JP2564268B2 - 融合抗原ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、２種以上の抗原ポリペプチドが融合した形
の融合抗原ポリペプチド（以下ハイブリッド抗原ポリペ
プチドと略記する）および該ハイブリッド抗原ポリペプ
チドをコードするDNAを組み込んだ組換え体DNAを含む微
生物を用いるハイブリッド抗原ポリペプチドの製造法に
関する。

抗原抗体反応は医療および学術分野の種々の領域におい
て応用されており、本発明のハイブリッド抗原ポリペプ
チドは幅広い分野において用途が期待される。

従来の技術とその問題点 従来、抗原抗体反応は広い分野で利用されている技術
であるが、特に医療分野では病気の診断、治療および予
防に幅広く応用されている。これらは抗原抗体反応の高
い特異性に依存しており、この高い特異性が診断の正確
性、治療および予防の有効性を保証している。しかしな
がら、一つの病気に複数の抗原分子が関係している場合
が知られており、そのような場合、一種類の抗原分子を
用いた診断、治療および予防は抗原抗体反応の高い特異
性のゆえに、その正確性および有効性が低下する場合が
ある。このような場合、従来は２種以上の抗原分子の混
合物あるいは、病原体の粗抽出液等が用いられている。

成人Ｔ細胞白血病（adult T cell leukemia,以下ATL
と略記する。）の血清診断の場合を例にして、以下に従
来の技術を具体的に説明する。

ATLは成人Ｔ細胞白血病ウイルス〔adult T cell leuk
emia virus,以下ATLVと略記する。ATLVは、またヒト細
胞白血病ウイルス（HTLV）とも言うがここではATLVを用
いる。〕が原因と考えられており、ATLV感染の血清診断
はATLの診断および輸血等によるATLV感染の予防の為に
重要な臨床診断技術である。これは血清中のATL−関連
抗原〔ATL−associated antigen（ｓ）以下ATLAと略記
する。〕に対する抗体（以下抗ATLA抗体と略記する。）
の有無を抗原抗体反応を利用して調べることにより行わ
れている。ATLAはATLV粒子の構成分子であり、複数の分
子種が知られている。それらは、ATLVのgag遺伝子によ
りコードされるATLA群と、env遺伝子によりコードされ
るATLA群に大別され、さらにそれぞれのATLA群中でも抗
原性の異なる複数のATLA分子種がある〔服部ら、ヴィロ
ロジィー（Virology），136,338−347（1984）〕。一つ
の抗ATLA抗体は、唯一種のATLAと特異的に反応する。AT
LVに感染した人の血清中には多種類の抗ATLA抗体が存在
し、その多様性には個体差があることが知られている。
このような血清の診断には、従来ATL由来培養細胞株の
粗抽出液を抗原として用いる方法が検討されている。し
かしこのATLA製造法には、細胞の培養が高価につくこ
と、ATLVを産生する細胞株の大量培養には安全性の面
で問題があること、生産量が限られることなどの問題
がある。さらに従来の製造法ではenv遺伝子にコードさ
れる抗原ポリペプチドのうち、分子量46,000ダルトンの
糖タンパク質が欠落する。

一方、近年組換えDNAの技術を応用して、ATLVのgag遺
伝子にコードされるATLAポリペプチド、あるいはenv遺
伝子にコードされるATLAポリペプチドを微生物を用いて
生産する技術が開発されている〔サムエルら（K.P.Samu
el et al.）サイエンス（Science）226,1094−1097（19
84）；清川ら，プロシィーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA）81,6202−6206（1984）；関根ら，日本農芸
化学会 昭和59年度大会講演要旨集440ページ；板村
ら，第57会日本生化学会大会抄録1984年1079ページ〕し
かしながら、この方法で製造されるATLAポリペプチドは
gag遺伝子にコードされるATLAとしての抗原性あるいはe
nv遺伝子にコードされるATLAとしての抗原性しか示さ
ず、単独に用いた場合は診断の正確性の著しい低下をま
ねく場合が有る。その為に２種のATLAポリペプチドの混
合使用の必要性が指摘されているが、２種のポリペプチ
ドを別々に製造して混合使用することは経済的に不利で
ある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、有用抗原ポリペプチドの製造法につい
て研究をした結果、２種以上の抗原ポリペプチドが融合
した形のハイブリッド抗原ポリペプチドの製造法を確立
した、本発明によれば上記問題点を解決することができ
る。

