KR20210008502A - 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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조나단 알렉산더 테렛
데메트리오스 칼라이치디스
메리-리 데퀘안트
진칼 사미르 파달리아
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크리스퍼 테라퓨틱스 아게
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Abstract

일부 구현예에서, 암의 치료를 위한 방법 및 조성물(예를 들어, 세포 조성물)이 본원에 제공된다.

Description

암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 2018년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/670,417호; 2018년 7월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/701,340호; 2018년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 제62/756,643호; 2018년 11월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/773,658호; 및 2019년 3월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/826,600호의 이익을 주장한다. 상기 언급된 특허 출원의 전체 내용은 본원에 이 참고문헌에 의해 포함된다.
키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor) T 세포 치료는 암 세포를 보다 특이적으로 그리고 효과적으로 표적화하고 사멸하도록 유전자 변형된 T 세포를 사용한다. T 세포가 혈액으로부터 수집된 후, 세포는 이의 표면 상에 CAR을 포함하도록 조작된다. CAR은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기법을 이용하여 T 세포로 도입될 수 있다. 환자에게 이 동종이계 CAR T 세포를 주사할 때, 이 수용체는 T 세포가 암 세포를 사멸하게 한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포) 및 내인성 CD70 발현을 파괴(CD70을 넉아웃)하도록 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기법을 이용하여 편집된 면역 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 CD70 유전자의 파괴를 포함하는 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 제공한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 파괴된 CD70 유전자 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 B2M 유전자, 파괴된 CD70 유전자 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 파괴된 PD-1 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 종양 항원(예를 들어, BCMA, CD19, CD33 또는 CD70)을 표적화한다.
일부 양태에서, 제공된 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 조기 탈진의 방지, CAR T 세포 팽창의 향상 및 암 세포 사멸의 효율의 증가를 포함하는 개선된 T 세포 기능을 나타낸다. 일부 양태에서, 제공된 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 비편집된 T 세포에 비해 또는 CD70을 발현하는 편집된 T 세포에 비해 지속적인 한결같은 세포 성장을 나타내면서, 증가된 세포독성 및 사이토카인(예를 들어, IL-2 및/또는 IFN-감마) 분비를 나타낸다.
일부 양태에서, 본 발명은 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 조작된 T 세포는 파괴된 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 조작된 T 세포는 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 (i) 파괴된 TRAC 유전자; (ii) 파괴된 B2M 유전자; (iii) 파괴된 CD70 유전자; 및 (iv) CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 세포 집단에서의 조작된 T 세포는 파괴된 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC) 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 집단에서의 조작된 T 세포는 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는 (i) 파괴된 TRAC 유전자; (ii) 파괴된 B2M 유전자; (iii) 파괴된 CD70 유전자; 및 (iv) CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, CAR은 i-B 세포 성숙 항원(BCMA)에 결합하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 엑토도메인은 항-BCMA 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 엑토도메인은 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 양태에서, 항-BCMA scFv는 가변 중(VH)쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 기준 항체와 동일한 가변 경(VL)쇄 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함한다. 일부 양태에서, 항-BCMA scFv는 각각 서열 번호 60 및 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함한다. 일부 양태에서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 57과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA scFv는 (i) 서열 번호 80, 서열 번호 82, 및/또는 서열 번호 84 또는 (ii) 서열 번호 81, 서열 번호 83 또는 서열 번호 85의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/하거나, 항-BCMA scFv는 (i) 서열 번호 74, 서열 번호 76, 및/또는 서열 번호 78의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, CAR은 CD33에 결합하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 엑토도메인은 항-CD33 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 엑토도메인은 항-CD33 scFv를 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD33 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 140에 기재된 VH 및 서열 번호 141에 기재된 VL을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD33 scFv는 각각 서열 번호 140 및 서열 번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD33 scFv는 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, CAR은 CD19에 결합하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 엑토도메인은 항-CD19 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 엑토도메인은 항-CD19 scFv를 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD19 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 152에 기재된 VH 및 서열 번호 153에 기재된 VL을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD19 scFv는 각각 서열 번호 152 및 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD19 scFv는 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 (i) 파괴된 TRAC 유전자; (ii) 파괴된 B2M 유전자; (iii) 파괴된 CD70 유전자; 및 (iv) CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는 (i) 파괴된 TRAC 유전자; (ii) 파괴된 B2M 유전자; (iii) 파괴된 CD70 유전자; 및 (iv) CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자;
(iii) 파괴된 CD70 유전자
(iv) (a) 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인, (b) CD8 막관통 도메인, 및 (c) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, CD70에 결합하는 CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD70 scFv는 각각 서열 번호 51 및 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 scFv는 (i) 서열 번호 68, 서열 번호 70, 및/또는 서열 번호 72 또는 (ii) 서열 번호 69, 서열 번호 71, 및/또는 서열 번호 73의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고/하거나, 항-CD70 scFv는 (i) 서열 번호 62, 서열 번호 64, 및/또는 서열 번호 66 또는 (ii) 서열 번호 63, 서열 번호 65, 및/또는 서열 번호 67의 CDR 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인을 포함한다. 임의의 상기 또는 관련 양태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 상기 또는 관련 양태에서, CAR은 CD8 막관통 도메인을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자의 결실이 있다. 일부 양태에서, 결실은 15개 내지 30개의 염기쌍이다. 일부 양태에서, 결실은 20개의 염기쌍이다. 일부 양태에서, 결실은 서열 번호 86을 포함한다. 일부 양태에서, 결실은 서열 번호 86이다.
일부 양태에서, 본 발명은 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하고, 여기서 CAR은 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하고, 여기서 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일하다. 일부 양태에서, 본 발명은 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하고, 여기서 핵산 서열은 서열 번호 45이다.
일부 구현예에서, CD70 유전자는 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 파괴된다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자는 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 파괴된다. 일부 구현예에서, B2M 유전자는 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 파괴된다. 일부 구현예에서, PD-1 유전자는 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 파괴된다.
일부 양태에서, 본 발명은
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 45와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(I) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45 또는 서열 번호 44에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 공여자 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은
(i) 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은
(i) 서열 번호 44의 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 조작된 T 세포를 제공한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포는 파괴된 PD-1 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 파괴된 PD-1 유전자를 포함하는 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 파괴된 CD70 유전자를 추가로 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 5회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 여기서 표적 세포는 CAR에 특이적인 항원을 발현한다. 일부 양태에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지한다. 일부 양태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 일부 양태에서, 표적 세포는 혈액학적 암 또는 고형 종양의 암 세포이다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포 또는 세포 집단은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 서열 번호 56과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포 또는 세포 집단은 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 서열 번호 136과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포 또는 세포 집단은 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 서열 번호 148과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포 또는 세포 집단은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 서열 번호 45와 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 다른 양태는 임의의 본원에 기재된 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 CAR을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함하는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 B2M 유전자, 파괴된 CD70 유전자 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 파괴된 TRAC 유전자를 포함하는 T 세포를 포함하고, 여기서 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산, 파괴된 B2M 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 (a) 항-CD70 항원 결합 단편을 포함하는 엑토도메인, (b) CD8 막관통 도메인, 및 (c) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는
(i) 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 44에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD3z 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD8 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인을 포함한다.
세포 집단의 임의의 상기 또는 관련 양태에서, 파괴된 β2M 유전자는 서열 번호 9 내지 서열 번호 14 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 세포 집단의 임의의 상기 또는 관련 양태에서, 파괴된 CD70 유전자는 서열 번호 129 내지 서열 번호 134 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TRAC 유전자는 서열 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, 항-CD70 CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자는 서열 번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, 항-BCMA CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 55의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TRAC 유전자는 서열 번호 156의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, 항-CD19 CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 148의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 148의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 156의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자는 서열 번호 135의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, 항-CD33 CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 136의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 136의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자는 서열 번호 135의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
임의의 상기 양태에서, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 (a) 증가된 세포 증식 능력을 나타내거나;
(b) 증가된 세포 용해를 나타내거나;
(c) 감소된 세포 탈진을 나타내거나;
(d) 사이토카인 의존적 증식을 유지시키거나;
(e) 증가된 사이토카인 분비를 나타내거나;
(f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합이고,
대조군 T 세포는 내인성 CD70 단백질을 발현한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 적어도 50%, 선택적으로 50% 내지 65%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 적어도 90%, 선택적으로 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 99.5% 초과는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 적어도 60%, 선택적으로 60% 내지 75%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 적어도 80%, 선택적으로 80% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 적어도 80%, 선택적으로 80% 내지 95%는 검출 가능한 수준의 CAR(예를 들어, 항-CD70 CAR 또는 항-BCMA CAR)을 발현한다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포)는 파괴된 PD-1 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포의 적어도 50%, 선택적으로 50% 내지 70%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 PD-1 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CAR을 발현한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a) T 세포에
RNA-가이드 뉴클레아제,
CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, 및
CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 전달하는 단계; 및
(b) 파괴된 CD70 유전자를 포함하고 CAR을 발현하는 조작된 T 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자에 측접되고, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자에서 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 조작된 T 세포는 파괴된 β2M 유전자를 추가로 포함한다.
조작된 T 세포를 제조하는 방법이 본원에 또한 제공되고, 상기 방법은 (a) T 세포에 RNA-가이드 뉴클레아제, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 전달하는 단계(선택적으로, 여기서 CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 측접됨), 및 (b) 조작된 T 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 선택적으로 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 뉴클레아제이다. 다른 RNA-가이드 뉴클레아제가 사용될 수 있고, 하기에 기재된다.
일부 구현예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 98의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 118의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 99의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 119의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 94 또는 서열 번호 95의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 114 또는 서열 번호 115의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
임의의 상기 양태에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA는 리보핵단백질 입자(RNP)에서 복합체화된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 100의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 120의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 표적 세포에 대한 면역요법을 위한 조작된 T 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
(a) T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계, 및
(b) 표적 세포 상에 발현된 항원에 결합하는 CAR을 발현시키는 단계이되, 항원은 CD70이 아닌 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 생체외이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 T 세포에서 TRAC 유전자를 파괴하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 T 세포에서 β2M 유전자를 파괴하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, CAR은 파괴된 TRAC 유전자에서 핵산에 의해 암호화된다. 일부 양태에서, CAR은 본원에 기재된 CAR 중 어느 하나이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 조작된 T 세포 집단을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는, T 세포의 증식을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는, T 세포의 탈진을 감소시키는 방법을 제공한다. 임의의 상기 양태에서, CD70 유전자는 CRISPR/Cas 유전자 편집에 의해 파괴된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 T 세포에서 TRAC 유전자, β2M 유전자, 또는 TRAC 유전자와 β2M 유전자 둘 다를 파괴하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, TRAC 유전자, β2M 유전자, 또는 TRAC 유전자와 β2M 유전자 둘 다는 CRISPR/Cas 유전자 편집에 의해 파괴된다.
일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포 집단 또는 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 조작된 T 세포는 조작된 인간 T 세포이다. 일부 양태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 양태에서, 암은 CD70, BMCA, CD19, CD33 또는 이들의 조합을 발현한다. 일부 양태에서, 세포 집단은 암을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 암은 고형 종양 악성종양 또는 혈액학적 악성종양이다. 일부 양태에서, 고형 종양 악성종양은 난소 종양, 췌장 종양, 신장 종양, 폐 종양 및 장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 세포 집단은 대상체에서 종양의 용적을 감소시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포 집단 또는 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 발명은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 환자에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 조작된 T 세포는 파괴된 CD70 유전자 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD70에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD70에 결합하지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 환자에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자;
(iii) 파괴된 CD70 유전자; 및
(iv) CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 환자에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자;
(iii) 파괴된 CD70 유전자; 및
(iv) (a) 항-CD70 항원 결합 단편을 포함하는 엑토도메인, (b) CD8 막관통 도메인, 및 (c) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 45의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45 또는 서열 번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
(i) 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함한다.
일부 양태에서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 44에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
임의의 상기 또는 관련 양태에서, 조작된 T 세포는 조작된 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 조작된 동종이계 T 세포이다.
도 1은 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-(사중 넉아웃) T 세포에서 고도로 효율적인 다중 유전자 편집을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 2는 다중유전자 편집된 세포 중에서 유사한 팽창을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 3은 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+(즉, 3X KO(CD70), CD70 CAR+) T 세포에서 효율적인 다중 유전자 편집을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 4는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 일반 비율이 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 집단 중에서 유지된다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 5는 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포에서 효율적인 다중 유전자 편집을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 6은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 일반 비율이 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+(즉, 4X KO, CD70 CAR+) T 세포 집단 중에서 유지된다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 7a-도 7c는 다중 유전자 편집을 갖는 항-BCMA CAR+ T 세포의 규명에 관한 데이터를 보여주는 그래프를 포함한다. 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포는 TRAC 및 β2M(도 7a), PD-1 및 CD70(도 7b) 및 BCMA CAR(도 7c) 발현을 위해 염색되었다. 항-BCMA CAR은 이중 및 사중 넉아웃 CAR T 세포 둘 다에서 대략 80%에서 발현되었다.
도 8은 3주에 걸쳐 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD33 CAR T 세포와 비교하여 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD33 CAR T 세포에서의 CD4+ 세포의 소실의 방지를 보여주는 유세포분석법 도표를 포함한다.
도 9는 CD70 KO가 2주에 걸쳐 항-CD33 CAR T 세포에서 세포 증식을 향상시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 생존가능 세포의 총수는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD33 CAR T 세포에서 정량화되었다.
도 10은 CD70 KO가 2주에 걸쳐 항-CD19 CAR T 세포에서 세포 증식을 향상시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 생존가능 세포의 총수는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD33 CAR T 세포에서 정량화되었다.
도 11은 CD70 KO가 항-BCMA CAR T 세포에서 세포 증식을 향상시키고, BCMA CAR 세포 증식에 대한 PD1 KO의 해로운 효과를 구제한다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 생존가능 세포의 총수는 4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD1-), 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), 3X KO(PD1)(TRAC-/β2M-/PD1-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD33 CAR T 세포에서 정량화되었다.
도 12는 CD70 KO가 항-BCMA CAR T 세포에서 세포 증식을 향상시키고, BCMA CAR 세포 증식에 대한 PD1 KO의 해로운 효과를 구제한다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 생존가능 세포의 총수는 4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD1-), 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), 3X KO(PD1)(TRAC-/β2M-/PD1-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD33 CAR T 세포에서 정량화되었다. 항-BCMA CAR T 세포는 도 11에 도시된 것처럼 CAR T 세포와 상이한 공여자 T 세포로부터 유래되었다.
도 13은 2X KO(TRAC-/B2M-) 항-BCMA CAR+ T 세포 및 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-BCMA CAR+ T 세포에서 항원 노출로 인한 아폽토시스 세포사의 비교를 보여주는 그래프를 포함한다. CAR+ T 세포는 24시간마다 재시험감염으로 24시간 동안 플레이트 결합된 BCMA 항원에 노출되고, 아폽토시스는 유세포분석법에 의해 각각의 항원 시험감염 후에 평가되었다. 항원 시험감염으로 인한 아폽토시스의 유도는 유도가 없는 것과 비교하여 CD70 KO를 가진 항-BCMA CAR+ T 세포에서 더 낮았다.
도 14는 2X KO(TRAC-/B2M-) 항-BCMA CAR+ T 세포 및 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-BCMA CAR+ T 세포에서 항원 노출 후에 CAR T 세포 팽창의 비교를 보여주는 그래프를 포함한다. CAR+ T 세포는 24시간마다 재시험감염으로 24시간 동안 플레이트 결합된 BCMA 항원에 노출되고, 세포 팽창은 각각의 항원 시험감염 후에 평가되고, 0h 시간에 집단으로 정규화되었다. 항원 시험감염 후의 집단 팽창은 유도가 없는 것과 비교하여 CD70 KO를 가진 항-BCMA CAR+ T 세포에서 더 높았다.
도 15는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포에서 강력한 세포 팽창을 보여주는 그래프를 포함한다. 생존가능 세포의 총수는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR T 세포에서 정량화되었다. 3X KO 세포는 CD70 sgRNA T7 또는 T8 중 어느 하나로 생성되었다.
도 16은 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포에서 강력한 세포 팽창을 보여주는 그래프를 포함한다. 생존가능 세포의 총수는 4X KO(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-), 3X KO(TRAC-/β2M-/PD1-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR T 세포에서 정량화되었다.
도 17은 항-CD19CAR T 세포(TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD19 CAR+ 또는 TRAC-/β2M-/항-CD19 CAR+ T 세포)에 의한 Nalm6(상부 패널) 세포 및 Raji(하부 패널) 세포 둘 다의 강력한 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 18은 항-CD33 CAR T 세포(TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD33 CAR+ 또는 TRAC-/β2M-/항-CD33 CAR+ T 세포)에 의한 MV411 세포의 강력한 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 19는 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR+ T 세포와 비교된 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포에 의한 A498 세포의 강력한 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 20은 MV411 표적 세포에 의한 시험감염 후에 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 또는 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD33 CAR T 세포의 세포 팽창을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 21은 Nalm6 표적 세포에 의한 시험감염 후에 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 또는 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR T 세포의 세포 팽창을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 22a는 연속 재시험감염 후에 항-CD70 CAR T 세포에 의한 A498 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다. 4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD1-), 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), 3X KO(PD1)(TRAC-/β2M-/PD1-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR+ T 세포가 사용되었다. 3X KO(CD70), CD70 CAR+ T 세포 및 4X KO, CD70 CAR+ T 세포는 가장 효과적이었다. 도 22b는 연속 재시험감염 후에 항-CD70 CAR T 세포에 의한 ACHN 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다. 도 22a와 동일한 세포를 사용하였다. 3X KO(CD70), CD70 CAR+ T 세포 및 4X KO, CD70 CAR+ T 세포는 가장 효과적이었다.
도 23a는 다양한 효과기 : 표적 비율에서의 항-CD70 CAR T 세포에 의한 ACHN 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다. 4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD1-), 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), 3X KO(PD1)(TRAC-/β2M-/PD1-) 및 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR+ T 세포가 사용되었다. 3X KO(CD70), CD70 CAR+ T 세포 및 4X KO, CD70 CAR+ T 세포는 다중 연속 재시험감염 후에 우수한 살해자였다. 도 23b는 8회 재시험감염 후에 도 23a로부터의 세포에서 LAG3(왼쪽) 및 PD1(오른쪽) 발현을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 24a-도 24c는 PD-1 및 CD70의 넉아웃이 다발성 골수종 세포주(MM.1S)에 의한 연속 재시험감염을 통해 측정되는 바대로 항-BCMA CAR+ T 세포의 세포 사멸 활성을 향상시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 이중 넉아웃(2X KO(TRAC-/β2M-)) 항-BCMA CAR+ T 세포(원)는 대략 4회 재시험감염 후에 MM.1S 세포를 향한 이의 효력을 소실하기 시작하는 반면, 사중 넉아웃(4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD1-)) 항-BCMA CAR+ T 세포(정사각형)는 10회 재시험감염 후에 MM.1S 세포를 100% 사멸할 수 있었다(도 24a). 이와 일치하여, 사중 넉아웃 항-BCMA CAR+ T 세포는 10회 재시험감염 후에 표적 세포에 반응하여 IFN-g를 계속해서 분비하는 반면, 이중 넉아웃 항-BCMA CAR+ T 세포는 제3 재시험감염 후에 IFN-g 분비 감소를 나타냈다(도 24b). 사중 넉아웃 항-BCMA CAR+ T 세포는 또한 이중 넉아웃 항-BCMA CAR+ T 세포보다 표적 세포에 대한 노출에 반응하여 더 높은 증식을 나타냈다(도 24c).
도 25a-도 25c는 이중 넉아웃(2X KO) TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 삼중 넉아웃(3X KO(PD1)) TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포에 비해 사중 넉아웃(4X KO) TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 삼중 넉아웃(3X KO(CD70)) TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포를 사용한 (PD-L1을 발현하는) A498 PD-L1 신장암 세포에서의 가장 높은 세포 사멸 활성을 보여주는 그래프를 포함한다. 2:1의 CAR T 세포 : A498-PD-L1 세포 비율이 도 25a에서 사용되고, 1:1의 CAR T 세포 : A498-PD-L1 세포 비율이 도 25b에 사용되고, 0.5:1의 CAR T 세포 : A498-PD-L1 세포 비율이 도 25c에 사용된다.
도 26a 및 도 26b는 사중 넉아웃(4X KO) TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포가 삼중 넉아웃(3X KO(CD70)) TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포, 이중 넉아웃(2X KO) TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 삼중 넉아웃(3X KO(PD1)) TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포에 비해 가장 높은 수준의 사이토카인 IFN-감마(도 26a) 및 IL-2(도 26b)를 분비한다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 1:1의 CAR T 세포 : A498-PD-L1 세포 비율이 사용되었다.
도 27a는 2X KO(TRAC-/β2M-), CD70 CAR+ T 세포; 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD1-), CD70 CAR+ T 세포; 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), CD70 CAR+ T 세포; 또는 4X KO(PD-1, CD70)(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-), CD70 CAR+ T 세포에 노출된 피하 A498 신장 세포 암종 모델에서 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 27b는 피하 A498 신장 세포 암종 재시험감염 모델에서 종양 성장의 방지를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 27a로부터의 마우스는 25일에 A498 종양 세포에 의해 재시험감염되었고, 종양 용적은 시간에 걸쳐 평가되었다. 도 27c는 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), CD70 CAR+ T 세포; 4X KO(PD-1, CD70)(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-), CD70 CAR+ T 세포; 2X KO(TRAC-/β2M-), CD70 CAR+ T 세포; 또는 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD1-), CD70 CAR+ T 세포에 노출된 피하 A498 신장 세포 암종 모델(CAR-T 주사의 시기에 약 150mm3의 큰 종양)에서 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다.
도 28a는 2X KO(TRAC-/β2M-), BCMA CAR+ T 세포; 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD1-), BCMA CAR+ T 세포; 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), BCMA CAR+ T 세포; 또는 4X KO(PD-1, CD70)(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-), BCMA CAR+ T 세포에 노출된 피하 MM.1S 모델에서 종양 용적 감소를 보여주는 그래프를 포함한다.
도 28b는 종양 세포 재시험감염 후에 피하 MM.1S 모델에서의 종양 용적 감소를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 28a로부터의 마우스는 45일에 MM.1S 세포의 제2 접종에 의해 재시험감염되었고, 종양 용적은 시간에 걸쳐 평가되었다.
도 29는 투약 후 1주(오른쪽 그래프), 2주(중간 그래프) 및 3주(왼쪽 그래프)에 인간 CD45+ 2X KO(TRAC-/β2M-), BCMA CAR+ T 세포; 인간 CD45+ 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD1-), BCMA CAR+ T 세포; 인간 CD45+ 3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), BCMA CAR+ T 세포; 및 인간 CD45+ 4X KO(PD-1, CD70)(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-), BCMA CAR+ T 세포의 수를 보여주는 그래프를 포함한다.
도 30은 1x105개, 3x105개, 1x106개 또는 3x106개의 세포/마우스의 용량에서 TRAC-/β2M/-항-BCMA CAR+ T 세포(2X KO, BCMA CAR+ T 세포); TRAC-/β2M-/PD1-/항-BCMA CAR+ T 세포(3X KO(PD-1), BCMA CAR+ T 세포); TRAC-/β2M-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포(3X KO(CD70), BCMA CAR+ T 세포); 또는 TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포(4X KO(PD-1, CD70), BCMA CAR+ T 세포)에 노출된 피하 RPMI-8226 종양 이종이식 모델에서의 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다.
도 31은 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포가 사이토카인 의존적 증식을 유지시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 32는 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포의 사이토카인 의존적 성장을 보여준다.
도 33은 4X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-), BCMA CAR+ T 세포가 사이토카인 의존성을 유지시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 34는 24시간 동안 다양한 비율로 A498 신장암 세포와 동시배양될 때 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR + T 세포와 비교된 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포에 의한 향상된 사이토카인 (IL-2) 방출을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 35는 TCR+ T 세포에 비해 항-CD70 CAR T 세포(2X KO(TRAC-/β2M-), CD70 CAR+; 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD-1-), CD70 CAR+; 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-) CD70 CAR+)에 의한 A498 세포의 강력한 세포 사멸을 보여주는 그래프를 포함한다. T 세포는 24시간 동안 다양한 비율로 A498 세포와 동시배양되었고, 세포 용해의 백분율은 측정되었다.
도 36은 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+(즉, 2X KO, CD70 CAR+) T 세포 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+(즉, 3X KO(PD-1), CD70 CAR+) T 세포에 비해 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(4X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(CD70), CD70 CAR+)를 사용한 A498 신장암 세포에서의 가장 높은 세포 사멸 활성을 보여주는 그래프를 포함한다. 0.25:1의 CAR T 세포:A498 세포 비율이 사용되었다. A498 세포의 세포 용해의 백분율은 동시배양 후 24시간에 측정되었다.
도 37a 및 도 37b는 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(4X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(CD70), CD70 CAR+)가 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포(2X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(PD-1), CD70 CAR+)에 비해 가장 높은 수준의 사이토카인 IFN-감마(도 37a) 및 IL-2(도 37b)를 분비한다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 0.25:1의 CAR T 세포:A498 세포 비율이 사용되었다. IFN-감마 및 IL-2 분비는 동시배양 후 24시간에 측정되었다.
도 38은 항-CD70 CAR T 세포(3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), CD70 CAR+; 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD1-), CD70 CAR+; 및 4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD-1-), CD70 CAR+)에서의 CD70의 넉아웃이 내인성 CD70을 발현하는 항-CD70 CAR T 세포(2X KO(TRAC-/β2M-) CD70 CAR+)에 비해 CD4+ T 세포에서 PD-1 발현의 수준을 감소시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 39a 및 도 39b는 항-CD70 CAR T 세포(3X KO(CD70)(TRAC-/β2M-/CD70-), CD70 CAR+; 3X KO(PD-1)(TRAC-/β2M-/PD1-), CD70 CAR+; 및 4X KO(TRAC-/β2M-/CD70-/PD-1-), CD70 CAR+)에서의 CD70 넉아웃이 내인성 CD70을 발현하는 항-CD70 CAR T 세포(2X KO(TRAC-/β2M-) CD70 CAR+)에 비해 CD8+ T 세포(도 39a) 및 CD4+ T 세포(도 39b)에서 탈진 마커 LAG3의 수준을 감소시킨다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 40a는 5개의 상이한 암 세포주에서의 상대 CD70 발현(왼쪽 패널) 및 3개의 상이한 암 세포주에서의 상대 CD70 발현(오른쪽 패널)을 보여주는 그래프를 포함한다. 도 40b는 9개의 상이한 암 세포주에서의 상대 CD70 발현을 보여주는 그래프를 포함한다. 도 40c-도 40d는 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포(2X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(PD-1), CD70 CAR+)에 비해 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(4X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(CD70), CD70 CAR+)를 사용한 (낮은 수준의 CD70을 발현하는) ACHN(ATCC® CRL-1611™) 신장암 세포에서의 가장 높은 세포 사멸 활성을 보여주는 그래프를 포함한다. 0.5:1의 CAR T 세포:ACHN 세포 비율이 도 40c에서 사용되고, 0.25:1의 CAR T 세포:ACHN 세포 비율이 도 40d에서 사용되었다. 도 40e 및 도 40f는 변하는 수준의 CD70 발현(4:1, 1:1 또는 0.25:1의 효과기 : 표적 세포 비율)을 갖는 추가의 고형 종양 세포주에 대해 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(도 40e) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(도 40f)를 사용한 세포 사멸 활성을 보여주는 그래프를 포함한다. 도 40g는 24시간 또는 96시간의 동시배양 기간 후에 고형 종양 세포주에 대한 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포를 사용한 세포 사멸 활성을 보여주는 그래프를 포함한다. 도 40h-도 40j는 다양한 효과기 : 표적 비율에서 CD70 결핍 만성 골수성 백혈병(K562) 세포(도 40h), CD70 발현 다발성 골수종(MM.1S) 세포(도 40i) 및 CD70 발현 T 세포 림프종(HuT78) 세포(도 40j)에 대한 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(3KO(CD70), CD70 CAR+)를 사용한 세포 사멸 활성을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 41a 및 도 41b는 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(4X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(CD70), CD70 CAR+)가 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포(2X KO, CD70 CAR+) 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포(3X KO(PD-1), CD70 CAR+)에 비해 가장 높은 수준의 사이토카인 IFN-감마(도 41a) 및 IL-2(도 41b)를 분비한다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 0.25:1의 CAR T 세포:ACHN 세포 비율이 사용되었다.
도 42a는 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-CD70 CAR T 세포에 노출된 인간 난소 종양 이종이식 모델(예를 들어, SKOV-3 종양 세포)에서의 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 42b는 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-CD70 CAR T 세포에 노출된 인간 비소세포 폐 종양 이종이식 모델(예를 들어, NCI-H1975 종양 세포)에서의 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 42c는 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-CD70 CAR T 세포에 노출된 인간 췌장 종양 이종이식 모델(예를 들어, Hs766T 종양 세포)에서의 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. 도 42d는 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-CD70 CAR T 세포에 노출된 인간 T 세포 림프종 이종이식 모델(예를 들어, HuT78 종양 세포)에서의 종양 용적 감소를 평가하도록 설계된 실험으로부터의 결과를 보여주는 그래프를 포함한다. 개별 마우스의 종양 용적(왼쪽) 및 평균 종양 용적(오른쪽)이 도시되어 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로 항원 표적화 모이어티(예를 들어, CAR)를 발현하도록 조작된 면역 세포에서의 CD70 유전자의 파괴가 항종양 효능을 포함하여 세포 기반 면역요법에 중요한 여러 특징을 향상시킨다는 발견에 기초한다. 구체적으로는, 이러한 조작된 면역 세포는 장기간 향상된 항종양 효능을 생성하는 연장된 증식 및 생체내 지속성을 포함하는 예상치 못한 우수한 특징을 나타냈다. 특히, 이 예상치 못한 특징은 BCMA, CD19, CD33 및 CD70을 포함하는 다양한 항원에 특이적인 표적화 모이어티에 의해 나타났다.
본원에서 입증된 것처럼, CD70 유전자의 파괴는 시험관내 암 세포에 의한 여러 회차의 시험감염 후에 항원 표적화 모이어티를 발현하도록 조작된 면역 세포의 세포독성을 유지시켰다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 이 세포독성 유지는 CD70 유전자의 파괴가 조작된 면역 세포가 탈진에 저항성이게 하고, 세포가 더 길게 생존할 수 있게 한다는 것을 나타낸다.
항원 표적화 모이어티를 발현하도록 조작된 면역 세포에서의 CD70 유전자의 파괴가 큰 종양에 대한 항종양 효능을 향상시키고, 영속적인 항암 기억 반응을 유도한다는 것이 또한 발견되었다. 구체적으로는, 항암 기억 반응은 재시험감염시 종양 성장을 방지하였다. 추가로, CD70 유전자의 파괴가 더 낮은 비율의 조작된 면역 세포 대 표적 세포에서 항원 표적화 모이어티를 발현하도록 조작된 면역 세포의 세포독성을 향상시킨다는 것이 입증되었고, 이는 낮은 용량의 조작된 면역 세포의 가능성이 있는 효능을 나타낸다.
CD70 유전자의 파괴가 조작된 면역 세포의 세포 증식 및 생체내 지속성을 향상시킨다고 또한 밝혀졌다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 본원에 기재된 조작된 면역 세포의 우수한 특징이 더 한결같은 세포 집단, 더 많은 세포 분열에 생존하는 세포의 능력으로 인한 더 큰 규모의 제조, 및 조작된 세포를 생성하는 데 필요한 더 적은 출발 세포를 허용한다고 생각된다. 이러한 특징은 또한 임상 환경에서 유리한 것으로 입증될 수 있다. 예를 들어, 팽창 증가 및 탈진 감소는 용량당 효능 증가 및 더 낮은 용량에서 효능을 얻는 능력을 나타낸다.
항원 표적 모이어티를 발현하도록 조작된 면역 세포에서의 CD70 유전자의 파괴가 고도의 면역 억제 분자, 즉 PD-L1을 발현하는 암 세포에 대해 세포독성을 유지한다는 것이 또한 입증되었다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 암 세포에서 발현된 PD-L1에 결합될 때 면역 세포에서 발현된 PD-1의 내부 음성 신호가 CD70의 파괴에 의해 극복될 수 있다고 생각된다.
따라서, 효능 및 지속성이 증가된 조작된 면역 세포의 사용을 수반하는 암, 예컨대 BCMA+, CD19+, CD33+, 및 CD70+ 악성종양의 치료를 위한 방법 및 조성물(예를 들어, 세포 조성물)이 본원에 제공된다.
CD70 유전자 편집
분화 클러스터 70(CD70: Cluster of Differentiation 70)은 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리의 구성원이고, 이의 발현은 활성화된 T 및 B 림프구 및 성숙 수지상 세포로 제한된다. CD70은 이의 리간드인 CD27과의 상호작용을 통해 종양 세포 및 조절 T 세포 생존의 원인에 연루된다. CD70 및 이의 수용체 CD27은 T 세포(활성화된 및 T reg) 및 B 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서 면역 기능에서 여러 역할을 갖는다. CD70이 아폽토시스와 같은 기능을 제어하기 위해 모든 이 세포 유형에서 어떻게 작용하는지는 정확히 명확하지 않으며, 간행물은 모순되는 역할을 나타낸다. 예를 들어, CD70이 항원 부하에 따라 T 세포의 아폽토시스 또는 생존을 유도한다고 보고되었다(Wensveen, F., et al. J. Immunol, Vol 188: 4256-4267, 2012).
CAR T 세포가 효과적인 면역치료학적인 것으로 입증되었지만, 다양한 시험감염이 여전히 있다. 예를 들어, 시간에 따라 CAR T 세포는 생체내 탈진되고 비효과적이 된다. 제조와 관련하여 환자에 투약하기 위해 충분한 세포를 제조하는 데 상당한 시간이 걸린다. 이 제한을 해결하기 위해, 본 발명은 항원 표적화 모이어티(예를 들어, scFv)를 발현함과 동시에 내인성 CD70 발현을 파괴하도록 조작된 CAR T 세포를 제공한다.
