JPWO2011030682A1 - ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体及びその製造方法 - Google Patents

ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2011030682A1
JPWO2011030682A1 JP2011530804A JP2011530804A JPWO2011030682A1 JP WO2011030682 A1 JPWO2011030682 A1 JP WO2011030682A1 JP 2011530804 A JP2011530804 A JP 2011530804A JP 2011530804 A JP2011530804 A JP 2011530804A JP WO2011030682 A1 JPWO2011030682 A1 JP WO2011030682A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
outer shell
protein
shell constituent
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2011530804A
Other languages
English (en)
Inventor
宏 半田
宏 半田
浩司 土井
浩司 土井
輝也 榎本
輝也 榎本
雅章 川野
雅章 川野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokyo Institute of Technology NUC
Original Assignee
Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Institute of Technology NUC filed Critical Tokyo Institute of Technology NUC
Publication of JPWO2011030682A1 publication Critical patent/JPWO2011030682A1/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5184—Virus capsids or envelopes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
    • C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
    • C12N2810/851—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from growth factors; from growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

多様な薬剤に対応可能なドラッグデリバリー用担体に利用できるウイルス外殻構成タンパク質を含む構造体を提供することを目的として、ウイルス外殻構成タンパク質とそれによって被覆された構造体とからなり、構造体の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されていることを特徴とするウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体を提供する。

Description

本発明は、ウイルス外殻構成タンパク質で被覆した構造体及びその製造方法に関する。本発明のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体は、ドラッグデリバリーや遺伝子治療の担体として有用である。
ドラッグデリバリーシステムは、生体内の薬物分布をコントロールし、副作用を生じさせることなく、薬物の投与量を最適化するために必要なものである。このドラッグデリバリーシステムにおいては、薬剤を送達するための担体が重要である。従来から、ドラッグデリバリー用担体としては、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチンTM試薬）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン）、セラミック材料（例えば、リン酸カルシウム）などが利用されてきている。FDAによって承認された抗がん剤用の担体としては、MPEG-DSPE修飾リポソームを用いてドキソルビシンを内包したDoxyl（登録商標）、ヒト血清アルブミンにパクリタキセルを結合させたAbraxane（登録商標）などがある。これらの担体には、がんに対するアクティブターゲティング能力はないが、EPR（Enhanced permeability and retention）効果と呼ばれる、がん組織に特有の構造に蓄積しやすい特性があるため、抗がん剤の作用を向上させることができる。
最近、本発明者らは、ウイルス外殻構成タンパク質を利用したドラッグデリバリー用担体を開発し、先に特許出願を行っている（特許文献１、特許文献２）。ウイルス外殻構成タンパク質には、１）細胞膜受容体を介する宿主細胞との選択的な結合能（細胞指向性）、２）エンドサイト−シスによる宿主細胞内への侵入能（細胞内輸送能）、３）自己組織化によるナノ構造体形成能（ナノカプセル）、４）ウイルスゲノムのパッケ−ジング活性（内包活性）といったドラッグデリバリー用担体として優れた性質を有している。
国際公開第WO2006/004173号パンフレット 国際公開第WO2007/116808号パンフレット
多様な薬剤に対応するドラッグデリバリーシステムを確立するためには、その薬剤の大きさや形状に関係なく、疾患部位へ送達できる担体が必要である。しかし、上述した特許文献１や特許文献２に記載されている担体は、ウイルス外殻構成タンパク質をウイルス粒子に再構成し、その再構成されたウイルス粒子内に薬剤を収容するものであるため、薬剤の大きさはウイルス粒子の内部に収容可能なサイズに限定されてしまう。
本発明は、このような技術的背景の下でなされたものであり、多様な薬剤に対応可能なドラッグデリバリー用担体を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ウイルス外殻構成タンパク質は、ウイルス粒子の内部に収容できないような大きな構造体に対しては、構造体の表面に非特異的に付着し、ウイルス外殻構成タンパク質からなる層を形成し、構造体を被覆することを見出した。
特許文献１及び特許文献２には、ウイルス外殻構成タンパク質はウイルス粒子に再構成されることが記載されており（例えば、特許文献１の２頁３〜５行、特許文献２の５頁２２〜２６行）、また、送達しようとする薬剤などは、ウイルス粒子の内部に収容されることが記載されている（例えば、特許文献１の２頁８〜１０行、特許文献２の５頁２６〜２８行）。
上述した本発明者によって見出されたウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体は、ウイルス粒子とは異なる構造を持つものであるから、この構造体は、特許文献１及び特許文献２に記載されている薬剤等を収容したウイルス粒子とは異なるものである。
また、本願出願時においては、ウイルス外殻構成タンパク質の集合体は、塩濃度やpHなどによって取りうる構造が固定しており、自由に大きさや形状を変えることはできないものであると考えられていた。例えば、Kanesashiらは、VP1（SV40ウイルスの外殻構成タンパク質）の五量体は、１）1M NaClと2mM CaCl2を含む高塩濃度条件下では、粒径20nm、32nm、及び45nmのナノカプセルおよびチュ−ブ状構造体を形成し、２）CaCl2を含まず、1M NaClのみの条件下では、粒径20nmの均一なナノカプセルのみを形成し、３）2M (NH4)2SO4と2mM CaCl2の条件下では、粒径45nmの均一なナノカプセルを形成し、４）150mM NaClと2mM CaCl2存在下、pH5.0という条件下では、チュ−ブ状構造体のみを形成することを報告している（Kanesashi et al., J. Gen. Virol., 2003, 1899-1905）。
従って、ウイルス外殻構成タンパク質の集合体が、様々な大きさや形状の構造体に対して、その大きさや形状に合わせて構造体を包み込めるということは全く予想外のことであった。
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１５）を提供するものである。
