JP2001500015A

JP2001500015A - Ｔ７ポリメラーゼを利用する組換えアデノ随伴ウイルスの誘導可能な製造方法

Info

Publication number: JP2001500015A
Application number: JP10512963A
Authority: JP
Inventors: ウイルソン，ジエイムズ・エム; チエン，ナンシー
Original assignee: トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2001-01-09
Also published as: IL128780A0; CA2264482A1; AU4183397A; WO1998010088A1; EP0931158A1; AU722624B2

Abstract

(57)【要約】組換えＡＡＶの効率的な製造方法が記述される。一局面において、３種のベクターが宿主細胞中に導入される。第一のベクターはＴ７ポリメラーゼの発現を指図する。第二のベクターはＴ７プロモーターの制御下にｒｅｐおよびｃａｐをもつ。第三のベクターはＡＡＶのＩＴＲにより隣接されるミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶカセットを含有する。第二の局面において、宿主細胞は、必要とされるベクター成分の一をもつプラスミドを含有するよう安定にトランスフェクションされ、そしてこの宿主細胞が二重トランスフェクション／感染される。

Description

【発明の詳細な説明】Ｔ７ポリメラーゼを利用する組換えアデノ随伴ウイルスの誘導可能な製造方法発明の背景アデノ随伴ウイルスは複製の不完全なパルボウイルスであり、そのゲノムは長さ約4.6kbであり、145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を包含する。ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムは複製（ｒｅｐ）およびビリオン形成（ｃａｐ）の原因である遺伝子を含有する。この非病原性のヒトウイルスがヒト細胞に感染する場合、ウイルスゲノムが第 19染色体に組込まれ細胞の潜伏感染をもたらす。感染性ウイルスの産生およびウイルスの複製は、細胞がアデノウイルスもしくはヘルペスウイルスのような溶菌ヘルパーウイルスで共感染されない限り起こらない。ヘルパーウイルスの感染により、ＡＡＶのプロウイルスがレスキューされかつ増幅され、そしてＡＡＶおよびヘルパーウイルスの双方が産生される。ＡＡＶは、外来性ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする独特の特徴を保有する。多様なグループが、疾患状態の治療におけるＡＡＶの潜在的使用を研究してきた。しかしながら、ＤＮＡの送達のためのＡＡＶの使用に対する障害は、組換えゲノムの包膜化のための高度に効率的な方法の欠如である。コティン(R．Kotin)、 Hum．Gene Ther.、5:793-801(1994)を参照。さらに、ｒｅｐ遺伝子産物は細胞に対し毒性であり、従って高レベルで発現され得ない。例えば、以前に知られた方法は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノムでの宿主細胞のトランスフェクション、次いで野生型ＡＡＶおよびアデノウイルスでの共感染を使用する。しかしながら、この方法は野生型ＡＡＶの容認できない高レベルにつながる。汚染する野生型ＡＡＶもしくはヘルパーアデノウイルスの非存在下でのｒＡＡＶとの細胞のインキュベーションは、組換え遺伝子発現をほとんど伴わない。また、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子産物の非存在下では、組込みは非効率的であり、かつ第19染色体に向けられない。バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７Ｐｏｌ）はＴ７の第１遺伝子の産物であり、これはその応答するプロモーター配列を特異的に認識し得、かつ、高転写酵素活性を表し得る［チャンバーリン(M．Chamberlin)ら、Natur e、228:227-231(1970)；ダン(J．Dunn)とシュトゥディエール(F．Studier)、J． Mol．Biol.、166:447-535(1983)；およびモファット(B．Moffatt)ら、Cell、49: 221-227(1987)］。それは、大腸菌(E．coli)［テイバー(S．Tabor)とリチャードソン(C．Richardson)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、82:1074-1078(1985)；シュトゥディエール(F．Studier)とモファット(B．Moffatt)、J．Mol．Biol.、189 :113-130(1986)］、組換えワクシニアウイルスに感染した真核細胞［フュェルスト(T．Fuerst)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、83:8122-8126(1986)；ラムゼイ・イーウィング(A．Ramsey-Ewing)とモス(B．Moss)、J．Biol．Chem.、271:16 962-16966(1996)］、および哺乳類細胞［リーバー(A．Lieber)ら、Nucl．Acids Res.、17:8485-8493(1989)］におけるタンパク質の異種発現に使用されている。必要とされるものは、パッケージング細胞に対するｒｅｐの毒性に関連する問題を回避するｒＡＡＶの効率的な製造方法である。発明の要約本発明は、Ｔ７ポリメラーゼを利用するｒＡＡＶの効率的な製造のための誘導可能な方法を提供する。Ｔ７Ｐｏｌはλファージ由来であり、また、そのプロモーターは哺乳類の細胞で活性でない。従って、ｒｅｐ／ｃａｐの発現は、これらの遺伝子をＴ７プロモーターの制御下に置くこと、そして、Ｔ７Ｐｏｌをトランスにもしくは誘導可能なプロモーターの制御下に提供することにより制御され得る。従って、本方法は、ｒＡＡＶを産生する従来技術の方法を非効率的にするｒｅｐの毒性の影響を回避する。本発明の方法はｒＡＡＶの大規模での製造にとりわけ適し、これは遺伝子治療で使用されるべきｒＡＡＶベクターに望ましい。