JP2001520050A - 遺伝子供給ベクター類及びそれらの使用 - Google Patents

遺伝子供給ベクター類及びそれらの使用

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JP2001520050A JP2000517098A JP2000517098A JP2001520050A JP 2001520050 A JP2001520050 A JP 2001520050A JP 2000517098 A JP2000517098 A JP 2000517098A JP 2000517098 A JP2000517098 A JP 2000517098A JP 2001520050 A JP2001520050 A JP 2001520050A
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ツァン,シャオリウ
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キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド
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Abstract

(57)【要約】 アデノ−関連ウィルス(AAV )のためのヘルパーウィルスとして作用することができる粒子、及び標的宿主細胞に供給するための少なくとも1つの選択された核酸配列を含み、そしてさらにタンパク質及び複製機能をコードするDNA (i )を含んで成る粒子を包含する感染性ウィルス粒子の調製物に関し、ここで、前記機能は、前記調製物中の粒子が、前記選択された核酸配列を含んで成る感染性組換えAAV 粒子の、第1標的宿主細胞からのアセンブリー及び開放のための前期第1標的細胞を感染する場合、共に十分であり、それにより、前記感染性組換えAAV 粒子が、順に第2標的宿主細胞を感染し、そして前記感染された標的物宿主細胞における前記DNA (i )の発現を引き起こすことができることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】発明の分野 本発明は、遺伝子供給ベクター類、それらの調製のための方法及び中間体、並
びにそれらを使用する方法に関する。 一定の態様において、本発明は、標的細胞への選択されたDNA の供給のための
新規調製物を提供する。 一定の態様において、本発明はまた、所望のDNA 、特に異種DNA を担持する組
換えアデノ−関連ウィルス(AAV )粒子の生成のための新規な高収率の方法も提
供する。 本発明はまた、細胞への供給のための、選択されたDNA を担持する組換えAAV
粒子の新規調製物も提供する。
【0002】発明の背景及び従来技術 ヘルペスウィルス(HSV)アンプリコンは知られており、そしてそれらに基づく
ベクター、例及び初期の公開された文書の引用は、WO96/29421号明細書(lynzva
le Ltd and Cantab Pharmaceuticals Research Ltd: S Efstathiou, SC Inglis
and X Zhang )に記載されている。HSV アンプリコンは、HSV 複製起点及びパッ
ケージングシグナルorisS-pac を保持する。HSV アンプリコンプラスミドは、ヘ
ルパーウィルスとしてのHSV と一緒に細胞中に導入されるとすぐに、増幅され、
そしてHSV 粒子中にパッケージングされることはよく知られている。
【0003】 アデノ−関連ウィルス(Adeno-associated virus) (AAV )は、非病原性ヒト
パルボウィルスとして知られており、そして遺伝子トランスファーベクターとし
ての使用のために提案されて来た。組換えAAV はまた、たとえば次のものに記載
されているように、知られている:アメリカ特許第4,797,368 号(DHHS: BJ Car
ter & JD Tratschin); アメリカ特許第5,139,941 号(Univ Florida Fes Fouda
tion, N Muzyczka など);アメリカ特許第5,474,935 号(DHSS: S Chatterjee
and K K Wong ); WO95/06743(UAB Research Foundation: J Dong and RA Friz
zell);及びアメリカ特許第5,589,377 号(Rhone Poulenc Rorer; J Lebkowski
など)。しかしながら、問題が遺伝子供給のためのrAAV(組換えAAV )の開発に
直面しており;それらの問題はrAAVストック生成のための現在のパッケージング
システムの低い効率、及びヘルパーウィルスからの精製の問題を包含する。
【0004】 M Feng など., Nature Biotechnology (1997) 15: 866-870は、遺伝子供給及
び発現のために1 対のアデノウィルスベクターを記載しており、その結果、両ベ
クターにより感染された細胞は組換えレトロウィルスを放出し、次にそのレトロ
ウィルスが周囲の細胞を感染する。 さらなる遺伝子供給システム、特にアデノ−関連ウィルスに基づくそれらの供
給システムについての必要性が残存しており;そして本発明は、種々の態様にお
いて、下記に言及されるような特徴及び利点を有するようなシステムを提供しよ
うと努める。
【0005】発明の要約及び記載 本発明によれば、第1に、アデノ−関連ウィルス(AAV )粒子(たとえば、ヘ
ルペス単純ウィルス又はアデノウィルス)の生成のためにヘルパーウィルスとし
て作用することができる第1のウィルス型のウィルス粒子の感染性調製物が提供
され、ここで核酸成分は、標的細胞への供給のための選択された核酸配列を含み
、そしてさらにタンパク質及び複製機能をさらにコードし、これらは一緒になっ
て、前記ウィルス調製物により感染された細胞である第1の感染された細胞にお
いて、前記第1 のウィルス型とは異なるウィルス型たとえば組換えAAV の追加の
感染性粒子のアセンブリー及び開放を可能にするのに十分であり、ここでタンパ
ク質及び前記選択された核酸配列を含んで成る前記さらなる粒子は、こんどは第
2の感染細胞に感染することができ、そして前記選択された核酸の発現を引き起
こすことができる。
【0006】 1 つの観点において、本発明は、アデノ−関連ウィルス(AAV )のためのヘル
パーウィルスとして作用することができる粒子、及び標的宿主細胞に供給するた
めの少なくとも1つの選択された核酸配列を含み、そしてさらにタンパク質及び
複製機能をコードするDNA (i )を含んで成る粒子を包含する感染性ウィルス粒
子の調製物を提供し、ここで、前記調製物の前記粒子が第1の標的宿主細胞に感
染する場合、前記タンパク質及び機能は一緒になって、前記選択された核酸配列
を含んで成る感染性組換えAAV 粒子のアセンブリー及び第1標的宿主細胞からの
開放のために十分であり、それにより、前記感染性組換えAAV 粒子が、今度は第
2標的宿主細胞に感染し、そして前記感染された標的物宿主細胞中での前記DNA
(i )の発現を引き起こすことができることを特徴とする。
【0007】 前記ウィルス粒子は、複製−欠陥ヘルペスウィルス、たとえば、前記ヘルペス
ウィルスが正常な宿主細胞に感染した場合に新規の感染性ヘルペスウィルス粒子
のために必須の遺伝子の機能を欠いている遺伝子的に無能にされた(gereticall
y disalsled)ヘルペスウィルスであり得るヘルペスウィルス粒子から成るか又は
それを含むことができる;たとえばWO92/05263(Immunology Ltd: SC Inglis な
ど)及びWO94/21807(Cantab Pharmaceuticals: Inglis など)を参照のこと。
【0008】 正常な宿主細胞は、一般的に、宿主細胞の親型の細胞に対して非生来性である
欠陥ウィルス機能を補完することが意図された組換え要素を含まない細胞である
。標的細胞への供給のための異種DNA を含む、本明細書に記載され、そして言及
されるような複製−欠陥組換えAAV 粒子は通常、それらが、通常、正常な宿主細
胞、たとえば処理されたヒト又は非ヒト哺乳類の組織の細胞である標的細胞に感
染する場合、AAV 粒子をさらに生成することができない。
【0009】 一定の態様において、本発明は次の目的を提供し、又はそれに寄与する: 本発明の例は、ベクター調製物により最初に感染された宿主標的細胞を取り囲
む広範囲の宿主標的細胞への選択されたDNA の標的化を提供し、その結果、前記
周囲細胞における前記DNA の発現を可能にする。 前記システムの例は、はじめて、調製物自体のウィルス粒子により最初には感
染されなくなる細胞における選択されたDNA の遺伝子供給及び発現を提供するこ
とができる。
【0010】 前記システムの例は、投与された調製物自体のウィルス粒子により感染される
ようにならず、そして従って、投与される調製物の粒子と同じタイプのウィルス
により感染されず、そして従って、投与された調製物のウィルス粒子に対するあ
らゆる免疫応答、たとえば抗−ヘルペス免疫応答、の標的にならないか又は一次
標的にならない細胞における、選択されたDNA の発現を可能にすることができる
【0011】 本発明の例は、rAAV 粒子の全身性投与の不存在化でのrAAV感染の発生を可能
にし、そしてこれは、抗−AAV 免疫応答からの一次標的細胞の少なくとも初期逃
避を助けることができる。 本発明の例は、ヘルパーウィルス粒子を有さないか又は実質的に有さない、た
とえば複製コンピテントヘルパーウィルス粒子を有さないrAAV生成物を提供する
ことができる。 技法の例は、標的細胞に供給されるべき1 よりも多くの成分の単一−粒子供給
に適用できる。
【0012】 技法の例は、サイトカイン遺伝子を長命の(long lived) 細胞にトランスフェ
クト/ 感染せしめることを必要としないで、サイトカイン遺伝子の遺伝子供給に
より、すなわち免疫刺激物を発現する細胞が、たとえば細胞の死を確かにするで
あろうrAAVのようなウィルス感染により感染された細胞であることを確実にする
ことにより、免疫刺激を提供することに適用できる。 技法の例は、たとえばベクター調製物の異種DNA がレポーター遺伝子を含んで
成る場合、ベクター調製物により供給される遺伝子の発現のモニターに適用でき
る。
【0013】 本発明の例に従っての調製物は、実質的に広い宿主範囲にわたっての遺伝子供
給に適用できる。 調製物の例は、ヘルペスウィルス又はアンプリコンによる感染から約24〜48時
間で、rAAV又はその第二世代発現生成物の有用な収率をもたらすことができる。 調製物の他の例は、組換えアデノウィルスに基づくことができる。
【0014】 本発明の調製物の例は、細胞にインビボ感染し、そしてそのような選択された
核酸の発現をもたらすために、たとえば免疫応答を誘発するために調製物中に存
在する遺伝子によりコードされた抗原を発現するために、治療に使用され得る。
本発明の例により提供される遺伝子治療技法は、標的細胞における欠陥遺伝子又
は失われた遺伝子を置換するための訂正遺伝子療法(corrective gene therapy)
又は遺伝子供給技法(gene debivary technique)であることができ、あるいは所
望の免疫応答を誘発し又は調節することが意図される遺伝子を発現するための遺
伝子免疫治療技法(gene immunotherapy technique) であることができる。
