WO2007116808A1 - ウイルス粒子様構造体およびそれを含有する製剤 - Google Patents

Abstract

　画像診断や組織再生または温熱治療などで有効な金属もしくは金属化合物をウイルス様粒子構造体に取り込ませることにより、細胞レベルの診断、治療に対して有望な、金属および／または金属化合物を内包するウイルス粒子様構造体を提供すること、ならびにその構造体の最適な形成方法を提供することを目的とする。本発明のウイルス粒子様構造体は、ウイルスタンパク質と、被封入物質である金属および金属化合物の少なくとも一方を含む微粒子とを含有する、実質的に均一サイズのウイルス粒子様構造体である。好ましくは前記微粒子が表面荷電として正または負の電荷を有し、鉄、酸化鉄またはフェライトを主成分とする。前記ウイルスタンパク質が、ＳＶ４０ウイルス、ＪＣＶウイルス、ＢＫＶウイルスに由来する１種以上のタンパク質および／またはその変異体もしくは改変体であることが望ましい。

Description

明 細 書

ウィルス粒子様構造体およびそれを含有する製剤

技術分野

[0001] 本発明は、ウィルス粒子様構造体およびそれを含有する製剤に関する。そのウィル ス粒子様構造体は、ウィルスタンパク質の自己集合過程で、金属もしくは金属化合物 を含有する微粒子も含めて組織化され、形成された構造体である。

背景技術

[0002] 金属化合物力 なる粒子は、製剤として医療分野でも広く一般に用いられている。

その中で、生体の画像診断の一手法である磁気共鳴画像 (MRI)は、正常組織と病 態組織との磁気共鳴緩和時間の違いを計測することで癌などの診断ができることから 、 X線被爆のない診断法として広く利用されている。この中で緩和時間の違いをより 顕著にするために、例えば米国特許第 4, 827, 945号 (特表平 01— 500196号)ま たは国際公開第 94/03501号パンフレットなどに記載されている酸ィ匕鉄粒子力もな る造影剤が臨床現場で用いられ、これらの造影剤は、酸化鉄粒子を高分子多糖など で分散することで製剤化されて ヽる。

[0003] また、癌組織は、正常組織に比べて、熱による損傷を受け易いという生物学的な特 性を利用して、臨床現場では腫瘍部分を局所的に加温する癌の温熱治療が行なわ れている。この手法は生体組織を誘電加温により加熱する方法で、副作用の少ない 非侵襲治療法として注目されて ヽるが、誘電加温で生体組織全体を加温するために 、正常組織へのダメージを惹き起こさない温度コントロールが必要となる。このことか ら例えば欧州特許出願公開第 0444194号 (特開平 2— 174720号)または特開平 3 — 128331号などに記載されているように、酸化鉄等の強磁性微粒子を生体内へ導 入し、交流磁場中で、この強磁性微粒子のヒステリシス損による発熱を利用して、腫 瘍部分を局所的に加温する方法、あるいは国際公開第 01Z058458号パンフレット (特表 2003— 522149号）に記載されているように、光熱変換可能な誘電性または 半導性であるコアおよび導電性であるシェルを有する粒子を生体内へ導入し、光熱 変換可能な光を照射することにより細胞または組織で局所的高熱を誘発させる方法 などが提案されている。

[0004] さらに近年、細胞移植や細胞治療の検討が再生医療分野で盛んに行なわれており 、これらの移植や治療効果を早期に確認するために、細胞移植や細胞治療の細胞 の動態追跡が重要となっている。このような生体内に移植された細胞を非侵襲的に モニターする有効な方法として、磁気共鳴画像法などが提案されている。このようなも のとしては、例えば国際公開第 05Z009478号パンフレット（特開 2005— 95153号 )に記載されているような、磁気粒子で標識された不活性ィ匕したウィルスのェンベロ ープを用いる手法などが提案されている。一方、非侵襲生体組織計測では、生体組 織に対してある程度透過性を有する近赤外光を用いた光診断法も注目され、検討が なされている。一般に光は生体組織で散乱あるいは吸収されることから減衰率が高く 、その欠点を補うために光造影剤のような薬剤を併用することが検討されている。この ようなものとしては、例えば国際公開第 01Z058458号パンフレット（特表 2003— 52 2149号）に記載されているように、希土類発光体をドープしたシリカを用いる手法が 提案されている。

[0005] 上で例示した磁気共鳴画像法の造影剤、温熱治療法に用いられる治療剤、細胞の 動態追跡に用いられる標識剤、ある ヽは光による非侵襲計測に用いられる光造影剤 などの医療分野で用いられる金属化合物力 なる粒子は、それぞれの臨床用途に合 わせて、生体親和性、組織親和性、または細胞親和性のある物質で表面改質したり 、あるいは組織特異的吸着物質や細胞特異的吸着物質などで表面を修飾すること により目的とする機能を向上させることが検討されている。

発明の開示

[0006] し力しながら、現時点では臨床適用を考えた場合、充分な機能が付与されていると は言えない現状である。

[0007] 生理活性物質を内包するウィルス粒子様構造体はこれまで種々検討されて ヽるが 、構造体の作製時に生理活性物質自体が失活したり、作製時の溶媒に難溶であると いう問題があった。これに対して金属もしくは金属化合物という非生理的な物質を封 入した製剤については、有効な利用法も含め、ドラッグデザイン、製造方法について の研究は、必ずしも充分進んでいるとは言えない。 [0008] 上記の状況に鑑みて本発明者らは、金属または金属化合物からなる粒子を医療適 用に好適な形態の構造体として提供することが臨床への実用化に最も近いアブロー チとして開発研究を進めた。生体親和性のある物質、特定物質に吸着 ·結合し得る 特異的な物質、標識またはレポーターとして機能し得る物質などを用いる表面改質 の多様な可能性を与えるタンパク質を利用すること、自己組織化の機能を本来的に 有するウィルスタンパク質が本目的に有用であると確信して本発明を完成するに至つ た。

[0009] したがって、本発明は、ウィルス粒子様構造体およびその製造方法と応用を提供す ることを目的とする。

[0010] 本発明のウィルス粒子様構造体は、ウィルスタンパク質と、被封入物質である金属 および金属化合物の少なくとも一方 (以下、金属 Z金属化合物と称することもある）を 含む微粒子と、を含有し、実質的に均一サイズであるウィルス粒子様構造体である。 すなわち、本発明は、画像診断や組織再生または温熱治療などで有効な金属また は金属化合物をウィルス粒子様構造体に取り込ませることにより、細胞レベルの診断 、治療に対して有望な、金属または金属化合物を内包するウィルス粒子様構造体を 提供し、またその構造体の最適な形成方法を提供する。

[0011] 本発明によれば、ウィルスタンパク質と、被封入物質として金属または金属化合物 などを含むウィルス粒子様構造体とすることで、ばらつきや副作用の少ない細胞診断 や治療に対して有効な製剤としての可能性を秘めているだけではなぐこの構造体の 安定な形成方法により均一なサイズのウィルス粒子様構造体の提供が可能である。

[0012] 本発明のウィルス粒子様構造体は、ゲスト分子として金属 Z金属化合物を含むナノ 粒子を封入し、実質的に均一サイズの粒子であるため、ゲスト分子のナノ粒子特性が 充分に発揮させることができる。

[0013] また、本発明のウィルス粒子様構造体は、ゲスト分子の金属または金属化合物の種 類を目的に応じて適宜変えることにより、極めて様々な方面の用途に用いることがで きる多用途対応タイプの構造体である。

[0014] 本発明に用いられるウィルスタンパク質は、ゲスト分子の担体としてのみならず、細 胞指向性があり、修飾を施すことにより、様々に多機能化し、または特性を所望する 形に変更することができる。

[0015] 自己集合および組織ィ匕能を有するウィルスタンパク質を利用するために、本発明の ウィルス粒子様構造体は、所定の条件下で、構成成分を混合してから簡単な操作で 調製することができる。

[0016] 本発明のさらに他の目的、特徴および特質は、以後の説明および添付図面を参酌 することによって、明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 ノ ク質 VP 1 (五量体; pentamer)のインビトロ再構成を示す透過型電子顕微鏡写真 である。

[0018] 上段: VP1五量体のみで再構成を行うと、 pH5では、チューブ状構造物、 pH7また は 9では、不完全な構造物が形成された。

[0019] 下段：フェライト（ferrite)存在下で VP1五量体の再構成を行うと、 pH5, 7および 9 V、ずれにお 、ても、直径 25〜30nmの小型粒子の形成が確認できた。

[図 2]図 2Aは、中空ウィルス粒子様構造体に対する、抗 VP1抗体を用いたウェスタ ンブロッテイングの結果を示す図である。また、図 2B上は、実施例 5のウィルス粒子 様構造体に対する、抗 VP 1抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果を示す図で あり、図 2B下は、実施例 5のウィルス粒子様構造体中の Fe²⁺の存在量を示す図であ る。さらに、図 2Cは、実施例 8のコントロール中の Fe²⁺の存在量を示す図である。

[図 3]図 3は、実施例 5のウィルス粒子様構造体のモリブデン染色による電子顕微鏡 観察写真である (左；中空ウィルス粒子様構造体、右;本願発明のウィルス粒子様構 造体)。

