CN114634943A - 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程改造成表达一种或多种TFP的T细胞以及使用其治疗包括癌症在内的疾病的方法。

Description

使用融合蛋白对TCR重编程的组合物和方法
本申请是申请日为2016年05月18日、申请号为201680032042.0、发明名称为“使用融合蛋白对TCR重编程的组合物和方法”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2016年05月18日、申请号为PCT/US2016/033146)的分案申请。
交叉引用
本申请要求2015年5月18日提交的美国临时专利申请号62/163,342的权益，该案以引用的方式整体并入本文中。
发明背景
大多数患有血液恶性疾病或晚期实体肿瘤的患者都无法用标准疗法治愈。此外，传统的治疗选项通常具有严重的副作用。已经作出多种尝试来使患者的免疫系统排斥癌细胞，这种方法统称为癌症免疫疗法。然而，存在的若干障碍使得很难实现临床效用。尽管已经鉴别出数百种所谓的肿瘤抗原，但这些抗原通常是来源于自身，并因此会使癌症免疫疗法针对健康组织，或者具有较差免疫原性。此外，癌细胞使用了多种机制来使其自身不可见或抵抗癌症免疫疗法免疫攻击的起始和传播。
近期有关使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞疗法的研究在利用免疫系统的能力治疗B细胞恶性疾病方面显示出颇具前景的结果，该疗法依赖于将基因工程改造的T细胞重新引导至癌细胞上的适合细胞表面分子(参见例如，Sadelain等人,CancerDiscovery 3:388-398(2013))。利用CD19特异性CAR T细胞(称为CTL019)得到的临床结果显示，罹患慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及儿童急性淋巴母细胞白血病(ALL)的患者完全缓解(参见例如，Kalos等人,Sci Transl Med 3:95ra73(2011)；Porter等人,NEJM 365:725-733(2011)；Grupp等人,NEJM 368:1509-1518(2013))。一种替代方法是使用针对肿瘤相关肽抗原选择的T细胞受体(TCR)α和β链对自体T细胞进行基因工程改造。这些TCR链将形成完整的TCR复合物并且使含TCR的T细胞具有第二种指定的特异性。在患有滑膜癌瘤的患者中，利用表达NY-ESO-1特异性TCRα和β链的工程改造的自体T细胞获得了振奋人心的结果。
除表达CAR或第二TCR的基因修饰的T细胞在体外/离体识别并破坏对应靶细胞的能力外，利用工程改造的T细胞的成功患者疗法还需要T细胞能够强活化、扩增、随时间推移持续存在，并且在复发性疾病情况下，实现‘记忆’反应。CAR T细胞的较高并且可管理的临床功效当前局限于CD19阳性B细胞恶性疾病及表达NY-ESO-1-肽并且表达HLA-A2的滑膜肉瘤患者。显然，需要改善基因工程改造的T细胞以使其更广泛地作用于多种人恶性疾病。本文描述了TCR亚基，包括CD3ε、CD3γ及CD3δ，以及TCRα和TCRβ链与细胞表面抗原特异性结合结构域形成的新型融合蛋白，这些融合蛋白具有克服现有方法的缺点的潜力。本文描述了比CAR更有效地杀灭靶细胞，但释放的促炎性细胞因子量与CAR相当或更少的新型融合蛋白。这些融合蛋白及其使用方法代表了TFP相对于CAR的优势，因为这些细胞因子的水平升高与过继性CAR-T疗法的剂量限制性毒性有关。
发明概述
本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程改造成表达一种或多种TFP的T细胞，以及使用其治疗疾病的方法。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，该抗原结合结构域是抗CD19结合结构域。
在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，该抗原结合结构域是抗B细胞成熟抗原(BCMA)结合结构域。
在一些情形中，所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接。在一些情形中，所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一些情形中，编码的抗原结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，编码的连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情形中，TCR亚基包含TCR细胞外结构域。在一些情形中，TCR亚基包含TCR跨膜结构域。在一些情形中，TCR亚基包含TCR细胞内结构域。在一些情形中，TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域；(ii)TCR跨膜结构域；及(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少两个是来自同一TCR亚基。在一些情形中，TCR亚基包含含刺激性结构域的TCR细胞内结构域，该刺激性结构域选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域，或其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，TCR亚基包含含刺激性结构域的细胞内结构域，该刺激性结构域选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域，或其具有至少一个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，所述人或人源化抗体结构域包括抗体片段。在一些情形中，该人或人源化抗体结构域包括scFv或VH结构域。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码(i)分别与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:29具有70-100％序列同一性的抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2及LCCDR3，和/或(ii)分别与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35具有70-100％序列同一性的抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含在轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:49中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:49具有95-99％同一性的序列。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码重链可变区，其中所述重链可变区包含在重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:51中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:51具有95-99％同一性的序列。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码(i)分别与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:41具有70-100％序列同一性的抗BCMA轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2及LC CDR3，和/或(ii)分别与SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47具有70-100％序列同一性的抗BCMA重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含在轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:53中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:53具有95-99％同一性的序列。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码重链可变区，其中所述重链可变区包含在重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:55中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:55具有95-99％同一性的序列。在一些情形中，所述TFP包含TCR亚基的细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，所编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，所编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，分离的核酸分子还包含编码共刺激性结构域的序列。在一些情形中，所述共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，分离的核酸分子还包含前导序列。在一些情形中，分离的核酸分子是mRNA。
在一些情形中，所述TFP包括TCR亚基的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，所述ITAM包括选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，该ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。在一些情形中，该ITAM选自由以下组成的组：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基，并且替代选自由以下组成的组的不同ITAM：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。
在一些情形中，该核酸包含核苷酸类似物。在一些情形中，该核苷酸类似物选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ethylene nucleic acid,ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺
在一个方面，本文提供了一种由本文所提供的核酸分子编码的分离的多肽分子。
在一个方面，本文提供了一种分离的TFP分子，该TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。
在一个方面，本文提供了一种分离的TFP分子，该TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
在一个方面，本文提供了一种分离的TFP分子，该TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中
在一些情形中，该分离的TFP分子包括含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的抗体或抗体片段。在一些情形中，该抗CD19结合结构域是scFv或VH结构域。在一些情形中，该抗CD19结合结构域包含与氨基酸序列SEQ IDNO:51具有95-100％同一性的重链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，该抗CD19结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有95-100％同一性的轻链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，该分离的TFP分子包含TCR细胞外结构域，该细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
在一个方面，本文提供了一种分离的TFP分子，该TFP分子包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。
在一个方面，本文提供了一种分离的TFP分子，该TFP分子包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
在一个方面，本文提供了一种分离的TFP分子，该TFP分子包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中。
在一些情形中，该分离的TFP分子包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。在一些情形中，该抗BCMA结合结构域是scFv或VH结构域。在一些情形中，该抗BCMA结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:55具有95-100％同一性的重链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，该抗BCMA结合结构域包含与氨基酸序列SEQID NO:53具有95-100％同一性的轻链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，该分离的TFP分子包含TCR细胞外结构域，该细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，抗BCMA结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情形中，分离的TFP分子还包含编码共刺激性结构域的序列。在一些情形中，分离的TFP分子还包含编码细胞内信号传导结构域的序列。在一些情形中，分离的TFP分子还包含前导序列。
在一个方面，本文提供了一种载体，该载体包含编码本文所提供的TFP的核酸分子。在一些情形中，所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma viral,RSV)载体或逆转录病毒载体。在一些情形中，该载体还包含启动子。在一些情形中，该载体是在体外转录的载体。在一些情形中，该载体中的核酸序列还包含多聚腺苷酸尾。在一些情形中，该载体中的核酸序列还包含3’UTR。
在一个方面，本文提供了一种包含本文所提供的载体的细胞。在一些情形中，该细胞是人T细胞。在一些情形中，该T细胞是CD8+或CD4+T细胞。在一些情形中，该细胞还包含编码抑制性分子的核酸，该抑制性分子包含含抑制性分子的至少一部分的第一多肽以及与其缔合的含来自细胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽。在一些情形中，所述抑制性分子包含含PD1的至少一部分的第一多肽以及含共刺激性结构域和主要信号传导结构域的第二多肽。
在一个方面，本文提供了一种人CD8+或CD4+ T细胞，该细胞包含至少两个TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域，其中所述TFP分子能够与所述人CD8+或CD4+ T细胞中，细胞表面处和/或所述表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
在一个方面，本文提供了一种蛋白质复合物，该复合物包含：含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的TFP分子；以及至少一种内源性TCR复合物。
在一些情形中，所述TCR包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。在一些情形中，抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
在一个方面，本文提供了一种蛋白质复合物，该复合物包含：含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的TFP分子；以及至少一种内源性TCR复合物。
在一些情形中，所述TCR包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。在一些情形中，抗BCMA结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
在一个方面，本文提供了一种人CD8+或CD4+ T细胞，该细胞包含每一本文所提供的蛋白质复合物至少两种不同的TFP蛋白。
在一个方面，本文提供了一种制备细胞的方法，该方法包括用本文所提供的载体转导T细胞。
在一个方面，本文提供了一种产生RNA工程改造的细胞群的方法，该方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞中，其中该RNA包括编码本文所提供的TFP分子的核酸。
在一个方面，本文提供了一种在哺乳动物体内提供抗肿瘤免疫性的方法，该方法包括向该哺乳动物施用有效量的表达本文所提供的TFP分子，或表达本文所提供的多肽分子的细胞。
在一些情形中，该细胞是自体T细胞。在一些情形中，该细胞是同种异体T细胞。在一些情形中，所述哺乳动物是人。
在一个方面，本文提供了一种治疗患有与CD19或BCMA表达有关的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括向该哺乳动物施用有效量的本文所提供的TFP分子，本文所提供的细胞，或本文所提供的多肽分子。
在一些情形中，所述与CD19或BCMA表达有关的疾病选自由以下组成的组：增生性疾病、癌症、恶性疾病、骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症、白血病前期、与CD19表达有关的非癌症相关适应症。在一些情形中，该疾病是选自由以下组成的组的血液癌症：B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)；慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞-滤泡性淋巴瘤、大细胞-滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、白血病前期、与CD19或BCMA表达有关的疾病，及其组合。在一些情形中，所述表达TFP分子的细胞和增加表达TFP分子的细胞的功效的药剂组合施用。在一些情形中，相较于施用有效量表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)或抗BCMA CAR的T细胞的哺乳动物，所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。在一些情形中，所述表达TFP分子的细胞和改善与施用表达TFP分子的细胞有关的一种或多种副作用的药剂组合施用。在一些情形中，所述表达TFP分子的细胞和治疗与CD19或BCMA有关的疾病的药剂组合施用。
在一个方面，本文所提供的分离的核酸分子、本文所提供的分离的多肽分子、本文所提供的分离的TFP、本文所提供的复合物、本文所提供的载体或本文所提供的细胞用作药物。
在一个方面，本文提供了一种治疗患有与CD19或BCMA表达有关的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括向该哺乳动物施用有效量的本文所提供的TFP分子、本文所提供的细胞或本文所提供的多肽分子，其中相较于施用有效量的表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)或抗BCMA CAR的T细胞的哺乳动物，所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
以引用的方式并入
本说明书中所提到的所有公布、专利及专利申请均以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同具体且个别地指示每一个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图简述
本发明的新颖特征将根据所附权利要求书中的特性陈述。通过参照以下陈述说明性实施方案的详述将更好地了解本发明的特征和优势，在以下详述中，利用了本发明的原理并且其随附图式如下：
图1是展示本发明的T细胞受体融合多肽(TFP)的使用的示意性说明。示例性TFP含有通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和全长CD3ε多肽。当利用T细胞产生TFP或将TFP引入T细胞中时，该TFP与内源性T细胞受体(TCR)(被显示成包括两个CD3ε多肽、一个CD3γ多肽、一个CD3δ多肽、两个CD3ζ多肽、一个TCRα亚基及一个TCRβ亚基，其中水平的灰色区段表示质膜)的其它多肽缔合形成重编程的TCR，其中一个或两个内源性CD3ε多肽被TFP取代。
图2中A是展示本发明的重编程T细胞受体融合多肽(TFP)的示例性变型的示意性说明。
图2中A示出了含有TFP的示例性重编程TCR，该TFP含有通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和全长TCR Vα多肽。
图2中B示出了含有多个TFP的一系列示例性重编程TCR，所述TFP包括i)通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和全长TCR Vα多肽；和ii)通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和全长TCR Vβ多肽。
图2中C示出了含有多个TFP的示例性重编程TCR，所述TFP包括i)通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和截短的(Δ)TCR多肽；和ii)通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19scFv和全长CD3ε多肽。截短的(Δ)TCR多肽是因缺失Vα而截短的。
图2中D示出了含有多个TFP的示例性重编程TCR，所述TFP包括i)通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和截短的(Δ)TCR Vα多肽；和ii)通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 scFv和截短的(Δ)TCR Vβ多肽。截短的(Δ)TCR多肽是因缺失Vβ而截短的。
图3是展示本发明的T细胞受体融合多肽(TFP)的使用的示意性说明。示例性TFP含有通过(G4S)3连接子序列融合的抗CD19 VH结构域和全长CD3ε多肽。当利用T细胞产生TFP或将TFP引入T细胞中时，该TFP与内源性T细胞受体(TCR)(被显示成包括两个CD3ε多肽、一个CD3γ多肽、一个CD3δ多肽、两个CD3ζ多肽、一个TCRα亚基及一个TCRβ亚基，其中水平的灰色区段表示质膜)的其它多肽缔合形成重编程的TCR，其中一个或两个内源性CD3ε多肽被TFP取代。
图4是展示编码各种TFP的DNA构建体的一系列示意性说明。
图5是描绘在慢病毒转导后T细胞上抗CD19 LL(长连接子)TFP的表面表达的示例性柱形图。效应T细胞未被转导或用抗CD19-28ζCAR或指定的抗CD19 LL TFP构建体转导。在IL-2中扩增10天后，通过流式细胞术测定其表面的适当CAR或TFP构建体的表达。
图6是描绘在慢病毒转导后T细胞上抗CD19 SL(短连接子)TFP的表面表达的示例性柱形图。效应T细胞未被转导或用抗CD19-28ζCAR或指定的抗CD19 SL TFP构建体转导。在IL-2中扩增7天后，通过流式细胞术测定其表面的适当CAR或TFP构建体的表达。
图7是描绘在慢病毒转导后T细胞上抗BCMA TFP的表面表达的示例性柱形图。效应T细胞未被转导或用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP构建体转导。在IL-2中扩增10天后，通过流式细胞术测定其表面的TFP表达。
图8是描绘抗CD19 LL TFP杀灭表达CD19的Raji靶细胞的示例性柱形图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个Raji靶细胞一起以20:1、10:1或5:1的E:T比孵育18小时。在流式细胞术细胞毒性测定中测定细胞毒性百分比。
图9是描绘抗BCMA TFP杀灭表达BCMA的RPMI8226靶细胞的示例性柱形图。使转导的效应T细胞扩增12天，随后与1×104个RPMI8226靶细胞一起以10:1或5:1的E:T比孵育4小时。在流式细胞术细胞毒性测定中测定细胞毒性百分比。
图10A是描绘抗CD19-28ζCAR构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图10B是描绘抗CD19-CD3εLL TFP构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图10C是描绘抗CD19-CD3γLL TFP构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图10D是描绘抗CD19-TCRαc LL TFP构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图10E是描绘抗CD19-TCRβc LL TFP构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图10F是描绘抗CD19-TCRαLL TFP构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图10G是描绘抗CD19-TCRβLL TFP构建体随时间杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图11是描绘抗CD19 TFP杀灭CD19转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使转导的效应T细胞扩增7天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图12是描绘抗BCMA TFP随时间杀灭BCMA转导的HeLa靶细胞的示例性曲线图。使未被转导或用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的效应T细胞扩增7天，随后与1×104个HeLa或HeLa-BCMA靶细胞一起孵育。在RTCA测定中测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图13是描绘用不同量的编码抗CD19-CD3εLL TFP的慢病毒转导的T细胞随时间的杀灭活性的示例性曲线图。使指定MOI的编码抗CD19-CD3εLL TFP的慢病毒转导的T细胞扩增14天，随后与1×104个CD19转导的HeLa靶细胞一起孵育。测定细胞指数，该细胞指数指示细胞毒性。
图14是描绘通过用体外转录(IVT)的编码抗CD19-CD3εSL或抗CD19-CD3γSL TRuC的mRNA电穿孔转染的T细胞的杀灭活性的示例性图。通过用体外转录(IVT)的编码GFP对照物、抗CD19-CD3εSL或抗CD19-CD3γSL TruC的mRNA电穿孔活化的PBMC来对效应T细胞转染。在扩增3天后，将效应物与1×104个Raji细胞或K562细胞一起以10:1的E:T比率孵育4小时。在流式细胞术细胞毒性测定中测定细胞毒性百分比。
图15A是描绘用抗CD19 LL TFP转导的T细胞响应于带有CD19的靶细胞而释放IL-2的示例性图。使未被转导、用对照CAR、抗CD19-28ζCAT或指定抗CD19 LL TFP转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个Raji细胞或K562靶细胞一起孵育。通过ELISA测定IL-2水平。
图15B是描绘用抗CD19 LL TFP转导的T细胞响应于带有CD19的靶细胞而释放IFN-γ的示例性图。使未被转导、用对照CAR、抗CD19-28ζCAT或指定抗CD19 LL TFP转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个Raji细胞或K562靶细胞一起孵育。通过ELISA测定IFN-γ水平。
图15C是描绘用抗CD19 LL TFP转导的T细胞响应于带有CD19的靶细胞而释放IL-2的示例性图。使未被转导、用对照CAR、抗CD19-28ζCAT或指定抗CD19 LL TFP转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个HeLa细胞或CD19-HeLa靶细胞一起孵育。通过ELISA测定IL-2水平。
图15D是描绘用抗CD19 LL TFP转导的T细胞响应于带有CD19的靶细胞而释放IFN-γ的示例性图。使未被转导、用对照CAR、抗CD19-28ζCAT或指定抗CD19 LL TFP转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个HeLa细胞或CD19-HeLa靶细胞一起孵育。通过ELISA测定IFN-γ水平。
图16是描绘用抗CD19 TFP转导的T细胞响应于带有CD19的靶细胞而释放IFN-γ的示例性图。使未被转导或用指定抗CD19 TFP转导的效应T细胞扩增7天，随后与1×104个HeLa或CD19-HeLa靶细胞一起孵育。通过ELISA测定IFN-γ水平。
图17A是描绘用抗BCMA TFP转导的T细胞响应于带有BCMA的靶细胞而释放IL-2的示例性图。使未被转导或用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的效应T细胞扩增7天，随后与1×104个HeLa或HeLa-BCMA靶细胞一起孵育。通过2-plex Luminex测定IL-2产量。
图17B是描绘用抗BCMA TFP转导的T细胞响应于带有BCMA的靶细胞而释放IFN-γ的示例性图。使未被转导或用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的效应T细胞扩增7天，随后与1×104个HeLa或HeLa-BCMA靶细胞一起孵育。通过2-plex Luminex测定IFN-γ产量。
图18是描绘用抗CD19 TFP转导的T细胞响应于带有CD19的靶细胞而失调的示例性图。使未被转导或用抗CD19-28ζCAR、抗BCMA-CD3εLL TFP或抗BCMA-CD3γLL TFP转导的效应T细胞扩增14天，随后与1×104个指定的CD19+ve或CD19–ve靶细胞一起孵育。测定在CD3+CD8+设门下CD107+细胞的百分比。在荧光标记的抗CD107a抗体存在下，共培养靶细胞和效应细胞。接着，通过流式细胞术测定细胞表面CD107a染色呈阳性的在CD3和CD4/CD8设门内的T细胞的百分比。
图19是描绘用抗BCMA TFP转导的T细胞响应于带有BCMA的靶细胞而失调的示例性图。使未被转导或用50MOI抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的效应T细胞扩增13天，随后与1×104个指定的BCMA+ve RPMI8226靶细胞一起孵育。测定在CD3+CD8+设门下CD107+细胞的百分比。
图20A描绘了在播散性人白血病异种移植模型中用抗CD19 LL TFP转导的T细胞的体内功效的示例性图。用5×105个Raji细胞经静脉内激发NSG小鼠三天，随后过继转移5×106个未被转导(4)或用抗CD19-28ζCAR(1)、抗CD19-CD3εLL TFP(2)或抗CD19-CD3γLL TFP(3)转导的T细胞。
图20B描绘了在播散性人白血病异种移植模型中用抗CD19 LL TFP转导的T细胞的体内功效的示例性图。用1×106个Nalm-6细胞经静脉内激发NSG小鼠三天，随后过继转移5×106个未被转导(4)或用抗CD19-28ζCAR(1)、抗CD19-CD3εLL TFP(2)或抗CD19-CD3γLLTFP(3)转导的T细胞。通过对数秩(Mantel-Cox)检验比较存活曲线显示，p＝0.0001(第4组对比第1、2、3组)，p＝0.0001(第1组对比第2、3组)，及p＝0.0004(第2组对比第3组)。通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验比较存活曲线显示，p＝0.0001(第4组对比第1、2、3组)，p＝0.0001(第1组对比第2、3组)，及p＝0.0005(第2组对比第3组)。
发明详述
在一个方面，本文描述了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的核酸分子，该融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗CD19结合结构域的人或人源化抗体结构域。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR细胞外结构域。在其它实施方案中，TCR亚基包含TCR跨膜结构域。在又其它实施方案中，TCR亚基包含TCR细胞内结构域。在其它实施方案中，TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域；(ii)TCR跨膜结构域；及(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少两个是来自同一TCR亚基。在又其它实施方案中，TCR亚基包含TCR细胞内结构域，该TCR细胞内结构域包括选自以下的刺激性结构域：CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域，或其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。在又其它实施方案中，TCR亚基包含细胞内结构域，该细胞内结构域包括选自以下的刺激性结构域：4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域，或其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述人或人源化抗体结构域包括抗体片段。在一些实施方案中，该人或人源化抗体结构域包括scFv或VH结构域。