【0015】 標的細胞への供給及びそこでの発現のために選択されたDNA は、たとえばWO96
/26267(Cantab Pharmaceuticals: Inglis など)に言及され、そして引用され
ているように、1又は複数の異種遺伝子、たとえば抗原、たとえば腫瘍特異的抗
原、をコードするか、あるいはサイトカインもしくは他の免疫刺激剤又は他の免
疫調節タンパク質をコードするDNA を含んで成ることができる。選択されたDNA
は、所望により、治療遺伝子(therapeutic gene) 、たとえば標的細胞又は組織
における遺伝子欠陥を修正するために供給され、そして発現されることが意図さ
れる遺伝子であることができる。
【0016】 選択されたDNA はまた、所望により、調節DNA 配列、たとえば転写因子、又は
組織特異的プロモーター配列(たとえば、肝臓特異的遺伝子発現を指令するアル
ブミンプロモーター、又はニューロン特異的遺伝子発現を指令するニューロンエ
ノラーゼプロモーター)をコードすることができるが、但し、完全な異種DNA 挿
入体のサイズはrAAV 粒子中にパッケージングされ得るサイズのもの、たとえば
通常、約4.5kb までのサイズのものである。アデノ−関連ウィルスベクター自体
は広い組織向性(tissue fropism) を有するので、特定の細胞型に標的DNA の発
現を指令するための組織特異的プロモーター配列の存在は非常に有用であり得る
【0017】 一定の態様においては、本発明は、 (a )新たな感染性ヘルペスウィルス粒子又は新たなヘルペスウィルスアンプ
リコン粒子の生成に関して複製−欠陥性であり、そして (b )(i )AAV のITR 配列を端に有する、たとえば約4.5kb までのサイズの
、AAV に対して異種性である(heterologous)DNA、及び(ii)AVV ITR 配列を端
に有する以外の位置において少なくとも部分的にコードされるAVV rep 及びcap
遺伝子をコードするDNA を含んで成る、ヘルペスウィルス調製物又はヘルペスウ
ィルスアンプリコン調製物である第1ウィルス型のウィルス粒子の調製物を提供
し、
【0018】 ここで、前記(i )及び(ii)の両方が、ウィルス粒子により感染される細胞
内で複製することができるように、ヘルペスウィルス複製起点(oriS)に関連し
て、そして場合によってはさらに、ヘルペスウィルス パッケージングシグナル
(pac )に関連して位置し、 その結果、第1細胞が前記調製物により感染された場合、それらはヘルペスウ
ィルス又はヘルペスウィルスアンプリコンの新たな感染性粒子を生ぜしめること
ができないが、しかしそれらは組換えAAV 粒子を構成する、AAV コートタンパク
質にパッケージングされた、(i )で上記したようなDNA を含んで成る組換えAA
V 粒子を生ぜしめることができ、そして その結果、前記組換えAAV 粒子は、前記第1細胞からのそれらの放出の後、第
2の細胞に感染することができるが、しかし前記第2の細胞からの新たな感染性
ウィルス粒子を生ぜしめることはできない。
【0019】 そのような調製物においては、DNA (i )及びDNA (ii)は、oriS及びpac 配
列を含む同じか又は異なるヘルペスウィルスアンプリコンによりコードされ得る
。そのような例の結果は、供給のための遺伝子がすべて、アンプリコンDNA 中に
コードされ得るということである可能性がある。
【0020】 DNA (i )及びDNA (ii)は、たとえば同じヘルペスウィルスアンプリコンに
コードされていてもよい。 あるいは、DNA (i )は第1ヘルペスウィルスアンプリコンによりコードされ
、そしてDNA (ii)は第2ヘルペスウィルスアンプリコンによりコードされてい
てもよい。 しかしながら、アンプリコンを使用する必要はない。本発明の他の種類の調製
物は、上記で示されたDNA (i )及び上記で示されたDNA (ii)を含んで成るこ
とができ、ここで両DNA は、新たな感染性ヘルペスウィルス粒子の生成のために
必須ではないが、しかし変異体ヘルペスウィルスにより感染された細胞における
ヘルペスウィルスタンパク質の発現のためには一般的に必須ではない遺伝子を欠
いている変異体ゲノムを有する感染性変異体ヘルペスウィルス(たとえば、DNA
(i )及び(ii)のためのそれぞれ異なった変異体ヘルペスウィルス)によりコ
ードされる。
【0021】 さらなる態様においては、rep 及びcap は、DISCヘルペスウィルス変異体、す
なわち新たな感染性ヘルペスウィルス粒子の生成のために必須の遺伝子を欠いて
いる変異体、すなわちアンプリコンにコードされる供給のための他のDNA を有す
る変異体ヘルペスウィルス、にコードされ;従って、DNA (i )はヘルペスウィ
ルスアンプリコンによりコードされ得、そしてDNA (ii)はDISCヘルペスウィル
スによりコードされ得、又は逆もまた真である。 (i )及び/ 又は(ii)の要素は、それらがDISCヘルペスウィルス変異体中で
コードされる場合、必須のヘルペスウィルス遺伝子の欠失の部位で挿入され得る
【0022】 一定の重要な例においては、免疫刺激遺伝子、たとえばIL−2 もしくは他のサ
イトカインをコードする遺伝子、又は他の免疫刺激遺伝子、又は抗原をコードす
る遺伝子、又は治療タンパク質をコードする遺伝子、たとえばそのような遺伝子
を欠いている細胞への供給及びそこにおける発現のために第VIII又はIX因子をコ
ードする遺伝子、及び/ 又はレポーター遺伝子、たとえばgfp 又はLacZがまた、
たとえば変異体ヘルペスウィルス又はヘルペスウィルスアンプリコンに挿入され
得る。
【0023】 本発明の一定の例は、たとえば上記のような調製物の形で、組み込み官能性を
組込むことができ、ここで約4.5kb までのAAV に対して異種性でありそしてAAV
のITR 配列を端に有するDNA (i )は、AAV rep 遺伝子、又は組換えAAV 粒子に
より感染された前記第2細胞のDNA 中への前記DNA (i )の組み込みを引き起こ
すのに十分であるrep 遺伝子の副配列を伴う。
【0024】 本発明の1 つの観点によれば、たとえばヘルパーウィルスを有さない及び/ 又
はアデノウィルスを有さない、異種性DNA を含んで成り、そしてAAV コートタン
パク質にパッケージングされた組換えAAV (アデノ−関連ウィルス)ゲノムの調
製物もまた提供される。前記調製物は、たとえば感染性複製−コンピテントヘル
パーウィルスを有さない。それらは、複製−欠陥ヘルペスウィルスを含むが、し
かし好ましくは、複製−コンピテントヘルペスウィルスを有さない。
【0025】 また、異種DNA を含んで成り、そしてAAV コートタンパク質にパッケージング
された、たとえば複製−コンピテントヘルパーウィルスを有さない組換えAAV ゲ
ノムの生成方法が提供され、ここで前記方法は、 (i )新たな感染性ヘルペスウィルス粒子の生成のために必須であるが、しか
しヘルペスウィルスタンパク質の一般的な発現のためには必須ではない遺伝子を
欠いているゲノムを有し、そして組換え体にされ、そしてヘルペスウィルスゲノ
ムに欠けているウィルス遺伝子の機能を発現することができる細胞上での培養に
より増殖されたヘルペスウィルスを供給し; (ii)AAV のrep 及びcap 遺伝子、並びに組換えAAV 粒子に組込まれることが
所望される異種DNA を端に有するように位置するITR を含んで成るヘルペスウィ
ルスアンプリコンを供給し;
【0026】 (iii )ヘルペスウィルスゲノムに欠いている前記必須遺伝子の機能を発現し
ない細胞に感染するために、(i )からのヘルペスウィルス及び(ii)からのア
ンプリコンを用い;そして (iv)前記異種DNA を含んで成り、そしてAAV コートタンパク質にパッケージ
ングされ、好ましくは複製−コンピテントヘルパーウィルスを有さない前記組換
えAAV ゲノムを、(iii )において感染された細胞から収穫する; 段階を含んで成る。
【0027】 本発明はまた、組換えAAV 粒子の種々の調製物、たとえば、AVV のITR 配列を
端に有し、そしてAAV コートタンパク質にパッケージングされ、ヘルパーウィル
スを有さず、そして/ 又はアデノウィルスを有さず、そして/ 又は感染性複製−
コンピテントヘルパーウィルスを有さず、そして/ 又は複製―欠陥ヘルペスウィ
ルスを含むが、しかし複製−コンピテントヘルペスウィルス又は他のヘルパーウ
ィルスを有さない、たとえば約4.5kb までのサイズの異種DNA を含んで成る組換
えAAV ゲノムの調製物を含んで成る、組換えAAV 粒子の調製物を提供する。
【0028】 本発明はまた、組換えAAV 粒子を生成するための方法、たとえばAAV のITR を
端に有し、そしてAAV コートタンパク質にパッケージングされた、約4.5kb まで
のサイズの異種DNA を含んで成る組換えAAV ゲノム(たとえば複製−コンピテン
トヘルパーウィルスを有さない)を生成するための方法を提供し、ここで前記方
法は、 (i )新たな感染性ヘルペスウィルス粒子の生成のために必須であるが、しか
しヘルペスウィルスタンパク質の一般的な発現のためには必須ではない遺伝子を
欠いているゲノムを有し、そして組換え体にされ、そしてヘルペスウィルスゲノ
ムに欠けているウィルス遺伝子の機能を発現することができる細胞上での培養に
より増殖されたヘルペスウィルスを用意し;
【0029】 (ii)AAV のrep 及びcap 遺伝子の他に、組換えAAV 粒子に組込まれることが
所望される異種DNA を端に有するように位置する、AAV のITR 配列を含んで成る
少なくとも1 つのヘルペスウィルスアンプリコンを用意し; (iii )ヘルペスウィルスゲノムに欠いている前記遺伝子の機能を発現しない
細胞に感染するために、(i )からのヘルペスウィルス及び(ii)からのアンプ
リコンを用い;そして (iv)前記異種DNA を含んで成り、そしてAAV コートタンパク質にパッケージ
ングされ、好ましくは複製−コンピテントヘルパーウィルスを有さない前記組換
えAAV ゲノムを、(iii )における感染された細胞から収穫する; 段階を含んで成る。
【0030】 本発明の他の態様によれば、上記のような特徴を有するそれらの例は、ヘルペ
スウィルスの代わりに、ヘルパーウィルスとしてアデノウィルスを用いて実施さ
れ得る。 本発明の実施に関して有用な方法及び材料の例が、さらに下記に記載されるが
、それらは例示的であって、本発明を限定するものではない。
【0031】 本発明に関して使用できる細胞系及びウィルスの例は、次の通りである:Vero
及びBHK 細胞は、European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC No.88
020401及びNo.85011423; Porton Down, UK) から得られる。CR−1及びBHK, TK
−, gH+細胞の構成は、MEG Boursnell など. (1997) J Infect Dis 175(1)pp 1
6-25; 及びX Zhang など. (1998) J Gen Virol 79(1)pp 125-131により記載され
ている。それらの細胞系は、HSV −1からのgHをコードする遺伝子を含有し、そ
して従って、非相補的細胞において、無能にされた感染性単サイクルウィルス(
DISC−HSV )であるgH−欠失HSV のための相補的細胞として作用することができ
る。CR−1細胞は、DMEMウシ胎児血清(FCS )において増殖し、そしてBHK 細胞