（１）ウイルス外殻構成タンパク質とそれによって被覆された構造体とからなり、構造体の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されていることを特徴とするウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
（２）ウイルス外殻構成タンパク質が、構造体の表面に非特異的に付着していることを特徴とする（１）に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
（３）構造体が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの構造体であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
（４）構造体の粒径が、30nm以上であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
（５）ウイルス外殻構成タンパク質が、SV40ウイルスの外殻構成タンパク質であることを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
（６）ウイルス外殻構成タンパク質と構造体とを、100mM〜500mMの一価陽イオン及び2μM〜50mMの二価陽イオンの存在下で、pH5〜pH10で15〜30℃にてインキュベートすることにより、ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体を製造する方法であって、前記構造体が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの構造体であることを特徴とするウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法。
（７）構造体の粒径が、30nm以上であることを特徴とする（６）に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法。
（８）ウイルス外殻構成タンパク質が、SV40ウイルスの外殻構成タンパク質であることを特徴とする（６）又は（７）に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法。
（９）動物に薬剤を投与し、その動物の疾患部位に薬剤を送達させることにより、その動物の疾患を治療する方法であって、投与する薬剤が、薬剤の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されている薬剤であることを特徴とする疾患の治療方法。
（１０）動物が、ヒト以外の動物であることを特徴とする（９）に記載の疾患の治療方法。
（１１）ウイルス外殻構成タンパク質に、疾患部位に対して親和性を持つ物質が付加されていることを特徴とする（９）又は（１０）に記載の疾患の治療方法。
（１２）ウイルス外殻構成タンパク質が、薬剤の表面に非特異的に付着していることを特徴とする（９）乃至（１１）のいずれかに記載の疾患の治療方法。
（１３）薬剤が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの薬剤であることを特徴とする（９）乃至（１２）のいずれかに記載の疾患の治療方法。
（１４）薬剤の粒径が、30nm以上であることを特徴とする（９）乃至（１３）のいずれかに記載の疾患の治療方法。
（１５）ウイルス外殻構成タンパク質が、SV40ウイルスの外殻構成タンパク質であることを特徴とする（９）乃至（１４）のいずれかに記載の疾患の治療方法。
本発明により、大きさや形状に関係なく多様な薬剤をウイルス外殻構成タンパク質で被覆することが可能になり、これにより、薬剤を疾患部位へ容易に送達することができるようになる。
また、異なる複数の薬剤を同一のウイルス外殻構成タンパク質で被覆することにより、それら複数の薬剤に修飾基を一度に付加することが可能になる。
ウイルス外殻構成タンパク質で被覆したポリスチレンビーズの電子顕微鏡写真（下図）、及びウイルス外殻構成タンパク質で被覆していないポリスチレンビーズの電子顕微鏡写真（上図）。 ウイルス外殻構成タンパク質で被覆したフェライト粒子の電子顕微鏡写真（下図）、及びウイルス外殻構成タンパク質で被覆していないフェライト粒子の電子顕微鏡写真（上図）。 ウイルス外殻構成タンパク質で被覆したDOX包含PLA球状構造体の電子顕微鏡写真（下図）、及びウイルス外殻構成タンパク質で被覆していないDOX包含PLA球状構造体の電子顕微鏡写真（上図）。 ウイルス外殻構成タンパク質で被覆したsiRNA包含PLGA球状構造体の電子顕微鏡写真（下図）、及びウイルス外殻構成タンパク質で被覆していないsiRNA包含PLGA球状構造体の電子顕微鏡写真（上図）。 抗VP1抗体を添加した場合の金コロイド染色をしたポリスチレンビーズの電子顕微鏡写真（下図）、及び抗VP1抗体を添加しない場合の金コロイド染色をしたポリスチレンビーズの電子顕微鏡写真（上図）。矢印で示した黒い点は金コロイドである。 抗VP1抗体を添加した場合の金コロイド染色をしたシリカビーズの電子顕微鏡写真（下図）、及び抗VP1抗体を添加しない場合の金コロイド染色をしたシリカビーズの電子顕微鏡写真（上図）。 ウイルス外殻構成タンパク質のみで形成された粒子のζ電位を示す図。 ウイルス外殻構成タンパク質で被覆した負電荷構造体と被覆していない負電荷構造体のζ電位を示す図。上図は平均粒径が100nmのポリスチレンビーズを用いた場合であり、中図は平均粒径が200nmのポリスチレンビーズを用いた場合であり、下図は平均粒径が500nmのポリスチレンビーズを用いた場合である。 ウイルス外殻構成タンパク質で被覆した正電荷構造体（シリカビーズ）と被覆していない正電荷構造体のζ電位を示す図。 ウイルス外殻構成タンパク質で被覆したsiRNA包含リポソームの電子顕微鏡写真（下図）、及びウイルス外殻構成タンパク質で被覆していないsiRNA包含リポソームの電子顕微鏡写真（上図）。 EGFを固定したフェライト含有ウイルス様粒子とEGFを固定していないたフェライト含有ウイルス様粒子に対する各種細胞の取り込み能を示す図。グラフの縦軸は、細胞中の鉄含有量を示す。 フェライト含有ウイルス様粒子の投与前後のマウスのMRI T2強調画像。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体は、ウイルス外殻構成タンパク質とそれによって被覆された構造体とからなり、構造体の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されていることを特徴とするものである。ウイルス外殻構成タンパク質は、構造体の表面に非特異的に付着していることが好ましい。
（１）ウイルス外殻構成タンパク質
ウイルス外殻構成タンパク質を供給するウイルスの種類には特に限定されず、各種のウイルスからの様々なタンパク質が本発明の被覆構造体に用いることができる。本発明を適用できるウイルスとして、具体的にはSV40ウイルス、JCVウイルス、BKVウイルスなどのパポーバウイルス属のウイルス;ヘパドナウイルス(B型肝炎ウイルスなど)、アデノウイルス、フラビウイルス(日本脳炎ウイルスなど)、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルスなど)、ポックスウイルス、パルボウイルス(アデノ関連ウイルスなど)、オルソミクソウイルス(インフルエンザウイルスなど)、ラブドウイルス(狂犬病ウイルスなど)、レトロウイルス(後天性免疫不全症候群ウイルスなど)、C型肝炎ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、バクテリオファージ、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどのウイルスを挙げることができる。なかでも正二十面体の構造を呈するウイルスが好ましい。
ウイルスにより、宿主(本発明の被覆構造体の投与を受けるヒト被検者も含まれる)の細胞に対する親和性、吸着の特異性が異なるために、必要とする被覆構造体の指向特性を考慮してウイルスの種類を選択してそのタンパク質を利用することが望ましい。これにより、特異的なターゲティング性能を付与することができる。従来の担体の標的がん細胞・組織への蓄積はEPR効果によるものであるため、従来の担体は、特異的なターゲティング性能は有していなかった。
