TW202241479A - 遞送外來抗原之溶瘤病毒及表現靶向外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合療法 - Google Patents

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Abstract

本申請案提供使用編碼外來抗原(例如細菌唾液酸酶)之重組溶瘤病毒及表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞(例如CAR-NK細胞)來治療癌症(例如實體腫瘤)的方法及組合物。

Description

遞送外來抗原之溶瘤病毒及表現靶向外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合療法
本申請案係關於使用編碼外來抗原之溶瘤病毒(例如牛痘病毒)及表現特異性識別外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞來治療癌症的方法及組合物。
癌症在美國係第二大死因。近年來，癌症免疫療法已取得重大進展，包含免疫檢查點抑制劑、具有嵌合抗原受體之T細胞及溶瘤病毒。
溶瘤病毒係感染癌細胞、在其中複製且最終將其殺死而健康細胞保持無恙之天然或經基因修飾之病毒。已報導，最近完成之溶瘤單純疱疹病毒T-VEC在436名患有不可切除性階段IIIB、IIIC或IV黑色素瘤之患者中之III期臨床試驗符合其主要終點，其中接受T-VEC之患者中之持久反應率為16.3%，與之相比在接受GM-CSF之患者中為2.1%。基於此試驗之結果，FDA在2015年批準T-VEC。
已在各個臨床試驗期中測試來自至少8種不同物種之溶瘤病毒構築體，包含腺病毒、單純疱疹病毒-1、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)、裡奧病毒(reovirus)、麻疹病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus)及牛痘病毒。眾所周知，溶瘤病毒在癌症患者中充分耐受。然而，溶瘤病毒作為單獨治療之臨床益處仍有限。因關於溶瘤病毒安全性之擔憂，故僅在臨床前研究及臨床研究中使用高度減毒之溶瘤病毒(天然無毒或經由基因工程化減毒)。因現已充分確定溶瘤病毒之安全性，故此時應設計及測試具有最大抗腫瘤功效之溶瘤病毒。具有穩定溶瘤效應之溶瘤病毒將釋放豐富腫瘤抗原以引發或活化免疫細胞(包含T細胞及NK細胞)，從而產生強免疫治療效應。
本申請案提供使用溶瘤病毒及表現嵌合受體之經工程化免疫細胞來治療癌症之方法及組合物。
本申請案之一態樣提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之包括編碼外來抗原之核苷酸序列之重組溶瘤病毒；及(b)有效量之表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，外來抗原包括錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係醣胺聚醣(GAG)結合結構域。在一些實施例中，外來抗原包括跨膜結構域。在一些實施例中，錨定結構域或跨膜結構域位於外來抗原之羧基末端處。在一些實施例中，外來抗原包括穩定化結構域。在一些實施例中，穩定化結構域係Fc結構域。
在上述任一方法之一些實施例中，編碼外來抗原之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子係可為早期啟動子、中間啟動子或晚期啟動子或早期/晚期雜合啟動子之病毒啟動子。在一些實施例中，溶瘤病毒係痘病毒且啟動子係痘病毒早期啟動子、晚期啟動子或雜合早期/晚期啟動子。在一些實施例中，啟動子係病毒晚期啟動子。在一些實施例中，啟動子係F17R晚期啟動子(例如SEQ ID NO: 61)。在一些實施例中，啟動子係雜合早期/晚期啟動子。在一些實施例中，啟動子包括人類啟動子之部分或完整核苷酸序列。在一些實施例中，人類啟動子係組織或腫瘤特異性啟動子。
在上述任一方法之一些實施例中，外來抗原係病毒蛋白或其片段。在一些實施例中，外來抗原係細菌蛋白或其片段。
在上述任一方法之一些實施例中，外來抗原係唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係具有外切唾液酸酶(exo-sialidase)活性之蛋白質(酶學委員會(Enzyme Commission) EC 3.2.1.18)，包含細菌、真菌、病毒唾液酸酶及其衍生物。在一些實施例中，唾液酸酶係如由酶學委員會EC 4.2.2.15定義之無水唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係Neu5Ac α(2,6)-Gal唾液酸酶、Neu5Ac α(2,3)-Gal唾液酸酶或Neu5Ac α(2,8)-Gal唾液酸酶。
在上述任一方法之一些實施例中，外來抗原係細菌唾液酸酶。在一些實施例中，細菌唾液酸酶係選自由以下組成之群：產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)唾液酸酶、黏放線菌( Actinomyces viscosus)唾液酸酶及產脲節桿菌( Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌( Salmonella typhimurium)唾液酸酶及霍亂弧菌( Vibrio cholera)唾液酸酶。在一些實施例中，細菌唾液酸酶係黏放線菌唾液酸酶(「avSial」)。
在上述任一方法之一些實施例中，其中外來抗原係唾液酸酶，唾液酸酶係天然唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係包括唾液酸酶催化結構域之經工程化蛋白質。在一些實施例中，唾液酸酶包括錨定結構域。在一些實施例中，唾液酸酶係包括融合至錨定結構域之唾液酸酶催化結構域之融合蛋白。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係醣胺聚醣(GAG)結合結構域。在一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶包括位於唾液酸酶之羧基末端處之錨定結構域或跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括唾液酸酶催化結構域、鉸鏈區及跨膜結構域。
在上述任一方法之一些實施例中，其中外來抗原係唾液酸酶，唾液酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 1-33及53-54組成之群之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%中之任一者)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%中之任一者)序列一致性之胺基酸序列。
在上述任一方法之一些實施例中，外來抗原係DAS181或其衍生物。在一些實施例中，嵌合受體包括不與人類天然雙調蛋白(amphiregulin)或神經胺酸酶交叉反應之抗DAS181抗體部分。
在上述任一方法之一些實施例中，嵌合受體係嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR包括抗唾液酸酶抗體部分、跨膜結構域及細胞內結構域。在一些實施例中，細胞內結構域包括CD28細胞內信號傳導序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體部分包括抗體重鏈可變結構域(VH)，其包括含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之重鏈互補決定區(CDR-H) 1、含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2及含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列CDR-H3；及抗體輕鏈可變結構域(VL)，其包括含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之輕鏈互補決定區(CDR-L) 1、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體部分包括VH，其包括與SEQ ID NO: 117之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%中之任一者)序列一致性之胺基酸序列；及VL，其包括與SEQ ID NO: 118之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%中之任一者)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體部分係scFv。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體部分包括與SEQ ID NO: 119之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%中之任一者)序列一致性之胺基酸序列。
在上述任一方法之一些實施例中，經工程化免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、巨噬細胞及其組合。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係T細胞，例如γδT細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NKT細胞。
在上述任一方法之一些實施例中，溶瘤病毒係選自由以下組成之群之病毒：牛痘病毒、裡奧病毒、塞尼卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城雞瘟病毒(NDV)、單純疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒屬(morbillivirus)病毒、逆轉錄病毒、流行性感冒病毒、辛德比斯病毒(Sinbis virus)、痘病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、慢病毒、腺病毒及其衍生物。在一些實施例中，該病毒係塔裡莫拉維克病毒(Talimogene Laherparepvec)。在一些實施例中，該病毒係裡奧病毒。在一些實施例中，該病毒係具有E1ACR2缺失之腺病毒。
在上述任一方法之一些實施例中，溶瘤病毒係痘病毒。在一些實施例中，痘病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，牛痘病毒係選自由以下組成之群之病毒株：Dryvax、Lister、M63、LIVP、Tian Tan、改良型安卡拉牛痘株(Modified Vaccinia Ankara)、New York City Board of Health (NYCBOH)、Dairen、Ikeda、LC16M8、Tashkent、IHD-J、Brighton、Dairen I、Connaught、Elstree、Wyeth、Copenhagen、Western Reserve、Elstree、CL、Lederle-絨毛膜尿囊(Chorioallantoic)株、AS及其衍生物。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒Western Reserve。
在上述任一方法之一些實施例中，重組溶瘤病毒包括一或多個與相應野生型病株相比減小病毒之免疫原性之突變。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒，且一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R。
在上述任一方法之一些實施例中，病毒係牛痘病毒，且該病毒包括一或多種選自由以下組成之群之蛋白質：(a)變體牛痘病毒(VV) H3L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 66-69中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(b)變體牛痘病毒(VV) D8L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 70-72或85中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(c)變體牛痘病毒(VV) A27L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 73具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及(d)變體牛痘病毒(VV) L1R蛋白，其包括與SEQ ID NO: 74具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在上述任一方法之一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列。在一些實施例中，第二核苷酸序列編碼異源性蛋白質。在一些實施例中，異源性蛋白質係免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIGIT、LAG3、TIM-3、VISTA、B7-H4或HLA-G之抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗體。在一些實施例中，異源性蛋白質係免疫抑制受體之抑制劑。在一些實施例中，免疫抑制受體係LILRB、TYRO3、AXL或MERTK。在一些實施例中，免疫抑制受體之抑制劑係抗LILRB抗體。在一些實施例中，異源性蛋白質係多特異性免疫細胞銜接體(engager)。在一些實施例中，異源性蛋白質係雙特異性T細胞銜接體(BiTE)。在一些實施例中，異源性蛋白質係選自由以下組成之群：細胞介素、共刺激分子、腫瘤抗原呈遞蛋白、抗血管生成因子、腫瘤相關抗原、外來抗原及基質金屬蛋白酶(MMP)。在一些實施例中，異源性蛋白質係IL-15、IL-12、IL2、具有較低毒性或較佳功能之經修飾IL-2、IL18、很少或不結合至IL-18結合蛋白之經修飾IL-18、Flt3L、CCL5、CXCL10或CCL4及該等細胞介素之仍具有抗腫瘤免疫性之任一經修飾形式或可阻斷及中和該等細胞介素功能及活性之任何結合蛋白之抑制劑。
在上述任一方法之一些實施例中，病毒包括兩個或更多個其他核苷酸序列，其中每一核苷酸序列編碼異源性蛋白質。
在上述任一方法之一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步包括編碼細胞介素之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素係Il-15。
在上述任一方法之一些實施例中，經工程化免疫細胞及重組溶瘤病毒係同時投與。在一些實施例中，在投與經工程化免疫細胞之前投與重組溶瘤病毒。
在上述任一方法之一些實施例中，經由載體細胞(例如免疫細胞或幹細胞，例如間質幹細胞)來投與重組溶瘤病毒。
在上述任一方法之一些實施例中，以裸病毒形式投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，經由直接腫瘤內注射來投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之免疫治療劑。在一些實施例中，免疫治療劑係選自由以下組成之群：化學療法、放射療法、放射性免疫療法、單特異性或多特異性抗體、細胞療法、癌症疫苗(例如基於樹突狀細胞之癌症疫苗)、細胞介素、PI3Kγ抑制劑、TLR9配體、HDAC抑制劑、LILRB2抑制劑、MARCO抑制劑及免疫檢查點抑制劑。
在上述任一方法之一些實施例中，癌症係實體癌。
本申請案之一態樣提供一種醫藥組合物，其包括：(a)重組溶瘤病毒，其包括編碼外來抗原之核苷酸序列；(b)經工程化免疫細胞，其表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體；及(c)醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，外來抗原係細菌唾液酸酶，例如avSial。在一些實施例中，外來抗原係DAS181或其衍生物。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NK細胞、T細胞(例如γδ　T細胞)、NKT細胞或巨噬細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。
本申請案之另一態樣提供特異性結合黏放線菌唾液酸酶之經分離抗體或其抗原結合片段，其包括：VH，其包括含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-H1、含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2及含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-H3；及VL，其包括含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L1、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3。
在一些態樣中，本文提供包括編碼唾液酸酶之第一核苷酸序列及編碼多特異性免疫細胞銜接體之第二核苷酸序列之重組溶瘤病毒，其中第一核苷酸序列及第二核苷酸序列可操作地連接至一或多個啟動子。
在一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體係雙特異性免疫細胞銜接體。在一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體包括能夠特異性識別腫瘤抗原之第一抗原結合結構域及能夠特異性識別免疫效應細胞之細胞表面分子之第二抗原結合結構域。在一些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、上皮細胞黏附分子(EpCAM)及表皮生長因子受體(EGFR)。在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3或41-BB。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面標記物係CD3ε。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，第一抗原結合結構域係scFv，且/或第二抗原結合結構域係scFv。在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP且第一抗原結合結構域包括：(i)第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)，其具有SEQ ID NO: 86之胺基酸序列；(i)第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)，其具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列；(iii)第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)，其具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列，(iv)第一重鏈互補決定區(CDR-H1)，其具有SEQ ID NO: 89之胺基酸序列，(v)第二重鏈互補決定區(CDR-H2)，其具有SEQ ID NO: 90之胺基酸序列，及(vi)第三重鏈互補決定區(CDR-H3)，其具有SEQ ID NO: 91之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP且第一抗原結合結構域包括與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 98之胺基酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3，且第二抗原結合結構域包括：(i)第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)，其具有SEQ ID NO: 92之胺基酸序列，(ii)第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)，其具有SEQ ID NO: 93之胺基酸序列，(iii)第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)，其具有SEQ ID NO: 94之胺基酸序列，(iv)第一重鏈互補決定區(CDR-H1)，其具有SEQ ID NO: 95之胺基酸序列，(v)第二重鏈互補決定區(CDR-H2)，其具有SEQ ID NO: 96之胺基酸序列，及(vi)第三重鏈互補決定區(CDR-H3)，其具有SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3且第二抗原結合結構域包括與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3且第二抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 99之胺基酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體包括與SEQ ID N O: 100之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性之胺基酸序列。在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體包括SEQ ID N O: 100之胺基酸序列。
在一些實施例中，重組溶瘤病毒係選自由以下組成之群之病毒：牛痘病毒、裡奧病毒、塞尼卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城雞瘟病毒(NDV)、單純疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒屬病毒、逆轉錄病毒、流行性感冒病毒、辛德比斯病毒、痘病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、慢病毒、腺病毒及其衍生物。在一些實施例中，該病毒係塔裡莫拉維克病毒。在一些實施例中，該病毒係裡奧病毒。在一些實施例中，該病毒係具有E1ACR2缺失之腺病毒。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，重組溶瘤病毒係痘病毒。在一些實施例中，痘病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，牛痘病毒係選自由以下組成之群之病毒株：Dryvax、Lister、M63、LIVP、Tian Tan、改良型安卡拉牛痘株、New York City Board of Health (NYCBOH)、Dairen、Ikeda、LC16M8、Tashkent、IHD-J、Brighton、Dairen I、Connaught、Elstree、Wyeth、Copenhagen、Western Reserve、Elstree、CL、Lederle-絨毛膜尿囊株、AS及其衍生物。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒Western Reserve。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，重組溶瘤病毒包括一或多個與相應野生型病株相比減小病毒之免疫原性之突變。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒，且一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R。
在一些實施例中，病毒係牛痘病毒，且該病毒包括一或多種選自由以下組成之群之蛋白質：(a)變體牛痘病毒(VV) H3L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 66-69中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(b)變體牛痘病毒(VV) D8L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 70-72或85中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(c)變體牛痘病毒(VV) A27L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 73具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及(d)變體牛痘病毒(VV) L1R蛋白，其包括與SEQ ID NO: 74具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，重組溶瘤病毒係牛痘病毒，且重組溶瘤病毒包括胸苷激酶(TK)基因破壞。在一些實施例中，將第一及第二核苷酸序列(分別編碼唾液酸酶及多特異性免疫細胞銜接體)插入TK基因中。在一些實施例中，重組溶瘤病毒包括牛痘生長因子(VGF)基因破壞。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶係Neu5Ac α(2,6)-Gal唾液酸酶、Neu5Ac α(2,3)-Gal唾液酸酶或Neu5Ac α(2,8)-Gal唾液酸酶。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶具有外切唾液酸酶活性之任一蛋白質(酶學委員會EC 3.2.1.18)，包含細菌、人類、真菌、病毒唾液酸酶及其衍生物。在一些實施例中，細菌唾液酸酶係選自由以下組成之群：產氣莢膜梭菌唾液酸酶、黏放線菌唾液酸酶及產脲節桿菌唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶及霍亂弧菌唾液酸酶。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶係人類唾液酸酶或其衍生物。在一些實施例中，唾液酸酶係NEU1、NEU2、NEU3或NEU4。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶係天然唾液酸酶。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶包括錨定結構域。在一些實施例中，唾液酸酶係包括融合至錨定結構域之唾液酸酶催化結構域之融合蛋白。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係醣胺聚醣(GAG)結合結構域。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶係具有如由酶學委員會EC 3.2.1.18定義之外切唾液酸酶活性之蛋白質。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶係如由酶學委員會EC 4.2.2.15定義之無水唾液酸酶。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 1-33、53-54及105組成之群之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181或其衍生物。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列進一步編碼可操作地連接至唾液酸酶之分泌序列。在一些實施例中，分泌序列包括SEQ ID NO: 40、101及102中之任一者之胺基酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括唾液酸酶催化結構域、鉸鏈區及跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括唾液酸酶催化結構域、鉸鏈區、IgG Fc區及跨膜結構域。在一些實施例中，鉸鏈區係IgG1鉸鏈區。在一些實施例中，IgG Fc結構域包括SEQ ID NO: 104之胺基酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶包括免疫球蛋白G (IgG) Fc (可結晶片段)結構域。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括唾液酸酶催化結構域、IgG Fc結構域及跨膜結構域。在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，IgG Fc結構域包括SEQ ID NO: 104之胺基酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，唾液酸酶包括位於唾液酸酶之羧基末端處之錨定結構域或跨膜結構域。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，一或多個啟動子包括可為早期啟動子、中間啟動子或晚期啟動子或早期/晚期雜合啟動子之病毒啟動子。在一些實施例中，重組溶瘤病毒係痘病毒且啟動子係痘病毒早期啟動子、晚期啟動子或雜合早期/晚期啟動子。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，一或多個啟動子包括病毒晚期啟動子。在一些實施例中，啟動子係F17R晚期啟動子(SEQ ID NO: 61)。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，一或多個啟動子包括雜合早期-晚期啟動子。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，一或多個啟動子包括含有SEQ ID NO: 107之核苷酸序列之啟動子。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，啟動子包括人類啟動子之部分或完整核苷酸序列。在一些實施例中，人類啟動子係組織或腫瘤特異性啟動子。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，一或多個啟動子包括可操作地連接至第一核苷酸序列之第一啟動子及可操作地連接至第二核苷酸序列之第二啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係F17R啟動子且第二啟動子係pE/L啟動子。在一些實施例中，F17R啟動子包括SEQ ID NO: 61之核酸序列。在一些實施例中，pE/L啟動子包括SEQ ID NO: 107之核酸序列。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，重組溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質或核酸之其他核苷酸序列。在一些實施例中，其他核苷酸序列編碼異源性蛋白質。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIGIT、LAG3、TIM-3、VISTA、B7-H4或HLA-G之抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗體。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係免疫抑制受體之抑制劑。在一些實施例中，免疫抑制受體係LILRB、TYRO3、AXL或MERTK。在一些實施例中，免疫抑制受體之抑制劑係抗LILRB抗體。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係多特異性免疫細胞銜接體。在一些實施例中，異源性蛋白質係雙特異性T細胞銜接體(BiTE)。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係選自由以下組成之群：細胞介素、共刺激分子、腫瘤抗原呈遞蛋白、抗血管生成因子、腫瘤相關抗原、外來抗原及基質金屬蛋白酶(MMP)。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係CD55或CD59之抑制劑。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係IL-15、IL-12、IL2、具有較低毒性或較佳功能之經修飾IL-2、IL18、很少或不結合至IL-18結合蛋白之經修飾IL-18、Flt3L、CCL5、CXCL10或CCL4及該等細胞介素之仍具有抗腫瘤免疫性之任一經修飾形式或可阻斷及中和該等細胞介素功能及活性之任何結合蛋白之抑制劑。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係細菌多肽。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係選自由以下組成之群之腫瘤相關抗原：癌胚抗原、甲型胎兒蛋白、MUC16、存活素(survivin)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3)、B7家族成員、LILRB、CD19、BCMA、NY-ESO-1、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR (例如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1、NY-ESO-1、纖維蛋白-3 (Fibulin-3)、CDH17及其他具有臨床顯著性之腫瘤抗原。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，病毒包括兩個或更多個其他核苷酸序列，其中每一核苷酸序列編碼異源性蛋白質。
在一些態樣中，本文提供Western Reserve株之重組牛痘病毒，其包括：第一核苷酸序列，其編碼具有SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之唾液酸酶；及第二核苷酸序列，其編碼具有SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之雙特異性免疫細胞銜接體；其中第一核苷酸序列及第二核苷酸序列可操作地連接至一或多個啟動子；且其中重組牛痘病毒包括胸苷激酶(TK)基因之破壞或缺失及牛痘生長因子(VGF)基因之破壞或缺失。
本申請案之一態樣提供一種醫藥組合物，其包括前述技術方案中之任一者之重組溶瘤病毒及醫藥上可接受之載劑。
本申請案之一態樣提供包括上述任一重組溶瘤病毒之載體細胞。在一些實施例中，載體細胞係經工程化免疫細胞或幹細胞(例如間質幹細胞)或B細胞或淋巴球。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係嵌合抗原受體(CAR)-T (例如γδT細胞)、CAR-NK、CAR-NKT或CAR-巨噬細胞。
本申請案之一態樣提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與有效量之上述任一重組溶瘤病毒、醫藥組合物或載體細胞。
在一些實施例中，該方法包括向個體投與有效量之上述任一重組溶瘤病毒。在一些實施例中，經由載體細胞(例如免疫細胞或幹細胞，例如間質幹細胞)來投與重組溶瘤病毒。
在一些實施例中，癌症係FAP陽性癌症。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、結腸癌及乳癌。在一些實施例中，投與重組溶瘤病毒會活化及/或擴增個體中之CD4 +及/或CD8 +T細胞。在一些實施例中，投與重組溶瘤病毒會增加個體中之腫瘤浸潤性淋巴球。
在一些實施例中，以裸病毒形式投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，經由直接腫瘤內注射來投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之免疫治療劑。在一些實施例中，免疫治療劑係選自由以下組成之群：化學療法、放射療法、放射性免疫療法、單特異性或多特異性抗體、細胞療法、癌症疫苗(例如基於樹突狀細胞之癌症疫苗)、細胞介素、PI3Kγ抑制劑、TLR9配體、HDAC抑制劑、LILRB2抑制劑、MARCO抑制劑及免疫檢查點抑制劑。
亦提供用於上述任一方法之組合物、套組及製品。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年12月30日提出申請之美國臨時申請案63/132,420之優先權權益，該臨時申請案之內容以全文引用方式併入本文中。 ASCII文字檔案上之序列表之提交
關於ASCII文本文件之下列提交內容之內容以全文引用方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(文件名稱：208712001341SEQLIST.TXT，記錄日期：2021年12月29日，大小：308,635個位元組)。
本申請案提供使用編碼外來抗原之溶瘤病毒(例如牛痘病毒)及表現特異性識別外來抗原之嵌合受體(例如CAR)之經工程化免疫細胞(例如NK細胞)來治療癌症之組合物及方法。在一些實施例中，外來抗原係細菌唾液酸酶，例如DAS181或其衍生物。本文所闡述之重組溶瘤病毒能夠將外來抗原(例如唾液酸酶)遞送至腫瘤細胞及/或腫瘤細胞環境中，該外來抗原由經工程化免疫細胞特異性識別，由此增強針對腫瘤細胞之免疫反應。在一些實施例中，所遞送唾液酸酶可減少存在於腫瘤細胞或免疫細胞上之唾液酸，且致使腫瘤細胞更易於由有效性可能另外因癌細胞過度唾液酸化而減弱之免疫細胞殺死。 I. 定義
除非下文另有定義，否則本文所用之術語具有業內通用含義。
如本文中所使用，術語「治療(treatment或treating)」係獲得有益或期望結果(包含臨床結果)之方式。出於本申請案之目的，有益或期望臨床結果包含(但不限於)下列結果中之一或多者：減少一或多種源自疾病之症狀，減弱疾病程度，穩定疾病(例如預防或延遲疾病惡化)，預防或延遲疾病擴散，預防或延遲疾病發生或復發，延遲或減緩疾病進展，改善疾病狀態，緩解(部分或完全)疾病，降低治療疾病所需之一或多種其他藥劑之劑量，延遲疾病進展，增加生活品質，及/或延長存活。「治療」亦涵蓋減少疾病之病理學後果。本申請案之方法涵蓋該等治療態樣中之任一者或多者。
術語「個體」、「受試者」及「患者」可在本文中互換使用以闡述哺乳動物，包含人類。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體患有癌症。在一些實施例中，個體需要治療。
如業內所理解，「有效量」係指組合物足以產生期望治療結果(例如減小癌症之嚴重程度或持續時間、穩定其嚴重程度或消除其一或多種症狀)之量。對於治療應用而言，有益或期望結果包含(例如)減少一或多種源自疾病之症狀(生物化學、組織學及/或行為學，包含其併發症及在疾病發生期間呈現之中間病理學表型)，增加疾病患者之生活品質，降低治療疾病所需之其他藥劑之劑量，增強另一藥劑之效應，延遲疾病進展，及/或延長患者存活。在一些實施例中，有效量之治療劑可延長存活(包含整體存活及無進展存活)；產生目標反應(包含完全反應或部分反應)；在一定程度上減輕疾病或病狀之一或多種體徵或症狀；及/或改良受試者之生活品質。
如本文中所使用，術語「野生型」係熟習此項技術者所理解之業內術語，且意指生物體、株、基因或特性出現於自然界中之與突變或變體形式不同之典型形式。
術語「非天然」或「經工程化」可互換使用且指示人為干預。該等術語在提及核酸分子或多肽時意指，核酸分子或多肽至少實質上不含至少一種與其在自然界中天然締合且可發現於自然界中之其他組分。
如本文中所使用，「唾液酸酶」係指能夠催化末端唾液酸自醣蛋白或醣脂上之碳水化合物裂解之天然或經工程化唾液酸酶。如本文中所使用，「唾液酸酶」可係指天然或非天然唾液酸酶中能夠催化末端唾液酸自醣蛋白或醣脂上之碳水化合物裂解之結構域。術語「唾液酸酶」亦涵蓋包括天然或非天然唾液酸酶蛋白或其酶促活性片段或結構域及另一多肽、其片段或結構域(例如錨定結構域或跨膜結構域)之融合蛋白。
本文所用之術語「唾液酸酶」涵蓋唾液酸酶催化結構域蛋白。「唾液酸酶催化結構域蛋白」係包括唾液酸酶之催化結構域或與唾液酸酶之催化結構域實質上同源之胺基酸序列但不包括唾液酸酶之整個胺基酸序列的蛋白質。催化結構域係衍生而來，其中唾液酸酶催化結構域蛋白實質上保留衍生催化結構域之完整唾液酸酶之功能活性。唾液酸酶催化結構域蛋白可包括非衍生自唾液酸酶之胺基酸序列。唾液酸酶催化結構域蛋白可包括衍生自或實質上同源於一或多種其他已知蛋白質之胺基酸序列之胺基酸序列，或可包括一或多個非衍生自或實質上同源於其他已知蛋白質之胺基酸序列之胺基酸。
如本文中所使用，「表現」係指自DNA模板轉錄多核苷酸(例如轉錄為mRNA或其他RNA轉錄物)之過程及/或隨後將所轉錄mRNA轉譯為肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄物及所編碼多肽可統稱為「基因產物」。若多核苷酸係衍生自基因體DNA，則表現可包含在真核細胞中剪接mRNA。
術語「抗體」係以其最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包含(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、三特異性抗體等)、人類化抗體、嵌合抗體、全長抗體及其抗原結合片段、單鏈Fv、奈米抗體、Fc融合蛋白，只要其展現期望抗原結合活性即可。抗體及/或抗體片段可衍生自鼠類抗體、兔抗體、雞抗體、人類抗體、完全人類化抗體、駱駝科抗體可變結構域及人類化形式、鯊魚抗體可變結構域及人類化形式以及駱駝化抗體可變結構域。
本文所用之術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域中序列具有超變性之每一區域。HVR可形成結構上經界定之環(「超變環」)。通常，天然4鏈抗體包括6個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR與稱為框架區(FR)之較保守區域間雜排列。每一VH及VL由三個HVR及四個FR構成，且自胺基末端至羧基末端以下列順序配置：FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3、FR4。HVR通常包括來自超變環及/或來自「互補決定區」 (CDR)之胺基酸殘基，CDR具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。實例性超變環出現於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。)  實例性CDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991))。除VH中之CDR1外，CDR通常包括形成超變環之胺基酸殘基。CDR亦包括「特異性決定殘基」或「SDR」，該等殘基係接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR或a-CDR之區域內。實例性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於L1之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處(Almagro及Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))。
下 表 1提供業內已知之各種演算法之實例性CDR定義。 表 1. CDR 定義
   Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3 IMGT 4 AHo 5
CDR-H1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
CDR-H2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
CDR-H3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
CDR-L1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
CDR-L2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
CDR-L3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1 殘基編號遵循以下文獻中之命名 ： Kabat 等人 ， J. Biol. Chem . 252:6609-6616 (1977) ； Kabat 等人 ， U.S. Dept. of Health and Human Services , 「 Sequences of proteins of immunological interest 」 (1991) 。 2 殘基編號遵循以下文獻中之命名 ： Chothia 等人 ， J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ； Al-Lazikani B. 等人 ， J. Mol. Biol. , 273: 927-948 (1997) 。 3 殘基編號遵循以下文獻中之命名 ： MacCallum 等人 ， J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) ； Abhinandan 及 Martin, Mol. Immunol.,45: 3832-3839 (2008) 。 4 殘基編號遵循以下文獻中之命名 ： Lefranc M.P. 等人 ， Dev. Comp. Immunol. , 27: 55-77 (2003) ； 及 Honegger 及 Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001) 。 5 殘基編號遵循以下文獻中之命名 ： Honegger 及 Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001) 。
術語「重組」在用於提及(例如)細胞或核酸、蛋白質或載體時指示，已藉由引入異源性核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質來修飾細胞、核酸、蛋白質或載體，或細胞係衍生自如此修飾之細胞。
術語「病毒」或「病毒顆粒」係根據其在病毒學內之普通一般含義來使用，且係指包含病毒基因體(例如DNA、RNA、單鏈、雙鏈)、病毒衣殼與相關蛋白質及(在包膜病毒(例如疱疹病毒、痘病毒)之情形下)、包含脂質及視情況宿主細胞膜之組分之包膜及/或病毒蛋白之病毒體。
如本文中所使用，「溶瘤病毒」係指選擇性複製於具有腫瘤之受試者中之腫瘤細胞中且選擇性殺死該等細胞之病毒。該等病毒包含天然地優先複製及累積於腫瘤細胞中之病毒(例如痘病毒)及已經工程化以具有此特徵之病毒。一些溶瘤病毒可在感染腫瘤細胞後殺死腫瘤細胞。舉例而言，溶瘤病毒可藉由溶解腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞之細胞死亡來使腫瘤細胞死亡。實例性溶瘤病毒包含(但不限於)痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、棒狀病毒、乳頭瘤病毒、水疱性口炎病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、細小核糖核酸病毒(picomavirus)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、乳頭瘤病毒、細小病毒、裡奧病毒及柯薩奇病毒。
術語「痘病毒」係根據其在病毒學內之普通一般含義來使用且係指能夠感染複製於宿主細胞質中之脊椎動物及無脊椎動物之痘病毒科(Poxviridae)家族的成員。在實施例中，痘病毒病毒體具有約200 nm直徑及約300 nm長度之大小且擁有呈單一、線性、雙鏈DNA區段形式且通常為130-375千鹼基之基因體。術語痘病毒包含(但不限於)所有痘病毒科屬(例如β昆蟲痘病毒、亞塔痘病毒(yatapoxvirus)、鹿痘病毒、γ昆蟲痘病毒、野兔痘病毒、豬痘病毒、軟疣痘病毒、魚痘病毒、α昆蟲痘病毒、羊痘病毒、正痘病毒、禽痘病毒及副痘病毒)。在實施例中，痘病毒係正痘病毒(例如天花病毒、牛痘病毒(vaccinia virus、cowpox virus)、猴痘病毒)、副痘病毒(例如羊口瘡病毒、假牛痘病毒、牛流行性口炎病毒)、亞塔痘病毒(例如塔納痘病毒(tanapox virus)、亞巴猴腫瘤病毒(yaba monkey tumor virus))或軟疣痘病毒(例如傳染性軟疣病毒)。在實施例中，痘病毒係正痘病毒(例如牛痘病毒株Brighton、浣熊痘病毒株Herman、兔痘病毒株Utrecht、牛痘病毒株WR、牛痘病毒株IHD、牛痘病毒株Elstree、牛痘病毒株CL、牛痘病毒株Lederle-絨毛膜尿囊株或牛痘病毒株AS)。在實施例中，痘病毒係副痘病毒(例如羊口瘡病毒株NZ2或假牛痘病毒株TJS)。
如本文中所使用，「經修飾病毒」或「重組病毒」係指與親代病毒株相比基因體有所改變之病毒。通常，經修飾病毒在親代病毒株之基因體中具有一或多個核苷酸截短、取代(代替)、突變、插入(添加)或缺失(截短)。經修飾病毒可具有一或多個經修飾內源性病毒基因及/或一或多個經修飾基因間區域。實例性經修飾病毒可具有一或多個插入病毒基因體中之異源性核苷酸序列。經修飾病毒可含有一或多個呈用於表現異源性基因之基因表現盒形式之異源性核苷酸序列。可使用熟習此項技術者已知之任一方法來進行修飾，包含如本文所提供之方法，例如基因工程化及重組DNA方法。
關於本文所鑑別多肽及抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義如下：在比對各序列且考慮將任何保守取代視為序列一致性之一部分之後，候選序列中與所比較多肽中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR)或MUSCLE軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包含在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列對比電腦程式MUSCLE來生成(Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004；Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004，其中之每一者之全部內容出於所有目的以引用方式併入本文中)。
本文所用之術語「表位」係指抗體或二價抗體所結合之抗原上之特定原子或胺基酸群組。若兩個抗體或抗體部分對抗原展現競爭性結合，則其可結合抗原內之相同表位。
術語「多肽」或「肽」在本文中用於涵蓋所有種類之天然及合成蛋白，包含所有長度之蛋白質片段、融合蛋白及經修飾蛋白，包含(但不限於)醣蛋白以及所有其他類型之經修飾蛋白(例如源自磷酸化、乙醯化、肉豆蔻醯化、棕櫚醯化、醣基化、氧化、甲醯化、醯胺化、聚麩胺醯化、ADP-核醣基化、聚乙二醇化、生物素化等之蛋白質)。
如本文中所使用，術語「特異性結合」、「特異性識別」及「對……具有特異性」係指可量測及可再現之相互作用，例如靶與抗體(例如二價抗體)之間之結合。在某些實施例中，特異性結合決定了在異質分子群體(包含生物分子，例如細胞表面受體)存在下靶之存在。舉例而言，特異性識別靶(其可為表位)之抗體係與其結合其他分子相比以更大親和力、親合力更容易地及/或以更長持續時間結合此靶之抗體(例如二價抗體)。在一些實施例中，抗體與無關分子之結合程度小於抗體與靶之結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在一些實施例中，特異性結合靶之抗體具有≤10 -5M、≤10 -6M、≤10 -7M、≤10 -8M、≤10 -9M、≤10 -10M、≤10 -11M或≤10 -12M之解離常數(KD)。在一些實施例中，抗體特異性結合蛋白質上在來自不同物種之蛋白質中保守之表位。在一些實施例中，特異性結合可包含(但不要求)排他性結合。可以實驗方式藉由業內已知方法來測定抗體或抗原結合結構域之結合特異性。該等方法包含(但不限於)西方印漬(Western blot)、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORETM及肽掃描。
本文所用之術語「同時投與」意指，組合療法中之第一療法及第二療法係使用不超過約15分鐘(例如不超過約10分鐘、5分鐘或1分鐘中之任一者)之時間間隔來投與。在同時投與第一療法及第二療法時，第一療法及第二療法可含於相同組合物(例如包括第一療法及第二療法二者之組合物)或分開組合物(例如第一療法在一種組合物中且第二療法含於另一組合物中)中。
如本文中所使用，術語「依序投與」意指，組合療法中之第一療法及第二療法係以大於約15分鐘(例如大於約20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘或更久中之任一者)之時間間隔來投與。可首先投與第一療法或第二療法中之任一者。第一療法及第二療法含於分開組合物中，該等分開組合物可含於相同或不同之包裝或套組中。
如本文中所使用，術語「並行投與」意指，組合療法中之第一療法及第二療法之投與彼此重疊。
術語「醫藥組合物」係指如下製劑：其係呈使得其中所含活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外對受試者無毒之一或多種成分。醫藥上可接受之載劑包含(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑、冷凍保護劑、張力劑、防腐劑及其組合。醫藥上可接受之載劑或賦形劑已較佳地滿足毒理學及製造測試之所需標準，及/或包含於由美國食品藥物監督管理局(U.S. Food and Drug administration)或其他州/聯邦政府編製之惰性成分導則(Inactive Ingredient Guide)上，或列示於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或用於哺乳動物及更尤其人類中之其他公認藥典中。
術語「包裝插頁」用於係指通常包含於診斷產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告的資訊。
「製品」係包括至少一種試劑(例如用於治療疾病或病狀(例如癌症)之藥劑或用於特異性檢測本文所闡述之生物標記物之探針)之任一製造物(例如包裝或容器)或套組。在某些實施例中，製造物或套組係以用於實施本文所闡述方法之單元形式來推銷、分配或出售。
應理解，本文所闡述之本發明實施例包含「由實施例組成」及/或「基本上由實施例組成」。
提及「約」一值或參數在本文中包含(且闡述)涉及該值或參數本身之若干變化。舉例而言，關於「約X」之說明包含對「X」之說明。
如本文中所使用，提及「非」一值或參數通常意指且闡述一值或參數「除外」。舉例而言，該方法並不用於治療X型疾病意指該方法用於治療除X外之類型之疾病。
本文所用之術語「約X-Y」與「約X至約Y」具有相同含義。
除非上下文另外明確規定，否則本文及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」或「該(the)」包含複數個指示物。
如本文在諸如「A及/或B」等片語中所使用，術語「及/或」意欲包含A及B；A或B；A (單獨)；及B (單獨)。同樣，如在諸如「A、B及/或C」等片語中所使用，術語「及/或」意欲涵蓋下列實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。 II. 治療方法
本申請案提供治療有需要之個體之癌症(例如實體腫瘤)之方法，其包括向個體投與有效量之重組溶瘤病毒及經工程化免疫細胞(或包括經工程化免疫細胞之組合物)。在一些實施例中，經工程化免疫細胞表現靶向由重組溶瘤病毒表現之異源性蛋白質之嵌合受體。在一些實施例中，異源性蛋白質係唾液酸酶(例如DAS181或其衍生物，例如膜結合形式之DAS181)，且嵌合受體特異性識別唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181或其衍生物，且其中嵌合受體包括不與人類天然雙調蛋白或任一其他人類抗原交叉反應之抗DAS181抗體。
在一些實施例中，提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之包括編碼外來抗原之核苷酸序列之重組溶瘤病毒；及(b)有效量之表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，外來抗原係非人類蛋白(例如細菌蛋白)。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，癌症係實體癌。
在一些實施例中，提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之包括編碼外來抗原之核苷酸序列之重組溶瘤病毒；及(b)有效量之表現特異性識別該外來抗原之CAR之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，外來抗原係非人類蛋白(例如細菌蛋白)。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，癌症係實體癌。
在一些實施例中，提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之包括編碼外來抗原之核苷酸序列之重組溶瘤病毒；及(b)有效量之表現特異性識別該外來抗原之CAR之經工程化NK細胞。在一些實施例中，外來抗原係非人類蛋白(例如細菌蛋白)。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素(例如IL-15)之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。在一些實施例中，癌症係實體癌。
在一些實施例中，提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之包括編碼唾液酸酶之核苷酸序列之重組溶瘤病毒或有效量之包括重組溶瘤病毒之載體細胞；及(b)有效量之表現特異性識別唾液酸酶之嵌合受體之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，唾液酸酶係細菌唾液酸酶(例如產氣莢膜梭菌唾液酸酶、黏放線菌唾液酸酶、產脲節桿菌唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶或霍亂弧菌唾液酸酶)。在一些實施例中，唾液酸酶包括錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域係GAG結合蛋白結構域，例如人類雙調蛋白之上皮錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係GPI連接體。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181。在一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，嵌合受體特異性識別唾液酸酶(例如DAS181)且並不與人類天然雙調蛋白或任一其他人類抗原交叉反應。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係T細胞或NK細胞。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素(例如IL-15)之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，癌症係實體癌。
在一些實施例中，提供治療個體之癌症之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之包括編碼唾液酸酶之核苷酸序列之重組溶瘤病毒；及(b)有效量之包括特異性識別唾液酸酶之嵌合抗原受體(CAR)之經工程化天然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，唾液酸酶係細菌唾液酸酶(例如產氣莢膜梭菌唾液酸酶、黏放線菌唾液酸酶、產脲節桿菌唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶或霍亂弧菌唾液酸酶)。在一些實施例中，唾液酸酶包括錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域係GAG結合蛋白結構域，例如人類雙調蛋白之上皮錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係GPI連接體。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181。在一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，嵌合受體特異性識別唾液酸酶(例如DAS181)且並不與人類天然雙調蛋白或任一其他人類抗原交叉反應。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素(例如IL-15)之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，癌症係實體癌。
在一些實施例中，提供治療個體之癌症(例如實體癌)之方法，其包括向個體投與：(a)有效量之重組溶瘤病毒，其包括編碼唾液酸酶(例如DAS181或其衍生物)之第一核苷酸序列及編碼特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體之第二核苷酸序列；及(b)有效量之表現CAR及IL-15之NK細胞，其中CAR包括特異性結合至唾液酸酶之抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。在一些實施例中，溶瘤病毒係包括胸苷激酶(TK)基因及牛痘生長因子(VGF)基因之破壞或缺失之牛痘病毒。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括唾液酸酶結構域、Fc結構域及跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 105或106之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，雙特異性抗體包括與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包括含有與SEQ ID NO: 119之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列之抗唾液酸酶scFv。在一些實施例中，CAR自N-末端至C-末端包括抗唾液酸酶scFv、CD8鉸鏈區、CD8跨膜結構域、CD28之共刺激結構域及CD3ζ之細胞內結構域。在一些實施例中，CAR包括與SEQ ID NO: 120之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-15包括與SEQ ID NO: 121之胺基酸序列具有至少85%一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供將外來抗原遞送至個體中之癌細胞中之方法，其包括向個體投與有效量之包括編碼外來抗原之核苷酸序列之重組溶瘤病毒。在一些實施例中，外來抗原係細菌蛋白。在一些實施例中，外來抗原係唾液酸酶。在一些實施例中，外來抗原係細菌唾液酸酶(例如產氣莢膜梭菌唾液酸酶、黏放線菌唾液酸酶、產脲節桿菌唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶或霍亂弧菌唾液酸酶)。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181之唾液酸酶催化結構域。在一些實施例中，該方法進一步包括投與經工程化免疫細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞表現特異性識別外來抗原之嵌合受體。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素(例如IL-15)之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。
在一些實施例中，提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與有效量之經工程化免疫細胞，其中免疫細胞表現編碼外來抗原之重組溶瘤病毒。在一些實施例中，免疫細胞表現特異性識別外來抗原之嵌合受體。在一些實施例中，外來抗原係唾液酸酶，例如細菌唾液酸酶(例如產氣莢膜梭菌唾液酸酶、黏放線菌唾液酸酶、產脲節桿菌唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶或霍亂弧菌唾液酸酶)。在一些實施例中，唾液酸酶包括錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域係GAG結合蛋白結構域，例如人類雙調蛋白之上皮錨定結構域。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係GPI連接體。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181。在一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，嵌合受體特異性識別唾液酸酶(例如DAS181)且並不與人類天然雙調蛋白或任一其他人類抗原交叉反應。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素(例如IL-15)之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。在一些實施例中，癌症係實體癌。
在一些實施例中，提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與有效量之經工程化免疫細胞，其中免疫細胞表現編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒。在一些實施例中，免疫細胞表現特異性識別由病毒編碼之唾液酸酶之嵌合受體。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步表現編碼細胞介素(例如IL-15)之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之異源性核酸序列。在一些實施例中，嵌合受體係CAR。在一些實施例中，癌症係實體癌。
本文所闡述之方法包括投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒(亦在本文中稱為「VV」)。適宜溶瘤病毒及其衍生物闡述於下文之「 溶瘤病毒」子部分中。
在一些實施例中，該方法包括向個體投與有效量之包括編碼唾液酸酶之核苷酸序列之重組溶瘤病毒，其中編碼異源性蛋白質之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒、裡奧病毒、塞尼卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城雞瘟病毒(NDV)、單純疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒屬病毒、逆轉錄病毒、流行性感冒病毒、辛德比斯病毒、痘病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、慢病毒、腺病毒或柯薩奇病毒或其衍生物。在一些實施例中，溶瘤病毒係塔裡莫拉維克病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒係裡奧病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒係腺病毒(例如具有E1ACR2缺失之腺病毒)。
在一些實施例中，溶瘤病毒係痘病毒。在一些實施例中，痘病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，牛痘病毒係諸如以下等病毒株：Dryvax、Lister、M63、LIVP、Tian Tan、改良型安卡拉牛痘株、New York City Board of Health (NYCBOH)、Dairen、Ikeda、LC16M8、Tashkent、IHD-J、Brighton、Dairen I、Connaught、Elstree、Wyeth、Copenhagen、Western Reserve、Elstree、CL、Lederle-絨毛膜尿囊株或AS或其衍生物。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒Western Reserve。
在一些實施例中，經由載體細胞(例如免疫細胞或幹細胞，例如間質幹細胞)投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，以裸病毒形式投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，經由腫瘤內注射來投與重組溶瘤病毒。
在一些實施例中，本文所闡述之重組溶瘤病毒包括編碼外來抗原(例如唾液酸酶)之核苷酸序列。在一些實施例中，外來抗原結合膜。在一些實施例中，外來抗原包括跨膜結構域。在一些實施例中，外來抗原包括錨定部分。在一些實施例中，外來抗原包括穩定化結構域，例如Fc結構域。在一些實施例中，重組溶瘤病毒編碼一或多種其他異源性蛋白質，例如其他免疫治療劑(例如雙特異性T細胞銜接體，例如抗FAP抗CD3雙特異性抗體)。在一些實施例中，重組溶瘤病毒包括編碼免疫檢查點抑制劑之核苷酸序列。實例性外來抗原(包含唾液酸酶構築體)及由溶瘤病毒編碼之其他異源性蛋白質包含(但不限於)闡述於下文之子部分B 「外來抗原及其他異源性蛋白質」中者。
在一些實施例中，該方法包括投與包括編碼唾液酸酶之核苷酸序列之重組溶瘤病毒，其中編碼異源性蛋白質之核苷酸序列可操作地連接至啟動子，且其中重組溶瘤病毒包括一或多個與相應野生型病株相比減小病毒之免疫原性之突變。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒(例如牛痘病毒Western Reserve)，且一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R或其他免疫原性蛋白質(例如A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27)。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R。在一些實施例中，該病毒包括一或多種選自由以下組成之群之蛋白質：(a)變體牛痘病毒(VV) H3L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 66-69中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(b)變體牛痘病毒(VV) D8L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 70-72或85中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(c)變體牛痘病毒(VV) A27L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 73具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及(d)變體牛痘病毒(VV) L1R蛋白，其包括與SEQ ID NO: 74具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
本文所闡述之重組溶瘤病毒(例如牛痘病毒)編碼外來抗原。在一些實施例中，外來抗原係唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係細菌唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係分泌型唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶包括膜錨定部分或跨膜結構域。適宜唾液酸酶及其衍生物或變體闡述於下文之「 唾液酸酶」子部分中。在一些實施例中，重組溶瘤病毒編碼一或多種促進免疫反應或抑制免疫抑制蛋白之異源性蛋白質或核酸，如下文之「 多特異性免疫細胞銜接體」及「 其他異源性蛋白質或核酸」子部分中所闡述。
在一些實施例中，該方法包括投與包括編碼唾液酸酶之核苷酸序列之重組溶瘤病毒，其中唾液酸酶可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，唾液酸酶係Neu5Ac α(2,6)-Gal唾液酸酶或Neu5Ac α(2,3)-Gal唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係細菌唾液酸酶(例如產氣莢膜梭菌唾液酸酶、黏放線菌唾液酸酶及產脲節桿菌唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌唾液酸酶或霍亂弧菌唾液酸酶)或其衍生物。
在一些實施例中，唾液酸酶包括大細菌唾液酸酶之所有或一部分胺基酸序列，或可包括與大細菌唾液酸酶之所有或一部分胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶結構域包括SEQ ID NO: 2或27或與SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之唾液酸酶序列。在一些實施例中，唾液酸酶結構域包括衍生自SEQ ID NO: 26之胺基酸274-666之黏放線菌唾液酸酶之催化結構域，該催化結構域與SEQ ID NO: 26之胺基酸274-666具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。
在一些實施例中，唾液酸酶係天然唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係包括唾液酸酶催化結構域之融合蛋白。
在一些實施例中，唾液酸酶包括錨定部分。在一些實施例中，唾液酸酶係包括融合至錨定結構域之唾液酸酶催化結構域之融合蛋白。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域係醣胺聚醣(GAG)結合結構域。
在一些實施例中，唾液酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 1-33或53-54組成之群之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%或95%)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少約80% (例如至少約85%、90%或95%)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181。
在一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，錨定結構域或跨膜結構域位於唾液酸酶之羧基末端處。
編碼外來抗原(例如唾液酸酶蛋白)及/或異源性蛋白質之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，啟動子係病毒啟動子，例如早期、晚期或早期/晚期病毒啟動子。在一些實施例中，啟動子係雜合啟動子。在一些實施例中，啟動子包括人類啟動子(例如組織-或腫瘤特異性啟動子)之啟動子序列。適宜啟動子闡述於下文之「 用於表現異源性蛋白質或核酸之啟動子」子部分中。
本文所闡述之方法包括投與有效量之表現嵌合受體之經工程化免疫細胞，例如闡述於下文之「 經工程化免疫細胞」部分中之任一經工程化免疫細胞。在非限制性實例中，經工程化免疫細胞可為T細胞(例如αβT細胞或γδT細胞)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、樹突狀細胞(DC)、細胞介素誘導之殺手(CIK)細胞、細胞介素誘導之天然殺手(CINK)細胞、淋巴因子活化之殺手(LAK)細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、巨噬細胞、周邊血單核細胞(PBMC)或其組合。在一些實施例中，細胞療法包括已經各種細胞介素/抗體組合刺激以活化效應T細胞(CD3、CD38及IL-2)或在一些情形下T細胞及NK細胞(CD3、CD28、IL-15及IL-21)之PBMC細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係CAR-T、CAR-NK、CAR-巨噬細胞或CAR-NKT細胞。
在一些實施例中，經工程化免疫細胞表現識別由腫瘤細胞表現之外來抗原(例如經由本文所提供之任一重組溶瘤病毒遞送至腫瘤細胞中之異源性蛋白質)之嵌合受體。在一些實施例中，由重組溶瘤病毒遞送之外來抗原係細菌肽或細菌唾液酸酶(例如DAS181 (SEQ ID NO: 2))。在一些實施例中，外來抗原係包括跨膜結構域之唾液酸酶。在一些實施例中，外來抗原係不含AR標籤且融合至C-末端跨膜結構域(例如SEQ ID NO: 31)之DAS181。
在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之其他免疫療法。在一些實施例中，在其他免疫療法之前、之後或同時投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，其他免疫療法係多特異性免疫細胞銜接體(例如雙特異性分子，例如BiTE)、細胞療法、癌症疫苗(例如樹突狀細胞(DC)癌症疫苗)、細胞介素(例如IL-15、IL-12、不結合或以較小程度結合至α受體之經修飾IL-2、不結合或以較小程度結合至IL-18 BP之經修飾IL-18、CXCL10或CCL4)、免疫檢查點抑制劑(例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、B7-H4、TIGIT、LAG3、TIM3或HLA之抑制劑)、主開關抗LILRB及雙特異性抗LILRB-4-1BB、抗FAP-CD3、PI3Kγ抑制劑、TLR9配體、HDAC抑制劑、LILRB2抑制劑、MARCO抑制劑等。適宜免疫細胞銜接體及免疫檢查點抑制劑闡述於下文之「其他異源性蛋白質或核酸」子部分中。
在一些實施例中，與單獨之經工程化免疫細胞及/或其他免疫療法相比，投與重組溶瘤病毒可將腫瘤細胞殺死增加至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。
本申請案之一態樣提供減少個體癌細胞之唾液酸化之方法，其包括向個體投與有效量之本文所闡述之任一重組溶瘤病毒及經工程化免疫細胞。在一些實施例中，唾液酸酶減少了腫瘤細胞上之表面唾液酸。在一些實施例中，唾液酸酶將腫瘤細胞上之表面唾液酸減少至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%或90%。在一些實施例中，唾液酸酶自腫瘤細胞之細胞表面裂解α2,3唾液酸及α2,6唾液酸二者。在一些實施例中，唾液酸酶將α2,3唾液酸及α2,6唾液酸二者之裂解增加至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%或90%。
在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增加個體中由工程化免疫細胞殺死之腫瘤細胞。在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增加NK細胞殺死之腫瘤細胞。在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒使NK細胞殺死增加至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與缺乏唾液酸酶之重組溶瘤病毒相比，編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒使NK細胞殺死增加至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增加由T細胞殺死之腫瘤細胞。在一些實施例中，編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒將由T細胞殺死之腫瘤細胞增加至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與缺乏唾液酸酶之重組溶瘤病毒相比，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒將由T細胞殺死之腫瘤細胞增加至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增加由PBMC殺死之腫瘤細胞。在一些實施例中，與缺乏唾液酸酶之重組溶瘤病毒相比，編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒將由PBMC殺死之腫瘤細胞增加至少5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%。
在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增強個體中之細胞介素產生。在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增強T淋巴球之細胞介素產生。在一些實施例中，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒會增強個體腫瘤微環境中之T淋巴球介導之局部細胞介素產生。在一些實施例中，細胞介素包含IL2及IFN-γ。在一些實施例中，與投與缺乏唾液酸酶之溶瘤病毒相比，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒可將細胞介素產生增加至少5%、10%、20%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與投與缺乏唾液酸酶之溶瘤病毒相比，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒可將IL2產生增加至少2.5倍、至少3倍或至少4倍。在一些實施例中，與投與缺乏唾液酸酶之溶瘤病毒相比，投與編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒可將IFN-γ產生增加至少5%、10%、20%、30%、40%或50%。
本文所闡述之方法適於治療各種癌症。如本文中所使用，癌症係病因在於或特徵在於任一類型之惡性腫瘤或血液學惡性腫瘤之疾病之術語，包含轉移性癌症、實體腫瘤、淋巴腫瘤及血癌。
癌症包含白血病、淋巴瘤(何傑金氏(Hodgkins)及非何傑金氏(non-Hodgkins))、肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、實體組織癌(包含乳癌及胰臟癌)、低氧腫瘤、口腔、咽喉、喉及肺之鱗狀細胞癌、泌尿生殖道癌(例如子宮頸癌及膀胱癌)、造血性癌症、頭頸癌及神經系統癌症(例如神經膠質瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤等)、良性病灶(例如乳頭瘤)及諸如此類。
許多癌細胞係過度唾液酸化的。本文所闡述之重組溶瘤病毒能夠將唾液酸酶遞送至腫瘤細胞及腫瘤微環境中。在腫瘤微環境內，唾液酸酶可去除癌細胞上之末端唾液酸殘基，由此減少免疫細胞或免疫療法試劑之進入障壁且促進針對癌細胞之細胞免疫性。舉例而言，免疫細胞上之稱為Siglect (結合唾液酸之免疫球蛋白樣凝集素)之受體群組將結合其抑制性受體配體，該等配體係腫瘤細胞上之唾液酸化醣偶聯物。在一些實施例中，去除唾液酸可防止該等配體結合至免疫細胞上之Siglect且由此消除對腫瘤細胞免疫性之抑制。
在一些實施例中，藉由重組溶瘤病毒遞送唾液酸酶可減少存在於腫瘤細胞上之唾液酸，且致使腫瘤細胞更易於由有效性因癌細胞過度唾液酸化而減弱之免疫細胞、基於免疫細胞之療法及其他治療劑殺死。
在一些實施例中，癌症包括實體腫瘤。在本文所提供之任一方法之一些實施例中，癌症係腺癌、轉移性癌症及/或係難治性癌症。在任一前述方法之某些實施例中，癌症係乳房癌、結腸癌或結腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌或泌尿道上皮癌。在任一前述方法之某些實施例中，癌症係上皮癌(例如子宮內膜癌)、卵巢癌、子宮頸癌、外陰癌、子宮癌、輸卵管癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、胰臟癌、泌尿癌、膀胱癌、頭頸癌、口腔癌或肝癌。在一些實施例中，癌症係選自人類肺泡基底上皮腺癌、人類乳房上皮腺癌及神經膠母細胞瘤。在一些實施例中，癌症係FAP陽性癌症(亦即表現FAP之癌症)。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、結腸癌及乳癌。
在一些實施例中，單獨(例如作為單一療法)或一起同時(例如於相同或分開調配物中，作為組合療法)來投與經工程化免疫細胞及重組溶瘤病毒。在一些實施例中，在投與經工程化免疫細胞之前投與重組溶瘤病毒。在非限制性實例中，可在包括嵌合受體之經工程化免疫細胞之前1或更多、2或更多、4或更多、6或更多、8或更多、10或更多、12或更多、24或更多或48或更多小時投與重組溶瘤病毒。在一些實施例中，在表現靶向由重組溶瘤病毒表現之異源性蛋白質之嵌合抗原受體之經工程化免疫細胞群體之前投與表現重組溶瘤病毒的載體細胞(例如經工程化免疫細胞)群體。在非限制性實例中，可在包括靶向由重組溶瘤病毒表現之異源性蛋白質之嵌合受體之經工程化免疫細胞之前1或更多、2或更多、4或更多、6或更多、8或更多、10或更多、12或更多、24或更多或48或更多小時投與包括重組溶瘤病毒的載體細胞(例如經工程化免疫細胞)。在一些實施例中，投與重組溶瘤病毒(例如以包括重組溶瘤病毒之醫藥組合物或載體細胞)及投與表現嵌合受體之經工程化免疫細胞之間之時間段足以容許病毒在腫瘤細胞中表現異源性蛋白質或核酸。
可使用任何適宜投與途徑及適宜劑量來投與重組溶瘤病毒及包括嵌合受體之經工程化免疫細胞及(在一些實施例中)其他免疫治療劑。熟習此項技術者熟知適當劑量或投與途徑之確定。動物實驗提供了用於測定人類療法之有效劑量之可靠導則。可遵循以下文獻中所制定之原理來種間縮放有效劑量：Mordenti, J.及Chappell, W. 「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,」 Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等人編輯，Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46。
在一些實施例中，依序投與重組溶瘤病毒、包括嵌合受體之經工程化免疫細胞及(在一些實施例中)其他免疫治療劑(舉例而言，可在經工程化免疫細胞之前及/或在其他治療劑之前投與重組溶瘤病毒，該等其他治療劑係(例如)如上文所闡述之雙特異性FAP/CD3抗體、雙特異性或三特異性LILRB-4-1BB抗體、PD-1抗體等)。在一些實施例中，同時或並行投與重組溶瘤病毒、經工程化免疫細胞及/或其他免疫治療劑。在一些實施例中，以單一調配物形式來投與重組溶瘤病毒、經工程化免疫細胞及/或其他免疫治療劑。在一些實施例中，以分開調配物形式來投與重組溶瘤病毒、經工程化免疫細胞及/或其他免疫治療劑。
本發明方法可與癌症治療之習用化學治療方法、放射學方法及/或手術方法組合。 A. 溶瘤病毒
本申請案提供用於治療癌症之重組溶瘤病毒，其包括至少一種編碼異源性蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，異源性蛋白質可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，異源性蛋白質係外來抗原。在一些實施例中，異源性蛋白質係唾液酸酶，例如細菌唾液酸酶。
在一些實施例中，本申請案提供包括編碼唾液酸酶之核苷酸序列之重組溶瘤病毒。在一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，重組溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列。
在一些實施例中，本申請案提供包括編碼唾液酸酶之第一核苷酸序列及編碼異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列之重組溶瘤病毒，其中第一核苷酸序列可操作地連接至啟動子且第二核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列可操作地連接至不同啟動子。在一些實施例中，重組溶瘤病毒包括兩個或更多個核苷酸序列，其中每一核苷酸序列編碼異源性蛋白質或核酸。在一些實施例中，第二核苷酸序列編碼選自由以下組成之群之異源性蛋白質：免疫檢查點抑制劑、免疫抑制受體抑制劑、多特異性免疫細胞銜接體(例如BiTE)、細胞介素、共刺激分子、腫瘤抗原呈遞蛋白、抗血管生成因子、腫瘤相關抗原、外來抗原及基質金屬蛋白酶(MMP)、巨噬細胞或單核球功能調控分子(LILRB抗體)、葉酸鹽受體β抗體、腫瘤細胞特異性抗原(CD19、CDH17等)或腫瘤支架蛋白(FAP、纖維蛋白-3等)之抗體。
在一些實施例中，提供包括編碼唾液酸酶之第一核苷酸序列之重組牛痘病毒，其中第一核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，牛痘病毒進一步包括編碼諸如以下等異源性蛋白質之第二核苷酸：免疫檢查點抑制劑、免疫抑制受體抑制劑、細胞介素、共刺激分子、腫瘤抗原呈遞蛋白、抗血管生成因子、腫瘤相關抗原、外來抗原或基質金屬蛋白酶(MMP)、巨噬細胞或單核球功能調控分子(LILRB抗體)、葉酸鹽受體β抗體、腫瘤細胞特異性抗原(CD19、CDH17等)或腫瘤支架蛋白(FAP、纖維蛋白-3等)之抗體，其中第二核苷酸序列可操作地連接至相同或不同啟動子。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒Western Reserve。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒，且一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R。
在一些實施例中，提供包括編碼唾液酸酶之第一核苷酸序列之重組牛痘病毒，其中第一核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，牛痘病毒進一步包括編碼異源性蛋白質之第二核苷酸，其中異源性蛋白質係膜結合補體活化調節因子(例如CD55、CD59、CD46、CD35、因子H、C4結合蛋白或其他所鑑別補體活化調節因子)，且其中第二核苷酸序列可操作地連接至相同或不同啟動子。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒Western Reserve。在一些實施例中，病毒係牛痘病毒，且一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R。
在一些實施例中，提供包括編碼黏放線菌唾液酸酶或其衍生物之第一核苷酸序列之重組溶瘤病毒(例如牛痘病毒)，其中第一核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質(例如免疫檢查點抑制劑、免疫抑制受體抑制劑、細胞介素、共刺激分子、腫瘤抗原呈遞蛋白、抗血管生成因子、腫瘤相關抗原、外來抗原或基質金屬蛋白酶(MMP))之第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列可操作地連接至相同或不同啟動子。在一些實施例中，重組溶瘤病毒係包膜病毒(例如牛痘病毒)且異源性蛋白質係膜結合補體活化調節因子(例如CD55、CD59、CD46、CD35、因子H、C4結合蛋白或其他所鑑別補體活化調節因子)。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 1或26之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供編碼包括錨定結構域之唾液酸酶(例如DAS181)之重組溶瘤病毒(例如牛痘病毒)。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列。在一些實施例中，錨定結構域係醣胺聚醣(GAG)結合結構域。在一些實施例中，錨定結構域在生理學pH下帶正電。在一些實施例中，錨定結構域位於唾液酸酶之羧基末端處。在一些實施例中，唾液酸酶係衍生自黏放線菌唾液酸酶。在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181。在一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列進一步編碼可操作地連接至唾液酸酶之分泌序列。在一些實施例中，分泌序列可操作地連接至唾液酸酶之胺基末端。
在一些實施例中，提供編碼包括跨膜結構域之唾液酸酶之重組溶瘤病毒(例如牛痘病毒)。在一些實施例中，跨膜結構域包括選自SEQ ID NO: 45-52之胺基酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶係衍生自黏放線菌唾液酸酶。　在一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列進一步編碼可操作地連接至唾液酸酶之分泌序列。
諸多溶瘤病毒包含牛痘病毒、柯薩奇病毒、腺病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、塞尼卡谷病毒、柯薩奇病毒A21、水疱性口炎病毒、細小病毒H1、裡奧病毒、疱疹病毒、慢病毒及脊髓灰白質炎病毒以及細小病毒。可利用牛痘病毒Western Reserve、GLV-1h68、ACAM2000及OncoVEX GFP。可基因修飾該等溶瘤病毒之基因體以插入編碼包含唾液酸酶之所有部分或催化部分之蛋白質的核苷酸序列。編碼包含唾液酸酶之所有部分或催化活性部分之蛋白質之核苷酸序列處於病毒表現盒之控制下，從而唾液酸酶由感染細胞表現。
溶瘤病毒(OV)能夠相對於正常細胞優先累積及複製於腫瘤細胞中且殺死腫瘤細胞。此能力可為病毒(例如痘病毒、裡奧病毒、新城雞瘟病毒及流行性腮腺炎病毒)之天然特徵，或可修飾或選擇病毒以達成此性質。病毒可經基因減毒或修飾以便其可避開抗病毒免疫及受試者中之其他防禦(例如水疱性口炎病毒、單純疱疹病毒、腺病毒)，從而其優先累積於腫瘤細胞或腫瘤微環境中，且/或可使用(例如)腫瘤特異性細胞表面分子、轉錄因子及組織特異性微RNA來選擇腫瘤細胞對病毒之偏好或將腫瘤細胞工程化至病毒中(例如參見Cattaneo等人，Nat. Rev. Microbiol., 6(7):529-540 (2008)；Dorer等人，Adv. Drug Deliv. Rev., 61(7- 8):554-57l (2009)；Kelly等人，Mol. Ther., 17(3):409-416 (2009)；及Naik等人，Expert Opin. Biol. Ther., 9(9): 1163-1176 (2009))。
其他未修飾溶瘤病毒包含熟習此項技術者已知之任一者，包含選自名為GLV-lh68、JX-594、JX-954、ColoAdl、MV-CEA、MV-NIS、ONYX-015、B18R、H101、OncoVEX GM-CSF、Reolysin、NTX-010、CCTG-102、Cavatak、Oncorine及TNFerade之病毒者。
適宜溶瘤病毒已闡述於(例如) WO2020097269中，該案件之全部內容以引用方式併入本文中。本文所闡述之溶瘤病毒包含(例如)水疱性口炎病毒，例如參見美國專利第7,731,974號、第7,153,510號、第6,653,103號及美國專利公開案第2010/0178684號、第2010/0172877號、第2010/0113567號、第2007/0098743號、第20050260601號、第20050220818號及歐洲專利第1385466號、第1606411號及第1520175號；單純疱疹病毒，例如參見美國專利第7,897,146號、第7731,952號、第7,550,296號、第7,537,924號、第6,723,316號、第6,428,968號及美國專利公開案第2011/0177032號、第2011/0158948號、第2010/0092515號、第2009/0274728號、第2009/0285860號、第2009/0215147號、第2009/0010889號、第2007/0110720號、第2006/0039894號及第20040009604號；逆轉錄病毒，例如參見美國專利第6,689,871號、第6,635,472號、第6,639,139號、第5,851,529號、第5,716,826號、第5,716,613號及美國專利公開案第20110212530號；及腺相關病毒，例如參見美國專利第8,007,780號、第7,968,340號、第7,943,374號、第7,906,111號、第7,927,585號、第7,811,814號、第7,662,627號、第7,241,447號、第7,238,526號、第7,172,893號、第7,033,826號、第7,001,765號、第6,897,045號及第6,632,670號。
在一些實施例中，溶瘤病毒係水疱性口炎病毒(VSV)。VSV已用於多種溶瘤病毒應用中。另外，已對VSV實施工程化以表現人類乳頭瘤病毒(HPV)之抗原性蛋白(作為經由接種疫苗來治療HPV陽性子宮頸癌之方法(REF 18337377、29998190))及表現促發炎性因子以增加腫瘤免疫反應(REF 12885903)。已闡述對VSV實施工程化以編碼其他基因之各種方法(REF 7753828)。簡言之，將VSV RNA基因體逆轉錄至具有上游T7 RNA聚合酶啟動子之互補、雙鏈DNA中且鑑別VSV基因體內用於基因插入之適當位置(例如在側接VSV醣蛋白(G)之非編碼5’或3’區域內(REF 12885903)。可(例如)使用Mlu I及Nhe I來達成限制酶消解，從而產生線性化DNA分子。可使由編碼側接適當限制位點之所關注基因之DNA分子組成之插入體連接至線性化VSV基因體DNA。可使用T7聚合酶轉錄所得DNA，從而產生插入所關注基因之完整VSV基因體RNA。經由(例如)轉染及培育將此RNA分子引入哺乳動物細胞中會產生表現由所關注基因編碼之蛋白質之病毒子代。
在一些實施例中，重組溶瘤病毒係腺病毒。在一些實施例中，腺病毒係腺病毒血清型5病毒(Ad5)。Ad5含有人類E2F-1啟動子，該啟動子係視網膜母細胞瘤(Rb)路徑缺陷性腫瘤特異性轉錄調控元件，其驅動必需E1a病毒基因之表現，從而限制病毒複製及Rb路徑缺陷性腫瘤細胞之細胞毒性(REF 16397056)。腫瘤細胞之標誌係Rb路徑缺陷。經由連接至Ad5基因體來將所關注基因工程化至Ad5中。生成含有所關注基因之質體且(例如)使用AsiSI及PacI消解。使用AsiSI及PacI消解Ad5 DNA質體(例如PSF-AD5 (REF Sigma OGS268))且與重組細菌連接酶連接或使用RE消解之所關注基因共轉變至允許大腸桿菌(E.coli)中，如已針對生成表現人類顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之Ad5所報導(REF 16397056)。回收DNA且轉染至允許宿主(例如人類胚胎腎細胞(HEK293)或HeLa中)會產生編碼所關注基因之病毒。
在一些實施例中，重組溶瘤病毒係經修飾溶瘤病毒(例如本文所闡述之任一病毒之衍生物)。在一些實施例中，重組溶瘤病毒包括一或多個與相應野生型病株相比減小病毒之免疫原性之突變。
可經由直接腫瘤內注射來遞送溶瘤病毒。儘管直接腫瘤內遞送可最小化正常細胞對病毒之暴露，但通常因(例如)腫瘤部位難以接近(例如腦腫瘤)或出於腫瘤呈若干擴散於較大區域中之小結節形式或出於疾病轉移性而受限。可經由全身性或局部遞送(例如藉由靜脈內投與或腹膜腔內投與及其他此類途徑)來遞送病毒。全身性遞送不僅可將病毒遞送至原發性腫瘤部位，且亦遞送至彌慢性轉移中。 牛痘病毒 (VV)
在一些實施例中，重組溶瘤病毒係牛痘病毒(VV)。已使用各種VV株作為OV治療之模板；統一特徵在於缺失病毒胸苷激酶(TK)基因，從而致使病毒之生產性複製依賴於主動複製細胞(亦即贅瘤性細胞)，且由此該等VV具有優先癌細胞感染性(例如Western Reserve (WR) VV株) (REF 25876464)。可使用同源重組利用lox位點來產生在基因體中插入所關注基因之VV。
在一些實施例中，病毒係經修飾牛痘病毒。在一些實施例中，病毒係包括一或多個突變之經修飾牛痘病毒。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種蛋白質(例如A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27)中。在一些實施例中，一或多個突變位於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A27L、H3L、D8L及L1R。實例性突變已闡述於(例如)國際專利公開案WO2020086423中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。
使用VV作為癌症治療遞送載體之限制因素係藉由將VV注射至血流中所誘導之強烈中和抗體(Nab)反應，其限制了病毒之維持及擴散能力且防止載體再投用。NAb識別且結合包埋於VV包膜中之病毒醣蛋白，由此防止病毒與宿主細胞受體相互作用。已鑑別諸多參與宿主細胞受體識別之VV醣蛋白。已展示，蛋白質H3L、L1R、A27L、D8L、A33R及B5R尤其可由NAb靶向，其中A27L、H3L、D8L及L1R係呈現於成熟病毒顆粒之表面上之主要NAb抗原。A27L、H3L及D8L係結合至宿主醣胺聚醣(GAG)硫酸乙醯肝素(HS) (A27L及H3L)及硫酸軟骨素(CS) (D8L)且介導病毒至宿主細胞之內吞作用之黏附分子。L1R蛋白參與病毒成熟。在該等蛋白質中之一或多者中包括突變之經修飾牛痘病毒已闡述於國際專利公開案WO2020086423中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，經修飾牛痘病毒包括一或多種選自由以下組成之群之蛋白質：(a)變體牛痘病毒(VV) H3L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 66-69中之任一者具有至少90% (例如至少91%、92 %、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(b)變體牛痘病毒(VV) D8L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 70-72或85中之任一者具有至少90% (例如至少91%、92 %、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)胺基酸序列一致性之胺基酸序列；(c)變體牛痘病毒(VV) A27L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 73具有至少90% (例如至少91%、92 %、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及(d)變體牛痘病毒(VV) L1R蛋白，其包括與SEQ ID NO: 74具有至少90% (例如至少91%、92 %、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，變體VV H3L蛋白在下列胺基酸殘基中之一或多者處包括胺基酸取代或缺失：14、15、16、33、34、35、38、40、44、45、52、131、134、135、136、137、154、155、156、161、166、167、168、198、227、250、253、254、255及256，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，變體VV H3L包括一或多個選自由以下組成之群之胺基酸突變：I14A、D15A、R16A、K38A、P44A、E45A、V52A、E131A、T134A、L136A、R137A、R154A、E155A、I156A、M168A、I198A、E250A、K253A、P254A、N255A及F256A，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 66。
在一些實施例中，變體VV D8L蛋白在下列胺基酸殘基中之一或多者處包括胺基酸取代或缺失：44、48、98、108、117及220，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，變體VV D8L構築體包括一或多個選自由以下組成之群之胺基酸突變：R44A、K48A、K98A、K108A、K117A及R220A，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 70。
在一些實施例中，變體VV A27L蛋白包括胺基酸取代或缺失在下列胺基酸殘基中之一或多者處：27、30、32、33、34、35、36、37、39、40、107、108及109，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，變體A27L構築體包括一或多個選自由以下組成之群之胺基酸突變：K27A、A30D、R32A、E33A、A34D、I35A、V36A、K37A、D39A、E40A、R107A、P108A及Y109A，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 73。
在一些實施例中，變體VV L1R蛋白包括胺基酸取代或缺失在下列胺基酸殘基中之一或多者處：25、27、31、32、33、35、58、60、62、125及127，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，變體L1R構築體包括一或多個選自由以下組成之群之胺基酸突變：E25A、N27A、Q31A、T32A、K33A、D35A、S58A、D60A、D62A、K125A及K127A，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 74。
在一些實施例中，變體VV H3L蛋白包括胺基酸取代或缺失在下列胺基酸殘基中之一或多者處：14、15、16、33、34、35、38、40、44、45、52、131、132、134、135、136、137、154、155、156、161、166、167、168、195、198、199、227、250、251、252、253、254、255、256、258、262、264、266、268、272、273、275及277，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，變體H3L構築體包括一或多個選自由以下組成之群之胺基酸突變：I14A、D15A、R16A、K33A、F34A、D35A、K38A、N40A、P44A、E45A、V52A、E131A、D132A、T134A、F135A、L136A、R137A、R154A、E155A、I156A、K161A、L166A、VI 67 A、M168A、E195A、I198A、V199A、R227A、E250A、N251A、M252A、K253A、P254A、N255A、F256A、S258A、T262P、A264T、K266I、Y268C、M272K、Y273N、F275N及T277A，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 68。
在一些實施例中，變體VV D8L蛋白包括胺基酸取代或缺失在下列胺基酸殘基中之一或多者處：43、44、48、53、54、55、98、108、109、144、168、177、196、199、203、207、212、218、220、222及227，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，變體VV D8L構築體包括一或多個選自由以下組成之群之胺基酸突變：V43A、R44A、K48A、S53A、G54A、G55A、K98A、K108A、K109A、A144G、T168A、S177A、L196A、F199A、L203A、N207A、P212A、N218A、R220A、P222A及D227A，其中胺基酸編號係基於SEQ ID NO: 72。
在一些實施例中，提供包括Western Reserve株之重組牛痘病毒之組合物，該重組牛痘病毒包括與SEQ ID NO: 108之核酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%一致性中之任一者之核酸序列。在一些實施例中，第一核苷酸序列及第二核苷酸序列可操作地連接至一或多個啟動子。在一些實施例中，重組牛痘病毒包括胸苷激酶(TK)基因之破壞或缺失及牛痘生長因子(VGF)基因之破壞或缺失。在一些實施例中，將至少與SEQ ID NO: 108之核酸序列具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99%或100%一致性中之任一者之核酸序列整合至牛痘病毒的TK基因中。 B. 外來抗原及其他異源性蛋白質
本文所闡述之溶瘤病毒包括編碼外來抗原之核苷酸序列。在一些實施例中，外來抗原係唾液酸酶，例如細菌唾液酸酶。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括一或多個編碼異源性蛋白質或核酸之核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼如下文之部分「多特異性免疫細胞銜接體」中所闡述之多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3之雙特異性抗體)之核苷酸序列。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括核苷酸序列編碼如下文之部分「其他異源性蛋白質或核苷酸序列」中所闡述之異源性蛋白質或核酸(例如免疫檢查點抑制劑)。
在一些實施例中，外來抗原係非人類蛋白質。在一些實施例中，外來抗原係病毒多肽，包含病毒蛋白或其肽片段。在一些實施例中，外來抗原係細菌多肽，包含細菌蛋白質或其肽片段。在一些實施例中，外來抗原係天然蛋白質或其抗原性片段(亦即可由包括嵌合受體之經工程化免疫細胞特異性識別之肽片段)。在一些實施例中，外來抗原係合成多肽。在一些實施例中，外來抗原係包括融合至一或多個多肽序列之抗原肽之融合蛋白，該等多肽序列有助於抗原肽之抗原活性(亦即能夠由包括嵌合受體之經工程化免疫細胞特異性識別)。舉例而言，外來抗原可包含促進外來抗原與腫瘤細胞之細胞表面之間之相互作用的錨定結構域。舉例而言，在唾液酸酶構築體中，錨定結構域及唾液酸酶結構域可以容許蛋白質結合於靶細胞膜處或其附近之任一適當方式進行配置，從而治療性唾液酸酶可展現去除唾液酸殘基之細胞外活性。外來抗原可具有一個以上之錨定結構域。在外來抗原具有一個以上之錨定結構域之情形下，該等錨定結構域可相同或不同。外來抗原可包括一或多個跨膜結構域(例如一或多個跨膜α螺旋)。外來抗原可具有一個以上之抗原肽，例如一個以上之唾液酸酶結構域。在外來抗原具有一個以上之唾液酸酶結構域之情形下，該等唾液酸酶結構域可相同或不同。在外來抗原包括多個錨定結構域之情形下，該等錨定結構域可串聯配置(使用或不使用連接體)或配置於其他結構域(例如抗原肽，例如唾液酸酶結構域)之交替側上。在外來抗原包括多個抗原肽(例如唾液酸酶結構域)之情形下，抗原肽(例如唾液酸酶結構域)可串聯配置(使用或不使用連接體)或配置於其他結構域之交替側上。在一些實施例中，外來抗原包括穩定化結構域，例如Fc結構域。 1. 唾液酸酶
在一些實施例中，重組溶瘤病毒編碼包含能夠(例如)自人類細胞上之聚醣去除唾液酸(N-乙醯基神經胺酸(Neu5Ac))之唾液酸酶之所有部分或催化部分的異源性蛋白質。一般而言，Neu5Ac藉由各種唾液醯基轉移酶中之任一者經由α 2,3、α 2,6或α 2,8鍵聯連接至蛋白質上之聚醣中之倒數第二個糖。
除天然唾液酸酶或其催化部分外，異源性蛋白質亦可視情況包含有助於蛋白質之治療活性之肽或蛋白序列。舉例而言，該蛋白質可包含促進蛋白質與細胞表面之間之相互作用之錨定結構域。錨定結構域及唾液酸酶結構域可以容許蛋白質結合於靶細胞膜處或其附近之任一適當方式進行配置，從而治療性唾液酸酶可展現去除唾液酸殘基之細胞外活性。該蛋白質可具有一個以上之錨定結構域。在多肽具有一個以上之錨定結構域之情形下，該等錨定結構域可相同或不同。該蛋白質可包括一或多個跨膜結構域(例如一或多個跨膜α螺旋)。該蛋白質可具有一個以上之唾液酸酶結構域。在化合物具有一個以上之唾液酸酶結構域之情形下，該等唾液酸酶結構域可相同或不同。在蛋白質包括多個錨定結構域之情形下，該等錨定結構域可串聯配置(使用或不使用連接體)或配置於其他結構域(例如唾液酸酶結構域)之交替側上。在化合物包括多個唾液酸酶結構域之情形下，唾液酸酶結構域可串聯配置(使用或不使用連接體)或配置於其他結構域之交替側上。 唾液酸酶催化活性
在一些實施例中，唾液酸酶具有如由酶學委員會EC 3.2.1.18定義之外切唾液酸酶活性。在一些實施例中，唾液酸酶係如由酶學委員會EC 4.2.2.15定義之無水唾液酸酶。
在一些實施例中，由溶瘤病毒表現之唾液酸酶可對經由α 2,3鍵聯連接之Neu5Ac具有特異性，對經由α 2,6鍵聯連接之Neu5Ac具有特異性，對經由α 2,8鍵聯連接之Neu5Ac具有特異性，或可裂解經由α 2,3鍵聯或α 2,6鍵聯連接之Neu5Ac。在一些實施例中，唾液酸酶可裂解經由α 2,3鍵聯、α 2,6鍵聯或α 2,8鍵聯連接之Neu5Ac。各種唾液酸酶闡述於表2-5中。
可裂解唾液酸殘基與受質分子之其他部分之間之一類以上鍵聯的唾液酸酶(尤其可裂解α(2,6)-Gal鍵聯及α(2,3)-Gal鍵聯二者或α(2,6)-Gal鍵聯及α(2,3)-Gal鍵聯二者及α(2,8)-Gal鍵聯之唾液酸酶)可用於本發明化合物中。所包含唾液酸酶係可降解受體唾液酸Neu5Ac α(2,6)-Gal及Neu5Ac α(2,3)-Gal之大細菌唾液酸酶。舉例而言，可使用來自產氣莢膜梭菌(基因庫登錄號X87369)、黏放線菌(基因庫X62276)、產脲節桿菌(基因庫AY934539)或產綠小單胞菌(Micromonospora viridifaciens) (基因庫登錄號D01045)之細菌唾液酸酶。
在一些實施例中，唾液酸酶包括大細菌唾液酸酶之所有或一部分胺基酸序列，或可包括與大細菌唾液酸酶之所有或一部分胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶結構域包括SEQ ID NO: 2或27或與SEQ ID NO: 12具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之唾液酸酶序列。在一些實施例中，唾液酸酶結構域包括衍生自SEQ ID NO: 26之胺基酸274-666之黏放線菌唾液酸酶之催化結構域，該催化結構域與SEQ ID NO: 26之胺基酸274-666具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%之序列一致性。
其他唾液酸酶包含人類唾液酸酶，例如由基因NEU2 (SEQ ID NO: 4；基因庫登錄號Y16535；Monti, E, Preti, Rossi, E., Ballabio, A及Borsani G. (1999) Genomics 57:137-143)及NEU4 (SEQ ID NO: 6；基因庫登錄號NM080741；Monti等人(2002) Neurochem Res 27:646-663)編碼者。本發明化合物之唾液酸酶結構域可包括唾液酸酶之所有或一部分胺基酸序列，或可包括與唾液酸酶之所有或一部分胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，在唾液酸酶結構域包括天然唾液酸酶之一部分胺基酸序列或與天然唾液酸酶之一部分胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之序列的情形下，該部分與完整唾液酸酶包括基本上相同之活性。在一些實施例中，由重組溶瘤病毒表現之唾液酸酶係唾液酸酶催化結構域蛋白。如本文中所使用，「唾液酸酶催化結構域蛋白」包括唾液酸酶之催化結構域，但不包括衍生催化結構域之唾液酸酶之整個胺基酸序列。「唾液酸酶催化結構域蛋白」具有唾液酸酶活性，且本文所用之術語可與「唾液酸酶」互換使用。在一些實施例中，唾液酸酶催化結構域蛋白包括至少10%、至少20%、至少50%、至少70%之衍生催化結構域序列之唾液酸酶之活性。在一些實施例中，唾液酸酶催化結構域蛋白包括至少90%之衍生催化結構域序列之唾液酸酶之活性。
唾液酸酶催化結構域蛋白可包含其他胺基酸序列，例如(但不限於)其他唾液酸酶序列、衍生自其他蛋白質之序列或非衍生自天然蛋白序列之序列。其他胺基酸序列可實施諸多功能中之任一者，包含向催化結構域蛋白貢獻其他活性，增強唾液酸酶催化結構域蛋白之表現、處理、摺疊或穩定性，或甚至提供期望之蛋白質大小或間隔。
在一些實施例中，唾液酸酶催化結構域蛋白係包括黏放線菌唾液酸酶之催化結構域之蛋白質。在一些實施例中，黏放線菌唾液酸酶催化結構域蛋白包括黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26；基因庫WP_003789074)之胺基酸270-666。在一些實施例中，黏放線菌唾液酸酶催化結構域蛋白包括始於黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26)之胺基酸270至胺基酸290中之任一胺基酸且止於該黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26)之胺基酸665至胺基酸901中之任一胺基酸的胺基酸序列，且缺乏自胺基酸1延伸至胺基酸269之任一黏放線菌唾液酸酶蛋白序列。
在一些實施例中，黏放線菌唾液酸酶催化結構域蛋白包括黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26)之胺基酸274-681且缺乏其他黏放線菌唾液酸酶序列。在一些實施例中，黏放線菌唾液酸酶催化結構域蛋白包括黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26)之胺基酸274-666且缺乏任一其他黏放線菌唾液酸酶序列。在一些實施例中，黏放線菌唾液酸酶催化結構域蛋白包括黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26)之胺基酸290-666且缺乏任一其他黏放線菌唾液酸酶序列。在其他實施例中，黏放線菌唾液酸酶催化結構域蛋白包括黏放線菌唾液酸酶序列(SEQ ID NO: 26)之胺基酸290-681且缺乏任一其他黏放線菌唾液酸酶序列。
在一些實施例中，用於由溶瘤病毒表現之有用唾液酸酶多肽包含含有如下序列之多肽：其與SEQ ID NO: 27 90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致或包括SEQ ID NO: 27之375、376、377、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391或392個鄰接胺基酸。
在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181、其功能衍生物(例如其片段)或其生物類似物。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 2至少約80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括SEQ ID NO: 2之414、413、412、411或410個鄰接胺基酸。在一些實施例中，唾液酸酶包括不含錨定結構域(AR結構域)之DAS181片段。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 27至少約80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)或100%一致之胺基酸序列。
DAS181係具有結合肝素之錨定結構域之重組唾液酸酶融合蛋白。DAS181與製備及調配DAS181之方法闡述於US 7,645,448、US 9,700,602及US 10,351,828中，該等案件中之每一者之全部內容出於任何及所有目以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181之分泌形式、其功能衍生物或其生物類似物。在一些實施例中，編碼分泌形式之DAS181之核苷酸序列編碼可操作地連接至DAS181之分泌序列，其中分泌序列使得蛋白質能夠自真核細胞分泌。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 28至少約80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 28至少約80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括SEQ ID NO: 28之414、413、412、411或410個鄰接胺基酸。
在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181之跨膜形式、其功能衍生物或其生物類似物。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 31至少約80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 31至少約80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括SEQ ID NO: 31之414、413、412、411或410個鄰接胺基酸。 表 2 ：經工程化唾液酸酶
名稱 序列
黏放線菌唾液酸酶    mtshspfsrr hlpallgslp laatgliaaa ppahavptsd gladvtitqv napadglysv gdvmtfnitl tntsgeahsy apastnlsgn vskcrwrnvp agttktdctg lathtvtaed lkaggftpqi ayevkaveya gkalstpeti kgatspvkan slrvesitps sskeyyklgd tvtytvrvrs vsdktinvaa tessfddlgr qchwgglkpg kgavynckpl thtitqadvd agrwtpsitl tatgtdgtal qtltatgnpi nvvgdhpqat papapdaste lpasmsqaqh vapntatdny ripaittapn gdllisyder pkdngnggsd apnpnhivqr rstdggktws aptyihqgte tgkkvgysdp syvvdhqtgt ifnfhvksyd hgwgnsqagt dpenrgiiqa evststdngw twthrtitad itkdnpwtar faasgqgiqi qhgphagrlv qqytirtagg avqavsvysd dhgktwqagt pvgtgmdenk vvelsdgslm lnsrasdssg frkvahstdg gqtwsepvsd knlpdsvdna qiirafpnaa pddprakvll lshspnpkpw srdrgtisms cddgaswtts kvfhepfvgy ttiavqsdgs igllsedahd ganyggiwyr nftmnwlgeq cgqkpaepsp apsptaapsa apseqpapsa apsteptqap apssapepsa vpepssapap epttapstep tptpapssap epsagptaap apetssapaa eptqaptvap saeptqvpga qpsaapsekp gaqpssapkp datgrapsvv npkataapsg kasssaspap srsatatskp gmepdeidrp sdgamaqptg gasapsaapt qaakagsrls rtgtnallvl glagvavvgg ylllrarrsk n (SEQ ID NO:26)
AvCD MGDHPQATPA PAPDASTELP ASMSQAQHLA ANTATDNYRI PAITTAPNGD LLISYDERPK DNGNGGSDAP NPNHIVQRRS TDGGKTWSAP TYIHQGTETG KKVGYSDPSY VVDHQTGTIF NFHVKSYDQG WGGSRGGTDP ENRGIIQAEV STSTDNGWTW THRTITADIT KDKPWTARFA ASGQGIQIQH GPHAGRLVQQ YTIRTAGGAV QAVSVYSDDH GKTWQAGTPI GTGMDENKVV ELSDGSLMLN SRASDGSGFR KVAHSTDGGQ TWSEPVSDKN LPDSVDNAQI IRAFPNAAPD DPRAKVLLLS HSPNPRPWSR DRGTISMSCD DGASWTTSKV FHEPFVGYTT IAVQSDGSIG LLSEDAHNGA DYGGIWYRNF TMNWLGEQCG QKPAE (SEQ ID NO:1)
DAS181 MGDHPQATPA PAPDASTELP ASMSQAQHLA ANTATDNYRI PAITTAPNGD LLISYDERPK DNGNGGSDAP NPNHIVQRRS TDGGKTWSAP TYIHQGTETG KKVGYSDPSY VVDHQTGTIF NFHVKSYDQG WGGSRGGTDP ENRGIIQAEV STSTDNGWTW THRTITADIT KDKPWTARFA ASGQGIQIQH GPHAGRLVQQ YTIRTAGGAV QAVSVYSDDH GKTWQAGTPI GTGMDENKVV ELSDGSLMLN SRASDGSGFR KVAHSTDGGQ TWSEPVSDKN LPDSVDNAQI IRAFPNAAPD DPRAKVLLLS HSPNPRPWSR DRGTISMSCD DGASWTTSKV FHEPFVGYTT IAVQSDGSIG LLSEDAHNGA DYGGIWYRNF TMNWLGEQCG QKPAKRKKKG GKNGKNRRNR KKKNP (SEQ ID NO:2)
不含初始Met且不含錨定結構域之DAS181 GDHPQATPAP APDASTELPA SMSQAQHLAA NTATDNYRIP AITTAPNGDL LISYDERPKD NGNGGSDAPN PNHIVQRRST DGGKTWSAPT YIHQGTETGK KVGYSDPSYV VDHQTGTIFN FHVKSYDQGW GGSRGGTDPE NRGIIQAEVS TSTDNGWTWT HRTITADITK DKPWTARFAA SGQGIQIQHG PHAGRLVQQY TIRTAGGAVQ AVSVYSDDHG KTWQAGTPIG TGMDENKVVE LSDGSLMLNS RASDGSGFRK VAHSTDGGQT WSEPVSDKNL PDSVDNAQII RAFPNAAPDD PRAKVLLLSH SPNPRPWSRD RGTISMSCDD GASWTTSKVF HEPFVGYTTI AVQSDGSIGL LSEDAHNGAD YGGIWYRNFT MNWLGEQCGQ KPA (SEQ ID NO:27)
膜結合唾液酸酶 (分泌序列及TM加下劃線) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDMGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGFTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPA NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR(SEQ ID NO : 31)
分泌型唾液酸酶 (分泌序列加下劃線) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNP (SEQ ID NO: 28)
表 3 ：人類唾液酸酶
名稱 Uniprot 識別符 SEQ ID NO
人類Neu 1 Q99519 3
人類Neu 2 Q9Y3R4 4
人類Neu 3 Q9UQ49 5
人類Neu 4 Q8WWR8 6
人類Neu 4同種型2 Q8WWR8 7
人類Neu 4同種型3 Q8WWR8 8
表 4 ：與人類高度共生之生物體中之液酸酶
生物體 Uniprot/ 基因庫編號 基因名稱 SEQ ID NO
黏放線菌 Q59164 nanH 9
黏放線菌 A0A448PLN7 nanA 10
口腔鏈球菌( Streptococcus oralis) A0A081R4G6 nanA 11
口腔鏈球菌 D4FUA3 nanH 12
和緩鏈球菌( Streptococcus mitis) A0A081Q0I6 nanA 13
和緩鏈球菌 A0A3R9LET9 nanA_1 14
和緩鏈球菌 A0A3R9J1C3 nanA_2 15
和緩鏈球菌 A0A3R9IIK2 nanA_3 16
和緩鏈球菌 A0A3R9IXG7 nanA_4 17
和緩鏈球菌 A0A3R9K5C5 nanA_5 18
和緩鏈球菌 J1H2U0 nanH 19
牙齦卟啉單胞菌( Porphyromonas gingivalis) B2RL82 20
福賽斯坦納菌( Tannerella forsythia) Q84BM9 siaHI 21
福賽斯坦納菌 A0A1D3USB1 nanH 22
嗜黏蛋白艾克曼氏菌( Akkermansia Muciniphila) B2UPI5    23
嗜黏蛋白艾克曼氏菌 B2UN42    24
多形擬桿菌( Bacteroides thetaiotaomicron) Q8AAK9    25
表 5 ：其他唾液酸酶
生物體 Uniprot/ 基因庫編號
史查理阿科諾菌( Actinotignum schaalii) S2VK03
人結腸厭氧棍狀菌( Anaerotruncus colihominis) B0PE27
活潑瘤胃球菌( Ruminococcus gnavus) A0A2N5NZH2
難養芽胞梭菌( Clostridium difficile) Q185B3
敗血梭菌( Clostridium septicum) P29767
產氣莢膜梭菌 P10481
產氣莢膜梭菌 Q8XMY5
產氣莢膜梭菌 A0A2Z3TZA2
霍亂弧菌( Vibrio cholerae) P0C6E9
鼠傷寒沙門桿菌( Salmonella typhimurium) P29768
索氏梭菌( Paeniclostridium sordellii) A0A446I8A2
肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumoniae) (NanA) P62576
肺炎鏈球菌 (NanB) Q54727
綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa) A0A2X4HZU8
煙曲黴菌( Aspergillus fumigatus) Q4WQS0
產脲節桿菌 Q5W7Q2
產綠小單胞菌 Q02834
錨定結構域
在一些實施例中，外來抗原(例如唾液酸酶)包括錨定結構域(亦在本文中稱為「錨定部分」)。如本文中所使用，「細胞外錨定結構域」或「錨定結構域」係與位於靶細胞之外表面處或其上或緊鄰靶細胞之外表面之實體相互作用的任一部分。錨定結構域可用於使本發明之外來抗原(例如唾液酸酶)保留於靶細胞之外表面處或其附近。細胞外錨定結構域可結合：1)表現於癌細胞表面上之分子或表現於癌細胞表面上之分子之部分、結構域或表位；2)附接至表現於癌細胞表面上之分子之化學實體；或3)環繞癌細胞之細胞外基質之分子。
實例性錨定結構域結合至肝素/硫酸，硫酸肝素係一類普遍存在於細胞膜上之GAG。許多蛋白質特異性結合至肝素/硫酸乙醯肝素，且已鑑別該等蛋白質中之GAG結合序列(Meyer, F A, King, M及Gelman, R A. (1975) Biochimica et Biophysica Acta 392: 223-232；Schauer, S.編輯，pp 233. Sialic Acids Chemistry, Metabolism and Function. Springer-Verlag, 1982)。舉例而言，人類血小板因子4 (PF4) (SEQ ID NO:77)、人類介白素8 (IL8) (SEQ ID NO:78)、人類抗凝血酶III (AT III) (SEQ ID NO:80)、人類缺輔基蛋白E (ApoE) (SEQ ID NO:80)、人類血管相關遷移細胞蛋白(AAMP) (SEQ ID NO:81)或人類雙調蛋白(SEQ ID NO:82)之GAG結合序列已展示對肝素具有極高親和力。
在一些實施例中，錨定結構域係非蛋白質錨定部分，例如磷脂醯肌醇(GPI)連接體。 連接體
外來抗原可包括一或多個佈置於不同結構域之間之多肽連接體。舉例而言，包含唾液酸酶或其催化結構域之蛋白質可視情況包含一或多個可接合唾液酸酶之各個結構域之多肽連接體。連接體可用於提供蛋白質結構域之最佳間隔或摺疊。藉由連接體接合之蛋白質結構域可為唾液酸酶結構域、錨定結構域、跨膜結構域或外來抗原中提供其他功能(例如增強蛋白質穩定性、促進純化等)之任何其他結構域或部分。一些較佳連接體包含胺基酸甘胺酸。舉例而言，連接體具有序列：(GGGGS (SEQ ID NO: 55))n，其中n為1-20。在一些實施例中，連接體係免疫球蛋白之鉸鏈區。任一能夠保持催化結構域無立體阻礙之鉸鏈或連接體序列可用於將某一唾液酸酶結構域連接至另一結構域(例如跨膜結構域或錨定結構域)。在一些實施例中，連接體係包括SEQ ID NO: 62之序列之鉸鏈結構域。 分泌序列
在一些實施例中，編碼外來抗原(例如唾液酸酶)之核苷酸序列進一步編碼可操作地連接至外來抗原(例如唾液酸酶)之分泌序列(例如信號序列或信號肽)。術語「分泌序列」、「信號序列」及「信號肽」可互換使用。在一些實施例中，分泌序列係可操作地連接至蛋白質之N-末端之信號肽。在一些實施例中，分泌序列之長度介於10個胺基酸與30個胺基酸之間(例如介於15個胺基酸與25個胺基酸之間、介於15個胺基酸與22個胺基酸之間或介於20個胺基酸與25個胺基酸之間)。在一些實施例中，分泌序列使得能夠自真核細胞分泌蛋白質。在易位穿過內質網膜期間，分泌序列通常裂解掉且蛋白質進入分泌路徑中。在一些實施例中，核苷酸序列自N-末端至C-末端編碼分泌序列、唾液酸酶及跨膜結構域，其中唾液酸酶可操作地連接至分泌序列及跨膜結構域。在一些實施例中，N-末端分泌序列發生裂解，從而產生具有N-末端細胞外結構域之蛋白質。一實例性分泌序列提供於SEQ ID NO: 40中。 跨膜結構域
在一些實施例中，外來抗原(例如唾液酸酶)係包括跨膜結構域之唾液酸酶。在一些實施例中，抗原肽(例如唾液酸酶結構域)可接合至哺乳動物(較佳地人類)跨膜(TM)結構域。此配置允許外來抗原(例如唾液酸酶)表現於細胞表面上。適宜跨膜結構域包含(但不限於)包括以下結構域之序列：人類CD28 TM結構域(NM_006139；FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 46)；人類CD4 TM結構域(M35160；MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF (SEQ ID NO: 47)；人類CD8 TM1結構域(NM_001768；IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 48)；人類CD8 TM2結構域(NM_001768；IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (SEQ ID NO: 49)；人類CD8 TM3結構域(NM_001768；IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 50)；人類41BB TM結構域(NM_001561；IISFFLALTSTALLFLLFF LTLRFSVV (SEQ ID NO: 51)；人類PDGFR TM1結構域(VVISAILA LVVLTIISLIILI；SEQ ID NO:52)；及人類PDGFR TM2結構域NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR；SEQ ID NO: 45)。
在一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列編碼自胺基末端至羧基末端包括分泌序列(例如SEQ ID NO: 40)、唾液酸酶(例如包括選自SEQ ID NO: 1-27之胺基酸序列之唾液酸酶)及跨膜結構域(例如選自SEQ ID NO: 45-52之跨膜結構域)之蛋白質。然而，可使用任一適宜分泌序列、唾液酸酶結構域序列或跨膜結構域。在一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列編碼自胺基末端至羧基末端包括分泌序列(例如SEQ ID NO: 40)、SEQ ID NO: 27之唾液酸酶及跨膜結構域(例如選自SEQ ID NO: 45-52之跨膜結構域)之蛋白質。
在一些實施例中，唾液酸酶與選自SEQ ID NO: 31之序列具有至少50%、至少60%、至少65%、80% (例如至少約85%、86%、87%、88%、89%中之任一者)或至少90% (例如至少約91%、92%、94%、96%、98%或99%中之任一者)之序列一致性。在一些實施例中，唾液酸酶包括選自SEQ ID NO: 31之序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 穩定化結構域
在一些實施例中，外來抗原(例如唾液酸酶)包括穩定化結構域。穩定結構域可為穩定抑制性多肽之任一適宜結構域。在一些實施例中，穩定結構域延長了抑制性多肽之活體內半衰期。在一些實施例中，穩定結構域係Fc結構域。在一些實施例中，穩定結構域係白蛋白結構域。
在一些實施例中，穩定化結構域係免疫球蛋白G (IgG) Fc (可結晶片段)結構域。在一些實施例中，Fc結構域係選自由以下組成之群：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其組合及雜合體之Fc片段。在一些實施例中，Fc結構域係衍生自人類IgG。在一些實施例中，Fc結構域包括人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或組合或雜合IgG之Fc結構域。在一些實施例中，IgG Fc結構域包括與SEQ ID NO: 104之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，IgG Fc結構域包括SEQ ID NO: 104之胺基酸序列。
在一些實施例中，外來抗原(例如唾液酸酶)自N-末端至C-末端包括：抗原肽(例如唾液酸酶催化結構域)、IgG Fc結構域及跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 105或106之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，唾液酸酶包括SEQ ID NO: 105或106之胺基酸序列。
在一些實施例中，唾液酸酶包括跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括：唾液酸酶催化結構域、鉸鏈區及跨膜結構域。在一些實施例中，唾液酸酶自N-末端至C-末端包括：唾液酸酶催化結構域、鉸鏈區、IgG Fc區及跨膜結構域。在一些實施例中，鉸鏈區係IgG1鉸鏈區。在一些實施例中，IgG Fc結構域包括SEQ ID NO: 104之胺基酸序列。 2. 多特異性免疫細胞銜接體
在一些實施例中，重組溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體之核苷酸序列。在一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體係雙特異性免疫細胞銜接體。在一些實施例中，異源性蛋白質係雙特異性T細胞銜接體(BiTE)。實例性雙特異性免疫細胞銜接體已闡述於(例如)國際專利公開案WO2018049261中，該公開案之全部內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，雙特異性免疫細胞銜接體包括特異性識別腫瘤抗原(例如EpCAM、FAP或EGFR等)之第一抗原結合結構域(例如scFv)及特異性識別效應細胞上之細胞表面分子(例如T淋巴球上之CD3或4-1BB)之第二抗原結合結構域(例如scFv)。腫瘤抗原可為腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)。在一些實施例中，TAA或TSA表現於實體腫瘤之細胞上。腫瘤抗原包含(但不限於) EpCAM、FAP、EphA2、HER2、GD2、EGFR、VEGFR2及磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)、CDH17、纖維蛋白-3、HHLA2、葉酸鹽受體等。在一些實施例中，腫瘤抗原係EpCAM。在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP。在一些實施例中，腫瘤抗原係EGFR。
如上所述，效應細胞包含(但不限於) T淋巴球、B淋巴球、天然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、單核球、嗜中性球、NKT細胞或諸如此類。在一些實施例中，效應細胞係T淋巴球。在一些實施例中，效應細胞係細胞毒性T淋巴球。效應細胞上之細胞表面分子包含(但不限於) CD3、CD4、CD5、CD8、CD16、CD28、CD40、CD64、CD89、CD134、CD137、NKp46、NKG2D或諸如此類。在一些實施例中，細胞表面分子係CD3。
