KR20110039220A - 항ｃｄ27 항체 - Google Patents

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KR20110039220A
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나오코 히우라
츠구오 쿠보타
아키코 후루야
유타카 칸다
미츠오 사토
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교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 및 그의 사용 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명에 따르면, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하여 이루어지는 벡터, 상기 벡터를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 및 상기 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 CD27이 관여하는 질환의 진단약 또는 치료약을 제공할 수 있다.

Description

항ＣＤ27 항체{ANTI-CD27 ANTIBODY}
본 발명은, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하여 이루어지는 벡터, 상기 벡터를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 및 상기 항체 또는 항체 단편을 사용하는 진단약, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 치료약에 관한 것이다.
최근, 다양한 질환의 발병이나 병태의 진행에 따라, 그 질환이나 병태에 관련된 세포가 발현하는 단백질에 부가된 당쇄 구조에 변화가 발생한다는 사례가 보고되어 있다. 이 사례 중에서 대표적인 것은, 80 ％를 초과하는 인간의 암종(癌種)에서 발현이 관찰되는 O 결합형(세린트레오닌형) 당쇄 항원 중 하나인 Tn 항원과, 이 Tn 항원에 시알산이 부가된 시알릴 Tn 항원의 발현이다(비특허문헌 2). 이들 당쇄 항원은 정상 세포에서는 거의 발현이 관찰되지 않는다고 알려져 있으며, 암 특이적 백신 요법의 표적 분자로서 의료에 응용하기 위한 연구가 이루어지고 있다(비특허문헌 1). 이들 암 특이적인 당쇄 항원의 발현은, 생체 내에 존재하는 복잡한 당쇄 생합성 경로와 당쇄 대사 경로를 구성하는 효소 활성에 의해 제어된다. 그의 일례로서, 암 세포에서 당쇄 생합성 경로에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 양식이 변화된 결과, 당쇄 생합성 경로가 도중에 차단되는 예 등이 알려져 있다. Tn 항원은 정상 세포에서의 O 결합형 당쇄의 생합성 경로의 중간 산물로서 알려져 있으며, 단백질 아미노산 서열 중의 특정한 세린(Ser) 잔기 또는 트레오닌(Thr) 잔기의 측쇄에 존재하는 수산기에 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이 α 결합한 구조이다(GalNAcα-Ser/Thr). 이 Tn 항원의 비환원 말단측에 코어 1β3 갈락토오스 전이 효소(코어 1β3 Gal-T, T-신테타제)의 활성에 의해 갈락토오스가 1 분자 전이됨으로써, 정상형의 O 결합형 당쇄(TF 항원 등)의 생합성이 진행된다. 복수종의 암 세포주에서 세포 내의 코어 1β3 갈락토오스 전이 효소의 활성이 저하된 결과, 당쇄의 생합성 경로가 차단되어, Tn 항원 또는 시알릴 Tn 항원이 발현하는 것으로 생각된다. 암 세포 내에서 코어 1β3 갈락토오스 전이 효소의 활성이 저하되는 기구는 복잡하며, 현재도 완전히 해명되지는 않았다. 그러나, 그 기구 중 하나로서, 코어 1β3 갈락토오스 전이 효소의 활성 발현에 필요한 특정한 샤페론 단백질(Cosmc)을 코딩하는 유전자가 변이된 결과, 세포 내의 코어 1β3 갈락토오스 전이 효소 활성이 대폭 저하된다는 기구가 추정된다(비특허문헌 6). 복수의 암종에서 공통으로 Tn 항원의 발현이 관찰되기 때문에, 세포 내의 당쇄 생합성 경로나 당쇄 대사 경로에서의 이상은, 그 세포 내에서 발현하는 많은 상이한 당단백질에 부가한 당쇄 구조에 공통된 변화를 발생시키는 주된 원인으로 생각된다.
당쇄 구조의 변화와 병태의 진행이 밀접하게 관련되어 있다는 것이 알려져 있는 질환의 대표적인 것으로서는 암이다. 또한, 암 이외에 당쇄 구조의 변화와 병태의 진행이 밀접하게 관련되어 있다는 것이 알려져 있는 질환으로서, IgA 신증이 알려져 있다. IgA 신증이란, 면역 글로불린의 일종인 면역 글로불린 A(IgA)가 신사구체의 메산지움(mesangial) 영역에 과립상으로 침착된 병리상이 특징적인 만성 사구체 신염이며, 1968년에 베르거(Berger)에 의해 최초로 보고되었다(비특허문헌 2). 이 질환은, 일본 국내의 만성 사구체 신염 환자수의 약 절반을 차지하는 대표적인 신염이다. IgA 신증으로 진단된 환자의 약 4할은 그 후 20년 이내에 말기 신부전으로 이행되어, 인공 투석이나 신장 이식이 부득이한 것으로 알려져 있다. 이와 같이 IgA 신증은 일반적으로 예후가 불량한 질환으로서 인식되고 있음에도 불구하고, 임상에서 유효성이 증명된 치료법은 아직 확립되어 있지 않다. IgA 신증의 환자 체내에서는, 2종의 IgA 아이소타이프(IgA1과 IgA2) 중 주로 IgA1이 신장에 침착한다는 것이 알려져 있다. 또한, 그 침착의 원인 중 하나로서, IgA2 분자에는 없고 IgA1 분자에 존재하는 힌지 영역에 부가된 O 결합형 당쇄의 구조가 정상형으로부터 Tn 항원 또는 시알릴 Tn 항원으로 변화되어 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3, 비특허문헌 4). IgA1 힌지 영역에 부가된 O 결합형 당쇄로부터 갈락토오스가 결손되어 Tn 항원 또는 시알릴 Tn 항원으로 변화되면 IgA1 분자의 자기 응집능이 항진되고, IgA1 분자의 신장 메산지움 영역으로의 침착이 항진된다는 것이 증명되어 있다(비특허문헌 5). 또한, IgA 신증 환자로부터 단리한 IgA 생산 세포에서, Cosmc의 발현량 저하에 기인하는 코어 1β3 갈락토오스 전이 효소 활성의 저하가 보고되어 있다(비특허문헌 6). 즉, IgA 신증 환자 체내의 IgA 생산 세포에서는 당쇄 생합성 경로가 도중에 차단된 결과, 정상형 당쇄를 갖는 IgA1의 생산을 행할 수 없게 되고, 대신 당쇄 부전형의 IgA1이 생산된다. IgA 신증의 발병 기구 중 하나로서, 이 당쇄 부전형 IgA1이 신사구체에 침착된 결과, 염증이 야기된다는 기구가 알려져 있다.
일반적으로 IgA는 혈액 중의 B 세포, 또는 B 세포로부터 분화된 형질 세포에 의해 생산된다. 형질 세포는 B 세포 분화의 최종 단계이며, 2차 림프 조직, 전신의 점막 조직, 골수 등에 분포되어 대량의 항체를 생산하지만, IgA를 생산하는 형질 세포는 주로 점막 조직에 분포한다는 것이 알려져 있다. 한편, 2차 림프 조직의 배중심(germinal center)에서 고친화성의 IgA 항체 생산능을 획득한 B 세포 클론으로부터는, 메모리 B 세포 또는 형질 세포가 분화되고, 전신의 표적 장기에 분포되어 장기간에 걸쳐서 항체를 계속 생산한다는 것이 알려져 있다. 그러나, IgA 신증의 발병에 관여하는 당쇄 부전 IgA를 생산하는 세포가 B 세포 분화 과정의 어떠한 단계에서 발생하는지, 당쇄 부전 IgA를 생산하는 B 세포 또는 형질 세포가 체내의 어떠한 조직에 분포하는지에 대해서는 분명히 되어 있지 않다.
B 세포 또는 형질 세포에 발현하는 세포막 표면 분자로서 알려진 단백질 중에서, O 결합형 당쇄가 결합하는 분자 중 하나로서 CD27이 알려져 있다(비특허문헌 7). CD27 분자는, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼 패밀리에 속하는 분자량이 약 55 kDa인 I형 막 단백질이며, 2개의 단량체가 디술피드 결합에 의해 연결된 이량체로서 존재한다(비특허문헌 8). CD27은 형질 세포, B 세포 이외에 T 림프구의 일부에 발현한다는 것이 알려져 있지만, 특히 B 세포의 분화 과정에서 메모리 B 세포 및 형질 세포로 분화될 때 발현이 상승한다는 것이 알려져 있다. 이들 분화 과정의 세포에는 O 결합형 당쇄가 결합한 CD27이 발현한다는 것이 알려져 있지만, 당쇄가 결합하는 아미노산 잔기는 분명히 되어 있지 않다(비특허문헌 9). CD27의 리간드 분자로서는 TNF 패밀리 중 하나인 CD70이 알려져 있다. CD70은, 일부 B 세포 또는 T 세포에 발현하는 CD27에 결합하여 세포 증식 시그널을 도입하거나, 또는 B 세포의 항체 생산을 촉진시킨다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 10).
또한, CD27은 정상 세포뿐만 아니라, 몇 개의 암 세포에서 발현이 항진된다는 것이 알려져 있다. CD27을 발현하는 암의 종류로서는 맨틀 세포 림프종, 만성 림프성 백혈병, 소림프성 백혈병, 버키트 림프종, 여포성 림프종, 말트 림프종(MALT-lymphoma), 미만성 대세포 림프종, 형질 세포종 등, 다양한 비호지킨 림프종이 보고되어 있다(비특허문헌 11). 많은 암 세포에서는, 상술한 바와 같이 Tn 항원 또는 시알릴 Tn 항원 등의 당쇄를 포함하는 당쇄 부전 단백질을 발현한다는 것이 알려져 있다.
CD27을 특이적으로 인식하는 항체로서는, 세자리 증후군 환자로부터 단리한 백혈병 세포를 면역함으로써 얻어진 S152 항체가 보고되어 있다(비특허문헌 8).
S152 항체는, 정상 B 세포 및 T 세포에 대해서도 친화성을 갖는다는 것이 나타나 있다. 현재까지 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 분자를 특이적으로 인식하는 항체는 알려져 있지 않다.
일반적으로 비인간 항체, 예를 들면 마우스 항체 등을 인간에게 투여하면, 이물질로서 인식됨으로써 인간 체내에 마우스 항체에 대한 인간 항체(Human Anti Mouse Antibody: HAMA)가 유도된다는 것이 알려져 있다. HAMA는 투여된 마우스 항체와 반응하여 부작용을 야기하거나(비특허문헌 12 내지 15), 마우스 항체의 체내로부터의 소실을 빠르게 하고(비특허문헌 16 내지 18), 마우스 항체의 치료 효과를 저하시킨다는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 19, 20).
이러한 문제점을 해결하기 위해, 유전자 재조합 기술을 이용하여 비인간 항체로부터 인간형 키메라 항체나 인간화 항체의 제작이 시도되고 있다.
인간화 항체는, 마우스 항체 등의 비인간 항체에 비해 인간으로의 투여를 행함에 있어서 다양한 이점을 갖고 있다. 예를 들면, 원숭이를 사용한 실험에서 마우스 항체에 비해 면역원성이 저하되고, 혈중 반감기가 연장된다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 21, 비특허문헌 22). 즉, 인간화 항체는 비인간 항체에 비해 인간에 있어서 부작용이 적고, 그 치료 효과가 장기간 지속되는 것이 기대된다.
또한, 인간화 항체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작하기 때문에, 다양한 형태의 분자로서 제작할 수 있다. 예를 들면, 인간 항체의 중쇄(이하, H쇄로 표기함) 정상 영역(이하, C 영역으로 표기함)(H쇄 C 영역을 CH로 표기함)으로서 γ1 서브 클래스를 사용하면, 항체 의존성 세포 상해 활성(이하, ADCC 활성으로 표기함) 등의 이펙터 기능이 높은 인간화 항체를 제작할 수 있으며(비특허문헌 23), 마우스 항체에 비해 혈중 반감기의 연장이 기대된다(비특허문헌 24). 특히 체내로부터 Tn 항원형 CD27 양성 세포를 제거하는 치료에서는, 항체를 통해 이펙터 세포를 표적 세포의 근방에 집적시키고, 표적 세포를 특이적으로 상해하기 위해, 항체의 Fc 영역(항체 중쇄의 힌지 영역 이후의 영역)을 통한 보체 의존성 세포 상해 활성(이하, CDC 활성으로 표기함)이나 ADCC 활성 등의 세포 상해 활성이 중요하다. 인간의 치료에서는 세포 상해 활성을 발휘시키기 위해, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직하다(비특허문헌 25, 26).
또한, 인간화 항체는 최근 단백질 공학, 유전자 공학의 진보에 따라, Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(이하, scFv로 표기함)(비특허문헌 27), 2량체화 V 영역 단편(이하, Diabody로 표기함)(비특허문헌 28), 디술피드 안정화 V 영역 단편(이하, dsFv로 표기함)(비특허문헌 29), CDR을 포함하는 펩티드(비특허문헌 30) 등의 분자량이 작은 항체 단편으로서도 제작할 수 있으며, 이들 항체 단편은 완전한 항체 분자에 비해 표적 조직으로의 이행성이 우수하다(비특허문헌 31).
Crit Rev Oncog., 6, 57(1995) J Urol Nephrol., 74, 694(1968) Clin Exp Immunol., 100, 470(1995) J Am Soc Neph., 7, 955(1996) Nephrol Dial Transplant., 17, 50(2002) J Intern Med., 258, 467(2005) Current Opinion in Immunology 17, 275(2005) J Immunol., 141, 21(1988) Eur J Immunol., 22, 447(1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 94. 6346(1997) Leukemia and Lymphoma., 43, 1855(2002) Hum. Pathol., 38, 564(2007) Hum. Pathol., 36, 886(2005) FEBS Lett., 579, 6179(2005) Cancer Res., 65, 7378(2005) Hum. Pathol., 36, 886(2005) Oncogene, 13, 2328(2006) Virchows Arch., 448, 52(2006) J. Immunol., 135, 1530(1985) Cancer Res., 46, 6489(1986) Cancer Res., 56, 1118(1996) Immunol., 85, 668(1995) Cancer Res., 56, 1118(1996) Immunol., 85, 668(1995) J. Immunol., 144, 1382(1990) Nature, 322, 323(1988) Science, 242, 423(1988) Nature Biotechnol., 15, 629(1997) Molecular Immunol., 32, 249(1995) J. Biol. Chem., 271, 2966(1996) Cancer Res., 52, 3402(1992)
본 발명의 목적은 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 사용 방법을 제공하는 것에 있다.
갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 사용 방법이 요구되고 있다.
본 발명은, 하기 (1) 내지 (32)에 관한 것이다.
(1) 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드(이하, CD27이라고 함)의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하고, 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(2) O 결합형 당쇄가 결합한 CD27의 세포 외 영역 중, 갈락토오스가 결합한 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 세포 외 영역은 인식하지 않고, 갈락토오스가 결합하지 않은 0 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 세포 외 영역을 인식하고, 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄가 시알릴 Tn 항원 또는 Tn 항원으로부터 선택되는 적어도 1개의 O 결합형 당쇄인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(4) 상기 (3)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄가 Tn 항원인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(5) 상기 (3) 또는 (4)에 있어서, 모노클로날 항체가 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 세포 외 영역으로의 결합에서, 모노클로날 항체 KM4030과 경합(競合) 반응하는 모노클로날 항체인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 모노클로날 항체가, 모노클로날 항체 KM4030이 결합하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 모노클로날 항체가 수탁 번호 FERM BP-10976으로서 기탁되어 있는 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체인 항체 또는 상기 항체 단편.
(8) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 항체 또는 상기 항체 단편.
(9) 상기 (8)에 있어서, 유전자 재조합 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 항체인 유전자 재조합 항체 또는 상기 항체 단편.
(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(Diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 항체 단편.
(11) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
(12) 상기 (11)에 있어서, 하이브리도마가 수탁 번호 FERM BP-10976으로서 기탁되어 있는 하이브리도마인 하이브리도마.
(13) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 코딩하는 DNA.
(14) 상기 (13)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
(15) 상기 (14)에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주.
(16) 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 하이브리도마 또는 상기 (15)에 기재된 형질 전환주를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 생성 축적시키고, 상기 배양물로부터 항체 또는 상기 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법.
(17) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
(18) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 검출 시약.
(19) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단약.
(20) 상기 (19)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 진단약.
(21) 상기 (19)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 진단약.
(22) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 치료약.
(23) 상기 (22)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 치료약.
(24) 상기 (22)에 있어서, CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 갈락토오스를 결실한 O형 당쇄가 결합한 구조가 관여하는 질환이 암인 치료약.
(25) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 발현한 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단 방법.
(26) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단 방법.
(27) 상기 (25) 또는 (26)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 진단 방법.
(28) 상기 (25) 또는 (26)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 진단 방법.
(29) 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단약을 제조하기 위한 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
(30) 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 치료약을 제조하기 위한 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
(31) 상기 (29) 또는 (30)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
(32) 상기 (29) 또는 (30)에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
본 발명에 따르면, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드(이하, CD27로 기재함)의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 각종 질환의 치료약 또는 진단약을 제공할 수 있다.
[도 1] 인간 CD27 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 pCR2.1 CD27의 제작 방법을 나타낸다.
[도 2] 인간 CD27 단백질의 세포 외 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 pCR CD27axb의 제작 방법을 나타낸다.
[도 3] 인간 IgG4 정상 영역의 아미노산 치환을 행한 변이형 인간 IgG4Fc 영역을 갖는 플라스미드 벡터 pBShCγ4SP의 제작 방법을 나타낸다.
[도 4] 변이형 인간 IgG4Fc 영역의 DNA 서열에 제한 효소 인식 서열을 삽입한 DNA 서열을 포함하는 플라스미드 벡터 pCR IgG4Fc BamHISalI의 제작 방법을 나타낸다.
[도 5] CD27-Fc의 DNA 서열을 삽입하는 pKANTEX XhoI/SalI의 제작 방법을 나타낸다.
[도 6] CD27-Fc 단백질 발현 벡터 pKANTEX CD27-hIgG4Fc의 제작 방법을 나타낸다.
[도 7] CHO/DG44 세포 및 Lec8 세포를 숙주 세포로서 발현시킨 CD27-Fc 단백질의 SDS-PAGE 해석의 결과를 나타낸다. 좌측은 β 머캅토에탄올을 첨가하지 않은 비환원 상태, 우측은 β 머캅토에탄올을 첨가한 환원 상태를 나타낸다. 모두 좌측으로부터 마커, Lec8 세포 및 CHO/DG44 세포의 분획물(fraction)을 나타낸다.
[도 8] CHO/DG44 세포 및 Lec8 세포를 숙주 세포로서 발현시킨 CD27-Fc 단백질을 SDS-PAGE 해석(좌측) 또는 웨스턴 블로팅(우측)의 결과를 나타낸다. 모두 좌측 레인으로부터 마커, CHO/DG44 세포 및 Lec8 세포의 샘플을 나타낸다. 웨스턴 블로팅은, 항RCAS1 항체 22-1-1 항체를 사용하여 염색을 행하였다.
[도 9] 동물 세포 발현용의 CD27 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터 pCR CD27 axc의 제작 방법을 나타낸다.
[도 10] 동물 세포 발현 벡터 pKANTEX CD27의 제작 방법을 나타낸다.
[도 11] CD27 발현 CHO/DG44 세포 및 CD27 발현 Lec8 세포에 대한 항CD27 모노클로날 항체의 흐름 세포측정기(flow cytometer)의 결과를 나타낸다. 상단이 CD27/Lec8-4에 대한 막대 그래프, 하단이 CD27/DG44-8에 대한 막대 그래프의 결과를 나타낸다. 어떠한 막대 그래프도 종축이 세포수, 횡축이 형광 강도를 나타낸다.
[도 12] 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030 및 KM4031의 Lec8 세포, CD27/Lec8-4 세포 및 CD27/DG44-8 세포에 대한 결합 활성을 형광 세포 염색법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸다. 상단은 ABI 세포 검출 시스템(cellular detection system)을 사용한 측정 결과를 나타내고, 종축은 형광 강도, 횡축은 반응시킨 항체를 나타낸다. 하단은 흐름 세포측정기(FCM)를 사용한 측정 결과를 나타내고, 종축이 평균 형광 강도, 횡축이 반응시킨 항체를 나타낸다.
[도 13] 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030 및 KM4031의 경합 ELISA의 결과를 나타낸다. 상단은 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030의 반응성, 하단은 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4031의 반응성을 나타낸다. 종축이 세포 증식, 횡축이 항체 농도를 나타낸다.
[도 14] 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체의 유전자 클로닝 방법을 나타낸다.
[도 15] 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터의 조성 방법을 나타낸다.
[도 16] 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터의 조성 방법을 나타낸다.
[도 17] 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터의 조성 방법을 나타낸다.
[도 18] 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터의 조성 방법을 나타낸다.
[도 19-1] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026(◇), 키메라형 KM4028(△), 키메라형 KM4030(○), 키메라형 KM4031(□), 시판 항CD27 항체 0323(●) 및 시판 항Tn 항체 22-1-1(■)의 CD27/Lec8-4 세포에 대한 결합 활성을 흐름 세포측정기(FCM)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. 종축은 평균 형광 강도를, 횡축은 반응시킨 항체의 최종 농도를 나타낸다.
[도 19-2] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026(◇), 키메라형 KM4028(△), 키메라형 KM4030(○), 키메라형 KM4031(□), 시판 항CD27 항체 0323(●) 및 시판 항Tn 항체 22-1-1(■)의 CD27/DG44-4 세포에 대한 결합 활성을 흐름 세포측정기(FCM)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. 종축은 평균 형광 강도를, 횡축은 반응시킨 항체의 최종 농도를 나타낸다.
[도 19-3] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026(◇), 키메라형 KM4028(△), 키메라형 KM4030(○), 키메라형 KM4031(□), 시판 항CD27 항체 0323(●) 및 시판 항Tn 항체 22-1-1(■)의 Lec8 세포에 대한 결합 활성을 흐름 세포측정기(FCM)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. 종축은 평균 형광 강도를, 횡축은 반응시킨 항체의 최종 농도를 나타낸다.
[도 20] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026(◇), 키메라형 KM4028(△), 키메라형 KM4030(○) 및 키메라형 KM4031(□)의 CD27/Lec8-4 세포에 대한 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 나타낸다. 종축은 세포 상해 활성(％)을, 횡축은 각 항체의 최종 농도를 나타낸다.
[도 21] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM402, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031의 CD27/Lec8-4 세포에 대한 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC 활성)을 나타낸다. 종축은 세포 상해 활성(％)을, 횡축은 반응시킨 항체를 나타낸다.
[도 22] 원숭이 CD27 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터 pCR mfCD27의 조성 방법을 나타낸다.
[도 23] 원숭이 CD27 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터 mfCD27His의 조성 방법을 나타낸다.
[도 24] 원숭이 CD27 발현 벡터 pKANTEX mfCD27His의 제작 방법을 나타낸다.
[도 25] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM402, 키메라형 KM4030, 키메라형 KM4031 및 시판 항CD27 항체 0323의 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포 또는 게잡이 원숭이 CD27/DG44 세포에 대한 결합 활성을 흐름 세포측정기(FCM)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. 종축은 평균 형광 강도를, 횡축은 반응시킨 항체를 나타낸다.
[도 26] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026(◆), 키메라형 KM4028(▲), 키메라형 KM4030(●) 및 키메라형 KM4031(■)의 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포에 대한 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 나타낸다. 종축은 세포 상해 활성(％)을, 횡축은 각 항체의 최종 농도를 나타낸다.
[도 27] 각종 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4030의 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포(●) 또는 인간 CD27/Lec8 세포(○)에 대한 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)을 나타낸다. 종축은 세포 상해 활성(％)을, 횡축은 각 항체의 최종 농도를 나타낸다.
[도 28-1] 각종 항당쇄 부전 CD27 항체 KM4026, KM402, KM4030 및 KM4031의 당쇄 부전 CD27-Fc(Tn 항원형 CD27-Fc에 대한 결합의 비아코어 센서그램(Biacore sensorgram)을 나타낸다. 종축은 RU(공명 단위)를, 횡축은 반응 시간(s)을 나타낸다.
[도 28-2] 각종 항당쇄 부전 CD27 항체 KM4026, KM402, KM4030 및 KM4031의 (시알릴 Tn 항원형 CD27-Fc)에 대한 결합의 비아코어 센서그램을 나타낸다. 종축은 RU(공명 단위)를, 횡축은 반응 시간(s)을 나타낸다.
본 발명은, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드(이하, CD27로도 기재함)의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다. CD27 유전자로서는 CD27을 코딩하는 유전자이면 어떠한 것이어도 상관없지만, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 유전자를 들 수 있다. 또한, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에 혼성화되고, CD27의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 등도 본 발명의 CD27 유전자에 포함된다.
엄격한 조건하에 혼성화하는 DNA란, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA를 프로브로 하여 콜로니ㆍ혼성화법, 플라크ㆍ혼성화법, 서던 블로팅ㆍ혼성화법, DNA 마이크로 어레이법 등에 의해 얻어지는 혼성화 가능한 DNA를 의미하고, 구체적으로는 혼성화한 콜로니 또는 플라크에서 유래하는 DNA, 또는 상기 서열을 갖는 PCR 산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 유리를 사용하여 0.7 내지 1.0 mol/L의 염화나트륨 존재하에 65 ℃에서 혼성화를 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 mmol/L 염화나트륨, 15 mmol/L 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하여 65 ℃ 조건하에 필터 또는 슬라이드 유리를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 혼성화는, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, 1987-1997), DNA 클로닝 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition(Oxford University, 1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 혼성화 가능한 DNA로서는 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 적어도 60 ％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80 ％ 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵 생물의 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열에는, 종종 유전자의 다형이 관찰된다. 본 발명에서 사용되는 CD27 유전자에는, 유전자의 다형에 의해 염기 서열에 다소 변이를 발생시킨 유전자도 포함된다.