ウイルス外殻構成タンパク質を生体に適用される製剤に使用される場合に、直ちに問題となるのは、その安全性である。ウイルス自身が病原性を有していたり、その構造タンパク質が細胞障害性を持っていたり、抗原性を示すものもある。この観点から、パポーバウイルス属のウイルス、特にSV40ウイルス、JCVウイルス、BKVウイルスからのウイルス外殻構成タンパク質が好ましいと言える。これらのウイルスは、宿主に感染してもほとんどこれに起因する病理的兆候が認められず、ヒトには無害であるか、極めて病原性が低いと考えられている。霊長類に感染するパポーバウイルス、中でもヒトヘの高い安全性および高い構造安定性を有するSV40ウイルスでは、ヒトに投与しても抗原性が認められない利点がある。他方、JCVウイルスは、脳部位で感染するウイルスであるため、そのタンパク質も血液−脳関門を通過できる特性があるが、抗原性を有する。本発明の被覆構造体においては、ウイルス外殻構成タンパク質としてパポーバウイルス属由来のものが特に好ましい。
ウイルスによっては、複数の外殻構成タンパク質を持つものがある。例えば、SV40ウイルスはメジャー外殻構成タンパク質であるVP1とマイナー外殻構成タンパク質であるVP2、VP3の３種類のタンパク質を持っている。本発明においては、メジャー外殻構成タンパク質であるVP1のみを使用するのが好ましい。
ウイルス外殻構成タンパク質は、天然のウイルスから得られる、ネイティブなタンパク質を精製して用いてもよいが、必要な修飾を施したウイルス外殻構成タンパク質の変異体または改変体も好ましく利用することができる。あるいはネイティブなウイルス外殻構成タンパク質とその変異体または改変体とをともに使用してもよい。このような変異体または改変体を用いる理由として、ウイルス粒子様構造体の抗原性を軽減するか、あるいは免疫監視機構からから認識されにくくなる(いわゆる「ステルス化」された状態である)効果が期待できる。またはターゲティング機能を付与する観点から、特定の臓器、組織、細胞への親和性を増強する必要性も生じる。あるいは被覆構造体のより安定性を高める必要性もある。さらにはタンパク質表面に様々な機能を付加し得る部分を形成する要求に応じる必要性がある。このように様々な観点からの要求に対しても、タンパク質分子の適切な修飾により応じることが可能である。
ウイルス外殻構成タンパク質の親水的傾向を増強することにより血中安定性を増して、長時間にわたり血液中の濃度を維持できる。また血中滞留性を向上させるために、タンパク質表面にポリエチレングリコール(PEG)またはポリアルキレンオキシド鎖を導入して親水性を増すことが可能である。そのオキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。PEGとして、オキシエチレン単位が10〜3500のポリエチレングリコールが好適である。
ウイルス外殻構成タンパク質の表面に導入されたポリエチレングリコール、ポリアルキレンオキシド鎖の先端に、さらに機能性官能基として、「機能性物質」を付してもよい。先端に「機能性物質」を結合しているポリアルキレンオキシド鎖が固定化された被覆構造体は、ポリアルキレンオキシド鎖導入の効果に加えて、ポリアルキレンオキシド鎖に邪魔されることなく「機能性物質」の機能、例えば「認識素子」として特定臓器指向性、特定の組織指向性などの作用が充分に発揮される。
「機能性物質」として薬剤分子、レポーター標識(例として、発色物質、酵素または放射性標識)または親和性リガンド(例えば抗体または抗体フラグメント、特異的な結合をするパートナー片割れ(具体的にはビオチンまたはストレプトアビジン)、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖)をウイルス外殻構成タンパク質にカップリングさせ、被覆構造体の表面、実際にはウイルス外殻構成タンパク質の表面を機能化させてもよい。直接的なカップリングは、タンパク質の官能基、例えばアミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、N-ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む官能基によって結合される。
親和性リガンドには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、オリゴペプチド、多糖糖、糖類、ペプチドをコードする核酸分子、レクチン、細胞接着因子、抗原、薬剤および他のリガンドなどが挙げられる。
上記のようにウイルス外殻構成タンパク質は、ネイティブのウイルス外殻構成タンパク質と機能的に等価である変異体もしくは改変体であってもよい。すなわち構造体被覆能を保持し、しかもネイティブのウイルス外殻構成タンパク質の有する標的の組織性または細胞指向性を改変した変異体もしくは改変体であってもよい。この場合の変異体または改変体は、突然変異誘発法、化学修飾法または遺伝子組換え技術により得られる。ウイルス外殻構成タンパク質の変異体もしくは改変体とは、ウイルス外殻構成タンパク質を構成するアミノ酸配列において、1個以上、好ましくは1個もしくは数個、より好ましくは1〜24個、さらに好ましくは1〜15個のアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸残基により置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、かような変異体もしくは改変体は、構造体被覆能を有するものである。
ここで「欠失」とは、ネイティブタンパク質のポリペプチド鎖から、1個以上のアミノ酸残基が喪失されていることをいう。逆に「付加」とは、ポリペプチド鎖に1個以上のアミノ酸を挿入することであり、1箇所にペプチドの形態で入れてもよい。また「置換」とは特定部位のアミノ酸残基を他の種類のアミノ酸に置き換えることを言う。
「機能的に等価」なる用語は、アミノ酸配列において1個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および/または挿入により修飾されたアミノ酸配列であるか、あるいは、アミノ酸配列において、例えばリン酸化もしくは脱リン酸化、グルコシル化もしくは脱グルコシル化などにより化学的にアミノ酸残基の側鎖が修飾された配列であるが、それにも拘わらず天然ウイルス外殻構成タンパク質と実質的に同等の作用あるいは活性が維持されていることに対応している。このような機能的に等価な変異体は、天然の生物学的突然変異として発生することがあるが、特定部位の突然変異誘発、不特定部位の突然変異誘発の方法により作製してもよい。さらに改変体は、化学修飾法、酵素的開裂および/または連結反応などの公知技術を用いて製造することができる。発現制御配列を作動的に結合させた適切な核酸分子を宿主細胞で発現させるか、またはそのような組換えDNA分子を含む組換えDNAクローニングベクターを発現させる組換え手段により、あるいは化学的または生化学的な合成(細胞外)により調製することもできる。
ウイルス外殻構成タンパク質の突然変異体あるいはネイティブタンパク質を人工的に一部もしくは全部合成されたもの、または生物起源のタンパク質を改変して得られた改変体は、上記のようにそのウイルス起源のタンパク質にない機能を有するか、あるいは不適切な性質、例えば抗原性が改善されたものであってもよい。
ウイルス外殻構成タンパク質の変異体または改変体は、構造体被覆能を喪失している場合、あるいは抗原性が強化される場合もある。このような変異体または改変体は本発明の被覆構造体に利用することができない。したがって、ウイルス外殻構成タンパク質の変異体または改変体には、事前にこのような不利な性質を示さないかをチェックする必要性はついて回る。
（２）構造体
構造体の種類に特に制限はなく、例えば、ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、金属化合物粒子、PLA(Poly-Lactic Acid)、PLGA(co-Poly Lactic acid/Glycolic Acid)といった高分子からなる構造体やリポソームのような構造体などを挙げることができる。
構造体の形状も特に制限はなく、球状、立方体状、膜状、線維状などの形状であってもよい。
構造体は正又は負の電荷を有していてもよく、また、電荷を持たないものであってもよい。
構造体が小さい場合には、ウイルス外殻構成タンパク質がウイルス粒子を形成し、構造体を粒子内部に収容してしまうので、構造体はウイルス粒子内部に収容できない大きさのものであることが好ましい。「ウイルス粒子内部に収容できない大きさ」は、ウイルスの種類などによって異なるので、使用するウイルス外殻構成タンパク質に応じて決めればよい。SV40ウイルスの場合、通常、構造体の粒径が30nm以上になるとウイルス粒子内部に収容できなくなる。このため、構造体の平均粒径は、30nm以上とするのが好ましいが、45nm以上とするのがより好ましい。また、構造体の平均粒径は、50nmを超えるものであってもよく、100nmを超えるものであってもよい。SV40ウイルス以外のウイルスの場合も、上述した数値と同様の平均粒径とすることができる。
