WO2013147125A1 - 薬剤取り込み増強剤 - Google Patents

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WO2013147125A1
WO2013147125A1 PCT/JP2013/059470 JP2013059470W WO2013147125A1 WO 2013147125 A1 WO2013147125 A1 WO 2013147125A1 JP 2013059470 W JP2013059470 W JP 2013059470W WO 2013147125 A1 WO2013147125 A1 WO 2013147125A1
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WO
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drug
drug uptake
agent
uptake enhancer
derived
Prior art date
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PCT/JP2013/059470
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English (en)
French (fr)
Inventor
尚巳 岡田
武田　伸一
智子 千代
Original Assignee
独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/484—Glycyrrhiza (licorice)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/65—Paeoniaceae (Peony family), e.g. Chinese peony

Definitions

  • the present invention relates to a drug efficiency enhancer that enhances the efficiency of drug uptake into cells by virus particles and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient.
  • a viral vector that uses the infectivity and replication ability of a virus is one of gene transfer techniques for introducing a target gene into a cell.
  • adeno-associated virus vectors have recently attracted attention as useful gene transfer carriers in gene therapy.
  • Adeno-associated virus (AAV; Adeno-Associated Virus, hereinafter abbreviated as “AAV” in this specification) is a non-pathogenic virus belonging to parvovirus and is autonomously proliferating because it lacks self-replicating ability. Cannot propagate and requires co-infection with adenovirus and herpesvirus for growth.
  • AAV exists as an episome in the nucleus, is not inserted into a chromosome, has low immunogenicity to the host, and has a wide host range. Therefore, it has many advantages as a vector that has low pathogenicity, is highly resistant to genetic mutation, is highly safe, does not easily cause an inflammatory reaction, and can infect various cells and can express a transgene for a long time. Have Therefore, various clinical applications for tumor diseases, neuromuscular diseases, genetic diseases and the like are expected as a carrier for gene transfer.
  • Patent Document 1 discloses a method for enhancing the expression of a gene incorporated into an AAV vector by using a histone deacetylase (hereinafter, abbreviated as “HDAC” in this specification) inhibitor that is an anticancer agent. .
  • HDAC histone deacetylase
  • an inserted gene can be expressed with high efficiency by using an AAV vector and an HDAC inhibitor in combination.
  • this method is useful for neoplastic diseases in that the HDAC inhibitor has an antitumor effect, it is not used for systemic diseases such as lifestyle-related diseases and muscular dystrophy, and chronic diseases such as hereditary neuromuscular diseases. This is not preferable because a cell-killing effect may occur.
  • Virus vectors are also useful for the production of iPS cells.
  • retrovirus vectors and lentivirus vectors are mainly used for the production of iPS cells.
  • these viral vectors have a risk of causing a gene mutation accompanying insertion into the chromosome of the host cell, a safety problem has been pointed out (Non-patent Document 1).
  • the AAV vector is highly safe because it is not integrated into the chromosome, but has a problem that the efficiency of introduction into fibroblasts is insufficient (Non-patent Document 2).
  • the aforementioned HDAC inhibitor promotes differentiation induction, there is a problem that it is not suitable for functional analysis of differentiation regulators or preparation of undifferentiated cells by reprogramming.
  • a drug efficiency enhancer with few side effects has been developed, which can enhance the intracellular uptake efficiency of the agent or the drug carrier by using it together with the agent or a drug carrier including the agent. Is to provide.
  • an expression efficiency enhancer that can enhance the expression efficiency of a gene inserted into a viral vector from a vast amount of substances, is highly safe, and can be applied to various diseases. It has been found that an extract of shakuyakukanzoto, known as a traditional Chinese medicine, can enhance the expression of a gene inserted into a viral vector. However, according to further research, the extract is expected not to directly increase the gene expression efficiency but to enhance the efficiency of gene expression by enhancing the intracellular uptake efficiency of virus particles. I found outside facts. Therefore, by applying this property, it has become possible not only to enhance the gene expression efficiency, but also to allow the agent to be efficiently taken into a predetermined cell in the drug delivery system. Furthermore, it has also been clarified that the extract has little adverse effect on the living body, such as not changing the HDAC activity of cells into which virus particles are introduced. The present invention has been completed based on the above-mentioned novel findings, and provides the following.
  • a drug for enhancing the intracellular uptake efficiency of an agent or a drug carrier containing the agent comprising as an active ingredient a substance derived from a genus Paeonia, a substance derived from a genus Glycyrrhiza, or a combination thereof Uptake enhancer.
  • virus particle is a virus vector or a hollow particle.
  • a pharmaceutical composition comprising the drug uptake enhancer according to any one of (1) to (8).
  • a drug uptake kit for cells containing the drug uptake enhancer according to any one of (1) to (8).
  • An administration regimen for enhancing drug uptake into cells wherein the administration of the agent or a drug carrier including the same is administered simultaneously with the administration of the drug uptake enhancing agent according to any one of (1) to (8) Or the said regimen which describes administering to a biological body after administration.
  • the intracellular uptake efficiency of the agent or drug carrier can be improved by using it together with the agent or the drug carrier including the agent.
  • the drug uptake enhancer of the present invention does not affect the differentiation induction of cells into which the agent or drug carrier is introduced.
  • A shows untreated U251 cells
  • B shows U251 cells treated with rAAV8-GFP
  • C shows U251 cells treated with rAAV8-GFP and a drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto. It is a figure which shows the cytotoxic result of the chemical
  • Cont is a sample without addition of the drug uptake enhancer of the present invention
  • A is a sample to which the drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto of the present invention is added
  • SB is a sample to which sodium butyrate is added.
  • Alexa trademark; the same hereafter
  • NT is an untreated cell
  • Cont is a cell without the addition of the drug uptake enhancer of the present invention
  • A is a cell to which the drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto of the present invention is added
  • SB is sodium butyrate. Added cells.
  • the small white dot indicates the Alexa 568-rAAV8-M3 virion with a white dashed line, and the arrow indicates the nucleus of U251 cells.
  • It is a measurement result of the luciferase activity which shows the intracellular uptake
  • B It is a figure which shows the cytotoxic result by glaze, licorice, or glaze licorice.
  • TJ-68 a drug uptake enhancer
  • 72 h the group that has been cultured for 72 hours without removing it after treatment with the drug uptake enhancer
  • the final concentration of positive control SB sodium butyrate is 1 mM and 3 mM.
  • FIG. 3 is a measurement result of luciferase activity showing the drug uptake efficiency by the drug uptake enhancer of the present invention when rAAV2 is used as a drug carrier.
  • the final concentrations of TJ-68, which is a drug uptake enhancer, are 0.42 and 0.83 mg / mL from the left.
  • the final concentration of positive control SB (sodium butyrate) is 1 mM and 3 mM.
  • rAV2 recombinant adenovirus 2
  • FIG. 3 is a measurement result of luciferase activity in muscle tissue collected from a mouse to which rAAV9-luc as a drug carrier was intravenously administered after oral administration of the drug uptake enhancer of the present invention.
  • a first aspect of the present invention is a drug uptake enhancer into cells. According to the present invention, the intracellular uptake efficiency of an agent or a drug carrier can be enhanced without affecting cell differentiation induction.
  • drug uptake enhancer refers to a drug having a medicinal effect that enhances the intracellular uptake efficiency of the agent or drug carrier in combination with the agent or drug carrier.
  • uptake into cells broadly encompasses events for an agent or drug carrier to be taken into cells. Therefore, not only the phenomenon in which the agent or drug carrier is taken into cells by phagocytosis, but also the adhesion of the agent or drug carrier to the cell surface, which can be said to be the pre-uptake stage, and the cell membrane penetration of the agent or drug carrier. Etc. are also encompassed in the uptake into cells in the present specification.
  • the uptake mechanism is not particularly limited. Examples thereof include endocytosis (including phagocytosis and phagocytosis) and changes in cell membrane permeability.
  • drug carrier refers to a carrier that can deliver a contained agent into a predetermined cell.
  • a drug delivery system such as a cholesterol conjugate
  • DDS Drug Delivery system
  • virus particles are particularly preferable because they can be delivered to specific sites (including organs and tissues) that target agents when used in living organisms.
  • virus particle is also called a virion, and refers to a particle having an outer shell protein composed of a capsid or a coating particle and having a cell infectivity. Specifically, it includes viral vector particles having a viral genome and hollow particles only in the outer shell.
  • the term “viral vector particle” refers to a virus that removes a gene related to pathogenicity from a viral genome and includes a viral nucleic acid (including DNA or RNA) as a viral vector incorporating a foreign gene in the outer shell protein.
  • a viral nucleic acid including DNA or RNA
  • any viral vector known in the art can be used.
  • retrovirus vectors including lentivirus vectors and mouse moloney leukemia virus vectors
  • adenovirus vectors adenovirus vectors
  • AAV vectors Sendai virus vectors
  • Sendai virus vectors Sendai virus vectors.
  • the type of foreign gene incorporated into the viral vector is not limited. A desired gene can be incorporated.
  • “hollow particles” include hollow capsids and coated particles.
  • “hollow capsid” refers to a virus particle consisting only of an outer shell protein that does not contain a viral nucleic acid or core.
  • a “capsid” is a coat or shell consisting of a plurality of unit proteins (capsomere) surrounding a viral nucleic acid or core. In the present specification, when the term “capsid” is simply used, it means the structure.
  • a substance containing a viral nucleic acid or core therein is called a “nucleocapsid” with respect to the hollow capsid.
  • coated particles refer to hollow capsids with envelopes arranged outside.
  • An “envelope” is an envelope that exists outside the capsid of some viruses, is composed of a lipid bilayer, and is embedded with viral-derived glycoproteins called spikes or envelope proteins. Yes.
  • the lipid bilayer membrane of the envelope is a collection of part of the cytoplasmic membrane or nuclear membrane of the host cell when the virus buds from the host cell, and is basically derived from the host cell.
  • the hollow particles in this specification are hollow particles derived from animal viruses.
  • animal viruses include retroviridae, picornauis, caliciviridae, astrovirus, flaviviridae, togaviridae, coronaviridae, paramyxoviridae, rhabdoviridae, filoviridae, orthomyxovirus Family, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae or Birnaviridae RNA viruses, and adenovirus, herpesviridae, poxviridae, iridoviridae, hepadnaviridae, circoviridae, parvovirus DNA viruses belonging to the family or Papovaviridae are included.
  • Viruses belonging to the Retroviridae family of RNA viruses and viruses belonging to the Adenoviridae, Parvoviridae or Herpesviridae family of DNA viruses can be suitably used as the virus derived from the hollow particles.
  • Particularly suitable are retroviridae oncovirus, lentivirus or spumavirus, adenoviridae adenovirus, or parvoviridae AAV.
  • virus particles By using virus particles, it is possible to deliver the agent contained in the target cells into the target cells using the target cell-specific infectivity of the virus particles.
  • AAV virions when AAV virions are used, the specificity of the infected target cell in each AAV serotype is applied and delivered to specific cells, tissues and organs such as nerve cells, muscle cells, hepatocytes, fibroblasts, etc. Yes (Okada T. and Takeda S., Gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. In A Guide to Human Gene Therapy (ed. By Roland W. Herzog and Sergei Zolotukhin), World Scient -one two Three).
  • agent refers to a substance that can be given into a target cell by incorporating it into a target cell. Uptake of the agent into the target cell is performed in a state of being encapsulated in the drug carrier and in a state of the agent alone.
  • agent in the present specification include a nucleic acid, a peptide, a low molecular compound, or a combination thereof. Two or more kinds of nucleic acids, two or more kinds of peptides, two or more kinds of low molecular weight compounds, or combinations thereof are also included in the agent.
  • An agent usually imparts various activities to target cells such as promoting or suppressing the expression of a specific gene, promoting or suppressing proliferation, or inducing or suppressing cell death. obtain.
  • target cells such as promoting or suppressing the expression of a specific gene, promoting or suppressing proliferation, or inducing or suppressing cell death.
  • nucleic acids, peptides, and low molecular weight compounds as agents will be defined.
  • nucleic acid as an agent includes natural nucleic acids, chemically modified nucleic acids, artificial nucleic acids, nucleic acid analogs, and combinations thereof.
  • Natural nucleic acid refers to DNA and RNA in which only natural nucleotides existing in nature are linked.
  • “Chemically modified nucleic acid” refers to an artificially chemically modified nucleic acid.
  • methylphosphonate DNA / RNA phosphorothioate DNA / RNA, phosphoramidate DNA / RNA, 2′-O-methyl DNA / RNA, and the like can be mentioned.
  • “Artificial nucleic acid” refers to a nucleic acid comprising a non-natural nucleotide or a non-natural nucleotide linked to a part of a natural nucleic acid.
  • the term “non-natural nucleotide” as used herein refers to a non-naturally occurring nucleotide that is artificially constructed or artificially chemically modified and has properties and / or structures similar to those of the natural nucleotide.
  • Nucleic acid analog refers to an artificially constructed polymer compound having a structure and / or property similar to that of a natural nucleic acid.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • PONA peptide nucleic acid having a phosphate group
  • BNA / LNA Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid
  • morpholino nucleic acid including morpholino oligo
  • the nucleic acid may be labeled with a phosphate group, sugar and / or base.
  • a labeling substance known in the art can be used.
  • radioisotopes eg, 32 P, 3 H, 14 C
  • DIG dimethyl sulfoxide
  • biotin e.g, glutathione, glutathione, glutathione, glutathione, glutathione, glutathione, glutasulfate, phosphate group, sugar and / or base.
  • fluorescent dyes eg, FITC, Alexa, Texas Red, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA
  • a luminescent substance for example, acridinium ester
  • the size of the nucleic acid as the agent is not limited, but is usually 2 to 50 kb nucleotides, preferably 5 to 20 kb nucleotides, more preferably 10 to 10 kb nucleotides, and more Preferably, the nucleotide is 14 to 5 kb.
  • nucleic acid as the agent include functional nucleic acids, vectors, mRNA or fragments thereof, or combinations thereof. Each is defined below.
  • RNA interference agents nucleic acid aptamers (including RNA aptamers and DNA aptamers), antisense DNA, ribozymes (including deoxyribozymes), U1 adapters, molecular beacons, riboswitches, or transcription factor binding regions Etc.
  • RNA interference agents can be preferably applied as pharmaceutical agents.
  • RNA interference agent refers to inducing RNA interference (RNAi) in vivo and suppressing (silencing) the expression of the gene through degradation of the target gene transcript.
  • RNAi RNA interference
  • shRNA small interfering RNA
  • miRNA miRNA
  • vector refers to a nucleic acid molecule having a function of carrying a foreign gene or a fragment thereof.
  • examples include plasmids, cosmids, and artificial chromosomes.
  • Artificial chromosomes include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), fungal artificial chromosome (BAC), and P1-derived artificial chromosome (PAC). Chromosome). Preferably, it is HAC.
  • the vector can contain a foreign gene or a fragment thereof inside.
  • the foreign gene include a transcription factor, a signal transduction factor, a gene encoding an extracellular secreted protein or an enzyme, or a fragment having an activity thereof. It does not matter whether the included gene is a wild type gene or a mutant gene. Moreover, two or more vectors containing different genes may be included in the incorporated drug.
  • the vector is preferably included in a state in which the gene or a fragment thereof can be expressed in the cell to be introduced.
  • the “expressable state” means that the gene or fragment thereof contained in the vector is placed under the control of the promoter and terminator in the nucleic acid expression system so that it can be expressed in the cell to be introduced.
  • a “nucleic acid expression system” is a system having at least one set of expression regulatory elements necessary for gene expression in a functional state.
  • expression control elements include an enhancer and a poly A addition signal as necessary.
  • mRNA is a nucleic acid molecule encoding any protein.
  • the mRNA may be either an mRNA precursor or a mature mRNA. Preferably it is a mature mRNA.
  • mRNA or a fragment thereof may contain an m7G cap structure at the 5 ′ end and / or a poly A chain at the 3 ′ end. It does not matter whether the protein encoded by the mRNA is a wild type or a mutant type.
  • peptide as an agent includes both oligopeptides and polypeptides.