CD27로서는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, CD27의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 60 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상, 가장 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, CD27의 기능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 예를 들면 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 얻을 수 있다. 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개 내지 수십개, 예를 들면 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 수개, 예를 들면 1개 내지 5개의 아미노산이다.
본 발명에 기재된 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고는 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치일 수 있지만, 염기 서열에 대해서는 BLAST (문헌[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)])에서 디폴트의 매개 변수를 사용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는 BLAST 2(문헌 [Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997); Genome Res., 7, 649(1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html])에서 디폴트의 매개 변수를 사용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 매개 변수로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열인 경우에는 5, 아미노산 서열인 경우에는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열인 경우에는 2, 아미노산 서열인 경우에는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열인 경우에는 11 잔기, 아미노산 서열인 경우에는 3 잔기, -y(Dropoff(X) for blast extensions in bits)가 blastn인 경우에는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value for gapped alignment in bits)가 15 및 -Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits)가 blastn인 경우에는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/ blastcgihelp.html).
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제작할 수 있으며, 예를 들면 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 일부를 결실시키고, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질 전환체를 배양함으로써 제작할 수 있다. 또한, 이렇게 하여 제작되는 폴리펩티드 또는 DNA에 기초하여, 상기와 동일한 방법에 의해 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열에서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
CD27의 세포 외 영역이란, 문헌 [The Journal of Immunology, 147, 3165(1991)]에 예측되어 있는 세포 외 도메인의 1 내지 171번째에 상당하는 영역 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 세포 외 영역이란, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이면 어떠한 것이어도 상관없으며, 구체적으로는 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 의해 코딩되는 CD27의 세포 외 영역을 들 수 있다.
O 결합형 당쇄란, 단백질의 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)의 아미노산 잔기에서 각 아미노산 측쇄에 포함되는 -OH기를 통해 당쇄가 결합한 구조를 말한다. O 결합형 당쇄 중에서도, 폴리펩티드 위에서의 Ser 또는 Thr 아미노산 측쇄의 -OH기에 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이 결합한 O 결합형 당쇄를 뮤신형 당쇄라고 한다. O 결합형 당쇄의 구체예로서는, T 항원, 시알릴 T 항원, Tn 항원 또는 시알릴 Tn 항원 등을 들 수 있다(표 1).
Figure pct00001
본 발명에서 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄란, 단백질의 Ser 또는 Thr의 아미노산 잔기의 -OH기를 통해 결합한 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)에 갈락토오스(Gal)가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 말하며, 구체적으로는 상기한 Tn 항원 및 시알릴 Tn 항원을 들 수 있다. 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄는 정상 O 결합형 당쇄의 합성 경로에서의 중간체이며, 통상적으로 정상 세포에서의 당단백질에는 거의 존재하지 않고, 암이나 신증 등 어떠한 특정 질환에서 발현이 확인된다.
이하, 본 발명에서 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 이상 당쇄, 이상 당쇄가 결합한 단백질을 당쇄 부전 단백질 및 이상 당쇄가 결합한 CD27을 당쇄 부전 CD27로 기재하는 경우가 있다.
O 결합형 당쇄가 결합하는 폴리펩티드에서의 아미노산 잔기로서는, CD27 단백질의 세포 외 영역의 아미노산 서열 중의 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)의 아미노산 잔기를 들 수 있다.
또한, O 결합형 당쇄가 결합하는 폴리펩티드에서의 아미노산 잔기는, O 결합형 당쇄 결합 공통 서열(consensus sequence)을 NetOGlyc3.1 서버(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) 등의 서열 검색 소프트웨어를 사용하여 확인할 수 있다. 또는, O 결합형 당쇄를 갖는 당 단백질의 질량 분석법(MS) 해석을 행함으로써 구체적인 당쇄 결합 부위를 특정할 수 있다.
본 발명에서, CD27 단백질 위의 O 결합형 당쇄가 결합하는 폴리펩티드에서의 아미노산 잔기로서는, CD27 단백질의 아미노산 서열 중 어떠한 Ser 또는 Thr 잔기에도 O 결합형 당쇄가 결합할 수 있지만, 바람직하게는 서열 번호 2로 표시되는 CD27 단백질의 118번째 Thr, 127번째 Ser, 129번째 Thr, 132번째 Ser, 133번째 Ser, 137번째 Ser, 143번째 Thr, 149번째 Ser, 156번째 Thr, 162번째 Thr, 173번째 Thr, 175번째 Ser 및 176번째 Thr로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기로 이루어지는 당쇄 결합 부위를 들 수 있다.
CD27 단백질 1 분자당 세포 외 영역에 결합하는 O 결합형 당쇄의 수로서는, 적어도 1개의 Ser 잔기 또는 Thr 잔기에 O 결합형 당쇄가 결합할 수 있으며, O 결합형 당쇄의 수는 한정되지 않는다.
본 발명의 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27(이하, 당쇄 부전 CD27로 기재함)을 발현한 세포를 취득하는 방법으로서는, O 결합형 당쇄 합성 공정에서 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 우리딘 5'-이인산 갈락토오스(UDP-갈락토오스)의 수송에 관련된 단백질 등의 활성을 저하 또는 결손시킨 세포주에 CD27을 코딩하는 DNA를 도입함으로써, 당쇄 부전 CD27 발현 세포를 제작할 수 있다. 또한, 정상 O형 당쇄를 포함하는 CD27을 발현하는 세포에 대하여 시알리다아제 및 갈락토시다아제 등의 당쇄 절단 효소를 작용시킴으로써, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 갖는 CD27 발현 세포를 제작하는 것도 가능하다.
폴리펩티드 위에서의 Ser 또는 Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소의 구체예로서는, β1,3-갈락토실 트랜스페라제(문헌 [The Journal of Biological Chemistry, 277, 178-186(2002)]) 등을 들 수 있다. 또한, 폴리펩티드 위에서의 Ser 또는 Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소의 활성에 관여하는 단백질로서는, 이 효소의 단백질 접힘(folding)에 관여하는 샤페론인 Cosmc(문헌 [Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 16613-16618(2002)]) 등을 들 수 있다.
IgA 신증의 환자 유래의 CD27 발현 세포는 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 UDP-갈락토오스의 수송에 관련된 단백질 등을 코딩하는 DNA에 부가, 결실 또는 치환 등이 발생함으로써 효소의 활성이 저하 또는 결손되기 때문에, CD27 발현 세포로서 이용할 수 있다.
UDP-갈락토오스의 수송에 관련된 단백질로서는, UDP-갈락토오스 트랜스포터 등을 들 수 있다. UDP-갈락토오스 트랜스포터의 활성이 저하 또는 결손된 세포주로서는, Lec8 세포(문헌 [Glycobiology.1, 307-14(1991)]) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 당쇄 부전 CD27을 발현한 세포로서는 인간 체내에 내재적으로 존재하는 세포, 인간 체내에 내재적으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 상술한 바와 같은 O 결합형 당쇄 합성 공정에서 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 UDP-갈락토오스의 수송에 관련된 단백질 등의 활성을 저하 또는 결손시킨 세포주, 동일한 성질을 갖고 인간 체내에 내재적으로 존재하는 세포 등을 들 수 있다.
인간 체내에 내재적으로 존재하는 세포로서는, O 결합형 당쇄 합성 공정에서 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 UDP-갈락토오스의 수송에 관련된 단백질 등의 활성이 저하 또는 결손된 세포주가 바람직하고, 구체적으로는 IgA 신증 환자 체내 또는 암환자 체내에서 CD27 단백질이 발현되는 세포를 들 수 있으며, 예를 들면 생체 검사 등에서 얻어진 면역 관련 세포 또는 종양 세포 중에서 CD27 단백질이 발현되는 세포를 들 수 있다.
유전자 재조합 기술에 의해 얻어지는 세포로서는, O 결합형 당쇄 합성 공정에서 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 UDP-갈락토오스의 수송에 관련된 단백질 등의 활성을 저하 또는 결손시킨 숙주 세포를 제작하고, 목적으로 하는 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 당쇄 부전 CD27을 발현한 세포을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 구체적으로 UDP-갈락토오스 트랜스포터의 활성이 저하된 Lec8 세포, 또는 β1,3-갈락토실 트랜스페라제 또는 본 효소 활성에 관여하는 Comsc 샤페론 단백질의 이상에 의해 효소의 활성이 저하 또는 결손된 IgA 신증 환자 유래의 IgA 항체 발현 세포 등을 들 수 있다.
또한, 당쇄 부전 CD27 단백질을 제작하는 방법으로서는, 상술한 CD27 발현 세포를 사용하여 당쇄 부전 CD27 단백질을 발현, 정제하는 방법 등을 들 수 있다.
당쇄 부전 CD27 단백질을 취득하는 방법으로서는, CD27 단백질과 다른 물질의 융합 단백질로서 발현시켜 정제함으로써 취득할 수 있다. CD27 단백질과 융합시키는 물질로서는, 항체 정상 영역, 항체 Fc 영역, GST 태그, 히스티딘 태그(His 태그라고도 함) 또는 Myc 태그 등의 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 상기 융합 단백질은, 프로테인 A, 니켈 칼럼, 특이적 항체 칼럼 등의 친화성 칼럼(affinity column)을 사용함으로써 분리 정제할 수 있다.
상술한 바와 같이 하여 얻어진 당쇄 부전 CD27 세포 또는 당쇄 부전 CD27에 대하여 본 발명의 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편은 결합 활성을 갖는다.
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편이 당쇄 부전 CD27 단백질에 결합하는 것은, 예를 들면 공지된 면역학적 검출법, 바람직하게는 형광 세포 염색법 등을 이용하여 특정한 항원을 발현한 세포와 특정 항원에 대한 항체의 결합성을 확인하는 방법에 의해 확인할 수 있다. 또한, 공지된 면역학적 검출법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단클론 항체 실험 메뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]) 등을 조합하여 확인할 수도 있다.
본 발명에서의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 및 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체에 의해 생산되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
하이브리도마는, 예를 들면 상기한 당쇄 부전 CD27을 발현한 세포 등을 항원으로서 제조하고, 상기 항원을 면역한 동물로부터 항원 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 유도하고, 상기 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마를 배양하거나, 또는 상기 하이브리도마 세포를 동물에 투여하여 상기 동물을 복수암화시키고, 상기 배양액 또는 복수를 분리, 정제함으로써 당쇄 부전 CD27 항체를 취득할 수 있다.
항원을 면역하는 동물로서는 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면 어떠한 것도 사용할 수 있지만, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗 등이 바람직하게 사용된다. 또한, 이러한 동물로부터 항체 생산능을 갖는 세포를 취득하고, 상기 세포에 생체 외에서 면역을 실시한 후, 골수종 세포와 융합하여 제작한 하이브리도마가 생산하는 항체 등도 본 발명의 항체에 포함된다.
모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 생산 세포가 분비하는 항체이며, 단 하나의 에피토프(항원 결정기라고도 함)를 인식하고, 모노클로날 항체를 구성하는 아미노산 서열(1차 구조)이 균일하다.
에피토프란, 모노클로날 항체가 인식하고, 결합하는 단일의 아미노산 서열, 아미노산 서열로 이루어지는 입체 구조, 당쇄가 결합한 아미노산 서열 및 당쇄가 결합한 아미노산 서열로 이루어지는 입체 구조 등을 들 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체의 에피토프로서는, 당쇄 부전 CD27 단백질의 입체 구조를 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서는, 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역을 인식하고, 결합하는 모노클로날 항체이면 어떠한 항체여도 상관없지만, 구체적으로는 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 및 KM4031 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 하이브리도마 KM4026에 의해 생산된 모노클로날 항체 KM4026, 모노클로날 항체 KM4026과 경합하여 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체, 및 모노클로날 항체 KM4026이 결합하는 당쇄 부전 CD27 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서는 하이브리도마 KM4027에 의해 생산된 모노클로날 항체 KM4027, 모노클로날 항체 KM4027과 경합하여 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체, 및 모노클로날 항체 KM4027이 결합하는 당쇄 부전 CD27 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체도 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체로서는 하이브리도마 KM4028에 의해 생산된 모노클로날 항체 KM4028, 모노클로날 항체 KM4028과 경합하여 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체, 및 모노클로날 항체 KM4028이 결합하는 당쇄 부전 CD27 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체도 들 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서는 하이브리도마 KM4030에 의해 생산된 모노클로날 항체 KM4030, 모노클로날 항체 KM4030과 경합하여 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체, 및 모노클로날 항체 KM4030이 결합하는 당쇄 부전 CD27 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체도 들 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체로서는 하이브리도마 KM4031에 의해 생산된 모노클로날 항체 KM4031, 모노클로날 항체 KM4031과 경합하여 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체, 및 모노클로날 항체 KM4031이 결합하는 당쇄 부전 CD27 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체와 경합 반응하는 모노클로날 항체로서는, 구체적으로 상술한 바와 같이 각종 모노클로날 항체와 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 대하여 경합 반응을 갖는 모노클로날 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체로서는, 구체적으로 상술한 바와 같이 각종 모노클로날 항체가 인식하는 당쇄 부전 CD27 세포 외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.
하이브리도마 KM4030은 2008년 6월 5일자로 부다페스트 조약에 기초하여 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(305-8566 일본 이바라키현 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 중앙 제6)에 FERM BP-10976으로서 기탁되어 있다.
유전자 재조합 항체는 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 상기 항체 단편 등, 유전자 재조합 기술에 의해 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 재조합 항체에서 항원 결합 활성을 갖고, 항원성이 낮고, 혈중 반감기가 연장된 것은 치료약으로서 바람직하다.
인간형 키메라 항체는, 비인간 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH로 표기함) 및 경쇄 가변 영역(이하, VL로 표기함)과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH로 표기함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL로 표기함)으로 이루어지는 항체를 말한다.
본 발명의 인간형 키메라 항체는, 이하와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 당쇄 부전 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체, 또는 당쇄 부전 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입하여 항체를 발현시켜 제작할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로서는 인간 면역 글로불린(이하, hIg로 표기함)에 속하면 어떠한 것이어도 상관없지만, hIgG 클래스인 것이 바람직하고, hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브 클래스를 모두 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이어도 상관없고, κ 클래스 또는 λ 클래스인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 키메라 항체로서는 항체의 VH가 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL이 서열 번호 35로 표시되는 아미노산 서열인 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 26으로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL이 서열 번호 36으로 표시되는 아미노산 서열인 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 27로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL이 서열 번호 37로 표시되는 아미노산 서열인 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 28로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL이 서열 번호 38로 표시되는 아미노산 서열인 인간형 키메라 항체 및 항체의 VH가 서열 번호 29로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL이 서열 번호 39로 표시되는 아미노산 서열인 인간형 키메라 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간형 키메라 항체로서는, 항체의 VH가 서열 번호 40 내지 42로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH이며, 항체의 VL이 서열 번호 43 내지 45로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 46 내지 48로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH이며, 항체의 VL이 서열 번호 49 내지 51로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 52 내지 54로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH이며, 항체의 VL이 서열 번호 55 내지 57로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 58 내지 60으로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH이며, 항체의 VL이 서열 번호 61 내지 63으로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 64 내지 66으로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH이며, 항체의 VL이 서열 번호 67 내지 69로 표시되는 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체를 들 수 있다.
인간화 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말하며, 인간형 CDR 이식 항체, 재구성 항체(reshaped antibody)라고도 한다.
본 발명의 인간화 항체는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하며, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 생산되는 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임 워크(이하, FR이라고 함)에 이식한 항체 가변 영역(이하, V 영역이라고 함)을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열은, 인간 항체 유래의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, 단백질 정보 은행(protein data bank) 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 또는 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)] 등에 기재된 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 서열 등이 사용된다.
인간화 항체의 CH로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이어도 상관없지만, hIgG 클래스인 것이 바람직하고, hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4와 같은 서브 클래스를 모두 사용할 수 있다. 또한, 인간화 항체의 CL로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이어도 상관없으며, κ 클래스 또는 λ 클래스인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서는 항체의 VH의 CDR1 내지 3이 서열 번호 40 내지 42로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL의 CDR1 내지 3이 서열 번호 43 내지 45로 표시되는 아미노산 서열인 인간화 항체, 항체의 VH의 CDR1 내지 3이 서열 번호 46 내지 48로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL의 CDR1 내지 3이 서열 번호 49 내지 51로 표시되는 아미노산 서열인 인간화 항체, 항체의 VH의 CDR1 내지 3이 서열 번호 52 내지 54로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL의 CDR1 내지 3이 서열 번호 55 내지 57로 표시되는 아미노산 서열인 인간화 항체, 항체의 VH의 CDR1 내지 3이 서열 번호 58 내지 60으로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL의 CDR1 내지 3이 서열 번호 61 내지 63으로 표시되는 아미노산 서열인 인간화 항체 및 항체의 VH의 CDR1 내지 3이 서열 번호 64 내지 66으로 표시되는 아미노산 서열이며, 항체의 VL의 CDR1 내지 3이 서열 번호 67 내지 69로 표시되는 아미노산 서열인 인간화 항체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 항체로서는, 구체적으로 이하에 나타내는 인간화 항체를 들 수 있다.
항체의 VH의 아미노산 서열에 대해서는 항체의 VH가 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중 30번째의 Ser, 48번째의 Val, 49번째의 Ser, 77번째의 Asn, 93번째의 Val, 97번째의 Ala 및 117번째의 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체, 및/또는 항체의 VL의 아미노산 서열에 대해서는, 항체의 VL이 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중 21번째의 Ile, 40번째의 Pro, 58번째의 Val, 85번째의 Thr 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산을 갖는 인간화 항체 등을 들 수 있지만, 도입되는 개변의 수에 제한은 없다.
예를 들면, 이하에 나타내는 인간화 항체를 들 수 있다.
항체의 VH가 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중 30번째의 Ser, 48번째의 Val, 49번째의 Ser, 77번째의 Asn 및 97번째의 Ala가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체.
바람직하게는 항체의 VH가 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중 48번째의 Val, 49번째의 Ser 및 97번째의 Ala가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체.
바람직하게는 항체의 VH가 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중 30번째의 Ser 및 97번째의 Ala가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
상기한 아미노산 개변의 결과 얻어지는 항체 VH의 아미노산 서열로서는, 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중 30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중 30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중
77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 및 49번째의 Ser을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
77번째의 Asn을 Gly로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중
30번째의 Ser을 Asn으로, 및 48번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 및 49번째의 Ser을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
30번째의 Ser을 Asn으로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 및 49번째의 Ser을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
48번째의 Val을 Ile로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 및 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
49번째의 Ser을 Ala로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
77번째의 Asn을 Gly로, 및 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열,
77번째의 Asn을 Gly로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
77번째의 Asn을 Gly로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
93번째의 Val을 Thr로, 및 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열,
93번째의 Val을 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열,
97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열 중
30번째의 Ser을 Asn으로 치환한 아미노산 서열, 48번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열, 49번째의 Ser을 Ala로 치환한 아미노산 서열, 77번째의 Asn을 Gly로 치환한 아미노산 서열, 93번째의 Val을 Thr로 치환한 아미노산 서열, 97번째의 Ala를 Thr로 치환한 아미노산 서열, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
항체의 VL에 대해서는, 예를 들면 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중 21번째의 Ile, 40번째의 Pro, 58번째의 Val, 85번째의 Thr 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 들 수 있다.
바람직하게는, 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중 40번째의 Pro, 58번째의 Val, 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 들 수 있다.
상기한 아미노산 개변의 결과 얻어지는 VL의 아미노산 서열로서는, 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중 21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 개변으로부터 선택되는 적어도 1개의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중 21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중
40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중
21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 및 58번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
58번째의 Val을 Ile로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중
21번째의 Ile를 Leu로, 및 40번째의 Pro를 Leu로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 및 58번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
21번째의 Ile를 Leu로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
40번째의 Pro를 Leu로, 및 58번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열,
40번째의 Pro를 Leu로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
40번째의 Pro를 Leu로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
58번째의 Val을 Ile로, 및 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열,
58번째의 Val을 Ile로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열,
85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열
등을 들 수 있다.
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열 중
21번째의 Ile를 Leu로 치환한 아미노산 서열, 40번째의 Pro를 Leu로 치환한 아미노산 서열, 58번째의 Val을 Ile로 치환한 아미노산 서열, 85번째의 Thr을 Ala로 치환한 아미노산 서열, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 항체의 구체예로서는, 가변 영역의 H쇄가 서열 번호 96 및/또는 가변 영역의 L쇄가 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체, 가변 영역의 H쇄가 서열 번호 101 및/또는 가변 영역의 L쇄가 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체, 가변 영역의 H쇄가 서열 번호 103 및/또는 가변 영역의 L쇄가 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체, 가변 영역의 H쇄가 서열 번호 105 및/또는 가변 영역의 L쇄가 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체, 및 가변 영역의 H쇄가 서열 번호 107 및/또는 가변 영역의 L쇄가 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
인간 항체는 원래 인간 체내에 내재적으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 따라 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 내재적으로 존재하는 항체는, 예를 들면 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하고, 클로닝함으로써 상기 항체를 생산하는 림프구를 배양할 수 있으며, 배양 상청 중으로부터 상기 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 제조한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 상기 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로서 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하는 파지를 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은, 유전자 공학적 수법에 의해 2개가 완전한 H쇄 및 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생산 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 삽입된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들면 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 상기 ES 세포를 마우스의 초기배(初期胚)로 이식한 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은, 통상적인 인간 이외의 동물에서 행해지는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 생산 하이브리도마를 취득하고, 배양함으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 생산 축적시킬 수 있다.
상술한 항체 또는 항체 단편을 구성하는 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 상술한 항체 또는 그의 항체 단편과 동일한 활성을 갖는 항체 또는 그의 항체 단편도 본 발명의 항체 또는 그의 항체 단편에 포함된다.
결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며, 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 문헌 [Molecular Cloning Second Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488(1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지된 기술에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이다. 예를 들면 1 내지 수십개, 바람직하게는 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1개 내지 5개이다.
상기한 항체의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은, 다음을 나타낸다. 동일한 서열 중의 임의이면서도 1개 또는 복수개의 아미노산 서열 중에서, 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미한다. 또한, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 발생하는 경우도 있으며, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형 중 어떠한 것이어도 상관없다. 천연형 아미노산 잔기로서는 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린 및 L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다.
A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌
B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산
C군: 아스파라긴, 글루타민
D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산
E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린
F군: 세린, 트레오닌, 호모세린
G군: 페닐알라닌, 티로신
본 항체의 이펙터 활성으로서는, ADCC 활성, CDC 활성, 항체 의존성 탐식 활성(antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP), 옵소닌화 효과 등을 들 수 있으며, 다양한 방법으로 제어할 수 있다.
이펙터 활성을 제어하는 방법으로서는 항체의 Fc 영역에 결합한 당쇄를 제어하는 방법, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 아미노산 개변하는 방법 등을 들 수 있다.
항체의 Fc 영역에 결합한 당쇄를 제어하는 방법으로서는, IgG 항체의 297번째의 당쇄를 제거함으로써 ADCC, CDC 활성을 저하시키는 방법(문헌 [Molecular Immunology, 32, 1311, (1995), WO2008/030564]), 항체의 Fc 영역으로의 갈락토오스의 결합을 저하시켜 CDC 활성을 저하시키는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 항체의 Fc 영역에 결합한 당쇄를 제어하는 방법으로서는, IgG 항체의 Fc 영역의 297번째의 아스파라긴에 결합한 N 결합형 당쇄에서, 당쇄가 결합하는 기부(基部)의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 푸코오스가 결합하지 않은 당쇄를 포함하는 항체를 생산하는 방법(US7,214,775, US6,946,292), 이등분(bisecting) GlcNAc를 결합시킨 당쇄를 포함하는 항체를 생산시키는 방법(문헌 [Nature Biotechnology, 17, 176, (1999)]), 비환원 말단에 결합한 갈락토오스(Gal)를 결합시킨 당쇄를 갖는 항체를 생산시키는 방법(문헌 [Hum. Antibod. Hybridomas, 5, 143-151, (1994)]) 등의 방법을 들 수 있다.
항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 아미노산 개변하는 방법으로서는, 항체의 Fc 영역의 아미노산 개변을 행함으로써 이펙터 활성을 제어하는 방법(J.B.C., 277, 26733-26740, 2002, US6,737,056, US7,297,775, US2007/0020260, WO2005/070963), 및 항체의 Fc 영역의 각 서브 클래스간의 도메인 교환을 행함으로써 이펙터 활성을 제어하는 방법(WO2007/011041) 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 단편으로서는, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diabody, dsFv 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, diabody, dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단됨) H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 상기 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
F(ab')2는, IgG의 힌지 영역의 2개의 디술피드 결합의 하부를 효소 펩신으로 분해하여 얻어진 2개의 Fab 영역이 힌지 부분에서 결합하여 구성된 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 프래그먼트이다.
본 발명의 F(ab')2는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디술피드 결합시켜 제작할 수 있다.
Fab'은, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 Fab'는, 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 F(ab')2를 환원제 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다. 또는, 상기 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 적당한 펩티드 링커(이하, P로 표기함)를 사용하여 연결한 VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드에서 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
본 발명의 scFv는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하며, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
diabody는 scFv가 이량체화된 항체 단편이며, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일할 수도 있고, 한쪽을 상이한 항원 결합 활성으로 할 수도 있다.