構造体の平均粒径の上限については特に制限はないが、あまり大きくなると実用的な用途が失われるので、平均粒径は500nm以下であることが好ましい。ここで、「粒径」とは、構造体が球状であればその球体の直径であり、構造体が立方体などの球状でない場合は、構造体を収容できる最小の球体を設定し、その球体の直径を粒径とする。また、DNAのように折り畳み可能な線維状の物質の場合、折り畳んだ状態の構造体を収容できる最小の球体を設定し、その球体の直径を粒径とする。
（３）製造方法
本発明のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法は、ウイルス外殻構成タンパク質と構造体とを、100mM〜500mMの一価陽イオン及び2μM〜50mMの二価陽イオンの存在下で、pH5〜pH10で15〜30℃にてインキュベートすることにより、ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体を製造する方法であって、前記構造体が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの構造体であることを特徴とするものである。
具体的には既存のタンパク質精製技術を利用して精製したウイルス外殻構成タンパク質に、構造体を充分に撹拌しながら混合する工程(I)と、工程(I)で得られた混合物を100mM〜500mMの一価陽イオンおよび2μM〜50mMの二価陽イオンの存在下で、pH5〜pH10で、15〜30℃にてインキュベートする工程(II)とを含む。
工程(I)の後、工程(II)の前に、塩(例えばNaC1、CaC12など)、キレート化剤(例えばEDTA、EGTAなど)、さらに必要であれば還元剤(例えば、DTT)などを含む緩衝液を加えて、次いでこの混合溶液を4℃で所定の時間、インキュベートしてもよい。
工程(II)の好ましい一実施形態を挙げると、溶液を15〜20時間、好ましくは16時間、15〜30℃でpH5〜10の100mM〜500mMの一価陽イオンおよび2μM〜50mMの二価陽イオンを含む溶液で透析をする。
前記一価陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくはナトリウムイオンである。また、二価陽イオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられ、好ましくはカルシウムイオンである。さらに前記一価陽イオンの濃度が100〜500mMであることが望ましく、100〜200mMであることがより望ましく、140〜160mMであることがさらに望ましく、150mMであることが最も望ましい。また前記二価陽イオンの濃度が1〜5mMであることが望ましく、2mMであることがより望ましい。
本発明の製造方法において、構造体の体積とウイルス外殻構成タンパク質重量に対する比は、1m3につき4μg以上であることが好ましく、1m3につきおよそ4μgであることがより好ましい。
（４）利用の態様
本発明の被覆構造体は、様々な用途に利用することができる。以下に、その具体例を幾つか挙げる。
（Ａ）薬剤の疾患部位への送達
構造体として薬剤（例えば、低分子化合物といった抗がん剤など）を用い、ウイルス外殻構成タンパク質の表面を疾患部位（例えば、がん細胞など）に対して親和性を示すように改変することで、薬剤の疾患部位への局所的な送達が可能になる。
（Ｂ）核酸の導入
構造体として核酸を用いることで、核酸の細胞への効率的な導入が可能になる。核酸としては、外来遺伝子のほか、機能性核酸（siRNA、miRNA、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーなど）などを挙げることができる。
（Ｃ）造影剤の送達
構造体として造影剤（例えばフェライトなど）を用い、ウイルス外殻構成タンパク質の表面を疾患部位（例えば、がん細胞）に対して親和性を示すように改変することで、造影剤の疾患部位への局所的な送達が可能になる。これにより、生体内において疾患部位をMRIのT2強調画像で可視化することが可能となる。
（Ｄ）バイオセンサにおけるプローブ
構造体として磁性微粒子などを用いた場合、ウイルス外殻構成タンパク質の表面を改変して抗体などを修飾することでバイオセンサにおけるプローブとして抗原などの検出・測定をすることが可能である。
（５）疾患の治療方法
本発明の疾患の治療方法は、上述した本発明のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体を利用したものであり、動物に薬剤を投与し、その動物の疾患部位に薬剤を送達させることにより、その動物の疾患を治療する方法であって、投与する薬剤が、薬剤の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されている薬剤であることを特徴とするものである。
この治療方法は、薬剤をウイルス外殻構成タンパク質で被覆する点を除き、一般的なドラッグデリバリーシステムと同様に行うことができる。
治療対象とする疾患は特に限定されず、一般的にドラッグデリバリーシステムが適用されている疾患などを治療対象とすることができる。具体例としては、がん、炎症性疾患（肺炎、肝炎、脳炎、関節炎など）、アルツハイマー病、糖尿病、脳梗塞、心筋梗塞などを挙げることができる。
薬剤は、上記疾患に有効な薬剤であれば特に限定されない。また、ドラッグデリバリーシステムには、副作用の強い薬剤、あるいは遺伝子治療薬などがよく用いられるが、本発明においてもそのような薬剤を用いてもよい。
治療対象とする動物は、ヒトでもよく、また、ヒト以外の動物でもよい。ヒト以外の動物としては、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなど）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、ゼブラフィッシュなど）などを挙げることができる。
本発明の治療方法においては、ウイルス外殻構成タンパク質に、疾患部位に対して親和性を持つ物質を付加し、薬剤が疾患部位に特異的に送達されるようにしてもよい。疾患部位に対して親和性を持つ物質としては、例えば、抗体や疾患部位に含まれる細胞の受容体に対するリガンドなどを挙げることができる。
この治療方法は、新しい薬剤のスクリーニング方法に応用できる。即ち、表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されている薬剤候補物質を疾患モデル動物に投与し、その疾患モデル動物の疾患部位に薬剤を送達させ、その後の疾患モデル動物の病態を観察することにより、治療効果を有する薬剤候補物質をスクリーニングできる。
以下に示す実施例は、本発明の範囲内の好適な態様にすぎない。また、実施例中で用いる装置名及び、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度等の数値的条件、処理方法等はこの発明の範囲内の好適例にすぎない。
（実施例１） 構造体の作製
ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、フェライト粒子、DOX包含PLA球状構造体、siRNA包含PLGA球状構造体の５種類の構造体を以下のようにして作製又は入手した。
（１）ポリスチレンビーズ
ポリスチレンビーズは、平均粒径100nm、200nm、及び500nmの３種類をPolysciences,Inc.より購入した。購入したポリスチレンビーズ（Cat＃16688-15,08216-15,09836-15）は球状で、カルボキシル基を有する為負電荷を帯びている。
（２）シリカビーズ
シリカビーズは、平均粒径110nmのものを作製した。以下に作製法を示す。
Ａ）シリカビーズの合成
エタノール83.5 mlにテトラエトキシシラン4.5 mlを分散させ、4℃で30分間攪拌する。ここに4℃で冷却しておいた2.8%のアンモニア水溶液20 mlを加え一昼夜攪拌する。反応終了後、反応液に超純水100 mlを加え、エバポレーターによって溶存エタノールとアンモニアを除き、その後超純水で透析することにより得られたシリカビーズ分散溶媒を超純水で置換する。
Ｂ）シリカビーズのアミノ化