本申請案之效應細胞上之細胞表面分子係發現於特定細胞類型或有限數量細胞類型之外細胞壁或細胞質膜上之分子。細胞表面分子之實例包含(但不限於)膜蛋白，例如受體、轉運蛋白、離子通道、質子幫浦及G蛋白質偶合受體；細胞外基質分子，例如黏附分子(例如整聯蛋白、鈣黏蛋白、選擇素或NCAMS)；例如參見美國專利第7,556,928號，其全部內容以引用方式併入本文中。效應細胞上之細胞表面分子包含(但不限於) CD3、CD4、CD5、CD8、CD16、CD27、CD28、CD38、CD64、CD89、CD134、CD137、CD154、CD226、CD278、NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D及恆定TCR。
銜接體分子之細胞表面分子結合結構域可活化免疫效應細胞。熟習此項技術者認識到，免疫細胞具有不同之細胞表面分子。舉例而言，CD3係T細胞上之細胞表面分子，而CD16、NKG2D或NKp30係NK細胞上之細胞表面分子，且CD3或恆定TCR係NKT細胞上之細胞表面分子。活化T細胞之銜接體分子可由此與活化NK細胞之銜接體分子具有不同之細胞表面分子結合結構域。在(例如)免疫細胞係T細胞之一些實施例中，活化分子係CD3 (例如CD3γ、CD3δ或CD3ε)或CD27、CD28、CD40、CD134、CD137及CD278中之一或多者。在(例如)免疫細胞係NK細胞之一些其他實施例中，細胞表面分子係CD16、NKG2D或NKp30，或在免疫細胞係NKT細胞之一些實施例中，細胞表面分子係CD3或恆定TCR。
CD3包括三條不同多肽鏈(ε、δ及γ鏈)，且係由T細胞表現之抗原。三條CD3多肽鏈與T細胞受體(TCR)及ζ鏈締合以形成TCR複合物，該複合物具有活化T細胞中之信號傳導級聯之功能。當前，許多治療策略靶向TCR信號轉導以使用抗人類CD3單株抗體來治療疾病。CD3特異性抗體OKT3係批準用於人類治療應用之第一單株抗體，且在臨床上用作用於治療同種異體移植排斥之免疫調節劑。
在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3或41-BB。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面標記物係CD3ε。在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，第一抗原結合結構域係scFv，且第二抗原結合結構域係scFv。在一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體包括識別FAP之第一scFv及識別CD3/CD3ε之第二scFv。
在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP且第一抗原結合結構域包括：(i)第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)，其包括SEQ ID NO: 86之胺基酸序列；(ii)第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)，其包括SEQ ID NO: 87之胺基酸序列；(iii)第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)，其包括SEQ ID NO: 88之胺基酸序列，(iv)第一重鏈互補決定區(CDR-H1)，其包括SEQ ID NO: 89之胺基酸序列；(v)第二重鏈互補決定區(CDR-H2)，其包括列SEQ ID NO: 90之胺基酸序；及(vi)第三重鏈互補決定區(CDR-H3)，其包括SEQ ID NO: 91之胺基酸序列。在一些實施例中，腫瘤抗原係FAP且第一抗原結合結構域包括與SEQ ID NO: 98之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 98之胺基酸序列。
在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3，且第二抗原結合結構域包括：(i)第一輕鏈互補決定區(CDR-L1)，其包括SEQ ID NO: 92之胺基酸序列；(ii)第二輕鏈互補決定區(CDR-L2)，其包括SEQ ID NO: 93之胺基酸序列；(iii)第三輕鏈互補決定區(CDR-L3)，其包括SEQ ID NO: 94之胺基酸序列；(iv)第一重鏈互補決定區(CDR-H1)，其包括SEQ ID NO: 95之胺基酸序列；(v)第二重鏈互補決定區(CDR-H2)，其包括SEQ ID NO: 96之胺基酸序列；及(vi)第三重鏈互補決定區(CDR-H3)，其包括SEQ ID NO: 97之胺基酸序列。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3且第二抗原結合結構域包括與SEQ ID NO: 99之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，效應細胞上之細胞表面分子係CD3且第二抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 99之胺基酸序列。
在一些實施例中，重組溶瘤病毒包括編碼多特異性免疫細胞銜接體之第二核苷酸序列，該多特異性免疫細胞銜接體包括與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性之胺基酸序列。在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，多特異性免疫細胞銜接體包括SEQ ID NO: 100之胺基酸序列。
在一些情形下，不同於來自上述參考序列(例如第一scFv之SEQ ID NO: 98、第二scFv之SEQ ID NO: 99或多特異性免疫細胞銜接體之SEQ ID NO: 100)者之胺基酸係保守取代或高度保守性取代。保守取代及高度保守性取代可如上文之「唾液酸酶」部分中所定義。
在一些實施例中，第二核苷酸序列進一步編碼可操作地連接至多特異性免疫細胞銜接體之信號肽序列。在一些實施例中，信號肽序列包括SEQ ID NO: 103之胺基酸序列。在一些實施例中，第二核苷酸序列編碼與SEQ ID NO: 101具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第二核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 101之胺基酸序列。在一些實施例中，第二核苷酸序列包括與SEQ ID NO: 109之核酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性之核酸序列。在一些實施例中，第二核苷酸序列包括SEQ ID NO: 109之核酸序列。 3. 其他異源性蛋白質或核苷酸序列
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列。在一些實施例中，第二核苷酸序列編碼異源性蛋白質。
在上述任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，異源性蛋白質係免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIGIT、LAG3、TIM-3、VISTA、B7-H4或HLA-G之抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係抗體。在一些實施例中，免疫檢查點調節劑係免疫檢查點抑制劑，例如PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CD160、CD73、CTLA-4、B7-H4、TIGIT、VISTA或2B4之抑制劑或拮抗劑抗體或誘餌配體。在一些實施例中，免疫檢查點調節劑係PD-1抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係針對免疫檢查點分子之抗體，例如抗PD-1抗體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係結合至免疫檢查點分子之配體，例如可溶性或游離PD-L1/PD-L2。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係融合至免疫球蛋白之Fc片段(例如IgG4 Fc)之PD-1細胞外結構域，其可阻斷腫瘤細胞表面上之PDL-1結合至免疫細胞上之免疫檢查點PD-1。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係結合至HHLA2之配體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係融合至免疫球蛋白之Fc片段(例如IgG4 Fc)之TMIGD2之細胞外結構域。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係結合至至少兩種不同抑制性免疫檢查點分子(例如雙特異性)之配體，例如結合至CD47及CXCR4二者之配體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包括融合至免疫球蛋白之Fc片段(例如IgG4 Fc)之SIRPα細胞外結構域及CXCL12片段。該等分子可結合至癌細胞上之CD47，由此阻止其與SIRPα之相互作用以阻斷發送至巨噬細胞及樹突狀細胞之「勿吃吾」信號。
在一些實施例中，異源性蛋白質係免疫抑制受體之抑制劑。免疫抑制受體可為由免疫效應細胞表現之抑制或減小腫瘤細胞免疫反應之任一受體。實例性效應細胞包含(但不限於) T淋巴球、B淋巴球、天然殺手(NK)細胞、樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、單核球、嗜中性球、NKT細胞或諸如此類。在一些實施例中，免疫抑制受體係LILRB、TYRO3、AXL、葉酸鹽受體β或MERTK。在一些實施例中，免疫抑制受體之抑制劑係抗LILRB抗體。
在一些實施例中，異源性蛋白質減小了個體免疫系統對重組溶瘤病毒之中和。在一些實施例中，重組溶瘤病毒係包膜病毒(例如牛痘病毒)，且異源性蛋白質係補體活化調節因子(例如CD55或CD59)。補體係先天性免疫系統之關鍵組分，其靶向病毒以予以中和且自循環系統清除。補體活化可裂解及活化C3且使調理素C3片段沈積於表面上。後續C5裂解可組裝破壞脂質雙層之膜攻擊複合物(C5b、6、7、8、9)。
在一些實施例中，重組溶瘤病毒係包膜病毒(例如牛痘病毒)，且異源性蛋白質係補體活化調節因子(例如CD55、CD59、CD46、CD35、因子H、C4結合蛋白或其他所鑑別補體活化調節因子)。不期望受限於理論，補體活化調節因子在病毒包膜表面(例如牛痘病毒包膜)上之表現使得病毒能夠調節補體活化且與野生型病毒相比減少補體介導之病毒中和。在一些實施例中，異源性核苷酸序列編碼人類CD55、CD59、CD46、CD35、因子H、C4結合蛋白或其他所鑑別補體活化調節因子之結構域。在另一實施例中，異源性核酸編碼包括具有SEQ ID NO: 58之序列之胺基酸序列之CD55蛋白。鑒於本文所呈現之揭示內容，熟習此項技術者易於在本文所呈現之任一包膜重組溶瘤病毒(例如牛痘病毒)中採用其他補體活化調節因子(例如CD59、CD46、CD35、因子H、C4結合蛋白等)。
在一些實施例中，異源性蛋白質係細胞介素。在一些實施例中，異源性蛋白質係IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、CXCL10或CCL4或衍生自任一上文所提及蛋白質之經修飾蛋白質(例如融合蛋白)。在一些實施例中，異源性蛋白質係經修飾以減少副效應之IL-2衍生物。在一些實施例中，異源性蛋白質係不結合至IL18-BP之經修飾IL-18。在一些實施例中，異源性蛋白質係包括發炎性細胞介素及穩定結構域之融合蛋白。穩定結構域可為穩定抑制性多肽之任一適宜結構域。在一些實施例中，穩定結構域延長了抑制性多肽之活體內半衰期。在一些實施例中，穩定結構域係Fc結構域。在一些實施例中，穩定結構域係白蛋白結構域。
在一些實施例中，Fc結構域係選自由以下組成之群：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其組合及雜合體之Fc片段。在一些實施例中，Fc結構域係衍生自人類IgG。在一些實施例中，Fc結構域包括人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或組合或雜合IgG之Fc結構域。在一些實施例(例如衍生自IL-12或IL-2之融合蛋白)中，Fc結構域之效應功能小於相應野生型Fc結構域(例如效應功能小至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%，如藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之程度所量測)。
在一些實施例中，發炎性細胞介素及穩定化結構域經由連接體(例如肽連接體)彼此融合。肽連接體可具有天然序列或非天然序列。舉例而言，可使用衍生自純重鏈抗體之鉸鏈區之序列作為連接體。肽連接體可具有任一適宜長度。在一些實施例中，肽連接體往往不採用剛性三維結構，而係提供多肽撓性。在一些實施例中，肽連接體係撓性連接體。實例性撓性連接體包含甘胺酸聚合物、甘胺酸-絲胺酸聚合物、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及業內已知之其他撓性連接體。
在一些實施例中，異源性蛋白質係細菌或病毒多肽。在一些實施例中，異源性蛋白質係選自以下之腫瘤相關抗原：癌胚抗原、甲型胎兒蛋白、MUC16、存活素、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、B7家族成員、LILRB、CD19、BCMA、NY-ESO-1、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA、EGFR (例如EGFRvIII)、GD2、HER2、IGF1R、間皮素、PSMA、ROR1、WT1、NY-ESO-1、CDH17及其他具有臨床顯著性之腫瘤抗原。
在一些實施例中，重組溶瘤病毒包括兩個或更多個其他核苷酸序列，其中每一核苷酸序列編碼本文所闡述之任一異源性蛋白質或核酸。 拮抗劑或抑制劑
本文所用之拮抗劑可與抑制劑互換使用。在一些實施例中，異源性蛋白質係靶蛋白之抑制劑(亦即拮抗劑)，其中靶蛋白係免疫抑制蛋白(例如檢查點抑制劑或其他免疫細胞活化抑制劑)。在一些實施例中，靶蛋白係免疫檢查點蛋白。在一些實施例中，靶蛋白係PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CD160、CD73、CTLA-4、B7-H4、TIGIT、VISTA或2B4。在一些實施例中，靶蛋白係CTLA-4、PD-1、PD-L1、B7-H4或HLA-G。在一些實施例中，靶蛋白係選自LILRB、TYRO3、AXL或MERTK之免疫抑制受體。
拮抗劑抑制靶蛋白(例如免疫抑制受體或免疫檢查點蛋白)之表現及/或活性。在一些實施例中，拮抗劑將靶蛋白之表現(例如mRNA或蛋白質含量)抑制至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%中之任一者或更多。可使用業內已知方法來測定靶蛋白之表現含量，包含(例如)用於測定RNA含量之定量聚合酶鏈反應(qPCR)、微陣列及RNA定序；及用於測定蛋白質含量之西方印漬及酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
在一些實施例中，拮抗劑將靶蛋白之活性(例如結合至靶蛋白之配體或受體或酶促活性)抑制至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%中之任一者或更多。可使用業內已知方法來評價結合，包含(例如)表面電漿共振(SPR)分析及凝膠位移分析。
拮抗劑可為任何適宜分子形式，包含(但不限於)小分子抑制劑、寡肽、擬肽、RNAi分子(例如小干擾RNA (siRNA)、短髮夾RNA (shRNA)、微RNA (miRNA))、反義寡核苷酸、核酶、蛋白質(例如抗體、抑制性多肽、融合蛋白等)及基因編輯系統。 i. 抗體
在一些實施例中，拮抗劑抑制靶蛋白(例如免疫檢查點蛋白或免疫抑制蛋白)與配體或受體之結合。在一些實施例中，拮抗劑係特異性結合至靶蛋白(例如CTLA-4、PD-1、PD-L1、B7-H4、HLA-G、LILRB、TYRO3、AXL或MERTK、葉酸鹽受體β等)之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，拮抗劑係多株抗體。在一些實施例中，拮抗劑係單株抗體。在一些實施例中，拮抗劑係全長抗體或免疫球蛋白衍生物。在一些實施例中，拮抗劑係抗原結合片段。實例性抗原結合片段包含(但不限於)單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、經二硫化物穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv) 2、單結構域抗體(例如VHH)、Fv-Fc融合體、scFv-Fc融合體、scFv-Fv融合體、二價抗體、三價抗體及四價抗體。在一些實施例中，拮抗劑係scFv。在一些實施例中，拮抗劑係Fab或Fab’。在一些實施例中，拮抗劑係嵌合、人類、部分人類化、完全人類化或半合成抗體。抗體及/或抗體片段可衍生自鼠類抗體、兔抗體、人類抗體、完全人類化抗體、駱駝科抗體可變結構域及人類化形式、鯊魚抗體可變結構域及人類化形式以及駱駝化抗體可變結構域。在一些實施例中，拮抗劑係雙特異性分子(例如雙特異性抗體或雙特異性Fab、雙特異性scFv、抗體-Fc融合蛋白Fv等)或三特異性分子(例如包括Fab、scFv、VH或Fc融合蛋白等之三特異性抗體)。
在一些實施例中，抗體包括一或多個抗體恆定區，例如人類抗體恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區係選自IgA、IgG、IgD、IgE及IgM之同型之重鏈恆定區。在一些實施例中，人類輕鏈恆定區係選自κ及λ之同型之輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包括IgG恆定區，例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區。在一些實施例中，在期望效應功能時，可選擇包括人類IgG1重鏈恆定區或人類IgG3重鏈恆定區之抗體。在一些實施例中，在不期望效應功能時，可選擇包括人類IgG4或IgG2重鏈恆定區或具有負面影響FcγR結合之突變(例如N297A/Q)之IgG1重鏈之抗體。在一些實施例中，抗體包括人類IgG4重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體在人類IgG4恆定區中包括S241P突變。
在一些實施例中，抗體包括Fc結構域。術語「Fc區」、「Fc結構域」或「Fc」係指免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分之C-末端非抗原結合區。該術語包含天然Fc區及變體Fc區。在一些實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C-末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在，此並不影響Fc區之結構或穩定性。除非本文另外指定，否則IgG或Fc區中之胺基酸殘基編號係根據抗體之EU編號系統(亦稱為EU索引)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, MD, 1991中所闡述。在一些實施例中，抗體包括變體Fc區，該變體Fc區與野生型IgG或野生型抗體之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代。
在一些實施例中，改變抗體以增加或降低抗體之醣基化程度。抗體醣基化位點之添加或缺失可方便地藉由改變胺基酸序列以產生或去除一或多個醣基化位點來達成。
可使用業內已知方法獲得特異性結合至靶蛋白之抗體，例如藉由對非人類哺乳動物實施免疫且自其獲得雜交瘤，或藉由使用業內已知之分子生物學技術及子序列選擇來選殖抗體庫，或藉由使用噬菌體顯示。 ii. 核酸藥劑
在一些實施例中，異源性核酸係下調靶蛋白之核酸藥劑。在一些實施例中，拮抗劑抑制靶蛋白之表現(例如mRNA或蛋白質表現)。在一些實施例中，拮抗劑係siRNA、shRNA、miRNA、反義寡核苷酸或基因編輯系統。
在一些實施例中，拮抗劑係RNAi分子。在一些實施例中，拮抗劑係siRNA。在一些實施例中，拮抗劑係shRNA。在一些實施例中，拮抗劑係miRNA。
熟習此項技術者可易於設計下調靶蛋白之RNAi分子或編碼RNAi分子之核酸。本文所用之術語「RNAi」或「RNA干擾」係指RNA分子藉由特異性結合至靶mRNA分子來抑制基因表現或轉譯之生物過程。例如參見Zamore等人，2000, Cell, 101, 25-33；Bass, 2001, Nature, 411, 428-429；Elbashir等人，2001, Nature, 411, 494-498；及Kreutzer等人，國際PCT公開案第WO 00/44895號；Zernicka-Goetz等人，國際PCT公開案第WO 01/36646號；Fire，國際PCT公開案第WO 99/32619號；Plaetinck等人，國際PCT公開案第WO00/01846號；Mello及Fire，國際PCT公開案第WO 01/29058號；Deschamps-Depaillette，國際PCT公開案第WO 99/07409號；及Li等人，國際PCT公開案第WO 00/44914號；Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819；Volpe等人，2002, Science, 297, 1833-1837；Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218；及Hall等人，2002, Science, 297, 2232-2237；Hutvagner及Zamore，2002, Science, 297, 2056-60；McManus等人，2002, RNA, 8, 842-850；Reinhart等人，2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626；以及Reinhart及Bartel, 2002, Science, 297, 1831)。實例性RNAi分子包含siRNA、miRNA及shRNA。
siRNA可為包括自我互補性有義區及反義區之雙鏈多核苷酸分子，其中反義區包括與靶核酸分子或其部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義區具有對應於靶核苷酸序列或其部分之核苷酸序列。在一些實施例中，siRNA包括一或多個髮夾或不對稱髮夾二級結構。在一些實施例中，siRNA可構築於天然miRNA之架構中。siRNA分子未必限於彼等僅含有RNA之分子，而進一步涵蓋經化學修飾之核苷酸及非核苷酸。
可使用業內已知方法來設計RNAi。舉例而言，可藉由基於功能性對RNAi序列(例如1000個序列)進行分類來設計siRNA，其中將功能基團分類為具有大於85%之敲低活性且非功能基團具有小於85%之敲低活性。計算整個RNAi靶序列之功能基團及非功能基團二者之鹼基組成分佈。然後可使用功能基團及非功能基團之鹼基分佈比率來構建RNAi序列之每一位置之評分矩陣。對於既定靶序列而言，對每一位置之鹼基進行評分，且然後將所有位置相乘之對數比率作為最終評分。使用此評分系統，可發現功能性敲低活性與對數比評分之極強相關性。一旦選擇靶序列，即可經由迅速NCBI blast及緩慢史密斯-沃特曼演算法(Smith Waterman algorithm)搜尋二者針對Unigene資料庫進行篩選以鑑別基因特異性RNAi或siRNA。可選擇在最後12個鹼基中具有至少一個失配之序列。
在一些實施例中，拮抗劑係反義寡核苷酸，例如反義RNA、DNA或PNA。在一些實施例中，拮抗劑係核糖酶。「反義」核酸係指與編碼靶蛋白或片段之「有義」核酸互補(例如與雙鏈cDNA分子之編碼鏈互補或與mRNA序列互補)之核苷酸序列。反義核酸可與整個編碼鏈或與其部分或其實質性一致序列互補。舉例而言，反義寡核苷酸可與mRNA轉譯起始位點周圍之區域(例如在所關注靶基因核苷酸序列之−10至+10區域之間)互補。在一些實施例中，反義核酸分子對於核苷酸序列之編碼鏈之「非編碼區」係反義的。反義寡核苷酸之長度可為(例如)約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多個核苷酸。可使用化學合成或酶連接反應且使用標準程序來構築反義核酸。舉例而言，可使用天然核苷酸或各種經修飾核苷酸以化學方式來合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，該等經修飾核苷酸經設計以增加分子之生物穩定性或增加形成於反義核酸與有義核酸之間之雙鏈體的物理穩定性(舉例而言，可使用硫代磷酸酯衍生物及經吖啶取代之核苷酸)。亦可使用已以反義定向亞選殖核酸之表現載體以生物方式來產生反義核酸。
在一些實施例中，反義核酸係核糖酶。對靶核苷酸序列具有特異性之核糖酶可包含一或多個與此一核苷酸序列互補之序列及具有負責mRNA裂解之已知催化區之序列(例如美國專利第5,093,246號或Haselhoff及Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988))。舉例而言，有時利用四膜蟲L-19 IVS RNA之衍生物，其中活性位點之核苷酸序列與擬裂解於mRNA中之核苷酸序列互補(例如Cech等人，美國專利第4,987,071號；及Cech等人，美國專利第5,116,742號)。可使用靶mRNA序列自RNA分子池選擇具有特定核糖核酸酶活性之催化RNA (例如Bartel及Szostak, Science 261: 1411-1418 (1993))。
在一些實施例中，拮抗劑係基因編輯系統，例如CRISPR/Cas基因編輯系統、轉錄活化子樣效應核酸酶或TALEN基因編輯系統、鋅指基因編輯系統等。在一些實施例中，拮抗劑係(例如)以組織特異性方式敲低靶蛋白之基因編輯系統。在一些實施例中，拮抗劑係使靶蛋白表現沉默之基因編輯系統。
在一些實施例中，基因編輯系統包括嚮導核酸酶(例如經工程化(例如可程式化或可靶向)核酸酶)以誘導編碼靶蛋白之靶序列(例如DNA序列或RNA序列)之基因編輯。可使用任何適宜嚮導核酸酶，包含(但不限於) CRISPR相關蛋白(Cas)核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應核酸酶(TALEN)、大範圍核酸酶、其他內核酸酶或外核酸酶、其變體、其片段及其組合。在一些實施例中，基因編輯系統包括融合至轉錄抑制子之嚮導核酸酶。在一些實施例中，基因編輯系統進一步包括雜交至編碼靶蛋白之靶序列之經工程化核酸。在一些實施例中，基因編輯系統係包括Cas核酸酶(例如Cas9)及嚮導RNA (亦即gRNA)之CRISPR-Cas系統。 4. 用於表現異源性蛋白質或核酸之啟動子
編碼本文所闡述之異源性蛋白質(例如外來抗原，例如唾液酸酶)或核酸之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，至少使編碼外來抗原(例如唾液酸酶)之第一核苷酸序列及編碼其他異源性蛋白質或核酸之第二核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子。在一些實施例中，所有編碼異源性蛋白質或核酸之核酸皆可操作地連接至相同啟動子。在一些實施例中，所有編碼異源性蛋白質或核酸之核酸皆可操作地連接至不同啟動子。
在一些實施例中，啟動子係病毒啟動子。病毒啟動子可包含(但不限於) VV啟動子、痘病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、牛痘ATI啟動子或T7啟動子。啟動子可為牛痘病毒啟動子、合成啟動子、至少在感染早期引導轉錄之啟動子、至少在感染中間期引導轉錄之啟動子、在感染早期/晚期引導轉錄之啟動子或至少在感染晚期引導轉錄之啟動子。
在一些實施例中，本文所闡述之啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，本文所闡述之啟動子係可誘導啟動子。
適於組成型表現於哺乳動物細胞中之啟動子包含(但不限於)巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子(US 5,168,062)、RSV啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子(Adra等人，1987, Gene 60: 65-74)、單純疱疹病毒(HSV)-l之胸苷激酶(TK)啟動子及T7聚合酶啟動子(WO98/10088)。牛痘病毒啟動子尤其適於表現於溶瘤痘病毒中。代表性實例包含(但不限於)牛痘7.5K、H5R、11K7.5 (Erbs等人，2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28)、TK、p28、pll、pB2R、pA35R及K1L啟動子以及合成啟動子(例如闡述於以下文獻中者：Chakrabarti等人，(1997, Biotechniques 23: 1094-7；Hammond等人，1997, J. Virol Methods 66: 135-8；及Kumar及Boyle, 1990,Virology 179: 151-8))以及早期/晚期嵌合啟動子。適用於溶瘤麻疹病毒之啟動子包含(但不限於)引導表現麻疹病毒轉錄單元之任一啟動子(Brandler及Tangy, 2008, CIMID 31: 271)。
可誘導啟動子屬調控性啟動子之種類。可誘導啟動子可由一或多種條件誘導，該等條件係(例如)物理條件、宿主細胞之微環境或宿主細胞之生理學狀態、誘導劑(亦即誘導因子)或其組合。
可在活體外(例如在適宜經培養細胞系中)或在活體內(例如在適宜動物模型或受試者中)測試適當表現用啟動子。在所編碼免疫檢查點調節劑包括抗體及尤其mAb時，用於表現該免疫檢查點調節劑之重組分之適宜啟動子之實例包括CMV、SV以及牛痘病毒pH5R、F17R及pllK7.5啟動子；用於表現該免疫檢查點調節劑之輕組分之適宜啟動子之實例包括PGK、β-肌動蛋白以及牛痘病毒p7.5K、F17R及pA35R啟動子。
啟動子可由較強或較弱之啟動子代替，其中代替會改變病毒之減毒。如本文中所使用，使用較強啟動子代替啟動子係指自基因體去除啟動子且使用可相對於所代替啟動子增加轉錄起始程度之啟動子代替。通常，較強啟動子相對於所代替啟動子結合聚合酶複合物之能力有所改良。因此，可操作地連接至較強啟動子之開放閱讀框具有較高基因表現程度。類似地，使用較弱啟動子代替啟動子係指自基因體去除啟動子且使用相對於所代替啟動子降低轉錄起始程度之啟動子代替。通常，較弱啟動子相對於所代替啟動子結合聚合酶複合物之能力有所減弱。因此，可操作地連接至較弱啟動子之開放閱讀框具有較低基因表現程度。病毒可因使用較強啟動子與較弱啟動子而展現特性(例如減毒)之差異。舉例而言，在牛痘病毒中，合成早期/晚期及晚期啟動子係相對較強啟動子，而牛痘合成早期、P7.5k早期/晚期、P7.5k早期及P28晚期啟動子係相對較弱啟動子( 例如參見Chakrabarti等人(1997) BioTechniques23 (6) 1094-1097)。在一些實施例中，本文所闡述之啟動子係弱啟動子。在一些實施例中，本文所闡述之啟動子係強啟動子。
在一些實施例中，啟動子係溶瘤病毒之病毒啟動子。在一些實施例中，啟動子係早期病毒啟動子、晚期病毒啟動子、中間病毒啟動子或早期/晚期病毒啟動子。在一些實施例中，啟動子係合成病毒啟動子，例如合成早期、早期/晚期或晚期病毒啟動子。
在一些實施例中，啟動子係牛痘病毒啟動子。用於本發明中之實例性牛痘病毒啟動子可包含(但不限於) P 7.5k、P 11k、P SE、P SEL、P SL、H5R、TK、P28、C11R、G8R、F17R、I3L、I8R、A1L、A2L、A3L、H1L、H3L、H5L、H6R、H8R、D1R、D4R、D5R、D9R、D11L、D12L、D13L、M1L、N2L、P4b或K1啟動子。
實例性牛痘早期、中間及晚期啟動子包含(例如)牛痘P 7.5k早期/晚期啟動子、牛痘P EL早期/晚期啟動子、牛痘P 13早期啟動子、牛痘P 11k晚期啟動子及列示於本文其他處之牛痘啟動子。實例性合成啟動子包含(例如) P SE合成早期啟動子、P SEL合成早期/晚期啟動子、P SL合成晚期啟動子、列示於本文其他處之牛痘合成啟動子(Patel等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 9431-9435 (1988)；Davison及Moss, J Mol Biol210: 749-769 (1989)；Davison等人， Nucleic Acids Res.18: 4285-4286 (1990)；Chakrabarti等人， BioTechniques23: 1094-1097 (1997))。可使用不同啟動子之組合在相同病毒或兩種不同病毒中表現不同基因產物。
在一些實施例中，採用至少在感染晚期引導轉錄之啟動子(例如F17R啟動子，展示於SEQ ID NO: 61中)。在一些實施例中，晚期啟動子係選自由以下組成之群：F17R、I2L晚期啟動子、L4R晚期啟動子、P 7.5k早期/晚期啟動子、P EL早期/晚期啟動子、P 11k晚期啟動子、P SEL合成早期/晚期啟動子及P SL合成晚期啟動子。晚期牛痘病毒啟動子F17R僅活化於腫瘤細胞中之VV感染之後，由此藉由使用F17R啟動子將進一步增強VV之異源性蛋白質或核酸之腫瘤選擇性表現。在一些實施例中，本發明之異源性蛋白質或核酸之晚期表現容許在T細胞活化及介導性腫瘤溶解之前充分進行病毒複製。
在一些實施例中，啟動子係雜合啟動子。在一些實施例中，雜合啟動子係合成早期/晚期病毒啟動子。在一些實施例中，啟動子包括人類啟動子之部分或完整核苷酸序列。在一些實施例中，人類啟動子係組織或腫瘤特異性啟動子。在一些實施例中，腫瘤特異性啟動子可為驅動腫瘤細胞中之增強性表現或驅動腫瘤細胞中之特異性表現之啟動子(例如驅動腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)之表現之啟動子)。在一些實施例中，雜合啟動子包括組織或腫瘤特異性啟動子之部分或完整核苷酸序列及相對於組織-或腫瘤特異性啟動子增加雜合啟動子之強度之核苷酸序列(例如CMV啟動子序列)。包括組織-或腫瘤特異性啟動子之雜合啟動子之非限制性實例包含hTERT及CMV雜合啟動子或AFP及CMV雜合啟動子。
在本文所闡述之任一重組溶瘤病毒之一些實施例中，一或多個啟動子包括可操作地連接至第一核苷酸序列之第一啟動子及可操作地連接至第二核苷酸序列之第二啟動子。在一些實施例中，第一啟動子係F17R啟動子且第二啟動子係pE/L啟動子。在一些實施例中，F17R啟動子包括SEQ ID NO: 61之核酸序列。在一些實施例中，pE/L啟動子包括SEQ ID NO: 107之核酸序列。 C. 經工程化免疫細胞
本申請案進一步提供用於治療有需要之個體之癌症之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞包括特異性識別由本文所闡述之任一重組溶瘤病毒編碼之外來抗原(例如細菌唾液酸酶)之嵌合受體。
在本申請案之一些態樣中，提供表現嵌合受體之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係選自由以下組成之群：細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞、NK細胞、NK-T細胞及巨噬細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NK細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係γδT細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係NKT細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係巨噬細胞。　 在一些實施例中，經工程化免疫細胞係兩種或更多種類型免疫細胞之混合物，例如T細胞及NK細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係PBMC。
本文所闡述之經工程化免疫細胞之一些實施例包括一或多種經工程化嵌合受體，該等經工程化嵌合受體能夠針對表現靶抗原之腫瘤細胞直接或間接活化免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)。實例性經工程化受體包含(但不限於)嵌合抗原受體(CAR)、經工程化T細胞受體及TCR融合蛋白。
在一些實施例中，經工程化免疫細胞係自體細胞(自擬治療受試者獲得之細胞)。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係同種異體細胞，其可包含各種易於分離及/或市售之細胞/細胞系。
在一些實施例中，經工程化免疫細胞表現特異性識別由重組溶瘤病毒編碼之外來抗原之嵌合受體。在一些實施例中，經工程化免疫細胞表現特異性識別由重組溶瘤病毒編碼之唾液酸酶之嵌合受體。
在一些實施例中，經工程化免疫細胞進一步包括編碼共刺激配體之異源性核苷酸序列。在一些實施例中，共刺激配體係細胞介素。實例性共刺激配體包含(但不限於)腫瘤壞死因子(TNF)配體、細胞介素(例如IL-2、IL-12、IL-15或IL21)及免疫球蛋白(Ig)超家族配體。 例如參見US10117897B2，其內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係包括編碼IL-15 (例如人類IL-15)之異源性核苷酸序列之NK細胞。人類IL-15之一實例性序列係SEQ ID NO: 121。
在一些實施例中，經工程化免疫細胞包括載體，該載體包括編碼嵌合受體(例如CAR)之第一核苷酸序列及編碼共刺激配體(例如細胞介素，例如IL-15)之第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列及第二核苷酸序列經由編碼自剪接肽(例如2A肽，例如T2A)之第三核苷酸序列彼此連接。實例性構築展示於圖50A中。 1. 嵌合抗原受體 (CAR)
本文所用之「嵌合抗原受體」或「CAR」係指可用於將一或多種靶結合特異性移植於免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)上之經工程化受體。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括細胞外靶結合結構域、跨膜結構域及T細胞受體及/或其他受體之細胞內信號傳導結構域。
本文所闡述經工程化免疫細胞之一些實施例包括嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR包括抗原結合部分及效應蛋白或其片段，該效應蛋白或其片段包括直接或間接活化表現CAR之免疫細胞之一級免疫細胞信號傳導分子或一級免疫細胞信號傳導結構域。在一些實施例中，CAR包括抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域。亦提供包括CAR之經工程化免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)。抗原結合部分及效應蛋白或其片段可存在於一或多條多肽鏈中。實例性CAR構築體已闡述於(例如) US9765342B2、WO2002/077029及WO2015/142675中，該等案件以引用方式併入本文中。任一已知CAR構築體可用於本申請案中。
在一些實施例中，一級免疫細胞信號傳導分子或一級免疫細胞信號傳導結構域包括選自由以下組成之群之分子之細胞內結構域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域由一級免疫細胞信號傳導結構域組成或基本上由其組成。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括CD3ζ之細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，CAR進一步包括共刺激分子或其片段。在一些實施例中，共刺激分子或其片段係衍生自選自由以下組成之群之分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特異性結合CD83之配體。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域進一步包括含有CD28細胞內信號傳導序列之共刺激結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括CD28細胞內信號傳導序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列。
跨膜結構域可衍生自天然或合成來源。在來源為天然時，該結構域可源自任一膜結合蛋白或跨膜蛋白。本發明所用之特定跨膜區可衍生自(亦即至少包括其跨膜區) CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。在一些實施例中，CAR係包括來自純系FMC63 (Nicholson IC等人，Mol Immunol. 1997)之CD19 scFv、CH2-CH3間隔體、CD28-TM、41BB及CD3ζ之CD-19 CAR。在一些實施例中，跨膜結構域可為合成結構域，在該情形下其可主要包括諸如白胺酸及纈胺酸等疏水性殘基。在一些實施例中，可在合成跨膜結構域之每一端處發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施例中，長度為(例如)約2至約10 (例如約2、3、4、5、6、7、8、9或10中之任一者)個胺基酸之短寡肽或多肽連接體可在跨膜結構域與細胞內信號傳導結構域之間形成鍵聯。在一些實施例中，連接體係甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
在一些實施例中，使用與細胞內結構域中之一個序列天然締合之跨膜結構域(舉例而言，若細胞內結構域包括CD28共刺激序列，則跨膜結構域係衍生自CD28跨膜結構域)。在一些實施例中，跨膜結構域可藉由胺基酸取代進行選擇或修飾以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，從而最小化與受體複合物之其他成員之相互作用。
在一些實施例中，CAR包括CD8之跨膜結構域。在一些實施例中，CAR包括CD28之跨膜結構域。
在一些實施例中，CAR進一步包括佈置於抗原結合結構域與跨膜結構域之間之鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區係衍生自CD8。
CAR之細胞內信號傳導結構域負責活化CAR已置於其中之免疫細胞之至少一種正常效應功能。舉例而言，T細胞之效應功能可為細胞溶解活性或輔助性活性(包含細胞介素之分泌)。因此，術語「細胞內信號傳導結構域」係指轉導效應功能信號且引導細胞實施特殊功能之蛋白質部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情形下無需使用整條鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可使用該截短部分來代替完整鏈，只要其轉導效應功能信號即可。因此，術語「細胞內信號傳導序列」意欲包含細胞內信號傳導結構域之足以轉導效應功能信號之任一截短部分。
用於本申請案之CAR中之細胞內信號傳導結構域之實例包含TCR及在抗原受體銜接後協同用於起始信號轉導之共受體之細胞質序列以及該等序列之任一衍生物或變體及具有相同功能能力之任一合成序列。
已知僅經由TCR產生之信號可能不足以完全活化T細胞，且亦可能需要二級或共刺激信號。因此，可認為T細胞活化係藉由兩類不同之細胞內信號傳導序列來介導：經由TCR (一級信號傳導序列)起始抗原依賴性一級活化之彼等；及以抗原獨立性方式用於提供二級或共刺激信號(共刺激信號傳導序列)之彼等。
一級信號傳導序列以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初次活化。以刺激方式起作用之一級信號傳導序列可含有信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。在一些實施例中，CAR構築體包括一或多個ITAM。本發明所使用之含有一級信號傳導序列之特定ITAM實例包含衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d者。
在一些實施例中，CAR包括衍生自CD3ζ之一級信號傳導序列。舉例而言，CAR之細胞內信號傳導結構域可包括CD3ζ細胞內信號傳導序列本身或其與可用於本文所闡述CAR之背景中之任何其他期望細胞內信號傳導序列的組合。舉例而言，CAR之細胞內結構域可包括CD3ζ細胞內信號傳導序列及共刺激信號傳導序列。共刺激信號傳導序列可為包含(例如)以下之共刺激分子之細胞內結構域之一部分：CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配體及諸如此類。
在一些實施例中，CAR之細胞內信號傳導結構域包括CD3ζ之細胞內信號傳導序列及CD28之細胞內信號傳導序列。在一些實施例中，CAR之細胞內信號傳導結構域包括CD3ζ之細胞內信號傳導序列及4-1BB之細胞內信號傳導序列。在一些實施例中，CAR之細胞內信號傳導結構域包括CD3ζ之細胞內信號傳導序列以及CD28及4-1BB之細胞內信號傳導序列。
在一些實施例中，抗原結合片段係抗體片段。在一些實施例中，抗原結合部分包括scFv或Fab。在一些實施例中，抗原結合部分係針對遞送至腫瘤細胞(例如藉由重組溶瘤病毒)之外來抗原。在一些實施例中，外來抗原係DAS181或其衍生物(例如不含錨定結構域之DAS181之唾液酸酶結構域之跨膜形式，如實例11及15中所闡述)。
在一些實施例中，使用溶瘤病毒遞送至腫瘤細胞之唾液酸酶結構域(例如非人類唾液酸酶或其衍生物，例如DAS181之唾液酸酶結構域)用於自腫瘤細胞表面去除唾液酸且用作增強免疫細胞介導之腫瘤細胞殺死之外來抗原。在一些實施例中，組合帶有唾液酸酶之溶瘤病毒與特異性靶向唾液酸酶結構域(例如DAS181)之經工程化免疫細胞，由此增強由溶瘤病毒感染之腫瘤細胞之殺死。
在一些實施例中，抗原結合結構域特異性結合至唾液酸酶(例如avSial)。在一些實施例中，抗原結合結構域特異性結合至DAS181或其衍生物。在一些實施例中，抗原結合結構域係衍生自下文之部分III 「抗唾液酸酶抗體」中所得到之任一抗唾液酸酶抗體之抗體片段。在一些實施例中，抗原結合結構域係D004之scFv。
在一些實施例中，CAR包括特異性結合黏放線菌唾液酸酶(例如DAS181或其衍生物)之抗原結合結構域，其中抗原結合結構域包括：VH，其包括含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-H1、含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2及含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-H3；及VL，其包括含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L1、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3。在一些實施例中，抗原結合結構域包括：VH，其包括與SEQ ID NO: 117之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列；及VL，其包括與SEQ ID NO: 118之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原結合結構域包括含有SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之VH及含有SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，抗原結合結構域包括含有與SEQ ID NO: 119之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列的scFv。在一些實施例中，抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 119之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供自N-末端至C-末端包括以下各項之CAR：抗唾液酸酶scFv (例如D004 scFv)、CD8鉸鏈區、CD8跨膜結構域、CD28之共刺激結構域及CD3ζ之細胞內信號傳導結構域。一實例性CAR構築體展示於圖50A中。在一些實施例中，CAR包括與SEQ ID NO: 120之胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%一致性中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原結合結構域包括SEQ ID NO: 120之胺基酸序列。
本文亦提供表現本文所闡述之任一CAR之經工程化免疫細胞(例如淋巴球，例如T細胞、NK細胞或其組合)。亦提供產生表現本文所闡述之任一CAR之經工程化免疫細胞之方法，該方法包括將包括編碼CAR之核酸之載體引入免疫細胞中。在一些實施例中，將載體引入免疫細胞中包括使用載體轉導免疫細胞。在一些實施例中，將載體引入免疫細胞中包括使用載體轉染免疫細胞。可使用業內已知之任一方法將載體轉導或轉染至免疫細胞中。 2. 經工程化 T 細胞受體
在一些實施例中，嵌合受體係T細胞受體。在一些實施例中，其中經工程化免疫細胞係T細胞，T細胞受體係內源性T細胞受體。在一些實施例中，預選擇具有TCR之經工程化免疫細胞。在一些實施例中，T細胞受體係重組TCR。在一些實施例中，TCR對由溶瘤病毒編碼之外來抗原(例如唾液酸酶)具有特異性。在一些實施例中，TCR對外來抗原具有增強之親和力。實例性TCR及將TCR引入免疫細胞中之方法已闡述於(例如) US5830755及Kessels等人，Immunotherapy through TCR gene transfer. Nat. Immunol.2, 957-961 (2001)中。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係TCR-T細胞。 3. TCR 融合蛋白 (TFP)
在一些實施例中，經工程化免疫細胞包括TCR融合蛋白(TFP)。本文所用之「TCR融合蛋白」或「TFP」係指包括融合至TCR-CD3複合物或其部分(包含TCRα鏈、TCRβ鏈、TCRγ鏈、TCRδ鏈、CD3ε、CD3δ或CD3γ)之亞單元之細胞外靶結合結構域的經工程化受體。TCR-CD3複合物或其部分之亞單元包括天然TCR-CD3亞單元之跨膜結構域及細胞內結構域之至少一部分。TFP包括TCR-CD3亞單元或其部分之細胞外結構域。
包括抗體片段作為靶結合部分之實例性TFP構築體已闡述於(例如) WO2016187349及WO2018098365中，該等案件以引用方式併入本文中。 4. 使經工程化免疫細胞靶向外來抗原。
本文所闡述之工程化免疫細胞可靶向外來抗原。在一些實施例中，經工程化免疫細胞可靶向使用重組溶瘤病毒遞送至腫瘤細胞中之外來抗原(例如細菌肽或細菌唾液酸酶)。
可以業內已知用於遞送經工程化免疫細胞(例如CART-T、CAR-NK或CAR-NKT細胞)之任一方式將經工程化免疫細胞遞送至患者。在一些實施例中，表現於表現唾液酸酶之經工程化免疫細胞之表面上或由該等細胞分泌之唾液酸酶可自表現於免疫細胞及/或腫瘤細胞上的唾液酸聚醣去除唾液酸。去除腫瘤細胞上之唾液酸可進一步活化不再經由Siglec/唾液酸軸及其他選擇素相互作用與腫瘤細胞之抑制信號銜接之樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞及NK細胞。該等相互作用可進一步增強針對癌症之免疫活化且改變腫瘤微環境(TME)。對於腫瘤細胞而言，因其去唾液酸化，故其暴露於活化NK細胞及T細胞以及其他免疫細胞之攻擊，從而減小腫瘤大小。
在一些實施例中，本文所陳述之經工程化免疫細胞可經工程化以表現免疫細胞表面膜上之唾液酸酶(例如(但不限於)融合至跨膜結構域之DAS181之唾液酸酶結構域)，從而唾液酸酶結合膜。在一些實施例中，唾液酸酶可融合至跨膜結構域。
不受限於任何理論或假設，膜結合唾液酸酶並不自由循環且僅與表現溶瘤病毒之腫瘤細胞接觸。以此方式，唾液酸酶不會使非靶向細胞(例如紅血球)去唾液酸化，而代之以主要消除僅來自腫瘤細胞之唾液酸。 5. 經工程化免疫細胞組合物
本申請案亦提供包括經工程化免疫細胞之組合物，該等經工程化免疫細胞表現特異性識別由重組溶瘤病毒編碼之外來抗原之嵌合受體。在一些實施例中，提供包括表現特異性識別唾液酸酶(例如黏放線菌唾液酸酶，例如DAS181或其衍生物)之嵌合受體之經工程化免疫細胞之組合物。在一些實施例中，提供包括表現特異性識別唾液酸酶(例如黏放線菌唾液酸酶，例如DAS181或其衍生物)之嵌合受體之NK細胞之組合物。在一些實施例中，提供包括表現CAR之NK細胞之組合物，該CAR包括抗DAS181 scFv (例如D004 scFv)、跨膜結構域及細胞內結構域(例如CD28之共刺激結構域及CD3ζ之細胞內信號傳導結構域)。
在一些實施例中，提供製備表現CAR之經工程化NK細胞之組合物之方法，其包括：(a)活化周邊血細胞；(b)使用編碼CAR之載體轉導經活化周邊血細胞；及(c)在NK MACS培養基中培育經轉導細胞。 D. 溶瘤病毒及載體細胞
在一些實施例中，本申請案提供包括本文所闡述之任一重組溶瘤病毒之載體細胞。在一些實施例中，載體細胞係免疫細胞或幹細胞(例如間質幹細胞)。在一些實施例中，載體細胞係B細胞。在一些實施例中，載體細胞係白血球。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係嵌合抗原受體(CAR)-T、CAR-NK、CAR-NKT或CAR-巨噬細胞。在一些實施例中，免疫細胞係經工程化免疫細胞(例如上文子部分C中所闡述之任一經工程化免疫細胞)。
在一些實施例中，提供包括含有編碼唾液酸酶之重組溶瘤病毒之經工程化免疫細胞之組合物。在一些實施例中，重組溶瘤病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，牛痘病毒係Western Reserve株。在一些實施例中，牛痘病毒係經修飾牛痘病毒(例如包括一或多個突變之牛痘病毒，其突變位於一或多種蛋白質(例如A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13或A28)中)。在一些實施例中，唾液酸酶係衍生自黏放線菌唾液酸酶。　在一些實施例中，唾液酸酶係DAS181。在一些實施例中，編碼唾液酸酶之核苷酸序列進一步編碼可操作地連接至唾液酸酶之分泌序列。在一些實施例中，唾液酸酶進一步包括跨膜結構域。在一些實施例中，經工程化免疫細胞編碼嵌合受體。在一些實施例中，嵌合受體係嵌合抗原受體。在一些實施例中，CAR特異性識別由溶瘤病毒編碼之唾液酸酶。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞、NK細胞及NK-T細胞。在一些實施例中，經工程化免疫細胞係患者之自體細胞或同種異體細胞。
本申請案進一步提供包括本文所提供之任一重組溶瘤病毒之免疫細胞。在一些實施例中，藉由將免疫細胞與重組溶瘤病毒一起培育來製備包括重組溶瘤病毒之免疫細胞。在一些實施例中，藉由將編碼重組溶瘤病毒之核苷酸序列工程化至細胞中(例如藉由使用構築體轉導或轉染細胞)來製備包括重組溶瘤病毒之免疫細胞。
可使用溶瘤病毒感染載體細胞(例如免疫細胞或幹細胞)之群體。含有唾液酸酶之病毒可藉由任一適當生理上可接受之細胞載體來投與。含有唾液酸酶之病毒可於任一適當生理上可接受之細胞載體中投與。感染倍率(multiplicity of infection)通常在約0.001至1000之範圍內(例如在0.001至100之範圍內)。或者，可採用脂質體、業內熟知之一般轉染方法(例如磷酸鈣沈澱及電穿孔)等使用病毒DNA來轉染效應細胞。因病毒之轉染效率較高，故可達成高含量之經修飾細胞。在一些實施例中，包括重組溶瘤病毒之經工程化免疫細胞可藉由將該免疫細胞與病毒一起培育一定時間段來製備。在一些實施例中，可將免疫細胞與病毒一起培育足於使細胞感染病毒且表現一或多種病毒編碼之異源性蛋白質(例如唾液酸酶及/或本文所闡述之任一免疫調節蛋白)之時間。
可將包括重組溶瘤病毒之載體細胞(例如免疫細胞或幹細胞)之群體注射至接受者中。投與本發明細胞之適宜性之測定尤其取決於可評價臨床參數，例如血清學指徵及組織生檢之組織學檢驗。通常，投與醫藥組合物。投與途徑包含全身性注射，例如血管內注射、皮下注射或腹膜腔內注射、腫瘤內注射等。 III. 抗唾液酸酶抗體
本申請案提供抗唾液酸酶抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，本文所闡述之抗唾液酸酶抗體及其抗原結合片段特異性結合黏放線菌唾液酸酶(亦在本文中稱為「avSial」或「av唾液酸酶」)。在一些實施例中，本申請案提供抗DAS181抗體及其抗原結合片段。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括針對下 表 A中所闡述之任一實例性抗avSial抗體D004 (亦在本文中稱為「闡釋性抗唾液酸酶抗體」或「親代抗唾液酸酶抗體」)所展示之一個、兩個、三個、四個、五個或所有六個CDR。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括如 表 A中所展示抗體D004之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括與SEQ ID NO:117之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，VH序列相對於SEQ ID NO: 117之胺基酸序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但保留關於包括SEQ ID NO: 117之抗體之結合avSial之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 117中總共有1至13個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個)胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生於CDR外側之區域中(亦即在FR中)。在一特定實施例中，VH包括一個、兩個或三個選自由以下組成之群之CDR：(a)包括SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-H1或包括最多5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之其變體；(b)包括SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2或包括最多5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之其變體；及(c)包括SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-H3或包括最多5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之其變體。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括與SEQ ID NO: 118之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，VL序列相對於SEQ ID NO: 118之胺基酸序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但保留關於包括SEQ ID NO: 118之抗體之結合avSial之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 118中總共有1至11個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個)胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生於CDR外側之區域中(亦即在FR中)。在一特定實施例中，VL包括一個、兩個或三個選自由以下組成之群之CDR：(a)包括SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L1或包括最多5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之其變體；(b)包括SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2或包括最多5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之其變體；及(c)包括SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3或包括最多5個(例如1、2、3、4或5個)胺基酸取代之其變體。
在一實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括：VH，其包括SEQ ID NO: 117之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 117具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列；及VL；其包括SEQ ID NO: 118之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 118具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括：VH，其包括含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-H1、含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2及含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-H3；及VL，其包括含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-Ll、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體或抗原結合片段包括VH之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其具有SEQ ID NO: 117中所示之序列；及VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其具有SEQ ID NO:118中所示之序列。 表 A. 抗 avSial 抗體序列
純系 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
D004    DYNMD (SEQ ID NO: 111) DINPNNGGTISNQKFKG (SEQ ID NO: 112) RRYYGNHWYFDV (SEQ ID NO: 113) KASQDINIYLS (SEQ ID NO: 114) RANRLMD (SEQ ID NO: 115) LQYDEFPPT (SEQ ID NO: 116)
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體係全長抗體。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體包括免疫球蛋白(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之Fc區。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體係抗原結合片段。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗原結合片段係自N-末端至C-末端包括VH、肽連接體及VL之scFv。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗原結合片段係自N-末端至C-末端包括VL、肽連接體及VH之scFv。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗原結合片段包括與SEQ ID NO: 119具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、98%或99%或100%)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗原結合片段包括SEQ ID NO: 119之胺基酸序列。
本發明之抗唾液酸酶抗體可使用業內已知之任何技術來產生，包含使用習用單株抗體方法(例如標準體細胞雜交技術， 例如參見Kohler及Milstein, Nature256:495 (1975))、B淋巴球之病毒或致癌轉變或重組抗體技術。
雜交瘤產生係極成熟程序。用於製備雜交瘤之常用動物系統係鼠類系統。用於分離免疫化脾細胞以供融合之免疫化方案及技術為業內所已知。亦已知融合配偶體(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。可用於製備由本發明提供之人類抗體之一種熟知方法涉及使用XenoMouse™動物系統。XenoMouse™小鼠係經工程化小鼠品系，其包括人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之較大片段且缺乏小鼠抗體產生( 例如參見Green等人，(1994) Nature Genetics 7:13-21；WO2003/040170)。可藉由業內已知之任何方法對動物實施免疫( 例如參見Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990)。對非人類動物(例如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬)實施免疫之方法在業內已眾所周知( 例如參見Harlow及Lane之上述文獻及美國專利第5,994,619號)。唾液酸酶抗原可與佐劑一起投與以刺激免疫反應。實例性佐劑包含完全或不完全弗氏佐劑(complete or incomplete Freund's adjuvant)、RIBI (胞壁醯二肽)或ISCOM (免疫刺激複合物)。在使用唾液酸酶抗原對動物實施免疫之後，自分離自免疫化動物之細胞來製備產生抗體之永生化細胞系。在免疫化之後，將動物處死且淋巴結及/或脾B細胞係永生化的。細胞之永生化方法包含(但不限於)使用致癌基因轉移、使用致癌病毒改變、在選擇用於永生化細胞之條件下培養、使其接觸致癌或突變化合物、使其與永生化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合及不活化腫瘤抑制基因( 例如參見Harlow及Lane之上述文獻)。若使用骨髓瘤細胞融合，則骨髓瘤細胞較佳地不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌性細胞系)。使用唾液酸酶、其部分或表現唾液酸酶之細胞篩選永生化細胞。選擇抗唾液酸酶抗體產生細胞(例如雜交瘤細胞)，選殖且進一步針對期望特性(包含穩定生長、高抗體產生及期望抗體特性)進行篩選，如下文進一步所論述。可在同基因動物活體內、在缺乏免疫系統之動物(例如裸小鼠)中或在細胞培養物活體外來擴增雜交瘤。選擇、選殖及擴增雜交瘤之方法為熟習此項技術者所熟知。
本發明之抗唾液酸酶抗體亦可使用噬菌體顯示或酵母顯示方法來製備。該等分離人類抗體之顯示方法已確立於業內( 例如參見Knappik等人，(2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86；Feldhaus等人，(2003) Nat Biotechnol 21:163-170。
在一些其他實施例中，本發明提供本文所闡述之任一抗唾液酸酶抗體之衍生物。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體衍生物係衍生自本發明之闡釋性抗唾液酸酶抗體之胺基酸序列之修飾，而保留親代抗體胺基酸序列之整體分子結構。可修飾親代抗體鏈之任何區域(例如框架區、CDR區或恆定區)之胺基酸序列。修飾類型包含親代抗體之一或多個胺基酸之取代、插入、缺失或其組合。
胺基酸取代涵蓋保守取代及非保守取代。術語「保守胺基酸取代」意指一種胺基酸經另一胺基酸代替，其中兩種胺基酸在某些物理-化學性質(例如所涉及殘基之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性性質)方面具有類似性。舉例而言，取代通常可進行於下列群組中之每一者內：(a)非極性(疏水性)胺基酸，例如丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸，例如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸及麩醯胺酸；(c)帶正電(鹼性)胺基酸，例如精胺酸、離胺酸及組胺酸；及(d)帶負電(酸性)胺基酸，例如天門冬胺酸及麩胺酸。
修飾可進行於抗唾液酸酶抗體之胺基酸序列之任何位置中，包含CDR、框架區或恆定區之位置中。在一實施例中，本發明提供抗唾液酸酶抗體衍生物，其含有本發明之闡釋性抗唾液酸酶抗體之V H及V LCDR序列，但含有不同於闡釋性抗唾液酸酶抗體之彼等框架序列之框架序列。該等框架序列可自包含種系抗體基因序列之公共DNA資料庫或公開參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見基因庫資料庫或「VBase」人類種系序列資料庫(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第91-3242號(1991)；Tomlinson等人， J. Mol. Biol.227:776-798 (1992)；及Cox等人， Eur. J. Immunol.24:827-836 (1994))。可用於構築抗體衍生物之框架序列包含在結構上類似於本發明之闡釋性抗體所用之框架序列者。舉例而言，可將闡釋性抗體之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3序列以及CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3序列接枝於與衍生框架序列之種系免疫球蛋白基因中所發現者具有相同序列之框架區上，或可將CDR序列接枝於與種系序列相比含有一或多個突變之框架區上。
在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體衍生物係包括本發明之闡釋性抗體之胺基酸序列之嵌合抗唾液酸酶抗體。在一實例中，組合來自一或多種闡釋性抗唾液酸酶抗體之一或多個CDR與來自非人類動物(例如小鼠或大鼠)之抗唾液酸酶抗體之CDR。在另一實例中，嵌合抗唾液酸酶抗體之所有CDR皆係衍生自一或多種闡釋性抗唾液酸酶抗體。在一些特定實施例中，嵌合抗唾液酸酶抗體包括一個、兩個或三個來自闡釋性抗唾液酸酶抗體之重鏈可變區之CDR及/或一個、兩個或三個來自輕鏈可變區之CDR。可使用業內已知之習用方法來生成嵌合抗體。
另一類修飾係使V H及/或V L鏈之CDR區內之胺基酸殘基發生突變。可實施定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變，且可在如業內已知之活體外或活體內分析中評估對抗體結合或所關注其他功能性質之效應。通常，可引入保守取代。突變可為胺基酸添加及/或缺失。此外，通常改變CDR區內之不超過一個、兩個、三個、四個或五個之殘基。在一些實施例中，抗唾液酸酶抗體衍生物在重鏈CDR中及/或在輕鏈CDR中包括1、2、3或4個胺基酸取代。在另一實施例中，胺基酸取代係將抗唾液酸酶抗體中之一或多個半胱胺酸變為另一殘基(例如(但不限於)丙胺酸或絲胺酸)。半胱胺酸可為規範或非規範半胱胺酸。在一實施例中，相對於闡釋性抗唾液酸酶抗體之胺基酸序列，抗唾液酸酶抗體衍生物在重鏈HVR區中具有1、2、3或4個保守胺基酸取代。
亦可對V H及/或V L區內之框架殘基進行修飾。通常，進行該等框架變化以降低抗體之免疫原性。一種方式係將一或多個框架殘基「回復突變」成相應種系序列。已發生體細胞突變之抗體可含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑒定。為使框架區序列返回至其種系構形，可藉由(例如)定點誘變或PCR介導之誘變將體細胞突變「回復突變」成種系序列。 IV. 醫藥組合物、套組及製品
本申請案進一步提供醫藥組合物，其包括本文所闡述之重組溶瘤病毒、包括重組溶瘤病毒之載體細胞及/或經工程化免疫細胞中之任一者及醫藥上可接受之載劑。
在一些實施例中，提供一種組合物(例如醫藥組合物)，其包括：(a)重組溶瘤病毒，其包括編碼外來抗原之核苷酸序列；及(b)經工程化免疫細胞，其表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體。在一些實施例中，外來抗原係細菌抗原。在一些實施例中，外來抗原係唾液酸酶，例如DAS181。
在一些實施例中，本申請案提供一種醫藥組合物，其包括：溶瘤病毒(例如VV)，其包括編碼唾液酸酶之第一核苷酸序列及視情況本文所闡述之任一或多種其他異源性蛋白質或核酸；及經工程化免疫細胞，其表現特異性結合唾液酸酶之嵌合受體(例如CAR-T、CAR-NK或CAR-NKT細胞)。在一些實施例中，一或多種異源性蛋白質或核酸可調節及增強免疫細胞功能，例如抗LILRB、抗葉酸鹽受體β、雙特異性抗體(例如抗LILRB/4-1BB)等。
在一些實施例中，本申請案提供第一醫藥組合物，其包括含有編碼唾液酸酶之第一核苷酸序列及視情況本文所闡述之任一或多種其他異源性蛋白質或核酸之重組溶瘤病毒(例如VV)及視情況醫藥上可接受之載劑；及第二醫藥組合物，其包括表現特異性結合唾液酸酶之嵌合受體之經工程化免疫細胞(例如CAR-T、CAR-NK或CAR-NKT細胞)及視情況醫藥上可接受之載劑。
在一些實施例中，提供一種醫藥組合物，其包括：(a)重組溶瘤病毒，其包括編碼唾液酸酶(例如DAS181或其衍生物)之核苷酸序列；(b) NK細胞，其表現特異性識別唾液酸酶之CAR；及(c)醫藥上可接受之載劑。在一些實施例中，溶瘤病毒係牛痘病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒進一步包括編碼多特異性免疫細胞銜接體(例如特異性結合FAP及CD3ε之雙特異性抗體)之核苷酸序列。在一些實施例中，NK細胞進一步表現IL-15。
可藉由混合本文所闡述具有期望純度之重組溶瘤病毒及/或經工程化免疫細胞與醫藥上可接受之可選載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol, A.編輯(1980))以凍乾調配物或水溶液形式來製備醫藥組合物。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用劑量及濃度下對接受者無毒，且包含緩衝劑、抗氧化劑(包含抗壞血酸、甲硫胺酸、維他命E、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑、等滲劑(例如氯化鈉)、穩定劑、金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)、螯合劑(例如EDTA)及/或非離子型表面活性劑。
調配物可包含載劑。載劑係可溶於循環系統中且在生理上可接受之大分子，其中生理接受意味著熟習此項技術者接受該載劑至患者之注射作為治療方案之一部分。載劑較佳地在循環系統中相對穩定且具有可接受之血漿清除半衰期。該等大分子包含(但不限於)大豆卵磷脂、油酸及山梨醇酐三油酸酯。
調配物亦可包含其他可用於維持pH、穩定溶液或調控滲透壓之試劑。該等試劑之實例包含(但不限於)鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)及碳水化合物(例如葡萄糖、半乳糖或甘露糖)以及諸如此類。
在一些實施例中，醫藥組合物含於單用途小瓶(例如單用途密封小瓶)中。在一些實施例中，醫藥組合物含於多用途小瓶中。在一些實施例中，醫藥組合物以散裝形式含於容器中。在一些實施例中，將醫藥組合物冷凍保存。
在一些實施例中，本文所提供之系統可穩定且無限期地儲存於冷凍保存條件下(例如在-80℃下)，且可根據需要或期望在投與之前解凍。舉例而言，在解凍以供投與之前，本文所提供之系統可儲存於保存溫度(例如-20℃或-80℃)下至少約數小時(1、2、3、4或5小時)或數天或介於其間，包含至少約數年(例如但不限於1、2、3年或更久)或介於其間，例如至少或約1、2、3、4或5小時至至少或約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71或72小時或4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30天或1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12個月或1、2、3、4或5年或更久。本文所提供之系統亦可穩定儲存於冷凍條件下(例如在4℃下)及/或使用冰傳輸至投與部位以供治療。舉例而言，在投與治療之前，本文所提供之系統可儲存於4℃下或冰上至少約數小時或介於其間，例如(但不限於) 1、2、3、4或5小時至至少或約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小時或更久。
本申請案進一步提供用於本文所闡述之任一治療方法實施例中之套組及製品。套組及製品可包括本文所闡述之調配物及醫藥組合物中之任一者。
在一些實施例中，提供一種套組，其包括一或多個用於表現本文所闡述之任一重組溶瘤病毒之核酸構築體及關於產生重組溶瘤病毒之說明書。在一些實施例中，該套組進一步包括關於治療癌症之說明書。
在一些實施例中，提供一種套組，其包括本文所闡述之任一重組溶瘤病毒及本文所闡述之任一表現嵌合受體之經工程化免疫細胞(例如CAR-NK細胞)以及關於治療癌症之說明書。在一些實施例中，該套組進一步包括另一免疫治療劑(例如免疫檢查點抑制劑)。在一些實施例中，該套組進一步包括一或多種用於治療癌症之其他治療劑。在一些實施例中，拮抗劑、重組溶瘤病毒及經工程化免疫細胞及視情況其他免疫治療劑處於單一組合物(例如包括經工程化免疫細胞及重組溶瘤病毒之組合物)中。在一些實施例中，重組溶瘤病毒及經工程化免疫細胞及視情況用於治療癌症之其他免疫治療劑處於分開組合物中。
本發明套組係呈適宜包裝形式。適宜包裝包含(但不限於)小瓶、瓶、廣口瓶、撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及諸如此類。套組可視情況提供其他組分，例如緩衝液及詮釋性資訊。本申請案由此亦提供製品，其包含小瓶(例如密封小瓶)、瓶、廣口瓶、撓性包裝及諸如此類。
本說明書中所揭示之所有特徵可以任一組合進行組合。本說明書中所揭示之每一特徵皆可由適應於相同、等價或類似目的之替代特徵所代替。因此，除非另有明確說明，否則每一所揭示特徵僅係一系列等效或類似特徵之實例。 實例
下述實例僅意欲例示本發明且由此不應視為以任一方式限制本發明。下列實例及詳述說明係藉由闡釋方式而非藉由限制方式來提供。 實例 1 ： DAS181 處理可減少腫瘤細胞表面上之唾液酸
在此研究中，檢驗DAS181對某些腫瘤細胞之唾液酸負荷之影響。簡言之，對A549 (人類肺泡基底上皮腺癌)及MCF (人類乳房上皮腺癌)腫瘤細胞上之α-2,3及α-2,6唾液酸修飾實施FAC及基於影像之量化。藉由PNA-FITC使用流式細胞術分析及成像方式來檢測A549及MCF7細胞中之唾液酸去除後之半乳糖暴露。如上文所論述，存在最通常藉由α-2,3鍵聯或α-2,6鍵聯附接至倒數第二個糖之兩種唾液酸，其分別可藉由朝鮮槐凝集素(Maackia Amurensis Lectin II，MAL II)及西洋接骨木凝集素(Sambucus Nigra Lectin，SNA)進行檢測。另外，可使用花生凝聚素(Peanut Agglutinin，PNA)來檢測表面半乳糖(例如在唾液酸去除之後暴露之半乳糖)。
圖 1繪示藉由螢光成像來檢測A549及MCF細胞上之α-2,6唾液酸(藉由FITC-SNA)。
使用不同濃度之DAS181處理A549細胞且然後染色以使2,6連接之唾液酸(FITC-SNA)、α-2,3連接之唾液酸(FITC-MALII)或半乳糖(FITC-PNA)成像。如可在 圖 2中看到，DAS181有效去除2,3及2,6連接之唾液酸二者且暴露半乳糖。
與之相比，DAS185 (因Y348F突變而缺乏唾液酸酶活性之DAS181變體)則不能去除α-2,6連接之唾液酸或α-2,3連接之唾液酸。如 圖 3中所展示，將A549細胞與DAS185一起培育對表面上之α-2,3連接之唾液酸基本上無影響，而DAS181則以濃度依賴性方式減少表面上之α-2,3連接之唾液酸(使用FITC-MALII將細胞染色；結果展示於 圖 3中)。類似地，將A549細胞與DAS185一起培育對表面上之α2,6連接之唾液酸基本上無影響，而DAS181則以濃度依賴性方式減少表面上之α-2,6連接之唾液酸(使用FITC-SNA將細胞染色；結果展示於 圖 4中)。與該等結果一致，將A549細胞與DAS185一起培育對表面半乳糖基本上無影響，而DAS181則以濃度依賴性方式增加表面半乳糖(使用FITC-PNA對細胞染色；結果展示於 圖 5中)。 實例 2 ： DAS181 處理增加了 PBMC 介導之腫瘤細胞殺死
實例1證實，DAS181以廣泛特異性(例如裂解α-2,3與α-2,6鍵聯二者)有效減小腫瘤細胞之唾液酸負荷。實例2證實，與未處理腫瘤細胞相比，使用DAS181處理腫瘤細胞會顯著增強經處理腫瘤細胞之PBMC介導之殺死。
簡言之，α-2,3及α-2,6唾液酸之FAC及基於影像之量化
使用紅色螢光蛋白對A549細胞進行基因標記(A549-紅)。收穫新鮮人類PBMC並使用各種細胞介素-抗體組合進行刺激以活化效應T細胞(CD3、CD38及IL-2)或(在一些情形下) T細胞及NK細胞(CD3、CD28、IL-15及IL-21)。然後將經活化PBMC與已暴露於DAS181 (100 nM)之A549-紅細胞一起共培養。藉由活細胞成像監測PBMC之腫瘤細胞殺死並使用IncuCyte量化。收集細胞培養基並藉由ELISA分析以評價PBMC之細胞介素產生。
圖 6展示，用於刺激PBMC之處理及DAS181與用於刺激PBMC之處理之組合皆不影響A549-紅細胞增殖。
圖 7展示，與僅媒劑對照相比，DAS181顯著增加由PBMC (供體1)介導之腫瘤細胞毒性(T細胞介導及NK細胞介導二者)。使用來自不同供體(供體2； 圖 8)之PBMC觀察到類似結果。 圖 9A-C呈現 圖 7中所呈現數據之量化。 圖 9A展示在使用或不使用DAS181下利用PBMC以指示效應細胞:腫瘤細胞比率處理後之A549-紅細胞之量化。 圖 9B展示在使用或不使用DAS181下利用經CD3、CD38及IL-2刺激以活化效應T細胞之PBMC以指示效應細胞:腫瘤細胞比率處理後之A549-紅細胞之量化。 圖 9C展示在使用或不使用DAS181下利用經CD3、CD28、IL-15及IL-21刺激以活化效應T細胞及NK細胞之PBMC以指示效應細胞:腫瘤細胞比率處理後之A549-紅細胞之量化。 圖 10A-10C分別展示使用來自不同供體(供體2)之PBMC之相同量化。 實例 3 ： 溶瘤牛痘病毒及 DAS181 對腫瘤細胞之 NK 細胞介導之殺死
在此研究中，檢驗溶瘤牛痘病毒(Western Reserve, VV)及DAS181對NK細胞介導之殺死之影響。使用DAS185 (缺乏唾液酸酶活性之變體蛋白)作為對照。此實例證實，暴露於DAS181會增加溶瘤病毒之腫瘤細胞殺死。
簡言之，將腫瘤細胞(U87-GFP)以5×10 4個細胞/孔(100ul)平鋪於96孔組織培養板中之DMEM中並在37℃下培育過夜。在第2天，使用VV以MOI 0.5、1或2於無胎牛血清培養基中將細胞感染2小時且然後暴露於1nM DAS181或1 mM DAS185。然後將腫瘤細胞與經純化NK細胞以效應物:腫瘤(E:T) = 1:1、5:1、10:1混合。在補充有2% FBS之培養基中培養細胞以減少神經胺酸酶/唾液酸酶背景。在24 hr之後，藉由MTS分析(96孔板)量測腫瘤殺死，且收集細胞培養基。藉由ELISA量測IFNγ表現。此研究之結果展示於 圖 11及 圖 12中，其中可看到，DAS181增加了溶瘤牛痘病毒之腫瘤細胞殺死，但惰性DAS185則不能。 實例 4 ： DAS181 對在腫瘤細胞存在下之 DC 成熟及巨噬細胞活性之影響
在此研究中，檢驗DAS181對單核球源樹突狀細胞或巨噬細胞之影響。使用DAS185 (缺乏唾液酸酶活性之變體蛋白)作為對照。
簡言之，藉由將5×10 6個黏附性PBMC再懸浮於3 ml補充有100 ng/ml GM-CSF及50 ng/ml IL-4之培養基中來製備單核球源樹突狀細胞(DC)。在48 hr之後，將2 ml補充有100 ng/ml GM-CSF及50 ng/ml IL-4之新鮮培養基添加至每一孔中。再過72 hr之後，將腫瘤細胞(U87-GFP)平鋪於24孔板中之DMEM中。使用VV以不同MOI在無FBS培養基中將腫瘤細胞感染2小時。以1:1之腫瘤細胞:DC比率混合在1nM DAS181或DAS185存在下培養之DC與腫瘤細胞。樹突狀細胞成熟(CD86、CD80、MHC-II、MHC-I之表現)。
另外，在含有10%熱滅活FBS之RPMI 1640培養基(Invitrogen)中培養THP-1細胞。使用PMA (20 ng/ml)在不存在及存在1nM唾液酸酶DAS181或DAS185下刺激6孔板中之THP-1細胞(3×10e6個細胞/孔)。細胞培養基體積為2ml。在第5天，將腫瘤細胞(U87-GFP, DMEM細胞培養基)平鋪於24孔組織培養板中。使用VV以不同MOI (亦即0.5、1、2)在無FBS培養基中將腫瘤感染2小時。對於THP-1細胞培養而言，藉由移液管取出1.5 ml細胞培養基。藉由離子黴素(1ug/ml)及PMA (20 ng/ml)亦在不存在及存在1nM唾液酸酶DAS181或DAS185及腫瘤細胞-VV下以1:1之腫瘤:巨噬細胞比率將經分化THP-1細胞進一步刺激12 h。在補充有2% FBS之培養基中培養THP-1細胞以減少神經胺酸酶背景。在第6天，藉由ELISA陣列量測培養基中之細胞介素濃度。
如可在 圖 13中看到，DAS181顯著增強表現樹突狀細胞成熟標記物，不論單獨培養細胞抑或與經牛痘病毒感染之腫瘤細胞一起培養。
另外，此研究之結果證實，暴露於DAS181會增加THP-1源巨噬細胞之TNF-α分泌( 圖 14)。 實例 5 ： DAS181 在免疫細胞不存在下增加了溶瘤腺病毒腫瘤細胞殺死
此實例所提供之意外結果證實，使用DAS181進行處理會增加溶瘤病毒腫瘤細胞殺死，即使在不存在免疫細胞下。
使用紅色螢光蛋白對A549細胞進行基因標記(A549-紅)。藉由活細胞成像監測在存在或不存在DAS181下之腫瘤細胞增殖及溶瘤腺病毒(Ad5)殺死並使用IncuCyte量化。收集細胞培養基以用於藉由ELISA量測PBMC之細胞介素產生。如 圖 15中所展示，DAS181增加了溶瘤腺病毒介導之腫瘤細胞殺死及生長抑制。 實例 6 ： DAS181 在 PBMC 存在下增加溶瘤腺病毒殺死腫瘤細胞
如實例5中所展示，在不存在免疫細胞下，使用DAS181處理增加溶瘤病毒殺死腫瘤細胞。實例6提供結果證實，在PBMC存在下同時存在溶瘤病毒時，使用DAS181處理亦增加腫瘤細胞殺死。
藉由紅色螢光蛋白對A549細胞進行基因標記(A549-紅)。收穫新鮮人類PBMC並使用適當細胞介素及抗體組合刺激以活化效應T細胞。然後共培養活化PBMC與已在有或沒有溶瘤腺病毒(Ad5)下經DAS181處理之A549-紅細胞。藉由活細胞成像監測PBMC殺死腫瘤細胞並使用IncuCyte量化。收集細胞培養基以用於ELISA量測PBMC產生之細胞介素。如 圖 16中所展示，當在PBMC存在下同時存在溶瘤腺病毒時，DAS181顯著增加腫瘤細胞殺死。 實例 7 ： 表現 DAS181 之溶瘤病毒之構築及表徵
經設計以表現DAS181之構築體示意性繪示於 圖 17中 。
為生成表現DAS181之重組VV，修飾pSEM-1載體以包含編碼DAS181之序列以及兩個loxP位點(loxP位點序列示於SEQ ID NO: 62中)以相同位向側接編碼GFP蛋白之序列(GFP編碼序列示於SEQ ID NO: 63中)。(pSEM-1-TK-DAS181-GFP)。DAS181表現係於F17R晚期啟動子之轉錄控制下以限制於腫瘤組織內之表現。實例性構築體之一部分序列示於SEQ ID NO: 65中。
使用Western Reserve VV作為親代病毒。藉由pSEM-1-TK-DAS181-GFP重組至Western Reserve VV之TK基因中以生成VV-DAS181來生成表現DAS181之VV。
可如下生成重組病毒。 轉染 ：
以5×10 5個細胞/2 ml DMEM-10% FBS/孔將CV-1細胞接種至6孔板中並生長過夜。藉由以MOI 0.05將病毒儲液稀釋於DMEM/2% FBS中來製備親代VV病毒(1 ml/孔)。自CV-1孔去除培養基並立即添加VV，且培養1-2小時。CV-1細胞此時應60-80%鋪滿。在1.5 ml管中實施轉染混合。對於每一轉染，將9 µl Genejuice稀釋於91 ul無血清DMEM中並在室溫培育5 min。藉由上下吸移液兩或三次來輕輕添加3ug pSEM-1-TK-DAS181-GFP DNA。在室溫靜置15 min。自CV-1孔吸取VV病毒並使用2 ml無血清DMEM洗細胞一次。添加2 ml DMEM-2% FBS並逐滴添加該DNA-Genejuice溶液。在37℃培育48-72 hr或直至所有細胞聚集為止。藉由重複吸移液來收穫細胞。藉由重複冷凍-解凍所收穫細胞，首先將該等所收穫細胞置於乾冰/乙醇浴中且然後在37℃水浴中解凍並渦旋，自細胞釋放病毒。重複冷凍-解凍循環三次。可將細胞溶解物儲存於-80℃。 蝕斑分離 ：
以5×10 5個細胞/2ml DMEM-10% FBS/孔將CV-1細胞接種至6孔板中並生長過夜。在接收細胞溶解物時，CV-1細胞應60-80%鋪滿。在冰上使用具有超音波轉換探針之音波破碎機將細胞溶解物音波處理4個30s循環，直至懸浮液中之材料分散為止。在DMEM-2% FBS中製備細胞溶解物之10倍連續稀釋液。以稀釋度10 -2、10 -3、10 -4向每一孔中添加1 ml細胞溶解物-培養基，在37℃下培育。使用移液管尖端挑選充分分離之GFP+蝕斑。輕微搖動移液管尖端以刮除及剝離蝕斑中之細胞。輕輕轉移至含有0.5 ml DMEM培養基之微離心管中。冷凍-解凍三次並實施音波處理。重複相同之蝕斑分離過程3-5次。 病毒擴增 ：
在6孔板中以5×10 5個細胞/2ml DMEM-10% FBS/孔接種CV-1細胞並生長過夜。在開始實驗時，CV-1應鋪滿。使用250 ul蝕斑溶解物/1ml DMEM-2% FBS感染1個孔，並在37℃下培育2 h。取出蝕斑溶解物並添加2 ml新鮮DMEM-2% FBS，且培育48-72 hr直至細胞聚集。藉由重複移液來收集細胞，冷凍-解凍3次並實施音波處理。將一半細胞溶解物添加於4ml DMEM-2%FBS中並在75-CM2燒瓶中感染CV-1細胞，在2 h之後，取出病毒並添加12 ml DMEM-2%FBS，且培養48-72 h (直至細胞聚集)。收穫細胞，在1800 G下旋轉5 min，且棄除上清液並再懸浮於1 ml DMEM-2.5% FBS中。 病毒滴定 ：
在6孔板中以5×10 5個細胞/2ml DMEM-10% FBS/孔接種CV-1細胞並生長過夜。將病毒以50 ul病毒/4950 ul DMEM-2% FBS (A, 10 -2)、500ul A/4500ul培養基(B, 10 -3)及500 ul B/4500 ul培養基(C, 10 -4)稀釋於DMEM-2% FBS中，對於病毒儲積液為10 -7至10 -10。去除培養基並使用PBS洗滌1次，且使用1ml病毒稀釋液一式兩份感染細胞。將細胞培育1 h，每10 min搖動板。在1 h後，取出病毒並添加2 ml DMEM-10% FBS，且培育48 h。去除培養基，添加1 ml於20%乙醇中之0.1%結晶紫並在室溫下保持15 min。去除培養基並在室溫下乾燥24 hr。對蝕斑進行計數並表示為蝕斑形成單位(pfu)/ml。 VV-DAS181 之 DAS181 表現之檢測 ：
使用VV-DAS181以MOI 0.2感染CV-1細胞。在48小時後，收集CV-1細胞。使用Wizard SV基因體DAN純化系統提取DNA且用作DAS181 PCR擴增之模板。使用標準PCR方案及引子序列(SialF: GGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCA (SEQ ID NO: 56)及SialR: CCGGTTGCGCCTATTCTTGCCGTTCTTGCCGCC (SEQ ID NO: 57))實施PCR。發現預期PCR產物(1251 bp)。 實例 8 ： 由牛痘病毒表現之 DAS181 在活體外係活性的
實例8所提供之結果證實，使用溶瘤病毒將DAS181遞送至細胞中會產生等效於使用於1 ml培養基中之大約0.78nM-1.21 nM經純化DAS181進行處理之唾液酸酶活性。
將CV-1細胞平鋪於6孔板中。使用唾液酸酶-VV或對照VV以MOI 0.1或MOI 1轉導細胞。在24 hr之後，收集經轉染細胞，且在PBS中以3×10 6/500 µl製備單細胞懸浮液。使用用於蛋白質提取之Sigma哺乳動物細胞溶解套組(Sigma, MCL1-1KT)製備細胞溶解物，且收集上清液。使用神經胺酸酶分析套組(Abcam, ab138888)根據製造商說明書來量測唾液酸酶(DAS181)活性。將1 nM、2 nM及10 nM DAS181添加至VV細胞溶解物中作為對照並生成標準曲線。感染唾液酸酶-VV之1×10 6個細胞之DAS181表現等效於於1 ml培養基中之0.78nM-1.21 nM DAS181。如 圖 18中所展示，DAS181具有活體外唾液酸酶活性 。 實例 9 ：牛痘病毒 - 唾液酸酶促進樹突狀細胞成熟
實例9所提供之結果證實，與不含唾液酸酶之溶瘤病毒相比，編碼唾液酸酶之溶瘤病毒促進樹突狀細胞成熟。
為測定唾液酸酶-VV是否可促進DC活化及成熟，將黏附性人類PBMC以5×10 6個細胞再懸浮於3 ml補充有100 ng/ml GM-CSF及50 ng/ml IL-4之培養基中，然後在每孔具有2ml補充有相同濃度之GM-CSF及IL-4之新鮮培養基之6孔板中培養。在細胞培養後6天，在經唾液酸酶-VV感染之腫瘤細胞溶解物、經VV感染之腫瘤細胞溶解物、經VV感染之腫瘤細胞溶解物+合成DAS181蛋白或LPS (陽性對照)存在下培養細胞。再過24 hr之後，藉由流式細胞術測定CD86、CD80、MHC-II、MHC-I之表現。如 圖 19中所展示，與使用單獨VV之處理相比，唾液酸酶-VV促進了指示樹突狀細胞活化及成熟之標記物之表現。 實例 10 ：唾液酸酶 -VV 增強 T 淋巴球介導之細胞介素產生及溶瘤活性
為評價DAS181是否可藉由誘導IFN-γ (IFNr)及IL-2表現來活化人類T細胞，藉由添加10 µg/ml CD3抗體來活化人類PBMC，藉由每48 hr添加IL-2來進一步刺激增殖。在第15天，使用VV以MOI 0.5、1或2在2.5% FBS培養基中將腫瘤細胞(A549)感染2小時。以5:1或10:1之效應物:靶比率在1 ug/ml CD3抗體存在下將活化T細胞添加至培養物中。再過24 hr之後，量測腫瘤細胞毒性，且收集細胞培養基以用於細胞介素陣列。如可在 圖 20中看到，唾液酸酶-VV所誘導之CD3活化性T細胞之IL-2及IFN-γ表現顯著大於VV。另外，如可在 圖 21中看到，唾液酸酶-VV在5:1之E:T下誘發強於VV之抗腫瘤反應。 實例 11 ： 分泌型及跨膜 DAS181 之表現構築體之生成
產生分泌及跨膜形式之DAS181以檢驗對唾液酸酶活性之影響。作為陰性對照，亦產生大大減小唾液酸酶活性之分泌及跨膜形式之點突變體。最後，亦構築分泌及跨膜形式之一種替代唾液酸酶Neu2。
為促進DAS181自細胞之分泌，藉由基因合成將編碼小鼠免疫球蛋白κ鏈之信號肽之DNA序列添加至DAS181序列之N-末端且然後一起選殖至哺乳動物表現載體pcDNA3.4中。為限制細胞表面上之DAS181唾液酸酶活性，合成編碼DAS181催化結構域之DNA序列並與人類PDGFR β跨膜結構域同框選殖至哺乳動物表現載體pDisplay中。對於對照而言，以類似方式合成編碼分泌及跨膜形式之DAS185 (缺乏唾液酸酶活性之突變蛋白)之DNA序列並分別選殖至pcDNA3.4及pDisplay載體中。另外，以相同方式生成表現分泌及跨膜形式之人類Neu2唾液酸酶之構築體。展示下列構築體之序列：構築體1 (分泌型DAS181；SEQ ID NO: 34)、構築體4 (跨膜DAS181；SEQ ID NO: 37)、構築體2 (分泌型DAS185；SEQ ID NO: 35)、構築體5 (跨膜DAS185；SEQ ID NO: 38)、構築體3 (分泌型人類Neu2；SEQ ID NO: 36)及構築體6 (跨膜人類Neu2；SEQ ID NO: 39)。 實例 12 ： 分泌型及跨膜唾液酸酶之酶促活性
對於異位表現而言，使用jetPRIME轉染試劑(Polyplus Transfection第114-15號)遵循製造商方案來將哺乳動物表現載體(詳述於實例11中)轉染至HEK293細胞中。簡言之，將人類胚胎腎細胞(HEK293)以約2 × 10 5個活細胞/孔平鋪於6孔組織培養板中並藉由在37℃、5% CO2及95%相對濕度下培育(通常過夜)來生長至鋪滿。將2微升(等效於2微克) DNA稀釋至200微升jetPRIME緩衝液中，隨後加入4微升jetPRIME試劑。對管實施渦旋，在1,000 × g下短暫離心(約10秒)並在室溫下培育10分鐘。在培育期間，使用新鮮培養基(MEM + 10% FBS)補充所有孔上之培養基。將轉染液添加至個別孔中，且將板放回培育器中並保持24小時。在培育後，保留上清液。使用非酶促細胞解離試劑Versene (Gibco第15040-066號)產生單細胞懸浮液。使用DPBS將單層洗滌1次且添加500微升Versene，對板進行培育直至細胞自器皿表面脫離；添加500微升完整培養基且將細胞在300×g下離心5分鐘。抽吸上清液且將細胞懸浮於300微升競爭培養基中以供酶促分析。
對於每一所得轉染培養物而言，利用唾液酸酶以酶促方式裂解螢光受質水合2′-(4-甲基傘形酮基)-α-D-N-乙醯基神經胺酸鈉鹽(MuNaNa)以釋放螢光分子4-甲基傘形酮(4-Mu)之能力來評估上清液及經再懸浮細胞之活性。在365 nM下激發所得游離4-Mu且在445 nm下使用螢光讀板儀讀取發射。簡言之，將100 µl之每一試樣平鋪至黑色、未處理之96孔板中。將板在37℃下於水浴中培育大約30分鐘並隨後與經預培育(37℃, 30分鐘)之100 µM MuNaNa混合。使用Molecular Devices SpectraMax M5e多模式讀板儀在30秒間隔下以動力學方式量測螢光60分鐘。藉由與純4-Mu (介於100-5 µM之間)之標準曲線進行比較來量化藉由裂解所生成4-Mu之量。藉由使所產生4-Mu之量(≤ 20 µM)除以所需時間(秒)來測定每一試樣之反應速率。比較所觀察反應速率以測定每一試樣溶液之近似相對活性(表6)。可展示，來自分泌型DAS181轉染之上清液及來自跨膜DAS181轉染之經再懸浮細胞最具活性且大約相等。所有DAS185及Neu2試樣溶液皆展示與DAS181試樣溶液相比可忽略之活性。Neu2試樣溶液等效於背景。另外，將所觀察反應速率與已知濃度之DAS181 (介於1000-60 pM之間)之標準曲線進行比較。經外推，來自分泌型DAS181轉染之上清液及來自跨膜DAS181轉染之經再懸浮細胞大約等效於4000 pM DAS181。經觀察，所有其他試樣大約等效於或小於90 pM DAS181。 表 6
      條件化培養基 * 濃縮細胞 **
活性 (pM 4-Mu/sec) DAS181 等效濃度 (pM) 活性 (pM 4-Mu/sec) DAS181 等效濃度 (pM)
DAS181 分泌型 構築體 1 60797 4370 25326 1857
TM 構築體 4 1451 166 55261 3978
DAS185 分泌型 構築體 2 89 N/A 47 N/A
TM 構築體 5 1.9 N/A 48 N/A
Neu2 分泌型 構築體 3 2.2 N/A 0.3 N/A
TM 構築體 6 0.6 N/A 0.0 N/A
*旋轉條件化培養基試樣以去除任何碎屑並在純淨狀態下測試。 **收穫細胞，旋轉並再懸浮於300 µL培養基中。 調節所有值以自培養基去除背景活性。 所測得所有值皆闡述所測試之特定試樣。不能直接比較試樣之間之值，此乃因酶濃度有所變化。
  
實例 13 ： 分泌型 DAS181 及跨膜 DAS181 減少了腫瘤細胞上之表面唾液酸
在使用Fugene HD (Promega)遵循由製造商提供之說明書將各種表現構築體瞬時轉染至A549-紅細胞中之後，藉由成像及流式細胞術檢驗分泌型及跨膜唾液酸酶對細胞表面唾液酸去除及半乳糖暴露之效應。簡言之，將A549-紅細胞以2 × 10 5個細胞/孔平鋪於6孔板中之2 ml A549-紅完整生長培養基中。對於擬轉染細胞之每一孔而言，將3 μg質體DNA及9 μl Fugene HD稀釋至150 μl Opti-MEM® I減血清培養基中，輕輕混合並在室溫下培育5分鐘以形成DNA-Fugene HD複合物。將上述DNA-Fugene HD複合物直接添加至每一含有細胞之孔中且將細胞在37℃下於CO 2培育器中培育過夜，然後進行其他實驗。
對於成像實驗而言，將轉染細胞以8,000個細胞/孔再接種於96孔板中。然後固定細胞並在細胞培養24 hr、48 hr或72 hr後針對α2,3-唾液酸、α2,6-唾液酸及半乳糖進行染色。將細胞分別與40µg/ml SNA-FITC、20µg/ml PNA-FITC在室溫下一起培育1h以對α2,6-唾液酸及半乳糖進行染色。對於α2,3-唾液酸而言，將細胞與40µg/ml生物素化MA II一起培育1hr，隨後與FITC-鏈黴抗生物素蛋白一起再培育1hr。為檢測HA-標籤表現，將細胞與HA-標籤兔mAb (1:200)在室溫下一起培育1hr，隨後與驢抗兔-Alexa Fluor647一起再培育1hr。藉由Keyence螢光顯微術獲取影像。
在轉染後24 hr獲取之影像展示，類似於重組DAS181處理，分泌型DAS181 (構築體1)及跨膜DAS181 (構築體4)轉染自細胞表面去除α2,3唾液酸及α2,6唾液酸二者且同時半乳糖染色有所增加。與酶活性結果一致，經酶惰性DAS185 (構築體2、5)或人類Neu2 (構築體3、6)轉染之細胞展示與媒劑對照細胞類似之染色模式。
在轉染後72 hr獲取之影像明顯地證實，僅分泌型及跨膜DAS181轉染能夠有效去除腫瘤細胞表面唾液酸。然而，人類Neu2可能不能由細胞充分表現，此乃因存在於跨膜構築體中之HA標籤之染色僅在經DAS181及DAS185構築體轉染之細胞中呈陽性。
對於流式細胞術分析而言，將經轉染細胞以1×10 5個細胞/孔再接種於24孔板中。然後固定細胞並在細胞培養24 hr、48 hr或72 hr後針對α2,3-唾液酸、α2,6-唾液酸及半乳糖染色。使用Acea流式細胞儀系統分析結果。分泌型構築體關於α2,3 (圖22A)及α2,6 (圖22B)唾液酸以及半乳糖(圖22C)之轉染結果(使用重組DAS181處理作為對照)展示於 圖 22A-22C中。跨膜構築體關於α2,3 (圖23A)及α2,6 (圖23B)唾液酸以及半乳糖(圖23C)之轉染結果(使用分泌型DAS181轉染作為對照)展示於 圖 23A-23C中。與成像研究結果一致，分泌型DAS181及跨膜DAS181轉染可去除細胞表面α2,3唾液酸及α2,6唾液酸且暴露半乳糖，而使用分泌型及跨膜DAS185或人類Neu2之轉染則具有較小效應。 實例 14 ： 分泌型 DAS181 及跨膜 DAS181 增加了由 PBMC 及溶瘤病毒介導之腫瘤細胞殺死
因分泌型DAS181及跨膜DAS181展示可有效去除細胞表面唾液酸，故使用經分泌型及跨膜DAS181轉染之細胞來評估其對於PBMC及溶瘤病毒介導之腫瘤細胞殺死之效應。因瞬時轉染可對細胞生長具有有害效應，故藉由將經轉染A549-紅細胞在1 mg/ml G418存在下培養3週直至完全殺死對照未轉染細胞為止來生成分泌及跨膜型DAS181之穩定池細胞。以2000個細胞/孔之密度將經DAS181轉染之穩定池A549-紅細胞接種至96孔板中。接種A549-紅親代細胞以作為對照。第二天，去除完整生長培養基且更換為50 ul含有或不含溶瘤病毒之培養基。對新分離PBMC進行計數並以200,000/ml再懸浮於含有抗CD3/抗CD28/IL2之A549完整培養基中，然後將50µl新鮮PBMC添加至細胞中。基於經計數紅色物件藉由Essen Incucyte監測細胞生長最多5天。如 圖 24中所展示，分泌型DAS181表現會敏化經活化PBMC介導之腫瘤細胞殺死且增加與溶瘤病毒相關之PBMC介導之細胞殺死(在MOI 1及5下二者)。如 圖 25中所展示，跨膜DAS181表現使A549-紅細胞對活化PBMC殺死顯著敏化。在MOI 5下所觀察之效應病毒遠大於在MOI 1下。在某些實驗條件下將唾液酸酶活性及溶瘤病毒作為單一藥劑之功效組合至一起時可能會掩蓋加和效應。 實例 15 ： 帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒之生成
此實例證實編碼唾液酸酶之實例性溶瘤病毒構築體之生成。成功地生成Endo-Sial-VV、SP-Sial-VV及TM-Sial-VV之構築體。 1.1. pSEM-1- 唾液酸酶 -GFP/RFP 之設計。
為生成表現唾液酸酶之重組VV，使用基因合成來產生pSEM-1載體。該構築體包括編碼唾液酸酶之基因、編碼GFP或RFP之基因及兩個具有相同定向且側接於GFP/RFP之loxP位點(pSEM-1-唾液酸酶-GFP/RFP)。所插入唾液酸酶處於F17R晚期啟動子之轉錄控制下以限制腫瘤組織內之唾液酸酶表現。質體之簡化設計係如圖26中所展示。 1.2. SP-Sial-VV 及 TM-Sial-VV 之生成。
使用牛痘病毒(VV)株WR作為用於與唾液酸酶重組以產生以三種不同同種型表現唾液酸酶之VV之親代病毒：i)限制於細胞內腔室(Endo-Sial-VV)；ii)分泌至細胞外環境(SP-Sial-VV)；或iii)局部化於細胞表面處(TM-Sial-VV)。
藉由經由同源重組將pSEM-1-TK-唾液酸酶-GFP、pSEM-1-TK-SP-唾液酸酶-RFP或pSEM-1-TK-TM-唾液酸酶-GFP插入VV之TK基因中來生成唾液酸酶-VV。產生所有病毒並藉由滴定於CV-1細胞上來加以量化。 1.2.1. VV 、 Endo -Sial-VV 、 SP-Sial-VV 及 TM-Sial-VV 之滴定式量化
在獲得重組病毒且使其儲積液擴增之後，藉由蝕斑分析來滴定感染性顆粒。簡言之，使用VV、Endo-Sial-VV、SP-Sial-VV或TM-Sial-VV之連續稀釋液感染接種於12孔板中之CV-1細胞。在感染48 h之後，固定細胞並使用20%乙醇/0.1%結晶紫染色，且對病毒蝕斑進行計數。製備每一病毒儲積液(10 6)於100 µl 10 mM Tris-HCl (pH 9.0)中之等分試樣以供運輸。因此，所有病毒皆為10 7pfu/ml。 1.2.2 藉由 PCR 檢測病毒重組
為證實唾液酸酶同種型已成功地插入VV基因體中，根據標準方案實施PCR以使用每一原病毒作為模板DNA來擴增構築體。為此，PCR引子經設計以特異性結合至圖2中所展示之區域。該等引子將能夠證實：i)構築體已成功地插入VV基因體中；ii)構築體在重組期間維持其各別修飾(亦即分泌及跨膜結構域)。所用引子序列如下： Sial-fwd：5’ - GGCCACACTGCTCGCCCAGCCAGTTCATG  (SEQ ID NO: 56) Sial-rev：5’ - ATGCCTCCACCGAGCTGCCAGCAAGCATG (SEQ ID NO: 57) SP-Sial-rev：5’ - TCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTG (SEQ ID NO: 83) TM-Sial-fwd：5’ - TCATCACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATG (SEQ ID NO: 84)
在所有三種同種型中皆檢測到具有預測大小之唾液酸酶之帶，從而證實已成功生成唾液酸酶VV構築體(圖27)。在使用sialFWD + SPsialREV引子對時，僅SP-Sial-VV及TM-Sial-VV展示具有預計大小之SP-Sial之帶，此證實該等病毒具有分泌信號。最後，在使用TM-sial-fwd + SP-Sial-rev引子時，僅TM-sial-VV展示具有預測大小之TM-唾液酸酶之強帶。此數據證實，成功地生成VV重組體且三種同種型之構築體在病毒基因體內係完整的。 實例 16 ： 唾液酸酶 -VV 能夠在活體外感染腫瘤細胞、複製於其中並溶解腫瘤細胞。
此實例所提供之結果證實，Endo-Sial-VV、SP-Sial-VV及TM-Sial-VV與親代牛痘病毒相比在CV-1及U87細胞中具有相當之感染性及複製活性且在U87及A549細胞中具有相當之溶解活性，從而指示轉基因並不損害VV之感染性、複製性及溶解能力。使用唾液酸酶-VV或親代VV以增加之MOI來感染腫瘤細胞。在感染後之不同時間點(24、48、72或96小時)，收穫細胞並實施蝕斑分析及MTS分析以測定病毒複製。
如 圖 28中所展示，病毒之複製能力不受唾液酸酶修飾影響。將CV-1或U87細胞平鋪於12孔組織培養板中並使用唾液酸酶-VV或VV以MOI 0.1在2.5% FBS培養基中感染2小時，隨後在完整培養基中培養。在感染後之不同時間點(24、48、72或96小時)，收穫細胞且藉由蝕斑分析使用CV-1細胞來測定病毒複製。
另外，如圖29中所展示，在U87及A549細胞中，經修飾牛痘病毒之溶解活性與親代牛痘病毒之溶解活性相當，如 圖 29及下文之表7-9中所展示。 表 7. U87 細胞存活百分比 (%)
MOI0.1 MOI1 MOI5
Endo-Sial-VV 64.5% 61.5% 48.0%
SP-Sial-VV 72.0% 50.7% 34.2%
TM-Sial-VV 86.2% 65.3% 45.0%
模擬VV 68.4% 55.7% 43.9%
表 8. A549 細胞存活百分比 (%)
MOI0.1 MOI1 MOI5
Endo-Sial-VV 82.4% 50.2% 24.7%
SP-Sial-VV 92.5% 54.5% 46.4%
TM-Sial-VV 87.2% 44.0% 40.6%
模擬VV 85.0% 36.0% 16.7%
實例 17 ：唾液酸酶 -VV 增強了活體外樹突狀細胞成熟
此實例所提供之結果證實：SP-及TM-Sial-VV藉由增強人類DC之成熟標記物表現來活化該等細胞。SP-Sial-VV及TM-Sial-VV二者皆有效誘導DC之活體外活化。
評估編碼唾液酸酶之溶瘤病毒對DC成熟之效應。將GM-CSF/IL4源人類DC (Astarte, WA)與VV-U87腫瘤細胞(ATCC, VA)一起培養24小時。收集DC並使用針對DC上之DC成熟標記物CD86、CD80、HLA-ABC、HLA-Dr之抗體進行染色，且藉由流式細胞術實施測定。收集細胞並使用HLA-Dr-FITC (ab193620, Abcam, MA)及HLA-ABC-PE (ab155381, Abcam, MA)或CD80-FITC (ab18279, Abcam, MA)及CD86-PE (ab234226, Abcam, MA)抗體進行染色，且實施流動分析(Sony SA3800)。
圖30-33分別展示DC成熟標記物HLA-ABC、HLA-DR、CD80及CD86之表現。與DC與僅感染VV或U87之U87之細胞一起培養相比，將DC與感染SP-Sial-VV或TM-Sial-VV之U87腫瘤細胞一起培養可增強DC成熟標記物之表現。 實例 18 ：唾液酸酶 -VV 增強了 NK 介導之活體外腫瘤細胞殺死
此實例所提供之結果證實，Sial-VV增強了NK介導之細胞毒性。將經VV感染之腫瘤細胞與NK一起共培養，且測定腫瘤細胞之特異性裂解。
方案 ：共培養負向選擇之人類NK細胞(Astarte, WA)及VV-U87細胞(ATCC, VA)，且藉由LDH分析(Abcam, MA)來量測腫瘤殺死效能。如圖34中所展示，結果表明，Sial-VV增強了NK細胞介導之活體外U87腫瘤殺死。(* P值，U87及NK培養物中之Sial-VV對模擬VV) 特異性裂解計算為：
Figure 02_image001
Endo-Sial-VV SP-Sial-VV TM-Sial-VV 模擬VV
U87 13% 23% 10% 9%
U87 + NK 21% 36% 16% 12%
P值(Sial-VV對VV) 0.02 0.03 0.02
P值(NK對無NK) 0.04 0.03 0.01
*P值：使用利用單尾及1型分析之T.測試。 實例 19 ： 唾液酸酶 -VV 抑制活體內腫瘤生長
上述實例證實，唾液酸酶-VV在活體外具有促進免疫細胞活化及細胞毒性之令人吃驚之有益效應。實例19所提供之結果證實，與對照VV相比，唾液酸酶-VV顯著抑制活體外腫瘤生長。
為測試唾液酸酶-VV對活體內腫瘤生長之效應，將2×10 5及2×10 4個B16-F10腫瘤細胞接種於C57小鼠之右側腹或左側腹上。在右側腹或左側腹上之腫瘤大小達到100mm時(14天)，每隔一天將4×10 7pfu VV經腫瘤內注射至腫瘤中之右側或左側部位並持續3個劑量。量測腫瘤大小。圖35展示右側腹上之腫瘤大小。結果指示，與對照VV相比，TM-sial-VV顯著抑制腫瘤生長。SP-sial VV抑制腫瘤生長，但程度較小。圖36展示左側腹上之腫瘤大小。結果指示，與對照VV相比，TM-sial-VV顯著抑制腫瘤生長。
圖37展示，經各種VV或PBS對照治療之小鼠之小鼠體重並無顯著差異。將2×10 5及2×10 4個B16-F10腫瘤細胞接種於C57小鼠之右側腹或左側腹上。在右側腫瘤大小達到100mm時(14天)，每隔一天經腫瘤內注射4×10 7pfu VV並持續3個劑量。 帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之 CD8+ 及 CD4+ T 細胞浸潤
將腫瘤細胞接種於C57小鼠之右側腹上，且向所得腫瘤經腫瘤內注射如上文所闡述之VV (每隔一天，持續3個劑量)。在第一VV治療之後7天，收集腫瘤組織(n=6)並實施流動分析以分析腫瘤內之CD8+及CD4+ T細胞浸潤。* p值：治療組對對照VV組。圖38A展示結果量化及p值，且證實帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強CD8+及CD4+ T細胞浸潤。圖38B展示FACS繪圖。結果證實，與對照牛痘病毒相比，帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之CD8+及CD4+ T細胞浸潤。 帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著降低腫瘤內之 Treg/CD4+ T 細胞之比率
將腫瘤細胞接種於C57小鼠之右側腹上，且向所得腫瘤經腫瘤內注射如上文所闡述之VV (每隔一天，持續3個劑量)。在第一VV治療之後7天，收集腫瘤組織(n=6)並實施流動分析以測定腫瘤內之Treg/CD4+ T細胞之比率。如圖39中所展示，與對照VV相比，TM-Sial-VV降低了腫瘤內之Treg/CD4+ T細胞之比率。* p值：治療組對對照VV組。 帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之 NK 及 NKT 細胞浸潤
將腫瘤細胞接種於C57小鼠之右側腹上，且向所得腫瘤經腫瘤內注射如上文所闡述之VV (每隔一天，持續3個劑量)。在第一VV治療之後7天，收集腫瘤組織(n=6)並實施流動分析以測定NK1.1+ NK細胞之數量。如圖40中所展示，帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之NK及NKT細胞浸潤。* p值：治療組對對照VV組。 帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之 NK 及 NKT 細胞浸潤
將腫瘤細胞接種於C57小鼠之右側腹上，且向所得腫瘤經腫瘤內注射如上文所闡述之VV (每隔一天，持續3個劑量)。在第一VV治療之後7天，收集腫瘤組織(n=6)並實施流動分析以測定PD-L1之表現。如圖41中所展示，帶有跨膜結合之唾液酸酶之溶瘤病毒顯著增加腫瘤細胞內之PD-L1表現(p＜0.05, TM-Sial-VV對對照VV)。 實例 20 ： 靶向糖免疫檢查點及腫瘤基質之溶瘤牛痘病毒
此實例闡述vvDD-Sial-FAP/CD3之生成，該vvDD-Sial-FAP/CD3係分別表現膜結合唾液酸酶(以自細胞表面聚醣去除唾液酸)及靶向纖維母細胞活化蛋白(FAP)之T細胞銜接體(以消除糖免疫檢查點及腫瘤基質)之一種溶瘤牛痘病毒。將vvDD-Sial-FAP/CD3設計為Western Reserve (WR)株之經工程化牛痘病毒，其具有以下特徵：(1)使用唾液酸酶及FAP/CD3轉基因插入性破壞病毒胸苷激酶(TK)基因。TK係嘧啶合成路徑之必需酶；病毒TK基因缺失由此使得病毒選擇性複製於具有高含量細胞內核苷酸池之快速分裂之癌性細胞中；及(2)缺失牛痘生長因子(VGF)基因，從而更大程度地依賴於癌細胞之細胞週期狀態。已闡述vvDD病毒(參見McCart JA等人，Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res2001;61:8751-8757，其內容以全文引用方式併入本文中)。用於將唾液酸酶及FAP/CD3 T細胞銜接體整合至vvDD之TK基因中之核酸構築體包括SEQ ID NO: 108中所展示之核酸序列。
結果展示，自vvDD-Sial-FAP/CD3表現之唾液酸酶自細胞表面有效裂解唾液酸，且唾液酸酶上之Fc之融合在ADCC報告基因分析中誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。 自 vvDD-Sial-FAP/CD3 表現之唾液酸酶自細胞有效裂解唾液酸。模擬感染人類肺腺癌細胞或使用vvDD或Sial-FAP/CD3-vvDD以0.05 pfu/細胞進行感染。在感染之後約20 hr時，收穫細胞並與經別藻藍蛋白(APC)標記之西洋接骨木凝集素(SNA)一起培育以檢測細胞表面上之a-2,6-唾液酸鍵聯。如 圖 42A中所展示，APC信號降低指示藉由病毒表現性唾液酸酶去除a-2,6-唾液酸鍵聯。如 圖 42B中所展示，與對照相比，病毒表現性唾液酸酶將a-2,6-唾液酸鍵聯含量減小至約40%。 ADCC 報告基因分析證實了 vvDD-Sial-FAP/CD3 之效能
模擬感染A549人類肺腺癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以指示pfu/細胞進行感染。第二天，將表現報告基因之效應細胞(穩定表現FcγRIIIa受體及驅動螢火蟲螢光素酶表現之活化T細胞核因子(NFAT)反應元件之Jurkat細胞)添加至經感染A549細胞中。所表現之經NFAT反應元件驅動之螢光素酶用作ADCC之早期報告基因。6小時後，將螢光素酶受質添加至孔中且量測每一孔中之發光以量化效應細胞中之螢光素酶活性。如 圖 43中所展示，經模擬或vvDD感染之A549細胞不產生螢光素酶表現(模擬感染及vvDD感染之線條在圖形中係平坦重疊線且無法區分)。感染vvDD-Sial-FAP/CD3之A549細胞會誘導Jurkat報告基因效應細胞中之螢光素酶表現，從而指示了ADCC路徑之活化。
在另一實驗中，模擬感染A549人類肺腺癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.05 pfu/細胞進行感染。在感染之後約20 hr時，收集上清液並通過0.2 mm過濾器以生成條件化培養基。將指示量之條件化培養基添加至COLO829 (FAP陽性)或A549 (FAP陰性)細胞中，隨後添加T細胞受體(TCR)/CD3效應細胞(表現由活化T細胞核因子(NFAT)反應元件驅動之螢光素酶報告基因之Jurkat細胞)。5小時後，將螢光素酶受質添加至孔中且量測每一孔中之發光以量化效應細胞中之螢光素酶活性。如 圖 44A-44B中所展示，來自感染vvDD-Sial-FAP/CD3之細胞之條件化培養基以濃度依賴性方式於FAP陽性COLO829細胞中產生指示ADCC之螢光素酶表現，但在FAP陰性A549細胞系中產生極低螢光素酶表現，從而指示FAP/CD3雙特異性T細胞銜接體之特定效應。來自模擬感染細胞或感染vvDD之細胞之條件化培養基不產生螢光素酶表現。
亦使用與表現FAP之正常人類真皮纖維母細胞混合之HCT116人類結腸癌細胞或FAP陽性HCC1143人類乳癌細胞在人類周邊血單核細胞存在下來實施活體外效能研究。模擬感染與正常人類真皮纖維母細胞(NhDF)一起共培養之HCT116細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.1 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)之比率添加周邊血單核細胞(PBMC)。兩天後，收集細胞培養上清液進行乳酸去氫酶(LDH)分析以量測細胞毒性。如 圖 45中所展示，與模擬感染或vvDD感染之細胞相比，在PBMC存在下使用vvDD-Sial-FAP/CD3感染與表現FAP之正常人類真皮纖維母細胞混合之HCT116人類結腸癌細胞會產生顯著較高之LDH。 vvDD-Sial-FAP/CD3 感染細胞誘導 T 細胞之活體外活化
為評價感染vvDD-Sial-FAP/CD3之細胞之T細胞活化，模擬感染與正常人類真皮纖維母細胞(NhDF)一起共培養之A549人類肺腺癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.1 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)添加周邊血單核細胞(PBMC)。一天後，收穫細胞且使用流式細胞術分析CD4+及CD8+ T細胞上之CD25活化標記物之表現。與模擬感染或vvDD感染之細胞相比，使用vvDD-Sial-FAP/CD3進行感染可顯著增加CD4 +T細胞群體( 圖 46A)及CD8 +T細胞群體( 圖 46B)中之CD25 +細胞%。使用ELISA分析上清液之顆粒酶B釋放。如 圖 46C中所展示，與模擬感染或vvDD感染之對照相比，使用vvDD-Sial-FAP/CD3進行感染可產生顯著更高之顆粒酶B釋放。
為評價其他癌症類型之vvDD-Sial-FAP/CD3感染細胞之T細胞活化，以類似方式模擬感染與正常人類真皮纖維母細胞(NhDF)一起共培養之HCT116人類結腸癌細胞或HCC1143人類乳癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.1 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)添加周邊血單核細胞(PBMC)。兩天後，收穫細胞並使用流式細胞術分析CD4+及CD8+ T細胞上之活化標記物CD69及CD25之表現。如 圖 47A中所展示，對於HCT116/NhDF及HCC1143細胞而言，與模擬感染或vvDD感染之細胞相比，使用vvDD-Sial-FAP/CD3進行感染皆顯著增加CD4 +T細胞群體中之CD69 +細胞%。類似地，如 圖 47B中所展示，對於HCT116/NhDF及HCC1143細胞而言，與模擬感染或vvDD感染之細胞相比，使用vvDD-Sial-FAP/CD3進行感染皆顯著增加CD8 +T細胞群體中之CD69 +細胞%。
因此，在結腸癌及乳癌腫瘤模型中，vvDD-Sial-FAP/CD3皆誘導CD4 +及CD8 +T細胞之活化，如藉由CD69及CD25標記物上調以及顆粒酶B釋放增加(此會增強細胞殺死)所量測。 vvDD-Sial-FAP/CD3 增強了腫瘤球體中之淋巴球浸潤
使用與CAF微組織一起共培養之A549展示，vvDD-Sial-FAP/CD3有效擴散於腫瘤球體內。另外，vvDD-Sial-FAP/CD3增加了腫瘤浸潤性淋巴球，從而增強細胞殺死。
模擬感染與癌症相關纖維母細胞(CAF)一起共培養之A549人類肺腺癌細胞或使用分別表現綠色螢光蛋白或黃色螢光蛋白之vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.3 pfu/細胞進行感染。藉由成像監測GFP或YFP之表現。螢光蛋白之強度增加指示了腫瘤球體內之病毒擴散。如 圖 48中所展示，vvDD-Sial-FAP/CD3有效擴散於腫瘤球體內。
為分析vvDD-Sial-FAP/CD3對腫瘤球體中之淋巴球浸潤之效應，模擬感染與癌症相關纖維母細胞(CAF)一起共培養之A549人類肺腺癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.3 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)添加由CellTracker DeepRed標記之周邊血單核細胞(PBMC)。展示在添加PBMC之後兩天獲取之影像。使用vvDD-Sial-FAP/CD3進行感染可增加腫瘤球體之核心中之紅色螢光(Cy5-PBMC)，從而指示腫瘤浸潤性淋巴球有所增加( 圖 49)。
總而言之，此實例中所提供之結果證實，vvDD-Sial-FAP/CD3在多種癌症模型中誘導強效抗腫瘤及抗基質效應。評估vvDD-Sial-FAP/CD3 (單獨或與檢查點抑制劑或NK細胞療法組合)之活體內效能。 實例 21 ： 用於治療實體腫瘤之靶向 av 唾液酸酶之工程化嵌合抗原受體天然殺手 (CAR-NK) 細胞及帶有 av 唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒的組合療法
嵌合抗原受體(CAR) -工程化天然殺手(NK)細胞療法已成為接受性癌症免疫療法之有前景平臺。然而，迄今為止，與血液學惡性腫瘤相比，CAR-NK或CAR-T療法在實體腫瘤中達成之效能有限。一個難題在於實體腫瘤中缺乏常見腫瘤特異性表面抗原靶。因此，研發新穎溶瘤牛痘病毒(VV)來遞送雙功能糖免疫檢查點抑制劑(參見實例20)及與CAR-NK細胞療法組合之通用腫瘤細胞標記物以增加抗腫瘤效能。使用缺失病毒TK及VGF基因之牛痘病毒(vvDD)來驅動衍生自黏放線菌之膜結合唾液酸酶(avSial)在病毒晚期啟動子下之表現可觀察到，VV感染及未感染之腫瘤細胞皆達成有效去唾液酸化，此將緩解TME內之NK及其他免疫細胞上之唾液酸之抑制。另外，VV感染之腫瘤細胞上之表面結合avSial亦可用作avSial-CAR NK細胞之通用靶，且較少擔心與正常人類組織之交叉反應性及抗原損失。 方法 逆轉錄病毒及質體構築體
使用合成DNA方式(Genewiz)構築逆轉錄病毒載體。簡言之，合成在SFG逆轉錄病毒主鏈中含有DAS181特異性scFv、CD8跨膜結構域、CD28及CD3 ζ細胞質區之CAR(SEQ ID NO: 120)並使用HiFi組裝(New England Biolabs)連接至一起。該等載體亦含有由明脈扁刺蛾( Thosea asigna)病毒2A (T2A)肽鍵跳躍多肽隔開之IL-15基因(SEQ ID NO: 121)。自最初經由小鼠免疫化研究生成並經由ELISA (Genescript)篩選之抗體來衍生靶向DAS181之D004 scFv序列。 DAS181 結合親和力分析
在293T細胞中測試scFv與DAS181之結合親和力。簡言之，使用Genejuice遵循製造商方案將含有不同scFv之各種DAS181 CAR構築體轉染至293T細胞中。在48小時之後，收穫293T細胞並使用DAS181生物素(Ansun)染色，隨後使用鏈黴抗生物素蛋白APC (Biolegend)染色，並藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行分析以鑑別DAS181陽性結合細胞。在Novocyte 3000 (ACEA Biosciences)上實施流式細胞術並使用ACEA NovoExpress軟體進行分析。 DAS181 CAR NK 細胞生成
藉由瞬時轉染包裝細胞系(Biovec)來產生逆轉錄病毒上清液。藉由白血球分離獲得來自健康供體之周邊血細胞，活化且然後實施逆轉錄病毒轉導。將細胞維持於NK MACS培養基(Miltenyi Biotec)中。在活化之後第12天及第20天時，收穫一部分細胞並經由抗小鼠Fab PE (Jackson Immunoresearch)、抗CD56 APCcy7、抗CD3 BV510 (Biolegend)之染色對轉導效率以及NK及T細胞組成實施FACS分析。 表現腫瘤細胞系之膜唾液酸酶
為測試DAS181 CAR NK細胞之功能，生成表現膜唾液酸酶之腫瘤細胞系。經由基於PCR之方法生成含有Tm唾液酸酶(亦即具有跨膜結構域之唾液酸酶)或Tm.Fc.唾液酸酶(亦即具有跨膜結構域及Fc結構域之唾液酸酶)之逆轉錄病毒載體。使用含有Tm唾液酸酶或Tm.Fc唾液酸酶之逆轉錄病毒載體及含有增強綠色螢光蛋白(eGFP)之第二逆轉錄病毒載體雙重轉導A549及A375腫瘤細胞系。使用Sony SH800分選儀流式分選雙陽性轉導細胞。流式細胞術證實，超過90%之A375細胞及超過86%之A549細胞最初針對eGFP及膜唾液酸酶呈雙陽性，且超過95%之A375細胞及超過93%之A549細胞在晚期傳代中呈雙陽性。亦經由SNA (西洋接骨木凝聚素，其係結合α2,6-連接之唾液酸之凝集素)、MAA (朝鮮槐凝聚素，其係主要識別α2-3連接之唾液酸之凝集素)及PNA (花生凝聚素，其結合末端半乳糖殘基，且在唾液酸去除之後結合有所增加)之結合之流式細胞術分析來評價腫瘤細胞表面之去唾液酸化。 NK 細胞之細胞毒性評價
使用未修飾及經轉導NK細胞針對表現膜唾液酸酶之經eGFP修飾之A549或A375腫瘤細胞在不同E:T比率下來實施共培養分析。對於E:T比率4:1及2:1，在72 hr時添加第二劑量之新鮮腫瘤細胞以再攻擊腫瘤。藉由實時螢光顯微術(IncuCyte；Essen Biosciences)監測腫瘤細胞(綠色)增殖6至7天。使用總綠色物件積體強度(GCU × um 2/孔)量度來量化綠色螢光。每一條件至少一式兩份地實施。在4×物鏡下使整個孔成像。
在3D球體分析中，將5000個腫瘤細胞(表現eGFP及膜唾液酸酶之A375或A549)接種於U形底板中並保持4天以形成球體。然後以50k、25k或12.5k個細胞/孔之劑量添加未修飾、CD19 CAR轉導或DAS181 CAR轉導之NK細胞。使用IncuCyte球體模組監測腫瘤球體生長6至7天。 結果
經由小鼠免疫化研究研發抗 avSial抗體。生成表現基於對DAS181具有特異性之所選單鏈可變片段(scFv)且含有CD28共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域之CAR構築體之NK細胞。CAR NK細胞進一步表現人類IL-15基因以改良NK持久性及功能。在經CAR構築體轉染之293T細胞中評價抗 avSial scFv與 av唾液酸酶之結合親和力。將所選抗 avSial scFv CAR包裝至γ逆轉錄病毒載體中以轉導衍生自健康供體周邊血之經活化及擴增之NK細胞。為進行概念驗證，亦生成表現跨膜唾液酸酶及GFP之靶腫瘤細胞系A375及A549。與CD19 CAR NK及未轉導(NT) NK細胞相比， avSial CAR NK在共培養分析中於＜= 1:2之低E:T比率下針對表現 avSial之腫瘤細胞具有顯著增加之細胞毒性。在腫瘤細胞再攻擊時， avSial CAR NK之腫瘤生長控制亦顯著優於CD19 CAR NK或未轉導(NT) NK細胞。另外， avSial CAR NK細胞完全消除表現跨膜唾液酸酶之A375腫瘤球體，而CD19 CAR NK或NT NK細胞僅暫時控制腫瘤球體生長。總而言之，已研發靶向 avSial之有效CAR IL15 NK，其可用於證實在與帶有 avSial之VV 組合用於治療實體腫瘤時具有增強之效能及多功能性。 DAS181 重組蛋白結合表現 DAS181 特異性 CAR 之 293 T 細胞
DAS181 CAR構築體( 圖 50A)係由不同DAS181 scFv製得且D004可視為與DAS181生物素化重組蛋白具有最高百分比之細胞結合。對應於D004 CAR構築體之scFv之CDR序列展示於表A中。亦製備CD19特異性CAR以作為對照構築體。亦藉由抗小鼠Fab染色( 圖 50C)或蛋白質L染色( 圖 50D)來測定轉導效率。 NK 細胞成功地經工程化以在細胞表面上表現 CAR 構築體
使用來自兩個健康供體之周邊血細胞來生成CAR NK細胞。在第12天及第20天，轉導效率為約40%。在CD19 CAR NK中，蛋白質L染色展示低於抗小鼠Fab染色之速率( 圖 51A)。抗小鼠Fab染色揭示，CD19 CAR與DAS181 CAR之間之CAR表現染色係相當的( 圖 51A 及 51C)。在第5天，轉染1百萬個細胞。在擴增之後，在第20天，生長出20至40百萬個細胞( 圖 51B)。 DAS181 CAR NK 殺死表現膜唾液酸酶之腫瘤細胞
為測試DAS181 CAR NK細胞(D004)之細胞毒性，將表現Tm唾液酸酶或Tm.Fc唾液酸酶之A375細胞與未轉導(NT)細胞、CD19 CAR NK或DAS181 CAR NK一起共培養。如 圖 52及 圖 53中所展示，與NT或CD19 CAR NK細胞相比，DAS181 CAR NK始終更能殺死表現膜唾液酸酶之A375及A549細胞。有趣的是，與Tm唾液酸酶相比，DAS181 CAR NK更能殺死表現Tm.Fc唾液酸酶之腫瘤細胞。
在腫瘤再攻擊分析中，將NK細胞與表現膜唾液酸酶之腫瘤細胞在4:1之E:T比率下一起共培養72 hr。NT、CD19 CAR NK或DAS181 CAR NK細胞之腫瘤殺死效應最初並無差異。然而，在72小時時進行第二輪新鮮腫瘤細胞添加之後，DAS181 CAR NK細胞顯示針對表現膜唾液酸酶之A375或A549腫瘤細胞之顯著增強之殺死效應( 圖 54-55)。
在3D腫瘤球體分析中進一步測試DAS181 CAR NK功能。NT NK細胞會暫時性減小腫瘤球體大小。然而，在2天之後，腫瘤再次生長。含有IL-15轉基因之CD19 CAR NK細胞能夠控制腫瘤球體生長而無反彈。僅DAS181 CAR NK完全根除了腫瘤球體。 圖 56展示，在不同NK劑量下，與NT及CD19 CAR NK細胞相比，DAS181 CAR NK細胞更有效地控制腫瘤。
為測試DAS181 CAR NK之活體外持久性，在第20天將DAS181 CAR NK細胞及NT NK細胞在無IL-15細胞介素支持下培養6週。 圖 57展示自兩種不同供體製得之NK細胞在6週內之活細胞計數。NT NK在一週之後快速死亡，而DAS181 CAR NK在活細胞計數下降之前維持較高含量達3至4週。大部分DAS181 CAR NK細胞持續整個6週。數據證實了DAS181 CAR NK細胞與NT對照相比之持久細胞毒性。 表現膜唾液酸酶之腫瘤細胞並不穩定
應注意，在一個月傳代之後，表現膜唾液酸酶(Tm.唾液酸酶或Tm.Fc.唾液酸酶)之A375或A549腫瘤細胞易於發生細胞死亡( 圖 58)。使用流式細胞術評價膜唾液酸酶表現。晚期傳代之膜唾液酸酶表現高於早期傳代( 圖 59-60)。該等結果展示，唾液酸酶致使腫瘤細胞易受攻擊。因腫瘤細胞變得去唾液酸化( 圖 61及表9)，故腫瘤細胞表面蛋白得以顯露且使得細胞對環境應力(例如胰蛋白酶化)較為敏感。 表 9.圖53中之數據之量化。
SNA MAA PNA
MFI 相對 % MFI 相對 % MFI 相對倍數
A375 2975221 100.00 156613 100.00 1937 1.00
A375 tm.fc. 唾液酸酶 203210 6.83 90580 57.84 186172 96.11
A375 tm. 唾液酸酶 191644 6.44 92882 59.31 171747 88.67
A549 872816 100.00 139926 100.00 20482 1.00
A549 tm.fc. 唾液酸酶 150002 17.19 66521 47.54 211936 10.35