は5%トリプトースブイヨン(GMEM)及び10%FCS により補充されたGlasgow 変
性イーグル培地において増殖し得る。
【0032】 293 細胞は、ATCC (CCRK 1573)から入手でき、そして10%FCS を補充されたDM
EMにおいて増殖し得る。HSV −1株SC16は、よく知られた臨床学的単離物である
。RAAV及びアンプリコンストックを生成するためのヘルパーウィルスとして使用
され得る遺伝子的に無能にされたHSV 株の中には、HSV −1株SC16からそれ自体
知られている技法を用いて誘導され、そしてgH領域、及びチミジンキナーゼ(TK
)遺伝子の一部を包含する欠失を有する欠失変異体が存在するDISCウィルススト
ックは、CR−1細胞上で増殖され、そしてタイトレーションされ得る。変異体E1
a E3−欠失アデノウィルスは、よく知られている変異体であり、そして293 細胞
上でタイトレーションされ得る。
【0033】 インビトロの遺伝子供給: 本発明の態様に従ってのベクター構造体を用いての遺伝子供給は次の通りに実
施され得る: 本明細書に記載されるベクターを用いての遺伝子供給は、たとえばDISC−AAV
−gfp, rAAV 配列を含む無能にされた組換えヘルペスウィルス、そしてさらにgf
p レポーター遺伝子を用いることによって;又はpHAV6.6 アンプリコン、rep 及
びcap 遺伝子を担持するAAV アンプリコンプラスミド、並びにGFP 遺伝子をまた
含むITR を用いることによってインビトロで実施され得る。それらの両ベクター
の構成は、ここでより詳細に記載される。GFP 遺伝子は、調査目的のために有用
であり、そして他の目的のためには、ベクターの類似体がGFP 以外の対応する所
望の遺伝子、たとえば治療遺伝子、たとえば第IX因子(fIX )をコードする遺伝
子を用いて容易に構成され得る。
【0034】 Vero細胞が、5pfu/細胞のDISC−AAV −gfp 又はpHAV−6.6 アンプリコンスト
ックの細胞当たり5感染単位(IU)により感染せしめられ得る。感染段階は37℃
で20分間、行われ得る。次に、細胞は回転沈降され、そして50mlの培地により2
度洗浄され得る。感染された細胞が再懸濁され、そして1:100 の比で、感染され
ていないVero細胞と共に混合され得る。混合された細胞は、0.5 %のFCS を含む
培地を有する組織培養物容器中に再接種され得る。細胞が、緑色の蛍光の出現及
び蛍光の隣接する細胞への広がりについて、UV蛍光顕微鏡により毎日、調べられ
得る。混合された細胞が再接種された後1 日目で、多くの単一の蛍光細胞が蛍光
顕微鏡の最も暗い視野を通して散乱しているように見える。
【0035】 それらの細胞は、通常、HSベクターを含むGFP により最初から感染されている
細胞であり、そして種子細胞と命名され得る。それらの細胞はrAAV子孫を生成し
続けることができる。2日目で、蛍光パターンは、1 日目に見られるパターンに
類似する。しかしながら、細胞接種の後3日目で、それらの種子細胞を取り囲む
細胞は、緑色の蛍光発光を示し始めるように見える。この蛍光拡散は多層の隣接
する細胞を通して生じ、そして種子細胞に隣接する細胞ほど、最強の蛍光発光が
生じる。顕微鏡下で多くの試験検体の全体の蛍光パターンは、ブドウの房の形状
を幾分有するように見えた。この蛍光パターンは、試験培養物が継代しないで維
持される場合、次の数日間、及び継代されていない試験培養物における細胞の生
命が絶える前、未変化のまま存続するように見える。
【0036】 組換えDISC−AAV −gfp 及びアンプリコンpHAV−6.6 の両者は、Vero細胞培養
物において細胞から細胞に広がる性質を有さず:上記の試験並置に見られる緑色
蛍光の広がりは、種子細胞として上記で命名された細胞から生成されるrAAVの広
がりの証拠であり、次にこのrAAVは隣接する細胞中に入り、そしてそれらの細胞
中にGFP 遺伝子を供給する。 これのさらなある確認は、rAAVを含むが、しかし
rep −cap 配列を有さないベクターがその対応する実験を実施するために使用さ
れる試験により得られる。
【0037】 この場合、rAAVは、rep 及びcap 遺伝子を欠いている、DISC−AAV −gfp 又は
pHAV−6.6 のいずれかの類似体により最初に感染されたそれらの細胞から生成さ
れない。本出願までに実施された試験においては、上記試験におけるような蛍光
の広がりは見出されていない。予測されるように、蛍光拡散は、初期の混合され
た細胞培養物が設定された後5日間まで観察されない。この結果はさらに、1−
段階の感染された種子細胞から生成されるrAAV(rep +cap +ベクターを用いて
の)が周囲の細胞に広がるとする結論を確かめる。従って、2−段階遺伝子供給
がインビトロで示され得る。
【0038】 インビボでの2−段階遺伝子供給: 2−段階遺伝子供給が、動物モデルとしてマウスを用いて、インビボで前記方
法に類似する方法を実施することによって生存組織に示され得る。 エクスビボ方法は次の通りに実施され得る:この方法においては、マウス線維
芽細胞系L929が、それぞれ、5pfu/ 細胞のDISC−AAV −gfp, DISC −AAV −fIX,
又はアンプリコン構造体pHAV−6.6 およびpHAV−6.8 によりインビトロ感染され
得る。
【0039】 感染は37℃での20分間、行われ得る。次に、細胞は培地により十分に洗浄され
得る。その後、処理された細胞を、マウス中に皮下注射する。遺伝子発現は、GF
P 遺伝子を含む構造体による処理の場合、UV蛍光顕微鏡下でGFP について組織断
片を試験することによって、又は第IX因子遺伝子を含む構造体により処理の場合
、第IX因子タンパク質について免疫組織化学的染色を通してモニターされ得る。
第IX因子遺伝子の発現はまた、実験動物から集められた血液サンプルに対して第
IX因子についての通常のELISA アッセイによりモニターされ得る。インビボ2−
段階遺伝子供給は、インビトロで示されるパターンと類似するGFP 拡散パターン
の出現により、又は動物から集められた血液における長期の第IX因子発現により
示され得る。
【0040】 RAAV原液生成のためへのDISC−AAV およびアンプリコン−AAV の利用: 本明細書において開示されるようなDISC−AAV 及びアンプリコン−AAV 構造体
が、ヘルパーウィルスに汚染を有さないか又は実質的に有さない高い力価の組換
えアデノ−関連ウィルス(rAAV)ストックを生成するために使用され得る。
【0041】 ヒト遺伝子治療のためのrAAV(組換えAAV )の開発に直面する問題は、rAAVス
トックの生成のための現在入手できるパッケージングシステムの低い効率であっ
た。rAAVベクターを生成するための現在使用される方法は、細胞、たとえばよく
知られており、且つ入手できる293 細胞中の、パッケージングプラスミドと共に
rAAV配列を含む組換えベクターの同時トランスフェクションを含んで成る。続い
て、細胞は、感染のAAV 溶液相のためのヘルパーウィルスとして使用するよう、
アデノウィルスにより感染される。
【0042】 そのベクタープラスミドは、興味ある遺伝子、及びITR を端に有する転写制御
要素を含むことができる。前記パッケージングプラスミドは、ITR 配列を除いて
、完全なAAV ゲノム配列を含むことができる。トランスフェクトされた細胞にお
いては、ITR を端に有するrAAVゲノムが切除され、複製され、そしてパッケージ
ングプラスミドからトランス型で供給されるcap タンパク質から構成されるウィ
ルス粒子中にキャプシド封入される。このパッケージングシステムに使用される
ヘルパーウィルスは、たとえばアデノウィルスE1欠失変異体であった。
【0043】 そのような現在のパッケージングシステムに関する問題は次のことを包含する
:(1)高い力価のrAAVを有するストックを生成することは困難である。このシ
ステムからのrAAVの典型的な収率は、10cmの培養プレート当たり約105 コロニー
形成単位(cfu )であり得る。従って。通常の研究のために十分な量のrAAVを得
るためには、典型的には、100 以上のプレートがトランスフェクトされる必要が
あり、これは労働集約的であり、且つ時間がかかり過ぎる。収穫されたウィルス
は、使用のために力価が十分に高くあるように、カラムクロマトグラフィーによ
り濃縮されるべきである。
【0044】 (2)この段階で生成されるストックは通常、追加の継代により拡張され得な
い。個々のストックは通常、トランスフェクションにより生成されるべきである
。(3)感染性ヘルパーアデノウィルスの汚染(wtアデノウィルスの可能性ある
汚染により)とは、広範な分離方法が初期ストック分離に続いて必要とされるこ
とを実際上は意味することができる。日常、3回の浮遊密度超遠心分離が、汚染
されたヘルパーウィルスを、検出できないレベルまで除去するために必要とされ
得る。そのような精製方法は、時間の浪費のみならず、またrAAV力価の有意な損
失も引き起こすことができる。
【0045】 rAAVのためのパッケージング細胞系を確立する手段において存在すると思われ
る困難性は、rep タンパク質の細胞毒性にあると思われる。最近、誘発性プロモ
ーター(メタロチオネインプロモーターまたはAd誘発性プロモーター)下でrep
を発現する細胞系は報告されている。そのような細胞系においてさえ、ヘルパー
アデノウィルスがまだ必要とされ、そして従って、ヘルパーウィルスの汚染の問
題が残っている。
【0046】 本発明の一定の態様においては、遺伝子的に無能にされたヘルペスウィルス、
たとえばWO92/05263(Immunology Limited : Inglie など)に記載されるような
ウィルスは、rAAVのためのヘルパーウィルスとして使用され得る(アデノウィル
スの代わりに、アデノウィルス及びHSV の両者はAAV 溶解性感染のためのヘルパ
ーとして使用することができるので)、そしてヘルペスウィルスアンプリコンま
たは無能にされたヘルペスウィルスは、rAAVパッケージングの機能を提供するた
めに(トランス形で)、AAV rep 及びキャプシドをコードする遺伝子を担持する
ことができる。
【0047】 初期rAAV原液は、トランスフェクション又はウィルス感染を通して、及び好ま
しくは、DISC−HSV のための相補的細胞、たとえばBHK またはVero相補的細胞系
におけるアンプリコンプラスミドDNA によるトランスフェクションにより生成さ
れ得る。本発明の観点によれば、そのようなストックは、相補的細胞の感染を通
しての続く継代により容易に拡張され得、そしてしばしば、生成において利点を
付与することができる。
【0048】 次にそのようなストックは、結局ヘルペスウィルスヘルパーのための非−相補
的細胞、たとえば(非−相補的)Hela又はVero細胞において継代され得る。その
ような非−相補的細胞における一回の継代の後、rAAVのパッケージングは影響さ
れないが、しかし感染性欠陥ヘルペスウィルス及びアンプリコンは、そのような
段階において、容易に除かれ得、その結果、感染性ヘルパーウィルス粒子を有さ
ないか又は実質的に有さないストックが調製され得る。このシステムが上記問題
を克服できることが予測される。
【0049】 本発明の態様を製造するために有意な詳細な実験方法の例は次の通りである: rAAVストックを次の通りにアンプリコン構造体から生成することができる:BH
K, TK −, gH+細胞を、リポフェクタミン(Gibco BRL からの)によるpHAV−5.