놀랍게도, 본 발명은 CD70 유전자의 파괴가 CAR T에서 scFv에 의해 표적화된 항원과 무관하게 증가된 CAR T 건강 및 기능(예를 들어, 증식 연장, 탈진 감소)이 가능하게 한다는 것을 보여준다. 이는 CD33 및 CD70과 같은 T 세포에서 발현된 항원에도 심지어 적용되고, 여기서 파괴된 CD70 유전자의 효과는 동족살해가 예상될 수 있는 경우에도 CAR T 기능을 보유한다. 즉, CAR 삽입과 독립적인 이 CD70 넉아웃 세포(예를 들어, 여기서 CD70 유전자는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 편집됨)는 비변형된 T 세포(또는 CD70을 발현하는 편집된 T 세포)에 비해 지속적인 한결같은 세포 성장을 나타내고, 더 낮은 수준의 탈진 마커, 예컨대 LAG3을 발현한다. 본 발명의 CAR T 세포는 CAR T 세포를 암 세포에 가이드하기 위해 암 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 항체(전체 항체 및 항체 단편 포함) 또는 다른 분자(예를 들어, 수용체 또는 리간드)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)이다. 다른 구현예에서, 항체는 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)이다. 다른 구현예에서, 항체는 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)이다. 다른 암 항원은 본 발명에 의해 포함된다.
유전자 파괴가 유전자 편집을 통한(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삽입 또는 결실시키기 위한 CRISPR/Cas 유전자 편집을 이용한) 유전자 변형을 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 파괴된 유전자는 기능적 단백질을 암호화하지 않는 유전자이다. 일부 구현예에서, 파괴된 유전자를 포함하는 세포는 (예를 들어, 유세포분석법에 의한 예를 들어 항체에 의해) 그 유전자에 의해 암호화된 단백질의 검출 가능한 수준을 (예를 들어, 세포 표면에서) 발현하지 않는다. 검출 가능한 수준의 단백질을 발현하지 않는 세포는 넉아웃 세포라 칭해질 수 있다. 예를 들어, CD70 단백질이 CD70 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 세포 표면에서 검출될 수 없으면 CD70 유전자 편집을 갖는 세포는 CD70 넉아웃 세포라고 생각될 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 유전자 및/또는 단백질을 발현하지 않는 세포의 소정의 백분율을 생성시키는 소정의 세포 백분율이 편집된(예를 들어, CD70 유전자 편집된) 세포 집단이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집된 세포 집단의 세포의 적어도 50%(예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 85%)는 CD70 넉아웃 세포이다. 일부 구현예에서, 이 집단의 세포(예를 들어 T 세포)의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 CD70 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전자 편집된 세포 집단의 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 CD70 넉아웃 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는 조작된 T 세포의 백분율은 시간이 지나면서 증가한다. 따라서, 일부 구현예에서, 조작된 T 세포 집단의 조작된 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는다. 예를 들어, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는다.
CD70 유전자에서 게놈 변경(예를 들어, 파괴, 예를 들어 결실, 삽입, 치환)을 생성하기 위해 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 변형된 및 비변형된 CD70 gRNA 서열의 비제한적인 예는 표 5에 기재되어 있다(예를 들어, 서열 번호 23 내지 서열 번호 29 및 서열 번호 33 내지 서열 번호 39). 다른 gRNA 서열은 염색체 19(GRCh38 좌표: 염색체 19: 6,583,183 내지 6,604,103; Ensembl: ENSG00000125726)에 위치한 CD70 유전자 서열을 사용하여 설계될 수 있다. 소정의 구현예에서, CD70 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 CD70 mRNA 및/또는 단백질의 발현을 파괴하는 CD70 유전자에서의 또는 그 주위에서의 삽입-결실(예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환)을 생성한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제) 및 CD70 유전자(또는 임의의 다른 관심 유전자)를 표적화하는 gRNA를 함유하는 리보핵단백질 입자(RNP)는 T 세포(예를 들어, 1차 T 세포)로 전달된다. 다른 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA는 T 세포에 별개로 전달된다. 리보핵단백질 입자(RNP)는 단순히 gRNA와 예비복합체화된/복합체된(이것에 결합된) RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)이다.
일부 구현예에서, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 비제한적인 예로서 서열 번호 33 내지 서열 번호 39를 포함하는 gRNA 중 어느 하나와 같은 합성 변형된 gRNA이다. 일부 구현예에서, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 비제한적인 예로서 서열 번호 23 내지 서열 번호 29를 포함하는 gRNA 중 어느 하나와 같은 합성 비변형된 gRNA이다.
일부 구현예에서, CD70 게놈 영역을 표적화는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 CD70 유전자에서 이중 가닥 절단을 생성한다. 절단의 복구는 CD70 유전자를 삽입/결실시키고, 여기서 CD70 유전자 서열은 서열 번호 129 내지 서열 번호 134로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
다중-유전자 편집
본 발명의 조작된 T 세포는 일부 구현예에서 예를 들어 하나 초과의 유전자에서 하나 초과의 파괴된 유전자(예를 들어, 하나 초과의 유전자 편집)를 포함한다. 예를 들어, 조작된 T 세포는 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자, 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자, 파괴된 예정 세포사-1(PD-1 또는 PDCD1) 유전자, 또는 상기 파괴된 유전자의 2개 이상의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 파괴된 CD70 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 파괴된 PD-1 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자, 파괴된 CD70 유전자 및 파괴된 PD-1 유전자를 포함한다.
TRAC 유전자 편집
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 포함한다. 이 파괴는 TCR의 기능을 소실시키고, 조작된 T 세포가 비동종반응이 되고 동종이계 이식에 적합하게 하여 이식편 대 숙주 질환의 위험을 최소화한다. 일부 구현예에서, 내인성 TRAC 유전자의 발현은 이식편 대 숙주 반응을 방지하도록 제거된다.
일부 구현예에서, TRAC 유전자 발현의 파괴는 (예를 들어, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 및 공여자 주형을 사용하여) TRAC 유전자로 키메라 항원 수용체(CAR)를 넉킹하여 생성된다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 발현의 파괴는 뉴클레아제 및 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 게놈 결실은 HDR에 의해 생성되고, 여기서 키메라 항원 수용체(CAR)는 (예를 들어, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 및 공여자 주형을 사용하여) TRAC 유전자의 분절을 대체한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 발현의 파괴는 뉴클레아제 및 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA에 의해, 키메라 항원 수용체(CAR)를 TRAC 유전자로 넉킹하여 생성된다.
TRAC 유전자에서 게놈을 생성하기 위해 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 변형된 및 비변형된 TRAC gRNA 서열의 비제한적인 예는 표 7(예를 들어, 서열 번호 30 및 서열 번호 40)에 기재되어 있다. 본원에 참고로 포함된 2018년 5월 11일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/032334호를 또한 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 14(GRCh38: 염색체 14: 22,547,506 내지 22,552,154; Ensembl; ENSG00000277734)에 위치한 TRAC 유전자 서열을 사용하여 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 TRAC 게놈 영역에서 절단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 TRAC 유전자의 삽입/결실을 생성시킨다.
일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 T 세포 수용체(TCR) 표면 단백질을 발현하지 않는다. 예를 들어, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제) 및 TRAC 유전자(또는 임의의 다른 관심 유전자)를 표적화하는 gRNA를 함유하는 리보핵단백질 입자(RNP)는 T 세포(예를 들어, 1차 T 세포)에 전달된다. 다른 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA는 T 세포에 별개로 전달된다. 리보핵단백질 입자(RNP)는 단순히 gRNA와 예비복합체화된/복합체된 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)이다.
일부 구현예에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 표 1에서의 하기 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TRAC 유전자에서의 삽입/결실을 생성시킨다.
Figure pct00001
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 15개 내지 30개의 염기쌍의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기쌍의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자의 30개 초과의 염기쌍의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 20개의 염기쌍의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 서열 번호 86의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 서열 번호 86을 포함하는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 서열 번호 118의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자에서 서열 번호 118을 포함하는 결실을 포함한다.
β2M 유전자 편집
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 파괴된 β2M 유전자를 포함한다. β2M은 MHC I 복합체의 공통(불변) 성분이다. 유전자 편집에 의한 이의 발현의 파괴는 치료학적 동종이계 T 세포 반응에 대하여 숙주를 방지하여 동종이계 T 세포 지속성을 증가시킬 것이다. 일부 구현예에서, 내인성 β2M 유전자의 발현은 숙주 대 이식편 반응을 방지하도록 제거된다.
β2M 유전자에서의 게놈 결실을 생성하기 위해 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 변형된 및 비변형된 β2M gRNA 서열의 비제한적인 예는 표 7에 기재되어 있다(예를 들어, 서열 번호 31 및 서열 번호 41). 본원에 참고로 포함된 2018년 5월 11일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/032334호를 또한 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 15(GRCh38 좌표: 염색체 15: 44,711,477 내지 44,718,877; Ensembl: ENSG00000166710)에 위치한 β2M 유전자 서열을 사용하여 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, β2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 β2M 게놈 영역에서 절단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 β2M 유전자의 삽입/결실을 생성시킨다.
일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않는다. 예를 들어, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 세포 집단의 조작된 T 세포의 50% 미만은 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 조작된 T 세포의 30% 미만은 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현한다. 예를 들어, 세포 집단의 조작된 T 세포의 50% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만은 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 세포 집단의 조작된 T 세포의 40% 내지 30%, 40% 내지 20%, 40% 내지 10%, 40% 내지 5%, 30% 내지 20%, 30% 내지 10%, 30% 내지 5%, 20% 내지 10%, 20% 내지 5%, 또는 10% 내지 5%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제) 및 B2M 유전자(또는 임의의 다른 관심 유전자)를 표적화하는 gRNA를 함유하는 리보핵단백질 입자(RNP)는 T 세포(예를 들어, 1차 T 세포)에 전달된다. 다른 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA는 T 세포에 별개로 전달된다. 리보핵단백질 입자(RNP)는 단순히 gRNA와 예비복합체화된/복합체된 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)이다.
일부 구현예에서, 편집된 β2M 유전자는 표 2에서의 하기 서열로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
Figure pct00002
PD-1 유전자 편집
PD-1은 활성화된 T 세포에서 상향조절되고, T 세포 반응을 약화시키거나 중단시키도록 작용하는 면역 관문 분자이다. 유전자 편집에 의한 PD-1의 파괴는 대상체에서 더 지속적이고/이거나 강력한 치료학적 T 세포 반응을 야기하고/하거나, 면역 억제를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 파괴된 PD-1 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 PD-1 유전자의 발현은 본 발명의 CAR T 세포의 항종양 효능을 향상시키도록 제거된다.
PD-1 유전자에서의 게놈 결실을 생성하도록 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 변형된 및 비변형된 PD-1 gRNA 서열의 비제한적인 예는 표 5(예를 들어, 서열 번호 32 및 서열 번호 42)에 기재되어 있다. 본원에 참고로 포함된 2018년 5월 11일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/032334호를 또한 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 2(GRCh38 좌표: 염색체 2: 241,849,881 내지 241,858,908; Ensembl: ENSG00000188389)에 위치한 PD-1 유전자 서열을 사용하여 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, PD-1 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 TRAC 게놈 영역에서 절단을 생성하여 PD-1 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 PD-1 유전자의 삽입/결실을 생성시킨다.
일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 PD-1 표면 단백질을 발현하지 않는다. 예를 들어, 집단의 조작된 T 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 검출 가능한 수준의 PD-1 표면 단백질을 발현하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포의 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 60% 내지 70%, 70% 내지 100%, 70% 내지 90%, 70% 내지 80%, 80% 내지 100%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 PD-1 표면 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제) 및 PD-1 유전자(또는 임의의 다른 관심 유전자)를 표적화하는 gRNA를 함유하는 리보핵단백질 입자(RNP)는 T 세포(예를 들어, 1차 T 세포)에 전달된다. 다른 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA는 T 세포에 별개로 전달된다. 리보핵단백질 입자(RNP)는 단순히 gRNA와 예비복합체화된/복합체된 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)이다.
세포 표현형
일부 구현예에서, 세포 집단 내의 하나 이상의 유전자 편집은 세포 증식 능력, 세포 탈진, 세포 생존능력, 세포 용해 능력의 변화(예를 들어, 사이토카인 생성 및/또는 방출의 증가), 또는 임의의 이들의 조합과 연관된 표현형을 발생시킨다.
일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포는 항-CD70 scFv 엑토도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포는 항-BCMA scFv 엑토도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포는 항-CD19 scFv 엑토도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 집단의 조작된 T 세포는 항-CD33 scFv 엑토도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 임의의 상기 조작된 T 세포는 또한 다음의 유전자 중 하나 이상의 파괴를 포함할 수 있다: TRAC, β2M, PD-1, 및/또는 CD70(예를 들어, TRAC-/β2M-/CD70-; TRAC-/β2M-/PD-1-; 또는 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-).
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 증가한 세포 증식 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 적어도 20% 더 높은 세포 증식 능력을 나타낸다. 예를 들어, 조작된 T 세포(예를 들어, TRAC-/β2M-/CD70-; TRAC-/β2M-/PD-1-; 또는 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-; CAR을 갖거나 갖지 않음)는 대조군 T 세포에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 더 높은 세포 증식 능력을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 20% 내지 100%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 40% 내지 100%, 40% 내지 90%, 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%의 더 높은 세포 증식 능력을 나타낸다. 세포 증식을 측정하는 방법은 당업자에 공지되어 있고, 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 감소한 탈진을 나타낸다. 예를 들어, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 감소한 수준의 LAG3(또는 다른 탈진 마커)을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, LAG3 발현의 수준은 대조군 T 세포에 비해 적어도 20% 감소한다. 예를 들어, LAG3 발현의 수준은 대조군 T 세포에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, LAG3 발현의 수준은 대조군 T 세포에 비해 20% 내지 100%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 40% 내지 100%, 40% 내지 90%, 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 또는 50% 내지 60% 감소한다. 일부 구현예에서, 감소한 탈진은 TIGIT, PD-1, LAG-3 또는 이들의 조합을 포함하는 탈진 마커의 감소한 표면 발현을 측정하여 결정된다. 표면 발현을 측정하는 방법은 당업자에 공지되어 있고, 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 증가한 세포 생존능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 적어도 20%의 세포 생존능력 증가를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 세포 생존능력 증가를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 20% 내지 100%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 40% 내지 100%, 40% 내지 90%, 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%의 세포 생존능력 증가를 나타낸다. 세포 생존능력을 측정하는 방법은 당업자에 공지되어 있고, 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 증가한 세포 용해 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 세포 용해 능력(적어도 20% 초과의 표적 세포의 사멸)의 적어도 20% 증가를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 세포 용해 능력 증가를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 20% 내지 100%, 20% 내지 90%, 20% 내지 80%, 20% 내지 70%, 20% 내지 60%, 20% 내지 50%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 40% 내지 100%, 40% 내지 90%, 40% 내지 80%, 40% 내지 70%, 40% 내지 60%, 40% 내지 50%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 또는 50% 내지 60%의 세포 용해 능력 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조작된 T 세포는 대조군 세포에 비해 증가한 사이토카인 분비를 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서 조작된 T 세포에 의해 분비된 사이토카인(예를 들어, IL-2 및/또는 IFN-감마)의 수준은 대조군 T 세포에 의해 분비된 사이토카인의 수준보다 적어도 2배(예를 들어, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 5배) 더 높다.
일부 구현예에서, 대조군 T 세포는 내인성 CD70 단백질(T 세포에 의해 보통 발현된 CD70)을 발현하는 조작된 T 세포(예를 들어, 유전자 편집된 T 세포)이다. 일부 구현예에서, 대조군 T 세포는 내인성 CD70 단백질을 발현하고, CAR을 암호화하는 핵산의 삽입에 의해 파괴된 TRAC 유전자(예를 들어, 항-CD70 CAR 또는 항-BCMA CAR), 파괴된 β2M 유전자, 파괴된 PD-1 유전자, 또는 상기 파괴된 유전자의 임의의 조합을 포함하는 조작된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 대조군 T 세포는 비편집된 T 세포이다.
놀랍게도, 본 발명의 다중-유전자 편집된 CAR T 세포(예를 들어, TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70- 세포)는 암 세포에 의한 다수의 시험감염(재시험감염(들)이라고도 칭함) 후에 세포독성(암 세포를 사멸하는 능력)을 유지시킨다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 적어도 1회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 여기서 표적 세포는 CAR T 세포에 의해 인식된 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 적어도 2회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 여기서 표적 세포는 CAR T 세포에 의해 인식된 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 적어도 1회 재시험감염 후에 세포독성을 유지한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 적어도 2회 재시험감염 후에 세포독성을 유지한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 여기서 표적 세포는 CAR T 세포에 의해 인식된 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 여기서 표적 세포는 CAR T 세포에 의해 인식된 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 10회 이상의 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 여기서 표적 세포는 CAR T 세포에 의해 인식된 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 10회 이상의 재시험감염 후에 세포독성을 유지한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 CD70에 특이적인 CAR을 발현하고, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)는 CD70을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 CD19에 특이적인 CAR을 발현하고, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)는 CD19를 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 CD33에 특이적인 CAR을 발현하고, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)는 CD33을 발현한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 BCMA에 특이적인 CAR을 발현하고, 표적 세포(예를 들어, 암 세포)는 BCMA를 발현한다.
유전자 편집 방법
유전자 편집(게놈 편집 포함)은 뉴클레오타이드(들)/핵산(들)이 DNA 서열, 예컨대 표적화된 세포의 게놈에서 삽입되고/되거나, 결실되고/되거나, 치환된 유전자 조작의 유형이다. 표적화된 유전자 편집은 (예를 들어, 표적화된 유전자 또는 표적화된 DNA 서열에서) 표적화된 세포의 게놈에서의 미리 선택된 부위에서 삽입, 결실, 및/또는 치환이 가능하게 한다. 내인성 유전자의 서열이 예를 들어 뉴클레오타이드(들)/핵산(들)의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 편집될 때, 영향받은 서열을 포함하는 내인성 유전자는 서열 변경으로 인해 넉아웃 또는 넉다운될 수 있다. 따라서, 표적화된 편집은 내인성 유전자 발현을 파괴시키도록 이용될 수 있다. "표적화된 통합"은 삽입 부위에서의 내인성 서열의 결실을 가지며 또는 결실 없이 하나 이상의 외인성 서열의 삽입을 수반하는 과정을 지칭한다. 표적화된 통합은 외인성 서열을 함유하는 공여자 주형이 존재할 때 표적화된 유전자 편집으로부터 생길 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "파괴된 유전자"는 내인성 유전자로부터의 기능적 단백질의 발현이 감소되거나 저해되도록 내인성 유전자에 비해 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 유전자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "유전자의 파괴"는 내인성 유전자로부터의 기능적 단백질의 발현이 감소되거나 저해되도록 내인성 유전자에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드/핵산을 삽입, 결실 또는 치환시키는 방법을 지칭한다. 유전자를 파괴시키는 방법은 당업자에 공지되어 있고, 본원에 기재된다.
표적화된 편집은 뉴클레아제 독립적 접근법을 통해 또는 뉴클레아제 의존적 접근법을 통해 달성될 수 있다. 뉴클레아제 독립적 표적화된 편집 접근법에서, 상동성 재조합은 숙주 세포의 효소 기계를 통해 내인성 서열로 도입되는 외인성 폴리뉴클레오타이드와 측접하는 상동성 서열에 의해 가이드된다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 내인성 서열에서 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 대체를 도입할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제 의존적 접근법은 특정 희귀-절단 뉴클레아제(예를 들어, 엔도뉴클레아제)에 의해 이중 가닥 절단(DSB)의 특정 도입을 통해 더 높은 빈도로 표적화된 편집을 달성할 수 있다. 이러한 뉴클레아제 의존적 표적화된 편집은 또한 DNA 복구 기전, 예를 들어, DSB에 반응하여 생기는 비상동성 말단 연결(NHEJ: non-homologous end joining)을 이용한다. NHEJ에 의한 DNA 복구는 대개 적은 수의 내인성 뉴클레오타이드의 랜덤 삽입 또는 결실(삽입/결실)로 이어진다. NHEJ 매개 복구와 반대로, 복구는 또한 상동성 직접 복구(HDR: homology directed repair)에 의해 발생할 수 있다. 한쌍의 상동성 아암에 의해 측접된 외인성 유전 재료를 함유하는 공여자 주형이 존재할 때, 외인성 유전 재료는 HDR에 의해 게놈으로 도입될 수 있고, 이는 외인성 유전 재료의 표적화된 통합을 생성한다.
특이적 및 표적화된 DSB를 도입할 수 있는 이용 가능한 엔도뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 RNA-가이드된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제(CRISPR/Cas9; 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 연관 9)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가로, phiC31 및 Bxb1 인터그라아제를 이용하는 DICE(이중 인터그라아제 카세트 교환) 시스템은 또한 표적화된 통합에 사용될 수 있다.　
ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인(ZFBD)에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이고, 이 도메인은 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 폴리펩타이드 도메인이다. 징크 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 징크 핑거 결합 도메인 내의 약 30개의 아미노산의 도메인이다. 징크 핑거의 예는 C2H2 징크 핑거, C3H 징크 핑거 및 C4 징크 핑거를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 설계된 징크 핑거 도메인은 설계/조성이 원칙적으로 합당한 기준, 예를 들어 치환 규칙 및 존재하는 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 저장하는 데이터베이스에서 정보 가공을 위해 컴퓨터화된 알고리즘의 적용으로부터 생기는 자연에서 생기지 않는 도메인이다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 WO 98/53058호; WO 98/53059호; WO 98/53060호; WO 02/016536호 및 WO 03/016496호를 참조한다. 선택된 징크 핑거 도메인은 경험적 과정, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택으로부터 주로 생성되는 자연에서 발견되지 않는 도메인이다. ZFN은 미국 특허 제7,888,121호 및 미국 특허 제7,972,854호에 더 자세히 기재되어 있다. ZFN의 가장 인정되는 예는 FokI 뉴클레아제와 징크 핑거 DNA 결합 도메인의 FokI 뉴클레아제의 융합체이다.　
TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 융합된 뉴클레아제를 포함하는 표적화된 뉴클레아제이다. "전사 활성자 유사 효과기 DNA 결합 도메인", "TAL 효과기 DNA 결합 도메인" 또는 "TALE DNA 결합 도메인"은 DNA에 대한 TAL 효과기 단백질의 결합의 원인인 TAL 효과기 단백질의 폴리펩타이드 도메인이다. TAL 효과기 단백질은 감염 동안 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원균에 의해 분비된다. 이 단백질은 식물 세포의 핵에 들어가고, 이의 DNA 결합 도메인을 통해 효과기-특이적 DNA 서열에 결합하고, 이의 전사촉진 도메인을 통해 이 서열에서 유전자 전사를 활성화한다. TAL 효과기 DNA 결합 도메인 특이성은 반복부 가변-이잔기(RVD: repeat variable-diresidue)라 불리는 선택 반복 위치에서 다형성을 포함하는 효과기-가변 수의 불완전 34 아미노산 반복부에 따라 달라진다. TALEN은 미국 특허 출원 제2011/0145940호에 더 자세히 기재되어 있다. 당해 분야에서 TALEN의 가장 인정되는 예는 FokI 뉴클레아제와 TAL 효과기 DNA 결합 도메인의 융합 폴리펩타이드이다.　
본원에 제공된 바와 같은 용도에 적합한 표적화된 뉴클레아제의 추가의 예는, 개별적으로 사용되든 또는 조합으로 사용되든, Bxb1, phiC31, R4, PhiBT1 및 Wβ/SPBc/TP901-1을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
표적화된 뉴클레아제의 다른비제한적인 예는 자연 발생 및 재조합 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR/Cas9, 제한 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제 호밍 엔도뉴클레아제 등을 포함한다.　
CRISPR-Cas9 유전자 편집
CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 사용된 RNA-가이드 DNA-표적화 플랫폼으로서 재목적화된 원핵생물에서 자연 발생 방어 기전이다. 이것은 DNA의 절단을 표적화하기 위해 DNA 뉴클레아제 Cas9, 및 crisprRNA(crRNA) 및 전사촉진 RNA(tracrRNA)의 2개의 비암호화 RNA에 의존한다. CRISPR은 예를 들어 원핵생물을 감염시키거나 공격한 바이러스에 의해 세포에 이전에 노출된 외래 DNA와 유사성을 갖는 DNA의 단편(스페이서 DNA)을 함유하는 박테리아 및 고세균의 게놈에서 발견된 DNA 서열의 패밀리인 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부)의 약어이다. 이 DNA 단편은 후속하는 공격 동안 예를 들어 유사한 바이러스로부터의 재도입시 유사한 외래 DNA를 검출하고 파괴시키도록 원핵생물에 의해 사용된다. CRISPR 유전좌위의 전사는 외래 외인성 DNA를 인식하고 절단할 수 있는 Cas (CRISPR 연관된) 단백질과 회합하고 이를 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 RNA 분자를 형성시킨다. CRISPR/Cas 시스템의 많은 유형 및 클래스가 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Koonin et al., (2017) Curr Opin Microbiol 37:67-78] 참조).
crRNA는 전형적으로 표적 DNA에서 20개의 뉴클레오타이드(nt) 서열과 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍짓기를 통해 CRISPR-Cas9 복합체의 서열 인식 및 특이성을 유도한다. crRNA에서의 5' 20nt의 서열의 변경은 특이적 유전좌위로의 CRISPR-Cas9 복합체의 표적화를 허용한다. 표적 서열 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라 칭해지는 특이적 짧은 DNA 모티프(서열 NGG를 가짐)가 있으면 CRISPR-Cas9 복합체는 crRNA, 단일-가이드 RNA(sgRNA)의 처음의 20 nt에 일치하는 서열을 함유하는 DNA 서열에 오직 결합한다.
TracrRNA는 촉매 활성 CRISPR-Cas9 복합체를 형성하기 위해 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 결합된 RNA-듀플렉스 구조를 형성하기 위해 crRNA의 3' 말단으로 혼성화하고, 이후 이것은 표적 DNA를 절단할 수 있다.
CRISPR-Cas9 복합체가 표적 부위에서 DNA에 결합되면, Cas9 효소 내의 2개의 독립적인 뉴클레아제 도메인은 각각 PAM 부위의 상류에 DNA 가닥의 하나를 절단하여서, 이중-가닥 절단(DSB)을 남기고, DNA의 가닥 둘 다는 염기쌍에서 종료한다(무딘 말단).
특이적 표적 부위에서의 DNA의 CRISPR-Cas9 복합체의 결합 및 부위-특이적 DSB의 형성 후, 다음의 핵심 단계는 DSB의 복구이다. 세포는 DSB를 복구하기 위한 2개의 주요 DNA 복구 경로를 이용한다: 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성 직접 복구(HDR).
NHEJ는 비분열 세포를 포함하는 대부분의 세포 유형에서 고도로 활성으로 보이는 강력한 복구 기전이다. NHEJ는 오류 발생이 쉽고, 대개 DSB의 부위에서 1개의 뉴클레오타이드와 수백개의 뉴클레오타이드 사이에 제거 또는 부가를 발생시킬 수 있긴 하지만, 이러한 변형은 전형적으로 20 nt 미만이다. 생성된 삽입 및 결실(삽입/결실)은 유전자의 암호화 영역 또는 비암호화 영역을 파괴할 수 있다. 대안적으로, HDR은 고충실도로 DSB를 복구하기 위해 내인성으로 또는 외인성으로 제공된 상동성 공여자 DNA의 긴 스트레치를 이용한다. HDR은 분열 세포에서 오직 활성이고, 대부분의 세포 유형에서 비교적 낮은 빈도로 생긴다. 본 발명의 많은 구현예에서, NHEJ는 복구 오페란트로서 이용된다.
일부 구현예에서, 다른 Cas9 동족체가 사용될 수 있지만, Cas9 (CRISPR 연관 단백질 9) 엔도뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오게네스 유래이다. 야생형 Cas9가 사용될 수 있거나, Cas9의 변형된 버전(예를 들어, Cas9의 진화된 버전, 또는 Cas9 오쏠로그 또는 변이체)이 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있다고 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, Cas9는 다른 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cpf1(클래스 II CRISPR/Cas 시스템의 것)로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 I형, II형 또는 III형 시스템으로부터 유래된 성분을 포함한다. CRISPR/Cas 유전좌위에 대한 업데이트된 분류 체계는 I형 내지 V형 또는 VI형을 갖는 클래스 1 및 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템을 한정한다(Makarova et al., (2015) Nat Rev Microbiol, 13(11):722-36; Shmakov et al., (2015) Mol Cell, 60:385-397). 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템은 단일 단백질 효과기를 갖는다. II형, V형 및 VI형의 Cas 단백질은 본원에서 "클래스 2 Cas 뉴클레아제"라 불리는 단일-단백질, RNA-가이드 엔도뉴클레아제이다. 클래스 2 Cas 뉴클레아제는 예를 들어 Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 및 C2c3 단백질을 포함한다. Cpf1 뉴클레아제(Zetsche et al., (2015) Cell 163:1-13)는 Cas9에 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 II형 CRISPR/Cas 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템으로부터의 Cas9 단백질) 유래이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템(단일-단백질 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질) 유래이다. 단백질의 Cas9 및 Cpf1 패밀리는 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소이고, 이들은 본원에서 추가로 기재된 것처럼 적절한 가이드 RNA를 설계함으로써 원하는 핵산 표적을 절단하도록 지시될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 하나 초과의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 적어도 하나의 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인(예를 들어, Cpf1) 및 적어도 하나의 HNH 유사 뉴클레아제 도메인(예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 표적 서열에서 DSB를 도입한다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 오직 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 함유하도록 변형된다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 뉴클레아제 도메인의 하나가 이의 핵산 절단 활성을 감소시키도록 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 변형된다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 기능적 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인을 함유하지 않도록 변형된다. 다른 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 기능적 HNH-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하지 않도록 변형된다. 오직 하나의 뉴클레아제 도메인이 기능적인 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제는 표적 서열로 단일-가닥 절단("닉")을 도입할 수 있는 니카아제이다. 일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 변경시키도록 치환된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 니카아제는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함한다. RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 (S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제에 기초한) D10A를 포함한다. 일부 구현예에서, 니카아제는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함한다. HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 (S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제에 기초한) E762A, H840A, N863A, H983A 및 D986A를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 I형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 I형 CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분이다. 예를 들어, Cas 뉴클레아제는 Cas3 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 III형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 IV형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 V형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 VI형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된다.
가이드 RNA
본 발명은 표적 핵산 내의 특이적 표적 서열에 관련 폴리펩타이드(예를 들어, 부위 지정 폴리펩타이드)의 활성을 지시할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 제공한다. 게놈-표적화 핵산은 RNA일 수 있다. 게놈-표적화 RNA는 본원에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA”로 칭해진다. 가이드 RNA는 관심 있는 표적 핵산 서열 및 CRISPR 반복 서열에 혼성화하는 적어도 스페이서 서열을 포함한다. II형 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열이라 불리는 제2 RNA를 포함한다. II형 gRNA에서, CRISPR 반복 서열 및 tracrRNA 서열은 듀플렉스를 형성하도록 서로에 혼성화한다. V형 gRNA에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 시스템 둘 다에서, 듀플렉스는 부위 지정 폴리펩타이드에 결합하여, 가이드 RNA 및 부위 지정 폴리펩타이드는 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산은 부위 지정 폴리펩타이드와의 이의 회합에 의해 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 게놈-표적화 핵산은 따라서 부위 지정 폴리펩타이드의 활성을 지시한다.
당업자에 의해 이해되는 것처럼, 각각의 가이드 RNA는 이의 게놈 표적 서열에 상보성인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 문헌[Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012) and Deltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 구현예에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 단일-분자 가이드 RNA이다.
이중-분자 가이드 RNA는 RNA의 2개의 가닥을 포함한다. 제1 가닥은 5'에서 3' 방향으로 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열(최소 CRISPR 반복 서열에 상보성), 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다.
II형 시스템에서의 단일-분자 가이드 RNA("sgRNA"라 칭함)는 5'에서 3' 방향으로 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다. 선택적인 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 추가의 기능(예를 들어, 안정성)의 원인인 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 헤어핀 구조를 형성하도록 최소 CRISPR 반복부 및 최소 tracrRNA 서열을 연결한다. 선택적인 tracrRNA 연장은 하나 이상의 헤어핀을 포함한다.
V형 시스템에서의 단일-분자 가이드 RNA는 5'에서 3' 방향으로 최소 CRISPR 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 20개의 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 20개 미만의 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 20개 초과의 뉴클레오타이드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에서 17개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 갖는 가변 길이 스페이서 서열을 포함한다(표 3 참조).
일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 우라실을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 하나 이상의 우라실을 포함한다. 예를 들어, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 1개의 우라실(U)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 2개의 우라실(UU)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 3개의 우라실(UUU)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 4개의 우라실(UUUU)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 5개의 우라실(UUUUU)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 6개의 우라실(UUUUUU)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 7개의 우라실(UUUUUUU)을 포함할 수 있다. sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에서 8개의 우라실(UUUUUUUU)을 포함할 수 있다.
sgRNA는 비변형 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형된 sgRNA는 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
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예시에 의해, CRISPR/Cas/Cpf1 시스템에서 사용된 가이드 RNA, 또는 다른 더 작은 RNA는 하기 예시되고 당해 분야에 기재된 바대로 화학 수단에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 화학 합성 절차가 계속해서 기술되지만, 고성능 액체 크로마토그래피(PAGE와 같은 겔의 사용을 피하는 HPLC)와 같은 절차에 의한 이러한 RNA의 정제는 폴리뉴클레오타이드 길이가 100개의 이러한 뉴클레오타이드를 넘어 상당히 증가하면서 더 도전적이 된다. 더 긴 길이의 RNA를 생성하기 위해 사용된 하나의 접근법은 함께 결찰된 2개 이상의 분자를 생성하는 것이다. 훨씬 더 긴 RNA, 예컨대 Cas9 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 것은 효소에 의해 더 용이하게 생성된다. 다양한 유형의 RNA 변형은 당해 분야에 기재된 바대로 안정성을 향상시키고/시키거나, 선천성 면역 반응의 가능성 또는 정도를 감소시키고/시키거나, 다른 속성을 향상시키는 변형과 같은 RNA의 화학 합성 및/또는 효소 생성 동안에 또는 후에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 삽입/결실 빈도(편집 빈도)는 고도로 효율적인 gRNA 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있는 TIDE 분석을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 고도로 효율적인 gRNA는 80% 초과의 유전자 편집 빈도를 생성한다. 예를 들어, gRNA는 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 유전자 편집 빈도를 생성하면 고도로 효율적인 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 2개의 가이드 RNA를 사용하여 게놈 서열의 결실에 의해 발생할 수 있다. 세포에서 게놈 결실을 생성하기 위한(예를 들어, 세포에서 유전자를 넉아웃하기 위한) CRISPR-Cas 유전자 편집 기술의 방법은 공지되어 있다(Bauer DE et al. Vis. Exp. 2015;95;e52118).