實例性序列 SEQ ID NO: 3 人類Neu1唾液酸酶 MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFAAIFLLLSLAASWSKAENDFGLVQPLVTMEQLLWVSGRQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKMSSSDEGAKFIALRRSMDQGSTWSPTAFIVNDGDVPDGLNLGAVVSDVETGVVFLFYSLCAHKAGCQVASTMLVWSKDDGVSWSTPRNLSLDIGTEVFAPGPGSGIQKQREPRKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWRYGSGVSGIPYGQPKQENDFNPDECQPYELPDGSVVINARNQNNYHCHCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGAVVTSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWRKETVQLWPGPSGYSSLATLEGSMDGEEQAPQLYVLYEKGRNHYTESISVAKISVYGTL SEQ ID NO: 4 人類Neu2唾液酸酶 MASLPVLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPIQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ SEQ ID NO: 5 人類Neu3唾液酸酶 MEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN SEQ ID NO: 6 人類Neu4唾液酸酶 MGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS SEQ ID NO: 7 人類Neu4同種型2唾液酸酶 MMSSAAFPRWLSMGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS SEQ ID NO: 8 人類Neu4同種型3唾液酸酶 MMSSAAFPRWLQSMGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS SEQ ID NO: 9 黏放線菌nanH唾液酸酶 MTSHSPFSRRRLPALLGSLPLAATGLIAAAPPAHAVPTSDGLADVTITQVNAPADGLYSVGDVMTFNITLTNTSGEAHSYAPASTNLSGNVSKCRWRNVPAGTTKTDCTGLATHTVTAEDLKAGGFTPQIAYEVKAVEYAGKALSTPETIKGATSPVKANSLRVESITPSSSQENYKLGDTVSYTVRVRSVSDKTINVAATESSFDDLGRQCHWGGLKPGKGAVYNCKPLTHTITQADVDAGRWTPSITLTATGTDGATLQTLTATGNPINVVGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAIPPPPMGTCSSPTTSARRTTATAAATTPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGPVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWCRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAEPSPGRRRRRHPQRHRRRSRPRRPRRALSPRRHRHHPPRPSRALRPSRAGPGAGAHDRSEHGAHTGSCAQSAPEQTDGPTAAPAPETSSAPAAEPTQAPTVAPSVEPTQAPGAQPSSAPKPGATGRAPSVVNPKATGAATEPGTPSSSASPAPSRNAAPTPKPGMEPDEIDRPSDGTMAQPTGAPARRVPRRRRRRRPAAGCLARDQRAADPGPCGCRGCRRVPAAAGSPFEELNTRRAGHPALSTD SEQ ID NO: 10 黏放線菌nanA唾液酸酶 MTTTKSSALRRLSALAGSLALAVTGIIAAAPPAHATPTSDGLADVTITQTHAPADGIYAVGDVMTFDITLTNTSGQARSFAPASTNLSGNVLKCRWSNVAAGATKTDCTGLATHTVTAEDLKAGGFTPQIAYEVKAVGYKGEALNKPEPVTGPTSQIKPASLKVESFTLASPKETYTVGDVVSYTVRIRSLSDQTINVAATDSSFDDLARQCHWGNLKPGQGAVYNCKPLTHTITQADADHGTWTPSITLAATGTDGAALQTLAATGEPLSVVVERPKADPAPAPDASTELPASMSDAQHLAENTATDNYRIPAITTAPNGDLLVSYDERPRDNGNNGGDSPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPSYIHQGVETGRKVGYSDPSYVVDNQTGTIFNFHVKSFDQGWGHSQAGTDPEDRSVIQAEVSTSTDNGWSWTHRTITADITRDNPWTARFAASGQGIQIHQGPHAGRLVQQYTIRTADGVVQAVSVYSDDHGQTWQAGTPTGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGTGFRKVATSTDGGQTWSEPVPDKNLPDSVDNAQIIRPFPNAAPSDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDNGASWVTGRVFNEKFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDGNYGGIWYRNFTMGWVGDQCSQPRPEPSPSPTPSAAPSAEPTSEPTTAPAPEPTTAPSSEPSVSPEPSSSAIPAPSQSSSATSGPSTEPDEIDRPSDGAMAQPTGGAGRPSTSVTGATSRNGLSRTGTNALLVLGVAAAAAAGGYLVLRIRRARTE SEQ ID NO: 11 口腔鏈球菌nanA唾液酸酶 MNYKSLDRKQRYGIRKFAVGAASVVIGTVVFGANPVLAQEQANAAGANTETVEPGQGLSELPKEASSGDLAHLDKDLAGKLAAAQDNGVEVDQDHLKKNESAESETPSSTETPAEEANKEEESEDQGAIPRDYYSRDLKNANPVLEKEDVETNAANGQRVDLSNELDKLKQLKNATVHMEFKPDASAPRFYNLFSVSSDTKENEYFTMSVLDNTALIEGRGANGEQFYDKYTDAPLKVRPGQWNSVTFTVEQPTTELPHGRVRLYVNGVLSRTSLKSGNFIKDMPDVNQAQLGATKRGNKTVWASNLQVRNLTVYDRALSPDEVQTRSQLFERGELEQKLPEGAKVTEKEDVFEGGRNNQPNKDGIKSYRIPALLKTDKGTLIAGTDERRLHHSDWGDIGMVVRRSSDNGKTWGDRIVISNPRDNEHAKHADWPSPVNIDMALVQDPETKRIFAIYDMFLESKAVFSLPGQAPKAYEQVGDKVYQVLYKQGESGRYTIRENGEVFDPQNRKTDYRVVVDPKKPAYSDKGDLYKGNELIGNIYFEYSEKNIFRVSNTNYLWMSYSDDDGKTWSAPKDITHGIRKDWMHFLGTGPGTGIALRTGPHKGRLVIPVYTTNNVSYLSGSQSSRVIYSDDHGETWQAGEAVNDNRPVGNQTIHSSTMNNPGAQNTESTVVQLNNGDLKLFMRGLTGDLQVATSHDGGATWDKEIKRYPQVKDVYVQMSAIHTMHEGKEYILLSNAGGPGRNNGLVHLARVEENGELTWLKHNPIQSGKFAYNSLQELGNGEYGLLYEHADGNQNDYTLSYKKFNWDFLSRDRISPKEAKVKYAIQKWPGIIAMEFDSEVLVNKAPTLQLANGKTATFMTQYDTKTLLFTIDPEDMGQRITGLAEGAIESMHNLPVSLAGSKLSDGINGSEAAIHEVPEFTGGVNAEEAAVAEIPEYTGPLATVGEEVAPTVEKPEFTGGVNAEEAPVAEMPEYTGPLSTVGEEVAPTVEKPEFTGGVNAVEAAVHELPEFKGGVNAVLAASNELPEYRGGANFVLAASNDLPEYIGGVNGAEAAVHELPEYKGDTNLVLAAADNKLSLGQDVTYQAPAAKQAGLPNTGSKETHSLISLGLAGVLLSLFAFGKKRKE SEQ ID NO: 12 口腔鏈球菌nanH唾液酸酶 MSDLKKYEGVIPAFYACYDDQGEVSPERTRALVQYFIDKGVQGLYVNGSSGECIYQSVEDRKLILEEVMAVAKGKLTIIAHVACNNTKDSMELARHAESLGVDAIATIPPIYFRLPEYSVAKYWNDISAAAPNTDYVIYNIPQLAGVALTPSLYTEMLKNPRVIGVKNSSMPVQDIQTFVSLGGEDHIVFNGPDEQFLGGRLMGAKAGIGGTYGAMPELFLKLNQLIAEKDLETARELQYAINAIIGKLTSAHGNMYGVIKEVLKINEGLNIGSVRSPLTPVTEEDRPVVEAAAQLIRETKERFL SEQ ID NO: 13 和緩鏈球菌nanA唾液酸酶 MNQRHFDRKQRYGIRKFTVGAASVVIGAVVFGVAPALAQEAPSTNGETAGQSLPELPKEVETGNLTNLDKELADKLSTATDKGTEVNREELQANPGSEKAAETEASNETPATESEDEKEDGNIPRDFYARELENVNTVVEKEDVETNPSNGQRVDMKEELDKLKKLQNATIHMEFKPDASAPRFYNLFSVSSDTKVNEYFTMAILDNTAIVEGRDANGNQFYGDYKTAPLKIKPGEWNSVTFTVERPNADQPKGQVRVYVNGVLSRTSPQSGRFIKDMPDVNQVQIGTTKRTGKNFWGSNLKVRNLTVYDRALSPEEVKKRSQLFERGELEKKLPEGAKVTDKLDVFQGGENRKPNKDGIASYRIPALLKTDKGTLIAGADERRLHHSDWGDIGMVVRRSDDKGKTWGDRIVISNPRDNENARRAHAGSPVNIDMALVQDPKTKRIFSIFDMFVEGEAVRDLPGKAPQAYEQIGNKVYQVLYKKGEAGHYTIRENGEVFDPENRKTEYRVVVDPKKPAYSDKGDLYKGEELIGNVYFDYSDKNIFRVSNTNYLWMSYSDDDGKTWSAPKDITYGIRKDWMHFLGTGPGTGIALHSGPHKGRLVIPAYTTNNVSYLGGSQSSRVIYSDDHGETWHAGEAVNDNRPIGNQTIHSSTMNNPGAQNTESTVVQLNNGDLKLFMRGLTGDLQVATSKDGGATWEKDVKRYADVKDVYVQMSAIHTVQEGKEYIILSNAGGPGRYNGLVHVARVEANGDLTWIKHNPIQSGKFAYNSLQDLGNGEFGLLYEHATATQNEYTLSYKKFNWDFLSKDGVAPTKATVKNAVEMSKNVIALEFDSEVLVNQPPVLKLANGNFATFLTQYDSKTLLFAASKEDIGQEITEIIDGAIESMHNLPVSLEGAGVPGGKNGAKAAIHEVPEFTGAVNGEGTVHEDPAFEGGINGEEAAVHDVPDFSGGVNGEVAAIHEVPEFTGGINGEEAAKLELPSYEGGANAVEAAKSELPSYEGGANAVEAAKLELPSYESGAHEVQPASSNLPTLADSVNKAEAAVHKGKEYKANQSTAVQAMAQEHTYQAPAAQQHLLPKTGSEDKSSLAIVGFVGMFLGLLMIGKKRE SEQ ID NO: 14 和緩鏈球菌nanA_1唾液酸酶 MNQSSLNRKNRYGIRKFTIGVASVAIGSVLFGITPALAQETTTNIDVSKVETSLESGAPVSEPVTEVVSGDLNHLDKDLADKLALATNQGVDVNKHNLKEETSKPEGNSEHLPVESNTGSEESIEHHPAKIEGADDAVVPPRDFFARELTNVKTVFEREDLATNTGNGQRVDLAEELDQLKQLQNATIHMEFKPDANAPQFYNLFSVSSDKKKDEYFSMSVNKGTAMVEARGADGSHFYGSYSDAPLKIKPGQWNSVTFTVERPKADQPNGQVRLYVNGVLSRTNTKSGRFIKDMPDVNKVQIGATRRANQTMWGSNLQIRNLTVYNRALTIEEVKKRSHLFERNDLEKKLPEGAEVTEKKDIFESGRNNQPNGEGINSYRIPALLKTDKGTLIAGGDERRLHHFDYGDIGMVIRRSQDNGKTWGDKLTISNLRDNPEATDKTATSPLNIDMVLVQDPTTKRIFSIYDMFPEGRAVFGMPNQPEKAYEEIGDKTYQVLYKQGETERYTLRDNGEIFNSQNKKTEYRVVVNPTEAGFRDKGDLYKNQELIGNIYFKQSDKNPFRVANTSYLWMSYSDDDGKTWSAPKDITPGIRQDWMKFLGTGPGTGIVLRTGAHKGRILVPAYTTNNISHLGGSQSSRLIYSDDHGQTWHAGESPNDNRPVGNSVIHSSNMNKSSAQNTESTVLQLNNGDVKLFMRGLTGDLQVATSKDGGVTWEKTIKRYPEVKDAYVQMSAIHTMHDGKEYILLSNAAGPGRERKNGLVHLARVEENGELTWLKHNPIQNGEFAYNSLQELGGGEYGLLYEHRENGQNYYTLSYKKFNWDFVSKDLISPTEAKVSQAYEMGKGVFGLEFDSEVLVNRAPILRLANGRTAVFMTQYDSKTLLFAVDKKDIGQEITGIVDGSIESMHNLTVNLAGAGIPGGMNAAESVEHYTEEYTGVLGTSGVEGVPTISVPEYEGGVNSELALVSEKEDYRGGVNSASSVVTEVLEYTGPLSTVGSEDAPTVSVLEYEGGVNIDSPEVTEAPEYKEPIGTSGYELAPTVDKPAYTGTIEPLEKEENSGAIIEEGNVSYITENNNKPLENNNVTTSSIISESSKLKHTLKNATGSVQIHASEEVLKNVKDVKIQEVKVSSLSSLNYKAYDIQLNDASGKAVQPKGTVIVTFAAEQSVENVYYVDSKGNLHTLEFLQKDGEVTFETNHFSIYAMTFQLSLDNVVLDNHREDKNGEVNSASPKLLSINGHSQSSQLENKVSNNEQSKLPNTGEDKSISTVLLGFVGVILGAMIFYRRKDSEG SEQ ID NO: 15 和緩鏈球菌nanA_2唾液酸酶 MDKKKIILTSLASVAVLGAALAASQPSLVKAEEQPTASQPAGETGTKSEVTSPEIKQAEADAKAAEAKVTEAQAKVDTTTPVADEAAKKLETEKKEADEADAAKTKAEEAKKTADDELAAAKEKAAEADAKAKEEAKKEEDAKKEEADSKEALTEALKQLPDNELLDKKAKEDLLKAVEAGDLKASDILAELADDDKKAEANKETEKKLRNKDQANEANVATTPAEEAKSKDQLPADIKAGIDKAEKADAARPASEKLQDKADDLGENVDELKKEADALKAEEDKKAETLKKQEDTLXEAKEALKSAKDNGFGEDITAPLEKAVTAIEKERDAAQNAFDQAASDTKAVADELNKLTDEYNKTLEEVKAAKEKEANEPAKPVEEEPAKPAEKTEAEKAAEAKTEADAKVAELQKKADEAKTKADEATAKATKEAEDVKAAEKAKEEADKAKTDAEAELAKAKEEAEKAKAKVEELKKEEKDNLEALKAALDQLEKDIDADATITNKEEAKKALGKEDILAAVEKGDLTAGDVLKELENQNATAEATKDQDPQADEIGATKQEGKPLSELPAADKEKLDAAYNKEASKPIVKKLQDIADDLVEKIEKLTKVADKDKADATEKAKAVEEKNAALDKQKETLDKAKAALETAKKNQADQAIQDGLQDAVTKLEASFASAKTAADEAQAKFDEVNEVVKAYKAAIDELTDDYNATLGHIENLKEVPKGEEPKDFSGGVNDDEAPSSTPNTNEFTGGANDADAPTAPNANEFAGGVNDEEAPTTENKPEFNGGVNDEEAPTVPNKPEGEAPKPTGENAKDAPVVKLPEFGANNPEIKKILDEIAKVKEQIKDGEENGSEDYYVEGLKERLADLEEAFDTLSKNLPAVNKVPEYTGPVTPENGQTQPAVNTPGGQQGGSSQQTPAVQQGGSGQQAPAVQQGGSNQQVPAVQQTNTPAVAGTSQDNTYQAPAAKEEDKKELPNTGGQESAALASVGFLGLLLGALPFVKRKN SEQ ID NO: 16 和緩鏈球菌nanA_3唾液酸酶 MKYRDFDRKRRYGIRKFAVGAASVVIGTVVFGANPVLAQEQANAAGANTETVEPGQGLSELPKEASSGDLAHLDKDLAGKLAAAQDNGVEVDQDHLKKNESAESETPSSTETPAEGTNKEEESEDQGAIPRDYYSRDLKNANPVLEKEDVETNAANGQRVDLSNELDKLKQLKNATVHMEFKPDASAPRFYNLFSVSSDTKENEYFTISVLDNTALIEGRGANGEQFYDKYTDAPLKVRPGQWNSVTFTVEQPTTELPHGRVRLYVNGVLSRTSLKSGNFIKDMPDVNQAQLGATKRGNKTVWASNLQVRNLTVYDRALSPDEVQTRSQLFERGELEQKLPEGAKVTEKEDVFEGGRNNQPNKDGIKSYRIPALLKTDKGTLIAGTDERRLHHSDWGDIGMVVRRSSDNGKTWGDRIVISNPRDNEHAKHADWPSPVNIDMALVQDPETKRIFAIYDMFLESKAVFSLPGQAPKAYEQVGDKVYQVLYKQGESGRYTIRENGEVFDPQNRKTDYRVVVDPKKPAYSDKGDLYKGNELIGNIYFEYSEKNIFRVSNTNYLWMSYSDDDGKTWSAPKDITHGIRKDWMHFLGTGPGTGIALRTGPHKGRLVIPVYTTNNVSYLSGSQSSRVIYSDDHGETWQAGEAVNDNRPVGNQTIHSSTMNNPGAQNTESTVVQLNNGDLKLFMRGLTGDLQVATSHDGGATWDKEIKRYPQVKDVYVQMSAIHTMHEGKEYILLSNAGGPGRNNGLVHLARVEENGELTWLKHNPIQSGKFAYNSLQDLGNGEYGLLYEHADGNQNDYTLSYKKFNWDFLTKDWISPKEAKVKYAIEKWPGILAMEFDSEVLVNKAPTLQLANGKTARFMTQYDTKTLLFTVDSEDMGQKVTGLAEGAIESMHNLPVSVAGTKLSNGMNGSEAAVHEVPEYTGPLGTAGEEPAPTVEKPEFTGGVNGEEAAVHEVPEYTGPLGTSGEEPAPTVEKPEFTGGVNAVEAAAHEVPEYTGPLGTSGKEPAPTVEKPEYTGGVNAVEAAVHEVPEYTGPLATVGEEAAPKVDKPEFTGGVNAVEAAVHELPEYTGGVNAADAAVHEIAEYKGADSLVTLAAEDYTYKAPLAQQTLPDTGNKESSLLASLGLTAFFLGLFAMGKKREK SEQ ID NO: 17 和緩鏈球菌nanA_4唾液酸酶 MEKIWREKSCRYSIRKLTVGTASVLLGAVFLASHTVSADTIKVKQNESTLEKTTAKTDTVTKTTESTEHTQPSEAIDHSKQVLANNSSSESKPTEAKVASATTNQASTEAIVKPNENKETEKQELPVTEQSNYQLNYDRPTAPSYDGWEKQALPVGNGEMGAKVFGLIGEERIQYNEKTLWSGGPRPDSTDYNGGNYRERYKILAEIRKALEDGDRQKAKRLAEQNLVGPNNAQYGRYLAFGDIFMVFNNQKKGLDTVTDYHRGLDITEATTTTSYTQDGTTFKRETFSSYPDDVTVTHLTQKGDKKLDFTVWNSLTEDLLANGDYSAEYSNYKSGHVTTDPNGILLKGTVKDNGLQFASYLGIKTDGKVTVHEDSLTITGASYATLLLSAKTNFAQNPKTNYRKDIDLEKTVKGIVEAAQGKYYETLKRNHIKDYQSLFNRVKLNLGGSNIAQTTKEALQTYNPTKGQKLEELFFQYGRYLLISSSRDRTDALPANLQGVWNAVDNPPWNADYHLNVNLQMNYWPAYMSNLAETAKPMINYIDDMRYYGRIAAKEYAGIESKDGQENGWLVHTQATPFGWTTPGWNYYWGWSPAANAWMMQNVYDYYKFTKDETYLKEKIYPMLKETAKFWNSFLHYDQASDRWVSSPSYSPEHGTITIGNTFDQSLVWQLFHDYMEVANHLNVDKDLVTEVKAKFDKLKPLHINKEGRIKEWYEEDSPQFTNEGIENNHRHVSHLVGLFPGTLFSKDQAEYLEAARATLNHRGDGGTGWSKANKINLWARLLDGNRAHRLLAEQLKYSTLENLWDTHAPFQIDGNFGATSGIAEMLLQSHTGYIAPLPALPDAWKDGQVSGLVARGNFEVSMQWKDKNLQSLSFLSNVGGDLVVDYPNIEASQVKVNGKPVKATVLKDGRIQLATQKGDVITFEHFSGRVTSLTAVRQNGVTAELTFNQVEGATHYVIQRQVKDESGQTSATREFVTNQTHFIDRSLDPQLAYTYTVKAMLGNVSTQVSEKANVETYNQLMDDRDSRIQYGSAFGNWADSELFGGTEKFADLSLGNYTDKDATATIPFNGVGIEIYGLKSSQLGIAEVKIDGKSVGELDFYTAGATEKGSLIGRFTGLSDGAHVMTITVKQEHKHRGSERSKISLDYFKVLPGQGTTIEKMDDRDSRIQYGSQFKDWSDTELYKSTEKYADINNSDPSTASEAQATIPFTGTGIRIYGLKTSALGKALVTLDGKEMPSLDFYTAGATQKATLIGEFTNLTDGNHILTLKVDPNSPAGRKKISLDSFDVIKSPAVSLDSPSIAPLKKGDKNISLTLPAGDWEAIAVTFPGIKDPLVLRRIDDNHLVTTGDQTVLSIQDNQVQIPIPDETNRKIGNAIEAYSIQGNTTSSPVVAVFTKKDEKKVENQQPTTSKGDDPAPIVEIPEYTKPIGTAGLEQPPTVSIPEYTQPIGTAGLEQAPTVSIPEYTKPVGTAGIEQAPTVSIPEYTKPIGTAGLEQAPTVSIPEYTQPIGTAGLEQPPTVSIPEYTKSIGTAGLEQPPVVNVPEYTQPIGTAGIEQPPTVSIPEYTKPIGTAGQEQALTVSIPEYTKPIGTAGQEQAPTVSVPEYKLRVLKDERTGVEIIGGATDLEGISHISSRRVLAQELFGKTYDAYDLHLKNSTDQSLQPKGSVLVRLPISSAVENVYYLTPSKELQALDFTIREGMAEFTTSHFSTYAVVYQANGASTTAEQKPSETDIKPLANSSEQVSSSPDLVQSTNDSPKEQLPATGETSNPLLFLSGLSLVLTATFLLKSKKDESN SEQ ID NO: 18 和緩鏈球菌nanA_5唾液酸酶 MKQYFLEKGRIFSIRKLTVGVASVAVGLTFFASGNVAASELVTEPKLEVDGQSKEVADVKHEKEEAVKEEAVKEEVTEKTELTAEKATEEAKTAEVAGDVLPEEIPDRAYPDTPVKKVDTAAIVSEQESPQVETKSILKPTEVAPTEGEKENRAVINGGQDLKRINYEGQPATSAAMVYTIFSSPLAGGGSQRYLNSGSGIFVAPNIMLTVAHNFLVKDADTNAGSIRGGDTTKFYYNVGSNTAKNNSLPTSGNTVLFKEKDIHFWNKEKFGEGIKNDLALVVAPVPLSIASPNKAATFTPLAEHREYKAGEPVSTIGYPTDSTSPELKEPIVPGQLYKADGVVKGTEKLDDKGAVGITYRLTSVSGLSGGGIINGDGKVIGIHQHGTVDNMNIAEKDRFGGGLVLSPEQLAWVKEIIDKYGVKGWYQGDNGNRYYFTPEGEMIRNKTAVIGKNKYSFDQNGIATLLEGVDYGRVVVEHLDQKDNPVKENDTFVEKTEVGTQFDYNYKTEIEKTDFYKKNKEKYEIVSIDGKAVNKQLKDTWGEDYSVVSKAPAGTRVIKVVYKVNKGSFDLRYRLKGTDQELAPATVDNNDGKEYEVSFVHRFQAKEITGYRAVNASQEATIQHKGVNQVIFEYEKIEDPKPATPATPVVDPKDEETEIGNYGPLPSKAQLDYHKEELAAFIHYGMNTYTNSEWGNGRENPQNFNPTNLDTDQWIKTLKDAGFKRTIMVVKHHDGFVIYPSQYTKHTVAASPWKDGKGDLLEEISKSATKYDMNMGVYLSPWDANNPKYHVSTEKEYNEYYLNQLKEILGNPKYGNKGKFIEVWMDGARGSGAQKVTYTFDEWFKYIKKAEGDIAIFSAQPTSVRWIGNERGIAGDPVWHKVKKAKITDDVKNEYLNHGDPEGDMYSVGEADVSIRSGWFYHDNQQPKSIKDLMDIYFKSVGRGTPLLLNIPPNKEGKFADADVARLKEFRATLDQMYATDFAKGATVTASSTRKNHLYQASNLTDGKDDTSWALSNDAKTGEFTVDLGQKRRFDVVELKEDIAKGQRISGFKVEVELNGRWVPYGEGSTVGYRRLVQGQPVEAQKIRVTITNSQATPILTNFSVYKTPSSIEKTDGYPLGLDYHSNTTADKANTTWYDESEGIRGTSMWTNKKDASVTYRFNGTKAYVVSTVDPNHGEMSVYVDGQKVADVQTNNAARKRSQMVYETDDLAPGEHTIKLVNKTGKAIATEGIYTLNNAGKGMFELKETTYEVQKGQPVTVTIKRVGGSKGAATVHVVTEPGTGVHGKVYKDTTADLTFQDGETEKTLTIPTIDFTEQADSIFDFKVKMTSASDNALLGFASEATVRVMKADLLQKDQVSHDDQASQLDYSPGWHHETNSAGKYQNTESWASFGRLNEEQKKNASVTAYFYGTGLEIKGFVDPGHGIYKVTLDGKELEYQDGQGNATDVNGKKYFSGTATTRQGDQTLVRLTGLEEGWHAVTLQLDPKRNDTSRNIGIQVDKFITRGEDSALYTKEELVQAMKNWKDELAKFDQTSLKNTPEARQAFKSNLDKLSEQLSASPANAQEILKIATALQAILDKEENYGKEDTPTSEQPEEPNYDKAMASLSEAIQNKSKELSSDKEAKKKLVELSEQALTAIQEAKTQDAVDKALQAALTSINQLQATPKEEVKPSQPEEPNYDKAMASLAEAIQNKSKELGSDKESKKKLVELSEQALTAIQEAKTQDAVDKALQAALTSINQLQATPKEEAKPSQPEEPNYDKAMASLAEAIQNKSKELGSDKEAKKKLVELSEQALTAIQEAKTQDAVDKALQAALTSINQLQATPKEEVKHSIVPTDGDKELVQPQPSLEVVEKVINFKKVKQEDSSLPKGETRVTQVGRAGKERILTEVAPDGSRTIKLREVVEVAQDEIVLVGTKKEESGKIASSVHEVPEFTGGVIDSEATIHNLPEFTGGVTDSEAAIHNLPEFTGGVTDSEAAIHNLPEFTGGMTDSEAAIHNLPEFTGGMTDSEGVAHGVSNVEEGVPSGEATSHQESGFTSDVTDSETTMNEIVYKNDEKSYVVPPMLEDKTYQAPANRQEVLPKTGSEDGSAFASVGIIGMFLGMIGIVKRKKD SEQ ID NO: 19 和緩鏈球菌nanH唾液酸酶 MSGLKKYEGVIPAFYACYDDAGEVSPERTRALVQYFIDKGVQGLYVNGSSGECIYQSVEDRKLILEEVMAVAKGKLTIIAHVACNNTKDSIELARHAESLGVDAIATIPPIYFRLPEYSVAKYWNDISAAAPNTDYVIYNIPQLAGVALTPSLYTEMLKNPRVIGVKNSSMPVQDIQTFVSLGGDDHIVFNGPDEQFLGGRLMGAKAGIGGTYGAMPELFLKLNQLIADKDLETARELQYAINAIIGKLTAAHGNMYCVIKEVLKINEGLNIGSVRSPLTPVTEEDRPVVEAAAQLIRESKERFL SEQ ID NO: 20 牙齦卟啉單胞菌唾液酸酶 MANNTLLAKTRRYVCLVVFCCLMAMMHLSGQEVTMWGDSHGVAPNQVRRTLVKVALSESLPPGAKQIRIGFSLPKETEEKVTALYLLVSDSLAVRDLPDYKGRVSYDSFPISKEDRTTALSADSVAGRCFFYLAADIGPVASFSRSDTLTARVEELAVDGRPLPLKELSPASRRLYREYEALFVPGDGGSRNYRIPSILKTANGTLIAMADRRKYNQTDLPEDIDIVMRRSTDGGKSWSDPRIIVQGEGRNHGFGDVALVQTQAGKLLMIFVGGVGLWQSTPDRPQRTYISESRDEGLTWSPPRDITHFIFGKDCADPGRSRWLASFCASGQGLVLPSGRVMFVAAIRESGQEYVLNNYVLYSDDEGGTWQLSDCAYHRGDEAKLSLMPDGRVLMSVRNQGRQESRQRFFALSSDDGLTWERAKQFEGIHDPGCNGAMLQVKRNGRNQMLHSLPLGPDGRRDGAVYLFDHVSGRWSAPVVVNSGSSAYSDMTLLADGTIGYFVEEDDEISLVFIRFVLDDLFDARQ SEQ ID NO: 21 福賽斯坦納菌siaHI唾液酸酶 MTKKSSISRRSFLKSTALAGAAGMVGTGGAATLLTSCGGGASSNENANAANKPLKEPGTYYVPELPDMAADGKELKAGIIGCGGRGSGAAMNFLAAANGVSIVALGDTFQDRVDSLAQKLKDEKNIDIPADKRFVGLDAYKQVIDSDVDVVIVATPPNFRPIHFQYAVEKSKHCFLEKPICVDAVGYRTIMATAKQAQAKNLCVITGTQRHHQRSYIASYQQIMNGAIGEITGGTVYWNQSMLWYRERQAGWSDCEWMIRDWVNWKWLSGDHIVEQHVHNIDVFTWFSGLKPVKAVGFGSRQRRITGDQYDNFSIDFTMENGIHLHSMCRQIDGCANNVSEFIQGTKGSWNSTDMGIKDLAGNVIWKYDVEAEKASFKQNDPYTLEHVNWINTIRAGKSIDQASETAVSNMAAIMGRESAYTGEETTWEAMTAAALDYTPADLNLGKMDMKPFVVPVPGKPLEKK SEQ ID NO: 22 福賽斯坦納菌nanH唾液酸酶 MKKFFWIIGLFISMLTTRAADSVYVQNPQIPILIDRTDNVLFRIRIPDATKGDVLNRLTIRFGNEDKLSEVKAVRLFYAGTEAGTKGRSRFAPVTYVSSHNIRNTRSANPSYSVRQDEVTTVANTLTLKTRQPMVKGINYFWVSVEMDRNTSLLSKLTPTVTEAVINDKPAVIAGEQAAVRRMGIGVRHAGDDGSASFRIPGLVTTNEGTLLGVYDVRYNNSVDLQEHIDVGLSRSTDKGQTWEPMRIAMSFGETDGLPSGQNGVGDPSILVDERTNTVWVVAAWTHGMGNARAWTNSMPGMTPDETAQLMMVKSTDDGRTWSEPINITSQVKDPSWCFLLQGPGRGITMRDGTLVFPIQFIDSLRVPHAGIMYSKDRGETWHIHQPARTNTTEAQVAEVEPGVLMLNMRDNRGGSRAVSITRDLGKSWTEHSSNRSALPESICMASLISVKAKDNIIGKDLLFFSNPNTTEGRHHITIKASLDGGVTWLPAHQVLLDEEDGWGYSCLSMIDRETVGIFYESSVAHMTFQAVKIKDLIR SEQ ID NO: 23 嗜黏蛋白艾克曼氏菌唾液酸酶 MTWLLCGRGKWNKVKRMMNSVFKCLMSAVCAVALPAFGQEEKTGFPTDRAVTVFSAGEGNPYASIRIPALLSIGKGQLLAFAEGRYKNTDQGENDIIMSVSKNGGKTWSRPRAIAKAHGATFNNPCPVYDAKTRTVTVVFQRYPAGVKERQPNIPDGWDDEKCIRNFMIQSRNGGSSWTKPQEITKTTKRPSGVDIMASGPNAGTQLKSGAHKGRLVIPMNEGPFGKWVISCIYSDDGGKSWKLGQPTANMKGMVNETSIAETDNGGVVMVARHWGAGNCRRIAWSQDGGETWGQVEDAPELFCDSTQNSLMTYSLSDQPAYGGKSRILFSGPSAGRRIKGQVAMSYDNGKTWPVKKLLGEGGFAYSSLAMVEPGIVGVLYEENQEHIKKLKFVPITMEWLTDGEDTGLAPGKKAPVLK SEQ ID NO: 24 嗜黏蛋白艾克曼氏菌唾液酸酶 MGLGLLCALGLSIPSVLGKESFEQARRGKFTTLSTKYGLMSCRNGVAEIGGGGKSGEASLRMFGGQDAELKLDLKDTPSREVRLSAWAERWTGQAPFEFSIVAIGPNGEKKIYDGKDIRTGGFHTRIEASVPAGTRSLVFRLTSPENKGMKLDDLFLVPCIPMKVNPQVEMASSAYPVMVRIPCSPVLSLNVRTDGCLNPQFLTAVNLDFTGTTKLSDIESVAVIRGEEAPIIHHGEEPFPKDSSQVLGTVKLAGSARPQISVKGKMELEPGDNYLWACVTMKEGASLDGRVVVRPASVVAGNKPVRVANAAPVAQRIGVAVVRHGDFKSKFYRIPGLARSRKGTLLAVYDIRYNHSGDLPANIDVGVSRSTDGGRTWSDVKIAIDDSKIDPSLGATRGVGDPAILVDEKTGRIWVAAIWSHRHSIWGSKSGDNSPEACGQLVLAYSDDDGLTWSSPINITEQTKNKDWRILFNGPGNGICMKDGTLVFAAQYWDGKGVPWSTIVYSKDRGKTWHCGTGVNQQTTEAQVIELEDGSVMINARCNWGGSRIVGVTKDLGQTWEKHPTNRTAQLKEPVCQGSLLAVDGVPGAGRVVLFSNPNTTSGRSHMTLKASTNDAGSWPEDKWLLYDARKGWGYSCLAPVDKNHVGVLYESQGALNFLKIPYKDVLNAKNAR SEQ ID NO: 25 多形擬桿菌唾液酸酶 MKRNHYLFTLILLLGCSIFVKASDTVFVHQTQIPILIERQDNVLFYFRLDAKESRMMDEIVLDFGKSVNLSDVQAVKLYYGGTEALQDKGKKRFAPVDYISSHRPGNTLAAIPSYSIKCAEALQPSAKVVLKSHYKLFPGINFFWISLQMKPETSLFTKISSELQSVKIDGKEAICEERSPKDIIHRMAVGVRHAGDDGSASFRIPGLVTSNKGTLLGVYDVRYNSSVDLQEYVDVGLSRSTDGGKTWEKMRLPLSFGEYDGLPAAQNGVGDPSILVDTQTNTIWVVAAWTHGMGNQRAWWSSHPGMDLYQTAQLVMAKSTDDGKTWSKPINITEQVKDPSWYFLLQGPGRGITMSDGTLVFPTQFIDSTRVPNAGIMYSKDRGKTWKMHNMARTNTTEAQVVETEPGVLMLNMRDNRGGSRAVAITKDLGKTWTEHPSSRKALQEPVCMASLIHVEAEDNVLDKDILLFSNPNTTRGRNHITIKASLDDGLTWLPEHQLMLDEGEGWGYSCLTMIDRETIGILYESSAAHMTFQAVKLKDLIR SEQ ID NO: 26 黏放線菌唾液酸酶 MTSHSPFSRRHLPALLGSLPLAATGLIAAAPPAHAVPTSDGLADVTITQVNAPADGLYSVGDVMTFNITLTNTSGEAHSYAPASTNLSGNVSKCRWRNVPAGTTKTDCTGLATHTVTAEDLKAGGFTPQIAYEVKAVEYAGKALSTPETIKGATSPVKANSLRVESITPSSSKEYYKLGDTVTYTVRVRSVSDKTINVAATESSFDDLGRQCHWGGLKPGKGAVYNCKPLTHTITQADVDAGRWTPSITLTATGTDGTALQTLTATGNPINVVGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHVAPNTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDHGWGNSQAGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDNPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPVGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDSSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPKPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHDGANYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAEPSPAPSPTAAPSAAPSEQPAPSAAPSTEPTQAPAPSSAPEPSAVPEPSSAPAPEPTTAPSTEPTPTPAPSSAPEPSAGPTAAPAPETSSAPAAEPTQAPTVAPSAEPTQVPGAQPSAAPSEKPGAQPSSAPKPDATGRAPSVVNPKATAAPSGKASSSASPAPSRSATATSKPGMEPDEIDRPSDGAMAQPTGGASAPSAAPTQAAKAGSRLSRTGTNALLVLGLAGVAVVGGYLLLRARRSKN SEQ ID NO: 27 不含初始Met且不含錨定結構域之DAS181 GDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPA SEQ ID NO: 28 構築體1：mIg-K_DAS181 蛋白序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNP SEQ ID NO: 29 構築體2：mIg-K_DAS185 蛋白序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGFTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNP SEQ ID NO: 30 構築體3：mIg-K_Neu2-AR 蛋白序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDMASLPVLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPIQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNP SEQ ID NO: 31 構築體4：DAS181(-AR)_TM蛋白序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGATPARSPGMGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGFTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPA VDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRSEQ ID NO: 32 構築體5：DAS185(-AR)_TM蛋白序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGATPARSPGMGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGFTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPA VDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRSEQ ID NO: 33 構築體6：Neu2_TM蛋白序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGATPARSPGMASLPVLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPIQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ VDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR未加下劃線=唾液酸酶結構域 加下劃線序列之說明 ： N- 末端部分METDTLLLWVLLLWVPGSTGD =信號 YPYDVPDYA = HA標籤 GATPARSPG =選殖位點 C- 末端部分VD =選殖位點 EQKLISEEDL = Myc標籤 NAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR = TM結構域 SEQ ID NO: 34 構築體1：mIg-K_DAS181 核苷酸序列ATGgagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacGGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCAGATGCCTCCACCGAGCTGCCAGCAAGCATGTCCCAGGCACAGCACCTGGCAGCAAATACCGCAACAGACAACTACAGAATCCCCGCCATCACCACAGCCCCAAATGGCGATCTGCTGATCAGCTATGACGAGCGCCCCAAGGATAACGGAAATGGAGGCTCCGACGCACCAAACCCTAATCACATCGTGCAGCGGAGATCTACCGATGGCGGCAAGACATGGAGCGCCCCTACCTACATCCACCAGGGCACCGAGACAGGCAAGAAGGTCGGCTACTCTGACCCAAGCTATGTGGTGGATCACCAGACCGGCACAATCTTCAACTTTCACGTGAAGTCCTATGACCAGGGATGGGGAGGCTCTAGGGGCGGCACCGATCCTGAGAATCGCGGCATCATCCAGGCCGAGGTGTCTACCAGCACAGACAACGGCTGGACCTGGACACACCGGACCATCACAGCCGACATCACAAAGGATAAGCCCTGGACCGCAAGATTCGCAGCAAGCGGACAGGGCATCCAGATCCAGCACGGACCTCACGCAGGCCGGCTGGTGCAGCAGTACACCATCAGAACAGCAGGAGGAGCAGTGCAGGCCGTGTCCGTGTATTCTGACGATCACGGCAAGACCTGGCAGGCAGGCACCCCAATCGGCACAGGCATGGACGAGAATAAGGTGGTGGAGCTGAGCGATGGCTCCCTGATGCTGAACTCTAGGGCCAGCGACGGCTCCGGCTTCCGCAAGGTGGCACACTCTACAGACGGAGGACAGACCTGGTCCGAGCCCGTGTCTGATAAGAATCTGCCTGACAGCGTGGATAACGCCCAGATCATCCGGGCCTTTCCTAATGCCGCCCCAGACGATCCCAGAGCCAAGGTGCTGCTGCTGTCCCACTCTCCAAACCCAAGGCCTTGGAGCCGGGACAGAGGCACAATCAGCATGTCCTGCGACGATGGCGCCAGCTGGACCACATCCAAGGTGTTCCACGAGCCATTTGTGGGCTACACCACAATCGCCGTGCAGTCTGATGGCAGCATCGGACTGCTGAGCGAGGACGCACACAATGGCGCCGATTACGGCGGCATCTGGTATCGGAACTTCACCATGAACTGGCTGGGCGAGCAGTGTGGCCAGAAGCCAGCCAAGCGGAAGAAGAAGGGCGGCAAGAACGGCAAGAATAGGCGCAACCGGAAGAAGAAGAACCCCTGATGA SEQ ID NO: 35 構築體2：mIg-K_DAS185核苷酸序列 ATGgagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacGGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCAGATGCCTCCACCGAGCTGCCAGCAAGCATGTCCCAGGCACAGCACCTGGCAGCAAATACCGCAACAGACAACTACAGAATCCCCGCCATCACCACAGCCCCAAATGGCGATCTGCTGATCAGCTATGACGAGCGCCCCAAGGATAACGGAAATGGAGGCTCCGACGCACCAAACCCTAATCACATCGTGCAGCGGAGATCTACCGATGGCGGCAAGACATGGAGCGCCCCTACCTACATCCACCAGGGCACCGAGACAGGCAAGAAGGTCGGCTACTCTGACCCAAGCTATGTGGTGGATCACCAGACCGGCACAATCTTCAACTTTCACGTGAAGTCCTATGACCAGGGATGGGGAGGCTCTAGGGGCGGCACCGATCCTGAGAATCGCGGCATCATCCAGGCCGAGGTGTCTACCAGCACAGACAACGGCTGGACCTGGACACACCGGACCATCACAGCCGACATCACAAAGGATAAGCCCTGGACCGCAAGATTCGCAGCAAGCGGACAGGGCATCCAGATCCAGCACGGACCTCACGCAGGCCGGCTGGTGCAGCAGTACACCATCAGAACAGCAGGAGGAGCAGTGCAGGCCGTGTCCGTGTATTCTGACGATCACGGCAAGACCTGGCAGGCAGGCACCCCAATCGGCACAGGCATGGACGAGAATAAGGTGGTGGAGCTGAGCGATGGCTCCCTGATGCTGAACTCTAGGGCCAGCGACGGCTCCGGCTTCCGCAAGGTGGCACACTCTACAGACGGAGGACAGACCTGGTCCGAGCCCGTGTCTGATAAGAATCTGCCTGACAGCGTGGATAACGCCCAGATCATCCGGGCCTTTCCTAATGCCGCCCCAGACGATCCCAGAGCCAAGGTGCTGCTGCTGTCCCACTCTCCAAACCCAAGGCCTTGGAGCCGGGACAGAGGCACAATCAGCATGTCCTGCGACGATGGCGCCAGCTGGACCACATCCAAGGTGTTCCACGAGCCATTTGTGGGCTTCACCACAATCGCCGTGCAGTCTGATGGCAGCATCGGACTGCTGAGCGAGGACGCACACAATGGCGCCGATTACGGCGGCATCTGGTATCGGAACTTCACCATGAACTGGCTGGGCGAGCAGTGTGGCCAGAAGCCAGCCAAGCGGAAGAAGAAGGGCGGCAAGAACGGCAAGAATAGGCGCAACCGGAAGAAGAAGAACCCCTGATGA SEQ ID NO: 36 構築體3：mIg-K_Neu2-AR核苷酸序列 ATGgagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacATGGCCAGCCTGCCTGTGCTGCAGAAGGAGAGCGTGTTCCAGTCCGGCGCCCACGCATACAGAATCCCCGCCCTGCTGTATCTGCCTGGCCAGCAGTCCCTGCTGGCCTTTGCCGAGCAGAGAGCCTCTAAGAAGGACGAGCACGCAGAGCTGATCGTGCTGAGGAGGGGCGACTACGATGCACCAACCCACCAGGTGCAGTGGCAGGCACAGGAGGTGGTGGCACAGGCAAGGCTGGACGGACACCGCAGCATGAATCCATGCCCCCTGTATGATGCCCAGACCGGCACACTGTTCCTGTTCTTTATCGCAATCCCCGGCCAGGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACCAGAGCCAACGTGACAAGACTGTGCCAGGTGACCTCCACAGACCACGGCAGGACCTGGAGCAGCCCTCGCGACCTGACAGATGCAGCAATCGGACCAGCATACAGGGAGTGGTCTACATTCGCCGTGGGCCCTGGCCACTGCCTGCAGCTGCACGATCGGGCCAGAAGCCTGGTGGTGCCAGCCTACGCCTATCGGAAGCTGCACCCCATCCAGAGACCTATCCCATCTGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGACCACGGCAGAACTTGGGCCAGAGGCCACTTTGTGGCCCAGGATACACTGGAGTGTCAGGTGGCAGAGGTGGAGACCGGAGAGCAGAGGGTGGTGACACTGAATGCACGCAGCCACCTGAGGGCCCGCGTGCAGGCCCAGTCCACCAACGACGGCCTGGATTTCCAGGAGTCTCAGCTGGTGAAGAAGCTGGTGGAGCCACCTCCACAGGGATGTCAGGGCTCTGTGATCAGCTTTCCCTCCCCTCGGTCTGGCCCAGGCAGCCCAGCACAGTGGCTGCTGTACACCCACCCCACACACTCCTGGCAGAGGGCAGACCTGGGAGCATATCTGAATCCAAGACCCCCTGCACCAGAGGCCTGGTCCGAGCCTGTGCTGCTGGCCAAGGGCTCTTGCGCCTACAGCGACCTGCAGAGCATGGGCACCGGACCTGATGGCTCTCCACTGTTCGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGATTATGAGGAGATCGTGTTCCTGATGTTTACACTGAAGCAGGCCTTTCCTGCCGAGTATCTGCCACAGAAGCGGAAGAAGAAGGGCGGCAAGAACGGCAAGAATCGGAGAAACCGGAAGAAGAAGAACCCTTGATGA SEQ ID NO: 37 構築體4：DAS181(-AR)_TM核苷酸序列 atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacTATCCA TATGATGTTCCAGATTATGCTGGGGCCACGCCGGCCAGATCTCCCGGGATGGGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCAGATGCCTCCACCGAGCTGCCAGCAAGCATGTCCCAGGCACAGCACCTGGCAGCAAATACCGCAACAGACAACTACAGAATCCCCGCCATCACCACAGCCCCAAATGGCGATCTGCTGATCAGCTATGACGAGCGCCCCAAGGATAACGGAAATGGAGGCTCCGACGCACCAAACCCTAATCACATCGTGCAGCGGAGATCTACCGATGGCGGCAAGACATGGAGCGCCCCTACCTACATCCACCAGGGCACCGAGACAGGCAAGAAGGTCGGCTACTCTGACCCAAGCTATGTGGTGGATCACCAGACCGGCACAATCTTCAACTTTCACGTGAAGTCCTATGACCAGGGATGGGGAGGCTCTAGGGGCGGCACCGATCCTGAGAATCGCGGCATCATCCAGGCCGAGGTGTCTACCAGCACAGACAACGGCTGGACCTGGACACACCGGACCATCACAGCCGACATCACAAAGGATAAGCCCTGGACCGCAAGATTCGCAGCAAGCGGACAGGGCATCCAGATCCAGCACGGACCTCACGCAGGCCGGCTGGTGCAGCAGTACACCATCAGAACAGCAGGAGGAGCAGTGCAGGCCGTGTCCGTGTATTCTGACGATCACGGCAAGACCTGGCAGGCAGGCACCCCAATCGGCACAGGCATGGACGAGAATAAGGTGGTGGAGCTGAGCGATGGCTCCCTGATGCTGAACTCTAGGGCCAGCGACGGCTCCGGCTTCCGCAAGGTGGCACACTCTACAGACGGAGGACAGACCTGGTCCGAGCCCGTGTCTGATAAGAATCTGCCTGACAGCGTGGATAACGCCCAGATCATCCGGGCCTTTCCTAATGCCGCCCCAGACGATCCCAGAGCCAAGGTGCTGCTGCTGTCCCACTCTCCAAACCCAAGGCCTTGGAGCCGGGACAGAGGCACAATCAGCATGTCCTGCGACGATGGCGCCAGCTGGACCACATCCAAGGTGTTCCACGAGCCATTTGTGGGCTACACCACAATCGCCGTGCAGTCTGATGGCAGCATCGGACTGCTGAGCGAGGACGCACACAATGGCGCCGATTACGGCGGCATCTGGTATCGGAACTTCACCATGAACTGGCTGGGCGAGCAGTGTGGCCAGAAGCCAGCCGTCGACGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAG GATCTGaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt SEQ ID NO: 38 構築體5：DAS185(-AR)_TM核苷酸序列 atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTGGGGCCACGCCGGCCAGATCTCCCGGGATGGGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCAGATGCCTCCACCGAGCTGCCAGCAAGCATGTCCCAGGCACAGCACCTGGCAGCAAATACCGCAACAGACAACTACAGAATCCCCGCCATCACCACAGCCCCAAATGGCGATCTGCTGATCAGCTATGACGAGCGCCCCAAGGATAACGGAAATGGAGGCTCCGACGCACCAAACCCTAATCACATCGTGCAGCGGAGATCTACCGATGGCGGCAAGACATGGAGCGCCCCTACCTACATCCACCAGGGCACCGAGACAGGCAAGAAGGTCGGCTACTCTGACCCAAGCTATGTGGTGGATCACCAGACCGGCACAATCTTCAACTTTCACGTGAAGTCCTATGACCAGGGATGGGGAGGCTCTAGGGGCGGCACCGATCCTGAGAATCGCGGCATCATCCAGGCCGAGGTGTCTACCAGCACAGACAACGGCTGGACCTGGACACACCGGACCATCACAGCCGACATCACAAAGGATAAGCCCTGGACCGCAAGATTCGCAGCAAGCGGACAGGGCATCCAGATCCAGCACGGACCTCACGCAGGCCGGCTGGTGCAGCAGTACACCATCAGAACAGCAGGAGGAGCAGTGCAGGCCGTGTCCGTGTATTCTGACGATCACGGCAAGACCTGGCAGGCAGGCACCCCAATCGGCACAGGCATGGACGAGAATAAGGTGGTGGAGCTGAGCGATGGCTCCCTGATGCTGAACTCTAGGGCCAGCGACGGCTCCGGCTTCCGCAAGGTGGCACACTCTACAGACGGAGGACAGACCTGGTCCGAGCCCGTGTCTGATAAGAATCTGCCTGACAGCGTGGATAACGCCCAGATCATCCGGGCCTTTCCTAATGCCGCCCCAGACGATCCCAGAGCCAAGGTGCTGCTGCTGTCCCACTCTCCAAACCCAAGGCCTTGGAGCCGGGACAGAGGCACAATCAGCATGTCCTGCGACGATGGCGCCAGCTGGACCACATCCAAGGTGTTCCACGAGCCATTTGTGGGCTTCACCACAATCGCCGTGCAGTCTGATGGCAGCATCGGACTGCTGAGCGAGGACGCACACAATGGCGCCGATTACGGCGGCATCTGGTATCGGAACTTCACCATGAACTGGCTGGGCGAGCAGTGTGGCCAGAAGCCAGCCGTCGACGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt SEQ ID NO: 39 構築體6：Neu2_TM核苷酸序列 atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTGGGGCCACGCCGGCCAGATCTCCCGGGATGGCCAGCCTGCCTGTGCTGCAGAAGGAGAGCGTGTTCCAGTCCGGCGCCCACGCATACAGAATCCCCGCCCTGCTGTATCTGCCTGGCCAGCAGTCCCTGCTGGCCTTTGCCGAGCAGAGAGCCTCTAAGAAGGACGAGCACGCAGAGCTGATCGTGCTGAGGAGGGGCGACTACGATGCACCAACCCACCAGGTGCAGTGGCAGGCACAGGAGGTGGTGGCACAGGCAAGGCTGGACGGACACCGCAGCATGAATCCATGCCCCCTGTATGATGCCCAGACCGGCACACTGTTCCTGTTCTTTATCGCAATCCCCGGCCAGGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACCAGAGCCAACGTGACAAGACTGTGCCAGGTGACCTCCACAGACCACGGCAGGACCTGGAGCAGCCCTCGCGACCTGACAGATGCAGCAATCGGACCAGCATACAGGGAGTGGTCTACATTCGCCGTGGGCCCTGGCCACTGCCTGCAGCTGCACGATCGGGCCAGAAGCCTGGTGGTGCCAGCCTACGCCTATCGGAAGCTGCACCCCATCCAGAGACCTATCCCATCTGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGACCACGGCAGAACTTGGGCCAGAGGCCACTTTGTGGCCCAGGATACACTGGAGTGTCAGGTGGCAGAGGTGGAGACCGGAGAGCAGAGGGTGGTGACACTGAATGCACGCAGCCACCTGAGGGCCCGCGTGCAGGCCCAGTCCACCAACGACGGCCTGGATTTCCAGGAGTCTCAGCTGGTGAAGAAGCTGGTGGAGCCACCTCCACAGGGATGTCAGGGCTCTGTGATCAGCTTTCCCTCCCCTCGGTCTGGCCCAGGCAGCCCAGCACAGTGGCTGCTGTACACCCACCCCACACACTCCTGGCAGAGGGCAGACCTGGGAGCATATCTGAATCCAAGACCCCCTGCACCAGAGGCCTGGTCCGAGCCTGTGCTGCTGGCCAAGGGCTCTTGCGCCTACAGCGACCTGCAGAGCATGGGCACCGGACCTGATGGCTCTCCACTGTTCGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGATTATGAGGAGATCGTGTTCCTGATGTTTACACTGAAGCAGGCCTTTCCTGCCGAGTATCTGCCACAGGTC GACGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt SEQ ID NO : 40 實例性胺基酸分泌序列 METDTLLLWVLLLWVPGSTGD SEQ ID NO: 41 HA標籤胺基酸序列 YPYDVPDYA SEQ ID NO: 42 N-末端選殖位點胺基酸序列 GATPARSPG SEQ ID NO: 43 C-末端選殖位點胺基酸序列 VD SEQ ID NO: 44 Myc標籤胺基酸序列 EQKLISEEDL SEQ ID NO: 53 鼠傷寒沙門桿菌 TVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYN SEQ ID NO: 54 霍亂弧菌唾液酸酶 MRFKNVKKTALMLAMFGMATSSNAALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDVIFRGPDRIPSIVASSVTPGVVTAFAEKRVGGGDPGALSNTNDIITRTSRDGGITWDTELNLTEQINVSDEFDFSDPRPIYDPSSNTVLVSYARWPTDAAQNGDRIKPWMPNGIFYSVYDVASGNWQAPIDVTDQVKERSFQIAGWGGSELYRRNTSLNSQQDWQSNAKIRIVDGAANQIQVADGSRKYVVTLSIDESGGLVANLNGVSAPIILQSEHAKVHSFHDYELQYSALNHTTTLFVDGQQITTWAGEVSQENNIQFGNADAQIDGRLHVQKIVLTQQGHNLVEFDAFYLAQQTPEVEKDLEKLGWTKIKTGNTMSLYGNASVNPGPGHGITLTRQQNISGSQNGRLIYPAIVLDRFFLNVMSIYSDDGGSNWQTGSTLPIPFRWKSSSILETLEPSEADMVELQNGDLLLTARLDFNQIVNGVNYSPRQQFLSKDGGITWSLLEANNANVFSNISTGTVDASITRFEQSDGSHFLLFTNPQGNPAGTNGRQNLGLWFSFDEGVTWKGPIQLVNGASAYSDIYQLDSENAIVIVETDNSNMRILRMPITLLKQKLTLSQN SEQ ID NO: 55 Lv-CD19-CAR質體DNA序列 ATGGAGTTTGGACTGAGCTGGCTGTTTCTCGTGGCCATTCTGAAGGGCGTCCAGTGCAGCAGAGACATCCAGATGACCCAGACAACCAGCTCTCTGAGCGCTAGCCTCGGAGATAGAGTGACCATTAGCTGTAGAGCCTCCCAAGACATTTCCAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACTCCGGAGTGCCCTCTAGGTTTTCCGGATCCGGCAGCGGCACAGACTACTCTCTGACCATCTCCAATCTGGAGCAAGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAAGGCAACACACTGCCTTACACATTCGGCGGCGGAACAAAGCTCGAACTGAAAAGAGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGCGGAGGATCCGGCGGAGGAGGCTCCGAAGTCCAGCTGCAACAAAGCGGACCCGGACTGGTGGCTCCCAGCCAATCTCTGAGCGTGACATGCACAGTGTCCGGCGTCTCTCTGCCCGACTACGGAGTCAGCTGGATTAGACAGCCTCCTAGAAAGGGACTGGAGTGGCTGGGAGTCATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTATAACTCCGCCCTCAAGTCTAGGCTCACCATCATCAAAGACAACAGCAAGAGCCAAGTGTTCCTCAAGATGAACAGCCTCCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAACACTACTACTACGGAGGCAGCTACGCTATGGATTACTGGGGCCAAGGCACCACAGTCACAGTGAGCAGCTATGTGACCGTGAGCAGCCAAGACCCCGCCAAAGATCCCAAGTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGAGGCGTGCTGGCTTGTTATTCTCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGATCCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACACCTAGAAGGCCCGGCCCCACAAGGAAACATTACCAGCCCTACGCCCCCCCTAGAGACTTCGCTGCCTATAGATCCAAGAGAGGAAGAAAAAAGCTGCTCTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAAACAACACAAGAGGAGGACGGATGTAGCTGTAGATTCCCCGAGGAGGAAGAGGGAGGATGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCTCTAGGAGCGCCGATGCTCCCGCTTATCAGCAAGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGAAGAAGGGAAGAATACGACGTGCTGGATAAGAGGAGGGGAAGAGACCCCGAGATGGGAGGCAAGCCTAGAAGGAAGAACCCCCAAGAGGGACTGTACAACGAGCTCCAAAAGGACAAGATGGCTGAAGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGAGAGAGAAGGAGGGGCAAGGGCCACGATGGACTCTACCAAGGCCTCAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCTCTGCACATGCAAGCTCTGCCCCCAGATGATGA SEQ ID NO: 56 Lv-CD19-CAR經轉譯胺基酸序列 MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVSSYVTVSSQDPAKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPDD SEQ ID NO: 57 CD19-scFv胺基酸序列 MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTTVTVS SEQ ID NO: 58 CD55-A27胺基酸序列 MDCGLPPDVPNAQPALEGRTSFPEDTVITYKCEESFVKIPGEKDSVICLKGSQWSDIEEFCNRSCEVPTRLNSASLKQPYITQNYFPVGTVVEYECRPGYRREPSLSPKLTCLQNLKWSTAVEFCKKKSCPNPGEIRNGQIDVPGGILFGATISFSCNTGYKLFGSTSSFCLISGSSVQWSDPLPECREIYCPAPPQIDNGIIQGERDHYGYRQSVTYACNKGFTMIGEHSIYCTVNNDEGEWSGPPPECRGGGGSGGGGSGGGGSDGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKAPEDKAADAAAAAADDNEETLKQRLTNLEKKITNVTTKFEQIEKCCKRNDEVLFRLENHAETLRAAMISLAKKIDVQTGRAAAE TK-左(SEQ ID NO: 59) agttgataatcggccccatgttttcaggtaaaagtacagaattaattagacgagttagacgttatcaaatagctcaatataaatgcgtgactataaaatattctaacgataatagatacggaacgggactatggacgcatgataagaataattttgaagcattggaagcaactaaactatgtgatgtcttggaatcaattacagatttctccgtgataggtatcgatgaaggacagttctttccagacattgttgaatt 唾液酸酶(反向補體)：(SEQ ID NO: 60) tcatcaggggttcttcttcttccggttgcgcctattcttgccgttcttgccgcccttcttcttccgcttggctggcttctggccacactgctcgcccagccagttcatggtgaagttccgataccagatgccgccgtaatcggcgccattgtgtgcgtcctcgctcagcagtccgatgctgccatcagactgcacggcgattgtggtgtagcccacaaatggctcgtggaacaccttggatgtggtccagctggcgccatcgtcgcaggacatgctgattgtgcctctgtcccggctccaaggccttgggtttggagagtgggacagcagcagcaccttggctctgggatcgtctggggcggcattaggaaaggcccggatgatctgggcgttatccacgctgtcaggcagattcttatcagacacgggctcggaccaggtctgtcctccgtctgtagagtgtgccaccttgcggaagccggagccgtcgctggccctagagttcagcatcagggagccatcgctcagctccaccaccttattctcgtccatgcctgtgccgattggggtgcctgcctgccaggtcttgccgtgatcgtcagaatacacggacacggcctgcactgctcctcctgctgttctgatggtgtactgctgcaccagccggcctgcgtgaggtccgtgctggatctggatgccctgtccgcttgctgcgaatcttgcggtccagggcttatcctttgtgatgtcggctgtgatggtccggtgtgtccaggtccagccgttgtctgtgctggtagacacctcggcctggatgatgccgcgattctcaggatcggtgccgcccctagagcctccccatccctggtcataggacttcacgtgaaagttgaagattgtgccggtctggtgatccaccacatagcttgggtcagagtagccgaccttcttgcctgtctcggtgccctggtggatgtaggtaggggcgctccatgtcttgccgccatcggtagatctccgctgcacgatgtgattagggtttggtgcgtcggagcctccatttccgttatccttggggcgctcgtcatagctgatcagcagatcgccatttggggctgtggtgatggcggggattctgtagttgtctgttgcggtatttgctgccaggtgctgtgcctgggacatgcttgctggcagctcggtggaggcatctggggcaggtgctggtgttgcctgtgggtggtcgcccat F17R: (SEQ ID NO: 61) gaatttcattttgtttttttctatgctataa LoxP: (SEQ ID NO: 62) ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat GFP: (SEQ ID NO: 63) Atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag TK-右：(SEQ ID NO: 64) aattctgtgagcgtatggcaaacgaaggaaaaatagttatagtagccgcactcgatgggacatttcaacgtaaaccgtttaataatattttgaatcttattccattatctgaaatggtggtaaaactaactgctgtgtgtatgaaatgctttaaggaggcttccttttctaaacgattgggtgaggaaaccgagatagaaataa SEQ ID NO: 65 用於表現唾液酸酶(DAS181)之牛痘病毒構築體之一部分之序列。 atgaacggcggacatattcagttgataatcggccccatgttttcaggtaaaagtacagaattaattagacgagttagacgttatcaaatagctcaatataaatgcgtgactataaaatattctaacgataatagatacggaacgggactatggacgcatgataagaataattttgaagcattggaagcaactaaactatgtgatgtcttggaatcaattacagatttctccgtgataggtatcgatgaaggacagttctttccagacattgttgaattagatcgataaaaattaattaattacccgggtaccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgctcgaagcggccggcctcatcaggggttcttcttcttccggttgcgcctattcttgccgttcttgccgcccttcttcttccgcttggctggcttctggccacactgctcgcccagccagttcatggtgaagttccgataccagatgccgccgtaatcggcgccattgtgtgcgtcctcgctcagcagtccgatgctgccatcagactgcacggcgattgtggtgtagcccacaaatggctcgtggaacaccttggatgtggtccagctggcgccatcgtcgcaggacatgctgattgtgcctctgtcccggctccaaggccttgggtttggagagtgggacagcagcagcaccttggctctgggatcgtctggggcggcattaggaaaggcccggatgatctgggcgttatccacgctgtcaggcagattcttatcagacacgggctcggaccaggtctgtcctccgtctgtagagtgtgccaccttgcggaagccggagccgtcgctggccctagagttcagcatcagggagccatcgctcagctccaccaccttattctcgtccatgcctgtgccgattggggtgcctgcctgccaggtcttgccgtgatcgtcagaatacacggacacggcctgcactgctcctcctgctgttctgatggtgtactgctgcaccagccggcctgcgtgaggtccgtgctggatctggatgccctgtccgcttgctgcgaatcttgcggtccagggcttatcctttgtgatgtcggctgtgatggtccggtgtgtccaggtccagccgttgtctgtgctggtagacacctcggcctggatgatgccgcgattctcaggatcggtgccgcccctagagcctccccatccctggtcataggacttcacgtgaaagttgaagattgtgccggtctggtgatccaccacatagcttgggtcagagtagccgaccttcttgcctgtctcggtgccctggtggatgtaggtaggggcgctccatgtcttgccgccatcggtagatctccgctgcacgatgtgattagggtttggtgcgtcggagcctccatttccgttatccttggggcgctcgtcatagctgatcagcagatcgccatttggggctgtggtgatggcggggattctgtagttgtctgttgcggtatttgctgccaggtgctgtgcctgggacatgcttgctggcagctcggtggaggcatctggggcaggtgctggtgttgcctgtgggtggtcgcccatttatagcatagaaaaaaacaaaatgaaattcaagctttcactaattccaaacccacccgctttttatagtaagtttttcacccataaataataaatacaataattaatttctcgtaaaagtagaaaatatattctaatttattgcacggtaaggaagtagatcataactcgagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaatagactagcgctcaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgcggccgcttcctcgctcactgacgctagcgccctatagtgagtcgtattacagatccaattctgtgagcgtatggcaaacgaaggaaaaatagttatagtagccgcactcgatgggacatttcaacgtaaaccgtttaataatattttgaatcttattccattatctgaaatggtggtaaaactaactgctgtgtgtatgaaatgctttaaggaggcttccttttctaaacgattgggtgaggaaaccgagatagaaataataggaggtaatgatatgtatcaatcggtgtgtagaaagtgttacatcgactcata SEQ ID NO: 66 突變牛痘病毒(VV) H3L蛋白 MAAAKTPVIVVPVAAALPSETFPNVHEHINDQAAADVADAEVMAAKRNVVVAKDDPDHYKDYAFIQWTGGNIRNDDKYTHFFSGFCNTMCTEETKRNIARHLALWDSNFFTELENKKVEYVVIVENDNVIAAIAFLAPVLKAMHDKKIDILQMAEAITGNAVKTEAAADKNHAIFTYTGGYDVSLSAYIIRVTTALNIADEIIKSGGLSSGFYFEIARIENEMKINAQILDNAAKYVEHDPRLVAEHRFANMAAAAWSRIGTAATKRYPGVMYAFTTPLISFFGLFDINVIGLIVILFIMFMLIFNVKSKLLWFLTGTFVTAFI SEQ ID NO: 67 突變牛痘病毒(VV) H3L蛋白 MAAAKTPVIVVPVIDRLPSETFPNVHEHINDQKFDDVKDNEVMAEKRNVVVVKDDPDHYKDYAFIQWTGGNIRNDDKYTHFFSGFCNTMCTEETKRNIARHLALWDSNFFTELENKKVEYVVIVENDNVIEDITFLRPVLKAMHDKKIDILQMREIITGNKVKTELVMDKNHAIFTYTGGYDVSLSAYIIRVTTALNIVDEIIKSGGLSSGFYFEIARIENEMKINRQILDNAAKYVEHDPRLVAEHRFGWMKPNFWFRIGPATVIRCPGVKNANTAPLISFFGLFDINVIGLIVILFIMFMLIFNVKSKLLWFLTGTFVTAFI SEQ ID NO: 68 突變牛痘病毒(VV) H3L蛋白 MAAAKTPVIVVPVAAALPSETFPNVHEHINDQAAADVADAEVMAAKRNVVVAKDDPDHYKDYAFIQWTGGNIRNDDKYTHFFSGFCNTMCTEETKRNIARHLALWDSNFFTELENKKVEYVVIVENDNVIAAIAAAAPVLKAMHDKKIDILQMAAAITGNAVKTEAAADKNHAIFTYTGGYDVSLSAYIIRVTTALNAADEIIKSGGLSSGFYFEIARIENEMKINAQILDNAAKYVEHDPRLVAEHRFAAAAAAAWARIGPATTIRCPGVKNANTAPLISFFGLFDINVIGLIVILFIMFMLIFNVKSKLLWFLTGTFVTAFI SEQ ID NO: 69 突變牛痘病毒(VV) H3L蛋白 MAAAKTPVIVVPVIDRLPSETFPNVHEHINDQKFDDVKDNEVMAEKRNVVVVKDDPDHYKDYAFIQWTGGNIRNDDKYTHFFSGFCNTMCTEETKRNIARHLALWDSNFFTELENKKVEYVVIVENDNVIEDITFLRPVLKAMHDKKIDILQMREIITGNKVKTELVMDKNHAIFTYTGGYDVSLSAYIIRVTTALNIVDEIIKSGGLSSGFYFEIARIENEMKINRQILDNAAKYVEHDPRLVAEHRFGWMKPNFWFRIGPATVIRCPGVKNANTAPLISFFGLFDINVIGLIVILFIMFMLIFNVKSKLLWFLTGTFVTAFI SEQ ID NO: 70 突變牛痘病毒(VV) D8L蛋白 MPQQLSPINIETKKAISNARLKPLDIHYNESKPTTIQNTGALVAINFAGGYISGGFLPNEYVLSSLHIYWGKEDDYGSNHLIDVYKYSGEINLVHWNAKKYSSYEEAAKHDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIVNQLDSIRSANTSAPFDSVFYLDNLLPSKLDYFTYLGTTINHSADAVWIIFPTPINIHSDQLSKFRTLLSSSNHDGKPHYITENYANPYKLNDDTQVYYSGEIIRAATTSPARENYFMRWLSDLRETCFSYYQKYIEENKTFAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN SEQ ID NO: 71 突變牛痘病毒(VV) D8L蛋白 MPQQLSPINIETKKAISNARLKPLDIHYNESKPTTIQNTGKLFWINFKGGYISGWFLPNEYVLSSLHIYWGKEDDYGSNHLIDVYKYSGEINLVHWNKKKYSSYEEAKKHDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIVNQLDSIRSTNTSAPFDSVFYLDNLLPSKLDYFSYLGTTINHYADAVWIIFPTPINIHSDQLSKYRTLSSSSNHDGKTHYITECYRNLYKLNGDTQVYYSGEIIRAATTSPARENYFMRWLSDLRETCFSYYQKYIEENKTFAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN SEQ ID NO: 72 突變牛痘病毒(VV) D8L蛋白 MPQQLSPINIETKKAISNARLKPLDIHYNESKPTTIQNTGKLAAINFAGGYIAAAFLPNEYVLSSLHIYWGKEDDYGSNHLIDVYKYSGEINLVHWNAKKYSSYEEAAAHDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIVNQLDSIRSGNTSAPFDSVFYLDNLLPSKLDYFAYLGTTINHAADAVWIIFPTPINIHSDQASKARTLASSSAHDGKAHYITEAYANAYKLNADTQVYYSGEIIRAATTSPARENYFMRWLSDLRETCFSYYQKYIEENKTFAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN SEQ ID NO: 73 突變牛痘病毒(VV) A27L蛋白 MDGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKAPEDKAADAAAAAADDNEETLKQRLTNLEKKITNVTTKFEQIEKCCKRNDEVLFRLENHAETLRAAMISLAKKIDVQTGRAAAE SEQ ID NO: 74 突變牛痘病毒(VV) L1R蛋白 MGAAASIQTTVNTLSERISSKLEQAAAASAAAACAIEIGNFYIRQNHGCNLTVKNMCAAAAAAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNALAIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPKQVAGTGVQFYMIVIGVIILAALFMYYAKRMLFTSTNDKIKLILANKENVHWTTYMDTFFRTSPMVIATTDMQN SEQ ID NO: 75 SialF引子 GGCGACCACCCACAGGCAACACCAGCACCTGCCCCA SEQ ID NO: 76 SialR引子 CCGGTTGCGCCTATTCTTGCCGTTCTTGCCGCC SEQ ID NO: 77 人類血小板因子4 (PF4) NGRRICLDLQAPLYKKIIKKLLES SEQ ID NO: 78 人類介白素8 (IL8) GRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS SEQ ID NO: 79 人類抗凝血酶III (AT-III) QIHFFFAKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDKS SEQ ID NO: 80 人類缺輔基蛋白E (ApoE) ELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAG SEQ ID NO: 81 人類血管相關遷移細胞蛋白(AAMP) RRLRRMESESES SEQ ID NO: 82 人類雙調蛋白(AR) KRKKKGGKNGKNTTNTKKKNP SEQ ID NO: 83 SP-Sial-rev TCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTG SEQ ID NO: 84 TM-Sial-fwd TCATCACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATG SEQ ID NO: 85 突變牛痘病毒(VV) D8L蛋白 MPQQLSPINIETKKAISNARLKPLDIHYNESKPTTIQNTGKLLWINFKGGYISGWFLPNEYVLSSLHIYWGKEDDYGSNHLIDVYKYSGEINLVHWNKKKYSSYEEAKKHDDGLIIISIFLQVLDHKNVYFQKIVNQLDSIRSTNTSAPFDSVFYLDNLLPSKLDYFSYLGTTINHYADAVWIIFPTPINIHSDQLSKYRTLSSSSNHDGKTHYITECYRNLYKLNGDTQVYYSGEIIRAATTSPARENYFMRWLSDLRETCFSYYQKYIEENKTFAIIAIVFVFILTAILFFMSRRYSREKQN SEQ ID NO: 86 FAP scFv CDR-L1 RASKSVSTSAYSYMH SEQ ID NO: 87 FAP CDR-L2 LASNLES SEQ ID NO: 88 FAP CDR-L3: QHSRELPYT SEQ ID NO: 89 FAP CDR-H1 ENIIH SEQ ID NO: 90 FAP CDR-H2 WFHPGSGSIKYNEKFKD SEQ ID NO: 91 FAP CDR-H3 HGGTGRGAMDY SEQ ID NO: 92 CD3ε scFv CDR-L1 RASSSVSYMN SEQ ID NO: 93 CD3ε CDR-L2 DTSKVAS SEQ ID NO: 94 CD3ε CDR-L3: QQWSSNPLT SEQ ID NO: 95 CD3ε CDR-H1 RYTMH SEQ ID NO: 96 CD3ε CDR-H2 YINPSRGYTNYNQKFKD SEQ ID NO: 97 CD3ε CDR-H3 YYDDHYCLDY SEQ ID NO: 98 FAP scFv MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTENIIHWVKQRSGQGLEWIGWFHPGSGSIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGGTGRGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGSAQILMTQSPASSVVSLGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIKRAGS SEQ ID NO: 99 CD3ε scFv VDDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS SEQ ID NO: 100 CD3ε/FAP雙特異性免疫細胞銜接體(無信號序列) QVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTENIIHWVKQRSGQGLEWIGWFHPGSGSIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGGTGRGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGSAQILMTQSPASSVVSLGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIKRAGSGGGGSGGGGSGGGGSVDDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS SEQ ID NO: 101 CD3ε/FAP雙特異性免疫細胞銜接體(具信號序列) MDWIWRILFLVGAATGAHSQVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTENIIHWVKQRSGQGLEWIGWFHPGSGSIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAVYFCARHGGTGRGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGSAQILMTQSPASSVVSLGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIKRAGSGGGGSGGGGSGGGGSVDDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKS SEQ ID NO: 102 實例性信號肽序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS SEQ ID NO: 103 實例性信號肽序列 MDWIWRILFLVGAATGAHS SEQ ID NO: 104 IgG Fc結構域胺基酸序列 SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 105 唾液酸酶-IgG Fc-跨膜結構域(無信號肽序列) MGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR SEQ ID NO: 106唾液酸酶-IgG Fc-跨膜結構域(具信號肽序列) MYRMQLLSCIALSLALVTNSMGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR SEQ ID NO: 107 pE/L啟動子 TATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTT SEQ ID NO: 108：Sial-FAP/CD3核酸構築體GGCCGGCCTCATCATGATTTCAGTTCCAGTTTAGTCCCAGCCCCGAAGGTCAGGGGATTAGAGGACCACTGCTGACAATAGTAGGTTGCAGCATCTTCGGCCTCCATGCTTGAAATGGTCAGGCTATATGAAGTCCCACTGCCAGATCCGGAGAACCGGTAGGGGACTCCACTAGCCACCTTAGAGGTGTCATAGATCCATCGCTTTGGAGAAGTCCCGGATTTCTGCTGGTACCAGTTCATATAGCTGACACTAGAGGAGGCCCGGCATGTCATGGTCACTTTTTCGCCAGGGGAAGCTGACATAATGGCGGGAGACTGAGTCAGCTGGATGTCAGAGCCTCCTCCGCCGGAGCCGCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTGACACTGTCAGAGTTGTCCCCTGTCCCCAATAATCCAGACAATAATGATCGTCATAGTAGCGAGCGCAATAGTACACGGCGCTGTCCTCTGATGTCAGACTAGACAGCTGCATGTATGCGGTGGAGCTTGACTTATCGGTAGTCAGAGTAGCCTTGTCTTTAAACTTCTGGTTGTAGTTGGTGTATCCCCTGCTTGGATTAATGTACCCGATCCATTCCAGTCCCTGCCCAGGTCGCTGCTTCACCCAGTGCATTGTGTAGCGAGTGAATGTATAGCCGGAGGTCTTACAGCTCATTTTCACTGATGCTCCTGGTCTAGCCAGCTCTGCTCCAGACTGCTGCAGCTTGATATCGTCGACTGAGCCTCCCCCGCCACTTCCTCCTCCTCCAGATCCTCCTCCTCCGGATCCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCTCCCTACTGTGCTGACAGTAATAGGTTGCAGCATCCTCCTCCTCCACAGGGTGGATGTTGAGGGTGAAGTCTGTCCCAGACCCACTGCCACTGAACCTGGGAGGGACCCCAGATTCTAGGTTGGATGCAAGATAGATGAGGAGTTTGGGTGGCTGTCCTGGTTTCTGTTGGTACCAGTGCATATAACTATAGGCAGATGTACTGACACTTTTGCTGGCCCTGCATGAGATGGTGGCCCTCTGCCCCAGAGATACAACTGAGGAAGCAGGAGACTGGGTCATCAGAATTTGTGCACTACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCACTCGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTAGTCCATAGCTCCTCGCCCAGTTCCTCCGTGTCTTGCACAGAAATAGACCGCAGAGTCTTCAGATGTCAATCTACTAAGCTCCATATAGACTGTGCTGGAGGATTTGTCCGCAGTCAATGTGGCCTTGTCCTTGAATTTCTCATTGTACTTTATACTACCACTTCCAGGGTGAAACCACCCAATCCACTCAAGACCCTGCCCAGACCTCTGCTTTACCCAGTGTATAATATTTTCAGTGAAGGTGTAGCCAGAAGTCTTGCAGGACAGCTTCACTGATGCCCCGGGTTTCACCAGTTCAGCTCCAGACTGCTTCAGCTGCACCTGAGAATGAGCGCCGGTAGCAGCGCCGACGAGGAAGAGGATGCGCCAGATCCAGTCCATTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTCATATGTCATCACTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATGATGAGGATGATAAGGGAGATGATGGTGAGCACCACCAGGGCCAGGATGGCTGAGATCACCACCACCTTAAAGGGCAAGGAGTGTGGCACCACGATGACCTCCTGCGTGTCCTGGCCCACAGCTTTGCCGGGGCTCAGAGACAGAGATTTCTGGGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCATGACGGAGCAGCTGAACACATTGCCTTGTTGCCATCTAGACTTATCCACGGTCAGCTTGGAGTACAGAAAGAAGCTGCCGTCGGAATCGAGCACGGGGGGTGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCGGGCTGTCCGTTGCTTTCCCATTCGACGGCGATGTCGCTAGGGTAGAAGCCTTTCACGAGGCATGTGAGGGACACTTGATTCTTGGTCATCTCCTCTCTAGAGGGAGGGAGGGTATACACTTGAGGTTCCCTAGGCTGGCCCTTGGCCTTGCTGATGGTCTTCTCAATGGGGGCGGGCAGAGCCTTGTTGCTGACCTTGCATTTATACTCTTTGCCGTTCAGCCAGTCTTGGTGCAGCACTGTCAGCACGGACACGACTCTATAGGTGCTGTTATACTGTTCCTCTCTAGGCTTGGTCTTAGCGTTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCGGGGTCTTCATGGGACACATCCACCACCACGCATGTCACCTCGGGTGTTCTAGAAATCATGAGGGTGTCCTTGGGTTTGGGGGGAAACAGAAACACGGAGGGTCCGCCGAGCAGCTCGGGAGCGGGACAAGGAGGGCATGTGTGGGTCTTATCGCAGCTCTTGGGCTCGGCTGGCTTCTGGCCACACTGCTCGCCCAGCCAGTTCATGGTGAAGTTCCGATACCAGATGCCGCCGTAATCGGCGCCATTGTGTGCGTCCTCGCTCAGCAGTCCGATGCTGCCATCAGACTGCACGGCGATTGTGGTGTAGCCCACAAATGGCTCGTGGAACACCTTGGATGTGGTCCAGCTGGCGCCATCGTCGCAGGACATGCTGATTGTGCCTCTGTCCCGGCTCCAAGGCCTTGGGTTTGGAGAGTGGGACAGCAGCAGCACCTTGGCTCTGGGATCGTCTGGGGCGGCATTAGGAAAGGCCCGGATGATCTGGGCGTTATCCACGCTGTCAGGCAGATTCTTATCAGACACGGGCTCGGACCAGGTCTGTCCTCCGTCTGTAGAGTGTGCCACCTTGCGGAAGCCGGAGCCGTCGCTGGCCCTAGAGTTCAGCATCAGGGAGCCATCGCTCAGCTCCACCACCTTATTCTCGTCCATGCCTGTGCCGATTGGGGTGCCTGCCTGCCAGGTCTTGCCGTGATCGTCAGAATACACGGACACGGCCTGCACTGCTCCTCCTGCTGTTCTGATGGTGTACTGCTGCACCAGCCGGCCTGCGTGAGGTCCGTGCTGGATCTGGATGCCCTGTCCGCTTGCTGCGAATCTTGCGGTCCAGGGCTTATCCTTTGTGATGTCGGCTGTGATGGTCCGGTGTGTCCAGGTCCAGCCGTTGTCTGTGCTGGTAGACACCTCGGCCTGGATGATGCCGCGATTCTCAGGATCGGTGCCGCCCCTAGAGCCTCCCCATCCCTGGTCATAGGACTTCACGTGAAAGTTGAAGATTGTGCCGGTCTGGTGATCCACCACATAGCTTGGGTCAGAGTAGCCGACCTTCTTGCCTGTCTCGGTGCCCTGGTGGATGTAGGTAGGGGCGCTCCATGTCTTGCCGCCATCGGTAGATCTCCGCTGCACGATGTGATTAGGGTTTGGTGCGTCGGAGCCTCCATTTCCGTTATCCTTGGGGCGCTCGTCATAGCTGATCAGCAGATCGCCATTTGGGGCTGTGGTGATGGCGGGGATTCTGTAGTTGTCTGTTGCGGTATTTGCTGCCAGGTGCTGTGCCTGGGACATGCTTGCTGGCAGCTCGGTGGAGGCATCTGGGGCAGGTGCTGGTGTTGCCTGTGGGTGGTCGCCCATACTGTTTGTGACAAGTGCAAGACTTAGTGCAATGCAAGACAGGAGTTGCATCCTGTACATTTATAGCATAGAAAAAAACAAAATGAAATTCAAGCTT SEQ ID NO: 109 FAP/CD3免疫細胞銜接體核苷酸序列 TGATTTCAGTTCCAGTTTAGTCCCAGCCCCGAAGGTCAGGGGATTAGAGGACCACTGCTGACAATAGTAGGTTGCAGCATCTTCGGCCTCCATGCTTGAAATGGTCAGGCTATATGAAGTCCCACTGCCAGATCCGGAGAACCGGTAGGGGACTCCACTAGCCACCTTAGAGGTGTCATAGATCCATCGCTTTGGAGAAGTCCCGGATTTCTGCTGGTACCAGTTCATATAGCTGACACTAGAGGAGGCCCGGCATGTCATGGTCACTTTTTCGCCAGGGGAAGCTGACATAATGGCGGGAGACTGAGTCAGCTGGATGTCAGAGCCTCCTCCGCCGGAGCCGCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTGACACTGTCAGAGTTGTCCCCTGTCCCCAATAATCCAGACAATAATGATCGTCATAGTAGCGAGCGCAATAGTACACGGCGCTGTCCTCTGATGTCAGACTAGACAGCTGCATGTATGCGGTGGAGCTTGACTTATCGGTAGTCAGAGTAGCCTTGTCTTTAAACTTCTGGTTGTAGTTGGTGTATCCCCTGCTTGGATTAATGTACCCGATCCATTCCAGTCCCTGCCCAGGTCGCTGCTTCACCCAGTGCATTGTGTAGCGAGTGAATGTATAGCCGGAGGTCTTACAGCTCATTTTCACTGATGCTCCTGGTCTAGCCAGCTCTGCTCCAGACTGCTGCAGCTTGATATCGTCGACTGAGCCTCCCCCGCCACTTCCTCCTCCTCCAGATCCTCCTCCTCCGGATCCCGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCTCCCTACTGTGCTGACAGTAATAGGTTGCAGCATCCTCCTCCTCCACAGGGTGGATGTTGAGGGTGAAGTCTGTCCCAGACCCACTGCCACTGAACCTGGGAGGGACCCCAGATTCTAGGTTGGATGCAAGATAGATGAGGAGTTTGGGTGGCTGTCCTGGTTTCTGTTGGTACCAGTGCATATAACTATAGGCAGATGTACTGACACTTTTGCTGGCCCTGCATGAGATGGTGGCCCTCTGCCCCAGAGATACAACTGAGGAAGCAGGAGACTGGGTCATCAGAATTTGTGCACTACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCACTCGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTAGTCCATAGCTCCTCGCCCAGTTCCTCCGTGTCTTGCACAGAAATAGACCGCAGAGTCTTCAGATGTCAATCTACTAAGCTCCATATAGACTGTGCTGGAGGATTTGTCCGCAGTCAATGTGGCCTTGTCCTTGAATTTCTCATTGTACTTTATACTACCACTTCCAGGGTGAAACCACCCAATCCACTCAAGACCCTGCCCAGACCTCTGCTTTACCCAGTGTATAATATTTTCAGTGAAGGTGTAGCCAGAAGTCTTGCAGGACAGCTTCACTGATGCCCCGGGTTTCACCAGTTCAGCTCCAGACTGCTTCAGCTGCACCTGAGAATGAGCGCCGGTAGCAGCGCCGACGAGGAAGAGGATGCGCCAGATCCAGTCCAT SEQ ID NO: 110 編碼Sial-IgG Fc-跨膜結構域之核苷酸序列 CTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGCATGATGAGGATGATAAGGGAGATGATGGTGAGCACCACCAGGGCCAGGATGGCTGAGATCACCACCACCTTAAAGGGCAAGGAGTGTGGCACCACGATGACCTCCTGCGTGTCCTGGCCCACAGCTTTGCCGGGGCTCAGAGACAGAGATTTCTGGGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCATGACGGAGCAGCTGAACACATTGCCTTGTTGCCATCTAGACTTATCCACGGTCAGCTTGGAGTACAGAAAGAAGCTGCCGTCGGAATCGAGCACGGGGGGTGTGGTCTTGTAGTTGTTCTCGGGCTGTCCGTTGCTTTCCCATTCGACGGCGATGTCGCTAGGGTAGAAGCCTTTCACGAGGCATGTGAGGGACACTTGATTCTTGGTCATCTCCTCTCTAGAGGGAGGGAGGGTATACACTTGAGGTTCCCTAGGCTGGCCCTTGGCCTTGCTGATGGTCTTCTCAATGGGGGCGGGCAGAGCCTTGTTGCTGACCTTGCATTTATACTCTTTGCCGTTCAGCCAGTCTTGGTGCAGCACTGTCAGCACGGACACGACTCTATAGGTGCTGTTATACTGTTCCTCTCTAGGCTTGGTCTTAGCGTTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGAACTTGACCTCGGGGTCTTCATGGGACACATCCACCACCACGCATGTCACCTCGGGTGTTCTAGAAATCATGAGGGTGTCCTTGGGTTTGGGGGGAAACAGAAACACGGAGGGTCCGCCGAGCAGCTCGGGAGCGGGACAAGGAGGGCATGTGTGGGTCTTATCGCAGCTCTTGGGCTCGGCTGGCTTCTGGCCACACTGCTCGCCCAGCCAGTTCATGGTGAAGTTCCGATACCAGATGCCGCCGTAATCGGCGCCATTGTGTGCGTCCTCGCTCAGCAGTCCGATGCTGCCATCAGACTGCACGGCGATTGTGGTGTAGCCCACAAATGGCTCGTGGAACACCTTGGATGTGGTCCAGCTGGCGCCATCGTCGCAGGACATGCTGATTGTGCCTCTGTCCCGGCTCCAAGGCCTTGGGTTTGGAGAGTGGGACAGCAGCAGCACCTTGGCTCTGGGATCGTCTGGGGCGGCATTAGGAAAGGCCCGGATGATCTGGGCGTTATCCACGCTGTCAGGCAGATTCTTATCAGACACGGGCTCGGACCAGGTCTGTCCTCCGTCTGTAGAGTGTGCCACCTTGCGGAAGCCGGAGCCGTCGCTGGCCCTAGAGTTCAGCATCAGGGAGCCATCGCTCAGCTCCACCACCTTATTCTCGTCCATGCCTGTGCCGATTGGGGTGCCTGCCTGCCAGGTCTTGCCGTGATCGTCAGAATACACGGACACGGCCTGCACTGCTCCTCCTGCTGTTCTGATGGTGTACTGCTGCACCAGCCGGCCTGCGTGAGGTCCGTGCTGGATCTGGATGCCCTGTCCGCTTGCTGCGAATCTTGCGGTCCAGGGCTTATCCTTTGTGATGTCGGCTGTGATGGTCCGGTGTGTCCAGGTCCAGCCGTTGTCTGTGCTGGTAGACACCTCGGCCTGGATGATGCCGCGATTCTCAGGATCGGTGCCGCCCCTAGAGCCTCCCCATCCCTGGTCATAGGACTTCACGTGAAAGTTGAAGATTGTGCCGGTCTGGTGATCCACCACATAGCTTGGGTCAGAGTAGCCGACCTTCTTGCCTGTCTCGGTGCCCTGGTGGATGTAGGTAGGGGCGCTCCATGTCTTGCCGCCATCGGTAGATCTCCGCTGCACGATGTGATTAGGGTTTGGTGCGTCGGAGCCTCCATTTCCGTTATCCTTGGGGCGCTCGTCATAGCTGATCAGCAGATCGCCATTTGGGGCTGTGGTGATGGCGGGGATTCTGTAGTTGTCTGTTGCGGTATTTGCTGCCAGGTGCTGTGCCTGGGACATGCTTGCTGGCAGCTCGGTGGAGGCATCTGGGGCAGGTGCTGGTGTTGCCTGTGGGTGGTCGCCCATACTGTTTGTGACAAGTGCAAGACTTAGTGCAATGCAAGACAGGAGTTGCATCCTGTACAT SEQ ID NO: 117 D004 VH (CDR序列加下劃線) EVQLQQSGPELVKPGASLKIPCRASGYTFT DYNMDWVKQSHGKSLEWIG DINPNNGGTISNQKFKGKATLTVDKSSSTASMELRSLTSEDTAVYYCAI RRYYGNHWYFDVWGTGTSVTVSS SEQ ID NO: 118 D004 VL (CDR序列加下劃線) DIRMTQSPSSMYASLGERVTIAC KASQDINIYLSWFQQKPGTSPKTLIY RANRLMDGVPSRFSASGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYC LQYDEFPPTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 119 D004 scFv MYRMQLLSCIALSLALVTNSDIRMTQSPSSMYASLGERVTIACKASQDINIYLSWFQQKPGTSPKTLIYRANRLMDGVPSRFSASGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPPTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASLKIPCRASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTISNQKFKGKATLTVDKSSSTASMELRSLTSEDTAVYYCAIRRYYGNHWYFDVWGTGTSVTVSS SEQ ID NO: 120 D004 CAR MYRMQLLSCIALSLALVTNSDIRMTQSPSSMYASLGERVTIACKASQDINIYLSWFQQKPGTSPKTLIYRANRLMDGVPSRFSASGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPPTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASLKIPCRASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTISNQKFKGKATLTVDKSSSTASMELRSLTSEDTAVYYCAIRRYYGNHWYFDVWGTGTSVTVSSTRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 121 IL15 MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINT 儘管本文已展示及所闡述某些實施例，但熟習此項技術者應明瞭，該等實施例僅藉由實例方式來提供。熟習此項技術者現將構想出諸多變化、改變及代替，此並不背離本發明。應理解，可採用本文所闡述揭示內容之實施例之各種替代方式來實踐本發明。下列申請專利範圍意欲界定本發明範圍並由此覆蓋該等申請專利範圍及其等效形式範圍內之方法及結構。
圖 1 ：藉由螢光顯微術檢測A549及MCF細胞上之2,6唾液酸(藉由FITC-SNA)。固定A549及MCF細胞並在37℃下與FITC-SNA一起培育一小時，然後在螢光顯微鏡下成像以展示經FITC-SNA標記之細胞(左圖)並與亮視野細胞疊對(右圖)。
圖 2 ：藉由DAS181處理有效去除A549細胞上之2,6唾液酸、2,3唾液酸且暴露半乳糖。使用DAS181在37℃下將A549處理兩小時並與染色試劑一起培育一小時，然後在螢光顯微鏡下成像以展示腫瘤細胞上之唾液酸之有效去除。
圖 3 ：藉由DAS181處理有效去除A549細胞上之2,6唾液酸，但藉由DAS185處理則不能。使用DAS181在37℃下將A549處理30分鐘或兩小時並與FITC-SNA一起培育一小時，然後使用流式細胞術檢驗以展示腫瘤細胞上之2,6唾液酸之有效去除。
圖 4 ：藉由DAS181處理有效去除A549細胞上之2,3唾液酸，但藉由DAS185處理則不能。使用DAS181在37℃下將A549處理30分鐘或兩小時並與FITC-MALII一起培育一小時，然後使用流式細胞術檢驗以展示腫瘤細胞上之2,3唾液酸之有效去除。
圖 5 ：藉由DAS181處理有效暴露A549細胞上之半乳糖，但藉由DAS185處理則不能。使用DAS181在37℃下將A549處理30分鐘或兩小時並與FITC-PNA一起培育一小時，然後使用流式細胞術檢驗以展示腫瘤細胞上之半乳糖之有效暴露。
圖 6 ：DAS181處理及PBMC刺激方案並不影響A549-紅細胞增殖。以2k/孔過夜接種A549-紅細胞，隨後更換含有左側所列示試劑之培養基。在添加試劑之後立即(0 hr)開始藉由IncuCyte進行掃描且每3 hr安排一次。藉由分析細胞核(紅血球)計數來監測A549-紅細胞增殖。動力學讀出揭示，在不存在PBMC下，媒劑、DAS181或各種刺激試劑對A549細胞增殖並無效應。
圖 7 ：在或不在DAS181處理下於與來自供體1之PBMC一起共培養後A549-紅細胞中之細胞毒性檢測。該等結果展示，DAS181處理顯著加強了來自供體1之PBMC之抗腫瘤細胞毒性。以2k/孔過夜接種A549-紅細胞，隨後與100K/孔之供體-1 PBMC (E:T=50:1)在培養基(不活化)、CD3+CD28+IL-2 (T細胞活化)或CD3+CD29+IL-2+IL-15+IL-21 (T細胞及NK細胞活化)存在下一起共培養。藉由IncuCyte在0 hr及添加PBMC後72 hr時獲取代表性影像。
圖 8 ：在或不在DAS181處理下於與來自供體2之PBMC一起共培養後A549-紅細胞中之細胞毒性檢測。該等結果展示，DAS181處理顯著加強了來自供體2之PBMC之抗腫瘤細胞毒性。以2k/孔過夜接種A549-紅細胞，隨後與100k/孔之供體-1 PBMC (E:T=50:1)在培養基(不活化)、CD3+CD28+IL-2 (T細胞活化)或CD3+CD29+IL-2+IL-15+IL-21 (T細胞及NK細胞活化)存在下一起共培養。藉由IncuCyte在0 hr及添加PBMC後72 hr時獲取代表性影像。
圖 9A-9C ：在或不在DAS181處理下於與來自供體1之PBMC一起共培養後A549-紅細胞中之細胞毒性檢測。該等結果展示，DAS181處理顯著加強了來自供體1之PBMC之抗腫瘤細胞毒性。以2k個細胞/孔將A549腫瘤紅血球接種於96孔板中。在過夜培育之後，以指示E:T比率將與(A)培養基、(B) CD3/CD28/IL-2或(C) CD3/CD28/IL-2/IL-15/IL-21混合之來自供體1之PBMC添加至每一孔中。同時，添加DAS 181 (100 nM)。每3hr藉由IncuCyte掃描板且持續總共72hr。藉由分析RFP細胞計數來監測增殖。
圖 10A-10C ：在或不在DAS181處理下於與來自供體2之PBMC一起共培養後A549-紅細胞中之細胞毒性檢測。該等結果展示，DAS181處理顯著加強了來自供體2之PBMC之抗腫瘤細胞毒性。以2k個細胞/孔將A549腫瘤紅血球接種於96孔板中。在過夜培育之後，以指示E:T比率將與(A)培養基、(B) CD3/CD28/IL-2或(C) CD3/CD28/IL-2/IL-15/IL-21混合之來自供體2之PBMC添加至每一孔中。同時，添加DAS 181 (100 nM)。每3hr藉由IncuCyte掃描板且持續總共72hr。藉由分析RFP細胞計數來監測增殖。
圖 11 ：DAS181增強了牛痘病毒之NK介導之腫瘤溶解，如藉由MTS分析所量測。⍟ =T測試P值＜0.05，其表明，與死酶DAS185相比，僅DAS181可加強NK細胞介導之活體外U87腫瘤殺死。* = T測試P值＜0.05。
圖 12 ：DAS181增加了牛痘病毒之NK介導之腫瘤殺死，如藉由MTS分析所量測。* = T測試P值＜0.05，此表明，DAS181增加了VV之NK細胞介導之活體外U87細胞殺死。
圖 13 ：DAS181顯著增強了單獨培養或暴露於經VV感染之腫瘤細胞之人類DC細胞中之成熟標記物(CD80、CD86、HLA-Dr、HLA-ABC)的表現。* = T測試P值＜0.05。
圖 14 ：DAS181顯著增強了THP-1源巨噬細胞之TNF-α產生。* = T測試P值＜0.05。
圖 15 ：DAS181處理促進了溶瘤腺病毒介導之腫瘤細胞殺死及生長禁止。以2K個細胞/孔將549腫瘤紅血球接種於96孔板中。在過夜培育之後，如所指示，添加DAS181媒劑、溶瘤腺病毒及DAS181。亦以前述量將CD3/CD28/IL-2添加至每一孔中。圖形展示，DAS181 +溶瘤腺病毒會有效減少腫瘤細胞增殖。
圖 16A-16B ：DAS181處理增強了溶瘤病毒之PBMC介導之腫瘤細胞殺死。以2K個細胞/孔將549腫瘤紅血球接種於96孔板中。在過夜培育之後，以10K/孔(A)或40K/孔(B)之密度添加新鮮PBMC。如圖形中所指示添加CD3、CD28、IL-2、DAS181及溶瘤腺病毒，隨後藉由IncuCyte定時掃描。圖形展示，DAS181 +溶瘤腺病毒會顯著增強人類PBMC介導之腫瘤細胞根除。
圖 17 ：編碼唾液酸酶之牛痘病毒構築體之一部分之示意圖。
圖 18A-18B ：由唾液酸酶-VV表現之DAS181具有針對含有唾液酸之受質之活體外活性。(A) 0.5 nM、1 nM及2 nM下之DAS181活性之標準曲線。(B) 1×10 6個感染唾液酸酶-VV之細胞在活體外於1ml培養基中表現等效於0.78nM - 1.21 nM DAS181之DAS181。
圖 19 ：唾液酸酶-VV增強樹突狀細胞成熟。將GM-CSF/IL4源人類DC與感染Sial-VV或VV之U87腫瘤細胞溶解物一起培養24小時。使用LPS作為對照。收集DC並使用針對CD80、CD86、HLA-DR及HLA-ABC之抗體染色。藉由流動分析來測定DC成熟標記物之表現。結果表明，Sial-VV增強DC成熟。* = T測試P值＜0.05。
圖 20 ：唾液酸酶-VV誘導T細胞之IFN-γ及IL2表現。將經CD3抗體活化之人類T細胞與A594腫瘤細胞在感染Sial-VV-或VV之腫瘤細胞溶解物存在下一起共培養24小時，且藉由ELISA量測細胞介素IFNγ或IL-2表現。結果表明，感染Sial-VV之腫瘤細胞溶解物誘導人類T細胞之IFNγ及IL2表現。* = T測試P值＜0.05。
圖 21 ：唾液酸酶-VV增強T細胞介導之腫瘤細胞溶解活性。將經CD3 Ab活化之人類T細胞與感染Sial-VV-或VV之A594腫瘤細胞一起共培養24小時，且藉由MTS分析來測定腫瘤細胞活力。結果表明，腫瘤細胞之Sial-VV感染會增強腫瘤殺死。* = T測試P值＜0.05。
圖 22A-22C ：DAS181及分泌型唾液酸酶構築體1、2及3對細胞表面α2,3唾液酸(圖22A)、α2,6唾液酸(圖22B)及半乳糖(圖22C)之影響。 圖 22A：藉由構築體-1、2或3轉染A549-紅細胞。在過夜培育之後，提取轉染細胞並再接種於24孔板中。再過24hr、48hr及72hr之後，固定細胞並使用MALII-FITC染色1hr，然後實施流動分析。使用100nM DAS181將未轉染細胞處理2hr，然後固定。使用備用於DAS181之媒劑處理另一組未轉染細胞以作為對照。圖22B：藉由構築體-1、2及3轉染A549-紅細胞。在過夜培育之後，提取轉染細胞並再接種於24孔板中。再過24hr、48hr及72hr之後，固定細胞並使用SNA-FITC染色1hr，然後實施流動分析。使用100nM DAS181將未轉染細胞處理2hr，然後固定。使用備用於DAS181之媒劑處理另一組未轉染細胞以作為對照。圖22C：藉由構築體-1、2及3轉染A549-紅細胞。在過夜培育之後，提取轉染細胞並再接種於24孔板中。再過24hr、48hr及72hr之後，固定細胞並使用PNA-FITC染色1hr，然後實施流動分析。使用100nM DAS181將未轉染細胞處理2hr，然後固定。使用備用於DAS181之媒劑處理另一組未轉染細胞以作為對照。
圖 23A-23C ：DAS181及跨膜唾液酸酶構築體1、4、5及6對細胞表面α2,3唾液酸(圖23A)、α2,6唾液酸(圖23B)及半乳糖(圖23C)之影響。圖23A：藉由構築體-1、4、5及6轉染A549-紅細胞。在過夜培育之後，提取轉染細胞並再接種於24孔板中。再過24hr、48hr及72hr之後，固定細胞並使用生物素化MALII染色1hr，隨後使用FITC-鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)再染色1hr。藉由流式細胞術檢測2, 3-唾液酸含量。圖23B：藉由構築體-1、4、5及6轉染A549-紅細胞。在過夜培育之後，提取轉染細胞並再接種於24孔板中。在額外之24hr、48hr及72hr內，固定細胞並使用SNA-FITC染色1hr。藉由流式細胞術檢測2, 6-唾液酸含量。圖23C：藉由構築體-1、4、5及6轉染A549-紅細胞。在過夜培育之後，提取轉染細胞並再接種於24孔板中。再過24hr、48hr及72hr之後，固定細胞並使用PNA-FITC染色1hr。藉由流式細胞術檢測半乳糖含量。
圖 24 ：構築體1之穩定表現增加了溶瘤病毒及PBMC介導之A549細胞殺死。將新分離PBMC與僅A549親代紅血球或與穩定表現構築體-1之細胞或穩定表現構築體-1之細胞以1MOI或5MOI在兩個分開板(板2及4)上一起培育。
圖 25 ：構築體4之穩定表現增加了溶瘤病毒及PBMC介導之A549細胞殺死。活化新分離PBMC並與僅A549-紅細胞或與穩定表現構築體-4之細胞或穩定表現構築體-4之細胞以1MOI或5MOI OL在兩個分開板(板2及4)上一起培育。
圖 26 ：用於重組至Western Reserve VV之TK基因中以生成編碼唾液酸酶之溶瘤病毒之實例性唾液酸酶表現構築體的設計。展示細胞內唾液酸酶、具有錨定結構域之分泌型唾液酸酶及具有跨膜結構域之細胞表面表現之唾液酸酶之實例性構築體。
圖 27 ：唾液酸酶表現之PCR檢測：使用唾液酸酶-VV以MOI 0.2來感染CV-1細胞。在48小時之後，收集CV-1細胞，且使用Wizard® SV基因體DNA純化系統提取DNA且用作唾液酸酶PCR擴增之模板。使用標準PCR方案實施PCR。預期PCR產物大小為1251bp。
圖 28 ：使用對照VV、SP-Sial-VV、Endo-Sial-VV或TM-Sial-VV以MOI 1來感染U87或CV-1細胞。在24、48、72或96小時時收集細胞。藉由蝕斑分析來測定病毒效價。
圖 29 ：使用對照VV、SP-Sial-VV、Endo-Sial-VV或TM-Sial-VV以MOI 0.1、1或5來感染U87腫瘤細胞。藉由MTS分析來量測腫瘤殺死。
圖 30 ：藉由與編碼分泌型或跨膜唾液酸酶之溶瘤病毒一起培養來增強DC成熟標記物HLA-ABC之表現。
圖 31 ：藉由與編碼分泌型或跨膜唾液酸酶之溶瘤病毒一起培養來增強DC成熟標記物HLA-DR之表現。
圖 32 ：藉由與編碼分泌型或跨膜唾液酸酶之溶瘤病毒一起培養來增強DC成熟標記物CD80之表現。
圖 33 ：藉由與編碼分泌型或跨膜唾液酸酶之溶瘤病毒一起培養來增強DC成熟標記物CD86之表現。
圖 34 ：Sial-VV在活體外增強了NK介導之腫瘤溶解。共培養負向選擇之人類NK細胞(Astarte, WA)及VV-U87細胞(ATCC, VA)，且藉由LDH分析(Abcam, MA)來量測腫瘤殺死效能。結果表明，Sial-VV在活體外增強了NK細胞介導之U87腫瘤殺死。(* P值，U87及NK培養物中之Sial-VV對模擬VV)。
圖 35 ：結果指示，與對照VV相比，TM-sial-VV顯著抑制活體內腫瘤生長(腫瘤細胞接種於小鼠之右側腹中)。
圖 36 ：結果指示，與對照VV相比，TM-sial-VV顯著抑制活體內腫瘤生長(腫瘤細胞接種於小鼠之左側腹中)。
圖 37 ：小鼠體重不受使用Sial-VV或VV之處理影響。結果並不展示小鼠體重之差異。
圖 38A-38B ：帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之CD8+及CD4+ T細胞浸潤。* p值：治療組對對照VV組。圖38A展示結果之量化。圖38B展示FACS繪圖。
圖 39 ：與對照VV相比，TM-Sial-VV降低了腫瘤內之Treg/CD4+ T細胞之比率。* p值：治療組對對照VV組。
圖 40 ：帶有唾液酸酶之溶瘤牛痘病毒顯著增強腫瘤內之NK及NKT細胞浸潤。* p值：治療組對對照VV組。
圖 41 ：TM-Sial-VV顯著增加腫瘤細胞內之PD-L1表現(p ＜0.05)。
圖 42A-42B ：結果指示，包括編碼唾液酸酶及雙特異性免疫細胞銜接體之核苷酸序列之實例性溶瘤病毒(vvDD-Sial-FAP/CD3)減小了細胞表面上之α-2,6-唾液酸鍵聯之含量。
圖 43 ：結果指示，在Jurkat效應T細胞存在下，vvDD-Sial-FAP/CD3誘導A549之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)路徑T細胞活化。
圖 44A-44B：在Jurkat細胞存在下，與FAP陰性A549細胞( 圖 44B)相比，來自感染vvDD-Sial-FAP/CD3之A549細胞之條件化培養基誘導增加了FAP陽性COLO829結腸癌細胞( 圖 44A)之ADCC路徑T細胞活化。
圖 45 ：在PBMC存在下，使用vvDD-Sial-FAP/CD3感染與表現FAP之正常人類真皮纖維母細胞混合之HCT116人類結腸癌細胞使得LDH顯著高於模擬感染或vvDD感染細胞。
圖 46A-46C ：模擬感染與正常人類真皮纖維母細胞(NhDF)一起共培養之A549人類肺腺癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.1 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)添加周邊血單核細胞(PBMC)。一天後，收穫細胞且使用流式細胞術分析CD4+ ( 圖 46A)及CD8+ ( 圖 46B) T細胞上之CD25活化標記物之表現。使用ELISA分析上清液之顆粒酶B釋放( 圖 46C)。
圖 47A-47B ：模擬感染與正常人類真皮纖維母細胞(NhDF)一起共培養之HCT116人類結腸癌細胞或HCC1143人類乳癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.1 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)添加周邊血單核細胞(PBMC)。兩天後，收穫細胞且使用流式細胞術分析CD4+ ( 圖 47A)及CD8+ ( 圖 47B) T細胞上之活化標記物CD69及CD25之表現。
圖 48 ：模擬感染與癌症相關纖維母細胞(CAF)一起共培養之A549人類肺腺癌細胞或使用分別表現綠色螢光蛋白或黃色螢光蛋白之vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.3 pfu/細胞進行感染。藉由成像監測GFP或YFP之表現。螢光蛋白之強度增加指示了腫瘤球體內之病毒擴散。
圖 49 ：模擬感染與癌症相關纖維母細胞(CAF)一起共培養之A549人類肺腺癌細胞或使用vvDD或vvDD-Sial-FAP/CD3以0.3 pfu/細胞進行感染。第二天，以10:1 (效應物:靶)添加由CellTracker DeepRed標記之周邊血單核細胞(PBMC)。展示在添加PBMC之後兩天獲取之影像。使用vvDD-Sial-FAP/CD3進行感染可增加腫瘤球體之核心中之紅色螢光，從而指示腫瘤浸潤性淋巴球有所增加。
圖 50A展示DAS181 CAR及CD19 CAR構築體之示意圖。
圖 50B展示293T細胞中之DAS181-生物素蛋白與包括各種scFv純系之DAS181 CAR (D004)之結合。
圖 50C-50D展示各種DAS181 CAR (D004)向293T細胞之轉導效率，如藉由抗小鼠Fab染色(圖50C)及蛋白質L染色(圖50D)所測定。
圖 51A展示NT、CD19 CAR及DAS181 CAR (D004) NK細胞之轉導率。
圖 51B展示NT NK、CD19 CAR NK及DAS181 CAR (D004) NK試樣中之總細胞計數。
圖 51C展示NT、CD19 CAR及DAS181 CAR (D004) NK細胞之轉導率。
圖 52 展示，DAS181 CAR NK細胞針對表現Tm-Fc-唾液酸酶之A549腫瘤細胞之抗腫瘤效應強於針對表現Tm-唾液酸酶之A549腫瘤細胞者。
圖 53展示，DAS181 CAR NK細胞針對表現Tm-Fc-唾液酸酶之A375腫瘤細胞之抗腫瘤效應強於針對表現Tm-唾液酸酶之A375腫瘤細胞者。
圖 54展示，在第二腫瘤再攻擊測試中，DAS181 CAR NK細胞展現強於CAR19 CAR NK細胞及NT NK細胞之針對表現膜唾液酸酶之A549及A375腫瘤細胞之抗腫瘤效應。
圖 55展示，在第二腫瘤再攻擊測試中，DAS181 CAR NK細胞展現強於CAR19 CAR NK細胞及NT NK細胞之針對表現膜唾液酸酶之A375腫瘤細胞之抗腫瘤效應。
圖 56展示，在不同NK劑量下，DAS181 CAR NK細胞控制腫瘤之有效性大於NT及CD19 CAR NK細胞 。
圖 57展示，DAS181 CAR NK細胞在活體外較未轉導(NT) NK細胞持續更長時間。在此實驗中，將細胞培養物定期維持於完整NK培養基中，除非並無IL15細胞介素支持。
圖 58展示，表現膜唾液酸酶之腫瘤細胞並不穩定。
圖 59展示，A375腫瘤細胞在傳代之後其膜唾液酸酶表現含量有所增加。
圖 60展示，A549腫瘤細胞在傳代之後其膜唾液酸酶表現含量有所增加。
圖 61展示表現膜唾液酸酶之A375及A549腫瘤細胞之去唾液酸化。 

          <![CDATA[<110> 美商安迅生物製藥公司(Ansun Biopharma Inc.)]]>
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          Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
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                      20                  25                  30          
          Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
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          Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
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          Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
                  115                 120                 125             
          Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
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          145                 150                 155                 160 
          Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
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          Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
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          His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
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          Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
          225                 230                 235                 240 
          Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
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          Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu
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          Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
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          Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
          65                  70                  75                  80  
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              130                 135                 140                 
          Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
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          Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
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          Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
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          Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
                          325                 330                 335     
          Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
                      340                 345                 350         
          Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
              370                 375                 380                 
          Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg Lys Lys Lys Gly
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          Asn Asp Phe Gly Leu Val Gln Pro Leu Val Thr Met Glu Gln Leu Leu
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                          85                  90                  95      
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                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Gly Ser Val Val Ile Asn Ala Arg Asn Gln Asn Asn Tyr His Cys His
                  275                 280                 285             
          Cys Arg Ile Val Leu Arg Ser Tyr Asp Ala Cys Asp Thr Leu Arg Pro
              290                 295                 300                 
          Arg Asp Val Thr Phe Asp Pro Glu Leu Val Asp Pro Val Val Ala Ala
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ala Val Val Thr Ser Ser Gly Ile Val Phe Phe Ser Asn Pro Ala
                          325                 330                 335     
          His Pro Glu Phe Arg Val Asn Leu Thr Leu Arg Trp Ser Phe Ser Asn
                      340                 345                 350         
          Gly Thr Ser Trp Arg Lys Glu Thr Val Gln Leu Trp Pro Gly Pro Ser
                  355                 360                 365             
          Gly Tyr Ser Ser Leu Ala Thr Leu Glu Gly Ser Met Asp Gly Glu Glu
              370                 375                 380                 
          Gln Ala Pro Gln Leu Tyr Val Leu Tyr Glu Lys Gly Arg Asn His Tyr
          385                 390                 395                 400 
          Thr Glu Ser Ile Ser Val Ala Lys Ile Ser Val Tyr Gly Thr Leu
                          405                 410                 415 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 380]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Met Ala Ser Leu Pro Val Leu Gln Lys Glu Ser Val Phe Gln Ser Gly
           1               5                  10                  15      
          Ala His Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Tyr Leu Pro Gly Gln Gln
                      20                  25                  30          
          Ser Leu Leu Ala Phe Ala Glu Gln Arg Ala Ser Lys Lys Asp Glu His
                  35                  40                  45              
          Ala Glu Leu Ile Val Leu Arg Arg Gly Asp Tyr Asp Ala Pro Thr His
              50                  55                  60                  
          Gln Val Gln Trp Gln Ala Gln Glu Val Val Ala Gln Ala Arg Leu Asp
          65                  70                  75                  80  
          Gly His Arg Ser Met Asn Pro Cys Pro Leu Tyr Asp Ala Gln Thr Gly
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Phe Leu Phe Phe Ile Ala Ile Pro Gly Gln Val Thr Glu Gln
                      100                 105                 110         
          Gln Gln Leu Gln Thr Arg Ala Asn Val Thr Arg Leu Cys Gln Val Thr
                  115                 120                 125             
          Ser Thr Asp His Gly Arg Thr Trp Ser Ser Pro Arg Asp Leu Thr Asp
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ile Gly Pro Ala Tyr Arg Glu Trp Ser Thr Phe Ala Val Gly
          145                 150                 155                 160 
          Pro Gly His Cys Leu Gln Leu His Asp Arg Ala Arg Ser Leu Val Val
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Tyr Ala Tyr Arg Lys Leu His Pro Ile Gln Arg Pro Ile Pro
                      180                 185                 190         
          Ser Ala Phe Cys Phe Leu Ser His Asp His Gly Arg Thr Trp Ala Arg
                  195                 200                 205             
          Gly His Phe Val Ala Gln Asp Thr Leu Glu Cys Gln Val Ala Glu Val
              210                 215                 220                 
          Glu Thr Gly Glu Gln Arg Val Val Thr Leu Asn Ala Arg Ser His Leu
          225                 230                 235                 240 
          Arg Ala Arg Val Gln Ala Gln Ser Thr Asn Asp Gly Leu Asp Phe Gln
                          245                 250                 255     
          Glu Ser Gln Leu Val Lys Lys Leu Val Glu Pro Pro Pro Gln Gly Cys
                      260                 265                 270         
          Gln Gly Ser Val Ile Ser Phe Pro Ser Pro Arg Ser Gly Pro Gly Ser
                  275                 280                 285             
          Pro Ala Gln Trp Leu Leu Tyr Thr His Pro Thr His Ser Trp Gln Arg
              290                 295                 300                 
          Ala Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Asn Pro Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ala
          305                 310                 315                 320 
          Trp Ser Glu Pro Val Leu Leu Ala Lys Gly Ser Cys Ala Tyr Ser Asp
                          325                 330                 335     
          Leu Gln Ser Met Gly Thr Gly Pro Asp Gly Ser Pro Leu Phe Gly Cys
                      340                 345                 350         
          Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Tyr Glu Glu Ile Val Phe Leu Met Phe Thr
                  355                 360                 365             
          Leu Lys Gln Ala Phe Pro Ala Glu Tyr Leu Pro Gln
              370                 375                 380 