8 により感染せしめることができる。2μg のアンプリコンプラスミドDNA を20
0 μl の無菌水に添加し、そして10μl のリポフェクタミンを無菌水により20倍
に希釈する。このようにして得られたDNA 及びリポフェクタミン溶液を軽く混合
し、そして室温で30分間、放置する。次に、1.6ml のOptimem 培地(製造業者に
より供給されるような)を、前記DNA −リポフェクタミン混合物に添加する。
【0050】 細胞を、血清を有さない培地によりすすぎ、そしてDNA −リポフェクタミン混
合物を細胞上に軽く被覆する。37℃で5時間のインキュベーションの後、そのト
ランスフェクション溶液を除去し、そして5mlのGMEM+5%FCS により置換する
。次に、細胞を37℃でさらに16時間インキュベーションすることができる。次に
、その得られる細胞を、1pfu/細胞の遺伝子的に欠陥のHSV (特に(gH+細胞が
使用される場合)、本明細書においてまたはWO92/05263に記載されるgH−HSV 1
ウィルス)により、さらに24時間、感染せしめる。ウィルスを収穫し、そしてヘ
ルパーウィルスの力価についてプラークアッセイにより滴定する。
【0051】 このウィルスストックをさらに、BHK, TK −, gH+細胞において、2〜3度継
代し、そして最後の継代はVero細胞において行われる。個々の継代に関しては、
細胞を1pfu/細胞のウィルス(PS1の力価に基づく)により感染せしめる。次に
、rAAV力価を、たとえばアッセイ目的のために、Vero細胞を一連の希釈されたウ
ィルス溶液により感染せしめることによって滴定することができる、そしてGFP
陽性細胞を、UV蛍光顕微鏡下で計数することができる。予備結果は、1×109
どの高い力価を有するrAAVが第1段階、すなわちpHAV−6.6 のトランスフェクシ
ョン、続くgH−HSV の超感染から生成され得る。
【0052】 rAAVストックをまた、次の通りに、gH−HSV −AAV 組換えウィルスから生成す
ることができる。VeroまたはHela細胞を、AAV −gtp 配列(下記に記載される)
を含むgH−HSV 1により、1pfu/細胞で1時間、感染せしめることができる。次
に、1%FCS を含む培地を添加し、そして感染体をさらに24時間放置する。ウィ
ルス収穫物を、DISC−HSV の出現についてプラークアッセイによりタイトレーシ
ョンする。rAAV力価を上記に類似する手段で定量化することができる。
【0053】 適切な組換えヘルペスウィルスのためのベクターの構成を次の通りにして実施
することができる: 組換えアデノ−関連ウィルスAAV が、完全なAAV −2ゲノムを含む出発材料プ
ラスミドpAV 1として使用して得られ、そして寄託番号ATCC No.37215 として、
The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland からの市販に基
づいて公的に入手できる。次のrDNA操作がそれ自体知られている態様で実施され
得る:
【0054】 完全なAAV −2ゲノムを、制限酵素BglII によりプラスミドpAV 1から切除し
、そしてプラスミドpuc119中にクローン化する。その得られるプラスミドをpucA
V 1と命名する。プラスミドpucAV 1をSnaBI 及びPpuMI により共同消化し、AA
V コード配列を除去するが、しかし5' ITR (AAV 配列のヌクレオチド1 −191)及
び3'ITR ( ヌクレオチド4494−4675) は損なわないで残す。
【0055】 得られる配列を用いて、緑色の蛍光タンパク質(GFP )をコードするマーカー
遺伝子によりrAAV配列を含むプラスミドを構成することができる。GFP の増強さ
れたバージョンを含むプラスミドpEGFP −N 1は、Clontechから市販されている
(カタログ6085−1)。 3755bp のDNA フラグメントを、AseI及びBsaIを用いて
のpEGFP −N 1の共同消化から生成し、そしてそのフラグメントはCMV プロモー
ターGFP −ポリA 及びネオマイシンカセットを含む。これを、SnaBI 及びPpuMI
により上記のように消化されているpucAV 1中にブラント−末端連結によりクロ
ーン化し、その結果、GFP 及びネオマイシン−含有DNA フラグメントは、AAV IT
R を端に有する。この得られるプラスミドをpTR −CMVgfpと命名する。
【0056】 pucAV 1の消化生成物をまた用いて、選択の治療用遺伝子と共にrAAVを含むプ
ラスミドを構成する。治療用遺伝子、たとえば血餅第IX因子(血友病B を処理す
るための)をコードする遺伝子(それ自体知られており、そして入手できる)を
、GFP についての上記のような類似する手段でrAAV ITRカッセト中にクローン化
することができる。これが第IX因子についての遺伝子を用いて実施される場合、
その得られるプラスミドをpTR −fIX と命名する。 より一般的には、rAAV配列を、次の順序で、AAV5'LTR, 選択の適切な哺乳類プ
ロモーター、興味ある遺伝子(たとえば、上記例におけるGFP 又は第IX因子のた
めの遺伝子)、ポリ−A シグナル及びAAV3'LTR含むDNA フラグメントとして製造
することができる。
【0057】 rAAV配列を含むHSV アンプリコンプラスミドを次の通りにして構成できる: GFP 又は第IX因子のいずれかにより、上記のようにして製造されたrAAV配列を
、それらを担持するそれぞれのプラスミドから、pVUIおよびAseIの両者による消
化により切除し、そして特許出願WO96/29421(Lynxvale Ltd and Cantab Pharma
ceuticals Research Ltd: Efstathiou, Inglis and Zhang)に記載のようにして
得られるアンプリコンプラスミドpW7TK におけるユニークSapI部位中にブラント
−末端連結する。その得られるアンプリコンプラスミドを、それぞれpHAV−5.6
及びpHAV−5.8 と命名する。
【0058】 rAAV配列及びAAV rep 及びcap コード配列の両者を含むHSV アンプリコンを次
の通りにして構成することができる: 適切なプラスミドを次のとおりにして構成する:rep 及びcap 遺伝子生成物コ
ードするための領域を包含するAAV 配列を、BalI消化によりpAV 1から切除し、
そしてpHAV−5.6 のScaI部位及びpHAV−5.8 のユニークSapI部位中にクローン化
することができる。その得られるアンプリコンプラスミドをそれぞれpHAV−6.6
及びpHAV−6.8 と命名する。
【0059】 アンプリコンストックを次の通りにして生成することができる:最初に、pHAV
−6.6 又はpHAV−6.8 のいずれかからのアンプリコンプラスミドDNA を、リン酸
カルシウム沈殿又はリポフェクタミン(Gibco FRL からの)のいずれかにより、
CR−1細胞(gH−HSV 1ウィルス収容することができるgH+組換え相補的哺乳類
細胞)中にトランスフェクトする。細胞を、5cmのペトリ皿に、トランスフェク
ションの1 日前、接種することができる。
【0060】 リン酸カルシウム沈殿に関しては、8μg のDNA を、0.5ml のHepes 緩衝溶液
(HEBS)pH7.05及び70μl のCaCl2 と共に室温で30分間、混合する。培養培地を
除去し、そしてDNA 沈殿物を細胞に添加する。細胞を37℃で40分間インキュベー
トし、その後、トランスフェクション混合物を除き、そして4mlのGMEM+5%FC
S 溶液により置換する。細胞を37℃でさらに4時間インキュベートし、その後、
HEBS中、25%のDMSO溶液1mlにより、正確に4分間処理する。次に、DMSO溶液を
除き、そして細胞を血清を有さない培地により洗浄する。5mlのGMEM+5%FCS
を添加し、そして細胞を37℃でさらに16時間インキュベートする。リポフェクタ
ミン トランスフェクションを、供給者の説明書に従って実施する:2μg のア
ンプリコンプラスミドDNA を、200 μl の無菌水に添加し、そして10μl のリポ
フェクタミンを無菌水により20倍に希釈する。
【0061】 DNA 及びリポフェクタミン溶液を一緒に軽く混合し、そして室温で30分間放置
する。次に、1.6ml のOptimem 培地(製造業者により供給されるような)を、前
記DNA −リポフェクタミン混合物に添加する。細胞を、血清を有さない培地によ
りすすぎ、そしてDNA −リポフェクタミン混合物を細胞上に軽く被覆する。37℃
で5時間のインキュベーションの後、トランスフェクション溶液を除去し、そし
て5mlのGMEM+5%FCS により置換する。細胞を37℃でさらに16時間インキュベ
ートし、そして次に1pfu/細胞のps1によりさらに24時間、感染せしめる。
【0062】 次に、ウィルスを収穫し、そしてプラークアッセイにより滴定する。このウィ
ルス原液を、BHK, TK −, gH+細胞において、1〜3度、さらに継代する。個々
の継代に関しては、細胞を3〜5pfu/細胞のウィルスにより1時間感染せしめる
(PS1の力価に基づく)。次に、0.6mM のメトトレキセート及び1×TGAG(40×
TGAG:0.6mM のチミジン、3.8mM のグリシン、9mMのアデノシン、1.9mM のグア
ノシン)を含む選択培養物を添加し、そして感染された細胞を37℃で24〜48時間
、培養し、その後、収穫し、そして所望により、タイトレーションする。
【0063】 rAAV及びAAV rep −cap コード配列の両者を含む組換えgH−HSV 1ウィルスを
次の通りにして構成することができる: 本発明のベクターの構成における中間段階として、必須遺伝子、たとえばgH−
HSV −1を欠いている欠失HSV ウィルスを構成することが便利である。本発明の
例においては、欠失されたgH遺伝子の遺伝子座中に所望する異種DNA の後期挿入