在一些实施方案中，所述分离的核酸分子包含(i)本文所提供的任何抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2及LC CDR3，和/或(ii)本文所提供的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
在一些实施方案中，轻链可变区包含在本文所提供的轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在其它实施方案中，重链可变区包含在本文所提供的重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，TFP包括TCR亚基的细胞外结构域，该细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ，或其功能片段，或其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列。在其它实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，该跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα、β链，或TCR亚基CD3ε、CD3γ及CD3δ，或其功能片段，或其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，该跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα、β或ζ链，或CD3ε、CD3γ及CD3δCD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154，或其功能片段，或其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，编码的连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情形中，编码的连接子序列包含长连接子(LL)序列。在一些情形中，编码的长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，编码的连接子序列包含短连接子(SL)序列。在一些情形中，编码的短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。
一些实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激性结构域的序列。在一些情形中，所述共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，或其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含前导序列。
本文还提供了由任何先前所描述的核酸分子编码的分离的多肽分子。
在另一方面，本文还提供了分离的T细胞受体融合蛋白(TFP)分子，这些TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。在一些实施方案中，这些分离的TFP分子包括含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，该抗CD19结合结构域是scFv或VH结构域。在其它实施方案中，该抗CD19结合结构域包含轻链和重链，该轻链和重链具有本文所提供的氨基酸序列，或其功能片段，或在本文所提供的轻链可变区氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，分离的TFP分子包含TCR细胞外结构域，该细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ，或其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情形中，该连接子序列包括长连接子(LL)序列。在一些情形中，该长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，该连接子序列包括短连接子(SL)序列。在一些情形中，该短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。
在一些实施方案中，分离的TFP分子还包含编码共刺激性结构域的序列。在其它实施方案中，分离的TFP分子还包含编码细胞内信号传导结构域的序列。在又其它实施方案中，分离的TFP分子还包含前导序列。
本文还提供了载体，这些载体包含编码任何先前所描述的TFP分子的核酸分子。在一些实施方案中，所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，该载体还包含启动子。在一些实施方案中，该载体是在体外转录的载体。在一些实施方案中，该载体中的核酸序列还包含多聚腺苷酸尾。在一些实施方案中，该载体中的核酸序列还包含3’UTR。
本文还提供了包含所述载体中的任一种的细胞。在一些实施方案中，该细胞是人T细胞。在一些实施方案中，该细胞是CD8+或CD4+ T细胞。在其它实施方案中，这些细胞还包含编码抑制性分子的核酸，该抑制性分子包含含抑制性分子的至少一部分的第一多肽以及与其缔合的含来自细胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽。在一些情形中，所述抑制性分子包含含PD1的至少一部分的第一多肽以及含共刺激性结构域和主要信号传导结构域的第二多肽。
在另一方面，本文提供了分离的TFP分子，这些TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域，其中该TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
在另一方面，本文提供了分离的TFP分子，这些TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中该TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中。
在另一方面，本文提供了人CD8+或CD4+ T细胞，该细胞包含至少两个TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+或CD4+ T细胞中、所述细胞表面处和/或所述表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
在另一方面，本文提供了蛋白质复合物，所述复合物包含：i)含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的TFP分子；以及ii)至少一种内源性TCR复合物。
在一些实施方案中，所述TCR包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ。在一些实施方案中，抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情形中，该连接子序列包括长连接子(LL)序列。在一些情形中，该长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，该连接子序列包含短连接子(SL)序列。在一些情形中，该短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。
本文还提供了人CD8+或CD4+ T细胞，这些细胞包含每一所述蛋白质复合物中的任一种至少两种不同的TFP蛋白。
在另一方面，本文提供了一种人CD8+或CD4+ T细胞群，其中所述群的T细胞个别地或共同地包含至少两个TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗CD19或抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域，其中所述TFP分子能够与所述人CD8+或CD4+ T细胞中、所述细胞表面处和/或所述表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
在另一方面，本文提供了一种人CD8+或CD4+ T细胞群，其中所述群的T细胞个别地或共同地包含至少两个由本文所提供的分离的核酸分子编码的TFP分子。
在另一方面，本文提供了制备细胞的方法，所述方法包括用任何所述载体转导T细胞。
在另一方面，本文提供了一种产生RNA工程改造的细胞群的方法，所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞中，其中该RNA包括编码任何所述TFP分子的核酸。
在另一方面，本文提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的表达任何所述TFP分子的细胞。在一些实施方案中，该细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，该细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
在另一方面，本文提供了治疗患有与CD19表达有关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向该哺乳动物施用有效量的包含任何所述TFP分子的细胞。在一些实施方案中，该与CD19表达有关的疾病是选自增生性疾病，如癌症或恶性疾病，或癌前病况，如骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症或白血病前期，或是与CD19表达有关的非癌症相关适应症。在一些实施方案中，该疾病是血液癌症，该血液癌症选自由以下组成的组：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(“B-ALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“T-ALL”)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；额外的血液癌症或血液病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症，以及“白血病前期”(伴有无效产生骨髓血细胞(或发育不良)的一组不同的血液病症)，并且与CD19表达有关的疾病包括但不限于非典型性和/或非经典癌症、恶性疾病、癌前病症或表达CD19的增生性疾病；及其组合。
在一些实施方案中，表达任何所述TFP分子的细胞和改善与施用表达TFP分子的细胞有关的一种或多种副作用的药剂组合施用。在一些实施方案中，表达任何所述TFP分子的细胞和治疗与CD19有关的疾病的药剂组合施用。
本文还提供了用作药物的任何所述分离的核酸分子、任何所述分离的多肽分子、任何所述分离的TFP、任何所述蛋白质复合物、任何所述载体或任何所述细胞。
定义
除非另作定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“一个(种)”是指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法宾语。举例来说，“一个要素”意思指一个要素或多于一个要素。
如本文所使用，“约”可以取决于状况以及本领域技术人员所了解或可了解而表示加或减小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或超过30％。
如本说明书中所使用，“受试者”或“个体”可以包括但不限于，哺乳动物，如人或非人哺乳动物，例如家畜、农业动物或野生动物，以及鸟类和水生动物。“患者”是罹患疾病、病症或病况，或有发展疾病、病症或病况的风险，或在其它方面需要本文所提供的组合物和方法的受试者。
如本文所使用，“治疗”是指成功治疗或改善疾病或病况的任何指征。治疗可以包括例如减轻、延迟或缓解疾病或病况的一种或多种症状的严重程度，或者其可以包括降低患者所经历的疾病、缺陷、病症或不良状况等的症状的频率。如本文所使用，“治疗或预防”有时在本文中用于指在一定程度上治疗或改善疾病或病况的方法，并且涵盖指向该目的一系列结果，包括但不限于，完全预防该病况。
如本文所使用，“预防”是指患者疾病或病况，例如肿瘤形成的预防。举例来说，如果有发展肿瘤或其它形式癌症的风险的个体用本发明的方法治疗并且后续未发展该肿瘤或其它形式癌症，则至少在一段时间内该疾病在该个体中得到预防。
如本文所使用，“治疗有效量”是足以向施用组合物的个体提供有益作用或以其它方式减少有害的非有益事件的组合物或其活性化合物的量。“治疗有效剂量”在本文中意思指由于其施用而产生一种或多种所希望或期望(例如有益)作用的剂量，该施用在指定时间段内实行一次或多次。确切剂量将取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；及Pickar,Dosage Calculations(1999))。
如本文所使用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括来源于组成TCR的各种多肽的重组多肽，该TFP一般能够i)结合至靶细胞上的表面抗原；及ii)典型地当共定位于T细胞表面中或表面上时与完整TCR复合物的其它多肽组分相互作用。
如本文所使用，术语“CD19”是指分化19蛋白簇(Cluster of Differentiation19protein)，其是在B细胞白血病前体细胞、其它恶性B细胞以及正常B细胞系的大多数细胞上可检测到的抗原决定子。人和鼠类氨基酸和核酸序列可以见于公共数据库，如GenBank、UniProt及Swiss-Prot。举例来说，人CD19的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号P15391。人CD19多肽规范序列(canonical sequence)是UniProt登录号P15391(或P15391-1)：MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR(SEQ ID NO:1)。
编码人CD19的核苷酸序列可以见于登录号NM001178098。CD19是在大多数B细胞谱系癌症，包括例如ALL、CLL及非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)上表达。其它表达CD19的细胞提供于以下“与CD19表达相关的疾病”的定义中。它还是正常B细胞祖细胞的早期标志物。参见例如，Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)。在一个实例中，TFP的抗原结合部分识别并结合如在恶性和正常B细胞上表达的CD19蛋白质的细胞外结构域内的表位。
如本文所使用，术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原，又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)并且分化269蛋白簇(CD269)是人中由TNFRSF17基因编码的蛋白质。TNFRSF17是识别B细胞活化因子(BAFF)的TNF受体超家族的细胞表面受体(参见例如，Laabi等人,EMBO11(11):3897–904(1992))。该受体在成熟B淋巴细胞中表达，并且对于B细胞发育和自体免疫反应很重要。人和鼠类氨基酸和核酸序列可以见于公共数据库，如GenBank、UniProt及Swiss-Prot。举例来说，人BCMA的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号Q02223。人BCMA多肽规范序列是UniProt登录号Q02223(或Q02223-1)：MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR(SEQ ID NO:2)。
编码人BCMA的核苷酸序列可以见于登录号NM001192。BCMA在大多数B细胞谱系癌症，包括例如白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤上表达。其它表达BCMA的细胞提供于以下“与BCMA表达相关的疾病”的定义中。经显示，该受体特异性结合至肿瘤坏死因子(配体)超家族成员13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)，并且引起NF-κB和MAPK8/JNK活化。此受体还结合至各种TRAF家族成员，并因此可以转导有关细胞存活和增殖的信号(参见例如，Laabi等人,Nucleic Acids Research 22(7):1147–54(1994))。在一个实例中，TFP的抗原结合部分识别并结合如在恶性和正常B细胞上表达的BCMA蛋白质的细胞外结构域内的表位。
如本文所使用，术语“抗体”是指来源于免疫球蛋白分子的特异性结合至抗原的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白，或其片段，并且可以来源于天然来源或重组来源。
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指含有抗原结合结构域，即，完整抗体的抗原决定可变区的抗体的至少一部分，或其重组变体，其足以使抗体片段识别并特异性结合靶标，如抗原及其指定表位。抗体片段的实例包括但不限于，Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域，及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个含轻链可变区的抗体片段及至少一个含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中该轻链和重链可变区通过短柔性多肽连接子连续地连接，并且能够表达为单一多肽链的形式，并且其中该scFv保持其来源的完整抗体的特异性。
就抗体来说，“重链可变区”或“VH”是指在称为框架区的侧接链段中杂有三个CDR的重链片段，这些框架区一般比CDR保守性高并且形成支架以支撑CDR。
除非具体说明，否则如本文所使用，scFv可以具有关于多肽的N末端和C末端呈任一次序的VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-连接子-VH或者可以包含VH-连接子-VL。
本发明的TFP组合物中包含抗体或其片段的部分可以呈多种形式存在，其中抗原结合结构域是作为连续多肽链，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)，来源于鼠类、人源化或人抗体的单链抗体(scFv)的一部分表达(Harlow等人,1999,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明的TFP组合物的抗原结合结构域包括抗体片段。在另一方面，TFP包括含scFv或sdAb的抗体片段。
术语“抗体重链”是指呈天然存在的构象的抗体分子中存在的两类多肽链中的较大链，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指呈天然存在的构象的抗体分子中存在的两类多肽链中的较小链。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语也应解释为指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白，或通过合成指定该抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域中可用并且众所周知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指能够被抗体特异性结合，或以其它方式激发免疫反应的分子。这一免疫反应可能涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两种。
熟练技术人员应了解，任何大分子，包括实际上所有蛋白质或肽在内，都可以用作抗原。另外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。熟练技术人员应了解，包含了编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码“抗原”，该术语如本文所使用。另外，本领域技术人员应了解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于，使用超过一个基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列以各种组合形式布置以编码引起所希望的免疫反应的多肽。此外，熟练技术人员还应了解，抗原根本不必由“基因”编码。很显然，抗原可以是合成产生的，或者可以来源于生物样品，或者可能是除多肽外的大分子。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或含其它生物组分的流体。
术语“抗肿瘤作用”是指可以通过各种方式表现的生物作用，包括但不限于，例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、期望寿命增加、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活率降低，或与癌性病况相关的各种生理症状改善。“抗肿瘤作用”还可以由本发明的肽、多核苷酸、细胞及抗体在首先防止肿瘤发生方面的能力来表现。
术语“自体”是指来源于个体的任何材料稍后将被再引入该相同个体中。
术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些方面，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。
术语“异种”是指移植物来源于不同物种的动物。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其它部分。本文中描述了多种癌症的实例，并且包括但不限于，乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
短语“与CD19表达有关的疾病”和“与BCMA表达有关的疾病”包括但不限于，与CD19或BCMA表达有关的疾病，或与表达CD19或BCMA的细胞有关的病况，包括例如增生性疾病，如癌症或恶性疾病，或癌前病况，如骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症或白血病前期；或者与表达CD19或BCMA的细胞有关的非癌症相关适应症。在一个方面，与CD19或BCMA表达有关的癌症是血液癌症。在一个方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19或BCMA表达有关的癌症包括癌症和恶性疾病，包括但不限于，例如一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如B细胞ALL、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如CLL或慢性骨髓性白血病(CML)。其它与CD19表达有关的癌症或血液病况包含但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，即伴有无效产生骨髓血细胞(或发育不良)的一组不同的血液病症，等等。与CD19的表达或BCMA表达有关的其它疾病包括但不限于，例如与CD19或BCMA表达有关的非典型性和/或非经典癌症、恶性疾病、癌前病况或增生性疾病。与CD19或BCMA表达有关的非癌症相关适应症包括但不限于，例如自身免疫性疾病(例如狼疮、类风湿性关节炎、结肠炎)、炎症性病症(过敏和哮喘)及移植。
术语“保守性序列修饰”是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明的TFP内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基置换，并且改变的TFP可以使用本文所描述的功能测定进行测试。
术语“刺激”是指由刺激性结构域或刺激性分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合，由此介导信号转导事件，如但不限于，通过TCR/CD3复合物进行的信号转导所诱导的初次反应。刺激可以介导某些分子表达的改变，和/或细胞骨架结构的重新组织等。
术语“刺激性分子”或“刺激性结构域”是指T细胞所表达的提供初级细胞质信号传导序列的分子或其部分，所述初级细胞质信号传导序列以针对T细胞信号传导途径的至少某一方面刺激的方式调控TCR复合物的初次活化。在一个方面，初级信号是由例如TCR/CD3复合物与装载有肽上MHC分子结合起始，并由此介导T细胞反应，包括但不限于，增殖、活化、分化等。以刺激性方式作用的初级细胞质信号传导序列(又称为“初级信号传导结构域”)可以含有信号传导基序，该基序称为免疫受体酪氨酸活化基序或“ITAM”。特别适用于本发明中的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于，来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(又称为“ICOS”)及CD66d的那些。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在表面上展示外来抗原与主要组织相容性复合物(MHC)的复合物的免疫系统细胞，如辅助细胞(例如B细胞、树突状细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递至T细胞。
如本文所使用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生了促进含有TFP的细胞，例如表达TFP的T细胞的免疫效应功能的信号。免疫效应功能，例如在表达TFP的T细胞中的免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和T辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的那些。
初级细胞内信号传导结构域可以包含ITAM(“免疫受体酪氨酸活化基序”)。含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于，来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d DAP10和DAP12的那些。
术语“共刺激分子”是指在T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，如但不限于增殖的同源结合配偶体。共刺激分子是高效免疫反应所需的除抗原受体或其配体外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于，1类MHC分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以通过以下蛋白质家族表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)及活化NK细胞受体。这些分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体等。细胞内信号传导结构域可以包含作为该结构域的来源的分子的整个细胞内部分，或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段。术语“4-1BB”是指具有如GenBank登录号AAA62478.2所提供的氨基酸序列或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激性结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基。
术语“编码”是指多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列的固有特性，这些核苷酸序列在生物过程中用作合成具有指定核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或指定氨基酸序列并且具有由此引起的生物特性的其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于一个基因的mRNA在细胞或其它生物系统中转录和翻译产生蛋白质，则该基因、cDNR或RNA编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常被提供于序列表中的编码链，以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链，可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。就编码蛋白质的核苷酸序列的一些形式可能含有一个或多个内含子来说，短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且指有效实现特定生物或治疗结果的如本文所述的化合物、配制物、材料或组合物的量。
术语“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统，或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何材料。
术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统引入，或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域中已知多种载体，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子性或两性化合物关联的多核苷酸、质粒及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为进一步包括有助于核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足以进行表达的顺式作用元件；其它表达元件可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域中已知的并入重组多核苷酸的所有表达载体，包括粘粒、质粒(例如裸质粒或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒是独特的逆转录病毒，能够感染非分裂细胞；这些病毒能够将大量的遗传信息递送至宿主细胞DNA中，由此它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV及FIV是慢病毒的所有实例。
术语“慢病毒载体”是指来源于至少一部分慢病毒基因组的载体，包括特别是如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中所提供的自灭活慢病毒载体。可以用于临床的其它慢病毒载体的实例包括但不限于，例如来自Oxford BioMedica的LENTIVECTORTM基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床型慢病毒载体也可使用并且是本领域技术人员所知的。
术语“同源”或“同一性”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子，如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置被相同单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子各自的位置都被腺嘌呤占据，则这两个分子在该位置处同源或同一。两个序列之间的同源性与匹配或同源位置的数量直接相关；例如，如果两个序列中的半数位置(例如长度是十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列50％同源；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则这两个序列90％同源。
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合子序列)。在很大程度上，人源化抗体和其抗体片段是来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种(供体抗体；如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换的人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)。在一些情形中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段还可以包含在受体抗体和引入的CDR或框架序列中都未发现的残基。这些修饰可以进一步改善和优化抗体或抗体片段的性能。一般来说，人源化抗体或抗体片段将包含至少一个且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区都与非人免疫球蛋白的CDR区对应并且所有FR区或大部分FR区都是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。有关更多详情，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“人”或“完全人”是指这样一种免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，在该免疫球蛋白中，整个分子都是人来源的或者由与该抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意思指从天然状态改变或取出的。举例来说，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以呈大体上纯化的形式存在，或者可以存在于非原生环境，如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，使用以下常见核酸碱基缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞苷，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能性连接，该连接引起异源核酸序列的表达。举例来说，当第一核酸序列与第二核酸序列呈功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的DNA序列可以彼此相邻，并且例如在需要接合两个蛋白质编码区时是处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明确限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，这些核酸的结合特性与参考核酸类似并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另外指示，否则特定核酸序列也隐含地其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP及互补序列以及明确指明的序列。确切地说，可以通过产生一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；及Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用，该术语是指在本领域中通常又称为肽、寡肽和寡聚物的短链，以及在本领域中一般称为蛋白质的较长链，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指由细胞的转录机构，或引入的合成机构识别的起始多核苷酸序列的特定转录所需的DNA序列。