  • oligopeptides include peptide hormones and polypeptide fragments.
  • polypeptides include antibodies, transcription factors, signal transduction factors, and enzymes.
  • Antibodies include, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies, synthetic antibodies, and antibody fragments.
  • the immunoglobulin molecule can be of any class (eg, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY), or any subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 , IgA2).
  • the antibody is preferably an antibody derived from the same species as the biological species to which the drug carrier is administered.
  • the monoclonal antibody or polyclonal antibody as the drug is preferably a human antibody.
  • “Recombinant antibody” refers to a chimeric antibody, a humanized antibody, or a multispecific antibody.
  • a “chimeric antibody” is an antibody prepared by combining amino acid sequences of antibodies from different animals, and is an antibody in which the constant region (C region) of one antibody is replaced with the C region of another antibody.
  • C region constant region
  • an antibody in which the C region of a mouse monoclonal antibody is replaced with the C region of a human antibody is applicable. This can reduce the immune response to the antibody in the human body.
  • a “humanized antibody” is a mosaic antibody in which the complementarity determining region (CDR) in the V region of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, is replaced with the CDR of a human antibody.
  • Multispecific antibody refers to a multivalent antibody, that is, an antibody having a plurality of antigen-binding sites in one molecule, and each antigen-binding site binds to a different epitope.
  • bispecific antibodies that have two antigen-binding sites, such as IgG, that bind to different epitopes on each antigen-binding site can be mentioned.
  • “Synthetic antibody” refers to an antibody synthesized chemically or by using a recombinant DNA method.
  • an antibody newly synthesized using a recombinant DNA method can be mentioned.
  • a single chain antibody scFv: single chain fragment, variable region
  • a diabody a triabody, a tetrabody, or the like
  • scFv single chain fragment, variable region
  • the “antibody fragment” corresponds to, for example, Fab, F (ab ′ 2 ), Fv and the like.
  • the peptide may be modified.
  • Peptide modifications include functional modifications or label modifications.
  • Functional modifications include, for example, glycosylation, acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, or PEGylation.
  • Modifications on the label include fluorescent dyes (Alexa, fluorescein, FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5,), fluorescent proteins (eg, PE, APC, GFP,), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase) , Glucose oxidase), radioisotopes (eg 3 H, 14 C, 35 S) or biotin or (strept) avidin.
  • fluorescent dyes Alexa, fluorescein, FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5,
  • fluorescent proteins eg, PE, APC, GFP,
  • enzymes eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatas
  • the peptide size is not limited. Usually, it is 500 kDa or less, preferably 100 kDa or less, more preferably 80 kDa or less, and further preferably 50 kDa or less.
  • the “low molecular compound” is a compound having a molecular weight of 5000 or less, preferably 2000 or less, more preferably 1000 or less, and corresponds to substances other than the nucleic acids and peptides. Examples include various pharmaceutical compounds such as alkaloids, flavonoids, polysaccharides, hormones, neurotransmitters and immunosuppressants. Moreover, the derivative
  • the drug uptake enhancer of the present invention contains a Paeonia plant-derived material, a Glycyrrhiza plant-derived material, or a combination thereof as an active ingredient.
  • Paeonia plants are perennials belonging to the genus Paeoniaceae, and include herbaceous species known as peonies and woody species known as buttons. Both are widely used worldwide as raw materials for herbal medicines that are important to Kampo.
  • the kind of the plant belonging to the genus of the present invention is not particularly limited since it can contain the same herbal components as long as it belongs to the genus.
  • Specific examples of the button genus plant of the present invention include, for example, P. lactiflora, P. japonica, P. ovobata, P. officinalis (P. officinalis), P. mlokosewitschii, P. pellegrina, P. tenuifolia, P. lutea, P. anomala, P. anomala P. macrophylla, P. decomposita, P. delavayi, P. jishanensis, P. ludlowii, P. ludlowii, P. ludlowii ostii), P. potaninii, P. qiui, P. rockii, P. suffruticosa and the like.
  • the “Glycyrrhiza plant” is a perennial herbaceous plant belonging to the genus Leguminosae, and is widely used worldwide as licorice (licorice), which is a raw material of herbal medicine important in Chinese medicine.
  • the kind of licorice plant of the present invention is not particularly limited because it can contain the same herbal components as long as it belongs to the genus.
  • Specific examples of the licorice plant of the present invention include G. G. uralensis, G. G. glabra, G. G. inflata, G. aspera, G. eurycarpa, G. ⁇ ⁇ pallidiflora, G. yunnanensis, G. repidota (G .Lepidota), G.echinata, G. (G.acanthocarpa) and the like.
  • the mixing ratio of each derived material is not particularly limited, for example ,
  • the mixing ratio of button genus plant material and licorice plant material is in the range of 2: 8 to 8: 2 by weight, 3: 7 to 7: 3, or 4: 6 to 6: 4 Can be mentioned.
  • Shakuyakukanzo-to which is a herbal medicine comprising them in a weight ratio of 1: 1, may be used.
  • the origin may be derived from any part of the plant body of the genus Button and / or the plant of the genus Licorice.
  • examples include roots, stolons (underground stems), stems (including stems and branches), leaves (including leaf buds), flowers (including flower buds), fruits, and seeds.
  • it is a root part (in the case of Button genus plants and Licorice plants) or stron (in the case of Licorice plants) which is mainly used as a crude drug in these plants.
  • stron in the case of Licorice plants
  • these sites contain a particularly large amount of main active ingredients as crude drugs.
  • paeoniflorin which is the main active ingredient of herbal medicines
  • paeonin, paeonol, etc. are the main active ingredients of herbal medicines
  • a large amount of glycyrrhizin or isoliquiritigenin is contained in the root or stron.
  • the state of the derived substance is not particularly limited as long as it is derived from the plant.
  • the plant itself, the extract from a derived plant body, or those combinations are mentioned.
  • the “plant body itself” means a part containing a part of the plant body such as a fragment, powder, or juice.
  • fragment refers to a plant body that has been cut into pieces by cutting, printing, or the like.
  • the size of the fragment is not particularly limited as long as it is a size that can be administered as an active ingredient of a drug uptake enhancer and that can exhibit a drug effect. For example, it may be in the range of 1 to 5 mm.
  • “Powder” refers to a powdered plant body.
  • the size of the particles constituting the powder is not particularly limited as long as it is 1 mm or less. For example, it may be a granule size, a fine powder size, or a mixture thereof.
  • the “squeezed liquid” refers to a liquid component obtained by squeezing a plant body. Small pieces of plant bodies may be included as solid components, or may be filtered to make only liquid components.
  • the plant body may be in a raw state, a fermented state, or a dried state. What is necessary is just to select suitably according to the said form of a plant body. For example, if a plant body is a powder, the dry state is preferable. Moreover, if it is a squeezed liquid, it will be in a raw state or a fermented state. In the present invention, a dry powder of the derived plant body is preferable.
  • extract means a product obtained by taking out only components such as a low molecular compound contained in a plant derived from a medium such as a solvent.
  • a liquid component obtained by immersing a fragment of a derived plant body in water, ethanol or a mixture thereof at a predetermined temperature for a predetermined time and then removing the plant body by centrifugation or filtration.
  • Liquid liquid component
  • solids including granules and powder
  • the predetermined temperature is, for example, 10 to 100 ° C., preferably 40 to 99 ° C., more preferably 70 to 99 ° C. under 1 atm when the solvent is water, and a heat and pressure-resistant airtight device such as an autoclave is used.
  • the temperature may be in the range of 100 to 121 ° C.
  • the temperature may be in the range of 0 to 78.3 ° C, preferably 15 to 77 ° C, more preferably 20 to 77 ° C under 1 atm.
  • the above-described conditions for water or ethanol may be appropriately applied depending on the concentration of ethanol.
  • the predetermined time varies depending on the temperature of the solvent.
  • the solvent temperature is a low temperature of less than 40 ° C., for example, it takes a long time of several days to one year or more, and the boiling point is 40 ° C. or more under 1 atm. If it is less than the high temperature, it may be a short time of about 2 minutes to several hours, for example. Further, when the solvent is water and the temperature is 100 to 121 ° C. under 1 to 2 atm, the time may be 2 to 30 minutes, preferably about 10 to 20 minutes.
  • the extract is particularly preferable among the extracts because the contamination rate of the cell fragments of the derived plant body is low and the medicinal effect of the drug uptake enhancer of the present invention can be obtained with a small amount.
  • the state of each derived material may be the same or different.
  • the button genus plant-derived material is a dry powder
  • the licorice plant-derived material is an extract powder.
  • the states of both derived substances are the same. For example, it is a case where any derived material is an extract.
  • the drug uptake enhancer of the present invention comprises a button genus plant-derived material and a licorice plant-derived material alone as a drug uptake enhancer, or a mixture of each derived material in an appropriate ratio. Can be manufactured.
  • the preparation method of the derived material varies depending on the state and form of the derived material. For example, when using a squeezed juice as a squeezed liquid, in a squeezing step, a raw product or a dried product is immersed in a solvent such as water and returned to a squeezing machine, or a mixer or a mill. It can be obtained by filtering or squeezing after applying (including grated).
  • the derived material when used as a dry powder, it can be obtained by pulverizing the dried material of the derived material in a pulverizing step. At this time, if the derived substance is in a raw state, it may be subjected to a drying step before the pulverization step or may be subjected to the pulverization step while being in a raw state and then subjected to a drying step.
  • the obtained plant body is immersed in a solvent to obtain a plant. What is necessary is just to pass through the extraction process which extracts the component contained in a body in a solvent. If necessary, a concentration step for concentrating the extracted components may be performed.
  • each of the derived materials is produced separately, and then in an appropriate ratio, for example, a button genus plant-derived material and a licorice plant-derived material
  • the product may be prepared by mixing in a weight ratio of 2: 8 to 8: 2, 3: 7 to 7: 3, or 4: 6 to 6: 4, or a button genus plant.
  • the licorice plant can be mixed in advance in the above-mentioned weight ratio, and then a derivative as a mixture can be prepared by the above-described process.
  • the derived product or drug uptake enhancer commercially available Chinese medicines or herbal medicines can be used.
  • Shakuyakukanzo-to which is a mixture of button genus plant material and licorice plant material in a weight ratio of 1: 1, is used as a Chinese medicine for muscle spasms such as komera collar and associated pain or stomach pain. It is commercially available from chemical manufacturers such as The shakuyakukanzoto can be used as a drug uptake enhancer as it is or by subjecting it to an extraction process.
  • capture enhancer of this invention is not limited to this method at all.
  • the method of preparing an extract as a derived product includes an extraction process as an essential process, and a fragmentation process, a drying process, and a concentration process as selection processes. Hereinafter, each process will be described.
  • the "extraction process” means that a medicinal component such as a low molecular compound contained in the plant is immersed in the solvent by immersing the plant body of the genus Button and / or licorice. This is a step of elution. In this step, the liquid component obtained by removing the plant body, which is a solid component, from the solvent after extraction by centrifugation, filtration or the like becomes an extract containing a medicinal component.
  • the solvent examples include water, organic solvents (alcohols, benzene, hexane, toluene, and the like), or a mixed solution obtained by combining them.
  • it is water that is not toxic to a living body, or ethanol or a mixture of ethanol and water that has very low toxicity.
  • the plant body is washed with water or the like before being immersed in the solvent to sufficiently remove soil or dust attached to the surface.
  • the amount of the solvent is not limited, but usually the solvent volume (volume / weight: V / W) relative to the weight of the plant to be used may be in the range of 2 to 10 times. For example, when 10 g of plant body is used in the extraction step, water can be used in the range of 20 mL to 100 mL.
  • the solvent may be heated.
  • the heating temperature varies depending on the type of solvent.
  • it is 50 to 100 ° C., preferably 60 to 99 ° C., more preferably 70 to 98 ° C. under 1 atm.
  • the range of 100 to 121 ° C. is used at 1 to 2 atm using ethanol, and the range of 40 to 78.3 ° C., preferably 55 to 77 ° C., more preferably 60 to 77 ° C. at 1 atm for ethanol.
  • the above-described conditions for water or ethanol may be appropriately applied depending on the concentration of ethanol.
  • the extraction time in the solvent depends on the state of the plant to be extracted, the type and temperature of the solvent, or the solubility of the solvent in the medicinal component. For example, when immersing a plant in a raw state in water at 20 ° C under 1 atm, the extraction time takes one year or more, but when immersing a plant powder in a dry state in water heated to 98 ° C. The extraction time is about 2 to 20 minutes. Furthermore, when the solvent is water, a time of about 1 to 15 minutes is sufficient if the temperature is 120 to 121 ° C. under 2 atmospheres. In general, the lower the solvent temperature, the longer the extraction time, and the higher the solvent time, the shorter. Moreover, the extraction time may be shorter as the medicinal component is more soluble in the solvent, and the longer the time is required as it is less soluble.
  • the method for heating the solvent is not particularly limited as long as the solvent can be heated to around the desired temperature.
  • a method of heating in an open flame in a container or a method of heating with a heat source such as a microwave or a heater can be mentioned.
  • the order of plant immersion and solvent heating is not important.
  • the plant body may be immersed after the solvent is heated to a predetermined temperature, or the plant body may be immersed in a solvent at room temperature and heated to the predetermined temperature.
  • the solvent may be stirred together with heating.
  • stirring method for example, stirring may be performed with a stirring rod, or stirring may be performed using a stirring device.
  • fragmentation step is a step of fragmenting a plant body of the genus Button and / or Licorice. This step is a selection step, and may be performed prior to or simultaneously with the extraction step as necessary.
  • “Fragmentation” as used herein includes not only cutting the plant into small pieces by cutting, but also increasing the surface area of the plant internal tissue exposed to the outside. For example, epidermis peeling, crushing, slicing, chopping, grated, and combinations thereof of the plant body can be mentioned. Fragmentation can increase the external exposed area of the internal tissue of the plant that is in direct contact with the solvent, thereby increasing the extraction efficiency of the medicinal component contained in the plant into the solvent.
  • the "drying process” means the process of drying the plant body of the genus Button genus plant and / or licorice plant, and making it a dry plant body. This step is a selection step, and may be performed prior to the extraction step as necessary.
  • the order is not particularly limited.
  • a drying process may be performed after a fragmentation process, and a fragmentation process may be performed after a drying process. More preferably, a drying step is performed after the fragmentation step. This is because the moisture evaporation surface increases by increasing the externally exposed area of the plant internal tissue through the fragmentation step, and the plant can be dried in a shorter time.
  • “Drying” in this step means reducing the moisture contained in the plant body. By reducing the moisture in the plant body, the solvent easily penetrates into the tissue of the plant body, so that the medicinal component contained in the plant body can be efficiently extracted into the solvent in a short time. In addition, when an organic solvent such as ethanol is used as an extraction solvent, the penetration of the extraction solvent is not hindered or diluted by moisture present in the cells when the plant body is dried.
  • an organic solvent such as ethanol
  • the drying method is not particularly limited as long as moisture contained in the plant body can be reduced.
  • natural drying methods including sun-drying
  • dehumidifying drying methods that put them in a sealed container together with a dehumidifying agent
  • dry methods that apply hot or cold air using a blower
  • a heat drying method using a heat source a vacuum drying method using a vacuum pump or the like in a sealed container
  • a freeze drying method or a combination thereof.
  • the lyophilization method is preferred in that it can be dried in a relatively short time without almost modifying the medicinal component.
  • the plant fragmented in the fragmentation step may be dried at ⁇ 50 ° C. for 6 hours to 1 week, preferably at ⁇ 50 ° C. for 24 hours to 72 hours.
  • the moisture content of the plant body is preferably 50% or less before drying. More preferably, it is 30% or less, and further preferably 20% or less.
  • Concentration process is a process of increasing the concentration of the medicinal component contained in the extract by subtracting the solvent used for extraction from the extract obtained in the extraction process. This step is a selection step and may be performed after the extraction step as necessary.
  • This step is not particularly limited as long as it is a method capable of removing a solvent that can reduce only the solvent without modifying the medicinal component contained in the extract.