一局面において、本発明は３種のベクターを利用するｒＡＡＶの製造方法を提供する。第一のベクターは、トランスフェクションもしくは感染の後に宿主細胞中でＴ７ポリメラーゼを発現することが可能である。第二のベクターは、Ｔ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含んで成る（Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐ）。第三のベクターは、選択されたトランス遺伝子に隣接する５’および３’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含有するカセットを含んで成る。これら３種のベクターを含有する宿主細胞が、組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で培養され、そしてｒＡＡＶが回収される。別の局面において、本発明は、宿主細胞が、三重感染系(triple infection sy stem)で使用される系の３成分の１種で安定にトランスフェクションされる方法を提供する。残りの成分は上述されるように宿主細胞中に導入される。一態様において、本発明は、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有するベクター、ならびに５’および３’のＡＡＶのＩＴＲにより隣接される選択されたミニ遺伝子を含むカセットを含有するベクターが、Ｔ７ポリメラーゼを発現する宿主細胞中に導入される方法を提供する。宿主細胞は、その後、ｒＡＡＶの産生を可能にする条件下で培養される。別の態様において、本発明は、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有するプラスミドで安定にトランスフェクションされた宿主細胞を利用する方法を提供する。Ｔ７ｐｏｌを含有するベクター、ならびに、５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲを含むカセットを含有するベクターが宿主細胞中に導入される。宿主細胞はｒＡＡＶの産生を可能にする条件下で培養される。さらに別の態様において、本発明は、レスキュー可能なｒＡＡＶカセットで安定にトランスフェクションされた宿主細胞を利用する方法を提供する。Ｔ７ｐｏｌを含有するベクターおよびＴ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有するベクターが宿主細胞中に導入される。宿主細胞はｒＡＡＶの産生を可能にする条件下で培養される。なお別の局面において、本発明は、三重感染系で使用される系の３成分の２種で安定にトランスフェクションされた宿主細胞を利用する方法を提供する。残りの成分がその後、上述されるように宿主細胞中に導入される。さらなる局面において、本発明は、三重感染系で使用される系の３成分で安定にトランスフェクションされた宿主細胞を利用する方法を提供する。この局面において、Ｔ７Ｐｏｌが誘導可能なプロモーターにより制御される。さらにさらなる一局面において、本発明は、本発明の方法に従って製造されるｒＡＡＶを提供する。本発明の他の局面および利点は、その好ましい態様の以下の詳述される記述にさらに記述される。図面の簡単な説明図１は、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスの構築の概略の図解を提供する。図２は、Ｔ７プロモーターの制御下にＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含有する組換えプラスミドの構築の概略の図解を提供する。図３は、Ｔ７プロモーターの制御下にｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスの構築の概略の図解を提供する。図４は、組換えハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスの構築の概略の図解を提供する。発明の詳細な記述本発明は、とりわけ遺伝子の送達および移転に有用な組換えＡＡＶベクターの効率的な製造のための誘導可能な方法を提供する。とりわけ、本発明は、毒性のしかし必要なｒｅｐ遺伝子の発現がＴ７プロモーターにより制御されるＡＡＶの製造方法を提供する。従って、一局面において、ｒＡＡＶの製造のための本発明の方法は、Ｔ７プロモーターの制御下のＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにＡＡＶのＩＴＲにより隣接される選択されたミニ遺伝子を含有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カセットを宿主細胞中に導入することを必要とする。Ｔ７ｐｏｌをコードする遺伝子の導入に際して、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐ構築物からのｒｅｐタンパク質の高レベル発現が誘導され、また、細胞は大規模で成長されうる。ｒｅｐ発現が所望される場合、細胞は、Ｔ７プロモーターに作用するＴ７ポリメラーゼを発現させられる。これは、目的の遺伝子をもつｒＡＡＶの効率的な複製およびパッケージングを助長する。宿主細胞は、上の要素を含有するベクターで三重トランスフェクション（もしくは感染）されうる。あるいは、必要とされる要素の１種もしくはそれ以上を発現しかつ残りの要素でトランスフェクション／感染されうる宿主細胞が利用される。別の代替において、系の全３要素を安定に発現する宿主細胞が利用され、そして、Ｔ７ｐｏｌが誘導可能なプロモーターの制御下に置かれ、これは、ｒｅｐ／ｃａｐの発現が制御されることおよび細胞に対する毒性の影響の回避を可能にする。本発明の方法で使用されるベクター成分のそれぞれについて、アデノウイルス構築物が現在のところ好ましい。しかしながら、本明細書に提供される情報および既知の技術を使用すれば、当業者は、宿主細胞中で所望の遺伝子の発現をさせることが可能な異なるウイルス（アデノウイルスもしくは非アデノウイルス）またはプラスミドのベクターを容易に構築し得る。例えば、非分割細胞(non-divid ing cell)を感染させることのそれらの無能力のために好ましさはより少ないとは言え、この系で必要とされる要素、例えばＴ７ポリメラーゼをもつベクターが、レトロウイルスを使用して容易に構築されうる。