术语“启动子/调控序列”是指表达可操作地连接至启动子/调控序列的基因产物所需的核酸序列。在一些情形中，这一序列可以是核心启动子序列，并且在其它情形中，这一序列还可以包括增强子序列及表达基因产物所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指这样一种核苷酸序列，该核苷酸序列当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞中在大多数或所有细胞生理条件下产生基因产物。
术语“诱导型”启动子是指这样一种核苷酸序列，该核苷酸序列当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导子存在于细胞中时才在该细胞中产生基因产物。
术语“组织特异性”启动子是指这样一种核苷酸序列，该核苷酸序列当与基因编码或指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅在细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时才在该细胞中产生基因产物。
在scFv的情形中使用的术语“连接子”和“柔性多肽连接子”是指由氨基酸，如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的用以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽连接子。在一个实施方案中，柔性多肽连接子是Gly/Ser连接子并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9及n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽连接子包括但不限于，(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一实施方案中，连接子包括多个(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的重复。本发明的范围内还包括WO2012/138475(以引用的方式并入本文中)中所描述的连接子。在一些情形中，该连接子序列包括长连接子(LL)序列。在一些情形中，该长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，该连接子序列包括短连接子(SL)序列。在一些情形中，该短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。
如本文所使用，5’帽(又称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在开始转录后不久即添加至真核生物信使RNA的“前部”或5’端的经过修饰的鸟嘌呤核苷酸。5’帽由连接至第一个转录的核苷酸的末端基团组成。其存在对于核糖体识别以及防止RNA酶作用至关重要。帽的添加与转录相结合，并且与转录地共同发生，由此彼此相互影响。在开始转录后不久，所合成的mRNA的5’端就被与RNA聚合酶缔合的帽合成复合物结合。这一酶复合物催化mRNA戴帽所需的化学反应。合成是以多步骤生物化学反应进行的。戴帽部分可以经过修饰以调节mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所使用，“体外转录的RNA”是指在体外合成的RNA，优选mRNA。一般来说，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所使用，“多聚腺苷酸”是通过聚腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于短暂表达的构建体的优选实施方案中，多聚腺苷酸是介于50与5000个之间，优选超过64个，更优选超过100个，最优选超过300或400个。多聚腺苷酸序列可以通过化学方式或酶方式修饰以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所使用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分，或其修饰变体与信使RNA分子的共价键联。在真核生物体中，大多数的信使RNA(mRNA)分子在3’端处聚腺苷酸化。3’多聚腺苷酸尾是通过酶，即聚腺苷酸化聚合酶的作用添加至前体mRNA中的较长腺嘌呤核苷酸序列(通常数百个腺嘌呤核苷酸)。在高级真核生物中，多聚腺苷酸尾被添加至含有特定序列，即聚腺苷酸化信号的转录物上。多聚腺苷酸尾及其所结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从核输出以及翻译也很重要。聚腺苷酸化是在DNA转录成RNA之后立即在核中发生，但另外也可以稍后在细胞质中发生。在转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶缔合的内切核酸酶复合物作用裂解。裂解位点通常以裂解位点附近碱基序列AAUAAA的存在为特征。在mRNA裂解后，腺苷残基被添加至游离3’端的裂解位点处。
如本文所使用，“短暂”是指在数小时、数天或数周时间内非整合转基因的表达，其中该表达时间段小于该基因在整合至宿主细胞中的基因组中或包含在稳定质粒复制子内时表达的时间段。
术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传播至细胞另一部分中起作用的多个信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够跨细胞膜接收信号并传播信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”意图包括在其中可引起免疫反应的活生物体(例如哺乳动物、人)。
术语“大体上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。大体上纯化的细胞还指已经与在其天然存在状态下通常与其相关联的其它细胞类型分离的细胞。在一些情形中，一群大体上纯化的细胞是指一群同源细胞。在其它情形中，这一术语简单地指已经与在其天然状态下天然相关联的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞是在体外培养的。在其它方面，细胞不是在体外培养的。
如本文所使用，术语“治疗性(therapeutic)”意思指治疗(treatment)。治疗作用是通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态获得。
如本文所使用，术语“预防”意思指疾病或疾病状态的预防或防护性治疗。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症抗原”或“与过度增生性病症有关的抗原”是指特定过度增生性病症共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性病症抗原是来源于癌症，包括但不限于，原发性或转移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、NHL、白血病、子宫癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾癌，以及腺癌，如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源性核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是被外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞和其后代。
术语“特异性结合”是指识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如CD19)，但未必并且基本上不识别或结合样品中的其它分子的抗体、抗体片段或特定配体。
范围：在本公开通篇，本发明的各个方面可以通过范围形式呈现。应了解，呈范围形式的描述仅为了便利和简洁起见，而不应解释为对本发明范围的固定限制。因此，对范围的描述应视为具体地公开所有可能的子范围以及在该范围内的个别数字值。举例来说，对范围，如从1至6的描述应视为具体地公开子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的个别数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作为另一举例，一个范围，如95-99％同一性，包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的事物，并且包括如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％及98-99％同一性等子范围。无论范围宽度如何，此均适用。
描述
本文提供了使用T细胞受体(TCR)融合蛋白的物质组合物以及使用T细胞受体(TCR)融合蛋白治疗如癌症等疾病的方法。如本文所使用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括来源于组成TCR的各种多肽的重组多肽，该重组多肽一般能够i)结合至靶细胞上的表面抗原；及ii)典型地当共定位于T细胞中或表面上时与完整TCR复合物的其它多肽组分相互作用。如本文所提供，相较于嵌合抗原受体，TFP提供了相当大的益处。术语“嵌合抗原受体”或替代地“CAR”是指包含呈scFv形式的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及细胞质信号传导结构域(在本文中又称为“细胞内信号传导结构域”)的重组多肽，所述细胞质信号传导结构域包含来源于如下所定义的刺激性分子的功能性信号传导结构域。一般来说，CAR的中心细胞内信号传导结构域来源于通常发现与TCR复合物相缔合的CD3ζ链。CD3ζ信号传导结构域可以与来源于至少一个共刺激分子，如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28的一个或多个功能性信号传导结构域融合。
T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)
本发明涵盖编码TFP的重组DNA构建体，其中该TFP包含特异性结合至CD19，例如人CD19的抗体片段，其中抗体片段的序列与编码TCR亚基或其部分的核酸序列相邻并且在同一阅读框中。本发明涵盖编码TFP的重组DNA构建体，其中该TFP包含特异性结合至BCMA，例如人BCMA的抗体片段，其中抗体片段的序列与编码TCR亚基或其部分的核酸序列相邻并且在同一阅读框中。本文提供的TFP能够与一个或多个内源性TCR亚基(或替代地，一个或多个外源性TCR亚基，或内源性TCR亚基和外源性TCR亚基的组合)缔合以便形成功能性TCR复合物。
在一个方面，本发明的TFP包含靶特异性结合元件，又称为抗原结合结构域。部分的选择取决于界定靶细胞表面的靶抗原的类型和数量。举例来说，可选择抗原结合结构域以识别在与特定疾病状态有关的靶细胞上充当细胞表面标志物的靶抗原。因此，可以充当本发明TFP中的抗原结合结构域的靶抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染；自身免疫疾病；及癌性疾病(例如恶性疾病)有关的那些。
在一个方面，通过将抗原结合结构域工程改造至特异性结合所需抗原的TFP中，可以使TFP介导的T细胞反应针对所关注抗原。
在一个方面，TFP中包含抗原结合结构域的部分包含靶向CD19的抗原结合结构域。在一个方面，抗原结合结构域靶向人CD19。在一个方面，TFP中包含抗原结合结构域的部分包含靶向BCMA的抗原结合结构域。在一个方面，抗原结合结构域靶向人BCMA。
抗原结合结构域可以是结合至该抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体，如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)及骆驼源性纳米抗体的可变结构域(VHH)，以及本领域中已知可用作抗原结合结构域的替代性支架，如重组纤连蛋白结构域、anticalin、DARPIN等。同样，特异性识别并结合靶抗原的天然或合成配体也可以用作TFP的抗原结合结构域。在一些情形中，抗原结合结构域宜来源于与最终将使用TFP相同的物种。举例来说，对用于人来说，TFP的抗原结合结构域在抗体或抗体片段的抗原结合结构域中包含人或人源化残基可能是有益的。
因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人源化或人抗体或抗体片段，或者鼠类抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域包含本文所述的人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)及轻链互补决定区3(LC CDR3)，和/或本文所述的人源化或人抗CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)及重链互补决定区3(HC CDR3)，例如该人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域包含一个或多个，例如全部三个LC CDR以及一个或多个，例如全部三个HCCDR。在一个实施方案中，人源化或人抗CD19结合结构域包含本文所述的人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)及重链互补决定区3(HC CDR3)，例如该人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域具有两个可变重链区，各自包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一个实施方案中，人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域包含本文所述的人源化或人轻链可变区和/或本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区，例如至少两个本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，抗CD19或抗BCMA结合结构域是scFv，该scFv包含具有本文所提供的氨基酸序列的轻链和重链。在一个实施方案中，该抗CD19或抗BCMA结合结构域(例如scFv)包含：包含在本文所提供的轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列的轻链可变区；和/或包含在本文所提供的重链可变区氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与本文所提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化或人抗CD19或抗BCMA结合结构域是scFv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区通过连接子，例如本文所述的连接子连接至包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗CD19或抗BCMA结合结构域包括(Gly4-Ser)n连接子，其中n是1、2、3、4、5或6，优选是3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如呈以下取向中的任一种：轻链可变区-连接子-重链可变区，或重链可变区-连接子-轻链可变区。在一些情形中，该连接子序列包括长连接子(LL)序列。在一些情形中，该长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，该连接子序列包括短连接子(SL)序列。在一些情形中，该短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。
在一些方面，当抗体的特定序列或区域被修饰成使得与人体中天然产生的抗体或其片段类似性增加时，非人抗体被人源化。在一个方面，抗原结合结构域被人源化。
人源化抗体可以使用本领域中已知的众多技术产生，包括但不限于，CDR移植(参见例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，各自以引用的方式整体并入本文中)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(参见例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；以及Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，各自以引用的方式整体并入本文中)、链改组(参见例如，美国专利号5,565,332，以引用的方式整体并入本文中)，以及例如美国专利申请公布号US2005/0042664、美国专利申请公布号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO 9317105；Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)；Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)；Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000)；Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)；Roguska等人,ProteinEng.,9(10):895-904(1996)；Couto等人,Cancer Res.,55(23增刊):5973s-5977s(1995)；Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)；Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)，以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)中所公开的技术，所述参考文献各自以引用的方式整体并入本文中。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，例如改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域中众所周知的方法鉴别，例如通过对CDR与框架残基相互作用进行建模以鉴别对于抗原结合很重要的框架残基以及进行序列比较以鉴别在特定位置处的不常见框架残基(参见例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323，以引用的方式整体并入本文中)。
人源化抗体或抗体片段保留有一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，这些残基典型地是从“输入”可变结构域获得。如本文所提供，人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR，以及框架区，其中构成框架的氨基酸残基完全或主要来源于人种系。用于使抗体或抗体片段人源化的多种技术是本领域中众所周知的并且基本上可以遵循Winter和同事的方法(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列，即CDR移植进行(EP 239,400；PCT公布号WO 91/09967；以及美国专利号4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640，其内容以引用的方式整体并入本文中)。在此类人源化抗体和抗体片段中，基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是一些CDR残基并且可能一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。也可以通过镶饰或表面重塑(EP 592,106；EP519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；以及Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)使抗体和抗体片段人源化，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文中。
选择用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变结构域应降低抗原性。根据所谓的“最佳配合(best-fit)”方法，针对已知人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。最接近啮齿动物序列的人序列则被接受作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容以引用的方式整体并入本文中)。另一方法使用了来源于具有特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共同序列的特定框架。该相同框架可以用于若干不同的人源化抗体(参见例如，Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区，例如全部四个框架区来源于VH4-4-59种系序列。在一个实施方案中，该框架区可以例如在相应鼠类序列的氨基酸中包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如取代。在一些实施方案中，轻链可变区的框架区，例如全部四个框架区来源于VK3-1.25种系序列。在一个实施方案中，该框架区可以例如在相应鼠类序列的氨基酸中包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如取代。
在一些方面，本发明的TFP组合物中包含抗体片段的部分被人源化而保持对靶抗原的高亲和力及其它有利的生物特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体和抗体片段是通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型通常是可得的并且是本领域技术人员所熟悉的。可用计算机程序图解并展示了所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以此方式，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，以获得所希望的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原增加的亲和力。一般来说，CDR残基直接并且最充分地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可以保持与原始抗体类似的抗原特异性，例如在本发明中，结合人CD19的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的结合至人CD19或人BCMA的亲和力和/或特异性。
在一个方面，抗CD19或抗BCMA结合结构域是以抗体或抗体片段的特定功能特征或特性表征。举例来说，在一个方面，本发明的TFP组合物中包含抗原结合结构域的部分特异性结合人CD19或人BCMA。在一个方面，抗原结合结构域与人CD19的结合特异性与Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)中所述的FMC63 scFv相同或类似。在一个方面，本发明涉及构成抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中该抗原结合结构域特异性结合至CD19或BCMA蛋白或其片段，其中该抗体或抗体片段包括含本文所提供的氨基酸序列的可变轻链和/或可变重链。在某些方面，scFv与前导序列相邻并在同一阅读框中。
在一个方面，抗CD19或抗BCMA结合结构域是一个片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个方面，抗CD19结合结构域是Fv、Fab、(Fab’)2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体和其片段以野生型或增强的亲和力结合CD19蛋白。
本文还提供了用于获得对于靶抗原(例如CD19、BCMA或本文别处关于融合部分结合结构域的标所描述的任何靶抗原)具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括通过在本文所陈述的VH结构域氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供作为该VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选将由此获得的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，并测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合以鉴别对所关注的靶抗原(例如CD19或BCMA)具有特异性并任选具有一种或多种所希望的特性的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。
在一些情形中，VH结构域和scFv可以根据本领域中已知的方法制备(参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。scFv分子可以通过使用柔性多肽连接子将VH区和VL区连接在一起产生。scFv分子包含具有最佳长度和/或氨基酸组成的连接子(例如Ser-Gly连接子)。连接子长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的多肽连接子(例如在5-10个氨基酸之间)，则防止链内折叠。链间折叠还是使两个可变区连在一起形成功能性表位结合位点所需的。在一些情形中，该连接子序列包括长连接子(LL)序列。在一些情形中，该长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，该连接子序列包括短连接子(SL)序列。在一些情形中，该短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。关于连接子取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448；美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794；以及PCT公布号WO2006/020258和WO2007/024715，以引用的方式并入本文中。
scFv可以在其VL区与VH区之间包含约10、11、12、13、14、15或超过15个残基的连接子。该连接子序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，该连接子序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一实施方案中，该连接子序列包含数组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。在一个实施方案中，连接子可以是(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。改变连接子长度可以保持或增强活性，由此在活性研究中产生优良功效。在一些情形中，该连接子序列包括长连接子(LL)序列。在一些情形中，该长连接子序列包括(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情形中，该连接子序列包括短连接子(SL)序列。在一些情形中，该短连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至3。
稳定性和突变
可以参照常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理特性(例如热稳定性)评价抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如scFv分子(例如可溶性scFv)的稳定性。在一个实施方案中，人源化或人scFv在所描述的测定中的热稳定性比亲本scFv高约0.1℃、约0.25℃、约0.5℃、约0.75℃、约1℃、约1.25℃、约1.5℃、约1.75℃、约2℃、约2.5℃、约3℃、约3.5℃、约4℃、约4.5℃、约5℃、约5.5℃、约6℃、约6.5℃、约7℃、约7.5℃、约8℃、约8.5℃、约9℃、约9.5℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃或约15℃。
抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如scFv的改善的热稳定性随后被赋予完整CD19-TFP构建体，由此改善抗CD19或抗BCMA TFP构建体的治疗特性。相较于常规抗体，抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如scFv的热稳定性可以有至少约2℃或3℃的改善。在一个实施方案中，相较于常规抗体，抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如scFv的热稳定性有1℃的改善。在另一实施方案中，相较于常规抗体，抗CD19结合结构域，例如scFv的热稳定性有2℃的改善。在另一实施方案中，相较于常规抗体，scFv的热稳定性有4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃的改善。比较可以例如在本文所公开的scFv分子与作为scFv VH和VL来源的抗体的scFv分子或Fab片段之间进行。热稳定性可以使用本领域中已知的方法测量。例如，在一个实施方案中，可以测量TM。用于测量TM的方法以及测定蛋白质稳定性的其它方法于下文更详细地描述。
scFv中的突变(通过可溶性scFv的人源化或直接诱变引起)改变scFv的稳定性并且改善scFv和抗CD19或抗BCMA TFP构建体的总体稳定性。使用如TM、变性温度和聚集温度等测量值来比较人源化scFv与鼠类scFv的稳定性。在一个实施方案中，抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如scFv包含至少一个由人源化过程引起的突变，由此突变的scFv赋予抗CD19TFP构建体改善的稳定性。在另一实施方案中，抗CD19结合结构域，例如scFv包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个由人源化过程引起的突变，由此突变的scFv赋予CD19-TFP或BCMA-TFP构建体改善的稳定性。
在一个方面，TFP的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且该抗原结合结构域保持本文所述的抗CD19或抗BCMA抗体片段所希望的功能特性。在一个具体方面中，本发明的TFP组合物包含抗体片段。在另一方面，该抗体片段包含scFv。
在各个方面，通过修饰一个或两个可变区(例如VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸残基来对TFP的抗原结合结构域进行工程改造。在一个具体方面中，本发明的TFP组合物包含抗体片段。在另一方面，该抗体片段包含scFv。
本领域的普通技术人员应了解，本发明的抗体或抗体片段可以被进一步进行修饰以使其氨基酸序列改变(例如相对于野生型)，但不改变所希望的活性。举例来说，可以在该蛋白质中进行额外核苷酸取代，由此在“非必需”氨基酸残基处进行氨基酸取代。举例来说，一个分子中的非必需氨基酸残基可以被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基置换。在另一实施方案中，一连串氨基酸可以被结构类似但侧链家族成员的次序和/或组成不同的序列置换，例如可以进行保守取代，其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换。
具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸或多肽序列情形中，同一性百分比是指相同的两个或更多个序列。当在比较窗或指定区内比较且对准以达到最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动对准和目测检查所测量，如果两个序列具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，在指定区内，或在未指定时在整个序列内具有60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，则两个序列为“大体上同一”。任选地，同一性存在于长度是至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域内，或更优选存在于长度是100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内。