ATLの血清診断の場合を例にして具体的に説明する
と、gag遺伝子を含むDNA断片とenv遺伝子を含むDNA断片
を組換えDNAの手法を用いてベクターDNAに組み込み、得
られた組換え体DNAを微生物に入れ、該微生物を培養し
た結果、gag遺伝子にコードされるATLAポリペプチドとe
nv遺伝子にコードされるATLAポリペプチドとが融合した
融合ポリペプチドが著量生成蓄積されることを見出し
た。本発明で生産される融合ポリペプチドは、一分子上
にgag遺伝子にコードされるATLAの抗原性とenv遺伝子に
コードされるATLAの抗原性を合せ持つハイブリッド抗原
ポリペプチドである。本発明方法によれば該ハイブリッ
ド抗原ポリペプチドを安価に、安全に大量生産すること
が可能である。本発明のハイブリッド抗原ポリペプチド
は臨床診断の分野において用いられるばかりでなく、多
価サブユニットワクチンとして予防医学分野での応用も
期待される。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明は、２種以上の抗原ポリペプチドが融合した形
のハイブリッド抗原ポリペプチド、該ポリペプチドをコ
ードするDNA断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該
プラスミドを含む微生物およびこれらの製造法を提供す
る。

本発明のハイブリッド抗原ポリペプチドは、２種以上
の抗原ポリペプチドが融合した形を有するものである。
抗原ポリペプチドとしては、たとえば、ATLAがあげられ
る。具体的にはATLVのgag遺伝子産物、env遺伝子産物ま
たはそれらの断片が用いられる。本発明のハイブリッド
抗原ポリペプチドは、抗原ポリペプチドをコードする遺
伝子DNAを２個以上結合してベクタープラスミドに組み
込み、得られる組換え体プラスミドを宿主微生物に導入
し、得られる形質転換株を培養することによって製造す
ることができる。

本発明の組換え体プラスミドの造成は以下の通り行
う。

抗原ペプチドをコードするDNAを２種以上、たとえばA
TLVのgag遺伝子産物をコードするDNAとenv遺伝子産物を
コードするDNAとを組換えDNA技法により遺伝子の読みと
りのフレームを合わせてベクターDNAに組み込むことに
よって組換え体プラスミドを造成することができる。

ATLVのgag遺伝子産物をコードするDNAおよびenv遺伝
子産物をコードするDNAの起源としては、たとえば清木
らによってクローン化されたpATK03,pATK100〔清木ら、
プロシィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ィ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）,USA.8
0,3618−3622（1983）〕および、これらの誘導体プラス
ミドを用いることができる。具体的に好適なプラスミド
としては、gag遺伝子産物をコードするDNAとしてはpTAG
424A（FERM BP−341）、およびpAFA10（ATCC39582）
を、env遺伝子産物をコードするDNAとしてはpEFM2をあ
げることができる。pEFM2を含む大腸菌はEscherichia c
oli EEFM2として昭和60年８月８日付で、米国アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC53228と
して寄託されている。pEFM2は第３図に示す様にtrp系の
プロモーターの支配下にATLVのenv遺伝子によりコード
される抗原ポリペプチドの一部が発現する構造をしてい
る。pEFM2により発現されるポリペプチドのアミノ酸配
列、およびその遺伝子の塩基配列は第１表に示した。

