BR112020001627A2 - fibroína modificada, ácido nucleico, vetor de expressão, hospedeiro, produto, fibra de fibroína artificialmente modificada, e, método para a produção de uma fibra de fibroína artificialmente modificada. - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se à fibroína modificada contendo uma sequência de domínio representada pela fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-(A)n, sendo que a sequência de domínio tem uma sequência de aminoácidos tendo um teor reduzido de resíduos de glutamina em associação com a deleção de um ou múltiplos resíduos de glutamina em REP ou a substituição de um ou múltiplos resíduos de glutamina em REP por outros resíduos de aminoácidos. [Na fórmula 1 e na fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos composta de 4 a 27 resíduos de aminoácidos, sendo que a razão do número de resíduos de alanina relativo ao número total de resíduos de aminoácidos em motivo (A)n é de 80% ou mais; REP representa uma sequência de aminoácidos composta de 10 a 200 resíduos de aminoácidos; m representa um número inteiro de 10 a 300; e múltiplas partes de motivos (A)n ou semelhantes podem ter mutuamente a mesma sequência de aminoácidos ou podem ter mutuamente diferentes sequências de aminoácidos.]

Description

1 / 109 FIBROÍNA MODIFICADA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, HOSPEDEIRO, PRODUTO, FIBRA DE FIBROÍNA ARTIFICIALMENTE MODIFICADA, E, MÉTODO PARA A

PRODUÇÃO DE UMA FIBRA DE FIBROÍNA ARTIFICIALMENTE MODIFICADA

DESCRIÇÃO Título da invenção

FIBROÍNA MODIFICADA Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a uma fibroína modificada. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma fibroína modificada com um teor reduzido de resíduo de glutamina. A presente invenção refere-se, também, a um ácido nucleico que codifica uma fibroína modificada, um vetor de expressão incluindo a sequência de ácido nucleico, um hospedeiro transformado com o vetor de expressão, e um produto feito a partir de uma fibroína modificada. Técnica anterior

[002] A fibroína é uma proteína fibrosa e contém até 90% de resíduos de glicina, alanina e serina resultando na formação de uma folha β-pregueada (Literatura Não Patente 1). As proteínas (proteínas da seda, proteínas da seda de vespão, e proteínas da seda de aranhas) e semelhantes constituindo o fio produzido pelos insetos e pelas aranhas são conhecidas como fibroína.

[003] As proteínas da seda têm excelentes propriedades mecânicas, propriedades higroscópicas e propriedades desodorantes e são amplamente usadas como matérias-primas para peças de roupa. Além disso, o fio da seda é uma fibra natural imunotolerante e tem biocompatibilidade alta, e é, por conseguinte, também usada para suturas cirúrgicas.

[004] Há até sete tipos de glândulas de seda em aranha, cada uma

2 / 109 das quais produz fibroína (a proteína da seda de aranhas) com propriedades diferentes. De acordo com o órgão da fonte, as proteínas da seda de aranhas são chamadas de uma proteína araneídea de glândula ampulada maior (MaSp, Major ampullate Spider protein) com tenacidade alta, a uma proteína araneídea de glândula ampulada menor (MiSp, Minor ampullate Spider protein) com alongabilidade alta, e proteínas de seda araneídea flageliforme (Flag), tubuliforme, agregada, aciniforme, e piriforme. Em particular, estudos estruturais têm sido intensivamente conduzidos na proteína anareídea de glândula ampulada maior que apresenta tenacidade alta devido ao fato de que a proteína tem excelentes resistência e alongabilidade (Literatura de Patente 1 e Literatura de Patente 2).