为进行序列比较，典型地一个序列充当参考序列，用以与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列座标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数或者可以指定替代性参数。随后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。供比较序列的比对方法是本领域中众所周知的。可以利用Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法；Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics ComputerGroup,575 Science Dr.,Madison,WI)；或者人工比对和目测检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)，来进行供比较序列的最佳比对。适用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST及BLAST 2.0算法，分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402；及Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。执行BLAST分析的软件通过National Center forBiotechnology Information公开可用。
在一个方面，本发明涵盖起始抗体或片段(例如scFv)氨基酸序列的修饰，这些修饰产生功能等效的分子。举例来说，TFP中包含的抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如scFv的VH或VL可以经过修饰以与抗CD19结合结构域，例如scFv的起始VH或VL框架保持至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。为了产生功能等效的分子，本发明涵盖完整TFP构建体的修饰，例如在TFP构建体各种结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰。TFP构建体可以经过修饰以与起始TFP构建体保持至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
细胞外结构域
细胞外结构域可以来源于天然来源或重组来源。在该来源是天然来源的情况下，该结构域可以来源于任何蛋白质，而且特别是膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，细胞外结构域能够与跨膜结构域缔合。特别适用于本发明中的细胞外结构域可以至少包括例如T细胞受体α、β或ζ链，或CD3ε、CD3γ或CD3δ，或在替代实施方案中CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的细胞外区域。
跨膜结构域
一般来说，TFP序列含有由单一基因组序列编码的细胞外结构域和跨膜结构域。在替代性实施方案中，TFP可以被设计成包含与TFP细胞外结构域异源的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区邻近的一个或多个额外氨基酸，例如与作为跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞外区域缔合的一个或多个氨基酸(例如细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过15个氨基酸)和/或与作为跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域缔合的一个或多个额外氨基酸(例如细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与所用TFP的其它结构域之一缔合的跨膜结构域。在一些情形中，跨膜结构域可以经过选择或通过氨基酸取代进行修饰以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，例如以使与受体复合物的其它成员的相互作用减到最少。在一个方面，跨膜结构域能够与TFP-T细胞表面上的另一TFP发生同二聚化。在一个不同方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以经过修饰或取代，由此使与同一TFP中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用减到最小。
跨膜结构域可以来源于天然来源或重组来源。在该来源是天然来源的情况下，该结构域可以来源于任何膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，跨膜结构域能够向细胞内结构域进行信号传导，只要TFP结合至靶标。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜区域。
在一些情形中，跨膜结构域可以通过铰链，例如来自人蛋白质的铰链连接至TFP的细胞外区域，例如TFP的抗原结合结构域。举例来说，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链，或CD8a铰链。
连接子
任选地，长度介于2与10个氨基酸之间的短寡肽或多肽连接子可以在TFP的跨膜结构域与细胞质区域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸对提供特别适合的连接子。举例来说，在一个方面，连接子包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，连接子是由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:4)编码。
细胞质结构域
如果TFP含有CD3γ、δ或ε多肽，则TFP的细胞质结构域可以包括细胞内信号传导结构域；TCRα和TCRβ亚基一般没有信号传导结构域。细胞内信号传导结构域一般负责引入了TFP的免疫细胞的至少一种正常效应功能的活化。术语“效应功能”是指细胞的专有功能。T细胞的效应功能可以例如是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质中转导效应功能信号并引导细胞执行专门功能的部分。尽管通常可以采用完整的细胞内信号传导结构域，但在许多情况中不必使用完整链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分来说，可以使用此截短部分替代完整链，只要该截短部分转导效应功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意图包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的TFP中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和一起作用以在抗原受体接合后起始信号转导的辅助受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体，和具有相同功能能力的任何重组序列。
已知由单独TCR产生的信号不足以完全活化天然T细胞并且需要二次信号和/或共刺激信号。因此，天然T细胞活化可以被认为是由两类截然不同的细胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初次活化的序列(初级细胞内信号传导结构域)以及以不依赖于抗原的方式作用以提供二次或共刺激信号的序列(二级细胞质结构域，例如共刺激性结构域)。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初次活化。以刺激性方式作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。
特别适用于本发明中的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d的那些。在一个实施方案中，本发明的TFP包含细胞内信号传导结构域，例如CD3ε的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如活性相较于天然ITAM结构域有所改变(例如增加或降低)的突变的ITAM结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括含修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含优化和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
TFP的细胞内信号传导结构域可包含CD3ζ信号传导结构域本身，或者该结构域可以与可用于本发明的TFP情形中的任何其它所希望的细胞内信号传导结构域组合。举例来说，TFP的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ε链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指TFP中包含共刺激分子细胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原高效反应所需的除抗原受体或其配体外的细胞表面分子。这些分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体等。举例来说，经展示，CD27共刺激可在体外增强人TFP-T细胞的扩增、效应功能及存活，并且在体内加强人T细胞存留时间和抗肿瘤活性(Song等人,Blood.2012；119(3):696-706)。
在本发明TFP的细胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定次序相互连接。任选地，长度在例如2与10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的短寡肽或多肽连接子可以在细胞内信号传导序列之间形成连接。
在一个实施方案中，可以使用甘氨酸-丝氨酸对作为适合连接子。在一个实施方案中，可以使用单一氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸，作为适合连接子。
在一个方面，本文所描述的表达TFP的细胞还可以包含第二TFP，例如包括针对例如相同靶标(CD19或BCMA)或不同靶标(例如CD123)的不同抗原结合结构域的第二TFP。在一个实施方案中，当表达TFP的细胞包含两种或更多种不同TFP时，这些不同TFP的抗原结合结构域可以使得这些抗原结合结构域不会彼此相互作用。举例来说，表达第一和第二TFP的细胞可以具有呈例如片段形式(例如scFv)的第一TFP的抗原结合结构域，该抗原结合结构域不与第二TFP的抗原结合结构域形成缔合，例如该第二TFP的抗原结合结构域是VHH。
在另一方面，本文所述的表达TFP的细胞还可以表达另一试剂，例如增强表达TFP的细胞的活性的试剂。举例来说，在一个实施方案中，该试剂可以是对抑制性分子进行抑制的试剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如PD1，可以降低表达TFP的细胞产生免疫效应反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。在一个实施方案中，对抑制性分子进行抑制的试剂包含第一多肽，例如抑制性分子，以及与其缔合的向细胞提供阳性信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，该试剂包含第一多肽，例如抑制性分子，如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4及TIGIT，或这些分子中任一个的片段(例如这些分子中任一个的细胞外结构域的至少一部分)，以及第二多肽，即本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激性结构域(例如4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文所描述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，该试剂包含第一多肽PD1或其片段(例如PD1细胞外结构域的至少一部分)，和本文所述的细胞内信号传导结构域第二多肽(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人,1996 Int.Immunol 8:765-75)。经显示，PD1的两个配体PD-L1和PD-L2当结合至PD1时使T细胞活化下调(Freeman等人,2000J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人,2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人,2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人癌症中含量丰富(Dong等人,2003 J Mol Med81:281-7；Blank等人,2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人,2004Clin Cancer Res 10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以保持免疫抑制。
在一个实施方案中，该试剂包含抑制性分子的细胞外结构域(ECD)，例如程序性死亡蛋白1(PD1)可以与跨膜结构域以及任选地细胞内信号传导结构域如41BB和CD3ζ融合(在本文中又称为PD1 TFP)。在一个实施方案中，PD1 TFP当与本文所述的抗CD19 TFP组合使用时，改善T细胞的存留时间。在一个实施方案中，该TFP是包含PD 1细胞外结构域的PD1 TFP。或者，提供了含有特异性结合至程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性死亡配体2(PD-L2)的抗体或抗体片段如scFv的TFP。
在另一方面，本发明提供了表达TFP的T细胞(例如TFP-T细胞)群。在一些实施方案中，该表达TFP的T细胞群包含表达不同TFP的细胞的混合物。举例来说，在一个实施方案中，该TFP-T细胞群可以包括：第一细胞，该第一细胞表达具有本文所述的抗CD19或抗BCMA结合结构域的TFP；以及第二细胞，该第二细胞表达具有不同抗CD19或抗BCMA结合结构域，例如不同于第一细胞所表达的TFP中的抗CD19结合结构域的本文所述的抗CD19或抗BCMA结合结构域的TFP。作为另一个实例，该表达TFP的细胞群可以包括：第一细胞，该第一细胞表达包括例如本文所述的抗CD19或抗BCMA结合结构域的TFP；以及第二细胞，该第二细胞表达包括针对除CD19或BCMA外的靶标(例如另一肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域的TFP。
在另一方面，本发明提供一种细胞群，其中该细胞群中至少一个细胞表达具有本文所述的抗CD19或抗BCMA结构域的TFP，并且第二细胞表达另一试剂，例如增强表达TFP的细胞的活性的试剂。举例来说，在一个实施方案中，该试剂可以是对抑制性分子进行抑制的试剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如可以降低表达TFP的细胞产生免疫效应反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。在一个实施方案中，对抑制性分子进行抑制的试剂包含第一多肽，例如抑制性分子，和与其缔合的向细胞提供阳性信号的第二多肽，例如本文所述的细胞内信号传导结构域。
本文公开了用于产生编码TFP的体外转录的RNA的方法。本发明还包括编码TFP的RNA构建体，该构建体可以直接转染至细胞中。产生用于转染的mRNA的方法可以涉及在体外转录(IVT)带有专门设计的引物的模板，随后添加多聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸以及长度典型地是50-2000个碱基的多聚腺苷酸尾的构建体。由此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，该模板包括TFP的序列。
在一个方面，抗CD19或抗BCMA TFP由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码抗CD19或抗BCMA TFP的mRNA引入T细胞中以产生TFP-T细胞。在一个实施方案中，体外转录的RNA TFP可以通过短暂转染形式引入细胞中。该RNA使用聚合酶链式反应(PCR)产生的模板，通过体外转录产生。来自任何来源的所关注DNA都可以通过PCR直接转化成模板，以使用适当引物和RNA聚合酶在体外合成mRNA。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它适当的DNA来源。所希望的体外转录模板是本发明的TFP。在一个实施方案中，打算用于PCR的DNA含有开放阅读框。该DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5’和/或3’非翻译区(UTR)的一部分或全部。该核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，打算用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一实施方案中，打算用于PCR的DNA是包括5’和3’UTR的人核酸序列。该DNA可以替代地是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单一生物体或来自不止一种生物体。
使用PCR产生模板以在体外转录用于转染的mRNA。用于执行PCR的方法是本领域中众所周知的。用于PCR中的引物被设计成具有与用作PCR模板的DNA区域大体上互补的区域。如本文所使用，“大体上互补”是指其中引物序列中的大部分或所有碱基都互补，或者一个或多个碱基不互补，或错配的核苷酸序列。大体上互补的序列能够与预定DNA靶在用于PCR的退火条件下退火或杂交。引物可以被设计成与DNA模板的任何部分大体上互补。举例来说，引物可以被设计成扩增核酸中通常在细胞中转录的部分(开放阅读框)，包括5’和3’UTR。引物还可以被设计成扩增核酸中编码所关注的特定结构域的一部分。在一个实施方案中，引物被设计成扩增人cDNA的编码区，包括5’和3’UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以通过本领域中众所周知的合成方法产生。“正向引物”是位于待扩增DNA序列上游的含有与DNA模板上核苷酸大体上互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指相对于编码链，在待扩增DNA序列的5位。“反向引物”是位于待扩增DNA序列下游的含有与双链DNA模板大体上互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指相对于编码链，在待扩增DNA序列的3’位。
可用于PCR的任何DNA聚合酶都可以用于本文所公开的方法中。试剂和聚合酶可购自众多来源。
也可以使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5’和3’UTR。在一个实施方案中，5’UTR的长度介于一个与3000个核苷酸之间。打算添加至编码区中的5’和3’UTR序列的长度可以通过不同方法改变，包括但不限于，设计出与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用这一方法，本领域的普通技术人员可以改变在转录的RNA转染后获得最佳翻译效率所需的5’和3’UTR长度。
5’和3’UTR可以是所关注核酸的天然存在的内源性5’和3’UTR。或者，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物中或通过任何其它模板修饰来添加不是所关注核酸内源性的UTR序列的UTR序列。使用不是所关注核酸内源性的UTR序列的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。举例来说，已知3’UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，3’UTR可以基于本领域中众所周知的UTR特性进行选择或设计以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5’UTR可以含有内源性核酸的Kozak序列。或者，当通过如上文所述的PCR添加不是所关注核酸的内源序列的5’UTR时，可以通过该5’UTR序列重新设计共同Kozak序列。Kozak序列可以增加某些RNA转录物的翻译效率，但看来并非所有RNA都需要该序列才能够高效翻译。需要Kozak序列的许多mRNA是本领域中已知的。在其它实施方案中，5’UTR可以是RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒的5’UTR。在其它实施方案中，可以在3’或5’UTR中使用各种核苷酸类似物以阻止外切核酸酶降解mRNA。
为了在不需要基因克隆情况下能由DNA模板合成RNA，转录启动子应连接至DNA模板中在待转录序列上游。当将用作RNA聚合酶启动子的序列添加至正向引物的5’端时，RNA聚合酶启动子被并入PCR产物中，在待转录的开放阅读框的上游。在一个优选实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所描述。其它有用的启动子包括但不限于，T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3及SP6启动子的共同核苷酸序列是本领域中已知的。
在一个优选实施方案中，mRNA具有5’端帽和3’多聚腺苷酸尾，由此决定核糖体结合、翻译起始以及细胞中mRNA的稳定性。在环状DNA模板，例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的较长连接产物。在3’UTR端处线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，该mRNA不能有效转染真核细胞，即使它在转录之后进行了聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以使转录物的3’端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将多聚A/T链段整合至DNA模板中的常规方法是分子克隆。不过，整合至质粒DNA中的多聚A/T序列可能使质粒不稳定，这就是从细菌细胞获得的质粒DNA模板通常大量掺杂缺失和其它异常的原因。这使得克隆程序不仅繁杂耗时，而且通常是不可靠的。这就是允许构建含多聚A/T 3’链段的DNA模板的方法特别不希望克隆的原因。
转录DNA模板的多聚A/T区段可以在PCR期间，通过使用含多聚T尾，如有100个T的尾(大小可以是50-5000个T)的反向引物产生，或在PCR之后，通过任何其它方法，包括但不限于DNA连接或体外重组产生。多聚腺苷酸尾也使RNA稳定并减少其降解。一般来说，多聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施方案中，多聚腺苷酸尾是在100与5000个之间的腺苷。
RNA的多聚腺苷酸尾可以在体外转录之后，使用多聚腺苷酸聚合酶，如大肠杆菌多聚腺苷酸聚合酶(E-PAP)进一步延伸。在一个实施方案中，将多聚腺苷酸尾的长度从100个核苷酸增加至在300与400个核苷酸之间使RNA的翻译效率增加约两倍。另外，将不同化学基团连接至3’端可以增加mRNA的稳定性。此连接可以含有修饰/人工的核苷酸、适体及其它化合物。举例来说，可以使用多聚腺苷酸聚合酶将ATP类似物并入多聚腺苷酸尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
5’帽也使RNA分子稳定。在一个优选实施方案中，由本文所公开的方法产生的RNA包括5’帽。5’帽是使用本领域中已知并且本文所描述的技术提供(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
由本文所公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是起始核糖体与mRNA的不依赖于帽的结合并促进翻译起始的任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列。可以包括适于细胞电穿孔的任何溶质，这些溶质可以含有促进细胞渗透和活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂以及表面活性剂。
RNA可以使用多种不同的方法引入靶细胞中，例如可商购的方法，包括但不限于，电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染进行的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染，或biolistic粒子递送系统，如“基因枪”(参见例如，Nishikawa等人,Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
编码TFP的核酸构建体
本发明还提供了编码一个或多个本文所述的TFP构建体的核酸分子。在一个方面，该核酸分子是以信使RNA转录物的形式提供。在一个方面，该核酸分子是以DNA构建体的形式提供。
编码所希望的分子的核酸序列可以使用本领域中已知的重组方法获得，如通过筛选由表达该基因的细胞构成的文库；通过从已知包括该基因的载体得到该基因；或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织分离。或者，可以通过合成产生而非克隆所关注基因。
本发明还提供插入了本发明的DNA的载体。来源于逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的适合工具，因为这些载体能够长期、稳定地整合转基因并且在其子代细胞中繁殖。相对于来源于致癌逆转录病毒，如鼠类白血病病毒的载体，慢病毒载体的附加益处在于，这些载体可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。这些载体还具有低免疫原性的附加益处。
在另一实施方案中，包含编码所需本发明TFP的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一实施方案中，编码TFP的核酸可以使用转座子，如sleeping beauty、crisper、CAS9及锌指核酸酶进行表达。参见以下June等人,2009 Nature Reviews Immunology9.10:704-716，以引用的方式并入本文中。
本发明的表达构建体还可以用于使用标准基因递送方案进行的核酸免疫和基因疗法。基因递送方法是本领域中已知的(参见例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，以引用的方式整体并入本文中)。在另一实施方案中，本发明提供了基因疗法载体。
可以将核酸克隆至多种类型的载体中。举例来说，可以将核酸克隆至载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒及粘粒。特别值得关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体及测序载体。
另外，表达载体可以呈病毒载体形式提供至细胞中。病毒载体技术是本领域中众所周知的并且描述于例如Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)以及其它病毒学和分子生物学指南中。可用作载体的病毒包括但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般来说，适合的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、常规限制性内切核酸酶位点，以及一种或多种选择性标志物(例如WO 01/96584、WO 01/29058，以及美国专利号6,326,193)。
已经开发出多种基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。举例来说，逆转录病毒为基因递送系统提供了一个适宜的平台。所选基因可以使用本领域中已知的技术插入载体中并包装于逆转录病毒粒子中。重组病毒接着可以被分离并在体内或离体递送至受试者的细胞中。本领域中已知多种逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用了腺病毒载体。本领域中已知多种腺病毒载体。在一个实施方案中，使用了慢病毒载体。
其它的启动子元件，例如增强子，调控转录起始的频率。典型地，这些都位于在起始位点上游30-110bp的区域中，不过经显示，很多启动子还在起始位点的下游含有功能元件。启动子元件之间的间距通常很灵活，因此当各元件相对于彼此倒转或移动时，启动子的功能得到保持。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距在活性开始下降前可以增加至间隔50bp。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或独立作用以活化转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达TFP转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然的EF1a启动子驱动伸长因子-1复合物的α亚基的表达，该复合物负责将氨酰基tRNA通过酶递送至核糖体。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且经显示，该启动子可有效驱动被克隆至慢病毒载体中的转基因表达TFP(参见例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这一启动子序列是能够驱动与其可操作地链接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。不过，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、伸长因子-1a启动子、血红蛋白启动子以及肌酸激酶启动子。另外，本发明不应局限于使用组成型启动子。也涵盖诱导型启动子作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一个分子开关，该分子开关能够在希望该启动子可操作地链接的多核苷酸表达时开启此表达，或在不希望表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子及四环素调控的启动子。
为了评估TFP多肽或其部分的表达，打算引入细胞中的表达载体还可以含有选择性标志物基因或报告基因或这两种，以帮助从打算用病毒载体转染或感染的细胞群中鉴别和选出表达细胞。在其它方面，选择性标志物可以被携带于独立DNA片段上并用于共转染程序中。选择性标志物和报告基因都可以侧接适当的调控序列以便能在宿主细胞中表达。有用的选择性标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因被用于鉴别可能转染的细胞以及评价调控序列的功能。一般来说，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且该基因编码的多肽的表达是通过一些容易检测的特性，例如酶活性表现出来。报告基因的表达是在DNA引入受体细胞中之后的适合时间测定。适合报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人,2000 FEBS Letters 479:79-82)。适合的表达系统是众所周知的并且可以使用已知技术制备或商购获得。一般来说，将带有显示最高报告基因表达水平的最小5’侧接区的构建体鉴别为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因并且用于评价能够调节启动子驱动的转录的试剂。
将基因引入细胞中并进行表达的方法是本领域中已知的。在表达载体的情况下，该载体可以通过本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。举例来说，表达载体可以通过物理、化学或生物方式转移至宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂质转染法、粒子轰击法、显微注射法、电穿孔法等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如，Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染法。