  • a method for subtracting the liquid from the extract a method known in the art can be used. For example, an evaporation concentration method using an evaporator or the like, a natural evaporation concentration method in which a solvent is evaporated by air drying, or the like, and a concentration method by cooling an extract solution are exemplified.
  • the solvent in the extract may be reduced until the concentration of the medicinal component in the extract becomes 3 times or more, preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more compared to before this step.
  • the solvent may be almost or completely removed until the medicinal component or the like is precipitated.
  • the preparation method in the case where the derived material is an extract has been described as a specific example.
  • the drying step is an essential step, and the fragmentation step is performed as necessary. To go through.
  • the drug uptake enhancer of the present invention can be used not only as a constituent of a pharmaceutical composition described later, but also the drug uptake enhancer itself can be administered to a living body or cells (including tissues and organs). In this case, it is assumed that the drug uptake enhancer is not administered alone, but is administered together with an agent or a drug carrier including the agent. This is because the drug uptake enhancer of the present invention functions as an auxiliary agent for enhancing the intracellular uptake efficiency of the agent or the drug carrier.
  • the administration method of the drug uptake enhancer of the present invention may be a method of adding it to a medium as long as it is a cell.
  • the agent or the drug carrier finally has a target site cell. Any form known in the art can be applied as long as it is a method that can be delivered to and incorporated into. Since the specific administration method in this case may be the same as the administration method of the pharmaceutical composition of the 2nd aspect mentioned later, description here is abbreviate
  • the drug uptake enhancer of the present invention is first administered to the living body, and then the agent or the drug carrier containing the agent is administered to the living body, or the carrier. At the same time, it is preferable to administer to the living body.
  • the drug uptake enhancer of the present invention can improve the intracellular uptake efficiency of the agent or the drug carrier by using it together with the agent or a drug carrier including the agent. Therefore, when used in DDS, the intended agent can be efficiently taken up into cells.
  • the drug uptake enhancer of the present invention does not affect HDAC activity, there are few side effects on the living body, and it is also suitable for functional analysis of differentiation regulators and preparation of undifferentiated cells by reprogramming.
  • the 2nd aspect of this invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of this aspect includes the drug uptake enhancer described in the first aspect.
  • the pharmaceutical composition of this aspect has a pharmacological effect that enhances the intracellular uptake efficiency of the agent or drug carrier used in combination by the action of the active ingredient contained in the drug uptake enhancer described in the first aspect.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment includes a drug uptake enhancer and can optionally include a liquid medium, a carrier, and / or other active ingredients.
  • a drug uptake enhancer can optionally include a liquid medium, a carrier, and / or other active ingredients.
  • Drug uptake enhancer included in the pharmaceutical composition of this aspect is the drug uptake enhancer described in the first aspect.
  • the drug uptake enhancer is an essential component in the pharmaceutical composition of the present invention, and functions as an active ingredient of the pharmaceutical composition that enhances the intracellular uptake efficiency of the agent or drug carrier.
  • the content of the drug uptake enhancer is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically effective amount.
  • the “pharmaceutically effective amount” means a dose necessary for the drug uptake enhancer to exert its function, and a dose having little or no harmful side effects on the administered organism.
  • the specific dose varies depending on the type of agent or drug carrier to be used in combination, the type of carrier, dosage form, subject information, administration method, administration route, etc. described later.
  • the pharmaceutically effective range of doses and the preferred route of administration are usually based on data obtained from cell culture assays and animal studies.
  • the final dose is determined and adjusted according to the judgment of the doctor according to the individual subject.
  • the subject information to be taken into consideration includes the degree or severity of disease, general health, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, resistance to treatment, and the like.
  • the content of the drug uptake enhancer in the pharmaceutical composition per dosage unit include the pharmaceutical composition of the present invention for human adult males (body weight 60 kg) that do not require other medications. When administered orally, it may contain about 0.01 wt% to 100 wt%, preferably about 0.1 wt% to about 90 wt% of a drug uptake enhancer per dosage unit.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when administered by injection, about 0.01% (w / v) to about 20% (w / v), preferably about 0.1% (w / v) per dosage unit of injection v) to about 10% (w / v) drug uptake enhancer may be included.
  • it can be divided into several doses to reduce the burden on the subject.
  • the pharmaceutical composition of this aspect can contain a liquid medium as a structural component.
  • Liquid media include, for example, solvents such as water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • solvents such as water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • Such a liquid medium is desirably sterilized at the time of use, and is preferably adjusted to be isotonic with blood as necessary.
  • composition of the present invention can contain a pharmaceutically acceptable carrier as a constituent.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to an additive usually used in the field of pharmaceutical technology. For example, an excipient, a binder, a disintegrant, a filler, an emulsifier, a fluid addition regulator, a lubricant and the like can be mentioned.
  • Excipients include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically, but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, dextrin, malto Dextrin, starch and cellulose), metal salts (eg sodium chloride, sodium phosphate or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium and high molecular weight polyethylene glycols ( PEG), pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (more specifically, but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inos
  • binders include starch paste using corn, wheat, rice, or potato starch, simple syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac and / or polyvinylpyrrolidone. As mentioned.
  • Disintegrants include the starch, lactose, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride Or their salts are mentioned as examples.
  • the filler examples include the sugar and / or calcium phosphate (for example, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifiers examples include sorbitan fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and propylene glycol fatty acid esters.
  • Examples of the flow addition regulator and lubricant include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • flavoring agents, solubilizers, suspending agents, diluents, surfactants, stabilizers, absorption promoters, extenders, moisturizers, humectants, adsorbents, if necessary Disintegration inhibitors, coating agents, coloring agents, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents and the like can also be included.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can include two or more of the above carriers as necessary.
  • Such a carrier is mainly used for facilitating the formation of the dosage form and maintaining the dosage form state and the drug effect, and for making the drug uptake enhancer as an active ingredient difficult to be degraded by enzymes in the living body. And may be used as needed.
  • other active ingredients refers to active ingredients other than the drug uptake enhancer of the first aspect in the pharmaceutical composition of this aspect.
  • the other active ingredient may have the same pharmacological effect as that of the drug uptake enhancer of the first aspect, or may have a different pharmacological effect.
  • it may be an agent to be used in combination with the drug uptake enhancer of the present invention or a drug carrier including the same.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited as long as it does not inactivate the drug uptake enhancer of the first aspect or is difficult to inactivate and can sufficiently exert its pharmacological effect in vivo after administration. Not limited.
  • General dosage forms include liquids or solids (including semi-solids such as gels), but any of the present invention may be used.
  • Specific dosage forms include, for example, parenteral dosage forms such as injections, suspensions, emulsions, eye drops, nasal drops, creams, ointments, plasters, shipping agents and suppositories, or liquids and powders.
  • Oral dosage forms such as (including powders, powders, and powders), granules, tablets, capsules, sublinguals, and lozenges.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not administered alone, but is used in combination with an agent or a drug carrier including the agent (including the case where the agent or drug carrier is included in the pharmaceutical composition of the present invention).
  • an agent or a drug carrier including the agent including the case where the agent or drug carrier is included in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • any form known in the art may be applied as long as the agent or drug carrier can be finally delivered to and taken up by the cells at the target site.
  • the living body to be administered is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human.
  • Specific dosage unit forms of the pharmaceutical composition of the present invention can be roughly classified into oral administration methods and parenteral administration methods.
  • the oral administration method is generally systemic administration, but the parenteral administration method can be further subdivided into systemic administration and local administration (for example, subcutaneous administration, transdermal administration, transmucosal administration, or rectal administration).
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected according to the onset site or the degree of progression of the disease, and may be systemic administration or local administration. Preferably, it is oral administration or systemic administration via intravascular injection.
  • the drug uptake enhancer can be applied quickly, and it is relatively low in invasiveness, so the burden on the subject is small It is.
  • the onset site is a local disease
  • local administration directly administered to and around the onset site by local injection or transdermal administration can also be employed.
  • the injection site of the pharmaceutical composition by injection is not particularly limited.
  • the circulatory system such as intravascular or intraventricular, liver, muscle, joint, bone marrow, intrathecal, percutaneous, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intranasal, intestine, sublingual And the like in the organ or tissue.
  • the order of administration with the agent or drug carrier to be used in combination is not particularly limited. It may be administered either before, simultaneously with, or after administration of the agent or drug carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered before administration of the agent or drug carrier (for example, 10 minutes to 1 day before administration) or simultaneously with the pharmaceutical composition of the present invention (in the pharmaceutical composition of the present invention).
  • the pharmaceutical composition of the present invention in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • an agent or a drug carrier for example, 10 minutes to 1 day before administration
  • the intracellular uptake efficiency of the agent or the drug carrier including the agent can be enhanced. Therefore, although usefulness is expected, it is possible to improve the utility of a known carrier that has low practical efficiency due to low uptake efficiency into a target cell, or has not been able to obtain a sufficient effect. . As a result, nucleic acids, peptides, and low-molecular compounds can be efficiently introduced into target cells, and improvement in reprogramming for gene therapy, cancer therapy, and iPS cell production can be expected.
  • Drug uptake kit 3-1 Overview
  • a third aspect of the present invention is a drug uptake kit. According to the drug uptake kit of the present invention, the intracellular uptake efficiency of the agent or drug carrier can be enhanced.
  • the drug uptake kit of the present invention includes the drug uptake enhancer described in the first aspect and an agent or drug carrier as essential components.
  • the drug carrier in this embodiment does not necessarily include an agent.
  • a desired agent can be included in the drug carrier as required. Therefore, the drug uptake kit of the present invention may contain an agent or a drug uptake marker as a constituent article.
  • drug uptake markers include compounds labeled with radioactive isotopes such as 11 C, 18 F, 15 O, and 13 N when used in PET (Positron Emission Tomography) and the like.
  • SPECT Single Photon Emission Computed Tomography
  • a drug enhancer administration regimen or instructions for use may be included as constituent articles.
  • Example 1 Intracellular uptake efficiency of drug uptake enhancer> (the purpose) The uptake efficiency of the drug carrier rAAV in cells treated with the drug uptake enhancer of the present invention is verified by the expression efficiency of the luciferase gene and the like included in rAAV. At the same time, the HDAC inhibitory activity is also verified.
  • Method 1 Cultured cells and culture conditions In this study, U251 cells (human glioma) were used. Cells were obtained from the Human Science Research Resource Bank. The cultured cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 using DMED / F-12 (1: 1) (GIBCO) medium containing 10% FBS (Nichirei).
  • HDAC inhibitor was used as a positive control for the drug uptake enhancer.
  • Sodium butyrate was used as the HDAC inhibitor.
  • Sodium butyrate was dissolved in PBS to a concentration of 100 ⁇ m or 200 ⁇ m, filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and then subdivided and stored at ⁇ 30 ° C.
  • recombinant AAV was used as a drug carrier.
  • rAAV was determined by the method of Okada et al. (Okada, T., et al., 2009, Hum. Gene Ther., 20: 1013-1021; Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16: 1212-1218).
  • rAAV8-Luc 2.1 ⁇ 10 13 vg / mL
  • rAAV8-GFP 2.1 ⁇ 10 12 vg / mL
  • rAAV was fluorescently labeled using Alexa Fluor 568 Protein Labeling Kit (life technologies) (Alexa 568-rAAV8-M3) and used for analysis of intracellular kinetics of rAAV.
  • RAAV8-Luc (2 ⁇ 10 5 vg / cell) as a drug carrier at 1 ⁇ 10 9 vg / well directly or after medium replacement 6 hours after the addition of a drug uptake enhancer or HDAC inhibitor
  • rAAV-GFP (1 ⁇ 10 5 vg / cell) was added at 5 ⁇ 10 8 vg / well. 48 hours after addition of rAAV, luciferase gene expression was measured by luciferase activity measurement, GFP gene expression was observed by GFP fluorescence observation, and HDAC inhibitory activity measurement was performed.
  • Luciferase activity was measured using Bright-Glo TM Luciferase Assay System (Promega) 48 hours after the addition of rAAV. Specifically, the medium was removed immediately before the measurement, and Luciferase Assay System Mixture was added. The detailed method followed the attached protocol. The luciferase activity was measured using Appliskan (Thermo Scientific) (Luminescence, shake, high, 500 sec).
  • HDAC-Glo TM I / II Assay Mixture added with Triton (final concentration 1%) was added. The measurement followed the attached protocol.
  • FIG. 1 shows the results of measuring luciferase activity
  • FIG. 2 shows the results of measuring HDAC inhibitory activity
  • FIG. 3 shows the results of measuring GFP.
  • a on the horizontal axis represents a serial dilution series of a drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto from low concentration to each concentration
  • Cont represents a sample without addition of the drug uptake enhancer of the present invention.
  • A shows untreated U251 cells
  • B shows U251 cells treated with rAAV8-GFP
  • C shows U251 cells treated with rAAV8-GFP and a drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto.
  • FIG. 1 when treated with a drug uptake enhancer, a significant concentration-dependent increase in luciferase activity was confirmed, indicating that the efficiency of rAAV8-Luc uptake into U251 cells was enhanced.
  • FIG. 3 also proved that when treated with a drug uptake enhancer, the uptake efficiency of rAAV8-GFP into U251 cells was enhanced.
  • Example 2 Cytotoxicity test of drug uptake enhancer> (the purpose) The cytotoxicity of the drug uptake enhancer of the present invention is verified by XTT assay.
  • Example 2 Basically, the method described in Example 1 was followed. A 96 well-plate was a transparent plate. The cytotoxicity test was performed according to the attached protocol using Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) 48 hours after the addition of rAAV. Specifically, 48 hours after the addition of rAAV, the medium was removed, and 100 ⁇ L of XTT Mixture diluted with DMED / F-12 medium containing 10% FBS was added and incubated for 2 hours or more. The measurement was performed using Appliskan (Thermo Scientific) (Potoabsorption, 450 nm, shake).
  • XTT Cell Proliferation Kit II
  • Example 3 Verification of effect of drug on uptake of rAAV into cells> (the purpose) It is verified by the rAAV genome copy number in the cell that the intracellular uptake efficiency of the drug carrier by the drug uptake enhancer of the present invention is enhanced.
  • the promoter portion of the viral vector was quantitatively detected by quantitative RT-PCR, and the intracellular rAAV genome copy number was calculated.
  • a known copy number plasmid (pCMV) containing a CMV promoter was linearized and used for preparation of a standard curve and calibration.
  • CMV-F SEQ ID NO: 1 5′-TACATCAATGGGCGTGGATA-3 ′
  • CMV-R SEQ ID NO 2: 5′-GGCGGAGTTGTTACGACATT-3 ′
  • TAKARA SYBR Premix Ex Ex Taq II
  • FIG. 5 is a graph showing the uptake rate of Alexa® 568-rAAV8-M3 genome in cells by quantitative RT-PCR.
  • Cont is a sample without addition of the drug uptake enhancer of the present invention
  • A is a sample to which the drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto of the present invention is added
  • SB is a sample to which sodium butyrate is added. It is.
  • the vertical axis shows the relative value when the uptake rate of Alexa 568-rAAV8-M3 genome of Cont is 1. It was proved that the sample to which the drug uptake enhancer was added had a significantly enhanced uptake rate of Alexa 568-rAAV8-M3 genome compared to the Cont and SB samples.
  • FIG. 6 is a diagram showing the localization of Alexa 568-rAAV8-M3.
  • NT is an untreated cell
  • Cont is a cell without the addition of the drug uptake enhancer of the present invention
  • A is a cell to which the drug uptake enhancer derived from Shakuyakukanzoto of the present invention is added
  • SB is sodium butyrate. Added cells.
  • the white dot on the arrow indicates Alexa 568-rAAV8-M3
  • the arrowhead indicates the nucleus of U251 cells. Microscopic observation also shows that the number of Alexa 568-rAAV8-M3 localized in the cells, particularly around the nucleus, increased in the cells to which the drug uptake enhancer was added.
  • Example 4 Effect of glaze and / or licorice in drug uptake enhancer (1)> (the purpose) The effects of glaze and / or licorice in the drug uptake enhancer of the present invention will be verified using extracts prepared from various Chinese medicines including glaze and / or licorice.