[005] Como uma estrutura específica à fibroína, é conhecida uma estrutura na qual motivos de aminoácidos classificados como GPGXX, uma região rica em resíduos de alanina ((A)n ou (GA)n), GGX, e um espaçador são repetidos (Literatura Não Patente 2). Além disso, tem sido relatado que a substituição do motivo (GA)n pelo motivo (A)n resulta em alongabilidade reduzida mas em resistência à tração aumentada, um aumento no número de motivos GPGXX resulta em alongabilidade aumentada, e a substituição de vários motivos GPGXX pelos motivos (A)n resulta em resistência à tração aumentada (Literatura de Patente 2). Além disso, é considerado que os motivos GGX e GPGXX têm uma estrutura helicoidal flexível que concede elasticidade ao fio (Literatura de Patente 3).

[006] Proteínas recombinantes da seda de aranhas e proteínas recombinantes da seda são produzidas em vários sistemas de produção de proteínas heterólogas. Por exemplo, têm sido relatados muitos casos de produção de fibroína recombinante por organismos como cabra, bicho-da-seda, planta, célula de mamífero, levedura, fungo, bactéria gram-negativa, e bactéria gram-positiva, e determinados resultados têm sido obtidos. (Literatura Não Patente 3, Literatura de Patentes 4 e 5).

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[007] Uma fibra de fibroína obtida por fiação tem a propriedade de encolhimento quando imersa em água ou água quente, exposta a um ambiente de umidade alta, ou semelhantes. Esta propriedade causa problemas no processo de fabricação e na produção, e também afeta o produto feito da fibra.

[008] Como um método de antiencolhimento para prevenir o encolhimento do produto, por exemplo, são descritos um método para prevenir o encolhimento de um tecido de seda, no qual o tecido de seda que usa uma fibra torcida forte que tem sido lavada é imerso em água, outro solvente, ou um solvente misto dos mesmos em um estado de tensão e aquecido durante um tempo predeterminado (Literatura de Patente 6), um método para fixar um formato de um produto de fibra animal, no qual o produto de fibra animal moldado em uma forma requerida é submetido a um tratamento de ser colocado em contato com um vapor de água saturado de alta pressão a de 120°C a 200°C para fixar o formato no momento do tratamento com vapor de água (Literatura de Patente 7), e semelhantes.

LISTA DE CITAÇÕES Literatura de Patente

[009] [Literatura de Patente 1] Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 2012-55269, [Literatura de Patente 2] Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 2005-502347, [Literatura de Patente 3] Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 2009-505668, [Literatura de Patente 4] Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 2014-502140, [Literatura de Patente 5] Publicação de Patente Internacional nº WO2015/042164, [Literatura de Patente 6] Publicação de Patente Japonesa

4 / 109 Examinada nº H2-6869, [Literatura de Patente 7] Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H6-294068. Literatura Não Patente

[0010] [Literatura Não Patente 1] Asakura et al., “Encyclopedia of Agricultural Science”, Academic Press: New York, NY, 1994, Vol. 4, pp. 1-11, [Literatura Não Patente 2] Microbial Cell Factories, 2004, 3:14, [Literatura Não Patente 3] Science, 2002, Vol. 295, pp. 472-476.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problemas a serem solucionados pela invenção

[0011] Os métodos de antiencolhimento, como descritos nas Literaturas de Patente 6 e 7, são, por um lado, industrialmente desvantajosos porque a operação é complicada e o número de etapas é aumentado. Por outro lado, seria industrialmente útil se o encolhimento da própria fibra de pudesse ser suprimido ou reduzido. Entretanto, até a presente data, não é conhecida fibra de fibroína tendo um encolhimento suprimido ou reduzido, ou uma fibroína modificada constituindo a fibra de fibroína.

[0012] Um objetivo da presente invenção é prover uma fibroína modificada capaz de fiação de uma fibra de fibroína com encolhimento reduzido. Meios para solucionar os problemas

[0013] Os presentes inventores verificaram que uma fibra de fibroína com encolhimento reduzido pode ser obtida pela redução do teor de resíduo de glutamina presente em fibroína. Ademais, os presentes inventores verificaram que o filme obtido por moldagem da fibroína tem impermeabilidade à agua. A presente invenção tem sido completada baseada

5 / 109 em tais novas verificações.