스페이서 서열
일부 구현예에서, gRNA는 스페이서 서열을 포함한다. 스페이서 서열은 관심 있는 표적 핵산의 표적 서열(예를 들어, DNA 표적 서열, 예컨대 게놈 표적 서열)을 한정하는 서열(예를 들어, 20개의 뉴클레오타이드 서열)이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 스페이서 서열은 20개의 뉴클레오타이드이다.
"표적 서열"은 PAM 서열에 인접하고, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9)에 의해 변형된 서열이다. "표적 핵산"은 이중 가닥 분자인데, 하나의 가닥은 표적 서열을 포함하고 "PAM 가닥"이라 칭해지고, 다른 상보성 가닥이 "비-PAM 가닥"이라 칭해진다. 당업자는 gRNA 스페이서 서열이 관심 있는 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 위치한 표적 서열의 역보체에 혼성화한다는 것을 인식한다. 따라서, gRNA 스페이서 서열은 표적 서열의 RNA 등가물이다. 예를 들어, 표적 서열이 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'(서열 번호 86)이면, gRNA 스페이서 서열은 5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'(서열 번호 98)이다. gRNA의 스페이서는 혼성화(즉, 염기 쌍짓기)를 통해 서열-특이적 방식으로 관심 있는 표적 핵산과 상호작용한다. 스페이서의 뉴클레오타이드 서열은 따라서 관심 있는 표적 핵산의 표적 서열의 따라 변한다.
본원에서의 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서 서열은 이 시스템에서 사용된 Cas9 효소의 PAM의 5'에 위치한 표적 핵산의 영역에 혼성화하도록 설계된다. 스페이서는 표적 서열과 완벽히 일치할 수 있거나, 미스매치를 가질 수 있다. 각각의 Cas9 효소는 이것이 표적 DNA에서 인식하는 특정 PAM 서열을 갖는다. 예를 들어, S. 피오게네스는 표적 핵산에서 서열 5'-NRG-3'를 포함하는 PAM을 인식하고, 여기서 R은 A 또는 G 중 어느 하나를 포함하고, N은 임의의 뉴클레오타이드이고, N은 스페이서 서열에 의해 표적화된 표적 핵산 서열의 바로 3'에 있다.
일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20개 미만의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 20개 초과의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 적어도 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 최대 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 PAM의 제1 뉴클레오타이드의 바로 5'에 20개의 염기를 포함한다. 예를 들어, 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'를 포함하는 서열에서, 표적 핵산은 N에 대응하는 서열을 포함하고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드이고, 밑줄 표시된 NRG 서열은 S. 피오게네스 PAM이다.
본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 gRNA의 비제한적인 예는 2018년 5월 11일에 출원된 PCT/IB2018/001619호(본원에 참고로 포함됨)에 제공된다.
gRNA의 제조 방법
본 발명의 gRNA는 비제한적인 예로서 시험관내 전사(IVT), 합성 및/또는 화학 합성 방법, 또는 이들의 조합을 포함하는 당해 분야에서 이용 가능한 적합한 방식에 의해 제조된다. 효소 (IVT), 고상, 액상, 조합된 합성 방법, 작은 영역 합성 및 결찰 방법이 이용된다. 일 구현예에서, gRNA는 IVT 효소 합성 방법을 이용하여 제조된다. IVT에 의해 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 국제 출원 PCT/US2013/30062호에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA를 포함하고, 작제물 및 벡터는 본원에 기재된 gRNA를 시험관내 전사시키기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 비천연 변형된 핵염기는 합성 동안 또는 합성 후 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 gRNA로 도입된다. 소정의 구현예에서, 뉴클레오사이드간 연결, 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 당에서 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 화학 합성 또는 폴리머라제 효소에 의해 폴리뉴클레오타이드의 말단에서 도입된다. 변형된 핵산 및 이의 합성의 예는 PCT 출원 PCT/US2012/058519호에 개시되어 있다. 변형된 폴리뉴클레오타이드의 합성은 또한 문헌[Verma and Eckstein, Annual Review of Biochemistry, vol. 76, 99-134 (1998)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 효소 또는 화학 결찰 방법은 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 영역을 상이한 기능적 모이어티, 예컨대 표적화 또는 전달 물질, 형광 표지, 액체, 나노입자 등과 접합시키기 위해 사용된다. 폴리뉴클레오타이드 및 변형된 폴리뉴클레오타이드의 접합체는 문헌[Goodchild, Bioconjugate Chemistry, vol. 1(3), 165-187 (1990)]에서 검토되어 있다.
본 발명의 소정의 구현예는 또한 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 gRNA를 암호화하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA 분자이다. 다른 구현예에서, 핵산은 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 핵산은 crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 반복 서열의 전부 또는 일부에 의해 측접된 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 tracrRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA 및 tracrRNA는 2개의 별개의 핵산에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 tracrRNA는 단일 핵산에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, crRNA 및 tracrRNA는 단일 핵산의 반대의 가닥에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 tracrRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 gRNA는 당해 분야에 기재된 임의의 수단(예를 들어, WO/2005/01248호 참조)에 의해 화학적으로 합성된다. 화학 합성 절차가 계속해서 기술되지만, 고성능 액체 크로마토그래피(PAGE와 같은 겔의 사용을 피하는 HPLC)와 같은 절차에 의한 이러한 RNA의 정제는 폴리뉴클레오타이드 길이가 100개의 이러한 뉴클레오타이드를 넘어 상당히 증가하면서 더 도전적이 된다. 더 긴 길이의 RNA를 생성하기 위해 사용된 하나의 접근법은 함께 결찰된 2개 이상의 분자를 생성하는 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 gRNA는 효소 방법(예를 들어, 시험관내 전사, IVT)에 의해 합성된다.
다양한 유형의 RNA 변형은 당해 분야에 기재된 바대로 안정성을 향상시키고/시키거나, 선천성 면역 반응의 가능성 또는 정도를 감소시키고/시키거나, 다른 속성을 향상시키는 변형과 같은 RNA의 화학 합성 및/또는 효소 생성 동안에 또는 후에 도입될 수 있다.
소정의 구현예에서, 하나 초과의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템이 하나 초과의 표적 핵산을 절단하도록 각각의 가이드 RNA는 상이한 표적화 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 동일한 또는 다른 특성, 예컨대 Cas9 RNP 복합체 내에 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 하나 초과의 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각각의 가이드 RNA는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에 암호화될 수 있다. 하나 초과의 가이드 RNA의 발현을 유도하도록 사용된 프로모터는 동일하거나 상이하다.
가이드 RNA는 crRNA의 표적화 서열(예를 들어, 스페이서 서열)을 통해 임의의 관심 서열을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열과 표적 핵산 분자 상의 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 100% 상보성이다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 적어도 하나의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 1개 내지 6개의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 표적화 서열 및 표적 핵산 분자 상의 표적 서열은 5개 또는 6개의 미스매치를 함유할 수 있다.
표적화 서열의 길이는 CRISPR/Cas9 시스템 및 사용된 성분에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터의 상이한 Cas9 단백질은 다양한 최적 표적화 서열 길이를 갖는다. 따라서, 표적화 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 50개 초과의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 18개 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 서열은 20개의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질은 리보핵단백질(RNP), 예를 들어 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 가이드 RNA는 Cas 단백질을 표적 핵산 분자(예를 들어, 게놈 DNA 분자) 상의 표적 서열에 가이드할 수 있고, 여기서 Cas 단백질은 표적 핵산을 절단한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 복합체는 Cpf1/가이드 RNA 복합체이다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 II형 CRISPR/Cas9 복합체이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 복합체는 Cas9/가이드 RNA 복합체이다.
가이드 RNA 및 뉴클레아제의 전달
일부 구현예에서, gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 동시에 또는 순차적으로 별개로 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 세포에 함께 전달된다. 일부 구현예에서, gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 리보핵단백질(RNP)을 형성하도록 함께 예비복합체화된다.
RNP는 적어도 핵산-농후 세포 환경에서 잡다한 상호작용의 위험을 최소화하고 분해로부터 RNA를 보호하므로 유전자 편집에 유용하다. RNP를 형성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9 뉴클레아제) 및 관심 유전자를 표적화하는 gRNA를 함유하는 RNP는 세포(예를 들어, T 세포)에 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기천공에 의해 T 세포에 전달된다.
본원에 사용된 바와 같이, "TRAC 표적화 RNP"는 RNA-가이드 뉴클레아제와 예비복합체화된 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "β2M 표적화 RNP"는 RNA-가이드 뉴클레아제와 예비복합체화된 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "CD70 표적화 RNP"는 RNA-가이드 뉴클레아제와 예비복합체화된 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "PD-1 표적화 RNP"는 RNA-가이드 뉴클레아제와 예비복합체화된 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 지칭한다.
일부 구현예에서, TRAC 표적화 RNP는 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, β2M 표적화 RNP는 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, CD70 표적화 RNP는 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, PD-1 표적화 RNP는 세포에 전달된다.
일부 구현예에서, 하나 초과의 RNP는 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 RNP는 별개로 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 RNP는 동시에 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 하기 RNP 중 적어도 하나는 세포에 전달된다:
(i) TRAC 표적화 RNP;
(ii) β2M 표적화 RNP;
(iii) CD70 표적화 RNP; 또는
(iv) PD-1 표적화 RNP. 일부 구현예에서, 하기 RNP 중 적어도 2개는 세포에 전달된다:
(i) TRAC 표적화 RNP;
(ii) β2M 표적화 RNP;
(iii) CD70 표적화 RNP; 또는
(iv) PD-1 표적화 RNP.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 RNA-가이드 뉴클레아제를 발현하는 DNA 벡터, RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 RNA, 또는 단백질에서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 유전자를 표적화는 gRNA는 RNA, 또는 gRNA를 발현하는 DNA 벡터로서 세포에 전달된다.
RNA-가이드 뉴클레아제, gRNA, 및/또는 RNP의 전달은 직접 주사 또는 공지된 방법, 예를 들어, 전기천공 또는 화학 형질주입을 이용한 세포 형질주입을 통해서일 수 있다. 다른 세포 형질주입 방법을 이용할 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포
키메라 항원 수용체는 종양 세포에 의해 발현된 항원을 인식하고 이에 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 지칭한다. 일반적으로, CAR은 T 세포에 설계되고, T 세포 수용체(TCR) 복합체의 신호전달 도메인 및 항원-인식 도메인(예를 들어, 항체의 단일 사슬 단편(scFv) 또는 다른 항체 단편)의 키메라이다(Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505). CAR을 발현하는 T 세포는 CAR T 세포라 칭해진다. CAR은 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대한 T 세포 특이성 및 반응성을 재지시하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에 항원 가공에 독립적인 항원을 인식하는 능력을 주어, 종양 회피의 주요 기전을 우회한다. 게다가, T 세포에서 발현될 때, CAR은 유리하게는 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이합체화하지 않는다. CAR은 대개 이들이 결합하는 항원에 참조가 된다. 예를 들어, "CD19 CAR", "CD70 CAR", "CD33 CAR" 및 "BCMA CAR"은 각각 CD19, CD70, CD33 또는 BCMA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 따라서, 이러한 용어는 항-CD19 CAR, 항-CD70 CAR, 항-CD33 CAR 및 항-BCMA CAR과 상호 교환가능하다. 항원에 특이적으로 결합하는 CAR이 어느 한 용어로 지칭될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
CAR의 4세대가 있고, 이들의 각각은 상이한 성분을 함유한다. 1세대 CAR은 항체 유래 scFv를 힌지 및 막관통 도메인을 통해 T 세포 수용체의 CD3제타(ζ 또는 z) 세포내 신호전달 도메인에 연결한다. 2세대 CAR은 동시자극 신호를 공급하도록 추가의 도메인, 예를 들어 CD28, 4-1BB(41BB) 또는 ICOS를 혼입시킨다. 3세대 CAR은 TCR CD3ζ 사슬과 융합된 2개의 동시자극 도메인을 함유한다. 3세대 동시자극 도메인은 예를 들어 CD3ζ, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS 또는 OX40의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 단일 사슬 가변 단편(scFv)으로부터 흔히 유래된 엑토도메인, 힌지, 막관통 도메인 및 CD3Ζ 및/또는 동시자극 분자로부터 유래된 1개(1세대), 2개(2세대) 또는 3개(3세대)의 신호전달 도메인을 갖는 엔도도메인을 함유한다(Maude et al., Blood. 2015; 125(26):4017-4023; Kakarla and Gottschalk, Cancer J. 2014; 20(2):151-155).
CAR은 전형적으로 이의 기능적 특성이 다르다. T 세포 수용체의 CD3ζ 신호전달 도메인은 관여될 때 T 세포를 활성화하고 이의 증식을 유도하지만, 아네르기(말초 림프구 관용성을 직접 유도하는 신체의 방어 기전에 의한 반응의 결여)로 이어질 수 있다. 림프구는 특이적 항원에 반응할 수 없을 때 아네르기로 생각된다. 2세대 CAR에서의 동시자극 도메인의 첨가는 변형된 T 세포의 복제 능력 및 지속성을 개선하였다. 유사한 항종양 효과는 CD28 또는 4-1BB CAR에 의해 시험관내 관찰되지만, 전임상 생체내 연구는 4-1BB CAR이 우수한 증식 및/또는 지속성을 생성시킬 수 있다는 것을 제시한다. 임상 실험은 이 2세대 CAR 둘 다가 생채내 실질적인 T 세포 증식을 유도할 수 있지만, 4-1BB 동시자극 도메인을 함유하는 CAR이 더 길게 지속하는 것으로 보인다는 것을 제시한다. 3세대 CAR은 효력을 증대시키기 위해 다중 신호전달 도메인(동시자극)을 조합한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 1세대 CAR이다. 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 2세대 CAR이다. 또 다른 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 3세대 CAR이다.
일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체, 예컨대 scFv)을 포함하는 세포외 (엑토) 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 (엔도) 도메인을 포함한다.
엑토도메인
엑토도메인은 세포외 유체에 노출된 CAR의 영역이고, 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인, 및 선택적으로 신호 펩타이드, 스페이서 도메인, 및/또는 힌지 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 짧은 링커 펩타이드와 연결된 면역글로불린의 VL 및 VH를 포함하는 단일-사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성을 위한 글리신 및 세린의 스트레치, 및 부가된 용해도를 위한 글루타메이트 및 리신의 스트레치를 갖는 친수성 잔기를 포함한다. 단일-사슬 가변 단편(scFv)은 실제로 항체의 단편이 아니고, 10개 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드와 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 보통 가요성을 위해 글리신이 풍부하고, 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하며, VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나, 또는 그 반대일 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 scFv는 인간화된다. 다른 구현예에서, scFv는 완전 인간이다. 또 다른 구현예에서, scFv는 키메라(예를 들어, 마우스 및 인간 서열의 키메라)이다.
일부 구현예에서, scFv는 (CD70에 특이적으로 결합하는) 항-CD70 scFv이다. 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 항-CD70 scFv 단백질의 비제한적인 예는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, scFv는 (BCMA에 특이적으로 결합하는) 항-BCMA scFv이다. 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 항-BCMA scFv 단백질의 비제한적인 예는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, scFv는 (CD19에 특이적으로 결합하는) 항-CD19 scFv이다. 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 항-CD19 scFv 단백질의 비제한적인 예는 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, scFv는 (CD33에 특이적으로 결합하는) 항-CD33 scFv이다. 본원에 제공된 바대로 사용될 수 있는 항-CD33 scFv 단백질의 비제한적인 예는 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 scFv 단백질을 사용할 수 있다.
신호 펩타이드는 CAR 결합의 항원 특이성을 향상시킬 수 있다. 신호 펩타이드는 항체, 예컨대 비제한적인 예로서 CD8, 및 에피토프 태그, 예컨대 비제한적인 예로서 GST 또는 FLAG로부터 유래될 수 있다. 신호 펩타이드의 예는 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(서열 번호 88) 및 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열 번호 89)를 포함한다. 다른 신호 펩타이드를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서 도메인 또는 힌지 도메인은 CAR의 세포외 도메인(항원 결합 도메인 포함)과 막관통 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 스페이서 도메인은 폴리펩타이드 사슬에서 막관통 도메인을 세포외 도메인 및/또는 세포질 도메인에 연결하도록 작용하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 힌지 도메인은 CAR 또는 이의 도메인에 가요성을 제공하거나, 또는 CAR 또는 이의 도메인의 입체 장애를 방지하도록 작용하는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 스페이서 도메인 또는 힌지 도메인은 300개 이하의 아미노산(예를 들어, 10개 내지 100개의 아미노산, 또는 5개 내지 20개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 스페이서 도메인(들)은 CAR의 다른 영역에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다. 다른 힌지 도메인을 사용할 수 있다.
막관통 도메인
막관통 도메인은 막에 걸친 소수성 알파 헬릭스이다. 막관통 도메인은 CAR의 안정성을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 CAR의 막관통 도메인은 CD8 막관통 도메인이다. 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8 및 CD28 막관통 도메인의 키메라이다. 다른 막관통 도메인을 본원에 제공된 바대로 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD8a 막관통 도메인: FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR(서열 번호 90)이다. 다른 막관통 도메인을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 아미노산 서열: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(서열 번호 126)를 포함하는 CD8a 막관통 도메인이다.
엔도도메인
엔도도메인은 수용체의 기능적 말단이다. 항원 인식 후에, 수용체 클러스터 및 신호는 세포로 전송된다. 가장 흔히 사용되는 엔도도메인 성분은 세(3)개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 CD3-제타이다. 이는 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에 전송한다. 많은 경우에, CD3-제타는 완전 수용성 활성화 신호를 제공할 수 없고, 따라서 동시자극 신호전달이 사용된다. 예를 들어, CD28 및/또는 4-1BB는 증식성/생존 신호를 전송하도록 CD3-제타(CD3ζ)와 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 CAR의 동시자극 분자는 CD28 동시자극 분자이다. 다른 구현예에서, 동시자극 분자는 4-1BB 동시자극 분자이다. 일부 구현예에서, CAR은 CD3ζ 및 CD28을 포함한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD3-제타 및 4-1BB를 포함한다. 또 다른 구현예에서, CAR은 CD3ζ, CD28 및 4-1BB를 포함한다. 표 4는 본원에 사용될 수 있는 4-1BB, CD28 및 CD3-제타로부터 유래된 신호전달 도메인의 예를 제공한다.
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암 항원
CD70
일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 CD70를 표적화하도록 설계된 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 조작된다. CD70은 초기에 T 세포 증식 및 생존에 관여된 동시자극 수용체인 CD27에 대한 리간드로서 확인되었다. CD70은 바이러스 감염 동안 배수 림프절에서 활성화된 T 세포 및 항원 제시 세포의 적은 백분율로 오직 발견된다. 많은 인간 종양은 또한 비제한적인 예로서 고형 암, 예컨대 투명 세포 신장암, 유방암, 위암, 난소암, 교모세포종 및 혈액학적 악성종양을 포함하는 CD70을 발현한다. 정상 조직에서의 이의 제한된 발현 패턴 및 다수의 암에서의 과발현으로 인해, CD70은 매력적인 치료학적 표적이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)를 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 47 또는 서열 번호 49의 서열에 의해 암호화된 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 서열을 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 51의 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 52의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 45의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 46의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 47 또는 서열 번호 49와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 48 또는 서열 번호 서열 번호 50과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 51과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 52와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 45와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 46과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
BCMA
일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 BCMA를 표적화하도록 설계된 CAR에 의해 조작된다. B 세포 성숙 항원(BCMA, CD269)은 종양 괴사 인자 수용체(TNF) 슈퍼패밀리의 구성원이다. BCMA는 B-세포 활성화 인자(BAFF) 및 증식 유도 리간드(APRIL)에 결합한다. 비악성 세포 중에서, BCMA는 혈장 세포 및 성숙 B 세포의 하위집단에 의해 주로 발현된다. BCMA는 다발성 골수종 세포 및 비호지킨 림프종을 포함하는 B-계통 세포에 의해 선택적으로 발현되고, 따라서 BCMA는 또한 매력적인 치료학적 표적이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)를 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 58의 서열에 의해 암호화된 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 59의 서열을 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 60의 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 61의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 56의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 57의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 58과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 59와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 60과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 61과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 56과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 57과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CD19
일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 CD19를 표적화하도록 설계된 CAR에 의해 조작된다. 분화 클러스터 19(CD19)는 백혈병 전구 세포에서 검출 가능한 항원 결정부위이다. 인간 및 쥣과 아미노산 및 핵산 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대 GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 인간 CD19의 아미노산 서열은 UniProt/Swiss-Prot 수탁 번호 P15391로서 발견될 수 있고, 인간 CD19를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 수탁 번호 NM-001178098에서 발견될 수 있다. CD19는 예를 들어 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병 및 비호지킨 림프종을 포함하는 대부분의 B 계통 암에서 발현된다. 이것은 또한 B 세포 전구세포의 초기 마커이다. 예를 들어, 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]을 참조한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)를 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 150의 서열에 의해 암호화된 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 151의 서열을 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 152의 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 153의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 148의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 149의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 150과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 151과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 152와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 153과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 148과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 149와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
CD33
일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 CD33를 표적화하도록 설계된 CAR에 의해 조작된다. Siglec3으로도 공지된 CD33은 시알산에 결합하는 것으로 공지된 골수성 계통의 세포 상에 발현된 막관통 수용체이다. CD33이 암 세포(예를 들어, 급성 골수성 백혈병)에서 발현되면서, CD33이 이 악성종양을 표적화하기 위한 세포 표면 마커를 나타낸다고 생각된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)를 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 138의 서열에 의해 암호화된 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 137의 서열을 포함하는 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 140의 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 141의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 136의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 139의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 138과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 137과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 140과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 141과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 136과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체를 포함하는 CAR은 서열 번호 139과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
항체
항체(복수 형태와 상호교환적으로 사용됨)는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한(즉, 전장) 단일클론 항체뿐만 아니라, 항원 결합 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 가변 단편(scFv), 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 단일 도메인 항체(예를 들어, 낙타 또는 라마 VHH 항체), 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유 변형된 항체를 포함하는 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 배열을 포함한다.
전형적인 항체 분자는 항원 결합에 보통 관여된 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 항원 결합을 담당하는 이 영역/잔기는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 기준 항체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항-CD70 항체 또는 항-BCMA 항체)의 VH/VL 서열의 아미노산 서열로부터 확인될 수 있다. VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"("FR")으로 공지된 더 보존된 영역이 개재된 "상보성 결정 영역"("CDR")으로도 공지된 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다.
프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 당해 분야에 공지된 방법론을 이용하여, 예를 들어 카밧(Kabat) 정의, 쵸티아(Chothia) 정의, AbM 정의, 및/또는 콘택트 정의에 의해 정확히 확인될 수 있고, 이들 모두는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 동일한 CDR을 갖는 2개의 항체는 동일한 방법에 의해 결정된 바와 같이 2개의 항체가 그 CDR의 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 문헌[Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; 및 Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)]을 참조한다. 또한, hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs를 참조한다.
일부 구현예에서, 항체는 scFv, 예컨대 항-CD70 scFv, 항-BCMA scFv, 항-CD19 scFv 또는 항-CD33 scFv이다. 항체는 임의의 종류의 항체, 예컨대 IgD, IgE, IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위종류)을 포함하고, 항체는 임의의 특정 종류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 종류로 배정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 종류의 면역글로불린이 있고, 이들 중 몇몇은 하위종류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 불린다. 면역글로불린의 상이한 종류의 아단위 구조 및 3차원 구성이 잘 공지되어 있다.
본원에 제공된 바대로 사용되는 항체는 쥣과, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원(키메라 또는 인간화된 항체를 포함)일 수 있다. 일부 예에서, 항체는 변형된 불변 영역, 예컨대 면역학적으로 불활성인, 예를 들어 보체 매개 용해를 촉발하지 않거나, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 항원 결합 단편인 비인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 형태를 지칭한다. 대부분, 인간화된 항체는 수혜자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수혜자 항체에서도 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않고, 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하도록 포함된 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체는 최적으로 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 다른 형태의 인간화된 항체는, 원래의 항체로부터 하나 이상의 CDR로부터 "유래된" 하나 이상의 CDR이라고도 칭하는, 원래의 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)을 갖는다. 인간화된 항체는 또한 친화도 성숙을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 항체로부터 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 제1 종으로부터의 가변 영역 또는 가변 영역의 일부 및 제2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 포유류(예를 들어, 비인간 포유류, 예컨대 마우스, 토끼 및 래트)의 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하지만, 불변 부분은 다른 포유류, 예컨대 인간으로부터 유래된 항체에서의 서열에 상동성이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 가변 영역 및/또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 표적 항원, 예컨대 인간 CD70, 인간 BCMA, 인간 CD19 또는 인간 CD33에 특이적으로 결합한다. 표적 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당해 분야에 잘 공지된 용어이고, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법은 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 분자가 대안적인 표적보다 특정 표적 항원과 더 빈번히, 더 신속히, 더 긴 기간으로 및/또는 더 높은 친화도로 반응하거나 회합되면 그 분자는 "특이적 결합"을 나타낸다고 말해진다. 항체가 다른 물질에 결합하는 것보다 더 높은 친화도, 결합도로, 더 신속히, 및/또는 더 긴 기간으로 결합하면 그 항체는 표적 항원에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, CD70, BCMA, CD19 또는 CD33 에피토프에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체는 다른 CD70, BCMA, CD19 또는 CD33 에피토프 또는 비-CD70, 비-BCMA, 비-CD19 또는 비-CD33 에피토프에 결합하는 것보다 더 높은 친화도, 결합도로, 더 신속히, 및/또는 더 긴 기간으로 CD70, BCMA, CD19 또는 CD33 에피토프에 결합하는 항체이다. 이 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있다고 또한 이해된다. 그러므로, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (이것이 포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합의 언급은 우선적 결합을 의미한다.
일부 구현예에서, 항체와 CD70 사이의 평형 해리 상수(KD)는 100 pM 내지 1 μM이다. 일부 구현예에서, 항체와 CD70 사이의 KD는 1 nM 내지 100 nM이다.
일부 구현예에서, 항체와 BCMA 사이의 평형 해리 상수(KD)는 100 pM 내지 1 μM이다. 일부 구현예에서, 항체와 BCMA 사이의 KD는 1 nM 내지 100 nM이다.
일부 구현예에서, 항체와 CD19 사이의 평형 해리 상수(KD)는 100 pM 내지 1 μM이다. 일부 구현예에서, 항체와 CD19 사이의 KD는 1 nM 내지 100 nM이다.
일부 구현예에서, 항체와 CD33 사이의 평형 해리 상수(KD)는 100 pM 내지 1 μM이다. 일부 구현예에서, 항체와 CD33 사이의 KD는 1 nM 내지 100 nM이다.
본원에 개시된 바와 같은 임의의 예시적인 항체의 기능적 변이체는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 기능적 변이체는 기준 항체와 실질적으로 유사한 결합 및 생물학적 활성(예를 들어, 실질적으로 유사한 결합 친화도, 결합 특이성, 저해 활성, 항종양 활성, 또는 이들의 조합)을 보유하면서 기준 항체에 대해 VH 및/또는 VL, 또는 VH CDR 중 하나 이상 및/또는 VL CDR 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 잔기 변이를 함유할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 항체는 기준 항체, 예컨대 항체 A(VH: 서열 번호 51; VL: 서열 번호 52) 또는 항체 B(VH: 서열 번호 60; VL: 서열 번호 61)의 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3과 비교하여 10개 이하의 아미노산 변이(예를 들어, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 총체적으로 함유하는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함한다. "총체적으로"는 모든 3개의 VH CDR에서의 아미노산 변이의 총수가 한정된 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 대안적으로 또는 또한, 항체는 기준 항체의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3과 비교하여 10개 이하의 아미노산 변이(예를 들어, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 총체적으로 함유하는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 항체는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함할 수 있고, 이들 중 적어도 하나는 기준 항체, 예컨대 항체 A(VH: 서열 번호 51; VL: 서열 번호 52) 또는 항체 B(VH: 서열 번호 60; VL: 서열 번호 61)의 대응물 VH CDR로서 5개 이하의 아미노산 변이(예를 들어, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유한다. 구체적인 예에서, 항체는 기준 항체, 예컨대 항체 A(VH: 서열 번호 51; VL: 서열 번호 52) 또는 항체 B(VH: 서열 번호 60; VL: 서열 번호 61)의 VH CDR3으로서 5개 이하의 아미노산 변이(예를 들어, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 VH CDR3을 포함한다. 대안적으로 또는 또한, 항체는 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함할 수 있고, 이들 중 적어도 하나는 기준 항체의 대응물 VL CDR으로서 5개 이하의 아미노산 변이(예를 들어, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유한다. 구체적인 예에서, 항체는 기준 항체의 VL CDR3으로서 5개 이하의 아미노산 변이(예를 들어, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변이)를 함유하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 경우에, 아미노산 잔기 변이는 보존적 아미노산 잔기 치환일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산이 치환된 단백질의 상대 전하 또는 크기 특징을 변경하지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 방법을 집대성한 참고문헌, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 발견되는 것과 같은 당업자에게 공지된 폴리펩타이드 서열을 변경하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 중에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) A → G, S; (b) R → K, H; (c) N → Q, H; (d) D → E, N; (e) C → S, A; (f) Q → N; (g) E → D, Q; (h) G → A; (i) H → N, Q; (j) I → L, V; (k) L → I, V; (l) K → R, H; (m) M → L, I, Y; (n) F → Y, M, L; (o) P → A; (p) S → T; (q) T → S; (r) W → Y, F; (s) Y → W, F; 및 (t) V → I, L.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 기준 항체, 예컨대 항체 A(VH: 서열 번호 51; VL: 서열 번호 52) 또는 항체 B(VH: 서열 번호 60; VL: 서열 번호 61)의 VH CDR과 총체적으로 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 동일한 VH CDR을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 항체는 기준 항체의 VL CDR과 총체적으로 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 98%) 동일한 VL CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 기준 항체, 예컨대 항체 A(VH: 서열 번호 51; VL: 서열 번호 52) 또는 항체 B(VH: 서열 번호 60; VL: 서열 번호 61)의 VH와 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 동일한 VH 및/또는 기준 항체의 VL과 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95% 또는 98%) 동일한 VL을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 각각 서열 번호 51 및 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 서열 번호 51에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 52에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 서열 번호 51에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 52에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 카밧에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 서열 번호 51에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 52에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 쵸티아에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 서열 번호 51에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 52에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 AbM에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 각각 서열 번호 68, 서열 번호 70 및 서열 번호 72에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 62, 서열 번호 64 및 서열 번호 66에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체(예를 들어, 항-CD70 scFv)는 각각 서열 번호 69, 서열 번호 71 및 서열 번호 73에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 63, 서열 번호 65 및 서열 번호 67에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 49에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 48에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD70 항체는 서열 번호 47에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD70 scFv이다.
일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 각각 서열 번호 60 및 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 서열 번호 60에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 61에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 서열 번호 60에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 61에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 카밧에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 서열 번호 60에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 61에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 쵸티아에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 서열 번호 60에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 61에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 AbM에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 각각 서열 번호 80, 서열 번호 82 및 서열 번호 84에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 74, 서열 번호 76 및 서열 번호 78에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체(예를 들어, 항-BCMA scFv)는 각각 서열 번호 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 85에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 75, 서열 번호 77 및 서열 번호 79에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA scFv이다. 일부 구현예에서, 항-BCMA 항체는 서열 번호 58에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-BCMA scFv이다.
일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 각각 서열 번호 152 및 서열 번호 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 서열 번호 152에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 153에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 서열 번호 152에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 153에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 카밧에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 서열 번호 152에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 153에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 쵸티아에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 서열 번호 152에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 153에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 AbM에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 각각 서열 번호 169, 서열 번호 170 및 서열 번호 171에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 각각 서열 번호 166, 서열 번호 167 및 서열 번호 168에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체(예를 들어, 항-CD19 scFv)는 각각 서열 번호 175, 서열 번호 176 및 서열 번호 177에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 172, 서열 번호 173 및 서열 번호 174에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD19 항체는 서열 번호 150에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD19 scFv이다.
일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 각각 서열 번호 140 및 서열 번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 서열 번호 140에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 141에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 서열 번호 140에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 141에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 카밧에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 서열 번호 140에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 141에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 쵸티아에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 서열 번호 140에 기재된 VH의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR2), 및 서열 번호 141에 기재된 VL의 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하고, 여기서 CDR은 AbM에 따라 결정된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 각각 서열 번호 142, 서열 번호 143 및 서열 번호 144에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 145, 서열 번호 146 및 서열 번호 147에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체(예를 들어, 항-CD33 scFv)는 각각 서열 번호 178, 서열 번호 179 및 서열 번호 180에 기재된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 및 서열 번호 145, 서열 번호 146 및 서열 번호 147에 기재된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 137에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD33 scFv이다. 일부 구현예에서, 항-CD33 항체는 서열 번호 138에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 항-CD33 scFv이다.
항원 표적화 키메라 항원 수용체 작제물
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 종양 항원 표적화 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 비종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 일반적으로 발현된 면역원성 분자, 예컨대 단백질을 언급하는 "종양 연관 항원"이고, 비종양 세포에서 이것은 결코 발현되지 않거나, 오직 낮은 수준으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양-보유 숙주의 면역계에 의해 인식된 종양 연관된 구조는 종양 연관된 항원이라 칭해진다. 일부 구현예에서, 종양 연관된 항원은 대부분의 종양에 의해 이것이 광범위하게 발현되면 공통 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 연관된 항원은 분화 항원, 돌연변이성 항원, 과발현된 세포 항원 또는 바이러스 항원이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 종양 세포에 고유한 단백질과 같은 면역원성 분자라 칭해지는 "종양 특이적 항원" 또는 "TSA"이다. 종양 특이적 항원은 배타적으로 종양 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CD70이 아니다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 비-CD70 표적화 CAR(예를 들어, CD70에 결합하지 않는 CAR)을 포함한다.