用于将所关注的多核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物，例如人细胞中的最常用方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒及腺相关病毒等(参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学方式包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒以及基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束及脂质体。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。现有技术靶向递送核酸的其它方法是可用的，如用靶向性纳米粒子或其它适合的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。涵盖使用脂质体配制物将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以被包封于脂质体的水性内部中、散布于脂质体的脂质双层内、通过同时与脂质体和寡聚核苷酸缔合的连接分子连接至脂质体、夹在脂质体中、与脂质体形成复合物、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、包含在脂质中呈悬浮液形式、包含胶束或与胶束形成复合物，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于在溶液中的任何特定结构。举例来说，它们可以呈双层结构形式、呈胶束形式，或具有“塌缩的(collapsed)”结构存在。它们还可以简单地散布于溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质是脂肪性物质，这些脂肪性物质可以是天然存在或合成的脂质。举例来说，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小滴，以及含有长链脂肪烃和其衍生物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇及醛的化合物类别。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。举例来说，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma(St.Louis,Mo.)获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以从K & KLaboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二棕榈酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中的储备液可以在约-20℃储存。氯仿被用作唯一溶剂，这是因为它比甲醇更易蒸发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体所形成的多种单层和多层脂质媒介物的通用术语。脂质体的特征可以在于具有含磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。这些脂质体是在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成的。脂质组分经历自我重排，随后形成密闭结构并将水和溶解的溶质夹在脂质双层之间(Ghosh等人,1991 Glycobiology 5:505-10)。不过，也涵盖在溶液中的结构不同于正常囊泡结构的组合物。举例来说，脂质可以呈现胶束结构或仅以不均一脂质分子聚集体形式存在。还涵盖脂转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
不管用于将外源性核酸引入宿主细胞或以其它方式使细胞暴露于本发明抑制剂的方法如何，为了确定宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。这些测定包括例如本领域技术人员众所周知的“分子生物”测定法，如Southern印迹法和Northern印迹法、RT-PCR及PCR；“生物化学”测定法，如例如通过免疫方式(ELISA和Western印迹法)，或通过本文所描述的用于鉴别在本发明范围内的试剂的测定法检测特定肽的存在或不存在。
本发明还提供了一种载体，该载体包含编码TFP的核酸分子。在一个方面，TFP载体可以直接转导至细胞，例如T细胞中。在一个方面，载体是克隆或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、小环分子、微型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达TFP构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
T细胞来源
在进行扩增和基因修饰之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”意图包括能够引起免疫反应的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。在本发明的某些方面，可以使用本领域中可得到的多种T细胞系。在本发明的某些方面，T细胞可以使用熟练技术人员已知的多种技术，如FicollTM分离从受试者收集的一单位血液获得。在一个优选方面，通过单采血液成分术(apheresis)从个体的循环血获得细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞及血小板。在一个方面，可以对通过单采血液成分术收集的细胞进行洗涤以去除血浆部分并将细胞放入适当缓冲液或介质中用于后续加工步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代性方面，洗涤溶液不含钙并且可以不含镁或可以不含许多(如果不是全部)二价阳离子。在无钙存在下的初始活化步骤可以引起活化放大。本领域普通技术人应易于理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法实现，如根据制造商的说明书，使用半自动“流通”离心管(例如Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞再悬浮于多种生物相容性缓冲液，如无钙、无镁PBS、PlasmaLyte A，或者含或不含缓冲剂的其它生理盐水溶液中。或者，可以去除单采血液成分术样品的不想要组分并将细胞直接再悬浮于培养基中。
在一个方面，通过将红细胞溶解并例如经PERCOLLTM梯度离心或逆流离心淘选耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞分离出T细胞。特定T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+ T细胞可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。举例来说，在一个方面，T细胞通过与抗CD3/抗CD28(例如3×28)偶联珠粒，如DYNABEADSTM M-450 CD3/CD28 T一起孵育一段足以对所希望的T细胞进行阳性选择的时间来分离。在一个方面，该时间段是约30分钟。在另一方面，该时间段在30分钟至36小时或更长以及其间的任何整数值的范围内。在另一方面，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又另一优选方面，该时间段是10至24小时。在一个方面，孵育时间段是24小时。在T细胞比其它细胞类型少的情况下，如在从肿瘤组织分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或从免疫力低下的个体分离时，可以使用更长孵育时间来分离T细胞。另外，使用较长孵育时间可以增加捕捉CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，使T细胞能够结合至CD3/CD28珠粒，和/或通过增加或减小珠粒与T细胞的比率(如本文另外描述)，可以在培养起始或该过程期间的其它时间点关于或针对T细胞亚群进行优先选择。另外，通过增加或减小珠粒或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养起始或其它所希望的时间点关于或针对T细胞亚群进行优先选择。熟练技术人员将认识到，在本发明的情况下还可以使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并且在活化和扩增过程中使用“未被选择”的细胞。“未被选择”的细胞也可以经历另外数轮选择。
通过阴性选择来富集T细胞群可以用针对阴性选择的细胞独有的表面标志物的抗体组合实现。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，该方法使用了针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。举例来说，为了能通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8的抗体。在某些方面，可能希望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+的调控T细胞。或者，在某些方面，通过抗C25偶联珠粒或其它类似的选择方法耗尽T调控细胞。
在一个实施方案中，可以选出表达以下一种或多种的T细胞群：IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B及穿孔素，或其它适当的分子，例如其它细胞因子。针对细胞表达进行筛选的方法可以例如通过PCT公布号WO 2013/126712中所描述的方法确定。
对于通过阳性或阴性选择来分离所希望的细胞群，可以变化细胞浓度和表面(例如粒子，如珠粒)。在某些方面，可能希望明显减小其中珠粒与细胞混合在一起的体积(例如增加细胞浓度)以确保细胞与珠粒的最大接触。举例来说，在一个方面，使用了2×109个细胞/毫升的浓度。在一个方面，使用了1×109个细胞/毫升的浓度。在又一方面，使用了每毫升超过1×108个细胞。在又一方面，使用了10、15、20、25、30、35、40、45或50×106个细胞/毫升的浓度。在另一方面，使用了75、80、85、90、95或100×106个细胞/毫升的浓度。在其它方面，使用了125或150×106个细胞/毫升的浓度。使用较高浓度可以增加细胞产率、细胞活化及细胞扩增。另外，使用较高细胞浓度允许更高效地捕捉可能较弱表达所关注靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血液、肿瘤组织等)捕捉细胞。此类细胞群可能具有治疗价值并且是希望获得的。举例来说，使用较高的细胞浓度允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在一个相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过明显稀释T细胞与表面(例如粒子，如珠粒)的混合物，使粒子与细胞之间的相互作用减到最低。由此选出表达大量有待结合至粒子的所需抗原的细胞。举例来说，相较于CD8+ T细胞，在较稀浓度下，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28并且更高效地被捕捉。在一个方面，所用细胞的浓度是5×106/mL。在其它方面，所用浓度可以是约1×105/mL至1×106/mL，及其间任何整数值。在其它方面，细胞可以在2-10℃或室温下，在旋转器上以不同速度孵育不同时间长度。
供刺激用的T细胞还可以在洗涤步骤之后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和后续的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞以及在一定程度上去除单核细胞而提供更均一的产物。在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。尽管本领域中已知许多冷冻溶液和参数并且可用于此情形中，但一种方法涉及使用含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白及7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40及5％右旋糖、20％人血清白蛋白及7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它适合的细胞冷冻介质，细胞接着以1分钟的速率冷冻至-80℃并储存于液氮储罐的气相中。可以使用其它控制性冷冻方法以及直接在-20℃或液氮中不受控制冷冻。在某些方面，将低温保存的细胞解冻并如本文所描述进行洗涤，并且在使用本发明的方法活化之前使其在室温下保持一小时。
在本发明的上下文中还涵盖在可能需要如本文所述扩增细胞之前的时间段，从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，待扩增的细胞来源可以在任何所需时间点收集，并且将所希望的细胞，如T细胞分离并冷冻以待用于针对多种疾病或病况的T细胞疗法中，这些疾病或病况将得益于T细胞疗法，如本文所描述的那些。在一个方面，血液样品或单采血液成分是从大体上健康的受试者取得。在某些方面，血液样品或单采血液成分是从有发生疾病的风险但尚未发展该疾病的大体上健康的受试者取得，并且分离所关注细胞并冷冻待用。在某些方面，T细胞可以被扩增、冷冻并在稍后时间使用。在某些方面，在如本文所述诊断出特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一方面，细胞是在多种相关治疗措施之前从来自受试者的血液样品或单采血液成分分离，所述相关治疗措施包括但不限于用如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)等药剂、抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢霉素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉芬酸酯(mycophenolate)及FK506、抗体，或其它免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢霉素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉芬酸、类固醇、FR901228，以及辐射治疗的治疗。
在本发明的另一方面，T细胞是在向受试者施用功能性T细胞的治疗之后立即从患者获得。就这一点来说，据观察在某些癌症治疗之后，特别是在用破坏免疫系统的药物治疗之后，在治疗后不久且患者从治疗正常恢复期间，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或其离体扩增的能力得到改善。同样，在使用本文所述的方法离体操作时，这些细胞可以处于用于增强移植和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的情形内涵盖在此恢复期间收集血液细胞，包括T细胞、树突状细胞或造血细胞系的其它细胞。另外，在某些方面，可以使用动员(例如用GM-CSF动员)和调理方案在受试者体内建立有利于特定细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，尤其是在治疗之后的指定时间范围内。示范性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞以及免疫系统的其它细胞。
T细胞活化和扩增
T细胞可以大体上使用例如美国专利号6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041；以及美国专利申请公布号20060121005中所描述的方法活化和扩增。
一般来说，本发明的T细胞可以通过接触连接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面来进行扩增。具体地说，T细胞群可以如本文所述，如通过接触抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体，或通过接触蛋白质激酶C活化剂(例如苔藓抑素)与钙离子载体缀合来实现刺激。对于共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用了结合该辅助分子的配体。举例来说，可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适于刺激T细胞增殖的条件下接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞增殖，使用了抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3，可以使用XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)以及本领域中通常所了解的其它方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。
暴露不同刺激时间的T细胞可以展现不同的特征。举例来说，典型的血液或单采血液成分得到的外周血单核细胞产物具有的辅助T细胞群(TH,CD4+)大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC,CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生这样一群T细胞，该细胞群在约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，该T细胞群包含大量增加的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果分离出抗原特异性TC细胞亚群，则将此亚群扩增较高程度可能是有利的。
另外，除CD4和CD8标志物外，其它表型标志物也明显不同，但在较大程度上，在细胞扩增过程期间可再现。因此，此再现性使得能针对特定目的定制活化的T细胞产物。
一旦构建出抗CD19或抗BCMA TFP，则可以使用多种测定法评价该分子的活性，如但不限于，在抗原刺激后扩增T细胞、在无再刺激存在下保持T细胞扩增的能力，以及在适当体外和动物模型中的抗癌活性。评价抗CD19或抗BCMA TFP的作用的测定法于下文更详细地描述。
可以使用原代T细胞中TFP表达的Western印迹分析来检测单体和二聚体的存在(参见例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简单点说，在体外扩增表达TFP的T细胞(CD4+T细胞与CD8+T细胞的1:1混合物)超过10天，随后溶解并在还原条件下进行SDS-PAGE。使用针对TCR链的抗体，通过Western印迹法检测TFP。相同的T细胞亚群在非还原条件下进行SDS-PAGE分析以评价共价二聚体的形成。
在抗原刺激后TFP+T细胞的体外扩增情况可以用流式细胞术测量。举例来说，用αCD3/αCD28和APC刺激CD4+T细胞与CD8+T细胞的混合物，随后用在待分析启动子控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或甘油磷酸激酶(PGK)启动子。在培养第6天，通过流式细胞术评价CD4+和/或CD8+ T细胞亚群中的GFP荧光(参见例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。或者，在第0天利用涂有αCD3/αCD28的磁珠刺激CD4+和CD8+ T细胞混合物，并在第1天，使用表达TFP和eGFP的双顺反子慢病毒载体，利用2A核糖体跳跃序列，用TFP进行转导。洗涤后，用CD19+K562细胞(K562-CD19)、野生型K562细胞(K562野生型)或在抗CD3和抗CD28抗体存在下表达hCD32和4-1BBL的K562细胞(K562-BBL-3/28)再刺激培养物。每隔一天以100IU/mL将外源性IL-2添加至培养物中。通过流式细胞术，使用基于珠粒的计数法对GFP+ T细胞进行计数(参见例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。
还可以测量在无再刺激存在下TFP+ T细胞的持续扩增情况(参见例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简单点说，在第0天用涂有αCD3/αCD28的磁珠刺激并在第1天用指定TFP转导之后，在培养第8天，使用Coulter Multisizer III粒子计数器测量平均T细胞容积(fl)。
也可以使用动物模型测量TFP-T活性。举例来说，使用人CD19特异性TFP+ T细胞治疗免疫缺陷小鼠的原发性人前体B ALL的异种移植模型可以使用(参见例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简单点说，在确定ALL之后，将小鼠随机分入治疗组。将不同数量的经过工程改造的T细胞以1:1比率共注射至患有B-ALL的NOD/SCID/γ-/-小鼠中。在T细胞注射后的各种时间点，评价来自小鼠的脾DNA中每个载体的拷贝数。以每周时间间隔评估动物的白血病。测量注射了αCD19-ζTFP+ T细胞或mock转导的T细胞的小鼠中外周血CD19+B-ALL母细胞数量。使用对数秩检验比较各组的存活率曲线。此外，还可以在T细胞注射后4周，分析NOD/SCID/γ-/-小鼠中的绝对外周血CD4+和CD8+ T细胞计数。对小鼠注射白血病细胞并在3周后，注射被编码连接至eGFP的TFP的双顺反子慢病毒载体工程改造成表达TFP的T细胞。T细胞通过与mock转导的细胞混合，随后注射而归一化至45-50％输入GFP+ T细胞，并利用流式细胞术确定。以1周的时间间隔评估动物的白血病。使用对数秩检验比较TFP+ T细胞组的存活率曲线。
可以评价剂量依赖性TFP治疗反应(参见例如，Milone等人,Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009))。举例来说，在确定白血病之后35-70天，从第21天注射了TFP T细胞、等量mock转导的T细胞或未注射T细胞的小鼠获得外周血。对来自各组的小鼠随机抽血以测定外周血CD19+ALL母细胞数量，然后在第35天和第49天将其杀灭。在第57天和第70天评价剩余动物。
先前例如在Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)中已描述有关细胞增殖和细胞因子产生的评估。简单点说，在微量滴定板中，通过将洗涤过的T细胞与表达CD19的K562细胞(K19)或表达CD32和CD137的K562细胞(KT32-BBL)以2:1的最终T细胞:K562比率混合来评估TFP介导的增殖情况。在使用前，用γ放射照射K562细胞。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至含KT32-BBL细胞的培养物中以用作刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+ T细胞离体扩增。根据制造商的描述，使用CountBrightTM荧光珠粒(Invitrogen)和流式细胞术对培养物中的T细胞进行计数。使用以表达eGFP-2A连接的TFP的慢病毒载体工程改造的T细胞，通过GFP表达来鉴别TFP+ T细胞。对于不表达GFP的TFP+ T细胞，用生物素化重组CD19蛋白和二次抗生物素蛋白-PE偶联物检测TFP+ T细胞。另外，用特定单克隆抗体(BD Biosciences)同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。根据制造商的说明书，使用人TH1/TH2细胞因子细胞测量珠测定试剂盒(BDBiosciences)对再刺激后24小时收集到的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光度，并根据制造商的说明书分析数据。
可以通过标准51Cr释放测定法评估细胞毒性(参见例如，Milone等人,MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009))。简单点说，在37℃下，在频繁搅动下向靶细胞(K562细胞系和原代原B-ALL细胞)中装载51Cr(呈NaCrO4形式，New England Nuclear)，保持2小时，在完全RPMI中洗涤两次并涂铺于微量滴定板中。在各孔中的完全RPMI中将效应T细胞与靶细胞以不同的效应细胞:靶细胞(E:T)比率混合。另外，准备仅含培养基(自发释放，SR)或含triton-X 100清洁剂的1％溶液(总释放，TR)的额外孔。在37℃下孵育4小时后，从各孔收集上清液。然后，使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,Mass.)测量51Cr的释放量。每一条件一式三份执行，并且使用下式计算溶解百分比：％溶解＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示每一实验条件的平均51Cr释放量。
可以使用成像技术评价带有肿瘤的动物模型中TFP的具体运输和增殖情况。此类测定法描述于例如Barrett等人,Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)中。简单点说，向NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠静脉内注射Nalm-6细胞，7天后注射电穿孔放入TFP构建体4小时后的T细胞。用慢病毒构建体稳定转染T细胞以使其表达萤火虫荧光素酶，并获取小鼠的生物发光影像。或者，可以如下所述，在Nalm-6异种移植模型中测量单次注射TFP+ T细胞的治疗功效和特异性：向NSG小鼠注射被转导成稳定表达萤火虫荧光素酶的Nalm-6，随后，在7天后，单侧尾静脉注射经电穿孔放入CD19 TFP的T细胞。在注射后的各种时间点，获取动物影像。举例来说，可以在第5天(治疗前2天)和第8天(TFP+PBL后24小时)，生成代表性小鼠中萤火虫荧光素酶阳性白血病的光子密度热图。
也可以使用其它测定法，包括本文实施例部分中所描述的测定法以及本领域中已知的测定法，评价本发明的抗CD19或抗BCMA TFP构建体。
治疗应用
CD19或BCMA相关疾病和/或病症
在一个方面，本发明提供了用于治疗与CD19或BCMA表达有关的疾病的方法。在一个方面，本发明提供了治疗其中部分肿瘤对CD19或BCMA呈阴性且部分肿瘤对CD19或BCMA呈阳性的疾病的方法。举例来说，本发明的TFP可用于治疗经历了CD19或BCMA表达升高相关疾病的治疗的受试者，其中经历了针对CD19或BCMA水平升高的治疗的受试者展现与CD19或BCMA水平升高有关的疾病。
在一个方面，本发明涉及一种载体，该载体包含可操作地连接至启动子的抗CD19或BCMA TFP，用于在哺乳动物T细胞中表达。在一个方面，本发明提供了一种表达CD19或BCMA TFP的重组T细胞，该TFP用于治疗表达CD19或BCMA的肿瘤，其中该表达CD19或BCMATFP的重组T细胞称为CD19或BCMA TFP-T。在一个方面，本发明的CD19或BCMA TFP-T能够使肿瘤细胞与其表面上表达的至少一种本发明的CD19或BCMA TFP接触，由此使TFP-T靶向肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞生长。
在一个方面，本发明涉及一种抑制表达CD19或BCMA的肿瘤细胞生长的方法，该方法包括使肿瘤细胞与本发明的CD19或BCMA TFP T细胞接触，由此使TFP-T响应于抗原而活化并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长受到抑制。
在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法。该方法包括向受试者施用本发明的CD19或BCMA TFP T细胞，由此治疗受试者的癌症。能用本发明的CD19或BCMATFP T细胞治疗的癌症的实例是与CD19或BCMA表达有关的癌症。在一个方面，与CD19或BCMA表达有关的癌症是血液癌症。在一个方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19表达有关的癌症包括癌症和恶性疾病，包括但不限于，例如一种或多种急性白血病，包括但不限于，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。其它与CD19或BCMA表达有关的癌症或血液病况包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，即伴有无效产生骨髓血细胞(或发育不良)的一组不同的血液病症，等等。与CD19或BCMA表达有关的其它疾病包括但不限于，例如与CD19或BCMA表达有关的非典型性和/或非经典癌症、恶性疾病、癌前病况或增生性疾病。
在一些实施方案中，可以用例如本文所述的CD19或BCMA TFP治疗的癌症是多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤是以浆细胞集落在骨髓中积累为特征的血液癌症。当前的多发性骨髓瘤疗法包括但不限于，用来那度胺(lenalidomide)，即沙利度胺(thalidomide)类似物治疗。来那度胺的活性包括抗肿瘤活性、血管生成抑制及免疫调节。一般来说，根据流式细胞术，骨髓瘤细胞被认为对CD19或BCMA表达呈阴性。本发明涵盖认识到少量的骨髓瘤肿瘤细胞表达CD19或BCMA。因此，在一些实施方案中，可以使用例如本文所描述的CD19或BCMA TFP靶向骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，CD19或BCMA TFP疗法可以与一种或多种额外疗法，例如来那度胺治疗组合使用。
本发明包括这样一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰成表达TFP并且表达TFP的T细胞被输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀灭受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，表达TFP的T细胞能够在体内复制，引起长期存留，由此可以导致持续的肿瘤控制。在各个方面，在将T细胞施用给患者之后，施用给患者的T细胞，或其子代在患者体内持续存在至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。
本发明还包括这样一类细胞疗法，其中T细胞通过例如体外转录的RNA修饰成短暂地表达TFP并且表达TFP的T细胞被输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀灭受体中的肿瘤细胞。因此，在各种方面，在将T细胞施用给患者之后，施用给患者的T细胞存在不到一个月，例如三周、两周或一周。
不希望受任何特定理论束缚，由表达TFP的T细胞引起的抗肿瘤免疫反应可以是主动或被动免疫反应，或替代地，可以归于直接与间接免疫反应。在一个方面，TFP转导的T细胞响应于表达CD19或BCMA抗原的人癌细胞而展现特异性促炎性细胞因子分泌和有效的细胞溶解活性，抵抗可溶性CD19或BCMA抑制，介导旁观者杀灭作用并且介导确定的人肿瘤的消退。举例来说，在表达CD19或表达BCMA的肿瘤的异质区内的低抗原肿瘤细胞可能易于被先前针对相邻抗原阳性癌细胞具有反应的CD19重定向或BCMA重定向的T细胞间接破坏。
在一个方面，本发明的人TFP修饰的T细胞可以是一类用于离体免疫的疫苗和/或哺乳动物的体内疗法。在一个方面，该哺乳动物是人。
就离体免疫来说，在将细胞施用给哺乳动物之前，以下至少一种情形在体外发生：i)细胞扩增；ii)将编码TFP的核酸引入细胞中；或iii)低温保存细胞。
离体程序是本领域中众所周知的并且在下文更完整地论述。简单点说，从哺乳动物(例如人)分离细胞并用表达本文所公开的TFP的载体进行基因修饰(即，在体外转导或转染)。可以将TFP修饰的细胞施用给哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人并且TFP修饰的细胞可以关于受体是自体的。或者，细胞可以关于受体是同种异体细胞、同基因细胞或异种细胞。
离体扩增造血干细胞和祖细胞的程序描述于以引用的方式并入本文中的美国专利号5,199,942中，该程序可以用于本发明的细胞。其它适合的方法是本领域中已知的，因此本发明不限于任何特定的离体细胞扩增方法。简单点说，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)通过采集外周血或骨髓外植体，从哺乳动物收集CD34+造血干细胞和祖细胞；及(2)离体扩增这些细胞。除美国专利号5,199,942中所描述的细胞生长因子外，还可以使用其它因子，如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配体培养并扩增细胞。
就离体免疫来说，除使用基于细胞的疫苗外，本发明还提供了用于体内免疫以引起针对患者体内抗原的免疫反应的组合物和方法。
一般来说，可以用如本文所述活化并扩增的细胞治疗和预防免疫受损的个体中发生的疾病。确切地说，使用本发明的TFP修饰的T细胞治疗与CD19或BCMA表达有关的疾病、病症和病况。在某些方面，使用本发明的细胞来治疗有发生与CD19或BCMA表达有关的疾病、病症和病况风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防与CD19或BCMA表达有关的疾病、病症和病况的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的TFP修饰的T细胞。
在一个方面，本发明的TFP-T细胞可以用于治疗增生性疾病如癌症或恶性疾病，或癌前病况如骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症，或白血病前期。在一个方面，癌症是血液癌症。在一个方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，本发明的TFP-T细胞可用于治疗癌症和恶性疾病，如但不限于，例如急性白血病，包括但不限于，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其它的血液癌症或血液病况，包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，即伴有无效产生骨髓血细胞(或发育不良)的一组不同的血液病症，等等。与CD19或BCMA表达有关的其它疾病包括但不限于，例如表达CD19或BCMA的非典型性和/或非经典癌症、恶性疾病、癌前病况或增生性疾病。与CD19或BCMA表达有关的非癌症相关适应症包括但不限于，例如自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎症性病症(过敏和哮喘)及移植。
本发明的TFP修饰的T细胞可以单独施用，或与稀释剂和/或与如IL-2或其它细胞因子或细胞群等其它组分组合以药物组合物形式施用。
血液癌症
血液癌症病况是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌症类型，如白血病和恶性淋巴增生性病况。