[0014] Isto é, a presente invenção refere-se a, por exemplo, cada uma das seguinte invenções.

[1] Uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, na qual a sequência de domínio tem uma sequência de aminoácidos com um teor reduzido de um resíduo de glutamina equivalente a um aminoácido no qual um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP estão deletados ou substituídos por outros resíduos de aminoácidos, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. [Na Fórmula 1 e na Fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos e o número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é 80% ou mais. REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos. m representa um número inteiro de 10 a 300. Uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos. Uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.]

[2] A fibroína modificada de acordo com o aspecto [1], na qual a REP contém um motivo GPGXX (onde X representa um resíduo de aminoácido diferente de um resíduo de glicina) e tem um teor de motivo GPGXX de 10% ou mais.

[3] A fibroína modificada de acordo com o aspecto [1] ou [2], na qual uma taxa de teor de resíduo de glutamina é 9% ou menos.

[4] A fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [3], na qual os outros resíduos de aminoácidos são resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), alanina (A), glicina

6 / 109 (G), treonina (T), serina (S), triptofano (W), tirosina (Y), prolina (P) e histidina (H).

[5] A fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [4], na qual uma hidrofobicidade da REP é -0,8 ou mais.

[6] A fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [5], incluindo, adicionalmente, uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos estão substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[7] A fibroína modificada de acordo com o aspecto [6], na qual a fibroína de ocorrência natural é uma fibroína derivada de insetos ou aranhas.

[8] A fibroína modificada de acordo com o aspecto [7], na qual a fibroína de ocorrência natural é uma proteína araneídea de glândula ampulada maior (MaSp) ou uma proteína araneídea de glândula ampulada menor (MiSp) de aranhas.

[9] Uma fibroína modificada incluindo: uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 17; ou uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 17.

[10] A fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [9], incluindo, adicionalmente, uma sequência de etiqueta em qualquer um de ou ambos de um terminal-N e um terminal-C.

[11] A fibroína modificada de acordo com o aspecto [10], na qual a sequência de etiqueta inclui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7.

[12] Uma fibroína modificada incluindo: uma sequência de

7 / 109 aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 20; ou uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 20.

[13] Um ácido nucleico que codifica a fibroína modificada de acordo com o aspectos [1] a [12.]

[14] Um ácido nucleico que hibridiza com uma fita complementar do ácido nucleico de acordo com o aspecto [13] sob condições estringentes e que codifica uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. [Na Fórmula 1 e na Fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos e o número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é 80% ou mais, REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos, m representa um número inteiro de 10 a 300, uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos, e uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.]

[15] Um ácido nucleico tendo 90% ou mais de identidade de sequência com o ácido nucleico de acordo com o aspecto [13] e que codifica uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. [Na Fórmula 1 e na Fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos e o

8 / 109 número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é 80% ou mais. REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos. m representa um número inteiro de 10 a 300. Uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos. Uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.]

[16] Um vetor de expressão incluindo: a sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos aspectos [13] a [15]; e uma ou uma pluralidade de sequências regulatórias funcionalmente ligadas à sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer um dos aspectos [13] a [15.]

[17] O vetor de expressão de acordo com o aspecto [16], que é um vetor plasmidial ou um vetor viral.

[18] Um hospedeiro transformado com o vetor de expressão de acordo com o aspecto [16] ou [17.]

[19] O hospedeiro de acordo com o aspecto [18], que é um procarioto.

[20] O hospedeiro de acordo com o aspecto [19], no qual o procarioto é um micro-organismo pertencendo a um gênero selecionado do grupo consistindo em Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium e Pseudomonas.

[21] O hospedeiro de acordo com o aspecto [18], que é um eucarioto.

[22] O hospedeiro de acordo com o aspecto [21], no qual o eucarioto é uma levedura, um fungo filamentoso, ou uma célula de inseto.