塩酸を用いてシリカビーズ1 gを分散させた超純水20 mlのpHを3以下に調整する。このシリカビーズ分散液を強く攪拌しながら、シランカップリング剤である3-アミノプロピルトリメトキシシラン1.8 mlと6Nの塩酸1.7 mlと超純水2 mlを混合したものを穏やかに添加する。さらに攪拌を続けながらシリカビーズ分散液にエタノール25 mlを添加する。水酸化ナトリウム水溶液を用いてシリカビーズ分散液のpHを5.5に調整し、70℃のウォーターバス中に設置し、四時間攪拌を続ける。得られたアミノ化シリカビーズ分散液を遠心管に移し、20,000 Gで15分間遠心分離し、上清を捨てる。アミノ化シリカビーズの沈殿にpH 2の酢酸溶液20 mlを加えて粒子を再分散させ、20,000 Gで15分間遠心分離する。この酢酸溶液によるアミノ化ビーズの洗浄作業を3回繰り返す。最終的に得られたアミノ化シリカビーズの沈殿をpH 2の酢酸溶液に再分散させ、保存する。
作製したシリカビーズは、球状で、アミノ基を有するため正電荷を帯びている。
（３）フェライト粒子
フェライト粒子は、平均粒径30nmのものを作製した。以下に作製法を示す。
Ａ）フェライト粒子前駆体（オレイン酸-鉄錯体）の合成
塩化第二鉄六水和物10.78 gを超純水60 mlに溶解させ、オレイン酸ナトリウム36.65 gを加える。ここにエタノール80 mlを加え室温で5分間攪拌する。その後ここにヘキサン140 mlを加え、攪拌しながら四時間還流させる。反応溶液を冷却した後、水相を除去し、さらに超純水30 mlで有機溶媒相を三回洗浄する。洗浄後、有機溶媒相を238 G、4℃で10分間遠心し、上清を取り出し、70℃のオーブン中で一昼夜乾燥させる。
Ｂ）フェライト粒子の合成
得られたフェライト粒子前駆体をトリ-N-オクチルアミン190 gに溶かし、オレイン酸ナトリウム6.14 gを加え、一分間に2℃ずつ昇温させながら攪拌する。100分後、溶媒の沸点まで加熱し、攪拌しながら30分間還流させる。反応後、得られた粒子をメタノール30 mlで三回洗浄し、1-オクタデセンに分散させる。
Ｃ）フェライト粒子の水相への移送
得られたフェライト粒子180 mgをイソプロパノール10 mlで三回洗浄し、トルエン（溶存酸素を窒素で置換したもの）16 mlに分散させる。チオシンゴ酸0.3 gをジメチルスルホキシド（溶存酸素を窒素で置換したもの）4 mlに溶かし、先ほどのフェライト粒子を分散させたトルエンに加え、反応容器を窒素で充填し密封した後、35 kHzの超音波処理を4℃で四時間施す。超音波処理後、フェライトナノ粒子を2-メトキシエタノール5 mlで5回洗浄し、ここに0.1 M、pH 7のクエン酸水溶液10 mlを加え、35 kHzの超音波処理を4℃で一時間施す。反応後、反応液に1,4-ジオキサン20 mlを加えてフェライト粒子を沈殿させた後、上清を捨てる。粒子を超純水10 mlに再分散させ超純水中で透析する。
作製したフェライト粒子は、立方体状で、クエン酸を有するため負電荷を帯びている。
（４）DOX包含PLA球状構造体
DOX包含PLA球状構造体は、平均粒径200nm前後のものを作製した。以下に作製法を示す。
フェライト粒子前駆体2.5 mg、ポリ乳酸（Mw: 85-160 k）12.5 mg、ドキソルビシン1 mg、トリエチルアミン(ドキソルビシンに対して)10 当量をクロロホルム2 ml中に溶解させ、これを有機層とする。6.25mlの5%（wt/wt）PVA(Poly Vinyl Alcohol)水溶液中へと攪拌下で有機層2 mlを滴下、混合液を10分間超音波照射し、DOX包含PLA球状構造体を形成させる。得られた構造体は一晩攪拌してクロロホルムを除去し、20,400gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。その後、超純水を適量加えて再分散させ、再び20,400gで10分間遠心分離する。この超純水による洗浄作業を3回繰り返す。その後、超純水に再分散させて保存する。
（５）siRNA包含PLGA球状構造体
siRNA包含PLGA球状構造体は、平均粒径200nm前後のものを作製した。以下に作製法を示す。
1〜10μgのsiRNAを含む水溶液10μl と、0〜100μgのDOTAP (Trimethyl[2,3-(dioleyloxy)propyl]-ammonium Chloride)を含む水溶液10μlを混合し、これを10mgのPLGAを含むアセトン溶液400μl中へ攪拌下で添加する。その後、5mlの2%(wt/wt)のPVAと攪拌下で混合する。得られたsiRNA包含PLGA球状構造体を20,400gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。その後、超純水を適量加えて再分散させ、再び20,400gで10分間遠心分離する。この超純水による洗浄作業を3回繰り返す。その後、超純水中で一晩攪拌しアセトンを除去し、再度超純水により洗浄を行った後に保存する。
（実施例２） ウイルス外殻構成タンパク質による構造体の被覆
SV40のVP1五量体をWO2007/116808に記載の方法で精製し、精製したタンパク質10μgに実施例１で作製した各構造体を混合した。この混合試料溶液は、150mM NaCl、5mM EGTA、5mM DTTを含み、総溶液量は100μlとした。
混合試料溶液のpHは、構造体としてシリカビーズを用いた場合はpH5.0(HCl[pH5.0])とし、ポリスチレンビーズ及びフェライト粒子を用いた場合はpH7.0(Tris-HCl[pH7.0])とし、DOX包含PLA球状構造体及びsiRNA包含PLGA球状構造体を用いた場合はpH7.9(Tris-HCl[pH7.9])とした。
次に、前記混合試料溶液を、150mM NaClおよび2mM CaCl2を含む溶液に10時間、室温(25℃)で透析することにより溶媒を置換した。透析に用いた溶液のpHは、混合試料溶液のpHと同じになるように調整した。
この混合試料溶液を回収して、透過型電子顕微鏡を用いて構造体を観察した。ウイルス外殻構成タンパク質の添加により、構造体表面を一様にウイルス外殻構成タンパク質が被覆していることが確認された（図１、２、３、４）。
このような実験から、ウイルス外殻構成タンパク質が様々な構造体を被覆できることが示された。
（実施例３） ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の金コロイド染色
抗VP1抗体およびProtein A結合金コロイド粒子（10nm）を用い、ウイルス外殻構成タンパク質による被覆の検証を行った。まず、実施例２のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体（平均粒径が100nmのポリスチレンビーズ、平均粒径が110nmのシリカビーズ）1.85×109粒子に対して、IgG精製した抗VP1抗体4μgを加え、37℃で1時間インキュベーションした。その後、1.85×1011粒子の金コロイド粒子を加えて37℃で１時間インキュベーションすることで金コロイド染色を行った。反応後は溶液を4℃で保存した。
反応後の溶液を透過型電子顕微鏡により観察を行ったところ、ウイルス外殻構成タンパク質被覆ポリスチレンビーズおよびウイルス外殻構成タンパク質被覆シリカビーズともに抗VP1抗体を加えていない場合は構造体表面に金コロイド粒子は確認されないことに対し（図５上、図６上）、抗VP1抗体を加えた場合のみ構造体表面に金コロイド粒子が確認された（図５下、図６下）。
この結果から、ウイルス外殻構成タンパク質により、これら構造体表面が被覆されていることが示された。
（実施例４） ウイルス外殻構成タンパク質によるζ電位（表面電位）の変化
実施例２で調製したウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体（平均粒径が100nm、200nm、500nmのポリスチレンビーズ、平均粒径が110nmのシリカビーズ）と、ウイルス外殻構成タンパク質で被覆していない構造体のζ電位を測定した。ζ電位の測定は、pH5.0、7.0、及び9.0の三通りの条件で行った。
負電荷構造体（ポリスチレンビーズ）及び正電荷構造体（シリカビーズ）のいずれにおいても、ウイルス外殻構成タンパク質による被覆により、構造体のζ電位が中性へと近づくことが確認された（図８及び図９）これにより、ウイルス外殻構成タンパク質が構造物表面を被覆していることが示された。
（実施例５）ウイルス外殻構成タンパク質で被覆されたsiRNA包含リポソームの作製
以下の（１）〜（３）に示す方法に従ってウイルス外殻構成タンパク質で被覆されたsiRNA包含リポソームの作製した（図１０）。
（１）カチオン性リポソームの調製