본 발명의 diabody는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하며, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 취득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 P의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기간의 디술피드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 레이터 등에 의해 나타낸 방법(문헌 [Protein Engineering, 7, 697(1994)])에 따라 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다.
본 발명의 dsFv는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하며, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR 중 적어도 1개의 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다.
본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하며, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵 생물용 발현 벡터 또는 진핵 생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
또한, CDR을 포함하는 펩티드는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명에는, 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편에 약제, 단백질, 방사성 동위 원소 등을 화학적 또는 유전자 공학적으로 결합시킨 항체와의 접합체(conjugate)를 포함한다.
본 발명의 접합체는 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 그의 항체 단편 중의 적당한 치환기 또는 측쇄, 나아가서는 항체 또는 그의 항체 단편 중의 당쇄 등에 약제, 단백질, 방사성 동위 원소 등을 화학적 수법(문헌 [항체 공학 입문, 가네미츠 오사무 저, 치진쇼칸(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 당쇄 부전 CD27 단백질을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 코딩하는 DNA와, 결합시키고자 하는 단백질을 코딩하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포에 도입한다는 유전자 공학적 수법에 의해서도 제조할 수 있다.
약제로서는 화학 요법제, 항체 의약, 면역 부활제, 고분자의 약제 등을 들 수 있다.
단백질로서는 사이토카인, 증식 인자, 독소 단백질 등을 들 수 있다.
또한, 항체 또는 상기 항체 단편에 결합시키는 약제는 프로드러그의 형태일 수도 있다. 본 발명에서의 프로드러그란, 종양 환경에 존재하는 효소 등에 의해 화학적인 수식을 받아 암 세포를 상해하는 작용을 갖는 물질로 변환되는 약제를 말한다.
화학 요법제로서는, 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사길항제, 항암성 항생 물질, 식물 유래 알카로이드, 토포이소메라아제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타아제 저해제, P당 단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제, 키나아제 저해제 등의 어떠한 화학 요법제도 포함된다. 화학 요법제로서는 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카르바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 독소루비신리포(독실), 에피루비신, 젬시타빈(젬자르), 다우노루비신, 다우노루비신리포(다우노솜), 프로카르바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈플라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페플로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(택솔), 도세탁셀(탁소텔), 알데스류킨, 아스파라기나아제, 부술판, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캠토테신, CPT-11, 10-히드록시-7-에틸-캠토테신(SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸, 노기테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜파란, 머캅토푸린, 히드록시카르바미드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 스트렙토조신, 타목시펜, 고세렐린, 류프로렐린, 플루타미드, 테니포시드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실머스타드, 비노렐빈, 클로람부실, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토뮤덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티닙(이레사), 이마티닙(STI571), 에를로티닙, Flt3 저해제, 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체(VEGFR) 저해제, 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 저해제, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제(이레사, 타르세바 등), 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올-트랜스 레티노산, 탈리도마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 금티오말레이트, D-페니실라민, 부실라민, 아자티오프린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 히드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 타목시펜, 덱사메타손, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류플린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 아자티오프린, 페니실라민, 금티오말레이트, 말레산클로르페니라민, 클로르페니라민, 크레마시틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조밉, 알로푸리놀, 겜투주맵, 이브리투모맵 티욱세탄, 131 토시투모맵, 타르그레틴, 오조가민, 클래리스로마이신, 로이코보린, 이포스파미드, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민, 메토트렉세이트, 마이탄시노이드 및 그의 유도체 등을 들 수 있다.
화학 요법제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 글루타르알데히드를 통해 화학 요법제와 항체의 아미노기간을 결합시키는 방법, 수용성 카르보디이미드를 통해 화학 요법제의 아미노기와 항체의 카르복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
항체 의약으로서는, 항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관련된 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원, 병변 부위의 혈관 신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아포토시스가 유도되는 항원으로서는, 분화 클러스터(cluster of differentiation, 이하, CD로 기재함) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), 사람 백혈구 항원(HLA)-클래스 II, EGFR 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관련된 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원으로서는, CD4, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리 분자(DR4, DR5, TNFR1, TNFR2), TNF-관련 아포토시스 유도 리간드 수용체(TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4), 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성화제(RANK), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체 4, 사이토카인[인터류킨-1α(이하, 인터류킨을 IL이라고 함), IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 형질 전환 성장 인자(TGF)β, TNFα 등], 이들 사이토카인의 수용체, 케모카인(SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, CTACK 등), 이들 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관 신생을 저해하는 항체의 항원으로서는, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 섬유아세포 성장 인자(FGF), EGF, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 에리트로포이에틴(EPO), TGFβ, IL-8, 에필린(Ephilin), SDF-1 등 및 이들의 수용체를 들 수 있다.
면역 부활제로서는 면역 보강제(immunoadjuvant)로서 알려져 있는 천연물이 바람직하며, 구체예로서는 면역을 항진하는 약제인 β-1,3-글루칸(렌티난, 시조피란), α 갈락토실세라마이드(KRN7000), 균체 분말(피시바닐, BCG), 균체 추출물(크레스틴)을 들 수 있다.
고분자의 약제로서는 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG로 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 약제를 항체 또는 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 다양한 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실, 항체 생산의 억제 등의 효과가 기대된다(문헌 [바이오 콘주게이트 의약품, 히로가와 쇼텐(1993)]). 예를 들면, PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다(문헌 [바이오 콘주게이트 의약품, 히로가와 쇼텐(1993)]). PEG화 수식 시약으로서는 리신의 ε-아미노기의 수식제(일본 특허 공개 (소)61-178926), 아스파라긴산 및 글루탐산의 카르복실기의 수식제(일본 특허 공개 (소)56-23587), 아르기닌의 구아니디노기의 수식제(일본 특허 공개 (평)2-117920) 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식 인자로서는, NK세포, 마크로파지, 호중구 등의 세포를 항진하는 사이토카인 또는 증식 인자이면 어떠한 것이어도 상관없지만, 예를 들면 인터페론(이하, IFN이라고 함)-α, INF-β, INF-γ, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 자극 인자(G-CSF), 과립구ㆍ마크로파지 자극 인자(GM-CSF), 마크로파지 자극 인자(M-CSF) 등을 들 수 있다.
독소 단백질로서는 리신, 디프테리아톡신, ONTAK 등을 들 수 있으며, 독성을 조절하기 위해 단백질에 변이를 도입한 단백질 독소도 포함된다.
방사성 동위 원소로서는, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 199Tc, 77Lu, 211At, Re186, Re188, In111 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소는, 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시킬 수도 있다. 킬레이트제로서는, 메틸벤질디에틸렌-트리아민펜타아세트산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
본 발명에서는, 본 발명에서 사용되는 항체와 1개 이상의 다른 약제를 조합하여 투여하거나, 또는 방사선 조사를 조합할 수도 있다. 다른 약제로서는, 상술한 화학 요법제, 항체 의약, 면역 부활제, 사이토카인 또는 증식 인자 등을 들 수 있다.
방사선 조사로서는, X선, γ선 등의 광자(전자파) 조사, 전자선, 양자선, 중입자선 등의 입자선 조사 등이 포함된다.
조합하여 투여하는 방법으로서는, 본 발명에서 사용되는 항체와 동시 투여할 수도 있고, 본 발명에서 사용되는 항체의 투여에 전후하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 검출 방법, 정량 방법, 검출 시약, 정량 시약 또는 진단약은, 특정한 표지체를 본 발명의 항체에 표지하여 사용하는 방법을 들 수 있다. 표지체로서는 통상적인 면역학적 검출 또는 측정법에서 사용되는 표지체를 들 수 있으며, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시페라아제 등의 효소, 아크리디늄에스테르, 로핀 등의 발광 물질, 플루오레신ㆍ이소티아네이트(FITC), 트리메틸로다민(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 항체의 제조 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
1. 모노클로날 항체의 제조 방법
(1) 항원의 제조
하기에 기재된 방법에 의해, CD27 전장 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 O 결합형 당쇄 합성 공정에서 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 UDP-갈락토오스의 수송에 관련된 단백질 등의 활성이 저하 또는 결손된 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 도입함으로써, 항원이 되는 당쇄 부전 CD27 또는 당쇄 부전 CD27을 발현시킨 세포를 얻을 수 있다. 또한, 당쇄 부전 CD27을 세포막 위 또는 배양액 중에 다량으로 발현되는 각종 인간 유래 배양 세포, 인간 조직 등으로부터 당쇄 부전 CD27을 정제하여 항원을 제조하는 방법, 또는 당쇄 부전 CD27의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 제조하고, 항원으로서 사용할 수도 있다. 또한, 당쇄 부가능이 없는 대장균 등의 원핵 생물을 사용하여 발현, 정제한 CD27에 시험관 내에서 당쇄를 부가함으로써, 당쇄 부전 CD27을 얻을 수 있다.
또한, 동일하게 하여 정상적인 O 결합형 당쇄 합성 공정을 갖는 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등의 숙주 세포에 CD27 전장 또는 그의 부분 길이를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 도입함으로써, 정상적인 O 결합형 당쇄를 갖는 CD27을 발현시킨 세포를 취득할 수 있으며, 상기 세포로부터 정상적인 O 결합형 당쇄를 갖는 CD27 단백질을 정제할 수 있다.
상술한 바와 같이 하여 얻어진 당쇄 부전 CD27, 정상 O 결합형 당쇄를 갖는 CD27의 단백질 또는 발현 세포는, 목적으로 하는 항체의 스크리닝, 취득된 항체의 항원에 대한 반응성을 확인하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 폴리펩티드로서는, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)나 Current Protocols IN Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)] 등에 기재된 방법 등을 이용하여, 예를 들면 이하의 방법에 의해 이것을 상기 폴리펩티드 코딩하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.
우선, 전장 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 이 때, 혹시 필요하다면 전장 cDNA를 바탕으로 하여 폴리펩티드를 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 제조하고, 상기 전장 cDNA 대신에 상기 DNA 단편을 사용할 수도 있다. 이어서, 상기 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주 세포로서는, 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등, O 결합형 당쇄를 부가하는 능력을 갖고, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에서 자율 복제 가능 또는 염색체 중으로의 내장이 가능하고, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 적당한 프로모터를 함유하는 것이 사용된다.
대장균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터는 원핵 생물 중에서 자율 복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명에서 사용되는 DNA 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 상기 재조합 벡터는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함할 수도 있다.
발현 벡터로서는, 예를 들면 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 로슈 다이어그노스틱스사 제조), pKK233-2(파마시아사 제조), pSE280(인비트로젠사 제조), pGEMEX-1(프로메가사 제조), pQE-8(퀴아젠사 제조), pKYP10(일본 특허 공개 (소)58-110600), pKYP200(문헌 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669(1984)]), pLSA1(문헌 [Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)]), pGEL1(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)]), pBluescript II SK(-)(스트라테이진사 제조), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)으로부터 제조], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 제조], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 제조, 일본 특허 공개 (소)60-221091], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP-6798)로부터 제조, 일본 특허 공개 (소)60-221091], pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400(문헌 [J. Bacteriol., 172, 2392(1990)]), pGEX(파마시아사 제조), pET 시스템(노바젠사 제조), pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 상관없다. 예를 들면 trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lac T7 프로모터, let I 프로모터 등과 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터로서는, 리보솜 결합 서열인 샤인ㆍ달가르노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈의 사이를 적당한 거리(예를 들면 6 내지 18 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 염기 서열에서는, 숙주 내에서의 발현에 최적인 코돈이 되도록 염기를 치환할 수 있으며, 이에 따라 목적으로 하는 폴리펩티드의 생산률을 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 재조합 벡터에서의 유전자의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
숙주 세포로서는 에쉐리히아속 등에 속하는 미생물, 예를 들면 대장균 XL1-Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49, 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는 상기 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있으며, 예를 들면 칼슘 이온을 사용하는 방법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)], [Gene, 17, 107(1982)]이나 [Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서 예를 들면 pcDNAI, pcDM8(후나코시사로부터 시판), pAGE107(일본 특허 공개 (평)3-22979; 문헌 [Cytotechnology, 3, 133, (1990)]), pAS3-3(일본 특허 공개 (평)2-227075), pCDM8(문헌 [Nature, 329, 840, (1987)]), pcDNAI/Amp(인비트로젠사 제조), pcDNA3.1(인비트로젠사 제조), pREP4(인비트로젠사 제조), pAGE103(문헌 [[J. Biochemistry, 101, 1307(1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93(WO97/10354) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들면 거대 세포 바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus)의 프로모터 및 인핸서 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용할 수도 있다.
숙주 세포로서는, 당쇄 합성 경로 중 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 우리딘 5'-이인산 갈락토오스(UDP-갈락토오스)의 수송에 관련된 단백질 등의 활성을 저하 또는 결손시킨 세포주이면 어떠한 것이어도 상관없다. 구체적으로는, UDP-갈락토오스 트랜스포터가 결손된 차이니즈 햄스터 세포(CHO 세포)인 Lec8 변이체(문헌 [ACS Symp. Ser. 128, 214(1980)])를 들 수 있다.
또한, 당쇄 합성 경로에 관련된 효소, 수송 단백질의 활성이 결손되지 않은 세포여도 UDP-갈락토오스 트랜스포터(별칭 UDP-갈락토오스 트랜스로케이터; UGALT) 또는, 코어 1 신타아제, 글리코프로테인-n-아세틸갈락토사민 3-베타-갈락토실 트랜스페라제, (C1GALT1, 별칭 코어 1 베타-3-gal-t, t 신타아제) 또는 C1GALT1-스페시픽 샤페론 1(c1galt1c1, 별칭 코어 1 베타-3-갈락토실 트랜스페라제-스페시픽 몰레큘러 샤페론(COSMC), C1GALT2) 등의 효소, 수송 단백질의 기능을 저하 또는 결손시킨 세포주를 사용할 수 있다.
당쇄 합성 경로에 관련된 효소, 수송 단백질의 활성이 결손되지 않은 세포로서는, 예를 들면 (Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈ㆍ햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637(일본 특허 공개 (소)63-299) 등을 들 수 있다.
이러한 대상이 되는 효소군으로서는, 등을 들 수 있다.
유전자 기능을 저하시키는 방법으로서는, 안티센스법, 리보자임법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, 1886 (1999)]), 상동 재조합법(문헌 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993)]), RNA-DNA 올리고뉴클레오티드(RDO)법, RNA 간섭(RNAi)법(문헌 [Nature, 391, 806, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 15502, (1998), Nature, 395, 854, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049, (1999), Cell, 95, 1017, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1451, (1999) roc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959, (1998), Nature Cell Biol., 2, 70, (2000)]), 레트로바이러스를 사용한 방법, 트랜스포존을 사용한 방법(문헌 [Nature Genetics, 25, 35, (2000)]) 등을 들 수 있다.
벡터의 도입 방법으로서는 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있으며, 예를 들면 전기 천공법(문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)]), 인산칼슘법(일본 특허 공개 (평)2-227075), 리포펙션법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)]) 등을 들 수 있다.
유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다. 진핵 생물에서 유래하는 세포로 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 폴리펩티드를 생성 축적시키고, 상기 배양물로부터 채취함으로써 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 상기 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 이용되는 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 유도인자(inducer)를 배지에 첨가할 수도 있다. 예를 들면, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가할 수 있다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되는 RPMI1640 배지(문헌 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519(1967)]), 이글의 MEM 배지(문헌 [Science, 122, 501(1952)]), 달베코 개변 MEM 배지(문헌 [Virology, 8, 396(1959)]), 199 배지(문헌 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)]) 또는 이들 배지에 FCS 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 배양은, 통상적으로 pH 6 내지 8, 30 내지 40 ℃, 5 ％ CO2 존재하 등의 조건하에 1 내지 7일간 행한다. 또한, 배양 중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 삽입한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 동물 세포 등에서 유래하는 형질 전환체를 통상적인 배양 방법에 따라 배양하여 상기 폴리펩티드를 생성 축적시키고, 상기 배양물로부터 채취함으로써 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
폴리펩티드의 생산 방법으로서는 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외에 분비시키는 방법 및 숙주 세포 외막 위에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포나 생산시키는 폴리펩티드의 구조를 변경함으로써 적절한 방법을 선택할 수 있다.
폴리펩티드가 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 위에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법(문헌 [J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)]), 로우 등의 방법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)]), 또는 일본 특허 공개 (평)05-336963, WO94/23021 등에 기재된 방법을 이용함으로써 상기 유전자 산물을 숙주 세포 외에 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 특허 공개 (평)2-227075에 기재되어 있는 방법에 준하여 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
폴리펩티드는, 예를 들면 이하와 같이 하여 단리ㆍ정제할 수 있다.
폴리펩티드가 세포 내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심 분리에 의해 회수하여 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤-가울린 균질기, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하고, 무세포 추출액을 얻는다. 상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터 통상적인 효소의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로오스, 디아이온 HPA-75(미쯔비시 가가꾸사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로오스 FF(파마시아사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 수법을 단독으로 또는 조합하여 이용하여 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 폴리펩티드가 세포 내에 불용체를 형성하여 발현한 경우에는, 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써 침전 분획으로서 상기 폴리펩티드의 불용체를 회수한다. 회수한 상기 폴리펩티드의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 상기 가용화액을 희석 또는 투석함으로써 상기 폴리펩티드를 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드 켐테크사, 퍼킨 엘머사, 파마시아사, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사, 신테셀-베가사, 퍼셉티브사, 시마즈 세이사꾸쇼 등의 펩티드 합성기를 사용하여 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 항체 생산 세포의 제조
3 내지 20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터에 상기한 바와 같이 제조한 항원을 면역하고, 이 동물의 비장, 림프절, 말초혈 중의 항체 생산 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮고, 상기한 동물에서 충분한 항체가의 상승이 관찰되지 않는 경우에는, CD27 녹아웃 동물을 피면역 동물로서 사용하는 방법도 있다.
면역은, 동물의 피하 또는 정맥 내 또는 복강 내에 적당한 아주반트[예를 들면, 프로인트의 완전 아주반트(Complete FReund's Adjuvant)나 수산화알루미늄겔과 백일해균 백신 등]와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소 혈청 알부민)나 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin) 등의 캐리어 단백질과 접합체를 제작하고, 이것을 면역원으로서 사용한다.
항원의 투여는, 1회째의 투여 후 1 내지 2주 간격으로 5 내지 10회 행한다. 각 투여 후 3 내지 7일째에 안저 정맥총으로부터 채혈하고, 그 혈청이 항원과 반응하는 것을 효소 면역 측정법(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]) 등으로 조사한다. 면역에 사용한 항원에 대하여, 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 마우스, 래트 또는 햄스터를 비장 세포의 공급원으로서 제공한다.
비장 세포와 골수종 세포의 융합에 사용함에 있어서, 항원 물질의 최종 투여후 3 내지 7일째에 면역한 마우스, 래트 또는 햄스터로부터 비장을 적출하고, 비장 세포를 채취한다. 비장을 MEM 배지(닛스이 세이야꾸사 제조) 중에서 가늘게 절단하고, 핀셋으로 풀어 원심 분리(1200 rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 트리스-염화암모늄 완충액(pH 7.65)으로 1 내지 2분간 처리하여 적혈구를 제거하고, MEM 배지로 3회 세정하여 융합용 비장 세포로서 제공한다.
(3) 골수종 세포의 제조
골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 사용한다. 예를 들면, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(문헌 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)]), P3-NS1/1-Ag41(NS-1)(문헌 [European J. Immunology, 6, 511(1976)]), SP2/O-Ag14(SP-2)(문헌 [Nature, 276, 269(1978)]), P3-X63-Ag8653(653)(문헌 [J. Immunology, 123, 1548(1979)]), P3-X63-Ag8(X63)(문헌 [Nature, 256, 495(1975)]) 등이 사용된다. 이들 세포주는 8-아자구아닌 배지[RPMI-1640 배지에 글루타민(1.5 mM), 2-머캅토에탄올(5×10-5 M), 젠타마이신(10 μg/mL) 및 소 태아 혈청(FCS)을 첨가한 배지(이하, 정상 배지라고 함)에 8-아자구아닌(15 μg/mL)을 첨가한 배지]로 계대(繼代)하지만, 세포 융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지로 계대하여 융합 당일 2×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포 융합
상술한 항체 생산 세포와 골수종 세포를 MEM 배지 또는 PBS(인산이나트륨1.83 g, 인산일칼륨 0.21 g, 식염 7.65 g, 증류수 1 리터, pH 7.2)로 세정하고, 세포수가 항체 생산 세포:골수종 세포=5 내지 10:1이 되도록 혼합하여 원심 분리(1200 rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 침전된 세포군을 푼 후, 교반하면서 37 ℃에서 폴리에틸렌글리콜 1000(PEG-1000) 2 g, MEM 2 mL 및 디메틸술폭시드 0.7 mL의 혼액 0.2 내지 1 mL/108 항체 생산 세포를 첨가하고, 1 내지 2분마다 MEM 배지 1 내지 2 mL를 수회 첨가한 후, MEM 배지를 첨가하여 전량이 50 mL가 되도록 한다. 원심 분리(900 rpm, 5분간)한 후, 상청을 버리고 천천히 세포를 풀어 메스피펫에 의한 흡입, 취출로 천천히 세포를 HAT 배지[정상 배지에 히포크산틴(10-4 mol/L), 티미딘(1.5×10-5 mol/L) 및 아미노프테린(4×10-7 mol/L)을 첨가한 배지] 100 mL 중에 현탁한다. 이 현탁액을 96 웰 배양용 플레이트에 100 μL/웰씩 분주하고, 5 ％ CO2 인큐베이터 중 37 ℃에서 7 내지 14일간 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 취하여 후술하는 바인딩 분석 등에 의해 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드를 포함하는 항원에 반응하고, 폴리펩티드를 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 것을 선택한다.
또한, 이어서 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하고[1회째는 HT 배지(HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용함], 안정적으로 강한 항체가가 관찰된 것을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.
(5) 모노클로날 항체의 제조
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5 mL를 복강 내 투여하고, 2주간 사육함]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스에 (4)에서 얻어진 항CD27 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포 2×106 내지 5×107 세포/마리를 복강 내 주사한다. 10 내지 21일에 하이브리도마는 복수암화된다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심 분리(3,000 rpm, 5분간)하여 고형분을 제거한 후, 40 내지 50 ％ 황산암모늄으로 염석한 후, 카프릴산 침전법, DEAE-세파오로스 칼럼, 프로테인 A-칼럼 또는 겔 여과 칼럼에 의한 정제를 행하고, IgG 또는 IgM 분획을 모아 정제 모노클로날 항체로 한다.
항체의 서브 클래스의 결정은, 서브 클래스 타이핑 키트를 사용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은, 로리법 및 280 nm 에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 바인딩 분석
항원으로서는, 본항 (1)에 기재된 방법에 의해 본 발명에서 사용되는 CD27 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등에 도입하여 얻은 유전자 도입 세포나 재조합 단백질, 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 폴리펩티드나 부분 펩티드를 사용한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소 혈청 알부민)나 KLH(Keyhole Limpet hemocyanin) 등의 캐리어 단백질과 접합체를 제작하고, 이것을 사용한다.
이들 항원을 96 웰 플레이트에 분주하여 고상화한 후, 제1항체로서 피면역 동물 혈청, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS 또는 PBS-0.05 ％ 트윈으로 세정한 후, 제2항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항면역 글로불린 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS-트윈으로 세정한 후, 제2항체의 표지 물질에 따른 반응을 행한다.
갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체와 경합하는 항체는 상술한 바인딩 분석계에 피검 항체를 첨가하여 반응시킴으로써 취득할 수 있다. 즉, 피검 항체를 첨가했을 때 모노클로날 항체의 결합이 저해되는 항체를 스크리닝함으로써, 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역으로의 결합에 대하여 취득한 모노클로날 항체와 경합하는 모노클로날 항체를 취득할 수 있다.
또한, 당쇄 부전 CD27을 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프에 결합하는 항체는 상술한 바인딩 분석계에서 취득된 항체의 에피토프를 동정하고, 동정한 에피토프의 부분적인 당쇄 결합 펩티드, 또는 에피토프의 입체 구조에 의태시킨 당쇄 결합 펩티드 등을 제작하여 면역함으로써 취득할 수 있다.
2. 유전자 재조합 항체의 제작
유전자 재조합 항체의 제작예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 제작 방법을 나타낸다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터란, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA가 삽입된 동물 세포용 발현 벡터이며, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간 항체의 γ1 서브 클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 들 수 있다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA로서는 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA를 사용할 수도 있고, cDNA를 사용할 수도 있지만, cDNA를 사용하는 것이 바람직하다. 동물 세포용 발현 벡터로서는, 인간 항체의 C 영역을 코딩하는 유전자를 삽입하여 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, pAGE107(문헌 [Cytotechnol., 3, 133(1990)]), pAGE103(문헌 [J. Biochem., 101, 1307(1987)]), pHSG274(문헌 [Gene, 27, 223(1984)]), pKCR(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)]), pSG1bd2-4(문헌 [Cytotechnol., 4, 173(1990)]), pSE1UK1Sed1-3(문헌 [Cytotechnol., 13, 79(1993)]) 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서로서는, SV40의 초기 프로모터(문헌 [J. Biochem., 101, 1307(1987)]), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR(문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)]), 면역 글로불린 H쇄의 프로모터(문헌 [Cell, 41, 479(1985)])와 인핸서(문헌 [Cell, 33, 717(1983)]) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는 항체 H쇄 및 L쇄가 각각의 벡터 위에 존재하는 타입, 또는 동일한 벡터 위에 존재하는 타입(탠덤형) 중 어떠한 것도 사용할 수 있지만, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포로의 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 균형이 잡힌다는 등의 점에서 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터가 바람직하다(문헌 [J. Immunol. Methods, 167, 271(1994)]). 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터로서는, pKANTEX93(WO97/10354), pEE18(문헌 [하이브리도마, 17, 559(1998)]) 등을 들 수 있다.