[図 4]図 4Aは、実施例 10のウィルス粒子様構造体の透過型電子顕微鏡写真である 。図 4Bは、実施例 10のウィルス粒子様構造体に対する、抗 VP1抗体を用いたウェス タンブロッテイングの結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0020] 以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

[0021] ·ウィルス粒子様構造体 本発明の構造体は、ウィルスタンパク質と、被封入物質である金属 Z金属化合物を 含む微粒子とを含有した、実質的に均一サイズのウィルス粒子様構造体であることを 特徴としている。

[0022] 本明細書で!/ヽぅ「ウィルス粒子様構造体」とは、ウィルス粒子に類似する構造を持つ 、複数の構造要素から構成される構造体をいう。ウィルス粒子またはウィルス粒子に 近似する構造のために、単に「ウィルス様粒子」と ヽうこともある。

[0023] 「ウィルス粒子」とは、ヴイリオン (virion)とも!/、 、、形態的にウィルスとしての条件を 満たしている粒子構造であり、その大きさは 20〜300nmである。ヴイリオンには、ェ ンべロープなる膜を持つものもあるが、本発明のウィルス粒子様構造体は、典型的に はエンベロープを有しない構造を対象とし、ウィルスタンパク質と、被封入物質である 金属 Z金属化合物を含む微粒子とを含有している。なお本明細書でいう「内包」、「 封入」とは、ウィルスタンパク質集合体が形成する閉鎖空間の内部にあるもののみな らず、ウィルスタンパク質と結合 (または吸着、捕捉などの態様でもよい)し、ウィルス タンパク質集合体内か、または粒子表面近くにあるものも含まれる。

[0024] 上記ウィルス粒子様構造体は、さらに必要であれば粒子形成促成因子または所望 する場合には生理活性物質を含有してもよい。そうした生理活性物質は、ウィルスタ ンパク質に結合される力、ウィルスタンパク質の集合体内に封入される薬剤（例えば 抗癌剤、抗生物質、生理活性ペプチドなどの低分子化合物、ポリペプチド、タンパク 質、多糖類などの高分子物質)または遺伝子治療用の核酸などである。「粒子形成 促成因子」については後記する。

[0025] ，本発明の構造体

本発明のウィルス粒子様構造体は、ウィルスが本来的に有する粒子形成能、すな わち、ウィルスタンパク質が発揮する自己集合組織ィ匕の特性を利用している。ウィル スタンパク質は核酸力も分離され、各構成員としてバラバラの状態に分散されていて も、インビトロで、可逆的に元のウィルス超分子構造に類似した、空の (核酸は含まな い）シェル構造へ再構成され得る。そうしたウィルスタンパク質の集合過程で、金属 Z 金属化合物を含む微粒子をその集合体内に取り込ませて形成された構造体が、本 発明のウィルス粒子様構造体である。金属 Z金属化合物を含む微粒子は、好ましく は金属 z金属化合物の集合体である微粒子であり、また好ましくは、そのサイズがナ ノメーター ·オーダーの微粒子が多数、ウィルスタンパク質集合体内部に取り込まれ ている。

[0026] 本発明のウィルス粒子様構造体は、ウィルスタンパク質による自己集合能と自己組 織ィ匕に基づいて形成される構造であることから、その構造の均一性が確保される。す なわち本発明の構造体は、その大きさ、サイズ分布および形状において均質である。 構造体の大きさも実質的に均一なサイズであると考えてもよい。「実質的に均一」とは 、構造体のサイズ分布が狭い範囲内に収まっていることを意味する。したがって本構 造体の平均粒子径に対して、粒子径の変動係数が 10%未満、好ましくは 8%未満、 特に好ましくは 2〜5%であることが好ましい。力ような範囲であれば単分散の系とし て分布していることを意味する。人工的に合成される粒子系の粒径分布と比較すると 、際立って均一な系といえる。「変動係数 (CV)」とは、 100 X (粒子径標準偏差 Z平 均粒子径）（％)で表される係数である。これはその数値が小さいほど単分散の粒子 集団であることを示す指標である。平均粒子径、変動係数などの粒子径分布は、 TE M (透過型電子顕微鏡)観察による方法に基づいた。形状も元のウィルス粒子の形 状と同一か、類似する形状であり、球形か、球形に近い。本ウィルス粒子様構造体の サイズは、エンベロープを持たない構造であるために、好ましくは 20〜150nm、より 好ましくは 20〜： L00nm、さらに好ましくは 30〜50nmの範囲にあり、ナノ粒子の担体 として好適である。

[0027] 金属などの超微細粒子のうち、電子の波長（10nm程度)より小さい粒子径を有する ナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として、電子の運動に対するサイズ有限性の影 響が大きくなつてくるためにバルタ体とは異なる特異な物性を示すことが知られて 、る 。このようなナノレベルの金属の特性を活かすための好適な担体として、本発明のゥ ィルス粒子様構造体は特別の意義を有する。金属 Z金属化合物を担体であるウィル スタンパク質構造内に安定的に取り込むために、好ましくは金属 Z金属化合物を含 む粒子の表面に官能基を導入し、該粒子の官能基とタンパク質との相互作用を生じ させる。

[0028] ·金属および金属化合物 本発明のウィルス粒子様構造体に含める金属または金属化合物は特に制限されな い。

[0029] 画像診断や組織再生または温熱治療などに対して有効な金属または金属化合物 であれば特に限定はされな ヽ。ウィルス粒子様構造体に被封入物質として封入させ ることから、これらの金属または金属化合物単独で、またはこれらの金属または金属 化合物を主成分とする組成物としてウィルス粒子様構造体に封入させる場合は、金 属または金属化合物は粒子状のものが好ま 、。

[0030] このような金属または金属化合物としては鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜 鉛、マグネシウム、カドミウム、モリブデン、ノ リウム、チタン、シリコン、ガドリニウム、金 、白金、バナジウム、セレン、アルミニウム、スズなどの金属またはそれらの複合体、前 記の一種または二種以上の金属の酸化物、窒化物、炭化物またはそれらの複合体、 さらには、前記金属のイオンと錯形成可能な有機配位子とのキレート錯体などが挙げ られる。なお、これらの金属または金属化合物は本発明の用途に応じて生体や組織 、細胞にとって悪影響のないものが望ましい。

[0031] 前述の中で、特に超音波画像診断装置や核磁気共鳴画像化診断装置での画像 ィ匕剤、診断剤、あるいは交番磁場治療装置を利用した温熱治療剤として用いる場合 には、磁性金属粒子または磁性金属化合物粒子を用いるのが好ましい。このような 粒子状の被封入物質としては、鉄、酸化鉄、フェライトを主成分とすることがより好まし い。

[0032] このような鉄、酸化鉄、フェライトを主成分とする粒子は、常磁性体、強常磁性体、 強磁性体などの磁性体 (以下、これらを総称して単に「磁性体」ともいう。）が好ましぐ より好ましくは、常磁性体および強常磁性体であり、特に残留磁化がないかまたは少 な 、点で、強常磁性体を用いることが好まし 、。

[0033] 力かる磁性体の具体例としては、四三酸化鉄 (Fe O )、 γ—重三二酸化鉄（ γ— F

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e O )などの酸ィ匕鉄、各種フェライト粒子、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属

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、コバルト、ニッケル、マンガンなどの各種合金を挙げることができ、フェライト粒子は、 MIIO -Fe O (MII = Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mg, Cd)型の 2価金属塩などで

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ある。 [0034] 本発明に用いられる磁性粒子は、磁鉄鉱、 Fe O、 Fe O、混合フェライト、有機強

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磁性材料を包含する他の鉄含有化合物など!、ずれも使用することできるが、最大の 磁力を示す Fe Oであるフェライト (Fe Oと δ— Fe Oの固溶体）は磁気応答性が

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良好であり、特に好ましい。磁気特性が良好なフェライトのナノレベルサイズの微粒子 は、特開 2002— 128523号公報に開示されているように、 4〜25°C、中性 pH付近 の温和な条件下の制御沈殿法によって合成できる。フェライトをコアとする磁性粒子 には、さら〖こ Zn、 Co、 Niなどの各種金属元素を含有させて磁気特性を制御すること ができる。

[0035] さらに、光による画像化や診断に用いられる画像化剤や診断剤としては、各種のプ ローブ、発光体として働き得る金属 Z金属化合物を含む微粒子を本発明では好適に 用いることができる。このような金属としては、モリブデン、銅、ノ リウム、亜鉛、チタン、 ガドリゥム、金、白金、カドミウム、シリコン、バナジウム、セレン、テルル、アルミニウム、 スズなどが挙げられる。