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 428]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Met Glu Glu Val Thr Thr Cys Ser Phe Asn Ser Pro Leu Phe Arg Gln
           1               5                  10                  15      
          Glu Asp Asp Arg Gly Ile Thr Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Tyr Ile
                      20                  25                  30          
          Pro Pro Thr His Thr Phe Leu Ala Phe Ala Glu Lys Arg Ser Thr Arg
                  35                  40                  45              
          Arg Asp Glu Asp Ala Leu His Leu Val Leu Arg Arg Gly Leu Arg Ile
              50                  55                  60                  
          Gly Gln Leu Val Gln Trp Gly Pro Leu Lys Pro Leu Met Glu Ala Thr
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Gly His Arg Thr Met Asn Pro Cys Pro Val Trp Glu Gln Lys
                          85                  90                  95      
          Ser Gly Cys Val Phe Leu Phe Phe Ile Cys Val Arg Gly His Val Thr
                      100                 105                 110         
          Glu Arg Gln Gln Ile Val Ser Gly Arg Asn Ala Ala Arg Leu Cys Phe
                  115                 120                 125             
          Ile Tyr Ser Gln Asp Ala Gly Cys Ser Trp Ser Glu Val Arg Asp Leu
              130                 135                 140                 
          Thr Glu Glu Val Ile Gly Ser Glu Leu Lys His Trp Ala Thr Phe Ala
          145                 150                 155                 160 
          Val Gly Pro Gly His Gly Ile Gln Leu Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Tyr Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Trp Phe Phe Cys Phe Gln Leu
                      180                 185                 190         
          Pro Cys Lys Thr Arg Pro His Ser Leu Met Ile Tyr Ser Asp Asp Leu
                  195                 200                 205             
          Gly Val Thr Trp His His Gly Arg Leu Ile Arg Pro Met Val Thr Val
              210                 215                 220                 
          Glu Cys Glu Val Ala Glu Val Thr Gly Arg Ala Gly His Pro Val Leu
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Cys Ser Ala Arg Thr Pro Asn Arg Cys Arg Ala Glu Ala Leu Ser
                          245                 250                 255     
          Thr Asp His Gly Glu Gly Phe Gln Arg Leu Ala Leu Ser Arg Gln Leu
                      260                 265                 270         
          Cys Glu Pro Pro His Gly Cys Gln Gly Ser Val Val Ser Phe Arg Pro
                  275                 280                 285             
          Leu Glu Ile Pro His Arg Cys Gln Asp Ser Ser Ser Lys Asp Ala Pro
              290                 295                 300                 
          Thr Ile Gln Gln Ser Ser Pro Gly Ser Ser Leu Arg Leu Glu Glu Glu
          305                 310                 315                 320 
          Ala Gly Thr Pro Ser Glu Ser Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Thr Ser
                          325                 330                 335     
          Arg Lys Gln Arg Val Asp Leu Gly Ile Tyr Leu Asn Gln Thr Pro Leu
                      340                 345                 350         
          Glu Ala Ala Cys Trp Ser Arg Pro Trp Ile Leu His Cys Gly Pro Cys
                  355                 360                 365             
          Gly Tyr Ser Asp Leu Ala Ala Leu Glu Glu Glu Gly Leu Phe Gly Cys
              370                 375                 380                 
          Leu Phe Glu Cys Gly Thr Lys Gln Glu Cys Glu Gln Ile Ala Phe Arg
          385                 390                 395                 400 
          Leu Phe Thr His Arg Glu Ile Leu Ser His Leu Gln Gly Asp Cys Thr
                          405                 410                 415     
          Ser Pro Gly Arg Asn Pro Ser Gln Phe Lys Ser Asn
                      420                 425             
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 484]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Gly Val Pro Arg Thr Pro Ser Arg Thr Val Leu Phe Glu Arg Glu
           1               5                  10                  15      
          Arg Thr Gly Leu Thr Tyr Arg Val Pro Ser Leu Leu Pro Val Pro Pro
                      20                  25                  30          
          Gly Pro Thr Leu Leu Ala Phe Val Glu Gln Arg Leu Ser Pro Asp Asp
                  35                  40                  45              
          Ser His Ala His Arg Leu Val Leu Arg Arg Gly Thr Leu Ala Gly Gly
              50                  55                  60                  
          Ser Val Arg Trp Gly Ala Leu His Val Leu Gly Thr Ala Ala Leu Ala
          65                  70                  75                  80  
          Glu His Arg Ser Met Asn Pro Cys Pro Val His Asp Ala Gly Thr Gly
                          85                  90                  95      
          Thr Val Phe Leu Phe Phe Ile Ala Val Leu Gly His Thr Pro Glu Ala
                      100                 105                 110         
          Val Gln Ile Ala Thr Gly Arg Asn Ala Ala Arg Leu Cys Cys Val Ala
                  115                 120                 125             
          Ser Arg Asp Ala Gly Leu Ser Trp Gly Ser Ala Arg Asp Leu Thr Glu
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Ile Gly Gly Ala Val Gln Asp Trp Ala Thr Phe Ala Val Gly
          145                 150                 155                 160 
          Pro Gly His Gly Val Gln Leu Pro Ser Gly Arg Leu Leu Val Pro Ala
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Tyr Arg Val Asp Arg Arg Glu Cys Phe Gly Lys Ile Cys Arg
                      180                 185                 190         
          Thr Ser Pro His Ser Phe Ala Phe Tyr Ser Asp Asp His Gly Arg Thr
                  195                 200                 205             
          Trp Arg Cys Gly Gly Leu Val Pro Asn Leu Arg Ser Gly Glu Cys Gln
              210                 215                 220                 
          Leu Ala Ala Val Asp Gly Gly Gln Ala Gly Ser Phe Leu Tyr Cys Asn
          225                 230                 235                 240 
          Ala Arg Ser Pro Leu Gly Ser Arg Val Gln Ala Leu Ser Thr Asp Glu
                          245                 250                 255     
          Gly Thr Ser Phe Leu Pro Ala Glu Arg Val Ala Ser Leu Pro Glu Thr
                      260                 265                 270         
          Ala Trp Gly Cys Gln Gly Ser Ile Val Gly Phe Pro Ala Pro Ala Pro
                  275                 280                 285             
          Asn Arg Pro Arg Asp Asp Ser Trp Ser Val Gly Pro Gly Ser Pro Leu
              290                 295                 300                 
          Gln Pro Pro Leu Leu Gly Pro Gly Val His Glu Pro Pro Glu Glu Ala
          305                 310                 315                 320 
          Ala Val Asp Pro Arg Gly Gly Gln Val Pro Gly Gly Pro Phe Ser Arg
                          325                 330                 335     
          Leu Gln Pro Arg Gly Asp Gly Pro Arg Gln Pro Gly Pro Arg Pro Gly
                      340                 345                 350         
          Val Ser Gly Asp Val Gly Ser Trp Thr Leu Ala Leu Pro Met Pro Phe
                  355                 360                 365             
          Ala Ala Pro Pro Gln Ser Pro Thr Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Val
              370                 375                 380                 
          Gly Arg Arg Ala Arg Leu His Met Gly Ile Arg Leu Ser Gln Ser Pro
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Pro Arg Ser Trp Thr Glu Pro Trp Val Ile Tyr Glu Gly Pro
                          405                 410                 415     
          Ser Gly Tyr Ser Asp Leu Ala Ser Ile Gly Pro Ala Pro Glu Gly Gly
                      420                 425                 430         
          Leu Val Phe Ala Cys Leu Tyr Glu Ser Gly Ala Arg Thr Ser Tyr Asp
                  435                 440                 445             
          Glu Ile Ser Phe Cys Thr Phe Ser Leu Arg Glu Val Leu Glu Asn Val
              450                 455                 460                 
          Pro Ala Ser Pro Lys Pro Pro Asn Leu Gly Asp Lys Pro Arg Gly Cys
          465                 470                 475                 480 
          Cys Trp Pro Ser
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 496]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Met Met Ser Ser Ala Ala Phe Pro Arg Trp Leu Ser Met Gly Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Arg Thr Pro Ser Arg Thr Val Leu Phe Glu Arg Glu Arg Thr Gly Leu
                      20                  25                  30          
          Thr Tyr Arg Val Pro Ser Leu Leu Pro Val Pro Pro Gly Pro Thr Leu
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Phe Val Glu Gln Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ser His Ala His
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Val Leu Arg Arg Gly Thr Leu Ala Gly Gly Ser Val Arg Trp
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ala Leu His Val Leu Gly Thr Ala Ala Leu Ala Glu His Arg Ser
                          85                  90                  95      
          Met Asn Pro Cys Pro Val His Asp Ala Gly Thr Gly Thr Val Phe Leu
                      100                 105                 110         
          Phe Phe Ile Ala Val Leu Gly His Thr Pro Glu Ala Val Gln Ile Ala
                  115                 120                 125             
          Thr Gly Arg Asn Ala Ala Arg Leu Cys Cys Val Ala Ser Arg Asp Ala
              130                 135                 140                 
          Gly Leu Ser Trp Gly Ser Ala Arg Asp Leu Thr Glu Glu Ala Ile Gly
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ala Val Gln Asp Trp Ala Thr Phe Ala Val Gly Pro Gly His Gly
                          165                 170                 175     
          Val Gln Leu Pro Ser Gly Arg Leu Leu Val Pro Ala Tyr Thr Tyr Arg
                      180                 185                 190         
          Val Asp Arg Arg Glu Cys Phe Gly Lys Ile Cys Arg Thr Ser Pro His
                  195                 200                 205             
          Ser Phe Ala Phe Tyr Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Cys Gly
              210                 215                 220                 
          Gly Leu Val Pro Asn Leu Arg Ser Gly Glu Cys Gln Leu Ala Ala Val
          225                 230                 235                 240 
          Asp Gly Gly Gln Ala Gly Ser Phe Leu Tyr Cys Asn Ala Arg Ser Pro
                          245                 250                 255     
          Leu Gly Ser Arg Val Gln Ala Leu Ser Thr Asp Glu Gly Thr Ser Phe
                      260                 265                 270         
          Leu Pro Ala Glu Arg Val Ala Ser Leu Pro Glu Thr Ala Trp Gly Cys
                  275                 280                 285             
          Gln Gly Ser Ile Val Gly Phe Pro Ala Pro Ala Pro Asn Arg Pro Arg
              290                 295                 300                 
          Asp Asp Ser Trp Ser Val Gly Pro Gly Ser Pro Leu Gln Pro Pro Leu
          305                 310                 315                 320 
          Leu Gly Pro Gly Val His Glu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Val Asp Pro
                          325                 330                 335     
          Arg Gly Gly Gln Val Pro Gly Gly Pro Phe Ser Arg Leu Gln Pro Arg
                      340                 345                 350         
          Gly Asp Gly Pro Arg Gln Pro Gly Pro Arg Pro Gly Val Ser Gly Asp
                  355                 360                 365             
          Val Gly Ser Trp Thr Leu Ala Leu Pro Met Pro Phe Ala Ala Pro Pro
              370                 375                 380                 
          Gln Ser Pro Thr Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Val Gly Arg Arg Ala
          385                 390                 395                 400 
          Arg Leu His Met Gly Ile Arg Leu Ser Gln Ser Pro Leu Asp Pro Arg
                          405                 410                 415     
          Ser Trp Thr Glu Pro Trp Val Ile Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Tyr Ser
                      420                 425                 430         
          Asp Leu Ala Ser Ile Gly Pro Ala Pro Glu Gly Gly Leu Val Phe Ala
                  435                 440                 445             
          Cys Leu Tyr Glu Ser Gly Ala Arg Thr Ser Tyr Asp Glu Ile Ser Phe
              450                 455                 460                 
          Cys Thr Phe Ser Leu Arg Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Ala Ser Pro
          465                 470                 475                 480 
          Lys Pro Pro Asn Leu Gly Asp Lys Pro Arg Gly Cys Cys Trp Pro Ser
                          485                 490                 495     
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 497]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Met Met Ser Ser Ala Ala Phe Pro Arg Trp Leu Gln Ser Met Gly Val
           1               5                  10                  15      
          Pro Arg Thr Pro Ser Arg Thr Val Leu Phe Glu Arg Glu Arg Thr Gly
                      20                  25                  30          
          Leu Thr Tyr Arg Val Pro Ser Leu Leu Pro Val Pro Pro Gly Pro Thr
                  35                  40                  45              
          Leu Leu Ala Phe Val Glu Gln Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ser His Ala
              50                  55                  60                  
          His Arg Leu Val Leu Arg Arg Gly Thr Leu Ala Gly Gly Ser Val Arg
          65                  70                  75                  80  
          Trp Gly Ala Leu His Val Leu Gly Thr Ala Ala Leu Ala Glu His Arg
                          85                  90                  95      
          Ser Met Asn Pro Cys Pro Val His Asp Ala Gly Thr Gly Thr Val Phe
                      100                 105                 110         
          Leu Phe Phe Ile Ala Val Leu Gly His Thr Pro Glu Ala Val Gln Ile
                  115                 120                 125             
          Ala Thr Gly Arg Asn Ala Ala Arg Leu Cys Cys Val Ala Ser Arg Asp
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Leu Ser Trp Gly Ser Ala Arg Asp Leu Thr Glu Glu Ala Ile
          145                 150                 155                 160 
          Gly Gly Ala Val Gln Asp Trp Ala Thr Phe Ala Val Gly Pro Gly His
                          165                 170                 175     
          Gly Val Gln Leu Pro Ser Gly Arg Leu Leu Val Pro Ala Tyr Thr Tyr
                      180                 185                 190         
          Arg Val Asp Arg Arg Glu Cys Phe Gly Lys Ile Cys Arg Thr Ser Pro
                  195                 200                 205             
          His Ser Phe Ala Phe Tyr Ser Asp Asp His Gly Arg Thr Trp Arg Cys
              210                 215                 220                 
          Gly Gly Leu Val Pro Asn Leu Arg Ser Gly Glu Cys Gln Leu Ala Ala
          225                 230                 235                 240 
          Val Asp Gly Gly Gln Ala Gly Ser Phe Leu Tyr Cys Asn Ala Arg Ser
                          245                 250                 255     
          Pro Leu Gly Ser Arg Val Gln Ala Leu Ser Thr Asp Glu Gly Thr Ser
                      260                 265                 270         
          Phe Leu Pro Ala Glu Arg Val Ala Ser Leu Pro Glu Thr Ala Trp Gly
                  275                 280                 285             
          Cys Gln Gly Ser Ile Val Gly Phe Pro Ala Pro Ala Pro Asn Arg Pro
              290                 295                 300                 
          Arg Asp Asp Ser Trp Ser Val Gly Pro Gly Ser Pro Leu Gln Pro Pro
          305                 310                 315                 320 
          Leu Leu Gly Pro Gly Val His Glu Pro Pro Glu Glu Ala Ala Val Asp
                          325                 330                 335     
          Pro Arg Gly Gly Gln Val Pro Gly Gly Pro Phe Ser Arg Leu Gln Pro
                      340                 345                 350         
          Arg Gly Asp Gly Pro Arg Gln Pro Gly Pro Arg Pro Gly Val Ser Gly
                  355                 360                 365             
          Asp Val Gly Ser Trp Thr Leu Ala Leu Pro Met Pro Phe Ala Ala Pro
              370                 375                 380                 
          Pro Gln Ser Pro Thr Trp Leu Leu Tyr Ser His Pro Val Gly Arg Arg
          385                 390                 395                 400 
          Ala Arg Leu His Met Gly Ile Arg Leu Ser Gln Ser Pro Leu Asp Pro
                          405                 410                 415     
          Arg Ser Trp Thr Glu Pro Trp Val Ile Tyr Glu Gly Pro Ser Gly Tyr
                      420                 425                 430         
          Ser Asp Leu Ala Ser Ile Gly Pro Ala Pro Glu Gly Gly Leu Val Phe
                  435                 440                 445             
          Ala Cys Leu Tyr Glu Ser Gly Ala Arg Thr Ser Tyr Asp Glu Ile Ser
              450                 455                 460                 
          Phe Cys Thr Phe Ser Leu Arg Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Ala Ser
          465                 470                 475                 480 
          Pro Lys Pro Pro Asn Leu Gly Asp Lys Pro Arg Gly Cys Cys Trp Pro
                          485                 490                 495     
          Ser
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 913]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 黏放線菌]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Met Thr Ser His Ser Pro Phe Ser Arg Arg Arg Leu Pro Ala Leu Leu
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Leu Pro Leu Ala Ala Thr Gly Leu Ile Ala Ala Ala Pro Pro
                      20                  25                  30          
          Ala His Ala Val Pro Thr Ser Asp Gly Leu Ala Asp Val Thr Ile Thr
                  35                  40                  45              
          Gln Val Asn Ala Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Ser Val Gly Asp Val Met
              50                  55                  60                  
          Thr Phe Asn Ile Thr Leu Thr Asn Thr Ser Gly Glu Ala His Ser Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Ala Pro Ala Ser Thr Asn Leu Ser Gly Asn Val Ser Lys Cys Arg Trp
                          85                  90                  95      
          Arg Asn Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Thr Asp Cys Thr Gly Leu Ala
                      100                 105                 110         
          Thr His Thr Val Thr Ala Glu Asp Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Pro
                  115                 120                 125             
          Gln Ile Ala Tyr Glu Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Gly Lys Ala Leu
              130                 135                 140                 
          Ser Thr Pro Glu Thr Ile Lys Gly Ala Thr Ser Pro Val Lys Ala Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Arg Val Glu Ser Ile Thr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Asn Tyr
                          165                 170                 175     
          Lys Leu Gly Asp Thr Val Ser Tyr Thr Val Arg Val Arg Ser Val Ser
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Thr Ile Asn Val Ala Ala Thr Glu Ser Ser Phe Asp Asp Leu
                  195                 200                 205             
          Gly Arg Gln Cys His Trp Gly Gly Leu Lys Pro Gly Lys Gly Ala Val
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn Cys Lys Pro Leu Thr His Thr Ile Thr Gln Ala Asp Val Asp
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gly Arg Trp Thr Pro Ser Ile Thr Leu Thr Ala Thr Gly Thr Asp
                          245                 250                 255     
          Gly Ala Thr Leu Gln Thr Leu Thr Ala Thr Gly Asn Pro Ile Asn Val
                      260                 265                 270         
          Val Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
                  275                 280                 285             
          Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn
              290                 295                 300                 
          Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Pro Pro Pro Pro Met
          305                 310                 315                 320 
          Gly Thr Cys Ser Ser Pro Thr Thr Ser Ala Arg Arg Thr Thr Ala Thr
                          325                 330                 335     
          Ala Ala Ala Thr Thr Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
                      340                 345                 350         
          Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
                  355                 360                 365             
          Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
              370                 375                 380                 
          Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
          385                 390                 395                 400 
          Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
                          405                 410                 415     
          Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
                      420                 425                 430         
          Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
                  435                 440                 445             
          Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
              450                 455                 460                 
          His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
          465                 470                 475                 480 
          Pro Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
                          485                 490                 495     
          Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
                      500                 505                 510         
          Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
                  515                 520                 525             
          Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
              530                 535                 540                 
          Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
          545                 550                 555                 560 
          Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Cys Arg
                      580                 585                 590         
          Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
                  595                 600                 605             
          Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
              610                 615                 620                 
          Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
          625                 630                 635                 640 
          Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
                          645                 650                 655     
          Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Ser Pro Gly Arg
                      660                 665                 670         
          Arg Arg Arg Arg His Pro Gln Arg His Arg Arg Arg Ser Arg Pro Arg
                  675                 680                 685             
          Arg Pro Arg Arg Ala Leu Ser Pro Arg Arg His Arg His His Pro Pro
              690                 695                 700                 
          Arg Pro Ser Arg Ala Leu Arg Pro Ser Arg Ala Gly Pro Gly Ala Gly
          705                 710                 715                 720 
          Ala His Asp Arg Ser Glu His Gly Ala His Thr Gly Ser Cys Ala Gln
                          725                 730                 735     
          Ser Ala Pro Glu Gln Thr Asp Gly Pro Thr Ala Ala Pro Ala Pro Glu
                      740                 745                 750         
          Thr Ser Ser Ala Pro Ala Ala Glu Pro Thr Gln Ala Pro Thr Val Ala
                  755                 760                 765             
          Pro Ser Val Glu Pro Thr Gln Ala Pro Gly Ala Gln Pro Ser Ser Ala
              770                 775                 780                 
          Pro Lys Pro Gly Ala Thr Gly Arg Ala Pro Ser Val Val Asn Pro Lys
          785                 790                 795                 800 
          Ala Thr Gly Ala Ala Thr Glu Pro Gly Thr Pro Ser Ser Ser Ala Ser
                          805                 810                 815     
          Pro Ala Pro Ser Arg Asn Ala Ala Pro Thr Pro Lys Pro Gly Met Glu
                      820                 825                 830         
          Pro Asp Glu Ile Asp Arg Pro Ser Asp Gly Thr Met Ala Gln Pro Thr
                  835                 840                 845             
          Gly Ala Pro Ala Arg Arg Val Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro
              850                 855                 860                 
          Ala Ala Gly Cys Leu Ala Arg Asp Gln Arg Ala Ala Asp Pro Gly Pro
          865                 870                 875                 880 
          Cys Gly Cys Arg Gly Cys Arg Arg Val Pro Ala Ala Ala Gly Ser Pro
                          885                 890                 895     
          Phe Glu Glu Leu Asn Thr Arg Arg Ala Gly His Pro Ala Leu Ser Thr
                      900                 905                 910         
          Asp
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 793]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 黏放線菌]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Met Thr Thr Thr Lys Ser Ser Ala Leu Arg Arg Leu Ser Ala Leu Ala
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Leu Ala Leu Ala Val Thr Gly Ile Ile Ala Ala Ala Pro Pro
                      20                  25                  30          
          Ala His Ala Thr Pro Thr Ser Asp Gly Leu Ala Asp Val Thr Ile Thr
                  35                  40                  45              
          Gln Thr His Ala Pro Ala Asp Gly Ile Tyr Ala Val Gly Asp Val Met
              50                  55                  60                  
          Thr Phe Asp Ile Thr Leu Thr Asn Thr Ser Gly Gln Ala Arg Ser Phe
          65                  70                  75                  80  
          Ala Pro Ala Ser Thr Asn Leu Ser Gly Asn Val Leu Lys Cys Arg Trp
                          85                  90                  95      
          Ser Asn Val Ala Ala Gly Ala Thr Lys Thr Asp Cys Thr Gly Leu Ala
                      100                 105                 110         
          Thr His Thr Val Thr Ala Glu Asp Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Pro
                  115                 120                 125             
          Gln Ile Ala Tyr Glu Val Lys Ala Val Gly Tyr Lys Gly Glu Ala Leu
              130                 135                 140                 
          Asn Lys Pro Glu Pro Val Thr Gly Pro Thr Ser Gln Ile Lys Pro Ala
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Lys Val Glu Ser Phe Thr Leu Ala Ser Pro Lys Glu Thr Tyr
                          165                 170                 175     
          Thr Val Gly Asp Val Val Ser Tyr Thr Val Arg Ile Arg Ser Leu Ser
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Thr Ile Asn Val Ala Ala Thr Asp Ser Ser Phe Asp Asp Leu
                  195                 200                 205             
          Ala Arg Gln Cys His Trp Gly Asn Leu Lys Pro Gly Gln Gly Ala Val
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn Cys Lys Pro Leu Thr His Thr Ile Thr Gln Ala Asp Ala Asp
          225                 230                 235                 240 
          His Gly Thr Trp Thr Pro Ser Ile Thr Leu Ala Ala Thr Gly Thr Asp
                          245                 250                 255     
          Gly Ala Ala Leu Gln Thr Leu Ala Ala Thr Gly Glu Pro Leu Ser Val
                      260                 265                 270         
          Val Val Glu Arg Pro Lys Ala Asp Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
                  275                 280                 285             
          Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Asp Ala Gln His Leu Ala Glu Asn
              290                 295                 300                 
          Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asp Leu Leu Val Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Arg Asp Asn Gly Asn
                          325                 330                 335     
          Asn Gly Gly Asp Ser Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
                      340                 345                 350         
          Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Ser Tyr Ile His Gln Gly
                  355                 360                 365             
          Val Glu Thr Gly Arg Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
              370                 375                 380                 
          Asp Asn Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Phe Asp
          385                 390                 395                 400 
          Gln Gly Trp Gly His Ser Gln Ala Gly Thr Asp Pro Glu Asp Arg Ser
                          405                 410                 415     
          Val Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Ser Trp
                      420                 425                 430         
          Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Arg Asp Asn Pro Trp Thr
                  435                 440                 445             
          Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile His Gln Gly Pro
              450                 455                 460                 
          His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Asp Gly
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Gln Thr Trp
                          485                 490                 495     
          Gln Ala Gly Thr Pro Thr Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
                      500                 505                 510         
          Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
                  515                 520                 525             
          Thr Gly Phe Arg Lys Val Ala Thr Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
              530                 535                 540                 
          Ser Glu Pro Val Pro Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
          545                 550                 555                 560 
          Gln Ile Ile Arg Pro Phe Pro Asn Ala Ala Pro Ser Asp Pro Arg Ala
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg
                      580                 585                 590         
          Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asn Gly Ala Ser Trp Val
                  595                 600                 605             
          Thr Gly Arg Val Phe Asn Glu Lys Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
              610                 615                 620                 
          Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Gly Asn Tyr
          625                 630                 635                 640 
          Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Gly Trp Val Gly Asp Gln
                          645                 650                 655     
          Cys Ser Gln Pro Arg Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Thr Pro Ser Ala
                      660                 665                 670         
          Ala Pro Ser Ala Glu Pro Thr Ser Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ala Pro
                  675                 680                 685             
          Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ser Ser Glu Pro Ser Val Ser Pro Glu Pro
              690                 695                 700                 
          Ser Ser Ser Ala Ile Pro Ala Pro Ser Gln Ser Ser Ser Ala Thr Ser
          705                 710                 715                 720 
          Gly Pro Ser Thr Glu Pro Asp Glu Ile Asp Arg Pro Ser Asp Gly Ala
                          725                 730                 735     
          Met Ala Gln Pro Thr Gly Gly Ala Gly Arg Pro Ser Thr Ser Val Thr
                      740                 745                 750         
          Gly Ala Thr Ser Arg Asn Gly Leu Ser Arg Thr Gly Thr Asn Ala Leu
                  755                 760                 765             
          Leu Val Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Leu Val
              770                 775                 780                 
          Leu Arg Ile Arg Arg Ala Arg Thr Glu
          785                 790             
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 1130]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 口腔鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Met Asn Tyr Lys Ser Leu Asp Arg Lys Gln Arg Tyr Gly Ile Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Phe Ala Val Gly Ala Ala Ser Val Val Ile Gly Thr Val Val Phe Gly
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Pro Val Leu Ala Gln Glu Gln Ala Asn Ala Ala Gly Ala Asn
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Thr Val Glu Pro Gly Gln Gly Leu Ser Glu Leu Pro Lys Glu
              50                  55                  60                  
          Ala Ser Ser Gly Asp Leu Ala His Leu Asp Lys Asp Leu Ala Gly Lys
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ala Ala Ala Gln Asp Asn Gly Val Glu Val Asp Gln Asp His Leu
                          85                  90                  95      
          Lys Lys Asn Glu Ser Ala Glu Ser Glu Thr Pro Ser Ser Thr Glu Thr
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Glu Glu Ala Asn Lys Glu Glu Glu Ser Glu Asp Gln Gly Ala
                  115                 120                 125             
          Ile Pro Arg Asp Tyr Tyr Ser Arg Asp Leu Lys Asn Ala Asn Pro Val
              130                 135                 140                 
          Leu Glu Lys Glu Asp Val Glu Thr Asn Ala Ala Asn Gly Gln Arg Val
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Ser Asn Glu Leu Asp Lys Leu Lys Gln Leu Lys Asn Ala Thr
                          165                 170                 175     
          Val His Met Glu Phe Lys Pro Asp Ala Ser Ala Pro Arg Phe Tyr Asn
                      180                 185                 190         
          Leu Phe Ser Val Ser Ser Asp Thr Lys Glu Asn Glu Tyr Phe Thr Met
                  195                 200                 205             
          Ser Val Leu Asp Asn Thr Ala Leu Ile Glu Gly Arg Gly Ala Asn Gly
              210                 215                 220                 
          Glu Gln Phe Tyr Asp Lys Tyr Thr Asp Ala Pro Leu Lys Val Arg Pro
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Trp Asn Ser Val Thr Phe Thr Val Glu Gln Pro Thr Thr Glu
                          245                 250                 255     
          Leu Pro His Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg
                      260                 265                 270         
          Thr Ser Leu Lys Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Asn
                  275                 280                 285             
          Gln Ala Gln Leu Gly Ala Thr Lys Arg Gly Asn Lys Thr Val Trp Ala
              290                 295                 300                 
          Ser Asn Leu Gln Val Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asp Arg Ala Leu Ser
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Glu Val Gln Thr Arg Ser Gln Leu Phe Glu Arg Gly Glu Leu
                          325                 330                 335     
          Glu Gln Lys Leu Pro Glu Gly Ala Lys Val Thr Glu Lys Glu Asp Val
                      340                 345                 350         
          Phe Glu Gly Gly Arg Asn Asn Gln Pro Asn Lys Asp Gly Ile Lys Ser
                  355                 360                 365             
          Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala
              370                 375                 380                 
          Gly Thr Asp Glu Arg Arg Leu His His Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly
          385                 390                 395                 400 
          Met Val Val Arg Arg Ser Ser Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg
                          405                 410                 415     
          Ile Val Ile Ser Asn Pro Arg Asp Asn Glu His Ala Lys His Ala Asp
                      420                 425                 430         
          Trp Pro Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Ala Leu Val Gln Asp Pro Glu
                  435                 440                 445             
          Thr Lys Arg Ile Phe Ala Ile Tyr Asp Met Phe Leu Glu Ser Lys Ala
              450                 455                 460                 
          Val Phe Ser Leu Pro Gly Gln Ala Pro Lys Ala Tyr Glu Gln Val Gly
          465                 470                 475                 480 
          Asp Lys Val Tyr Gln Val Leu Tyr Lys Gln Gly Glu Ser Gly Arg Tyr
                          485                 490                 495     
          Thr Ile Arg Glu Asn Gly Glu Val Phe Asp Pro Gln Asn Arg Lys Thr
                      500                 505                 510         
          Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Lys Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys
                  515                 520                 525             
          Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asn Glu Leu Ile Gly Asn Ile Tyr Phe Glu
              530                 535                 540                 
          Tyr Ser Glu Lys Asn Ile Phe Arg Val Ser Asn Thr Asn Tyr Leu Trp
          545                 550                 555                 560 
          Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Lys Asp
                          565                 570                 575     
          Ile Thr His Gly Ile Arg Lys Asp Trp Met His Phe Leu Gly Thr Gly
                      580                 585                 590         
          Pro Gly Thr Gly Ile Ala Leu Arg Thr Gly Pro His Lys Gly Arg Leu
                  595                 600                 605             
          Val Ile Pro Val Tyr Thr Thr Asn Asn Val Ser Tyr Leu Ser Gly Ser
              610                 615                 620                 
          Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly Glu Thr Trp Gln
          625                 630                 635                 640 
          Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp Asn Arg Pro Val Gly Asn Gln Thr Ile
                          645                 650                 655     
          His Ser Ser Thr Met Asn Asn Pro Gly Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr
                      660                 665                 670         
          Val Val Gln Leu Asn Asn Gly Asp Leu Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu
                  675                 680                 685             
          Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala Thr Ser His Asp Gly Gly Ala Thr Trp
              690                 695                 700                 
          Asp Lys Glu Ile Lys Arg Tyr Pro Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Gln
          705                 710                 715                 720 
          Met Ser Ala Ile His Thr Met His Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Leu Leu
                          725                 730                 735     
          Ser Asn Ala Gly Gly Pro Gly Arg Asn Asn Gly Leu Val His Leu Ala
                      740                 745                 750         
          Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile
                  755                 760                 765             
          Gln Ser Gly Lys Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gln Glu Leu Gly Asn Gly
              770                 775                 780                 
          Glu Tyr Gly Leu Leu Tyr Glu His Ala Asp Gly Asn Gln Asn Asp Tyr
          785                 790                 795                 800 
          Thr Leu Ser Tyr Lys Lys Phe Asn Trp Asp Phe Leu Ser Arg Asp Arg
                          805                 810                 815     
          Ile Ser Pro Lys Glu Ala Lys Val Lys Tyr Ala Ile Gln Lys Trp Pro
                      820                 825                 830         
          Gly Ile Ile Ala Met Glu Phe Asp Ser Glu Val Leu Val Asn Lys Ala
                  835                 840                 845             
          Pro Thr Leu Gln Leu Ala Asn Gly Lys Thr Ala Thr Phe Met Thr Gln
              850                 855                 860                 
          Tyr Asp Thr Lys Thr Leu Leu Phe Thr Ile Asp Pro Glu Asp Met Gly
          865                 870                 875                 880 
          Gln Arg Ile Thr Gly Leu Ala Glu Gly Ala Ile Glu Ser Met His Asn
                          885                 890                 895     
          Leu Pro Val Ser Leu Ala Gly Ser Lys Leu Ser Asp Gly Ile Asn Gly
                      900                 905                 910         
          Ser Glu Ala Ala Ile His Glu Val Pro Glu Phe Thr Gly Gly Val Asn
                  915                 920                 925             
          Ala Glu Glu Ala Ala Val Ala Glu Ile Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu
              930                 935                 940                 
          Ala Thr Val Gly Glu Glu Val Ala Pro Thr Val Glu Lys Pro Glu Phe
          945                 950                 955                 960 
          Thr Gly Gly Val Asn Ala Glu Glu Ala Pro Val Ala Glu Met Pro Glu
                          965                 970                 975     
          Tyr Thr Gly Pro Leu Ser Thr Val Gly Glu Glu Val Ala Pro Thr Val
                      980                 985                 990         
          Glu Lys Pro Glu Phe Thr Gly Gly Val Asn Ala Val Glu Ala Ala Val
                  995                 1000                1005            
          His Glu Leu Pro Glu Phe Lys Gly Gly Val Asn Ala Val Leu Ala Ala
              1010                1015                1020                
          Ser Asn Glu Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Gly Ala Asn Phe Val Leu Ala
          1025                1030                1035               1040 
          Ala Ser Asn Asp Leu Pro Glu Tyr Ile Gly Gly Val Asn Gly Ala Glu
                          1045                1050                1055    
          Ala Ala Val His Glu Leu Pro Glu Tyr Lys Gly Asp Thr Asn Leu Val
                      1060                1065                1070        
          Leu Ala Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ser Leu Gly Gln Asp Val Thr Tyr
                  1075                1080                1085            
          Gln Ala Pro Ala Ala Lys Gln Ala Gly Leu Pro Asn Thr Gly Ser Lys
              1090                1095                1100                
          Glu Thr His Ser Leu Ile Ser Leu Gly Leu Ala Gly Val Leu Leu Ser
          1105                1110                1115               1120 
          Leu Phe Ala Phe Gly Lys Lys Arg Lys Glu
                          1125                1130
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 305]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 口腔鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Met Ser Asp Leu Lys Lys Tyr Glu Gly Val Ile Pro Ala Phe Tyr Ala
           1               5                  10                  15      
          Cys Tyr Asp Asp Gln Gly Glu Val Ser Pro Glu Arg Thr Arg Ala Leu
                      20                  25                  30          
          Val Gln Tyr Phe Ile Asp Lys Gly Val Gln Gly Leu Tyr Val Asn Gly
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Gly Glu Cys Ile Tyr Gln Ser Val Glu Asp Arg Lys Leu Ile
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Glu Val Met Ala Val Ala Lys Gly Lys Leu Thr Ile Ile Ala
          65                  70                  75                  80  
          His Val Ala Cys Asn Asn Thr Lys Asp Ser Met Glu Leu Ala Arg His
                          85                  90                  95      
          Ala Glu Ser Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Thr Ile Pro Pro Ile Tyr
                      100                 105                 110         
          Phe Arg Leu Pro Glu Tyr Ser Val Ala Lys Tyr Trp Asn Asp Ile Ser
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Ala Pro Asn Thr Asp Tyr Val Ile Tyr Asn Ile Pro Gln Leu
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Val Ala Leu Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Glu Met Leu Lys Asn
          145                 150                 155                 160 
          Pro Arg Val Ile Gly Val Lys Asn Ser Ser Met Pro Val Gln Asp Ile
                          165                 170                 175     
          Gln Thr Phe Val Ser Leu Gly Gly Glu Asp His Ile Val Phe Asn Gly
                      180                 185                 190         
          Pro Asp Glu Gln Phe Leu Gly Gly Arg Leu Met Gly Ala Lys Ala Gly
                  195                 200                 205             
          Ile Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Met Pro Glu Leu Phe Leu Lys Leu Asn
              210                 215                 220                 
          Gln Leu Ile Ala Glu Lys Asp Leu Glu Thr Ala Arg Glu Leu Gln Tyr
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ile Asn Ala Ile Ile Gly Lys Leu Thr Ser Ala His Gly Asn Met
                          245                 250                 255     
          Tyr Gly Val Ile Lys Glu Val Leu Lys Ile Asn Glu Gly Leu Asn Ile
                      260                 265                 270         
          Gly Ser Val Arg Ser Pro Leu Thr Pro Val Thr Glu Glu Asp Arg Pro
                  275                 280                 285             
          Val Val Glu Ala Ala Ala Gln Leu Ile Arg Glu Thr Lys Glu Arg Phe
              290                 295                 300                 
          Leu
          305 
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 1110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Met Asn Gln Arg His Phe Asp Arg Lys Gln Arg Tyr Gly Ile Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Phe Thr Val Gly Ala Ala Ser Val Val Ile Gly Ala Val Val Phe Gly
                      20                  25                  30          
          Val Ala Pro Ala Leu Ala Gln Glu Ala Pro Ser Thr Asn Gly Glu Thr
                  35                  40                  45              
          Ala Gly Gln Ser Leu Pro Glu Leu Pro Lys Glu Val Glu Thr Gly Asn
              50                  55                  60                  
          Leu Thr Asn Leu Asp Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser Thr Ala Thr
          65                  70                  75                  80  
          Asp Lys Gly Thr Glu Val Asn Arg Glu Glu Leu Gln Ala Asn Pro Gly
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Lys Ala Ala Glu Thr Glu Ala Ser Asn Glu Thr Pro Ala Thr
                      100                 105                 110         
          Glu Ser Glu Asp Glu Lys Glu Asp Gly Asn Ile Pro Arg Asp Phe Tyr
                  115                 120                 125             
          Ala Arg Glu Leu Glu Asn Val Asn Thr Val Val Glu Lys Glu Asp Val
              130                 135                 140                 
          Glu Thr Asn Pro Ser Asn Gly Gln Arg Val Asp Met Lys Glu Glu Leu
          145                 150                 155                 160 
          Asp Lys Leu Lys Lys Leu Gln Asn Ala Thr Ile His Met Glu Phe Lys
                          165                 170                 175     
          Pro Asp Ala Ser Ala Pro Arg Phe Tyr Asn Leu Phe Ser Val Ser Ser
                      180                 185                 190         
          Asp Thr Lys Val Asn Glu Tyr Phe Thr Met Ala Ile Leu Asp Asn Thr
                  195                 200                 205             
          Ala Ile Val Glu Gly Arg Asp Ala Asn Gly Asn Gln Phe Tyr Gly Asp
              210                 215                 220                 
          Tyr Lys Thr Ala Pro Leu Lys Ile Lys Pro Gly Glu Trp Asn Ser Val
          225                 230                 235                 240 
          Thr Phe Thr Val Glu Arg Pro Asn Ala Asp Gln Pro Lys Gly Gln Val
                          245                 250                 255     
          Arg Val Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Ser Pro Gln Ser Gly
                      260                 265                 270         
          Arg Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Asn Gln Val Gln Ile Gly Thr
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Arg Thr Gly Lys Asn Phe Trp Gly Ser Asn Leu Lys Val Arg
              290                 295                 300                 
          Asn Leu Thr Val Tyr Asp Arg Ala Leu Ser Pro Glu Glu Val Lys Lys
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ser Gln Leu Phe Glu Arg Gly Glu Leu Glu Lys Lys Leu Pro Glu
                          325                 330                 335     
          Gly Ala Lys Val Thr Asp Lys Leu Asp Val Phe Gln Gly Gly Glu Asn
                      340                 345                 350         
          Arg Lys Pro Asn Lys Asp Gly Ile Ala Ser Tyr Arg Ile Pro Ala Leu
                  355                 360                 365             
          Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ala Asp Glu Arg Arg
              370                 375                 380                 
          Leu His His Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly Met Val Val Arg Arg Ser
          385                 390                 395                 400 
          Asp Asp Lys Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg Ile Val Ile Ser Asn Pro
                          405                 410                 415     
          Arg Asp Asn Glu Asn Ala Arg Arg Ala His Ala Gly Ser Pro Val Asn
                      420                 425                 430         
          Ile Asp Met Ala Leu Val Gln Asp Pro Lys Thr Lys Arg Ile Phe Ser
                  435                 440                 445             
          Ile Phe Asp Met Phe Val Glu Gly Glu Ala Val Arg Asp Leu Pro Gly
              450                 455                 460                 
          Lys Ala Pro Gln Ala Tyr Glu Gln Ile Gly Asn Lys Val Tyr Gln Val
          465                 470                 475                 480 
          Leu Tyr Lys Lys Gly Glu Ala Gly His Tyr Thr Ile Arg Glu Asn Gly
                          485                 490                 495     
          Glu Val Phe Asp Pro Glu Asn Arg Lys Thr Glu Tyr Arg Val Val Val
                      500                 505                 510         
          Asp Pro Lys Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys Gly
                  515                 520                 525             
          Glu Glu Leu Ile Gly Asn Val Tyr Phe Asp Tyr Ser Asp Lys Asn Ile
              530                 535                 540                 
          Phe Arg Val Ser Asn Thr Asn Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp Asp
          545                 550                 555                 560 
          Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Lys Asp Ile Thr Tyr Gly Ile Arg
                          565                 570                 575     
          Lys Asp Trp Met His Phe Leu Gly Thr Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala
                      580                 585                 590         
          Leu His Ser Gly Pro His Lys Gly Arg Leu Val Ile Pro Ala Tyr Thr
                  595                 600                 605             
          Thr Asn Asn Val Ser Tyr Leu Gly Gly Ser Gln Ser Ser Arg Val Ile
              610                 615                 620                 
          Tyr Ser Asp Asp His Gly Glu Thr Trp His Ala Gly Glu Ala Val Asn
          625                 630                 635                 640 
          Asp Asn Arg Pro Ile Gly Asn Gln Thr Ile His Ser Ser Thr Met Asn
                          645                 650                 655     
          Asn Pro Gly Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr Val Val Gln Leu Asn Asn
                      660                 665                 670         
          Gly Asp Leu Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln Val
                  675                 680                 685             
          Ala Thr Ser Lys Asp Gly Gly Ala Thr Trp Glu Lys Asp Val Lys Arg
              690                 695                 700                 
          Tyr Ala Asp Val Lys Asp Val Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His Thr
          705                 710                 715                 720 
          Val Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ala Gly Gly Pro
                          725                 730                 735     
          Gly Arg Tyr Asn Gly Leu Val His Val Ala Arg Val Glu Ala Asn Gly
                      740                 745                 750         
          Asp Leu Thr Trp Ile Lys His Asn Pro Ile Gln Ser Gly Lys Phe Ala
                  755                 760                 765             
          Tyr Asn Ser Leu Gln Asp Leu Gly Asn Gly Glu Phe Gly Leu Leu Tyr
              770                 775                 780                 
          Glu His Ala Thr Ala Thr Gln Asn Glu Tyr Thr Leu Ser Tyr Lys Lys
          785                 790                 795                 800 
          Phe Asn Trp Asp Phe Leu Ser Lys Asp Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala
                          805                 810                 815     
          Thr Val Lys Asn Ala Val Glu Met Ser Lys Asn Val Ile Ala Leu Glu
                      820                 825                 830         
          Phe Asp Ser Glu Val Leu Val Asn Gln Pro Pro Val Leu Lys Leu Ala
                  835                 840                 845             
          Asn Gly Asn Phe Ala Thr Phe Leu Thr Gln Tyr Asp Ser Lys Thr Leu
              850                 855                 860                 
          Leu Phe Ala Ala Ser Lys Glu Asp Ile Gly Gln Glu Ile Thr Glu Ile
          865                 870                 875                 880 
          Ile Asp Gly Ala Ile Glu Ser Met His Asn Leu Pro Val Ser Leu Glu
                          885                 890                 895     
          Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Lys Asn Gly Ala Lys Ala Ala Ile His
                      900                 905                 910         
          Glu Val Pro Glu Phe Thr Gly Ala Val Asn Gly Glu Gly Thr Val His
                  915                 920                 925             
          Glu Asp Pro Ala Phe Glu Gly Gly Ile Asn Gly Glu Glu Ala Ala Val
              930                 935                 940                 
          His Asp Val Pro Asp Phe Ser Gly Gly Val Asn Gly Glu Val Ala Ala
          945                 950                 955                 960 
          Ile His Glu Val Pro Glu Phe Thr Gly Gly Ile Asn Gly Glu Glu Ala
                          965                 970                 975     
          Ala Lys Leu Glu Leu Pro Ser Tyr Glu Gly Gly Ala Asn Ala Val Glu
                      980                 985                 990         
          Ala Ala Lys Ser Glu Leu Pro Ser Tyr Glu Gly Gly Ala Asn Ala Val
                  995                 1000                1005            
          Glu Ala Ala Lys Leu Glu Leu Pro Ser Tyr Glu Ser Gly Ala His Glu
              1010                1015                1020                
          Val Gln Pro Ala Ser Ser Asn Leu Pro Thr Leu Ala Asp Ser Val Asn
          1025                1030                1035               1040 
          Lys Ala Glu Ala Ala Val His Lys Gly Lys Glu Tyr Lys Ala Asn Gln
                          1045                1050                1055    
          Ser Thr Ala Val Gln Ala Met Ala Gln Glu His Thr Tyr Gln Ala Pro
                      1060                1065                1070        
          Ala Ala Gln Gln His Leu Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Asp Lys Ser
                  1075                1080                1085            
          Ser Leu Ala Ile Val Gly Phe Val Gly Met Phe Leu Gly Leu Leu Met
              1090                1095                1100                
          Ile Gly Lys Lys Arg Glu
          1105                1110
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 1292]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Met Asn Gln Ser Ser Leu Asn Arg Lys Asn Arg Tyr Gly Ile Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Phe Thr Ile Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Gly Ser Val Leu Phe Gly
                      20                  25                  30          
          Ile Thr Pro Ala Leu Ala Gln Glu Thr Thr Thr Asn Ile Asp Val Ser
                  35                  40                  45              
          Lys Val Glu Thr Ser Leu Glu Ser Gly Ala Pro Val Ser Glu Pro Val
              50                  55                  60                  
          Thr Glu Val Val Ser Gly Asp Leu Asn His Leu Asp Lys Asp Leu Ala
          65                  70                  75                  80  
          Asp Lys Leu Ala Leu Ala Thr Asn Gln Gly Val Asp Val Asn Lys His
                          85                  90                  95      
          Asn Leu Lys Glu Glu Thr Ser Lys Pro Glu Gly Asn Ser Glu His Leu
                      100                 105                 110         
          Pro Val Glu Ser Asn Thr Gly Ser Glu Glu Ser Ile Glu His His Pro
                  115                 120                 125             
          Ala Lys Ile Glu Gly Ala Asp Asp Ala Val Val Pro Pro Arg Asp Phe
              130                 135                 140                 
          Phe Ala Arg Glu Leu Thr Asn Val Lys Thr Val Phe Glu Arg Glu Asp
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ala Thr Asn Thr Gly Asn Gly Gln Arg Val Asp Leu Ala Glu Glu
                          165                 170                 175     
          Leu Asp Gln Leu Lys Gln Leu Gln Asn Ala Thr Ile His Met Glu Phe
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Asp Ala Asn Ala Pro Gln Phe Tyr Asn Leu Phe Ser Val Ser
                  195                 200                 205             
          Ser Asp Lys Lys Lys Asp Glu Tyr Phe Ser Met Ser Val Asn Lys Gly
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Met Val Glu Ala Arg Gly Ala Asp Gly Ser His Phe Tyr Gly
          225                 230                 235                 240 
          Ser Tyr Ser Asp Ala Pro Leu Lys Ile Lys Pro Gly Gln Trp Asn Ser
                          245                 250                 255     
          Val Thr Phe Thr Val Glu Arg Pro Lys Ala Asp Gln Pro Asn Gly Gln
                      260                 265                 270         
          Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg Thr Asn Thr Lys Ser
                  275                 280                 285             
          Gly Arg Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Asn Lys Val Gln Ile Gly
              290                 295                 300                 
          Ala Thr Arg Arg Ala Asn Gln Thr Met Trp Gly Ser Asn Leu Gln Ile
          305                 310                 315                 320 
          Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asn Arg Ala Leu Thr Ile Glu Glu Val Lys
                          325                 330                 335     
          Lys Arg Ser His Leu Phe Glu Arg Asn Asp Leu Glu Lys Lys Leu Pro
                      340                 345                 350         
          Glu Gly Ala Glu Val Thr Glu Lys Lys Asp Ile Phe Glu Ser Gly Arg
                  355                 360                 365             
          Asn Asn Gln Pro Asn Gly Glu Gly Ile Asn Ser Tyr Arg Ile Pro Ala
              370                 375                 380                 
          Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala Gly Gly Asp Glu Arg
          385                 390                 395                 400 
          Arg Leu His His Phe Asp Tyr Gly Asp Ile Gly Met Val Ile Arg Arg
                          405                 410                 415     
          Ser Gln Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Lys Leu Thr Ile Ser Asn
                      420                 425                 430         
          Leu Arg Asp Asn Pro Glu Ala Thr Asp Lys Thr Ala Thr Ser Pro Leu
                  435                 440                 445             
          Asn Ile Asp Met Val Leu Val Gln Asp Pro Thr Thr Lys Arg Ile Phe
              450                 455                 460                 
          Ser Ile Tyr Asp Met Phe Pro Glu Gly Arg Ala Val Phe Gly Met Pro
          465                 470                 475                 480 
          Asn Gln Pro Glu Lys Ala Tyr Glu Glu Ile Gly Asp Lys Thr Tyr Gln
                          485                 490                 495     
          Val Leu Tyr Lys Gln Gly Glu Thr Glu Arg Tyr Thr Leu Arg Asp Asn
                      500                 505                 510         
          Gly Glu Ile Phe Asn Ser Gln Asn Lys Lys Thr Glu Tyr Arg Val Val
                  515                 520                 525             
          Val Asn Pro Thr Glu Ala Gly Phe Arg Asp Lys Gly Asp Leu Tyr Lys
              530                 535                 540                 
          Asn Gln Glu Leu Ile Gly Asn Ile Tyr Phe Lys Gln Ser Asp Lys Asn
          545                 550                 555                 560 
          Pro Phe Arg Val Ala Asn Thr Ser Tyr Leu Trp Met Ser Tyr Ser Asp
                          565                 570                 575     
          Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Lys Asp Ile Thr Pro Gly Ile
                      580                 585                 590         
          Arg Gln Asp Trp Met Lys Phe Leu Gly Thr Gly Pro Gly Thr Gly Ile
                  595                 600                 605             