白血病可以分类为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步分类为急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。其它相关病况包括骨髓发育不良综合症(MDS，先前称为“白血病前期”)，这是伴有无效产生骨髓血细胞(或发育不良)的一组不同的血液病况并且有转化成AML的风险。
本发明提供了用于治疗癌症的组合物和方法。在一个方面，癌症是血液癌症，包括但不限于，血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，本发明的TFP-T细胞可用于治疗癌症和恶性疾病，如但不限于，例如急性白血病，包括但不限于，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；其它的血液癌症或血液病况，包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良和骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，即伴有无效产生骨髓血细胞(或发育不良)的一组不同的血液病症，等等。与CD19或BCMA表达有关的其它疾病包括但不限于，例如表达CD19或BCMA的非典型性和/或非经典癌症、恶性疾病、癌前病况或增生性疾病。
本发明还提供了用于抑制表达CD19或BCMA的细胞群的增殖或减少表达CD19或BCMA的细胞群的方法，这些方法包括使包含表达CD19或BCMA的细胞的细胞群与结合至该表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMA TFP-T细胞接触。在一个特定方面，本发明提供了用于抑制表达CD19或BCMA的癌细胞群的增殖或减少表达CD19或BCMA的癌细胞群的方法，这些方法包括使表达CD19或BCMA的癌细胞群与结合至该表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMA TFP-T细胞接触。在一个方面，本发明提供了用于抑制表达CD19或BCMA的癌细胞群的增殖或减少表达CD19或BCMA的癌细胞群的方法，这些方法包括使表达CD19或BCMA的癌细胞群与结合至该表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMATFP-T细胞接触。在某些方面，相对于阴性对照，本发明的抗CD19或抗BCMA TFP-T细胞使患有骨髓性白血病或与表达CD19或BCMA的细胞有关的另一癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。
本发明还提供了用于预防、治疗和/或管理与表达CD19或BCMA的细胞有关的疾病(例如表达CD19或BCMA的血液癌症或非典型性癌症)的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用结合至表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMA TFP-T细胞。在一个方面，受试者是人。与表达CD19或BCMA的细胞有关的病症的非限制性实例包括自身免疫性病症(如狼疮)、炎症性病症(如过敏和哮喘)及癌症(如表达CD19或BCMA的血液癌症或非典型性癌症)。
本发明还提供了用于预防、治疗和/或管理与表达CD19或BCMA的细胞有关的疾病的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用结合至表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMA TFP-T细胞。在一个方面，受试者是人。
本发明提供了用于预防与表达CD19或BCMA的细胞有关的癌症复发的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用结合至表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMATFP-T细胞。在一个方面，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的结合至表达CD19或BCMA的细胞的本发明的抗CD19或抗BCMA TFP-T细胞于有效量的另一疗法的组合。
组合疗法
本文所述的表达TFP的细胞可以与其它已知的药剂和疗法组合使用。如本文所使用，“组合”施用意味着在受试者患病过程期间，向该受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如在受试者被诊断患有病症之后且在该病症被治愈或消除或者出于其它原因停止治疗之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送在开始递送另一种治疗时仍然继续，由此在施用方面存在重叠。这在本文中有时称为“同时”或“共同递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前已结束。在任一情形的一些实施方案中，归于组合施用，治疗更有效。举例来说，相较于在无第一种治疗存在下施用第二种治疗时所见到的情形或利用第一种治疗所见到的类似状况，该第二种治疗更有效，例如利用较少第二种治疗见到等效作用，或第二种治疗在较大程度上减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状减轻程度，或与病症相关的其它参数高于在无另一种治疗存在下递送一种治疗所观察到的情形。这两种治疗的作用可以是部分加和、完全加和或超过加和作用的。该递送可以使得在递送第二种治疗时仍能检测到所递送的第一种治疗的作用。
在一些实施方案中，“至少一种额外治疗剂”包括表达TFP的细胞。还提供了表达多个TFP的T细胞，所述TFP结合至相同或不同靶抗原，或同一靶抗原上的相同或不同表位。还提供了T细胞群，其中第一T细胞亚群表达第一TFP，并且第二T细胞亚群表达第二TFP。
本文所述的表达TFP的细胞和该至少一种额外治疗剂可以呈相同或独立组合物形式同时或依序施用。对于依序施用，可以先施用本文所述的表达TFP的细胞，再施用该额外药剂，或施用次序可以颠倒。
在其它方面，本文所述的表达TFP的细胞可以与手术、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体，或其它免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、FK506、雷帕霉素、霉芬酸、类固醇、FR901228、细胞因子以及辐射、肽疫苗(如Izumoto等人,2008 J Neurosurg 108:963-971中所述)组合用于治疗方案中。
在一个实施方案中，可以向受试者施用减少或改善与施用表达TFP的细胞有关的副作用的药剂。与施用表达TFP的细胞有关的副作用包括但不限于细胞因子释放综合症(CRS)，以及噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，又称为巨噬细胞活化综合症(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。因此，本文所述的方法可以包括向受试者施用本文所述的表达TFP的细胞以及另外施用管理由表达TFP的细胞的治疗引起的可溶性因子水平升高的药剂。在一个实施方案中，受试者体内升高的可溶性因子是以下一种或多种：IFN-γ、TNFα、IL-2及IL-6。因此，被施用于治疗此副作用的药剂可以是中和一种或多种所述可溶性因子的药剂。这些药剂包括但不限于类固醇、TNFα抑制剂以及IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的一个实例是依那西普(entanercept)。IL-6抑制剂的一个实例是托珠单抗(tocilizumab，toc)。
在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达TFP的细胞的活性的药剂。举例来说，在一个实施方案中，该药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如程序性死亡因子1(PD1)，可以降低表达TFP的细胞产生免疫效应反应的能力。抑制性分子抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFRβ。通过例如在DNA、RNA或蛋白质水平上抑制来进行抑制性分子的抑制可以优化表达TFP的细胞的性能。在实施方案中，可以使用抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA来抑制表达TFP的细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，该抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，表达TFP的细胞内的抑制性分子受到抑制。在这些实施方案中，抑制这些抑制性分子的表达的dsRNA分子连接至编码TFP的组分，例如TFP的所有组分的核酸。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如结合至抑制性分子的抗体或抗体片段。举例来说，所述药剂可以是结合至PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如伊匹单抗(又称为MDX-010和MDX-101，并且以YervoyTM销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(Tremelimumab)(可购自Pfizer的IgG2单克隆抗体，先前称为替西木单抗(ticilimumab)、CP-675,206))。在一个实施方案中，该药剂是结合至TIM3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该药剂是结合至LAG3的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，增强表达TFP的细胞的活性的药剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中该第一结构域是抑制性分子或其片段，并且该第二结构域是与阳性信号缔合的多肽，例如包含如本文所述的细胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号缔合的多肽可以包括CD28、CD27、ICOS的共刺激性结构域，例如CD28、CD27和/或ICOS的细胞内信号传导结构域，和/或例如CD3ζ的初级信号传导结构域，例如本文所描述。在一个实施方案中，所述融合蛋白由与表达TFP相同的细胞表达。在另一实施方案中，该融合蛋白由不表达抗CD19 TFP的细胞，例如T细胞表达。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包含如本文所述的表达TFP的细胞，例如多个表达TFP的细胞，与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这些组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以通过适于待治疗(或待预防)疾病的方式施用。施用的量和频率将由如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素决定，不过适当剂量可以由临床试验确定。
在一个实施方案中，该药物组合物大体上不含，例如不存在可检测量的污染物，所述污染物例如选自由以下组成的组：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的涂有抗CD3/抗CD28的珠粒、小鼠抗体、汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌以及真菌。在一个实施方案中，细菌是选自由以下组成的组的至少一种：粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)以及A群化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，打算施用的本发明组合物的精确量可以由医师考虑个体年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的差异来决定。一般可以确定，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以按每千克体重104至109个细胞，在一些情形中每千克体重105至106个细胞，包括这些范围内的所有整数值在内的剂量施用。T细胞组合物还可以按这些剂量多次施用。这些细胞可以通过使用免疫疗法中通常所知的输注技术施用(参见例如，Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
在某些方面，可能希望向受试者施用活化T细胞，然后再抽血(或进行单采血液成分术)，根据本发明活化由此得到的T细胞，并且向患者回输这些活化并且扩增的T细胞。此方法可以每数周进行多次。在某些方面，可以使抽取的10cc至400cc血液中的T细胞活化。在某些方面，使抽取的20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc血液中的T细胞活化。
主题组合物的施用可以通过任何便利的方式进行，包括气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或经腹膜内施用给患者。在一个方面，本发明的T细胞组合物是通过皮内或皮下注射施用给患者。在一个方面，本发明的T细胞组合物是通过静脉内注射施用。T细胞组合物可以直接注射至肿瘤、淋巴结或注射部位中。
在一个特定的示例性方面中，受试者可能经历白细胞去除术，其中白细胞被收集，富集或离体耗尽，以选出和/或分离所关注细胞，例如T细胞。这些T细胞分离物可以通过本领域中已知的方法扩增并处理，由此可以引入一个或多个本发明的TFP构建体，从而产生本发明的表达TFP的T细胞。有需要的受试者随后可以经历用高剂量化学疗法进行的标准治疗，随后经历外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或同时，受试者接受扩增的本发明的TFP T细胞输注。在额外方面，扩增的细胞是在手术之前或之后施用。
打算施用给患者的以上治疗的剂量将随所治疗病况的确切性质以及治疗的接受者而变化。施用给人的剂量比例可以根据本领域公认的实践执行。举例来说，对于成年患者，CAMPATH的剂量一般在1至约100mg范围内，通常每天施用，持续在1与30天之间的时间。优选的日剂量是每天1至10mg，不过在一些情形中，每天可以使用多达40mg的较大剂量(如美国专利号6,120,766中所述)。
在一个实施方案中，使用例如体外转录将TFP引入T细胞中，并且受试者(例如人)接受本发明的TFP T细胞的初次施用，以及本发明的TFP T细胞的一次或多次后续施用，其中该一次或多次后续施用是在前一次施用之后不到15天，例如14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用超过一次本发明的TFP T细胞，例如每周施用2、3或4次本发明的TFP T细胞。在一个实施方案中，受试者(例如人受试者)每周施用超过一次TFP T细胞(例如每周施用2、3或4次)(在本文中又称为一个周期)，随后一周不施用TFP T细胞，并且然后向受试者再施用一次或多次TFP T细胞(例如每周施用超过一次TFP T细胞)。在另一实施方案中，受试者(例如人受试者)接受超过一个周期的TFP T细胞，并且每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用TFP T细胞，每周施用3次。在一个实施方案中，将本发明的TFP T细胞施用至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更长时间。
在一个方面，CD19 TFP T细胞是使用慢病毒载体，如慢病毒产生的。以此方式产生的TFP-T细胞将稳定表达TFP。
在一个方面，TFP T细胞在转导后短暂表达TFP载体达4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。TFP的短暂表达可以通过RNA TFP载体递送实现。在一个方面，通过电穿孔将TFP RNA转导至T细胞中。
使用短暂表达TFP的T细胞(特别是带有鼠类scFv的TFP T细胞)治疗患者可能引起的潜在问题是在多次治疗之后的过敏反应。
不受理论束缚，相信这种过敏反应可能是由患者产生体液抗TFP反应，即具有抗IgE同种型的抗TFP抗体引起。据悉，当有十至十四天暂停暴露于抗原时，患者的产抗体细胞经历从IgG同种型(不会引起过敏反应)向IgE同种型的类别转换。
如果患者在短暂TFP疗法(如通过RNA转导产生的那些)过程期间产生抗TFP抗体反应的风险较高，则TFP T细胞输注暂停不应持续超过十至十四天。
本发明提供了包括但不限于以下实施方式：
1.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
2.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
3.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
4.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
5.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
6.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗CD19结合结构域。
7.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗B细胞成熟抗原(BCMA)结合结构域。
8.根据实施方式6或7所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接。
9.根据实施方式6-8中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的抗原结合结构域通过连接子序列连接至所述TCR细胞外结构域。
11.根据实施方式10所述的分离的核酸分子，其中所述编码的连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。
12.根据实施方式1-11中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR细胞外结构域。
13.根据实施方式1-12中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR跨膜结构域。
14.根据实施方式1-13中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR细胞内结构域。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域，及(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少两个是来自同一TCR亚基。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含含刺激性结构域的TCR细胞内结构域，所述刺激性结构域选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域，或其中具有至少一个修饰的氨基酸序列。
17.根据实施方式1-16中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含含刺激性结构域的细胞内结构域，所述刺激性结构域选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域，或其中具有至少一个修饰的氨基酸序列。
18.根据实施方式1-17中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包括抗体片段。
19.根据实施方式1-18中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包括scFv或VH结构域。
20.根据实施方式1-19中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码(i)分别与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:29具有70-100％序列同一性的抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2及LC CDR3，和/或(ii)分别与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33及SEQ ID NO:35具有70-100％序列同一性的抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含在轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:49中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:49具有95-99％同一性的序列。
22.根据实施方式1-21中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码重链可变区，其中所述重链可变区包含在重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:51中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:51具有95-99％同一性的序列。
23.根据实施方式1-19中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码(i)分别与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:41具有70-100％序列同一性的抗BCMA轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2及LC CDR3，和/或(ii)分别与SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47具有70-100％序列同一性的抗BCMA重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
24.根据实施方式1-19及23中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含在轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:53中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:53具有95-99％同一性的序列。
25.根据实施方式1-19、23及24中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码重链可变区，其中所述重链可变区包含在重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:55中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:55具有95-99％同一性的序列。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP包含TCR亚基的细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
27.根据实施方式1-26中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
28.根据实施方式1-27中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
29.根据实施方式1-28中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含编码共刺激性结构域的序列。
30.根据实施方式29所述的分离的核酸分子，其中所述共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸修饰，或响应于配体结合至所述TFP而磷酸化的氨基酸修饰。
32.根据实施方式1-31中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子是mRNA。
33.根据实施方式1-32中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP包括TCR亚基的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，所述ITAM包括选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
34.根据实施方式33所述的分离的核酸分子，其中所述ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
35.根据实施方式33所述的分离的核酸分子，其中所述ITAM选自由以下组成的组：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基，并且替代选自由以下组成的组的不同ITAM：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。
36.根据实施方式1-35中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含核苷酸类似物。
37.根据实施方式36所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
38.根据实施方式1-37中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含前导序列。
39.一种分离的多肽分子，其由如实施方式1-38中任一项所述的核酸分子编码。
40.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。
41.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
42.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中。
43.根据实施方式40所述的分离的TFP分子，其包括含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的抗体或抗体片段。
44.根据实施方式40-43中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域是scFv或VH结构域。
45.根据实施方式40-44中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:51具有95-100％同一性的重链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
46.根据实施方式40-45中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有95-100％同一性的轻链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
47.根据实施方式40-46中任一项所述的分离的TFP分子，所述TFP分子包含TCR细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
48.根据实施方式40-47中任一项所述的分离的TFP分子，其中：
49.根据实施方式40-48中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至所述TCR细胞外结构域。
50.根据实施方式49所述的分离的TFP分子，其中所述连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
51.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。
52.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
53.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中。
54.根据实施方式53所述的分离的TFP分子，其包括含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的抗体或抗体片段。
55.根据实施方式51-54中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗BCMA结合结构域是scFv或VH结构域。
56.根据实施方式51-55中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗BCMA结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:55具有95-100％同一性的重链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
57.根据实施方式51-56中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗BCMA结合结构域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:53具有95-100％同一性的轻链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
58.根据实施方式51-57中任一项所述的分离的TFP分子，所述TFP分子包含TCR细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
59.根据实施方式51-58中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗BCMA结合结构域通过连接子序列连接至所述TCR细胞外结构域。
60.根据实施方式59所述的分离的TFP分子，其中所述连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
61.根据实施方式40-60中任一项所述的分离的TFP分子，其还包含编码共刺激性结构域的序列。
62.根据实施方式40-61中任一项所述的分离的TFP分子，其还包含编码细胞内信号传导结构域的序列。
63.根据实施方式40-62中任一项所述的分离的TFP分子，其还包含前导序列。
64.一种核酸，其包含编码根据实施方式40-63中任一项所述的TFP的序列。
65.根据实施方式64所述的核酸，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
66.根据实施方式64或65所述的核酸，其中所述核酸是mRNA。
67.根据实施方式64-66中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
68.根据实施方式67所述的核酸，其中所述核苷酸类似物选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
69.根据实施方式64-68中任一项所述的核酸，其还包含启动子。
70.根据实施方式64-69中任一项所述的核酸，其中所述核酸是在体外转录的核酸。
71.根据实施方式64-70中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码多聚腺苷酸尾的序列。
72.根据实施方式64-71中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含3’UTR序列。
73.一种载体，包含编码根据实施方式40-63中任一项所述的TFP的核酸分子。
74.根据实施方式73所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳氏肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。
75.根据实施方式73或74所述的载体，还包含启动子。
76.根据实施方式73-75中任一项所述的载体，其中所述载体是在体外转录的载体。
77.根据实施方式73-76中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含多聚腺苷酸尾。
78.根据实施方式73-77中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含3’UTR。
79.一种细胞，其包含根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子、根据实施方式39所述的多肽分子、根据实施方式40-63中任一项所述的TFP分子、根据实施方式64-72中任一项所述的核酸、根据实施方式73-78中任一项所述的载体。
80.根据实施方式79所述的细胞，其中所述细胞是人T细胞。
81.根据实施方式80所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+或CD4+T细胞。
82.根据实施方式79-81中任一项所述的细胞，其还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含抑制性分子的至少一部分的第一多肽以及含来自细胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽。
83.根据实施方式82所述的细胞，其中所述抑制性分子包含含PD1的至少一部分的第一多肽及含共刺激性结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