(2) 인간 이외의 동물에서 유래하는 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA는 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 상기 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 위의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 서열을 각각 결정하고, 염기 서열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.
인간 이외의 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗 등 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 제조하는 방법으로서는 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법(문헌 [Methods in Enzymol., 154, 3(1987)]) 등, 키트로서는 RNA 이지 키트(퀴아젠사 제조) 등을 들 수 있다. 전체 RNA로부터 mRNA를 제조하는 방법으로서는 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]) 등, 키트로서는 올리고 TM-dT30<수퍼> mRNA 퓨리피케이션 키트(다카라사 제조) 등을 들 수 있다. 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 제조하는 키트로서는 패스트 트랙 mRNA 아이솔레이션 키트(인비트로젠사 제조), 퀵 프렙 mRNA 퓨리피케이션 키트(파마시아사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 통상법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Current Protocols in Molecular Biology], Supplement 1-34]), 또는 시판된 키트, 예를 들면 cDNA 신테시스 앤드 플라스미드 클로닝을 위한 수퍼 스크립트 TM 플라스미드 시스템(인비트로젠사 제조)이나 ZAP-cDNA 신테시스 키트(스트라타진사 제조)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리의 제작시에 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로서 합성한 cDNA를 삽입한 벡터는, 상기 cDNA를 삽입할 수 있는 벡터이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, ZAP 익스프레스(문헌 [Strategies, 5, 58(1992)]), pBluescript II SK(+)(문헌 [Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]), λZAPII(스트라타진사 제조), λgt10, λgt11(문헌 [DNA 클로닝: A Practical Approach, I, 49(1985)]), Lambda BlueMid(클론테크사 제조), λExCell, pT7T3 18U(파마시아사 제조), pcD2(문헌 [Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)] 및 pUC18(문헌 [Gene, 33, 103(1985)]) 등이 사용된다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들면, XL1-블루 MRF'(문헌 [Strategies, 5, 81(1992)], C600(문헌 [Genetics, 39, 440(1954)]), Y1088, Y1090(문헌 [Science, 222, 778(1983)]), NM522(문헌 [J. Mol. Biol., 166, 1(1983)]), K802(문헌 [J. Mol. Biol., 16, 118(1966)]) 및 JM105(문헌 [Gene, 38, 275(1985)]) 등이 사용된다.
cDNA 라이브러리에서의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA 클론의 선택법으로서는, 동위 원소 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니ㆍ혼성화법 또는 플라크ㆍ혼성화법(문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)])에 의해 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 제조하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로서 폴리메라제 연쇄 반응(이하, PCR법으로 표기함)(문헌 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34])에 의해 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 제조할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA를 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(스트라타진사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상적으로 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들면 생거(Sanger, F.) 등의 디데옥시법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)]) 등의 반응을 행하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예를 들면 A.L.F.DNA 시퀀서(파마시아사 제조) 등을 사용하여 해석함으로써 상기 cDNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지된 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코딩하고 있는지를 각각 확인할 수 있다. 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 대해서는, 기지된 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있으며, 나아가서는 이들이 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지된 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)])과 비교함으로써 찾아낼 수 있다.
또한, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 사용하여 임의의 데이터 베이스, 예를 들면 SWISS-PROT나 PIR-프로테인 등에 대하여 BLAST법(문헌 [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]) 등의 서열의 상동성 검색을 행함으로써, 사용하는 아미노산 서열이 신규인지의 여부를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
본항 2의 (1)에 기재된 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들면, 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해 연결 부분의 염기 서열이 적절한 아미노산을 코딩하고, 적당한 제한 효소 인식 서열이 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다. 제작된 VH 및 VL의 cDNA 각각을 본항 2의 (1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양쪽 말단에 갖는 합성 DNA를 사용하여 PCR법에 의해 각각 증폭하여, 각각을 본항 2의 (1)에 기재된 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수도 있다.
(4) 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하과 같이 하여 구축할 수 있다. 우선, 비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 또는 VL의 프레임 워크 영역(이하, FR로 표기함)의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열로서는, 인간 항체에서 유래하는 것이면 어떠한 것이어도 상관없다. 예를 들면, 단백질 정보 은행 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열, 인간 항체의 FR의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 서열(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]) 등을 들 수 있다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해, 원래의 항체 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60 ％ 이상)인 FR의 아미노산 서열을 선택한다. 이어서, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에 원래의 항체 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하여, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에서 보이는 코돈의 사용 빈도(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)])를 고려하여 DNA 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 각각 설계한다. 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR법을 행한다. 이 경우, PCR에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터 H쇄, L쇄 모두 6개의 합성 DNA를 설계하는 것이 바람직하다.
또한, 양쪽 말단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본항 2의 (1)에서 구축한 인간화 항체 발현용 벡터에 용이하게 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 수 있다. PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라타진사 제조) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하고, 본항 2의 (2)에 기재된 방법에 의해 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식하는 것만으로는, 그 항원 결합 활성이 원래의 비인간 항체에 비해 저하된다는 것이 알려져 있다(문헌 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]). 그 원인으로서는, 원래의 비인간 항체의 VH 및 VL에서는 CDR뿐만 아니라 FR 내의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하기 때문에, 인간화에 의해 비인간 항체의 FR의 아미노산 잔기가 인간 항체의 FR의 아미노산 잔기로 치환되면, 항원 결합 활성이 저하되는 것으로 생각되고 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 인간화 항체에서는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서 직접 항원과의 결합에 관여하는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 동정하고, 이들의 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 것이 행해지고 있다(문헌 [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266(1991)]). 인간화 항체의 제작에서는, 이들 항원 결합 활성에 관련된 FR의 아미노산 잔기를 매우 효율적으로 동정하기 위해, X선 결정 해석(문헌 [J. Mol. Biol., 112, 535(1977)]) 또는 컴퓨터 모델링(문헌 [Protein Engineering, 7, 1501(1994)] 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 행해지고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는, 인간화 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 초래했지만, 한편으로 모든 항체에 적응 가능한 인간화 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않으며, 현실적으로는 각각의 항체에 대하여 여러 종류의 개변체를 제작하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 다양한 시행 착오가 필요하다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 사용하여 본항 2의 (4)에 기재된 PCR법을 행함으로써 개변시킬 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대하여 본항 2의 (2)에 기재된 방법에 의해 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
본항 2의 (1)에 기재된 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예를 들면, 본항 2의 (4) 및 (5)에서 인간화 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양쪽 말단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본항 2의 (1)에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코딩하는 각각의 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝할 수 있다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
제작한 많은 종류의 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가하기 위해, 본항 2의 (3) 및 (6)에 기재된 유전자 재조합 항체 발현 벡터, 또는 이들을 개변한 발현 벡터를 사용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행할 수 있다. 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로서는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포도 사용할 수 있지만, 그 발현량의 높이로부터 COS-7 세포(ATCC CRL1651)가 일반적으로 사용된다(문헌 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283(1991)]). COS-7 세포로의 발현 벡터의 도입법으로서는, DEAE-덱스트란법(문헌 [Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283(1991)]), 리포펙션법(문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)]) 등을 들 수 있다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법(이하, ELISA법으로 표기함)(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), 단클론 항체 실험 메뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)]) 등에 의해 측정할 수 있다.
(8) 유전자 재조합 항체의 안정 발현
본항 2의 (3) 및 (6)에 기재된 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입함으로써, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포로의 발현 벡터의 도입법으로서는, 전기 천공법(일본 특허 공개 (평)2-257891, 문헌 [Cytotechnology, 3, 133(1990)]) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포로서는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포도 사용할 수 있다. 예를 들면, 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 2종의 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/dhFr-세포(ATCC CRL9096) 및 CHO/DG44 세포(문헌 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555(1986)]), 렉틴 내성을 획득한 Lec13(문헌 [Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55(1986)]), α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포(WO05/35586, WO02/31140), 래트 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662) 등을 들 수 있다.
상기 숙주 세포 이외에, 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 세포 내 당뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 바람직하게는 WO05/35586 , WO02/31140 등에 기재된 α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포 등을 사용할 수도 있다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질 전환주는, 일본 특허 공개 (평)2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라 G418 황산염(이하, G418로 표기함: 시그마사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지로 배양함으로써 선택할 수 있다. 동물 세포 배양용 배지로서는, RPMI1640 배지(인비트로젠사 제조), GIT 배지(니혼 세이야꾸사 제조), EX-CELL301 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(인비트로젠사 제조), 하이브리도마-SFM 배지(인비트로젠사 제조), 또는 이들 배지에 소 태아 혈청(이하, FCS로 표기함) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, 일본 특허 공개 (평)2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라 DHFR 증폭계 등을 이용하여 유전자 재조합 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는, 형질 전환주의 배양 상청으로부터 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]). 또한, 그 이외에 통상적으로 단백질의 정제에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하여 행함으로써 정제할 수 있다. 정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(이하, SDS-PAGE로 표기함)(문헌 [Nature, 227, 680(1970)])이나 웨스턴 블로팅법(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]) 등으로 측정할 수 있다.
3. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 반응 특이성은, 하기와 같이 하여 평가할 수 있다.
정상형 당쇄를 발현하는 세포, 및 O 결합형 당쇄 합성 공정에서 폴리펩티드 위의 Ser/Thr에 결합한 GalNAc에 Gal을 부가하는 효소, 이 효소의 활성에 관여하는 단백질 또는 우리딘 5'-이인산 갈락토오스(UDP-갈락토오스)의 수송에 관련된 단백질 등의 활성이 저하 또는 결손된 세포주를 숙주로서, CD27 코딩하는 염기 서열(서열 번호 1)을 발현시킨 CD27 발현 세포를 각각 제작할 수 있다. 이와 같이 하여, 정상 O 결합형 당쇄를 갖는 CD27을 발현한 세포, 당쇄 부전 CD27을 발현한 세포를 제작하고, 각각의 CD27을 발현하는 세포주와 정제 항체의 반응성을 ELISA법 및 형광 항체법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)]) 등으로 측정할 수 있다.
또한, CD27의 세포 외 도메인을 융합 단백질 등의 가용화체로서 상술한 숙주 세포에 각각 발현시키고, 적절한 조건하에 정제함으로써 입체 구조를 유지한 CD27 가용형 단백질을 각각 제조할 수 있다. 융합 단백질로서는, CD27 단백질을 항체 정상 영역(Fc라고도 함), GST 태그, 히스티딘 태그(His 태그라고도 함) 또는 Myc 태그 등의 별도의 폴리펩티드와 융합한 것을 들 수 있다. 상기 융합 단백질은 프로테인 A, 니켈 칼럼, 특이적 항체 칼럼 등의 친화성 칼럼을 사용함으로써 분리 정제할 수 있다. 이들 정제 CD27 가용형 단백질과 정제 항체의 반응성을 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용한 BIAcoreTM, ELISA법이나 면역 침강법 등에 의해 측정할 수도 있다(문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)].
당쇄 부전 CD27을 발현하는 배양 세포주에 대한 세포 상해 활성은, CDC활성, ADCC 활성 등을 공지된 방법(문헌 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993)])으로 측정하여 평가할 수 있다.
4. 본 발명의 당쇄 부전 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편을 사용한 질환의 진단 방법
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 당쇄 부전 CD27 또는 상기 폴리펩티드가 발현한 세포를 검출 또는 정량함으로써, 당쇄 부전 CD27이 관련된 질환을 진단할 수 있다.
당쇄 부전 CD27이 관여하는 질환으로서는, 생체 내에서 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드가 발현된 세포가 발견되는 질환이면 어떠한 것도 포함한다. 구체적으로는 IgA 신증 또는 암을 들 수 있다. 암으로서는 B, T 세포 분화 과정에서 유래하는 암을 들 수 있으며, 구체적으로는 맨틀 세포 림프종, 만성 림프성 백혈병, 소림프성 백혈병, 버키트 림프종, 여포성 림프종, 말트 림프종, 미만성 대세포 림프종, 형질 세포종 등 다양한 비호지킨 림프종 등을 들 수 있다.
본 발명에서 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드를 검출 또는 측정하는 대상이 되는 생체 시료로서는, 조직 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 소변, 대변, 조직액, 배양액 등, 상기 폴리펩티드를 포함할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
당쇄 부전 CD27이 관련된 질환 중, 예를 들면 IgA 신증의 진단은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
복수의 정상인의 생체로부터 채취한 생체 시료에 대하여, 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 사용하고, 하기의 면역학적 수법을 이용하여 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드의 검출 또는 측정을 행함으로써 정상인의 생체 시료 중의 상기 폴리펩티드의 발현량을 확인한다. 피험자의 생체 시료 중에 대해서도 마찬가지로 상기 폴리펩티드의 발현량을 조사하고, 그 발현량을 정상인의 발현량과 비교한다. 피험자의 상기 폴리펩티드의 발현량이 정상인에 비해 증가한 경우에는 IgA 신증이거나, 또는 장래 IgA 신증이 발병할 가능성이 높다고 진단할 수 있다.
당쇄 부전 CD27이 관련된 질환 중, 예를 들면 암의 진단은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
복수의 정상인의 생체로부터 채취한 생체 시료에 대하여, 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 사용하고, 하기의 면역학적 수법을 이용하여 당쇄 부전 CD27의 검출 또는 측정을 행함으로써 정상인의 생체 시료 중의 상기 폴리펩티드의 발현량을 확인한다. 피험자의 생체 시료 중에 대해서도 마찬가지로 상기 폴리펩티드의 발현량을 조사하고, 그 발현량을 정상인의 발현량과 비교한다. 피험자의 상기 폴리펩티드의 발현량이 정상인에 비해 증가한 경우에는, 암이 양성인 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 진단약은, 목적으로 하는 진단 방법에 따라 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약, 상기 반응의 검출용 시약을 포함할 수도 있다. 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약으로서는, 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로서는, 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체, 또는 이들의 유도체를 인식하는 표지된 이차 항체, 표지물의 기질 등, 통상적인 면역학적 검출 또는 측정법에 사용되는 시약을 들 수 있다.
본 발명에서 당쇄 부전 CD27의 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서는, 임의의 공지된 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 면역학적 검출 또는 측정 방법 등을 들 수 있다.
면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 사용하여 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 면역학적 검출 또는 측정 방법으로서는, 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent immunoassay), 웨스턴 블로팅법 및 물리 화학적 수법(TIA, LAPIA, PCIA) 등을 들 수 있다.
방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA)으로서는, 예를 들면 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 반응시키고, 방사선 표지를 실시한 항면역 글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 섬광 계수기 등으로 측정하는 방법을 들 수 있다.
효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA)으로서는, 예를 들면 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 반응시키고, 표지를 실시한 항면역 글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 발색 색소를 흡광 광도계로 측정하는 방법을 들 수 있으며, 예를 들면 샌드위치 ELISA법 등이 이용된다. 효소 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 상술한 바와 같이 임의의 공지(문헌 [이시카와 에이지 외 편찬, 효소 면역 측정법, 의학 서원])된 효소 표지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 알칼리포스파타아제 표지, 퍼옥시다아제 표지, 루시페라아제 표지, 비오틴 표지 등을 사용할 수 있다.
샌드위치 ELISA법은 고상에 항체를 결합시킨 후, 검출 또는 측정하고자 하는 항원을 트랩시키고, 트랩된 항원에 제2항체를 반응시키는 방법이다. 상기 ELISA법에서는, 검출 또는 측정하고자 하는 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편이며, 항원 인식 부위가 상이한 2종의 항체를 준비하고, 그 중 한쪽 항체 또는 항체 단편을 미리 플레이트(예를 들면, 96 웰 플레이트)에 흡착시키고, 제2항체 또는 항체 단편을 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소, 비오틴 등으로 표지한다. 상기한 항체가 흡착된 플레이트에 생체 내로부터 분리된 세포 또는 그의 파쇄액, 조직 또는 그의 파쇄액, 세포 배양 상청, 혈청, 흉수, 복수, 안액 등을 반응시킨 후, 표지한 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 반응시켜 표지 물질에 따른 검출 반응을 행한다. 상기 방법에 의해 피검 샘플 중의 항원 농도를 측정하는 경우에는, 농도가 기지된 항원을 단계적으로 희석하여 제작한 검량선으로부터 피검 샘플 중의 항원 농도를 산출할 수 있다. 샌드위치 ELISA법에 사용하는 항체로서는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 하나를 사용할 수도 있고, Fab, Fab', F(ab)2 등의 항체 프래그먼트를 사용할 수도 있다. 샌드위치 ELISA법에서 사용하는 2종의 항체의 조합으로서는, 상이한 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합일 수도 있고, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합일 수도 있다.
형광 면역 측정법(FIA)으로서는, 문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); 단클론 항체 실험 메뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 형광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 상술한 바와 같이 임의의 공지(문헌 [카와오이 아키라 저, 형광 항체법, 소프트 사이언스사)]된 형광 표지를 사용할 수 있다. 예를 들면, FITC 표지, RITC 표지 등을 사용할 수 있다.
발광 면역 측정법(luminescent immunoassay)으로서는, 문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단클론 항체 실험 메뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 발광 면역 측정법에서 사용하는 표지체로서는, 상술한 바와 같이 임의의 공지(문헌 [이마이 카즈히로 편찬, 생물 발광과 화학 발광, 히로가와 쇼텐; 임상 검사 42(1998)])된 발광체 표지를 들 수 있다. 예를 들면, 아크리디늄에스테르 표지, 로핀 표지 등을 사용할 수 있다.
웨스턴 블로팅법은, 항원 또는 항원을 발현한 세포 등을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)])으로 분획한 후, 상기 겔을 PVDF막 또는 니트로셀룰로오스막에 블로팅하고, 상기 막에 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 반응시키고, FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지, 비오틴 표지 등을 실시한 항마우스 IgG 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 상기 표지를 가시화함으로써 확인하는 방법이다. 웨스턴 블로팅법의 일례를 이하에 나타낸다.
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 세포나 조직을 용해하고, 환원 조건하에 레인당 단백질량으로서 0.1 내지 30 μg을 SDS-PAGE법에 의해 영동한다. 영동된 단백질을 PVDF막에 이동시키고, 1 ％ BSA를 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS로 표기함)에 실온에서 30분간 반응시켜 블록킹 조작을 행한다. 여기서 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시키고, 0.05 ％의 트윈-20을 포함하는 PBS(이하, 트윈-PBS로 표기함)로 세정하고, 퍼옥시다아제 표지한 염소 항마우스 IgG를 실온에서 2 시간 동안 반응시킨다. 트윈-PBS로 세정하고, ECLTM 웨스턴 블로팅 디텍션 리에이전트(아머샴사 제조) 등을 사용하여 모노클로날 항체가 결합한 밴드를 검출함으로써, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 검출할 수 있다. 웨스턴 블로팅에서의 검출에 사용되는 항체로서는, 천연형의 입체 구조를 유지하지 않은 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 사용된다.
물리 화학적 수법이란, 구체적으로는 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 항원인 갈락토오스를 결손한 O형 당쇄를 결합하는 CD27과 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 결합시킴으로써 응집체를 형성시키고, 이 응집체를 검출함으로써 행한다. 그 이외에 물리 화학적 수법으로서는, 모세관법, 일차원 면역 확산법, 면역 비탁법 또는 라텍스 면역 비탁법 등을 들 수 있다(문헌 [임상 검사법 제요, 카네하라 슛판, 499(1998)]).
예를 들면, 라텍스 면역 비탁법에서는, 항체 또는 항원을 감작시킨 입경 0.1 내지 1 μm 정도의 폴리스티렌 라텍스 등의 담체를 사용하여 대응하는 항원 또는 항체에 의해 항원 항체 반응을 일으키면, 반응액 중의 산란광은 증가하고, 투과광은 감소한다. 이 변화를 흡광도 또는 적분구 탁도로서 검출함으로써 피검 샘플 중의 항원 농도 등을 측정할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편은 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드의 세포 외 영역에 결합할 수 있기 때문에, 상기 폴리펩티드가 발현된 세포의 검출에 바람직하게 사용된다.
상기 폴리펩티드가 발현된 세포의 검출에는 공지된 면역학적 검출법을 이용할 수 있지만, 면역 침강법, 면역 세포 염색법 및 면역 조직 염색법 등이 바람직하게 이용된다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오 시스템사 제조)을 사용하는 형광 항체 염색법 등도 이용할 수 있다.
면역 침강법이란, 상기 폴리펩티드를 발현한 세포 등을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체 단편과 반응시킨 후, 프로테인 G-세파로오스 등의 면역 글로불린에 특이적인 결합능을 갖는 담체를 첨가하여 항원 항체 복합체를 침강시키는 방법이다. 또는 이하와 같은 방법에 의해서도 행할 수 있다.
ELISA용 96 웰 플레이트에 상술한 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 고상화한 후, BSA-PBS에 의해 블록킹한다. 항체가 정제되지 않은 상태의 예를 들면, 하이브리도마주 배양 상청 등이 정제되지 않은 상태인 경우에는, 항마우스 면역 글로불린 또는 래트 면역 글로불린 또는 프로테인 A 또는 G 등을 미리 ELISA용 96 웰 플레이트에 고상화하여 BSA-PBS로 블록킹한 후, 하이브리도마주 배양 상청을 분주하여 결합시킨다. BSA-PBS를 버리고 PBS로 세정한 후, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 세포나 조직의 용해액을 반응시킨다. 세정한 후의 플레이트로부터 면역 침강물을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼로 추출하고, 상기한 웨스턴 블로팅에 의해 검출을 행한다.
면역 세포 염색법 및 면역 조직 염색법이란, 항원을 발현한 세포 또는 조직 등을 경우에 따라서는 항체의 통과성을 양호하게 하기 위해 계면활성제나 메탄올 등으로 처리한 후, 본 발명의 항체를 반응시키고, FITC 등의 형광 표지, 퍼옥시다아제 등의 효소 표지, 비오틴 표지 등을 실시한 항면역 글로불린 항체 또는 결합 단편을 반응시킨 후, 상기 표지를 가시화하여 현미경으로 관찰하거나, 또는 형광 표지의 항체와 세포를 반응시키고, 흐름 세포측정기로 해석하는 형광 항체 염색법(흐름 세포측정법)이다. 예를 들면, 문헌 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단클론 항체 실험 메뉴얼, 고단샤 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편은 당쇄 부전 CD27의 세포 외 영역에 결합할 수 있기 때문에, 세포막 위에 천연형의 입체 구조를 유지하여 발현하는 CD27을 검출하는 흐름 세포측정법의 해석에 바람직하게 사용된다.
또한, 형광 항체 염색법의 원리를 이용한 FMAT8100HTS 시스템(어플라이드 바이오 시스템사 제조)을 사용함으로써, 형성된 항체-항원 복합체와 항체-항원 복합체의 형성에 관여하지 않은 유리된 항체 또는 항원을 분리하지 않고 항원량 또는 항체량을 측정할 수 있다.
5. 본 발명의 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드를 특이적으로 인식하고, 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편을 사용한 질환의 치료 방법
본 발명의 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드를 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그의 항체 단편은, 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드가 관여하는 질환의 치료에 사용할 수 있다.
당쇄 부전 CD27 폴리펩티드가 관여하는 질환으로서는, 생체 내에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포가 발견되는 질환이면 어떠한 것이어도 상관없으며, 예를 들면 IgA 신증이나 암 등을 들 수 있다.
또한, IgA 신증을 발병하고, 네프로시스 증후군을 나타내는 질환이나 신부전을 나타내는 것도 질환으로서 들 수 있다.
암으로서는, 조혈기 유래의 종양(혈액암이라고도 함)이나 상피 유래의 고형암을 들 수 있다.
혈액암으로서는, 구체적으로 백혈병, 림프종(호지킨 림프종, 비호지킨 림프종) 다발성 골수종 등을 들 수 있다. 구체적인 비호지킨 림프종으로서는, 맨틀 세포 림프종, 만성 림프성 백혈병, 소림프성 백혈병, 버키트 림프종, 여포성 림프종, 말트 림프종, 미만성 대세포 림프종, 형질 세포종 등을 들 수 있다.
고형암으로서는, 구체적으로 유방암, 자궁암, 대장암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁 경암, 소장암, 전립선암 또는 췌장암 등을 들 수 있다.
본 발명의 치료제로서는, 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편을 유효 성분으로 하는 암의 치료제를 들 수 있다. ADCC 활성이나 CDC 활성 등의 이펙터 활성을 갖는 암 치료제, 또는 아포토시스 유도 작용에 의한 암의 치료제 등도 본 발명의 치료제로서 포함된다.
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편은 세포막에 발현된 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드를 인식할 수 있기 때문에, 생체 내에서 존재하는 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드를 발현하는 세포를 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편이며, 이펙터 활성을 갖는 항체 또는 상기 항체 단편은, 생체 내 및 생체 외에서 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드를 발현하는 세포를 상해할 수 있다. 또한, 이러한 본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편은, 생체 내의 당쇄 부전 CD27 폴리펩티드 발현 세포를 상해하고, 감소시킬 수 있기 때문에, 치료제로서 특히 유효하게 사용된다.