を促進するために、HSV 1gH遺伝子を欠き、そしてgH遺伝子座でPacI部位を含む
欠失HSV 1を製造する。PacI制限部位は、それが野生型HSV ゲノムを切断しない
ので、その便利さのために、本明細書において好ましい。
【0064】 そのような変異体gH−HSV 1を、rAAV及びrep −cap 配列を担持するために、
又はアンプリコン原液生成のためのヘルパーウィルスとして、本発明の目的のた
めに使用することができる。挿入されるべき外来性DNA は、選択された、及び必
要なら、ウィルスにおける提案された挿入部位(本明細書においては、PacI部位
である)で挿入された便利な制限部位に対応する制限部位を端に有し(それ自体
知られているrDNA操作技法を用いて)、そして次に所望する新規の組換えウィル
スを生成するためにgH−HSV 1遺伝子中に連結され得る。
【0065】 (感染性の新規ウィルス粒子の生成のために必須の遺伝子を欠いている遺伝子
的に欠陥のヘルペスウィルスに基づくワクチンは、WO92/05263(Immunology Lim
ited: Inglisなど)及びつい最近の出版物に記載されている。gH遺伝子は、その
ような変異体ウィルスにおける欠失のための必須の糖タンパク質H(gH) 遺伝子の
好ましい例である。また、Forrester など., J. Virol. 66, 341-348, 1992も参
照のこと。gH−HSV 1の感染性原液を、引用される文献に記載される、内因性gH
を発現する相補性細胞において増殖することができる。子孫のウィルス粒子は、
正常な細胞(すなわち、ウィルスgHを発現するように製造されていない非−相補
性細胞)に起因するが、しかしそれらは感染性ではない。)
【0066】 gH−HSV 1欠失変異体の生成のために使用されるプラスミドを次の通りにして
構成することができる: 最初に、HSV gH遺伝子のいずれかの側のフランキング配列を、Vent DNAポリメ
ラーゼを用いて、ポリメラーゼ鎖反応(PCR )によりHSV −1株KOS(M)ウィルス
DNA から増幅し、そして生成物を、EcoRI −HindIII により切断されたpUC119中
にクローン化する。その得られるプラスミドを、pIMMB25 と命名し、そして使用
されるさらなるプラスミドの詳細は、WO96/29421(上記に引用され、そして引用
により本明細書中に組込まれる)に記載されるプラスミドpIMMB25 に関しての通
りである。
【0067】 その中間に、2つのPacI制限酵素を含む、配列JM1 Oligo 5' CGA TTA ATT AA
G TTA ACT AGA AGA CAA TAG CAG GCA TGC TGG GGA TGC GGT TAA TTA AGA 3'及び
JM2 Oligo5' TCT TAA TTA ACC GCA TCC CCA GCA TGC CTG CTA TTG TCT TCT AGT
TAA CTT AAT TAA TCG 3'を含んでなる合成オリゴヌクレオチドを、gHフランキン
グ配列の中間に位置するpIMMB25 のHpaI部位中にクローン化することができる。
その得られるプラスミドを、pIMMB −lacZPac と命名することができる。CMV プ
ロモーター、lacZ遺伝子及びポリA シグナルを含むDNA カッセトを、pAMP−lacZ
−ciから切断し、そしてpIMMB −LacZPac におけるHapI部位中にクローン化し、
その結果、それはPacI部位を端に有する。その得られるプラスミドを、pIMX−18
と命名することができる。
【0068】 組換えウィルスを、プラスミドpIMX−18によるタイプIHSV(株sc16)ウィルス
DNA のトランスフェクションにより構成することができる。ウィルスDNA を、ヨ
ウ化ナトリウムグラジエント((1976)Virology 74, 256-258に記載のような)
上で精製することができる。組換えを次の通りにして実施することができる:ト
ランスフェクション混合物を、5μg のウィルスDNA 、0.5 μg の線状化された
プラスミドDNA (制限酵素ScaIによる消化により線状化された)を、1mlのHEBS
緩衝液(137mM のNaCl, 5mM のKCl, 0.7mMのNa2 HPO4, 5.5mM のグルコース, 20
mMのHepes, pH7.05 )において混合することによって、調製することができる。
【0069】 70μl の2M のCaCl2 を滴下し、そして軽く混合する。培地を、CR1又はCR1
細胞の副−集密性5cm皿から除去し、そして500 μl のトランスフェクション混
合物を、2つの皿の個々に添加する。細胞を37℃で40時間インキュベートし、次
に、5%ウシ胎児血清(FCS )を含む増殖培地4mlを添加する。トランスフェク
ション混合物の添加の4時間後、培地を除去し、そして細胞を血清を有さない培
地により洗浄する。次に、細胞を、皿当たり15%グリセロール500 μl により2
分間、“衝撃”を与えることができる。次に、グリセロールを除去し、細胞を血
清を有さない培地により2度洗浄し、そして5%のFCS を含む増殖培地を添加す
る。
【0070】 4〜7日後、又は十分なウィルス細胞障害効果(CPE )が観察される場合、細
胞を培地に削り取り、2500rpm で4℃で5分間、回転沈降せしめ、そしてイーグ
ル最少必須培地(EMEM)120 μl に再懸濁する。これは現在、野生型及び組換え
ウィルスを含む粗ウィルス原液を生成する。その原液を凍結し、融解し、そして
音波処理し、そして有用な範囲の希釈度でCR1細胞に対する組換え体についてス
クリーンすることができる。
【0071】 ウィルス希釈溶液の添加の後、細胞を、1%の低−ゲル化−温度アガロースを
含む培地により被覆することができる。約3日でのウィルスプラークの出現の後
、330 μg/mlのXgalを含むアガロースの第2 被覆を添加する。青色プラークを48
時間以内に取り、そしてCR1細胞を含む24−ウェル皿に移す(ウェル当たり1cm
2 )。プラークを、十分なCPE への増殖を可能にし、そして培地中に削り取りに
より収穫する。複数回のプラーク−精製を、ウィルスの純粋な原液が得られ、又
は他の所望する精製段階が達成するまで、実施することができる。
【0072】 組換え体の構造を次の通りにして確かめることができる:ヨウ化ナトリウム精
製されたウィルスDNA を前記のようにして調製し、そしてBamHI により消化する
。この消化物をアガロースゲル上で分離し、そしてナイロン膜に移す。これを、
gH遺伝子のいずれかの側の配列に対して相同の放射性ラベルされたDNA フラグメ
ントによりプローブする。
【0073】 そのgH遺伝子座で単一のPacI部分を含む、そのようにして得られたgH−HSV1ウ
ィルスを、DISC−HSVPacと命名することができる。Rep −cap 及びrAAVの両者の
DISC−HSVPacウィルス中への挿入を次の通りして実施することができる。2つの
PacI部位を含むプラスミドを、NruI及びSacIにより切断されたpRC/CMV中に最初
に転結されるDISC−HSVPacを構成するために使用されるのと同じリンカーの助け
により製造することができる。得られるプラスミドを、pIMJ1と命名することが
できる。
【0074】 rep −cap 配列を、次の通りにしてpIMJ1中にクローン化することができる:
プラスミド、たとえばpAV 1のBaI フラグメント(AAV −2の完全なrep −cap
配列を含む)を、ポリメラーゼ処理によりブラント末端化し、そしてpIMJ1のユ
ニークHpaI部位中に連結し、その結果、rep −cap 配列は、新規プラスミドにお
けるPacI部位を端に有する。このプラスミドを、pIMJ−repcapと命名する。
【0075】 次に、PacI部位を端に有する、rAAV及びrep −cap 配列の両者を含むプラスミ
ドを、制限酵素PvuI及びAseIを用いて、プラスミドpTR −CMVgfp及びpTR −fIX
からGFP 又は第IX因子のいずれかを含むrAAV配列を切断することによって製造し
、そしてpIMJ−rep −cap におけるBbsI部位中にブラント末端連結し、その結果
、rAAVカセットがrep −cap 配列の次に存在し、そしてまた、pacI部位を端に有
する。それらのプラスミドを、それぞれpAAV−Pac −gfp 及びpAAV−Pac −fIX
と命名する。
【0076】 rAAV及びrep −cap 配列を、次の通りにしてDISC−HSVPacウィルス中に挿入す
ることができる:rAAV−repcapカセットを、pAAV−Pac −gfp 又はpAAV−Pac −
fIX から切断し、そしてDISC−HSVPacウィルス中に連結する。全方法は、上記挿
入方法に類似する。従って、たとえばrAAV配列を含むDISC−ウィルスを、DISC−
HSV のgH遺伝子座中にrAAVベクター配列を挿入することによって製造することが
できる。たとえば、AAV TRを端に有するGEP カセットを、PvuI及びBsaIによる消
化によりpTR −EGFP(上記のような)から除去し、そしてプラスミドpIMJ−1中
にクローン化し、その結果、AAV ベクター配列は、制限酵素PacIのための認識配
列を端に有するようになる。
【0077】 次に、完全なAAV ベクター配列をPacIにより切除し、そしてたとえばgH(欠失
)遺伝子座でDISCPac ウィルス中にクローン化することができる。連結されたDN
A を、CR−1細胞中にトランスフェクトし、そして組換えウィルスを、連続プラ
ーク精製により回収する。ウィルス子孫を、rep −cap DNA 及びGFP 、又は場合
によっては、第IX因子を含むDNA 配列の両者から製造されるプローブによるサザ
ンハイブリダイゼーションにより組換えウィルスについてスクリーンすることが
できる。新しく構成された組換えウィルスを、DISC−AAV −gfp (それぞれのrA