  • rAAV recombinant AAV Recombinant AAV
  • rAAV was used as a drug carrier.
  • rAAV was determined by the method of Okada et al. (Okada, T., et al., 2009, Hum. Gene Ther., 20: 1013-1021; Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16: 1212-1218).
  • rAAV9-CAG-Luc was used for the expression analysis of rAAV.
  • Extract Solution Dissolve 0.25 g of glaze extract powder (blessed from Tsumura), licorice extract powder (blessed from Tsumura), and TJ-68 (gakukan kanzo-to; blessed from Tsumura) in 12.5 mL of PBS. Autoclave extraction was performed at 120 ° C. for 10 minutes in the same manner as in Example 4. Then, after centrifuging twice at 10 K ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., the supernatant was recovered and stored as a stock at ⁇ 30 ° C. This stock was dissolved and centrifuged again at 10 K ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as a Kampo extract stock solution (20 mg / mL) in the experiment.
  • a transparent 96-well well-plate was used for GFP gene expression rAAV9 uptake analysis.
  • GFP measurement by GFP gene expression was performed using an inverted system fluorescence microscope (IX-70; OLYMPUS) 7 days after adding rAAV9 by GFP fluorescence observation.
  • rAAV9 Verification of cytotoxicity of the extract Recombinant AAV9 (rAAV9) was used as a drug carrier. Basically, the method described in Example 2 was followed. A 96 well-plate was a transparent plate. Cytotoxicity test was performed according to the attached protocol using Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) 48 hours after adding rAAV9. Specifically, 72 hours after adding rAAV, the medium was removed, and 100 ⁇ L of XTT Mixture diluted with DMED / F-12 medium containing 10% FBS was added and incubated for 2 hours or more. The measurement was performed using Appliskan (Thermo Scientific) (Potoabsorption, 450 nm, shake).
  • XTT Cell Proliferation Kit II
  • Example 6 Verification of drug uptake effect by main components of glaze and licorice> (the purpose) In the glaze and licorice which are the active ingredients of the drug uptake enhancer of the present invention, whether or not the main components contained therein have a drug uptake effect is verified.
  • Verification of cytotoxicity of drug uptake enhancer Basically, the method described in Examples 2 and 5 was applied. Measurements were taken 3 days after addition of rAAV.
  • Example 7 Effect of drug uptake enhancer in various cells> (the purpose) In Examples 1 to 6, U251 cells derived from neuroepithelial cells were used. It was verified that the drug uptake enhancer of the present invention also has a drug uptake effect in other cell types.
  • Method 1 Cultured cells and culture conditions Fibroblast-derived DMD5017, hepatocyte-derived HepG2, and myocyte-derived RD were used. DMD5017 cells were obtained from Coriell Cell Repositories (Camden, NJ), and HepG2 and RD were obtained from the Human Science Research Resource Bank. Cell culture conditions were in accordance with the method described in Example 1.
  • Example 4 Verification of intracellular uptake efficiency and cytotoxicity of rAAV by drug uptake enhancer The method described in Example 1 was followed. Each cell was seeded, and the TJ-68 extract, which is a drug uptake enhancer, was added the next day. When rAAV was added 6 hours later, the TJ-68 extract was removed by medium exchange (6h) Then, rAAV was added while leaving the TJ-68 extract in the medium, and the group cultured for 72 hours (72 hr) was verified.
  • the drug uptake enhancer of the present invention has a drug uptake effect regardless of the cell type.
  • High luciferase activity was observed in all cells, but in particular with DMD5017 derived from fibroblasts, after treatment with a 1.67 mg / mL drug uptake enhancer, remove the drug uptake enhancer from the medium when adding the drug carrier Observed nearly 100 times more luciferase activity compared to the negative control. Fibroblasts have very low luciferase activity even in the positive control SB treatment. This suggests that the drug uptake enhancer of the present invention is particularly effective for drug uptake into fibroblasts.
  • Example 8 Effect of drug uptake enhancer on drug carrier (1)> (the purpose)
  • two types of rAAV rAAV8 and rAAV9 were used as drug carriers.
  • the drug uptake enhancer of the present invention has the same drug uptake effect on serotype rAAV other than the above two types.
  • Method 1 Cultured cells and culture conditions RD derived from muscle cells was used. Cell culture conditions were in accordance with the method described in Example 1.
  • Example 3 Preparation of recombinant AAV The method described in Example 1 was followed. Recombinant AAV2 (rAAV2) was used as a drug carrier, and rAAV2-Luc (6.3 ⁇ 10 11 vg / mL) was used for expression analysis.
  • rAAV2 Recombinant AAV2
  • rAAV2-Luc 6.3 ⁇ 10 11 vg / mL
  • Example 4 Verification of intracellular uptake efficiency of rAAV2 by drug uptake enhancer The method described in Example 1 was followed. Each cell was seeded, and the TJ-68 extract, which is a drug uptake enhancer, was added the next day. Six hours later, rAAV2-Luc was added without removing the TJ-68 extract, and the cells were cultured for 72 hours.
  • Example 9 Effect of drug uptake enhancer on drug carrier (2)> (the purpose) It was verified that the drug uptake enhancer of the present invention has the same drug uptake effect as rAAV for drug carriers other than rAAV.
  • Method 1 Cultured cells and culture conditions RD derived from muscle cells was used. Cell culture conditions were in accordance with the method described in Example 1. RD cells were seeded in 96 well-plates at 1 ⁇ 10 4 cells / well.
  • Example 10 In vivo drug uptake effect by drug uptake enhancer> (the purpose)
  • Examples 1 to 9 demonstrated the effect of drug uptake into cells by the drug uptake enhancer of the present invention in cultured cells.
  • the effect of drug uptake into cells in vivo by the drug uptake enhancer of the present invention was examined using individual mice.
  • mice were orally dosed with 200 ⁇ L of a 0.25 g / mL drug uptake enhancer to 50 mg / body, and 6 hours later, 4.58 ⁇ 10 10 vg / body rAAV9 was intravenously administered. Individuals not administered with the drug uptake enhancer were used as negative controls.
  • mice muscle tissue was collected, dissolved using Passive Lysis Buffer (Promega) and a homogenizer (Nippi), and then centrifuged at 15 K ⁇ rpm for 5 minutes at 4 ° C. After quantifying the amount of protein in the supernatant by the BCA method, luciferase activity in muscle tissue was measured.
  • FIG. 15 shows the result. It was revealed that the luciferase activity in muscle cells was significantly enhanced in individuals administered with the drug uptake enhancer compared to non-administered individuals. From this result, it was proved that the drug uptake enhancer of the present invention has a drug uptake effect even in vivo.

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Abstract

　作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体と併用することで、該作用剤又は該薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強するとともに、副作用の少ない薬剤取り込み増強剤を開発し、提供する。　ボタン属植物由来物、カンゾウ属植物由来物又はその組合せを有効成分として含む薬剤取り込み増強剤を提供する。

Description

薬剤取り込み増強剤
　本発明は、ウイルス粒子による細胞内への薬剤取り込み効率を増強する薬剤効率増強剤及びそれを有効成分として含む医薬組成物に関する。
　ウイルスの感染能や複製能を利用したウイルスベクターは、細胞内に目的の遺伝子を導入する遺伝子導入技術の一つであり、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等に由来する種々のウイルスベクターが知られている。中でも、アデノ随伴ウイルスベクターは、近年、遺伝子治療において有用な遺伝子導入担体として注目されている。
　アデノ随伴ウイルス（AAV；Adeno-Associated Virus、以下、本明細書では「AAV」と略称する。）は、パルボウイルスに属する非病原性のウイルスで、自己複製能を欠損しているため自律的増殖ができず、増殖にはアデノウイルスやヘルペスウイルスの共感染を必要とする。また、AAVは、核内ではエピゾームとして存在し、染色体に挿入されることがなく、宿主に対する免疫原性が低い上に、宿主域が広い。したがって、病原性が低い、遺伝子変異が生じ難く安全性が高い、炎症反応が起こり難い、及び種々の細胞に感染可能で導入遺伝子を長期間発現することができる、というベクターとして非常に多くの利点を有する。それ故、遺伝子導入の担体として、腫瘍性疾患、神経筋疾患、遺伝性疾患等に対する様々な臨床応用が期待されている。
　一方、AAVベクターをはじめ、一般に純度の高いウイルスベクターを大量に調製するのは困難である。またAAVベクターに限らず、導入する細胞の種類によっては導入効率が低いという問題がある。さらに、免疫応答や副作用を予防するためには少量のベクターで高い発現を得ることが望ましい。そこで、現在では、主としてウイルスベクターに挿入された遺伝子の発現効率を改善することによって、ベクター量の不足分を発現量で補完する方法の開発が進められている。
　特許文献１は、抗癌剤であるヒストン脱アセチル化酵素（以下、本明細書では「HDAC」と略称する）阻害剤の使用により、AAVベクターに組み込んだ遺伝子の発現を増強する方法を開示している。この方法によれば、AAVベクターとHDAC阻害剤を併用することによって、挿入遺伝子を高効率に発現することができる。しかし、この方法は、HDAC阻害剤に抗腫瘍効果がある点で腫瘍性疾患には有用ではあるが、生活習慣病や筋ジストロフィー等の全身疾患や遺伝性神経筋疾患のような慢性疾患に対する使用は、殺細胞効果が生じる可能性があるため好ましくない。
　また、ウイルスベクターは、iPS細胞の作製にも有用である。例えば、iPS細胞の作製ではレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターが主に用いられている。しかし、これらのウイルスベクターは、宿主細胞の染色体への挿入に伴う遺伝子変異を生じるリスクがあるため、安全上の問題が指摘されている(非特許文献１)。一方、AAVベクターは、染色体に組込まれないことから安全性は高いが、線維芽細胞への導入効率が不十分という問題がある(非特許文献２)。また、前述のHDAC阻害剤は、分化誘導を促すため、分化調節因子の機能解析や、リプログラミングによる未分化細胞の作製を行なう場合には適さないという問題がある。
特許4588634号
塙秀樹＆島田隆，2003，ウイルス，第53巻，第2号，pp.77-183 Hansen J., et al., 2001, Journal of Virology, Vol. 75, 9: 4080-4090
　本発明では、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体と併用することによって、該作用剤又は該薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強することのできる、副作用の少ない薬剤効率増強剤を開発し、提供することである。