CD19 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 본원에서 CD19 CAR, 항-CD19 CAR 또는 항-CD19 CAR T 세포라고도 칭하는 CD19 표적화 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 항-CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 적어도 하나의 동시자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 항-CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 또는 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 항-CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 항-CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 항-CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 서열 번호 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 (i) 서열 번호 152 및 서열 번호 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 포함하는 항-CD19 scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD28 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 서열 번호 149에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 서열 번호 148에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD19 CAR은 서열 번호 148에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
CD33 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 본원에서 CD33 CAR, 항-CD33 CAR 또는 항-CD33 CAR T 세포라고도 칭하는 CD33 표적화 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 적어도 하나의 동시자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 또는 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 항-CD33 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 서열 번호 137에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD33 scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 (i) 서열 번호 140 및 서열 번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 포함하는 항-CD33 scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 서열 번호 139에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 서열 번호 136에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD33 CAR은 서열 번호 136에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
BCMA CAR
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 본원에서 BCMA CAR, 항-BCMA CAR 또는 항-BCMA CAR T 세포라고도 칭하는 BCMA 표적화 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 항-BCMA 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 적어도 하나의 동시자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 항-BCMA 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 또는 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 항-BCMA 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 항-BCMA 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 항-BCMA 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 (i) 서열 번호 60 및 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 포함하는 항-BCMA scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 서열 번호 57에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 서열 번호 56에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 서열 번호 56에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
CD70 CAR
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 본원에서 CD70 CAR, 항-CD70 CAR 또는 항-CD70 CAR T 세포라고도 칭하는 CD70 표적화 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 항-CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 적어도 하나의 동시자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 항-CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 또는 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 항-CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) CD28 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 항-CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 항-CD70 항원 결합 도메인을 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 서열 번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 (i) 서열 번호 51 및 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 포함하는 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인, (ii) 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD8 막관통 도메인, 및 (iii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 41BB 동시자극 도메인 및 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 서열 번호 45에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 항-CD70 CAR은 서열 번호 45에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
키메라 항원 수용체 작제물의 발현
공여자 주형
본원에서 공여자 주형이라 칭하는 것(공여자 폴리뉴클레오타이드라고도 칭함)을 포함하는, CAR을 암호화하는 핵산은 T 세포에 전달될 수 있다. 공여자 주형은 관심 있는 게놈 위치에서 효율적인 HDR을 허용하도록 비상동성 서열, 예컨대 상동성의 2개의 영역에 의해 측접된 CAR을 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 공여자 주형은 DNA에서 표적화된 위치와 상동성의 영역을 갖지 않을 수 있고, 표적 부위에서의 절단 후에 NHEJ 의존적 말단 연결에 의해 통합될 수 있다.
공여자 주형은 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포로 도입될 수 있다. 공여자 서열의 말단은 선형 형태로 도입되면 당업자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 엑소뉴클레오틱 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3' 말단에 추가되고/되거나, 자가-상보성 올리고뉴클레오타이드는 말단 중 하나 또는 둘 다에 결찰된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하기 위한 추가의 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.　
공여자 주형은 예를 들어 복제 기원, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가의 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포로 도입될 수 있다. 게다가, 공여자 주형은 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인터그라아제 결함 렌티바이러스(IDLV: integrase defective lentivirus))에 의해 전달될 수 있다.　
일부 구현예에서, 공여자 주형은 통합 부위에서의 내인성 프로모터, 즉 공여자가 삽입된 내인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 이의 발현이 유도되도록 삽입된다. 그러나, 일부 구현예에서, 공여자 주형은 외인성 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 항시적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 프로모터는 서열 번호 123의 서열을 포함하는 EF1α 프로모터이다. 다른 프로모터를 사용할 수 있다.
게다가, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인설레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩타이드를 암호화하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.　
일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 44와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 44의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 55와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 55의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 135와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 135의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 156과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 공여자 주형은 서열 번호 156의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 방법
일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작된 세포로 도입된다. 예를 들어, CAR은 벡터에 의해 조작된 세포로 도입될 수 있다. 당해 분야에 공지된 다양한 상이한 방법은 본원에 개시된 임의의 핵산 또는 발현 벡터를 면역 효과기 세포로 도입하도록 사용될 수 있다. 핵산을 세포로 도입하기 위한 방법의 비제한적인 예는 리포펙션, 형질주입(예를 들어, 인산칼슘 형질주입, 고도로 분지된 유기 화합물을 사용한 형질주입, 양이온 중합체를 사용한 형질주입, 덴드리머-기반 형질주입, 광학 형질주입, 입자-기반 형질주입(예를 들어, 나노입자 형질주입) 또는 리포솜(예를 들어, 양이온 리포솜)을 사용한 형질주입), 미량주사, 전기천공, 세포 스퀴징, 소노포레이션, 원형질체 융합, 임팔레펙션(impalefection), 유체역학적 전달, 유전자총, 마그네토펙션(magnetofection), 바이러스 형질주입 및 뉴클레오펙션을 포함한다.
전달 방법 및 작제물
뉴클레아제 및/또는 공여자 주형은 비제한적인 예로서 플라스미드 벡터, DNA 미니서클, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 연관 바이러스 벡터, 및 이들의 조합을 포함하는 벡터 시스템을 이용하여 전달될 수 있다.
종래의 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포(예를 들어, T 세포)에서 뉴클레아제 및 공여자 주형을 암호화하는 핵산을 도입하도록 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, DNA 미니서클, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포에 대한 전달 후에 에피솜 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다.
핵산의 비바이러스 전달의 방법은 전기천공, 리포펙션, 미량주사, 유전자총법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다중양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 네이키드 RNA, 캡핑된 RNA, 인공 비리온, 및 DNA의 물질-향상된 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용한 소노포레이션은 핵산의 전달에 또한 사용될 수 있다. 일부 구체적인 예가 하기 제공된다.
아데노 연관 바이러스 전달
공여자 CAR을 암호화하는 핵산 작제물은 아데노 연관 바이러스(AAV)를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. AAV는 숙주 게놈으로 부위 특이적으로 통합하고, 따라서 전이유전자, 예컨대 CAR을 전달할 수 있는 작은 바이러스이다. 반전 말단 반복부(ITR)는 AAV 게놈 및/또는 관심 전이유전자를 측접시켜 존재하고, 복제 기원으로서 작용한다. 전사될 때, 표적 세포로의 전달을 위해 AAV 게놈을 캡슐화하는 캡시드를 형성하는 rep 및 cap 단백질이 AAV 게놈에 또한 존재한다. AAV 혈청형을 부여하는 이들 캡시드에서의 표면 수용체는 캡시드가 주로 어떠한 표적 장기에 결합하는지 및 따라서 AAV가 가장 효율적으로 어떠한 세포를 감염시키는지를 결정한다. 현재 공지된 인간 AAV 혈청형은 12개가 있다. 일부 구현예에서, AAV는 AAV 혈청형 6(AAV6)이다.
아데노 연관 바이러스는 여러 이유로 유전자 치료법에 가장 흔히 사용되는 바이러스 중에 있다. 첫째로, AAV는 인간을 포함하는 포유류에 투여시 면역 반응을 유발하지 않는다. 둘째로, AAV는 특히 적절한 AAV 혈청형을 선택하는 것이 고려될 때 표적 세포에 효과적으로 전달된다. 마지막으로, AAV는 게놈이 통합 없이 숙주 세포에 지속할 수 있으므로 분열 세포 및 비분열 세포 둘 다를 감염시키는 능력을 갖는다. 이 속성은 이것이 유전자 치료법에 이상적인 후보이게 한다.
상동성 직접 복구(HDR)
CAR을 암호화하는 공여자 핵산은 표적 유전자 유전좌위로 상동성 직접 복구(HDR)에 의해 삽입된다. 표적 유전좌위에서의 DNA의 가닥 둘 다는 CRISPR Cas9 효소에 의해 절단된다. 이후, HDR은 이중 가닥 절단(DSB)을 복구하고 공여자 DNA를 삽입하도록 발생한다. 이것이 정확히 일어나기 위해서, 공여자 서열은 표적 유전자에서 DSB 부위를 둘러싸는 서열에 상보성인 플랭킹 잔기로 설계된다(이하 "상동성 아암"). 이 상동성 아암은 DSB 복구에 대한 주형으로서 작용하고, HDR이 본질적으로 오류가 없는 기전이게 한다. 상동성 직접 복구(HDR)의 속도는 중첩하는 또는 근처의 표적 부위의 선택이 중요하므로 돌연변이와 절단 부위 사이의 거리의 함수이다. 주형은 상동성 영역에 의해 측접된 초과의 서열을 포함할 수 있거나, 게놈 서열과 다른 서열을 함유할 수 있어서, 서열 편집을 허용한다.
표적 유전자는 대상체에서 면역 반응과 연관될 수 있고, 여기서 표적 유전자의 적어도 일부의 영구적인 결실은 면역 반응을 조절할 것이다. 예를 들어, CAR T 세포를 생성하기 위해, 표적 유전자는 TCRα 불변 영역(TRAC)일 수 있다. TRAC의 파괴는 내인성 TCR의 기능을 소실시킨다.
일부 구현예에서, 표적 유전자는 안전한 보유 유전좌위에 있다.
조작된 T 세포
본 발명의 조작된(유전자 편집된) CAR T 세포는 자가유래("자가") 또는 비자가유래("비자가", 예를 들어 동종이계, 동질유전자 또는 이종발생성)일 수 있다. "자가유래"는 동일한 대상체로부터의 세포를 지칭한다. "동종이계"는 대상체와 동일한 종이지만, 대상체에서의 세포와 유전적으로 다른 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, T 세포는 포유류로부터 얻는다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간으로부터 얻는다.
T 세포는 비제한적인 예로서 말초 혈액 단구 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막삼출, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 원천으로부터 얻어질 수 있다. 소정의 구현예에서, T 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수의 기법, 예컨대 침전, 예를 들어 FICOLL™ 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 T 세포 집단이 사용된다. 일부 구현예에서, 말초 혈액 단구 세포(PBMC)의 단리 후, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 다는 활성화, 팽창, 및/또는 유전자 변형 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
TCRab, CD3, CD4, CD8, CD27 CD28, CD38 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD122, CD95, CD197, CCR7, KLRG1, MCH-I 단백질 및/또는 MCH-II 단백질의 세포 표면 마커 중 하나 이상을 발현하는 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, TCRab, CD4 및/또는 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 중 하나 이상을 발현하는 T 세포의 특정 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리된다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포 집단은 CD70, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, HΜ3 및 LAG3의 마커 중 하나 이상을 발현하지 않거나 실질적으로 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포의 하위집단은 유전 조작 전에 및/또는 유전 조작 후에 양성 또는 음성 선택에 의해 단리될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 T 세포의 집단은 비제한적인 예로서 CD3+, CD4+, CD8+, 또는 이들의 조합을 포함하는 마커 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 공여자, 또는 대상체로부터 단리되고, 유전자 편집을 겪기 전에 시험관내 증식하도록 처음에 활성화되고 자극된다.
T 세포 조성물의 충분한 치료 용량을 달성하기 위해, T 세포는 대개 자극, 활성화 및/또는 팽창으로 1회차 이상 처리된다. T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 및 제6,867,041호에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 팽창될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 T 세포로의 게놈 편집 조성물의 도입 전에 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 3일, 약 2일 내지 약 4일, 약 3일 내지 약 4일, 또는 약 1일, 약 2일, 약 3일 또는 약 4일 동안 활성화되고 팽창된다.
일부 구현예에서, T 세포는 T 세포로의 유전자 편집 조성물의 도입 전에 약 4시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간 또는 약 72시간 동안 활성화되고 팽창된다.
일부 구현예에서, T 세포는 게놈 편집 조성물이 T 세포로 도입되는 동일한 시간에 활성화된다. 본원에 기재된 임의의 유전자 편집 방법에 의해 생성된 T 세포 집단 또는 단리된 T 세포는 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 파괴된 내인성 CD70 유전자 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 것을 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 병원균성 세포에서 발현된 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD70에 결합한다. 다른 구현예에서, CAR은 CD70에 결합하지 않는다. 이러한 T 세포 집단은 파괴된 내인성 예정 세포사-1(PD-1) 유전자, 파괴된 내인성 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자 및 파괴된 내인성 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자의 유전자 편집 중 하나 이상을 갖는 유전자 조작된 T 세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, CAR을 암호화하는 핵산은 TRAC 유전좌위로 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 T 세포의 집단은 파괴된 CD70 유전자 및 병원균성 세포에서 발현된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 T 세포의 집단은 파괴된 CD70 유전자 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 포함하고, 여기서 CAR은 CD70에 결합한다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 T 세포의 집단은 파괴된 CD70 유전자 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 포함하고, 여기서 CAR은 CD70에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 T 세포의 집단은 파괴된 CD70 유전자 및 병원균성 세포에서 발현된 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하고, 파괴된 PD1 유전자를 추가로 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD70에 결합한다. 일부 구현예에서 CAR은 CD70에 결합하지 않는다. 일부 양태에서, CAR은 CD19에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD33에 결합한다. 일부 양태에서, CAR은 BCMA에 결합한다. 임의의 바로 언급된 조작된 T 세포는 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자 및/또는 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
특정 예에서, 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자, 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA CAR, 항-CD19 CAR, 항-CD33 CAR 또는 항-CD70 CAR, 및 선택적으로 파괴된 예정 세포사-1(PD-1) 유전자를 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단이 본원에 제공된다. 본원에 개시된 임의의 조작된 T 세포는 자연적 (비파괴된) HLA 유전자를 함유할 수 있다.
일부 예에서, T 세포의 집단의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 발현하고, 검출 가능한 수준의 표면 CD70을 발현하지 않는다. 이러한 세포는 검출 가능한 수준의 표면 TCR, 검출 가능한 수준의 표면 β2M, 및/또는 검출 가능한 수준의 표면 PD-1을 발현하지 않는 특징을 추가로 보유할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 집단의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 발현하고, 검출 가능한 수준의 표면 CD70, 검출 가능한 수준의 표면 TCR 및 검출 가능한 수준의 표면 β2M을 발현하지 않는다. 일부 경우에, T 세포의 집단의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)는 본원에 개시된 바와 같은 CAR을 발현하고, 검출 가능한 수준의 표면 CD70, 검출 가능한 수준의 표면 TCR, 검출 가능한 수준의 표면 β2M 및 검출 가능한 수준의 PD-1을 발현하지 않는다.
검출 가능한 수준의 표면 CD70을 발현하지 않는 본원에 기재된 바와 같은 CAR을 발현하는 단리된 세포는 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 단리된 세포는 검출 가능한 수준의 표면 TCR, 검출 가능한 수준의 표면 β2M, 및/또는 검출 가능한 수준의 표면 PD-1을 발현할 수 없다. 일부 예에서, 단리된 세포는 TRAC 유전좌위로 삽입된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다.
RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어 본원에 기재된 것(예를 들어, Cas9 뉴클레아제) 및 CD70 유전자를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)(예를 들어, 본원에 기재된 것)를 포함하는 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 T 세포 집단은 본원에 또한 제공된다. 일부 경우에, T 세포 집단에서의 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)는 RNA-가이드 뉴클레아제 및 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA를 포함한다. 이러한 조작된 T 세포 집단은 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA, 및/또는 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 선택적으로 측접된 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 것)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 핵산(예를 들어, 벡터)을 포함하는 조작된 T 세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, T 세포 집단에서의 T 세포의 적어도 50%(예를 들어, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%)는 RNA-가이드 뉴클레아제, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함한다. CAR을 암호화하는 핵산이 TRAC 유전자 유전좌위에 대한 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암을 추가로 포함할 때, T 세포는 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 또한 포함할 수 있다. 또한, T 세포는 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
RNA-가이드 뉴클레아제, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, 및 선택적으로 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA 중 하나 이상, 및 CAR(예를 들어, 본원에 기재된 것)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 핵산(예를 들어, 벡터)을 포함하는 단리된 조작된 T 세포가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. CAR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 측접될 수 있다.
CAR-T 세포의 생성
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 세포의 게놈을 변형시켜 생성된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 부위에서의 이중 가닥 절단(DSB)이 유도된다. 일부 구현예에서, DSB는 하나 이상의 내인성 DNA 복구 경로를 이용하여 복구된다. 일부 구현예에서, DNA 복구 경로는 상동성 서열(예를 들어, 비상동성 말단 연결 경로 또는 NHEJ 경로)을 요하지 않는다. 일부 구현예에서, 복구 경로는 상동성 서열(예를 들어, 상동성 직접 경로 또는 HDR 경로)을 요한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 엔도뉴클레아제로서의 CRISPR-Cas9, 및 하나 이상의 비암호화 RNA에 의해 DSB를 유도하고, HDR 및 본원에 기재된 공여자 폴리뉴클레오타이드 주형을 사용하여 DSB를 복구하여 생성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 TRAC인 표적 유전자의 서열에 상보성인 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 98에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 30에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 98에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA는 서열 번호 118에 기재된 TRAC 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 30에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA는 서열 번호 118에 기재된 TRAC 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 108에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 40에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 108에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA는 서열 번호 118에 기재된 TRAC 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 40에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA는 서열 번호 118에 기재된 TRAC 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 β2M인 표적 유전자의 서열에 상보성인 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 99에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 31에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 99에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA는 서열 번호 119에 기재된 β2M 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 31에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA는 서열 번호 119에 기재된 β2M 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 109에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 41에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 109에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA는 서열 번호 119에 기재된 β2M 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 41에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA는 서열 번호 119에 기재된 β2M 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 CD70인 표적 유전자의 서열에 상보성인 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 94에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 26에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 94에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 114에 기재된 CD70 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 26에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 114에 기재된 CD70 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 104에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 36에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 104에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 114에 기재된 CD70 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 36에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 114에 기재된 CD70 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 CD70인 표적 유전자의 서열에 상보성인 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 95에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 27에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 95에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 115에 기재된 CD70 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 27에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 115에 기재된 CD70 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 105에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 37에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 105에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 115에 기재된 CD70 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 37에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA는 서열 번호 115에 기재된 CD70 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 PD-1인 표적 유전자의 서열에 상보성인 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 100에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 32에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 100에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA는 서열 번호 120에 기재된 β2M 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 32에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA는 서열 번호 120에 기재된 PD-1 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 110에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA 스페이서를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 서열 번호 110에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA는 서열 번호 120에 기재된 PD-1 서열을 표적화한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA는 서열 번호 120에 기재된 PD-1 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 98에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA, 서열 번호 99에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA, 서열 번호 94 또는 서열 번호 95에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA, 및/또는 서열 번호 100에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 108에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA, 서열 번호 109에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA, 서열 번호 104 또는 서열 번호 105에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA, 및/또는 서열 번호 110에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA를 사용하여 생성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 30에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA, 서열 번호 31에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA, 서열 번호 26 또는 서열 번호 27에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA, 및/또는 서열 번호 32에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조작된 T 세포는 서열 번호 40에 기재된 서열을 포함하는 TRAC gRNA, 서열 번호 41에 기재된 서열을 포함하는 β2M gRNA, 서열 번호 36 또는 서열 번호 27에 기재된 서열을 포함하는 CD70 gRNA, 및/또는 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 PD-1 gRNA를 사용하여 생성된다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 CAR을 암호화하는 핵산인 비상동성 서열을 포함하는 공여자 주형을 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 공여자 주형은 TRAC인 표적 유전자에서의 서열에 대응하는 상동성 아암으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 공여자 주형의 5' 상동성 아암(왼쪽 상동성 아암)은 서열 번호 122에 기재된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 주형의 3' 상동성 아암은 서열 번호 125에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 프로모터는 서열 번호 123에 기재된 서열을 포함하는 EF1a 프로모터이다. 일부 구현예에서, 공여자 주형은 서열 번호 135에 기재된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 주형은 서열 번호 156에 기재된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 주형은 서열 번호 44에 기재된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 주형은 서열 번호 55에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA 암호화 폴리뉴클레오타이드, 뉴클레아제 및 공여자 주형은 종래의 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법을 이용하여 세포(예를 들어, T 세포)로 도입된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 gRNA, sgRNA, mRNA 암호화 뉴클레아제 또는 공여자 주형은 비바이러스 벡터 전달 시스템을 이용하여 세포에 전달된다. 비바이러스 벡터 전달 시스템의 예는 DNA 플라스미드, DNA 미니서클, 네이키드 핵산, 리포솜, 리보핵단백질 입자(RNP) 또는 폴록사머를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터 전달 시스템을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 세포로 도입하는 방법은 전기천공, 리포펙션, 미량주사, 유전자총법 또는 물질-향상된 흡수를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 gRNA, sgRNA, mRNA 암호화 뉴클레아제 또는 공여자 주형은 바이러스 벡터 전달 시스템을 이용하여 세포에 전달된다. 바이러스 벡터 전달 시스템의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, CAR 작제물을 암호화하는 공여자 주형은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, CAR 작제물을 암호화하는 공여자 주형은 바이러스 전달 비히클에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 바이러스 전달 비히클은 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터이다.
일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 폴리펩타이드로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA, sgRNA)으로부터 별개로 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)는 하나 이상의 게놈-표적화 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, gRNA, sgRNA)와의 복합체로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 또는 예비복합체화된 엔도뉴클레아제는 비제한적인 예로서 나노입자, 리포솜, 리보핵단백질, 양으로 하전된 펩타이드, 소분자 RNA-접합체, 압타머-RNA 키메라 또는 RNA-융합 단백질 복합체를 포함하는 비바이러스 전달에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제 폴리펩타이드 또는 예비복합체화된 엔도뉴클레아제 폴리펩타이드를 세포에 도입하는 방법은 전기천공, 리포펙션, 미량주사, 유전자총법 또는 물질-향상된 흡수를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 폴리펩타이드는 리보핵단백질 입자 (RNP)를 형성하도록 하나 이상의 sgRNA와 예비복합체화된다. 일부 구현예에서, Cas9/sgRNA RNP는 지질 나노입자를 사용하여 제제화된다. 일부 구현예에서, 공여자 주형은 AAV 벡터를 사용하여 제제화된다. 일부 구현예에서, 제제화된 Cas9/sgRNA RNP의 세포에 대한 전달은 세포의 전기천공에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터로서 제제화된 공여자 주형은 전기천공 전에 전달된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터로서 제제화된 공여자 주형은 전기천공을 이용하여 전달된다. 일부 구현예에서, AAV 벡터로서 제제화된 공여자 주형은 전기천공 후에 전달된다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행된 유전자 편집은 파괴된 TRAC 유전자를 갖는 조작된 T 세포를 생성시킨다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 파괴는 TRAC 유전자 산물의 발현을 제거하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 파괴는 암호화된 유전자 산물의 전사 및 번역을 파괴하거나 저해한다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 파괴는 TRAC 유전자 산물의 발현을 제거하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 발현의 제거 또는 감소는 TCR의 기능 소실과 연관된다. 일부 구현예에서, TCR 기능 소실은 조작된 T 세포가 동종이계 이식에 적합하게 한다(즉, GvHD를 유도할 위험을 최소화). 일부 구현예에서, TRAC 유전자의 파괴는 (예를 들어, AAV 벡터 및 공여자 주형을 사용하여) TRAC 유전자로 CAR을 넉인함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, TRAC 유전자 발현의 파괴는 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA에 의해 CAR을 CAR 유전자로 넉인함으로써 생성된다. 일부 구현예에서, CAR의 넉인은 DSB의 부위를 둘러싼 TRAC의 서열에 상응하는 상동성 아암을 갖는 공여자 주형에 의해 제공된다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행된 유전자 편집은 파괴된 β2M 유전자를 갖는 조작된 T 세포를 생성시킨다. 일부 구현예에서, B2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 암호화된 유전자 산물의 전사 및 번역을 파괴하거나 저해하는 β2M 유전자의 삽입/결실을 생성한다. 일부 구현예에서, β2M 유전자의 파괴는 β2M 폴리펩타이드의 발현을 제거하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, B2M 폴리펩타이드의 발현의 제거 또는 감소는 MHC I 복합체의 기능 소실과 연관된다. 일부 구현예에서, MHC I 기능 소실은 조작된 T 세포가 동종이계 이식에 적합하게 한다(즉, 숙주 대 동종이계 T 세포 반응의 위험을 최소화). 일부 구현예에서, MHC I 기능 소실은 동종이계 수혜자에서 조작된 T 세포의 지속성을 증가시킨다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행된 유전자 편집은 파괴된 CD70 유전자를 갖는 조작된 T 세포를 생성시킨다. 일부 구현예에서, CD70 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 암호화된 유전자 산물의 전사 및 번역을 파괴하거나 저해하는 CD70 유전자의 삽입/결실을 생성한다. 일부 구현예에서, CD70 유전자의 파괴는 CD70 폴리펩타이드의 발현을 제거하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, CD70 폴리펩타이드의 발현의 제거 또는 감소는 세포 증식의 향상, 생체내 지속성의 향상, 탈진의 감소, 및/또는 항종양 효능의 향상과 연관된다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하여 수행된 유전자 편집은 파괴된 PD-1 유전자를 갖는 조작된 T 세포를 생성시킨다. 일부 구현예에서, PD-1 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 암호화된 유전자 산물의 전사 및 번역을 파괴하거나 저해하는 PD-1 유전자의 삽입/결실을 생성한다. 일부 구현예에서, PD-1 유전자의 파괴는 PD-1 폴리펩타이드의 발현을 제거하거나 감소시킨다.
방법 및 조성물
일부 구현예에서, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 바대로 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는 다발성 골수종, 백혈병(예를 들어, T 세포 백혈병, B 세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL), 및/또는 만성 림프구성 백혈병(C-CLL)), 림프종(예를 들어, B 세포 비호지킨 림프종(B-NHL), 호지킨 림프종, 및/또는 T 세포 림프종), 및/또는 투명 세포 신장 세포 암종(ccRCC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 다발성 골수종, 백혈병 또는 림프종을 갖는 대상체에게 본 발명의 CAR T 세포(예를 들어, 항-BCMA, 항-CD19, 항-CD33 및/또는 항-CD70 CAR T 세포)를 전달하는 단계릎 포함한다. 본원에 제공된 바대로 치료될 수 있는 암(예를 들어, 고형 종양)의 다른 비제한적인 예는 췌장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 비인두암, 비소세포 폐암(NSCLC), 교모세포종, 및/또는 흑색종을 포함한다.
CD70은 또한 혈액학적 종양 및 암종에서 검출되었다. 정상 조직에서의 CD70의 제한된 발현 패턴 및 다양한 악성종양에서의 이의 널리 퍼진 발현은 이것이 항체-기반 치료제에 대한 매력적인 표적이게 만든다. 그러나, CD70+ 암을 표적화하기 위한 CAR T 세포 치료법의 이용은 T 세포에서의 CD70 발현 때문에 잠재적으로 문제가 된다. 이 잠재적인 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 또한 항-CD70 결합 모이어티(예를 들어, 항-CD70 scFv)를 발현함과 동시에 내인성 CD70 발현을 파괴하도록 조작된 CAR T 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 암은 CD70+ 암이다. 다른 구현예에서, 암은 BCMA+ 암이다. 일부 구현예에서, 암은 CD19+ 암이다. 일부 구현예에서, 암은 CD33+ 암이다. 다른 암 항원을 발현하는 다른 암이 본 발명의 조작된 CD70 넉아웃 CAR T 세포를 사용하여 치료될 수 있다고 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 제공된 바와 같은 CAR T 세포의 집단을 대상체(예를 들어, CD70+ 암, BCMA+ 암, CD19+ 암 또는 CD33+ 암을 갖는 환자)에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD70 유전자 넉아웃을 포함하는 CAR T 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CD70 유전자 넉아웃 및 PD1 유전자 넉아웃을 포함하는 CAR T 세포의 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다. 이 이식 단계는 당해 분야에 공지된 임의의 이식 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 조작된 세포는 대상체의 혈액에서 직접 주사되거나 그렇지 않으면 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 입증된 것처럼, CD70 유전자 넉아웃을 포함하는 CAR T 세포는 증식의 연장 및 생체내 지속성의 증가를 나타낸다. 일부 구현예에서, CD70 유전자 넉아웃을 포함하는 CAR T 세포는 내인성 CD70을 발현하는 CAR T 세포에 비해 증가된 항종양 효능을 나타낸다. 일부 구현예에서, CD70 유전자 넉아웃을 포함하는 CAR T 세포는 내인성 CD70을 발현하는 CAR T 세포에 비해 고형 종양에서 증가된 항종양 효능을 나타낸다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, CD70 유전자 넉아웃을 포함하는 CAR T 세포의 생체내 지속성의 증가가 고형 종양에서 팽창을 허용할 수 있고, 따라서 내인성 CD70을 발현하는 CAR T 세포에 비해 이러한 종양에서 향상된 항종양 효능을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR T 세포에 의해 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-CD70 CAR T 세포에 의해 고형 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
투여 단계는 원하는 효과(들)가 생성되도록 원하는 부위, 예컨대 종양에서 도입된 세포를 적어도 부분적으로 국재화시키는 방법 또는 경로에 의해 대상체에게 세포, 예를 들어 조작된 T 세포를 배치(예를 들어, 이식)하는 것을 포함할 수 있다. 조작된 T 세포는 대상체에서의 원하는 위치로 전달시키는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있고, 여기서 이식된 세포 또는 세포의 성분의 적어도 일부가 생존가능하게 있다. 대상체에 대한 투여 후의 세포의 생존능력 기간은 수시간, 예를 들어 24시간만큼 짧은 시간에서 수일까지, 몇년까지 길게, 또는 심지어 대상체의 생애까지로, 즉 장기간 생착일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 일부 양태에서, 조작된 T 세포의 유효량은 전신 투여 경로, 예컨대 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여된다.
대상체는 진단, 치료 또는 치료법이 요망되는 임의의 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
공여자는 치료되는 대상체가 아닌 개체이다. 공여자는 환자가 아닌 개체이다. 일부 구현예에서, 공여자는 암이 치료되지 않거나 치료되는 것으로 의심되지 않는 개체이다. 일부 구현예에서, 다수의 공여자, 예를 들어 2 이상의 공여자를 사용한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 조작된 T 세포 집단은 하나 이상의 공여자로부터 얻은 동종이계 T 세포를 포함한다. 동종이계는 동일한 종의 하나 이상의 상이한 공여자로부터 얻은 세포를 포함하는 세포, 세포 집단 또는 생물학적 샘플을 지칭하고, 여기서 하나 이상의 유전좌위에서의 유전자는 수혜자(예를 들어, 대상체)와 동일하지 않다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 조작된 T 세포 집단은 하나 이상의 비관련된 공여자, 또는 하나 이상의 비동일한 형제자매로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 동질유전자 세포 집단, 예컨대 유전적으로 동일한 공여자(예를 들어, 동일한 쌍둥이)로부터 얻은 것을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 자가유래 세포이고, 즉 조작된 T 세포는 대상체로부터 얻어지거나 단리되고, 동일한 대상체에게 투여되고, 즉 공여자 및 수혜자는 동일하다.
유효량은 의학 병태(예를 들어, 암)의 적어도 하나 이상의 징후 또는 증상을 방지하거나 완화하는 데 필요한 조작된 T 세포의 집단의 양을 지칭하고, 원하는 효과를 제공하기 위한, 예를 들어 의학 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물의 충분한 양과 관련된다. 유효량은 또한 질환의 증상의 발생을 방지하거나 지연시키거나, 질환의 증상의 과정을 변경하거나(예를 들어, 비제한적인 예로서 질환의 증상의 느린 진행), 질환의 증상의 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 사례에 대해, 적절한 유효량이 일상적 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다고 이해된다.
본원에 기재된 다양한 양태에서의 사용을 위해, 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)의 유효량은 적어도 102개의 세포, 적어도 5 X 102개의 세포, 적어도 103개의 세포, 적어도 5 X 103개의 세포, 적어도 104개의 세포, 적어도 5 X 104 개의 세포, 적어도 105개의 세포, 적어도 2 X 105개의 세포, 적어도 3 X 10 개의 세포, 적어도 4 X 105개의 세포, 적어도 5 X 105개의 세포, 적어도 6 X 105개의 세포, 적어도 7 X 105개의 세포, 적어도 8 X 105개의 세포, 적어도 9 X 105개의 세포, 적어도 1 X 106개의 세포, 적어도 2 X 106개의 세포, 적어도 3 X 106개의 세포, 적어도 4 X 106개의 세포, 적어도 5 X 106개의 세포, 적어도 6 X 106개의 세포, 적어도 7 X 106개의 세포, 적어도 8 X 106개의 세포, 적어도 9 X 106개의 세포, 또는 이의 배수를 포함한다. 세포는 하나 이상의 공여자로부터 유래하거나, 자가유래 소스로부터 얻어진다. 본원에 기재된 일부 예에서, 세포는 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여 전에 배양물에서 팽창된다.
투여 방식은 주사, 주입, 설치 또는 섭취를 포함한다. 주사는 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내, 심실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척주관내, 내척수액내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 경로는 정맥내이다.
일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 전신으로 투여되고, 이는 표적 부위, 조직 또는 장기로의 직접적인 것이 아닌 세포 집단의 투여를 지칭하는데, 그래서 이것은 대신에 대상체의 순환계에 들어가고, 따라서 대사 및 다른 유사 과정으로 처리된다.
의학 병태의 치료를 위한 조성물을 포함하는 치료의 효능은 임상의에 의해 결정될 수 있다. 치료는 하나가 아닌 예로서 기능적 표적의 징후 또는 증상의 어느 하나 또는 모두가 유리한 방식으로 변경(예를 들어, 적어도 10% 증가)되거나, 질환(예를 들어, 암)의 다른 임상적으로 인정된 증상 또는 마커가 개선되거나 향상되면 "효과적인 치료"로 생각된다. 효능은 또한 입원 또는 의학 중재(예를 들어, 질환의 진행이 중지되거나 적어도 느려짐)의 필요성에 의해 평가된 것처럼 대상체에서 실패하여 악화하는 것에 의해 측정될 수 있다. 이 표시자의 측정 방법은 당업자에게 공지되고 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 대상체에서의 질환 치료를 포함하고, (1) 질환의 저해, 예를 들어 증상의 진행의 정지 또는 느려짐; 또는 (2) 질환의 개선, 예를 들어 증상의 회귀의 야기; 및 (3) 증상의 발생 가능성의 예방 또는 감소를 포함한다.
병용 치료가 본 발명에 의해 또한 포함된다. 예를 들어, CD70 및/또는 CD27 항체는 CAR T 세포 상의 CD70 및/또는 CD27에 결합하고/하거나 이의 활성을 조절하고, 탈진 감소, CAR T 세포 팽창의 향상 및 암 세포 사멸의 효능의 증가를 촉진하도록 사용될 수 있다. 따라서, CD70 및/또는 CD27 항체는 CAR T 세포 기능을 개선하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 CAR T 세포와 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 임의의 조작된 T 세포는 항-CD70 항체, 항-CD27 항체, 또는 항-CD70 항체 및 항-CD27 항체의 조합과 병용되어 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, TRAC - /β2M - CAR+ T 세포(예를 들어, 항-CD70 CAR 또는 항-BCMA CAR)는 항-CD70 및/또는 항-CD27 항체와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, TRAC - /β2M - /PD-1 - /CD70 - CAR+ T 세포(예를 들어, 항-CD70 CAR 또는 항-BCMA CAR)는 항-CD70 및/또는 항-CD27 항체와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, TRAC - /β2M - /PD-1 - CAR+ T 세포(예를 들어, 항-CD70 CAR 또는 항-BCMA CAR)는 항-CD70 및/또는 항-CD27 항체와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, TRAC - /β2M - /CD70 - CAR+ T 세포(예를 들어, 항-CD70 CAR 또는 항-BCMA CAR)는 항-CD70 및/또는 항-CD27 항체와 조합되어 투여된다. 일부 구현예에서, 병용 투여되는 항체는 발리루맙일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포에서 CD70 유전자를 파괴시키는 단계를 포함하는, T 세포의 탈진을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포에서 CD70 유전자를 파괴시키는 단계를 포함하는, T 세포의 증식을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포에서 CD70 유전자를 파괴시키는 단계를 포함하는, T 세포의 세포독성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포에서 CD70 유전자를 파괴시키는 단계를 포함하는, T 세포에서의 면역 관문(예를 들어, PD-1)의 저해 효과를 극복하는 방법을 제공한다.