従って、本発明は、Ｔ７ p ｏｌ、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐ、もしくはＡＡＶカセットを宿主細胞中に導入する目的上選択されるウイルスもしくはプラスミドにより制限されない。望ましくは、最低１種のベクターは、パッケージングを可能にするのに必要なヘルパー機能を提供するウイルスである。あるいは、ヘルパー機能は、コトランスフェクションされたアデノウイルスもしくはヘルペスウイルスにより提供されうる。これらのベクターを宿主細胞中に導入するのに適する技術が下に論考され、また、当業者に既知である。本明細書で使用されるところの「宿主細胞」は、本明細書で記述される条件下でＴ７ｐｏｌおよびＴ７／ｒｅｐ／ｃａｐの発現ならびにこのカセットを含有するｒＡＡＶのパッケージングを可能にする、好ましくは哺乳類のいずれかの細胞（細胞系）である。適するパッケージング細胞は既知であり、また、当業者により容易に選択されうる。Ａ．三重感染／トランスフェクション上に述べられたように、組換えＡＡＶの集成(assembly)およびパッケージングに使用される宿主細胞は、プラスミドベクターでトランスフェクションされうるか、もしくは、この系の必要とされる成分を含有するウイルスベクターに感染されうる。１．Ｔ７Ｐｏｌベクター好ましい一態様において、第一のベクターは適するプロモーターの制御下にＴ７Ｐｏｌの遺伝子を含有する。下の実施例５において、核局在化されたＴ７Ｐｏｌの遺伝子が、公的に入手可能なプラスミドから得られる［シュトラウス(M ．Strauss)、Nucleic Acids Res.、17:8485-8493(1989)］。しかしながら、当該遺伝子は、あるいは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(America n Type Culture Collection)（ｐＴＦ７−３−、受託番号第４８４９４４号）を包含する他の商業的および学術的供給源から得られうる。ジーンバンク(GenBank )受託番号第Ｍ３０３０８号もまた参照。望ましくは、Ｔ７ｐｏｌの遺伝子は、慣習的技術を使用して、ダン(Dunn)、Gene、68:259-266(1988)に記述されるもののような核局在化シグナルに連結される。望ましくは、Ｔ７Ｐｏｌは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター／エンハンサーの制御下にある［例えば、ボスハルト(Boshart)ら、Cel l、41:521-530(1985)を参照］。しかしながら、他の適当なプロモーターが当業者により容易に選択されうる。有用なプロモーターは構成性プロモーターもしくは調節される（誘導可能な）プロモーターであってよく、これは発現されるべきトランス遺伝子の量の制御を可能にすることができる。例えば、別の適するプロモーターは、制限なしに、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーター／エンハンサーを包含する。さらに他のプロモーター／エンハンサー配列が当業者により選択されうる。加えて、ベクターは、そのベクターでトランスフェクションされた細胞中でＴ７Ｐｏｌの発現をさせるのに必要な他の慣用の調節要素もまた包含する。こうした調節要素は当業者に既知である。２．Ｔ７／Ｒｅｐ／Ｃａｐベクター本系の第二のベクター成分は、Ｔ７プロモーターの制御下にｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は多様な既知の供給源から得られることができる。例えば、シェンク(T．Shenk)、J.Virol.、61:3096-3101(198 7)（プラスミドｐｓｕｂ２０１内にＡＡＶ２ゲノムを提供する）；ラスビー(E.W ．Lusby)ら、J．Virol.、41:518-526(1982)およびスムダ(J．Sumda)とカーター( B.J．Carter)、Virology、184:310-318(1991)を参照。同様に、Ｔ７プロモーター配列［ダン(J.J．Dunn)とシュトゥディエール(F.W ．Studier)、J．Mol．Biol.、166:477-535(1983)］は、多様な商業的および学術的供給源から得られうる。好ましい一態様において、ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列をさらに含有する。発明者らは、この配列が遺伝子発現を５ないし10倍増大させると考える。加えて、ベクターは、このベクターでトランスフェクションされた細胞中でｒｅｐ／ｃａｐの発現をさせるのに必要な慣習的調節要素もまた包含する。こうした調節要素は当業者に既知である。３．ｒＡＡＶカセット（鋳型）第三のベクター成分は、ＡＡＶのＩＴＲにより隣接されるミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶカセットを含有する。下により詳細に論考されるように、こうしたミニ遺伝子は、適するトランス遺伝子、プロモーター、およびトランス遺伝子の発現に必要な他の調節要素を含有する。使用されるＡＡＶ配列は、好ましくは、シスに作用する５’および３’の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に制限される［例えば、"Handbook of Parvoviruses" 、ティサー(P．Tijsser)編、ＣＲＣプレス(CRC Press)中のカーター(B.J．Car ter)、pp.155-168(1990)を参照］。望ましくは、本質的には、ＩＴＲをコードする143bpの配列全体がベクター中で使用される。これらの配列の若干の程度の小さな修飾がこの使用に許されることが期待される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は当該技術の熟練内にある。例えば、サンブルック(Sambrook)ら、"Molec ular Cloning．A Laboratory Manual"、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1989)のような教科書を参照。あるいは、ＩＴＲの機能性断片を使用することが望ましいことができる。