84.一种人CD8+或CD4+ T细胞，其包含至少两个TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗CD19或抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域，其中所述TFP分子能够与所述人CD8+或CD4+ T细胞中、表面处和/或所述表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
85.一种蛋白质复合物，其包含：
i)TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域；和
ii)至少一种内源性TCR亚基或内源性TCR复合物。
86.根据实施方式85所述的蛋白质复合物，其中所述TCR包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。
87.根据实施方式85或86所述的蛋白质复合物，其中所述抗CD19结合结构域通过连接子序列连接至所述TCR细胞外结构域。
88.根据实施方式87所述的蛋白质复合物，其中所述连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
89.一种蛋白质复合物，其包含：
(a)由根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子编码的TFP，和
(b)至少一种内源性TCR亚基或内源性TCR复合物。
90.一种蛋白质复合物，其包含：
i)TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域；和
ii)至少一种内源性TCR亚基或内源性TCR复合物。
91.根据实施方式90所述的蛋白质复合物，其中所述TCR包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。
92.根据实施方式90或91所述的蛋白质复合物，其中所述抗BCMA结合结构域通过连接子序列连接至所述TCR细胞外结构域。
93.根据实施方式92所述的蛋白质复合物，其中所述连接子区包括(G4S)n，其中n＝1至4。
94.一种人CD8+或CD4+ T细胞，其包含每一根据实施方式85-93中任一项所述的蛋白质复合物至少两种不同的TFP蛋白质。
95.一种人CD8+或CD4+ T细胞，其包含至少两个不同的由根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子编码的TFP分子。
96.一种人CD8+或CD4+ T细胞群，其中所述群的T细胞个别地或共同地包含至少两个TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗CD19或抗BCMA结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域，其中所述TFP分子能够与所述人CD8+或CD4+ T细胞中、表面处和/或所述表面上的内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
97.一种人CD8+或CD4+ T细胞群，其中所述群的T细胞个别地或共同地包含至少两个由根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子编码的TFP分子。
98.一种制备细胞的方法，所述方法包括用根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子、根据实施方式64-72中任一项所述的核酸或根据实施方式73-78中任一项所述的载体转导T细胞。
99.一种产生RNA工程改造的细胞群的方法，所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞中，其中所述RNA包括编码根据实施方式40-63中任一项所述的TFP分子的核酸。
100.一种在哺乳动物体内提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子、根据实施方式39所述的多肽分子、表达根据实施方式39所述的多肽分子的细胞、根据实施方式40-63中任一项所述的TFP分子、根据实施方式64-72中任一项所述的核酸、根据实施方式73-78中任一项所述的载体或根据实施方式79-84及94-98中任一项所述的细胞。
101.根据实施方式100所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
102.根据实施方式100所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
103.根据实施方式100-102中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
104.一种治疗患有与CD19或BCMA表达有关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子、根据实施方式39所述的多肽分子、表达根据实施方式39所述的多肽分子的细胞、根据实施方式40-63中任一项所述的TFP分子、根据实施方式64-72中任一项所述的核酸、根据实施方式73-78中任一项所述的载体或根据实施方式79-84及94-98中任一项所述的细胞。
105.根据实施方式104所述的方法，其中所述与CD19或BCMA表达有关的疾病选自由以下组成的组：增生性疾病、癌症、恶性疾病、骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症、白血病前期、与CD19表达有关的非癌症相关适应症。
106.根据实施方式104所述的方法，其中所述疾病是选自由以下组成的组的血液癌症：B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)；慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞-滤泡性淋巴瘤、大细胞-滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、骨髓发育不良综合症、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、威尔姆氏巨球蛋白血症、白血病前期、与CD19或BCMA表达有关的疾病，及其组合。
107.根据实施方式104所述的方法，其中所述表达TFP分子的细胞和增加表达TFP分子的细胞的功效的药剂组合施用。
108.根据实施方式104-107中任一项所述的方法，其中相较于施用有效量表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)或抗BCMA CAR的T细胞的哺乳动物，所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
109.根据实施方式104-108中任一项所述的方法，其中所述表达TFP分子的细胞和改善与施用表达TFP分子的细胞有关的一种或多种副作用的药剂组合施用。
110.根据实施方式104-109中任一项所述的方法，其中所述表达TFP分子的细胞和治疗所述与CD19或BCMA相关的疾病的药剂组合施用。
111.根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子、根据实施方式39所述的分离的多肽分子、表达根据实施方式39所述的多肽分子的细胞、根据实施方式40-63中任一项所述的分离的TFP分子、根据实施方式64-72中任一项所述的核酸、根据实施方式73-78中任一项所述的载体、根据实施方式85-93中任一项所述的复合物，或根据实施方式79-84及94-98中任一项所述的细胞，其用作药物。
112.一种治疗患有与CD19或BCMA表达有关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的根据实施方式1-38中任一项所述的分离的核酸分子、根据实施方式39所述的多肽分子、表达根据实施方式39所述的多肽分子的细胞、根据实施方式40-63中任一项所述的TFP分子、根据实施方式64-72中任一项所述的核酸、根据实施方式73-78中任一项所述的载体或根据实施方式79-84及94-98中任一项所述的细胞，其中相较于施用有效量表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)或抗BCMA CAR的T细胞的哺乳动物，所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
实施例
参照以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另外具体说明，否则这些实施例只是出于说明的目的提供，并且不打算作限制。因此，本发明不应当以任何方式解释为局限于以下实施例，而是应当解释为涵盖由于本文所提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。不作进一步描述，相信本领域的普通技术人员可以使用前述描述和以下说明性实施例，制备和利用本发明的化合物并实践所要求的方法。以下操作实施例具体地指出了本发明的各种方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余内容。
实施例1：TFP构建体
通过将利用编码短连接子(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:5)或长连接子(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:6)的DNA序列连接至CD3或TCR DNA片段的抗CD19 scFv DNA片段克隆至p510载体((System Biosciences(SBI))中XbaI和EcoR1位点处，来工程改造抗CD19 TFP构建体。
产生的抗CD19 TRuC构建体是p510_抗CD19_LL_TCRα(抗CD19scFv–长连接子-人全长T细胞受体α链)、p510_抗CD19_LL_TCRαC(抗CD19 scFv–长连接子-人T细胞受体α恒定结构域链)、p510_抗CD19_LL_TCRβ(抗CD19 scFv–长连接子-人全长T细胞受体β链)、p510_抗CD19_LL_TCRβC(抗CD19 scFv–长连接子-人T细胞受体β恒定结构域链)、p510_抗CD19_LL_CD3γ(抗CD19 scFv–长连接子-人CD3γ链)、p510_抗CD19_LL_CD3δ(抗CD19 scFv–长连接子-人CD3δ链)、p510_抗CD19_LL_CD3ε(抗CD19 scFv–长连接子-人CD3ε链)、p510_抗CD19_SL_TCRβ(抗CD19 scFv–短连接子-人全长T细胞受体β链)、p510_抗CD19_SL_CD3γ(抗CD19scFv–短连接子-人CD3γ链)、p510_抗CD19_SL_CD3δ(抗CD19 scFv–短连接子-人CD3δ链)、p510_抗CD19_SL_CD3ε(抗CD19 scFv–短连接子-人CD3ε链)。
通过将编码抗CD19、部分CD28细胞外结构域、CD28跨膜结构域、CD28细胞内结构域及CD3ζ的合成DNA克隆至p510载体的XbaI和EcoR1位点处来产生抗CD19 CAR构建体p510_抗CD19_28ζ。
通过将利用编码连接子：GGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:7)的DNA序列连接至CD3DNA片段的抗BCMA scFv DNA片段克隆至p510载体(SBI)的XbaI和EcoR1位点来工程改造抗BCMA TFP构建体。所产生单抗BCMA TFP构建体是p510_抗BCMA_CD3γ(抗BCMA scFv–连接子-人CD3γ链)和p510_抗BCMA_CD3ε(抗BCMA scFv–连接子-人CD3ε链)。
合成全长BCMA并克隆至p514(SBI)的BamHI和NheI位点以产生构建体p514_BCMA，用于产生稳定靶细胞系。
通过将利用编码连接子：GGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:7)的DNA序列连接至CD3DNA片段的抗FAP或抗CAIX scFv DNA片段克隆至p510载体(SBI)的XbaI和EcoR1位点来工程改造抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)和抗碳酸酐酶-9(CAIX)TFP构建体。可以产生的抗FAP或抗CAIXTFP构建体包括p510_抗FAP_CD3γ(抗FAP scFv–连接子-人CD3γ链)和p510_抗FAP_CD3ε(抗FAP scFv–连接子-人CD3ε链)以及p510_抗CAIX_CD3γ(抗CAIX scFv–连接子-人CD3γ链)和p510_抗CAIX_CD3ε(抗CAIX scFv–连接子-人CD3ε链)。
可以合成全长FAP和CAIX并克隆至p514(SBI)的BamHI和NheI位点以产生构建体p514_FAP和p514_CAIX，这些构建体可以用于产生稳定靶细胞系。
示例性构建体序列显示于下：
构建体序列
靶构建体
P514_BCMA(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0003465582640001041
Figure BDA0003465582640001051
Figure BDA0003465582640001061
Figure BDA0003465582640001071
CAR构建体
p510_抗CD19_28z(SEQ ID NO:9)
Figure BDA0003465582640001072
Figure BDA0003465582640001081
Figure BDA0003465582640001091
p526A_19BBZ(SEQ ID NO:10)
Figure BDA0003465582640001092
Figure BDA0003465582640001101
Figure BDA0003465582640001111
Figure BDA0003465582640001121
TFP(TRuC)构建体
p510_抗CD19_LL_TCRα(SEQ ID NO:11)
Figure BDA0003465582640001122
Figure BDA0003465582640001131
Figure BDA0003465582640001141
p510_抗CD19_LL_TCRαC(SEQ ID NO:12)
Figure BDA0003465582640001142
Figure BDA0003465582640001151
Figure BDA0003465582640001161
Figure BDA0003465582640001171
p510_抗CD19_LL_TCRβ(SEQ ID NO:13)
Figure BDA0003465582640001172
Figure BDA0003465582640001181
Figure BDA0003465582640001191
p510_抗CD19_LL_TCRβC(SEQ ID NO:14)
Figure BDA0003465582640001192
Figure BDA0003465582640001201
Figure BDA0003465582640001211
Figure BDA0003465582640001221
p510_抗CD19_LL_CD3γ(SEQ ID NO:15)
Figure BDA0003465582640001222
Figure BDA0003465582640001231
Figure BDA0003465582640001241
p510_抗CD19_LL_CD3δ(SEQ ID NO:16)
Figure BDA0003465582640001242
Figure BDA0003465582640001251
Figure BDA0003465582640001261
Figure BDA0003465582640001271
p510_抗CD19_LL_CD3ε(SEQ ID NO:17)
Figure BDA0003465582640001272
Figure BDA0003465582640001281
Figure BDA0003465582640001291
p510_抗CD19_SL_CD3ε(SEQ ID NO:18)
Figure BDA0003465582640001292
Figure BDA0003465582640001301
Figure BDA0003465582640001311
Figure BDA0003465582640001321
p510_抗CD19_SL_CD3γ(SEQ ID NO:19)
Figure BDA0003465582640001322
Figure BDA0003465582640001331
Figure BDA0003465582640001341
p510_抗CD19_SL_CD3δ(SEQ ID NO:20)
Figure BDA0003465582640001342
Figure BDA0003465582640001351
Figure BDA0003465582640001361
Figure BDA0003465582640001371
p510_抗CD19_SL_TCRβ(SEQ ID NO:21)
Figure BDA0003465582640001372
Figure BDA0003465582640001381
Figure BDA0003465582640001391
p510_抗BCMA_CD3ε(SEQ ID NO:22)
Figure BDA0003465582640001392
Figure BDA0003465582640001401
Figure BDA0003465582640001411
Figure BDA0003465582640001421
p510_抗BCMA_CD3γ(SEQ ID NO:23)
Figure BDA0003465582640001422
Figure BDA0003465582640001431
Figure BDA0003465582640001441
实施例2：抗体序列
产生抗体序列
人CD19多肽规范序列是UniProt登录号P15391(或P15391-1)。人BCMA多肽规范序列是UniProt登录号Q02223(或Q02223-1)。提供了能够特异性结合至人CD19多肽或人BCMA多肽或人FAP多肽或人BCMA多肽，及其片段或结构域的抗体多肽。抗CD19抗体、抗FAP抗体、抗CAIX抗体以及抗BCMA抗体可以使用多种技术产生(参见例如，Nicholson等人,1997)。当使用鼠类抗CD19抗体、抗FAP抗体、抗CAIX抗体或抗BCMA抗体作为起始物质时，对于临床环境来说，需要对鼠类抗CD19抗体、抗FAP抗体、抗CAIX抗体或抗BCMA抗体进行人源化，其中鼠类特异性残基可以在接受T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)治疗，即用TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA构建体转导的T细胞进行的治疗的受试者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)反应。通过将来自鼠类抗CD19抗体、抗FAP抗体、抗CAIX抗体或抗BCMA抗体的CDR区移植到适当人种系受体框架上，任选地包括针对CDR和/或框架区的其它修饰，来实现人源化。如本文所提供，抗体和抗体片段残基编号遵循Kabat(Kabat E.A.等人,1991；Chothia等人,1987)。
产生scFv
使用人或人源化抗CD19 IgG、抗FAP IgG、抗CAIX IgG或抗BCMA IgG产生TFP构建体的scFv序列。获得编码人或人源化VL和VH结构域的DNA序列，并任选地针对在来自智人的细胞中表达来优化这些构建体的密码子。scFv中VL和VH结构域出现的次序是不同的(即，VL-VH或VH-VL取向)，并且三个“G4S”或“G4S”亚基拷贝(G4S)3连接可变结构域以产生scFv结构域。抗CD19 scFv、抗FAP scFv、抗CAIX scFv以及抗BCMA scFv质粒构建体可以具有任选的Flag、His或其它亲和标签，并且通过电穿孔放入HEK293或其它适合的人或哺乳动物细胞系中，并经历纯化。验证测定包括通过FACS进行的结合分析、使用Proteon的动力学分析以及对表达CD19的细胞的染色。
VL和VH结构域的示例性抗CD19或抗BCMA CDR及编码其的核苷酸序列分别显示于下：
抗CD19
抗CD19轻链CDR1
编码序列：AGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAA(SEQ ID NO:24)。
氨基酸序列：RASQDISK(SEQ ID NO:25)。
抗CD19轻链CDR2
编码序列：ATCTACCATACATCAAGATTA(SEQ ID NO:26)。
氨基酸序列：IYHTSRL(SEQ ID NO:27)。
抗CD19轻链CDR3
编码序列：CAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACG(SEQ ID NO:28)。
氨基酸序列：QQGNTLPYT(SEQ ID NO:29)。
抗CD19重链CDR1
编码序列：GGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGC(SEQ ID NO:30)。
氨基酸序列：GVSLPDYGVS(SEQ ID NO:31)。
抗CD19重链CDR2
编码序列：GTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTC(SEQ ID NO:32)。
氨基酸序列：VIWGSETTYYNSAL(SEQ ID NO:33)。
抗CD19重链CDR3
编码序列：CATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTAC(SEQ ID NO:34)。
氨基酸序列：HYYYGGSYAMDY(SEQ ID NO:35)。
抗BCMA
抗BCMA轻链CDR1
编码序列：AAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCAT(SEQ ID NO:36)。
氨基酸序列：KSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:37)。
抗BCMA轻链CDR2
编码序列：AAAGTGAGCAACCGCTTTAGC(SEQ ID NO:38)。
氨基酸序列：KVSNRFS(SEQ ID NO:39)。
抗BCMA轻链CDR3
编码序列：GCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACC(SEQ ID NO:40)
氨基酸序列：AETSHVPWT(SEQ ID NO:41)。
抗BCMA重链CDR1
编码序列：AAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAAC(SEQ ID NO:42)。
氨基酸序列：KASGYSFPDYYIN(SEQ ID NO:43)。
抗BCMA重链CDR2
编码序列：TGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGC(SEQ IDNO:44)。
氨基酸序列：WIYFASGNSEYNQKFTG(SEQ ID NO:45)。
抗BCMA重链CDR3
编码序列：CTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTG(SEQ ID NO:46)。
氨基酸序列：LYDYDWYFDV(SEQ ID NO:47)。
抗CD19轻链可变区
编码序列：
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACA(SEQ ID NO:48)。
氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO:49)。
抗CD19重链可变区
编码序列：
GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:50)。
氨基酸序列：
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:51)。
抗BCMA轻链可变区
编码序列：
GATATTGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCCTGAGCGTGACCCCGGGCGAACCGGCGAGCATTAGCTGCAAAAGCAGCCAGAGCCTGGTGCATAGCAACGGCAACACCTATCTGCATTGGTATCTGCAGAAACCGGGCCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATAAAGTGAGCAACCGCTTTAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCGCGGATTTTACCCTGAAAATTAGCCGCGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCGTGTATTATTGCGCGGAAACCAGCCATGTGCCGTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAAAGC(SEQ ID NO:52)。
氨基酸序列：
DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIKS(SEQ ID NO:53)。
抗BCMA重链可变区
编码序列：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAGCTTTCCGGATTATTATATTAACTGGGTGCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATTTATTTTGCGAGCGGCAACAGCGAATATAACCAGAAATTTACCGGCCGCGTGACCATGACCCGCGATACCAGCAGCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACCGCGGTGTATTTTTGCGCGAGCCTGTATGATTATGATTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGC(SEQ ID NO:54)。
氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:55)。
TCR亚基的来源
人T细胞受体(TCR)复合物的亚基都含有细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。人TCR复合物含有CD3-ε多肽、CD3-γ多肽、CD3-δ多肽、CD3-ζ多肽、TCRα链多肽及TCRβ链多肽。人CD3-ε多肽规范序列是Uniprot登录号P07766。人CD3-γ多肽规范序列是Uniprot登录号P09693。人CD3-δ多肽规范序列是Uniprot登录号P043234。人CD3-ζ多肽规范序列是Uniprot登录号P20963。人TCRα链规范序列是Uniprot登录号Q6ISU1。人TCRβ链C区规范序列是Uniprot登录号P01850，人TCRβ链V区序列是P04435。
人CD3-ε多肽规范序列是MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:56)。
人CD3-γ多肽规范序列是：MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:57)。
人CD3-δ多肽规范序列是：MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO:58)。
人CD3-ζ多肽规范序列是：MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:59)。
人TCRα链规范序列是：MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA(SEQ ID NO:60)。
人TCRα链C区规范序列是：PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:61)。
人TCRα链V区CTL-L17规范序列是：MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(SEQ ID NO:62)。
人TCRβ链C区规范序列是：EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:63)。
人TCRβ链V区CTL-L17规范序列是：MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(SEQ ID NO:64)。
人TCRβ链V区YT35规范序列是：MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(SEQ ID NO:65)。
示例性抗BCMA重链序列是：
由TCR结构域和scFv产生TFP
使用连接子序列，如G4S、(G4S)2、(G4S)3或(G4S)4，将CD19或BCMA scFv重组连接至CD3-ε或其它TCR亚基(参见1C)。利用了各种连接子和scFv构型。TCRα和TCRβ链被用于产生TFP的全长多肽或仅其恒定结构域。TCRα和TCRβ链的任何可变序列都能用于制备TFP。
TFP表达载体
提供的表达载体包括：启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、起始分泌的信号序列、多聚腺苷酸化信号及转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许游离型复制和在原核生物中复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域中已知的其它元件)以及允许选择的元件(氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因和博莱霉素(zeocin)标志物)。
优选地，将编码TFP的核酸构建体克隆至慢病毒表达载体中，并基于TFP.CD19转导的T细胞(“CD19.TFP”或“CD19.TFP T细胞”或“TFP.CD19”或“TFP.CD19 T细胞”)响应于CD19+靶细胞、TFP.FAP转导的T细胞(“FAP.TFP”或“FAP.TFP T细胞”或“TFP.FAP”或“TFP.FAP T细胞”)响应于FAP+靶细胞、TFP.CAIX转导的T细胞(“CAIX.TFP”或“CAIX.TFP T细胞”或“TFP.CAIX”或“TFP.CAIX T细胞”)响应CAIX+靶细胞，或TFP.BCMA转导的T细胞(“BCMA.TFP”或“BCMA.TFP T细胞”或“TFP.BCMA”或“TFP.BCMA T细胞”)响应于BCMA+靶细胞的效应T细胞反应的数量和质量来验证表达。效应T细胞反应包括但不限于，细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生以及靶细胞溶解或细胞溶解活性(即，脱粒)。
使用TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA慢病毒转移载体产生包装于VSVg假型慢病毒粒子中的基因材料。将慢病毒转移载体DNA与VSVg、gag/pol和rev三种包装组分以及脂转染胺试剂混合以将其一起转移至293细胞中。24和48小时后，收集培养基，过滤并通过超速离心来浓缩。所得病毒制剂在-80C下储存。通过对SupT1细胞进行滴定来测定转导单元的数量。通过用抗CD3×抗CD28珠粒活化新鲜的原生T细胞24小时，然后添加适当数量的转导单元以获得所希望百分比的转导T细胞，由此产生重定向的TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞。使这些修饰过的T细胞扩增，直到这些细胞休止并且大小减小，此时将其低温保存以待分析。使用coulter multisizer III测量细胞数量和大小。在低温保存之前，利用流式细胞术分析来测定转导的细胞(在细胞表面上表达TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA的细胞)的百分比以及其表达的相对荧光强度。根据柱形图，通过比较转导的百分比与其相对荧光强度来检查TFP的相对表达水平。
在一些实施方案中，通过用多种病毒载体转导T细胞来引入多个TFP。
评价人源化TFP重定向T细胞的细胞溶解活性、增殖能力及细胞因子分泌
使用本领域中已知的测定法测定TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞产生细胞表面表达的TFP以及杀灭靶肿瘤细胞的功能能力。
用人白细胞介素2(IL-2)处理人PBMC(例如，来自正常进行单采血液成分的供体的血液，该供体的原生T细胞是通过针对T细胞、CD4+和CD8+淋巴细胞进行阴性选择来获得)，然后在37℃和5％CO2下，例如在10％RPMI中用抗CD3×抗CD28珠粒活化，随后用编码TFP的慢病毒载体转导。利用流式细胞术测定法，如利用抗FLAG抗体或抗鼠类可变结构域抗体确定细胞表面TFP的存在。使用ELISA或其它测定法测量细胞因子(例如IFN-γ)的产生。
实施例3：在人ALL小鼠模型中TFP T细胞的功效
可以使原代人ALL细胞在免疫受损的小鼠(例如NSG或NOD小鼠)中生长，不必在体外对其进行培养。同样，培养的人ALL细胞系可以在这些小鼠中诱发白血病。可以使用患有ALL的小鼠，例如在HALLX5447模型中测试人TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞的功效。此模型中的读出是在存在和不存在静脉内(i.v.)施用的人TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞下在静脉内输注ALL细胞之后小鼠的存活率。
实施例4：在体内实体肿瘤异种移植小鼠模型中进行的人TFP T细胞治疗
还可以在带有来源于表达人CD19或BCMA的ALL、CLL或NHL人细胞系的皮下实体肿瘤的免疫受损的小鼠模型中测试人TFP.CD19或TFP.BCMA T细胞的功效。可以通过测径规测量肿瘤大小，或通过跟踪表达GFP的肿瘤细胞发射的GFP荧光信号的强度，来评估响应于人TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞治疗的肿瘤缩小情况。