본 발명의 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는 유효 성분으로서의 상기 항체 또는 상기 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것일 수도 있지만, 통상적으로 약리학적으로 허용되는 1개 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 및 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있으며, 항체 또는 펩티드 제제의 경우 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다. 투여 형태로서는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다. 유제 및 시럽제와 같은 액체 제조물은, 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 호마유, 올리브유, 대두유 등의 오일류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 딸기 향미, 페퍼민트 등의 향미류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다. 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은, 젖당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐 알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산 에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다. 주사제는 염 용액, 포도당 용액, 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 제조된다. 좌제는 카카오 버터, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 제조된다. 또한, 분무제는 상기 항체 또는 항체 단편 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 상기 항체 또는 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 제조된다. 담체로서 구체적으로는 젖당, 글리세린 등이 예시된다. 상기 항체 또는 항체 단편 및 사용하는 담체의 성질에 따라 에어로졸, 건조 분말 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 상이하지만, 통상적으로 성인 1일당 10 μg/kg 내지 8 mg/kg이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예로 한정되지 않는다.
[실시예]
실시예 1
갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 가용형 CD27 세포 외 도메인의 제작(이하, 당쇄 부전 CD27로 기재하는 경우도 있음)
(1) 인간 CD27 유전자의 클로닝
클론테크사로부터 구입한 인간 말초혈 유래 cDNA 라이브러리로부터, 이하의 절차로 CD27을 코딩하는 유전자를 단리하였다. 1배 농도의 BD 어드밴티지 PCR 완충액(클론테크사 제조) 및 1배 농도의 첨부 dNTP를 포함하는 반응액에 인간 말초혈 단핵구 유래 단일쇄 cDNA 25 ng, 0.2 μmol/L cd27fw(서열 번호 3), 0.2 μmol/L cd27809B(서열 번호 4) 및 1배 농도의 어드밴티지 2 PCR 폴리메라제 믹스(클론테크사 제조)를 사용하여 합계 50 μL로서 PCR 반응을 행하였다. 반응 조건은 98 ℃에서 15초간, 68 ℃에서 30초간의 사이클을 30 사이클 행하였다. 상기 반응액을 2 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 약 1 kbp의 PCR 산물을 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR-2.1 벡터에 삽입하였다. PCR 증폭 단편이 삽입된 플라스미드를 사용하여 대장균을 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 제조하여 DNA 서열을 확인한 결과, 서열 번호 1에 기재된 DNA 서열을 갖는 pCR 2.1 CD27을 취득하였다(도 1).
(2) 인간 CD27 세포 외 도메인을 갖는 유전자를 클론화한 플라스미드의 구축
이어서, 이하에 나타내는 PCR 반응을 행함으로써 C 말단측에 존재하는 막 관통 영역을 제거한 CD27을 코딩하는 cDNA의 단리를 행하였다. 0.2 mmol/L dNTPs, 1 mmol/L 염화마그네슘을 포함하는 반응액에 1 ng의 pCR 2.1 CD27, 1 μmol/L CD27-A(서열 번호 5), 1 μmol/L CD27-B(서열 번호 6) 및 2.5 단위의 KOD 폴리메라제(도요보사 제조)를 사용하여, 합계 50 μL로서 98 ℃에서 15초간, 68 ℃에서 30초간의 사이클을 25 사이클의 조건으로 PCR 반응을 행하였다. 상기 반응액을 2 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 약 600 bp의 PCR 산물을 제로 블런트 PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR-블런트 벡터에 도입하였다. 본 인간 CD27 세포 외 도메인을 갖는 유전자를 클론화한 플라스미드를 pCRCD27axb로 하였다(도 2).
(3) 변이형 인간 IgG4Fc 영역을 갖는 벡터 pBShCγ4SP의 구축
WO97/10354에 기재된 야생형 인간 IgG4 서브 클래스의 C 영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 플라스미드 pBShCγ4를 사용하여, 야생형 인간 IgG4 서브 클래스의 C 영역(힌지 영역)의 108번째의 Ser이 Pro로 치환된 변이형 인간 IgG4 서브 클래스의 C 영역을 갖는 플라스미드 pBShCγ4SP를 구축하였다. 본 개변을 행함으로써 IgG 힌지 영역을 통한 2량체 형성이 안정화된다는 것이 알려져 있다(문헌 [molecular immnology, 30, 105, 1993]). 주형으로서 플라스미드 pBShCγ4의 1 ng을 포함하는 50 μL의 반응액[10 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50 mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화마그네슘, 0.001 ％ 젤라틴, 200 μM dNTPs, 0.5 μM 프라이머 1(서열 번호 7), 0.5 μM 프라이머 2(서열 번호 8) 및 2 유닛의 다카라 Ex Taq DNA 폴리메라제]을 제조하고, GeneAmp PCR 시스템 9700(퍼킨 엘머사 제조)을 사용하여 94 ℃에서 2분간, 55 ℃에서 2분간, 72 ℃에서 2분간의 사이클을 30 사이클 행하였다. 반응액을 QIAquick PCR 퓨리케이션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 정제한 후, 제한 효소 EcoT14I(다카라 바이오사 제조)로 처리하고, 0.8 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, QIA 퀵 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 증폭 단편을 회수하였다. 플라스미드 pBShCγ4를 제한 효소 EcoT14I로 절단한 후, 알칼리성 포스파타아제(다카라 바이오사 제조) 처리에 의해 5' 말단의 인산을 제거하고, 마찬가지로 0.8 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, QIA 퀵 겔 익스트랙션 키트를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 플라스미드 단편을 회수하였다. 회수한 증폭 단편과 플라스미드 pBShCγ4 유래의 플라스미드 단편을 연결하여, 목적으로 하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pBShCγ4SP를 구축하였다(도 3).
(4) 인간 IgG4Fc의 부분 서열을 포함하는 cDNA의 클로닝
이하에 나타내는 PCR 반응을 행함으로써, 5' 말단에 제한 효소 BamHI 부위, 3' 말단에 SalI 제한 효소를 갖는 인간 IgG4Fc를 코딩하는 DNA 단편을 증폭하였다. 0.2 mmol/L dNTPs, 1 mmol/L 염화마그네슘을 포함하는 반응액에 상기 (3)에서 구축한 pBShCγ4SP 25 ng, 1 μmol/L g4A(서열 번호 9), 1 μmol/L g4B(서열 번호 10) 및 2.5 단위의 KOD 폴리메라제(도요보사 제조)를 사용하여, 합계 50 μL로서 PCR 반응을 행하였다. 반응 조건은 98 ℃에서 15초간, 68 ℃에서 30초간의 사이클을 25 사이클로 행하였다. 상기 반응액을 2 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 약 700 bp의 PCR 산물을 제로 블런트 PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR-블런트 벡터에 도입하였다. 본 플라스미드를 pCRIgG4FcBamHISalI(도 4)로 하였다.
(5) 동물 세포용 발현 벡터 pKANTEX XhoI/SalI의 구축
WO97/10354에 기재되어 있는 인간화 항체 발현 벡터 pKANTEX93을 제한 효소 XhoI(다카라 바이오사 제조) 및 제한 효소 SalI(다카라 바이오사 제조)로 소화한 후, 0.8 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리하고, 겔 익스트랙션 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 약 9.8 kbp의 플라스미드 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편의 5' 및 3' 말단을 DNA 라이게이션 키트(다카라 바이오사 제조)를 사용하여 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요 보세키사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 복수의 암피실린 내성 콜로니로부터, QIA 프렙 스핀 미니프렙 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 재조합 플라스미드 DNA를 단리하고, 항체 L쇄의 발현 유닛이 제거된 것을 제한 효소 NotI(다카라 바이오사 제조) 및 KpnI(다카라 바이오사 제조) 소화에 의해 확인하였다. 상기 플라스미드를 pKANTEX XhoI/SalI로 명명하였다(도 5).
(6) 가용형 CD27 세포 외 도메인 발현 플라스미드 pKANTEX CD27IgG4Fc의 제작
상기 (2)에서 제작한 pCR 2.1 CD27axb를 NotI 및 BamHI를 사용하여 소화함으로써 얻어지는 약 600 bp의 단편, 및 상기 (3)에서 제작한 pCRIgG4FcBamHISalI를 BamHI 및 SalI 소화하여 얻어지는 약 700 bp의 DNA 단편을, 상기 (5)에서 얻어진 pKANTEX XhoI/SalI를 NotI 및 SalI 소화하여 얻어지는 약 8.8 kbp의 DNA 단편에 연결함으로써, CD27-Fc를 발현하기 위한 플라스미드 pKANTEX CD27IgG4Fc를 얻었다(도 6). 본 플라스미드에 코딩되는 가용형 CD27-Fc 융합 단백질(이하, CD27-Fc로 기재하는 경우도 있음)의 유전자 서열을 서열 번호 11에, 아미노산 서열을 서열 번호 12에 기재하였다. 상기 발현 벡터를 사용하여 형질 전환한 대장균을 100 mL의 LB 배지에 파종하고, 밤새 배양을 행한 후에 회수하여 Qia 필터 플라스미드 미디 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 플라스미드를 정제하였다. 정제 후, 30 μg의 플라스미드 벡터를 제한 효소 AatII 소화에 의해 선상화하였다. 선상화한 후 페놀ㆍ클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하고, 1/10 농도 TE 버퍼(1 mM 트리스 HCl, 0.1 mM EDTA)에 용해한 후, DNA 농도를 측정하고, 유전자 도입에 사용하였다.
(7) CD27-Fc의 발현
CHO/DG44 세포(문헌 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)], 이하 DG44라고 함) 또는 Lec8 세포로의 CD27-Fc 발현 플라스미드 pKANTEX CD27IgG4Fc의 도입은, 전기 천공법(문헌 [사이트 테크놀로지, 3, 133 (1990)])에 준하여 이하의 절차로 행하였다. 우선, 기본 배지[10 ％ 소 태아 투석 혈청(인비트로젠사) 및 50 μg/mL 젠타마이신(나카라이테스크사) 및 1×HT 서플리먼트(인비트로젠사 제조)를 첨가한 이스코브 변형 둘베코 배지(인비트로젠사)로 계대한 DG44 세포를 K-PBS 완충액[137 mmol/L KCl, 2.7 mmol/L NaCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4, 4.0 mmol/L MgCl2]에 현탁하여 8×106개/mL로 함으로써 세포 현탁액을 제조하였다. 제조한 세포 현탁액 200 μL(1.8×106개)를 상기 (6)에서 제조한 선상화 플라스미드 pKANTEXCD27IgG4Fc 10 μg과 혼화하였다. 단, Lec8 세포의 계대는 1×HT 서플리먼트를 첨가하지 않는 기본 배지(이하, HT-배지라고 함)로 행하였다. 상기 세포 DNA 혼화액을 진 펄서 큐벳(전극 사이 거리 2 mm)(바이오래드사)으로 옮긴 후, 유전자 도입 장치 진 펄서(바이오래드사)를 사용하여 펄스 전압 0.35 KV, 전기 용량 250 μF의 조건으로 유전자 도입을 행하였다. 상기 세포 현탁액을, HT-배지[10 ％ 소 태아 투석 혈청(인비트로젠사 제조) 및 50 μg/mL 젠타마이신(나카라이테스크사)을 첨가한 이스코브 변형 둘베코 배지(인비트로젠사 제조)] 10 mL에 혼화하고, 75 cm2 접착 세포용 플라스크(그레이너사 제조)에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 인큐베이터 내에서 배양을 행하였다. 3일간 배양한 후, G418(시그마사 제조)을 최종 농도가 0.5 mg/mL가 되도록 첨가하고, 10일간 배양하였다. 10일 후, 182 cm2 접착 세포용 플라스크(그레이너사 제조)로 계대하고, 전면성장(confluent)이 될 때까지 배양을 계속하였다. 전면성장이 된 시점에 무혈청 배지 EXCELL301(JRH 바이오사이언스사 제조)로 배지 교환을 행하여 1주일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하고, 하기에 기재된 방법으로 정제를 행하였다.
(8) CD27-Fc의 정제
(7)에서 배양을 행한 배양 상청을 3000 rpm, 4 ℃의 조건으로 10분간의 원심 분리를 행하고, 상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 공경 PES 멤브레인(아사히 테크노 글라스사 제조)을 사용하여 상청을 여과하였다. 0.8 cm 직경의 칼럼에 Mab 셀렉트(아머샴 파마시아 바이오테크사 제조) 0.5 mL를 충전하고, 정제수 3.0 mL 및 0.2 M 붕산-0.15 M NaCl 완충액(pH 7.5)(이하, 붕산 버퍼라고 함) 3.0 mL를 순차적으로 통탑(通塔)하였다. 또한, 0.1 M 시트르산 완충액(pH 3.5) 2.0 mL 및 붕산 버퍼 1.5 mL로 순차적으로 세정함으로써 담체의 평형화를 행하였다. 이어서, 상기 배양 상청을 칼럼에 통탑한 후, 붕산 버퍼 3.0 mL로 세정하였다. 세정한 후, 0.1 M 시트르산 완충액(pH 3.5) 1.25 mL를 사용하여 담체에 흡착한 항체의 용출을 행하였다. 용출은 250 μL씩 5분획으로 나누어 취득하였다. 이어서, 얻어진 정제 분획의 SDS-PAGE 해석을 행하고, 목적 단백질의 용출이 확인된 분획을 통합하여 PBS 버퍼를 사용하여 4 ℃에서 밤새 투석을 행하였다. 투석 후 CD27-Fc 용액을 회수하고, 0.22 ㎛ 공경 밀렉스 GV(밀리포어사)를 사용하여 멸균 여과한 후, 280 nm의 흡광도(OD 280 nm)를 흡광 광도계(시마쯔 UV-1700)를 사용하여 측정하고, CD27-Fc 농도를 산출하였다(OD 280 nm=1.0, 0.68 mg/mL로 환산; εM=134655, MW=92840으로부터 산출하였음). 각 숙주 세포에서 유래하는 CD27-Fc 발현 세포, 약 300 mL의 무혈청 배양액 상청으로부터 Lec8 유래 CD27-Fc를 3.6 mg, CHO/DG44 유래 CD27-Fc를 2.2 mg 얻었다. 각각의 단백질에 대하여, 용출 분획의 SDS-PAGE에서의 해석 결과를 도 7에 나타낸다.
그 결과, 환원 조건하에서는 DG44를 숙주로 한 경우에는 분자량 약 65 kDa, Lec8을 숙주로 한 경우에는 분자량 약 48 kDa의 위치에 CD27-Fc가 관찰되었다. 한편, 비환원 조건에서는, 환원 조건에서 관찰되었던 밴드의 약 2배의 분자량을 나타내는 위치에 각각의 밴드가 관찰되었기 때문에, CD27-Fc는 2량체로서 존재한다는 것을 확인할 수 있었다.
(9) 당쇄 구조의 확인
상기 (8)에서 정제한 CD27-Fc를 PBS로 10배로 희석한 용액 16 μL에 5배 농도의 SDS 샘플 버퍼 4 μL를 첨가한 후, 90 ℃에서 5분간 처리한 것을 SDS-PAGE에 사용하였다. 전기 영동은 5-20 ％ SDS-폴리아크릴아미드겔 e-PAGEL(ATTO사 제조, Cat.No.E-T520L)을 사용하고, ATTO 라피더스ㆍ미니 슬라브 전기 영동조에서 20 mA/매의 전류로 90 분간 전기 영동하였다. PVDF막(밀리포어 임모빌론사 제조, Cat.No.IPVH304F0)으로의 전사는 ATTO 호라이즈 블롯을 사용하고, 180 mA, 90분간의 조건으로 행하였다. 전사 후의 막은 10 ％ BSA를 포함하는 PBS(이하, 10 ％ BSA-PBS로 표기함)에 침지하고, 4 ℃에서 밤새 정치함으로써 블록킹하였다. 그 후, 1 ％ BSA-PBS를 사용하여 5 μg/mL로 제조한 항RCAS1 항체 클론 22-1-1(MBL사 제조, Cat.No.D060-3)을 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 반응하였다. 0.05 ％ 트윈-20-PBS(와꼬 쥰야꾸사 제조, Cat.No.167-11515)를 사용하여 실온에서 30분간 세정한 후, 1 ％ BSA-PBS로 2000배 희석한 2차 항체 퍼옥시다아제 표지 토끼 항마우스 면역 글로불린(DAKO사 제조, Cat.No.P 0161)으로 실온에서 1 시간 동안 반응하였다. 0.05 ％ 트윈-20-PBS를 사용하여 실온에서 30분간 세정한 후, ECL 웨스턴 블로팅 디텍션 리에이전트(아머샴 파마시아 바이오테크사 제조, Cat.No.RPN2106)를 사용하여 검출하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
SDS-PAGE 해석의 결과로부터, DG44 유래 CD27-Fc의 분자량은 Lec8 유래 CD27-Fc보다도 분자량이 크고, DG44 세포와 Lec8 세포를 숙주 세포로 함으로써 CD27-Fc에 결합하는 당쇄 구조가 상이하다는 것이 분명해졌다.
또한, 항RCAS1 항체 22-1-1은 O 결합형 당쇄인 Tn 항원을 인식한다는 것이 분명하며, 항Tn 항체로서 알려져 있다(문헌 [J.B.C., 278, 22998-23007, (2003))]). 항Tn 항체인 항RCAS-1 항체 클론 22-1-1은 DG44 유래 CD27-Fc에는 전혀 결합하지 않지만, Lec8 유래의 CD27-Fc에는 특이적으로 결합하였다. Lec8에서 생산한 CD27-Fc에는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O형 당쇄인 Tn 항원이 결합되었다는 것이 확인되었다.
실시예 2
세포막 위에 CD27을 발현하는 CHO 세포의 조성
(1) CD27 발현 플라스미드 pKANTEX CD27의 구축
실시예 1에서 제작한 pCR 2.1 CD27로부터, 유전자 발현에 불필요한 cDNA 부분을 제거한 cDNA 단편을 이하에 나타내는 PCR 반응에 의해 제작하였다.
0.2 mmol/L dNTPs, 1 mmol/L 염화마그네슘을 포함하는 반응액에 1 ng의 pCR 2.1 CD27, 1 μmol/L CD27-A(서열 번호 5), 1 μmol/L CD27-C(서열 번호 13) 및 2.5 단위의 KOD 폴리메라제(도요보사 제조)를 사용하여, 합계 50 μL로서 PCR 반응을 행하였다. 반응 조건은 98 ℃에서 15초간, 68 ℃에서 30초간의 사이클을 25 사이클로 행하였다. 상기 반응액을 2 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 약 800 bp의 PCR 산물을 제로 블런트 PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR-블런트 벡터에 도입하고, 서열 번호 1에 기재된 DNA 서열을 갖는 pCR27axc를 취득하였다(도 9). 이어서, pCR27axc를 제한 효소 NotI 및 제한 효소 SalI로 소화하여 얻어지는 약 780 bp의 DNA 단편을, 실시예 1에서 제작한 pKANTEX XhoI/SalI를 제한 효소 NotI 및 제한 효소 SalI로 소화하여 얻어지는 약 8.9 kbp의 DNA 단편에 연결함으로써 CD27을 발현하기 위한 플라스미드 pKANTEX CD27을 구축하였다(도 10). 본 플라스미드에 코딩되는 CD27 유전자 서열을 서열 번호 1에, 상기 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타내었다. 상기 발현 벡터를 사용하여 형질 전환한 대장균을 100 mL의 LB 배지에 파종하고, 밤새 배양을 행하였다. 배양 후에 균체를 회수하고, Qia 필터 플라스미드 미디 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 플라스미드를 정제하였다. 정제 후, 30 μg의 플라스미드 벡터를 제한 효소 AatII 소화에 의해 선상화하였다. 선상화한 후, 페놀ㆍ클로로포름 추출, 에탄올 침전을 행하고, 1/10 농도 TE 버퍼(1 mM 트리스 HCl, 0.1 mM EDTA)에 용해한 후, 농도를 측정하고, 유전자 도입을 행하였다.
(2) CD27 발현 플라스미드 pKANTEX CD27의 도입
상기 (1)에서 제작한 CD27 발현 플라스미드 pKANTEX CD27을 Lec8 세포 및 CHO/DG44 세포에 유전자 도입함으로써, CD27을 발현하는 Lec8 세포 및 DG44 세포의 수립을 행하였다. 도입하는 플라스미드로서 pKANTEXCD27을 사용한 것 이외에는, 실시예 1에 기재된 방법으로 실시하였다. 단, 유전자 도입 후의 세포는 HT-배지 30 mL에 현탁하고, 100 μL/웰이 되도록 3매의 96 웰 플레이트에 파종하였다. 파종 2일 후에 500 μg/mL G418을 포함하는 계대용 배지로 교환하고, 10일간 배양을 행하였다. 10일 후 50 nM MTX(시그마 알드리치사 제조)를 포함하는 HT-배지로 교환하고, MTX 내성주를 취득하였다. Lec8주에서 유래하는 CD27 발현주를 CD27/Lec8-4, DG44 세포에서 유래하는 CD27 발현 세포를 CD27/DG44-8로 명명하였다.
(3) CD27 발현 세포의 확인
(2)에서 제작한 CD27 발현 세포의 CD27 발현을 확인하기 위해, 흐름 세포측정기(FCM)를 사용하여 하기와 같이 해석을 행하였다.
CD27 발현 세포 1 내지 5×106개를 15 mL 튜브(벡톤 디킨슨사 제조)에 분취하고, 원심 분리(1500 rpm, 5분간)한 후, 상청을 제거하고, 50 μL의 1 ％ 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS 완충액(이하, 1 ％ BSA-PBS(코진 바이오사 제조)로 기재함)에 현탁하였다. 1차 항체로서 PC5로 표지된 항CD27 마우스 모노클로날 항체(벡크만 콜터사 제조, Cat.No.6607107), 또는 PC5 표지 마우스 IgG1 아이소타이프 컨트롤(벡크만 콜터, Cat.No.6607012)을 10 μL 첨가하고, 빙온(氷溫) 중에서 60분간 반응시켰다. 반응 후 1 mL 의 1 ％ BSA-PBS로 2회 세정한 후, 500 μL의 1 ％ BSA-PBS에 세포를 현탁하고, 흐름 세포측정기(FCM)(벡톤 디킨슨사 제조)로 형광 강도를 측정하였다.
그 결과를 도 11에 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, CD27/Lec8-4 및 CD27/DG44-8은 거의 동일한 정도의 CD27을 세포막 위에 발현한다는 것이 확인되었다.
실시예 3
갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27에 대한 모노클로날 항체(이하, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체라고 함)의 제작
(1) 면역원의 제조
실시예 1에서 얻어진 Lec8주 생산 CD27-Fc 50 μg을 수산화알루미늄 아주반트(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99, 1988]) 2 mg 및 백일해 백신(치바켄 켓세이 겡뀨쇼 제조) 1×109 세포와 함께 4주령 암컷 SD 래트 3마리에 투여하였다. 투여 2주일 후로부터, Lec8주 생산 CD27-Fc 50 μg을 1주일에 1회, 합계 3회 투여하였다. 미정맥으로부터 부분 채혈하고, 얻어진 항혈청의 결합 활성을 ABI8200 세포 검출 시스템(어플라이드 바이오사 제조) 또는, 흐름 세포측정기(사이토믹스 FC500 MPL, 벡크만 콜터사 제조)를 사용한 형광 세포 염색법에 의해 측정하고, 충분한 항체가를 나타낸 마우스로부터 최종 면역 3일 후에 비장을 적출하였다. 비장을 MEM(Minimum Essential Medium) 배지(닛스이 세이야꾸사 제조) 중에서 가늘게 절단하고 핀셋으로 풀어 원심 분리(1200 rpm, 5분간)하였다. 얻어진 침전 분획에 트리스-염화암모늄 완충액(pH 7.6)을 첨가하고, 1 내지 2분간 처리함으로써 적혈구를 제거하였다. 얻어진 침전 분획(세포 분획)을 MEM 배지로 3회 세정하여, 세포 융합에 사용하였다.
(2) 바인딩 ELISA
바인딩 ELISA에 사용하는 항원에는, 실시예 1에서 얻어진 Lec8주 생산 CD27-Fc 및 DG44 세포 생산 CD27-Fc를 각각 사용하였다. 96 웰의 ELISA용 플레이트(그레이너사)에 상기한 CD27-Fc 단백질을 5 μg/mL, 50 μL/웰로 분주하고, 4 ℃에서 밤새 방치하여 흡착시켰다. 상기 플레이트를 세정한 후, 1 ％ BSA-PBS를 100 μL/웰로 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 방치하고, 남아 있는 활성기를 블록하였다. 방치 후 1 ％ BSA-PBS를 버리고, 상기 플레이트에 1차 항체로서 피면역 동물 항혈청 또는 하이브리도마 배양 상청을 50 μL/웰로 분주하고, 2 시간 동안 방치하였다. 상기 플레이트를 0.05 ％ 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트[(ICI사 상표 트윈 20 상당품: 와꼬 쥰야꾸사 제조)]-PBS(이하 트윈-PBS로 표기)로 세정한 후, 2차 항체로서 퍼옥시다아제 표지 토끼 항래트 면역 글로불린(지메드사)을 50 μL/웰로 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 상기 플레이트를 트윈-PBS로 세정한 후, ABTS[2.2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸-6-술폰산)암모늄] 기질액[1 mmol/L ABTS-0.1 mol/L 시트르산 버퍼(pH 4.2), 0.1 ％ H2O2]을 첨가하고, 발색시켜 OD 415 nm의 흡광도를 플레이트 리더(이맥스; 몰레큘러 디바이스사)를 사용하여 측정하였다.