　本発明者らは、膨大な物質から、ウイルスベクターに挿入された遺伝子の発現効率を増強することができ、安全性が高く、かつ様々な疾患に適用可能な発現効率増強剤を鋭意模索した結果、漢方薬として知られる芍薬甘草湯の抽出液が、ウイルスベクターに挿入された遺伝子の発現を増強できることを見出した。ところが、さらなる研究によって、前記抽出液は、遺伝子の発現効率を直接的に増強するのではなく、ウイルス粒子の細胞内取り込み効率を増強することにより、結果的に遺伝子の発現効率を増強するという予想外の事実を見出した。それ故、この性質を応用することで、遺伝子の発現効率を増強させることのみならず、ドラッグデリバリーシステムにおいて作用剤を所定の細胞に効率的に取り込ませることができることも可能となった。さらに、前記抽出液は、ウイルス粒子を導入する細胞のHDAC活性は変化させない等、生体に対する副作用の影響が少ないことも明らかとなった。本発明は、上記新規知見に基づいて完成されたものであり、以下を提供する。
（１）ボタン属（Paeonia）植物由来物、カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物由来物又はその組合せを有効成分として含む、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強するための薬剤取り込み増強剤。
（２）前記由来物が根由来物、ストロン由来物又はその組合せである、（１）に記載の薬剤取り込み増強剤。
（３）前記由来物が植物体乾燥粉末、抽出物又はその組合せである、（１）又は（２）に記載の薬剤取り込み増強剤。
（４）前記由来物の組合せがボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物をそれぞれ２：８～８：２の重量比で含んでなる、（１）～（３）のいずれかに記載の薬剤取り込み増強剤。
（５）前記由来物の組合せが芍薬甘草湯である、（４）に記載の薬剤取り込み増強剤。
（６）前記薬剤運搬体がウイルス粒子である、（１）～（５）のいずれかに記載の薬剤取り込み増強剤。
（７）前記ウイルス粒子がウイルスベクター又は中空粒子である、（６）に記載の薬剤取り込み増強剤。
（８）前記作用剤が核酸、ペプチド及び／又は低分子化合物である、（１）～（７）のいずれかに記載の薬剤取り込み増強剤。
（９）（１）～（８）のいずれかに記載の薬剤取り込み増強剤を含む医薬組成物。
（１０）作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体をさらに含む、（９）に記載の医薬組成物。
（１１）（１）～（８）のいずれかに記載の薬剤取り込み増強剤を含む細胞内への薬剤取り込みキット。
（１２）作用剤及び／又は薬剤運搬体をさらに含む、（１１）に記載の薬剤取り込みキット。
（１３）細胞内への薬剤取り込み増強投与レジメンであって、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体の投与を（１）～（８）のいずれかに記載の薬剤取り込み増強剤の投与と同時に又は投与後に生体に投与することを記載した前記レジメン。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-078035号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明の薬剤取り込み増強剤によれば、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体と併用することで、その作用剤又は薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を改善することができる。
　本発明の薬剤取り込み増強剤によれば、作用剤又は薬剤運搬体を導入する細胞の分化誘導に対して影響を与えない。
本発明の薬剤取り込み増強剤による薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。横軸のAは、薬剤取り込み増強剤を濃度ごとに、またContは薬剤運搬体のみを示している。 本発明の薬剤取り込み増強剤によるHDAC阻害活性測定結果である。 本発明の薬剤取り込み増強剤による薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を表すGFPの蛍光画像である。Aは非処理のU251細胞、BはrAAV8-GFPで処理したU251細胞、そしてCはrAAV8-GFPと芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤で処理したU251細胞を示す。 本発明の薬剤取り込み増強剤の細胞毒性結果を示す図である。 定量RT-PCRによる細胞内のAlexa 568-rAAV8-M3ゲノムの取り込み率を示す図である。Contは、本発明の薬剤取り込み増強剤の添加なしのサンプル、Aは本発明の芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤を添加したサンプル、SBは酪酸ナトリウムを添加したサンプルである。 Alexa（登録商標；以下同じ）568-rAAV8-M3ウイルス粒子の局在を示す図である。図中、NTは未処理の細胞、Contは、本発明の薬剤取り込み増強剤の添加なしの細胞、Aは本発明の芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤を添加した細胞、SBは酪酸ナトリウムを添加した細胞である。矢印の白い小点はAlexa 568-rAAV8-M3ウイルス粒子を、白破線で囲み、矢頭で示した部分はU251細胞の核を示している。 表１に示す芍薬及び／又は甘草を含む各種漢方抽出液による薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。 A：芍薬、甘草又は芍薬甘草湯による薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。B: 芍薬、甘草又は芍薬甘草湯による細胞毒性結果を示す図である。 芍薬、甘草又は芍薬甘草湯による薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を表すGFPの蛍光画像である。 A：芍薬の主要成分であるペオニフロリン及び甘草の主要成分であるグリチルリチンによる薬剤運搬体の各種細胞内取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。B:前記主要成分による各種細胞に対する細胞毒性結果を示す図である。 A：本発明の薬剤取り込み増強剤による薬剤運搬体の各種細胞内取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。B: 本発明の薬剤取り込み増強剤による各種細胞に対する細胞毒性結果を示す図である。薬剤取り込み増強剤であるTJ-68の終濃度は、6 h（薬剤取り込み増強剤処理6時間後に薬剤取り込み増強剤を培地から除去した群）で左から0.42、0.83、及び1.67 mg/mL、72 h（薬剤取り込み増強剤処理後にそれを除去せず72時間培養し続けた群）で左から0.42、及び0.83 mg/mLである。陽性対照のSB（酪酸ナトリウム）の終濃度は、1 mM及び3 mMである。 薬剤運搬体としてrAAV2を用いた時の本発明の薬剤取り込み増強剤による薬剤取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。薬剤取り込み増強剤であるTJ-68の終濃度は、左から0.42、及び0.83 mg/mLである。陽性対照のSB（酪酸ナトリウム）の終濃度は、1 mM及び3 mMである。 薬剤運搬体として組み換えアデノウイルス2（rAV2）を用いた時の本発明の薬剤取り込み増強剤による薬剤取り込み効率を示すルシフェラーゼ活性の測定結果である。 薬剤運搬体としてrAV2を用いた時の細胞内取り込み効率を表すGFPの蛍光画像である。 本発明の薬剤取り込み増強剤を経口投与した後、薬剤運搬体としてのrAAV9-lucを静脈内投与したマウスから採取した筋組織におけるルシフェラーゼ活性の測定結果である。
１．薬剤取り込み増強剤
１－１．概要及び定義
　本発明の第１の態様は、細胞内への薬剤取り込み増強剤である。本発明によれば、細胞の分化誘導に影響を与えることなく作用剤又は薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強することができる。
Ａ．薬剤取り込み増強剤
　本明細書において「薬剤取り込み増強剤」とは、作用剤又は薬剤運搬体と併用することで、その作用剤又は薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強する薬効を有する薬剤をいう。
　本明細書において「細胞内への取り込み」とは、作用剤又は薬剤運搬体が細胞内部に取り込まれるための事象を広く包含する。したがって、作用剤又は薬剤運搬体が細胞に食作用によって取り込まれる事象のみならず、取り込みの前段階ともいえる作用剤又は薬剤運搬体の細胞表面への接着や、作用剤又は薬剤運搬体の細胞膜透過等も本明細書における細胞内への取り込みに包含される。取り込み機構は、特に制限はしない。例えば、エンドサイトーシス（食作用、飲作用を含む）、細胞膜透過性の変化が挙げられる。
　本発明の薬剤取り込み増強剤の構成については、「１－２．構成」の章で詳述する。
Ｂ．薬剤運搬体
　本明細書において「薬剤運搬体」とは、包含する作用剤を所定の細胞内に送達することのできる運搬体をいう。例えば、ウイルス粒子、リポソーム（例えば、膜透過ペプチド結合リポソーム、SNALPsを含む）、ナノ粒子(例えば、Davis ME， et al.，Nature， 2010, 464:1067-1070に記載の標的ナノ粒子伝達システムを含む)、コレステロール結合体のようなドラッグデリバリーシステム（DDS:Drug Delivery system）で使用される運搬体は、包含する作用剤が分解されることなく、それが有する活性を維持した、安定した状態で細胞内に取り込ませることができることから、本発明の薬剤運搬体として好適である。中でもウイルス粒子は、生体に使用した場合に、作用剤を標的とする特定の部位（器官及び組織を含む）に送達させることも可能であることから特に好ましい。
　本明細書において「ウイルス粒子」とは、ビリオンとも呼ばれ、カプシド又は被膜粒子からなる外殻タンパク質を有し、細胞感染能を有する粒子をいう。具体的には、ウイルスゲノムを有するウイルスベクター粒子及び外殻部のみの中空粒子を含む。
　本明細書において「ウイルスベクター粒子」とは、ウイルスゲノムから病原性に関する遺伝子を除去し、外来遺伝子を組み込んだウイルスベクターとしてのウイルス核酸（DNA又はRNAを含む）を外殻タンパク質内に包含するウイルス粒子をいう。本発明では、当該分野で公知のあらゆるウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、マウスモロニー白血病ウイルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、AAVベクター、センダイウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクター内に組み込まれた外来遺伝子の種類は問わない。所望の遺伝子を組み込むことができる。
　本明細書において「中空粒子」は、中空カプシド（empty capsid）、及び被膜粒子を含む。
　本明細書において「中空カプシド」とは、内部にウイルス核酸やコアを含まない外殻タンパク質のみからなるウイルス粒子をいう。「カプシド（capsid）」とは、ウイルス核酸又はコアを取り囲む複数の単位タンパク質（カプソメア：capsomere）からなる外皮（coat）又は殻（shell）である。本明細書では、単に「カプシド」と標記した場合には当該構造体を意味する。また、その内部にウイルス核酸やコアを含むものは、中空カプシドに対して「ヌクレオカプシド（nucleocapsid）」と呼ぶ。
　本明細書において「被膜粒子」とは、エンベロープを外部に纏った中空カプシドをいう。「エンベロープ（envelope）」は、一部のウイルスが有するカプシドの外側に存在する外被であり、脂質二重膜で構成され、所々にスパイク又はエンベロープタンパク質と呼ばれるウイルス由来の糖タンパク質が埋め込まれている。エンベロープの脂質二重膜は、ウイルスが宿主細胞から出芽する際に宿主細胞の細胞質膜又は核膜の一部を纏ったものであり、基本的には宿主細胞に由来する。
　本明細書における中空粒子は、動物ウイルス由来の中空粒子である。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス科、ピコルナウイス科、カリシウイルス科、アストロウイスル科、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科又はビルナウイルス科に属するRNAウイルス、及びアデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、イリドウイルス科、ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、又はパポバウイルス科に属するDNAウイルスを含む。RNAウイルス群のレトロウイルス科に属するウイルスや、DNAウイルス群のアデノウイルス科、パルボウイルス科又はヘルペスウイルス科に属するウイルスが、前記中空粒子の由来ウイルスとして好適に使用できる。レトロウイルス科のオンコウイルス、レンチウイルス若しくはスプーマウイルス、アデノウイルス科のアデノウイルス、又はパルボウイルス科のAAVは、特に好適である。
　ウイルス粒子を用いることで、そのウイルス粒子が有する標的細胞特異的な感染能を利用して、内部に包含する作用剤を標的細胞内に送達することが可能となる。例えば、AAVのウイルス粒子を用いる場合、各AAVの血清型における感染標的細胞の特異性を応用して、神経細胞、筋細胞、肝細胞、線維芽細胞等、特定の細胞、組織及び器官へ送達できる（Okada T. and Takeda S., Gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. in A Guide to Human Gene Therapy (ed. by Roland W. Herzog and Sergei Zolotukhin), World Scientific, NJ. 2010, 5(1), pp113-123）。
Ｃ．作用剤
　本明細書において「作用剤」とは、標的細胞内に取り込ませることで、その細胞に所定の作用効果を付与することのできる物質をいう。作用剤の標的細胞内への取り込みは、前記薬剤運搬体に内包された状態、及び作用剤単体の状態で行われる。本明細書における作用剤には、例えば、核酸、ペプチド、低分子化合物、又はその組合せが挙げられる。2種以上の核酸、2種以上のペプチド、2種以上の低分子化合物、又はそれらの組合せも作用剤に含まれる。作用剤は、通常、目的とする細胞に対して、特定の遺伝子の発現を促進又は抑制したり、増殖を促進又は抑制したり、又は細胞死を誘導又は抑制する等の様々な活性を付与し得る。以下で、作用剤としての核酸、ペプチド及び低分子化合物について定義する。
（１）核酸
　本明細書において作用剤としての「核酸」は、天然型核酸、化学修飾核酸、人工核酸、核酸類似体及びそれらの組合せを含む。
　「天然型核酸」とは、自然界に存在する天然型ヌクレオチドのみが連結してなるDNA及びRNAをいう。
　「化学修飾核酸」とは、人工的に化学修飾をされた核酸をいう。例えば、メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等が挙げられる。
　「人工核酸」とは、天然型核酸の一部に非天然型ヌクレオチドを含む核酸又は非天然型ヌクレオチドのみが連結してなる核酸をいう。ここでいう「非天然型ヌクレオチド」とは、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドをいう。
　「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された高分子化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルフォリノ核酸（ホルフォリノオリゴを含む）等が挙げられる。
　前記核酸は、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知の標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Alexa、テキサスレッド、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
　作用剤としての核酸のサイズは、限定はしないが、通常は、2 bp以上50 kb以下のヌクレオチド、好ましくは5 bp以上20 kb以下のヌクレオチド、より好ましくは10 bp以上10 kb以下のヌクレオチド、一層好ましくは14 bp以上5 kb以下のヌクレオチドである。
　作用剤としての核酸の具体例としては、機能性核酸、ベクター、mRNA若しくはその断片、又はその組合せが挙げられる。以下、それぞれについて定義する。
　（ａ）機能性核酸
　本明細書において「機能性核酸」とは、生体内又は細胞内において、好ましくは細胞内において、特定の生物学的機能、例えば、酵素機能、触媒機能又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、転写、翻訳の阻害又は亢進）を有する核酸をいう。具体的には、例えば、RNA干渉剤、核酸アプタマー（RNAアプタマー及びDNAアプタマーを含む）、アンチセンスDNA、リボザイム（デオキシリボザイムを含む）、U1アダプター、モレキュラー・ビーコン、リボスイッチ、又は転写因子結合領域等が挙げられる。特にRNA干渉剤は、薬剤作用剤として好ましく適用できる。ここで、「RNA干渉剤」とは、生体内においてRNA干渉（RNA inteference：RNAi）を誘導し、標的とする遺伝子の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができる物質をいう。例えば、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）又はmiRNA（micro RNA)（pri-miRNA及びpre-miRNAを含む）が挙げられる。
　(ｂ)ベクター
　本明細書において「ベクター」とは、外来遺伝子又はその断片を運搬する機能を有する核酸分子をいう。例えば、プラスミド、コスミド、及び人工染色体を含む。人工染色体には、ヒト人工染色体（HAC; Human Artificial Chromosome）、酵母人工染色体（YAC; Yeast Artificial Chromosome）、菌人工染色体（BAC; Bacterial Artificial Chromosome）、及びP1由来人工染色体（PAC; P1-derived Artificial Chromosome）を含む。好ましくは、HACである。
　ベクターは、内部に外来遺伝子又はその断片を含むことができる。外来遺伝子の例としては、転写因子、シグナル伝達因子、細胞外分泌性タンパク質又は酵素をコードする遺伝子、又はそれらの活性を有する断片が挙げられる。包含される遺伝子が、野生型遺伝子であるか、又は変異遺伝子であるかは問わない。また、異なる遺伝子を含む二以上のベクターが取り込み薬剤に包含されていてもよい。
　前記ベクターは、遺伝子又はその断片を導入すべき細胞内で発現可能な状態で包含することが好ましい。ここで「発現可能な状態」とは、ベクターに含まれる遺伝子又はその断片が導入すべき細胞内で発現可能なように、核酸発現システム内のプロモーターとターミネーターの制御下に配置されていることをいう。「核酸発現システム」とは、遺伝子の発現に必要な発現調節エレメントを、機能可能な状態で少なくとも一組有する系である。発現調節エレメントには、プロモーター及びターミネーターの他、必要に応じてエンハンサ及びポリA付加シグナルが含まれる。
　（ｃ）mRNA若しくはその断片