[0036] これらの金属 Z金属化合物を含む微粒子の中で量子ドットと称されるものは、励起 波長に対して発光波長がずれていること、蛍光寿命が長いこと、さらには粒子径によ り波長制御が可能なことから用途に応じて好適に用いることができる。このような量子 ドットは、周期表の第 II〜VI族、第 III〜V族および第 IV族の元素からなる量子サイズ 粒子として調製され、具体的な組成としては、 CdS、 CdSe、 CdTe、 ZnS、 ZnSe、 Zn Teゝ MgTe、 GaAs、 GaP、 GaSb、 GaN、 HgS、 HgSe、 HgTe、 InAs、 InP、 InSb 、 InN、 AlAs、 A1P、 AlSb、 A1S、 PbS、 PbSe、 Ge、 Siゝそれらの合金、または 3元 および 4元混合物等のそれらの混合物などが挙げられる。さらに必要であれば、前述 の組成の粒子をコアとし、その表面に ZnO、 ZnS、 ZnSe、 ZnTe、 CdO、 CdS、 CdS e、 CdTe、 MgS、 MgSe、 GaAs、 GaN、 GaP、 GaAs、 GaSb、 HgO、 HgS、 HgSe 、 HgTe、 InAs、 InN、 InP、 InSb、 AlAs、 A1N、 A1P、 AlSb、それらの合金、または それらの混合物からなる組成のシェルで被覆してもよ ヽ。このようなコア zシェル構造 にする場合は、シェルのバンドギャップエネルギーはコアのものより大きいことが好ま しい。

[0037] また、赤外線蛍光体として知られる、放射性希土類 (ランタ-ド)イオン性種もナノサ イス、粒子にすることで利用することが可能であり（WO 01/058458)、このような希 土類としてはネオジゥム、エルビウム、プラセォジゥムなどが挙げられる。

[0038] さらに、金属または金属化合物として、生理的に受け入れられる有機酸または無機 酸の酸付加塩も適宜選択して用いることができ、このような塩としては、例えば酢酸塩 、臭化物、塩化物、クェン酸塩、マレイン酸塩、メシラート塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸 塩、酒石酸塩、ォレイン酸塩、ステアリン酸塩、トシラート塩、カルシウム塩、メダルミン 塩、カリウム塩およびナトリウム塩が挙げられる。

[0039] または金属または金属化合物として、キレート化剤と結合した錯塩などが挙げられ る。このような錯塩としては、金属原子および配位子となる化合物（以下、「配位子成 分」という。）、または配位子が配位された金属錯体である。

[0040] ここで、金属塩としては、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄などの鉄化合物;塩化コバルト、 臭化コバルト、ヨウ化コバルトなどのコバルト化合物；塩化ニッケル、臭化ニッケル、ョ ゥ化ニッケル、ニッケルァセチルァセトナートなどのニッケル化合物；塩化パラジウム、 臭化パラジウム、ヨウ化パラジウムなどのパラジウム化合物；などが挙げられる。また配 位子成分は、典型的には架橋鎖として活性アミノ基を有する鎖式または環式のポリア ミノポリカルボン酸が好適である。さらにトリフエ-ルホスフィン、 2, 2，一ビビリジン、 1 , 5—シクロォクタジェン、 1, 3—ビス（ジフエ-ルホスフイノ）プロパンなども挙げられ る。上記配位子成分である化合物は、 1種単独で、または 2種以上を併用することが できる。

[0041] '微粒子

本発明のウィルスタンパク質の自己組織ィ匕により形成される構造体に、「ゲスト分子 」として封入される金属または金属化合物は、微粒子の形態でウィルスタンパク質と 混合されて、タンパク質構造体に取り込まれる。微粒子の形態、サイズ、構成物質は 特に限定されないが、ナノメーター 'オーダーの微粒子が多数、ウィルスタンパク質の 集合体内部に取り込まれることが好ましい。そうした微粒子のサイズは、限定されない 力 平均粒子径は通常、 0. 5〜： LOOnmであることが好ましぐさらに好ましくは 1. 0 〜50nm、より好ましくは 1. 5〜30nmの範囲である。

[0042] 上記微粒子は、金属および/または金属化合物からなる粒子であってもよ 、。例え ば鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンに見られるように、タンパク質のシェルによる拘 束的環境によって金属粒子の結晶核形成および凝集が促されることもある。

[0043] あるいは、上記微粒子は、金属および/または金属化合物とともにこれらを結合する ノ インダー機能を有する化合物を含めた複合微粒子であってもよ ヽ。そうしたバイン ダー化合物として、水不溶性の有機ポリマーが望ましい。このような有機ポリマーを得 るための単量体として、例えば芳香族ビ-ルイ匕合物、 a , j8—不飽和カルボン酸ェ ステル類、 , j8—不飽和カルボン酸アミド類、 a , j8—不飽和-トリル化合物、ハロ ゲンィ匕ビ二ルイ匕合物、共役ジェンィ匕合物、低級脂肪酸ビニルエステルなどを用いる ことができる。

[0044] 被封入物質である金属または金属化合物を含む微粒子の表面は、表面荷電として 正または負の電荷を有することが望ま 、。負の表面電荷を微粒子表面が有すること で、被封入物質の金属 Z金属化合物の相互作用が生じて、内包の増大と安定化が 図られる。そうした表面電荷は、またウィルスタンパク質のアミノ酸残基の側鎖と相互 作用をして封入される微粒子の構造体内での固定安定化にも寄与する。

[0045] 負の電荷はカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基を微粒子の表面に出るよう〖こ すればよい。例えば、金属 Z金属化合物を含む微粒子をカルボン酸 Zカルボン酸塩 でコーティングするなどの方法がある。負の電荷を導入するための好適な酸としては

、例えば乳酸、クェン酸、酒石酸、コハク酸、ジメルカプトコハク酸、マレイン酸、フマ ル酸およびァスコルビン酸が挙げられる。また正の電荷は、アミノ基、グァ -ジル基な どが挙げられる。

[0046] 上記粒子本体の表面に荷電を有する官能基を露出させるためには、有機ポリマー に、荷電を有する基を導入すればよい。

[0047] 金属 Z金属化合物のバインダー機能のために、有機ポリマーに表面処理すること も望ましい。表面処理官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、アル デヒド基、カルポジイミド基などの一般の表面処理基が使用可能であるがこれらに限 定されるものではない。

[0048] 金属 Z金属化合物は、同種の金属もしくは金属化合物であってもよぐ異なる種類 の金属もしくは金属化合物の組み合わせまたは混合であってもよ 、。 [0049] 金属 Z金属化合物を含有する微粒子の別の好ま 、態様として、コア Zシェル構 造を有するナノ粒子も例示される。このような構造の微粒子において、粒子コア部と は異なる材料で被覆し、コアとなる粒子のサイズや形状を変化させることなく機能化 でき、あるいはコアとシェルの 、ずれのバルタ材料とも異なる特性の発現が期待でき る。例えば発光性ナノ粒子の表面が露出していると、ナノ粒子表面に存在する多数 の欠陥が発光キラーとなってしまい、発光効率が低下してしまう。そこでナノ粒子の発 光波長に相当するバンドギャップよりも大きいバンドギャップを持つシェル材料で被 覆してコア zシェル構造にする。

[0050] コアが非導電性、例えば誘電物質または半導体物質で形成され、シェル層が導電 性である金属または金属様物質力も構成されるナノ粒子が例示される (WO 01/0 58458)。そうした物質の性質は粒子の特性に影響する。一例としてネオジミゥム、ェ ルビゥム、プラセォジミゥムなどの希土類発光体をドープしたシリカコアを、シリカナノ 粒子として利用する態様を示すことができる。誘電物質にはシリコンジオキサイド、チ タ-ゥムジオキサイド、ポリメチルメタタリレート（PMMA)、ポリスチレン、金スルフイド 、およびデンドリマーのごときマクロ分子などがある。半導体物質の例としては、 CdSe 、 CdSおよび GaAsなどがある。

[0051] ウィルスタンパク質 100重量部に対して、微粒子が 0. 002〜50重量部含まれるこ と力 子ましく、 0. 0025〜50重量部含まれることがより好ましぐ 0. 1〜50重量部含ま れることがさらに好ましぐ 4〜30重量部含まれることが最も好ましい。また、微粒子の 大きさおよび密度により、範囲は変動しうるが、一般的に、ウィルスタンパク質 1 gに 対して、微粒子が、 3 X 10⁸〜4 X 10¹¹粒子含まれることが好ましぐ 3 X 10^1G〜4 X 1 0¹¹粒子含まれることがより好ま U、。

[0052] ·ウィルスタンパク質

種類

本発明の構造体は、ウィルス粒子の持つ構造の均一性、ウィルスタンパク質の自己 集合能と自己組織ィ匕の能力を活かし、タンパク質集合超分子内の空洞 (いわば「cag ej構造）に取り込んだ金属 Z金属化合物の機能をナノレベルで発揮させる新し 、ナ ノ構造の構築体である。 [0053] ウィルスタンパク質には各種のタンパク質が存在する力 本発明の構造体には特に 制限されることなく用いられる。好ましくはタンパク質外殻であるキヤプシドである。キ ャプシドはキヤプソメァという単位粒子力 構成され、このキヤプソメァタンパク質は、 単一または複数のタンパク質が存在することが知られている。本発明には、いずれの キヤプシドのタンパク質であってもよ 、。なかでも VP1または VP2のキヤプシドタンパ ク質が好ましい。