DOTAPとDOPE(モル比は3:1)は、脂質濃度が5mg/mlになるようにクロロホルム中で混合し、希釈された。脂質膜を調製するため、窒素気流によって、クロロホルムをガラスバイアルの中の混合物から蒸発させた。膜は、間欠的な攪拌によってTris-HCl緩衝液中で再水和され、次いで、Mini Extruder（Avanti Polar Lipids社製)を使って、ポリーカーボネートフィルター(孔径：100nm)から押出し、約100nmの粒径に制御した。
（２）リポソーム-siRNA複合体の調製
siRNA(GL3)は、脂質濃度が455μg/mlになるように、サイズが制御されたリポソームと混合され(重量比は1:10）、15分間室温でインキュベートされた。
（３）siRNA-含有リポソームのVP1による被覆
VP1五量体は、実施例２と同様の方法で調製した。10μgのVP1五量体は、脂質換算で５μgのリポソーム-siRNA複合体と混合され、100μlになるようにVP1五量体調製緩衝液(20mM Tris-HCl pH7.9 150 mM NaCl 5mM DTT 5mM EGTA)で希釈され、次いで、VLP構成緩衝液（20 mM MOPS pH 7 150 mM NaCl）に対して使い捨てのポリプロピレン透析カップ(Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit, MWCO 3.5K, Pierce社製)で一晩透析された。
（参考例） フェライト含有ウイルス様粒子によるアクティブターゲティング
国際公開公報WO2007/116808に記載されているフェライト含有ウイルス様粒子（VLP-Ferrite）に上皮細胞成長因子（EGF）を固定した。このEGF固定VLP-Ferriteを、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）を高発現する細胞がどのくらい取り込むかを調べ、EGFを固定していないVLP-Ferriteに対する取り込み量と比較した。
また、EGFR高発現細胞とEGFR低発現細胞をマウスに移植し、そのマウスにEGF固定VLP-Ferriteを投与し、標的細胞（EGFR高発現細胞）へ優先的に送達されるかどうかを調べた。
（１）実験方法
（１−１）N138C変異型VP1五量体の調製
VP1（Simian Virus 40のVirus Protein 1）遺伝子はベクターpFastBacに挿入された。VP1の138番目のアミノ酸であるアスパラギンは、部位特異的変異誘発によってシステインに置換された。プラスミドは、バクミドへの転移のためにDH10BACに形質転換された。そのバクミドは、VP1クローン化バキュロウイルス(P1ウイルス)を発現させるためにsf9昆虫細胞にリポフェクションした。バキュロウイルスは、力価をあげるためにsf9細胞に感染して、72時間インキュベートされた（P2ウイルス）。調製されたP2バキュロウイルスは、VP1タンパク質を発現させるためにsf9細胞に感染して、72時間インキュベートされた。得られたsf9細胞は、超音波処理緩衝液(1%のデオキシコール酸ナトリウム、20mM Tris-HCl、pH7.9)中でプロテアーゼインヒビター存在下で再懸濁され、氷上で超音波処理によって破砕された。破砕液は、遠心分離によって不溶画分を除き、その上清は、塩化セシウム勾配(1.17, 1.28, 1.42, 1.58g/ml in 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)の上に積層され、 Beckman SW Ti 41 rotor内で、150,000×g、3時間遠心分離された。VLP-含有分画は、終濃度が1.38g/mlになるように塩化セシウムで再懸濁され、Beckman SW Ti 55 rotor.20内で、230,000×g、20時間遠心分離された。VLP-含有分画は、VLP懸濁緩衝液(20 mM Tris-HCl 150 mM NaCl, pH 7.9 0.1% NP40)に対して一晩透析され、VLPを五量体に分解するために5mM DTTとEGTAを加えた後、室温で1時間インキュベートされた。分解されたVP1は、HiLoad16/60Superdex200pgを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって更に精製された。
（１−２）クロスリンカーの調製
NHS(PEO)2Malと命名されたPEGクロスリンカーをPierce社から購入した。このクロスリンカーは、一端にスクシンイミドを他端にマレイミドを持っている。クロスリンカーは、261.1mMの濃度になるようにdryDMSOで希釈され、-30℃で保存された。
（１−３）EGFの調製
Peprotech社から組換hEGF(ヒト上皮細胞成長因子)タンパク質を購入した。hEGFは、2.5mg/mlの濃度になるように水で希釈され、次いで、MOPS緩衝液(20 mM MOPS pH 6.5 150 mM NaCl) に対して8時間透析された。タンパク質濃度は、較正としてBSAを用いたブラッドフォードアッセイによって評価され、その後、EGF溶液は-20℃で保存された。
（１−４）VLP-FerriteへのEGFの固定
DMSO中のクロスリンカーは、100倍量のMOPS緩衝液(20mM MOPS 150mM NaCl pH 6.5、EGFの緩衝液と同じである。)で希釈された。hEGFは、希釈されたクロスリンカーと混合され(モル比は1:1)、4℃で2時間インキュベートされた。インキュベーションの後、反応を停止させるために、MOPSによってpH6.5に緩衝されたエタノールアミンが100mMの濃度になるように加えられ、未結合のクロスリンカーを取り除くため同じ緩衝液に対して一晩透析された。翌日、透析されたサンプルが集められ、3000:1のモル比になるようにVLP-Ferriteと混合された。12時間の反応の後に、反応を停止させるためにNaOHが加えられた。未結合のhEGF又はクロスリンカーと結合したhEGFは、PBS中で15分間、15,000rpmの遠心分離を2回行うことによって、除去された。
（１−５）VLP-Ferriteのin vitroでの取込
4x105細胞のCV1、A431、及びWiDRは、10%のウシ胎仔血清が補われたDMEMの入った培養皿上に播種され、 37℃、5% CO2 下で、一晩インキュベートされた。細胞は、37℃、5% CO2 下、血清のないDMEM中での30分間のインキュベーションによって飢餓状態にされた。EGFが固定されているか、又は固定されていないVLP-Ferrite（鉄量換算で30μg）が、細胞に加えられ、37℃、5% CO2 下で、１時間インキュベートされた。10%のFBSが、培地に加えられ、更に11時間インキュベートされた。細胞は、PBSで2回洗浄され、掻き取られ、その後、エッペンドルフチューブに移された。細胞ペレットを得るために、懸濁液は、1分間、15,000rpmで4℃で遠心分離された。ペレットは、PBS中で再懸濁され、超音波処理され、細胞を溶かし、そして、フェライト（マグネタイト）を鉄イオンに溶解するために、硝酸を加えられた。鉄イオンを含む溶液は、イットリウムを用いて標準化し、鉄含有量を測定するため、ICP-OES分析に供された。
（１−６）MRIによるVLP-Ferriteのin vivo画像化
VLP-Ferriteのアクティブターゲッティングと画像化はin vivo MRIによってモニターされた。マウスは、A431とWiDRを左右それぞれに移植された。鉄換算で1 mgのEGFが固定されたVLP-Ferrite (およそ50mg/kg)を、静脈投与した。MRIの画像化は、注射の前後に7Tの MRIを使って行われた。
（２）実験結果
図１１にEGFを固定したVLP-FerriteとEGFを固定していないVLP-Ferriteに対する各種細胞の取り込み能を示す。図に示すように、EGFR高発現細胞であるA431では、EGFを固定することにより、取り込み能が著しく向上した。また、SV-40の宿主であるCV-1やEGFR低発現細胞であるWiDrにおいても、EGF固定による取り込み能の向上がみられた。
図１２にVLP-Ferriteを投与前後のMRI画像を示す。図に示すように、VLP-Ferriteを投与後にA431を移植した部位の信号が顕著に低下した。VLP-Ferriteには造影効果があるので、VLP-FerriteがA431に優先的に送達されたため、その造影効果によってA431を移植した部位の信号が低下したと推測される。
以上の結果は、いずれも国際公開公報WO2007/116808に記載されているウイルス様粒子（VLP-Ferrite）を用いたもので、本発明の構造体を用いたものではない。しかし、本発明の構造体もこのウイルス様粒子と同様にEGFなどのタンパク質を固定することができるので、標的細胞への特異的な送達は可能であると推測される。