このポリペプチドは、ATLVのenv遺伝子によりコードさ
れる抗原ポリペプチド群のうちgp62の６番目のシステイ
ンから295番目のプロリンまでを含み（Ｎ末端のシグナ
ルペプチド20アミノ酸を除いて番号をつけた）、さらに
Ｎ末端にMet−Asp−Pro−Cysが、Ｃ末端にLysが付いた
構造となっている。

これらの抗原ポリペプチドのうち、env遺伝子により
コードされる抗原ポリペプチドは、ATLVの感染により発
現する外被蛋白質抗原（表面抗原）であることが知られ
ているので、ATLV感染の診断、ATLV感染の防止、ATLの
治療、さらにはサブユニットワクチンとしての応用も期
待される。

ベクターDNAとしては、挿入した目的DNAが微生物中で
発現できるものなら、いかなるものも用いることができ
る。好ましくは、適当なプロモーター、たとえばトリプ
トファン（trp）系、ラクトース（lac）系のプロモータ
ーを持ち、その下流に目的DNAを挿入でき、しかもシャ
インダルガーノ配列（以下SD配列と略記する）と翻訳開
始コドン（ATG）との間を適当な距離、例えば６〜18塩
基数に調節したプラスミドを用いることができる。具体
的に好適なプラスミドとしてはpGEL1をあげることがで
きる。

pFEL1を含む大腸菌はEscherichia coli IGEL1（FERM BP
−629）として昭和59年10月６日付で工業技術院微生物
工業技術研究所（微工研）に寄託されている。

さらには、大腸菌由来の転写終結のシグナルを持つプ
ラスミドであれば好適である。具体的にはpKYP26をあげ
ることができる。pKYP26を含む大腸菌はEscherichia co
li IKYP26（FERM BP−863）として昭和60年８月８日付
で微工研に寄託されている。このプラスミドは第２図に
示す構造を持ち、制限酵素BamH IとBgl IIの切断部位の
間に、大腸菌のリポ蛋白質（以下“lpp"と略記する）の
転写終結のシグナルを含み、その上流に合成DNAを用い
てCGTACCTAAGTAATTAAGGATCCで示される配列が導入して
ある。この上流にポリペプチドをコードするDNA断片を
組み込めば、合成DNA由来の蛋白質合成終結コドン（上
記の塩基配列中で下線で示したTAAの配列）のいずれか
で蛋白質合成が終結する。

抗原ポリペプチドをコードするDNAとベクターDNAとの
組換えは、制限酵素を用いて両DNAを消化後、T4DNAリガ
ーゼを用いて結合する一般的組換えDNA技法を用いて行
うことができる。結合に際しては、制限酵素を用いて消
化したDNA断片の末端を、DNAポリメラーゼＩ・Kl enow
断片を用いる埋め込み反応、T4DNAポリメラーゼを用い
る埋め込み反応または削り込み反応を利用して加工する
方法やDNAリンカーを用いる方法によっても行うことが
できる。

上記組換えDNA技法に必要な反応条件は次のとおりで
ある。

DNAの制限酵素による消化は通常0.1〜100μｇのDNAを
２〜200ミリモル（好ましくは10〜40ミリモル）のトリ
ス塩酸（Tris−HCl）（pH6.0〜9.5、好ましくはpH7.0〜
8.0）、１〜200ミリモルのNaCl、２〜20ミリモル（好ま
しくは５〜10ミリモル）のMgCl₂中で制限酵素0.1〜300
単位（好ましくは１μｇのDNAに対し１〜３単位の酵
素）を用い、18〜42℃（好ましくは32〜38℃）におい
て、15分〜24時間消化反応を行う。反応の停止は通常55
〜75℃（好ましくは63〜70℃）で５〜30分間加熱するこ
とによるが、フェノールやジエチルピロカーボネートな
どの試薬により制限酵素を失活させる方法も用いること
ができる。