[23] O hospedeiro de acordo com o aspecto [22], no qual a levedura é uma levedura pertencendo a um gênero selecionado do grupo consistindo em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Candida, Yarrowia, e Hansenula.

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[24] O hospedeiro de acordo com o aspecto [23], no qual a levedura pertencendo a um gênero Saccharomyces é Saccharomyces cerevisiae, a levedura pertencendo a um gênero Schizosaccharomyces é Schizosaccharomyces pombe, a levedura pertencendo a um gênero Kluyveromyces é Kluyveromyces lactis, a levedura pertencendo a um gênero Trichosporon é Trichosporon pullulans, a levedura pertencendo a um gênero Schwanniomyces é Schwanniomyces alluvius, a levedura pertencendo a um gênero Pichia é Pichia pastoris, a levedura pertencendo a um gênero Candida é Candida albicans, a levedura pertencendo a um gênero Yarrowia é Yarrowia lipolytica, e a levedura pertencendo a um gênero Hansenula é Hansenula polymorpha.

[25] O hospedeiro de acordo com o aspecto [22], no qual o fungo filamentoso é um fungo filamentoso pertencendo a um gênero selecionado do grupo consistindo em Aspergillus, Penicillium, e Mucor.

[26] O hospedeiro de acordo com o aspecto [25], no qual o fungo filamentoso pertencendo a um gênero Aspergillus é Aspergillus oryzae, o fungo filamentoso pertencendo a um gênero Penicillium é Penicillium chrysogenum, e o fungo filamentoso pertencendo a um gênero Mucor é Mucor fragilis.

[27] O hospedeiro de acordo com o aspecto [22], no qual a célula de inseto é uma célula de inseto lepidóptero.

[28] O hospedeiro de acordo com o aspecto [27], no qual a célula de inseto é uma célula de inseto derivada de Spodoptera frugiperda ou uma célula de inseto derivada de Trichoplusia ni.

[29] Um produto incluindo a fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [12], o produto sendo selecionado do grupo consistindo em uma fibra, um fio, um filme, uma espuma, um grão, uma nanofibrila, um gel, e uma resina.

[0015] Além disso, a presente invenção refere-se, também, por

10 / 109 exemplo, a cada uma das seguintes invenções.

[30] Uma fibra de fibroína artificialmente modificada incluindo uma fibroína modificada, na qual a fibra de fibroína artificialmente modificada alonga-se quando umedecida e encolhe quando secada a partir do estado umedecido.

[31] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com o aspecto [30], na qual uma taxa de restauração definida pela Expressão (1) é 95% ou mais. taxa de restauração = (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) × 100 (%) --- (1)

[32] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com o aspecto [30] ou [31], na qual a fibra de fibroína artificialmente modificada é uma fibra tendo uma história de encolhimento de irreversivelmente sendo encolhida pelo contato com a água após a fiação e uma taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) de 2% ou mais. taxa de encolhimento A = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (2)

[33] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [30] a [32], na qual a fibra de fibroína artificialmente modificada é uma fibra tendo uma história de encolhimento de irreversivelmente sendo encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente sendo encolhida pela secagem e uma taxa de encolhimento B definida pela Expressão (3) de maior que 7%. taxa de encolhimento B = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação e então

11 / 109 adicionalmente encolhida pela secagem/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (3)

[34] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [30] a [33], na qual a fibroína modificada é a fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [12.]

[35] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [30] a [34], na qual uma taxa de alongamento definida pela Expressão (4) é 17% ou menos. taxa de alongamento = {(comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) − 1} × 100 (%) --- (4)

[36] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [30] a [35], na qual uma taxa de encolhimento C definida pela Expressão (5) é 15% ou menos. taxa de encolhimento C = {1 − (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida)} × 100 (%) --- (5)

[37] Um método para a produção de uma fibra de fibroína artificialmente modificada, incluindo uma etapa de encolhimento de colocar uma fibra crua, antes do contato com a água e após a fiação, em contato com a água para causar encolhimento irreversível, e então secar a fibra crua para causar encolhimento adicional, no qual a fibra crua inclui uma fibroína modificada.