(3) 형광 세포 염색법(ABI8200 세포 검출 시스템 해석)
실시예 2에서 제작한 CD27/Lec8-4 및 CD27/DG44-8을 분석용 세포로서 사용하였다. 50 nM MTX 및 500 ng/mL G418을 첨가한 계대용 배지로 계대한 CD27/Lec8-4 및 CD27/DG44-8을 0.05 ％ 트립신 용액(인비트로젠사 제조)으로 박리하고, ABI8200용 흑색 96 웰 플레이트에 1×104개/100 μL 배지/웰로 파종하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 플레이트에 1차 항체로서 피면역 래트 항혈청 또는 하이브리도마 배양 상청을 10 μL/웰로 분주하고, 2차 항체로서 ALEXA647 표지 항래트 면역 글로불린 G(H+L)(인비트로젠사 제조)를 100 μL/웰로 첨가하여 차광하에 4 시간 동안 방치하였다. 레이저광 633 He/Ne로 여기된 650 내지 685 nm의 형광을 ABI8200 세포 검출 시스템(어플라이드 바이오사 제조)으로 측정하였다.
(4) 형광 세포 염색법(흐름 세포측정기 해석)
실시예 2에서 제작한 CD27/Lec8-4 및 CD27/DG44-8을 분석용 세포로서 사용하였다. 50 nM MTX 및 500 μg/mL G418을 첨가한 HT-배지를 사용하여 계대한 CD27/Lec8-4 및 CD27/DG44-8을 0.02 ％ EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)을 사용하여 박리한 후, 각 세포를 PBS로 세정하였다. 세정 후 1 내지 5×105개의 세포를 50 μL의 1 ％ BSA-PBS에 현탁한 후, 1차 항체로서 피면역 래트 항혈청 또는 하이브리도마 배양 상청을 50 μL/웰로 분주하고, 빙온 중에서 30분간 반응시켰다. 또한, 네가티브 컨트롤로서 소 혈청 알부민, 마우스 IgG1 아이소타이프 컨트롤(코스모 바이오사 제조) 및 래트 IgG2a 아이소타이프 컨트롤(코스모 바이오사 제조)을, 포지티브 컨트롤로서 항RCAS1 항체 22-1-1(MBL사 제조) 및 항CD27 마우스 모노클로날 항체(벡크만 콜터사 제조)를 사용하여 동시에 반응시켰다. 반응 후 PBS를 사용하여 원심 분리를 2회 행하여 세포를 세정하고, 2차 항체로서 ALEXA488 표지 항래트 면역 글로불린 G(H+L)(인비트로젠사 제조)를 50 μL/웰로 첨가하여 빙온 중 차광하에 30분간 반응시켰다. 다시 PBS를 사용하여 원심 분리를 2회 행하여 세포를 세정한 후, 500 μL의 1 ％ BSA-PBS에 현탁하여 레이저광 488 nm 아르곤으로 여기되는 510 내지 530 nm의 형광을 흐름 세포측정기(벡크만 콜터사 제조, 사이토믹스 FC500 MPL)로 측정하였다.
(5) 마우스 골수종 세포의 제조
8-아자구아닌 내성 마우스 골수종 세포주 P3X63Ag8U.1(P3-U1: ATCC로부터 구입)을 정상 배지(10 ％ FCS RPMI 배지)에서 배양하고, 세포 융합시에 2×107개 이상의 세포를 확보하고, 세포 융합에 친주(親株)로서 사용하였다.
(6) 하이브리도마의 제작
상기 (1)에서 얻어진 마우스 비장 세포와 상기 (5)에서 얻어진 골수종 세포를 10:1이 되도록 혼합하고, 원심 분리(250×g, 5분간)하였다. 얻어진 침전 분획의 세포군을 푼 후, 교반하면서 37 ℃에서 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000) 1 g, MEM 배지 1 mL 및 디메틸술폭시드 0.35 mL의 혼액을 108개의 마우스 비장 세포당 0.5 mL 첨가하고, 상기 현탁액에 1 내지 2분간마다 MEM 배지 1 mL를 수회 첨가한 후, MEM 배지를 첨가하여 전량이 50 mL가 되도록 하였다.
상기 현탁액을 원심 분리(900 rpm, 5분간)하고, 얻어진 침전 분획의 세포를 천천히 푼 후, 상기 세포를 메스피펫에 의해 흡입 흡출하고, 천천히 HAT 배지[10 ％ 소 태아 혈청 첨가 RPMI 배지에 HAT 미디어 서플리먼트(인비트로젠사 제조)를 첨가한 배지] 100 mL 중에 현탁하였다. 상기 현탁액을 96 웰 배양용 플레이트에 200 μL/웰씩 분주하고, 5 ％ CO2 인큐베이터 중 37 ℃에서 8 내지 10일간 배양하였다. 배양 후, 배양 상청을 상기 (3) 및 상기 (4)에 기재한 형광 세포 염색법을 이용하여 CD27/Lec8-4에 반응하고, CD27/DG44-8 및 Lec8 세포에 반응하지 않는 웰을 선택하여, 이 웰에 포함되는 세포로부터 한계 희석법에 의한 클로닝을 2회 행하여 단세포 클론을 취득하였다.
그 결과, 당쇄 부전 CD27에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 KM4030 또는 KM4031을 생산하는 하이브리도마 KM4030 및 KM4031을 확립하였다(도 12). 동일한 방법에 의해, 당쇄 부전 CD27에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체 KM4026, KM4027 또는 KM4028을 생산하는 하이브리도마 KM4026, KM4027 및 KM4028을 확립하였다.
이들 당쇄 부전 CD27에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 당쇄 합성 경로에 관련된 효소, 수송 단백질의 활성이 결손되지 않은 DG44주 및 UDP-갈락토오스 트랜스포터의 활성이 저하 또는 결손된 Lec8주를 이용함으로써, 정상 당쇄 CD27 및 당쇄 부전 CD27을 각각 발현시킨 재조합 세포를 제작하고, 정상 당쇄 CD27 발현 세포나 Lec8주에는 결합하지 않고, 당쇄 부전 CD27 발현 세포에만 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 스크리닝하는 것이 가능한 계를 발견하여, 약 6000 웰 규모의 스크리닝 분석을 행함으로써 취득하였다.
(7) 모노클로날 항체의 정제
프리스탄 처리한 7주령 누드 암컷 마우스(ICR)에 상기 (6)에서 얻어진 하이브리도마주를 5 내지 20×106 세포/마리 복강 내 주사하였다. 10 내지 21일 후, 하이브리도마가 복수암화됨으로써 복수가 괸 마우스로부터 복수를 채취(1 내지 8 mL/마리)하였다. 상기 복수를 실린지 필터(공경 5 ㎛)를 사용하여 여과하고, 고형분을 제거하였다. 정제 IgG 모노클로날 항체는, 카프릴산 침전법(문헌 [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)])에 의해 정제함으로써 취득하였다. 모노클로날 항체의 서브 클래스의 결정은, 서브 클래스 타이핑 키트(래트 모노클로날 안티바디 이소타이핑 키트, DS 파마 바이오 메디칼사 제조)를 사용한 바인딩 ELISA에 의해 행하였다. 그 결과 각 항체의 서브 클래스는, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026은 래트 IgG2a 클래스, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4027은 래트 IgG2b 클래스, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4028은 래트 IgG1 클래스, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030은 래트 IgG2a 클래스 및 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4031은 래트 IgG1 클래스라는 것이 분명해졌다.
실시예 4
항당쇄 부전 CD27 특이적 모노클로날 항체의 반응성의 검토
하기에 나타내는 경합 ELISA계를 사용하여 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030 및 KM4031의 반응 특이성의 검토를 행하였다. 실시예 1에서 얻어진 Lec8주 생산 CD27-Fc를 5 μg/mL의 농도로 96 웰의 ELISA 플레이트(그레이너사 제조)에 50 μL/웰로 분주하고, 4 ℃에서 밤새 방치하여 흡착시켰다. 상기 플레이트를 세정한 후, 1 ％ BSA-PBS를 200 μL/웰로 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 방치하고, 남아 있는 활성기를 블록하였다. 방치 후 1 ％ BSA-PBS를 버리고, 상기 플레이트에 1차 항체로서 희석한 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030 정제 항체 또는 KM4031 정제 항체를 50 μL/웰로 분주하였다. 동시에, 결합 경합 물질로서 Lec8 생산 CD27-Fc 단백질, DG44 생산 CD27-Fc 단백질 또는 인간 면역 글로불린을 20, 2, 0.2, 0.02 μg/mL의 농도로 첨가하고, 항체와 결합 경합 물질을 공존시켰다. 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 방치한 후, 0.05 ％ 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄모노라우레이트[(ICI사 상표 트윈 20 상당품: 와꼬 쥰야꾸사 제조)]-PBS(이하 트윈-PBS로 표기)로 세정한 후, 2차 항체로서 퍼옥시다아제 표지 토끼 항래트 면역 글로불린(지메드사 제조)을 50 μL/웰로 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 방치하였다. 상기 플레이트를 트윈-PBS로 세정한 후, ABTS[2.2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸-6-술폰산)암모늄] 기질액[1 mmol/L ABTS-0.1 mol/L 시트르산 버퍼(pH 4.2), 0.1 ％ H2O2]을 첨가하여 발색시킨 후, OD 415 nm의 흡광도를 플레이트 리더(이맥스; 몰레큘러 디바이스사)를 사용하여 측정하였다.
도 13에 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030 및 KM4031의 경합 ELISA의 결과를 나타낸다. 그 결과, DG44 생산 CD27-Fc 및 인간 면역 글로불린은, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030 및 KM4031과 Tn 항원 결합 CD27-Fc의 결합을 저해하지 않았지만, Tn 항원 결합 CD27-Fc는 저해한다는 것이 분명해졌다. 또한, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027 및 KM4028에 대해서도 동일한 결과가 얻어졌다. 이상의 점으로부터, 본 발명의 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 및 KM4031은 당쇄 부전 CD27을 특이적으로 인식한다는 것이 분명해졌다.
도 28(A) 및 (B)에 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 및 KM4031의 비아코어에 의한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 당쇄 부전 CD27-Fc로의 결합 활성을 평가한 결과를 나타낸다. 결합 활성의 측정은, 비아코어 T100(GE 헬스 케어 바이오 사이언스사 제조)을 사용하고, 표면 플라즈몬 공명법(SPR법)을 이용하여 행하였다.
항인간 IgG4 항체(파미젠사 제조)를, 아민 커플링 키트(비아코어사 제조)를 사용하여 첨부 프로토콜에 따라 아민 커플링법에 의해 CM5 센서칩(GE 헬스 케어 바이오 사이언스사 제조)에 고정화하였다. 실시예 1의 (7)에서 얻어진 DG44 생산 CD27-Fc에 대하여 프로자임 글리코 엔지매틱 디글리코실레이션 키트(프로자임사 제조) 및 Pro O-링크 익스텐더 디글리코실레이션 플러스(프로자임사 제조)의 시알리다아제 A 또는 β(1-4)갈락토시다아제를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 당쇄 소화 효소 처리를 행한 Tn 항원형 CD27-Fc 또는 시알릴 Tn 항원형 CD27-Fc를 첨가하고, 항인간 IgG4 항체를 고정화한 칩 위에 200-250RU(공명 단위)가 되도록 캡쳐시켰다. 그 후, 20000 ng/mL로 5 단계로 희석한 측정 샘플(항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 및 KM4031)을 30 μL/분의 유속으로 칩 위에 흘리고, 각 농도의 센서그램을 취득하여, 장치에 첨부된 해석 소프트웨어 비아코어 T100 이밸류에이션 소프트웨어(비아코어사 제조)를 사용하여 해석하였다.
그 결과, 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체는 Tn 항원형 CD27-Fc 및 시알릴 Tn 항원형 CD27-Fc에 대하여 결합 활성을 나타낸다는 것이 분명해졌다. 이상의 점으로부터, 본 발명의 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체는, Tn 항원 및 시알릴 Tn 항원에 대하여 모두 결합한다는 것이 분명해졌다.
실시예 5
항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 단리, 해석
(1) 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포로부터의 mRNA의 제조
실시예 3에서 취득한 각 하이브리도마 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 및 KM4031 각각 5×107 내지 1×108개의 세포로부터, RNA 이지 미니 키트(퀴아젠사 제조) 및 올리고텍스TM-dT30<수퍼> mRNA 퓨리케이션 키트(다카라사 제조)를 사용하여, 각각 첨부된 사용 설명서에 따라 각 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체의 mRNA를 제조하였다.
(2) 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체의 H쇄 및 L쇄 가변 영역의 유전자 클로닝
실시예 5의 (1)에서 취득한 모노클로날 항체의 mRNA로부터 BD 스마트 레이스 cDNA 앰플리피케이션 키트(BD 바이오사이언스사 제조)를 사용하여, 첨부된 사용 설명서에 따라 cDNA를 취득하였다. 취득한 cDNA를 주형으로서, 래트 IgG1에 특이적인 프라이머(서열 번호 14), 래트 IgG2a에 특이적인 프라이머(서열 번호 15), 래트 IgG2b에 특이적인 프라이머(서열 번호 16) 또는 래트 CH1에 특이적인 프라이머(서열 번호 17)를 사용하여 각각 PCR 반응을 행하고, 각 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH라고 함)의 cDNA 단편을 증폭하였다. 또한, 항체의 각 서브 클래스 특이적 프라이머 대신에 래트 Ig(κ) 특이적 프라이머 (서열 번호 18) 및 (서열 번호 19)를 사용하여 PCR을 행하고, 각 항체의 경쇄 가변 영역(이하, VL라고 함)의 cDNA 단편을 증폭하였다. KM4026, KM4030, KM4031의 VL 및 VH를 증폭하기 위한 PCR 반응은 어드밴티지 2 PCR 키트(클론테크사 제조)를 사용하고, KM4027, KM4028의 VL 및 VH를 증폭하기 위한 PCR 반응은 KOD 플러스 폴리메라제(도요보사 제조)를 사용하여 각각 첨부된 사용 설명서에 따라 행하였다.
이어서, 클로닝하여 염기 서열을 결정하기 위해 취득한 PCR 산물을 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, KM4026, KM4030, KM4031 유래 PCR 산물은 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하고, KM4027, KM4028 유래 PCR 산물은 시퀀싱을 위한 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여, 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR 벡터에 삽입하였다. PCR 증폭 단편이 삽입된 플라스미드를 사용하여 대장균을 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 제조하여 DNA 서열을 확인하였다. 그 결과, cDNA의 5' 말단에 개시 코돈으로 추정되는 ATG 서열이 존재하는 완전 길이의 VH의 cDNA를 포함하는 플라스미드 및 VL의 cDNA를 포함하는 플라스미드가 취득되었다. 클로닝의 개략을 도 14에 나타내었다.
(3) 항CD27 모노클로날 항체 가변 영역의 유전자 서열의 해석
실시예 5의 (2)에서 얻어진 플라스미드에 포함되는 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 및 KM4031의 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 20 내지 서열 번호 24에, 상기 서열로부터 추정되는 시그널 서열을 포함한 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 25 내지 서열 번호 29에, VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 30 내지 서열 번호 34에, 상기 서열로부터 추정되는 시그널 서열을 포함한 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 35 내지 서열 번호 39에 각각 나타내었다.
또한, 각 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 기지된 항체의 아미노산 서열과 비교함으로써 동정하였다. 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4026의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 40, 서열 번호 41 및 서열 번호 42에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 43, 서열 번호 44 및 서열 번호 45에 각각 나타내었다. 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4027의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 49, 서열 번호 50 및 서열 번호 51에 각각 나타내었다. 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4028의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 52, 서열 번호 53 및 서열 번호 54에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 55, 서열 번호 56 및 서열 번호 57에 각각 나타내었다. 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4030의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 58, 서열 번호 59 및 서열 번호 60에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 63에 각각 나타내었다. 항당쇄 부전 CD27 모노클로날 항체 KM4031의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 64, 서열 번호 65 및 서열 번호 66에, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 67, 서열 번호 68 및 서열 번호 69에 각각 나타내었다.
실시예 6
항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 제작
(1) 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터의 구축
본 발명에서 제작하는 키메라 항체는, 실시예 5의 (3)에서 얻어진 항CD27 래트 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 US97/10354에 개시되어 있는 인간 IgG1의 중쇄 정상 영역 및 인간 κ의 경쇄 정상 영역을 각각 연결한 키메라 항체이다. 방법으로서는, 실시예 5의 (3)에서 얻어진 각 모노클로날 항체의 VL 또는 VH가 포함된 pCR 벡터와, US97/10354에 기재되어 있는 인간 IgG1의 중쇄 정상 영역 및 인간 κ의 경쇄 정상 영역이 포함되는 항체 발현 벡터 pKANTEX93을 사용하여, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터를 이하와 같이 하여 구축하였다(도 15, 도 16, 도 17, 도 18).
KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, KM4031의 VL 또는 VH가 포함되는 pCR 벡터를 주형으로서 10 ng 사용하고, 10×KOD 플러스 버퍼를 2 μL, 2 mmol/L dNTP를 2 μL, 25 mmol/L의 황산마그네슘을 1 μL, KOD 플러스 폴리메라제(도요보사 제조)를 1 μL, 각 항CD27 모노클로날 항체의 VL 및 VH에 특이적인 10 μmol/L의 프라이머를 각각 1 μL씩 포함하는 전량 20 μL로 이루어지는 용액을 제조하였다. 상기 제조 용액을 사용하여 94 ℃에서 5분간 가열한 후, 94 ℃에서 1분간, 68 ℃에서 2분간의 반응을 30 사이클 PCR 반응을 행하였다. KM4026의 VL의 프라이머는 서열 번호 70 및 71, VH의 프라이머는 서열 번호 72 및 73, KM4027의 VL의 프라이머는 서열 번호 74 및 75, VH의 프라이머는 서열 번호 76 및 77, KM4028의 VL의 프라이머는 서열 번호 78 및 79, VH의 프라이머는 서열 번호 80 및 81, KM4030의 VL의 프라이머는 서열 번호 82 및 83, VH의 프라이머는 서열 번호 84 및 85, KM4031의 VL의 프라이머는 서열 번호 86 및 87, VH의 프라이머는 서열 번호 88 및 89에 나타낸다.
각각의 PCR 반응 산물은 1 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 특이적 PCR 증폭 밴드를 회수하여 시퀀싱을 위한 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR 블런트-TOPO 벡터에 삽입하였다. 얻어진 각 항체의 VL은 제한 효소 EcoRI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조) 및 BsiWI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조)를 사용하여 소화하고, VL의 EcoRI-BsiWI 단편을 취득하였다. 또한, 각 항체의 VH는 제한 효소 NotI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조) 및 ApaI(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조)를 사용하여 소화하고, NotI-ApaI 단편을 취득하였다.
항CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, KM4031의 VL의 각 EcoRI-BsiWI 단편과, pKANTEX93을 제한 효소 EcoRI 및 BsiWI로 소화하여 얻어지는 DNA 단편을 라이게이션 하이(도요보사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 연결시켰다. 연결된 DNA 단편을 사용하여 대장균 DH5α(도요보사 제조)를 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 조정하고, BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 FS 레디 리액션 키트(PE 바이오시스템사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 반응한 후, 동사의 시퀀서 ABI 프리즘 3700에 의해 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 항CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, KM4031의 VL을 코딩하는 cDNA가 삽입된 pKANTEX93을 취득하였다. 이어서, 항CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, KM4031의 VH의 각 NotI-ApaI 단편과, 항CD27 모노클로날 항체의 각 VL이 삽입된 pKANTEX93을 제한 효소 NotI 및 ApaI로 소화하여 얻어지는 DNA 단편을 라이게이션 하이(도요보사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 연결시켰다. 연결된 DNA 단편을 사용하여 대장균 DH5α(도요보사 제조)를 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 조정하고, BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 FS 레디 리액션 키트(PE 바이오시스템사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 반응한 후, 동사의 시퀀서 ABI 프리즘 3700에 의해 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 항CD27 모노클로날 항체 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, KM4031의 VL 및 VH를 코딩하는 cDNA가 각각 삽입된 항CD27 키메라 항체 발현 벡터를 취득하였다.
(2) 동물 세포를 사용한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 발현
상기 (1)에서 얻어진 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 발현 벡터를 사용하여 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 동물 세포에서의 발현을 통상법(문헌 [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H.Freeman and Company(1992)])에 의해 행하고, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체(키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031)를 생산하는 형질 전환주를 취득하였다. 발현시키는 동물 세포주로서는, α1,6-푸코실트랜스페라아제(FUT8)의 유전자를 더블 녹아웃한 CHO/DG44 세포주(이하, FUT8 녹아웃 CHO 세포)를 사용하였다. 이 숙주 세포주로 발현시킨 항체의 N-결합형 복합형 당쇄의 코어 부분에는, 푸코오스가 부가되지 않는다는 것이 알려져 있다(WO2002/31140).
(3) 정제 키메라 항체의 취득
상기 (2)에서 얻어진 형질 전환주 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031을 통상적인 배양법으로 배양한 후, 세포 현탁액을 회수하고, 3000 rpm, 4 ℃의 조건으로 20분간의 원심 분리를 행하고, 배양 상청을 회수한 후 0.22 ㎛ 공경 밀렉스 GV 필터를 통해 여과 멸균하였다. 얻어진 배양 상청으로부터, 실시예 1의 (7)과 동일한 방법에 의해 Mab 셀렉트를 사용하여 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031을 정제하였다.
(4) 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 푸코오스 함량 측정
WO2002/31140에 기재된 방법에 따라, 각 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 Fc 영역의 N 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코오스의 1 위치가 α 결합하지 않은 당쇄의 비율을 조사하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
이 결과로부터, 실시예 6의 (3)에서 제작한 키메라 항체에는 푸코오스가 부가되지 않았다는 것이 분명해졌다.
Figure pct00002
실시예 7
항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 활성 평가
이하의 (1) 내지 (3)에서는, 실시예 6에서 얻어진 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031의 활성 평가를 행하였다.
(1) 비아코어에 의한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 인간 당쇄 부전 CD27-Fc로의 결합 활성 평가
항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030의 인간 당쇄 부전 CD27-Fc에 대한 결합 활성을 반응 속도론적으로 해석하기 위해, 표면 플라즈몬 공명법(SPR법)을 이용하여 결합 활성 측정을 행하였다. 이하의 조작은 모두 비아코어 T100(GE 헬스 케어 바이오 사이언스사 제조)을 사용하여 행하였다. 실시예 1의 (7)에서 얻어진 Lec8 유래 CD27-Fc를 아민 커플링법에 의해 CM5 센서칩(GE 헬스 케어 바이오 사이언스사 제조)에 고정화하였다. CD27-Fc를 고정화한 칩에 9 μg/mL로부터 3배 희석으로 단계적으로 희석하여 5 농도로 제조한 측정 샘플(키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031)을 싱글 카이네틱스의 자동 프로그램에 따라 저농도로부터 순서대로 연속 첨가하여 측정하였다. 장치에 첨부된 해석 소프트웨어 비아코어 T100 이밸류에이션 소프트웨어(비아코어사 제조)를 사용하고, 바이밸런트 애널라이트 모델로 해석하여 각 항체의 인간 당쇄 부전 CD27-Fc에 대한 결합 속도 상수 ka 및 해리 속도 상수 kd를 산출하였다.
그 결과, 얻어진 각 항체의 결합 속도 상수 ka1, 해리 속도 상수 kd1 및 해리 상수 KD(kd1/ka1)를 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은 모두 인간 당쇄 부전 CD27-Fc에 대하여 1×10-8 내지 1×10-9 mol/L의 높은 친화성을 나타내었다.
Figure pct00003
(2) 형광 세포 염색법(흐름 세포측정기 해석)에 의한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 반응 특이성 평가
실시예 2와 동일한 방법으로 제작한 CD27/DG44-4 세포, CD27/Lec8-4 세포 및 Lec8 세포를 분석용 세포로서 사용하였다. 500 μg/mL G418 첨가 HT-배지를 사용하여 계대한 CD27/DG44-4 및 50 nmol/L MTX 및 500 μg/mL G 418 첨가 HT-배지를 사용하여 계대한 CD27/Lec8-4를 0.02 ％ EDTA 용액을 사용하여 박리한 후, 각 세포를 PBS로 세정하였다. 세정 후 5×105개의 세포를 50 μL의 1 ％ BSA-PBS에 현탁한 후, 1차 항체로서 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체(키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031)를 0.02, 0.2, 2 및 10 μg/mL로 제조한 항체액을 50 μL/웰로 분주하고, 빙온 중에서 1 시간 동안 반응시켰다. 포지티브 컨트롤로서, 항Tn 항체인 항RCAS1 마우스 항체 22-1-1(MBL사 제조) 및 항CD27 마우스 항체 O323(산타크루즈 바이오테크놀로지사 제조)을 사용하였다. 반응 후 PBS를 사용하여 원심 분리를 2회 행하여 세포를 세정하고, 2차 항체로서 ALEXA 플루오로 488 표지 항인간 면역 글로불린 G(H+L), ALEXA 플루오로 488 표지 항마우스 면역 글로불린 G(H+L) 또는 ALEXA 플루오로 488 표지 항인간 면역 글로불린 M(μ)을 50 μL/웰로 첨가하고, 빙온, 차광하에 30분간 반응시켰다. 다시 PBS를 사용하여 원심 분리를 2회 행하고, 세포를 세정한 후, 500 μL의 1 ％ BSA-PBS에 현탁하여 레이저광 488 nm 아르곤으로 여기되는 510 내지 530 nm의 형광을 흐름 세포측정기(벡크만 콜터사 제조, 사이토믹스 FC500 MPL)로 측정하였다. 도 19(A) 내지 (C)에 결과를 나타낸다.
그 결과, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체는 모두 Lec8 세포 및 CD27/DG44-4 세포에는 결합하지 않았지만, 당쇄 부전 CD27을 발현한 CD27/Lec8-4 세포에만 결합이 관찰되었다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은 세포 표면에 발현하는 당쇄 부전 CD27을 특이적으로 인식한다는 것이 분명해졌다.