制限酵素消化によって生じたDNA断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ウイスランダー
（L.Wieslander）：アナリティカル・バイオケミストリ
ィ（Analytical Biochemistry），98,305（1979），以
下LGT法と略記する〕やポリアクリルアミドゲル電気泳
動法〔エイ・エム・マキサム（A.M.Maxam）ら；プロシ
ィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オ
ブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560（197
7）〕などによって行う。

DNA断片を結合させる場合は２〜200ミリモル（好まし
くは10〜70ミリモル）のトリス塩酸（pH6.0〜9.5、好ま
しくはpH7.0〜8.0）、２〜20ミリモル（好ましくは５〜
10ミリモル）のMgCl₂、0.1〜10ミリモル（好ましくは0.
5〜２ミリモル）のATP、１〜50ミリモル（好ましくは５
〜10ミリモル）のジチオスレイトール中でT4DNAリガー
ゼ0.1〜10単位を用いて１〜37℃（好ましくは３〜20
℃）で15分〜72時間（好ましくは２〜20時間）結合反応
を行う。

結合反応によって生じた組み換え体プラスミドDNA
は、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス・エヌ・
コーエン（S.N.Cohen）ら：プロシィーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）,USA69,2110（1972）〕によって、
大腸菌に導入する。

組換え体プラスミドDNAを持つ大腸菌から該DNAの単離
は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーンボイ
ム（H.C.Birnboim）ら：ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ（Nucleic Acids Research）７,1513（1979）〕な
どを用いて行う。

プラスミドDNAを１〜10種類の制限酵素で消化後アガ
ロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気泳
動により切断部位を調べる。さらにDNAの塩基配列を決
定する必要があるときはマキサム・ギルバート法〔プロ
シィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA.,74,560
（1977）〕またはM13ファージを用いたサンガー法〔サ
ンガー（Sanger）らプロシィーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.）USA.,74,5463（1977）；アマーシャム（Ame
rsham）社M13クローニング・アンド・シークエンシング
・ハンドブック（Cloning and sequencing handboo
k）〕によって決定する。

以上のような条件で組換え体プラスミドDNAを製造す
ることができる。

本発明のハイブリッド抗原ポリペプチドは以下のとお
りに製造できる。

すなわち、プラスミド（例えばpET17）を用いて大腸
菌Ｋ−12 HB101（ボリバー（Bolivar）ら、ジーン（Gen
e）２,75（1977）〕を形質転換させ、アンピシリン耐性
（Ap^R以下同じ）のコロニー中からpET17を有する大腸菌
を選びだす。pET17を有する大腸菌を培地に培養するこ
とにより培養物中にハイブリッド抗原ポリペプチドを生
成させることができる。

ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにハイ
ブリッド抗原ポリペプチドの生産に好適なものならば、
合成培地、天然培地のいずれも使用できる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクト
ース、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど
が、窒素源としては、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、カザミノ酸、
酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バクトトリプト
ン、コーン・スティープリカーなどが、その他の栄養源
としては、K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl、MgSO₄、ビタミン
B₁、MgCl₂などが使用できる。

培養はpH5.5〜8.5、温度18〜40℃で通気攪拌培養によ
り行われる。

培養５〜90時間で培養菌体中にハイブリッド抗原ポリ
ペプチドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌し、菌
体をリゾチーム処理後、凍結融解を繰り返して菌体を破
砕し、遠心して得られる沈澱から通常のポリペプチドの
抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。