[38] O método de produção de acordo com o aspecto [37], no qual uma taxa de encolhimento A da fibra crua definida pela Expressão (2) é 2% ou mais. taxa de encolhimento A = {1 − (comprimento da fibra

12 / 109 irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (2)

[39] O método de produção de acordo com o aspecto [37] ou [38], no qual uma taxa de encolhimento B da fibra crua definida pela Expressão (3) é maior que 7%. taxa de encolhimento B = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente encolhida pela secagem/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (3)

[40] O método de produção de acordo com os aspectos [37] a [39], no qual a fibroína modificada é a fibroína modificada de acordo com qualquer um dos aspectos [1] a [12.]

EFEITOS DA INVENÇÃO

[0016] De acordo com a presente invenção, é possível prover uma fibroína modificada capaz de fiação de uma fibra de fibroína com encolhimento reduzido. Além disso, é possível prover uma fibroína modificada capaz de produção de um filme de fibroína tendo absorbância de água reduzida e impermeabilidade à água.

[0017] Além disso, de acordo com a presente invenção, é possível prover uma fibra de fibroína artificialmente modificada na qual o grau de alongamento é aproximadamente o mesmo que o grau de encolhimento (taxa de restauração é próxima de 100%) e que tem a característica de ser capaz de se restaurar para o comprimento original da mesma, e um método para produção da mesma, em um caso no qual a dimensão da mesma altera-se (alongamento e encolhimento) devido ao contato com água e à subsequente secagem.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

[0018] A Fig. 1 é um diagrama esquemático mostrando uma

13 / 109 sequência de domínio de uma fibroína modificada. A Fig. 2 é um gráfico mostrando um exemplo de uma alteração no comprimento de uma fibra de fibroína devido ao contato com a água ou semelhantes. A Fig. 3 é uma vista ilustrativa que esquematicamente mostra um exemplo de um dispositivo de fiação para a produção de fibra crua.

MODALIDADES PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0019] Doravante, serão descritas em detalhe as modalidades para realização da presente invenção. Entretanto, a presente invenção não é limitada pelas seguintes modalidades. [Fibroína modificada]

[0020] A fibroína modificada de acordo com a presente invenção é uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. Na fibroína modificada, uma sequência de aminoácidos (sequência terminal-N e sequência terminal-C) pode ser, adicionalmente, adicionada a qualquer um dos ou ambos de o lado terminal-N e o lado terminal-C da sequência de domínio. A sequência terminal-N e a sequência terminal-C, embora não limitadas às mesmas, são tipicamente regiões que não têm repetições de motivos de aminoácido característicos de fibroína e consistem em aminoácidos de cerca de 100 resíduos.

[0021] O termo “fibroína modificada” como usado na presente invenção significa uma fibroína cuja sequência de domínio é diferente da sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural. A “fibroína de ocorrência natural” referida na presente invenção é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n.

[0022] A “fibroína modificada” pode ser uma fibroína cuja sequência de aminoácidos tem sido modificada baseada na fibroína de ocorrência

14 / 109 natural (por exemplo, a fibroína cuja sequência de aminoácidos tem sido modificada pela alteração de uma sequência de gene clonada de fibroína de ocorrência natural) ou uma fibroína artificialmente desenhada e sintetizada independentemente de fibroína de ocorrência natural (por exemplo, uma fibroína tendo uma sequência de aminoácidos desejada pela síntese química de um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desenhada), desde que ela tenha a sequência de aminoácidos especificada na presente invenção.