다른 구현예
본 발명은 다음의 구현예에 관한 것이다. 본 부문에 걸쳐, 조항 구현예는 'E' 다음에 서수로 축약된다. 예를 들어, E1은 구현예 1에 대응한다.
E1. 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 예정 세포사-1(PD-1) 유전자 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
E2. 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
E3. 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하지 않는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
E4. 구현예 2 또는 구현예 3에 있어서, 파괴된 PD-1 유전자를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
E5. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
E6. 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
E7. 조작된 T 세포로서,
파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자;
파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자; 및
파괴된 CD70 유전자; 및
키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
E8. 구현예 7에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산은 TRAC 유전자로 삽입된, 조작된 T 세포.
E9. 구현예 7 또는 구현예 8에 있어서, 파괴된 PD-1 유전자를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
E10. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-CD70 항체는 항-CD70 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 조작된 T 세포.
E11. 구현예 10에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 경쇄 가변 영역(VL) CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
E12. 구현예 11에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
E13. 구현예 11에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E14. 구현예 11에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E15. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-BCMA 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-BCMA 항체는 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 조작된 T 세포.
E16. 구현예 15에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
E17. 구현예 16에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
E18. 구현예 16에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E19. 구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인 및 선택적으로 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
E20. 구현예 5 내지 구현예 19 중 어느 하나에 있어서, TRAC 유전자는 서열 번호 44 또는 서열 번호 55의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 45 또는 서열 번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E21. 구현예 6 내지 구현예 20 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 β2M 유전자는 서열 번호 9 내지 서열 번호 14 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
E22. 구현예 1 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 5회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하는, 조작된 T 세포.
E23. 구현예 22에 있어서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하는, 조작된 T 세포.
E24. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 예정 세포사-1(PD-1) 유전자 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
E25. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
E26. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하지 않는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
E27. 구현예 25 또는 구현예 26에 있어서, 파괴된 예정 세포사-1(PD-1) 유전자를 추가로 포함하는, 세포 집단.
E28. 구현예 24 내지 구현예 27 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 추가로 포함하는, 세포 집단.
E29. 구현예 24 내지 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 추가로 포함하는, 세포 집단.
E30. 세포 집단으로서,
조작된 T 세포이되,
파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자;
파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자;
파괴된 CD70 유전자; 및
키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 포함하는, 세포 집단.
E31. 구현예 30에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산은 TRAC 유전자로 삽입된, 세포 집단.
E32. 구현예 30 또는 구현예 31에 있어서, 조작된 T 세포는 파괴된 예정 세포사-1(PD-1) 유전자를 추가로 포함하는, 세포 집단.
E33. 구현예 24 및 구현예 27 내지 구현예 32 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-CD70 항체는 항-CD70 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 세포 집단.
E34. 구현예 33에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 세포 집단.
E35. 구현예 34에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 세포 집단.
E36. 구현예 35에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
E37. 구현예 35에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
E38. 구현예 24 내지 구현예 32 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-BCMA 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-BCMA 항체는 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 세포 집단.
E39. 구현예 38에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 세포 집단.
E40. 구현예 39에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 세포 집단.
E41. 구현예 39에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
E42. 구현예 28 내지 구현예 41 중 어느 하나에 있어서, TRAC 유전자는 서열 번호 44 또는 서열 번호 55의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 45 또는 서열 번호 56의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 세포 집단.
E43. 구현예 29 내지 구현예 42 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 β2M 유전자는 서열 번호 9 내지 서열 번호 14 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열의 유전자를 포함하는, 세포 집단.
E44. 구현예 24 내지 구현예 43 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포의 적어도 50%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 PD-1 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는, 세포 집단.
E45. 구현예 44에 있어서, 조작된 T 세포의 50% 내지 70%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 PD-1 표면 단백질을 발현하지 않고/않거나, 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는, 세포 집단.
E46. 구현예 28 내지 구현예 45 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포의 적어도 90%, 선택적으로 90% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는, 세포 집단.
E47. 구현예 29 내지 구현예 46 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포의 적어도 60%, 선택적으로 60% 내지 75%는 검출 가능한 수준의 β2M 표면 단백질을 발현하지 않는, 세포 집단.
E48. 구현예 24 내지 구현예 47 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포의 적어도 80%, 선택적으로 80% 내지 100%는 검출 가능한 수준의 CD70 표면 단백질을 발현하지 않는, 세포 집단.
E49. 구현예 1 내지 구현예 48 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포의 적어도 80%, 선택적으로 80% 내지 95%는 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는, 세포 집단.
E50. 구현예 24 내지 구현예 49 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 적어도 20% 초과의 세포 증식 능력을 나타내는, 세포 집단.
E51. 구현예 24 내지 구현예 50 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 적어도 20% 초과의 세포 용해 능력을 나타내는, 세포 집단.
E52. 구현예 24 내지 구현예 51 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포에 의해 분비된 사이토카인의 수준은 대조군 T 세포에 의해 분비된 사이토카인의 수준보다 적어도 2배 더 높은, 세포 집단.
E53. 구현예 24 내지 구현예 52 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 감소한 세포 탈진을 나타내는, 세포 집단.
E54. 구현예 53에 있어서, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 감소한 수준의 LAG3을 발현하는, 세포 집단.
E55. 구현예 54에 있어서, 대조군 T 세포는 내인성 CD70 단백질을 발현하는 조작된 T 세포인, 세포 집단.
E56. 구현예 24 내지 구현예 55 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 사이토카인 의존적 증식을 유지하는, 세포 집단.
E57. 구현예 24 내지 구현예 56 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 5회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하는, 세포 집단.
E58. 구현예 47에 있어서, 조작된 T 세포는 암 세포에 의한 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하는, 세포 집단.
E59. 구현예 24 내지 58 중 어느 하나의 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
E60. 구현예 59에 있어서, 조작된 T 세포는 조작된 인간 T 세포인, 방법.
E61. 구현예 59 또는 60에 있어서, 대상체는 암을 갖는, 방법.
E62. 구현예 61에 있어서, 암은 CD70 및/또는 BCMA를 발현하는, 방법.
E63. 구현예 59 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 세포 집단은 암을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여되는, 방법.
E64. 구현예 59 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 암은 고형 종양 악성종양 또는 혈액학적 악성종양인, 방법.
E65. 구현예 64에 있어서, 고형 종양 악성종양은 난소 종양, 췌장 종양, 신장 종양, 폐 종양 및 장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E66. 구현예 63에 있어서, 세포 집단은 대상체에서 종양의 용적을 감소시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여되는, 방법.
E67. 조작된 T 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) T 세포에
RNA-가이드 뉴클레아제,
CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, 및
CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 전달하는 단계; 및
(b) 파괴된 CD70 유전자를 포함하고 CAR을 발현하는 조작된 T 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
E68. 구현예 67에 있어서, 단계 (a)에서 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 단계 (b)의 조작된 T 세포는 파괴된 PD-1 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
E69. 구현예 67 또는 구현예 68에 있어서, 단계 (a)에서 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 단계 (b)의 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
E70. 구현예 69에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 측접되고, 단계 (b)의 조작된 T 세포는 TRAC 유전자 유전자위로 삽입된 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
E71. 구현예 67 내지 구현예 70 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a)에서 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 단계 (b)의 조작된 T 세포는 파괴된 β2M 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
E72. 조작된 T 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) T 세포에
RNA-가이드된 뉴클레아제,
TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA,
β2M 유전자를 표적화하는 gRNA,
CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, 및
CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 전달하는 단계; 및
(b) 조작된 T 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
E73. 구현예 72에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 측접된, 방법.
E74. 구현예 72 또는 구현예 73에 있어서, PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E75. 구현예 67 내지 구현예 74 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 선택적으로 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제인, 방법.
E76. 구현예 69 내지 구현예 75 중 어느 하나에 있어서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 98의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 118의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
E77. 구현예 71 내지 구현예 76 중 어느 하나에 있어서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 99의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 119의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
E78. 구현예 67 내지 구현예 77 중 어느 하나에 있어서, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 94 또는 서열 번호 95의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 114 또는 서열 번호 115의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
E79. 구현예 68 내지 구현예 71 및 구현예 74 내지 구현예 78 중 어느 하나에 있어서, PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 100의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 120의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
E80. 구현예 67 내지 구현예 79 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-CD70 항체는 항-CD70 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 방법.
E81. 구현예 80에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
E82. 구현예 81에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
E83. 구현예 81에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
E84. 구현예 81에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
E85. 구현예 67 내지 구현예 79 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-BCMA 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-BCMA 항체는 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 방법.
E86. 구현예 85에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
E87. 구현예 86에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
E88. 구현예 86에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
E89. 구현예 67 내지 구현예 88 중 어느 하나에 있어서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인 및 선택적으로 CD3z 신호전달 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
E90. 구현예 72에 있어서, 벡터는 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
E91. 구현예 72에 있어서, 벡터는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
E92. RNA-가이드 뉴클레아제 및 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA를 포함하는 조작된 T 세포로서, 선택적으로 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 94 또는 서열 번호 95의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 114 또는 서열 번호 115의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E93. 구현예 92에 있어서, PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 추가로 포함하고, 선택적으로 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 100의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 120의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 PD-1 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 32의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E94. 구현예 92 또는 구현예 93에 있어서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 추가로 포함하고, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 98의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 118의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E95. 구현예 92 내지 구현예 94 중 어느 하나에 있어서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 추가로 포함하고, 선택적으로 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 99의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 119의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E96. 구현예 92 내지 구현예 95 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 선택적으로 S. 피오게네스 Cas9 뉴클레아제인, 조작된 T 세포.
E97. 구현예 92 내지 구현예 96 중 어느 하나에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 추가로 포함하고, 선택적으로 CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 측접된, 조작된 T 세포.
E98. 구현예 97에 있어서, CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-CD70 항체는 항-CD70 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 조작된 T 세포.
E99. 구현예 98에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
E100. 구현예 99에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
E101. 구현예 99에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E102. 구현예 99에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E103. 구현예 97에 있어서, CAR은 항-BCMA 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-BCMA 항체는 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 조작된 T 세포.
E104. 구현예 103에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
E105. 구현예 104에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
E106. 구현예 104에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E107. 구현예 97에 있어서, 벡터는 서열 번호 46 또는 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
E108. T 세포의 증식을 증가시키거나 탈진을 감소시키는 방법으로서, T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
E109. 구현예 108에 있어서, T 세포에서 예정 세포사-1(PD-1) 유전자, T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자 및 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 파괴하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E110. 구현예 108 내지 구현예 109 중 어느 하나에 있어서, T 세포에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E111. 구현예 108 내지 구현예 110 중 어느 하나에 있어서, CD70 유전자는 CRISPR/Cas 유전자 편집에 의해 파괴되는, 방법.
E112. 구현예 110 내지 구현예 111 중 어느 하나에 있어서, PD-1, TRAC, 및/또는 β2M 유전자는 CRISPR/Cas 유전자 편집에 의해 파괴되는, 방법.
E113. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 환자에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는 파괴된 CD70 유전자 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
E114. 구현예 113에 있어서, CAR은 CD70에 결합하는, 방법.
E115. 구현예 113에 있어서, CAR은 CD70에 결합하지 않는, 방법.
E116. 구현예 113 내지 구현예 115 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
E117. 구현예 113 내지 구현예 116 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 파괴된 B2M 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
E118. 구현예 113 내지 구현예 116 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 파괴된 PD-1 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
E119. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자;
(iii) 파괴된 CD70 유전자; 및
(iv) CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
E120. 구현예 113 내지 구현예 114 및 구현예 116 내지 구현예 119 중 어느 하나에 있어서, CAR은 (a) 항-CD70 항원 결합 단편을 포함하는 엑토도메인, (b) CD8 막관통 도메인, 및 (c) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3z 동시자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는, 방법,
E121. 구현예 119 또는 구현예 120에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
E122. 구현예 120 내지 구현예 121 중 어느 하나에 있어서, 항-CD70 항체는 항-CD70 scFv인, 방법.
E123. 구현예 122에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 중쇄 가변 영역(VH) 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 경쇄 가변 영역(VL) CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
E124. 구현예 123에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
E125. 구현예 122에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
E126. 구현예 122에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
E127. 구현예 113 및 구현예 115 내지 구현예 118 중 어느 하나에 있어서, CAR은 항-BCMA 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 선택적으로 항-BCMA 항체는 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)인, 방법.
E128. 구현예 127에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 상보성 결정 영역(CDR) 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
E129. 구현예 128에 있어서, 항-BCMA scFv는 기준 항체와 동일한 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
E130. 구현예 127에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
E131. 구현예 113 내지 구현예 130 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 조작된 인간 T 세포인, 방법.
E132. 구현예 113 내지 구현예 131 중 어느 하나에 있어서, 암은 CD70 및/또는 BCMA를 발현하는, 방법.
E133. 구현예 113 내지 구현예 132 중 어느 하나에 있어서, 세포 집단은 암을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여되는, 방법.
E134. 구현예 113 내지 구현예 133 중 어느 하나에 있어서, 암은 고형 종양 악성종양 또는 혈액학적 악성종양인, 방법.
E135. 구현예 134에 있어서, 고형 종양 악성종양은 난소 종양, 췌장 종양, 신장 종양, 폐 종양 및 장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
E136. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는
(i) 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 유전자;
(iii) 파괴된 CD70 유전자;
(iv) (a) 항-CD70 항원 결합 단편을 포함하는 엑토도메인, (b) CD8 막관통 도메인, 및 (c) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3z 동시자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
E137. 구현예 136에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
E138. 구현예 136 내지 구현예 137 중 어느 하나에 있어서, 조작된 T 세포는 인간 T 세포인, 세포 집단.
E139. 조작된 T 세포로서,
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
E140. 구현예 139에서, CAR을 암호화하는 핵산은 서열 번호 45와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E141. 조작된 T 세포로서,
(i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
E142. 구현예 139 내지 구현예 141 중 어느 하나에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45 또는 서열 번호 44에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 공여자 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
E143. 조작된 T 세포로서,
(i) 서열 번호 44의 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
(ii) 파괴된 B2M 유전자; 및
(iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
E144. 구현예 139 내지 구현예 143 중 어느 하나에 있어서, T 세포는 인간 T 세포인, 조작된 T 세포.
실시예
실시예 1. T 세포에서의 Cas9:sgRNA RNP에 의한 CD70의 효율적인 넉아웃
이 실시예는 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 생체외 1차 인간 T 세포에서의 CD70 유전자의 효율적인 편집을 기재한다. 엑손을 암호화하는 처음의 세(3)개의 단백질을 함유하는 CD70 유전자의 게놈 분절은 gRNA 설계 소프트웨어에서 입력으로서 사용되었다. 게놈 분절은 또한 측접하는 스플라이스 부위 억셉터/공여자 서열을 포함하였다. 원하는 gRNA는 암호화 서열을 삽입 또는 결실시켜, CD70의 아미노산 서열을 파괴하여, 프레임외/기능 소실 대립유전자(들)("CD70 넉아웃" 대립유전자라고 칭함)를 생성시키는 것이었다. CD70 유전자를 표적화하는 모든 일곱(7)개의 인실리코 확인된 gRNA 스페이서 서열이 합성되었고, gRNA는 표 5에 표시된 바대로 특이적으로 변형되었다. 표 5에서의 gRNA가 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형에 의해 변형되지만, 비변형된 gRNA 또는 다른 변형을 갖는 gRNA가 사용될 수 있다. 또한 2018년 5월 11일에 출원된 PCT/IB2018/001619호(본원에 그 전문이 참고로 포함됨)를 참조한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
1차 인간 T 세포는 Cas9 뉴클레아제 및 CD70 유전자를 표적화하는 합성 변형된 sgRNA(표 5에서의 서열)를 함유하는 리보핵단백질 입자(RNP) 또는 대조군(Cas9 무, gRNA 무)으로 형질주입(전기천공)되었다. 형질주입 후 사일 내지 육일(4일 내지 6일)에, 세포는 (1) 삽입/결실 빈도를 평가하기 위해 TIDE 분석으로 처리되고, (2) 세포 표면에서 CD70 발현 수준을 평가하기 위해 유세포분석법(1차 항체: FITC 항-인간 CD70 항체, 클론 113 내지 16, Biolegend)에 의해 처리되었다.
일곱(7)개의 gRNA는 표 6에 표시된 것처럼 TIDE 분석에 의해 측정 가능한 데이터를 생성하였다. 네(4)개의 gRNA 서열은 80% 초과의 단백질 발현 넉아웃으로 85% 초과의 삽입/결실 백분율(편집 빈도)을 생성하여서(서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 29), 고도로 효율적인 유전자 편집을 나타낸다. 표 6에서의 데이터는 한(1)명의 공여자로부터 얻었다. 시험 샘플마다 (중앙치 형광 강도(MFI)에 의해 평가된) CD70 단백질 발현의 수준은 대조군 세포에 존재하는 CD70 단백질 발현의 수준으로 정규화되었다.
Figure pct00007
T 세포에서의 온-타깃 삽입/결실 프로필의 분석
온-타깃 앰플리콘 분석은 CD70 유전자: GCTTTGGTCCCATTGGTCGC(서열 번호 160; 표적 서열, PAM 서열 번호 114를 가짐)를 표적화하는 T7 가이드(서열 번호 26; 서열 번호 36)를 사용하여 유전자 편집 후에 CD70 유전좌위에서 수행되었다.
유전자 편집 후에, 온-타깃 앰플리콘 분석은 (실시예 3에 기재된 바대로 생성된) TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포에서 CD70 유전좌위 주위에서 수행되었다.
초기 PCR은 KAPA HiFi PCR 키트(Kapa Biosystems, 매사추세츠주 윌밍턴)를 사용하여 수행되었다. 100 ng의 유입 gDNA를 10 uM의 각각의 프라이머와 조합하였다. CD70_F 프라이머 및 CD70_R 프라이머는 CD70 유전좌위를 증폭시키도록 짝짓기되었다(표 7).
Figure pct00008
TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포를 제조하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 후에 T 세포의 집단에서의 CD70 유전좌위의 분석은 CD70 유전좌위에서의 특정 삽입/결실 빈도 및 편집된 유전자 서열을 생성시킨다(표 8; 점선에서의 결실 및 볼드체에서의 삽입). 편집된 세포의 2개의 세포 집단은 2개의 상이한 공여자 T 세포(1 및 2)로부터 생성되었다. 각각의 공여자로부터의 편집된 T 세포의 집단은 1A/1B 및 2A/2B의 반복실험으로 분석되었다.
Figure pct00009
실시예 2. 다수의 유전자 넉아웃에 의한 T 세포의 생성
이 실시예는 동시에 2개, 3개 또는 4개의 유전자의 발현이 결여된 인간 T 세포를 제조하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술의 사용을 기재한다. 구체적으로는, T 세포 수용체(TCR) 유전자(TCR 알파 불변(TRAC) 영역에서 편집된 유전자), β2-마이크로글로불린(β2M) 유전자, 분화 클러스터 70(CD70) 유전자 및/또는 예정 세포사 1(PD-1 또는 PD1) 유전자는 기재된 유전자의 2개 이상이 결핍된 T 세포를 제조하기 위해 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 편집되었다. 하기 약어는 간결성 및 명확성을 위해 도면에 사용된다:
2X KO: TRAC-/β2M-
3X KO(PD-1): TRAC-/β2M-/PD-1-
3X KO(CD70): TRAC-/β2M-/CD70-
4X KO: TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-
활성화된 1차 인간 T 세포는 Cas9:gRNA RNP 복합체에 의해 전기천공되었다. 뉴클레오펙션 혼합물은 (문헌[Hendel et al., Nat Biotechnol. 2015; 33(9):985-989, PMID: 26121415]에 기재된 바대로) Nucleofector™ Solution, 5x106개의 세포, 1 μM Cas9 및 5 μM gRNA를 함유하였다. 이중 넉아웃 T 세포(2X KO)의 생성을 위해, 세포는 2개의 상이한 RNP 복합체로 전기천공되었는데, 각각은 Cas9 단백질 및 상기 표시된 농도의 TRAC(서열 번호 40) 및 β2M(서열 번호 41)의 sgRNA 중 하나를 함유한다. 삼중 넉아웃 T 세포(3X KO)의 생성을 위해, 세포는 3개의 상이한 RNP 복합체로 전기천공되었는데, 각각의 RNA 복합체는 Cas 단백질 및 (a) 상기 표시된 농도의 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41) 및 PD-1(서열 번호 42); 또는 (b) 상기 표시된 농도의 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)의 sgRNA 중 하나를 함유한다. 사중 넉아웃 T 세포(4X KO)의 생성을 위해, 세포는 4개의 상이한 RNP 복합체로 전기천공되었는데, 각각의 RNA 복합체는 Cas9 단백질 및 상기 표시된 농도의 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), PD-1(서열 번호 42) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)의 sgRNA 중 하나를 함유한다. gRNA의 비변형된 버전(또는 다른 변형된 버전)이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 26, 및/또는 서열 번호 27). 표 5 및 표 9에서의 서열.
Figure pct00010
전기천공 후 약 일(1)주에, 세포를 비처리한 채 두거나 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)/이오노마이신으로 밤새 처리하였다. 다음날 세포를 편집된 세포 집단의 세포 표면에서의 TRAC, β2M, PD-1 및 CD70 발현 수준을 평가하기 위해 유세포분석법에 처리하였다(예를 들어, 문헌[Kalaitzidis D et al. J Clin Invest 2017; 127(4): 1405-1413] 참조). 하기 1차 항체를 사용하였다(표 10):
Figure pct00011
표 11 및 표 12는 고도로 효율적인 다수의 유전자 편집을 보여준다. 이중-넉아웃 세포(2X KO; TRAC-/β2M-)에 대해, 생존가능 세포의 83%는 TCR 및 β2M의 발현이 결여되었다(표 11; 3X KO(PD1)). 삼중 넉아웃 세포에 대해, 생존가능 세포의 70%는 TCR, β2M 및 PD-1의 발현이 결여되었고(표 11); 생존가능 세포의 80%는 사용된 CD70 gRNA와 무관하게 TCR, β2M 및 CD70의 발현이 결여되었다(표 12). 사중 넉아웃 세포(4X KO)에 대해, 생존가능 세포의 78%는 TCR, β2M PD-1 및 CD70의 발현이 결여되었다(도 1).
Figure pct00012
Figure pct00013
T 세포에서의 삼중 및 사중 유전자 편집이 세포 팽창에 영향을 미치는지를 평가하기 위해, 세포 번호는 편집 후의 2주 기간에 걸쳐 이중, 삼중 및 사중 유전자 편집된 T 세포 중에서 나열되었다(비편집된 T 세포는 대조군으로서 사용됨). T 세포의 각각의 유전자형에 대해 5x106개의 세포가 생성되고 플레이팅되었다.
도 2에 도시된 것처럼, 세포 증식(팽창)은 전기천공후 윈도우 시험에 걸쳐 지속되었다. 생존가능 세포의 수에 의해 표시된 것처럼 이중(β2M-/TRAC-), 삼중(β2M-/TRAC-/PD-1- 또는 β2M-/TRAC-/CD70-) 및 사중(β2M-/TRAC-/PD-1-/CD70) 넉아웃 T 세포 중에서 유사한 세포 증식이 관찰되었다. 이 데이터는 다수의 유전자 편집(CD70 및 PD-1 유전자에 의한 삼중 및 사중까지)이 T 세포 증식에 의해 측정된 것처럼 T 세포 건강에 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다.
실시예 3. CD70 및/또는 PD1이 결여된 CAR T 세포의 생성
다중 넉아웃을 갖는 항-CD70 CAR T 세포의 생성
이 실시예는 TCR 유전자, β2M 유전자, CD70 유전자 및/또는 PD1 유전자의 발현이 결여되고, CD70을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 동종이계 인간 T 세포의 제조를 기재한다. 이들 세포는 도면에서 TCR-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 또는 3X KO(CD70) CD70 CAR+; TCR-/β2M-/PD1-/항-CD70 CAR+ 또는 3X KO(PD1) CD70 CAR+; TCR-/β2M-/PD1-/CD70-/항-CD70 CAR+ 또는 4X KO CD70 CAR+로 지정된다.
서열 번호 43의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는(서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화하는 서열 번호 44에서의 공여자 주형을 포함하는) 재조합 아데노 연관 아데노바이러스 벡터, 혈청형 6(AAV6)(MOI 50, 000)은 Cas9:sgRNA RNP(1 μM Cas9, 5 μM gRNA)에 의해 활성화된 동종이계 인간 T 세포에 전달되었다. 하기 sgRNA가 사용되었다: TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37) 및 PD1(서열 번호 42). gRNA의 비변형된 버전(또는 다른 변형된 버전)이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 26, 및/또는 서열 번호 27). 전기천공 후 약 일(1)주에, 세포는 편집된 세포 집단의 세포 표면에서의 TRAC, β2M, CD70 및 PD1 발현 수준을 평가하기 위해 유세포분석법에 대해 처리되었다. 하기 1차 항체를 사용하였다(표 13):
Figure pct00014
T 세포 비율 검정. CD4+ 및 CD8+ 세포의 비율은 이후 하기 항체를 사용하여 유세포분석법에 의해 편집된 T 세포 집단에서 평가되었다(표 14):
Figure pct00015
고효율 유전자 편집 및 CAR 발현은 편집된 항-CD70 CAR T 세포 집단에서 달성되었다. 또한, 편집은 CD4/CD8 T 세포 집단을 불리하게 변경하지 않았다. 도 3은 삼중 넉아웃 CAR T 세포에서의 고도로 효율적인 유전자 편집 및 항-CD70 CAR 발현을 보여준다. 생존가능 세포의 55% 초과는 TCR, β2M 및 CD70의 발현이 결여되고, 또한 항-CD70 CAR을 발현하였다. 도 4는 CD4/CD8 T 세포 하위집단의 정상 비율이 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포에서 유지된다는 것을 보여주고, 이는 이 다수의 유전자 편집이 CD4/CD8 T 세포 하위집단의 비율에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 생물학에 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다.
도 5는 사중 넉아웃 CAR T 세포에서의 고도로 효율적인 유전자 편집 및 항-CD70 CAR 발현을 보여준다. 생존가능 세포의 60% 초과는 TCR, β2M, PD-1 및 CD70의 발현이 결여되고, 항-CD70 CAR을 발현하였다. 도 6은 CD4/CD8 T 세포 하위집단의 정상 비율이 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포에서 유지된다는 것을 보여주고, 이는 이 다수의 유전자 편집이 CD4+/CD8+ T 세포 하위세트의 비율에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 생물학에 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다.
다중 넉아웃을 갖는 항-BCMA CAR T 세포의 생성
이 실시예는 TCR 유전자, β2M 유전자, PD-1 유전자 및/또는 CD70 유전자의 발현이 결여되고, 또한 B-세포 성숙 항원(BCMA)을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 동종이계 인간 T 세포의 제조를 기재한다.
서열 번호 54의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는(서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 항-BCMA CAR을 암호화하는 서열 번호 55에서의 공여자 주형을 포함하는) 재조합 아데노 연관 아데노바이러스 벡터, 혈청형 6(AAV6)은 Cas9:gRNA RNP(1 μM Cas9 및 5 μM gRNA)에 의해 활성화된 동종이계 인간 T 세포에 전달되었다. 하기 gRNA를 사용하였다: TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), PD-1(서열 번호 42) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37). gRNA의 비변형된 버전(또는 다른 변형된 버전)이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 26, 및/또는 서열 번호 27). 전기천공 후 약 일(1)주에, 세포는 하기 약간의 차이를 가지며 항-CD70 CAR+ T 세포에 대해 상기 기재된 바대로 유세포분석법에 대해 처리되었다. 항-BCMA CAR 발현은 비오티닐화 재조합 인간 BCMA(ACROS 카탈로그 # BC7-H82F0)를 사용하여 검출되었다. 이후, 이중 및 사중 넉아웃 항-BCMA CAR+ 세포는 본원에 기재된 바와 같이 규명되었다.
도 7a-도 7b는 TRAC 유전자, β2M 유전자, CD70 유전자 및 PD-1 유전자의 고도로 효율적인 유전자 편집을 보여준다. 도 7c는 이중 넉아웃 및 사중 넉아웃 세포에서의 항-BCMA CAR+ 세포의 높은 발현을 보여준다.
다중 넉아웃을 갖는 항-CD19 CAR T 세포의 생성
CD19를 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고, TCR 유전자, β2M 유전자, 및 선택적으로 CD70 유전자의 발현이 결여된 동종이계 인간 T 세포가 생성되었다.
동종이계 T 세포를 생성하기 위해, 활성화된 1차 인간 T 세포는 Cas9:gRNA RNP 복합체로 전기천공되고, TRAC 유전좌위와 상동성을 갖는 항-CD19 CAR 공여자 주형을 함유하는 아데노 연관 아데노바이러스 벡터(AAV)로 감염되었다. 서열 번호 155의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는(서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD19 CAR을 암호화하는 서열 번호 156에서의 공여자 주형을 포함하는) 재조합 AAV 혈청형 6(AAV6)은 Cas9:sgRNA RNP(1 μM Cas9, 5 μM gRNA)에 의해 활성화된 인간 T 세포에 전달되었다. 하기 sgRNA는 각각의 유전자를 넉아웃시키도록 사용되었다: TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), CD70(서열 번호 36). gRNA의 비변형된 버전(또는 다른 변형된 버전)이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 서열 번호 30, 서열 번호 21 또는 서열 번호 27). 전기천공 후 약 일(1)주에, 세포는 하기 약간의 차이를 가지며 항-CD70 CAR+ T 세포에 대해 상기 기재된 바대로 유세포분석법에 대해 처리되었다. 항-CD19 CAR 발현은 비오티닐화 재조합 인간 CD19(ACROBIOSYSTEMS INC; CD9-H825)를 사용하여 검출되었다. 이후, CD70 결핍 항-CD19 CAR+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 규명되었다.
다중 넉아웃을 갖는 항-CD33 CAR T 세포의 생성
CD33를 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하고, T 세포 수용체(TCR) 유전자(TCR 알파 불변 (TRAC) 영역에서 편집된 유전자), β2-마이크로글로불린(β2M) 유전자 및 선택적으로 CD70 유전자의 발현이 결여된 동종이계 인간 T 세포가 생성되었다.
동종이계 T 세포를 생성하기 위해, 활성화된 1차 인간 T 세포는 Cas9:gRNA RNP 복합체로 전기천공되고, TRAC 유전좌위와 상동성을 갖는 항-CD33 CAR 공여자 주형을 함유하는 아데노 연관 아데노바이러스 벡터(AAV)로 감염되었다. 서열 번호 87의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는(서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD33 CAR을 암호화하는 서열 번호 135에서의 공여자 주형을 포함하는) 재조합 AAV 혈청형 6(AAV6)은 Cas9:sgRNA RNP(1 μM Cas9, 5 μM gRNA)에 의해 활성화된 인간 T 세포에 전달되었다. 하기 sgRNA는 각각의 유전자를 넉아웃시키도록 사용되었다: TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), CD70(서열 번호 36). gRNA의 비변형된 버전(또는 다른 변형된 버전)이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 서열 번호 30, 서열 번호 21 또는 서열 번호 27).
TCR+ T 세포(RNP 무) 및 TRAC-/β2M- T 세포(CAR이 없는 TCR 및 β2M 결핍 세포)의 집단은 대조군으로서 사용하기 위해 유사하게 생성되었다. 전기천공 후 약 일(1)주에, 세포는 하기 약간의 차이를 가지며 항-CD70 CAR+ T 세포에 대해 상기 기재된 바대로 유세포분석법에 대해 처리되었다. 항-CD33 CAR 발현은 비오티닐화 재조합 인간 CD33을 사용하여 검출되었다(데이터 비기재). 이후, CD70 넉아웃 항-CD33 CAR+ T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 규명되었다.
CD70 넉아웃을 갖는 항-CD33 CAR T 세포에서의 CD4/CD8 세포 집단의 규명
CD33은 T 세포에서 발현될 수 있고, CD8 세포보다 배양된 CD4 세포에서 더 높은 수준이 관찰되었다. 항-CD33 CAR-T 세포의 제조 과정 동안에 CD4 세포는 동족살해로 인해 실질적으로 감소하게 된다. 도 8에 도시된 것처럼, 온전한 CD70을 갖는 항-CD33 CAR-T 세포 배양물은 3주 배양 기간에 걸쳐 CD4+ 세포의 97% 감소를 나타내지만, 파괴된 CD70을 갖는 세포의 배양물은 이 시간 과정에 걸쳐 불과 61% 감소를 나타냈다. 따라서, CD70 유전자의 파괴는 항-CD33 CAR-T 세포 배양물에서 관찰된 동족살해를 감소시키는 것으로 보인다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 이 효과는 CD70/CD27 상호작용에 의해 강화될 수 있는 면역 자극 기능을 통해 발생할 수 있고, CD70의 유전적 파괴는 CD4/CD8 비율을 보다 균형화시키고, 이는 악성종양에서의 치료학적 이익에 보다 최적일 수 있다.
실시예 4: CD70 KO는 세포 증식을 개선한다
시험관내 항-CD33 CAR T 세포의 세포 증식에 대한 CD70 KO의 효과
사이토카인 함유 배지(IL-2 + IL-7)에서 팽창하는 세포의 능력을 평가하기 위해, 항-CD33 CAR T 세포가 사용되었다. 구체적으로는, 이중 넉아웃(TRAC-/B2M-) 또는 삼중 넉아웃(TRAC-/B2M-/CD70-)을 포함하는 5x106개의 총 항-CD33 CAR T 세포는 실시예 3에 기재된 바대로 생성되고, 플레이팅되고, 10 mL 부피의 사이토카인 함유 배지에서 성장하게 하였다. 1주 후에 세포를 계수하였다. 이후, 이전의 배양물로부터의 5x106개의 세포를 10 mL의 부피(새로운 사이토카인 함유 배지)에서 재플레이팅하고, 1주 후에 세포의 총 수를 열거하였다. CD70 유전자의 파괴를 함유하는 동종이계 항-CD33 CAR-T 세포는 재플레이팅의 첫째주 및 둘째주에 더 높은 수준으로 팽창하였다(도 9). 이 데이터는 CD70 넉아웃이 배양에서 더 높은 세포 수율을 생성시킬 수 있다는 것을 보여준다.