(3) 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성)의 평가
실시예 2에서 제작한 CD27/Lec8-4 세포에 대한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031의 ADCC 활성을 이하에 나타내는 방법에 따라 측정하였다.
(3)-1 표적 세포 현탁액의 제조
50 nmol/L MTX 및 500 μg/mL G418 첨가 HT-배지를 사용하여 계대한 CD27/Lec8-4 세포를 0.02 ％ EDTA 용액을 사용하여 박리한 후, PBS로 세정하고, 5 ％ 투석이 완료된 소 태아 혈청(dFBS)(인비트로젠사 제조)을 포함하는 페놀 레드 비함유 RPMI1640 배지(인비트로젠사 제조)(이하, ADCC용 배지라고 함)로 세정하고, 동 배지로 적절한 농도에 이르도록 제조하여 표적 세포 현탁액으로 하였다.
(3)-2 이펙터 세포 현탁액의 제조
말초혈 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)는, 정상인 말초혈로부터 이하에 나타낸 방법에 의해 분리하였다. 헤파린나트륨주 N "시미즈"(시미즈 세이야꾸사 제조)를 0.5 mL 첨가한 실린지를 사용하여, 정상인으로부터 정상인 말초혈 50 mL를 채혈하였다. 15 mL 튜브에 3 mL씩 분주한 모노ㆍ폴리 분리 용액(DS 파마 바이오 메디칼사 제조) 위에 3.5 mL의 채취한 말초혈을 조용히 중층하고, 400×g, 브레이크 오프, 실온의 조건으로 20분간 원심 분리하여 단핵구층을 분리하였다. 이렇게 하여 얻어진 단핵구 분획을 ADCC용 배지를 사용하여 2회 세정하고, 동 배지에 의해 적절한 세포수에 이르게 제조하여 이펙터 세포 현탁액으로 하였다.
(3)-3 ADCC 활성의 측정
LDH-사이토톡식 테스트 와코(Wako사 제조)를 사용하여, 부속 설명서에 따라 이하의 절차로 측정하였다.
96 웰 U 바닥 플레이트(팔콘사 제조)의 각 웰에 각 항체를 30 μg/mL로부터 10배 희석으로 0.003 μg/mL의 농도로 희석한 항체액을 50 μL 분주하고, 이어서 (3)-1에서 제조한 표적 세포 현탁액을 1×104 세포/50 μL/웰로 분주하고, 마지막으로 (3)-2에서 제조한 이펙터 세포 현탁액을 2.5×105 세포/50 μL/웰로 분주하여 전량을 150 μL로 하고, 37 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 따라서, 이펙터 세포(E)와 표적 세포(T)의 비는 25:1로 실험을 행하였다. ADCC 활성은 다음의 수학식 1에 의해 구하였다. 결과를 도 20에 나타낸다.
[수학식 1]
ADCC 활성(％)={([검체의 흡광도]-[표적 세포 자연 유리된 흡광도]-[이펙터 세포 자연 유리된 흡광도])/([표적 세포 전체 유리된 흡광도]-[표적 세포 자연 유리된 흡광도])}×100
그 결과, 항체의 Fc 영역의 N 결합 복합형 당쇄에 코어 푸코오스가 결합하지 않은 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은 모두 CD27/Lec8-4 세포에 대하여 높은 ADCC 활성을 나타내었다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은 모두 당쇄 부전 CD27을 발현한 세포에 대하여 높은 ADCC 활성을 갖는다는 것이 분명해졌다.
(4) 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC 활성)의 평가
실시예 2에서 제작한 CD27/Lec8-4 세포에 대한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031의 CDC 활성을 이하에 나타내는 방법에 따라 측정하였다.
CD27/Lec8-4 세포를 PBS로 세정한 후, 10 ％ dFBS를 포함하는 RPMI1640 배지로 세정하고, 동 배지로 적절한 농도에 이르도록 제조하여 표적 세포 현탁액으로 하였다. 1웰당 5×104개가 되도록 표적 세포 현탁액을 96 웰 평저 플레이트(그레이너사 제조)에 50 μL/웰로 분주하고, 적당한 농도로 제조한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 용액 및 인간 보체(시그마사 제조)를 첨가하여 전량 150 μL/웰로 제조하였다. 또한, 음성 대조로서 항체를 포함하지 않는 반응 웰(0 ％ 세포 상해 활성웰), 양성 대조로서 세포를 포함하지 않는 반응 웰(100 ％ 세포 상해 활성 웰)을 각각 준비하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 인큐베이터에서 2 시간 동안 반응을 행하였다. 반응 종료 후, 각 반응 웰에 15 μL의 WST-1 시약(로슈사 제조)을 첨가하고, 37 ℃에서 4 시간 정도 반응시키고, 각 웰에서의 흡광도(OD 450nm-OD 690nm)를 플레이트 리더(Emax)를 사용하여 측정하였다. 각 웰의 흡광도로부터 이하의 수학식 2를 사용하여 CDC 활성(세포 상해 활성[％])을 산출하였다. 결과를 도 21에 나타낸다.
[수학식 2]
CDC 활성(세포 상해 활성[％])={1-(반응 웰의 흡광도-100 ％ 용균 웰의 흡광도)/(0 ％ 용균 웰의 흡광도-100 ％ 용균 웰의 흡광도)}×100
그 결과, 본 발명에서 취득한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은, 모두 CDC 활성을 나타내었다.
실시예 8
세포막 위에 게잡이 원숭이 CD27을 발현하는 CHO 세포의 조성
(1) 게잡이 원숭이 CD27 유전자의 클로닝
게잡이 원숭이 말초혈 유래 RNA로부터, 이하의 절차로 CD27을 코딩하는 유전자를 단리하였다. 게잡이 원숭이 말초혈로부터 트리졸(인비트로젠사 제조)을 사용하여 단리한 RNA를 주형으로서 3.3 μg 사용하고, 수퍼 스크립트 III 퍼스트 스트랜드 키트(인비트로젠사 제조)에 첨부된 올리고 dT를 1 μL, dNTP 믹스를 1 μL 포함하는 전량 5 μL로 이루어지는 용액을 제조하였다. 상기 제조한 용액을 65 ℃에서 5분간 반응한 후 빙상에서 1분간 급냉하고, 수퍼 스크립트 III 퍼스트 스트랜드 키트에 첨부된 10×RT 버퍼를 2 μL, DTT를 2 μL, RNase OUT을 1 μL, RT를 1 μL 첨가하고, 50 ℃에서 50분간 역전사 반응을 행하였다. 반응 후, 85 ℃에서 5분간 가열하여 역전사 효소를 실활시킨 후, 수퍼 스크립트 III 퍼스트 스트랜드 키트에 첨부된 RNase H를 1 μL 첨가하고, 37 ℃에서 20분간 반응시켜 RNA를 완전히 분해하였다. 본 게잡이 원숭이 말초혈 유래 단일쇄 cDNA는 사용할 때까지 -20 ℃에서 보존하였다.
상기에서 제작한 게잡이 원숭이 말초혈 유래 단일쇄 cDNA를 주형으로서 1.25 μL 사용하고, 10×KOD 플러스 버퍼 2.5 μL, 2 mmol/L dNTP를 2.5 μL, 25 mmol/L의 황산마그네슘을 1 μL, KOD 플러스 폴리메라제(도요보사 제조)를 0.5 μL, 붉은털 원숭이 CD27의 5'측 비번역 영역 서열로부터 설계한 mfCD27_5UTR(서열 번호 90)과 붉은털 원숭이 CD27의 3'측 비번역 영역 서열로부터 설계한 mfCD27_3UTR(서열 번호 91)을 각각 20 pmol씩 포함하는 전량 25 μL로 이루어지는 용액을 제조하였다. 상기 제조 용액을 사용하여 94 ℃에서 5분간 가열한 후, 94 ℃에서 30초간, 68 ℃에서 2분간의 반응을 30 사이클 PCR 반응을 행하였다. 상기 반응액을 1 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 약 800 bp의 PCR 산물을 시퀀싱을 위한 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR 블런트-TOPO 벡터에 삽입하였다. PCR 증폭 단편이 삽입된 벡터를 사용하여 대장균 DH5α(도요보사 제조)를 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 조정하고, BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 FS 레디 리액션 키트(PE 바이오시스템사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 반응한 후, 동사의 시퀀서 ABI 프리즘 3700에 의해 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 게잡이 원숭이 CD27을 코딩하는 cDNA(서열 번호 92)가 클로닝된 플라스미드 pCR mfCD27을 취득하였다(도 22).
(2) 원숭이 CD27 발현 플라스미드 pKANTEX mfCD27His의 구축
C 말단에 His 태그를 부가한 게잡이 원숭이 CD27 발현 벡터 pKANTEX mfCD27His를 이하의 방법으로 제작하였다.
pCR mfCD27을 주형으로서 10 ng 사용하고, 10×KOD 플러스 버퍼를 5 μL, 2 mmol/L dNTP를 5 μL, 25 mmol/L의 황산마그네슘을 2 μL, KOD 플러스 폴리메라제(도요보사 제조)를 1 μL, 100 μmol/L의 mfCD27toKAN_5(서열 번호 93) 및 mfCD27HisKAN_3(서열 번호 94)을 0.2 μL씩 포함하는 전량 50 μL로 이루어지는 용액을 제조하였다. 상기 제조 용액을 사용하여 94 ℃에서 5분간 가열한 후, 94 ℃에서 30초간, 68 ℃에서 2분간의 반응을 30 사이클 PCR 반응을 행하였다. 상기 반응액을 1 ％ 아가로스겔 전기 영동으로 분리한 후, 약 800 bp의 PCR 산물을 시퀀싱을 위한 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 pCR 블런트-TOPO 벡터에 삽입하였다. PCR 증폭 단편이 삽입된 벡터를 사용하여 대장균 DH5α(도요보사 제조)를 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 조정하고, BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 FS 레디 리액션 키트(PE 바이오시스템사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 반응한 후, 동사의 시퀀서 ABI 프리즘 3700에 의해 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, C 말단에 His 태그가 부가된 게잡이 원숭이 CD27을 코딩하는 cDNA(서열 번호 95)가 클로닝된 플라스미드 pCR mfCD27His를 취득하였다(도 23).
pCR mfCD27His를 제한 효소 NotI 및 SalI(다카라 바이오사 제조)로 소화하여 얻어지는 약 800 bp의 DNA 단편과, 실시예 2에서 제작한 pKANTEX CD27을 제한 효소 NotI 및 SalI(다카라 바이오사 제조)로 소화하여 얻어지는 약 10 kbp의 DNA 단편을 라이게이션 하이(도요보사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 연결시켰다. 연결된 DNA 단편을 사용하여 대장균 DH5α(도요보사 제조)를 형질 전환하고, 각 클론으로부터 얻어지는 플라스미드를 조정하고, BigDye 터미네이터 사이클 시퀀싱 FS 레디 리액션 키트(PE 바이오시스템사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 반응한 후, 동사의 시퀀서 ABI 프리즘 3700에 의해 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, C 말단에 His 태그가 부가된 게잡이 원숭이 CD27을 발현하기 위한 플라스미드 pKANTEX mfCD27His를 취득하였다(도 24).
pKANTEX mfCD27His를 사용하여 형질 전환시킨 DH5α(도요보사 제조)를 200 mL의 LB 배지에 파종하고, 밤새 배양을 행하였다. 배양 후에 균체를 회수하고, QIA필터 플라스미드 미디 키트(퀴아젠사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 플라스미드를 정제하였다. 정제한 플라스미드 50 μg을 제한 효소 AatII(뉴 잉글랜드 바이오랩스사 제조) 소화에 의해 선상화하였다.
(3) 원숭이 CD27 발현 플라스미드 pKANTEX mfCD27His의 도입
상기 (2)에서 제작한 게잡이 원숭이 CD27 발현 플라스미드 pKANTEX mfCD27His를 Lec8 세포 및 CHO/DG44 세포에 유전자 도입함으로써, 게잡이 원숭이 CD27을 발현하는 Lec8 세포 및 DG44 세포의 수립을 행하였다. 도입하는 플라스미드로서 pKANTEX mfCD27His를 사용한 것 이외에는, 실시예 1의 (6)에 기재된 방법으로 실시하였다. 단, 유전자 도입 후의 세포는 HT-배지 30 mL에 현탁하고, 100 μL/웰이 되도록 3매의 96 웰 플레이트에 파종하였다. 파종 1일 후에 500 μg/mL G418을 포함하는 계대용 배지로 교환하고, 10일간 배양을 행하여 G418 내성 클론주를 취득하였다. Lec8주 유래의 게잡이 원숭이 CD27 발현주를 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포, DG44 세포 유래의 게잡이 원숭이 CD27 발현 세포를 게잡이 원숭이 CD27/DG44 세포로 기재한다.
실시예 9
항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 원숭이 CD27 단백질로의 교차 반응성 평가
실시예 8에서 제작한 게잡이 원숭이 CD27/DG44 세포, 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포를 분석용 세포로서 사용하였다.
(1) 형광 세포 염색법(흐름 세포측정기 해석)에 의한 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 원숭이 CD27 발현 세포로의 반응성 평가
항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031의 게잡이 원숭이 CD27 발현 세포에 대한 결합 활성을 이하의 방법에 따라 측정하였다.
500 μg/mL G418 첨가 HT-배지를 사용하여 계대한 게잡이 원숭이 CD27/DG44 세포 및 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포를 0.02 ％ EDTA 용액을 사용하여 박리한 후, 각 세포를 PBS로 세정하였다. 세정 후 5×105개의 세포를 50 μL의 1 ％ BSA-PBS에 현탁한 후, 1차 항체로서 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체(키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031)를 10 μg/mL로 제조한 항체액을 50 μL/웰로 분주하고, 빙온 중에서 1 시간 동안 반응시켰다. 포지티브 컨트롤로서 항CD27 마우스 항체 O323을 사용하였다. 반응 후 PBS를 사용하여 원심 분리를 2회 행하여 세포를 세정하고, 2차 항체로서 ALEXA 플루오로 488 표지 항인간 면역 글로불린 G(H+L) 또는 ALEXA 플루오로 488 표지 항마우스 면역 글로불린 G(H+L)(모두 바이오리젠드사 제조)를 50 μL/웰로 첨가하고, 빙온, 차광하에 30분간 반응시켰다. 다시 PBS를 사용하여 원심 분리를 2회 행하고, 세포를 세정한 후, 500 μL의 1 ％ BSA-PBS에 현탁하여 레이저광 488 nm 아르곤으로 여기되는 510 내지 530 nm의 형광을 흐름 세포측정기(벡크만 콜터사 제조, 사이토믹스 FC500 MPL)로 측정하였다. 도 25에 결과를 나타낸다.
그 결과, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은, 당쇄 부전 CD27을 발현한 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포에 반응한다는 것이 분명해졌다. 한편, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026 및 키메라형 KM4028의 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포로의 반응성은 경미하였다. 또한, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체는, 모두 게잡이 원숭이 CD27/DG44 세포에는 결합하지 않는다는 것이 확인되었다.
(2) 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 원숭이 CD27 발현 세포에 대한 ADCC 활성의 평가
500 μg/mL G418 첨가 HT-배지를 사용하여 계대한 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포를 0.02 ％ EDTA 용액을 사용하여 박리한 후, PBS로 세정하고, ADCC용 배지로 세정하여 동 배지로 적절한 농도에 이르도록 제조하여 표적 세포 현탁액으로 하였다. 또한, 이펙터 세포 현탁액의 제조 및 ADCC 활성의 측정은, 실시예 7과 동일한 방법으로 행하였다. 도 26에 결과를 나타낸다.
그 결과, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은, 모두 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포(당쇄 부전 게잡이 원숭이 CD27 세포)에 대하여 ADCC 활성을 나타내었다.
이상의 점으로부터, 본 발명의 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4026, 키메라형 KM4028, 키메라형 KM4030 및 키메라형 KM4031은, 모두 당쇄 부전게잡이 원숭이 CD27 세포에 교차 반응성을 나타낸다는 것이 분명해졌다. 각 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체의 당쇄 부전 게잡이 원숭이 CD27에 대한 반응성에는 강약이 관찰되며, 인식하는 에피토프의 차이가 있었다.
또한, 실시예 2에서 제작한 인간 CD27/Lec8 세포 및 실시예 8에서 제작한 게잡이 원숭이 CD27/Lec8 세포 중, 흐름 세포측정기 해석에 의해 세포 표면 위의 CD27 발현량이 거의 동등하다는 것을 확인한 세포를 사용하여, 항당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4030의 ADCC 활성을 측정하였다. 이펙터 세포 현탁액은, 동일한 정상인 말초혈로부터 제조하였다. 도 27에 결과를 나타낸다.
그 결과, 당쇄 부전 CD27 키메라 항체 키메라형 KM4030은, 게잡이 원숭이CD27/Lec8 세포와 인간 CD27/Lec8 세포에 대하여 동등한 ADCC 활성을 나타낸다는 것이 시사되었다.
실시예 10
인간화 항체의 제작
(1) 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 설계
항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다.
우선, 서열 번호 58, 59 및 60으로 각각 표시되는 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030VH의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다. 서열 해석 시스템으로서 GCG 패키지(제네틱스 컴퓨터 그룹사 제조) 를 사용하여, 기존의 단백질의 아미노산 데이터 베이스를 BLASTP법(문헌 [Nucleic Acid Res., 25, 3389(1997)])에 의해 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030과 상동성이 높은 인간 항체를 검색하였다. 상동성 스코어와 실제의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 바, SWISSPROT 데이터 베이스 액세션 번호 BAH04525, 인간에서 H3N2 인플루엔자 바이러스에 대한 중화 모노클로날 항체의 레파토리(The repertoire of neutralizing monoclonal antibodies against H3N2 influenza viruses in human)(이하, BAH04525로 칭함)이 83.9 ％를 나타내고, 가장 상동성이 높은 인간 항체이기 때문에 이 항체의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다.
이상과 같이 하여 결정한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열이 적절한 위치에, 서열 번호 58 내지 60으로 나타낸 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 VH의 CDR의 아미노산 서열을 이식하였다. 이와 같이 하여, 서열 번호 96으로 표시되는 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0를 설계하였다.
이어서, 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열을 이하와 같이하여 설계하였다.
서열 번호 61 내지 63으로 각각 표시되는 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030VL의 CDR1 내지 3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다. 카바트 등은, 기지된 다양한 인간 항체의 VL을 그의 아미노산 서열의 상동성으로부터 서브 그룹(HSG I 내지 IV)으로 분류하고, 이들의 서브 그룹마다 공통 서열을 보고하였다(문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)]). 따라서, 인간 항체의 VL의 서브 그룹 I 내지 IV의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열과 항당쇄 부전 CD27 래트 항체 KM4030의 VL의 FR의 아미노산 서열의 상동성 검색을 실시하였다.
상동성을 검색한 결과, HSGI, HSGII, HSGIII 및 HSGIV의 상동성은 각각 86.3 ％, 60.0 ％, 73.8 ％, 73.8 ％였다. 따라서, KM4030VL의 FR의 아미노산 서열은 서브 그룹 I과 가장 높은 상동성을 가졌다.
이상의 결과로부터, 인간 항체의 VL의 서브 그룹 I의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열이 적절한 위치에, 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하였다. 그러나, 서열 번호 38에 기재된 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 VL의 아미노산 서열 중의 124번째의 Leu는, 카바트 등이 예시하는 인간 항체 FR의 아미노산 서열에 상당하는 부위에서 가장 사용되는 빈도가 높은 아미노산 잔기는 아니지만, 비교적 높은 빈도로 사용되는 아미노산 잔기이기 때문에, 상기한 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 아미노산 서열에서 관찰되는 아미노산 잔기를 사용하는 것으로 하였다. 이와 같이 하여, 서열 번호 97로 표시되는 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열 LV0를 설계하였다.
상기에서 설계한 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0 및 VL의 아미노산 서열 LV0는, 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 CDR의 아미노산 서열만을 이식한 서열이다. 그러나, 일반적으로 인간화 항체를 제작하는 경우에는, 단순한 인간 항체의 FR로의 래트 항체의 CDR의 아미노산 서열의 이식만으로는 결합 활성이 저하되는 경우가 많다. 그 때문에, 결합 활성의 저하를 회피하기 위해, CDR의 아미노산 서열의 이식과 함께 인간 항체와 래트 항체에서 상이한 FR의 아미노산 잔기 중, 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기를 개변하는 것이 행해지고 있다. 따라서, 본 실시예에서도 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 이하와 같이 하여 동정하였다.
우선, 상기에서 설계한 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0 및 VL의 아미노산 서열 LV0로 이루어지는 항체 V 영역(HV0LV0)의 삼차원 구조를 컴퓨터 모델링의 수법을 이용하여 구축하였다. 삼차원 구조 좌표 제작 및 삼차원 구조의 표시에에 대해서는 소프트웨어 디스커버리 스튜디오(엑셀리스사 제조)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라 행하였다. 또한, 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 V 영역의 삼차원 구조의 컴퓨터 모델도 동일하게 하여 구축하였다. 또한, HV0LV0의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서 항당쇄 부전 CD27 래트 항체 KM4030과 상이한 아미노산 잔기를 선택하고, 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 아미노산 잔기로 개변한 아미노산 서열을 제작하고, 마찬가지로 삼차원 구조 모델을 구축하였다. 이들 제작한 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030, HV0LV0 및 개변체의 V 영역의 삼차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 주는 것으로 예측되는 아미노산 잔기를 동정하였다.
그 결과, HV0LV0의 FR의 아미노산 잔기 중에서 항원 결합 부위의 삼차원 구조를 변화시키고, 항체의 결합 활성에 영향을 준다고 생각되는 아미노산 잔기로서, HV0에서는 30번째의 Ser, 48번째의 Val, 49번째의 Ser, 77번째의 Asn, 93번째의 Val, 97번째의 Ala 및 117번째의 Thr을, LV0에서는 21번째의 Ile, 40번째의 Pro, 58번째의 Val, 85번째의 Thr 및 87번째의 Tyr을 각각 선택하였다. 이들 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 1개 이상의 아미노산 서열을 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 개변하고, 다양한 개변을 갖는 인간화 항체의 VH 및 VL을 설계하였다. 구체적으로는, 항체 VH에 대해서는 서열 번호 96으로 표시되는 아미노산 서열의 30번째의 Ser을 Asn으로, 48번째의 Val을 Ile로, 49번째의 Ser을 Ala로, 77번째의 Asn을 Gly로, 93번째의 Val을 Thr로, 97번째의 Ala를 Thr로, 및 117번째의 Thr을 Val로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 1개의 개변을 도입하였다. 또한, VL에 대해서는, 서열 번호 97로 표시되는 아미노산 서열의 21번째의 Ile를 Leu로, 40번째의 Pro를 Leu로, 58번째의 Val을 Ile로, 85번째의 Thr을 Ala로, 및 87번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 아미노산 개변 중 적어도 1개의 개변을 도입하였다.
HV0LV0의 FR에 존재하는 적어도 1개의 아미노산 잔기를 개변한 HV2LV0, HV3LV0, HV5LV0 및 HV7LV0의 가변 영역의 아미노산 서열을 설계하고, H쇄 가변 영역 HV2, HV3, HV5 및 HV7의 아미노산 서열을 각각 서열 번호 101, 103, 105 및 107에 나타내었다.
(2) 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 제작 및 평가
항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는, 항당쇄 부전 CD27 래트 모노클로날 항체 KM4030의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA에서 사용되는 코돈을 이용하고, 아미노산 개변을 행하는 경우에는 포유 동물 세포에서 고빈도로 사용되는 코돈을 이용하여 제작하였다. 항당쇄 부전 CD27 인간화 항체의 HV0 및 LV0의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 서열 번호 98, 99에 각각 나타내고, 아미노산 개변을 행한 가변 영역 HV2, HV3, HV5 및 HV7의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 서열 번호 100, 102, 104 및 106에 각각 나타내었다.
본 발명에 따르면, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 특이적으로 인식하고, 상기 세포 외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하여 이루어지는 벡터, 상기 벡터를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 하이브리도마 또는 형질 전환체를 사용하는 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법, 및 상기 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 CD27이 관여하는 질환의 진단약 또는 치료약을 제공할 수 있다.