また、該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ
のサンプルバッファー〔レムリ（Laemmli），ネイチャ
ー（Nature），227,680（1970）〕に加熱溶解後、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動〔レムリの方法：同上
文献〕にかけ、コマジブリリアントブルー染色（小関，
志村編、「分子遺伝学実験法」共立出版353ページ,1983
年）によって行う。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１ プラスミドpKYP26およびpEFM2の分離精製 pKYP26を含む大腸菌〔Escherichia coli IKYP26（FER
M BP−863）〕およびpEFM2を含む大腸菌〔Escherichia
coli EEFM2（ATCC53228）〕をそれぞれ50μg/mlのアン
ピシリンを含むＬ培地（１％バクトトリプトン、0.5％
酵母エキス、１％NaCl pH7.5）10ml、で37℃、18時間培
養した。この培養液全量を50μg/mlのアンピシリンを含
むＬ培地１に植菌し、37℃で培養した。４時間後に、
クロラムフェニコールを170μg/mlとなるように加え、
さらに37℃、16時間培養した。遠心分離法（5,000rpm10
分間）により集菌を行い、0.8％NaClで菌体を洗浄した
後、50mMトリス塩酸（pH8.0）20mlに懸濁し、氷冷し
た。10mg/mlのリゾチームを8ml加え氷中に10分間静置し
た後、0.5M EDTAを9.6ml加え、氷中に10分間静置し、２
％トリトンＸ−100（和光純薬工業社製）を2.3ml加え氷
中にさらに１時間静置した。

50,000×ｇで４℃、１時間超遠心分離を行い、上清約40
mlを得た。次にこの上清に3M NaOHを加えpHを12.5とし
て、室温で10分間静かに攪拌した。2Mトリス塩酸（pH7.
5）を加え、pHを8.5にもどし、さらに３分間攪拌した。
この時点で液の容量は約55mlであった。1/9容の5M NaCl
を加えた後、10mMトリス塩酸（pH7.5）、1mM EDTAで飽
和したフェノールを等量加え、激しく攪拌した後、低速
遠心分離法（3,300rpm、10分間、以下同条件）により水
層を集めた（以下、この処理をフェノール抽出と略記す
る）。1/250容の5mg/ml RNase A（シグマ社製）を加
え、37℃、１時間RNA分解反応を行った後、1/5容の5M N
aClを加え、1/3容の30％PEG6000（半井化学薬品社製）
を加え−20℃に２時間静置した。遠心分離法で沈殿を集
め、10mMトリス塩酸（pH7.5）および1mM EDTAからなる
液2mlに溶かし、ソジウム・ドデシル・サルフェイト（S
DS）を0.5％となるように加え、Proteinase K（シグマ
社製）を50μg/mlとなるように加えて、37℃、１時間蛋
白質分解反応を行った。フェノール抽出を３回繰り返し
行った後、等量のクロロホルムを加え、激しく攪拌した
後低速遠心分離法により水層を集めた。1/10容の3M酢酸
ナトリウムを加え、2.5倍容のエタノールを加え、−20
℃、１時間静置した。冷却遠心分離法（４℃、11,000rp
m10分間）で沈殿を集め、10mMトリス塩酸（pH7.5）およ
び1mM EDTAからなる液1mlに溶かした。このようにしてp
KYP26およびpEFM2を各々800μｇを得ることができた。p
KYP26の構造は、EcoRI,KpnI,BamHI,BglII,PstIで切断し
てアガロースゲル電気泳動で確認した。またpEFM2の構
造は、XhoI、KpnI,BglII,HpaI,PstIで切断してアガロー
スゲル電気泳動で確認した。

実施例２ ATLVのP24遺伝子を含むプラスミドDNAの造成 （１）pAFB7の造成： pGEL1〔Escherichia coli IGEL1（FERM BP−629）か
ら常法により採取〕の５μｇを10mMトリス塩酸（pH7.
5）、7mM MgCl₂6mMメルカプトエタノールおよび100mM N
aClを含む溶液（以下、Ｙ−100緩衝液と略記する）40μ
ｌに溶かし、制限酵素PstI（宝酒造社製、以下特記しな
い限り制限酵素は宝酒造社製を用いた）10単位、BamHI8
単位を加え、37℃、２時間消化反応を行った。この反応
液からLGT法によりlppターミネーターを含む約1,700bp
のDNA断片を約0.2μｇ得た。