시험관내 항-CD19 CAR T 세포의 세포 증식에 대한 CD70 KO의 효과
사이토카인 함유 배지(IL-2 + IL-7)에서 팽창하는 세포의 능력을 추가로 평가하기 위해, 항-CD19 CAR T 세포가 사용되었다. 구체적으로는, 이중 넉아웃(TRAC-/B2M-) 또는 삼중 넉아웃(TRAC-/B2M-/CD70-)을 포함하는 5x106개의 총 항-CD19 CAR T 세포는 실시예 3에 기재된 바대로 생성되고, 플레이팅되고, 10 mL 부피의 사이토카인 함유 배지에서 성장하게 하였다. 1주 후에 세포를 계수하였다. 이후, 이전의 배양물로부터의 5x106개의 세포를 10 mL의 부피(새로운 사이토카인 함유 배지)에서 재플레이팅하고, 1주 후에 세포의 총 수를 열거하였다. CD70 유전자의 파괴를 함유하는 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포는 CD70 유전자 파괴가 없는 대조군 세포와 비교하여 재플레이팅의 첫째주 및 둘째주에 더 높은 수준으로 팽창하였다(도 10). 이 데이터는 CD70 넉아웃이 배양에서 더 높은 세포 수율을 생성시킬 수 있다는 것을 보여준다.
시험관내 항-BCMA CAR T 세포의 사이토카인 유도 증식 및 아폽토시스에 대한 CD70 KO의 효과
사이토카인 유도 증식. 세포 증식에 대한 CD70 및/또는 PD1 넉아웃의 효과를 평가하기 위해, 항-BCMA CAR T 세포를 사용하였다. 항-BCMA CAR T 세포는 실시예 3에 기재된 바대로 생성되었다. 편집된 T 세포의 하기 그룹이 생성되었다:
TRAC-/B2M-/항-BCMA CAR+(대조군; 2KO, BCMA CAR+)
TRAC-/B2M-/CD70-/항-BCMA CAR+(3KO(CD70), BCMA CAR+)
TRAC-/B2M-/PD1-/항-BCMA CAR+(3KO(PD1), BCMA CAR+)
TRAC-/B2M-/CD70-/PD1-/항-BCMA CAR+(4KO, BCMA CAR+).
편집된 세포는 CD3+B2M+ 세포의 자기 결실에 의해 TRAC-/B2M- 세포에 대해 농후화되었다. 간단히, 세포를 4℃에서 15분 동안 100 ㎕ 부피에서 각각 1x106개의 세포당 0.5 ㎍에서 항-CD3 Biotin(Biolegend 카탈로그 300404호), 항-β2M Biotin(Biolegend 카탈로그 316308호) 항체로 표지하고, 세척하고, 4℃에서 15분 동안 스트렙타비딘 표지된 자기 마이크로비드(Miltenyi Biotech, 130-048-101)와 항온처리하였다. 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 완충액에 재현탁시키고, LS 칼럼(Miltenyi Biotech, 130-042-401)을 통해 통과시켰다.
IL-2/IL-7 유도 T 세포 증식에서의 CD70 또는 PD1의 효과를 결정하기 위해, 편집된 T 세포(1E6개의 세포/ml)를 4주 이하 동안 5% 인간 AB 혈청(HP1022, Valley Biomedical)), 50 ng/ml의 IL-2(rhIL-2; 130-097-745, Miltenyi Biotech) 및 10 ng/ml의 IL-7(rhIL-7; Cellgenix 001410-050)이 보충된 성장 배지(X-vivo 배지(04-744, Lonza)에서 배양하였다. 표시된 일자에, 세포를 계수하고, 적절한 배양 접시에서 1.5E6개의 세포/ml로 새로운 배지에서 재시딩하였다.
도 11 및 도 12는 CD70의 넉아웃이 CD70 충분한 대조군(즉, 내인성 CD70을 포함하는 항-BCMA CAR T 세포)과 비교하여 시험관내 항-BCMA CAR T 세포의 IL-2/IL-7 유도 증식을 개선한다는 것을 보여준다. 도 11은 또한 CD70 KO가 (공여자 2(도 12)와 비교하여 공여자 1(도 11)의 세포 수의 감소로 표시된 것처럼) CD70 유전자가 온전할 때 17일 후에 이 공여자로부터의 T 세포가 충분히 감소하는 것으로 보일 때에도 항-BCMA CAR T 세포의 건강 및 증식 기능을 개선할 수 있다는 것을 보여준다. (CD70 유전자의 KO에 의해 가능한) T 세포 건강의 유지의 이 특성은 수율 및 일관성을 증가시키는 제조 동안 연장된 팽창, 환자에서의 가능성 있게 더 낮은 용량 및 보다 강력한 반응이 가능하게 하는 탈진된/비건강한 T 세포의 구제, T 세포 건강에 보다 해로울 수 있지만 T 세포 활성의 억제의 극복과 같은 다른 이점을 갖는 다른 KO(예를 들어, PD1 KO)와의 조합을 포함하는 CAR T 발생의 많은 양태에 광범위하게 이용 가능하다. 도 11 및 도 12에 도시된 것처럼, 단독의 PD1 유전자의 결실은 CAR T 세포 팽창에 이익을 나타내지 않고, CD70과 조합될 때 KO는 상승 효과를 나타낸다.
아폽토시스. 항원에 대한 노출 후에 항-BCMA CAR+ T 세포의 아폽토시스 세포사에 대한 CD70 KO의 효과는 항원 재시험감염 검정에서 평가되었다. 간단히, 항원 노출을 달성하기 위해, 항-BCMA CAR+ T 세포는 플레이트-부착된 재조합 BCMA 단백질에 노출되었다. 24웰 플레이트를 4℃에서 밤새 1x PBS 중의 재조합 BCMA 단백질(1 ㎍/ml; 비오티닐화 Human BCMA Protein, ACRO Biosystems)에 의해 코팅하고 이후 비결합된 항원을 세척하여 항원이 부착된 플레이트를 제조하였다. 세척 후에, 항원 결합된 플레이트를 이후 사용하여 CD70 넉아웃을 갖거나 갖지 않는 항-BCMA CAR+ T 세포를 시험감염시켰다. 2X KO(TRAC-/B2M-) 항-BCMA CAR+ T 세포 및 3X KO(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-BCMA CAR+ T 세포(1x106개의 세포/ml)는 24시간 동안 IL-2(rhIL-2; 130-097-745, Miltenyi Biotech)가 보충된 성장 배지(X-vivo 배지(04-744, Lonza), 5% 인간 AB 혈청(HP1022, Valley Biomedical))에서 플레이트 결합된 재조합 BCMA 단백질(1 ㎍/ml)에 노출되었다. 이후, 세포를 세척하고, 계수하고, 총 3회 연속 재시험감염(24시간, 48시간 및 72시간) 동안 24시간마다 새로운 플레이트 결합된 항원으로 재시험감염(1x106개의 세포/ml)시켰다. 각각의 재시험감염의 종료시, 세포의 분취액을 세척하고, 실온에서 15분 동안 아넥신 V 결합 완충액(BioLegend)에서 프로피듐 요오다이드와 함께 형광색소 접합된 아넥신 V로 염색하였다. 이후, 세포를 세척하고, 유세포분석법에 의한 분석을 위해 아넥신 V 결합 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 각각의 시점에 계수하고, ml당 세포 계수치를 도출하였다. 각각의 시점에 배수 팽창의 계산을 위해, 0시간에서의 초기 배수 팽창은 1에서 설정되었다. 각각의 시점에서의 ml당 세포 계수치에 이전의 시점에 대해 ml당 배수 팽창을 곱하여 모든 다른 시점에 대한 배수 팽창을 계산하였다. 예를 들어, 72시간에서의 ml당 세포 계수치에 48시간에서의 ml당 배수 팽창을 곱하여 72시간에서의 배수 팽창을 계산하였다.
도 13은 CD70의 결실(CD70 KO)이 제2 재시험감염(48시간) 및 제3 재시험감염(72시간) 후에 아폽토시스 세포의 백분율의 감소에 의해 표시된 것처럼 아폽토시스로부터 항-BCMA CAR+ T 세포를 구제한다는 것을 입증한다. 게다가, 항-BCMA CAR+ T 세포에서의 CD70 발현의 부재는 놀랍게도 항원 노출에 반응하여 항-BCMA CAR+ T 세포의 팽창을 향상시켰다(도 14).
시험관내 항-CD70 CAR T 세포의 세포 증식에 대한 CD70 KO의 효과
CAR T 세포에서의 CD70 유전자의 파괴의 영향을 추가로 평가하기 위해, 항-CD70 CAR T 세포는 실시예 3에 기재된 바대로 생성되었다. 구체적으로는, 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR T 세포는 2개의 상이한 gRNA(T7(서열 번호 36 및 T8(서열 번호 37))를 사용하여 생성되었다. 전기천공 후에, 세포 팽창은 생존가능 세포를 계수하여 실시예 2에 기재된 바대로 평가되었다. 도 15는 T7 또는 T8 gRNA 중 어느 하나에 의해 생성된 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포가 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포에 비해 더 높은 세포 팽창을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 데이터는 CD70 유전자의 넉아웃이 항-CD70 CAR+ T 세포에 세포 증식 이점을 준다는 것을 제시한다.
세포 팽창은 또한 사중 넉아웃, TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포에서 평가되었다. 이들 세포는 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포에 비해 더 높은 팽창을 나타냈다(도 16).
실시예 5. CD70 KO는 시험관내 CAR T 세포의 영속성 및 효력을 증가시킨다
CD70 넉아웃을 갖는 항-CD19 CAR T 세포의 세포 사멸 기능
실시예 3에 기재된 바와 같은 편집된 항-CD19 CAR T 세포의 제조 후에, CAR T 세포의 기능적 활성은 유세포분석법-기반 세포독성 검정을 이용하여 검증되었다. 항-CD19 CAR T 세포(TRAC-/β2M-/CD19 CAR+ 및 TRAC-/β2M-/CD70-/CD19 CAR+)를 Nalm6(ATCC crl3273) 또는 Raji(ATCC ccl-86)인 2개의 CD19 발현 암 세포주(표적 세포) 중 하나와 동시배양하였다. 표적 세포를 5 μM efluor670(eBiosciences)으로 표지하고, 세척하고, 변하는 비율(0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1:1의 T 세포 : 표적 세포)의 TRAC-/β2M-/항-CD19 CAR+ 또는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD19 CAR+와 동시배양물에서 항온처리하였다. 표적 세포를 96웰, U-바닥 플레이트에서 웰당 50,000개의 세포로 시딩하였다. 동시배양물을 밤새 항온처리하였다. 항온처리 후에, 웰을 세척하고, 배지를 5　mg/mL의 DAPI(Molecular Probes)의 1:500 희석액을 함유하는 200 ㎕의 배지로 대체하였다. 이후, 25 ㎕의 CountBright 비드(Life Technologies)를 각각의 웰에 첨가하고, 세포 배양물은 유세포분석법에 의해 세포 생존능력에 대해 분석되었다(즉, DAPI 염색에 음성인 생존가능 세포).
표적 세포(예를 들어, Nalm6 또는 Raji 세포)의 세포 용해 백분율은 이후 하기 식을 이용하여 결정되었다:
세포 용해 백분율 = (1-((시험 샘플에서의 표적 세포의 총 수) ÷ (대조군 샘플에서의 표적 세포의 총 수)) X 100;
여기서 시험 샘플은 1) TRAC-/β2M-/CD19 CAR+ T 세포 또는 2) TRAC-/β2M-/CD70-/CD19 CAR+ T 세포와 동시배양된 표적 세포(예를 들어, Nalm6 또는 Raji 세포)이고;
대조군 샘플은 동시배양되지 않은 표적 세포 단독이었다.
CD70 유전자의 파괴는 낮은 CAR-T 대 표적 비율에서 Raji 세포주에 대한 항-CD19 CAR-T 세포의 세포용해 활성을 향상시켰다(도 17, 하부 패널). CD70의 파괴는 Nalm6 세포주에 대한 항-CD19 CAR-T 활성을 향상시키지 않았다(도 17, 상부 패널). 중요하게는, Nalm6 세포주는 이 CAR-T 세포에 의해 용해하기 비교적 더 쉬워서(야생형 세포에 대하여 Nalm6에 대한 0.1:1의 CAR-T 세포 대 표적 비율에서의 80% 초과의 용해 대 Raji에 대한 이 비율에서의 0%의 용해), Nalm6 세포에 대한 이 검정에서의 CD70 파괴로 인한 생성된 증가된 효능의 결여를 설명할 것이다. Raji 세포주에 대한 CD70 소실에 의해 부여된 활성의 증가는 종양 환경을 시험감염시키는 데 있어서 특히 CAR-T 대 종양 비율이 낮을 때 CD70 소실이 종양 세포를 박멸하는 데 있어서 CAR-T 세포에 실질적인 이익을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
CD70 넉아웃을 갖는 항-CD33 CAR T 세포의 세포 사멸 기능
실시예 3에 기재된 바와 같은 편집된 항-CD33 CAR+ T 세포의 제조 후에, CAR T 세포의 기능적 활성은 유세포분석법-기반 세포독성 검정을 이용하여 검증되었다. 항-CD33 CAR T 세포(TRAC-/β2M-/CD33 CAR+ 및 TRAC-/β2M-/CD70-/CD33 CAR+) 또는 대조군 T 세포(RNP 무)를 CD33 발현 암 세포주 MV4-11(ATCC CRL-9591)과 동시배양하였다. 표적 세포를 5 μM efluor670(eBiosciences)으로 표시하고, 세척하고, 변하는 비율(0.01:1, 0.03:1, 0.06:1, 0.125:1, 0.25:1, 0.5:1, 또는 1:1 T 세포 : 표적 세포)의 TRAC-/B2M-/항-CD33 CAR+, TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD33 CAR+ 또는 대조군과 동시배양물에서 항온처리하였다. 표적 세포를 96웰, U-바닥 플레이트에서 웰당 50,000개의 세포로 시딩하였다. 동시배양물을 밤새 항온처리하였다. 48시간 후에, 웰을 세척하고, 배지를 5　mg/mL의 DAPI(Molecular Probes)의 1:500 희석액을 함유하는 200 μL의 배지로 대체하였다. 25 μL의 CountBright 비드(Life Technologies)는 이후 각각의 웰에 첨가되고, 세포 배양물은 유세포분석법에 의해 세포 생존능력에 대해 분석되었다(즉, DAPI 염색에 음성인 생존가능 세포).
표적 세포(예를 들어, MV4-11)의 세포 용해 백분율은 이후 하기 식을 이용하여 결정되었다:
세포 용해 백분율 = (1-((시험 샘플에서의 표적 세포의 총 수) ÷ (대조군 샘플에서의 표적 세포의 총 수)) X 100;
여기서 시험 샘플은 1) TRAC-/B2M-/CD33 CAR+ T 세포 또는 2) TRAC-/B2M-/CD70-/CD33 CAR+ T 세포와 동시배양된 표적 세포(예를 들어, MV4-11 세포)이고,
대조군 샘플은 동시배양되지 않은 표적 세포 단독이었다.
항-CD33 CAR T 세포의 집단 둘 다가 MV4-11 세포를 효과적으로 사멸하여 0.5의 CAR T 세포 : MV4-11 세포의 비율에서 거의 100%의 세포 사멸에 도달하지만, TRAC-/B2M-/CD70-/CD33 CAR+ T 세포는 더 낮은 CAR T 대 암 세포 비율에서 더 높은 세포 사멸을 입증하였다(도 18). 이 데이터는 추가의 CD70 넉아웃을 갖는 동종이계 항-CD33 CAR T 세포가 더 낮은 CAR T 세포 대 표적 세포 비율에서 더 효율적이라는 것을 입증한다.
CD70 넉아웃을 갖는 항-CD70 CAR T 세포의 세포 사멸 기능
세포 사멸 검정은 CD70+ 부착성 신장 세포 암종(RCC) 유래 세포주(A498 세포)를 사멸하는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포 및 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포의 능력을 평가하기 위해 이용되었다. 부착성 세포는 웰당 50,000개의 세포로 96웰 플레이트에서 시딩되고, 37℃에서 밤새 정치되었다. 다음날 편집된 항-CD70 CAR T 세포를 표시된 비율의 표적 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다. 표시된 항온처리 기간 후에, CAR T 세포를 흡기에 의해 배양물로부터 제거하고, 남은 생존가능 세포의 수를 평가하기 위해 100 ㎕의 Cell titer-Glo(Promega)를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트 판독기를 사용하여 웰당 방출된 광의 양을 정량화하였다. 세포는 24시간 동시항온처리 후에 RCC 유래 세포의 강력한 세포 사멸을 나타냈다(도 19). 항-CD70 CAR T 세포는 CD70이 넉아웃될 때 더 높은 효력을 나타냈고, 이는 낮은 T 세포 : A498 비율(1:1 및 0.5:1)에서 명확히 보이고, 여기서 세포 용해는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+에 대해서는 90% 초과로 있지만, 세포 용해는 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+에 대해서는 90% 아래로 떨어졌다. 이는 CD70 유전자의 넉아웃이 항-CD70 CAR+ T 세포에 더 높은 세포 사멸 효력을 준다는 것을 제시한다.
실시예 6. 시험관내 CD70 결핍 CAR T 세포의 재시험감염
CD70 넉아웃은 연속 재시험감염시 항-CD33 CAR+ T 세포 사멸을 개선한다
항원 발현 세포(예를 들어, 표적 세포)에 의한 시험감염 및 재시험감염 후에 팽창하는 세포의 능력을 평가하기 위해, 항-CD33 CAR T 세포는 실시예 3에 기재된 바대로 생성되고 사용되었다. 구체적으로는, 5x106개의 총 T 세포를 5x106개의 조사된 표적 세포(MV-4-11)의 존재 하에 플레이팅하고, 10 mL 부피에서 성장하게 하였다. 1주 후에, 세포를 계수하고, 이전의 배양물로부터의 5x106개의 세포를 이후 5x106개의 조사된 표적 세포의 새로운 분취액과 함께 10 mL의 부피에서 재플레이팅하고, 1주 후에 세포의 총 수를 열거하였다. 이 과정을 표시된 바대로 반복하고, 각각의 재시험감염은 5x106개의 세포로 시작하였다. 생존가능 세포의 수는 실시예 2에 기재된 바대로 계수되었다. CD70 유전자의 파괴를 함유하는 동종이계 항-CD33 CAR-T 세포는 MV-4-11 세포에 의한 2회 시험감염의 둘째주에 더 높은 수준으로 팽창하였다(도 20). 이 데이터는 CD70이 항원 발현 세포의 존재 하의 T 세포 팽창을 제한할 수 있고, 이의 소실이 항원 자극 후에 더 높은 세포 팽창을 발생시킬 수 있다는 것을 보여준다.
CD70 넉아웃은 연속 재시험감염시 항-CD19 CAR+ T 세포 사멸을 개선한다
항원 발현 세포(예를 들어, 표적 세포)에 의한 시험감염 및 재시험감염 후에 팽창하는 세포의 능력을 추가로 평가하기 위해, 항-CD19 CAR T 세포는 실시예 3에 기재된 바대로 생성되고 사용되었다. 구체적으로, 5x106개의 총 T 세포를 5x106개의 조사된 표적 세포(Nalm6)의 존재 하에 플레이팅하고, 10 mL 부피에서 성장하게 하였다. 1주 후에, 세포를 계수하고, 이전의 배양물로부터의 5x106개의 세포를 이후 5x106개의 조사된 표적 세포의 새로운 분취액과 함께 10 mL의 부피에서 재플레이팅하고, 1주 후에 세포의 총 수를 열거하였다. 이 과정을 표시된 바대로 반복하고, 각각의 재시험감염은 5x106개의 세포로 시작하였다. 생존가능 세포의 수는 실시예 2에 기재된 바대로 계수되었다. CD70 유전자의 파괴를 함유하는 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포는 처음의 2회 시험감염 동안 유사한 양으로 팽창하였다. 그러나, 3회 시험감염에서 CD70 유전자의 파괴를 함유하는 동종이계 항-CD19 CAR-T 세포는 Nalm6 세포에 의한 제3 시험감염에서 더 높은 수준으로 팽창하였다(도 21). 이 데이터는 CD70의 존재가 항원 발현 세포의 존재 하의 T 세포 팽창을 제한할 수 있고, 이의 소실이 반복된 항원 자극 후에 더 높은 세포 팽창을 발생시킬 수 있다는 것을 보여준다.
CD70 또는 PD-1과 CD70의 넉아웃은 연속 재시험감염시 항-CD70 CAR + T 세포 사멸을 유지시킨다
상기 생성된 항-CD70 CAR+ T 세포는 CD70+ 신장암 세포주, A498로 연속하여 재시험감염되고, CD70+ 신장암 세포주 A498 또는 ACHN을 사멸하는 이의 능력에 평가되었다.
A498 세포를 T25 플라스크에서 플레이팅하고, 2개(TRAC-/β2M-), 3개(TRAC-/β2M-/PD-1-) 또는 (TRAC-/β2M-/CD70-)), 또는 4개(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-)의 gRNA 편집을 함유하는 10x106개의 항-CD70 CAR+ T 세포와 2:1(T 세포 대 A498)의 비율로 혼합하였다.
각각의 시험감염 후 2일 또는 3일에, 세포를 계수하고, 세척하고, 새로운 T 세포 배지에 재현탁시키고, 하나의 A498 세포당 2개의 항-CD70 CAR+ T 세포(2:1, CAR+ T:표적)의 동일한 비율로 다음날 재시험감염하였다. CD70+ A498 세포에 의한 항-CD70 CAR+ T 세포의 시험감염은 13회 반복되었다. A498 세포에 대한 각각의 노출 후 3일 내지 4일에(그리고 다음의 재시험감염 전에), 배양물의 분취액을 취하고, 2:1(CAR T 세포 : 표적 세포)의 비율에서 A498 또는 ACHN 표적 세포를 사멸하는 CAR T 세포의 능력에 대해 분석되었다. 세포 사멸은 Cell titer-glo(Promega)를 사용하여 측정되었다. A498에 의한 제1 시험감염 전에, 2X KO(TRAC-/β2M-), 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70), 3X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-) 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-)를 갖는 항-CD70 CAR+ T 세포는 각각 100%에 이르는 A498 세포의 표적 세포 사멸을 나타냈다. 그러나, 시험감염 9에 의해, 2X KO(TRAC-/β2M-) 및 3X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-) 항-CD70 CAR+ T 세포는 40% 미만의 A498 세포의 표적 세포 사멸을 유도하지만, 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70) 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포는 60% 초과의 표적 세포 사멸을 나타냈다(도 22a). 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70) 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포에 대한 표적 세포 사멸은 A498 세포에 의한 13회 재시험감염 후에도 60% 초과로 있어서, 이들 CAR+ T 세포가 탈진에 저항적이라는 것을 나타낸다.
항-CD70 CAR T 세포는 A498 신장 암종 세포에 의한 연속 재시험감염 후에 2:1(T 세포 대 ACHN)의 비율로 ACHN 세포를 사멸하는 이의 능력에 대해 또한 평가되었다(도 22b). A498에 의한 제1 시험감염 전에, 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포, 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T, 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포　및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T는 각각 62%, 47%, 73% 및 81% 초과의 세포 사멸 효율을 나타냈다.
시험감염 5 후에, 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 2:1(T 세포 대 ACHN)의 비율로 ACHN 세포를 55% 초과로 여전히 효율적으로 사멸하지만, 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포 사멸은 ACHN 세포의 11% 아래로 떨어졌다. 이 경향은 지속되었고, 여기서 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포는 10회 재시험감염을 넘어 생존하지 못했다. 이에 반해서, 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 계속해서 배양물에서 팽창하고 2회 재시험감염 후에 2:1(T 세포 대 ACHN)의 비율로 ACHN 세포를 30% 초과로 사멸하였다.
이 데이터는 4x KO, CD70 CAR+ T 세포 및 3x KO(CD70), CD70 CAR+ 세포가 2X KO, CD70 CAR+ T 또는 3X KO(PD1), CD70 CAR+ T 세포보다 더 강력하다는 것을 입증한다. 또한, 3X (CD70) KO 및 4X KO는 T 세포 탈진을 방지한다.
5회 재시험감염 후에, 세포는 암 세포를 사멸하는 이의 능력에 대해 평가되었다. 놀랍게도, 3KO 및 4KO 항-CD70 CAR+ T 세포는 다수의 암 세포 시험감염 후에도 암 세포를 사멸하는 데 있어서 고도로 효과적이었다(도 23a). ACHN 세포에서의 항-CD70 CAR+ T 세포의 세포 사멸 효과는 1:1, 0.5:1 및 0.25:1의 감소된 효과기 대 표적 세포 비율에서도 재현 가능하다. (도 23a).
CAR T 치료에 대한 장기간 이익을 보장하기 위해, CAR T 세포는 CAR-T 매개 세포 사멸로부터의 암 세포 회피의 가능성을 배제하기 위해 긴 기간에 걸쳐 이의 표적 세포를 확인하고 박멸할 수 있어야 한다. 시험관내 재시험감염 검정은 여러 주기의 CAR-T 세포 활성화에 걸쳐 CAR-T 세포와 표적 세포의 반복적인 마주침을 모방한다. 이 데이터는 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포와 비교하여 표적 세포 사멸 능력의 감소를 나타내지 않으면서 신장암 세포에 의한 다수의 시험감염을 지속시키는 데 있어서 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포의 우수성을 나타낸다.
탈진 및 활성화 마커는 재시험감염 후에 항-CD70 CAR+T 세포에서의 유세포분석법에 의해 또한 측정되었다. 8회 시험감염 후에, 삼중(TRAC-/β2M-/CD70-) 및 사중(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) KO 항-CD70 CAR+ T 세포가 높은 세포 사멸 활성의 수준과 일치하게 이중(TRAC-/β2M-) 및 사중(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) KO 항-CD70 CAR+ T 세포보다 더 높은 활성화 마커 LAG3 발현을 나타냈다. PD1 발현이 이중(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR+T 세포와 비교하여 (삼중(TRAC-/β2M-/PD1-) 및 사중(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) KO 항-CD70 CAR+T 세포와 유사한) 삼중(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+T 세포에서 더 낮은 것이 관찰되어서, CD70의 넉아웃이 항-CD70 CAR+T 세포에서의 탈진 마커 PD1 발현의 하향조절에 대한 효과를 갖는다는 것을 제시한다. (도 23b).
PD-1 및 CD70의 넉아웃은 연속 재시험감염시 항-BCMA CAR + T 세포 사멸을 유지시킨다
실시예 3에 기재된 바대로 생성된 항-BCMA CAR+ T 세포는 연속적으로 BCMA+ 다발성 골수종 세포주 MM.1S(ATCC CRL-2974)에 의해 재시험감염되고, 이를 사멸하는 능력에 대해 평가되었다. CAR 관여를 통해 연속 T 세포 활성화시 사이토카인을 분비하는 능력은 또한 각각의 재시험감염 후에 측정되었다. MM.1S 세포는 5 μM eFlour670으로 표지되고, 6웰 조직 배양 접시에서 2개(TRAC-/β2M-) 또는 4개(TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-)의 gRNA 편집을 함유하는 1x106개의 항-BCMA CAR+ T 세포와 2:1(MM.1S 대 T 세포)의 비율로 혼합되었다. MM.1S 세포에 대한 노출 후 1일에, 배양물의 분취액이 취해지고, CAR-T 세포에 의한 표적 세포 사멸 및 IFN-g 분비 둘 다에 대해 분석되었다. 사이토카인 방출을 측정하기 위해, T 세포 및 표적 세포는 표시된 비율에서 24시간 동안 동시항온처리되었다. 상청액 배지는 제조사(RD Systems)의 지시에 따라 새로운 플레이트에서 IL-2 또는 IFNγ ELISA(RD Systems)에서 사용을 위해 수집되었다. 세포 사멸을 정량화하기 위해, 세포를 세척하고, 배지를 (죽은 세포/죽어 가는 세포를 열거하기 위해) 5 mg/mL의 DAPI(Molecular Probes)의 1:500 희석액을 함유하는 200 mL의 배지로 대체하였다. 마지막으로, 25 mL의 CountBright 비드(Life Technologies)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 세포를 유세포분석법에 의해 처리하였다.
1) 세포/mL = ((살아 있는 표적 세포 사건의 수)/(비드 사건의 수)) x ((로트의 배정된 비드 계수치(비드/50 ㎕))/(샘플의 부피))
2) 총 표적 세포는 세포/mL x 세포의 총 부피를 곱하여 계산되었다.
3) 세포 용해 백분율은 이후 하기 식으로 계산되었다:
% 세포 용해 = (1-((시험 샘플에서의 표적 세포의 총 수) / (대조군 샘플에서의 표적 세포의 총 수)) x 100
각각의 시험감염 후 2일 또는 3일에, 세포를 계수하고, 세척하고, 새로운 T 세포 배지에 재현탁시키고, 2개의 eFlour670 표지된 MM.1S 세포당 하나의 항-BCMA CAR+ T 세포의 동일한 비율로 재시험감염하였다. BCMA+ MM.1S 세포에 의한 항-BCMA CAR+ T 세포의 시험감염은 순차적으로 10회 반복되었다. MM.1S 세포에 의한 임의의 시험감염 전에, MM.1S 세포와의 2X KO(TRAC-/B2M-) 또는 4X KO(TRAC-/B2M-/CD70-/PD-1-) 항-BCMA CAR+ T 세포의 동시항온처리는 표적 세포를 완전히 사멸시켰다. 추가로, 2X KO 및 4X KO 항-BCMA CAR+ T 세포 둘 다에 의한 IFNγ 생성은 유사하였다. 그러나, MM.1S 세포에 의한 제4 재시험감염 후에, 2X KO 항-BCMA CAR+ T 세포에 의한 표적 세포 사멸 및 IFNγ 생성은 4X KO 항-BCMA CAR+ T 세포에 의해 유도된 것에 비해 감소하였다. 제8 재시험감염에 의해, 표적 세포 사멸은 2X KO 항-BCMA CAR+ T 세포에 대해 불과 대략 20%이지만, 4X KO 항-BCMA CAR+ T 세포에 의한 IFNg 및 표적 세포 사멸 둘 다는 MM.1S 세포에 의한 임의의 시험감염 전에 보인 것과 필적하게 있었다(도 24a-도 24b). 또한, 사중 넉아웃 항-BCMA CAR T 세포는 표적 세포에 대한 노출에 반응하여 더 높은 증식을 나타냈다(도 24c).
CAR T 치료에 대한 장기간 이익을 보장하기 위해, CAR T 세포는 CAR-T 매개 세포 사멸로부터의 암 세포 회피의 가능성을 배제하기 위해 긴 기간에 걸쳐 이의 표적 세포를 확인하고 박멸할 수 있어야 한다. 시험관내 재시험감염 검정은 여러 주기의 CAR-T 세포 활성화에 걸쳐 CAR-T 세포와 표적 세포의 반복적인 마주침을 모방하고, 따라서 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포와 비교하여 세포 사멸 능력의 감소를 나타내지 않으면서 표적 세포에 의한 다수의 시험감염을 지속하는 데 있어서 4X 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포의 우수성을 나타낸다(도 24a-도 24c).
실시예 7. CD70 KO은 과량의 저해 분자의 시험감염을 극복한다
A498-PD-L1 신장 암종 세포에 대한 다중-넉아웃 항-CD70 CAR+ T 세포의 효과의 비교
세포 사멸 검정. PD-L1을 과발현하는 A498 신장 암종 세포를 사멸하는 다중-유전자 편집된 항-CD70 CAR+ 세포의 능력은 본원에 기재된 세포 사멸 검정을 이용하여 결정되었다. PD-L1(CD274)을 과발현하는 세포를 생성하기 위해, A498 세포는 PD-L1 cDNA 및 퓨로마이신 내성 유전자를 암호화하는 렌티바이러스(Genecopoeia)로 감염되었다. 퓨로마이신에 의한 선택 후에, 세포는 PD-L1의 발현을 평가하기 위해 항-PD-L1 항체로 염색되었다. PD-L1을 발현하는 A498 세포는 A498-PD-L1이라 칭해지고, 기재된 기능적 검정에서 사용되었다.
TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+(2X KO, CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+(3X KO(PD-1), CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+(3X KO(CD70), CD70 CAR+) 및 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+(4X KO, CD70 CAR+) T 세포는 2:1(도 25a), 1:1(도 25b) 또는 0.5:1(도 25c)의 CAR T 세포 : A498-PD-L1 표적 세포 비율로 A498-PD-L1 세포와 항온처리되었다. CD70 넉아웃 세포는 24시간 동시항온처리 후에 RCC 유래 세포의 강력한 세포 사멸을 나타냈다(도 25a-도 25c). PD1 넉아웃 단독을 갖는 세포는 PD-L1 과발현의 존재 하에 세포를 효과적으로 용해하지 않았다. 그러나, CD70 넉아웃은 PD1 넉아웃을 구제할 수 있고, CD70 KO 및 PD1 KO를 갖는 CART 세포에서 향상된 세포 용해가 관찰되었다. 이 데이터는 이 CAR-T 세포의 표면 상의 CD70의 소실이 종양 세포, 예컨대 PD-L1에 의해 발현된 고도의 면역 억제 분자의 존재 하에서도 이의 기능을 향상시킨다는 것을 입증한다.