AVカセットに由来するGFP を含む)及びDISC−AAV −fIX (それぞれのrAAVカセ
ットに由来する第IX因子遺伝子を含む)と命名する。
【0078】 ウィルスストックを−70℃で貯蔵し、そして上記調製物及び方法に使用され得
る。組換えAAV 対アデノウィルス: 本発明の他の例においては、rAAVを生成するためのヘルパーウィルス及びベク
ターとして使用するための適切な組換えアデノウィルスのためのベクター構成を
、次の通りにして実施することができる: rDNA操作を、それ自体知られている態様で実施することができる:
【0079】 アデノウィルスタイプ2を、ATCC(カタログ番号VR−846 )から入手し、そし
てたとえば、HeLa細胞を感染するために使用し、そしてDNA を、感染された細胞
から、フェノール抽出、続くエタノール沈殿により単離する。次に、AD−2DNA
を制限酵素SacII により消化し、そしてその得られる358vp のフラグメントを、
ゲル電気泳動を用いて単離する。次にAd−2複製起点及びパッケージングシグナ
ルを含む358vp のフラグメントを、プラスミドpneb−193 のSmaI制限部位中に連
結し、そしてその得られるプラスミドをpADV−1と命名する。プラスミドpneb−
193 は、カタログ番号305 −1として、New England Biolab から入手できる。
【0080】 次に、組換えAAV 配列及びAAV rep 及びcap 遺伝子を、次の通りにしてプラス
ミド、ADV −1中に挿入することができる: プラスミドpTR −fIX (上記の)及びpTR −EGFPは、rAAV配列を含み、そして
それらのrAAV配列を、制限酵素PvuI及びAseIを用いてのそれらのプラスミドのい
ずれかの消化により単離することができる。プラスミドpTR −fIX を前記のよう
にして構成し、そしてプラスミドpTR −EGFPを次の通りにして構成する:GFP カ
セットをプラスミドpEGFP −N1(Clontech, カタログ番号6085−1)から除去し
、そしてPvuI及びBsaIを用いて、続いて、PpuMI 及びSnaBI による完全な消化に
よりpucAV 1中にクローン化し、pTR −EGFPを創造する。その得られるAAV 配列
を、プラスミドpADV−1のユニークBamHI 部位中へのブラント−末端連結により
クローン化する。その得られるプラスミドを、pADV−2と命名することができる
【0081】 Rep 及びcap 遺伝子生成物をコードする領域を包含するAAV 配列を、BalI消化
によりpAVIから切除し、そしてpADV−1のユニークBamHI 部位中にブラント末端
クローン化する。その得られるプラスミドを、pADV−3と命名することができる
。 組換えAAV ストックを次の通りにして生成することができる:最初に、293 細
胞を、5cmのペトリ皿において、トランスフェクションの1 日前、接種する。次
に、293 細胞を、上記のような製造業者の説明書に従って、リポフェクタミン(t
m)を用いて、プラスミドpADV−2及びpADV−3によりトランスフェクトする。
【0082】 プラスミドのトランスフェクションの24時間後、293 細胞を、Ad−2ヘルパー
ウィルスにより、2の感染多重度(MOI )で感染せしめることができる。最後に
、Ad−2ヘルパーウィルス感染の約2〜3日後、293 細胞は、rAAV及び汚染性ア
デノウィルスを含む粗ウィルス原液を生成する。その原液を、56℃での加熱に、
1時間ゆだね、汚染性アデノウィルスを不活性化する。得られるrAAVの力価を、
生成されるrAAV原液のサンプルの一連の希釈溶液による単層のHeLa細胞の感染に
より、続いて2の感染の多重度(MOI )でのアデノウィルス感染により決定する
ことができる。
【0083】 他の構造体をまた製造し、そして本発明に従って使用することができる。 上記の調製物及び方法に関して製造され、そして使用され得る組換えヘルペス
ウィルス及びヘルペスウィルスアンプリコンに基づくプラスミド及び組換えウィ
ルス構成のさらなる例は、次のものを包含する:
【0084】 技法への使用のためのrep 及びcap 遺伝子のさらなる構造体を、次の通りにし
て製造することができる:pucAV を、PpuMI により部分的に消化し(2つの部位
で、すなわち1つはnt191 で及び他の1つはnt351 で)、そして次に、SnaBI に
より完全に消化する。Rep 及びcap 配列を含むPpuMI −SnaBI フラグメントを単
離し、そしてpW7TK (アンプリコンプラスミド)のSapI部位、又はpIMJ−1(非
−アンプリコン、すなわちpuc119由来のプラスミド)のHpaI部位のいずれか中に
クローン化することができる。それらの新しく構成されたプラスミドを、それぞ
れ、pHAV−7.3 (十分な長さの4303bpのPpuMI −SnaBI フラグメント、及び損な
われていないrep 及びcap 遺伝子を含むアンプリコン)、pHAV−7.3del(切断さ
れた4143bpのフラグメント、N −末端−欠失のrep 及び損なわれていないcap を
含むアンプリコン)、及びpHAV−5.6 (損なわれていないrep 及びcap 遺伝子を
含む非−アンプリコンプラスミド)と命名することができる。
【0085】 AAV ベクタープラスミドの構成のためのさらなる方法においては、GFP カセッ
トを、pEGFP −N 1(CLONTECHカタログ番号6085−1)から、AseI及びBsaIによ
り除去し、そしてPpuMI 及びSnaBI により十分に消化されたpucAV 1中にクロー
ン化し、プラスミドpTR −EGFPを創造することができる。GFP をコードし、そし
てAAV TRを端に有する配列を、PvuI及びBsaIによりpTR −EGFPから除去し、そし
てpHAV−7.3 中にクローン化し、pHAV−4.1 (AAV ベクター配列及びrep 及びca
p 遺伝子の両者を含むアンプリコン)を創造し、又はpW7 −TKのSapI部中にクロ
ーン化し、pHAV−5(AAV ベクター配列のみを含むアンプリコン)を創造する。
AAV ベクター配列及びrep −cap 遺伝子を含む非−アンプリコンプラスミドを構
成するために、十分な長さの4303bpのPpuMI −SnaBI を、pTR −EGFPのTR配列の
外側にクローン化し、pHAV−9.3 を創造する。
【0086】 rAAVの生成: 小規模rAAV調製物に関しては、2.5 ×105 個の細胞を、それらがトランスフェ
クションの日に70−80%の集密性になるように、それらがさらなる使用のために
必要とされる1 日前、6ウェルプレート中に接種することができる。次に、細胞
を、リポフェクタミン(tm)/DNA複合体(Life Techndogies)によりトランスフェ
クトすることができる。BHK 細胞(gH+又はgH−)のトランスフェクションのた
めに、1μg のプラスミドDNA (100 μl のOPTI−MEM(tm), Life Technologyに
おける)を、10μl のリポフェクタミン(tm) 脂質(100 μl のOPTI−MEM(tm)
における)と共に混合し、そしてその混合物を室温で30分間放置する。
【0087】 この時間の最後で、合計体積を、OPTI−MEM(tm) により1mlに補充し、そして
その混合物を、6−ウェルプレートにおけるOPTI−MEM(tm) −洗浄された細胞に
適用することができる。5時間後、そのトランスフェクション混合物を除去し、
そして10%FCS を含む増殖培地2mlを添加する。細胞を次の日、細胞当たりプラ
ーク形成単位(pfu )のDISC−HSV により感染せしめる。細胞障害工程の完結後
(24〜36時間)、ウィルスをプレートに削り取ることによって収穫することがで
きる。293 細胞に関しては、トランスフェクションを同じ手段で実施するが、但
し、細胞はアデノウィルス、たとえば野生型アデノウィルス型5により、細胞当
たり2の感染の多重度(MOI )で感染せしめ、そしてウィルスを通常、48−72時
間で収穫することができる。
【0088】 両者の場合、細胞を、ベンチ−トップ遠心分離機による低速度遠心分離により
集め、そして血清を有さない培地1mlに再懸濁する。ウィルスを、水浴音波処理
機による1分間の音波処理により、収穫された細胞から開放することができる。
細胞溶解物を、短時間、遠心分離し、不溶性残骸を除去し、そして上清液を集め
る。汚染性HSV 及びアンプリコン粒子を、56℃で20分間インキュベートすること
によって完全に不活性化することができる(プラークアッセイにより確認され得
る)。リポフェクチン(tm)/ インテグリン標的化ペプチド/DNA(LID )トランス
フェクション複合体を、Hartなど.1998 により記載のようにして製造することが
できる。
【0089】 BHK 細胞のトランスフェクションのために、複合体を、次の3種の成分:ペプ
チド6([K16] GACRRETAWACG)、プラスミドDNA 及びリポフェクチン(tm)(Life
Technologies )を、0.75:4:1の重量比で軽く混合することによって製造す
ることができる。rAAVをタイトレーションするために、粗細胞溶解物又は精製さ
れたウィルスの希釈溶液を、6−ウェルプレート上に接種された細胞に添加した
。細胞を、3pfu/細胞のDISC−HSV 、又は293 細胞が使用される場合、2のMOI
でのアデノウィルスのいずれかにより超−感染せしめることができる。GFP 陽性
細胞を、超−感染の後16時間で、計数することができる。rAAVがヘルパーウィル
スの超−感染を伴わないで滴定される場合、GFP 陽性細胞を、初期rAA 感染の2
〜3日後、計数することができる。
【0090】 インビボ適用のためのrAAVの精製: 高度に精製されたストックの生成のためには、107 個のBHK 細胞を、ヘルパー
ウィルスとしてのDISC−HSV 、及びベクターゲノム及びrep 及びcap 遺伝子をコ
ードする別々のアンプリコン(pHAV5 及びpHAV7.3 )を用いて、上記のようにし