          Val Leu Arg Thr Gly Ala His Lys Gly Arg Ile Leu Val Pro Ala Tyr
              610                 615                 620                 
          Thr Thr Asn Asn Ile Ser His Leu Gly Gly Ser Gln Ser Ser Arg Leu
          625                 630                 635                 640 
          Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly Gln Thr Trp His Ala Gly Glu Ser Pro
                          645                 650                 655     
          Asn Asp Asn Arg Pro Val Gly Asn Ser Val Ile His Ser Ser Asn Met
                      660                 665                 670         
          Asn Lys Ser Ser Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr Val Leu Gln Leu Asn
                  675                 680                 685             
          Asn Gly Asp Val Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu Thr Gly Asp Leu Gln
              690                 695                 700                 
          Val Ala Thr Ser Lys Asp Gly Gly Val Thr Trp Glu Lys Thr Ile Lys
          705                 710                 715                 720 
          Arg Tyr Pro Glu Val Lys Asp Ala Tyr Val Gln Met Ser Ala Ile His
                          725                 730                 735     
          Thr Met His Asp Gly Lys Glu Tyr Ile Leu Leu Ser Asn Ala Ala Gly
                      740                 745                 750         
          Pro Gly Arg Glu Arg Lys Asn Gly Leu Val His Leu Ala Arg Val Glu
                  755                 760                 765             
          Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile Gln Asn Gly
              770                 775                 780                 
          Glu Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gln Glu Leu Gly Gly Gly Glu Tyr Gly
          785                 790                 795                 800 
          Leu Leu Tyr Glu His Arg Glu Asn Gly Gln Asn Tyr Tyr Thr Leu Ser
                          805                 810                 815     
          Tyr Lys Lys Phe Asn Trp Asp Phe Val Ser Lys Asp Leu Ile Ser Pro
                      820                 825                 830         
          Thr Glu Ala Lys Val Ser Gln Ala Tyr Glu Met Gly Lys Gly Val Phe
                  835                 840                 845             
          Gly Leu Glu Phe Asp Ser Glu Val Leu Val Asn Arg Ala Pro Ile Leu
              850                 855                 860                 
          Arg Leu Ala Asn Gly Arg Thr Ala Val Phe Met Thr Gln Tyr Asp Ser
          865                 870                 875                 880 
          Lys Thr Leu Leu Phe Ala Val Asp Lys Lys Asp Ile Gly Gln Glu Ile
                          885                 890                 895     
          Thr Gly Ile Val Asp Gly Ser Ile Glu Ser Met His Asn Leu Thr Val
                      900                 905                 910         
          Asn Leu Ala Gly Ala Gly Ile Pro Gly Gly Met Asn Ala Ala Glu Ser
                  915                 920                 925             
          Val Glu His Tyr Thr Glu Glu Tyr Thr Gly Val Leu Gly Thr Ser Gly
              930                 935                 940                 
          Val Glu Gly Val Pro Thr Ile Ser Val Pro Glu Tyr Glu Gly Gly Val
          945                 950                 955                 960 
          Asn Ser Glu Leu Ala Leu Val Ser Glu Lys Glu Asp Tyr Arg Gly Gly
                          965                 970                 975     
          Val Asn Ser Ala Ser Ser Val Val Thr Glu Val Leu Glu Tyr Thr Gly
                      980                 985                 990         
          Pro Leu Ser Thr Val Gly Ser Glu Asp Ala Pro Thr Val Ser Val Leu
                  995                 1000                1005            
          Glu Tyr Glu Gly Gly Val Asn Ile Asp Ser Pro Glu Val Thr Glu Ala
              1010                1015                1020                
          Pro Glu Tyr Lys Glu Pro Ile Gly Thr Ser Gly Tyr Glu Leu Ala Pro
          1025                1030                1035               1040 
          Thr Val Asp Lys Pro Ala Tyr Thr Gly Thr Ile Glu Pro Leu Glu Lys
                          1045                1050                1055    
          Glu Glu Asn Ser Gly Ala Ile Ile Glu Glu Gly Asn Val Ser Tyr Ile
                      1060                1065                1070        
          Thr Glu Asn Asn Asn Lys Pro Leu Glu Asn Asn Asn Val Thr Thr Ser
                  1075                1080                1085            
          Ser Ile Ile Ser Glu Ser Ser Lys Leu Lys His Thr Leu Lys Asn Ala
              1090                1095                1100                
          Thr Gly Ser Val Gln Ile His Ala Ser Glu Glu Val Leu Lys Asn Val
          1105                1110                1115               1120 
          Lys Asp Val Lys Ile Gln Glu Val Lys Val Ser Ser Leu Ser Ser Leu
                          1125                1130                1135    
          Asn Tyr Lys Ala Tyr Asp Ile Gln Leu Asn Asp Ala Ser Gly Lys Ala
                      1140                1145                1150        
          Val Gln Pro Lys Gly Thr Val Ile Val Thr Phe Ala Ala Glu Gln Ser
                  1155                1160                1165            
          Val Glu Asn Val Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Gly Asn Leu His Thr Leu
              1170                1175                1180                
          Glu Phe Leu Gln Lys Asp Gly Glu Val Thr Phe Glu Thr Asn His Phe
          1185                1190                1195               1200 
          Ser Ile Tyr Ala Met Thr Phe Gln Leu Ser Leu Asp Asn Val Val Leu
                          1205                1210                1215    
          Asp Asn His Arg Glu Asp Lys Asn Gly Glu Val Asn Ser Ala Ser Pro
                      1220                1225                1230        
          Lys Leu Leu Ser Ile Asn Gly His Ser Gln Ser Ser Gln Leu Glu Asn
                  1235                1240                1245            
          Lys Val Ser Asn Asn Glu Gln Ser Lys Leu Pro Asn Thr Gly Glu Asp
              1250                1255                1260                
          Lys Ser Ile Ser Thr Val Leu Leu Gly Phe Val Gly Val Ile Leu Gly
          1265                1270                1275               1280 
          Ala Met Ile Phe Tyr Arg Arg Lys Asp Ser Glu Gly
                          1285                1290        
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 1004]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<221> VARIANT        ]]>
          <![CDATA[<222> 298]]>
          <![CDATA[<223> Xaa = 任一胺基酸]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Met Asp Lys Lys Lys Ile Ile Leu Thr Ser Leu Ala Ser Val Ala Val
           1               5                  10                  15      
          Leu Gly Ala Ala Leu Ala Ala Ser Gln Pro Ser Leu Val Lys Ala Glu
                      20                  25                  30          
          Glu Gln Pro Thr Ala Ser Gln Pro Ala Gly Glu Thr Gly Thr Lys Ser
                  35                  40                  45              
          Glu Val Thr Ser Pro Glu Ile Lys Gln Ala Glu Ala Asp Ala Lys Ala
              50                  55                  60                  
          Ala Glu Ala Lys Val Thr Glu Ala Gln Ala Lys Val Asp Thr Thr Thr
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Ala Asp Glu Ala Ala Lys Lys Leu Glu Thr Glu Lys Lys Glu
                          85                  90                  95      
          Ala Asp Glu Ala Asp Ala Ala Lys Thr Lys Ala Glu Glu Ala Lys Lys
                      100                 105                 110         
          Thr Ala Asp Asp Glu Leu Ala Ala Ala Lys Glu Lys Ala Ala Glu Ala
                  115                 120                 125             
          Asp Ala Lys Ala Lys Glu Glu Ala Lys Lys Glu Glu Asp Ala Lys Lys
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Ala Asp Ser Lys Glu Ala Leu Thr Glu Ala Leu Lys Gln Leu
          145                 150                 155                 160 
          Pro Asp Asn Glu Leu Leu Asp Lys Lys Ala Lys Glu Asp Leu Leu Lys
                          165                 170                 175     
          Ala Val Glu Ala Gly Asp Leu Lys Ala Ser Asp Ile Leu Ala Glu Leu
                      180                 185                 190         
          Ala Asp Asp Asp Lys Lys Ala Glu Ala Asn Lys Glu Thr Glu Lys Lys
                  195                 200                 205             
          Leu Arg Asn Lys Asp Gln Ala Asn Glu Ala Asn Val Ala Thr Thr Pro
              210                 215                 220                 
          Ala Glu Glu Ala Lys Ser Lys Asp Gln Leu Pro Ala Asp Ile Lys Ala
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ile Asp Lys Ala Glu Lys Ala Asp Ala Ala Arg Pro Ala Ser Glu
                          245                 250                 255     
          Lys Leu Gln Asp Lys Ala Asp Asp Leu Gly Glu Asn Val Asp Glu Leu
                      260                 265                 270         
          Lys Lys Glu Ala Asp Ala Leu Lys Ala Glu Glu Asp Lys Lys Ala Glu
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Lys Lys Gln Glu Asp Thr Leu Xaa Glu Ala Lys Glu Ala Leu
              290                 295                 300                 
          Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Phe Gly Glu Asp Ile Thr Ala Pro Leu
          305                 310                 315                 320 
          Glu Lys Ala Val Thr Ala Ile Glu Lys Glu Arg Asp Ala Ala Gln Asn
                          325                 330                 335     
          Ala Phe Asp Gln Ala Ala Ser Asp Thr Lys Ala Val Ala Asp Glu Leu
                      340                 345                 350         
          Asn Lys Leu Thr Asp Glu Tyr Asn Lys Thr Leu Glu Glu Val Lys Ala
                  355                 360                 365             
          Ala Lys Glu Lys Glu Ala Asn Glu Pro Ala Lys Pro Val Glu Glu Glu
              370                 375                 380                 
          Pro Ala Lys Pro Ala Glu Lys Thr Glu Ala Glu Lys Ala Ala Glu Ala
          385                 390                 395                 400 
          Lys Thr Glu Ala Asp Ala Lys Val Ala Glu Leu Gln Lys Lys Ala Asp
                          405                 410                 415     
          Glu Ala Lys Thr Lys Ala Asp Glu Ala Thr Ala Lys Ala Thr Lys Glu
                      420                 425                 430         
          Ala Glu Asp Val Lys Ala Ala Glu Lys Ala Lys Glu Glu Ala Asp Lys
                  435                 440                 445             
          Ala Lys Thr Asp Ala Glu Ala Glu Leu Ala Lys Ala Lys Glu Glu Ala
              450                 455                 460                 
          Glu Lys Ala Lys Ala Lys Val Glu Glu Leu Lys Lys Glu Glu Lys Asp
          465                 470                 475                 480 
          Asn Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Leu Asp Gln Leu Glu Lys Asp Ile
                          485                 490                 495     
          Asp Ala Asp Ala Thr Ile Thr Asn Lys Glu Glu Ala Lys Lys Ala Leu
                      500                 505                 510         
          Gly Lys Glu Asp Ile Leu Ala Ala Val Glu Lys Gly Asp Leu Thr Ala
                  515                 520                 525             
          Gly Asp Val Leu Lys Glu Leu Glu Asn Gln Asn Ala Thr Ala Glu Ala
              530                 535                 540                 
          Thr Lys Asp Gln Asp Pro Gln Ala Asp Glu Ile Gly Ala Thr Lys Gln
          545                 550                 555                 560 
          Glu Gly Lys Pro Leu Ser Glu Leu Pro Ala Ala Asp Lys Glu Lys Leu
                          565                 570                 575     
          Asp Ala Ala Tyr Asn Lys Glu Ala Ser Lys Pro Ile Val Lys Lys Leu
                      580                 585                 590         
          Gln Asp Ile Ala Asp Asp Leu Val Glu Lys Ile Glu Lys Leu Thr Lys
                  595                 600                 605             
          Val Ala Asp Lys Asp Lys Ala Asp Ala Thr Glu Lys Ala Lys Ala Val
              610                 615                 620                 
          Glu Glu Lys Asn Ala Ala Leu Asp Lys Gln Lys Glu Thr Leu Asp Lys
          625                 630                 635                 640 
          Ala Lys Ala Ala Leu Glu Thr Ala Lys Lys Asn Gln Ala Asp Gln Ala
                          645                 650                 655     
          Ile Gln Asp Gly Leu Gln Asp Ala Val Thr Lys Leu Glu Ala Ser Phe
                      660                 665                 670         
          Ala Ser Ala Lys Thr Ala Ala Asp Glu Ala Gln Ala Lys Phe Asp Glu
                  675                 680                 685             
          Val Asn Glu Val Val Lys Ala Tyr Lys Ala Ala Ile Asp Glu Leu Thr
              690                 695                 700                 
          Asp Asp Tyr Asn Ala Thr Leu Gly His Ile Glu Asn Leu Lys Glu Val
          705                 710                 715                 720 
          Pro Lys Gly Glu Glu Pro Lys Asp Phe Ser Gly Gly Val Asn Asp Asp
                          725                 730                 735     
          Glu Ala Pro Ser Ser Thr Pro Asn Thr Asn Glu Phe Thr Gly Gly Ala
                      740                 745                 750         
          Asn Asp Ala Asp Ala Pro Thr Ala Pro Asn Ala Asn Glu Phe Ala Gly
                  755                 760                 765             
          Gly Val Asn Asp Glu Glu Ala Pro Thr Thr Glu Asn Lys Pro Glu Phe
              770                 775                 780                 
          Asn Gly Gly Val Asn Asp Glu Glu Ala Pro Thr Val Pro Asn Lys Pro
          785                 790                 795                 800 
          Glu Gly Glu Ala Pro Lys Pro Thr Gly Glu Asn Ala Lys Asp Ala Pro
                          805                 810                 815     
          Val Val Lys Leu Pro Glu Phe Gly Ala Asn Asn Pro Glu Ile Lys Lys
                      820                 825                 830         
          Ile Leu Asp Glu Ile Ala Lys Val Lys Glu Gln Ile Lys Asp Gly Glu
                  835                 840                 845             
          Glu Asn Gly Ser Glu Asp Tyr Tyr Val Glu Gly Leu Lys Glu Arg Leu
              850                 855                 860                 
          Ala Asp Leu Glu Glu Ala Phe Asp Thr Leu Ser Lys Asn Leu Pro Ala
          865                 870                 875                 880 
          Val Asn Lys Val Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Val Thr Pro Glu Asn Gly
                          885                 890                 895     
          Gln Thr Gln Pro Ala Val Asn Thr Pro Gly Gly Gln Gln Gly Gly Ser
                      900                 905                 910         
          Ser Gln Gln Thr Pro Ala Val Gln Gln Gly Gly Ser Gly Gln Gln Ala
                  915                 920                 925             
          Pro Ala Val Gln Gln Gly Gly Ser Asn Gln Gln Val Pro Ala Val Gln
              930                 935                 940                 
          Gln Thr Asn Thr Pro Ala Val Ala Gly Thr Ser Gln Asp Asn Thr Tyr
          945                 950                 955                 960 
          Gln Ala Pro Ala Ala Lys Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Pro Asn Thr
                          965                 970                 975     
          Gly Gly Gln Glu Ser Ala Ala Leu Ala Ser Val Gly Phe Leu Gly Leu
                      980                 985                 990         
          Leu Leu Gly Ala Leu Pro Phe Val Lys Arg Lys Asn
                  995                 1000                
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 1145]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Met Lys Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Lys Arg Arg Tyr Gly Ile Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Phe Ala Val Gly Ala Ala Ser Val Val Ile Gly Thr Val Val Phe Gly
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Pro Val Leu Ala Gln Glu Gln Ala Asn Ala Ala Gly Ala Asn
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Thr Val Glu Pro Gly Gln Gly Leu Ser Glu Leu Pro Lys Glu
              50                  55                  60                  
          Ala Ser Ser Gly Asp Leu Ala His Leu Asp Lys Asp Leu Ala Gly Lys
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ala Ala Ala Gln Asp Asn Gly Val Glu Val Asp Gln Asp His Leu
                          85                  90                  95      
          Lys Lys Asn Glu Ser Ala Glu Ser Glu Thr Pro Ser Ser Thr Glu Thr
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Glu Gly Thr Asn Lys Glu Glu Glu Ser Glu Asp Gln Gly Ala
                  115                 120                 125             
          Ile Pro Arg Asp Tyr Tyr Ser Arg Asp Leu Lys Asn Ala Asn Pro Val
              130                 135                 140                 
          Leu Glu Lys Glu Asp Val Glu Thr Asn Ala Ala Asn Gly Gln Arg Val
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Ser Asn Glu Leu Asp Lys Leu Lys Gln Leu Lys Asn Ala Thr
                          165                 170                 175     
          Val His Met Glu Phe Lys Pro Asp Ala Ser Ala Pro Arg Phe Tyr Asn
                      180                 185                 190         
          Leu Phe Ser Val Ser Ser Asp Thr Lys Glu Asn Glu Tyr Phe Thr Ile
                  195                 200                 205             
          Ser Val Leu Asp Asn Thr Ala Leu Ile Glu Gly Arg Gly Ala Asn Gly
              210                 215                 220                 
          Glu Gln Phe Tyr Asp Lys Tyr Thr Asp Ala Pro Leu Lys Val Arg Pro
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gln Trp Asn Ser Val Thr Phe Thr Val Glu Gln Pro Thr Thr Glu
                          245                 250                 255     
          Leu Pro His Gly Arg Val Arg Leu Tyr Val Asn Gly Val Leu Ser Arg
                      260                 265                 270         
          Thr Ser Leu Lys Ser Gly Asn Phe Ile Lys Asp Met Pro Asp Val Asn
                  275                 280                 285             
          Gln Ala Gln Leu Gly Ala Thr Lys Arg Gly Asn Lys Thr Val Trp Ala
              290                 295                 300                 
          Ser Asn Leu Gln Val Arg Asn Leu Thr Val Tyr Asp Arg Ala Leu Ser
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Glu Val Gln Thr Arg Ser Gln Leu Phe Glu Arg Gly Glu Leu
                          325                 330                 335     
          Glu Gln Lys Leu Pro Glu Gly Ala Lys Val Thr Glu Lys Glu Asp Val
                      340                 345                 350         
          Phe Glu Gly Gly Arg Asn Asn Gln Pro Asn Lys Asp Gly Ile Lys Ser
                  355                 360                 365             
          Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Lys Thr Asp Lys Gly Thr Leu Ile Ala
              370                 375                 380                 
          Gly Thr Asp Glu Arg Arg Leu His His Ser Asp Trp Gly Asp Ile Gly
          385                 390                 395                 400 
          Met Val Val Arg Arg Ser Ser Asp Asn Gly Lys Thr Trp Gly Asp Arg
                          405                 410                 415     
          Ile Val Ile Ser Asn Pro Arg Asp Asn Glu His Ala Lys His Ala Asp
                      420                 425                 430         
          Trp Pro Ser Pro Val Asn Ile Asp Met Ala Leu Val Gln Asp Pro Glu
                  435                 440                 445             
          Thr Lys Arg Ile Phe Ala Ile Tyr Asp Met Phe Leu Glu Ser Lys Ala
              450                 455                 460                 
          Val Phe Ser Leu Pro Gly Gln Ala Pro Lys Ala Tyr Glu Gln Val Gly
          465                 470                 475                 480 
          Asp Lys Val Tyr Gln Val Leu Tyr Lys Gln Gly Glu Ser Gly Arg Tyr
                          485                 490                 495     
          Thr Ile Arg Glu Asn Gly Glu Val Phe Asp Pro Gln Asn Arg Lys Thr
                      500                 505                 510         
          Asp Tyr Arg Val Val Val Asp Pro Lys Lys Pro Ala Tyr Ser Asp Lys
                  515                 520                 525             
          Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Asn Glu Leu Ile Gly Asn Ile Tyr Phe Glu
              530                 535                 540                 
          Tyr Ser Glu Lys Asn Ile Phe Arg Val Ser Asn Thr Asn Tyr Leu Trp
          545                 550                 555                 560 
          Met Ser Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Lys Asp
                          565                 570                 575     
          Ile Thr His Gly Ile Arg Lys Asp Trp Met His Phe Leu Gly Thr Gly
                      580                 585                 590         
          Pro Gly Thr Gly Ile Ala Leu Arg Thr Gly Pro His Lys Gly Arg Leu
                  595                 600                 605             
          Val Ile Pro Val Tyr Thr Thr Asn Asn Val Ser Tyr Leu Ser Gly Ser
              610                 615                 620                 
          Gln Ser Ser Arg Val Ile Tyr Ser Asp Asp His Gly Glu Thr Trp Gln
          625                 630                 635                 640 
          Ala Gly Glu Ala Val Asn Asp Asn Arg Pro Val Gly Asn Gln Thr Ile
                          645                 650                 655     
          His Ser Ser Thr Met Asn Asn Pro Gly Ala Gln Asn Thr Glu Ser Thr
                      660                 665                 670         
          Val Val Gln Leu Asn Asn Gly Asp Leu Lys Leu Phe Met Arg Gly Leu
                  675                 680                 685             
          Thr Gly Asp Leu Gln Val Ala Thr Ser His Asp Gly Gly Ala Thr Trp
              690                 695                 700                 
          Asp Lys Glu Ile Lys Arg Tyr Pro Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Gln
          705                 710                 715                 720 
          Met Ser Ala Ile His Thr Met His Glu Gly Lys Glu Tyr Ile Leu Leu
                          725                 730                 735     
          Ser Asn Ala Gly Gly Pro Gly Arg Asn Asn Gly Leu Val His Leu Ala
                      740                 745                 750         
          Arg Val Glu Glu Asn Gly Glu Leu Thr Trp Leu Lys His Asn Pro Ile
                  755                 760                 765             
          Gln Ser Gly Lys Phe Ala Tyr Asn Ser Leu Gln Asp Leu Gly Asn Gly
              770                 775                 780                 
          Glu Tyr Gly Leu Leu Tyr Glu His Ala Asp Gly Asn Gln Asn Asp Tyr
          785                 790                 795                 800 
          Thr Leu Ser Tyr Lys Lys Phe Asn Trp Asp Phe Leu Thr Lys Asp Trp
                          805                 810                 815     
          Ile Ser Pro Lys Glu Ala Lys Val Lys Tyr Ala Ile Glu Lys Trp Pro
                      820                 825                 830         
          Gly Ile Leu Ala Met Glu Phe Asp Ser Glu Val Leu Val Asn Lys Ala
                  835                 840                 845             
          Pro Thr Leu Gln Leu Ala Asn Gly Lys Thr Ala Arg Phe Met Thr Gln
              850                 855                 860                 
          Tyr Asp Thr Lys Thr Leu Leu Phe Thr Val Asp Ser Glu Asp Met Gly
          865                 870                 875                 880 
          Gln Lys Val Thr Gly Leu Ala Glu Gly Ala Ile Glu Ser Met His Asn
                          885                 890                 895     
          Leu Pro Val Ser Val Ala Gly Thr Lys Leu Ser Asn Gly Met Asn Gly
                      900                 905                 910         
          Ser Glu Ala Ala Val His Glu Val Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu Gly
                  915                 920                 925             
          Thr Ala Gly Glu Glu Pro Ala Pro Thr Val Glu Lys Pro Glu Phe Thr
              930                 935                 940                 
          Gly Gly Val Asn Gly Glu Glu Ala Ala Val His Glu Val Pro Glu Tyr
          945                 950                 955                 960 
          Thr Gly Pro Leu Gly Thr Ser Gly Glu Glu Pro Ala Pro Thr Val Glu
                          965                 970                 975     
          Lys Pro Glu Phe Thr Gly Gly Val Asn Ala Val Glu Ala Ala Ala His
                      980                 985                 990         
          Glu Val Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu Gly Thr Ser Gly Lys Glu Pro
                  995                 1000                1005            
          Ala Pro Thr Val Glu Lys Pro Glu Tyr Thr Gly Gly Val Asn Ala Val
              1010                1015                1020                
          Glu Ala Ala Val His Glu Val Pro Glu Tyr Thr Gly Pro Leu Ala Thr
          1025                1030                1035               1040 
          Val Gly Glu Glu Ala Ala Pro Lys Val Asp Lys Pro Glu Phe Thr Gly
                          1045                1050                1055    
          Gly Val Asn Ala Val Glu Ala Ala Val His Glu Leu Pro Glu Tyr Thr
                      1060                1065                1070        
          Gly Gly Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Val His Glu Ile Ala Glu Tyr
                  1075                1080                1085            
          Lys Gly Ala Asp Ser Leu Val Thr Leu Ala Ala Glu Asp Tyr Thr Tyr
              1090                1095                1100                
          Lys Ala Pro Leu Ala Gln Gln Thr Leu Pro Asp Thr Gly Asn Lys Glu
          1105                1110                1115               1120 
          Ser Ser Leu Leu Ala Ser Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Gly Leu
                          1125                1130                1135    
          Phe Ala Met Gly Lys Lys Arg Glu Lys
                      1140                1145
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 1797]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Met Glu Lys Ile Trp Arg Glu Lys Ser Cys Arg Tyr Ser Ile Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Leu Thr Val Gly Thr Ala Ser Val Leu Leu Gly Ala Val Phe Leu Ala
                      20                  25                  30          
          Ser His Thr Val Ser Ala Asp Thr Ile Lys Val Lys Gln Asn Glu Ser
                  35                  40                  45              
          Thr Leu Glu Lys Thr Thr Ala Lys Thr Asp Thr Val Thr Lys Thr Thr
              50                  55                  60                  
          Glu Ser Thr Glu His Thr Gln Pro Ser Glu Ala Ile Asp His Ser Lys
          65                  70                  75                  80  
          Gln Val Leu Ala Asn Asn Ser Ser Ser Glu Ser Lys Pro Thr Glu Ala
                          85                  90                  95      
          Lys Val Ala Ser Ala Thr Thr Asn Gln Ala Ser Thr Glu Ala Ile Val
                      100                 105                 110         
          Lys Pro Asn Glu Asn Lys Glu Thr Glu Lys Gln Glu Leu Pro Val Thr
                  115                 120                 125             
          Glu Gln Ser Asn Tyr Gln Leu Asn Tyr Asp Arg Pro Thr Ala Pro Ser
              130                 135                 140                 
          Tyr Asp Gly Trp Glu Lys Gln Ala Leu Pro Val Gly Asn Gly Glu Met
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ala Lys Val Phe Gly Leu Ile Gly Glu Glu Arg Ile Gln Tyr Asn
                          165                 170                 175     
          Glu Lys Thr Leu Trp Ser Gly Gly Pro Arg Pro Asp Ser Thr Asp Tyr
                      180                 185                 190         
          Asn Gly Gly Asn Tyr Arg Glu Arg Tyr Lys Ile Leu Ala Glu Ile Arg
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Glu Asp Gly Asp Arg Gln Lys Ala Lys Arg Leu Ala Glu
              210                 215                 220                 
          Gln Asn Leu Val Gly Pro Asn Asn Ala Gln Tyr Gly Arg Tyr Leu Ala
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gly Asp Ile Phe Met Val Phe Asn Asn Gln Lys Lys Gly Leu Asp
                          245                 250                 255     
          Thr Val Thr Asp Tyr His Arg Gly Leu Asp Ile Thr Glu Ala Thr Thr
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Ser Tyr Thr Gln Asp Gly Thr Thr Phe Lys Arg Glu Thr Phe
                  275                 280                 285             
          Ser Ser Tyr Pro Asp Asp Val Thr Val Thr His Leu Thr Gln Lys Gly
              290                 295                 300                 
          Asp Lys Lys Leu Asp Phe Thr Val Trp Asn Ser Leu Thr Glu Asp Leu
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ala Asn Gly Asp Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asn Tyr Lys Ser Gly
                          325                 330                 335     
          His Val Thr Thr Asp Pro Asn Gly Ile Leu Leu Lys Gly Thr Val Lys
                      340                 345                 350         
          Asp Asn Gly Leu Gln Phe Ala Ser Tyr Leu Gly Ile Lys Thr Asp Gly
                  355                 360                 365             
          Lys Val Thr Val His Glu Asp Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Tyr
              370                 375                 380                 
          Ala Thr Leu Leu Leu Ser Ala Lys Thr Asn Phe Ala Gln Asn Pro Lys
          385                 390                 395                 400 
          Thr Asn Tyr Arg Lys Asp Ile Asp Leu Glu Lys Thr Val Lys Gly Ile
                          405                 410                 415     
          Val Glu Ala Ala Gln Gly Lys Tyr Tyr Glu Thr Leu Lys Arg Asn His
                      420                 425                 430         
          Ile Lys Asp Tyr Gln Ser Leu Phe Asn Arg Val Lys Leu Asn Leu Gly
                  435                 440                 445             
          Gly Ser Asn Ile Ala Gln Thr Thr Lys Glu Ala Leu Gln Thr Tyr Asn
              450                 455                 460                 
          Pro Thr Lys Gly Gln Lys Leu Glu Glu Leu Phe Phe Gln Tyr Gly Arg
          465                 470                 475                 480 
          Tyr Leu Leu Ile Ser Ser Ser Arg Asp Arg Thr Asp Ala Leu Pro Ala
                          485                 490                 495     
          Asn Leu Gln Gly Val Trp Asn Ala Val Asp Asn Pro Pro Trp Asn Ala
                      500                 505                 510         
          Asp Tyr His Leu Asn Val Asn Leu Gln Met Asn Tyr Trp Pro Ala Tyr
                  515                 520                 525             
          Met Ser Asn Leu Ala Glu Thr Ala Lys Pro Met Ile Asn Tyr Ile Asp
              530                 535                 540                 
          Asp Met Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Gly Ile
          545                 550                 555                 560 
          Glu Ser Lys Asp Gly Gln Glu Asn Gly Trp Leu Val His Thr Gln Ala
                          565                 570                 575     
          Thr Pro Phe Gly Trp Thr Thr Pro Gly Trp Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp
                      580                 585                 590         
          Ser Pro Ala Ala Asn Ala Trp Met Met Gln Asn Val Tyr Asp Tyr Tyr
                  595                 600                 605             
          Lys Phe Thr Lys Asp Glu Thr Tyr Leu Lys Glu Lys Ile Tyr Pro Met
              610                 615                 620                 
          Leu Lys Glu Thr Ala Lys Phe Trp Asn Ser Phe Leu His Tyr Asp Gln
          625                 630                 635                 640 
          Ala Ser Asp Arg Trp Val Ser Ser Pro Ser Tyr Ser Pro Glu His Gly
                          645                 650                 655     
          Thr Ile Thr Ile Gly Asn Thr Phe Asp Gln Ser Leu Val Trp Gln Leu
                      660                 665                 670         
          Phe His Asp Tyr Met Glu Val Ala Asn His Leu Asn Val Asp Lys Asp
                  675                 680                 685             
          Leu Val Thr Glu Val Lys Ala Lys Phe Asp Lys Leu Lys Pro Leu His
              690                 695                 700                 
          Ile Asn Lys Glu Gly Arg Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Glu Asp Ser Pro
          705                 710                 715                 720 
          Gln Phe Thr Asn Glu Gly Ile Glu Asn Asn His Arg His Val Ser His
                          725                 730                 735     
          Leu Val Gly Leu Phe Pro Gly Thr Leu Phe Ser Lys Asp Gln Ala Glu
                      740                 745                 750         
          Tyr Leu Glu Ala Ala Arg Ala Thr Leu Asn His Arg Gly Asp Gly Gly
                  755                 760                 765             
          Thr Gly Trp Ser Lys Ala Asn Lys Ile Asn Leu Trp Ala Arg Leu Leu
              770                 775                 780                 
          Asp Gly Asn Arg Ala His Arg Leu Leu Ala Glu Gln Leu Lys Tyr Ser
          785                 790                 795                 800 
          Thr Leu Glu Asn Leu Trp Asp Thr His Ala Pro Phe Gln Ile Asp Gly
                          805                 810                 815     
          Asn Phe Gly Ala Thr Ser Gly Ile Ala Glu Met Leu Leu Gln Ser His
                      820                 825                 830         
          Thr Gly Tyr Ile Ala Pro Leu Pro Ala Leu Pro Asp Ala Trp Lys Asp
                  835                 840                 845             
          Gly Gln Val Ser Gly Leu Val Ala Arg Gly Asn Phe Glu Val Ser Met
              850                 855                 860                 
          Gln Trp Lys Asp Lys Asn Leu Gln Ser Leu Ser Phe Leu Ser Asn Val
          865                 870                 875                 880 
          Gly Gly Asp Leu Val Val Asp Tyr Pro Asn Ile Glu Ala Ser Gln Val
                          885                 890                 895     
          Lys Val Asn Gly Lys Pro Val Lys Ala Thr Val Leu Lys Asp Gly Arg
                      900                 905                 910         
          Ile Gln Leu Ala Thr Gln Lys Gly Asp Val Ile Thr Phe Glu His Phe
                  915                 920                 925             
          Ser Gly Arg Val Thr Ser Leu Thr Ala Val Arg Gln Asn Gly Val Thr
              930                 935                 940                 
          Ala Glu Leu Thr Phe Asn Gln Val Glu Gly Ala Thr His Tyr Val Ile
          945                 950                 955                 960 
          Gln Arg Gln Val Lys Asp Glu Ser Gly Gln Thr Ser Ala Thr Arg Glu
                          965                 970                 975     
          Phe Val Thr Asn Gln Thr His Phe Ile Asp Arg Ser Leu Asp Pro Gln
                      980                 985                 990         
          Leu Ala Tyr Thr Tyr Thr Val Lys Ala Met Leu Gly Asn Val Ser Thr
                  995                 1000                1005            
          Gln Val Ser Glu Lys Ala Asn Val Glu Thr Tyr Asn Gln Leu Met Asp
              1010                1015                1020                
          Asp Arg Asp Ser Arg Ile Gln Tyr Gly Ser Ala Phe Gly Asn Trp Ala
          1025                1030                1035               1040 
          Asp Ser Glu Leu Phe Gly Gly Thr Glu Lys Phe Ala Asp Leu Ser Leu
                          1045                1050                1055    
          Gly Asn Tyr Thr Asp Lys Asp Ala Thr Ala Thr Ile Pro Phe Asn Gly
                      1060                1065                1070        
          Val Gly Ile Glu Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Ile Ala
                  1075                1080                1085            
          Glu Val Lys Ile Asp Gly Lys Ser Val Gly Glu Leu Asp Phe Tyr Thr
              1090                1095                1100                
          Ala Gly Ala Thr Glu Lys Gly Ser Leu Ile Gly Arg Phe Thr Gly Leu
          1105                1110                1115               1120 
          Ser Asp Gly Ala His Val Met Thr Ile Thr Val Lys Gln Glu His Lys
                          1125                1130                1135    
          His Arg Gly Ser Glu Arg Ser Lys Ile Ser Leu Asp Tyr Phe Lys Val
                      1140                1145                1150        
          Leu Pro Gly Gln Gly Thr Thr Ile Glu Lys Met Asp Asp Arg Asp Ser
                  1155                1160                1165            
          Arg Ile Gln Tyr Gly Ser Gln Phe Lys Asp Trp Ser Asp Thr Glu Leu
              1170                1175                1180                
          Tyr Lys Ser Thr Glu Lys Tyr Ala Asp Ile Asn Asn Ser Asp Pro Ser
          1185                1190                1195               1200 
          Thr Ala Ser Glu Ala Gln Ala Thr Ile Pro Phe Thr Gly Thr Gly Ile
                          1205                1210                1215    
          Arg Ile Tyr Gly Leu Lys Thr Ser Ala Leu Gly Lys Ala Leu Val Thr
                      1220                1225                1230        
          Leu Asp Gly Lys Glu Met Pro Ser Leu Asp Phe Tyr Thr Ala Gly Ala
                  1235                1240                1245            
          Thr Gln Lys Ala Thr Leu Ile Gly Glu Phe Thr Asn Leu Thr Asp Gly
              1250                1255                1260                
          Asn His Ile Leu Thr Leu Lys Val Asp Pro Asn Ser Pro Ala Gly Arg
          1265                1270                1275               1280 
          Lys Lys Ile Ser Leu Asp Ser Phe Asp Val Ile Lys Ser Pro Ala Val
                          1285                1290                1295    
          Ser Leu Asp Ser Pro Ser Ile Ala Pro Leu Lys Lys Gly Asp Lys Asn
                      1300                1305                1310        
          Ile Ser Leu Thr Leu Pro Ala Gly Asp Trp Glu Ala Ile Ala Val Thr
                  1315                1320                1325            
          Phe Pro Gly Ile Lys Asp Pro Leu Val Leu Arg Arg Ile Asp Asp Asn
              1330                1335                1340                
          His Leu Val Thr Thr Gly Asp Gln Thr Val Leu Ser Ile Gln Asp Asn
          1345                1350                1355               1360 
          Gln Val Gln Ile Pro Ile Pro Asp Glu Thr Asn Arg Lys Ile Gly Asn
                          1365                1370                1375    
          Ala Ile Glu Ala Tyr Ser Ile Gln Gly Asn Thr Thr Ser Ser Pro Val
                      1380                1385                1390        
          Val Ala Val Phe Thr Lys Lys Asp Glu Lys Lys Val Glu Asn Gln Gln
                  1395                1400                1405            
          Pro Thr Thr Ser Lys Gly Asp Asp Pro Ala Pro Ile Val Glu Ile Pro
              1410                1415                1420                
          Glu Tyr Thr Lys Pro Ile Gly Thr Ala Gly Leu Glu Gln Pro Pro Thr
          1425                1430                1435               1440 
          Val Ser Ile Pro Glu Tyr Thr Gln Pro Ile Gly Thr Ala Gly Leu Glu
                          1445                1450                1455    
          Gln Ala Pro Thr Val Ser Ile Pro Glu Tyr Thr Lys Pro Val Gly Thr
                      1460                1465                1470        
          Ala Gly Ile Glu Gln Ala Pro Thr Val Ser Ile Pro Glu Tyr Thr Lys
                  1475                1480                1485            
          Pro Ile Gly Thr Ala Gly Leu Glu Gln Ala Pro Thr Val Ser Ile Pro
              1490                1495                1500                
          Glu Tyr Thr Gln Pro Ile Gly Thr Ala Gly Leu Glu Gln Pro Pro Thr
          1505                1510                1515               1520 
          Val Ser Ile Pro Glu Tyr Thr Lys Ser Ile Gly Thr Ala Gly Leu Glu
                          1525                1530                1535    
          Gln Pro Pro Val Val Asn Val Pro Glu Tyr Thr Gln Pro Ile Gly Thr
                      1540                1545                1550        
          Ala Gly Ile Glu Gln Pro Pro Thr Val Ser Ile Pro Glu Tyr Thr Lys
                  1555                1560                1565            
          Pro Ile Gly Thr Ala Gly Gln Glu Gln Ala Leu Thr Val Ser Ile Pro
              1570                1575                1580                
          Glu Tyr Thr Lys Pro Ile Gly Thr Ala Gly Gln Glu Gln Ala Pro Thr
          1585                1590                1595               1600 
          Val Ser Val Pro Glu Tyr Lys Leu Arg Val Leu Lys Asp Glu Arg Thr
                          1605                1610                1615    
          Gly Val Glu Ile Ile Gly Gly Ala Thr Asp Leu Glu Gly Ile Ser His
                      1620                1625                1630        
          Ile Ser Ser Arg Arg Val Leu Ala Gln Glu Leu Phe Gly Lys Thr Tyr
                  1635                1640                1645            
          Asp Ala Tyr Asp Leu His Leu Lys Asn Ser Thr Asp Gln Ser Leu Gln
              1650                1655                1660                
          Pro Lys Gly Ser Val Leu Val Arg Leu Pro Ile Ser Ser Ala Val Glu
          1665                1670                1675               1680 
          Asn Val Tyr Tyr Leu Thr Pro Ser Lys Glu Leu Gln Ala Leu Asp Phe
                          1685                1690                1695    
          Thr Ile Arg Glu Gly Met Ala Glu Phe Thr Thr Ser His Phe Ser Thr
                      1700                1705                1710        
          Tyr Ala Val Val Tyr Gln Ala Asn Gly Ala Ser Thr Thr Ala Glu Gln
                  1715                1720                1725            
          Lys Pro Ser Glu Thr Asp Ile Lys Pro Leu Ala Asn Ser Ser Glu Gln
              1730                1735                1740                
          Val Ser Ser Ser Pro Asp Leu Val Gln Ser Thr Asn Asp Ser Pro Lys
          1745                1750                1755               1760 
          Glu Gln Leu Pro Ala Thr Gly Glu Thr Ser Asn Pro Leu Leu Phe Leu
                          1765                1770                1775    
          Ser Gly Leu Ser Leu Val Leu Thr Ala Thr Phe Leu Leu Lys Ser Lys
                      1780                1785                1790        
          Lys Asp Glu Ser Asn
                  1795        
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 2115]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          Met Lys Gln Tyr Phe Leu Glu Lys Gly Arg Ile Phe Ser Ile Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Leu Thr Val Gly Val Ala Ser Val Ala Val Gly Leu Thr Phe Phe Ala
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Asn Val Ala Ala Ser Glu Leu Val Thr Glu Pro Lys Leu Glu
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Gln Ser Lys Glu Val Ala Asp Val Lys His Glu Lys Glu
              50                  55                  60                  
          Glu Ala Val Lys Glu Glu Ala Val Lys Glu Glu Val Thr Glu Lys Thr
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Thr Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Ala Lys Thr Ala Glu Val
                          85                  90                  95      
          Ala Gly Asp Val Leu Pro Glu Glu Ile Pro Asp Arg Ala Tyr Pro Asp
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Val Lys Lys Val Asp Thr Ala Ala Ile Val Ser Glu Gln Glu
                  115                 120                 125             
          Ser Pro Gln Val Glu Thr Lys Ser Ile Leu Lys Pro Thr Glu Val Ala
              130                 135                 140                 
          Pro Thr Glu Gly Glu Lys Glu Asn Arg Ala Val Ile Asn Gly Gly Gln
          145                 150                 155                 160 
          Asp Leu Lys Arg Ile Asn Tyr Glu Gly Gln Pro Ala Thr Ser Ala Ala
                          165                 170                 175     
          Met Val Tyr Thr Ile Phe Ser Ser Pro Leu Ala Gly Gly Gly Ser Gln
                      180                 185                 190         
          Arg Tyr Leu Asn Ser Gly Ser Gly Ile Phe Val Ala Pro Asn Ile Met
                  195                 200                 205             
          Leu Thr Val Ala His Asn Phe Leu Val Lys Asp Ala Asp Thr Asn Ala
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Ile Arg Gly Gly Asp Thr Thr Lys Phe Tyr Tyr Asn Val Gly
          225                 230                 235                 240 
          Ser Asn Thr Ala Lys Asn Asn Ser Leu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Val
                          245                 250                 255     
          Leu Phe Lys Glu Lys Asp Ile His Phe Trp Asn Lys Glu Lys Phe Gly
                      260                 265                 270         
          Glu Gly Ile Lys Asn Asp Leu Ala Leu Val Val Ala Pro Val Pro Leu
                  275                 280                 285             
          Ser Ile Ala Ser Pro Asn Lys Ala Ala Thr Phe Thr Pro Leu Ala Glu
              290                 295                 300                 
          His Arg Glu Tyr Lys Ala Gly Glu Pro Val Ser Thr Ile Gly Tyr Pro
          305                 310                 315                 320 
          Thr Asp Ser Thr Ser Pro Glu Leu Lys Glu Pro Ile Val Pro Gly Gln
                          325                 330                 335     
          Leu Tyr Lys Ala Asp Gly Val Val Lys Gly Thr Glu Lys Leu Asp Asp
                      340                 345                 350         
          Lys Gly Ala Val Gly Ile Thr Tyr Arg Leu Thr Ser Val Ser Gly Leu
                  355                 360                 365             
          Ser Gly Gly Gly Ile Ile Asn Gly Asp Gly Lys Val Ile Gly Ile His
              370                 375                 380                 
          Gln His Gly Thr Val Asp Asn Met Asn Ile Ala Glu Lys Asp Arg Phe
          385                 390                 395                 400 
          Gly Gly Gly Leu Val Leu Ser Pro Glu Gln Leu Ala Trp Val Lys Glu
                          405                 410                 415     
          Ile Ile Asp Lys Tyr Gly Val Lys Gly Trp Tyr Gln Gly Asp Asn Gly
                      420                 425                 430         
          Asn Arg Tyr Tyr Phe Thr Pro Glu Gly Glu Met Ile Arg Asn Lys Thr
                  435                 440                 445             
          Ala Val Ile Gly Lys Asn Lys Tyr Ser Phe Asp Gln Asn Gly Ile Ala
              450                 455                 460                 
          Thr Leu Leu Glu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Val Val Val Glu His Leu
          465                 470                 475                 480 
          Asp Gln Lys Asp Asn Pro Val Lys Glu Asn Asp Thr Phe Val Glu Lys
                          485                 490                 495     
          Thr Glu Val Gly Thr Gln Phe Asp Tyr Asn Tyr Lys Thr Glu Ile Glu
                      500                 505                 510         
          Lys Thr Asp Phe Tyr Lys Lys Asn Lys Glu Lys Tyr Glu Ile Val Ser
                  515                 520                 525             
          Ile Asp Gly Lys Ala Val Asn Lys Gln Leu Lys Asp Thr Trp Gly Glu
              530                 535                 540                 
          Asp Tyr Ser Val Val Ser Lys Ala Pro Ala Gly Thr Arg Val Ile Lys
          545                 550                 555                 560 
          Val Val Tyr Lys Val Asn Lys Gly Ser Phe Asp Leu Arg Tyr Arg Leu
                          565                 570                 575     
          Lys Gly Thr Asp Gln Glu Leu Ala Pro Ala Thr Val Asp Asn Asn Asp
                      580                 585                 590         
          Gly Lys Glu Tyr Glu Val Ser Phe Val His Arg Phe Gln Ala Lys Glu
                  595                 600                 605             
          Ile Thr Gly Tyr Arg Ala Val Asn Ala Ser Gln Glu Ala Thr Ile Gln
              610                 615                 620                 
          His Lys Gly Val Asn Gln Val Ile Phe Glu Tyr Glu Lys Ile Glu Asp
          625                 630                 635                 640 
          Pro Lys Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Val Val Asp Pro Lys Asp Glu
                          645                 650                 655     
          Glu Thr Glu Ile Gly Asn Tyr Gly Pro Leu Pro Ser Lys Ala Gln Leu
                      660                 665                 670         
          Asp Tyr His Lys Glu Glu Leu Ala Ala Phe Ile His Tyr Gly Met Asn
                  675                 680                 685             
          Thr Tyr Thr Asn Ser Glu Trp Gly Asn Gly Arg Glu Asn Pro Gln Asn
              690                 695                 700                 
          Phe Asn Pro Thr Asn Leu Asp Thr Asp Gln Trp Ile Lys Thr Leu Lys
          705                 710                 715                 720 
          Asp Ala Gly Phe Lys Arg Thr Ile Met Val Val Lys His His Asp Gly
                          725                 730                 735     
          Phe Val Ile Tyr Pro Ser Gln Tyr Thr Lys His Thr Val Ala Ala Ser
                      740                 745                 750         
          Pro Trp Lys Asp Gly Lys Gly Asp Leu Leu Glu Glu Ile Ser Lys Ser
                  755                 760                 765             
          Ala Thr Lys Tyr Asp Met Asn Met Gly Val Tyr Leu Ser Pro Trp Asp
              770                 775                 780                 
          Ala Asn Asn Pro Lys Tyr His Val Ser Thr Glu Lys Glu Tyr Asn Glu
          785                 790                 795                 800 
          Tyr Tyr Leu Asn Gln Leu Lys Glu Ile Leu Gly Asn Pro Lys Tyr Gly
                          805                 810                 815     
          Asn Lys Gly Lys Phe Ile Glu Val Trp Met Asp Gly Ala Arg Gly Ser
                      820                 825                 830         
          Gly Ala Gln Lys Val Thr Tyr Thr Phe Asp Glu Trp Phe Lys Tyr Ile
                  835                 840                 845             
          Lys Lys Ala Glu Gly Asp Ile Ala Ile Phe Ser Ala Gln Pro Thr Ser
              850                 855                 860                 
          Val Arg Trp Ile Gly Asn Glu Arg Gly Ile Ala Gly Asp Pro Val Trp
          865                 870                 875                 880 
          His Lys Val Lys Lys Ala Lys Ile Thr Asp Asp Val Lys Asn Glu Tyr
                          885                 890                 895     
          Leu Asn His Gly Asp Pro Glu Gly Asp Met Tyr Ser Val Gly Glu Ala
                      900                 905                 910         
          Asp Val Ser Ile Arg Ser Gly Trp Phe Tyr His Asp Asn Gln Gln Pro
                  915                 920                 925             
          Lys Ser Ile Lys Asp Leu Met Asp Ile Tyr Phe Lys Ser Val Gly Arg
              930                 935                 940                 
          Gly Thr Pro Leu Leu Leu Asn Ile Pro Pro Asn Lys Glu Gly Lys Phe
          945                 950                 955                 960 
          Ala Asp Ala Asp Val Ala Arg Leu Lys Glu Phe Arg Ala Thr Leu Asp
                          965                 970                 975     
          Gln Met Tyr Ala Thr Asp Phe Ala Lys Gly Ala Thr Val Thr Ala Ser
                      980                 985                 990         
          Ser Thr Arg Lys Asn His Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Leu Thr Asp Gly
                  995                 1000                1005            
          Lys Asp Asp Thr Ser Trp Ala Leu Ser Asn Asp Ala Lys Thr Gly Glu
              1010                1015                1020                
          Phe Thr Val Asp Leu Gly Gln Lys Arg Arg Phe Asp Val Val Glu Leu
          1025                1030                1035               1040 
          Lys Glu Asp Ile Ala Lys Gly Gln Arg Ile Ser Gly Phe Lys Val Glu
                          1045                1050                1055    
          Val Glu Leu Asn Gly Arg Trp Val Pro Tyr Gly Glu Gly Ser Thr Val
                      1060                1065                1070        
          Gly Tyr Arg Arg Leu Val Gln Gly Gln Pro Val Glu Ala Gln Lys Ile
                  1075                1080                1085            
          Arg Val Thr Ile Thr Asn Ser Gln Ala Thr Pro Ile Leu Thr Asn Phe
              1090                1095                1100                
          Ser Val Tyr Lys Thr Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Asp Gly Tyr Pro
          1105                1110                1115               1120 
          Leu Gly Leu Asp Tyr His Ser Asn Thr Thr Ala Asp Lys Ala Asn Thr
                          1125                1130                1135    
          Thr Trp Tyr Asp Glu Ser Glu Gly Ile Arg Gly Thr Ser Met Trp Thr
                      1140                1145                1150        
          Asn Lys Lys Asp Ala Ser Val Thr Tyr Arg Phe Asn Gly Thr Lys Ala
                  1155                1160                1165            
          Tyr Val Val Ser Thr Val Asp Pro Asn His Gly Glu Met Ser Val Tyr
              1170                1175                1180                
          Val Asp Gly Gln Lys Val Ala Asp Val Gln Thr Asn Asn Ala Ala Arg
          1185                1190                1195               1200 
          Lys Arg Ser Gln Met Val Tyr Glu Thr Asp Asp Leu Ala Pro Gly Glu
                          1205                1210                1215    
          His Thr Ile Lys Leu Val Asn Lys Thr Gly Lys Ala Ile Ala Thr Glu
                      1220                1225                1230        
          Gly Ile Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Gly Lys Gly Met Phe Glu Leu Lys
                  1235                1240                1245            
          Glu Thr Thr Tyr Glu Val Gln Lys Gly Gln Pro Val Thr Val Thr Ile
              1250                1255                1260                
          Lys Arg Val Gly Gly Ser Lys Gly Ala Ala Thr Val His Val Val Thr
          1265                1270                1275               1280 
          Glu Pro Gly Thr Gly Val His Gly Lys Val Tyr Lys Asp Thr Thr Ala
                          1285                1290                1295    
          Asp Leu Thr Phe Gln Asp Gly Glu Thr Glu Lys Thr Leu Thr Ile Pro
                      1300                1305                1310        
          Thr Ile Asp Phe Thr Glu Gln Ala Asp Ser Ile Phe Asp Phe Lys Val
                  1315                1320                1325            
          Lys Met Thr Ser Ala Ser Asp Asn Ala Leu Leu Gly Phe Ala Ser Glu
              1330                1335                1340                
          Ala Thr Val Arg Val Met Lys Ala Asp Leu Leu Gln Lys Asp Gln Val
          1345                1350                1355               1360 
          Ser His Asp Asp Gln Ala Ser Gln Leu Asp Tyr Ser Pro Gly Trp His
                          1365                1370                1375    
          His Glu Thr Asn Ser Ala Gly Lys Tyr Gln Asn Thr Glu Ser Trp Ala
                      1380                1385                1390        
          Ser Phe Gly Arg Leu Asn Glu Glu Gln Lys Lys Asn Ala Ser Val Thr
                  1395                1400                1405            
          Ala Tyr Phe Tyr Gly Thr Gly Leu Glu Ile Lys Gly Phe Val Asp Pro
              1410                1415                1420                
          Gly His Gly Ile Tyr Lys Val Thr Leu Asp Gly Lys Glu Leu Glu Tyr
          1425                1430                1435               1440 
          Gln Asp Gly Gln Gly Asn Ala Thr Asp Val Asn Gly Lys Lys Tyr Phe
                          1445                1450                1455    
          Ser Gly Thr Ala Thr Thr Arg Gln Gly Asp Gln Thr Leu Val Arg Leu
                      1460                1465                1470        
          Thr Gly Leu Glu Glu Gly Trp His Ala Val Thr Leu Gln Leu Asp Pro
                  1475                1480                1485            
          Lys Arg Asn Asp Thr Ser Arg Asn Ile Gly Ile Gln Val Asp Lys Phe
              1490                1495                1500                
          Ile Thr Arg Gly Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Thr Lys Glu Glu Leu Val
          1505                1510                1515               1520 
          Gln Ala Met Lys Asn Trp Lys Asp Glu Leu Ala Lys Phe Asp Gln Thr
                          1525                1530                1535    
          Ser Leu Lys Asn Thr Pro Glu Ala Arg Gln Ala Phe Lys Ser Asn Leu
                      1540                1545                1550        
          Asp Lys Leu Ser Glu Gln Leu Ser Ala Ser Pro Ala Asn Ala Gln Glu
                  1555                1560                1565            
          Ile Leu Lys Ile Ala Thr Ala Leu Gln Ala Ile Leu Asp Lys Glu Glu
              1570                1575                1580                
          Asn Tyr Gly Lys Glu Asp Thr Pro Thr Ser Glu Gln Pro Glu Glu Pro
          1585                1590                1595               1600 
          Asn Tyr Asp Lys Ala Met Ala Ser Leu Ser Glu Ala Ile Gln Asn Lys
                          1605                1610                1615    
          Ser Lys Glu Leu Ser Ser Asp Lys Glu Ala Lys Lys Lys Leu Val Glu
                      1620                1625                1630        
          Leu Ser Glu Gln Ala Leu Thr Ala Ile Gln Glu Ala Lys Thr Gln Asp
                  1635                1640                1645            
          Ala Val Asp Lys Ala Leu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ile Asn Gln Leu
              1650                1655                1660                
          Gln Ala Thr Pro Lys Glu Glu Val Lys Pro Ser Gln Pro Glu Glu Pro
          1665                1670                1675               1680 
          Asn Tyr Asp Lys Ala Met Ala Ser Leu Ala Glu Ala Ile Gln Asn Lys
                          1685                1690                1695    
          Ser Lys Glu Leu Gly Ser Asp Lys Glu Ser Lys Lys Lys Leu Val Glu
                      1700                1705                1710        
          Leu Ser Glu Gln Ala Leu Thr Ala Ile Gln Glu Ala Lys Thr Gln Asp
                  1715                1720                1725            
          Ala Val Asp Lys Ala Leu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ile Asn Gln Leu
              1730                1735                1740                
          Gln Ala Thr Pro Lys Glu Glu Ala Lys Pro Ser Gln Pro Glu Glu Pro
          1745                1750                1755               1760 
          Asn Tyr Asp Lys Ala Met Ala Ser Leu Ala Glu Ala Ile Gln Asn Lys
                          1765                1770                1775    
          Ser Lys Glu Leu Gly Ser Asp Lys Glu Ala Lys Lys Lys Leu Val Glu
                      1780                1785                1790        
          Leu Ser Glu Gln Ala Leu Thr Ala Ile Gln Glu Ala Lys Thr Gln Asp
                  1795                1800                1805            
          Ala Val Asp Lys Ala Leu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ile Asn Gln Leu
              1810                1815                1820                
          Gln Ala Thr Pro Lys Glu Glu Val Lys His Ser Ile Val Pro Thr Asp
          1825                1830                1835               1840 
          Gly Asp Lys Glu Leu Val Gln Pro Gln Pro Ser Leu Glu Val Val Glu
                          1845                1850                1855    
          Lys Val Ile Asn Phe Lys Lys Val Lys Gln Glu Asp Ser Ser Leu Pro
                      1860                1865                1870        
          Lys Gly Glu Thr Arg Val Thr Gln Val Gly Arg Ala Gly Lys Glu Arg
                  1875                1880                1885            
          Ile Leu Thr Glu Val Ala Pro Asp Gly Ser Arg Thr Ile Lys Leu Arg
              1890                1895                1900                
          Glu Val Val Glu Val Ala Gln Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Thr Lys
          1905                1910                1915               1920 
          Lys Glu Glu Ser Gly Lys Ile Ala Ser Ser Val His Glu Val Pro Glu
                          1925                1930                1935    
          Phe Thr Gly Gly Val Ile Asp Ser Glu Ala Thr Ile His Asn Leu Pro
                      1940                1945                1950        
          Glu Phe Thr Gly Gly Val Thr Asp Ser Glu Ala Ala Ile His Asn Leu
                  1955                1960                1965            
          Pro Glu Phe Thr Gly Gly Val Thr Asp Ser Glu Ala Ala Ile His Asn
              1970                1975                1980                
          Leu Pro Glu Phe Thr Gly Gly Met Thr Asp Ser Glu Ala Ala Ile His
          1985                1990                1995               2000 
          Asn Leu Pro Glu Phe Thr Gly Gly Met Thr Asp Ser Glu Gly Val Ala
                          2005                2010                2015    
          His Gly Val Ser Asn Val Glu Glu Gly Val Pro Ser Gly Glu Ala Thr
                      2020                2025                2030        
          Ser His Gln Glu Ser Gly Phe Thr Ser Asp Val Thr Asp Ser Glu Thr
                  2035                2040                2045            
          Thr Met Asn Glu Ile Val Tyr Lys Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Val Val
              2050                2055                2060                
          Pro Pro Met Leu Glu Asp Lys Thr Tyr Gln Ala Pro Ala Asn Arg Gln
          2065                2070                2075               2080 
          Glu Val Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Asp Gly Ser Ala Phe Ala Ser
                          2085                2090                2095    
          Val Gly Ile Ile Gly Met Phe Leu Gly Met Ile Gly Ile Val Lys Arg
                      2100                2105                2110        
          Lys Lys Asp
                  2115
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 305]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 和緩鏈球菌]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Met Ser Gly Leu Lys Lys Tyr Glu Gly Val Ile Pro Ala Phe Tyr Ala