[0023] O termo “sequência de domínio”, como usado na presente invenção, refere-se a uma sequência de aminoácidos que produz uma região cristalina (tipicamente, equivalente ao motivo (A)n de uma sequência de aminoácidos) e uma região amorfa (tipicamente, equivalente à REP de uma sequência de aminoácidos) peculiar à fibroína e significa uma sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. Aqui, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos, e o número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é 80% ou mais. REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos. m representa um número inteiro de 10 a 300. Uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos. Uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.

[0024] O motivo (A)n pode ser tal que o número de resíduos de alanina é 80% ou mais com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n, mas é preferivelmente 85% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, e ainda muito mais preferivelmente 100% (o que significa que o motivo (A)n consiste apenas em resíduos de alanina). É preferível que pelo menos sete de

15 / 109 uma pluralidade de motivos (A)n na sequência de domínio consistam apenas em resíduos de alanina. A frase “consistir apenas em resíduos de alanina” significa que o motivo (A)n tem uma sequência de aminoácidos representada por (A)n (onde A representa um resíduo de alanina e n representa um número inteiro de 4 a 27, preferivelmente um número inteiro de 4 a 20, e mais preferivelmente um número inteiro de 4 a 16).

[0025] A fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode ter uma sequência de aminoácidos com um teor reduzido de resíduo de glutamina, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. Visto que a fibroína modificada de acordo com a presente modalidade tem um teor reduzido de resíduos de glutamina, a fibra de fibroína obtida por fiação da fibroína modificada tem encolhimento reduzido. Além disso, o filme obtido por moldagem da fibroína tem impermeabilidade à agua.

[0026] É preferível que a fibroína modificada de acordo com a presente modalidade inclua pelo menos um motivo selecionado dentre o motivo GGX ou o motivo GPGXX (onde G representa um resíduo de glicina, P representa um resíduo de fenilalanina, e X representa um resíduo de aminoácido diferente de um resíduo de glicina) na sequência de aminoácidos de REP. Visto que estes motivos estão incluídos em REP, a alongabilidade da fibroína modificada pode ser aprimorada.

[0027] Em um caso no qual a fibroína modificada de acordo com a presente modalidade inclui um motivo GPGXX em REP, uma taxa de teor de motivo GPGXX é habitualmente de 1% ou mais, pode ser de 5% ou mais, e é preferivelmente 10% ou mais. Com esta configuração, a alongabilidade da fibroína modificada pode ser adicionalmente aprimorada. O limite superior da taxa de teor de motivo GPGXX não é particularmente limitado, pode ser de 50% ou menos e pode ser de 30% ou menos.

[0028] No presente relatório descritivo, a “taxa de teor de motivo GPGXX” é um valor calculado pelo seguinte método.

16 / 109 Em uma fibroína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, em um caso no qual o número obtido pela triplicação do número total dos motivos GPGXX em todas as REPs incluídas em uma sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio (isto é, equivalente ao número total de G e de P nos motivos GPGXX) é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos em todas as REPs excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio e excluindo, adicionalmente, os motivos (A)n é definido como y, a taxa de teor de GPGXX é calculada como x/y.

[0029] Para o cálculo da taxa de teor de motivo GPGXX, a “sequência excluindo uma sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio” é usado para excluir o efeito que ocorre devido ao fato de que a “sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio” (sequência equivalente à REP) pode incluir uma sequência que não é correlacionada com a sequência característica de fibroína, que influencia o resultado do cálculo da taxa de teor de motivo GPGXX em um caso no qual m é pequeno (isto é, em um caso no qual a sequência de domínio é curta). Em um caso no qual um “motivo GPGXX” está localizado no terminal-C de REP, ele é tratado como o “motivo GPGXX” mesmo se “XX” for, por exemplo, “AA”.

