物、专利及专利申请直接作为参考引用于本说明书中。
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Claims (24)

1.一种由含有药剂的衣壳或被膜粒子构成的药剂递送粒子的制造方法，所述制造方法包含如下(a)及(b)：
(a)在含有0.1～20%的表面活性剂的溶液中混合中空衣壳或中空粒子和药剂的工序；
(b)将所述混合工序后的混合液在-5～50℃下保持并将药剂导入中空衣壳或中空粒子内的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在所述导入工序中将混合液保持5分钟～120分钟。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，所述制造方法还包含(c)在所述导入工序后除去溶液中的表面活性剂的工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，表面活性剂为选自由Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、吐温20、吐温80、辛基-β-葡糖苷、OTG、SDS、CHAPS、CHAPSO、以及PEG和PPG的共聚物构成的组中的一种以上的表面活性剂。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，药剂为核酸、肽和/或低分子化合物。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，核酸为选自由功能性核酸、mRNA、mRNA片段以及含有任意的基因或其片段的载体构成的组中的一种以上的核酸。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，功能性核酸为选自由siRNA、miRNA、shRNA、核酸适体、反义DNA、U1接头、核酶、分子信标及核糖开关构成的组中的一种以上的核酸。
8.根据权利要求6所述的制造方法，其中，载体选自由质粒、粘粒及人工染色体构成的组。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，将中空衣壳或中空粒子进行修饰。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制造方法，其中，中空衣壳或中空粒子具有对于特定的细胞的初期感染活性。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的制造方法，其中，中空衣壳源自腺病毒或腺伴随病毒。
12.一种在衣壳或被膜粒子内含有药剂而成的药剂递送粒子，其中，所述药剂为不含该衣壳或被膜粒子所源自的病毒自身的基因的外源性的核酸、肽和/或低分子化合物。
13.根据权利要求12所述的药剂递送粒子，其中，所述外源性的核酸为选自由功能性核酸、mRNA、mRNA片段及含有任意的基因或其片段的载体构成的组中的一种以上的核酸。
14.根据权利要求13所述的药剂递送粒子，其中，功能性核酸为选自由siRNA、miRNA、shRNA、核酸适体、反义DNA、U1接头、核酶、分子信标及核糖开关构成的组中的一种以上的核酸。
15.根据权利要求13所述的药剂递送粒子，其中，载体选自由质粒、粘粒及人工染色体构成的组。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的药剂递送粒子，其中，将衣壳或被膜粒子进行修饰。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的药剂递送粒子，其中，衣壳源自腺病毒或腺伴随病毒。
18.根据权利要求11～17中任一项所述的药剂递送粒子，其中，衣壳或被膜粒子具有对于特定的细胞的初期感染活性。
19.一种药物组合物，所述药物组合物含有通过权利要求1～11中任一项所述的制造方法得到的药剂递送粒子和/或权利要求12～18中任一项所述的药剂递送粒子中的至少一种作为有效成分。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，所述药物组合物用于预防或者治疗疾病或者病症。
21.一种中空衣壳或者被覆粒子或病毒粒子的精制方法，所述精制方法包含对生产中空衣壳或者被覆粒子或病毒粒子的宿主细胞的培养液和/或该宿主细胞的提取液进行加热的工序，其中，在加热温度为45℃以上且低于55℃的情况下，加热时间为10分钟～90分钟，或在加热温度为55℃以上且60℃以下的情况下，加热时间为3分钟～30分钟。
22.一种腺伴随病毒生产能力增强细胞株的制造方法，所述制造方法包含向HEK293细胞株导入源自腺病毒的E1A基因区域、E1B19基因、E2A基因区域、E4orf6基因及编码VA RNA的基因的工序。
23.根据权利要求22所述的制造方法，所述制造方法还含有选择稳定地表达导入的所有基因的细胞株的工序。
24.根据权利要求22或23所述的制造方法，所述制造方法还含有导入源自人的Bcl-xL基因的工序、选择稳定地表达导入的Bcl-xL基因的细胞株的工序。
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