[0054] 他に、使用されるウィルスタンパク質として、ウィルス核酸 (DNAまたは RNA)と結 合したタンパク質、このタンパク質 ·核酸複合体を包むようにしているタンパク質、上記 キヤプシドの裏打ちをするタンパク質などもある。さらにエンベロープを有するウィル スでは、そのエンベロープを構成する脂質膜に結合するか、一緒に膜を構成してい るエンベロープタンパク質の 、ずれも、本発明構造体のウィルスタンパク質として用 いることができる。また粒子形成能が保持され、発揮される限り、異種のウィルスに由 来する複数のタンパク質、または同一ウィルスの異なる種類のウィルスタンパク質を 適宜に組み合わせて用いてもよい。具体的には 2種のキヤプシドタンパク質、例えば VP 1と VP2とを一緒に使用してもょ 、。

[0055] ，ゥイノレス

ウィルスタンパク質を供給するウィルスの種類には特に限定されず、各種のウィル スからの様々なタンパク質が本発明の構造体に用いることができる。本発明を適用で きるウィルスとして、具体的には SV40ウィルス、 JCVウィルス、 BKVウィルスなどのパ ポーパウィルス属のウィルス；へパドナウィルス（B型肝炎ウィルスなど）、アデノウィル ス、フラビウィルス (日本脳炎ウィルスなど）、ヘルぺスウィルス（単純へルぺスウィルス 、水痘 帯状疱疹ウィルス、サイトメガロウィルス、 EBウィルスなど）、ボックスウィルス 、ノ ルボウイルス（アデノ関連ウィルスなど）、オルソミクソウィルス (インフルエンザウイ ルスなど）、ラブドウィルス (狂犬病ウィルスなど）、レトロウイルス (後天性免疫不全症 候群ウィルスなど）、 C型肝炎ウィルス、レンチウィルス、ヘルぺスウィルス、バクテリオ ファージ、インフルエンザウイルス、センダイウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュ ロウィルスなどのウィルスを挙げることができる。なかでも正二十面体の構造を呈する ウィルスが好ましい。 [0056] ウィルスにより、宿主 (本発明構造体の投与を受けるヒト被検者も含まれる）の細胞 に対する親和性、吸着の特異性が異なるために、必要とする構造体の指向特性を考 慮してウィルスの種類を選択してそのタンパク質を利用することが望ま 、。これによ り、特異的なターゲティング性能を付与することができる。

[0057] ウィルスタンパク質を生体に適用される製剤に使用される場合に、直ちに問題とな るのは、その安全性である。ウィルス自身が病原性を有していたり、その構造タンパク 質が細胞障害性を持っていたり、抗原性を示すものもある。この観点から、パポーパ ウィルス属のウィルス、特に SV40ウィルス、 JCVウィルス、 BKVウィルスからのウィル スタンパク質が好ましいと言える。これらのウィルスは、宿主に感染してもほとんどこれ に起因する病理的兆候が認められず、ヒトには無害である力 極めて病原性が低いと 考えられている。霊長類に感染するパポーパウィルス、中でヒトへの高い安全性およ び高 、構造安定性を有する SV40ウィルスでは、ヒトに投与しても抗原性が認められ ない利点がある。他方、 JCVウィルスは、脳部位で感染するウィルスであるため、その タンパク質も血液-脳関門を通過できる特性があるが、抗原性を有する。本発明の構 造体においては、ウィルスタンパク質としてパポーパウィルス属由来のものが特に好 ましい。

[0058] ·ウィルスタンパク質の変異体または改変体

ウィルスタンパク質は、天然のウィルスカゝら得られる、ネイティブなタンパク質を精製 して用いてもょ ヽが、必要な修飾を施したウィルスタンパク質の変異体または改変体 も好ましく利用することができる。あるいはネイティブなウィルスタンパク質とその変異 体または改変体とをともに使用してもよい。このような変異体または改変体を用いる理 由として、ウィルス粒子様構造体の抗原性を軽減するか、あるいは免疫監視機構カゝら 力も認識されに《なる（ 、わゆる「ステルス化」された状態である)効果が期待できる。 またはターゲティング機能を付与する観点から、特定の臓器、組織、細胞への親和 性を増強する必要性も生じる。あるいは構造体のより安定性を高める必要性もある。 さらにはタンパク質表面に様々な機能を付加し得る部分を形成する要求に応じる必 要性がある。このように様々な観点力もの要求に対しても、タンパク質分子の適切な 修飾により応じることが可能である。 [0059] ウィルスタンパク質の親水的傾向を増強することにより血中安定性を増して、長時 間にわたり血液中の濃度を維持できる。また血中滞留性を向上させるために、タンパ ク質表面にポリエチレングリコール (PEG)またはポリアルキレンォキシド鎖を導入して 親水性を増すことが可能である。そのォキシエチレン単位の長さと導入する割合を適 宜変えることにより、その機能を調節することができる。 PEGとして、ォキシエチレン単 位が 10〜3500のポリエチレングリコールが好適である。

[0060] ウィルスタンパク質の表面に導入されたポリエチレングリコール、ポリアルキレンォキ シド鎖の先端に、さらに機能性官能基として、「機能性物質」を付してもよい。先端に「 機能性物質」を結合しているポリアルキレンォキシド鎖が固定化された構造体は、ポリ アルキレンォキシド鎖導入の効果に加えて、ポリアルキレンォキシド鎖に邪魔されるこ となく「機能性物質」の機能、例えば「認識素子」として特定臓器指向性、特定の組織 指向性などの作用が充分に発揮される。

[0061] ウィルス粒子様の表面、実際にはウィルスタンパク質の表面を、「機能性物質」とし て薬剤分子、レポーター標識 (例として、発色物質、酵素または放射性標識)または 親和性リガンド (例えば抗体または抗体フラグメント、特異的な結合をするパートナー 片割れ (具体的にはピオチンまたはストレプトアビジン）、オリゴペプチド、オリゴヌタレ ォチドまたはオリゴ糖)を、粒子を構成するウィルスタンパク質にカップリングさせるこ とにより機能化させてもよい。直接的なカップリングは、タンパク質の官能基、例えば アミノ基、ォキシカルボ-ルイミダゾール基、 N—ヒドロキシコハク酸イミド基といった反 応性に富む官能基によって結合される。

[0062] 親和性リガンドには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、 核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖糖、糖類、ペプチドをコ ードする核酸分子、レクチン、細胞接着因子、抗原、薬剤および他のリガンドなどが 挙げられる。

[0063] ·変異体または改変体の作製

上記のようにウィルスタンパク質は、ネイティブのウィルスタンパク質と機能的に等価 である変異体もしくは改変体であってもよい。すなわち粒子形成能を保持し、しかもネ ィティブのウィルスタンパク質の有する標的の組織性または細胞指向性を改変した変 異体もしくは改変体であってもよい。この場合の変異体または改変体は、突然変異誘 発法、化学修飾法または遺伝子組換え技術により得られる。ウィルスタンパク質の変 異体もしくは改変体とは、ウィルスタンパク質を構成するアミノ酸配列において、 1個 以上、好ましくは 1個もしくは数個、より好ましくは 1〜24個、さらに好ましくは 1〜15 個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基により置換されたアミノ酸配列 力もなるタンパク質である。また、力 うな変異体もしくは改変体は、粒子形成能を有 するものである。

[0064] ここで「欠失」とは、ネイティブタンパク質のポリペプチド鎖から、 1個以上のアミノ酸 残基が喪失されていることをいう。逆に「付加」とは、ポリペプチド鎖に 1個以上のァミノ 酸を挿入することであり、 1箇所にペプチドの形態で入れてもよい。また「置換」とは特 定部位のアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸に置き換えることを言う。

[0065] 「機能的に等価」なる用語は、アミノ酸配列において 1個または複数個のアミノ酸の 欠失、置換、付加および/または挿入により修飾されたアミノ酸配列である力、あるい は、アミノ酸配列において、例えばリン酸化もしくは脱リン酸化、ダルコシル化もしくは 脱ダルコシルイ匕などにより化学的にアミノ酸残基の側鎖が修飾された配列であるが、 それにも拘わらず天然ウィルスタンパク質と実質的に同等の作用あるいは活性が維 持されていることに対応している。このような機能的に等価な変異体は、天然の生物 学的突然変異として発生することがあるが、特定部位の突然変異誘発、不特定部位 の突然変異誘発の方法により作製してもよい。さらに改変体は、化学修飾法、酵素的 開裂および Zまたは連結反応などの公知技術を用いて製造することができる。発現 制御配列を作動的に結合させた適切な核酸分子を宿主細胞で発現させるか、また はそのような組換え DNA分子を含む組換え DNAクローユングベクターを発現させる 組換え手段により、あるいは化学的または生化学的な合成 (細胞外）により調製する ことちでさる。

[0066] ウィルスタンパク質の突然変異体あるいはネイティブタンパク質を人工的に一部もし くは全部合成されたもの、または生物起源のタンパク質を改変して得られた改変体は 、上記のようにそのウィルス起源のタンパク質にない機能を有する力、あるいは不適 切な性質、例えば抗原性が改善されたものであってもょ ヽ。 [0067] ウィルスタンパク質の変異体または改変体は、粒子形成能を喪失して 、る場合、あ るいは抗原性が強化される場合もある。このような変異体または改変体は本発明の構 造体に利用することができない。したがって、ウィルスタンパク質の変異体または改変 体には、事前にこのような不利な性質を示さないかをチェックする必要性はついて回 る。