こうした断片は当業者により決定されうる。ＡＡＶのＩＴＲ配列は、現在同定されているヒトＡＡＶの型を包含するいずれかの既知のＡＡＶから得られうる。同様に、他の動物を感染させることが既知のＡＡＶもまた、本発明のベクター構築物で使用されうる。ＡＡＶの選択は以下の発明を制限することが予期されない。多様なＡＡＶ株すなわちタイプ１〜４が、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能か、もしくは、多様な商業的および団体の供給源から要求により入手可能である。以下の例示的態様において、ＡＡＶ−２が便宜上使用される。５’および３’のＡＡＶのＩＴＲ配列は、選択されたトランス遺伝子配列および随伴する調節要素から構成されるミニ遺伝子に隣接する。このベクターのトランス遺伝子配列はＡＡＶ配列に対し異種の核酸配列であり、目的のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする。当該トランス遺伝子は、トランス遺伝子の転写を可能にする様式で調節成分に操作可能に連結される。このトランス遺伝子配列の組成は、生じるベクターを向けることができる使用に依存することができる。例えば、ある型のトランス遺伝子配列はレポーター配列を包含し、発現に際して検出可能なシグナルを生じる。こうしたレポーター配列は、制限なしに、大腸菌(E．coli)β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）ｃＤＮＡ)アルカリホスファターゼ遺伝子および緑蛍光タンパク質遺伝子を包含する。これらの配列は、それらの発現をさせる調節要素と連合される場合に、慣習的手段、例えば、紫外波長の吸光度、可視的な色変化、などにより検出可能なシグナルを提供する。より好ましいトランス遺伝子配列は、宿主細胞中で所望の遺伝子産物を発現する治療的遺伝子を包含する。これらの治療的核酸配列は、典型的には、インビボもしくはエクスビボで患者に投与されて遺伝的もしくは非遺伝的遺伝子欠損を置き換えもしくは矯正しうる、または後生的な障害もしくは疾患を治療しうる産物をコードする。トランス遺伝子配列の選択は本発明の制限とならない。上で同定された主要素に加え、ミニ遺伝子は、ＡＡＶカセットをもっベクターでトランスフェクションされた細胞中でトランス遺伝子の発現をさせるのに必要な慣用の調節要素もまた包含する。かように、このミニ遺伝子は、トランス遺伝子に連結されかつミニ遺伝子内すなわちベクターのＡＡＶのＩＴＲ配列の間に配置される選択されたプロモーターを含有する。トランス遺伝子の発現を仲介するプロモーターの選択は慣例の事柄であり、かつ、ベクターの制限とならない。有用なプロモーターは、第一のベクター成分に関して上で論考されるものを包含する。ミニ遺伝子はまた、望ましくは、転写物の効率的なポリアデニル酸化に必要とされるシグナルを提供する配列、ならびに機能性のスプライスドナーおよびアクセプター部位をもつイントロンを包含する異種核酸配列を含有する。本発明の例示的ベクターで使用される共通のポリＡ配列はパポバウイルスＳＶ−４０由来のものである。ポリＡ配列は、一般的には、トランス遺伝子配列の後かつ３’のＡＡＶのＩＴＲ配列の前に挿入される。共通のイントロン配列もまたＳＶ−４０由来であり、かつ、ＳＶ−４０Ｔイントロン配列と称される。本発明のミニ遺伝子は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列とトランス遺伝子との間に配置されるこうしたイントロンもまた含有しうる。これらのおよび他の共通のベクター要素の選択は慣習的であり、また、多くのこうした配列が利用可能である［例えば、サンブルック(Sambrook)ら、およびその中に引用される参考文献を参照］。ミニ遺伝子に隣接するＡＡＶのＩＴＲを含有するｒＡＡＶベクターは、プラスミドの基幹(backbone)上に担持さることができ、そして選択された宿主細胞をトランスフェクションするのに使用されうるか、もしくは、それが選択された宿主細胞を感染させることを可能にするウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）により隣接されうる。適するＡｄ／ＡＡＶ組換えウイルスは既知の技術に従って製造されうる。例えば、ＷＯ９６／１３５９８、ＷＯ９５／２３８６７およびＷＯ９５／０６７４３を参照。これらは本明細書に引用により組み込まれる。Ｂ．二重感染／トランスフェクションＴ７ｐｏｌを安定に発現する細胞系が構築されることができ、そしてその後、以下の表に具体的に示されるように、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有するベクターおよびｒＡＡＶカセットを含有するベクターで二重トランスフェクション（もしくは感染）されうる（Ｉｎｆ＝感染およびＴｘｆ＝トランスフェクション）。Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐｒＡＡＶ系ＡＩｎｆＩｎｆ系ＢＩｎｆＴｘｆ系ＣＴｘｆＩｎｆ系ＤＴｘｆＴｘｆあるいは、Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐで安定にトランスフェクションされた細胞系が、下の表に具体的に示されるように、Ｔ７ｐｏｌをもつベクターおよびｒＡＡＶカセットをもつベクターで二重トランスフェクション（感染）されうる。Ｔ７ＰｏｌｒＡＡＶ系ＥＩｎｆＩｎｆ系ＦＩｎｆＴｘｆ系ＧＴｘｆＩｎｆ系ＨＴｘｆＴｘｆさらに別法において、レスキュー可能なｒＡＡＶカセットを含有する細胞系が、以下の表に具体的に示されるように、Ｔ７Ｐｏｌを含有するベクターおよびＴ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有するベクターで二重トランスフェクション（感染）されうる。Ｔ７ＰｏｌＴ７ｒｅｐ／ｃａｐ系ＩＩｎｆＩｎｆ系ＪＩｎｆＴｘｆ系ＫＴｘｆＩｎｆ系ＬＴｘｆＴｘｆ二重トランスフェクション／感染段階で使用されるプラスミドおよびウイルスのベクターは、三重トランスフェクションおよび／もしくは感染系に関して上述されたようである。本発明の安定な細胞系は、慣用技術を使用しかつ付随する抵抗性マーカー遺伝子を介して選択される、所望の遺伝子、例えばＴ７Ｐｏｌを含有するプラスミドでの所望の細胞、例えば２９３細胞、もしくは必要とされるアデノウイルス遺伝子を発現する他のパッケージング細胞系のトランスフェクションにより製造され得る。