てトランスフェクトすることができる(リポフェクタミン(tm)/DNA複合体)。24
−36時間後、溶解工程の完結で、細胞を遠心分離により収穫し、そして反復して
の凍結−融解により溶解することができる。
【0091】 AAV ベクター原液を、連続した塩化セシウムグラジエントから精製し、HEPES
緩衝溶液に対して透析し、限外濾過(Microcon30)により濃縮し、そして56℃に
20分間、加熱し、残留DISCOHSVを不活性化する。トランスダクション力価を、2
のMOI でのrAAVgfp 及び野生型Ad5 の一連の3通りの希釈溶液によるHeLa細胞の
同時−感染により決定することができる。24時間後、gfp +細胞を蛍光顕微鏡に
より標価することができる。合計2mlの粗細胞溶解物におけるrAAV力価は、1mL
当たり1 ×109tu であり得る。精製及び超遠心分離の後、合計体積200 μl にお
ける力価は、mL当たり1 ×109tu であり得る。
【0092】 ヘルペスアンプリコンプラスミドの生成: rAAV粒子の有用な収率は、rAAVベクター配列及びrep 及びcap 遺伝子の両者が
HSV アンプリコンベクターに組込まれる場合に得られる。一連のHSV −由来のア
ンプリコンプラスミドを構成することができる。GH遺伝子座におけるrAAVベクタ
ー配列をコードする組換えDISC−HSV ベクターをまた構成することができる(DI
SC−AV2.1 )。AAV rep 及びcap 遺伝子を得るために、pucAAV1(完全なタイプ
−2 AAVゲノム)をPpuMI により部分的に消化し、そしてSnaBI により完全に消
化することができる。
【0093】 これは次の2種のAAV TR−マイナスDNA フラグメントを生成することができる
:損なわれていないrep 及びcap 発現カセットを包含する、4303bpのフラグメン
ト(wtAAV ゲノムのnt191 −4493)、及びp 5プロモーター及びrep のN −末端
配列が欠失されている、4143bpのフラグメント(wtAAV ゲノムのnt351 −4493)
。両DNA フラグメントを、それぞれ、pHAV7.3 及びpHAV7.3delを創造するために
、HSV アンプリコンプラスミドpW7TK 中にクローン化することができる。PHAV−
7.3delを、rAAV野生成の間、rep −対照として使用することができる。緑色蛍光
タンパク質(gfp )発現カッセトをコードする配列を、PpuMI 及びSnaBI により
前もって消化されたpucAAV1中にクローン化し、その結果、rAAVと、rep 及びca
p をコードするAAV ヘルパー構造体との間に配列オーバーラップは存在しない。
【0094】 続いてTRを端に有するカセットを、pW7TK 中にクローン化し、pHAV5 を創造し
、又はpHAV7.3 中にクローン化し、pHAV−4.1 を創造することができる(ここで
、AAV rep 及びcap 遺伝子AAV ベクター配列の両者が単一のアンプリコンプラス
ミドに組込まれている)。さらに、TRを端に有するGFP カセットを、DISC−HSV
−1の欠失されたgH遺伝子座中の挿入し、DISC−AV2.1 を創造することができる
。従来のプラスミドに基づく同様の構造体をまた構成することができる(pTR −
EGFP, pHAV−5.6 及びpHAV9.8 )。
【0095】 HSV アンプリコン及びDISC−HSV ヘルパーウィルスからのrAAVの生成: 形質導入するrAAV粒子を生成するハイブリッドHSV −AAV の能力を試験するた
めに、許容できる生成物細胞を、プラスミドの組み合わせによりトランスフェク
トし、そして十分なヘルパーウィルスにより感染せしめ、あらゆる細胞における
複製及び溶菌を確保することができる。組換えウィルスを、細胞障害工程の完結
で収穫することができる(BHK 細胞におけるDISC−HSV ヘルパーウィルスのため
には24−36時間、又は293 細胞におけるAdヘルパーウィルスのためには48−72時
間)。回収されたrAAVの量を、上記のようにして、粗細胞溶解物におけるgfp+形
質導入単位(tu)として滴定することができる。
【0096】 最高の収率が、ヘルパーウィルスとしてDISC−HSV を用いて、及びベクターゲ
ノム及びヘルパーAAV ゲノムを、別々に(pHAV−5及びpHVA−7.3 )、又は単一
のアンプリコン上に組み合わされて(pHAV−4.1 )、コードするHSV アンプリコ
ン構造体を用いて得られる。PHAV−5及びpHAV−7.3 の組み合わせに関しては、
1000tu以上のrAAVが、個々のトランスフェクトされた細胞のために生成され得る
。理論的には確かではないが、別々のアンプリコン上へのAAV ベクターゲノム及
びヘルパーAAV ゲノムの組み込みが、両者とも、改良されたrAAV回収率に寄与す
ることができると思われる。
【0097】 同じアンプリコン(pHAV−4.0 )上にrAAVベクター配列及びAAV ヘルパーゲノ
ムの両者を組込むことは、又はDISCウィルス自体(DISC−AV2.1 )の一部として
ベクターゲノムを組込むことは、ほとんど好ましくはない。BHK 生成体細胞のト
ランスフェクション効率(リポフェクタミン( 商標)/アンプリコンDNA 複合体に
関して、平均10%−15%である)を改良するために、既知の効果的なLID ベクタ
ーシステムを用いて、両プラスミドを供給することができる。この方法によれば
、25%の細胞がトランスフェクトされ得、そしてrAAVの収率はトランスフェクト
された細胞当たり約4000tuであり、このことは、個々の細胞のトランスフェクシ
ョンの効率がまた増強され得ることを示唆する。
【0098】 これまでに実施された一定の例においては、別々のHSV −アンプリコンプラス
ミドによりトランスフェクトされ、そしてヘルパーウィルスとしてのDISCにより
感染された細胞から回収できるrAAVの収率は、ヘルパーとしてAdを用いて、293
細胞において同じ構造体から生成される収率よりも高く、そしてまた、従来のプ
ラスミドによりトランスフェクトされたBHK 細胞から回収された収率よりも高い
ことが見出された。
【0099】 インビボでの細胞のトランスダクションのためのrAAVの調製: インビボ使用に関しては、gfp をコードするrAAVが、ヘルパーとしてpHAV−5,
pHAV −7.3 及びDISCウィルスを用いて精製され得る。セシウムグラジエント精
製及び超遠心分離の後、rAAVが、200 μl の合計体積において、1ml 当たり約1
×109tu の力価で得られる(AdによるHela細胞の同時感染により測定される)。
Adの不在下での形質導入力価は、約80倍低い。
【0100】 本発明のベクターはまた、本明細書に記載されるアンプリコン培養方法を包含
する、引用により本明細書中に組込まれるWO96/29421明細書(lynxvale Ltd & C
antab Pharmaceuticals Research Ltd: Efstathiou, Inglis, and Zhang: "Vect
ors for gene delivery")に記載される手段に類似する手段で適用され得る。 本明細書に記載される発明は、当業者に明らかであろう追加の修飾及び変更を
受けやすい。本発明の開示は、請求の範囲を包含する前述の記載及び引用された
出版物に言及され、又は記載される特徴の組み合わせにまた拡張することに向け
られる。本明細書に引用される文献は、それらの全体を引用により組込まれる。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年4月17日(2000.4.17)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG, BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,D K,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM ,HR,HU,ID,IL,IS,JP,KE,KG, KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO ,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,UA,U G,US,UZ,VN,YU,ZW Fターム(参考) 4B024 AA01 CA01 CA04 CA11 EA02 GA11 HA17 4B065 AA95Y AB01 BA02 CA24 CA44 4H045 AA10 BA10 CA01 CA03 EA20 FA72 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 アデノ−関連ウィルス(AAV )のためのヘルパーウィルスと
    して作用することができる粒子、及び標的宿主細胞に供給するための少なくとも
    1つの選択された核酸配列を含み、そしてさらにタンパク質及び複製機能をコー
    ドするDNA (i )を含んで成る粒子を含む感染性ウィルス粒子の調製物であって
    、前記調製物中の粒子が第1標的細胞に感染する場合、前記機能は、前記選択さ
    れた核酸配列を含んで成る感染性組換えAAV 粒子のアセンブリー及び第1標的宿
    主細胞からの開放のために十分であり、それにより、前記感染性組換えAAV 粒子
    が、次に第2標的宿主細胞に感染し、そして前記感染された標的宿主細胞におけ
    る前記DNA (i )の発現を引き起こすことができることを特徴とする調製物。
  2. 【請求項2】 感染性ヘルペスウィルスアンプリコン及び/ 又は新たな感染
    性ヘルペスウィルス粒子の生成のために必須の遺伝子に関して無能にされた変異
    体ゲノムを有する感染性変異体ヘルペスウィルスを含んで成る調製物であって、