[0068] ウィルスタンパク質、ウィルスタンパク質の変異体または改変体は、 SV40ウィルス、 JCVウィルスまたは BKVウィルスなどの VPキヤプシドタンパク質およびその変異体ま たは改変体の少なくとも 1種であることが望ましい。ウィルスタンパク質の中でもこれら のキヤプシドタンパク質は、アミノ酸配列が既知であり、容易に入手でき、また精製が できるためである。

[0069] 本発明者らの研究により、 SV40の VP1キヤプシドタンパク質、 JCVキヤプシドタン パク質、 BKVキヤプシドタンパク質の場合、粒子形成能および細胞接着性を保持し 得る外来ペプチド挿入可能部位が存在して ヽることが見出された。さらに挿入した外 来ペプチド鎖の種類によっては、細胞指向性を変更することも確認された。これらの 知見から、ウィルスタンパク質は、選択的かつ特異的にその担体機能を変化させる可 変性を備えて 、ることがわ力る。

[0070] ，粒子形成促進因子

本発明のウィルス粒子様構造体には、ウィルスタンパク質と前記微粒子との自己集 合と自己組織化を促進する粒子形成促進因子がさらに含まれてもよい。このような粒 子形成促進因子の存在下で、ウィルスタンパク質と金属 (化合物)含有粒子とを混合 した場合でも、ウィルスタンパク質が備えている自己集合的組織化の発揮が促進され 、効率よく構造要素が会合して組織化が進み、その結果としてほぼ同一サイズの構 造体が形成される。

[0071] 粒子形成促進因子として、ウィルス粒子のキヤプシドタンパク質、 DNA、 RNAまた は生体高分子、人工高分子、化合物単量体、もしくはこれらで表面をコーティングし たフェライト粒子などが挙げられる。生体高分子としては、 DNA、 RNA、またはタン ノ ク質などが挙げられる。また、人工高分子としては、ポリエチレンィミン、ポリ— L— グルタミン酸、ポリ一 L—リジン、ポリ一 L—ァスパラギン酸、ポリ一 L—アルギニンなど が挙げられる。化合物単量体としては、クェン酸、ジメルカプトコハク酸などが挙げら れる。ウィルスのキヤプシドタンパク質では、粒子形成促進活性を有する領域は、アミ ノ末端の領域であることが知られて 、る。例えば SV40ウィルスのキヤプシドタンパク 質 VP2では、少なくとも 1〜272位のアミノ酸配列を有するポリペプチドが粒子形成 促進因子として機能を発揮できる。キヤプシドタンパク質の VP 1は、ペンタマ一を形 成するが、粒子形成因子の存在下でその構造が変化して互いに会合し、正 20面体 の構造体を形成する。生体高分子等でコーティングされて ヽるフェライト粒子の場合 、表面が電荷 (例えばカルボキシル基)を有することが好ま U、。

[0072] 製造方法

上記のウィルス粒子様構造体は、以下のようにして作製することができる。

[0073] 本発明のウィルス粒子様構造体の形成方法は、ウィルスタンパク質および Zまたは その変異体もしくは改変体と、被封入物質である金属および金属化合物の少なくとも 一方を含む微粒子とを、 100mM〜500mMの一価陽イオンおよび 2 μ M〜50mM の二価陽イオンの存在下で、 pH5〜pH10で、 15〜30°Cにてインキュベートすること を特徴としている。

[0074] 具体的には既存のタンパク質精製技術を利用して精製したウィルスタンパク質に、 被封入物質である金属もしくは金属化合物を含有する微粒子とを充分に撹拌しなが ら混合する工程 (I)と、工程 (I)で得られた混合物を 100mM〜500mMの一価陽ィ オンおよび 2 M〜50mMの二価陽イオンの存在下で、 pH5〜pH10で、 15〜30 °Cにてインキュベートする工程 (Π)とを含む。

[0075] 工程 (I)の後、工程 (II)の前に、塩 (例えば NaCl、 CaClなど）、キレート化剤（例え

2

ば EDTA、 EGTAなど）、さらに必要であれば還元剤（例えば、 DTT)などを含む緩 衝液をカ卩えて、次いでこの混合溶液を 4°Cで所定の時間、インキュベートしてもよい。 工程 (Π)の好ましい一実施形態を挙げると、溶液を 15〜20時間、好ましくは 16時間 、 15〜30。Cで ρΗ5, 7または ρΗ9の 100mM〜500mMの一価陽イオンおよび M〜50mMの二価陽イオンを含む溶液で透析をする。

[0076] 前記一価陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモ-ゥムイオンな どが挙げられ、好ましくはナトリウムイオンである。また、二価陽イオンとしては、マグネ シゥムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられ、好ましくはカルシウムイオンである。 さらに前記一価陽イオンの濃度が 100〜500mMであることが望ましぐ 100-200 mMであることがより望ましぐ 140〜160mMであることがさらに望ましぐ 150mMで あることが最も望ましい。また前記二価陽イオンの濃度が l〜5mMであることが望ま しぐ 2mMであることがより望ましい。

[0077] 表面荷電として正または負の電荷を有し、金属 Z金属化合物を含む微粒子と、ウイ ルスタンパク質および Zまたはその変異体もしくは改変体とを含有するウィルス粒子 様構造体の製造において、ウィルスタンパク質と、当該ウィルスタンパク質 360重量 部に対して、金属 Z金属化合物を含む微粒子 0. 01〜： LOO重量部とを混合し、一価 の金属塩および二価の金属塩を含む水溶液に対して透析することにより調製される ことを特徴とする製造方法も本発明の方法である。

[0078] 該製造方法において、金属 Z金属化合物を含み、負の電荷を有する微粒子の前 記ウィルスタンパク質に対する重量比が 0. 2以上であることが好ましぐ 0. 2〜3であ ることがより好ましぐ 0. 2〜0. 27であることがさらに好ましい。

[0079] さらに該製造方法において、前記一価の金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、 アンモ-ゥム塩などが挙げられ、ナトリウム塩であることが望ましぐまた前記二価の金 属塩としては、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられ、カルシウム塩であるこ とが望ましい。

[0080] 金属 Z金属化合物を含む微粒子は、すでに報告されている技術を適用して製造す ることができる。凝集性の金属、金属イオンもしくは金属化合物のクラスタをナノ粒子 として形成する。あるいはバインダーに沈着させる力 リンカ一分子を介して連結させ る。溶液金属の還元による力、コロイドベースの沈着プロセスによるものである。

[0081] 金属 Z金属化合物を、金属を含有しな 、、例えば有機物等で被覆してもよ 、し、逆 に非金属化合物力 なる粒子を金属もしくは金属化合物で被覆してもよい。さらに、 例えば Au S粒子上に Auの還元 (硫ィ匕ナトリウムによるクロ口金酸の還元）により金で

2

被覆した Au Sコアを有する粒子のような、金属もしく金属化合物のみ力 なるコア

2 Z シェル構造の粒子にすることもできる。別の方法として、金属もしくは金属化合物をモ ノマーと混ぜて重合させ、ポリマー中に分散させてもよい。 [0082] 利用の態様

本発明のウィルス粒子様構造体力 生体内に導入されると、そのウィルスタンパク 質集合体に封入された金属 Z金属化合物は、予定された機能を発揮する。磁性金 属であれば、ヒステリシス損による熱を発散させ、磁気共鳴の場合にはその信号を、 発光体であれば、光を発して、これに付随して生体内の情報も提供される。発熱の場 合には治療に、信号に付加される生体情報は診断に利用できる。したがって、上記 ウィルス様構造体を含有する製剤は、そうした目的を達成するためのものであり、本 発明に含まれる。

[0083] '画像化剤

具体的には前記の製剤が、画像化剤、腫瘍に対する診断剤または治療剤である。 さらに具体的には前記製剤が、画像化剤として超音波画像診断装置、核磁気共鳴 画像ィ匕診断装置または X線画像診断装置のための造影剤であることが望ましい。

[0084] 磁気共鳴造影剤に用いられる常磁性金属化合物の金属原子として、各種の常磁 性金属を用いることができる。本発明のウィルス粒子様構造体に封入して好適に磁 気共鳴造影剤として用いられる磁性体粒子は、特に鉄、酸化鉄、フェライトを主成分 とするものである。磁鉄鉱、 Fe O、 Fe O、混合フェライト、有機強磁性材料を包含

2 3 3 4

する他の鉄含有化合物などいずれも使用することできるが、最大の磁力を示す Fe O

3 であるフ ライト (Fe Oと δ -Fe Oの固溶体）は磁気応答性が良好であり、特に

4 3 4 2 3

好ましい。

[0085] 磁気共鳴造影剤に用いられる常磁性金属化合物の金属原子として、上記の鉄以 外にも原子番号 57〜70のランタノイド系元素、特にガドリニウム（Gd)、ジスプロシゥ ム（Dy)、イッテルビウム（Yb)、プラセオジム（Pr)、ネオジム（Nd)、サマリウム（Sm) 、テルビウム（Tb)、ホルミウム（Ho)、エルビウム（Er)、クロム（Cr)、マンガン（Mn)、 コバルト（Co)、ニッケル (Ni)、銅（Cu)の遷移金属種などが挙げられる。