誘導可能な発現が望ましいか構成性の発現が望ましいかに依存して、適切なプロモーターが選択されうる。例えば、Ｔ７Ｐｏｌを誘導可能に発現する宿主細胞が望ましい場合、細胞は、メタロチオネインプロモーターの制御下にＴ７Ｐｏｌを含有するプラスミドでトランスフェクションされうる。あるいは、Ｔ７Ｐｏｌを構成性に発現する宿主細胞が望ましい場合は、それはＲｓｖもしくはＣＭＶのプロモーターの制御下に挿入されうる。類似の技術が、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有する宿主細胞、およびレスキュー可能なｒＡＡＶを含有する宿主細胞を提供するために使用されうる。下の実施例は安定な細胞系の製造を記述する。しかしながら、当業者は、他の慣用技術を使用してこうした細胞系を容易に産生し得る。一般に、アウスベル(Ausubel)ら、Current Protocols in Molecular Biology（ウィレイインターサイエンス(Wiley Interscience)1987）を参照。Ｃ．単一感染／トランスフェクション本系の成分の２種を安定に発現する細胞系が構築されることができ、そしてその後、上述されたように、この系の残存する成分を含有するベクターでトランスフェクション（もしくは感染）されうる。例えば、本明細書に記述される技術を使用して、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐおよびレスキュー可能なｒＡＡＶで安定にトランスフェクションされる細胞系が利用される。この細胞系がその後、Ｔ７ｐｏｌを含有するベクターでトランスフェクションもしくは感染される。別の例として、細胞系がＴ７ｐｏｌおよびレスキュー可能なｒＡＡＶで安定にトランスフェクションされる。この細胞系がその後、Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐを含有するベクターでトランスフェクションもしくは感染される。Ｄ．Ｔ７ Pｏｌ、ｒＡＡＶおよびＴ７／ｒｅｐ／ｃａｐを含有する細胞系本系の成分の全３種を安定に発現する細胞系が、本発明の方法で構築かつ利用されうる。既知の技術を使用して、ｒＡＡＶ、Ｔ７／ｒｅｐ／ｃａｐおよびＴ７ｐｏｌを含有する適するパッケージング細胞系が構築される。この態様において、Ｔ７Ｐｏｌは誘導可能なプロモーターの制御下に置かれる。適する誘導可能なプロモーターは当業者に既知であり、また、本明細書に論考される。例えば、Ｔ７Ｐｏｌはメタロチオネインプロモーターの制御下に置かれうる。この様式において、Ｔ７Ｐｏｌ、および従ってＴ７プロモーターの制御下にあるｒｅｐ／ｃａｐの発現が調節され得、そして細胞に対する毒性の影響が回避され得る。Ｅ．ベクターおよびｒＡＡＶの製造アデノウイルス、ＡＡＶおよびレポーター遺伝子もしくは治療的遺伝子、ならびに他のベクター要素の選択されたＤＮＡ配列の上述されたベクターへの集成は慣用技術を利用する。こうした技術は教科書［サンブルック(Sambrook)ら、上に引用される］に記述されるもののようなｃＤＮＡクローニング、アデノウイルスもしくはＡＡＶのゲノムの重なり合うオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列を提供するいずれかの適する方法を包含する。３ベクター系を使用するにしろ安定に感染した細胞を使用するにしろ、宿主細胞中へのベクターの導入は既知の技術を使用して成し遂げられる。適切な場合は、標準伯トランスフェクションおよびコトランスフェクション技術、例えば、相補性ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞系（トランス作用するＥ１ａタンパク質を提供する機能性アデノウイルスＥ１ａ遺伝子を含有するヒト腎細胞系）を使用するリン酸カルシウムトランスフェクション技術が使用される。本発明で使用される他の慣用方法は、ウイルスゲノムの相同的組換え、アガーオーバーレィ(agar overlay)でのウイルスのプラーク形成(plaquing)、シグナル発生を測定する方法、などを包含する。感染／トラスフェクションの後、宿主細胞をその後、標準的条件下で培養してｒＡＡＶの産生を可能にする。例えば、グレアム(F.L．Graham)とプレヴェ(L．P revec)、Methods Mol．Biol.、7:109-128(1991)を参照。望ましくは、ｒＡＡＶが慣用技術を使用して同定されれば、それは標準的技術を使用して単離されることができ、かつ精製されることができる。これらの実施例は本発明の好ましい方法を具体的に説明する。これらの実施例は具体的に説明するのみであり、また、本発明の範囲を制限しない。実施例１−Ｔ７Ｐｏｌアデノウイルスの構築図１は、Ｔ７ポリメラーゼをもつ組換えアデノウイルスの構築の概略図を提供する。プラスミドｐＭＴＴ７Ｎはマイケル・シュトラウス(Michael Strauss)博士から得た［リーバー(A．Lieber)ら、Nucl．Acids Res.、17:8485-8493(1989)］。ｐＭＴＴ７Ｎは、ＳＶ４０のポリアデニル酸化配列に連結されるＴ７Ｐｏｌ遺伝子に融合されるＳＶ４０ラージＴ抗原のＮ末端核局在化シグナル（Ｔ７Ｎｐｏｌ）を含有する。発現は誘導可能なマウスメタロチオネインプロモーターによりされる。ｐＭＴＴ７ＮプラスミドＤＮＡを、ＢｇｌＩＩおよびＰｖｕＩＩ制限酵素で切断し、そして断片をアガロースゲル上で分離した。ＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩのＴ７ＰｏｌのＤＮＡ断片を、ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＶ切断されたベクターｐＡｄ．ＣＭＶ．ｌｉｎｋ．１に連結してｐＡｄ．ＣＭＶ．Ｔ７Ｎを形成させた。ｐＡｄ．ＣＭＶ．ｌｉｎｋ．１は、Ｅ１ａおよびＥ１ｂの欠失されたアデノウイルス配列０ないし16交差単位を含有するプラスミドであり、そこにＣＭＶのプロモーター−ポリリンカーカセットをクローニングした。これはイェー(X．Ye)ら、J．Bio1．Chem.、271:3639-3646(1996)に記述される。ｐＡｄ．ＣＭＶ．Ｔ７Ｎにおいて、Ｔ７Ｐｏｌの発現単位はＣＭＶプロモーターにより指図される。