　本明細書において「mRNA」は、任意のタンパク質をコードする核酸分子である。mRNAは、mRNA前駆体又は成熟mRNAのいずれであってもよい。好ましくは成熟mRNAである。また、mRNA又はその断片は、5’末端にm7Gキャップ構造を、及び／又は3’末端にポリA鎖を含んでいてもよい。mRNAがコードするタンパク質は、野生型であるか、又は変異型であるかは問わない。
（２）ペプチド
　本明細書において作用剤としての「ペプチド」は、オリゴペプチド、ポリペプチドのいずれも含む。オリゴペプチドの具体例としては、ペプチドホルモンやポリペプチド断片が挙げられる。ポリペプチド具体例としては、抗体、転写因子、シグナル伝達因子、酵素が挙げられる。
　抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体、抗体フラグメントを含む。
　抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）であってもよい。薬剤としてモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いる場合、抗体は、薬剤運搬体を投与する生物種と同種由来の抗体であることが好ましい。例えば、薬剤運搬体をヒトに投与する場合、薬剤としてのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。
　「組換え抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は多重特異性抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の定常領域（C領域）を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。これによりヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のV領域における相補性決定領域（CDR）とヒト抗体のCDRとを置換したモザイク抗体である。「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
　「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、単鎖抗体（scFv：single chain Fragment of variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
　「抗体フラグメント」とは、例えば、Fab、F(ab’2）、Fv等が該当する。
　ペプチドは、修飾されていてもよい。ペプチドの修飾には、機能上の修飾又は標識上の修飾を含む。機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はPEG化が挙げられる。標識上の修飾には、蛍光色素（Alexa、フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP、）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。
　ペプチドのサイズは、限定はしない。通常は、500 kDa以下、好ましくは100 kDa以下、より好ましくは80 kDa以下、さらに好ましくは50 kDa以下である。
（３）低分子化合物
　本明細書において「低分子化合物」とは、分子量5000以下、好ましくは2000以下、より好ましくは1000以下の化合物であって、前記核酸及びペプチド以外の物質が該当する。例えば、アルカロイド、フラボノイド、多糖体、ホルモン、神経伝達物質及び免疫抑制剤等の様々な医薬化合物が挙げられる。また、特定の低分子化合物と同等の薬理活性を有する低分子化合物の誘導体、又はその塩も含む。
１－２．構成
　本発明の薬剤取り込み増強剤は、ボタン属（Paeonia）植物由来物、カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物由来物又はその組合せを有効成分として含む。
　本発明において「ボタン属（Paeonia）植物」とは、ボタン科（Paeoniaceae）ボタン属に属する多年生植物であり、シャクヤクとして知られる草本性種とボタンとして知られる木本性種を含む。いずれも漢方上重要な生薬の原料として、世界的に広く利用されている。
　本発明のボタン属植物の種類は、本属に属する種類であれば同様の生薬成分を含有し得ることから、特に限定はしない。本発明のボタン属植物として、具体的には、例えば、P.ラクティフローラ（P.lactiflora）、P.ジャポニカ（P.japonica）、P.オボバータ（P.ovobata）、P.オフィシナリス（P.officinalis）、P.ムロコセビッチ（P.mlokosewitschii）、P.ペレグリナ（P.pellegrina）、P.テヌイフォリア（P.tenuifolia）、P.ルテア（P.lutea）、P.アノマーラ（P.anomala）、P.マクロフィラ（P.macrophylla）、P. デコンポシータ（P.decomposita）、P.デラベイイ（P.delavayi)、P.ジシャネンシス（P.jishanensis)、P.ルドウィーイ（P.ludlowii)、P.オスチイ（P.ostii)、P.ポタニーニイ（P.potaninii)、P.チゥイ（P.qiui)、P.ロッキイ（P.rockii)、P.スフィルティコーサ（P.suffruticosa) 等が挙げられる。
　本発明において「カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物」とは、マメ科カンゾウ属に属する多年生草本植物であり、漢方上重要な生薬の原料であるカンゾウ（甘草）として、世界的に広く利用されている。
　本発明のカンゾウ属植物の種類は、本属に属する種類であれば同様の生薬成分を含有し得ることから、特に限定はしない。本発明のカンゾウ属植物として、具体的には、例えば、G．ウラレンシス（G. uralensis）、G．グラブラ（G. glabra）、G．インフラータ（G. inflata）、G.アスペラ（G. aspera）、G.ユーリカルパ（G. eurycarpa）、G.パリディフローラ（G. pallidiflora）、G.ユンナネンシス（G. yunnanensis）、G.レピドータ（G. lepidota）、G.エキナータ（G. echinata）、G.（G. acanthocarpa）等が挙げられる。
　本発明の薬剤取り込み増強剤が有効成分として前記ボタン属植物由来物及びカンゾウ属（Glycyrrhiza）植物由来物を組合せた混合物を含む場合、それぞれの由来物の混合比率は、特に限定はしないが、例えば、ボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物の混合比率が重量比で2:8～8:2の範囲、3:7～7:3の範囲、又は4:6～6:4の範囲が挙げられる。それらを1:1の重量比で含んでなる生薬である芍薬甘草湯を使用してもよい。
　前記由来物は、ボタン属植物及び／又はカンゾウ属植物における植物体のいずれの部位に由来してもよい。例えば、根、ストロン（stolon：地下茎)、茎（幹、枝を含む）、葉（葉芽を含む）、花（花芽を含む）、実、種子等が挙げられる。好ましくはこれらの植物において生薬として主に利用される根部（ボタン属植物及びカンゾウ属植物の場合）又はストロン（カンゾウ属植物の場合）である。これは、これらの部位に生薬としての主活性成分が特に多く含まれているためである。例えば、ボタン属植物であれば生薬の主活性成分であるペオニフロリン（paeoniflorin）をはじめ、ペオニン（paeonin）やペオノール（paeonol）等が根部に、またカンゾウ属植物であれば生薬の主活性成分であるグリチルリチン（glycyrrhizin）やイソリクイリチゲニン（isoliquiritigenin）が根部又はストロンに、多く含まれている。
　本発明において由来物の状態は、前記植物に由来するものであれば特に限定はしない。例えば、植物体そのもの、由来植物体からの抽出物、又はそれらの組合せが挙げられる。
　前記「植物体そのもの」とは、断片、粉末、搾汁液のように由来植物体の一部を含むものをいう。ここで「断片」とは、植物体を切裁、刷りおろし等によって小片化したものをいう。断片のサイズは、薬剤取り込み増強剤の有効成分として投与可能かつ薬効発揮可能な大きさであれば特に限定はしない。例えば、1～5 mmの範囲であればよい。「粉末」は、植物体を粉砕して粉状にしたものをいう。粉末を構成する粒子のサイズも1 mm以下であればよく、特に限定はしない。例えば、顆粒サイズ、微粉サイズ、又はそれらの混合物であってもよい。「搾汁液」とは、植物体を圧搾して得られる液体成分をいう。植物体の小片が固体成分として含まれていてもよいし、濾過して液体成分のみにしたものであってもよい。植物体は、生の状態、発酵させた状態、又は乾燥した状態を問わない。植物体の前記形態に応じて適宜選択すればよい。例えば、植物体が粉末であれば、乾燥した状態が好ましい。また搾汁液であれば、生の状態又は発酵させた状態となる。本発明では、由来植物体の乾燥粉末が好ましい。
　前記「抽出物」とは、由来植物体に含まれる低分子化合物等の成分のみを溶媒等の媒体中に取り出したものをいう。例えば、由来植物体の断片を水、エタノール又はそれらの混合液中に所定の温度下で、所定の時間浸漬した後、植物体を遠心や濾過によって除去することで得られる液体成分（いわゆる、抽出液）、使用した溶媒を前記抽出液から蒸発・乾燥等によって除去した後に残存する固形物（顆粒、粉末を含む）、又はその中間状態のペーストが挙げられる。前記所定の温度は、溶媒が、例えば、水であれば1気圧下10～100℃、好ましくは40～99℃、より好ましくは70～99℃の範囲、またオートクレーブ等の耐熱耐圧密閉器を用いた1～2気圧下であれば100～121℃の範囲、エタノールであれば1気圧下0～78.3℃、好ましくは15～77℃、より好ましくは20～77℃の範囲であればよい。また、水とエタノールの混合液に場合には、エタノールの濃度に応じて、上記水の場合又はエタノールの場合の条件を適宜応用すればよい。前記所定の時間は、溶媒の温度によって異なり、一般には、溶媒温度が40℃未満の低温であれば、例えば、数日～1年以上の長時間を要し、また1気圧下40℃以上沸点未満の高温であれば、例えば、2分～数時間程度の短時間でよい。さらに、溶媒が水の場合、1～2気圧下100～121℃の温度であれば、2分～30分、好ましくは10～20分程度の時間でよい。抽出物は、由来植物体の細胞片等の狭雑物の混入率が低く、少量で本発明の薬剤取り込み増強剤の薬効を得ることができることから、由来物の中でも特に好ましい。
　本発明の薬剤取り込み増強剤がボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物を含む場合、各由来物の状態は同じであってもよいし、異なっていてもよい。例えば、ボタン属植物由来物が乾燥粉末でカンゾウ属植物由来物が抽出物の粉末の場合が挙げられる。好ましくは両由来物の状態が同一であることである。例えば、いずれの由来物も抽出液である場合である。
１－３．薬剤取り込み増強剤の製造方法
　本発明の薬剤取り込み増強剤は、ボタン属植物由来物、カンゾウ属植物由来物をそれぞれ単独でそのまま薬剤取り込み増強剤として、又は各由来物を適当な比率で混合して、製造することができる。
　由来物の調製方法は、前記由来物の状態及び形態によって異なる。例えば、由来物を搾汁液とする場合には、圧搾工程において、生状態の由来物又は乾燥状態の由来物を水等の溶媒に浸漬して戻したものを圧搾機にかけて得るか、ミキサー若しくはミル（すりおろし機を含む）にかけた後、濾過若しくは圧搾して得ることができる。
　また、由来物を乾燥粉末とする場合には、由来物の乾燥物を粉砕工程で粉砕することで得ることができる。このとき、由来物が生状態であれば粉砕工程前に乾燥工程を経るか、生状態のまま粉砕工程にかけ、その後乾燥工程を経ればよい。
　さらに、由来物を抽出物とする場合には、必要に応じて前記乾燥工程、前記粉砕工程、又は由来物を断片化する断片化工程を経た後、得られた植物体を溶媒に浸漬し植物体に含有する成分を溶媒中に抽出する抽出工程を経ればよい。必要であれば、抽出した成分を濃縮する濃縮工程を経てもよい。
　薬剤取り込み増強剤をボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物の混合物とする場合、それぞれの由来物を別個に製造した後に、適当な比率で、例えば、ボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物を重量比で2:8～8:2の範囲、3:7～7:3の範囲、又は4:6～6:4の範囲で、混合して調製しもよいし、又はボタン属植物とカンゾウ属植物を予め前記重量比で混合した後に、上記工程により混合物としての由来物を調製することもできる。
　上記各工程は、漢方薬・生薬分野で一般的に使用される公知かつ通常の方法で行えばよい。
　一方、由来物又は薬剤取り込み増強剤は、市販の漢方薬や生薬を利用することもできる。例えば、ボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物を1:1の重量比で混合した芍薬甘草湯は、こむらがえりのような筋肉の痙攣やそれに伴う疼痛用又は胃痛用の漢方薬として、例えば、ツムラ等の薬品メーカーから市販されている。その芍薬甘草湯をそのまま、又はさらに抽出工程に供することによって、薬剤取り込み増強剤として利用することができる。以下、一具体例として由来物が抽出物の場合の調製方法を挙げて説明するが、本発明の薬剤取り込み増強剤はこの方法には何ら限定されない。
　由来物として抽出物を調製する方法は、必須工程として抽出工程を、選択工程として断片化工程、乾燥工程、濃縮工程を含む。以下、それぞれの工程について説明をする。
（１）抽出工程
　本明細書において「抽出工程」とは、ボタン属植物及び／又はカンゾウ属植物の植物体を溶媒中に浸漬して、該植物に含まれる低分子化合物等の薬効成分を溶媒中に溶出させる工程である。本工程で、抽出後に溶媒から固体成分である植物体を遠心、濾過等によって除去して得られる液体成分が、薬効成分を含んだ抽出液となる。
　溶媒は、例えば、水、有機溶媒（アルコール類、ベンゼン、ヘキサン若しくはトルエン等）、又はそれらを組み合わせた混合液が挙げられる。好ましくは生体に対して毒性が無い水か、毒性が非常に低いエタノール又はエタノールと水の混合液である。
　前記植物体は、前記溶媒中に浸漬する前に水等で洗浄し、表面に付着した土やゴミ等を十分に除去しておくことが望ましい。
　溶媒の分量は、限定はしないが、通常は、使用する植物体の重量に対する溶媒の容量（容量／重量：V／W）が2～10倍の範囲になるようにすればよい。例えば、抽出工程に植物体を10 g使用する場合には、水を20 mL～100 mLの範囲で使用することができる。
　植物体中に含まれる薬効成分を短時間で効率的に抽出するために、当該溶媒を加熱してもよい。加熱温度は、溶媒の種類によって異なるが、例えば、水であれば1気圧下50～100℃、好ましくは60～99℃、より好ましくは70～98℃の範囲、またオートクレーブ等の耐熱耐圧密閉器を用いた1～2気圧下であれば100～121℃の範囲、エタノールであれば1気圧下40～78.3℃、好ましくは55～77℃、より好ましくは60～77℃の範囲であればよい。また、水とエタノールの混合液に場合には、エタノールの濃度に応じて、上記水の場合又はエタノールの場合の条件を適宜応用すればよい。
　溶媒中での抽出時間は、抽出する植物体の状態、溶媒の種類や温度、又は薬効成分に対する溶媒の溶解度に依存する。例えば、1気圧下20℃の水に生状態の植物体を浸漬する場合は、抽出時間は、1年以上を要するが、98℃に加熱した水に乾燥状態の植物体粉末を浸漬する場合には、抽出時間は、2～20分程度で足りる。さらに、溶媒が水の場合、2気圧下120～121℃の温度であれば1～15分程度の時間でよい。一般的には、溶媒温度が低いほど抽出時間は長くなり、高いほど短くてよい。また、薬効成分が溶媒に対して易溶性であるほど抽出時間は短くてよく、難溶性であるほど長い時間を要する。
　溶媒を加熱する方法は、所望の温度付近まで溶媒を加熱できる方法であれば特に問わない。例えば、容器に入れて直火で加熱する方法や、マイクロウェーブやヒーター等の熱源によって加熱する方法が挙げられる。
　植物体の浸漬と溶媒の加熱の順序は問わない。例えば、所定の温度まで溶媒を加熱した後に植物体を浸漬してもよいし、室温状態の溶媒に植物体を浸漬して所定の温度まで加熱することもできる。
　なお、溶媒の温度及び抽出された薬効成分の濃度を均一化するために、加熱と共に溶媒の撹拌を行ってもよい。撹拌方法は、例えば、撹拌棒で撹拌してもよいし、撹拌装置を用いて撹拌してもよい。
（２）断片化工程
　本明細書において「断片化工程」とは、ボタン属植物及び／又はカンゾウ属植物の植物体を断片化する工程である。本工程は、選択工程であり、必要に応じて、前記抽出工程に先立ち又は前記抽出工程と同時に行えばよい。ここで言う「断片化」とは、前記植物体を切裁により小片にするのみならず、外部に露出した植物体内部組織の表面積を増大させる処理を含む。例えば、前記植物体の、表皮剥離、圧潰、薄切り、細切り、すりおろし、またそれらの組み合わせが挙げられる。断片化により前記溶媒に直接接触する植物体の内部組織の外部露出面積を増大でき、それによって、前記植物体に含まれる薬効成分を溶媒中への抽出効率を高めることができる。
（３）乾燥工程
　本明細書において「乾燥工程」とは、ボタン属植物及び／又はカンゾウ属植物の植物体を乾燥させ、乾燥植物体にする工程をいう。本工程は、選択工程であり、必要に応じて前記抽出工程に先立ち行えばよい。前記断片化工程を行う場合には、その順序は、特に限定しない。断片化工程後に乾燥工程を行ってもよいし、乾燥工程後に断片化工程を行ってもよい。断片化工程後に乾燥工程を行うのがより好ましい。これは、断片化工程により植物体内部組織の外部露出面積を増大させることによって、水分蒸発面が増大し、より短時間で植物体を乾燥することができるからである。
　本工程の「乾燥」とは、前記植物体に含まれる水分を減ずることをいう。植物体中の水分を減じることによって、前記溶媒が植物体の組織内に浸透し易くなることから、植物体中に含まれる薬効成分を溶媒中に短時間で効率的に抽出することができる。また、エタノール等の有機溶媒を抽出溶媒として使用した場合、植物体の乾燥により、非乾燥状態のときに細胞内に存在する水分によって抽出溶媒の浸透が阻害されたり、又は薄まることもない。
　乾燥の方法は、前記植物体中に含まれる水分を減じることができれば特に限定はしない。例えば、外気に晒して放置するだけの自然乾燥法（天日干しを含む）、除湿剤とともに密閉容器内に入れて乾燥する除湿乾燥法、送風装置等を用いて温風若しくは冷風を当てる風乾燥法、熱源を用いた加熱乾燥法、密閉容器内で真空ポンプ等を用いて脱気する真空乾燥法、凍結乾燥（フリーズドライ）法、又はその組み合わせが挙げられる。薬効成分をほとんど変性させることなく、比較的短時間で乾燥できる点で、凍結乾燥法が好ましい。凍結乾燥法であれば、例えば、断片化工程で断片化した前記植物体を-50℃で6時間～1週間、好ましくは-50℃下で24時間～72時間乾燥すればよい。本工程では、植物体の含水率を乾燥前の50％以下にすることが好ましい。より好ましくは30％以下、さらに好ましくは20％以下である。
（４）濃縮工程
　本明細書において「濃縮工程」とは、前記抽出工程で得られる抽出液から抽出に用いた溶媒を減じ、抽出液中に含まれる薬効成分の濃度を高める工程である。本工程は、選択工程であり、必要に応じて前記抽出工程後に行えばよい。
　本工程は、抽出液中に含まれる薬効成分を変性することなく、溶媒のみを減じることのできる溶媒を除去できる方法であれば特に限定はしない。抽出液から液体を減じる方法としては、当該分野で公知の方法を用いることができる。例えば、エバポレーター等を用いた蒸発濃縮法、溶媒を風乾等で蒸発させる自然蒸発濃縮法、抽出液の冷却による濃縮法が挙げられる。
　本工程では、抽出液中の薬効成分の濃度が本工程前と比較して3倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは10倍以上となるまで抽出液中の溶媒を減じればよい。薬効成分を固体として調製するためには、薬効成分等が析出するまで溶媒をほとんど又は完全に除去すればよい。
　以上、一具体例として由来物が抽出物の場合の調製方法を説明したが、由来物を植物体乾燥粉末とする場合には、前記乾燥工程が必須工程となり、必要に応じて、断片化工程を経ればよい。