수탁 번호
IPOD FREM BP-10976
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1-인간 CD27 DNA 서열
서열 번호 2-인간 CD27 아미노산 서열
서열 번호 3-인공 서열의 기재: CD27 포워드 프라이머
서열 번호 4-인공 서열의 기재: CD27809B
서열 번호 5-인공 서열의 기재: CD27-A 프라이머
서열 번호 6-인공 서열의 기재: CD27-B 프라이머
서열 번호 7-인공 서열의 기재: 프라이머 1
서열 번호 8-인공 서열의 기재: 프라이머 2
서열 번호 9-인공 서열의 기재: g4A 프라이머
서열 번호 10-인공 서열의 기재: g4B 프라이머
서열 번호 11-인공 서열의 기재: CD27-Fc 단백질 DNA 서열
서열 번호 12-인공 서열의 기재: CD27-Fc 단백질 아미노산 서열
서열 번호 13-인공 서열의 기재: CD27-C 프라이머
서열 번호 14-인공 서열의 기재: 래트 IgG1에 특이적인 프라이머
서열 번호 15-인공 서열의 기재: 래트 IgG2a에 특이적인 프라이머
서열 번호 16-인공 서열의 기재: 래트 IgG2b에 특이적인 프라이머
서열 번호 17-인공 서열의 기재: 래트 CH1 특이적인 프라이머
서열 번호 18-인공 서열의 기재: 래트 Ig(κ) 특이적 프라이머 1
서열 번호 19-인공 서열의 기재: 래트 Ig(κ) 특이적 프라이머 2
서열 번호 20-KM4026 VH 염기 서열
서열 번호 21-KM4027 VH 염기 서열
서열 번호 22-KM4028 VH 염기 서열
서열 번호 23-KM4030 VH 염기 서열
서열 번호 24-KM4031 VH 염기 서열
서열 번호 25-KM4026 VH 아미노산 서열
서열 번호 26-KM4027 VH 아미노산 서열
서열 번호 27-KM4028 VH 아미노산 서열
서열 번호 28-KM4030 VH 아미노산 서열
서열 번호 29-KM4031 VH 아미노산 서열
서열 번호 30-KM4026 VL 염기 서열
서열 번호 31-KM4027 VL 염기 서열
서열 번호 32-KM4028 VL 염기 서열
서열 번호 33-KM4030 VL 염기 서열
서열 번호 34-KM4031 VL 염기 서열
서열 번호 35-KM4026 VL 아미노산 서열
서열 번호 36-KM4027 VL 아미노산 서열
서열 번호 37-KM4028 VL 아미노산 서열
서열 번호 38-KM4030 VL 아미노산 서열
서열 번호 39-KM4031 VL 아미노산 서열
서열 번호 40-KM4026 VH CDR1
서열 번호 41-KM4026 VH CDR2
서열 번호 42-KM4026 VH CDR3
서열 번호 43-KM4026 VL CDR1
서열 번호 44-KM4026 VL CDR2
서열 번호 45-KM4026 VL CDR3
서열 번호 46-KM4027 VH CDR1
서열 번호 47-KM4027 VH CDR2
서열 번호 48-KM4027 VH CDR3
서열 번호 49-KM4027 VL CDR1
서열 번호 50-KM4027 VL CDR2
서열 번호 51-KM4027 VL CDR3
서열 번호 52-KM4028 VH CDR1
서열 번호 53-KM4028 VH CDR2
서열 번호 54-KM4028 VH CDR3
서열 번호 55-KM4028 VL CDR1
서열 번호 56-KM4028 VL CDR2
서열 번호 57-KM4028 VL CDR3
서열 번호 58-KM4030 VH CDR1
서열 번호 59-KM4030 VH CDR2
서열 번호 60-KM4030 VH CDR3
서열 번호 61-KM4030 VL CDR1
서열 번호 62-KM4030 VL CDR2
서열 번호 63-KM4030 VL CDR3
서열 번호 64-KM4031 VH CDR1
서열 번호 65-KM4031 VH CDR2
서열 번호 66-KM4030 VH CDR3
서열 번호 67-KM4031 VL CDR1
서열 번호 68-KM4031 VL CDR2
서열 번호 69-KM4031 VL CDR3
서열 번호 70-인공 서열의 기재: KM4026 VL 키메라 프라이머 1
서열 번호 71-인공 서열의 기재: KM4026 VL 키메라 프라이머 2
서열 번호 72-인공 서열의 기재: KM4026 VH 키메라 프라이머 1
서열 번호 73-인공 서열의 기재: KM4026 VH 키메라 프라이머 2
서열 번호 74-인공 서열의 기재: KM4027 VL 키메라 프라이머 1
서열 번호 75-인공 서열의 기재: KM4027 VL 키메라 프라이머 2
서열 번호 76-인공 서열의 기재: KM4027 VH 키메라 프라이머 1
서열 번호 77-인공 서열의 기재: KM4027 VH 키메라 프라이머 2
서열 번호 78-인공 서열의 기재: KM4028 VL 키메라 프라이머 1
서열 번호 79-인공 서열의 기재: KM4028 VL 키메라 프라이머 2
서열 번호 80-인공 서열의 기재: KM4028 VH 키메라 프라이머 1
서열 번호 81-인공 서열의 기재: KM4028 VH 키메라 프라이머 2
서열 번호 82-인공 서열의 기재: KM4030 VL 키메라 프라이머 1
서열 번호 83-인공 서열의 기재: KM4030 VL 키메라 프라이머 2
서열 번호 84-인공 서열의 기재: KM4030 VH 키메라 프라이머 1
서열 번호 85-인공 서열의 기재: KM4030 VH 키메라 프라이머 2
서열 번호 86-인공 서열의 기재: KM4031 VL 키메라 프라이머 1
서열 번호 87-인공 서열의 기재: KM4031 VL 키메라 프라이머 2
서열 번호 88-인공 서열의 기재: KM4031 VH 키메라 프라이머 1
서열 번호 89-인공 서열의 기재: KM4031 VH 키메라 프라이머 2
서열 번호 90-인공 서열의 기재: 프라이머 mfCD27_5UTR
서열 번호 91-인공 서열의 기재: 프라이머 mfCD27_3UTR
서열 번호 92-게잡이 원숭이 CD27 cDNA 서열
서열 번호 93-인공 서열의 기재: 프라이머 mfCD27toKAN_5
서열 번호 94-인공 서열의 기재: 프라이머 mfCD27HisKAN_3
서열 번호 95-인공 서열의 기재: His 태그 부착 게잡이 원숭이 CD27 cDNA 서열
서열 번호 96-인공 서열의 기재: KM4030 HV0 아미노산 서열
서열 번호 97-인공 서열의 기재: KM4030 LV0 아미노산 서열
서열 번호 98-인공 서열의 기재: KM4030 HV0 염기 서열
서열 번호 99-인공 서열의 기재: KM4030 LV0 염기 서열
서열 번호 100-인공 서열의 기재: KM4030 HV2 염기 서열
서열 번호 101-인공 서열의 기재: KM4030 HV2 아미노산 서열
서열 번호 102-인공 서열의 기재: KM4030 HV3 염기 서열
서열 번호 103-인공 서열의 기재: KM4030 HV3 아미노산 서열
서열 번호 104-인공 서열의 기재: KM4030 HV5 염기 서열
서열 번호 105-인공 서열의 기재: KM4030 HV5 아미노산 서열
서열 번호 106-인공 서열의 기재: KM4030 HV7 염기 서열
서열 번호 107-인공 서열의 기재: KM4030 HV7 아미노산 서열
독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP10976 20080605
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Anti-CD27 anitbody <130> 1001P11976 <150> JP 2008-171353 <151> 2008-06-30 <160> 107 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 783 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(783) <223> human CD27 DNA sequence <400> 1 atg gca cgg cca cat ccc tgg tgg ctg tgc gtt ctg ggg acc ctg gtg 48 Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 ggg ctc tca gct act cca gcc ccc aag agc tgc cca gag agg cac tac 96 Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 tgg gct cag gga aag ctg tgc tgc cag atg tgt gag cca gga aca ttc 144 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe 35 40 45 ctc gtg aag gac tgt gac cag cat aga aag gct gct cag tgt gat cct 192 Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 tgc ata ccg ggg gtc tcc ttc tct cct gac cac cac acc cgg ccc cac 240 Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 tgt gag agc tgt cgg cac tgt aac tct ggt ctt ctc gtt cgc aac tgc 288 Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 acc atc act gcc aat gct gag tgt gcc tgt cgc aat ggc tgg cag tgc 336 Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 100 105 110 agg gac aag gag tgc acc gag tgt gat cct ctt cca aac cct tcg ctg 384 Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 acc gct cgg tcg tct cag gcc ctg agc cca cac cct cag ccc acc cac 432 Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His 130 135 140 tta cct tat gtc agt gag atg ctg gag gcc agg aca gct ggg cac atg 480 Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met 145 150 155 160 cag act ctg gct gac ttc agg cag ctg cct gcc cgg act ctc tct acc 528 Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr 165 170 175 cac tgg cca ccc caa aga tcc ctg tgc agc tcc gat ttt att cgc atc 576 His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile 180 185 190 ctt gtg atc ttc tct gga atg ttc ctt gtt ttc acc ctg gcc ggg gcc 624 Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala 195 200 205 ctg ttc ctc cat caa cga agg aaa tat aga tca aac aaa gga gaa agt 672 Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser 210 215 220 cct gtg gag cct gca gag cct tgt cgt tac agc tgc ccc agg gag gag 720 Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu 225 230 235 240 gag ggc agc acc atc ccc atc cag gag gat tac cga aaa ccg gag cct 768 Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro 245 250 255 gcc tgc tcc ccc tga 783 Ala Cys Ser Pro 260 <210> 2 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe 35 40 45 Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 100 105 110 Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His 130 135 140 Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met 145 150 155 160 Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr 165 170 175 His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile 180 185 190 Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala 195 200 205 Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser 210 215 220 Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu 225 230 235 240 Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro 245 250 255 Ala Cys Ser Pro 260 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence : CD27 forward primer <400> 3 gggcggccgc tcctcaggct gtctcctcag gttgcctcct caaaatggca cggccacatc 60 cctgg 65 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificical sequence: CD27809B <400> 4 ggggatccca gggatctttg gggtggcca 29 <210> 5 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence : CD27-A primer <400> 5 gggcggccgc tcctcaggct gtctcctcag gttgcctcct caaaatggca cggccacatc 60 cctgg 65 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: CD27-B primer <400> 6 ggggatccca gggatctttg gggtggcca 29 <210> 7 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: Primer1 <400> 7 caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt cccccatgcc caccatgccc 60 ag 62 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: Primer2 <400> 8 acgcacgtga cctcaggggt ccgggagatc atgagagtgt ccttgggttt tggggggaac 60 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: g4A primer <400> 9 ggggatccga gtccaaatat ggtcccccat gccca 35 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: g4B primer <400> 10 gggtcgactc atttacccag agacagggag ag 32 <210> 11 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: CD27-Fc protein <220> <221> CDS <222> (1)..(1248) <223> CD27-Fc fusion protein DNA sequence <400> 11 atg gca cgg cca cat ccc tgg tgg ctg tgc gtt ctg ggg acc ctg gtg 48 Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 ggg ctc tca gct act cca gcc ccc aag agc tgc cca gag agg cac tac 96 Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 tgg gct cag gga aag ctg tgc tgc cag atg tgt gag cca gga aca ttc 144 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe 35 40 45 ctc gtg aag gac tgt gac cag cat aga aag gct gct cag tgt gat cct 192 Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 tgc ata ccg ggg gtc tcc ttc tct cct gac cac cac acc cgg ccc cac 240 Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 tgt gag agc tgt cgg cac tgt aac tct ggt ctt ctc gtt cgc aac tgc 288 Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 acc atc act gcc aat gct gag tgt gcc tgt cgc aat ggc tgg cag tgc 336 Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 100 105 110 agg gac aag gag tgc acc gag tgt gat cct ctt cca aac cct tcg ctg 384 Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 acc gct cgg tcg tct cag gcc ctg agc cca cac cct cag ccc acc cac 432 Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His 130 135 140 tta cct tat gtc agt gag atg ctg gag gcc agg aca gct ggg cac atg 480 Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met 145 150 155 160 cag act ctg gct gac ttc agg cag ctg cct gcc cgg act ctc tct acc 528 Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr 165 170 175 cac tgg cca ccc caa aga tcc ctg gga tcc gag tcc aaa tat ggt ccc 576 His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 180 185 190 cca tgc cca cca tgc cca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc 624 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 195 200 205 ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc 672 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 210 215 220 cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag 720 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 225 230 235 240 gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag 768 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 245 250 255 aca aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc 816 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 260 265 270 gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 864 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 275 280 285 tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc 912 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 290 295 300 tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc 960 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 305 310 315 320 cca tcc cag gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg 1008 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 325 330 335 gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat 1056 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 340 345 350 ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc 1104 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 355 360 365 gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg 1152 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 370 375 380 tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg 1200 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 385 390 395 400 cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa tga 1248 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 405 410 415 <210> 12 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe 35 40 45 Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 100 105 110 Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 Thr Ala Arg Ser Ser 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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 340 345 350 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 355 360 365 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 370 375 380 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 385 390 395 400 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 405 410 415 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: CD27-C primer <400> 13 gggtcgacct cagggggagc aggcaggctc 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: a primer for rat IgG1 <400> 14 gcaatcacct ccacagtttc tgggcac 27 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: a primer for rat IgG2a <400> 15 ccacaaggat tgcattccct tggcac 26 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: a primer for rat IgG2b <400> 16 gggcatgtag 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tggagtgggt tgcaaccatt acttatgatg gtagcattta ctatcgagac 240 tccgtgaagg gccgattcac aatctccaga gataatgcaa aaagcaccct ttacctgcaa 300 atgaacagtc tgaggtctga ggacacggcc acttattact gtacaagaga cccgggtctc 360 tactactttg atttctgggg ccaaggagtc atggtcacag tctcctca 408 <210> 25 <211> 135 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 25 Met Arg Thr Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Leu Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr 35 40 45 Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu 50 55 60 Trp Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser 65 70 75 80 Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 85 90 95 Phe Leu Gln Leu Asn Ser Ile Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe 100 105 110 Cys Ala Arg Trp Thr Gly Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Val Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 26 <211> 137 <212> PRT <213> Rattus norvegicus 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ctggctgtgt cagcaggaga gacggtcact 120 ataaactgta agtccagtca gagtcttttg tacagtggaa accaaaggaa ctatttggcc 180 tggtatcagc agaaacccgg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atctactagg 240 caatctggtg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacaaactt cactctgacc 300 atcagcagtg tgcaggcaga agatctggca atttattact gtcaacagta ttatgatact 360 cctcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaattgaaa 399 <210> 33 <211> 381 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 33 atgatggctg cacttcaact cttagggctg ctgctgctct ggctcccagg catgagatgt 60 gacatccaga tgacccagtc tccttcagtc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 120 ctcaactgca aagcaagtca gaatattaat gagtacttaa actggtatca gcaaaagctt 180 ggagaagctc ccaaactcct gatatataat acaaacaatt tgcaaacggg catcccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaggattttg ccgcatattt ctgctttcag cataatagtt ggccgtacac gtttggagct 360 gggaccaagc tggaactgaa a 381 <210> 34 <211> 399 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 34 atggaatcac agacccaggt cctcatgtcc ctgctgctct ggatttctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgacccagtc tccatcctct ctggctgtgt cagcaggaga gacggtcact 120 ctaaactgcc agtccagtca gagtctttta tacagtggaa accagaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg tcagtctcct aaacttctga tctactgggc atctactcgg 240 caatctggtg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagactt cactctgacc 300 atcagcagtg tgcaggcaga agatctggca atttattact gtcagcagta ttataatact 360 cctcggacgt tcggtggagg caccaagctg gaattgaaa 399 <210> 35 <211> 133 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 35 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr 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<220> <223> Description of artificial sequence: KM4027 VL primer 2 <400> 75 ccgtacgttt caattccagc ttggagcctc cacc 34 <210> 76 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4027 VH primer 1 <400> 76 ggcggccgcg acccctcacc atggacatca ggctcagctt ggctttc 47 <210> 77 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4027 VH primer 2 <400> 77 ggggcccttg gtggaggctg aggagactgt gaccatgact ccttg 45 <210> 78 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4028 VL primer 1 <400> 78 ggaattcgcc tcctcaaaat ggaatcacag acccaggtcc tcatg 45 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4028 VL primer 2 <400> 79 ccgtacgttt caattccagc ttggtgcctc cacc 34 <210> 80 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4028 VH primer 1 <400> 80 ggcggccgcg acccctcacc 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Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4031 VL primer 1 <400> 86 gcgaattcgc ctcctcaaaa tggaatcaca gacccaggtc ctcatgtcc 49 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4031 VL primer 2 <400> 87 gccgtacgtt tcaattccag cttggtgcct ccaccgaac 39 <210> 88 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4031 VH primer 1 <400> 88 atgcggccgc gacccctcac catggacatc aggctcagct tggctttcat tg 52 <210> 89 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4031 VH primer 2 <400> 89 gcgggccctt ggtggaggct gaggagactg tgaccatgac tccttggcc 49 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: mfCD27_5UTR <400> 90 gcacagaaag gcgctccctg ggcaggaacc 30 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: mfCD27_3UTR <400> 91 ggctgtagtg 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ctgggcggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cacctttagc aactactgga tgacctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attactaata gtggtggtag cacttactat 180 ccagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgagaca atgccaagaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagccgtat attactgtgc ccgagatgtt 300 aacacatact atgggtataa cgccctcttt gattactggg gcctgggtac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 99 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 LV0 DNA sequence <400> 99 gacatccaga tgacccagtc tccttcctca ctgtctgcat ctgtaggtga ccgagtcacc 60 atcacttgca aagcaagtca gaatattaat gagtacttaa actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat acaaacaatt tgcaaacggg ggtcccatca 180 cggttcagcg gcagtggttc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct 240 gaagatttcg caacttatta ctgctttcag cataatagtt ggccgtacac gttcggccaa 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 100 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV2 DNA Sequence <400> 100 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggtggc ttggtaaagc ctgggcggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cacctttaat aactactgga tgacctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attactaata gtggtggtag cacttactat 180 ccagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgagaca atgccaagaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagccgtat attactgtac acgagatgtt 300 aacacatact atgggtataa cgccctcttt gattactggg gcctgggtac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 101 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV2 amino acid sequence <400> 101 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Val Asn Thr Tyr Tyr Gly Tyr Asn Ala Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 102 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV3 DNA Sequence <400> 102 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggtggc ttggtaaagc ctgggcggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cacctttagc aactactgga tgacctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gattgcatcc attactaata gtggtggtag cacttactat 180 ccagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgagaca atgccaagaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagccgtat attactgtac acgagatgtt 300 aacacatact atgggtataa cgccctcttt gattactggg gcctgggtac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 103 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: HV3 amino acid sequence <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Val Asn Thr Tyr Tyr Gly Tyr Asn Ala Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 104 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV5 DNA Sequence <400> 104 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggtggc ttggtaaagc ctgggcggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cacctttaat aactactgga tgacctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gattgcatcc attactaata gtggtggtag cacttactat 180 ccagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgagaca atgccaaggg cagcctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagccgtat attactgtac acgagatgtt 300 aacacatact atgggtataa cgccctcttt gattactggg gcctgggtac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 105 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV5 amino acid sequence <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Gly Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Val Asn Thr Tyr Tyr Gly Tyr Asn Ala Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 106 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV7 DNA Sequence <400> 106 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggtggc ttggtaaagc ctgggcggtc cctgcgactc 60 tcctgtgcag cctctggttt cacctttaat aactactgga tgacctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gattgcatcc attactaata gtggtggtag cacttactat 180 ccagactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgagaca atgccaaggg cagcctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acagccactt attactgtac acgagatgtt 300 aacacatact atgggtataa cgccctcttt gattactggg gcctgggtgt cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 107 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of artificial sequence: KM4030 HV7 amino acid sequence <400> 107 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Gly Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Asp Val Asn Thr Tyr Tyr Gly Tyr Asn Ala Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Leu Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (32)

  1. 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드(이하, CD27이라고 함)의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하고, 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  2. O 결합형 당쇄가 결합한 CD27의 세포 외 영역 중, 갈락토오스가 결합한 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 세포 외 영역은 인식하지 않고, 갈락토오스가 결합하지 않은 0 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 세포 외 영역을 인식하고, 결합하는 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄가 시알릴 Tn 항원 또는 Tn 항원으로부터 선택되는 적어도 1개의 O 결합형 당쇄인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  4. 제3항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄가 Tn 항원인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 모노클로날 항체가 모노클로날 항체 KM4030과 경합 반응하는 모노클로날 항체인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가, 모노클로날 항체 KM4030이 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체인 모노클로날 항체 또는 상기 항체 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 수탁 번호 FERM BP-10976으로서 기탁되어 있는 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체인 항체 또는 상기 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 항체 또는 상기 항체 단편.
  9. 제8항에 있어서, 유전자 재조합 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 항체인 유전자 재조합 항체 또는 상기 항체 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(Diabody), 디술피드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 항체 단편.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  12. 제11항에 있어서, 하이브리도마가 수탁 번호 FERM BP-10976으로서 기탁되어 있는 하이브리도마인 하이브리도마.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 코딩하는 DNA.
  14. 제13항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
  15. 제14항에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환주.
  16. 제11항 또는 제12항에 기재된 하이브리도마 또는 제15항에 기재된 형질 전환주를 배지에 배양하고, 배양물 중에 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 생성 축적시키고, 상기 배양물로부터 항체 또는 상기 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27의 검출 시약.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단약.
  20. 제19항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 진단약.
  21. 제19항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 진단약.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 치료약.
  23. 제22항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 치료약.
  24. 제22항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 치료약.
  25. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 발현한 세포를 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단 방법.
  26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편을 사용하여 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 진단 방법.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 진단 방법.
  29. 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 진단약을 제조하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
  30. 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환의 치료약을 제조하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 IgA 신증인 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 갈락토오스가 결합하지 않은 O 결합형 당쇄를 포함하는 CD27이 관여하는 질환이 암인 항체 또는 상기 항체 단편의 사용.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
EP2520589B1 (en) * 2009-12-29 2018-11-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd27 antibody
BR112012026227A2 (pt) * 2010-04-13 2020-08-04 Celldex Therapeutics, Inc. anticorpo monoclonal humano ou humanizado, molécula biespecífica, vetor de expressão, célula transformada, composição, e, usos de um anticorpo
AU2011275749C1 (en) * 2010-07-09 2015-09-17 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Agonistic antibody to CD27
AU2015202353B2 (en) * 2010-07-09 2017-07-27 Aduro Biotech Holdings, Europe B.V. Agonistic antibody to CD27
EP2668210B1 (en) 2011-01-26 2020-06-17 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-kit antibodies and uses thereof
BR122020002414B1 (pt) * 2012-03-15 2022-03-03 Janssen Biotech, Inc Uso de anticorpos anti-cd27 humanos
CA2874646C (en) 2012-05-25 2020-12-01 Janssen Biotech, Inc. Non-natural consensus albumin binding domains
US9334332B2 (en) 2012-07-25 2016-05-10 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-kit antibodies
CN104813424B (zh) * 2012-11-29 2017-05-03 株式会社村田制作所 蓄电器件
US9725494B2 (en) * 2013-05-17 2017-08-08 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Soluble CD27 (sCD27) and the use thereof
JP6768639B2 (ja) 2014-05-23 2020-10-21 セルデックス セラピューティクス，インコーポレーテッド 好酸球又はマスト細胞関連障害の治療
WO2015187519A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Tslp assay
KR101720106B1 (ko) * 2015-04-22 2017-03-27 부산대학교 산학협력단 임신과 관련된 시알화 Tn 항원의 용도
EP3858388A1 (en) 2015-09-28 2021-08-04 Regents of the University of Minnesota Chimeric antigen receptor (car) t cells as therapeutic interventions for auto- and allo-immunity
MA45488A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
TWI784957B (zh) 2016-06-20 2022-12-01 英商克馬伯有限公司 免疫細胞介素
JOP20190055A1 (ar) 2016-09-26 2019-03-24 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة ضد cd27
JP7014783B2 (ja) * 2016-09-29 2022-02-01 ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド 抗ｃｄ２７抗体、その抗原結合性フラグメント、およびそのものの医学的使用
WO2018113774A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd27
CN108239659B (zh) 2016-12-23 2020-03-03 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
JP7356354B2 (ja) 2017-05-12 2023-10-04 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 細胞の操作のための材料及び方法並びに免疫腫瘍学におけるその使用
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
CN111511767A (zh) * 2018-03-28 2020-08-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd27抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2019196117A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-cd27 antibodies and use thereof
KR20210011919A (ko) 2018-04-17 2021-02-02 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 항-cd27 항체 및 항-pd-l1 항체 및 이중특이적 작제물
EP3790629A1 (en) 2018-05-11 2021-03-17 CRISPR Therapeutics AG Methods and compositions for treating cancer
EP3806848A2 (en) 2018-06-15 2021-04-21 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
US20220249558A1 (en) 2019-04-30 2022-08-11 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
EP3974541A4 (en) * 2019-05-21 2023-10-11 Acurasysbio Co., Ltd. COMPOSITION FOR CANCER DIAGNOSIS
WO2021087114A1 (en) * 2019-10-29 2021-05-06 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Anti-angiopoietin-like 4 (angptl4) antibodies and methods of use
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
JP2023532339A (ja) 2020-06-29 2023-07-27 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド サノトランスミッションを促進するためにエンジニアリングされたウイルス及び癌の処置におけるそれらの使用
JPWO2022196719A1 (ko) 2021-03-17 2022-09-22
JP2024512669A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションポリペプチド及び癌の処置におけるそれらの使用
WO2023278641A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023122632A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-29 Sri International Dual targeting for cell-specific delivery to the central nervous system
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5623587A (en) 1979-08-03 1981-03-05 Mitsuwa Seiki Co Ltd Vane type compressor
JPS58110600A (ja) 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
WO1985003934A1 (en) 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein and process for its preparation
JPS60221091A (ja) 1983-12-21 1985-11-05 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プロモ−タ−
JP2564268B2 (ja) 1985-08-28 1996-12-18 協和醗酵工業株式会社 融合抗原ポリペプチド
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
US5229289A (en) * 1988-03-11 1993-07-20 The Biomembrane Institute Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with animal and human and with synthetic carbohydrate-carrier conjugates
JP2958019B2 (ja) 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
EP0643132B1 (en) 1993-03-29 2006-05-31 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alpha-1,3-fucosyltransferase
JP3946256B2 (ja) 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
DE602005015542D1 (de) 2004-01-12 2009-09-03 Applied Molecular Evolution Varianten der fc-region
EP1921090B1 (en) 2005-07-22 2015-01-14 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically modified antibody composition
EP1808442B1 (en) * 2006-01-13 2011-05-11 Institut Pasteur Enzymatic large-scale synthesis of mucin glyconjugates, and immunogenic applications thereof
GB0620894D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
EP2520589B1 (en) * 2009-12-29 2018-11-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-cd27 antibody

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