[0086] 上記遷移金属を用いる場合、二価または三価のイオンとキレートイ匕化合物とを反応 させて形成された錯体をウィルスタンパク質集合体の中に内包させる態様であっても ょ 、。その理由はタンパク質が分解を受けたりして常磁性金属イオンが構造体の外 に出ても、錯体の形態であればその毒性が軽減されるからである。例えば遊離のガド リュウムは組織に沈着し肝臓 ·骨髄などに強い毒性を示すが、キレート化により腎臓 力も速やかに排泄される。このようにキレートイ匕化合物は、重金属である常磁性金属 の毒性を低下させるとともに、その投与を補助する機能、生体内での移行、排泄、常 磁性金属のプロトンとの作用などにおいても有用性を発揮する。

[0087] キレートイ匕化合物として、常磁性金属原子と錯体を形成でき、かつ本発明のウィル ス粒子様構造体と適度の親和性を有するものであれば特に限定されない。具体的に は架橋鎖として活性アミノ基を有する鎖式または環式のポリアミノポリカルボン酸であ つて、金属イオンを捕捉して錯体を形成する能力を有する二官能性構造をもったもの が好ましい。例えば、 DTPA (ジエチレントリァミンペンタ酢酸）の誘導体およびその 塩が考えられる。具体的にはモノアルキルアミド DTPA、ジアルキルアミド DTPA、モ ノアリールアミド DTPA、ジァリールアミド DTPA、モノアルキルエステル DTPA、ジァ ルキルエステル DTPA、モノアリールエステル DTPA、ジァリールエステル DTPA、 アルキル化 DTP Aなどが例示される。これらの化合物のうち、アルキルとして炭素数 1 20のアルキル基、ァリールとしてフエ-ル、ナフチルが例示される。ァリールは、アル キル、ハロゲン原子などで置換されていてもよい。

[0088] キレート化ィ匕合物のほかの例として、 TTHA (トリエチレンテトラァミンへキサ酢酸）、 EDTA (エチレンジアミンテトラ酢酸）、 DOTA(l, 4, 7, 10—テトラァザシクロドデカ ン一 1, 4, 7, 10—テトラ酢酸）、 EHPG (N, N—エチレンビス [2— (2—ヒドロキシフ ェ -ル）グリシン] )、 Cy clam (1, 4, 8, 11—テトラァザシクロテトラデカン）、 NTA、 H EDTA, BOPTA、 NOTA、 D03Aゝ HPD03A、 EOB— DTPAゝ TETA、 HAM, DPDP、ポルフィリンおよびその誘導体などが挙げられる（なお EOBは、エトキシベン ジルを意味する。）。

[0089] 上記常磁性金属原子イオンとキレート化剤とを常法によりキレート結合させる。その 結果、生成した常磁性金属またはその化合物の誘導体の例として、次の化合物が例 示される： Gd— DTPA, Gd— EOB— DTPA, Yb— EOB— DTPA, Dy— EOB— DTPA, Mn-DTPA, Gd— BOPTA, Gd— DOTA, Gd— HPD03A。ガドブト口 ール (gadobutrol)のような金属含有大環に基づく化合物も適して!/、る。

[0090] 台療剤 癌の温熱療法は、レーザー治療法、光線力学療法などともに非侵襲的な癌治療法 の範疇に属する。このように、癌の温熱療法は、独特の特性、優れた側面を有する治 療法であるが、必ずしも癌の治療現場では積極的に採用されて来な力つた。温熱療 法は単独で用いるのではなぐむしろ放射線ゃ抗癌剤の効果を強めることを目的に、 放射線ゃ抗癌剤と併用されて ヽるのが現状である。その理由として!ヽくつか挙げられ るが、必ずしもその治療効果が他の治療法を凌ぐほどの成果を上げることができない ために、従来法にとって代わるほどの理由はなかったと言っても差し支えない。このた め、癌の温熱療法に使用される部材、薬剤、装置に依然として改良の余地があると 考えられる。

[0091] 今のところ、この治療法の対象となるのは、通常の治療法では治すことが難しい局 所進行癌や再発癌である。温熱療法には全身を加温する方法 (全身温熱療法)と、 癌やその近傍を温める方法 (局所温熱療法)がある。一般には局所温熱療法が主に 行われる方法であり、マイクロ波、電磁波（交番磁場)、超音波を用いた装置で局所を 加温する。身体の外から加温する方式が最も多く行われるが、その他に食道、直腸、 子宮、胆管といった管腔内に器具を入れて加温する方法、癌組織の中に数本の電 極針を刺し入れて加温する方法なども試みられて!/、る。癌に対する効果は 41°C以上 で得られる力 42. 5°C以上で特に強くなることが知られている。身体の表面に近い 癌は目的の温度まで比較的容易に温めることができる力 身体の奥深いところにある 癌は脂肪、空気、骨が邪魔をして十分に温めることが難しい場合が多ぐ温熱療法の 効果が不十分になることが多 ヽ。そこでウィルス粒子様構造体に磁性粒子を封入さ せた本発明製剤を体内に導入して、温熱療法の発熱素子として使用すれば、身体 奥の癌組織、散在する癌細胞、微小な初期癌の細胞について効果的な治療が可能 となる。

[0092] 本発明の製剤をこのような温熱治療剤として用いる場合は、例えば被検者の静脈 内に、フェライトのような磁性を発現しうる金属または金属化合物力もなる磁性粒子（ 本発明の磁性粒子含有製剤である）を投与し、この投与が開始されてから 1分以上 4 8時間以内、好ましくは 30分以上 36時間以内に、その被検者の癌細胞のある部位 に対して、後述するエネルギー照射を行うことにより、磁性粒子に近接する腫瘍組織 の温度を上昇させ、正常細胞にほとんど影響を与えることなぐ治療を行なうことがで きる。一方、被検者の腫瘍組織の近傍に、直接に磁性粒子含有製剤を注入してもよ く、注入が開始されて力も 0. 5分以上 36時間以内、好ましくは 10分以上 24時間以 内に、被験者の癌細胞のある部位に対して、後述するエネルギー照射を行うことによ り、封入磁性粒子に近接する腫瘍組織の温度を上昇させることができる。

[0093] エネルギー照射としては、好ましくは交番磁場照射または超音波照射が挙げられ、 交番磁場照射は、周波数 25〜500kHzで行うことが好ま 、。

[0094] ，細胞導入用組成物

さらに上記のウィルス粒子様構造体を含有し、前記の金属 Z金属化合物を含む微 粒子を細胞内に導入するための組成物もまた本発明に含まれる。

[0095] 標的細胞の膜内に、目的とする金属 Z金属化合物またはこれを含む粒子を導入す る場合、導入する金属などをウィルス粒子様構造体に封入した形態によれば、容易 かつ効率的に移入することができる。本発明の組成物は、そうしたウィルス粒子様構 造体を含有し、さらに必要な添加物質を含んでなる。添加物質として、上記構造体の 安定化物質、塩類、キレート化剤、融合促進剤としてのポリエチレングリコール、リゾ レシチン、グリセロールォレイン酸エステルなどが挙げられる。トランスフエクシヨンの ための適切な技術はよく知られており、これには、エレクト口ポーレーシヨン、マイクロ インジェクション、リポフエクシヨン、ゥイノレス'トランスフエクシヨンおよびプロトプラスト融 合などが挙げられる。

[0096] ウィルス粒子内に担持されて細胞内に導入 ·移送される金属 Z金属化合物分子は 、上記のように粒子形態にされ、ウィルスタンパク質が形成する粒子様構造体内に取 り込まれる。例えばウィルスの外被 (coat)またはキヤプシドのタンパク質構造体の内 部に取り込まれる。一般的に遺伝子治療または他のインビボ応用に用いられる場合 、安全上の理由から、ウィルスは通常、不能化される。その結果、それらのウィルスは 宿主細胞に感染できる力 新しいヴイリオンを複製、組み立てることはできない。また 新しい細胞に感染し、つまり複製を無能 (incompetent)とすることはできない。遺伝 子治療に使用されて ヽるアデノウイルスもまた、本発明の使用に好まし ヽウィルスの 系である。上記のウィルス粒子様構造体も不能化されていることに変わりはない。 [0097] [実施例]

以下に示す実施例は、本発明の範囲内の好適な態様にすぎない。また、実施例中 で用い

る装置名及び、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度等の数値的条件、 処理方法

等はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。

[0098] (実施例 1)

フェライト粒子の合成

一般的な共沈法により合成を行なった。具体的には、 0. 1M FeCl水溶液 8. 3m

2

Lと 0· 1M FeCl水溶液 16. 7mLを混合した水溶液 25mLを 200mM NaOH水

3

溶液 50mL中に添加し、 1時間室温で攪拌することでフェライト粒子 (Fe Oおよび γ

3 4

-Fe Oの固溶体)を調製した。

2 3

[0099] ここで調製されたフェライト粒子は、透過型電子顕微鏡による観察から平均粒子径

8nmであることが確認された。

[0100] (実施例 2)