           1               5                  10                  15      
          Cys Tyr Asp Asp Ala Gly Glu Val Ser Pro Glu Arg Thr Arg Ala Leu
                      20                  25                  30          
          Val Gln Tyr Phe Ile Asp Lys Gly Val Gln Gly Leu Tyr Val Asn Gly
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Gly Glu Cys Ile Tyr Gln Ser Val Glu Asp Arg Lys Leu Ile
              50                  55                  60                  
          Leu Glu Glu Val Met Ala Val Ala Lys Gly Lys Leu Thr Ile Ile Ala
          65                  70                  75                  80  
          His Val Ala Cys Asn Asn Thr Lys Asp Ser Ile Glu Leu Ala Arg His
                          85                  90                  95      
          Ala Glu Ser Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Thr Ile Pro Pro Ile Tyr
                      100                 105                 110         
          Phe Arg Leu Pro Glu Tyr Ser Val Ala Lys Tyr Trp Asn Asp Ile Ser
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Ala Pro Asn Thr Asp Tyr Val Ile Tyr Asn Ile Pro Gln Leu
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Val Ala Leu Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Glu Met Leu Lys Asn
          145                 150                 155                 160 
          Pro Arg Val Ile Gly Val Lys Asn Ser Ser Met Pro Val Gln Asp Ile
                          165                 170                 175     
          Gln Thr Phe Val Ser Leu Gly Gly Asp Asp His Ile Val Phe Asn Gly
                      180                 185                 190         
          Pro Asp Glu Gln Phe Leu Gly Gly Arg Leu Met Gly Ala Lys Ala Gly
                  195                 200                 205             
          Ile Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Met Pro Glu Leu Phe Leu Lys Leu Asn
              210                 215                 220                 
          Gln Leu Ile Ala Asp Lys Asp Leu Glu Thr Ala Arg Glu Leu Gln Tyr
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ile Asn Ala Ile Ile Gly Lys Leu Thr Ala Ala His Gly Asn Met
                          245                 250                 255     
          Tyr Cys Val Ile Lys Glu Val Leu Lys Ile Asn Glu Gly Leu Asn Ile
                      260                 265                 270         
          Gly Ser Val Arg Ser Pro Leu Thr Pro Val Thr Glu Glu Asp Arg Pro
                  275                 280                 285             
          Val Val Glu Ala Ala Ala Gln Leu Ile Arg Glu Ser Lys Glu Arg Phe
              290                 295                 300                 
          Leu
          305 
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 526]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 牙齦卟啉單胞菌]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Met Ala Asn Asn Thr Leu Leu Ala Lys Thr Arg Arg Tyr Val Cys Leu
           1               5                  10                  15      
          Val Val Phe Cys Cys Leu Met Ala Met Met His Leu Ser Gly Gln Glu
                      20                  25                  30          
          Val Thr Met Trp Gly Asp Ser His Gly Val Ala Pro Asn Gln Val Arg
                  35                  40                  45              
          Arg Thr Leu Val Lys Val Ala Leu Ser Glu Ser Leu Pro Pro Gly Ala
              50                  55                  60                  
          Lys Gln Ile Arg Ile Gly Phe Ser Leu Pro Lys Glu Thr Glu Glu Lys
          65                  70                  75                  80  
          Val Thr Ala Leu Tyr Leu Leu Val Ser Asp Ser Leu Ala Val Arg Asp
                          85                  90                  95      
          Leu Pro Asp Tyr Lys Gly Arg Val Ser Tyr Asp Ser Phe Pro Ile Ser
                      100                 105                 110         
          Lys Glu Asp Arg Thr Thr Ala Leu Ser Ala Asp Ser Val Ala Gly Arg
                  115                 120                 125             
          Cys Phe Phe Tyr Leu Ala Ala Asp Ile Gly Pro Val Ala Ser Phe Ser
              130                 135                 140                 
          Arg Ser Asp Thr Leu Thr Ala Arg Val Glu Glu Leu Ala Val Asp Gly
          145                 150                 155                 160 
          Arg Pro Leu Pro Leu Lys Glu Leu Ser Pro Ala Ser Arg Arg Leu Tyr
                          165                 170                 175     
          Arg Glu Tyr Glu Ala Leu Phe Val Pro Gly Asp Gly Gly Ser Arg Asn
                      180                 185                 190         
          Tyr Arg Ile Pro Ser Ile Leu Lys Thr Ala Asn Gly Thr Leu Ile Ala
                  195                 200                 205             
          Met Ala Asp Arg Arg Lys Tyr Asn Gln Thr Asp Leu Pro Glu Asp Ile
              210                 215                 220                 
          Asp Ile Val Met Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Ser Trp Ser Asp
          225                 230                 235                 240 
          Pro Arg Ile Ile Val Gln Gly Glu Gly Arg Asn His Gly Phe Gly Asp
                          245                 250                 255     
          Val Ala Leu Val Gln Thr Gln Ala Gly Lys Leu Leu Met Ile Phe Val
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Val Gly Leu Trp Gln Ser Thr Pro Asp Arg Pro Gln Arg Thr
                  275                 280                 285             
          Tyr Ile Ser Glu Ser Arg Asp Glu Gly Leu Thr Trp Ser Pro Pro Arg
              290                 295                 300                 
          Asp Ile Thr His Phe Ile Phe Gly Lys Asp Cys Ala Asp Pro Gly Arg
          305                 310                 315                 320 
          Ser Arg Trp Leu Ala Ser Phe Cys Ala Ser Gly Gln Gly Leu Val Leu
                          325                 330                 335     
          Pro Ser Gly Arg Val Met Phe Val Ala Ala Ile Arg Glu Ser Gly Gln
                      340                 345                 350         
          Glu Tyr Val Leu Asn Asn Tyr Val Leu Tyr Ser Asp Asp Glu Gly Gly
                  355                 360                 365             
          Thr Trp Gln Leu Ser Asp Cys Ala Tyr His Arg Gly Asp Glu Ala Lys
              370                 375                 380                 
          Leu Ser Leu Met Pro Asp Gly Arg Val Leu Met Ser Val Arg Asn Gln
          385                 390                 395                 400 
          Gly Arg Gln Glu Ser Arg Gln Arg Phe Phe Ala Leu Ser Ser Asp Asp
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Thr Trp Glu Arg Ala Lys Gln Phe Glu Gly Ile His Asp Pro
                      420                 425                 430         
          Gly Cys Asn Gly Ala Met Leu Gln Val Lys Arg Asn Gly Arg Asn Gln
                  435                 440                 445             
          Met Leu His Ser Leu Pro Leu Gly Pro Asp Gly Arg Arg Asp Gly Ala
              450                 455                 460                 
          Val Tyr Leu Phe Asp His Val Ser Gly Arg Trp Ser Ala Pro Val Val
          465                 470                 475                 480 
          Val Asn Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asp Met Thr Leu Leu Ala Asp
                          485                 490                 495     
          Gly Thr Ile Gly Tyr Phe Val Glu Glu Asp Asp Glu Ile Ser Leu Val
                      500                 505                 510         
          Phe Ile Arg Phe Val Leu Asp Asp Leu Phe Asp Ala Arg Gln
                  515                 520                 525     
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 465]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 福賽斯坦納菌]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Met Thr Lys Lys Ser Ser Ile Ser Arg Arg Ser Phe Leu Lys Ser Thr
           1               5                  10                  15      
          Ala Leu Ala Gly Ala Ala Gly Met Val Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr
                      20                  25                  30          
          Leu Leu Thr Ser Cys Gly Gly Gly Ala Ser Ser Asn Glu Asn Ala Asn
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Asn Lys Pro Leu Lys Glu Pro Gly Thr Tyr Tyr Val Pro Glu
              50                  55                  60                  
          Leu Pro Asp Met Ala Ala Asp Gly Lys Glu Leu Lys Ala Gly Ile Ile
          65                  70                  75                  80  
          Gly Cys Gly Gly Arg Gly Ser Gly Ala Ala Met Asn Phe Leu Ala Ala
                          85                  90                  95      
          Ala Asn Gly Val Ser Ile Val Ala Leu Gly Asp Thr Phe Gln Asp Arg
                      100                 105                 110         
          Val Asp Ser Leu Ala Gln Lys Leu Lys Asp Glu Lys Asn Ile Asp Ile
                  115                 120                 125             
          Pro Ala Asp Lys Arg Phe Val Gly Leu Asp Ala Tyr Lys Gln Val Ile
              130                 135                 140                 
          Asp Ser Asp Val Asp Val Val Ile Val Ala Thr Pro Pro Asn Phe Arg
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ile His Phe Gln Tyr Ala Val Glu Lys Ser Lys His Cys Phe Leu
                          165                 170                 175     
          Glu Lys Pro Ile Cys Val Asp Ala Val Gly Tyr Arg Thr Ile Met Ala
                      180                 185                 190         
          Thr Ala Lys Gln Ala Gln Ala Lys Asn Leu Cys Val Ile Thr Gly Thr
                  195                 200                 205             
          Gln Arg His His Gln Arg Ser Tyr Ile Ala Ser Tyr Gln Gln Ile Met
              210                 215                 220                 
          Asn Gly Ala Ile Gly Glu Ile Thr Gly Gly Thr Val Tyr Trp Asn Gln
          225                 230                 235                 240 
          Ser Met Leu Trp Tyr Arg Glu Arg Gln Ala Gly Trp Ser Asp Cys Glu
                          245                 250                 255     
          Trp Met Ile Arg Asp Trp Val Asn Trp Lys Trp Leu Ser Gly Asp His
                      260                 265                 270         
          Ile Val Glu Gln His Val His Asn Ile Asp Val Phe Thr Trp Phe Ser
                  275                 280                 285             
          Gly Leu Lys Pro Val Lys Ala Val Gly Phe Gly Ser Arg Gln Arg Arg
              290                 295                 300                 
          Ile Thr Gly Asp Gln Tyr Asp Asn Phe Ser Ile Asp Phe Thr Met Glu
          305                 310                 315                 320 
          Asn Gly Ile His Leu His Ser Met Cys Arg Gln Ile Asp Gly Cys Ala
                          325                 330                 335     
          Asn Asn Val Ser Glu Phe Ile Gln Gly Thr Lys Gly Ser Trp Asn Ser
                      340                 345                 350         
          Thr Asp Met Gly Ile Lys Asp Leu Ala Gly Asn Val Ile Trp Lys Tyr
                  355                 360                 365             
          Asp Val Glu Ala Glu Lys Ala Ser Phe Lys Gln Asn Asp Pro Tyr Thr
              370                 375                 380                 
          Leu Glu His Val Asn Trp Ile Asn Thr Ile Arg Ala Gly Lys Ser Ile
          385                 390                 395                 400 
          Asp Gln Ala Ser Glu Thr Ala Val Ser Asn Met Ala Ala Ile Met Gly
                          405                 410                 415     
          Arg Glu Ser Ala Tyr Thr Gly Glu Glu Thr Thr Trp Glu Ala Met Thr
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Ala Leu Asp Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Asn Leu Gly Lys Met
                  435                 440                 445             
          Asp Met Lys Pro Phe Val Val Pro Val Pro Gly Lys Pro Leu Glu Lys
              450                 455                 460                 
          Lys
          465 
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 539]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 福賽斯坦納菌]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Met Lys Lys Phe Phe Trp Ile Ile Gly Leu Phe Ile Ser Met Leu Thr
           1               5                  10                  15      
          Thr Arg Ala Ala Asp Ser Val Tyr Val Gln Asn Pro Gln Ile Pro Ile
                      20                  25                  30          
          Leu Ile Asp Arg Thr Asp Asn Val Leu Phe Arg Ile Arg Ile Pro Asp
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Lys Gly Asp Val Leu Asn Arg Leu Thr Ile Arg Phe Gly Asn
              50                  55                  60                  
          Glu Asp Lys Leu Ser Glu Val Lys Ala Val Arg Leu Phe Tyr Ala Gly
          65                  70                  75                  80  
          Thr Glu Ala Gly Thr Lys Gly Arg Ser Arg Phe Ala Pro Val Thr Tyr
                          85                  90                  95      
          Val Ser Ser His Asn Ile Arg Asn Thr Arg Ser Ala Asn Pro Ser Tyr
                      100                 105                 110         
          Ser Val Arg Gln Asp Glu Val Thr Thr Val Ala Asn Thr Leu Thr Leu
                  115                 120                 125             
          Lys Thr Arg Gln Pro Met Val Lys Gly Ile Asn Tyr Phe Trp Val Ser
              130                 135                 140                 
          Val Glu Met Asp Arg Asn Thr Ser Leu Leu Ser Lys Leu Thr Pro Thr
          145                 150                 155                 160 
          Val Thr Glu Ala Val Ile Asn Asp Lys Pro Ala Val Ile Ala Gly Glu
                          165                 170                 175     
          Gln Ala Ala Val Arg Arg Met Gly Ile Gly Val Arg His Ala Gly Asp
                      180                 185                 190         
          Asp Gly Ser Ala Ser Phe Arg Ile Pro Gly Leu Val Thr Thr Asn Glu
                  195                 200                 205             
          Gly Thr Leu Leu Gly Val Tyr Asp Val Arg Tyr Asn Asn Ser Val Asp
              210                 215                 220                 
          Leu Gln Glu His Ile Asp Val Gly Leu Ser Arg Ser Thr Asp Lys Gly
          225                 230                 235                 240 
          Gln Thr Trp Glu Pro Met Arg Ile Ala Met Ser Phe Gly Glu Thr Asp
                          245                 250                 255     
          Gly Leu Pro Ser Gly Gln Asn Gly Val Gly Asp Pro Ser Ile Leu Val
                      260                 265                 270         
          Asp Glu Arg Thr Asn Thr Val Trp Val Val Ala Ala Trp Thr His Gly
                  275                 280                 285             
          Met Gly Asn Ala Arg Ala Trp Thr Asn Ser Met Pro Gly Met Thr Pro
              290                 295                 300                 
          Asp Glu Thr Ala Gln Leu Met Met Val Lys Ser Thr Asp Asp Gly Arg
          305                 310                 315                 320 
          Thr Trp Ser Glu Pro Ile Asn Ile Thr Ser Gln Val Lys Asp Pro Ser
                          325                 330                 335     
          Trp Cys Phe Leu Leu Gln Gly Pro Gly Arg Gly Ile Thr Met Arg Asp
                      340                 345                 350         
          Gly Thr Leu Val Phe Pro Ile Gln Phe Ile Asp Ser Leu Arg Val Pro
                  355                 360                 365             
          His Ala Gly Ile Met Tyr Ser Lys Asp Arg Gly Glu Thr Trp His Ile
              370                 375                 380                 
          His Gln Pro Ala Arg Thr Asn Thr Thr Glu Ala Gln Val Ala Glu Val
          385                 390                 395                 400 
          Glu Pro Gly Val Leu Met Leu Asn Met Arg Asp Asn Arg Gly Gly Ser
                          405                 410                 415     
          Arg Ala Val Ser Ile Thr Arg Asp Leu Gly Lys Ser Trp Thr Glu His
                      420                 425                 430         
          Ser Ser Asn Arg Ser Ala Leu Pro Glu Ser Ile Cys Met Ala Ser Leu
                  435                 440                 445             
          Ile Ser Val Lys Ala Lys Asp Asn Ile Ile Gly Lys Asp Leu Leu Phe
              450                 455                 460                 
          Phe Ser Asn Pro Asn Thr Thr Glu Gly Arg His His Ile Thr Ile Lys
          465                 470                 475                 480 
          Ala Ser Leu Asp Gly Gly Val Thr Trp Leu Pro Ala His Gln Val Leu
                          485                 490                 495     
          Leu Asp Glu Glu Asp Gly Trp Gly Tyr Ser Cys Leu Ser Met Ile Asp
                      500                 505                 510         
          Arg Glu Thr Val Gly Ile Phe Tyr Glu Ser Ser Val Ala His Met Thr
                  515                 520                 525             
          Phe Gln Ala Val Lys Ile Lys Asp Leu Ile Arg
              530                 535                 
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 419]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嗜黏蛋白艾克曼氏菌]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          Met Thr Trp Leu Leu Cys Gly Arg Gly Lys Trp Asn Lys Val Lys Arg
           1               5                  10                  15      
          Met Met Asn Ser Val Phe Lys Cys Leu Met Ser Ala Val Cys Ala Val
                      20                  25                  30          
          Ala Leu Pro Ala Phe Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Phe Pro Thr Asp
                  35                  40                  45              
          Arg Ala Val Thr Val Phe Ser Ala Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Ala Ser
              50                  55                  60                  
          Ile Arg Ile Pro Ala Leu Leu Ser Ile Gly Lys Gly Gln Leu Leu Ala
          65                  70                  75                  80  
          Phe Ala Glu Gly Arg Tyr Lys Asn Thr Asp Gln Gly Glu Asn Asp Ile
                          85                  90                  95      
          Ile Met Ser Val Ser Lys Asn Gly Gly Lys Thr Trp Ser Arg Pro Arg
                      100                 105                 110         
          Ala Ile Ala Lys Ala His Gly Ala Thr Phe Asn Asn Pro Cys Pro Val
                  115                 120                 125             
          Tyr Asp Ala Lys Thr Arg Thr Val Thr Val Val Phe Gln Arg Tyr Pro
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Val Lys Glu Arg Gln Pro Asn Ile Pro Asp Gly Trp Asp Asp
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Cys Ile Arg Asn Phe Met Ile Gln Ser Arg Asn Gly Gly Ser
                          165                 170                 175     
          Ser Trp Thr Lys Pro Gln Glu Ile Thr Lys Thr Thr Lys Arg Pro Ser
                      180                 185                 190         
          Gly Val Asp Ile Met Ala Ser Gly Pro Asn Ala Gly Thr Gln Leu Lys
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Ala His Lys Gly Arg Leu Val Ile Pro Met Asn Glu Gly Pro
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Lys Trp Val Ile Ser Cys Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Gly Lys
          225                 230                 235                 240 
          Ser Trp Lys Leu Gly Gln Pro Thr Ala Asn Met Lys Gly Met Val Asn
                          245                 250                 255     
          Glu Thr Ser Ile Ala Glu Thr Asp Asn Gly Gly Val Val Met Val Ala
                      260                 265                 270         
          Arg His Trp Gly Ala Gly Asn Cys Arg Arg Ile Ala Trp Ser Gln Asp
                  275                 280                 285             
          Gly Gly Glu Thr Trp Gly Gln Val Glu Asp Ala Pro Glu Leu Phe Cys
              290                 295                 300                 
          Asp Ser Thr Gln Asn Ser Leu Met Thr Tyr Ser Leu Ser Asp Gln Pro
          305                 310                 315                 320 
          Ala Tyr Gly Gly Lys Ser Arg Ile Leu Phe Ser Gly Pro Ser Ala Gly
                          325                 330                 335     
          Arg Arg Ile Lys Gly Gln Val Ala Met Ser Tyr Asp Asn Gly Lys Thr
                      340                 345                 350         
          Trp Pro Val Lys Lys Leu Leu Gly Glu Gly Gly Phe Ala Tyr Ser Ser
                  355                 360                 365             
          Leu Ala Met Val Glu Pro Gly Ile Val Gly Val Leu Tyr Glu Glu Asn
              370                 375                 380                 
          Gln Glu His Ile Lys Lys Leu Lys Phe Val Pro Ile Thr Met Glu Trp
          385                 390                 395                 400 
          Leu Thr Asp Gly Glu Asp Thr Gly Leu Ala Pro Gly Lys Lys Ala Pro
                          405                 410                 415     
          Val Leu Lys
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 674]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 嗜黏蛋白艾克曼氏菌]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          Met Gly Leu Gly Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Ser Ile Pro Ser Val
           1               5                  10                  15      
          Leu Gly Lys Glu Ser Phe Glu Gln Ala Arg Arg Gly Lys Phe Thr Thr
                      20                  25                  30          
          Leu Ser Thr Lys Tyr Gly Leu Met Ser Cys Arg Asn Gly Val Ala Glu
                  35                  40                  45              
          Ile Gly Gly Gly Gly Lys Ser Gly Glu Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
              50                  55                  60                  
          Gly Gln Asp Ala Glu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Asp Thr Pro Ser Arg
          65                  70                  75                  80  
          Glu Val Arg Leu Ser Ala Trp Ala Glu Arg Trp Thr Gly Gln Ala Pro
                          85                  90                  95      
          Phe Glu Phe Ser Ile Val Ala Ile Gly Pro Asn Gly Glu Lys Lys Ile
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Gly Lys Asp Ile Arg Thr Gly Gly Phe His Thr Arg Ile Glu
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Pro Ala Gly Thr Arg Ser Leu Val Phe Arg Leu Thr Ser
              130                 135                 140                 
          Pro Glu Asn Lys Gly Met Lys Leu Asp Asp Leu Phe Leu Val Pro Cys
          145                 150                 155                 160 
          Ile Pro Met Lys Val Asn Pro Gln Val Glu Met Ala Ser Ser Ala Tyr
                          165                 170                 175     
          Pro Val Met Val Arg Ile Pro Cys Ser Pro Val Leu Ser Leu Asn Val
                      180                 185                 190         
          Arg Thr Asp Gly Cys Leu Asn Pro Gln Phe Leu Thr Ala Val Asn Leu
                  195                 200                 205             
          Asp Phe Thr Gly Thr Thr Lys Leu Ser Asp Ile Glu Ser Val Ala Val
              210                 215                 220                 
          Ile Arg Gly Glu Glu Ala Pro Ile Ile His His Gly Glu Glu Pro Phe
          225                 230                 235                 240 
          Pro Lys Asp Ser Ser Gln Val Leu Gly Thr Val Lys Leu Ala Gly Ser
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Pro Gln Ile Ser Val Lys Gly Lys Met Glu Leu Glu Pro Gly
                      260                 265                 270         
          Asp Asn Tyr Leu Trp Ala Cys Val Thr Met Lys Glu Gly Ala Ser Leu
                  275                 280                 285             
          Asp Gly Arg Val Val Val Arg Pro Ala Ser Val Val Ala Gly Asn Lys
              290                 295                 300                 
          Pro Val Arg Val Ala Asn Ala Ala Pro Val Ala Gln Arg Ile Gly Val
          305                 310                 315                 320 
          Ala Val Val Arg His Gly Asp Phe Lys Ser Lys Phe Tyr Arg Ile Pro
                          325                 330                 335     
          Gly Leu Ala Arg Ser Arg Lys Gly Thr Leu Leu Ala Val Tyr Asp Ile
                      340                 345                 350         
          Arg Tyr Asn His Ser Gly Asp Leu Pro Ala Asn Ile Asp Val Gly Val
                  355                 360                 365             
          Ser Arg Ser Thr Asp Gly Gly Arg Thr Trp Ser Asp Val Lys Ile Ala
              370                 375                 380                 
          Ile Asp Asp Ser Lys Ile Asp Pro Ser Leu Gly Ala Thr Arg Gly Val
          385                 390                 395                 400 
          Gly Asp Pro Ala Ile Leu Val Asp Glu Lys Thr Gly Arg Ile Trp Val
                          405                 410                 415     
          Ala Ala Ile Trp Ser His Arg His Ser Ile Trp Gly Ser Lys Ser Gly
                      420                 425                 430         
          Asp Asn Ser Pro Glu Ala Cys Gly Gln Leu Val Leu Ala Tyr Ser Asp
                  435                 440                 445             
          Asp Asp Gly Leu Thr Trp Ser Ser Pro Ile Asn Ile Thr Glu Gln Thr
              450                 455                 460                 
          Lys Asn Lys Asp Trp Arg Ile Leu Phe Asn Gly Pro Gly Asn Gly Ile
          465                 470                 475                 480 
          Cys Met Lys Asp Gly Thr Leu Val Phe Ala Ala Gln Tyr Trp Asp Gly
                          485                 490                 495     
          Lys Gly Val Pro Trp Ser Thr Ile Val Tyr Ser Lys Asp Arg Gly Lys
                      500                 505                 510         
          Thr Trp His Cys Gly Thr Gly Val Asn Gln Gln Thr Thr Glu Ala Gln
                  515                 520                 525             
          Val Ile Glu Leu Glu Asp Gly Ser Val Met Ile Asn Ala Arg Cys Asn
              530                 535                 540                 
          Trp Gly Gly Ser Arg Ile Val Gly Val Thr Lys Asp Leu Gly Gln Thr
          545                 550                 555                 560 
          Trp Glu Lys His Pro Thr Asn Arg Thr Ala Gln Leu Lys Glu Pro Val
                          565                 570                 575     
          Cys Gln Gly Ser Leu Leu Ala Val Asp Gly Val Pro Gly Ala Gly Arg
                      580                 585                 590         
          Val Val Leu Phe Ser Asn Pro Asn Thr Thr Ser Gly Arg Ser His Met
                  595                 600                 605             
          Thr Leu Lys Ala Ser Thr Asn Asp Ala Gly Ser Trp Pro Glu Asp Lys
              610                 615                 620                 
          Trp Leu Leu Tyr Asp Ala Arg Lys Gly Trp Gly Tyr Ser Cys Leu Ala
          625                 630                 635                 640 
          Pro Val Asp Lys Asn His Val Gly Val Leu Tyr Glu Ser Gln Gly Ala
                          645                 650                 655     
          Leu Asn Phe Leu Lys Ile Pro Tyr Lys Asp Val Leu Asn Ala Lys Asn
                      660                 665                 670         
          Ala Arg
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 544]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 多形擬桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          Met Lys Arg Asn His Tyr Leu Phe Thr Leu Ile Leu Leu Leu Gly Cys
           1               5                  10                  15      
          Ser Ile Phe Val Lys Ala Ser Asp Thr Val Phe Val His Gln Thr Gln
                      20                  25                  30          
          Ile Pro Ile Leu Ile Glu Arg Gln Asp Asn Val Leu Phe Tyr Phe Arg
                  35                  40                  45              
          Leu Asp Ala Lys Glu Ser Arg Met Met Asp Glu Ile Val Leu Asp Phe
              50                  55                  60                  
          Gly Lys Ser Val Asn Leu Ser Asp Val Gln Ala Val Lys Leu Tyr Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Gly Gly Thr Glu Ala Leu Gln Asp Lys Gly Lys Lys Arg Phe Ala Pro
                          85                  90                  95      
          Val Asp Tyr Ile Ser Ser His Arg Pro Gly Asn Thr Leu Ala Ala Ile
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Tyr Ser Ile Lys Cys Ala Glu Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys
                  115                 120                 125             
          Val Val Leu Lys Ser His Tyr Lys Leu Phe Pro Gly Ile Asn Phe Phe
              130                 135                 140                 
          Trp Ile Ser Leu Gln Met Lys Pro Glu Thr Ser Leu Phe Thr Lys Ile
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Glu Leu Gln Ser Val Lys Ile Asp Gly Lys Glu Ala Ile Cys
                          165                 170                 175     
          Glu Glu Arg Ser Pro Lys Asp Ile Ile His Arg Met Ala Val Gly Val
                      180                 185                 190         
          Arg His Ala Gly Asp Asp Gly Ser Ala Ser Phe Arg Ile Pro Gly Leu
                  195                 200                 205             
          Val Thr Ser Asn Lys Gly Thr Leu Leu Gly Val Tyr Asp Val Arg Tyr
              210                 215                 220                 
          Asn Ser Ser Val Asp Leu Gln Glu Tyr Val Asp Val Gly Leu Ser Arg
          225                 230                 235                 240 
          Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Glu Lys Met Arg Leu Pro Leu Ser
                          245                 250                 255     
          Phe Gly Glu Tyr Asp Gly Leu Pro Ala Ala Gln Asn Gly Val Gly Asp
                      260                 265                 270         
          Pro Ser Ile Leu Val Asp Thr Gln Thr Asn Thr Ile Trp Val Val Ala
                  275                 280                 285             
          Ala Trp Thr His Gly Met Gly Asn Gln Arg Ala Trp Trp Ser Ser His
              290                 295                 300                 
          Pro Gly Met Asp Leu Tyr Gln Thr Ala Gln Leu Val Met Ala Lys Ser
          305                 310                 315                 320 
          Thr Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Lys Pro Ile Asn Ile Thr Glu Gln
                          325                 330                 335     
          Val Lys Asp Pro Ser Trp Tyr Phe Leu Leu Gln Gly Pro Gly Arg Gly
                      340                 345                 350         
          Ile Thr Met Ser Asp Gly Thr Leu Val Phe Pro Thr Gln Phe Ile Asp
                  355                 360                 365             
          Ser Thr Arg Val Pro Asn Ala Gly Ile Met Tyr Ser Lys Asp Arg Gly
              370                 375                 380                 
          Lys Thr Trp Lys Met His Asn Met Ala Arg Thr Asn Thr Thr Glu Ala
          385                 390                 395                 400 
          Gln Val Val Glu Thr Glu Pro Gly Val Leu Met Leu Asn Met Arg Asp
                          405                 410                 415     
          Asn Arg Gly Gly Ser Arg Ala Val Ala Ile Thr Lys Asp Leu Gly Lys
                      420                 425                 430         
          Thr Trp Thr Glu His Pro Ser Ser Arg Lys Ala Leu Gln Glu Pro Val
                  435                 440                 445             
          Cys Met Ala Ser Leu Ile His Val Glu Ala Glu Asp Asn Val Leu Asp
              450                 455                 460                 
          Lys Asp Ile Leu Leu Phe Ser Asn Pro Asn Thr Thr Arg Gly Arg Asn
          465                 470                 475                 480 
          His Ile Thr Ile Lys Ala Ser Leu Asp Asp Gly Leu Thr Trp Leu Pro
                          485                 490                 495     
          Glu His Gln Leu Met Leu Asp Glu Gly Glu Gly Trp Gly Tyr Ser Cys
                      500                 505                 510         
          Leu Thr Met Ile Asp Arg Glu Thr Ile Gly Ile Leu Tyr Glu Ser Ser
                  515                 520                 525             
          Ala Ala His Met Thr Phe Gln Ala Val Lys Leu Lys Asp Leu Ile Arg
              530                 535                 540                 
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 911]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 黏放線菌]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          Met Thr Ser His Ser Pro Phe Ser Arg Arg His Leu Pro Ala Leu Leu
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Leu Pro Leu Ala Ala Thr Gly Leu Ile Ala Ala Ala Pro Pro
                      20                  25                  30          
          Ala His Ala Val Pro Thr Ser Asp Gly Leu Ala Asp Val Thr Ile Thr
                  35                  40                  45              
          Gln Val Asn Ala Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Ser Val Gly Asp Val Met
              50                  55                  60                  
          Thr Phe Asn Ile Thr Leu Thr Asn Thr Ser Gly Glu Ala His Ser Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Ala Pro Ala Ser Thr Asn Leu Ser Gly Asn Val Ser Lys Cys Arg Trp
                          85                  90                  95      
          Arg Asn Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Thr Asp Cys Thr Gly Leu Ala
                      100                 105                 110         
          Thr His Thr Val Thr Ala Glu Asp Leu Lys Ala Gly Gly Phe Thr Pro
                  115                 120                 125             
          Gln Ile Ala Tyr Glu Val Lys Ala Val Glu Tyr Ala Gly Lys Ala Leu
              130                 135                 140                 
          Ser Thr Pro Glu Thr Ile Lys Gly Ala Thr Ser Pro Val Lys Ala Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ser Leu Arg Val Glu Ser Ile Thr Pro Ser Ser Ser Lys Glu Tyr Tyr
                          165                 170                 175     
          Lys Leu Gly Asp Thr Val Thr Tyr Thr Val Arg Val Arg Ser Val Ser
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Thr Ile Asn Val Ala Ala Thr Glu Ser Ser Phe Asp Asp Leu
                  195                 200                 205             
          Gly Arg Gln Cys His Trp Gly Gly Leu Lys Pro Gly Lys Gly Ala Val
              210                 215                 220                 
          Tyr Asn Cys Lys Pro Leu Thr His Thr Ile Thr Gln Ala Asp Val Asp
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gly Arg Trp Thr Pro Ser Ile Thr Leu Thr Ala Thr Gly Thr Asp
                          245                 250                 255     
          Gly Thr Ala Leu Gln Thr Leu Thr Ala Thr Gly Asn Pro Ile Asn Val
                      260                 265                 270         
          Val Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
                  275                 280                 285             
          Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Val Ala Pro Asn
              290                 295                 300                 
          Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
          305                 310                 315                 320 
          Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
                          325                 330                 335     
          Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
                      340                 345                 350         
          Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
                  355                 360                 365             
          Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
              370                 375                 380                 
          Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Trp Gly Asn Ser Gln Ala Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
                          405                 410                 415     
          Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
                      420                 425                 430         
          Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Asn Pro Trp Thr
                  435                 440                 445             
          Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
              450                 455                 460                 
          His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
          465                 470                 475                 480 
          Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
                          485                 490                 495     
          Gln Ala Gly Thr Pro Val Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
                      500                 505                 510         
          Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Ser
                  515                 520                 525             
          Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
              530                 535                 540                 
          Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
          545                 550                 555                 560 
          Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Lys Pro Trp Ser Arg
                      580                 585                 590         
          Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
                  595                 600                 605             
          Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
              610                 615                 620                 
          Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asp
          625                 630                 635                 640 
          Gly Ala Asn Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
                          645                 650                 655     
          Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Ser Pro Ala Pro
                      660                 665                 670         
          Ser Pro Thr Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Glu Gln Pro Ala Pro
                  675                 680                 685             
          Ser Ala Ala Pro Ser Thr Glu Pro Thr Gln Ala Pro Ala Pro Ser Ser
              690                 695                 700                 
          Ala Pro Glu Pro Ser Ala Val Pro Glu Pro Ser Ser Ala Pro Ala Pro
          705                 710                 715                 720 
          Glu Pro Thr Thr Ala Pro Ser Thr Glu Pro Thr Pro Thr Pro Ala Pro
                          725                 730                 735     
          Ser Ser Ala Pro Glu Pro Ser Ala Gly Pro Thr Ala Ala Pro Ala Pro
                      740                 745                 750         
          Glu Thr Ser Ser Ala Pro Ala Ala Glu Pro Thr Gln Ala Pro Thr Val
                  755                 760                 765             
          Ala Pro Ser Ala Glu Pro Thr Gln Val Pro Gly Ala Gln Pro Ser Ala
              770                 775                 780                 
          Ala Pro Ser Glu Lys Pro Gly Ala Gln Pro Ser Ser Ala Pro Lys Pro
          785                 790                 795                 800 
          Asp Ala Thr Gly Arg Ala Pro Ser Val Val Asn Pro Lys Ala Thr Ala
                          805                 810                 815     
          Ala Pro Ser Gly Lys Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ala Pro Ser Arg
                      820                 825                 830         
          Ser Ala Thr Ala Thr Ser Lys Pro Gly Met Glu Pro Asp Glu Ile Asp
                  835                 840                 845             
          Arg Pro Ser Asp Gly Ala Met Ala Gln Pro Thr Gly Gly Ala Ser Ala
              850                 855                 860                 
          Pro Ser Ala Ala Pro Thr Gln Ala Ala Lys Ala Gly Ser Arg Leu Ser
          865                 870                 875                 880 
          Arg Thr Gly Thr Asn Ala Leu Leu Val Leu Gly Leu Ala Gly Val Ala
                          885                 890                 895     
          Val Val Gly Gly Tyr Leu Leu Leu Arg Ala Arg Arg Ser Lys Asn
                      900                 905                 910     
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr
           1               5                  10                  15      
          Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr
                      20                  25                  30          
          Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr
                          85                  90                  95      
          Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp
                      100                 105                 110         
          His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln
                  115                 120                 125             
          Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile
              130                 135                 140                 
          Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr
          145                 150                 155                 160 
          His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala
                          165                 170                 175     
          Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala
                  195                 200                 205             
          Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln
              210                 215                 220                 
          Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu
          225                 230                 235                 240 
          Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser
                          245                 250                 255     
          Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser
                      260                 265                 270         
          Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln
                  275                 280                 285             
          Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys
              290                 295                 300                 
          Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp
          305                 310                 315                 320 
          Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr
                          325                 330                 335     
          Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala Val
                      340                 345                 350         
          Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly
                  355                 360                 365             
          Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu
              370                 375                 380                 
          Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala
          385                 390             
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala
                      20                  25                  30          
          Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr
              50                  55                  60                  
          Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val
                          85                  90                  95      
          Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr
                      100                 105                 110         
          Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro
                  115                 120                 125             
          Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val
              130                 135                 140                 
          Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro
          145                 150                 155                 160 
          Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn
                          165                 170                 175     
          Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile
                  195                 200                 205             
          Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His
          225                 230                 235                 240 
          Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg
                      260                 265                 270         
          Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly
                  275                 280                 285             
          Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser
              290                 295                 300                 
          Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp
          305                 310                 315                 320 
          Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg
                          325                 330                 335     
          Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly
                      340                 345                 350         
          Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr
                  355                 360                 365             
          Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu
              370                 375                 380                 
          Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe
          385                 390                 395                 400 
          Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg
                          405                 410                 415     
          Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys
                      420                 425                 430         
          Lys Asn Pro
                  435 
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 435]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala
                      20                  25                  30          
          Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr
              50                  55                  60                  
          Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val
                          85                  90                  95      
          Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr
                      100                 105                 110         
          Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro
                  115                 120                 125             
          Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val
              130                 135                 140                 
          Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro
          145                 150                 155                 160 
          Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn
                          165                 170                 175     
          Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile
                  195                 200                 205             
          Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His
          225                 230                 235                 240 
          Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg
                      260                 265                 270         
          Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly
                  275                 280                 285             
          Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser
              290                 295                 300                 
          Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp
          305                 310                 315                 320 
          Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg
                          325                 330                 335     
          Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly
                      340                 345                 350         
          Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Phe
                  355                 360                 365             
          Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu
              370                 375                 380                 
          Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe
          385                 390                 395                 400 
          Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Lys Arg
                          405                 410                 415     
          Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn Arg Lys Lys
                      420                 425                 430         
          Lys Asn Pro
                  435 
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 422]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp Met Ala Ser Leu Pro Val Leu Gln Lys Glu Ser
                      20                  25                  30          
          Val Phe Gln Ser Gly Ala His Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Leu Leu Tyr
                  35                  40                  45              
          Leu Pro Gly Gln Gln Ser Leu Leu Ala Phe Ala Glu Gln Arg Ala Ser
              50                  55                  60                  
          Lys Lys Asp Glu His Ala Glu Leu Ile Val Leu Arg Arg Gly Asp Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Asp Ala Pro Thr His Gln Val Gln Trp Gln Ala Gln Glu Val Val Ala
                          85                  90                  95      
          Gln Ala Arg Leu Asp Gly His Arg Ser Met Asn Pro Cys Pro Leu Tyr
                      100                 105                 110         
          Asp Ala Gln Thr Gly Thr Leu Phe Leu Phe Phe Ile Ala Ile Pro Gly
                  115                 120                 125             
          Gln Val Thr Glu Gln Gln Gln Leu Gln Thr Arg Ala Asn Val Thr Arg
              130                 135                 140                 
          Leu Cys Gln Val Thr Ser Thr Asp His Gly Arg Thr Trp Ser Ser Pro
          145                 150                 155                 160 
          Arg Asp Leu Thr Asp Ala Ala Ile Gly Pro Ala Tyr Arg Glu Trp Ser
                          165                 170                 175     
          Thr Phe Ala Val Gly Pro Gly His Cys Leu Gln Leu His Asp Arg Ala
                      180                 185                 190         
          Arg Ser Leu Val Val Pro Ala Tyr Ala Tyr Arg Lys Leu His Pro Ile
                  195                 200                 205             
          Gln Arg Pro Ile Pro Ser Ala Phe Cys Phe Leu Ser His Asp His Gly
              210                 215                 220                 
          Arg Thr Trp Ala Arg Gly His Phe Val Ala Gln Asp Thr Leu Glu Cys
          225                 230                 235                 240 
          Gln Val Ala Glu Val Glu Thr Gly Glu Gln Arg Val Val Thr Leu Asn
                          245                 250                 255     
          Ala Arg Ser His Leu Arg Ala Arg Val Gln Ala Gln Ser Thr Asn Asp
                      260                 265                 270         
          Gly Leu Asp Phe Gln Glu Ser Gln Leu Val Lys Lys Leu Val Glu Pro
                  275                 280                 285             
          Pro Pro Gln Gly Cys Gln Gly Ser Val Ile Ser Phe Pro Ser Pro Arg
              290                 295                 300                 
          Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gln Trp Leu Leu Tyr Thr His Pro Thr
          305                 310                 315                 320 
          His Ser Trp Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Asn Pro Arg Pro
                          325                 330                 335     
          Pro Ala Pro Glu Ala Trp Ser Glu Pro Val Leu Leu Ala Lys Gly Ser
                      340                 345                 350         
          Cys Ala Tyr Ser Asp Leu Gln Ser Met Gly Thr Gly Pro Asp Gly Ser
                  355                 360                 365             
          Pro Leu Phe Gly Cys Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Tyr Glu Glu Ile Val
              370                 375                 380                 
          Phe Leu Met Phe Thr Leu Lys Gln Ala Phe Pro Ala Glu Tyr Leu Pro
          385                 390                 395                 400 
          Gln Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Arg Arg Asn
                          405                 410                 415     
          Arg Lys Lys Lys Asn Pro
                      420         
          <![CDATA[<210> 31]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
                      20                  25                  30          
          Thr Pro Ala Arg Ser Pro Gly Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln
              50                  55                  60                  
          Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu
                          85                  90                  95      
          Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn
                      100                 105                 110         
          His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala
                  115                 120                 125             
          Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn
          145                 150                 155                 160 
          Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly
                          165                 170                 175     
          Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser
                      180                 185                 190         
          Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile
                  195                 200                 205             
          Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly
              210                 215                 220                 
          Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr
          225                 230                 235                 240 
          Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser
                          245                 250                 255     
          Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly
                      260                 265                 270         
          Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu
                  275                 280                 285             
          Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser
              290                 295                 300                 
          Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala
                          325                 330                 335     
          Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro
                      340                 345                 350         
          Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys
                  355                 360                 365             
          Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe
              370                 375                 380                 
          Val Gly Phe Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr
                          405                 410                 415     
          Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro
                      420                 425                 430         
          Ala Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val
                  435                 440                 445             
          Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe
              450                 455                 460                 
          Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile
          465                 470                 475                 480 
          Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
                          485                 490                 495 
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
                      20                  25                  30          
          Thr Pro Ala Arg Ser Pro Gly Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln
              50                  55                  60                  
          Ala Gln His Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu
                          85                  90                  95      
          Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn
                      100                 105                 110         
          His Ile Val Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala
                  115                 120                 125             
          Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn
          145                 150                 155                 160 
          Phe His Val Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly
                          165                 170                 175     
          Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser
                      180                 185                 190         
          Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile
                  195                 200                 205             
          Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly
              210                 215                 220                 
          Ile Gln Ile Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr
          225                 230                 235                 240 
          Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser
                          245                 250                 255     
          Asp Asp His Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly
                      260                 265                 270         
          Met Asp Glu Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu
                  275                 280                 285             
          Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser
              290                 295                 300                 
          Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala
                          325                 330                 335     
          Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro
                      340                 345                 350         
          Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys
                  355                 360                 365             
          Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe
              370                 375                 380                 
          Val Gly Phe Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ser Glu Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr
                          405                 410                 415     
          Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro
                      420                 425                 430         
          Ala Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val
                  435                 440                 445             
          Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe
              450                 455                 460                 
          Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile
          465                 470                 475                 480 
          Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
                          485                 490                 495 
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 481]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala
                      20                  25                  30          
          Thr Pro Ala Arg Ser Pro Gly Met Ala Ser Leu Pro Val Leu Gln Lys
                  35                  40                  45              
          Glu Ser Val Phe Gln Ser Gly Ala His Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Leu
              50                  55                  60                  
          Leu Tyr Leu Pro Gly Gln Gln Ser Leu Leu Ala Phe Ala Glu Gln Arg
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ser Lys Lys Asp Glu His Ala Glu Leu Ile Val Leu Arg Arg Gly
                          85                  90                  95      
          Asp Tyr Asp Ala Pro Thr His Gln Val Gln Trp Gln Ala Gln Glu Val
                      100                 105                 110         
          Val Ala Gln Ala Arg Leu Asp Gly His Arg Ser Met Asn Pro Cys Pro
                  115                 120                 125             
          Leu Tyr Asp Ala Gln Thr Gly Thr Leu Phe Leu Phe Phe Ile Ala Ile
              130                 135                 140                 
          Pro Gly Gln Val Thr Glu Gln Gln Gln Leu Gln Thr Arg Ala Asn Val
          145                 150                 155                 160 
          Thr Arg Leu Cys Gln Val Thr Ser Thr Asp His Gly Arg Thr Trp Ser
                          165                 170                 175     
          Ser Pro Arg Asp Leu Thr Asp Ala Ala Ile Gly Pro Ala Tyr Arg Glu
                      180                 185                 190         
          Trp Ser Thr Phe Ala Val Gly Pro Gly His Cys Leu Gln Leu His Asp
                  195                 200                 205             
          Arg Ala Arg Ser Leu Val Val Pro Ala Tyr Ala Tyr Arg Lys Leu His
              210                 215                 220                 
          Pro Ile Gln Arg Pro Ile Pro Ser Ala Phe Cys Phe Leu Ser His Asp
          225                 230                 235                 240 
          His Gly Arg Thr Trp Ala Arg Gly His Phe Val Ala Gln Asp Thr Leu
                          245                 250                 255     
          Glu Cys Gln Val Ala Glu Val Glu Thr Gly Glu Gln Arg Val Val Thr