これとは別に、pGEL1の10μｇを100μｌのＹ−100緩
衝液に溶かし、制限酵素PstIを16単位加え、37℃、１時
間消化反応を行った。アガロースゲル電気泳動法により
PstI消化が完全に行われたのを確認した後、制限酵素Hp
aIを３単位加え、37℃、30分間消化反応を行いHpaI部分
分解を行った。この反応液からLGT法によりtrp系のプロ
モーターを含む約940bpの部分分解DNA断片約0.2μｇを
得た。

次に、pAFA10（ATCC39582に担持された第１図に示す
プラスミド）の30μｇを250μｌのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素HpaI40単位、BamHI30単位を加え、37℃、
３時間消化反応を行い、この反応液からLGT法でP24遺伝
子を含む、約700bpのDNA断片を約0.5μｇ得た。

上記で得たpGEL1由来のPstI−BamHI断片（約1,700b
p）約0.1μｇ、PstI−HpaI断片（約940bp）約0.15μｇ
およびpAFA10由来のHpaI−BamHI断片（約700bp）約0.2
μｇを20mMトリス塩酸（pH7.5）10mM MgCl₂、10mMジチ
オスレイトールおよび1mM ATPを含む溶液（以下、T4DNA
リガーゼ緩衝液と略記する）20μｌに溶かし、３単位の
T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）を加え、４℃、16時間結
合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株〔ボリバーら、ジー
ン２,75（1977）〕を形質転換し、Ap^Rのコロニーを得、
このコロニーよりバーンボイムらの方法〔ヌクレイック
・アシド・リサーチ７,1513（1979）〕によりプラスミ
ドDNAを回収し、第１図に示したpAFB7を得た。

（２）pAAB6の造成： pTAG424A（FERM BP−341に担持された第２図に示すプラ
スミド。特開昭60−61534）２μｇを20μｌのＹ−100緩
衝液に溶かし制限酵素BamHIを４単位加え、37℃、２時
間消化反応を行った。つづいて該溶液のNaCl濃度を150m
Mになるように調整し、制限酵素NcoI（ニッポンジーン
社製）を４単位加え、37℃、２時間消化反応を行った。
つづいて、BamHI、NcoIで切断したDNAを33mMトリス−酢
酸（pH7.9）、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウ
ム、5mMジチオスレイトール、および0.4mMのdATP、dCT
P、dGTP、dTTPを含む溶液（以下、T4DNAポリメラーゼ緩
衝液と略記する）20μｌに溶かし、T4DNAポリメラーゼ
（宝酒造社製）１単位を加え、37℃、30分反応を行っ
た。

上記の酵素処理液を20μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に
溶かし、３単位のT4DNAリガーゼを加え、４℃、18時間
結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap^Rの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第２図に示したpAA
B6を得た。

（３）pAHA1の造成： 前項で得たpAAB6の15μｇを100μｌのＹ−100緩衝液
に溶かし、制限酵素StuI15単位とClaI〔ニュー・イング
ランド・バイオ・ラブス（New England Bio Labs）社
製〕20単位を加え、37℃、３時間消化反応を行い、この
反応液からLGT法でp24遺伝子の前半部分を含む約400bp
のDNA断片を約0.3μｇ得た。

次にpGEL1の５μｇを40μｌのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素ClaI〔ニュー・イングランド・バイオ・ラ
ブス（New England Bio Labs）社製〕５単位、PstI18単
位を加え、37℃、２時間消化反応を行った。この反応液
からLGT法でtrp系のプロモーター部分を含む約1,000bp
のDNA断片を約0.2μｇ得た。