クェン酸固定ィ匕フェライト粒子の合成

実施例 1によって調製されたフェライト粒子 180mgに対して、 lOOmMクェン酸ナト リウム水溶液 (PH7. 0)を 50mL添加し、超音波処理を施しながらフェライト粒子表面 へクェン酸分子の固定ィ匕を行なった。得られたクェン酸固定ィ匕フェライト粒子は透析 処理により超純水中へ分散した状態にした。その後、分散液中に含まれる凝集物を 取り除くために遠心処理を行い、その上清をクェン酸固定ィ匕フヱライト粒子として回 収した。得られたクェン酸固定ィ匕フェライト粒子は動的光散乱法により水溶液中にお V、て平均粒子径 12nm程度で分散して 、ることが確認された。

[0101] (実施例 3)

ジメルカプトコハク酸固定ィ匕フェライト粒子の合成

実施例 1によって調製されたフェライト粒子 180mgに対して、 lOOmMジメルカプト コハク酸ナトリウム水溶液 (pH7. 0)を 50mL添カ卩し、超音波処理を施しながらフェラ イト粒子表面へジメルカプトコハク酸分子の固定ィ匕を行なった。得られたジメルカプト コハク酸固定ィ匕フェライト粒子は透析処理により超純水中へ分散した状態にした。そ の後、分散液中に含まれる凝集物を取り除くため遠心処理を行い、その上清をジメル 力プトコハク酸固定ィ匕フェライト粒子として回収した。得られたジメルカプトコノ、ク酸固 定ィ匕フェライト粒子は、動的光散乱法により水溶液中において平均粒子径 12nm程 度で分散して ヽることが確認された。

[0102] (実施例 4)

フェライト含有ウィルス様粒子の再構成

精製した SV40の VP 1五量体タンパク質、 10 gに実施例 2のクェン酸固定ィ匕フエ ライト粒子、 3. 6 X 10¹²粒子 (4800ng)を混合した。この混合液を 20mM Tris— H Cl(pH7. 9)、 150mM NaCl、 5mM EGTA、 5mM DTT溶液で総体積を 100 Lに定容した。この混合溶液を 150mM NaClおよび 2mM CaClを含む溶液を

2

pH5 (HCl[pH5. 0])、pH7 (20mM Tris— HCl[pH7. 0])および pH9 (20mM Tris— HCl[pH9. 0])に調整した各溶液に 16時間、室温（22°C)で前記混合物を 透析することにより溶媒を置換した。

[0103] この溶液を回収して、透過型電子顕微鏡を用いて、置換した溶媒中の VP 1五量体 の集合化様式を観察した。フェライト粒子の添カ卩により、 12個の VP1五量体タンパク 質の集合体である、 T= 1ウィルス粒子様の構造体の形成が確認された。

[0104] このようなフェライト含有ウィルス様粒子の再構成実験から、ナノ磁性フェライト粒子 をウィルス様粒子の内部へ包含させることができることが示された。

[0105] (実施例 5)

フェライト量を変えた場合のウィルス粒子様構造体の形成効率

精製した SV40の VP 1五量体タンパク質、 10 gに実施例 2のクェン酸固定ィ匕フエ ライト粒子、0. 3 X 10¹⁰粒子 (48ng)ゝ 3. 6 X 10¹¹粒子 (480ng)ゝ 1. 1 X 10¹²粒子 (15

OOng)および 3. 6 X 10¹²粒子 (4800ng)それぞれを混合した。この混合液を 20mM Tris-HCl (pH7. 9)、 150mM NaCl、 5mM EGTA、 5mM DTT溶液で総 体積を 100 /z Lに定容した。この混合溶液を 150mM NaCl、 2mM CaClを含む

2 溶液を pH5 (20mM Tris— HCl[pH5. 0])、pH7 (20mM Tris— HCl[pH7. 0 ])および pH9 (20mM Tris— HCl[pH9. 0])に調整した各溶液に 16時間、室温（ 22°C)で透析をすることにより、置換した。

[0106] この溶液を回収して、透過型電子顕微鏡を用いて、置換した溶媒中の VP 1五量体 の集合化様式を観察した。通常、 VP1タンパク質のみで透析した場合には、チュー ブ状の構造物が形成された。この条件でフェライト粒子の添加量に依存して、 12個 の VP1五量体タンパク質の集合体である、 T= 1ウィルス粒子様の構造体の形成が 確認された。

[0107] 図 1に示すように、フェライト粒子の添カ卩により、 12個の VP1五量体タンパク質の集 合体である、 T= lウィルス粒子様の構造体の形成が確認された。なお、図 1に示し たものは、フェライト粒子を 3. 6 X 10¹²粒子 (4800ng)添カ卩したものである。

[0108] (実施例 6)

画像化剤

ラット副腎褐色細胞腫由来の細胞株 PC— 12は定法に従って培養し、培地 2mL当 たり 2 X 10⁵細胞を直径 35mmプレート（6— well plate)に播種し、ー晚培養した後 、上述の実施例 5で作製したフェライト粒子 3. 6 X 10¹²粒子 (4800ng)を包含するゥ ィルス粒子様構造体の懸濁液 35 μ Lを、 PC— 12細胞（2mL culture)〖こ添加し、 同プレートを 35°C、 1, 600 X g、 10分間遠心した。遠心後、培地交換し、プレートを 37°C、 5% CO下、 20時間インキュベートし、 PC— 12内にフェライト粒子を包含す

2

るウィルス粒子様構造体を導入した。なお、ネガティブコントロールとして、フェライト 粒子を包含しな 、ウィルス粒子様構造体を用 、て前述と同様の方法で作製した。

[0109] 次に、上述のウィルス粒子様構造体を導入した PC— 12細胞とフェライト粒子を包 含しないウィルス粒子様構造体をそれぞれトリプシン処理によりプレートから剥がし、 培地 0. 2mLに懸濁させ (約 1 X 10⁶細胞 ZmL)、これを NMR試料管に細胞懸濁液 0. 2mLを採取し、磁気共鳴計測（2テスラ動物実験用 CSI :ブルーカー、カールスル エー、ドイツ)を行った。撮像方法にはスピン'エコー法を用い、関心領域 (FOV) 35 mm X 35mm,スライス厚 4mm、マトリックス 256 X 128に設定して、 T—強調画像と T 強調画像を観察した。 T 強調画像の撮像条件は、繰り返し時間 (TR) 500m

2 1

s、エコー時間（TE) 18ms,フリップ角 90° 、 2回スキャンで、約 2分の計測時間を要 した。また、 T—強調画像の撮像条件は、繰り返し時間 2000ms、エコー時間 80〜1 20ms,フリップ角 90° 、 4回スキャンで、約 17分の計測時間を要した。それぞれの 元データにはゼロ'フィルをカ卩えて画像化し、最終的〖こマトリックス 256 X 256の画像 データを得た。その結果、フェライト粒子を包含しないウィルス粒子様構造体を導入 した PC— 12細胞懸濁液の T2—強調画像の信号強度を 100とした際、フェライト粒 子を包含するウィルス粒子様構造体を導入した PC— 12細胞懸濁液の T2—強調画 像の信号強度力 0であった。

[0110] 上記のことから本発明のフェライト粒子を包含するウィルス粒子様構造体は、生体 に対する画像化剤や診断剤として有効に機能することが期待される。

[0111] (実施例 7)

温熱治療剤

ラット副腎褐色細胞腫由来の細胞株 PC— 12は定法に従って培養し、培地 2mL当 たり 2 X 10⁵細胞を直径 35mmプレート（6— well plate)に播種し、ー晚培養した後 、上述の実施例 5で作製したフェライト粒子 3. 6 X 10¹²粒子 (4800ng)を包含するゥ ィルス粒子様構造体の懸濁液 35 μ Lを、 PC— 12細胞（2mL culture)〖こ添加し、 同プレートを 35°C、 1, 600 X g、 10分間遠心した。遠心後、培地交換し、プレートを 37°C、 5% CO下、 20時間インキュベートし、 PC— 12内にフェライト粒子を包含す

2

るウィルス粒子様構造体を導入した。なお、ネガティブコントロールとして、フェライト 粒子を包含しな 、ウィルス粒子様構造体を用 、て前述と同様の方法で作製した。

[0112] 次に、上述のウィルス粒子様構造体を導入した PC— 12細胞とフェライト粒子を包 含しないウィルス粒子様構造体のプレートを用いて、プレート内の PC— 12細胞の温 度計測を行なうため、光ファイバ温度計を配置し、共振周波数 300KHz、磁界を発 生させるためのコイルの直径 200mm、磁場強度 6mT、電流 225A、出力 3KW、ァ プリケーターからの距離 20mm、の条件で 2分間交番磁場照射したところ、ウィルス 粒子様構造体を導入した PC— 12細胞のプレートの方が約 6°C温度が高くなつた。