사이토카인 방출 검정. 사이토카인 방출 검정은 본원에 기재된 바대로 수행되었다. 1:1(CAR T 세포 : A948-PD-L1 표적 세포)의 비율에서 24시간 동시항온처리 후에 A948-PD-L1 세포의 존재 하에 동시배양될 때 IL-2 및 IFN-g를 생성하는 이중 넉아웃, 삼중 넉아웃 및 사중 넉아웃 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 ELISA 검정을 이용하여 평가되었다. 세포 동시배양물의 상청액으로부터의 IL-2 및 IFN-g이 측정되었다. 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 A948-PD-L1 세포와 배양될 때 가장 높은 수준의 IFN-g(도 26a) 및 IL-2(도 26b)를 분비하였다. 이 데이터는 CD70의 넉아웃이 종양 세포, 예컨대 PD-L1에 의해 발현된 고도의 면역 억제 분자의 존재 하에서도 사이토카인의 CAR-T 세포 분비를 향상시킨다는 것을 입증한다. CAR-T 세포에서의 PD-1의 넉아웃과 함께 CD70의 넉아웃은 이 효과를 더 향상시킨다. 이론에 의해 구속되고자 바라지 않으면서, 항-CD70 CAR+ T 세포에서의 CD70의 넉아웃이 다른 세포 넉아웃(예를 들어, PD1)의 해로운 표현형을 구제할 수 있는 것으로 생각된다. 이 데이터는 CAR T 세포에서의 CD70의 넉아웃이 고도의 면역 억제 상황에서 표적 세포 사멸 및 CAR T 세포 기능을 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 8. CD70 넉아웃은 생체내 효능을 개선한다
항-CD70 CART 세포에서의 CD70 및 PD1 넉아웃의 효능: NOG 마우스에서의 피하 신장 세포 암종 종양 이종이식 모델
작은 종양 모델에서의 치료
높은 수준의 CD70을 발현하는 신장 암종 세포를 제거하는 CD70 CAR을 발현하는 T 세포의 능력은 마우스에서 피하 신장 세포 암종(A498) 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체내 평가되었다.
CRISPR/Cas9 및 AAV6은 CD70을 표적화하는 CAR 작제물(서열 번호 45; 서열 번호 46)을 사용하여 TCR, β2M, CD70 및/또는 PD1의 발현이 결여되고 TRAC 유전좌위로부터의 발현이 수반된 인간 T 세포를 생성하도록 상기한 바대로(예를 들어, 실시예 3 참조) 사용되었다. 이 실시예에서, 활성화된 T 세포를 처음에 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), PD1(서열 번호 42) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 2개, 3개 또는 4개의 구별되는 Cas9:sgRNA RNP 복합체로 전기천공하였다. TRAC 유전좌위에서의 DNA 이중 가닥 절단은 키메라 항원 수용체 카세트(-/+ 유전자 발현을 위한 조절 요소)가 측접하는 TRAC 유전좌위에 대한 오른쪽 및 왼쪽 상동성 아암을 함유하는 공여자 주형(서열 번호 44; 서열 번호 45)(서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화)을 포함하는 AAV6-전달된 DNA 주형에 의한 상동성 직접 복구에 의해 복구되었다.
생성된 변형된 T 세포는 2X KO(TRAC-/β2M-), 3X KO(TRAC-/β2M-/PD1- 또는 TRAC-/β2M-/CD70-) 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) 항-CD70 CAR+(41BB 동시자극 도메인을 가짐) T 세포이다. CD70+ 신장 암종 세포주에 의해 야기된 질환을 개선하는 이 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 Translational Drug Development, LLC(애리조나주 스카츠데일)가 이용한 방법을 사용하여 NOG 마우스에서 평가되었다. 간단히, 12마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 마우스는 오른쪽 뒷옆구리에서 5x106개의 A498 신장 암종 세포/마우스의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 크기가 25 내지 75 mm3(약 50 mm3의 표적)에 도달할 때, 마우스는 표 15에 기재된 것처럼 5개의 치료 그룹으로 더 분할되었다. 1일에, 치료 그룹 2 내지 5는 표 15에 따라 항-CD70 CAR+ T 세포의 단일 200 ㎕의 정맥내 용량을 받았다.
Figure pct00016
종양 용적은 치료 개시 날짜로부터 매주 2회 측정되었다. 5일에 항-CD70 CAR T 세포의 모든 4개의 유형에 의한 치료가 22일까지 종양 용적의 감소를 나타내기 시작하였고, 항-CD70 CAR T 세포의 모든 4개의 유형이 91일까지 연구의 과정 동안 CD70+ 신장암 종양을 완전히 제거하였다(도 27a). 이 데이터는 모든 4개의 항-CD70 CAR T 세포가 생체내 CD70+ 신장암 종양을 회귀시킬 수 있다는 것을 입증한다.
재시험감염 후에 항-CD70 CAR T 세포의 활성을 시험하기 위해, 살아 있는 마우스를 25일에 5x106개의 A498 신장 암종 세포/마우스로 피하 왼쪽 뒷옆구리에서 접종하였다. (표 16). 지속적인 효능이 46일부터 뒤에 평가되었다. 결과는 도 27b에 도시되어 있다. 56일에, 2X, CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 5마리가 재시험감염후 종양 재성장을 나타냈고, 3X (PD1), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 4마리가 재시험감염후 종양 재성장을 나타냈고, 4X (CD70,PD1), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 2마리가 재시험감염후 종양 재성장을 나타내는 반면, 3X (CD70), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 마우스 중 어느 것도 재시험감염후 종양 재성장을 나타내지 않았다. 이 경향은 지속되었고, 70일에 3X (PD1), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 4마리가 재시험감염 후 종양 재성장을 나타냈고, 4X (CD70, PD1), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 4마리가 재시험감염 후 종양 재성장을 나타내는 반면, 3X (CD70), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 마우스 중 오직 1마리가 작은 종양을 나타냈는데, 이 종양은 재시험감염 후 34일에 나타나기 시작하였다. 91일 넘어서까지, 3X (CD70), CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 오직 1마리가 종양 재성장을 나타내기 시작하였고, 이는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포가 종양 세포에 대한 재노출 후 더 높은 생체내 효능을 보유한다는 것을 나타낸다.
Figure pct00017
큰 종양 모델에서의 치료
더 큰 신장 세포 암종 종양에 대한 항-CD70 CAR T 세포의 생체내 효능이 조사되었다. 상기한 것처럼, CRISPR/Cas9 및 AAV6은 CD70을 표적화하는 CAR 작제물(서열 번호 45)을 사용하여 TCR, β2M, CD70 및/또는 PD1의 발현이 결여되고 TRAC 유전좌위로부터의 발현이 수반된 인간 T 세포를 생성하도록 사용되었다. 이 실시예에서, 활성화된 T 세포는 처음에 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41), PD1(서열 번호 42) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 2개, 3개 또는 4개의 구별되는 Cas9:sgRNA RNP 복합체로 전기천공되었다. TRAC 유전좌위에서의 DNA 이중 가닥 절단은 키메라 항원 수용체 카세트(-/+ 유전자 발현을 위한 조절 요소)가 측접하는 TRAC 유전좌위에 대한 오른쪽 및 왼쪽 상동성 아암을 함유하는 AAV6-전달된 DNA 주형(서열 번호 43)(서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화)에 의한 상동성 직접 복구에 의해 복구되었다.
생성된 변형된 T 세포는 2X KO(TRAC-/β2M-), 3X KO(TRAC-/β2M-/PD1- 또는 TRAC-/β2M-/CD70-) 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) 항-CD70 CAR+(41BB 동시자극 도메인을 가짐) T 세포이다. CD70+ 신장 암종 세포주에 의해 야기된 질환을 개선하는 이 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 Translational Drug Development, LLC(애리조나주 스카츠데일)가 이용한 방법을 사용하여 NOG 마우스에서 평가되었다. 간단히, 12마리의, 5주령 내지 8주령 암컷 마우스, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac)를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 마우스는 5x106개의 A498 신장 암종 세포/마우스의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 크기가 125 내지 175 mm3(약 150 mm3의 표적)에 도달할 때, 마우스는 표 17에 기재된 것처럼 5개의 치료 그룹으로 더 분할되었다. 1일에, 치료 그룹 2 내지 5는 표 17에 따라 항-CD70 CAR+ T 세포의 단일 200 ㎕의 정맥내 용량을 받았다.
Figure pct00018
종양 용적은 치료 개시 날짜로부터 매주 2회 측정되었다. 4일 치료에 오직 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포는 종양 용적의 감소를 나타내기 시작했다(도 27c). 이에 반해서, 2X KO(TRAC-/β2M-) 항-CD70 CAR+ T 세포 또는 3X KO(TRAC-/β2M-/PD1-) 항-CD70 CAR+ T 세포에 의해 치료된 동물에 대한 종양 성장은 비치료 그룹과 유사하였다. 23일 치료에, 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포는 생체내 CD70+ 신장암 종양을 완전히 제거하였다. 23일 치료에, 4X KO(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포에 반응한 종양의 제거는 거의 완료되었고, 5마리의 마우스 중 4마리는 생체내 검출 가능한 신장암 종양을 나타내지 않았다.
이 데이터는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포 및 4X KO(TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포가 생체내 큰 CD70+ 신장암 종양을 유의미하게 회귀시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
CD70 넉아웃을 갖는 PD1, CD70 및 PD1의 상황에서의 항-BCMA CAR에 대한 생체내 종양 모델.
NOG 마우스에서의 피하 MM.1S 종양 이종이식 모델에 대한 TRAC-/β2M-/항-BCMA(4-1BB 동시자극) CAR+ T 세포, TRAC-/β2M-/PD-1-/항-BCMA(4-1BB 동시자극), TRAC-/β2M-/CD70-/항-BCMA(4-1BB 동시자극) 및 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-BCMA(4-1BB 동시자극) CAR+ T 세포의 효능이 평가되었다. 간단히, 25마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 1일에, 25마리의 마우스는 오른쪽 옆구리에서 50% Matrigel/마우스에서 5x106개의 MM.1S 세포의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 용적이 75 내지 125 mm3에 도달할 때, 마우스는 5 치료 그룹(N=5)으로 분할되고, 표 18에 표시된 것처럼 약 50%의 항-BCMA CAR+ T 세포를 포함하는 T 세포 집단이 투약되었다.
Figure pct00019
종양 용적 및 체중은 매주 2회 측정되고, 개별 마우스는 이들의 종양 용적이 2000 mm3 이상에 도달할 때 안락사되었다.
16일에, 모든 치료 그룹은 출발 용적으로부터 종양 회귀를 나타내지만, 대조군 그룹에서의 동물은 평균이 1500 mm3 초과인 종양을 가졌다. 27일에, 대조군 그룹에서의 모든 동물은 2000 mm3 이상의 종양 용적 종점에 도달하지만, 모든 치료 그룹은 20 mm3 미만의 평균 종양 용적을 가졌다(도 28a). 45일에, 각각의 치료 그룹(그룹 2 내지 5)으로부터의 모든 마우스는 2차 종양 시험감염(재시험감염)으로 추가로 처리되었다. 마우스는 왼쪽 옆구리에서 50% Matrigel/마우스에서 5x106개의 MM.1S 세포의 제2 피하 접종을 받았다. 대조군 마우스의 새로운 그룹은 참가하고(N=5), 또한 50% Matrigel/마우스에서 왼쪽 옆구리에서 5x106개의 MM.1S 세포의 접종을 받았다.
모든 마우스는 초기 오른쪽 옆구리 종양 및 왼쪽 옆구리에서의 재시험감염 종양 둘 다에서 종양 성장에 대해 모니터링되었다. 모든 치료 그룹은 대부분의 대상체에서 초기 오른쪽 옆구리 종양에서 종양 성장을 성공적으로 저해하였다(도 28a; 표 19). 종양 성장은 77일까지 실험의 기간 동안 종양 재시험감염 전 및 후 둘 다에 모든 치료에 의해 저해되었다. TRAC-/β2M-/CD70-/PD1-/항-BCMA CAR+ T 세포에 의해 치료된 오직 1마리의 대상체는 초기 암 세포 시험감염으로부터 종양 성장을 나타냈다(표 19).
놀랍게도, 왼쪽 옆구리에서의 재시험감염 후 종양 성장은 또한 재시험감염의 날(45일)부터 77일까지 모든 치료 그룹에 의해 유의미하게 저해되었다(도 28b; 표 19). 이 데이터는 CAR+ T 세포가 생체내 지속하여 초기 종양 성장을 저해할 뿐만 아니라, 추가의 CAR-T 세포가 이 마우스에 전달되지 않더라도 추가의 암 세포에 의한 재시험감염 후에 새로운 종양의 성장을 저해하는 것으로 나타났다. 예를 들어, TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포의 집단에 의해 초기에 치료된 4마리의 마우스 중 3마리, TRAC-/β2M-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포에 의해 초기에 치료된 5마리의 마우스 중 3마리 및 TRAC-/β2M-/PD1-/항-BCMA CAR+ T 세포에 의해 초기에 치료된 5마리의 마우스 중 3마리는 새로운 암 세포에 대한 제2 시험감염(재시험감염)에도 불구하고 새로운 종양 성장을 나타내지 않았다. 이 데이터는 예상치 못하게 항-BCMA CAR+ T 세포가 예를 들어 주사 후 적어도 77일까지 생체내 긴 기간 동안 지속할 수 있고, 생체내 긴 기간 동안 종양 세포 성장을 저해하고 종양 용적을 감소시키는 이의 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 이 놀라운 결과는 이러한 TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포의 사용이 생체내 우수한 장기간 항암 효과를 달성할 것이라는 것을 나타낸다.
인간 CD45+ 세포는 제조사 프로토콜에 따라 BD Trucount 관을 사용하여 마우스 혈액으로부터 정량화되고, Brilliant Violet 786 접합된 항-인간 CD45(Biolegend 카탈로그 368528)를 사용하여 검출되었다. 모든 그룹은 1주에 100 huCD45+ 세포/㎕ 미만의 값을 나타냈다. 투약 후 2주에, 모든 그룹에서의 순환 CD45+의 수는 3주까지 1주전 값으로 떨어지기 전에 최고였다(도 29). 45일에 재시험감염시, 항-BCMA CAR+ T 세포에 의해 치료된 대상체는 암 재시험감염 후에 순환 CAR T 세포의 후속하는 팽창 없이 종양 성장을 제거하거나 저해할 수 있었다. 이 데이터는 예상치 못하게 항-BCMA CAR+ T 세포가 예를 들어 주사 후 적어도 77일까지 생체내 긴 기간 동안 지속할 수 있고, 생체내 긴 기간 동안 종양 세포 성장을 저해하고 종양 용적을 감소시키는 이의 능력을 보유한다는 것을 추가로 나타낸다. 이 놀라운 결과는 TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포, TRAC-/ β2M-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포 및 TRAC-/β2M-/PD1-/항-BCMA CAR+ T 세포의 사용이 생체내 우수한 장기간 항암 효과를 달성할 것이라는 것을 나타낸다.
Figure pct00020
CD70 넉아웃의 상황에서의 항-BCMA CAR에 대한 생체내 종양 모델: 보통의 CAR T 투약에 대한 CD70 KO의 효과
CD70 넉아웃을 갖는 여러 항-BCMA CAR+ T 세포 유전자형 및 갖지 않는 것 둘 다의 효능은 NOG 마우스에서 피하 RPMI-8226 종양 이종이식 모델에 대해 평가되었다. 간단히, 팔십오(85)마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 1일에 마우스는 10x106개의 RPMI-8226 세포/마우스의 피하 접종을 받았다. RPMI-8226 세포에 의한 접종 후 십(10)일, 마우스는 17개의 치료 그룹(N=5)으로 분할되고, 표 20에 표시된 것처럼 약 80%의 항-BCMA CAR+ T 세포를 포함하는 T 세포 집단이 투약되었다.
Figure pct00021
종양 용적 및 체중은 매주 2회 측정되고, 개별 마우스는 종양 용적이 2000mm3 이상일 때 안락사되었다. 22일에, 이 데이터는 100,000개의 세포가 투약된 임의의 항-BCMA CAR T 세포 유전자형(그룹 5, 그룹 9, 그룹 13 및 그룹 17)과 비교하여 항-BCMA CAR T 세포(1x105 내지 3x106개의 세포 용량)의 더 높은 용량에 반응하여 통계학적으로 유의미한 종양 용적 감소를 나타냈다(도 30; 표 21).
36일에, 3x105개의 세포의 보통의 용량에서 투약된 TRAC-/β2M-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포는 CD70 KO가 없는 항-BCMA CAR+ T 세포(예를 들어, TRAC-/β2M-/항-BCMA CAR+ T 세포, TRAC-/β2M-/PD1-/항-BCMA CAR+ T 세포 또는 TRAC-/β2M-/PD1-/CD70-/항-BCMA CAR+ T 세포)보다 감소하는 종양 용적에 대한 더 큰 효과를 나타냈다(도 30). 1x106개 이상의 모든 항-BCMA CAR+ T 세포의 모든 더 높은 용량(도 30; 100만개, 300만개)은 종양 용적의 완전 회귀를 나타냈다. 이 경향은 연구의 57일을 넘어 지속되었다.
이 결과는 (예를 들어, CD70의 넉아웃에 의한) CD70의 활성의 저해가 생체내 CAR+ T 세포의 효능 및 효력을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이 효과는 항-CD70 CAR의 존재와 독립적이다.
Figure pct00022
실시예 9. 다중 넉아웃 CAR T 세포는 사이토카인 의존성을 보유한다
사이토카인 의존성 . 유전자 편집이 불리한 특성, 예컨대 비제어된 세포 성장을 갖는 세포를 생성하는 원치 않는 오프-타깃 편집을 생성시키는지를 결정하기 위해, 사이토카인 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는 유전자 편집된 CAR T 세포의 능력이 평가되었다.
항-CD70 CAR T 세포: 사이토카인 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포의 능력이 평가되었다. 5x106개의 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포는 세포 제조(0일) 후 약 2주에 플레이팅되었다. 생존가능 세포의 수는 완전 배지, 사이토카인(IL-2 및 IL-7)이 없는 5% 인간 혈청 또는 혈청 및 사이토카인이 결여된 기본 배지에서 플레이팅 후 7일 및 14일에 열거되었다. 세포는 사이토카인이 결여된 배양물에 플레이팅된 후 14일에 검출되지 않았고, 이는 게놈 편집으로 인한 임의의 가능성 있는 오프-타깃 효과가 세포에 성장 인자 독립적 성장/증식을 유도하지 않았다는 것을 제시한다(도 31). 세포는 오직 사이토카인(사이토카인을 함유하는 완전 배지)의 존재 하에 증식하고, 혈청 단독의 존재 하에 증식하지 않았다. 따라서, 생체내, 세포는 임의의 오프-타깃 게놈 편집으로 인해 사이토카인, 성장 인자 또는 항원 자극의 부재 하에 성장하지 않을 것이다.
사이토카인 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는 TRAC-/β2M-/CD70-/PD1- 항-CD70 CAR+ 세포의 능력이 또한 평가되었다. 2x106개의 세포는 세포 제조(0일) 후 약 2주에 플레이팅되었다. 생존가능 세포의 수는 완전 배지, 사이토카인(IL-2 및 IL-7)이 없는 5% 인간 혈청 또는 혈청 및 사이토카인이 결여된 기본 배지에서 플레이팅 후 26일까지 열거되었다. 세포는 사이토카인이 결여된 배양물에 플레이팅된 후 26일에 검출되지 않았고, 이는 게놈 편집으로 인한 임의의 가능성 있는 오프-타깃 효과가 세포에 성장 인자 독립적 성장/증식을 유도하지 않았다는 것을 제시한다(도 32). 세포는 오직 사이토카인(사이토카인을 함유하는 완전 배지)의 존재 하에 증식하고, 혈청 단독의 존재 하에 증식하지 않았다. 따라서, 게놈 편집은 임의의 부작용을 유도하지 않았고, 이는 세포가 사이토카인, 성장 인자 또는 항원 자극의 부재 하에 성장하게 한다.
항-BCMA CAR+ T 세포: 사이토카인 및/또는 혈청의 부재 하에 성장하는 TRAC-/β2M-/CD70-/PD-1-/항-BCMA CAR+ 세포의 능력이 평가되었다. TRAC-/β2M-/CD70-/PD-1-/항-BCMA CAR+ 세포는 또한 4X KO, BCMA CAR+ 세포라 칭해진다. 1x106개의 4X KO, BCMA CAR+ 세포는 실시예 6에 기재된 10회 재시험감염 후에 플레이팅되었다. 생존가능 세포의 수는 완전 배지, 사이토카인(IL-2 및 IL-7) 없는 5% 인간 혈청 또는 혈청 및 사이토카인이 결여된 기본 배지에서 플레이팅 후 7일 및 14일에 열거되었다. 세포는 사이토카인이 결여된 배양물에 플레이팅된 후 13일에 검출되지 않았고, 이는 게놈 편집으로 인한 임의의 가능성 있는 오프-타깃 효과가 세포에 성장 인자 독립적 성장/증식을 유도하지 않았다는 것을 제시한다(도 33). 세포는 오직 사이토카인(사이토카인을 함유하는 완전 배지)의 존재 하에 증식하고, 혈청 단독의 존재 하에 증식하지 않았다. 따라서, 생체내, 세포는 비제어 방식으로 성장하지 않을 것이다.
다른 CAR T 세포: 본원에 예시된 항-CD33 CAR+ T 세포 및 항-CD19 CAR+ T 세포가 오직 사이토카인의 존재 하에 증식하고, 혈청 단독의 존재 하에 증식하지 않는다는 것이 이전에 나타났다. 따라서, 생체내, 이 세포는 비제어 방식으로 성장하지 않을 것이다.
사이토카인 방출 검정. 사이토카인 방출을 측정하기 위해, T 세포 및 표적 세포는 표시된 비율에서 24시간 동안 동시항온처리되었다. 상청액 배지는 제조사(RD Systems)의 지시에 따라 새로운 플레이트에서 IL-2 또는 IFNγ ELISA(RD Systems)에서 사용을 위해 수집되었다.
A498 세포의 존재 하에 동시배양될 때 인터류킨-2(IL-2)를 생성하는 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포의 능력은 ELISA 검정을 이용하여 분석되었다. 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 둘 다는 높은 수준의 IL-2를 분비하였다. 두드러지게, TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포는 A498 세포와 배양될 때 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ 세포보다 더 높은 수준의 IL-2를 분비하였다(도 34). 이 결과는 CD70 유전자의 넉아웃이 더 많은 IL-2를 분비하도록 항-CD70 CAR+ T 세포에 이점을 준다는 것을 제시한다.
실시예 10. A498 신장 암종 세포에 대한 항-CD70 CAR+ T 세포에 대한 다중 넉아웃의 효과
항-CD70 CAR+ T 세포의 기능에 대한 다중 넉아웃의 효과.
세포 사멸 검정 . A498 신장 암종 세포를 사멸하는 다중 유전자 편집의 능력은 상기 기재된 세포 사멸 검정을 이용하여 결정되었다. 간단히, TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+(2X KO, CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+(3X KO(PD-1), CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+(3X KO(CD70), CD70 CAR+) 및 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+(4X KO, CD70 CAR+) 세포는 다양한 CAR T 세포 : A498 표적 세포 비율에서 CD70+ 부착성 RCC 유래 세포주 (A498 세포)와 항온처리되었다.
TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ 세포는 24시간 동시항온처리 후에 RCC 유래 세포의 강력한 세포 사멸을 나타냈다(도 35). 사중 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T는 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포(0.5:1 및 0.25:1의 낮은 T 세포 : A498 비율에서 보임)보다 더 높은 효력을 나타낸 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포보다 더 높은 세포 사멸 효력을 나타냈다. 결과는 CD70 및 PD-1 유전자 둘 다의 넉아웃이 항-CD70 CAR+ 세포에 더 높은 세포 사멸 효력을 준다는 것을 나타낸다.
유전자 편집된 세포는 또한 0.24:1의 CAR T 세포 : A948 표적 세포 비율에서 24시간 동시항온처리 후에 RCC 유래 세포의 강력한 세포 사멸을 나타냈다. (도 36). 구체적으로는, 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 이중 넉아웃 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+ T 세포 또는 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+ T 세포보다 더 높은 효력을 나타냈다. 이 데이터는 항-CD70 CAR의 상황에서 CD70의 넉아웃이 항-CD70 CAR+ T 세포의 세포 사멸 능력을 개선한다는 것을 나타낸다.
사이토카인 방출 검정. 사이토카인 방출 검정은 상기 기재된 바대로 수행되었다. 0.25:1(CAR T 세포 : A498 표적 세포)의 비율에서 24시간 동시항온처리 후에 A498 세포의 존재 하에 동시배양될 때 IL-2 및 인터페론 감마(IFN-감마(IFN-g))를 생성하는 이중 넉아웃, 삼중 넉아웃 및 사중 넉아웃 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 ELISA 검정을 이용하여 평가되었다. 세포 동시배양물의 상청액으로부터의 IL-2 및 IFN-g이 측정되었다. 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 A498 세포와 배양될 때 가장 높은 수준의 IFN-g(도 37a) 및 IL-2(도 37b)를 분비하였다.
탈진 마커 발현에서의 CD70 넉아웃의 효과
탈진 마커 PD-1 및 LAG3의 수준은 상기 실시예에 사용된 TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+(2X KO, CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+(3X KO(PD-1), CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+(3X KO(CD70), CD70 CAR+) 및 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+(4X KO, CD70 CAR+) T 세포에서 평가되었다. 유세포분석법에 의해 CD4+ T 세포는 PD-1 발현에 대해 평가되고(도 38), CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 둘 다는 LAG3 발현에 대해 평가되었다(각각 도 39a 및 도 39b).
데이터는 CD70 KO가 CAR T 세포에서 탈진 마커 발현의 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 38에서의 데이터는 PD-1 발현이 예상된 바대로 PD-1이 넉아웃될 때 감소한다는 것을 보여주고, 이것은 또한 CD70이 넉아웃될 때 감소한다.
도 39a 및 도 39b에서의 데이터는 CD70의 넉아웃이 CD4 및 CD8 세포에서 LAG3 발현 마커를 감소시킨다는 것을 나타낸다.
데이터는 CD70의 넉아웃이 더 양호한 치료제로 이어지는 CAR+ T 세포의 CD8+ 및 CD4+ 유전자 편집된 집단의 가능성 있는 탈진을 특이적으로 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 11. CD70 KO는 다수의 세포 유형에서 세포 사멸을 개선한다
다양한 암 세포주에서의 CD70 발현. 상대 CD70 발현은 다양한 암 유형을 사멸하는 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력을 추가로 평가하기 위해 다양한 암 세포주에서 측정되었다. CD70 발현은 Alexa Fluor 647 항-인간 CD70 항체(BioLegend 카탈로그 번호 355115)를 사용하여 FACS 분석에 의해 측정되었다. 도 40a(왼쪽 그래프)는, 다른 신장암 세포주 A498, 786-O, cacki-1 및 Caki-2와 비교하여, FACS에 의해 측정된 것처럼, ACHN 세포에서의 CD70의 상대 발현을 보여준다. 추가로, 비신장암 세포주는 Alexa Fluor 647 항-인간 CD70 항체(BioLegend 카탈로그 번호 355115; 도 40a, 오른쪽 패널) 또는 도 40b에서 FITC 항-인간 CD70 항체(BioLegend 카탈로그 번호 355105)를 사용하여 FACS 분석(표 22, 도 40a 및 도 40b)에 의해 CD70 발현에 대해 평가되었다. SNU-1(장암 세포)은 A498과 유사한 높은 수준의 CD70 발현을 나타냈다(도 40a, 오른쪽 패널). SKOV-3(난소), HuT78(림프종), NCI-H1975(폐) 및 Hs-766T(췌장) 세포주는 ACHN과 유사하거나 더 높지만 A498보다 낮은 CD70 발현 수준을 나타냈다(표 22, 도 40b).
Figure pct00023
세포 사멸 검정. ACHN 신장 암종 세포를 사멸하는 다중 유전자 편집된 항-CD70 CAR+ 세포의 능력은 상기에 기재된 세포 사멸 검정을 이용하여 결정되었다. TRAC-/β2M-/항-CD70 CAR+(2X KO, CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/PD-1-/항-CD70 CAR+(3X KO(PD-1), CD70 CAR+), TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+(3X KO(CD70), CD70 CAR+) 및 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+(4X KO, CD70 CAR+) 세포는 0.5:1(도 40c) 및 0.25:1(도 40d)의 CAR T 세포 : ACHN 표적 세포 비율에서 낮은 수준의 CD70 항원을 발현하는 부착성 RCC 유래 세포주(ACHN 세포)와 항온처리되었다(도 40a는 다른 신장암 세포주 A498, 786-O, cacki-1 및 Caki-2와 비교하여 FACS에 의해 측정된 것처럼 ACHN 세포에서의 CD70의 상대 발현을 나타낸다). 유전자 편집된 세포는 24시간 동시항온처리 후에 RCC 유래 세포의 강력한 세포 사멸을 나타냈다(도 40c 및 도 40d). 세포는 PD-1이 넉아웃될 때, CD70이 넉아웃될 때 더 높은 효력을 나타내고, PD-1 및 CD70 둘 다가 넉아웃될 때 심지어 약간 더 높은 효력을 나타냈다. 결론으로, PD-1 또는 CD70 또는 PD-1 및 CD70 둘 다의 넉아웃은 함께 ACHN 세포에서 항-CD70 CAR+ 세포의 세포 사멸 능력을 개선한다.
ACHN 세포는 보통 내지 낮은 수준의 CD70을 발현하는 것으로 발견되었지만, 3X KO(PD-1), CD70 CAR+ T 세포, 3X KO(CD70), CD70 CAR+ T 세포 및 4X KO CD70 CAR+ T 세포에 의한 사멸에 놀랍게도 감수성이었다(도 40c 및 도 40d). 이는 높은 CD70 발현이 항-CD70 CAR을 발현하는 유전자 편집된 T 세포에 의해 표적 세포의 효과적인 사멸에 대한 요건이 아니라는 것을 나타낸다. 추가로, SNU-1, SK-OV-3, NCI-H1975 및 HS-766T 세포주에 대한 CD70 발현의 수준이 ACHN과 유사하거나 더 높은 것으로 발견된다는 것을 고려하면, 항-CD70 CAR+ T 세포가 또한 이 암 세포 유형을 사멸하는 데 있어서 특히 효율적일 것으로 예상되었다. 실제로, TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+(4X KO, CD70 CAR+) 및 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+(3X KO(CD70), CD70 CAR+)가 동시배양의 오직 24시간 후에 다수의 고형 종양 세포주의 놀랍게도 강력한 세포 사멸을 나타낸다는 것이 발견되었다(도 40e는 4X KO CAR+ T 세포에 의한 사멸을 보여주고, 도 40f는 3X KO CAR+ T 세포에 의한 사멸을 보여준다). 3X KO, CD70 CAR+ 및 4X KO, CD70 CAR+ T 세포 둘 다가 4:1의 효과기 : 표적 세포 비율에서 신장, 췌장 및 난소 종양 세포(A498, ACHN, SK-OV-3 및 Hs-766T)를 60% 초과로 사멸하고, 1:1의 효과기 : 표적 세포 비율에서 50% 초과로 사멸하였다. 보통 내지 낮은 CD70 발현을 갖는 암 세포주(NCI-H1975, Calu-1 및 DU 145)의 세포 사멸은 동시배양의 24시간 내에 4:1의 효과기 : 표적 세포 비율에서 30% 초과의 사멸로 여전히 효과적이었다(도 40e 및 도 40f). 3X KO 또는 4X KO, CD70 CAR+ T 세포에 대한 더 긴 노출(즉, 96시간)은 모든 세포 유형에 걸쳐, 특히 SKOV-3, Hs-766T 및 NIC-H1975 세포에 대해 암 세포 사멸을 증가시키고, 여기서 1:1의 효과기 : 표적 세포 비율에서 사멸은 80% 초과였다(도 40g).
SNU-1 세포 사멸은 가시적 평가에 의해 평가되었다.
CAR+ T 세포에 대한 긴 노출 후에 표적 세포 사멸은 SNU-1 암 세포에 대한 현미경검사에 의해 또한 평가되었다. SNU-1 세포는 6웰 플레이트에서 웰당 100만개의 세포의 밀도로 플레이팅되고, 3X KO(CD70), 항-CD70 CAR+ T 세포와 4:1의 효과기 : 표적 비율로 혼합되었다. 동시배양물은 육(6)일 동안 항온처리되고, 생존가능 암 세포의 존재는 현미경검사에 의해 평가되었다. 모든 위 암종 표적 세포(SNU-1)는 대조군 웰과 비교하여 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포를 함유하는 웰에서 제거되어서, 암 세포가 연장된 동시배양에 의해 항-CD70 CAR+ T 세포에 의해 완전히 제거된다는 것을 나타낸다.
CD70 발현 세포를 선택적으로 사멸하는 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력이 결정되었다. 유세포분석법 검정은 3X KO(CD70)(TRAC-/B2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포에 의해 암 세포 현탁 계통(예를 들어, "표적 세포"라 칭해지는 K562, MM.1S 및 HuT78 암 세포)의 사멸을 시험하도록 설계되었다. 사용된 표적 세포주 중 2개는 CD70 발현 암 세포(예를 들어, MM.1S 및 HuT78)이지만, 음성 대조군 암 세포로서 사용된 세번째는 CD70 발현이 결여된다(예를 들어, K562). TRAC-/B2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 CD70 발현 MM.1S 또는 HuT78 세포주 또는 CD70-음성 K562 세포주와 동시배양되었다. 표적 세포는 5 μM efluor670(eBiosciences)으로 표지되고, 세척되고, 96웰 U-바닥 플레이트에서 웰당 50,000개의 표적 세포의 밀도로 시딩되었다. 표적 세포는 변하는 비율(0.5:1, 1:1, 2:1 및 4:1의 CAR+ T 세포 대 표적 세포)에서 TRAC-/B2M-/CD70- 항-CD70 CAR+ T 세포와 동시배양되고, 밤새 항온처리되었다. 표적 세포 사멸은 24시간 동시배양 후에 결정되었다. 세포를 세척하고, (죽은 세포/죽어 가는 세포를 열거하기 위해) 5 mg/mL의 DAPI(Molecular Probes)의 1:500 희석액을 함유하는 200 ㎕의 배지를 각각의 웰에 첨가하였다.　이후, 세포는 유세포분석법에 의해 분석되고, 남은 살아 있는 표적 세포의 양이 정량화되었다.
도 40h, 도 40i 및 도 40j는 TRAC-/B2M-/CD70- 항-CD70 CAR+ T 세포에 의한 선택적 표적 세포 사멸을 나타낸다. 3X KO(CD70) CAR+ T 세포와의 24시간 동시배양은 0.5:1의 낮은 CAR+ T 세포 대 CD70 발현 표적 세포 비율에서도 T 세포 림프종 세포(HuT78)를 거의 완전히 사멸시켰다(도 40j). 마찬가지로, 24시간 동시배양은 시험된 모든 CAR+ T 세포 대 표적 세포 비율에서 다발성 골수종 세포(MM.1S)를 거의 완전히 사멸시켰다(도 40I). 표적 세포의 사멸은 TRAC-/B2M-/항-CD70 CAR+ T 세포가 시험된 임의의 효과기 : 표적 세포 비율에서 대조군 샘플(예를 들어, 암 세포 단독 또는 무 RNP T 세포와의 동시배양)의 수준보다 높은 CD70 결핍 K562 세포의 사멸을 유도하지 않는다는 점에서 선택적인 것으로 발견되었다(도 40h).