これとは別に、実施例１で得たpKYP26の２μｇを10mM
トリス−HCl（pH7.5）7mM MgCl₂、6mMメルカプトエタノ
ールおよび10mM NaClを含む溶液（以下、Ｙ−10緩衝液
と略記する）30μｌに溶かし、制限酵素KpnI5単位を加
え、37℃、２時間消化反応を行った。このKpnIで切断し
たDNAを20μｌのT4DNAポリメラーゼ緩衝液に溶かしT4DN
Aポリメラーゼ１単位を加え、37℃、30分間反応をおこ
なった。このDNA反応液を30μｌのＹ−100緩衝液に溶か
し、制限酵素PstI4単位を加え、37℃、２時間消化反応
を行った。この反応液からLGT法でlpp系のターミネータ
ー部分を含む約1,700bpのDNA断片を約0.2μｇ得た。

上記で得たpAAB6由来のStuI−ClaI断片（約400bp）約
0.1μｇ、pGEL1由来のClaI−PstI断片（約1,000bp）約
0.2μｇ、pKYP26由来のKpnI−PstI断片（約1,700bp）約
0.1μｇを30μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶かし、４単
位のT4DNAリガーゼを加え、４℃、18時間結合反応を行
った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap^Rの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第２図に示したpAH
A1を得た。

（４）pAFG10の造成 前項で得たpAHA1の５μｇを50μｌのＹ−100緩衝液に
溶かし、制限酵素PstIを８単位加え、37℃、２時間消化
反応を行った。この反応液からLGT法でtrp系のプロモー
ター部分およびP24遺伝子のＮ末端部分を含む約1,100bp
のDNA断片を約0.5μｇ得た。

次に、第１項で造成したpAFB7の６μｇを、30μｌの
Ｙ−100緩衝液に溶かし、制限酵素BamHIを８単位加え、
37℃、２時間消化反応を行った。この反応液に0.2Mトリ
ス−HCl（pH8.0）、120mM CaCl₂、120mM MgCl₂、2M NaC
lおよび10mM EDTAからなる液５μｌを加え、滅菌水を15
μｌ加え、30℃に３分間保温した。BAL31ヌクレアーゼ
〔ベセズダ・リサーチ・ラボラトリース（Bethesda Res
earch Laboratories）社製〕を10単位加え30℃で80秒間
分解反応を行った。反応後フェノール抽出を行い、エタ
ノール沈殿法でDNAを回収した。このDNAを30μｌのＹ−
100緩衝液に溶かし、制限酵素PstIを８単位加え、37
℃、２時間消化反応を行った。この反応液からLGT法
で、P24遺伝子部分を含む約450bpのDNA断片を約0.1μｇ
得た。

上記で得たpAHA1由来のPstI断片（約1,100bp）約0.2
μｇ、pAFB7由来のPstI−BAL31ヌクレアーゼ分解断片
（約450bp）0.1μｇ、および前項で得たpKYP26由来のKp
nI−PstI断片（約1,700bp）0.1μｇを30μｌのT4DNAリ
ガーゼ緩衝液に溶かし、T4DNAリガーゼ６単位を加え、
４℃、18時間結合反応を行った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap^Rの
コロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの
方法によりプラスミドDNAを回収し、第３図に示したpAF
G10を得た。P24をコードする領域のＣ末端の塩基配列を
決定したところ、第３図に示した様にP24のＣ末端まで
を含み、さらにVal・Val・Leu・Ser・Asnが付いた構造
になっていることが確認された。pAFG10のコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列および、その遺伝子の塩基配
列は第２表に示した。

実施例３ ATLVのgag遺伝子によりコードされる抗原ポ
リペプチドとenv遺伝子によりコードされる抗原ポリペ
プチドとが融合したハイブリッド抗原ポリペプチドをコ
ードする組換え体プラスミドpET17の造成： 実施例２で得た組換え体プラスミドpAFG10の10μｇを10
0μｌのＹ−100緩衝液に溶かし、制限酵素XhoIを10単
位、StuIを12単位加え、37℃、３時間消化反応を行っ
た。