Ｔ７Ｐｏｌ遺伝子のためのプロモーターは、アデノウイルスの０〜１交差単位（ｍｕ）および９〜16ｍｕの配列内にカセットとしてポリＡ尾部に連結される。ｐＡｄ．ＣＭＶ．Ｔ７ＮをＮｈｅＩ切断により直鎖状とし、そして、セルフェイト（Cellphate)キット（ファルマシア(Pharmacia)）を使用して、ＣｌａＩで直鎖状にされたＡｄｄｅｌ３２７基幹とともにコトランスフェクションする。トランスフェクションのおよそ１週間後、Ｔ７Ｐｏｌアデノウイルスを、さらなる精製のためプラークから単離し得る。実施例２−Ｔ７Ｐｏｌを発現する細胞系Ｔ７Ｐｏｌを安定に発現する細胞系を、リン酸カルシウム沈殿を使用する［グレアム(F．Graham)とファン・デル・エブ(A．van der Eb)、Virol.、52:456 -467(1973)］、10：１の比での２９３細胞中へのプラスミドｐＭＴＴ７ＮおよびｐＭＴＣＢ６＋（選択マーカーを提供する）［チュー(K.H．Choo)ら、DNA、5:52 9-538;Eur．J．Biochem.、174:417-424］のコトランスフェクションにより樹立する。コロニーのクローニングを１mg/mlの濃度のジェネティシン選択により実施する。得られる各クローンをｐＴ７ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドでトランスフェクションし［下の実施例３を参照］、そして亜鉛イオンでの補充による誘導に際してＲｅｐタンパク質の発現を誘導するその能力について分析する。Ｔ７Ｐｏｌを構成性に発現する安定な細胞系を樹立するため、Ｔ７ＮＰｏｌ（上述されたように、ｐＭＴＴ７ＮのＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩ切断により得られる）を、ｐＥＢＶｈｉｓ［インヴィトロジェン(Invitrogen)］のベクター中のＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩのクローニング部位でＲＳＶプロモーターの下流にサブクローニングした。ｐＥＢＶｈｉｓＴ７Ｎと呼称される生じるプラスミドを２９３細胞中にトランスフェクションし、そして400μｇ/mlの濃度のヒグロマイシンで選択した。各陽性クローンを、これらのプラスミドでトランスフェクションされた細胞でＴ７−ＬａｃＺもしくはＴ７−ｒｅｐ／ｃａｐの発現を生じさせるその能力により、Ｔ７Ｐｏｌの存在について分析する。実施例３−Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐアデノウイルスの製造本組換えアデノウイルスベクターの製造を図２および３に概略で具体的に説明する。Ａ．プラスミド構築Ｔ７プロモーター／ＥＭＣＶＵＴＲ（脳心筋炎ウイルスの非翻訳領域）の制御下の遺伝子発現のため設計されたプラスミドｐＴＭ１［モス(B．Moss)ら、Nat ure、348:91-92(1990)］を、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐを発現するためのベクターとして使用した。ｒｅｐ／ｃａｐのコーディング配列全体を、唯一のＳａｃＩ切断部位により２部分に分離し、そして下述されるようにｐＴＭ１プラスミド中にサブクローニングした。ｒｅｐの開始部位とその本来のプロモーターｐ５との間に存在する適切な制限酵素が存在しないため、ｒｅｐ配列の左端（Ｎ−ｒｅｐ）を最初にＰＣＲにより増幅した。上側(upper)プライマーの配列は配列番号２すなわちＴＡＴＴＴＡＡＧＣＣＣＧＡＧＴＧＡＧＣＴ（255の位置から274まで）であり、これは位置274にヌクレオチド置換Ａ→Ｔを導入した（下線をつけられた）。ＳａｃＩ切断部位をその後生じさせ、ｐＴＭ１へのＮ−ｒｅｐのクローニングおよびＥＭＣＶのＵＴＲの好ましい開始部位（ＮｃｏＩ切断部位内）からのＲｅｐタンパク質の同じ読み取り枠での発現を可能にした。ＰＣＲ産物（長さ739bp）をｐＣＲ２．１ベクター（インヴィトロジェン(Invitrogen)）に直接クローニングし、そしてｐＣＲ−Ｎ−ｒｅｐと命名した。ｐＴＭ−１プラスミドをＳａｃＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で切断し、そして、ＡＡＶゲノムの右端（ＩＴＲ配列を含まない）、すなわち、ｒｅｐのＣ末端部分および完全長のｃａｐ配列を含有するｐｓｕｂ２０１［サムルスキ(Samulski)ら、J．Virol.、61:3096-3101(1987)］からの3.7kbのＳａｃＩ／ＳｎａＢＩ断片と連結した。このＴ７プロモーターで駆動されるｒｅｐ／ｃａｐ構築物をｐＴ７− Ｃ−ｒｅｐ／ｃａｐと命名する。ｒｅｐの最初の535bpの配列をＳａｃＩ切断によりｐＣＲ−Ｎ−Ｒｅｐプラスミドから取り出し、そしてｐＴ７−Ｃ−ｒｅｐ／ｃａｐ中にサブクローニングした。これは同様にＳａｃＩで切断されておりかつベクターの自己連結を予防するようアルカリホスファターゼ処理にかけられている。最終構築物をｐＴ７ｒｅｐ／ｃａｐと命名し、これは、Ｔ７プロモーター／ＥＭＣＶＵＴＲの下流にｒｅｐ／ｃａｐの完全長のコーディング配列、次いでＴ７の終止配列を含有する。Ｂ．Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐアデノウイルスの産生ｐＡｄ．ｌｉｎｋはｐＡｄ．ＣＭＶ．ｌｉｎｋに類似の構築物であり、これは、その中ににＣＭＶのプロモーター−ポリリンカーカセットがクローニングされかつイェー(X．Ye)ら、J．Biol．Chem.、271:3639-3646(1996)に記述された、他のアデノウイルスベクターで記述されるようにＥ１ａおよびＥ１ｂの欠失されたアデノウイルス配列０ないし16交差単位を含有するプラスミドである。しかしながら、ｐＡｄ．ｌｉｎｋはＣＭＶプロモーターもしくはポリＡ尾部配列を含有しない。Ｔ７プロモーター、ＥＭＣＶのＵＴＲ、ｒｅｐ／ｃａｐおよびＴ７終止配列を包含する領域全体を、ＣｌａＩおよびＥａｇＩでの切断によりｐＴ７ｒｅｐ／ｃａｐから削り取り、そしてその後、以前にＣｌａＩ／ＳａｌＩ切断にかけられていたｐＡｄ．ｌｉｎｋのアデノウイルス配列中に、クレノウポリメラーゼによりＥａｇＩおよびＳａｌＩの付着末端を埋めた後にサブクローニングした。生じるプラスミドをｐＡｄ．Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐと呼称する。