    前記選択された核酸配列をコードする組換えアデノ−関連ウィルスにより感染さ
    れる場合、前記タンパク質及び複製機能をコードする調製物が、前記第1標的宿
    主細胞から開放される、第2標的細胞への供給のための、前期組換えアデノ−関
    連ウィルスの感染性粒子の、前記第1標的宿主細胞からのアセンブリー及び開放
    を可能にするために(前記調製物により感染される場合、第1標的宿主細胞にお
    いて)十分である請求項1記載の調製物。
  3. 【請求項3】 前記ウィルス粒子が、正常な宿主細胞において新規の感染性
    ウィルス粒子(組換えAAV ウィルス以外の)を生成することができるウィルス粒
    子を有さない請求項1又は2記載の調製物。
  4. 【請求項4】 (a )正常な宿主細胞において新規の感染性ヘルペスウィル
    ス粒子の生成のために必須の遺伝子機能を欠いており、そして (b )(i )AAV のITR 配列を端に有する、たとえば約4.5kb までのAAV に対
    して非相同のDNA 、及び(ii)AVV ITR 配列を端に有する以外の位置において少
    なくとも部分的にコードされるAVV rep 及びcap 遺伝子をコードするDNA を含ん
    で成る、感染性組換えヘルペスウィルス粒子及び/ 又はヘルペスウィルスアンプ
    リコン粒子の調製物であって、 前記両DNA (i) 及びDNA (ii)が、ウィルス粒子により感染される細胞内で複製
    することができるよう、複製のヘルペスウィルス起点(oriS)に関連して、及び
    任意にはまた、ヘルペスウィルス パッケージングシグナル(pac )に関連して
    位置し、 その結果、前記粒子が正常な宿主細胞である第1標的細胞を感染する場合、ヘ
    ルペスウィルス又はヘルペスウィルスアンプリコンの新規感染性粒子は生成され
    ないが、しかし前記ウィルス粒子により感染された前記第1標的細胞は、AAV コ
    ートタンパク質にパッケージングされ、そして前記第1細胞からのそれらの開放
    後の、第2標的細胞を感染し、そして前記感染された第2標的細胞において前記
    DNA (i )の発現を引き起こすが、しかし前期第2感染された標的細胞から新規
    感染性ウィルス粒子を生ぜしめることができない、前記DNA (i )を含んで成る
    組換えAAV 粒子を生ぜしめることができることを特徴とする調製物。
  5. 【請求項5】 前記DNA (i )及びDNA (ii)が同じヘルペスウィルス粒子
    又は同じヘルペスウィルスアンプリコンにコードされる請求項4記載の調製物。
  6. 【請求項6】 前記DNA (i) 及びDNA (ii) が、異なったヘルペスウィルス
    、又はヘルプスウィルスアンプリコン粒子によりコードされる請求項4 記載の調
    製物。
  7. 【請求項7】 前記DNA (i )が第1ヘルペスウィルスアンプリコンにより
    コードされ、そして前記DNA (ii)が第2ヘルペスウィルスアンプリコンにより
    コードされる請求項6記載の調製物。
  8. 【請求項8】 前記DNA (i )及びDNA (ii)が感染性新規ヘルペスウィル
    ス粒子の生成のために必須の遺伝子を欠いている変異体ゲノムを有するそれぞれ
    の感染性変異体ヘルペスウィルスにより両者ともコードされる請求項6記載の調
    製物。
  9. 【請求項9】 前記DNA (ii)をコードする感染性新規ヘルペスウィルス粒
    子の生成のために必須の遺伝子を欠いている感染性変異体ヘルペスウィルスを含
    んで成り、そしてさらに、前記DNA (i )をコードするヘルペスウィルスアンプ
    リコン粒子を含んで成る請求項6の調製物。
  10. 【請求項10】 前記DNA (i )をコードする感染性新規ヘルペスウィルス
    粒子の生成のために必須の遺伝子を欠いている感染性変異体ヘルペスウィルスを
    含んで成り、そしてさらに、前記DNA (ii)をコードするヘルペスウィルスアン
    プリコン粒子を含んで成る請求項6の調製物。
  11. 【請求項11】 前記DNA (i )及び/ 又は(ii)が変異体ヘルペスウィル
    スによりコードされ、そして前記必須遺伝子の欠失の部位で挿入される請求項4
    記載の調製物。
  12. 【請求項12】 前記選択された核酸配列が、レポーター遺伝子、たとえば
    gfp 遺伝子又はLacZ遺伝子、又はその機能的フラグメントをコードする遺伝子を
    含んで成る請求項1〜11のいずれか1項記載の調製物。
  13. 【請求項13】 前記選択された核酸配列がさらに、追加の異種核酸、たと
    えば組織特異的プロモーター、たとえばアルブミンプロモーター又はニューロン
    エノラーゼプロモーターを含んで成る請求項1〜12のいずれか1項記載の調製
    物。
  14. 【請求項14】 前記標的細胞に供給するための前記選択されたDNA が、ヒ
    ト又は非ヒト動物において免疫応答を引き起こすことができる抗原をコードする
    請求項1〜13のいずれか1項記載の調製物。
  15. 【請求項15】 前記選択された核酸配列が、サイトカイン又は他の免疫調
    節タンパク質、たとえばIL-2をコードする遺伝子を含んで成る請求項1〜13の
    いずれか1項記載の調製物。
  16. 【請求項16】 前記選択された核酸配列が、治療用タンパク質、たとえば
    第IX因子をコードする遺伝子を含んで成る請求項1〜13のいずれか1項記載の
    調製物。
  17. 【請求項17】 免疫応答を誘発し、又は修飾するための前記抗原、又はサ
    イトカインもしくは免疫調節たんぱく質をインビボ発現するために細胞感染への
    使用のための請求項14又は15記載の調製物。
  18. 【請求項18】 標的細胞における欠陥又はミッシング遺伝子を置換するた
    めの遺伝子供給方法の使用のためへの請求項16記載の調製物。
  19. 【請求項19】 AAV のITR 配列を端に有し、そしてAAV のrep 遺伝子、又
    は前記第1標的細胞により生成される前記組換えAAV 粒子により感染される場合
    、前記第2標的細胞のDNA 中への前記DNA の組み込みを引き起こすのに十分であ
    るrep 遺伝子の副配列により付随される、約4.5kb までのサイズのAAV に対して
    非相同であるDNA を組み込んでいる請求項1〜16のいずれか1項記載の調製物
  20. 【請求項20】 ヘルパーウィルスを有さない、たとえば複製−コンピテン
    トヘルパーウィルスを有さない、たとえば新規の感染性ヘルペスウィルス粒子の
    生成のために必須の遺伝子を欠いている感染性変異体ヘルペスウィルスを含む請
    求項1〜16のいずれか1項記載の調製物による宿主細胞の感染により生成でき
    る、異種DNA を含んで成り、そしてAAV コートタンパク質にパッケージングされ
    た感染性組換えAAV (アデノ−関連ウィルス)ゲノムの調製物。
  21. 【請求項21】 異種DNA を含んで成り、そしてAAV コートタンパク質にパ
    ッケージングされた、たとえば複製−コンピテントヘルパーウィルスを有さない
    組換えAAV ゲノムの生成方法であって、 (i )新規感染性ヘルペスウィルス粒子の生成のために必須の遺伝子を欠いて
    いるゲノムを含んで成り、そして組換え体を製造し、そしてヘルペスウィルスゲ
    ノムに欠けているウィルス遺伝子の機能を発現することができる細胞に対する培
    養により増殖されるヘルペスウィルスを供給し; (ii)AAV のrep 及びcap 遺伝子を含んで成り、そしてさらに、組換えAVV 粒
    子に組み込まれることが所望される異種DNA 、及び前記異種DNA を端に有するよ
    う位置するITR を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンを供給し; (iii )ヘルペスウィルスゲノムに欠けている前記必須遺伝子の機能を発現し
    ない細胞を感染するために、(i )からのヘルペスウィルス及び(ii)からのア
    ンプリコンを用い;そして (iv)前記異種DNA を含んで成り、そしてAAV コートたんぱく質にパッケージ
    ングされ、好まししくは複製−コンピテントヘルパーウィルスを有さない前記組
    換えAAV ゲノムを、(iii )における感染された細胞から収穫する段階を含んで
    成る方法。
  22. 【請求項22】 AVV のITR 配列を端に有し、そしてAAV コートタンパク質
    にパッケージングされ、ヘルパーウィルスを有さず、そして/ 又はアデノウィル
    スを有さず、そして/ 又は感染性複製−コンピテントヘルパーウィルスを有さず
    、そして/ 又は複製―欠陥ヘルペスウィルスを含むが、しかし複製−コンピテン
    トヘルペスウィルス又は他のヘルパーウィルスを有さない、たとえば約4.5kb ま
    でのサイズの異種DNA を含んで成る組換えAAV ゲノムの調製物を含んで成る、組
    換えAAV 粒子の調製物。
  23. 【請求項23】 対象における又は細胞の培養物における遺伝子発現をモニ
    ターするための方法であって、 (i )前記対象又は前記培養物に、請求項1〜16のいずれか1項記載の調製
    物を投与し、ここで標的細胞に供給するための前記DNA がレポーター遺伝子を含
    んで成り;そしてその後、 (ii)前記レポーター遺伝子のインビボ又はインビトロ発現のために前記対象
    又は前期培養物からの細胞を、対応するレポーター遺伝子生成物の検出により、
    たとえばELISA または蛍光の検出により、たとえば蛍光顕微鏡によりモニターす
    る段階を含んで成る方法。
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