この反応液からLGT法によりトリプトファン系のプロモ
ーターとP24遺伝子の前半を含む約630bpのDNA断片約0.5
μｇを得た。

次に実施例１で得たpEFM2の５μｇを50μｌのＹ−100
緩衝液に溶かし、制限酵素XhoIを10単位、HpaIを８単位
加え、37℃、３時間消化反応を行った。この反応液から
LGT法により、env遺伝子の後半を含む約2,700bpのDNA断
片を約１μｇ得た。

上記で得たpAFG10由来のXhoI−StuI断片（約630bp）
0.05p moleとpFM2由来のXhoI−HpaI断片（約2,700bp）
0.01p moleを40μｌのT4DNAリガーゼ緩衝液に溶かし、T
4DNAリガーゼ５単位を加え、４℃、18時間結合反応を行
った。

該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換しAp^Rのコ
ロニーを得、このコロニーより前記バーンボイムらの方
法によりプラスミドDNAを回収し、第４図に示したpET17
を得た。pET17がコードするgag遺伝子によりコードされ
る抗原ポリペプチドとenv遺伝子によりコードされる抗
原ポリペプチドとの融合ポリペプチドのアミノ酸配列、
およびその遺伝子の塩基配列は第３表に示した。

実施例４ pET17を保有する大腸菌によるgag遺伝子によりコード
される抗原ポリペプチドとenv遺伝子によりコードされ
る抗原ポリペプチドとの融合ポリペプチドの生産 実施例３で得られた組換え体プラスミドpET17を用い
常法により大腸菌W3110StrA株（FERM BP−732）を形質
転換した。得られたAp^Rのコロニーを8mlのMCG培地〔0.6
％Na₂HPO₄、0.3％KH₂PO₄、0.5％NaCl、0.1％NH₄Cl、0.5
％グルコース、0.5％カザミノ酸、1mM MgSO₄、４μg/ml
ビタミンB₁、pH7.2〕に接種し、30℃で18時間培養し
た。得られた培養液を8,000rpm、10分間遠心して菌体を
回収した。この菌体をレムリのサンプルバッファーに懸
濁後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子量約2
5,000の部位にポリペプチドバンドを検出した。このバ
ンドは該プラスミドを含まない大腸菌を用いた場合には
存在しなかった。

このポリペプチドの分子量は、プラスミドpET17の構造
から予想されるハイブリッド抗原ポリペプチドの分子量
（25,051.02）と一致した。また、このようにして製造
したハイブリッド抗原ポリペプチドとgag遺伝子産物で
あるP24（特願昭59−24187に記載の方法で製造した）と
を用いてELISA法〔田口ら、ガン、74,185（1983）〕でA
TL患者血清と反応性を調べた。その結果ハイブリッド抗
原ポリペプチドはP24と反応するATL患者血清と反応する
のに加えて、P24と反応しないATL患者血清とも反応し
た。このことから、このハイブリッド抗原ポリペプチド
は、ATLVのgag遺伝子によりコードされる抗原ポリペプ
チドとenv遺伝子によりコードされる抗原ポリペプチド
とが融合した形であることが判明した。従って、上記の
ハイブリッド抗原ポリペプチドは抗ATLA抗体を検出する
血清診断に用いるのに極めて有効であると考えられる。

発明の効果 本発明によれば、２種以上の抗原ポリペプチドが融合
した形の融合抗原ポリペプチドを大量に製造することが
でき、これは抗原ポリペプチドで感染した患者、たとえ
ばATLVに感染した患者の血清の診断に利用することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpAFB7の造成工程を示す。 第２図はプラスミドpAHA1の造成工程を示す。 第３図はプラスミドpAFG10の造成工程を示す。 第４図はプラスミドpET17の造成工程を示す。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】成人Ｔ細胞白血病ウイルスのgag遺伝子も
   しくはその一部によりコードされる抗原ポリペプチドと
   成人Ｔ細胞白血病ウイルスのenv遺伝子もしくはその一
   部によりコードされる抗原ポリペプチドとが融合した形
   の融合抗原ポリペプチド。