ｐＡｄ．Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐを、Ｔ７ｒｅｐ／ｃａｐアデノウイルスの発生のため、ＣｌａＩで直鎖状にされたＡｄ．ｄｅｌ３２７基幹ＤＮＡとともに２９３細胞中にコトランスフェクションする。実施例４−ｒｅｐ／ｃａｐを発現する細胞系ｐＴ７ｒｅｐ／ｃａｐで安定にトランスフェクションされた細胞系を、10：１の比でのｐＭＴＣＢ６＋の２９３細胞中へのトランスフェクションにより樹立し、そしてジェネティシンで選択する。各クローンを、Ｔ７Ｐｏｌを発現するプラスミドでのトランスフェクションによりｒｅｐタンパク質の存在について分析する。実施例５−組換えＡＡＶハイブリッドベクターの製造プラスミドｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺは、ＡＡＶの非構造およびキャプシドのタンパク質の存在下で複製かつパッケージングされるべきｒＡＡＶの鋳型としてはたらく。プラスミドＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺは、その中でｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子がＣＭＶプロモーターからのβ−ガラクトシダーゼを発現するミニ遺伝子で置き換えられるｒＡＡＶカセットである。ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの直鎖状配置は、（ａ）鋳型としてｐＡＶ２［ラフリン(C.A．Laughlin)ら、Gene、23:65-73(1983 )］を使用するＰＣＲにより得られる５’のＡＡＶのＩＴＲ(ｂｐ１〜173)［配列番号１のヌクレオチド番号365〜538］；（ｂ）ＣＭＶの前初期エンハンサー／プロモーター［ボスハルト(Boshart)ら、C ell、41:521-530(1985)；配列番号１のヌクレオチド番号563〜1157］、（ｃ）ＳＶ４０のイントロン（配列番号１のヌクレオチド番号1178〜1179）、（ｄ）大腸菌(E．coli)β−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡ（配列番号１のヌクレオチド番号1356〜4827）、（ｅ）ＳＶ４０のポリアデニル酸化シグナル（初期および後期双方の転写単位からの切断／ポリＡシグナルを含有する237のＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩ限酵素断片；配列番号１のヌクレオチド番号4839〜5037）、ならびに（ｆ）ＳｎａＢＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてｐＡＶ２から得られる３’のＡＡＶのＩＴＲ（配列番号１のヌクレオチド番号5053〜5221）を包含する。所望の場合は、ＬａｃＺ遺伝子は、新たなｒＡＡＶを生じさせる目的上、所望の治療的もしくは他のトランス遺伝子で置き換えられ得る。図４を参照。２個のＡＡＶのＩＴＲ配列の間の、ＣＭＶに向けられたＬａｃＺレポーターカセットを包含する配列を、ＰｖｕＩＩ切断によりｐＡＶ．ＣＭＶ．ＬａｃＺから削り出す。この断片を、ＥｃｏＲＶ処理されたｐＡｄ．ｌｉｎｋと連結してプラスミドｐＡｄ．ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺを生じさせる。このプラスミドを、ＣｌａＩで直鎖状にされたＡｄｄｅｌ３２７基幹ＤＮＡとともにコトランスフェクションしてアデノ−ｒＡＡＶハイブリッドウイルスを生じさせる。実施例６−レスキュー可能な組込まれたｒＡＡＶ鋳型を含有する細胞系２９３細胞を、ｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ／ｒＡＡＶＡｄハイブリッドウイルスでトランスフェクション／感染させて、ｒＡＡＶを組込んでいる細胞系を生じさせる。これはサザンブロットによるゲノムＤＮＡの分析により決定されるようである。このクローンを、ｒｅｐ／ｃａｐを発現する構築物でのトランスフェクション／感染によりｒＡＡＶの鋳型のレスキューについて検査する。本発明の多数の改変および変法が上に同定された明細(specification)に包含され、また、当業者に明らかであることが期待される。本発明の方法に対するこうした改変および変更は、これに添付される請求の範囲の範囲に包含されると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者チエン，ナンシーアメリカ合衆国ペンシルベニア州19002アンブラー・サウスベスレヘムパイク174・アパートメントシー５

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）選択された宿主細胞中に、その発現をさせる配列の制御下にＴ７ポリメラーゼを含む第一のベクター、ｒｅｐおよびｃａｐの発現をさせるＴ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む第二のベクター；そして５’から３’へ、５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセットを含む第三のベクター；を導入すること；（ｂ）組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で宿主細胞を培養すること；そして（ｃ）組換えＡＡＶを回収すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。２．最低１種のベクターがアデノウイルスであり、かつ、宿主細胞が２９３細胞である、請求の範囲１に記載の方法。３．第一のベクターが組換えアデノウイルスである、請求の範囲１に記載の方法。４．第二のベクターが組換えアデノウイルスである、請求の範囲１に記載の方法。５．第三のベクターが、カセットに隣接するアデノウイルス配列をさらに含む、請求の範囲１に記載の方法。６．ミニ遺伝子が、マーカー遺伝子であるトランス遺伝子を含有する、請求の範囲１ないし５のいずれかに記載の方法。７．ミニ遺伝子が、治療的遺伝子であるトランス遺伝子を含有する、請求の範囲６に記載の方法。８．