本発明は、薬剤の疾患部位への送達を容易にするものであり、新たなドラッグデリバリーシステムの開発に有用である。

Claims (15)

  1. ウイルス外殻構成タンパク質とそれによって被覆された構造体とからなり、構造体の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されていることを特徴とするウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
  2. ウイルス外殻構成タンパク質が、構造体の表面に非特異的に付着していることを特徴とする請求項１に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
  3. 構造体が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの構造体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
  4. 構造体の粒径が、30nm以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
  5. ウイルス外殻構成タンパク質が、SV40ウイルスの外殻構成タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体。
  6. ウイルス外殻構成タンパク質と構造体とを、100mM〜500mMの一価陽イオン及び2μM〜50mMの二価陽イオンの存在下で、pH5〜pH10で15〜30℃にてインキュベートすることにより、ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体を製造する方法であって、前記構造体が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの構造体であることを特徴とするウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法。
  7. 構造体の粒径が、30nm以上であることを特徴とする請求項６に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法。
  8. ウイルス外殻構成タンパク質が、SV40ウイルスの外殻構成タンパク質であることを特徴とする請求項６又は７に記載のウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体の製造方法。
  9. 動物に薬剤を投与し、その動物の疾患部位に薬剤を送達させることにより、その動物の疾患を治療する方法であって、投与する薬剤が、薬剤の表面にウイルス外殻構成タンパク質が付着し、このタンパク質からなる層が形成されている薬剤であることを特徴とする疾患の治療方法。
  10. 動物が、ヒト以外の動物であることを特徴とする請求項９に記載の疾患の治療方法。
  11. ウイルス外殻構成タンパク質に、疾患部位に対して親和性を持つ物質が付加されていることを特徴とする請求項９又は１０に記載の疾患の治療方法。
  12. ウイルス外殻構成タンパク質が、薬剤の表面に非特異的に付着していることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の疾患の治療方法。
  13. 薬剤が、ウイルス粒子の内部に収容できない大きさの薬剤であることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の疾患の治療方法。
  14. 薬剤の粒径が、30nm以上であることを特徴とする請求項９乃至１３のいずれか一項に記載の疾患の治療方法。
  15. ウイルス外殻構成タンパク質が、SV40ウイルスの外殻構成タンパク質であることを特徴とする請求項９乃至１４のいずれか一項に記載の疾患の治療方法。
JP2011530804A 2009-09-09 2010-08-30 ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体及びその製造方法 Pending JPWO2011030682A1 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009207632 2009-09-09
JP2009207632 2009-09-09
PCT/JP2010/064667 WO2011030682A1 (ja) 2009-09-09 2010-08-30 ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体及びその製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPWO2011030682A1 true JPWO2011030682A1 (ja) 2013-02-07

Family

ID=43732356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011530804A Pending JPWO2011030682A1 (ja) 2009-09-09 2010-08-30 ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体及びその製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120164232A1 (ja)
EP (1) EP2476753A4 (ja)
JP (1) JPWO2011030682A1 (ja)
WO (1) WO2011030682A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3152288A1 (en) * 2014-06-06 2017-04-12 The Procter & Gamble Company Detergent composition comprising polyalkyleneimine polymers

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219577A (en) * 1990-06-22 1993-06-15 The Regents Of The University Of California Biologically active composition having a nanocrystalline core
JP2005502350A (ja) * 2001-09-06 2005-01-27 プロジェニクス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質変異体およびその使用
WO2006004173A1 (ja) * 2004-07-01 2006-01-12 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering 生理的条件下でのウイルス粒子様構造体及びその形成方法
WO2007116808A1 (ja) * 2006-04-03 2007-10-18 Tokyo Institute Of Technology ウイルス粒子様構造体およびそれを含有する製剤
WO2008150276A2 (en) * 2006-09-26 2008-12-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Virus coated nanoparticles and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5178882A (en) * 1990-06-22 1993-01-12 The Regents Of The University Of California Viral decoy vaccine
US6180389B1 (en) * 1997-01-03 2001-01-30 The Research And Development Institute, Inc. Virion-constrained nanoparticles comprising a plant virion coat protein shell and encapsulated guest molecules