１－４．投与方法
　本発明の薬剤取り込み増強剤は、後述する医薬組成物の構成成分として使用するだけでなく、薬剤取り込み増強剤そのものを生体や細胞（組織、器官を含む）に投与することができる。この場合、薬剤取り込み増強剤の単独投与ではなく、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体と併用投与することを前提とする。本発明の薬剤取り込み増強剤は、前記作用剤又は前記薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強するための補助剤として機能するからである。
　本発明の薬剤取り込み増強剤の投与方法は、細胞であれば、培地に添加する方法でよく、また、生体投与の場合には、最終的に作用剤又は薬剤運搬体が目的とする部位の細胞に送達され、取り込まれ得る方法であれば、当該分野で公知のあらゆる形態を適用することができる。この場合の具体的な投与方法は、後述する第２態様の医薬組成物の投与方法と同様でよいことから、ここでの説明は省略する。
　本発明の薬剤取り込み増強剤の生体への投与レジメンは、まず当該薬剤取り込み増強剤を生体に投与し、その後作用剤、又はそれを含む薬剤運搬体をその生体に投与するか、又は前記運搬体と同時に生体に投与することが好ましい。
１－５．効果
　本発明の薬剤取り込み増強剤は、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体と併用することで、前記作用剤又は前記薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を改善することができる。したがって、DDSで用いた場合には、目的とする作用剤を効率的に細胞内に取り込ませることが可能となる。
　本発明の薬剤取り込み増強剤は、HDAC活性に影響を及ぼさないことから、生体に対する副作用は少なく、また、分化調節因子の機能解析や、リプログラミングによる未分化細胞の作製にも適している。
２．医薬組成物
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、医薬組成物である。本態様の医薬組成物は、前記第１態様に記載の薬剤取り込み増強剤を包含することを特徴とする。
　本態様の医薬組成物は、第１態様に記載の薬剤取り込み増強剤に含まれる有効成分の作用によって併用する作用剤又は薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強する薬理効果を有する。
２－２．構成
２－２－１．成分
　本態様の医薬組成物は、薬剤取り込み増強剤を包含し、必要に応じて、液性媒体、担体、及び／又は他の活性成分を含むことができる。以下、本態様の医薬組成物における各成分について具体的に説明をする。
（１）薬剤取り込み増強剤
　本態様の医薬組成物に包含される薬剤取り込み増強剤は、前記第１態様に記載の薬剤取り込み増強剤である。当該薬剤取り込み増強剤は、本発明の医薬組成物における必須の構成成分であり、作用剤又は薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強する本医薬組成物の活性成分として機能する。
　本発明の医薬組成物において、薬剤取り込み増強剤の含有量は、製薬上有効な量であれば特に限定はしない。本明細書において「製薬上有効な量」とは、薬剤取り込み増強剤がその機能を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量を言う。具体的な用量は、併用する作用剤又は薬剤運搬体の種類、後述する担体の種類、剤形、被検体の情報、投与方法、及び投与経路等によって異なる。ヒトに投与する場合、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、通常、細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被検者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被検者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
　一投与単位あたりにおける医薬組成物中の薬剤取り込み増強剤の含有量の具体例としては、他の医薬の服用を必要としないヒト成人男子（体重60kg）に対して、本発明の医薬組成物を経口によって投与する場合、投与単位あたり約0.01重量％～100重量％、好ましくは約0.1重量％～約90重量％の薬剤取り込み増強剤を含んでいればよい。また、本発明の医薬組成物を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01％(w/v)～約20％(w/v)、好ましくは約0.1％(w/v)～約10％(w/v)の薬剤取り込み増強剤を含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で薬剤取り込み増強剤の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
（２）液性媒体
　本態様の医薬組成物は、剤形が液剤等の場合には、液性媒体を構成成分として含むことができる。液性媒体には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアレルアルコール、ポリオキシ化イソステアレルアルコール及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類のような溶媒が挙げられる。このような液性媒体は、使用時に殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
（３）担体
　本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を構成成分として含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが例として挙げられる。
　結合剤としては、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が例として挙げられる。
　崩壊剤としては、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が例として挙げられる。
　充填剤としては、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が例として挙げられる。
　乳化剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが例として挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが例として挙げられる。上記の添加剤の他、必要であれば矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、付湿剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
　本実施形態の医薬組成物は、必要に応じて、上記担体を二以上包含することもできる。
　このような担体は、主として剤形形成を容易にし、また剤形状態及び薬剤効果を維持する他、有効成分である薬剤取り込み増強剤が生体内の酵素による分解を受け難くするために用いられるものであり、必要に応じて適宜使用すればよい。
（４）他の活性成分
　本明細書において「他の活性成分」とは、本態様の医薬組成物における第１態様の薬剤取り込み増強剤以外の活性成分をいう。他の活性成分は、第１態様の薬剤取り込み増強剤と同様の薬理効果を有するものであってもよいし、異なる薬理効果を有するものであってもよい。あるいは、本発明の薬剤取り込み増強剤と併用すべき作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体であってもよい。
２－２－２．剤形
　本実施形態の医薬組成物の剤形は、第１態様の薬剤取り込み増強剤を不活化させない又はさせにくく、かつ投与後に生体内でその薬理効果を十分に発揮し得る形態であれば特に限定しない。
　一般的な剤形としては、液体又は固体（ゲルのような半固体を含む）が挙げられるが、本発明のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の非経口剤形又は液剤、散剤（粉剤、粉末剤、飴粉剤を含む）、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ剤等の経口剤形が挙げられる。
２－３．医薬組成物の製造
　本発明の医薬組成物の製造方法については、前記第１態様に記載の薬剤取り込み増強剤を活性成分として、当業者に公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co., Easton, Pa.)に記載された方法を参照することができる。
２－４．投与方法
　本発明の医薬組成物は、単独投与ではなく、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体と併用投与（本発明の医薬組成物中に作用剤又は薬剤運搬体を包含する場合を含む）することを前提とする。本発明の医薬組成物の投与方法は、最終的に作用剤又は薬剤運搬体が目的とする部位の細胞に送達され、取り込まれ得る方法であれば、当該分野で公知のあらゆる形態を適用することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
　本発明の医薬組成物の具体的な投与単位形態は、経口投与法及び非経口投与法に大別できる。経口投与法は、一般には全身投与でもあるが、非経口投与法は、さらに全身投与と局所投与（例えば、皮下投与、経皮投与、経粘膜投与、又は経直腸的投与等）に細分できる。本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができ、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。好ましくは経口投与又は血管内注射を介した全身投与である。血流等の循環系を介して薬剤取り込み増強剤を全身に行き渡らせることが可能なため、迅速に薬剤取り込み増強剤を適用でき、また侵襲性が比較的低く、被検体に与える負担が小さいからである。もちろん、発症箇所が局部的な疾患であれば、局所注射や経皮投与等により発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与も採用できる。注射による医薬組成物の注入部位は特に限定しない。例えば、血管内若しくは心室内のような循環系内や、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内、舌下等の器官若しくは組織内が挙げられる。
　また、併用する作用剤又は薬剤運搬体との投与の順序についても特に限定はしない。作用剤又は薬剤運搬体の投与前、同時、又は投与後のいずれで投与してもよい。通常は、作用剤又は薬剤運搬体の投与前（例えば、投与10分～1日前）に本発明の医薬組成物を投与するか、本発明の医薬組成物と同時（本発明の医薬組成物中に作用剤又は薬剤運搬体を包含する場合を含む）に投与すればよい。
２－５．効果
　本発明の医薬組成物によれば、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強することができる。したがって、有用性が期待されながらも標的細胞内への取り込み効率が低かったが故に実用性が乏しく、又は十分な効果を得ることができなかった公知の運搬体の活用性を向上できるようになる。それによって、目的細胞内への核酸、ペプチド、低分子化合物の効率的な導入が可能となり、遺伝子治療や、癌治療、iPS細胞作製のためのリプログラミングの改善が期待できる。
３．薬剤取り込みキット 
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、薬剤取り込みキットである。本発明の薬剤取り込みキットによれば、作用剤又は薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強することができる。
３－２．構成
　本発明の薬剤取り込みキットは、第１の態様に記載の薬剤取り込み増強剤、及び作用剤又は薬剤運搬体を必須の構成物品として含む。本態様における薬剤運搬体は、作用剤を必ずしも含んでいる必要はない。細胞又は生体に投与するときに、必要に応じて所望の作用剤を薬剤運搬体に包含させることができる。したがって、本発明の薬剤取り込みキットは、作用剤や薬剤取り込みマーカーを構成物品として含んでいてもよい。薬剤取り込みマーカーとしては、例えば、PET（陽電子放射断層撮影：Positron Emission Tomography)等で使用する場合には、11C、18F、15O、13N等の放射性同位元素で標識した化合物が挙げられる。また、SPECT（単一光子放射断層撮影：Single Photon Emission Computed Tomography）等で使用する場合には、99mTc標識した化合物が挙げられる。その他、薬剤増強剤投与レジメンや使用説明書を構成物品として含んでいてもよい。
＜実施例１：薬剤取り込み増強剤の細胞内取り込み効率＞
（目的）
　本発明の薬剤取り込み増強剤で処理した細胞における薬剤運搬体rAAVの取り込み効率をrAAVに包含されるルシフェラーゼ遺伝子等の発現効率によって検証する。また、同時にHDAC阻害活性についても検証する。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　本研究では、U251細胞（human glioma）を用いた。細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手した。培養細胞は、10% FBS（ニチレイ）含有DMED/F-12(1:1）（GIBCO）培地を用いて、5% CO2存在下37℃で培養した。
２．薬剤取り込み増強剤の調製
　芍薬甘草湯（TJ-68; ツムラ）1包2.5 gに10 mLの水（ddH2O）を加えて、37℃の恒温槽中で懸濁した。1 mLを取り、98℃で10分間抽出した後、10,000 rpm、10分、室温で3回遠心分離し、上清を0.45 μmのfilterで濾過し、この抽出液を薬剤取り込み増強剤として以下の実施例に使用した。
　また、薬剤取り込み増強剤に対する陽性対照には、HDAC阻害剤を使用した。HDAC阻害剤には、酪酸ナトリウムを用いた。酪酸ナトリウムは、100 mM又は200 mMの濃度となるようPBSで溶解し、0.22 μmのfilterで濾過した後、小分けにして-30℃保存した。
３．組換えAAVの調製
　本実施例では、薬剤運搬体として組換えAAV(rAAV)を使用した。rAAVは、Okadaらの方法（Okada, T., et al., 2009, Hum. Gene Ther., 20:1013-1021；Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218）に従って調製した。rAAVの発現解析には、rAAV8-Luc（2.1×1013 vg/mL）、rAAV8-GFP（2.1×1012 vg/mL）を用いた。rAAVにAlexa Fluor 568 Protein Labeling Kit（life technologies）を用いて蛍光標識を行い（Alexa 568-rAAV8-M3）、rAAVの細胞内動態の解析に使用した。
４．rAAVの細胞内取り込み効率の検証
　96 well-plateに、5×103 cell/100 μL/wellとなるようにU251細胞を播種し、一晩培養した。翌日、終濃度8.3 mg/mLの薬剤取り込み増強剤をPBSで5倍段階希釈系列にて段階希釈し、20 μLずつ各well（n=3）に添加した。なお、ルシフェラーゼ活性測定、HDAC阻害活性測定のような発光検出系については、全面白色の96 well-plateをGFPの蛍光観察及び蛍光ラベル化rAAVの取り込み解析には透明の96 well-plateを使用した。陽性対照として酪酸ナトリウムを終濃度3 mM及び9 mMで使用し、陰性対照は、PBS添加のみ（background）とした。薬剤取り込み増強剤又はHDAC阻害剤添加から6時間後の培地に直接、又は培地交換した後に、薬剤運搬体であるrAAV8-Luc（2×105 vg/cell）を1×109 vg/wellで、又はrAAV-GFP（1×105 vg/cell）を5×108 vg/wellで添加した。rAAVを添加した48時間後に、ルシフェラーゼ遺伝子発現をルシフェラーゼ活性測定によって、またGFP遺伝子発現をGFPの蛍光観察によって行うと共に、HDAC阻害活性測定を行った。
　ルシフェラーゼ活性測定は、前記rAAVを添加した48時間後にBright-GloTM Luciferase Assay System（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。具体的には、測定直前に培地を除き、Luciferase Assay System Mixtureを加えた。詳細な方法は、添付のプロトコルに従った。ルシフェラーゼ活性の測定は、Appliskan（Thermo Scientific）（Luminescence, shake, high, 500sec）を用いて行った。
　GFP測定は、前記rAAVを添加した48時間後に、倒立型システム蛍光顕微鏡（IX-70; OLYMPUS）を用いて観察した。
　HDAC阻害活性測定は、前記rAAVを添加した48時間後、測定直前に培地を捨て、Triton（終濃度1 %）を添加したHDAC-GloTM I/II Assay Mixtureを加えた。測定は、添付のプロトコルに従った。
（結果）
　図１～３に結果を示す。図１はルシフェラーゼ活性の測定結果を、図２はHDAC阻害活性測定結果を、そして図３はGFP測定結果を、それぞれ示している。また、図１において、横軸のAは芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤の段階希釈系列を低濃度から濃度ごとに、そしてContは本発明の薬剤取り込み増強剤の添加なしのサンプルを示す。図３で、Aは非処理のU251細胞、BはrAAV8-GFPで処理したU251細胞、そしてCはrAAV8-GFPと芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤で処理したU251細胞を示す。
　図１で示すように、薬剤取り込み増強剤で処理したときには、ルシフェラーゼ活性に有意な濃度依存的上昇を確認でき、rAAV8-LucのU251細胞内取り込み効率が増強されていることが示された。また、図３からも薬剤取り込み増強剤で処理したときには、rAAV8-GFPのU251細胞内取り込み効率が増強されていることが立証された。
　一方、図２が示すように、薬剤取り込み増強剤で処理したときには、HDAC阻害活性は誘導されなかった。
＜実施例２：薬剤取り込み増強剤の細胞毒性試験＞
（目的）
　本発明の薬剤取り込み増強剤の細胞毒性をXTT assayによって検証する。
（方法）
　基本的には実施例１に記載の方法に準じた。96 well-plateは、透明plateを用いた。細胞毒性試験は、rAAVを添加した48時間後にCell Proliferation Kit II(XTT)（Roche）を用いて、添付のプロトコルに従って行った。具体的には、rAAVを添加した48時間後に培地を除き、10% FBS含有DMED/F-12培地で希釈したXTT Mixtureを100 μL加え、2時間以上インキュベートした。測定は、Appliskan（Thermo Scientific）（Potoabsorption, 450nm, shake）を用いて行った。
（結果）
　図４に結果を示す。この図が示すように、本発明の薬剤取り込み増強剤は、6時間処理では、細胞毒性の効果を示さないことが立証された。
＜実施例３：rAAVの細胞への取り込みに対する薬剤の効果の検証＞
（目的）
　本発明の薬剤取り込み増強剤による薬剤運搬体の細胞内取り込み効率が増強していることを細胞内のrAAVゲノムコピー数により検証する。
（方法）