（ａ）Ｔ７ポリメラーゼを発現する宿主細胞を提供すること；（ｂ）Ｔ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む第一のベクターを宿主細胞中に導入すること；（ｃ）５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセットを含む第二のベクターを宿主細胞中に導入すること；そして（ｄ）組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。９．段階（ｂ）が、Ｔ７プロモーターならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションする段階を含んでなる請求の範囲８に記載の方法。１０．段階（ｂ）が、Ｔ７プロモーター配列ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに宿主細胞を感染させる段階を含んでなる請求の範囲８に記載の方法。１１．段階（ｃ）がカセットを含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションすることを含んでなる請求の範囲８に記載の方法。１２．段階（ｃ）が、アデノウイルス配列により隣接されるカセットを含む組換えアデノウイルスに宿主細胞を感染させることを含んでなる請求の範囲８に記載の方法。１３．（ａ）Ｔ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子で安定にトランスフェクションされた宿主細胞を提供すること；（ｂ）Ｔ７ポリメラーゼを含むベクターを宿主細胞中に導入すること；（ｃ）５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセットを含むベクターを宿主細胞中に導入すること；そして（ｄ）組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。１４．段階（ｂ）が、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子を含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションする段階を含んでなる請求の範囲１３に記載の方法。１５．段階（ｂ）が、その発現を制御する調節配列の制御下にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスに宿主細胞を感染させる段階を含んでなる請求の範囲１３に記載の方法。１６．段階（ｃ）が、カセットを含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションする段階を含んでなる請求の範囲１３に記載の方法。１７．段階（ｃ）が、アデノウイルス配列により隣接されるカセットを含む組換えアデノウイルスに宿主細胞を感染させる段階を含んでなる請求の範囲１３に記載の方法。１８．（ａ）５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセットを含む宿主細胞を提供すること；（ｂ）Ｔ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むベクターを宿主細胞中に導入すること；（ｃ）Ｔ７ポリメラーゼを含むベクターを宿主細胞中に導入すること；そして（ｄ）組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。１９．段階（ｂ）が、プラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェクションする段階を含む、請求の範囲１８に記載の方法。２０．段階（ｂ）が、組換えアデノウイルスベクターに宿主細胞を感染させる段階を含んでなる請求の範囲１８に記載の方法。２１．段階（ｃ）が、その発現を指図する調節配列の制御下にＴ７ポリメラーゼを含有するプラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェクションする段階を含んでなる請求の範囲１８に記載の方法。２２．段階（ｃ）が、その発現を指図する調節配列の制御下にＴ７ポリメラーゼを含む組換えアデノウイルスに宿主細胞を感染させる段階を含んでなる請求の範囲１８に記載の方法。２３．（ａ）５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセット、ならびにＴ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミドで安定にトランスフェクションされた宿主細胞を提供すること；（ｂ）Ｔ７ポリメラーゼを含むベクターを宿主細胞中に導入すること；そして（ｃ）組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。２４．（ａ）５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセット、ならびにＴ７ポリメラーゼを含むプラスミドで安定にトランスフェクションされた宿主細胞を提供すること；（ｂ）Ｔ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むベクターを宿主細胞中に導入すること；そして（ｃ）組換えＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。２５．（ａ）（ｉ）５’のＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、選択されたミニ遺伝子および３’のＡＡＶのＩＴＲから本質的に成るカセット；（ii）その発現を調節する配列の制御下にＴ７ポリメラーゼを含むプラスミドであって、前記配列は誘導可能なプロモーターを含み；ならびに（iii）Ｔ７プロモーター配列の制御下にＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、で安定にトランスフェクションされた宿主細胞を提供すること；そして（ｂ）前記Ｔ７プロモーターの発現を誘導すること、の段階を含んでなる組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の製造方法。２６．請求の範囲１〜２５のいずれか一の方法に従い製造された組換えアデノウイルス。