                      260                 265                 270         
          Leu Asn Ala Arg Ser His Leu Arg Ala Arg Val Gln Ala Gln Ser Thr
                  275                 280                 285             
          Asn Asp Gly Leu Asp Phe Gln Glu Ser Gln Leu Val Lys Lys Leu Val
              290                 295                 300                 
          Glu Pro Pro Pro Gln Gly Cys Gln Gly Ser Val Ile Ser Phe Pro Ser
          305                 310                 315                 320 
          Pro Arg Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gln Trp Leu Leu Tyr Thr His
                          325                 330                 335     
          Pro Thr His Ser Trp Gln Arg Ala Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Asn Pro
                      340                 345                 350         
          Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ala Trp Ser Glu Pro Val Leu Leu Ala Lys
                  355                 360                 365             
          Gly Ser Cys Ala Tyr Ser Asp Leu Gln Ser Met Gly Thr Gly Pro Asp
              370                 375                 380                 
          Gly Ser Pro Leu Phe Gly Cys Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Tyr Glu Glu
          385                 390                 395                 400 
          Ile Val Phe Leu Met Phe Thr Leu Lys Gln Ala Phe Pro Ala Glu Tyr
                          405                 410                 415     
          Leu Pro Gln Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
                      420                 425                 430         
          Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu
                  435                 440                 445             
          Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu
              450                 455                 460                 
          Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro
          465                 470                 475                 480 
          Arg
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 1311]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
          gacggcgacc acccacaggc aacaccagca cctgccccag atgcctccac cgagctgcca 120
          gcaagcatgt cccaggcaca gcacctggca gcaaataccg caacagacaa ctacagaatc 180
          cccgccatca ccacagcccc aaatggcgat ctgctgatca gctatgacga gcgccccaag 240
          gataacggaa atggaggctc cgacgcacca aaccctaatc acatcgtgca gcggagatct 300
          accgatggcg gcaagacatg gagcgcccct acctacatcc accagggcac cgagacaggc 360
          aagaaggtcg gctactctga cccaagctat gtggtggatc accagaccgg cacaatcttc 420
          aactttcacg tgaagtccta tgaccaggga tggggaggct ctaggggcgg caccgatcct 480
          gagaatcgcg gcatcatcca ggccgaggtg tctaccagca cagacaacgg ctggacctgg 540
          acacaccgga ccatcacagc cgacatcaca aaggataagc cctggaccgc aagattcgca 600
          gcaagcggac agggcatcca gatccagcac ggacctcacg caggccggct ggtgcagcag 660
          tacaccatca gaacagcagg aggagcagtg caggccgtgt ccgtgtattc tgacgatcac 720
          ggcaagacct ggcaggcagg caccccaatc ggcacaggca tggacgagaa taaggtggtg 780
          gagctgagcg atggctccct gatgctgaac tctagggcca gcgacggctc cggcttccgc 840
          aaggtggcac actctacaga cggaggacag acctggtccg agcccgtgtc tgataagaat 900
          ctgcctgaca gcgtggataa cgcccagatc atccgggcct ttcctaatgc cgccccagac 960
          gatcccagag ccaaggtgct gctgctgtcc cactctccaa acccaaggcc ttggagccgg 1020
          gacagaggca caatcagcat gtcctgcgac gatggcgcca gctggaccac atccaaggtg 1080
          ttccacgagc catttgtggg ctacaccaca atcgccgtgc agtctgatgg cagcatcgga 1140
          ctgctgagcg aggacgcaca caatggcgcc gattacggcg gcatctggta tcggaacttc 1200
          accatgaact ggctgggcga gcagtgtggc cagaagccag ccaagcggaa gaagaagggc 1260
          ggcaagaacg gcaagaatag gcgcaaccgg aagaagaaga acccctgatg a          1311
          <![CDATA[<210> 35]]>
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          <![CDATA[<400> 35]]>
          atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
          gacggcgacc acccacaggc aacaccagca cctgccccag atgcctccac cgagctgcca 120
          gcaagcatgt cccaggcaca gcacctggca gcaaataccg caacagacaa ctacagaatc 180
          cccgccatca ccacagcccc aaatggcgat ctgctgatca gctatgacga gcgccccaag 240
          gataacggaa atggaggctc cgacgcacca aaccctaatc acatcgtgca gcggagatct 300
          accgatggcg gcaagacatg gagcgcccct acctacatcc accagggcac cgagacaggc 360
          aagaaggtcg gctactctga cccaagctat gtggtggatc accagaccgg cacaatcttc 420
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          ctgcctgaca gcgtggataa cgcccagatc atccgggcct ttcctaatgc cgccccagac 960
          gatcccagag ccaaggtgct gctgctgtcc cactctccaa acccaaggcc ttggagccgg 1020
          gacagaggca caatcagcat gtcctgcgac gatggcgcca gctggaccac atccaaggtg 1080
          ttccacgagc catttgtggg cttcaccaca atcgccgtgc agtctgatgg cagcatcgga 1140
          ctgctgagcg aggacgcaca caatggcgcc gattacggcg gcatctggta tcggaacttc 1200
          accatgaact ggctgggcga gcagtgtggc cagaagccag ccaagcggaa gaagaagggc 1260
          ggcaagaacg gcaagaatag gcgcaaccgg aagaagaaga acccctgatg a          1311
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 1272]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
          gacatggcca gcctgcctgt gctgcagaag gagagcgtgt tccagtccgg cgcccacgca 120
          tacagaatcc ccgccctgct gtatctgcct ggccagcagt ccctgctggc ctttgccgag 180
          cagagagcct ctaagaagga cgagcacgca gagctgatcg tgctgaggag gggcgactac 240
          gatgcaccaa cccaccaggt gcagtggcag gcacaggagg tggtggcaca ggcaaggctg 300
          gacggacacc gcagcatgaa tccatgcccc ctgtatgatg cccagaccgg cacactgttc 360
          ctgttcttta tcgcaatccc cggccaggtg accgagcagc agcagctgca gaccagagcc 420
          aacgtgacaa gactgtgcca ggtgacctcc acagaccacg gcaggacctg gagcagccct 480
          cgcgacctga cagatgcagc aatcggacca gcatacaggg agtggtctac attcgccgtg 540
          ggccctggcc actgcctgca gctgcacgat cgggccagaa gcctggtggt gccagcctac 600
          gcctatcgga agctgcaccc catccagaga cctatcccat ctgccttctg ctttctgagc 660
          cacgaccacg gcagaacttg ggccagaggc cactttgtgg cccaggatac actggagtgt 720
          caggtggcag aggtggagac cggagagcag agggtggtga cactgaatgc acgcagccac 780
          ctgagggccc gcgtgcaggc ccagtccacc aacgacggcc tggatttcca ggagtctcag 840
          ctggtgaaga agctggtgga gccacctcca cagggatgtc agggctctgt gatcagcttt 900
          ccctcccctc ggtctggccc aggcagccca gcacagtggc tgctgtacac ccaccccaca 960
          cactcctggc agagggcaga cctgggagca tatctgaatc caagaccccc tgcaccagag 1020
          gcctggtccg agcctgtgct gctggccaag ggctcttgcg cctacagcga cctgcagagc 1080
          atgggcaccg gacctgatgg ctctccactg ttcggctgtc tgtacgaggc caacgattat 1140
          gaggagatcg tgttcctgat gtttacactg aagcaggcct ttcctgccga gtatctgcca 1200
          cagaagcgga agaagaaggg cggcaagaac ggcaagaatc ggagaaaccg gaagaagaag 1260
          aacccttgat ga                                                     1272
          <![CDATA[<210> 37]]>
          <![CDATA[<211> 1485]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 37]]>
          atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
          gactatccat atgatgttcc agattatgct ggggccacgc cggccagatc tcccgggatg 120
          ggcgaccacc cacaggcaac accagcacct gccccagatg cctccaccga gctgccagca 180
          agcatgtccc aggcacagca cctggcagca aataccgcaa cagacaacta cagaatcccc 240
          gccatcacca cagccccaaa tggcgatctg ctgatcagct atgacgagcg ccccaaggat 300
          aacggaaatg gaggctccga cgcaccaaac cctaatcaca tcgtgcagcg gagatctacc 360
          gatggcggca agacatggag cgcccctacc tacatccacc agggcaccga gacaggcaag 420
          aaggtcggct actctgaccc aagctatgtg gtggatcacc agaccggcac aatcttcaac 480
          tttcacgtga agtcctatga ccagggatgg ggaggctcta ggggcggcac cgatcctgag 540
          aatcgcggca tcatccaggc cgaggtgtct accagcacag acaacggctg gacctggaca 600
          caccggacca tcacagccga catcacaaag gataagccct ggaccgcaag attcgcagca 660
          agcggacagg gcatccagat ccagcacgga cctcacgcag gccggctggt gcagcagtac 720
          accatcagaa cagcaggagg agcagtgcag gccgtgtccg tgtattctga cgatcacggc 780
          aagacctggc aggcaggcac cccaatcggc acaggcatgg acgagaataa ggtggtggag 840
          ctgagcgatg gctccctgat gctgaactct agggccagcg acggctccgg cttccgcaag 900
          gtggcacact ctacagacgg aggacagacc tggtccgagc ccgtgtctga taagaatctg 960
          cctgacagcg tggataacgc ccagatcatc cgggcctttc ctaatgccgc cccagacgat 1020
          cccagagcca aggtgctgct gctgtcccac tctccaaacc caaggccttg gagccgggac 1080
          agaggcacaa tcagcatgtc ctgcgacgat ggcgccagct ggaccacatc caaggtgttc 1140
          cacgagccat ttgtgggcta caccacaatc gccgtgcagt ctgatggcag catcggactg 1200
          ctgagcgagg acgcacacaa tggcgccgat tacggcggca tctggtatcg gaacttcacc 1260
          atgaactggc tgggcgagca gtgtggccag aagccagccg tcgacgaaca aaaactcatc 1320
          tcagaagagg atctgaatgc tgtgggccag gacacgcagg aggtcatcgt ggtgccacac 1380
          tccttgccct ttaaggtggt ggtgatctca gccatcctgg ccctggtggt gctcaccatc 1440
          atctccctta tcatcctcat catgctttgg cagaagaagc cacgt                 1485
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 1485]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 38]]>
          atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
          gactatccat atgatgttcc agattatgct ggggccacgc cggccagatc tcccgggatg 120
          ggcgaccacc cacaggcaac accagcacct gccccagatg cctccaccga gctgccagca 180
          agcatgtccc aggcacagca cctggcagca aataccgcaa cagacaacta cagaatcccc 240
          gccatcacca cagccccaaa tggcgatctg ctgatcagct atgacgagcg ccccaaggat 300
          aacggaaatg gaggctccga cgcaccaaac cctaatcaca tcgtgcagcg gagatctacc 360
          gatggcggca agacatggag cgcccctacc tacatccacc agggcaccga gacaggcaag 420
          aaggtcggct actctgaccc aagctatgtg gtggatcacc agaccggcac aatcttcaac 480
          tttcacgtga agtcctatga ccagggatgg ggaggctcta ggggcggcac cgatcctgag 540
          aatcgcggca tcatccaggc cgaggtgtct accagcacag acaacggctg gacctggaca 600
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          tcagaagagg atctgaatgc tgtgggccag gacacgcagg aggtcatcgt ggtgccacac 1380
          tccttgccct ttaaggtggt ggtgatctca gccatcctgg ccctggtggt gctcaccatc 1440
          atctccctta tcatcctcat catgctttgg cagaagaagc cacgt                 1485
          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<211> 1443]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
          atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
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          gccagcctgc ctgtgctgca gaaggagagc gtgttccagt ccggcgccca cgcatacaga 180
          atccccgccc tgctgtatct gcctggccag cagtccctgc tggcctttgc cgagcagaga 240
          gcctctaaga aggacgagca cgcagagctg atcgtgctga ggaggggcga ctacgatgca 300
          ccaacccacc aggtgcagtg gcaggcacag gaggtggtgg cacaggcaag gctggacgga 360
          caccgcagca tgaatccatg ccccctgtat gatgcccaga ccggcacact gttcctgttc 420
          tttatcgcaa tccccggcca ggtgaccgag cagcagcagc tgcagaccag agccaacgtg 480
          acaagactgt gccaggtgac ctccacagac cacggcagga cctggagcag ccctcgcgac 540
          ctgacagatg cagcaatcgg accagcatac agggagtggt ctacattcgc cgtgggccct 600
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          cacggcagaa cttgggccag aggccacttt gtggcccagg atacactgga gtgtcaggtg 780
          gcagaggtgg agaccggaga gcagagggtg gtgacactga atgcacgcag ccacctgagg 840
          gcccgcgtgc aggcccagtc caccaacgac ggcctggatt tccaggagtc tcagctggtg 900
          aagaagctgg tggagccacc tccacaggga tgtcagggct ctgtgatcag ctttccctcc 960
          cctcggtctg gcccaggcag cccagcacag tggctgctgt acacccaccc cacacactcc 1020
          tggcagaggg cagacctggg agcatatctg aatccaagac cccctgcacc agaggcctgg 1080
          tccgagcctg tgctgctggc caagggctct tgcgcctaca gcgacctgca gagcatgggc 1140
          accggacctg atggctctcc actgttcggc tgtctgtacg aggccaacga ttatgaggag 1200
          atcgtgttcc tgatgtttac actgaagcag gcctttcctg ccgagtatct gccacaggtc 1260
          gacgaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgaatgctg tgggccagga cacgcaggag 1320
          gtcatcgtgg tgccacactc cttgcccttt aaggtggtgg tgatctcagc catcctggcc 1380
          ctggtggtgc tcaccatcat ctcccttatc atcctcatca tgctttggca gaagaagcca 1440
          cgt                                                               1443
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 40]]>
          Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ser Thr Gly Asp
                      20      
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 41]]>
          Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
           1               5                  
          <![CDATA[<210> 42]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
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          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          Gly Ala Thr Pro Ala Arg Ser Pro Gly
           1               5                  
          <![CDATA[<210> 43]]>
          <![CDATA[<211> 2]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 43]]>
          Val Asp
           1      
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 44]]>
          Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
           1               5                  10  
          <![CDATA[<210> 45]]>
          <![CDATA[<211> 50]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 45]]>
          Asn Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser
           1               5                  10                  15      
          Leu Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val
                      20                  25                  30          
          Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys
                  35                  40                  45              
          Pro Arg
              50  
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<211> 27]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 46]]>
          Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
           1               5                  10                  15      
          Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
                      20                  25          
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<211> 22]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 47]]>
          Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile
           1               5                  10                  15      
          Gly Leu Gly Ile Phe Phe
                      20          
          <![CDATA[<210> 48]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 48]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
           1               5                  10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr
                      20      
          <![CDATA[<210> 49]]>
          <![CDATA[<211> 23]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 49]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
           1               5                  10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
                      20              
          <![CDATA[<210> 50]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 50]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
           1               5                  10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
                      20                  
          <![CDATA[<210> 51]]>
          <![CDATA[<211> 27]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 51]]>
          Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
           1               5                  10                  15      
          Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
                      20                  25          
          <![CDATA[<210> 52]]>
          <![CDATA[<211> 21]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 52]]>
          Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser
           1               5                  10                  15      
          Leu Ile Ile Leu Ile
                      20      
          <![CDATA[<210> 53]]>
          <![CDATA[<211> 381]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 鼠傷寒沙門桿菌]]>
          <![CDATA[<400> 53]]>
          Thr Val Glu Lys Ser Val Val Phe Lys Ala Glu Gly Glu His Phe Thr
           1               5                  10                  15      
          Asp Gln Lys Gly Asn Thr Ile Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr
                      20                  25                  30          
          Lys Tyr Phe Arg Ile Pro Ala Met Cys Thr Thr Ser Lys Gly Thr Ile
                  35                  40                  45              
          Val Val Phe Ala Asp Ala Arg His Asn Thr Ala Ser Asp Gln Ser Phe
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Thr Ala Ala Ala Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Asn
          65                  70                  75                  80  
          Lys Lys Ile Ala Ile Tyr Asn Asp Arg Val Asn Ser Lys Leu Ser Arg
                          85                  90                  95      
          Val Met Asp Pro Thr Cys Ile Val Ala Asn Ile Gln Gly Arg Glu Thr
                      100                 105                 110         
          Ile Leu Val Met Val Gly Lys Trp Asn Asn Asn Asp Lys Thr Trp Gly
                  115                 120                 125             
          Ala Tyr Arg Asp Lys Ala Pro Asp Thr Asp Trp Asp Leu Val Leu Tyr
              130                 135                 140                 
          Lys Ser Thr Asp Asp Gly Val Thr Phe Ser Lys Val Glu Thr Asn Ile
          145                 150                 155                 160 
          His Asp Ile Val Thr Lys Asn Gly Thr Ile Ser Ala Met Leu Gly Gly
                          165                 170                 175     
          Val Gly Ser Gly Leu Gln Leu Asn Asp Gly Lys Leu Val Phe Pro Val
                      180                 185                 190         
          Gln Met Val Arg Thr Lys Asn Ile Thr Thr Val Leu Asn Thr Ser Phe
                  195                 200                 205             
          Ile Tyr Ser Thr Asp Gly Ile Thr Trp Ser Leu Pro Ser Gly Tyr Cys
              210                 215                 220                 
          Glu Gly Phe Gly Ser Glu Asn Asn Ile Ile Glu Phe Asn Ala Ser Leu
          225                 230                 235                 240 
          Val Asn Asn Ile Arg Asn Ser Gly Leu Arg Arg Ser Phe Glu Thr Lys
                          245                 250                 255     
          Asp Phe Gly Lys Thr Trp Thr Glu Phe Pro Pro Met Asp Lys Lys Val
                      260                 265                 270         
          Asp Asn Arg Asn His Gly Val Gln Gly Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ser
                  275                 280                 285             
          Gly Asn Lys Leu Val Ala Ala His Ser Ser Ala Gln Asn Lys Asn Asn
              290                 295                 300                 
          Asp Tyr Thr Arg Ser Asp Ile Ser Leu Tyr Ala His Asn Leu Tyr Ser
          305                 310                 315                 320 
          Gly Glu Val Lys Leu Ile Asp Asp Phe Tyr Pro Lys Val Gly Asn Ala
                          325                 330                 335     
          Ser Gly Ala Gly Tyr Ser Cys Leu Ser Tyr Arg Lys Asn Val Asp Lys
                      340                 345                 350         
          Glu Thr Leu Tyr Val Val Tyr Glu Ala Asn Gly Ser Ile Glu Phe Gln
                  355                 360                 365             
          Asp Leu Ser Arg His Leu Pro Val Ile Lys Ser Tyr Asn
              370                 375                 380     
          <![CDATA[<210> 54]]>
          <![CDATA[<211> 781]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 霍亂弧菌]]>
          <![CDATA[<400> 54]]>
          Met Arg Phe Lys Asn Val Lys Lys Thr Ala Leu Met Leu Ala Met Phe
           1               5                  10                  15      
          Gly Met Ala Thr Ser Ser Asn Ala Ala Leu Phe Asp Tyr Asn Ala Thr
                      20                  25                  30          
          Gly Asp Thr Glu Phe Asp Ser Pro Ala Lys Gln Gly Trp Met Gln Asp
                  35                  40                  45              
          Asn Thr Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Thr Asn Ala Asp Gly Met Pro
              50                  55                  60                  
          Ala Trp Leu Val Gln Gly Ile Gly Gly Arg Ala Gln Trp Thr Tyr Ser
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ser Thr Asn Gln His Ala Gln Ala Ser Ser Phe Gly Trp Arg Met
                          85                  90                  95      
          Thr Thr Glu Met Lys Val Leu Ser Gly Gly Met Ile Thr Asn Tyr Tyr
                      100                 105                 110         
          Ala Asn Gly Thr Gln Arg Val Leu Pro Ile Ile Ser Leu Asp Ser Ser
                  115                 120                 125             
          Gly Asn Leu Val Val Glu Phe Glu Gly Gln Thr Gly Arg Thr Val Leu
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Gly Thr Ala Ala Thr Glu Tyr His Lys Phe Glu Leu Val Phe
          145                 150                 155                 160 
          Leu Pro Gly Ser Asn Pro Ser Ala Ser Phe Tyr Phe Asp Gly Lys Leu
                          165                 170                 175     
          Ile Arg Asp Asn Ile Gln Pro Thr Ala Ser Lys Gln Asn Met Ile Val
                      180                 185                 190         
          Trp Gly Asn Gly Ser Ser Asn Thr Asp Gly Val Ala Ala Tyr Arg Asp
                  195                 200                 205             
          Ile Lys Phe Glu Ile Gln Gly Asp Val Ile Phe Arg Gly Pro Asp Arg
              210                 215                 220                 
          Ile Pro Ser Ile Val Ala Ser Ser Val Thr Pro Gly Val Val Thr Ala
          225                 230                 235                 240 
          Phe Ala Glu Lys Arg Val Gly Gly Gly Asp Pro Gly Ala Leu Ser Asn
                          245                 250                 255     
          Thr Asn Asp Ile Ile Thr Arg Thr Ser Arg Asp Gly Gly Ile Thr Trp
                      260                 265                 270         
          Asp Thr Glu Leu Asn Leu Thr Glu Gln Ile Asn Val Ser Asp Glu Phe
                  275                 280                 285             
          Asp Phe Ser Asp Pro Arg Pro Ile Tyr Asp Pro Ser Ser Asn Thr Val
              290                 295                 300                 
          Leu Val Ser Tyr Ala Arg Trp Pro Thr Asp Ala Ala Gln Asn Gly Asp
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ile Lys Pro Trp Met Pro Asn Gly Ile Phe Tyr Ser Val Tyr Asp
                          325                 330                 335     
          Val Ala Ser Gly Asn Trp Gln Ala Pro Ile Asp Val Thr Asp Gln Val
                      340                 345                 350         
          Lys Glu Arg Ser Phe Gln Ile Ala Gly Trp Gly Gly Ser Glu Leu Tyr
                  355                 360                 365             
          Arg Arg Asn Thr Ser Leu Asn Ser Gln Gln Asp Trp Gln Ser Asn Ala
              370                 375                 380                 
          Lys Ile Arg Ile Val Asp Gly Ala Ala Asn Gln Ile Gln Val Ala Asp
          385                 390                 395                 400 
          Gly Ser Arg Lys Tyr Val Val Thr Leu Ser Ile Asp Glu Ser Gly Gly
                          405                 410                 415     
          Leu Val Ala Asn Leu Asn Gly Val Ser Ala Pro Ile Ile Leu Gln Ser
                      420                 425                 430         
          Glu His Ala Lys Val His Ser Phe His Asp Tyr Glu Leu Gln Tyr Ser
                  435                 440                 445             
          Ala Leu Asn His Thr Thr Thr Leu Phe Val Asp Gly Gln Gln Ile Thr
              450                 455                 460                 
          Thr Trp Ala Gly Glu Val Ser Gln Glu Asn Asn Ile Gln Phe Gly Asn
          465                 470                 475                 480 
          Ala Asp Ala Gln Ile Asp Gly Arg Leu His Val Gln Lys Ile Val Leu
                          485                 490                 495     
          Thr Gln Gln Gly His Asn Leu Val Glu Phe Asp Ala Phe Tyr Leu Ala
                      500                 505                 510         
          Gln Gln Thr Pro Glu Val Glu Lys Asp Leu Glu Lys Leu Gly Trp Thr
                  515                 520                 525             
          Lys Ile Lys Thr Gly Asn Thr Met Ser Leu Tyr Gly Asn Ala Ser Val
              530                 535                 540                 
          Asn Pro Gly Pro Gly His Gly Ile Thr Leu Thr Arg Gln Gln Asn Ile
          545                 550                 555                 560 
          Ser Gly Ser Gln Asn Gly Arg Leu Ile Tyr Pro Ala Ile Val Leu Asp
                          565                 570                 575     
          Arg Phe Phe Leu Asn Val Met Ser Ile Tyr Ser Asp Asp Gly Gly Ser
                      580                 585                 590         
          Asn Trp Gln Thr Gly Ser Thr Leu Pro Ile Pro Phe Arg Trp Lys Ser
                  595                 600                 605             
          Ser Ser Ile Leu Glu Thr Leu Glu Pro Ser Glu Ala Asp Met Val Glu
              610                 615                 620                 
          Leu Gln Asn Gly Asp Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Asp Phe Asn Gln
          625                 630                 635                 640 
          Ile Val Asn Gly Val Asn Tyr Ser Pro Arg Gln Gln Phe Leu Ser Lys
                          645                 650                 655     
          Asp Gly Gly Ile Thr Trp Ser Leu Leu Glu Ala Asn Asn Ala Asn Val
                      660                 665                 670         
          Phe Ser Asn Ile Ser Thr Gly Thr Val Asp Ala Ser Ile Thr Arg Phe
                  675                 680                 685             
          Glu Gln Ser Asp Gly Ser His Phe Leu Leu Phe Thr Asn Pro Gln Gly
              690                 695                 700                 
          Asn Pro Ala Gly Thr Asn Gly Arg Gln Asn Leu Gly Leu Trp Phe Ser
          705                 710                 715                 720 
          Phe Asp Glu Gly Val Thr Trp Lys Gly Pro Ile Gln Leu Val Asn Gly
                          725                 730                 735     
          Ala Ser Ala Tyr Ser Asp Ile Tyr Gln Leu Asp Ser Glu Asn Ala Ile
                      740                 745                 750         
          Val Ile Val Glu Thr Asp Asn Ser Asn Met Arg Ile Leu Arg Met Pro
                  755                 760                 765             
          Ile Thr Leu Leu Lys Gln Lys Leu Thr Leu Ser Gln Asn
              770                 775                 780     
          <![CDATA[<210> 55]]>
          <![CDATA[<211> 1520]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 55]]>
          atggagtttg gactgagctg gctgtttctc gtggccattc tgaagggcgt ccagtgcagc 60
          agagacatcc agatgaccca gacaaccagc tctctgagcg ctagcctcgg agatagagtg 120
          accattagct gtagagcctc ccaagacatt tccaagtacc tcaactggta ccagcagaag 180
          cccgacggca ccgtgaagct gctgatctac cacaccagca gactgcactc cggagtgccc 240
          tctaggtttt ccggatccgg cagcggcaca gactactctc tgaccatctc caatctggag 300
          caagaggaca tcgccaccta cttctgccag caaggcaaca cactgcctta cacattcggc 360
          ggcggaacaa agctcgaact gaaaagaggc ggcggcggaa gcggaggagg aggatccgga 420
          ggcggaggat ccggcggagg aggctccgaa gtccagctgc aacaaagcgg acccggactg 480
          gtggctccca gccaatctct gagcgtgaca tgcacagtgt ccggcgtctc tctgcccgac 540
          tacggagtca gctggattag acagcctcct agaaagggac tggagtggct gggagtcatc 600
          tggggcagcg agaccaccta ctataactcc gccctcaagt ctaggctcac catcatcaaa 660
          gacaacagca agagccaagt gttcctcaag atgaacagcc tccagaccga cgacaccgcc 720
          atctactact gcgccaaaca ctactactac ggaggcagct acgctatgga ttactggggc 780
          caaggcacca cagtcacagt gagcagctat gtgaccgtga gcagccaaga ccccgccaaa 840
          gatcccaagt tctgggtgct ggtcgtggtg ggaggcgtgc tggcttgtta ttctctgctg 900
          gtgaccgtgg ccttcatcat cttctgggtg aggagcaaga gatccagact gctgcacagc 960
          gactacatga acatgacacc tagaaggccc ggccccacaa ggaaacatta ccagccctac 1020
          gcccccccta gagacttcgc tgcctataga tccaagagag gaagaaaaaa gctgctctac 1080
          atcttcaagc agcccttcat gaggcccgtg caaacaacac aagaggagga cggatgtagc 1140
          tgtagattcc ccgaggagga agagggagga tgcgagctga gagtgaagtt ctctaggagc 1200
          gccgatgctc ccgcttatca gcaaggccag aaccagctgt acaatgagct gaatctggga 1260
          agaagggaag aatacgacgt gctggataag aggaggggaa gagaccccga gatgggaggc 1320
          aagcctagaa ggaagaaccc ccaagaggga ctgtacaacg agctccaaaa ggacaagatg 1380
          gctgaagcct acagcgagat cggaatgaag ggagagagaa ggaggggcaa gggccacgat 1440
          ggactctacc aaggcctcag cacagccacc aaggacacct acgacgctct gcacatgcaa 1500
          gctctgcccc cagatgatga                                             1520
          <![CDATA[<210> 56]]>
          <![CDATA[<211> 506]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 56]]>
          Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
           1               5                  10                  15      
          Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
                      20                  25                  30          
          Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
                  35                  40                  45              
          Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
              50                  55                  60                  
          Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
                          85                  90                  95      
          Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
                      100                 105                 110         
          Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
                  115                 120                 125             
          Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
          145                 150                 155                 160 
          Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys
                      180                 185                 190         
          Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr
                  195                 200                 205             
          Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys
              210                 215                 220                 
          Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
                          245                 250                 255     
          Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Tyr Val Thr
                      260                 265                 270         
          Val Ser Ser Gln Asp Pro Ala Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val
                  275                 280                 285             
          Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
              290                 295                 300                 
          Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
          305                 310                 315                 320 
          Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
                          325                 330                 335     
          Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys
                      340                 345                 350         
          Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
                  355                 360                 365             
          Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
              370                 375                 380                 
          Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
          385                 390                 395                 400 
          Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
                          405                 410                 415     
          Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
                      420                 425                 430         
          Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
                  435                 440                 445             
          Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
              450                 455                 460                 
          Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
          465                 470                 475                 480 
          Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
                          485                 490                 495     
          Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Asp Asp
                      500                 505     
          <![CDATA[<210> 57]]>
          <![CDATA[<211> 268]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 57]]>
          Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
           1               5                  10                  15      
          Val Gln Cys Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
                      20                  25                  30          
          Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
                  35                  40                  45              
          Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
              50                  55                  60                  
          Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
          65                  70                  75                  80  
          Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
                          85                  90                  95      
          Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
                      100                 105                 110         
          Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
                  115                 120                 125             
          Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
          145                 150                 155                 160 
          Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys
                      180                 185                 190         
          Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr
                  195                 200                 205             
          Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys
              210                 215                 220                 
          Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
                          245                 250                 255     
          Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
                      260                 265             
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          <![CDATA[<400> 58]]>
          Met Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu
           1               5                  10                  15      
          Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys
                      20                  25                  30          
          Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser
              50                  55                  60                  
          Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys
                          85                  90                  95      
          Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys
                      100                 105                 110         
          Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys
                  115                 120                 125             
          Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser
                          165                 170                 175     
          Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp
                  195                 200                 205             
          His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe
              210                 215                 220                 
          Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu
          225                 230                 235                 240 
          Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Gly Gly Gly Ser
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly Thr Leu Phe Pro
                      260                 265                 270         
          Gly Asp Asp Asp Leu Ala Ile Pro Ala Thr Glu Phe Phe Ser Thr Lys
                  275                 280                 285             
          Ala Ala Lys Ala Pro Glu Asp Lys Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala
              290                 295                 300                 
          Ala Asp Asp Asn Glu Glu Thr Leu Lys Gln Arg Leu Thr Asn Leu Glu
          305                 310                 315                 320 
          Lys Lys Ile Thr Asn Val Thr Thr Lys Phe Glu Gln Ile Glu Lys Cys
                          325                 330                 335     
          Cys Lys Arg Asn Asp Glu Val Leu Phe Arg Leu Glu Asn His Ala Glu
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Arg Ala Ala Met Ile Ser Leu Ala Lys Lys Ile Asp Val Gln
                  355                 360                 365             
          Thr Gly Arg Ala Ala Ala Glu
              370                 375 
          <![CDATA[<210> 59]]>
          <![CDATA[<211> 259]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 59]]>
          agttgataat cggccccatg ttttcaggta aaagtacaga attaattaga cgagttagac 60
          gttatcaaat agctcaatat aaatgcgtga ctataaaata ttctaacgat aatagatacg 120
          gaacgggact atggacgcat gataagaata attttgaagc attggaagca actaaactat 180
          gtgatgtctt ggaatcaatt acagatttct ccgtgatagg tatcgatgaa ggacagttct 240
          ttccagacat tgttgaatt                                              259
          <![CDATA[<210> 60]]>
          <![CDATA[<211> 1251]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 60]]>
          tcatcagggg ttcttcttct tccggttgcg cctattcttg ccgttcttgc cgcccttctt 60
          cttccgcttg gctggcttct ggccacactg ctcgcccagc cagttcatgg tgaagttccg 120
          ataccagatg ccgccgtaat cggcgccatt gtgtgcgtcc tcgctcagca gtccgatgct 180
          gccatcagac tgcacggcga ttgtggtgta gcccacaaat ggctcgtgga acaccttgga 240
          tgtggtccag ctggcgccat cgtcgcagga catgctgatt gtgcctctgt cccggctcca 300
          aggccttggg tttggagagt gggacagcag cagcaccttg gctctgggat cgtctggggc 360
          ggcattagga aaggcccgga tgatctgggc gttatccacg ctgtcaggca gattcttatc 420
          agacacgggc tcggaccagg tctgtcctcc gtctgtagag tgtgccacct tgcggaagcc 480
          ggagccgtcg ctggccctag agttcagcat cagggagcca tcgctcagct ccaccacctt 540
          attctcgtcc atgcctgtgc cgattggggt gcctgcctgc caggtcttgc cgtgatcgtc 600
          agaatacacg gacacggcct gcactgctcc tcctgctgtt ctgatggtgt actgctgcac 660
          cagccggcct gcgtgaggtc cgtgctggat ctggatgccc tgtccgcttg ctgcgaatct 720
          tgcggtccag ggcttatcct ttgtgatgtc ggctgtgatg gtccggtgtg tccaggtcca 780
          gccgttgtct gtgctggtag acacctcggc ctggatgatg ccgcgattct caggatcggt 840
          gccgccccta gagcctcccc atccctggtc ataggacttc acgtgaaagt tgaagattgt 900
          gccggtctgg tgatccacca catagcttgg gtcagagtag ccgaccttct tgcctgtctc 960
          ggtgccctgg tggatgtagg taggggcgct ccatgtcttg ccgccatcgg tagatctccg 1020
          ctgcacgatg tgattagggt ttggtgcgtc ggagcctcca tttccgttat ccttggggcg 1080
          ctcgtcatag ctgatcagca gatcgccatt tggggctgtg gtgatggcgg ggattctgta 1140
          gttgtctgtt gcggtatttg ctgccaggtg ctgtgcctgg gacatgcttg ctggcagctc 1200
          ggtggaggca tctggggcag gtgctggtgt tgcctgtggg tggtcgccca t          1251
          <![CDATA[<210> 61]]>
          <![CDATA[<211> 31]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 61]]>
          gaatttcatt ttgttttttt ctatgctata a                                31
          <![CDATA[<210> 62]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 62]]>
          ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat                             34
          <![CDATA[<210> 63]]>
          <![CDATA[<211> 717]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 63]]>
          atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
          ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
          ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
          ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
          cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
          ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
          gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
          aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
          ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
          gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
          tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
          ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag    717
          <![CDATA[<210> 64]]>
          <![CDATA[<211> 204]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 64]]>
          aattctgtga gcgtatggca aacgaaggaa aaatagttat agtagccgca ctcgatggga 60
          catttcaacg taaaccgttt aataatattt tgaatcttat tccattatct gaaatggtgg 120
          taaaactaac tgctgtgtgt atgaaatgct ttaaggaggc ttccttttct aaacgattgg 180
          gtgaggaaac cgagatagaa ataa                                        204
          <![CDATA[<210> 65]]>
          <![CDATA[<211> 3110]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 牛痘病毒]]>
          <![CDATA[<400> 65]]>
          atgaacggcg gacatattca gttgataatc ggccccatgt tttcaggtaa aagtacagaa 60
          ttaattagac gagttagacg ttatcaaata gctcaatata aatgcgtgac tataaaatat 120
          tctaacgata atagatacgg aacgggacta tggacgcatg ataagaataa ttttgaagca 180
          ttggaagcaa ctaaactatg tgatgtcttg gaatcaatta cagatttctc cgtgataggt 240
          atcgatgaag gacagttctt tccagacatt gttgaattag atcgataaaa attaattaat 300
          tacccgggta ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc 360
          ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat 420
          aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 480
          cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg ctcgaagcgg 540
          ccggcctcat caggggttct tcttcttccg gttgcgccta ttcttgccgt tcttgccgcc 600
          cttcttcttc cgcttggctg gcttctggcc acactgctcg cccagccagt tcatggtgaa 660
          gttccgatac cagatgccgc cgtaatcggc gccattgtgt gcgtcctcgc tcagcagtcc 720
          gatgctgcca tcagactgca cggcgattgt ggtgtagccc acaaatggct cgtggaacac 780
          cttggatgtg gtccagctgg cgccatcgtc gcaggacatg ctgattgtgc ctctgtcccg 840
          gctccaaggc cttgggtttg gagagtggga cagcagcagc accttggctc tgggatcgtc 900
          tggggcggca ttaggaaagg cccggatgat ctgggcgtta tccacgctgt caggcagatt 960
          cttatcagac acgggctcgg accaggtctg tcctccgtct gtagagtgtg ccaccttgcg 1020
          gaagccggag ccgtcgctgg ccctagagtt cagcatcagg gagccatcgc tcagctccac 1080
          caccttattc tcgtccatgc ctgtgccgat tggggtgcct gcctgccagg tcttgccgtg 1140
          atcgtcagaa tacacggaca cggcctgcac tgctcctcct gctgttctga tggtgtactg 1200
          ctgcaccagc cggcctgcgt gaggtccgtg ctggatctgg atgccctgtc cgcttgctgc 1260
          gaatcttgcg gtccagggct tatcctttgt gatgtcggct gtgatggtcc ggtgtgtcca 1320
          ggtccagccg ttgtctgtgc tggtagacac ctcggcctgg atgatgccgc gattctcagg 1380
          atcggtgccg cccctagagc ctccccatcc ctggtcatag gacttcacgt gaaagttgaa 1440
          gattgtgccg gtctggtgat ccaccacata gcttgggtca gagtagccga ccttcttgcc 1500
          tgtctcggtg ccctggtgga tgtaggtagg ggcgctccat gtcttgccgc catcggtaga 1560
          tctccgctgc acgatgtgat tagggtttgg tgcgtcggag cctccatttc cgttatcctt 1620
          ggggcgctcg tcatagctga tcagcagatc gccatttggg gctgtggtga tggcggggat 1680
          tctgtagttg tctgttgcgg tatttgctgc caggtgctgt gcctgggaca tgcttgctgg 1740
          cagctcggtg gaggcatctg gggcaggtgc tggtgttgcc tgtgggtggt cgcccattta 1800
          tagcatagaa aaaaacaaaa tgaaattcaa gctttcacta attccaaacc cacccgcttt 1860
          ttatagtaag tttttcaccc ataaataata aatacaataa ttaatttctc gtaaaagtag 1920
          aaaatatatt ctaatttatt gcacggtaag gaagtagatc ataactcgag ataacttcgt 1980
          ataatgtatg ctatacgaag ttatctagcg ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc 2040
          gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 2100
          cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 2160
          aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 2220
          acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 2280
          aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 2340
          aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 2400
          ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 2460
          tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 2520
          ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 2580
          aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 2640
          tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 2700
          accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaatagac tagcgctcaa 2760
          taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgcggccg cttcctcgct cactgacgct 2820
          agcgccctat agtgagtcgt attacagatc caattctgtg agcgtatggc aaacgaagga 2880
          aaaatagtta tagtagccgc actcgatggg acatttcaac gtaaaccgtt taataatatt 2940
          ttgaatctta ttccattatc tgaaatggtg gtaaaactaa ctgctgtgtg tatgaaatgc 3000
          tttaaggagg cttccttttc taaacgattg ggtgaggaaa ccgagataga aataatagga 3060
          ggtaatgata tgtatcaatc ggtgtgtaga aagtgttaca tcgactcata            3110
          <![CDATA[<210> 66]]>
          <![CDATA[<211> 324]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 66]]>
          Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ala Ala Ala
           1               5                  10                  15      
          Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln
                      20                  25                  30          
          Ala Ala Ala Asp Val Ala Asp Ala Glu Val Met Ala Ala Lys Arg Asn
                  35                  40                  45              
          Val Val Val Ala Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe
              50                  55                  60                  
          Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His
          65                  70                  75                  80  
          Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg
                          85                  90                  95      
          Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn
                  115                 120                 125             
          Val Ile Ala Ala Ile Ala Phe Leu Ala Pro Val Leu Lys Ala Met His
              130                 135                 140                 
          Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Ala Glu Ala Ile Thr Gly Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Lys Thr Glu Ala Ala Ala Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val
                      180                 185                 190         
          Thr Thr Ala Leu Asn Ile Ala Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu
                  195                 200                 205             
          Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys
              210                 215                 220                 
          Ile Asn Ala Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp
          225                 230                 235                 240 
          Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Ala Asn Met Ala Ala Ala Ala
                          245                 250                 255     
          Trp Ser Arg Ile Gly Thr Ala Ala Thr Lys Arg Tyr Pro Gly Val Met
                      260                 265                 270         
          Tyr Ala Phe Thr Thr Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile
                  275                 280                 285             
          Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile
              290                 295                 300                 
          Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Phe Ile
          <![CDATA[<210> 67]]>
          <![CDATA[<211> 324]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 67]]>
          Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ile Asp Arg
           1               5                  10                  15      
          Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln
                      20                  25                  30          
          Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Asn
                  35                  40                  45              
          Val Val Val Val Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe
              50                  55                  60                  
          Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His
          65                  70                  75                  80  
          Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg
                          85                  90                  95      
          Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn
                  115                 120                 125             
          Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg Pro Val Leu Lys Ala Met His
              130                 135                 140                 
          Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Arg Glu Ile Ile Thr Gly Asn
          145                 150                 155                 160 
          Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Met Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val
                      180                 185                 190         
          Thr Thr Ala Leu Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu
                  195                 200                 205             
          Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys
              210                 215                 220                 
          Ile Asn Arg Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp
          225                 230                 235                 240 
          Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Gly Trp Met Lys Pro Asn Phe
                          245                 250                 255     
          Trp Phe Arg Ile Gly Pro Ala Thr Val Ile Arg Cys Pro Gly Val Lys
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Asn Thr Ala Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile
                  275                 280                 285             
          Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile
              290                 295                 300                 
          Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Phe Ile
          <![CDATA[<210> 68]]>
          <![CDATA[<211> 324]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 68]]>
          Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ala Ala Ala
           1               5                  10                  15      
          Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln
                      20                  25                  30          
          Ala Ala Ala Asp Val Ala Asp Ala Glu Val Met Ala Ala Lys Arg Asn
                  35                  40                  45              
          Val Val Val Ala Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe
              50                  55                  60                  
          Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His
          65                  70                  75                  80  
          Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg
                          85                  90                  95      
          Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn
                  115                 120                 125             
          Val Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ala Ala Pro Val Leu Lys Ala Met His
              130                 135                 140                 
          Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Ala Ala Ala Ile Thr Gly Asn
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Lys Thr Glu Ala Ala Ala Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val
                      180                 185                 190         
          Thr Thr Ala Leu Asn Ala Ala Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu
                  195                 200                 205             
          Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys
              210                 215                 220                 
          Ile Asn Ala Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp
          225                 230                 235                 240 
          Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
                          245                 250                 255     
          Trp Ala Arg Ile Gly Pro Ala Thr Thr Ile Arg Cys Pro Gly Val Lys
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Asn Thr Ala Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile
                  275                 280                 285             
          Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile
              290                 295                 300                 
          Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Phe Ile
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 69]]>
          Met Ala Ala Ala Lys Thr Pro Val Ile Val Val Pro Val Ile Asp Arg
           1               5                  10                  15      
          Leu Pro Ser Glu Thr Phe Pro Asn Val His Glu His Ile Asn Asp Gln
                      20                  25                  30          
          Lys Phe Asp Asp Val Lys Asp Asn Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Asn
                  35                  40                  45              
          Val Val Val Val Lys Asp Asp Pro Asp His Tyr Lys Asp Tyr Ala Phe
              50                  55                  60                  
          Ile Gln Trp Thr Gly Gly Asn Ile Arg Asn Asp Asp Lys Tyr Thr His
          65                  70                  75                  80  
          Phe Phe Ser Gly Phe Cys Asn Thr Met Cys Thr Glu Glu Thr Lys Arg
                          85                  90                  95      
          Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Leu Trp Asp Ser Asn Phe Phe Thr Glu
                      100                 105                 110         
          Leu Glu Asn Lys Lys Val Glu Tyr Val Val Ile Val Glu Asn Asp Asn
                  115                 120                 125             
          Val Ile Glu Asp Ile Thr Phe Leu Arg Pro Val Leu Lys Ala Met His
              130                 135                 140                 
          Asp Lys Lys Ile Asp Ile Leu Gln Met Arg Glu Ile Ile Thr Gly Asn
          145                 150                 155                 160 
          Lys Val Lys Thr Glu Leu Val Met Asp Lys Asn His Ala Ile Phe Thr
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Gly Gly Tyr Asp Val Ser Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Arg Val
                      180                 185                 190         
          Thr Thr Ala Leu Asn Ile Val Asp Glu Ile Ile Lys Ser Gly Gly Leu
                  195                 200                 205             
          Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Glu Ile Ala Arg Ile Glu Asn Glu Met Lys
              210                 215                 220                 
          Ile Asn Arg Gln Ile Leu Asp Asn Ala Ala Lys Tyr Val Glu His Asp
          225                 230                 235                 240 
          Pro Arg Leu Val Ala Glu His Arg Phe Gly Trp Met Lys Pro Asn Phe
                          245                 250                 255     
          Trp Phe Arg Ile Gly Pro Ala Thr Val Ile Arg Cys Pro Gly Val Lys
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Asn Thr Ala Pro Leu Ile Ser Phe Phe Gly Leu Phe Asp Ile
                  275                 280                 285             
          Asn Val Ile Gly Leu Ile Val Ile Leu Phe Ile Met Phe Met Leu Ile
              290                 295                 300                 
          Phe Asn Val Lys Ser Lys Leu Leu Trp Phe Leu Thr Gly Thr Phe Val
          305                 310                 315                 320 
          Thr Ala Phe Ile
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          <![CDATA[<400> 70]]>
          Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile
           1               5                  10                  15      
          Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys
                      20                  25                  30          
          Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Asn Phe Ala
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Gly Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser
              50                  55                  60                  
          Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Ala Lys His Asp Asp
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn
                  115                 120                 125             
          Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Ala
              130                 135                 140                 
          Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Thr Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His
                          165                 170                 175     
          Ser Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His
                      180                 185                 190         
          Ser Asp Gln Leu Ser Lys Phe Arg Thr Leu Leu Ser Ser Ser Asn His
                  195                 200                 205             
          Asp Gly Lys Pro His Tyr Ile Thr Glu Asn Tyr Ala Asn Pro Tyr Lys
              210                 215                 220                 
          Leu Asn Asp Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu
                      260                 265                 270         
          Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr
                  275                 280                 285             
          Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn
              290                 295                 300                 
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          <![CDATA[<400> 71]]>
          Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile
           1               5                  10                  15      
          Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys
                      20                  25                  30          
          Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Phe Trp Ile Asn Phe Lys
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Trp Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser
              50                  55                  60                  
          Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp
                          85                  90                  95      
          Asn Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Lys His Asp Asp
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn
                  115                 120                 125             
          Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Thr
              130                 135                 140                 
          Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His
                          165                 170                 175     
          Tyr Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His
                      180                 185                 190         
          Ser Asp Gln Leu Ser Lys Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Ser Ser Asn His
                  195                 200                 205             
          Asp Gly Lys Thr His Tyr Ile Thr Glu Cys Tyr Arg Asn Leu Tyr Lys
              210                 215                 220                 
          Leu Asn Gly Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu
                      260                 265                 270         
          Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr
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          Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn
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          <![CDATA[<210> 72]]>
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          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 72]]>
          Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile
           1               5                  10                  15      
          Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys
                      20                  25                  30          
          Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Ala Ala Ile Asn Phe Ala
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Tyr Ile Ala Ala Ala Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser
              50                  55                  60                  
          Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp
                          85                  90                  95      
          Asn Ala Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Ala Ala His Asp Asp
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn
                  115                 120                 125             
          Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Gly
              130                 135                 140                 
          Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ala Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His
                          165                 170                 175     
          Ala Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His
                      180                 185                 190         
          Ser Asp Gln Ala Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ala His