　透明96 well-plateに、5×103 cell/100 μL/wellとなるようにU251細胞を播種し、一晩培養した。翌日、終濃度8.3 mg/mLの薬剤取り込み増強剤をPBS(-)で5倍段階希釈系列にて段階希釈し、20 μLずつ各well（n=3）に添加した。陽性対照として酪酸ナトリウムを終濃度3 mM及び9 mMで使用し、陰性対照は、PBS添加のみ（background）とした。薬剤取り込み増強剤の添加から6時間後の培地に直接、又は培地交換した後に、Alexa 568-rAAV8-M3の200倍希釈液を10 μL添加した。添加16時間後に、1 μg/mL Hoechst33342（life technologies）で核染色を行いPBS(+)で洗浄後、倒立型システム蛍光顕微鏡（IX-70;OLYMPUS）で観察した。その後、水（ddH2O）で2倍希釈したBuffer AL（QIAGEN）50 μLを各wellに加え、細胞を溶解した。細胞溶解液を56℃で10分間処理した後、ウイルスベクターのプロモーター部分を定量RT-PCRで定量検出し、細胞内のrAAVゲノムコピー数を算出した。なお、標準として、CMVプロモーターを含む既知のコピー数のプラスミド(pCMV)を直鎖化して標準曲線の作成と検量に使用した。
　PCRの反応条件は、プライマーセットにCMVプロモーター配列を増幅するCMV-F（配列番号１：5´-TACATCAATGGGCGTGGATA-3´）及びCMV-R（配列番号２：5´-GGCGGAGTTGTTACGACATT-3´）を使用し、SYBR Premix Ex Taq II (TAKARA)を用いて、添付のプロトコルに従い、95.0℃で30秒処理後、95.0℃で4秒及び60.0℃で20秒を40サイクル行った後、4.0℃で保温した。増幅産物の定量は、iCycler(Bio-Rad)を用いて、使用説明書にしたがって行った。
（結果）
　図５及び６に結果を示す。
　図５は、定量RT-PCRによる細胞内のAlexa 568-rAAV8-M3ゲノムの取り込み率を示す図である。図中、Contは、本発明の薬剤取り込み増強剤の添加なしのサンプル、Aは本発明の芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤を添加したサンプル、SBは酪酸ナトリウム（sodium butyrate）を添加したサンプルである。縦軸は、ContのAlexa 568-rAAV8-M3ゲノムの取り込み率を1としたときの相対値を示している。薬剤取り込み増強剤を添加したサンプルは、ContやSBのサンプルと比較して、Alexa 568-rAAV8-M3ゲノムの取り込み率が有意に増強されていることが立証された。
　図６は、Alexa 568-rAAV8-M3の局在を示す図である。図中、NTは未処理の細胞、Contは、本発明の薬剤取り込み増強剤の添加なしの細胞、Aは本発明の芍薬甘草湯由来の薬剤取り込み増強剤を添加した細胞、SBは酪酸ナトリウムを添加した細胞である。矢印の白い小点はAlexa 568-rAAV8-M3を、矢頭はU251細胞の核を、示している。顕微鏡観察でも、薬剤取り込み増強剤を添加した細胞では、細胞内、特に核周囲に局在するAlexa 568-rAAV8-M3の数が増加しているのがわかる。
＜実施例４：薬剤取り込み増強剤における芍薬及び／又は甘草の効果（１）＞
（目的）
　芍薬及び／又は甘草を含む各種漢方薬から調製した抽出液を用いて、本発明の薬剤取り込み増強剤における芍薬及び／又は甘草の効果について検証する。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　実施例１に準じた。
２．漢方抽出液の調製
　表１に示す生薬組成からなる６種の漢方エキス末（TJ-9、TJ-23、TJ-41、TJ-48、TJ-60、TJ-68; ツムラより恵与、以下同じ）0.5 gを25 mLのPBSに溶解した。その後、120℃、10分でオートクレーブ抽出し、10 K×g、10分、4℃で2回遠心した後、上清を回収してストックとして-30℃で保存した。このストックを溶解後、再度10 K×gで10分間、4℃で遠心し、その上清を漢方抽出液原液（20 mg/mL）として実験に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３．組換えAAVの調製
　薬剤運搬体として組換えAAV(rAAV)を使用した。rAAVは、Okadaらの方法（Okada, T., et al., 2009, Hum. Gene Ther., 20:1013-1021；Okada, T., et al., 2005, Hum. Gene Ther., 16:1212-1218）に従って調製した。rAAVの発現解析には、rAAV9-CAG-Lucを用いた。
４．rAAVの細胞内取り込み効率の検証
　全面白色の96 well-plateに、5×103 cell/100 μL/wellとなるようにU251細胞を播種し、一晩培養した。翌日、20 mg/mLの漢方抽出液原液をPBSで段階希釈系列にて段階希釈し、20 μLずつ各well（n=3）に添加した。陰性対照は、PBS添加のみ（background）とした。漢方抽出液の添加から6時間後の培地に直接、又は培地交換した後に、薬剤運搬体であるrAAV9-CAG-Luc（5×105 vg/cell）を2.5×109 vg/wellで添加した。rAAV9を添加して3日後に、ルシフェラーゼ遺伝子の発現をルシフェラーゼ活性測定によって確認した。ルシフェラーゼ活性測定は、実施例１に記載の方法に従った。
（結果）
　図７に結果を示す。ルシフェラーゼ活性に基づく各種漢方抽出液によるrAAV9の細胞内取り込み効率は、いずれも漢方抽出液の濃度依存的に増加した。最も効率が高かったのは、TJ-68、すなわち芍薬と甘草が1：1からなる芍薬甘草湯であった。
＜実施例５：薬剤取り込み増強剤における芍薬及び／又は甘草の効果（２）＞
（目的）
　本発明の薬剤取り込み増強剤における芍薬及び甘草の効果について検証する。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　実施例１に準じた。
２．抽出液の調製
　芍薬エキス末（ツムラより恵与）、甘草エキス末（ツムラより恵与）、及びTJ-68（芍薬甘草湯；ツムラより恵与）0.25 gを12.5 mLのPBSに溶解し、実施例４と同様に120℃、10分でオートクレーブ抽出した。その後、10 K×g、10分、4℃で2回遠心した後、上清を回収してストックとして-30℃で保存した。このストックを溶解後、再度10 K×gで10分間、4℃で遠心し、その上清を漢方抽出液原液（20 mg/mL）として実験に用いた。
３．組換えAAVの調製及びrAAVの細胞内取り込み効率の検証
　基本的には実施例１及び４に準じた。rAAVの発現解析には、rAAV9-Luc（7.92×1012 vg/mL）又はrAAV9-GFP（2.44×1013 vg/mL）を用いた。ただし、ルシフェラーゼ活性の測定はrAAV9を添加して3日後に行った。
　GFP遺伝子発現rAAV9の取り込み解析には透明の96 well-plateを使用した。また、GFP遺伝子発現によるGFP測定は、GFPの蛍光観察によってrAAV9を添加した7日後に、倒立型システム蛍光顕微鏡（IX-70; OLYMPUS）を用いて行った。
４．抽出液の細胞毒性の検証
　薬剤運搬体として組換えAAV9(rAAV9)を使用した。基本的には実施例２に記載の方法に準じた。96 well-plateは、透明plateを用いた。細胞毒性試験は、rAAV9を添加した48時間後にCell Proliferation Kit II(XTT)（Roche）を用いて、添付のプロトコルに従って行った。具体的には、rAAVを添加した72時間後に培地を除き、10 % FBS含有DMED/F-12培地で希釈したXTT Mixtureを100 μL加え、2時間以上インキュベートした。測定は、Appliskan（Thermo Scientific）（Potoabsorption, 450nm, shake）を用いて行った。
（結果）
　図８及び図９に結果を示す。いずれの抽出液も濃度依存的にrAAV9の細胞内取り込み効率を増加させた。芍薬抽出液の方が甘草抽出液よりもrAAV9の細胞内取り込み効率が高かったが、細胞毒性も濃度依存的に高くなる傾向にあった。逆に甘草抽出液では、rAAV9の細胞内取り込み効率が芍薬抽出液ほどではなかったが、細胞毒性は高濃度でも比較的低かった。一方、芍薬甘草湯（TJ-68）は、rAAV9の細胞内取り込み効率も高く、細胞毒性は低いという芍薬と甘草の長所を兼ね備えていた。
＜実施例６：芍薬及び甘草の主要成分による薬剤取り込み効果の検証＞
（目的）
　本発明の薬剤取り込み増強剤の有効成分である芍薬及び甘草において、それらに含まれる主要成分が薬剤取り込み効果を有するのか否かについて検証する。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　実施例１に準じた。
２．主要成分溶液の調製
　芍薬の主要成分であるペオニフロリン（東京化成）は、10 mg/mLの濃度となるようPBSに溶解した後、0.22 μmのfilterで濾過して実験に用いた。甘草の主要成分であるグリチルリチンは、20 mg/mLのグリチロン皮下注40 mg溶液（ミノファーゲン製薬）を実験に用いた。
３．組換えAAVの調製及びrAAVの細胞内取り込み効率の検証
　基本的方法は実施例４に準じた。ただし、ルシフェラーゼ活性の測定はrAAV9を添加して3日後に行った。
４．薬剤取り込み増強剤の細胞毒性の検証
　基本的には実施例２及び５に記載の方法に準じた。rAAVを添加した3日後に測定した。
（結果）
　図１０に結果を示す。ペオニフロリン及びグリチルリチンのいずれも、細胞内取り込み効率及び細胞毒性において濃度依存性が見られなかった。この結果は、芍薬及び甘草の主要成分のみでは薬剤取り込み効果をもたらさないことを示唆している。
＜実施例７：各種細胞における薬剤取り込み増強剤の効果＞
（目的）
　前記実施例１～６では、神経上皮細胞由来のU251細胞を用いた。本発明の薬剤取り込み増強剤が他の細胞種においても同様に薬剤取り込み効果をもたらすことを検証した。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　繊維芽細胞由来のDMD5017、肝細胞由来のHepG2、及び筋細胞由来のRDを用いた。DMD5017細胞は、Coriell Cell Repositories (Camden, NJ)より入手し、HepG2、及びRDは、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手した。細胞培養条件は、実施例１に記載の方法に準じた。
２．薬剤取り込み増強剤の調製
　芍薬甘草湯（TJ-68）を実施例４に記載の方法によりオートクレーブ抽出し、それを本発明の薬剤取り込み増強剤として調製した。また、薬剤取り込み増強剤に対する陽性対照には、HDAC阻害剤を使用した。HDAC阻害剤には、酪酸ナトリウムを用いた。
３．組換えAAVの調製
　基本的方法は、実施例１に記載の方法に準じた。96 well-plateに、5×103 cell/wellとなるように細胞を播種した。薬剤運搬体として組換えAAV(rAAV)を使用し、その発現解析には、rAAV9-Luc（7.92×1012 vg/mL）を用いた。
４．薬剤取り込み増強剤によるrAAVの細胞内取り込み効率及び細胞毒性の検証
　実施例１に記載の方法に準じた。それぞれの細胞を播種し、翌日に薬剤取り込み増強剤であるTJ-68抽出液を添加し、その6時間後にrAAVを添加する際、培地交換によりTJ-68抽出液を除去した群（6h）と、TJ-68抽出液を培地内に残したままrAAVを添加し、72時間培養した群（72hr）について検証した。
（結果）
　図１１に結果を示す。この結果から、本発明の薬剤取り込み増強剤は、細胞の種類に依ることなく、薬剤取り込み効果をもたらすことが明らかとなった。いずれの細胞でも高いルシフェラーゼ活性が観察されたが、特に、繊維芽細胞由来のDMD5017では1.67mg/mLの薬剤取り込み増強剤で処理した後、薬剤運搬体添加時に薬剤取り込み増強剤を培地から除くことによって、陰性対照と比較して100倍近くものルシフェラーゼ活性が観察された。繊維芽細胞は陽性対照のSB処理でもルシフェラーゼ活性が極めて低い。これは、本発明の薬剤取り込み増強剤が繊維芽細胞内への薬剤取り込みに、特に効果的であることを示唆している。
＜実施例８：薬剤取り込み増強剤の薬剤運搬体に対する効果（１）＞
（目的）
　前記実施例１～７では、薬剤運搬体として2種類のrAAV（rAAV8及びrAAV9）を用いた。そこで、本発明の薬剤取り込み増強剤が前記2種以外の血清型rAAVに対しても同様の薬剤取り込み効果をもたらすことを検証した。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　筋細胞由来のRDを用いた。細胞培養条件は、実施例１に記載の方法に準じた。
２．薬剤取り込み増強剤の調製
　芍薬甘草湯（TJ-68）を実施例４に記載の方法によりオートクレーブ抽出し、それを本発明の薬剤取り込み増強剤として調製した。また、薬剤取り込み増強剤に対する陽性対照には、HDAC阻害剤を使用した。HDAC阻害剤には、酪酸ナトリウム（SB）を用いた。
３．組換えAAVの調製
　実施例１に記載の方法に準じた。薬剤運搬体として組換えAAV2(rAAV2)を使用し、その発現解析には、rAAV2-Luc（6.3×1011 vg/mL）を用いた。
４．薬剤取り込み増強剤によるrAAV2の細胞内取り込み効率の検証
　実施例１に記載の方法に準じた。それぞれの細胞を播種し、翌日に薬剤取り込み増強剤であるTJ-68抽出液を添加し、その6時間後にTJ-68抽出液を除去せずにrAAV2-Lucを添加し、72時間培養した。
（結果）
　図１２に結果を示す。rAAV2を薬剤運搬体に用いた場合でも陰性対照と比較して非常に高いルシフェラーゼ活性が観察された。この結果から、本発明の薬剤取り込み増強剤は、薬剤運搬体としてrAAVを用いた場合、その血清型に依ることなく、薬剤取り込み効果をもたらすことが明らかとなった。
＜実施例９：薬剤取り込み増強剤の薬剤運搬体に対する効果（２）＞
（目的）
　本発明の薬剤取り込み増強剤がrAAV以外の薬剤運搬体に対してもrAAVと同様の薬剤取り込み効果をもたらすことを検証した。
（方法）
１．培養細胞及び培養条件
　筋細胞由来のRDを用いた。細胞培養条件は、実施例１に記載の方法に準じた。96 well-plateに、１×104 cell/wellとなるようにRD細胞を播種した。
２．薬剤取り込み増強剤の調製
　実施例８に記載の方法に準じた。
３．組換えAVの調製及び薬剤取り込み増強剤によるrAAVの細胞内取り込み効率の検証
　基本的な操作は、実施例８に記載の方法に準じた。ただし、薬剤運搬体として組換えアデノウイルス2(rAV2)を使用し、その発現解析には、rAV2-Luc（1.3×109 vg/mL）及びrAV2-EGFP（5.2×108 vg/mL）を用いた。また、薬剤取り込み増強剤であるTJ-68抽出液の濃度を1.67mg/mLとし、TJ-68抽出液による処理時間は24時間とした。rAV2を添加して2日後に、ルシフェラーゼ遺伝子の発現をルシフェラーゼ活性測定によって行うとともに、細胞内で発現したGFPを倒立型システム蛍光顕微鏡（IX-70; OLYMPUS）により観察した。
（結果）
　図１３及び図１４に結果を示す。これらの図から、本発明の薬剤取り込み増強剤は、薬剤運搬体がアデノウイルスであっても薬剤取り込み効果をもたらすことが明らかとなった。したがって、本発明の薬剤取り込み増強剤は、薬剤運搬体の種類によらず、その効果を発揮し得ることが立証された。
＜実施例１０：薬剤取り込み増強剤によるインビボでの薬剤取り込み効果＞
（目的）
　実施例１～９により培養細胞での本発明の薬剤取り込み増強剤による細胞内への薬剤取り込み効果が立証された。そこで、本実施例ではマウス個体を用いて、本発明の薬剤取り込み増強剤によるインビボでの細胞内への薬剤取り込み効果について検証した。
（方法）
１．材料
　マウスは、8週齢のBalb/cマウスの雄個体（日本クレア）を使用した。
２．薬剤取り込み増強剤の調製
　芍薬甘草湯（TJ-68）1包2.5 gを10 mLの滅菌水に入れて37℃で溶解後、98℃で10分間、熱水抽出処理を行った。得られた抽出液を遠心することなく本発明の薬剤取り込み増強剤とした。
３．組換えAAVの調製及び薬剤取り込み増強剤によるrAAVの細胞内取り込み効率の検証
　薬剤運搬体として組換えAAV9(rAAV9) （Alexa 568-rAAV9-Luc）を使用した。基本的な操作は、実施例５に記載の方法に準じた。
　50 mg/bodyとなるようにマウスに0.25 g/mLの薬剤取り込み増強剤200 μLを経口投与し、その6時間後に、4.58×1010 vg/bodyのrAAV9を静脈内投与した。薬剤取り込み増強剤非投与の個体を陰性対照とした。静脈内投与5か月後に、マウスの筋組織を採取し、Passive Lysis Buffer（Promega）とホモジナイザー（ニッピ）を用いて溶解した後、15 K×rpm、5分、4℃で遠心した。上清のタンパク質量をBCA法によって定量した後、筋組織におけるルシフェラーゼ活性を測定した。
（結果）
　図１５に結果を示す。薬剤取り込み増強剤を投与した個体は、非投与個体と比較して顕著に筋細胞でのルシフェラーゼ活性が増強することが明らかとなった。この結果から、本発明の薬剤取り込み増強剤は、インビボにおいても薬剤取り込み効果をもたらすことが立証された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (13)

  1. 　ボタン属（Paeonia）植物由来物、カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物由来物又はその組合せを有効成分として含む、作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体の細胞内取り込み効率を増強するための薬剤取り込み増強剤。
  2. 　前記由来物が根由来物、ストロン由来物又はその組合せである、請求項１に記載の薬剤取り込み増強剤。
  3. 　前記由来物が植物体乾燥粉末、抽出物又はその組合せである、請求項１又は２に記載の薬剤取り込み増強剤。
  4. 　前記由来物の組合せがボタン属植物由来物とカンゾウ属植物由来物をそれぞれ２：８～８：２の重量比で含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬剤取り込み増強剤。
  5. 　前記由来物の組合せが芍薬甘草湯である、請求項４に記載の薬剤取り込み増強剤。
  6. 　前記薬剤運搬体がウイルス粒子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の薬剤取り込み増強剤。
  7. 　前記ウイルス粒子がウイルスベクター粒子又は中空粒子である、請求項６に記載の薬剤取り込み増強剤。
  8. 　前記作用剤が核酸、ペプチド及び／又は低分子化合物である、請求項１～７のいずれか一項に記載の薬剤取り込み増強剤。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤取り込み増強剤を含む医薬組成物。
  10. 　作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤取り込み増強剤を含む細胞内への薬剤取り込みキット。
  12. 　作用剤及び／又は薬剤運搬体をさらに含む、請求項１1に記載の薬剤取り込みキット。
  13. 　細胞内への薬剤取り込み増強剤投与レジメンであって、
    　作用剤又はそれを包含する薬剤運搬体の投与を請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤取り込み増強剤の投与と同時に又は投与後に生体に投与することを記載した前記レジメン。
PCT/JP2013/059470 2012-03-29 2013-03-29 薬剤取り込み増強剤 WO2013147125A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

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