[0113] 上記のことから、本発明のフェライト粒子を包含するウィルス粒子様構造体は、生体 に対する温熱治療剤として有効に機能することが期待される。

[0114] (実施例 8)ショ糖密度勾配遠心によるフェライト含有ウィルス様粒子の解析

20% (wZv)から 40% (wZv)ショ糖（20 mM Tris— HCl (pH 7. 9) )の密度 勾配溶液 600 ^中に、上述の実施例 5で作製したフェライト粒子 3. 6 X 10¹²粒子 (4 800ng)を包含するウィルス様粒子溶液 20 1を添カ卩し、 50, OOOrpmで 1時間遠心 した。遠心後、上から 55 1ずつ吸い取ることにより 12分画した。

[0115] このうち 7 μ 1を使って、抗 VP 1抗体を用いたウェスタンブロットを行い VP 1の存在す る画分を調べた。コントロールとして、中空のウィルス様粒子溶液も同様の実験を行 つた o

[0116] 中空の T= lウィルス様粒子は 3— 4画分、大型のウィルス様粒子は 7— 9画分に検 出された（図 2— Α)のに対して、フェライト含有の T= lウィルス様粒子は 7— 9画分に 検出された (図 2— Β上)。

[0117] また、残り 48 1を使って、 6Μ HC1 50 1, 908mMァスコルビン酸 100 1添 カロ後 10分間静置し、次に 1. 04mM 5-Br-PSAA 150 1、 3. 66M醉酸ナトリ ゥム 150 1添加後 20分間静置して、 558nmの吸光度測定によってフェライト由来の Fe²⁺の存在する画分を調べた。コントロールとして、フェライト溶液も同様の実験を行 つた o

[0118] フェライトそのものは 12画分に検出された（図 2— C下）のに対して、フェライト含有 ウィルス様粒子は 7— 9画分に検出された（図 2— B)。

[0119] 上記のことから、フェライト含有ウィルス様粒子は中空のウィルス様粒子より密度が 高くなり、かつフェライトが吸着していることがわかる。

[0120] (実施例 9)モリブデン酸アンモ-ゥム染色によるフェライト含有ウィルス様粒子の電 子顕微鏡観察

上述の実施例 5で作製したフェライト粒子 3. 6 X 10¹²粒子 (4800ng)を包含するゥ ィルス様粒子溶液をモリブデン酸アンモ-ゥムで染色後、透過型電子顕微鏡観察を 用いて観察した。コントロールとして、中空のウィルス様粒子にフェライトをカ卩えた状 態の溶液も同様の実験を行った。

[0121] すべてのフェライト含有ウィルス様粒子の中心にフェライトが観察できた（図 3左）の に対して、コントロールではウィルス様粒子の周囲にフェライトが付着している状態は 観察できたが中心にフェライトは観察できな力つた（図 3右)。

[0122] 上記のことから、フェライト含有ウィルス様粒子はすべてフェライトを内包しているこ とがわかる。

[0123] (実施例 10)フェライト表面の被覆物質による VP1五量体タンパク質の集合ィ匕様式 の影響

精製した SV40 VP1五量体タンパク質、 10 gに実施例 3のジメルカプトコハク酸 固定化フェライト、 3. 6 X 10¹²粒子（14100ng)を混合し、 20mM Tris— HCl(pH 7. 9) , 150mM NaCl, 5mM EGTA, 5mM DTT溶液で総体積を 100 1に定 容した。この混合溶液を 150mM NaCl, 2mM CaCl , pH7の溶液に 16時間、室

2

温で透析をする事で溶媒を置換した。

[0124] この溶液を回収し、透過型電子顕微鏡を用いて、置換した溶媒中の VP1五量体の 集合化様式を観察した。ジメルカプトコハク酸固定ィ匕フェライトの添カ卩によって、 12個 の VP1五量体タンパク質の集合体である T= lウィルス様粒子の形成が確認された。 (図 4— Α)また、ショ糖密度勾配遠心による解析では、クェン酸固定ィ匕フェライトの場 合と同程度の形成効率であつた (図 4 Β)。

[0125] 上記のことから、フェライト含有ウィルス様粒子の形成は、表面が負に帯電して!/、る フェライトの粒子数に依存して 、ることがわ力る。

[0126] さらに、本出願は、 2006年 4月 3日に出願された日本特許出願番号 2006— 1023 51号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている

Claims

請求の範囲

[1] ウィルスタンパク質と、

被封入物質である金属および金属化合物の少なくとも一方を含む微粒子と、 を含有し、実質的に均一サイズであるウィルス粒子様構造体。

[2] 前記微粒子が表面荷電として正または負の電荷を有する、請求項 1に記載のウイ ルス粒子様構造体。

[3] 前記金属および金属化合物の少なくとも一方が、鉄、酸ィ匕鉄またはフ ライトである

、請求項 1または 2に記載のウィルス粒子様構造体。

[4] 前記ウィルスタンパク質力 正二十面体の構造を呈するウィルスに由来するタンパ ク質およびその変異体または改変体の少なくとも 1種である、請求項 1〜3のいずれ かに記載のウィルス粒子様構造体。

[5] 前記ウィルスタンパク質力 ウィルスのキヤプシドタンパク質およびその変異体また は改変体の少なくとも 1種である、請求項 1〜4のいずれかに記載のウィルス粒子様 構造体。

[6] 前記キヤプシドタンパク質およびその変異体または改変体力 VP1キヤプシドタン パク質、 VP2キヤプシドタンパク質およびそれらの変異体または改変体力 なる群か ら選ばれる少なくとも 1種である、請求項 5に記載のウィルス粒子様構造体。

[7] 前記ウィルスタンパク質がパポーパウィルス属由来のものである、請求項 1〜6のい ずれかに記載のウィルス粒子様構造体。

[8] 前記ウィルスタンパク質が、 SV40ウィルス、 JCVウィルスおよび BKVウィルスから なる群カゝら選ばれるウィルス由来である、請求項 7に記載のウィルス粒子様構造体。

[9] 前記ウィルスタンパク質の変異体または改変体が、ウィルスタンパク質を構成するァ ミノ酸において、 1個以上のアミノ酸が欠失、 1個以上のアミノ酸が付加または他のァ ミノ酸により置換されたアミノ酸配列力 なるタンパク質である、請求項 5に記載のウイ ルス粒子様構造体。

[10] 前記ウィルスタンパク質の変異体または改変体が、遺伝子組換え技術、突然変異 誘発法または化学修飾法により作製された変異体もしくは改変体である、請求項 5に 記載のウィルス粒子様構造体。

[11] 前記ウィルスタンパク質と前記微粒子との自己集合および組織化を促進する粒子 形成促進因子がさらに含まれる、請求項 1〜10のいずれかに記載のウィルス粒子様 構造体。

[12] 前記粒子形成促成因子が、ウィルス粒子のキヤプシドタンパク質、 DNA、 RNA、ま たは生体高分子、人工高分子 ^化合物単量体、もしくはこれらで表面をコーティング したフェライト粒子である、請求項 11に記載のウィルス粒子様構造体。

[13] さらに生理活性物質を含有する、請求項 1〜12のいずれか〖こ記載のウィルス粒子 様構造体。

[14] 請求項 1〜13の ヽずれかに記載のウィルス粒子様構造体を含有する製剤。

[15] 前記製剤が、画像化剤、腫瘍に対する診断剤または治療剤である、請求項 14に記 載の製剤。

[16] 前記製剤が、画像化剤として超音波画像診断装置、核磁気共鳴画像化診断装置 または X線画像診断装置のための造影剤である、請求項 15に記載の製剤。

[17] 前記製剤が癌の温熱療法用の製剤である、請求項 14または 15に記載の製剤。

[18] 請求項 1〜13のいずれかに記載のウィルス粒子様構造体を含有し、前記ウィルス 粒子様構造体に含まれる微粒子を細胞導入するための組成物。

[19] ウィルスタンパク質およびその変異体または改変体の少なくとも 1種と、

被封入物質である金属および金属化合物の少なくとも 1種を含む微粒子とを、

100mM〜500mMの一価陽イオンおよび 2 μ M〜50mMの二価陽イオンの存在 下で、 pH5〜pH10で、 15〜30°Cにてインキュベートすることを特徴とする、ウィルス 粒子様構造体の形成方法。

[20] 前記一価陽イオンがナトリウムイオンである、請求項 19に記載の方法。

[21] 前記二価陽イオンがカルシウムイオンである、請求項 19または 20に記載の方法。

[22] 前記一価陽イオンの濃度が 100〜500mMであり、前記二価陽イオンの濃度が 1

〜5mMである、請求項 18〜21のいずれかに記載の方法。

[23] ウィルスタンパク質およびその変異体または改変体の少なくとも 1種 360重量部と、 表面荷電として正または負の電荷を有し、金属および金属化合物の少なくとも 1種を 含む微粒子 0. 01〜： LOO重量部と、を混合する工程 (I)と、 前記工程 (I)で得られた混合物を一価の金属塩および二価の金属塩を含む水溶 液に対して透析する工程 (II)と、

を含むウィルス粒子様構造体の製造方法。

[24] 金属もしくは金属化合物を含み、負の電荷を有する微粒子の前記ウィルスタンパク 質に対する重量比が 0. 2以上である、請求項 23に記載の製造方法。

[25] 前記一価の金属塩がナトリウム塩であり、前記二価の金属塩がカルシウム塩である 、請求項 23または 24に記載の製造方法。