ES2228467T3 (es) * 1999-02-03 2005-04-16 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Particulas terapeuticas de fosfato calcico y metodos de fabricacion y su uso.
US20060051373A1 (en) * 2002-04-05 2006-03-09 Olson William C Particle-bound human immunodeficiency virus envelope glycoproteins and related compositions and methods
IL164850A0 (en) * 2004-10-26 2005-12-18 Yissum Res Dev Co Gene therapy for kidney diseases
US7241582B2 (en) * 2005-07-05 2007-07-10 Mj Biologics, Inc. Diagnostic test kits

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219577A (en) * 1990-06-22 1993-06-15 The Regents Of The University Of California Biologically active composition having a nanocrystalline core
JP2005502350A (ja) * 2001-09-06 2005-01-27 プロジェニクス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質変異体およびその使用
WO2006004173A1 (ja) * 2004-07-01 2006-01-12 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering 生理的条件下でのウイルス粒子様構造体及びその形成方法
WO2007116808A1 (ja) * 2006-04-03 2007-10-18 Tokyo Institute Of Technology ウイルス粒子様構造体およびそれを含有する製剤
WO2008150276A2 (en) * 2006-09-26 2008-12-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Virus coated nanoparticles and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6014040993; Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６，１１５（１），ｐ．５７-６７ *

Also Published As

Publication number Publication date
US20120164232A1 (en) 2012-06-28
EP2476753A1 (en) 2012-07-18
EP2476753A4 (en) 2013-10-09
WO2011030682A1 (ja) 2011-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jain et al. The principles and applications of avidin-based nanoparticles in drug delivery and diagnosis
Khalid et al. Advanced in developmental organic and inorganic nanomaterial: a review
Urban et al. Nanotools for the delivery of antimicrobial peptides
Ma et al. Influence of nanoparticle shape, size, and surface functionalization on cellular uptake
Wang et al. Colloidal stability of silk fibroin nanoparticles coated with cationic polymer for effective drug delivery
JP2009504179A (ja) ｓｉＲＮＡの細胞内伝達のためのｓｉＲＮＡと親水性高分子との間の接合体、及びその製造方法
Niu et al. Recent advances in the rational design of silica-based nanoparticles for gene therapy
EP2134740A2 (en) Self-assembling nanoparticle drug delivery system
JP2007538380A (ja) 改善された磁気性質を有する磁性ナノ粒子
Li et al. A siRNA-induced peptide co-assembly system as a peptide-based siRNA nanocarrier for cancer therapy
CN111733139A (zh) 一种基于功能化巨噬细胞/单核细胞的靶向递送系统及其构建与应用
JP2018533543A (ja) シリカ系生体分子担体、それを含む医薬組成物、その作製方法、及びその使用
Delyanee et al. Amine-terminated dendritic polymers as promising nanoplatform for diagnostic and therapeutic agents’ modification: A review
AU2011205629B2 (en) Methods and compositions for nanoparticle-mediated cancer cell-targeted delivery
Santos et al. Inorganic nanoparticles in targeted drug delivery and imaging
Zhang et al. Orderly curled silica nanosheets with a small size and macromolecular loading pores: synthesis and delivery of macromolecules to eradicate drug-resistant cancer
Soto et al. Glucan particles as carriers of nanoparticles for macrophage-targeted delivery
CN103272242B (zh) 用作基因和siRNA传递载体的嵌段多肽
WO2011030682A1 (ja) ウイルス外殻構成タンパク質被覆構造体及びその製造方法
US20230159596A1 (en) Virus-like nanoparticles for oral delivery
Kawano et al. SV40 VP1 major capsid protein in its self-assembled form allows VP1 pentamers to coat various types of artificial beads in vitro regardless of their sizes and shapes
Nguyen et al. Harnessing the versatility of PLGA nanoparticles for targeted Cre-mediated recombination
Feracci et al. Organic nanoparticles
Ojha et al. Virus as a Nanocarrier for Drug Delivery Redefining Medical Therapeutics-A Status Report
CN112274654A (zh) 靶向载药纳米胶束、其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130522

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140930

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150310