사이토카인 방출 검정. 사이토카인 방출 검정은 상기 기재된 바대로 수행되었다. 0.25:1(CAR T 세포 : ACHN 표적 세포)의 비율에서 24시간 동시항온처리 후에 ACHN 세포의 존재 하에 동시배양될 때 IL-2 및 IFN-g를 생성하는 이중 넉아웃, 삼중 넉아웃 및 사중 넉아웃 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 ELISA 검정을 이용하여 평가되었다. 세포 동시배양물의 상청액으로부터의 IL-2 및 IFN-g이 측정되었다. 삼중 넉아웃 TRAC-/β2M-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포 및 사중 넉아웃 TRAC-/β2M-/PD-1-/CD70-/항-CD70 CAR+ T 세포는 ACHN 세포와 배양될 때 가장 높은 수준의 IFN-g(도41) 및 IL-2(도 41b)를 분비하였다. 결론으로, CD70 또는 PD-1 및 CD70 둘 다의 넉아웃은 함께 ACHN 세포에서 항-CD70 CAR+ 세포의 세포 사멸 능력을 개선한다.
실시예 12. 항-CD70 CAR+ T 세포에서의 CD70 KO의 효능: NOG 마우스에서의 종양 이종이식 모델
난소 종양 모델에서의 치료
보통의 수준의 CD70을 발현하는 난소 선암 세포를 제거하는 항-CD70 CAR을 발현하는 T 세포의 능력은 마우스에서 피하 난소 암종(SKOV-3) 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체내 평가되었다.
CRISPR/Cas9 및 AAV6은 CD70을 표적화하는 CAR 작제물(서열 번호 45; 서열 번호 46)을 사용하여 TCR, β2M, CD70의 발현이 결여되고 TRAC 유전좌위로부터의 발현이 수반된 인간 T 세포를 생성하도록 상기한 바대로(예를 들어, 실시예 3 참조) 사용되었다. 이 실시예에서, 활성화된 T 세포는 처음에 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 3개의 구별되는 Cas9:sgRNA RNP 복합체로 전기천공되었다. TRAC 유전좌위에서의 DNA 이중 가닥 절단은 키메라 항원 수용체 카세트(-/+ 유전자 발현을 위한 조절 요소)가 측접하는 TRAC 유전좌위에 대한 오른쪽 및 왼쪽 상동성 아암을 함유하는 공여자 주형(서열 번호 44; 서열 번호 45)(서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화)을 포함하는 AAV6-전달된 DNA 주형에 의한 상동성 직접 복구에 의해 복구되었다.
생성된 변형된 T 세포는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포였다. CD70+ 난소 암종 세포주에 의해 야기된 질환을 개선하는 이 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 Translational Drug Development, LLC(애리조나주 스카츠데일)가 이용한 방법을 사용하여 NOG 마우스에서 평가되었다. 간단히, 12마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 마우스는 오른쪽 뒷옆구리에서 5x106개의 SKOV-3 난소 암종 세포/마우스의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 크기가 25 내지 75 mm3(약 50 mm3의 표적)에 도달할 때, 마우스는 표 23에 기재된 것처럼 2개의 치료 그룹으로 더 분할되었다. 1일에, 치료 그룹 2는 표 23에 따라 항-CD70CAR+ T 세포의 단일 200 ㎕의 정맥내 용량을 받았다.
Figure pct00024
종양 용적은 치료 개시 날짜로부터 매주 2회 측정되었다. 주사 후 9일에, 항-CD70 CART 세포에 의해 치료된 종양은 비치료된 동물에서의 종양에 비해 종양 용적의 감소를 나타내기 시작했다. 주사 후 17일에, 항-CD70 CAR T 세포에 의해 치료된 마우스에서 CD70+ 난소암 종양은 완전히 제거되었다. 종양 성장의 이 완전한 회귀는 주사 후 44일에 걸쳐 치료된 동물에서 지속되었고, 이 때문에 항-CD70 CART 세포에 의해 치료된 5마리의 마우스 중 4마리는 관찰 종료(69일)까지 무종양으로 있었다(도 42a). 이 데이터는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ 세포가 인간 난소 종양을 치료하는 데 생체내 고도로 강력하다는 것을 입증한다.
비소세포 폐 암종(NSCLC) 종양 모델에서의 치료
보통의 수준의 CD70을 발현하는 폐 선암 세포를 제거하는 CD70 CAR을 발현하는 T 세포의 능력은 마우스에서 피하 폐 암종 (NCI-H1975) 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체내 평가되었다.
CRISPR/Cas9 및 AAV6은 CD70을 표적화하는 CAR 작제물(서열 번호 43; 서열 번호 44)을 사용하여 TCR, β2M, CD70의 발현이 결여되고 TRAC 유전좌위로부터의 발현이 수반된 인간 T 세포를 생성하도록 상기한 바대로(예를 들어, 실시예 3 참조) 사용되었다. 이 실시예에서, 활성화된 T 세포는 처음에 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 3개의 구별되는 Cas9:sgRNA RNP 복합체로 전기천공되었다. TRAC 유전좌위에서의 DNA 이중 가닥 절단은 키메라 항원 수용체 카세트(-/+ 유전자 발현을 위한 조절 요소)가 측접하는 TRAC 유전좌위에 대한 오른쪽 및 왼쪽 상동성 아암을 함유하는 AAV6-전달된 DNA 주형(서열 번호 43; 서열 번호 44)(서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화)에 의한 상동성 직접 복구에 의해 복구되었다.
생성된 변형된 T 세포는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ (41BB 동시자극 도메인을 가짐) T 세포였다. CD70+ 폐 암종 세포주에 의해 야기된 질환을 개선하는 이 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 Translational Drug Development, LLC(애리조나주 스카츠데일)가 이용한 방법을 사용하여 NOG 마우스에서 평가되었다. 간단히, 12마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 마우스는 오른쪽 뒷옆구리에서 5x106개의 NCI-H1975 폐 암종 세포/마우스의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 크기가 25 내지 75 mm3(약 50 mm3의 표적)에 도달할 때, 마우스는 표 24에 기재된 것처럼 2개의 치료 그룹으로 더 분할되었다. 1일에, 치료 그룹 2는 표 24에 따라 항-CD70CAR+ T 세포의 단일 200 ㎕의 정맥내 용량을 받았다.
Figure pct00025
종양 용적은 치료 개시 날짜로부터 매주 2회 측정되었다. 주사 후 12일에, 항-CD70 CAR T 세포에 의해 치료된 종양은 비치료된 동물에서의 종양에 비해 종양 용적의 감소를 나타내기 시작했다. 치료된 동물에서의 이 완전한 종양 회귀는 주사 후 33일에 걸쳐 지속되었다. 항-CD70 CAR T 세포에 의한 치료는 주사 후 40일에 걸쳐 확립된 H1975 폐암 이종이식에 대해 강력한 활성을 생성시켰고(종양 재성장은 100mm3 미만의 종양 크기로 40일까지 모든 마우스에서 억제되었음), 이때 종양이 성장하기 시작했다. (도 42b). 이 데이터는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ 세포가 생체내 인간 CD70+ 폐암 종양에 대한 강력한 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
췌장 종양 모델에서의 치료
보통의 수준의 CD70을 발현하는 췌장 암종 세포를 제거하는 CD70 CAR을 발현하는 T 세포의 능력은 마우스에서 피하 췌장(Hs 766T) 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체내 평가되었다.
CRISPR/Cas9 및 AAV6은 CD70을 표적화하는 CAR 작제물(서열 번호 43; 서열 번호 44)을 사용하여 TCR, β2M, CD70의 발현이 결여되고 TRAC 유전좌위로부터의 발현이 수반된 인간 T 세포를 생성하도록 상기한 바대로(예를 들어, 실시예 3 참조) 사용되었다. 이 실시예에서, 활성화된 T 세포는 처음에 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 3개의 구별되는 Cas9:sgRNA RNP 복합체로 전기천공되었다. TRAC 유전좌위에서의 DNA 이중 가닥 절단은 키메라 항원 수용체 카세트(-/+ 유전자 발현을 위한 조절 요소)가 측접하는 TRAC 유전좌위에 대한 오른쪽 및 왼쪽 상동성 아암을 함유하는 AAV6-전달된 DNA 주형(서열 번호 43; 서열 번호 44)(서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화)에 의한 상동성 직접 복구에 의해 복구되었다.
생성된 변형된 T 세포는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포였다. CD70+ 췌장 암종 세포주에 의해 야기된 질환을 개선하는 이 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 Translational Drug Development, LLC(애리조나주 스카츠데일)가 이용한 방법을 사용하여 NOG 마우스에서 평가되었다. 간단히, 12마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 마우스는 오른쪽 뒷옆구리에서 5x106개의 Hs766T 췌장 암종 세포의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 크기가 25 내지 75 mm3(약 50 mm3의 표적)에 도달할 때, 마우스는 표 25에 기재된 것처럼 2개의 치료 그룹으로 더 분할되었다. 1일에, 치료 그룹 2는 표 25에 따라 항-CD70 CAR+ T 세포의 단일 200 ㎕의 정맥내 용량을 받았다.
Figure pct00026
종양 용적은 치료 개시 날짜로부터 매주 2회 측정되었다. 주사 후 15일에, 항-CD70 CAR 세포에 의해 치료된 종양은 모든 치료된 마우스에서 종양 용적의 감소를 나타내기 시작했다. 항-CD70 CAR+ T 세포에 의한 치료는 (67일에 걸쳐) 연구의 기간 동안 추가의 성장의 증거 없이 시험된 모든 마우스에서 CD70+ 췌장암 종양의 크기를 효과적으로 감소시켰다(37mm3 미만)(도 42c). 이 데이터는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ 세포가 치료 개시 후 60일을 넘어 확립된 Hs766T 췌장암 이종이식에 대한 강력한 활성 및 영속적 반응으로 생체내 인간 CD70+ 췌장암 종양의 회귀를 유도한다는 것을 입증한다.
피부 T 세포 림프종 종양 이종이식 모델에서의 치료
T 세포 림프종을 제거하는 항-CD70 CAR을 발현하는 T 세포의 능력은 마우스에서 피하 T 세포 림프종(Hu T78) 종양 이종이식 모델을 사용하여 생체내 평가되었다.
CRISPR/Cas9 및 AAV6은 CD70을 표적화하는 CAR 작제물(서열 번호 43; 서열 번호 44)을 사용하여 TCR, β2M, CD70의 발현이 결여되고 TRAC 유전좌위로부터의 발현이 수반된 인간 T 세포를 생성하도록 상기한 바대로(예를 들어, 실시예 3 참조) 사용되었다. 이 실시예에서, 활성화된 T 세포는 처음에 TRAC(서열 번호 40), β2M(서열 번호 41) 및 CD70(서열 번호 36 또는 서열 번호 37)을 표적화하는 sgRNA를 함유하는 3개의 구별되는 Cas9:sgRNA RNP 복합체로 전기천공되었다. TRAC 유전좌위에서의 DNA 이중 가닥 절단은 키메라 항원 수용체 카세트(-/+ 유전자 발현을 위한 조절 요소)가 측접하는 TRAC 유전좌위에 대한 오른쪽 및 왼쪽 상동성 아암을 함유하는 AAV6-전달된 DNA 주형(서열 번호 43; 서열 번호 44)(서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD70 CAR을 암호화)에 의한 상동성 직접 복구에 의해 복구되었다.
생성된 변형된 T 세포는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ T 세포였다. CD70+ T 세포 림프종 세포주에 의해 야기된 질환을 개선하는 이 항-CD70 CAR+ T 세포의 능력은 Translational Drug Development, LLC(애리조나주 스카츠데일)가 이용한 방법을 사용하여 NOG 마우스에서 평가되었다. 간단히, 12마리의, 5주령 내지 8주령 암컷, CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/ JicTac) 마우스를 연구 시작 전 5일 내지 7일에 무병원균 조건 하에 유지되는 환기된 마이크로아이솔레이터 케이지에 개별적으로 수용하였다. 마우스는 오른쪽 뒷옆구리에서 3x106개의 T 세포 림프종 세포의 피하 접종을 받았다. 평균 종양 크기가 25 내지 75 mm3(약 50 mm3의 표적)에 도달할 때, 마우스는 표 26에 기재된 것처럼 2개의 치료 그룹으로 더 분할되었다. 1일에, 치료 그룹 2는 표 26에 따라 항-CD70 CAR+ T 세포의 단일 200 ㎕의 정맥내 용량을 받았다.
Figure pct00027
종양 용적은 치료 개시 날짜로부터 매주 2회 측정되었다. 주사 후 12일에, 항-CD70 CAR 세포에 의해 치료된 종양은 모든 치료된 마우스에서 종양 용적의 감소를 나타내기 시작했다. 항-CD70 CAR+ T 세포에 의한 치료는 15일에 치료된 모든 마우스에서 CD70+ T 세포 림프종 종양의 크기를 효과적으로 감소시켰다(도 42c). 이 데이터는 3X KO(TRAC-/β2M-/CD70-) 항-CD70 CAR+ 세포가 확립된 HuT78 T 세포 림프종 이종이식에 대한 강력한 활성으로 생체내 인간 CD70+ T 세포 림프종 종양의 회귀를 유도한다는 것을 입증한다.
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부정관사 "a" 및 "an"은, 본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용된 바와 같이, 명확히 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명확히 반대로 표시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에서 청구된 임의의 방법에서, 상기 방법의 단계 또는 행위의 순서가 상기 방법의 단계 또는 행위가 언급된 순서로 반드시 제한되지 않는다고 또한 이해되어야 한다.
청구항, 및 상기 본 명세서에서, 모든 이행어, 예컨대 "포함하는", "함유하는", "보유하는", "갖는", "포괄하는", "수반하는", "동반하는", "이루어진" 및 기타는 개방 말단인 것으로, 즉 포함하지만 제한되지 않는 것을 의미하도록 이해되어야 한다. "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"의 이행어는 오직 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 2111.03 부문에 기재된 것처럼 각각 폐쇄 이행어 또는 반폐쇄 이행어이어야 한다.
숫자 값 앞의 용어 "약" 및 "실질적으로"는 언급된 숫자 값의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 이 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 값은 본원에 구체적으로 고려되고 기재된다.
SEQUENCE LISTING <110> CRISPR THERAPEUTICS AG <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCER <130> AC1992 PCT S3 <140> PCT/IB2019/000500 <141> 2019-05-10 <150> US 62/670,417 <151> 2018-05-11 <150> US 62/701,340 <151> 2018-07-20 <150> US 62/756,643 <151> 2018-11-07 <150> US 62/773,658 <151> 2018-11-30 <150> US 62/826,600 <151> 2019-03-29 <160> 180 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: TRAC Indel <400> 1 aagagcaaca aatctgact 19 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: TRAC Indel <400> 2 aagagcaaca gtgctgtgcc tggagcaaca aatctgacta agagcaacaa atctgact 58 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: TRAC Indel <400> 3 aagagcaaca gtgctggagc aacaaatctg actaagagca acaaatctga ct 52 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: TRAC Indel <400> 4 aagagcaaca gtgcctggag caacaaatct gactaagagc aacaaatctg act 53 <210> 5 <211> 38 <212> DNA 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gtcggcaatt 1020 gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc 1080 tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg 1140 ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg 1200 ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc actggctgca 1260 gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg 1320 cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg 1380 ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc 1440 catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa 1500 tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc 1560 ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat 1620 cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg 1680 tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag 1740 atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga 1800 gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1860 atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1920 gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1980 gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 2040 cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 2100 tcttccattt caggtgtcgt gaccaccatg gcgcttccgg tgacagcact gctcctcccc 2160 ttggcgctgt tgctccacgc agcaaggccg caggtccagt tggtgcaaag cggggcggag 2220 gtgaaaaaac ccggcgcttc cgtgaaggtg tcctgtaagg cgtccggtta tacgttcacg 2280 aactacggga tgaattgggt tcgccaagcg ccggggcagg gactgaaatg gatggggtgg 2340 ataaatacct acaccggcga acctacatac gccgacgctt ttaaagggcg agtcactatg 2400 acgcgcgata ccagcatatc caccgcatac atggagctgt cccgactccg gtcagacgac 2460 acggctgtct actattgtgc tcgggactat ggcgattatg gcatggacta ctggggtcag 2520 ggtacgactg taacagttag tagtggtgga ggcggcagtg gcgggggggg aagcggagga 2580 gggggttctg gtgacatagt tatgacccaa tccccagata gtttggcggt ttctctgggc 2640 gagagggcaa cgattaattg tcgcgcatca aagagcgttt caacgagcgg 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ggagtccgag 720 gacttcgccg tgtattactg cagccagacc agccacatcc cttacacctt cggcggcggc 780 accaagctgg agatcaaaag tgctgctgcc tttgtcccgg tatttctccc agccaaaccg 840 accacgactc ccgccccgcg ccctccgaca cccgctccca ccatcgcctc tcaacctctt 900 agtcttcgcc ccgaggcatg ccgacccgcc gccgggggtg ctgttcatac gaggggcttg 960 gacttcgctt gtgatattta catttgggct ccgttggcgg gtacgtgcgg cgtccttttg 1020 ttgtcactcg ttattacttt gtattgtaat cacaggaatc gcaaacgggg cagaaagaaa 1080 ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1140 ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgcg agtgaagttt 1200 tcccgaagcg cagacgctcc ggcatatcag caaggacaga atcagctgta taacgaactg 1260 aatttgggac gccgcgagga gtatgacgtg cttgataaac gccgggggag agacccggaa 1320 atggggggta aaccccgaag aaagaatccc caagaaggac tctacaatga actccagaag 1380 gataagatgg cggaggccta ctcagaaata ggtatgaagg gcgaacgacg acggggaaaa 1440 ggtcacgatg gcctctacca agggttgagt acggcaacca aagatacgta cgatgcactg 1500 catatgcagg ccctgcctcc caga 1524 <210> 57 <211> 508 <212> PRT <213> 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gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc 1860 atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg 1920 gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga 1980 gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc 2040 cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt 2100 tcttccattt caggtgtcgt gaccaccatg gcgcttccgg tgacagcact gctcctcccc 2160 ttggcgctgt tgctccacgc agcaaggccg gaaatcgtcc tcacacaatc cccggggagc 2220 ctcgcagtca gtcctgggga acgagtcact atgagctgca aatccagtca gagtgttttt 2280 ttctcaagta gccagaagaa ctacctcgca tggtaccaac aaataccggg gcaatctccc 2340 cgcttgctta tatactgggc aagtacccgc gaatccggcg taccggatcg attcacggga 2400 tctgggtcag gtactgattt cactttgact atcagctctg ttcagcctga agatttggca 2460 atttactact gtcaccaata cttgagtagc cgaactttcg gccagggcac gaagctcgaa 2520 atcaagggcg gagggggagg ttctggtggg ggcggttctg gcggtggagg aagccaagta 2580 cagttgcaac agccaggggc ggaggtcgta aaacctgggg cgtctgtcaa gatgagctgt 2640 aaagcaagtg 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Claims (181)

  1. 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하지 않는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)를 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서, 파괴된 T 세포 수용체 알파 불변 영역(TRAC: T cell receptor alpha constant region) 유전자를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자를 추가로 포함하는, 조작된 T 세포.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 항-B 세포 성숙 항원(BCMA)에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  6. 제5항에 있어서, 엑토도메인은 항-BCMA 항체를 포함하는, 조작된 T 세포.
  7. 제5항에 있어서, 엑토도메인은 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는, 조작된 T 세포.
  8. 제7항에 있어서, 항-BCMA scFv는 가변 중(VH)쇄 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 및 기준 항체와 동일한 가변 경(VL)쇄 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
  9. 제7항에 있어서, 항-BCMA scFv는 각각 서열 번호 60 및 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
  10. 제7항에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD33에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  12. 제11항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD33 항체를 포함하는, 조작된 T 세포.
  13. 제11항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD33 scFv를 포함하는, 조작된 T 세포.
  14. 제13항에 있어서, 항-CD33 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 140에 기재된 VH 및 서열 번호 141에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
  15. 제11항에 있어서, 항-CD33 scFv는 각각 서열 번호 140 및 서열 번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
  16. 제11항에 있어서, 항-CD33 scFv는 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD19에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  18. 제17항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD19 항체를 포함하는, 조작된 T 세포.
  19. 제17항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD19 scFv를 포함하는, 조작된 T 세포.
  20. 제19항에 있어서, 항-CD19 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 152에 기재된 VH 및 서열 번호 153에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
  21. 제19항에 있어서, 항-CD19 scFv는 각각 서열 번호 152 및 서열 번호 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
  22. 제19항에 있어서, 항-CD19 scFv는 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  23. 조작된 T 세포로서,
    (i) 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자;
    (iii) 파괴된 CD70 유전자; 및
    (iv) CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
  24. 제23항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조작된 T 세포.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, CAR은 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  27. 제26항에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 조작된 T 세포.
  28. 제26항에 있어서, 항-CD70 scFv는 각각 서열 번호 51 및 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 조작된 T 세포.
  29. 제26항에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  30. 제26항에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD8 막관통 도메인을 포함하는, 조작된 T 세포.
  34. 제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자의 결실이 있는, 조작된 T 세포.
  35. 제34항에 있어서, 결실은 15개 내지 30개의 염기쌍인, 조작된 T 세포.
  36. 제34항에 있어서, 결실은 20개의 염기쌍인, 조작된 T 세포.
  37. 제34항에 있어서, 결실은 서열 번호 86을 포함하는, 조작된 T 세포.
  38. 조작된 T 세포로서,
    (i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
  39. 조작된 T 세포로서,
    (i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
  40. 제39항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45에 기재된 핵산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  41. 조작된 T 세포로서,
    (i) 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
  42. 제41항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 44에 기재된 핵산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 T 세포는 파괴된 예정 세포사-1(PD-1: programmed cell death-1) 유전자를 포함하는, 조작된 T 세포.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 5회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 표적 세포는 CAR에 특이적인 항원을 발현하는, 조작된 T 세포.
  45. 제44항에 있어서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하는, 조작된 T 세포.
  46. 제40항 또는 제41항에 있어서, 표적 세포는 암 세포인, 조작된 T 세포.
  47. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는 파괴된 CD70 유전자 및 CD70에 결합하지 않는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
  48. 제47항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함하는, 세포 집단.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 파괴된 β2M 유전자를 추가로 포함하는, 세포 집단.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 항-B 세포 성숙 항원(BCMA)에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 세포 집단.
  52. 제51항에 있어서, 엑토도메인은 항-BCMA 항체를 포함하는, 세포 집단.
  53. 제51항에 있어서, 엑토도메인은 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는, 세포 집단.
  54. 제53항에 있어서, 항-BCMA scFv는 가변 중(VH)쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 기준 항체와 동일한 가변 경(VL)쇄 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 세포 집단.
  55. 제53항에 있어서, 항-BCMA scFv는 각각 서열 번호 60 및 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 세포 집단.
  56. 제53항에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  57. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD33에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 세포 집단.
  58. 제57항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD33 항체를 포함하는, 세포 집단.
  59. 제57항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD33 scFv를 포함하는, 세포 집단.
  60. 제59항에 있어서, 항-CD33 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 140에 기재된 VH 및 서열 번호 141에 기재된 VL을 포함하는, 세포 집단.
  61. 제59항에 있어서, 항-CD33 scFv는 각각 서열 번호 140 및 서열 번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 세포 집단.
  62. 제59항에 있어서, 항-CD33 scFv는 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  63. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD19에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 세포 집단.
  64. 제63항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD19 항체를 포함하는, 세포 집단.
  65. 제63항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD19 scFv를 포함하는, 세포 집단.
  66. 제65항에 있어서, 항-CD19 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 152에 기재된 VH 및 서열 번호 153에 기재된 VL을 포함하는, 세포 집단.
  67. 제65항에 있어서, 항-CD19 scFv는 각각 서열 번호 152 및 서열 번호 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 세포 집단.
  68. 제65항에 있어서, 항-CD19 scFv는 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  69. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는
    (i) 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자;
    (iii) 파괴된 CD70 유전자; 및
    (iv) CD70에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
  70. 제69항에 있어서, CAR은 항-CD70 항체를 포함하는 엑토도메인을 포함하는, 세포 집단.
  71. 제69항에 있어서, CAR은 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인을 포함하는, 세포 집단.
  72. 제47항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인을 포함하는, 세포 집단.
  73. 제47항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 세포 집단.
  74. 제47항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD8 막관통 도메인을 포함하는, 세포 집단.
  75. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는
    (i) 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자;
    (iii) 파괴된 CD70 유전자;
    (iv) (a) 항-CD70 scFv를 포함하는 엑토도메인, (b) CD8 막관통 도메인, 및 (c) 41BB 동시자극 도메인 및 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
  76. 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 세포 집단.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 세포 집단.
  78. 제77항에 있어서, 항-CD70 scFv는 각각 서열 번호 51 및 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 세포 집단.
  79. 제77항에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  80. 제77항에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  81. 제48항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형된 T 세포에 비해 TRAC 유전자의 결실이 있는, 세포 집단.
  82. 제81항에 있어서, 결실은 15개 내지 30개의 염기쌍인, 조작된 T 세포.
  83. 제81항에 있어서, 결실은 20개의 염기쌍인, 조작된 T 세포.
  84. 제81항에 있어서, 결실은 서열 번호 86을 포함하는, 조작된 T 세포.
  85. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는
    (i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 세포 집단.
  86. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는
    (i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 세포 집단.
  87. 제86항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45에 기재된 핵산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  88. 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단으로서, 조작된 T 세포는
    (i) 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 세포 집단.
  89. 제88항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 44에 기재된 핵산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  90. 제47항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 5회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하고, 표적 세포는 CAR에 특이적인 항원을 발현하는, 세포 집단.
  91. 제90항에 있어서, 조작된 T 세포는 표적 세포에 의한 10회 재시험감염 후에 세포독성을 유지하는, 세포 집단.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 표적 세포는 암 세포인, 세포 집단.
  93. 제49항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 β2M 유전자는 서열 번호 9 내지 서열 번호 14 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 세포 집단.
  94. 제47항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴된 CD70 유전자는 서열 번호 129 내지 서열 번호 134 중 어느 하나로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 세포 집단.
  95. 제48항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 T 세포의 적어도 90%는 검출 가능한 수준의 TCR 표면 단백질을 발현하지 않는, 세포 집단.
  96. 제47항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 T 세포는 대조군 T 세포에 비해
    (a) 증가된 세포 증식 능력을 나타내거나;
    (b) 증가된 세포 용해를 나타내거나;
    (c) 감소된 세포 탈진을 나타내거나;
    (d) 사이토카인 의존적 증식을 유지시키거나;
    (e) 증가된 사이토카인 분비를 나타내거나;
    (f) (a) 내지 (e)의 임의의 조합이고,
    대조군 T 세포는 내인성 CD70 단백질을 발현하는, 세포 집단.
  97. 제47항 내지 제96항 중 어느 한 항의 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 조작된 T 세포는 조작된 인간 T 세포인, 방법.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 대상체는 암을 갖는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 암은 CD70, BMCA, CD19, CD33 또는 이들의 조합을 발현하는, 방법.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 세포 집단은 암을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 고형 종양 악성종양 또는 혈액학적 악성종양인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 고형 종양 악성종양은 난소 종양, 췌장 종양, 신장 종양, 폐 종양 및 장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  104. 제99항에 있어서, 세포 집단은 대상체에서 종양의 용적을 감소시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  105. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 제47항 내지 제96항 중 어느 한 항의 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  106. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
    (i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 방법.
  107. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
    (i) 파괴된 TRAC 유전자이되, 파괴된 TRAC 유전자는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하고, 핵산 서열은 서열 번호 45와 적어도 90% 동일한 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 45에 기재된 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  109. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 조작된 T 세포를 포함하는 세포 집단을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하고, 조작된 T 세포는
    (i) 서열 번호 44와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 파괴된 TRAC 유전자;
    (ii) 파괴된 β2M 유전자; 및
    (iii) 파괴된 CD70 유전자를 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 파괴된 TRAC 유전자는 서열 번호 44에 기재된 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  111. 조작된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) T 세포에
    RNA-가이드 뉴클레아제,
    CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, 및
    CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 전달하는 단계; 및
    (b) 파괴된 CD70 유전자를 포함하고 CAR을 발현하는 조작된 T 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 조작된 T 세포는 파괴된 TRAC 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  113. 제112항에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자에 측접되고, 조작된 T 세포는 TRAC 유전자에서 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 T 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하고, 조작된 T 세포는 파괴된 β2M 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  115. 조작된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) T 세포에
    RNA-가이드 뉴클레아제,
    TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA,
    β2M 유전자를 표적화하는 gRNA,
    CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, 및
    CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 공여자 주형을 포함하는 벡터를 전달하는 단계; 및
    (b) 조작된 T 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  116. 제115항에 있어서, CAR을 암호화하는 핵산은 왼쪽 및 오른쪽 상동성 아암에 의해 TRAC 유전자 유전좌위에 측접된, 방법.
  117. 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제, 선택적으로 S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  118. 제112항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 98의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 118의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 30의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  119. 제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 99의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 119의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 31의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  120. 제111항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 94 또는 서열 번호 95의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 서열 번호 114 또는 서열 번호 115의 뉴클레오타이드 서열을 표적화하고, 선택적으로 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA는 서열 번호 26 또는 서열 번호 27의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  121. 제111항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드 뉴클레아제 및 gRNA는 리보핵단백질 입자(RNP: ribonucleoprotein particle)에서 복합체화된, 방법.
  122. 표적 세포에 대한 면역요법을 위한 조작된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계, 및
    (b) 표적 세포 상에 발현된 항원에 결합하는 CAR을 발현시키는 단계이되, 항원은 CD70이 아닌 단계를 포함하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 표적 세포는 암 세포인, 방법.
  124. 제122항 또는 제123항에 있어서, 상기 방법은 생체외인, 방법.
  125. 제122항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포에서 TRAC 유전자를 파괴하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  126. 제125항에 있어서, CAR은 파괴된 TRAC 유전자에서 핵산에 의해 암호화된, 방법.
  127. 제122항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포에서 β2M 유전자를 파괴하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  128. 제111항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 항-B 세포 성숙 항원(BCMA)에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 엑토도메인은 항-BCMA 항체를 포함하는, 방법.
  130. 제128항에 있어서, 엑토도메인은 항-BCMA 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 항-BCMA scFv는 가변 중(VH)쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 기준 항체와 동일한 가변 경(VL)쇄 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 60에 기재된 VH 및 서열 번호 61에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
  132. 제130항에 있어서, 항-BCMA scFv는 각각 서열 번호 60 및 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
  133. 제130항에 있어서, 항-BCMA scFv는 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  134. 제111항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD33에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD33 항체를 포함하는, 방법.
  136. 제134항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD33 scFv를 포함하는, 방법.
  137. 제136항에 있어서, 항-CD33 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 140에 기재된 VH 및 서열 번호 141에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
  138. 제136항에 있어서, 항-CD33 scFv는 각각 서열 번호 140 및 서열 번호 141에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
  139. 제136항에 있어서, 항-CD33 scFv는 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  140. 제111항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD19에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD19 항체를 포함하는, 방법.
  142. 제140항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD19 scFv를 포함하는, 방법.
  143. 제142항에 있어서, 항-CD19 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL 사슬 CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 152에 기재된 VH 및 서열 번호 153에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
  144. 제142항에 있어서, 항-CD19 scFv는 각각 서열 번호 152 및 서열 번호 153에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
  145. 제142항에 있어서, 항-CD19 scFv는 서열 번호 150의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  146. 제111항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD70에 결합하는 엑토도메인을 포함하는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD70 항체를 포함하는, 방법.
  148. 제146항에 있어서, 엑토도메인은 항-CD70 scFv를 포함하는, 방법.
  149. 제148항에 있어서, 항-CD70 scFv는 기준 항체와 동일한 VH CDR 및 동일한 VL CDR을 포함하고, 기준 항체는 서열 번호 51에 기재된 VH 및 서열 번호 52에 기재된 VL을 포함하는, 방법.
  150. 제148항에 있어서, 항-CD70 scFv는 각각 서열 번호 51 및 서열 번호 52에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는, 방법.
  151. 제148항에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  152. 제148항에 있어서, 항-CD70 scFv는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  153. 제111항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD28 또는 41BB 동시자극 도메인을 포함하는, 방법.
  154. 제111항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  155. 제111항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, CAR은 CD8 막관통 도메인을 포함하는, 방법.
  156. 제111항 내지 제155항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조작된 T 세포 집단.
  157. T 세포의 증식을 증가시키는 방법으로서, T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  158. T 세포의 탈진을 감소시키는 방법으로서, T 세포에서 CD70 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  159. 제157항 또는 제158항에 있어서, CD70 유전자는 CRISPR/Cas 유전자 편집에 의해 파괴되는, 방법.
  160. 제157항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포에서 TRAC 유전자, β2M 유전자, 또는 TRAC 유전자와 β2M 유전자 둘 다를 파괴하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  161. 제160항에 있어서, TRAC 유전자, β2M 유전자, 또는 TRAC 유전자와 β2M 유전자 둘 다는 CRISPR/Cas 유전자 편집에 의해 파괴되는, 방법.
  162. 제5항에 있어서, CAR은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  163. 제162항에 있어서, CAR은 서열 번호 56과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 조작된 T 세포.
  164. 제11항에 있어서, CAR은 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  165. 제164항에 있어서, CAR은 서열 번호 136과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 조작된 T 세포.
  166. 제17항에 있어서, CAR은 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는, 조작된 T 세포.
  167. 제166항에 있어서, CAR은 서열 번호 148과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 조작된 T 세포.
  168. 제51항에 있어서, CAR은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  169. 제168항에 있어서, CAR은 서열 번호 56과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 세포 집단.
  170. 제57항에 있어서, CAR은 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  171. 제170항에 있어서, CAR은 서열 번호 136과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 세포 집단.
  172. 제63항에 있어서, CAR은 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는, 세포 집단.
  173. 제172항에 있어서, CAR은 서열 번호 148과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 세포 집단.
  174. 제128항에 있어서, CAR은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  175. 제174항에 있어서, CAR은 서열 번호 56과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
  176. 제134항에 있어서, CAR은 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  177. 제176항에 있어서, CAR은 서열 번호 136과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
  178. 제140항에 있어서, CAR은 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  179. 제178항에 있어서, CAR은 서열 번호 148과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
  180. 제146항에 있어서, CAR은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  181. 제180항에 있어서, CAR은 서열 번호 45와 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된, 방법.
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