                  195                 200                 205             
          Asp Gly Lys Ala His Tyr Ile Thr Glu Ala Tyr Ala Asn Ala Tyr Lys
              210                 215                 220                 
          Leu Asn Ala Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu
                      260                 265                 270         
          Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr
                  275                 280                 285             
          Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn
              290                 295                 300                 
          <![CDATA[<210> 73]]>
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          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 73]]>
          Met Asp Gly Thr Leu Phe Pro Gly Asp Asp Asp Leu Ala Ile Pro Ala
           1               5                  10                  15      
          Thr Glu Phe Phe Ser Thr Lys Ala Ala Lys Ala Pro Glu Asp Lys Ala
                      20                  25                  30          
          Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Asn Glu Glu Thr Leu Lys
                  35                  40                  45              
          Gln Arg Leu Thr Asn Leu Glu Lys Lys Ile Thr Asn Val Thr Thr Lys
              50                  55                  60                  
          Phe Glu Gln Ile Glu Lys Cys Cys Lys Arg Asn Asp Glu Val Leu Phe
          65                  70                  75                  80  
          Arg Leu Glu Asn His Ala Glu Thr Leu Arg Ala Ala Met Ile Ser Leu
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Lys Ile Asp Val Gln Thr Gly Arg Ala Ala Ala Glu
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 74]]>
          <![CDATA[<211> 250]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 74]]>
          Met Gly Ala Ala Ala Ser Ile Gln Thr Thr Val Asn Thr Leu Ser Glu
           1               5                  10                  15      
          Arg Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gln Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala
                      20                  25                  30          
          Ala Cys Ala Ile Glu Ile Gly Asn Phe Tyr Ile Arg Gln Asn His Gly
                  35                  40                  45              
          Cys Asn Leu Thr Val Lys Asn Met Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln
              50                  55                  60                  
          Leu Asp Ala Val Leu Ser Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Ser Gly Leu Thr
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Gln Lys Ala Tyr Val Pro Ala Met Phe Thr Ala Ala Leu Asn
                          85                  90                  95      
          Ile Gln Thr Ser Val Asn Thr Val Val Arg Asp Phe Glu Asn Tyr Val
                      100                 105                 110         
          Lys Gln Thr Cys Asn Ser Ser Ala Val Val Asp Asn Ala Leu Ala Ile
                  115                 120                 125             
          Gln Asn Val Ile Ile Asp Glu Cys Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Thr
              130                 135                 140                 
          Asn Leu Glu Phe Ile Asn Thr Gly Ser Ser Lys Gly Asn Cys Ala Ile
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Leu Met Gln Leu Thr Thr Lys Ala Thr Thr Gln Ile Ala Pro
                          165                 170                 175     
          Lys Gln Val Ala Gly Thr Gly Val Gln Phe Tyr Met Ile Val Ile Gly
                      180                 185                 190         
          Val Ile Ile Leu Ala Ala Leu Phe Met Tyr Tyr Ala Lys Arg Met Leu
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Ser Thr Asn Asp Lys Ile Lys Leu Ile Leu Ala Asn Lys Glu
              210                 215                 220                 
          Asn Val His Trp Thr Thr Tyr Met Asp Thr Phe Phe Arg Thr Ser Pro
          225                 230                 235                 240 
          Met Val Ile Ala Thr Thr Asp Met Gln Asn
                          245                 250 
          <![CDATA[<210> 75]]>
          <![CDATA[<211> 36]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          ggcgaccacc cacaggcaac accagcacct gcccca                           36
          <![CDATA[<210> 76]]>
          <![CDATA[<211> 33]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 76]]>
          ccggttgcgc ctattcttgc cgttcttgcc gcc                              33
          <![CDATA[<210> 77]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 77]]>
          Asn Gly Arg Arg Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys
           1               5                  10                  15      
          Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser
                      20                  
          <![CDATA[<210> 78]]>
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          <![CDATA[<400> 78]]>
          Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val
           1               5                  10                  15      
          Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
                      20                  25          
          <![CDATA[<210> 79]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 79]]>
          Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys
           1               5                  10                  15      
          Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn Arg Leu Phe Gly Asp
                      20                  25                  30          
          Lys Ser
          <![CDATA[<210> 80]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 80]]>
          Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
           1               5                  10                  15      
          Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln
                      20                  25                  30          
          Ala Gly
          <![CDATA[<210> 81]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 81]]>
          Arg Arg Leu Arg Arg Met Glu Ser Glu Ser Glu Ser
           1               5                  10          
          <![CDATA[<210> 82]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<400> 82]]>
          Lys Arg Lys Lys Lys Gly Gly Lys Asn Gly Lys Asn Thr Thr Asn Thr
           1               5                  10                  15      
          Lys Lys Lys Asn Pro
                      20      
          <![CDATA[<210> 83]]>
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          tcctgtcttg cattgcacta agtcttg                                     27
          <![CDATA[<210> 84]]>
          <![CDATA[<211> 34]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<400> 84]]>
          tcatcactaa cgtggcttct tctgccaaag catg                             34
          <![CDATA[<210> 85]]>
          <![CDATA[<211> 304]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 85]]>
          Met Pro Gln Gln Leu Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Lys Lys Ala Ile
           1               5                  10                  15      
          Ser Asn Ala Arg Leu Lys Pro Leu Asp Ile His Tyr Asn Glu Ser Lys
                      20                  25                  30          
          Pro Thr Thr Ile Gln Asn Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ile Asn Phe Lys
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Tyr Ile Ser Gly Trp Phe Leu Pro Asn Glu Tyr Val Leu Ser
              50                  55                  60                  
          Ser Leu His Ile Tyr Trp Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gly Ser Asn His
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ile Asp Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Glu Ile Asn Leu Val His Trp
                          85                  90                  95      
          Asn Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Lys His Asp Asp
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Ile Ile Ile Ser Ile Phe Leu Gln Val Leu Asp His Lys Asn
                  115                 120                 125             
          Val Tyr Phe Gln Lys Ile Val Asn Gln Leu Asp Ser Ile Arg Ser Thr
              130                 135                 140                 
          Asn Thr Ser Ala Pro Phe Asp Ser Val Phe Tyr Leu Asp Asn Leu Leu
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Lys Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Leu Gly Thr Thr Ile Asn His
                          165                 170                 175     
          Tyr Ala Asp Ala Val Trp Ile Ile Phe Pro Thr Pro Ile Asn Ile His
                      180                 185                 190         
          Ser Asp Gln Leu Ser Lys Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Ser Ser Asn His
                  195                 200                 205             
          Asp Gly Lys Thr His Tyr Ile Thr Glu Cys Tyr Arg Asn Leu Tyr Lys
              210                 215                 220                 
          Leu Asn Gly Asp Thr Gln Val Tyr Tyr Ser Gly Glu Ile Ile Arg Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ala Thr Thr Ser Pro Ala Arg Glu Asn Tyr Phe Met Arg Trp Leu Ser
                          245                 250                 255     
          Asp Leu Arg Glu Thr Cys Phe Ser Tyr Tyr Gln Lys Tyr Ile Glu Glu
                      260                 265                 270         
          Asn Lys Thr Phe Ala Ile Ile Ala Ile Val Phe Val Phe Ile Leu Thr
                  275                 280                 285             
          Ala Ile Leu Phe Phe Met Ser Arg Arg Tyr Ser Arg Glu Lys Gln Asn
              290                 295                 300                 
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 86]]>
          Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His
           1               5                  10                  15  
          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 87]]>
          Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
           1               5          
          <![CDATA[<210> 88]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 88]]>
          Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
           1               5                  
          <![CDATA[<210> 89]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 89]]>
          Glu Asn Ile Ile His
           1               5  
          <![CDATA[<210> 90]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 90]]>
          Trp Phe His Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
           1               5                  10                  15      
          Asp
          <![CDATA[<210> 91]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 91]]>
          His Gly Gly Thr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr
           1               5                  10      
          <![CDATA[<210> 92]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 92]]>
          Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
           1               5                  10  
          <![CDATA[<210> 93]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 93]]>
          Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
           1               5          
          <![CDATA[<210> 94]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 94]]>
          Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
           1               5                  
          <![CDATA[<210> 95]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
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          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 95]]>
          Arg Tyr Thr Met His
           1               5  
          <![CDATA[<210> 96]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 96]]>
          Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
           1               5                  10                  15      
          Asp
          <![CDATA[<210> 97]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
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          <![CDATA[<400> 97]]>
          Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
           1               5                  10  
          <![CDATA[<210> 98]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 98]]>
          Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
           1               5                  10                  15      
          Ala His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Asn Ile Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Ile Gly Trp Phe His Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn
          65                  70                  75                  80  
          Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                          85                  90                  95      
          Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
                      100                 105                 110         
          Tyr Phe Cys Ala Arg His Gly Gly Thr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr
                  115                 120                 125             
          Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Ile Leu Met Thr Gln Ser
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala Ser Ser Val Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
                          165                 170                 175     
          Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp
                      180                 185                 190         
          Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly Ser
                      260                 265             
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          <![CDATA[<400> 99]]>
          Val Asp Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro
           1               5                  10                  15      
          Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
                      20                  25                  30          
          Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
                  35                  40                  45              
          Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln
              50                  55                  60                  
          Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr
          65                  70                  75                  80  
          Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro
              130                 135                 140                 
          Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
                          165                 170                 175     
          Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly
                      180                 185                 190         
          Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
                  195                 200                 205             
          Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
              210                 215                 220                 
          Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
          225                 230                 235                 240 
          Leu Lys Ser
          <![CDATA[<210> 100]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 100]]>
          Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
           1               5                  10                  15      
          Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Asn
                      20                  25                  30          
          Ile Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Phe His Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                          85                  90                  95      
          Ala Arg His Gly Gly Thr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser
              130                 135                 140                 
          Ser Val Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln
                          165                 170                 175     
          Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu
                      180                 185                 190         
          Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                  195                 200                 205             
          Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
              210                 215                 220                 
          Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
          225                 230                 235                 240 
          Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Asp Ile Lys Leu Gln Gln
                      260                 265                 270         
          Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
                  275                 280                 285             
          Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys
              290                 295                 300                 
          Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
          305                 310                 315                 320 
          Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu
                          325                 330                 335     
          Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
                      340                 345                 350         
          Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp
                  355                 360                 365             
          His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
              370                 375                 380                 
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
                          405                 410                 415     
          Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
                      420                 425                 430         
          Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
                  435                 440                 445             
          Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
              450                 455                 460                 
          Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
          465                 470                 475                 480 
          Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
                          485                 490                 495     
          Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser
                      500                 505         
          <![CDATA[<210> 101]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
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          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 101]]>
          Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
           1               5                  10                  15      
          Ala His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
                      20                  25                  30          
          Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Asn Ile Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu
              50                  55                  60                  
          Glu Trp Ile Gly Trp Phe His Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn
          65                  70                  75                  80  
          Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
                          85                  90                  95      
          Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
                      100                 105                 110         
          Tyr Phe Cys Ala Arg His Gly Gly Thr Gly Arg Gly Ala Met Asp Tyr
                  115                 120                 125             
          Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Gln Ile Leu Met Thr Gln Ser
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala Ser Ser Val Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
                          165                 170                 175     
          Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp
                      180                 185                 190         
          Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala
          225                 230                 235                 240 
          Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly
                      260                 265                 270         
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Asp Ile Lys
                  275                 280                 285             
          Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys
              290                 295                 300                 
          Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
          305                 310                 315                 320 
          Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
                          325                 330                 335     
          Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys
                      340                 345                 350         
          Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
                  355                 360                 365             
          Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr
              370                 375                 380                 
          Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
          385                 390                 395                 400 
          Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
                          405                 410                 415     
          Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
                      420                 425                 430         
          Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
                  435                 440                 445             
          Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg
              450                 455                 460                 
          Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe
          465                 470                 475                 480 
          Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met
                          485                 490                 495     
          Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn
                      500                 505                 510         
          Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser
                  515                 520                 525     
          <![CDATA[<210> 102]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 102]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
           1               5                  10                  15      
          Val Thr Asn Ser
                      20  
          <![CDATA[<210> 103]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 103]]>
          Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
           1               5                  10                  15      
          Ala His Ser
          <![CDATA[<210> 104]]>
          <![CDATA[<211> 209]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 104]]>
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
           1               5                  10                  15      
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
                  35                  40                  45              
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                          85                  90                  95      
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
                  115                 120                 125             
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                          165                 170                 175     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                      180                 185                 190         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                  195                 200                 205             
          Lys
          <![CDATA[<210> 105]]>
          <![CDATA[<211> 675]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 105]]>
          Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ser
           1               5                  10                  15      
          Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His Leu Ala Ala Asn
                      20                  25                  30          
          Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr Thr Ala Pro Asn
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys Asp Asn Gly Asn
              50                  55                  60                  
          Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val Gln Arg Arg Ser
          65                  70                  75                  80  
          Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr Ile His Gln Gly
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro Ser Tyr Val Val
                      100                 105                 110         
          Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val Lys Ser Tyr Asp
                  115                 120                 125             
          Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro Glu Asn Arg Gly
              130                 135                 140                 
          Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn Gly Trp Thr Trp
          145                 150                 155                 160 
          Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp Lys Pro Trp Thr
                          165                 170                 175     
          Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile Gln His Gly Pro
                      180                 185                 190         
          His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg Thr Ala Gly Gly
                  195                 200                 205             
          Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His Gly Lys Thr Trp
              210                 215                 220                 
          Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu Asn Lys Val Val
          225                 230                 235                 240 
          Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg Ala Ser Asp Gly
                          245                 250                 255     
          Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly Gly Gln Thr Trp
                      260                 265                 270         
          Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser Val Asp Asn Ala
                  275                 280                 285             
          Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp Asp Pro Arg Ala
              290                 295                 300                 
          Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg Pro Trp Ser Arg
          305                 310                 315                 320 
          Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly Ala Ser Trp Thr
                          325                 330                 335     
          Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr Thr Thr Ile Ala
                      340                 345                 350         
          Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu Asp Ala His Asn
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe Thr Met Asn Trp
              370                 375                 380                 
          Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp
          385                 390                 395                 400 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
                          405                 410                 415     
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                      420                 425                 430         
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
                  435                 440                 445             
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
              450                 455                 460                 
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
          465                 470                 475                 480 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
                          485                 490                 495     
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                      500                 505                 510         
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
                  515                 520                 525             
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
              530                 535                 540                 
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
          545                 550                 555                 560 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
                          565                 570                 575     
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                      580                 585                 590         
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
                  595                 600                 605             
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
              610                 615                 620                 
          Gly Lys Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His
          625                 630                 635                 640 
          Ser Leu Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val
                          645                 650                 655     
          Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys
                      660                 665                 670         
          Lys Pro Arg
                  675 
          <![CDATA[<210> 106]]>
          <![CDATA[<211> 695]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 106]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
           1               5                  10                  15      
          Val Thr Asn Ser Met Gly Asp His Pro Gln Ala Thr Pro Ala Pro Ala
                      20                  25                  30          
          Pro Asp Ala Ser Thr Glu Leu Pro Ala Ser Met Ser Gln Ala Gln His
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Ala Asn Thr Ala Thr Asp Asn Tyr Arg Ile Pro Ala Ile Thr
              50                  55                  60                  
          Thr Ala Pro Asn Gly Asp Leu Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Arg Pro Lys
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asn Gly Asn Gly Gly Ser Asp Ala Pro Asn Pro Asn His Ile Val
                          85                  90                  95      
          Gln Arg Arg Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Thr Tyr
                      100                 105                 110         
          Ile His Gln Gly Thr Glu Thr Gly Lys Lys Val Gly Tyr Ser Asp Pro
                  115                 120                 125             
          Ser Tyr Val Val Asp His Gln Thr Gly Thr Ile Phe Asn Phe His Val
              130                 135                 140                 
          Lys Ser Tyr Asp Gln Gly Trp Gly Gly Ser Arg Gly Gly Thr Asp Pro
          145                 150                 155                 160 
          Glu Asn Arg Gly Ile Ile Gln Ala Glu Val Ser Thr Ser Thr Asp Asn
                          165                 170                 175     
          Gly Trp Thr Trp Thr His Arg Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr Lys Asp
                      180                 185                 190         
          Lys Pro Trp Thr Ala Arg Phe Ala Ala Ser Gly Gln Gly Ile Gln Ile
                  195                 200                 205             
          Gln His Gly Pro His Ala Gly Arg Leu Val Gln Gln Tyr Thr Ile Arg
              210                 215                 220                 
          Thr Ala Gly Gly Ala Val Gln Ala Val Ser Val Tyr Ser Asp Asp His
          225                 230                 235                 240 
          Gly Lys Thr Trp Gln Ala Gly Thr Pro Ile Gly Thr Gly Met Asp Glu
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Val Val Glu Leu Ser Asp Gly Ser Leu Met Leu Asn Ser Arg
                      260                 265                 270         
          Ala Ser Asp Gly Ser Gly Phe Arg Lys Val Ala His Ser Thr Asp Gly
                  275                 280                 285             
          Gly Gln Thr Trp Ser Glu Pro Val Ser Asp Lys Asn Leu Pro Asp Ser
              290                 295                 300                 
          Val Asp Asn Ala Gln Ile Ile Arg Ala Phe Pro Asn Ala Ala Pro Asp
          305                 310                 315                 320 
          Asp Pro Arg Ala Lys Val Leu Leu Leu Ser His Ser Pro Asn Pro Arg
                          325                 330                 335     
          Pro Trp Ser Arg Asp Arg Gly Thr Ile Ser Met Ser Cys Asp Asp Gly
                      340                 345                 350         
          Ala Ser Trp Thr Thr Ser Lys Val Phe His Glu Pro Phe Val Gly Tyr
                  355                 360                 365             
          Thr Thr Ile Ala Val Gln Ser Asp Gly Ser Ile Gly Leu Leu Ser Glu
              370                 375                 380                 
          Asp Ala His Asn Gly Ala Asp Tyr Gly Gly Ile Trp Tyr Arg Asn Phe
          385                 390                 395                 400 
          Thr Met Asn Trp Leu Gly Glu Gln Cys Gly Gln Lys Pro Ala Glu Pro
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                      420                 425                 430         
          Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
                  435                 440                 445             
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
              450                 455                 460                 
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
          465                 470                 475                 480 
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
                          485                 490                 495     
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                      500                 505                 510         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
                  515                 520                 525             
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
              530                 535                 540                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
          545                 550                 555                 560 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                          565                 570                 575     
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                      580                 585                 590         
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
                  595                 600                 605             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
              610                 615                 620                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
          625                 630                 635                 640 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile
                          645                 650                 655     
          Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile
                      660                 665                 670         
          Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met
                  675                 680                 685             
          Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
              690                 695 
          <![CDATA[<210> 107]]>
          <![CDATA[<211> 40]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 107]]>
          tatttatatt ccaaaaaaaa aaaataaaat ttcaattttt                       40
          <![CDATA[<210> 108]]>
          <![CDATA[<211> 3769]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 108]]>
          ggccggcctc atcatgattt cagttccagt ttagtcccag ccccgaaggt caggggatta 60
          gaggaccact gctgacaata gtaggttgca gcatcttcgg cctccatgct tgaaatggtc 120
          aggctatatg aagtcccact gccagatccg gagaaccggt aggggactcc actagccacc 180
          ttagaggtgt catagatcca tcgctttgga gaagtcccgg atttctgctg gtaccagttc 240
          atatagctga cactagagga ggcccggcat gtcatggtca ctttttcgcc aggggaagct 300
          gacataatgg cgggagactg agtcagctgg atgtcagagc ctcctccgcc ggagccgcct 360
          cctccgcttc ctcctcctcc gcttgacact gtcagagttg tcccctgtcc ccaataatcc 420
          agacaataat gatcgtcata gtagcgagcg caatagtaca cggcgctgtc ctctgatgtc 480
          agactagaca gctgcatgta tgcggtggag cttgacttat cggtagtcag agtagccttg 540
          tctttaaact tctggttgta gttggtgtat cccctgcttg gattaatgta cccgatccat 600
          tccagtccct gcccaggtcg ctgcttcacc cagtgcattg tgtagcgagt gaatgtatag 660
          ccggaggtct tacagctcat tttcactgat gctcctggtc tagccagctc tgctccagac 720
          tgctgcagct tgatatcgtc gactgagcct cccccgccac ttcctcctcc tccagatcct 780
          cctcctccgg atcccgcccg ttttatttcc agcttggtcc cccctccgaa cgtgtacgga 840
          agctccctac tgtgctgaca gtaataggtt gcagcatcct cctcctccac agggtggatg 900
          ttgagggtga agtctgtccc agacccactg ccactgaacc tgggagggac cccagattct 960
          aggttggatg caagatagat gaggagtttg ggtggctgtc ctggtttctg ttggtaccag 1020
          tgcatataac tataggcaga tgtactgaca cttttgctgg ccctgcatga gatggtggcc 1080
          ctctgcccca gagatacaac tgaggaagca ggagactggg tcatcagaat ttgtgcacta 1140
          ccgccagagc cacctccgcc tgaaccgcct ccaccactcg agacggtgac tgaggttcct 1200
          tgaccccagt agtccatagc tcctcgccca gttcctccgt gtcttgcaca gaaatagacc 1260
          gcagagtctt cagatgtcaa tctactaagc tccatataga ctgtgctgga ggatttgtcc 1320
          gcagtcaatg tggccttgtc cttgaatttc tcattgtact ttatactacc acttccaggg 1380
          tgaaaccacc caatccactc aagaccctgc ccagacctct gctttaccca gtgtataata 1440
          ttttcagtga aggtgtagcc agaagtcttg caggacagct tcactgatgc cccgggtttc 1500
          accagttcag ctccagactg cttcagctgc acctgagaat gagcgccggt agcagcgccg 1560
          acgaggaaga ggatgcgcca gatccagtcc attatttata ttccaaaaaa aaaaaataaa 1620
          atttcaattt ttcatatgtc atcactaacg tggcttcttc tgccaaagca tgatgaggat 1680
          gataagggag atgatggtga gcaccaccag ggccaggatg gctgagatca ccaccacctt 1740
          aaagggcaag gagtgtggca ccacgatgac ctcctgcgtg tcctggccca cagctttgcc 1800
          ggggctcaga gacagagatt tctgggtgta gtggttgtgc agagcctcgt gcatgacgga 1860
          gcagctgaac acattgcctt gttgccatct agacttatcc acggtcagct tggagtacag 1920
          aaagaagctg ccgtcggaat cgagcacggg gggtgtggtc ttgtagttgt tctcgggctg 1980
          tccgttgctt tcccattcga cggcgatgtc gctagggtag aagcctttca cgaggcatgt 2040
          gagggacact tgattcttgg tcatctcctc tctagaggga gggagggtat acacttgagg 2100
          ttccctaggc tggcccttgg ccttgctgat ggtcttctca atgggggcgg gcagagcctt 2160
          gttgctgacc ttgcatttat actctttgcc gttcagccag tcttggtgca gcactgtcag 2220
          cacggacacg actctatagg tgctgttata ctgttcctct ctaggcttgg tcttagcgtt 2280
          atgcacctcc acgccgtcca cgtaccagtt gaacttgacc tcggggtctt catgggacac 2340
          atccaccacc acgcatgtca cctcgggtgt tctagaaatc atgagggtgt ccttgggttt 2400
          ggggggaaac agaaacacgg agggtccgcc gagcagctcg ggagcgggac aaggagggca 2460
          tgtgtgggtc ttatcgcagc tcttgggctc ggctggcttc tggccacact gctcgcccag 2520
          ccagttcatg gtgaagttcc gataccagat gccgccgtaa tcggcgccat tgtgtgcgtc 2580
          ctcgctcagc agtccgatgc tgccatcaga ctgcacggcg attgtggtgt agcccacaaa 2640
          tggctcgtgg aacaccttgg atgtggtcca gctggcgcca tcgtcgcagg acatgctgat 2700
          tgtgcctctg tcccggctcc aaggccttgg gtttggagag tgggacagca gcagcacctt 2760
          ggctctggga tcgtctgggg cggcattagg aaaggcccgg atgatctggg cgttatccac 2820
          gctgtcaggc agattcttat cagacacggg ctcggaccag gtctgtcctc cgtctgtaga 2880
          gtgtgccacc ttgcggaagc cggagccgtc gctggcccta gagttcagca tcagggagcc 2940
          atcgctcagc tccaccacct tattctcgtc catgcctgtg ccgattgggg tgcctgcctg 3000
          ccaggtcttg ccgtgatcgt cagaatacac ggacacggcc tgcactgctc ctcctgctgt 3060
          tctgatggtg tactgctgca ccagccggcc tgcgtgaggt ccgtgctgga tctggatgcc 3120
          ctgtccgctt gctgcgaatc ttgcggtcca gggcttatcc tttgtgatgt cggctgtgat 3180
          ggtccggtgt gtccaggtcc agccgttgtc tgtgctggta gacacctcgg cctggatgat 3240
          gccgcgattc tcaggatcgg tgccgcccct agagcctccc catccctggt cataggactt 3300
          cacgtgaaag ttgaagattg tgccggtctg gtgatccacc acatagcttg ggtcagagta 3360
          gccgaccttc ttgcctgtct cggtgccctg gtggatgtag gtaggggcgc tccatgtctt 3420
          gccgccatcg gtagatctcc gctgcacgat gtgattaggg tttggtgcgt cggagcctcc 3480
          atttccgtta tccttggggc gctcgtcata gctgatcagc agatcgccat ttggggctgt 3540
          ggtgatggcg gggattctgt agttgtctgt tgcggtattt gctgccaggt gctgtgcctg 3600
          ggacatgctt gctggcagct cggtggaggc atctggggca ggtgctggtg ttgcctgtgg 3660
          gtggtcgccc atactgtttg tgacaagtgc aagacttagt gcaatgcaag acaggagttg 3720
          catcctgtac atttatagca tagaaaaaaa caaaatgaaa ttcaagctt             3769
          <![CDATA[<210> 109]]>
          <![CDATA[<211> 1578]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 109]]>
          tgatttcagt tccagtttag tcccagcccc gaaggtcagg ggattagagg accactgctg 60
          acaatagtag gttgcagcat cttcggcctc catgcttgaa atggtcaggc tatatgaagt 120
          cccactgcca gatccggaga accggtaggg gactccacta gccaccttag aggtgtcata 180
          gatccatcgc tttggagaag tcccggattt ctgctggtac cagttcatat agctgacact 240
          agaggaggcc cggcatgtca tggtcacttt ttcgccaggg gaagctgaca taatggcggg 300
          agactgagtc agctggatgt cagagcctcc tccgccggag ccgcctcctc cgcttcctcc 360
          tcctccgctt gacactgtca gagttgtccc ctgtccccaa taatccagac aataatgatc 420
          gtcatagtag cgagcgcaat agtacacggc gctgtcctct gatgtcagac tagacagctg 480
          catgtatgcg gtggagcttg acttatcggt agtcagagta gccttgtctt taaacttctg 540
          gttgtagttg gtgtatcccc tgcttggatt aatgtacccg atccattcca gtccctgccc 600
          aggtcgctgc ttcacccagt gcattgtgta gcgagtgaat gtatagccgg aggtcttaca 660
          gctcattttc actgatgctc ctggtctagc cagctctgct ccagactgct gcagcttgat 720
          atcgtcgact gagcctcccc cgccacttcc tcctcctcca gatcctcctc ctccggatcc 780
          cgcccgtttt atttccagct tggtcccccc tccgaacgtg tacggaagct ccctactgtg 840
          ctgacagtaa taggttgcag catcctcctc ctccacaggg tggatgttga gggtgaagtc 900
          tgtcccagac ccactgccac tgaacctggg agggacccca gattctaggt tggatgcaag 960
          atagatgagg agtttgggtg gctgtcctgg tttctgttgg taccagtgca tataactata 1020
          ggcagatgta ctgacacttt tgctggccct gcatgagatg gtggccctct gccccagaga 1080
          tacaactgag gaagcaggag actgggtcat cagaatttgt gcactaccgc cagagccacc 1140
          tccgcctgaa ccgcctccac cactcgagac ggtgactgag gttccttgac cccagtagtc 1200
          catagctcct cgcccagttc ctccgtgtct tgcacagaaa tagaccgcag agtcttcaga 1260
          tgtcaatcta ctaagctcca tatagactgt gctggaggat ttgtccgcag tcaatgtggc 1320
          cttgtccttg aatttctcat tgtactttat actaccactt ccagggtgaa accacccaat 1380
          ccactcaaga ccctgcccag acctctgctt tacccagtgt ataatatttt cagtgaaggt 1440
          gtagccagaa gtcttgcagg acagcttcac tgatgccccg ggtttcacca gttcagctcc 1500
          agactgcttc agctgcacct gagaatgagc gccggtagca gcgccgacga ggaagaggat 1560
          gcgccagatc cagtccat                                               1578
          <![CDATA[<210> 110]]>
          <![CDATA[<211> 2088]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 110]]>
          ctaacgtggc ttcttctgcc aaagcatgat gaggatgata agggagatga tggtgagcac 60
          caccagggcc aggatggctg agatcaccac caccttaaag ggcaaggagt gtggcaccac 120
          gatgacctcc tgcgtgtcct ggcccacagc tttgccgggg ctcagagaca gagatttctg 180
          ggtgtagtgg ttgtgcagag cctcgtgcat gacggagcag ctgaacacat tgccttgttg 240
          ccatctagac ttatccacgg tcagcttgga gtacagaaag aagctgccgt cggaatcgag 300
          cacggggggt gtggtcttgt agttgttctc gggctgtccg ttgctttccc attcgacggc 360
          gatgtcgcta gggtagaagc ctttcacgag gcatgtgagg gacacttgat tcttggtcat 420
          ctcctctcta gagggaggga gggtatacac ttgaggttcc ctaggctggc ccttggcctt 480
          gctgatggtc ttctcaatgg gggcgggcag agccttgttg ctgaccttgc atttatactc 540
          tttgccgttc agccagtctt ggtgcagcac tgtcagcacg gacacgactc tataggtgct 600
          gttatactgt tcctctctag gcttggtctt agcgttatgc acctccacgc cgtccacgta 660
          ccagttgaac ttgacctcgg ggtcttcatg ggacacatcc accaccacgc atgtcacctc 720
          gggtgttcta gaaatcatga gggtgtcctt gggtttgggg ggaaacagaa acacggaggg 780
          tccgccgagc agctcgggag cgggacaagg agggcatgtg tgggtcttat cgcagctctt 840
          gggctcggct ggcttctggc cacactgctc gcccagccag ttcatggtga agttccgata 900
          ccagatgccg ccgtaatcgg cgccattgtg tgcgtcctcg ctcagcagtc cgatgctgcc 960
          atcagactgc acggcgattg tggtgtagcc cacaaatggc tcgtggaaca ccttggatgt 1020
          ggtccagctg gcgccatcgt cgcaggacat gctgattgtg cctctgtccc ggctccaagg 1080
          ccttgggttt ggagagtggg acagcagcag caccttggct ctgggatcgt ctggggcggc 1140
          attaggaaag gcccggatga tctgggcgtt atccacgctg tcaggcagat tcttatcaga 1200
          cacgggctcg gaccaggtct gtcctccgtc tgtagagtgt gccaccttgc ggaagccgga 1260
          gccgtcgctg gccctagagt tcagcatcag ggagccatcg ctcagctcca ccaccttatt 1320
          ctcgtccatg cctgtgccga ttggggtgcc tgcctgccag gtcttgccgt gatcgtcaga 1380
          atacacggac acggcctgca ctgctcctcc tgctgttctg atggtgtact gctgcaccag 1440
          ccggcctgcg tgaggtccgt gctggatctg gatgccctgt ccgcttgctg cgaatcttgc 1500
          ggtccagggc ttatcctttg tgatgtcggc tgtgatggtc cggtgtgtcc aggtccagcc 1560
          gttgtctgtg ctggtagaca cctcggcctg gatgatgccg cgattctcag gatcggtgcc 1620
          gcccctagag cctccccatc cctggtcata ggacttcacg tgaaagttga agattgtgcc 1680
          ggtctggtga tccaccacat agcttgggtc agagtagccg accttcttgc ctgtctcggt 1740
          gccctggtgg atgtaggtag gggcgctcca tgtcttgccg ccatcggtag atctccgctg 1800
          cacgatgtga ttagggtttg gtgcgtcgga gcctccattt ccgttatcct tggggcgctc 1860
          gtcatagctg atcagcagat cgccatttgg ggctgtggtg atggcgggga ttctgtagtt 1920
          gtctgttgcg gtatttgctg ccaggtgctg tgcctgggac atgcttgctg gcagctcggt 1980
          ggaggcatct ggggcaggtg ctggtgttgc ctgtgggtgg tcgcccatac tgtttgtgac 2040
          aagtgcaaga cttagtgcaa tgcaagacag gagttgcatc ctgtacat              2088
          <![CDATA[<210> 111]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 111]]>
          Asp Tyr Asn Met Asp
           1               5  
          <![CDATA[<210> 112]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 112]]>
          Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Ser Asn Gln Lys Phe Lys
           1               5                  10                  15      
          Gly
          <![CDATA[<210> 113]]>
          <![CDATA[<211> 12]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 113]]>
          Arg Arg Tyr Tyr Gly Asn His Trp Tyr Phe Asp Val
           1               5                  10          
          <![CDATA[<210> 114]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 114]]>
          Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr Leu Ser
           1               5                  10      
          <![CDATA[<210> 115]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 115]]>
          Arg Ala Asn Arg Leu Met Asp
           1               5          
          <![CDATA[<210> 116]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 116]]>
          Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro Thr
           1               5                  
          <![CDATA[<210> 117]]>
          <![CDATA[<211> 121]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 117]]>
          Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
           1               5                  10                  15      
          Ser Leu Lys Ile Pro Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
                      20                  25                  30          
          Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
                  35                  40                  45              
          Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Ser Asn Gln Lys Phe
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                          85                  90                  95      
          Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Gly Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
                      100                 105                 110         
          Thr Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
                  115                 120     
          <![CDATA[<210> 118]]>
          <![CDATA[<211> 107]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 118]]>
          Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
           1               5                  10                  15      
          Glu Arg Val Thr Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr
                      20                  25                  30          
          Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Thr Leu Ile
                  35                  40                  45              
          Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Met Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                      100                 105         
          <![CDATA[<210> 119]]>
          <![CDATA[<211> 263]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 119]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
           1               5                  10                  15      
          Val Thr Asn Ser Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr
                      20                  25                  30          
          Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gln Asp
                  35                  40                  45              
          Ile Asn Ile Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro
              50                  55                  60                  
          Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Met Asp Gly Val Pro Ser
          65                  70                  75                  80  
          Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
              130                 135                 140                 
          Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ile Pro Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met
                          165                 170                 175     
          Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp
                      180                 185                 190         
          Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Ser Asn Gln Lys Phe Lys Gly
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu
              210                 215                 220                 
          Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile
          225                 230                 235                 240 
          Arg Arg Tyr Tyr Gly Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
                          245                 250                 255     
          Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
                      260             
          <![CDATA[<210> 120]]>
          <![CDATA[<211> 489]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 120]]>
          Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
           1               5                  10                  15      
          Val Thr Asn Ser Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr
                      20                  25                  30          
          Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gln Asp
                  35                  40                  45              
          Ile Asn Ile Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro
              50                  55                  60                  
          Lys Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Met Asp Gly Val Pro Ser
          65                  70                  75                  80  
          Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
              130                 135                 140                 
          Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ile Pro Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met
                          165                 170                 175     
          Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp
                      180                 185                 190         
          Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Ser Asn Gln Lys Phe Lys Gly
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Ser Met Glu
              210                 215                 220                 
          Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ile
          225                 230                 235                 240 
          Arg Arg Tyr Tyr Gly Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
                          245                 250                 255     
          Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
                      260                 265                 270         
          Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
                  275                 280                 285             
          Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
              290                 295                 300                 
          Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
          305                 310                 315                 320 
          Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser
                          325                 330                 335     
          Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
                      340                 345                 350         
          Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
                  355                 360                 365             
          Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
              370                 375                 380                 
          Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
                          405                 410                 415     
          Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
                      420                 425                 430         
          Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
                  435                 440                 445             
          Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
              450                 455                 460                 
          Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
          465                 470                 475                 480 
          Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
                          485                 
          <![CDATA[<210> 121]]>
          <![CDATA[<211> 161]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成構築體]]>
          <![CDATA[<400> 121]]>
          Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
           1               5                  10                  15      
          Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
                      20                  25                  30          
          Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
                  35                  40                  45              
          Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
              50                  55                  60                  
          Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
          65                  70                  75                  80  
          Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
                          85                  90                  95      
          Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
                      100                 105                 110         
          Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
                  115                 120                 125             
          Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
          145                 150                 155                 160 
          Thr
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0023
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Figure 12_A0101_SEQ_0029
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Figure 12_A0101_SEQ_0033
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Figure 12_A0101_SEQ_0072
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Figure 12_A0101_SEQ_0083
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Figure 12_A0101_SEQ_0116

Claims (49)

  1. 一種治療有需要個體之癌症之方法，其包括向該個體投與：(a)有效量之包括編碼外來抗原之核苷酸序列之重組溶瘤病毒；及(b)有效量之表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體之經工程化免疫細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中該外來抗原包括錨定結構域。
  3. 如請求項3之方法，其中該錨定結構域在生理學pH下帶正電。
  4. 如請求項2或3之方法，其中該錨定結構域係醣胺聚醣(GAG)結合結構域。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該外來抗原包括跨膜結構域。
  6. 如請求項2至5中任一項之方法，其中該錨定結構域或該跨膜結構域位於該外來抗原之羧基端。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該外來抗原包括穩定化結構域。
  8. 如請求項7之方法，其中該穩定化結構域係Fc結構域。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中編碼該外來抗原之核苷酸序列可操作地連接至啟動子。
  10. 如請求項9之方法，其中該啟動子係病毒晚期啟動子。
  11. 如請求項10之方法，其中該啟動子係F17R晚期啟動子。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該外來抗原係細菌蛋白。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該外來抗原係唾液酸酶。
  14. 如請求項13之方法，其中該唾液酸酶係具有外切唾液酸酶(exo-sialidase)活性之蛋白質。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該唾液酸酶係選自由以下組成之群：產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)唾液酸酶、黏放線菌( Actinomyces viscosus)唾液酸酶，及產脲節桿菌( Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶、鼠傷寒沙門桿菌( Salmonella typhimurium)唾液酸酶，及霍亂弧菌( Vibrio cholera)唾液酸酶。
  16. 如請求項13至15中任一項之方法，其中該唾液酸酶包括與選自由SEQ ID NO: 1-28、31及53-54組成之群之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。
  17. 如請求項16之方法，其中該唾液酸酶包括與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。
  18. 如請求項17之方法，其中該唾液酸酶係DAS181或其衍生物。
  19. 如請求項18之方法，其中該嵌合受體包括不與人類天然雙調蛋白(amphiregulin)或神經胺酸酶交叉反應之抗DAS181抗體部分。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該嵌合受體係嵌合抗原受體(CAR)。
  21. 如請求項20之方法，其中該CAR包括抗唾液酸酶抗體部分、跨膜結構域及細胞內結構域。
  22. 如請求項21之方法，其中該抗唾液酸酶抗體部分係scFv。
  23. 如請求項21或22之方法，其中該抗唾液酸酶抗體部分包括：抗體重鏈可變結構域(VH)，其包括含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之重鏈互補決定區(CDR-H) 1、含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2及含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-H3；及抗體輕鏈可變結構域(VL)，其包括含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之輕鏈互補決定區(CDR-L) 1、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3。
  24. 如請求項21至23中任一項之方法，其中該細胞內結構域包括CD28細胞內信號傳導序列及CD3ζ細胞內信號傳導序列。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該經工程化免疫細胞係選自由以下組成之群：T細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、巨噬細胞及其組合。
  26. 如請求項25之方法，其中該經工程化免疫細胞係NK細胞。
  27. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該溶瘤病毒係選自由以下組成之群之病毒：牛痘病毒、裡奧病毒(reovirus)、塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus，NDV)、單純疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒屬(morbillivirus)病毒、逆轉錄病毒、流行性感冒病毒、辛德比斯病毒(Sinbis virus)、痘病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、慢病毒、腺病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus)，及其衍生物。
  28. 如請求項27之方法，其中該溶瘤病毒係痘病毒。
  29. 如請求項28之方法，其中該痘病毒係牛痘病毒。
  30. 如請求項29之方法，其中該牛痘病毒係選自由以下組成之群之病毒株：Dryvax、Lister、M63、LIVP、Tian Tan、改良型牛痘病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara)、New York City Board of Health (NYCBOH)、Dairen、Ikeda、LC16M8、Tashkent、IHD-J、Brighton、Dairen I、Connaught、Wyeth、Copenhagen、Western Reserve、Elstree、CL、Lederle-絨毛膜尿囊(Chorioallantoic)株、AS，及其衍生物。
  31. 如請求項30之方法，其中該病毒係牛痘病毒Western Reserve。
  32. 如請求項1至31中任一項之方法，其中該重組溶瘤病毒包括一或多個與相應野生型株相比減小該病毒之免疫原性之突變。
  33. 如請求項32之方法，其中該病毒係牛痘病毒，且其中該一或多個突變係於一或多種選自由以下組成之群之蛋白質中：A14、A17、A13、L1、H3、D8、A33、B5、A56、F13、A28及A27。
  34. 如請求項33之方法，其中該病毒包括一或多種選自由以下組成之群之蛋白質： a.   變體牛痘病毒(VV) H3L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 66-69中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列； b.   變體牛痘病毒(VV) D8L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 70-72或85中之任一者具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列； c.   變體牛痘病毒(VV) A27L蛋白，其包括與SEQ ID NO: 73具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；及 d.   變體牛痘病毒(VV) L1R蛋白，其包括與SEQ ID NO: 74具有至少90%胺基酸序列一致性之胺基酸序列。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該重組溶瘤病毒進一步包括編碼異源性蛋白質之第二核苷酸序列。
  36. 如請求項35之方法，其中該異源性蛋白質係免疫檢查點抑制劑。
  37. 如請求項35之方法，其中該異源性蛋白質係多特異性免疫細胞銜接體(engager)。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該經工程化免疫細胞進一步包括編碼細胞介素之異源性核苷酸序列。
  39. 如請求項38之方法，其中該經工程化免疫細胞係NK細胞，且其中該細胞介素係IL-15。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該經工程化免疫細胞及該重組溶瘤病毒係同時投與。
  41. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該重組溶瘤病毒係在投與該經工程化免疫細胞之前投與。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該重組溶瘤病毒係經由載體細胞遞送。
  43. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該癌症係實體癌。
  44. 一種醫藥組合物，其包括：(a)重組溶瘤病毒，其包括編碼外來抗原之核苷酸序列；(b)經工程化免疫細胞，其表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體；及(c)醫藥上可接受之載劑。
  45. 如請求項44之醫藥組合物，其中該外來抗原係細菌唾液酸酶。
  46. 如請求項44或45之醫藥組合物，其中該經工程化免疫細胞係NK細胞。
  47. 一種套組，其包括：(a)重組溶瘤病毒，其包括編碼外來抗原之核苷酸序列；及(b)經工程化免疫細胞，其表現特異性識別該外來抗原之嵌合受體。
  48. 一種包括CAR之經工程化NK細胞，其中該CAR包括抗唾液酸酶抗體部分、跨膜結構域及細胞內結構域。
  49. 一種特異性結合黏放線菌唾液酸酶之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括：VH，其包括含有SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-H1、含有SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-H2及含有SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-H3；及VL，其包括含有SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L1、含有SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及含有SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L3。
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