可以使原代人实体肿瘤细胞在免疫受损的小鼠中生长，不必在体外对其进行培养。示例性实体肿瘤细胞包括如The Cancer Genome Atlas(TCGA)和/或Broad CancerCell Line Encyclopedia(CCLE，参见Barretina等人,Nature 483:603(2012))中所提供的实体肿瘤细胞系。示例性实体癌症细胞包括从肾细胞癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、子宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌或胃癌分离的原代肿瘤细胞。在人肿瘤异种移植模型中，可以使用这些小鼠来测试TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞的功效(参见例如，Morton等人,Nat.Procol.2:247(2007))。在通过皮下植入或注射1×106-1×107个原代细胞(胶原蛋白酶处理的肿块于EC基质材料中的悬浮液)或肿瘤片段(在EC基质材料中的原发性肿瘤片段)之后，在开始治疗之前，使肿瘤生长至200-500mm3。
实施例5：多重TFP多肽的说明以及多重人源化TFP重定向T细胞的用途
本文所提供的TFP多肽能够与内源性TCR亚基多肽功能性缔合，形成功能性TCR复合物。此处，为了产生功能性、多重重组TCR复合物，使用了慢病毒载体中的多个TFP来转导T细胞。举例来说，提供T细胞，该T细胞含有i)具有来自CD3δ多肽的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，以及CD19、FAP、CAIX或BCMA特异性scFv抗体片段的第一TFP；及ii)具有来自CD3γ多肽的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，以及CD19、FAP、CAIX或BCMA特异性抗体片段的第二TFP。第一TFP和第二TFP能够彼此相互作用并且与内源性TCR亚基多肽相互作用，由此形成功能性TCR复合物。
如以上实施例2和3中所提供，展现这些多重人源化TFP.CD19、TFP.FAP、TFP.CAIX或TFP.BCMA T细胞在液体和实体肿瘤中的用途。
实施例6：TFP转导的T细胞的制备
慢病毒产生
编码适当构建体的慢病毒制备如下。将5×106个HEK293FT细胞接种于100mm培养皿中并使其达到70-90％汇合过夜。在0.5mL无血清DMEM或Opti-MEM I培养基中稀释2.5μg指定DNA质粒和20μL慢病毒包装混合液(ALSTEM，目录号VP100；参见附录B3)并轻柔地混合。在一个独立试管中，在0.5mL无血清DMEM或Opti-MEM I培养基中稀释30μL NanoFect转染试剂(ALSTEM，目录号NF100)并轻柔地混合。然后，将NanoFect/DMEM和DNA/DMEM溶液混合在一起并涡旋10-15秒，随后在室温下孵育DMEM-质粒-NanoFect混合物15分钟。将来自前一步骤的完全转染复合物逐滴添加至细胞板中并摇动以使转染复合物均匀地分散于该板中。然后，在含5％CO2的潮湿恒温箱中，在37℃下孵育该板过夜。次日，用10mL新鲜培养基更换上清液并补充20μL ViralBoost(500x，ALSTEM，目录号VB100)。然后，在37℃下再孵育该板24小时。接着，将含慢病毒的上清液收集至50mL带盖的无菌锥形离心管中并放在冰上。在4℃下以3000rpm离心15分钟之后，用低蛋白质结合0.45μm无菌过滤器过滤澄清上清液，并且随后通过在4℃下以25,000rpm超速离心(Beckmann,L8-70M)1.5小时来分离病毒。取出沉淀并将其再悬浮于DMEM培养基中，并使用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒(Clontech；目录号631235)，通过定量RT-PCR确定慢病毒浓度/滴度。通过用DNA酶I处理来去除任何残留的质粒DNA。病毒储备制剂被立即用于感染或被等分并在-80℃下储存待用。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
PBMC分离
由全血或血沉棕黄层制备外周血单核细胞(PBMC)。将全血收集于10mL肝素真空采血管(vacutainer)中并且立即处理或在4℃下储存。在50mL锥形离心管中，约10mL抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)缓冲液混合，总体积是20mL(PBS，pH 7.4，不含Ca2+/Mg2 +)。然后，将20mL此血液/PBS混合物轻柔地涂铺至15mL Ficoll-Paque PLUS(GEHealthcare,17-1440-03)的表面上，随后在室温下在无制动情况下以400g离心30-40分钟。
血沉棕黄层是购自Research Blood Components(Boston,MA)。通过添加15mLFicoll-Paque(GE Health Care)来准备Leucosep管(Greiner bio-one)并以1000g离心1分钟。将血沉棕黄层在PBS(pH 7.4，不含Ca2+ or Mg2+)中以1:3稀释。将稀释的血沉棕黄层转移至Leucosep管中并在无制动情况下以1000g离心15分钟。小心地取出接种于稀释的血浆/Ficoll界面处的含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层以使Ficoll引起的污染减到最少。然后，通过用40mL PBS洗涤PBMC三次，随后在室温下以200g离心10分钟来去除残留的Ficoll、血小板及血浆蛋白。然后，用血细胞计数器对细胞计数。用CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)，含5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts,Woodland,CA)、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素)将经过洗涤的PBMC洗涤一次。或者，将经过洗涤的PBMC转移至隔离小瓶中并在-80℃下冷冻24小时，随后储存于液氮中待用。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
T细胞活化
用抗人CD28和CD3抗体偶联的磁珠刺激由全血或血沉棕黄层制备的外周血单核细胞(PBMC)，保持24小时，随后进行病毒转导。在不含huIL-2的CAR-T培养基(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)，含5％AB血清和1.25μg/mL两性霉素B(Gemini Bioproducts)、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素)中洗涤新鲜分离的PBMC一次，随后将其以1×106个细胞/毫升的最终浓度再悬浮于含300IU/mL人IL-2(来自1000×储备液；Invitrogen)的CAR-T培养基中。如果先前已冷冻PBMC，则将其解冻并在10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素存在下，以1×107个细胞/毫升再悬浮于9mL预先加温(37℃)的cDMEM培养基(LifeTechnologies)中，浓度是1×106个细胞/毫升，随后如上所述，在CART培养基中洗涤一次，以1×106个细胞/毫升再悬浮于CAR-T培养基中，并且添加IL-2。
在活化之前，用1mL无菌1×PBS(pH7.4)洗涤抗人CD28和CD3抗体偶联的磁珠(Invitrogen)三次，使用磁力架将珠粒从溶液分离，随后再悬浮于含300IU/mL人IL-2的CAR-T培养基中，达到4×107个珠粒/毫升的最终浓度。然后通过将25μL(1×106个珠粒)珠粒转移至1mL PBMC中，以1:1珠粒比细胞比率混合PBMC和珠粒。然后，将所希望数量的等分试样分配于12孔低吸附或非处理细胞培养板的各个孔中，并在37℃和5％CO2下孵育24小时，随后进行病毒转导。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
T细胞转导/转染和扩增
活化后，在37℃和5％CO2下孵育PBMC细胞24小时。在冰上使慢病毒解冻，并将5×106个慢病毒以及每毫升培养基2μL Transplus(Alstem)(最终稀释度是1:500)添加至含1×106个细胞的每个孔中。将细胞再孵育24小时，随后重复添加病毒。或者，在冰上使慢病毒解冻，并在5μg/mL Polybrene(Sigma)存在下，添加5或50MOI的对应病毒。在室温下，以100g低速离心病毒接种细胞，保持100分钟。然后使细胞在300IU/mL人IL-2持续存在下生长6-14天时间(总孵育时间取决于所需CAR-T细胞的最终数量)。每2-3天分析细胞浓度，并且在该时间添加培养基以维持1×106个细胞/毫升的细胞悬浮液。
在一些情形中，通过电穿孔将体外转录(IVT)的mRNA放入活化的PBMC中(图14)。在300IU/ml重组人IL-2(R&D System)存在下，用Dyna珠粒(ThermoFisher)以1比1比率刺激人PBMC，保持3天。在电穿孔之前，取出珠粒。洗涤细胞并将其以2.5×107个细胞/毫升的浓度再悬浮于OPTI-MEM培养基(ThermoFisher)中。将200μL细胞悬浮液(5×106个细胞)转移至2mm间隙的Electroporation Cuvettes PlusTM(Harvard Apparatus BTX)中并在冰上预冷却。将10μg IVT TFP mRNA添加至细胞悬浮液中。然后，使用ECM830 Electro Square WavePorator(Harvard Apparatus BTX)，在200V下电穿孔放入mRNA/细胞混合物，保持20毫秒。在电穿孔之后，立即将细胞转移至新鲜细胞培养基(AIM V AlbuMAX(BSA)无血清培养基+5％人AB血清+300IU/ml IL-2)中并在37℃下孵育。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
通过细胞染色验证TFP表达
在慢病毒转导或mRNA电穿孔之后，通过流式细胞术，使用抗小鼠Fab抗体检测鼠类抗CD19、抗FAP、抗CAIX或抗BCMA scFv来确定抗CD19、抗FAP、抗CAIX以及抗BCMA CAR和TFP的表达。在3mL染色缓冲液(PBS,4％BSA)中洗涤T细胞三次，并将其以1×106个细胞/孔再悬浮于PBS中。为去除死细胞，将细胞与Live dead aqua(Invitrogen)一起在冰上孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次并将其再悬浮于50μL染色缓冲液中。为阻断Fc受体，将1μL 1:100稀释的标准山羊IgG(LifeTechnologies)添加至每个管中并在冰中孵育10分钟。将1.0mLFACS缓冲液添加至各管中，充分混合并通过以300g离心5分钟使细胞沉淀。通过生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(Life Technologies)，并以生物素标记的标准多克隆山羊IgG抗体(Life Technologies)用作同种型对照来检测scFv TFP的表面表达。以10μg/mL添加两种抗体，反应体积是100μL。然后，细胞在4℃下孵育45分钟，洗涤一次，将其再悬浮于FACS缓冲液中，并通过向各管中添加100μL1:1000稀释的标准小鼠IgG，用标准小鼠IgG(Invitrogen)阻断。接着，细胞在冰上孵育10分钟，用染色缓冲液洗涤，并在再悬浮于100μL染色缓冲液中。然后，通过添加1.0μL藻红素(PE)标记的抗生蛋白链菌素(BD Biosciences)对细胞染色，并向各管中添加APC抗人CD3抗体(Clone-UCHT1,BD Biosciences)、PerCP/Cy5.5抗人CD8抗体(Clone-SK1,BD Biosciences)及太平洋蓝抗人CD4抗体(Clone-RPA-T4,BD Biosciences)。使用LSRFortessaTM X20(BD Biosciences)进行流式细胞术并使用FACSdiva软件采集数据，并用FlowJo(Treestar,Inc.Ashland,OR)进行分析。介于20％与40％之间的转导的T细胞表达抗CD19 CAR、抗CD19 LL TFP、抗CD19 SL TFP或抗BCMA TFP，表明CAR和TFP构建体的转导和表面表达水平相当(图5-7)。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
实施例7：通过流式细胞术进行细胞毒性测定
用荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记对相应CD19、FAP、CAIX或BCMA靶呈阳性或阴性的靶细胞。将这些靶细胞与未被转导、被对照CAR-T构建体转导或被TFP转导的效应T细胞混合。在指定孵育时间之后，通过流式细胞术测定各效应细胞/靶细胞培养物中死CFSE标记靶细胞相对于活CFSE标记靶细胞和阴性对照靶细胞的百分比。计算相对于仅含靶细胞的孔，各T细胞+靶细胞培养物中靶细胞存活率百分比。
通过在共孵育效应细胞和靶细胞之后，使用流式细胞术比较不存在或存在效应T细胞下靶细胞中存活靶细胞的数量，来测量效应T细胞的细胞毒性活性。在用CD19 TFP或CAR-T细胞进行的实验中，靶细胞是CD19阳性Raji伯基特氏淋巴瘤细胞(ATCC,CCL-86)，而用作阴性对照的细胞是CD19阴性K562细胞(ATCC,CCL-243)。在用BCMA TFP T细胞进行的实验中，靶细胞是BCMA阳性RPMI-8226浆细胞瘤/骨髓瘤细胞(ATCC,CCL-155)，而用作阴性对照的细胞是BCMA阴性Raji伯基特氏淋巴瘤细胞(ATCC,CCL-86)。
洗涤靶细胞一次，并将其以1×106个细胞/毫升再悬浮于PBS中。将荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(ThermoFisher)以0.03μM浓度添加至细胞悬浮液中并在室温下孵育细胞20分钟。通过向细胞悬浮液中添加体积是反应体积5倍的完全细胞培养基(RPMI-1640+10％HI-FBS)来停止标记反应，并在室温下再孵育细胞2分钟。通过离心使细胞沉淀并将其以2×105个细胞/毫升再悬浮于细胞毒性培养基(不含酚红的RPMI1640(Invitrogen)加5％AB血清中。向96孔U形底培养板(Corning)的各孔中添加五十微升CFSE标记的靶细胞悬浮液(相当于10,000个细胞)。
洗涤用BCMA TFP构建体转导的效应T细胞以及作为阴性对照的未被转导的T细胞并以2×106个细胞/毫升或1×106个细胞/毫升悬浮于细胞毒性培养基中。将50μL效应T细胞悬浮液(相当于100,000或50,000个细胞)添加至涂铺的靶细胞中，分别达到10:1或5:1的效应细胞与靶细胞比率，总体积是100μL。然后混合培养物，离心并在37℃、5％CO2下孵育4小时。在该孵育之后，根据制造商的推荐，立即将7AAD(7-氨基放线菌素D)(BioLegend)添加至培养的细胞中，并用BD Fortessa X-20(BD Biosciences)进行流式细胞术。使用FlowJo软件(TreeStar,Inc.)对流式细胞术数据进行分析。
通过用含效应T细胞和靶细胞的样品中存活RPMI-8226靶细胞(CFSE+7-AAD-)的数量除以仅含靶细胞的样品中存活RPMI-8226(CFSE+7-AAD-)细胞的数量来计算RPMI-8226靶细胞的存活率百分比。以杀灭RPMI-8226的百分比计算效应细胞的细胞毒性＝100％-RPMI-8226细胞存活百分比。
如先前所述，当与未被转导或被非CD19特异性CAR对照物转导的T细胞相比较时，用抗CD19 28ζCAR构建体转导的T细胞针对表达CD19的Raji B细胞展现出细胞毒性(图8)。不过，在所测试的所有效应细胞:靶细胞比率下，用抗CD19-CD3ε转导的T细胞诱导针对Raji靶的细胞毒性比抗CD19 CAR对照有效。在介于5与10:1之间的效应细胞:靶细胞比率下，抗CD19-CD3γTFP还介导稳固细胞毒性，高于用抗CD19-CAR所观察到的细胞毒性(图8)。用抗CD19-TCRα和抗CD19-TCRβTFP观察到某种细胞毒性。利用以替代性铰链区构建的抗CD19TFP获得类似结果。再一次，利用抗CD19-CD3ε或抗CD19-CD3γTFP转导的T细胞针对表达CD19的Raji靶细胞的细胞毒性高于抗CD19-CAR转导的T细胞。
用编码CD-19特异性TFP的mRNA电穿孔的T细胞也针对表达CD19的Raji细胞展现出稳固的细胞毒性。用对照物或抗CD19 TRuC构建体未观察到明显的CD19阴性K562细胞杀灭作用，但利用被抗CD19-CD3εSL或抗CD19-CD3γSL TRuC转导的T细胞观察到CD19特异性Raji杀灭作用(图14)。
用B细胞成熟抗原(BCMA)特异性TFP转导的T细胞也针对表达BCMA的RPMI8226细胞展现出稳固的细胞毒性。用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的T细胞有效介导针对表达BCMA的RPMI8226靶细胞的细胞毒性。在10:1的效应物比靶细胞比率下，几乎100％的靶细胞被杀灭(图9)。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
实施例8：通过实时细胞毒性测定分析细胞毒性
在实时细胞毒性测定(RTCA)形式中，抗CD19和抗BCMA TFP也展现出优于抗CD19CAR的细胞毒性。RTCA测定法实时测量了专用96孔板各孔中粘附靶细胞单层的电阻抗，并以值形式呈现最终读出，称为细胞指数。细胞指数的改变指示靶细胞单层由于靶细胞被共孵育的T细胞效应物杀灭而破坏。因此，可以根据同时含靶细胞和效应T细胞的孔的细胞指数相较于仅含靶细胞的孔的细胞指数的变化来评价效应T细胞的细胞毒性。
RTCA的靶细胞是表达CD19(CD19-HeLa)或BCMA(BCMA-HeLa)的HeLa细胞，并以未被转导的亲本HeLa细胞作为阴性对照。通过GeneArt(ThermoFisher)合成编码全长人CD19或BCMA的DNA，并将其插入带有新霉素作为选择标志物的双启动子慢病毒载体pCDH514B(System Bioscience)的多个克隆位点中，处于EF1a启动子控制下。然后，包装带有CD19或BCMA编码载体的慢病毒。用CD19慢病毒或BCMA慢病毒转导HeLa细胞24小时，然后用G418(1mg/mL)进行选择。通过FACS分析，利用抗人CD19或BCMA抗体(BioLegend，克隆编号19A2；Miltenyi，克隆编号REA315)确定被转导的CD19-Hela或BCMA-HeLa中CD19或BCMA的表达。
在DMEM、10％FBS、1％抗生素-抗霉素(Life Technologies)中培养粘附靶细胞。为了制备RTCA，将50μL RPMI培养基添加至E-板(ACEA Biosciences,Inc，目录号：JL-10-156010-1A)的适当孔中。然后，将板放入RTCA MP仪器(ACEA Biosciences,Inc.)中并如制造商手册中所述，将适当板布置和测定方案输入RTCA 2.0软件中。每15分钟进行基线测量，得到100个测量值。然后，将1×104个靶细胞/100μL体积添加至每个测定孔中并使细胞沉降15分钟。将板放回读取器中并再次读数。
次日，洗涤效应T细胞并将其再悬浮于细胞毒性培养基(不含酚红的RPMI1640(Invitrogen)加5％AB血清(Gemini Bioproducts；100-318))中。然后，从仪器中取出板并将悬浮于细胞毒性培养基(不含酚红的RPMI1640+5％AB血清)中的效应T细胞以100,000个细胞或50,000个细胞添加至各孔中，以分别达到10:1或5:1的效应物与靶比率。然后，将板放回仪器中。每2分钟进行测量，得到100个测量值，并且然后每15分钟测量，得到1000个测量值。
在RTCA测定中，如添加效应细胞后的细胞指数相对于单独HeLa或与对照CAR构建体转导的T细胞共孵育的HeLa时间依赖性降低所展示，观察到被抗CD19-28ζCAR转导的T细胞对CD19转导的HeLa的杀灭作用(图11)。不过，相较于用抗CD19 CAR观察到的靶细胞杀灭作用，表达抗CD19-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP的T细胞的靶细胞杀灭作用更深并且更快。举例来说，在添加被抗CD19-CD3εTFP转导的T细胞的4小时里，表达CD19的靶细胞基本上完全被杀灭。利用多种包含其它CD3的TFP构建体和TCR构建体转导的T细胞观察到极低或无杀灭作用。利用以替代性铰链区构建的抗CD19 TFP获得类似结果。抗CD19-CD3ε或抗CD19-CD3γTFP转导的T细胞针对CD19转导的HeLa靶细胞的细胞毒性也高于抗CD19-CAR转导的T细胞。
用抗BCMA TFP转导的T细胞针对表达BCMA的RPMI8226细胞也展现出稳固的细胞毒性。如图9中所示，用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的T细胞有效介导针对表达BCMA的RPMI8226靶细胞的细胞毒性。在10:1的效应物比靶细胞比率下，几乎100％的靶细胞被杀灭(图12)。
TFP转导的T细胞的细胞毒性活性关于用于转导的病毒的量(MOI)具有剂量依赖性。利用递增MOI的抗CD19-CD3εTFP慢病毒观察到增加的CD19-HeLa杀灭作用，进一步加强了TFP转导与细胞毒性活性之间的关系(图13)。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
实施例9：通过ELISA测定IL-2和IFN-γ分泌
与带有同源抗原的细胞的识别有关的效应T细胞活化和增殖的另一量度是效应细胞因子，如白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的产生。
如产品插页中所描述，针对人IL-2(目录号EH2IL2,Thermo Scientific)和IFN-γ(目录号KHC4012,Invitrogen)进行ELISA测定。简单点说，将50μL复原的标准品或样品一式两份添加至96孔板的每个孔中，随后添加50μL生物素化抗体试剂。通过轻敲该板数次来混合样品。然后，将50μL标准稀释剂添加至不含标准品或样品的所有孔中，并用带粘合剂的板盖小心地密封该板，随后在室温(20-25℃)下孵育3小时。接着，去除板盖，排空板内含物，并用洗涤缓冲液填满各孔。重复此洗涤程序总计3次，并将板转印至纸巾或其它吸收材料上。向各孔中添加100μL所制备的抗生蛋白链菌素-HRP溶液并附着新的板盖，随后在室温下孵育30分钟。再次去除板盖，丢弃板内含物，并将100μL TMB底物溶液添加至各孔中。使反应在室温下于暗处发生30分钟，之后向个孔中添加100μL停止溶液(Stop Solution)。评价该板。在停止反应的30分钟内，在设置于450nm和550nm的ELISA板读取器上测量吸光度。用450nm的值减去550nm的值并且相对于从IL-2标准曲线获得的值计算未知样品中IL-2的量。
或者，使用人细胞因子磁珠缓冲剂试剂盒(Human Cytokine Magnetic BufferReagent Kit)(Invitrogen,LHB0001M)以及人IL-2磁珠试剂盒(Human IL-2Magnetic BeadKit)(Invitrogen,LHC0021M)和人IFN-γ磁珠试剂盒(Human IFN-γMagnetic Bead Kit)(Invitrogen,LHC4031M)进行2-Plex测定。简单点说，将25μL人IL-2和IFN-γ抗体珠粒添加至96孔板各孔中并使用以下指导进行洗涤：200μL 1x洗涤溶液洗涤两次，将板与磁性96孔板分离器(Invitrogen,A14179)接触放置，使珠粒沉降1分钟并倾析出液体。然后，将50μL孵育缓冲液添加至该板中一式两份含100μL复原标准品或一式三份含50μL样品(来自细胞毒性测定的上清液)和50μL测定稀释剂的各孔中，总体积是150μL。在室温下，于暗处用轨道半径是3mm的回旋振荡器(orbital shaker)以600rpm混合样品2小时。遵循相同洗涤指导，洗涤板，并将100μL人IL-2和IFN-γ生物素化检测器抗体添加至各孔中。在室温下，于暗处用轨道半径是3mm的回旋振荡器以600rpm混合样品1小时。遵循相同洗涤指导，洗涤板，并将100μL抗生蛋白链菌素-R-藻红素添加至各孔中。在室温下，于暗处用轨道半径是3mm的回旋振荡器以600rpm混合样品30分钟。使用相同洗涤指导，洗涤板3次，并在倾析液体之后，将样品再悬浮于150μL1x洗涤溶液中。用轨道半径是3mm的回旋振荡器以600rpm混合样品3分钟并在4℃下储存过夜。之后，遵循相同洗涤指导，洗涤板，并将样品再悬浮于150μL 1x洗涤溶液中。
使用MAGPIX系统(Luminex)和xPONENT软件读取板。使用MILLIPLEX分析软件进行数据分析，由此提供标准曲线和细胞因子浓度。
图15显示，相对于未被转导或对照CAR转导的T细胞，用抗CD19TFP转导的T细胞当与内源性表达CD19的Raji细胞或CD19转导的HeLa细胞共培养时，产生较高水平的IL-2和IFN-γ。相比之下，与CD19阴性K562细胞或未被转导的HeLa细胞共培养使TFP转导的T细胞极少释放或不释放细胞因子。与先前的细胞毒性数据一致，用替代性铰链区构建的抗CD19TFP在与带有CD19的靶细胞共培养后产生类似结果(图16)。
与先前的细胞毒性数据相符，抗CD19-CD3ε和抗CD19-CD3γ的TFP构建体产生最高水平的IL-2和IFN-γ(图15和16)。然而，用抗CD19-CD3ε和抗CD19-CD3γTFP转导的T细胞的细胞因子产量与表达抗CD19-28ζCAR的T细胞相当，不过这些TFP展现的靶细胞杀灭水平要高得多(图8和11)。TFP比CAR更有效地杀灭靶细胞，但促炎性细胞因子释放量与CAR相当或比CAR低的可能性呈现了TFP相对于CAR的潜在优势，因为这些细胞因子的含量升高与过继CAR-T疗法的剂量限制性毒性有关。
用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的T细胞在与BCMA-HeLa共培养时也产生IL-2和IFN-γ，但与不表达BCMA的对照HeLa细胞共培养时不产生(图17)。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
实施例10：通过流式细胞术检测CD107a暴露
有关T细胞活化的另一测定是CD107a的表面表达，CD107a是位于休止细胞中的细胞质细胞溶解颗粒膜中的溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)。效应T细胞的脱粒，作为细胞溶解活性的先决条件，使CD107a在活化诱导的颗粒胞吐之后被动员至细胞表面。因此，除细胞因子产生外，CD107a暴露提供了与细胞毒性密切相关的T细胞活化的另一量度。
分开洗涤靶细胞和效应细胞并将其再悬浮于细胞毒性培养基(RPMI+5％人AB血清+1％抗生素抗霉素)。所述测定是通过以下方式执行：在每孔0.5μL PE/Cy7标记的抗人CD107a(LAMP-1)抗体(Clone-H4A3,BD Biosciences)存在下，在U形底96孔板(Corning)中，将2×105个效应细胞与2×105个靶细胞组合，最终体积是100μL。然后，在37℃、5％CO2下，将培养物孵育一小时。在此孵育之后，在不破坏细胞的情况下，立即向各孔中小心地添加10μL分泌抑制剂莫能霉素(monensin)(1000x溶液，BD GolgiStopTM)的1:10稀释液。然后，在37℃、5％CO2下，再孵育板2.5小时。在此孵育之后，用APC抗人CD3抗体(Clone-UCHT1,BDBiosciences)、PerCP/Cy5.5抗人CD8抗体(Clone-SK1,BD Biosciences)及太平洋蓝抗人CD4抗体(Clone-RPA-T4,BD Biosciences)对细胞染色，并且然后在37℃、5％CO2下孵育30分钟。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞2次(并且在分析之前，将其再悬浮于100μL FACS缓冲液和100ul IC固定缓冲液中。
通过流式细胞术检测T细胞表面上CD107a的暴露。流式细胞术是使用LSRFortessaTM X20(BD Biosciences)进行的并且使用FlowJo软件(Treestar,Inc.Ashland,OR)分析流式细胞术的数据。测定每一效应细胞/靶细胞培养物中在CD3设门内呈CD107+ve的CD8+效应细胞的百分比。
与先前的细胞毒性和细胞因子数据一致，表达CD19的靶细胞，如Raji或Nalm-6细胞与抗CD19-28ζCAR转导的效应T细胞共培养所诱导的表面CD107a表达相对于与CD19–ve靶细胞一起孵育的效应物有3至5倍增加(图18)。比较而言，在相同条件下，表达抗CD19-CD3εLL或CD19-CD3γLL TFP的效应物对CD107a表达展现的诱导作用达5至7倍。用替代性铰链区构建的抗CD19 TFP在与带有CD19的靶细胞共培养后产生类似的结果。
相对于未被转导的T细胞，用抗BCMA-CD3ε或抗BCMA-CD3γTFP转导的细胞在与BCMA+ve RPMI8226细胞共培养后也展现CD107a表面表达的增加(图19)。这些结果表明，TFP转导的效应T细胞在暴露于表达其同源抗原的靶细胞后变得活化并脱粒。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
实施例11：体内小鼠功效研究
为了评估用抗CD19 TFP转导的效应T细胞在体内实现抗肿瘤反应的能力，将用抗CD19-28ζCAR、抗CD19-CD3εLL TFP或抗CD19-CD3γLL TFP转导的效应T细胞过继转移至先前接种有CD19+Raji或Nalm6人白血病细胞系的NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)小鼠中。
从The Jackson Laboratory(库存号005557)获得在开始研究前至少6周龄的雌性NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX)小鼠，并且在用于实验之前，使其适应3天。使用于接种的Raji和Nalm-6人白血病细胞系维持在对数期培养，随后收集并用台盼蓝计数以测定活细胞计数。在肿瘤激发当天，以300g离心细胞5分钟并将其以1×106个细胞/100μL(Nalm-6)或5×105个细胞/100μL(Raji)再悬浮于预先加温的无菌PBS中。制备未被转导或者被抗CD19-28ζCAR、抗CD19-CD3εLL TFP或抗CD3γLL TFP构建体转导的T细胞以供用于过继转移。在研究第0天，用5×105个Raji细胞或1×106个Nalm-6细胞经静脉内激发每个实验组的10只动物。3天后，将5×106个指定效应T细胞群用100μL无菌PBS经静脉内转移至各动物中。每天记录下有关动物的详细临床观察结果，直到实施安乐死。每周测量所有动物的体重，直到死亡或实施安乐死。在过继转移测试物和对照物之后35天，对所有动物实施安乐死。由研究主管与兽医商议决定对研究期间看起来濒死的任何动物实施安乐死。
相对于未被转导的T细胞，过继转移用抗CD19-28ζCAR、抗CD19-CD3εLLTFP或抗CD19-CD3γLLTFP转导的T细胞延长带有Raji肿瘤(图20A)和带有Nalm6肿瘤(图20B)的小鼠的存活期，表明抗CD19CAR和TFP转导的T细胞都能够在这些小鼠模型中介导靶细胞杀灭并相应地增加存活期。总的说来，这些数据表明，TFP是对于在体外和体内都针对第一代CAR展现优良的抗原特异性杀灭作用的嵌合受体进行工程改造的另一平台。
可以用FAP.TFP和CAIX.TFP构建体进行类似实验。
尽管本文中已显示并描述本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将显而易见，这些实施方案仅仅作为举例提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现可以进行多种变更、改变及取代。应了解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案都可以用于实践本发明。预期以下权利要求书将界定本发明的范围，并且在这些权利要求和其等效物范围内的方法和结构都涵盖于其中。

Claims (10)

1.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
2.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
3.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
4.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
5.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和
(ii)包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及
(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；
其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且
其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。
6.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗CD19结合结构域。
7.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗B细胞成熟抗原(BCMA)结合结构域。
8.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。
9.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。
10.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中。
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