[0030] A Fig. 1 é um diagrama esquemático mostrando uma sequência de domínio de uma fibroína modificada. O método de cálculo da taxa de teor de motivo GPGXX será especificamente descrito com referência à Fig. 1. Primeiro, em uma sequência de domínio de uma fibroína modificada mostrada na Fig. 1 (tipo [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n]), visto que todas

17 / 109 as REPs são incluídas na “sequência excluindo uma sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio” (mostrada como “região A” na Fig. 1), o número de motivos GPGXX para o cálculo de x é 7, e x é 7 × 3 =

21. Similarmente, visto que todas as REPs estão incluídas na “sequência excluindo uma sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio” (mostrada como “região A” na Fig. 1), y que é o número total de resíduos de aminoácidos em todas as REPs excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio e excluindo, adicionalmente, motivos (A)n, é 50 + 40 + 10 + 20 + 30 = 150. A seguir, x/y (%) pode ser calculado pela divisão de x por y e é 21/150 = 14,0% em um caso da fibroína modificada da Fig. 1.

[0031] Na fibroína modificada de acordo com a presente modalidade, uma taxa de teor de resíduo de glutamina é preferivelmente 9% ou menos, mais preferivelmente 7% ou menos, ainda mais preferivelmente 4% ou menos, e particularmente preferivelmente 0%. Com esta configuração, o efeito da presente invenção é ainda notavelmente apresentado.

[0032] No presente relatório descritivo, a “taxa de teor de resíduo de glutamina” é um valor calculado pelo seguinte método. Em uma fibroína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, em um caso no qual o número total de resíduo de glutaminas em todas as REPs incluídas em uma sequência (sequência equivalente à “região A” na Fig. 1) excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como w, e o número total de resíduos de aminoácidos em todas as REPs excluindo a sequência do motivo

18 / 109 (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio e excluindo, adicionalmente, motivos (A)n é definido como y, a taxa de teor de resíduo de glutamina é calculada como w/y. Para o cálculo da taxa de teor de resíduo de glutamina, a “sequência excluindo uma sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio” é usada devido à mesma razão descrita acima.

[0033] A sequência de domínio da fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode incluir uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP estão deletados ou substituídos por outros resíduos de aminoácidos, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[0034] O “outro resíduo de aminoácido” pode ser um resíduo de aminoácido diferente de um resíduo de glutamina, mas é preferivelmente de um resíduo de aminoácido tendo um índice de hidropatia maior que aquele de um resíduo de glutamina. Com relação ao índice de hidropatia de resíduos de aminoácidos, índices conhecidos (“Hydropathy Index”: Kyte J, & Doolittle R (1982) de “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp. 105-132) podem ser usados como uma referência. Especificamente, o índice de hidropatia (doravante também chamado de “IH”) de cada aminoácido é como mostrado na Tabela 1 abaixo. [Tabela 1] Aminoácido IH Aminoácido IH Isoleucina (I) 4,5 Triptofano (W) -0,9 Valina (V) 4,2 Tirosina (Y) -1,3 Leucina (L) 3,8 Prolina (P) -1,6 Fenilalanina (F) 2,8 Histidina (H) -3,2 Cisteína (C) 2,5 Asparagina (N) -3,5 Metionina (M) 1,9 Ácido Aspártico (D) -3,5

19 / 109 Alanina (A) 1,8 Glutamina (Q) -3,5 Glicina (G) -0,4 Ácido Glutâmico (E) -3,5 Treonina (T) -0,7 Lisina (K) -3,9 Serina (S) -0,8 Arginina (R) -4,5

[0035] Como mostrado na Tabela 1, os resíduos de aminoácidos tendo um índice de hidropatia mais altos que aquele de um resíduo de glutamina incluem um resíduo de aminoácido selecionado dentre isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S), triptofano (W), tirosina (Y), prolina (P) e histidina (H). Dentre estes, é mais preferível um resíduo de aminoácido selecionado dentre isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M) e alanina (A), e é ainda mais preferível um resíduo de aminoácido selecionado dentre isoleucina (I), valina (V), leucina (L) e fenilalanina (F).

[0036] Em uma fibroína modificada, de acordo com a presente modalidade, a hidrofobicidade de REP é preferivelmente -0,8 ou mais, mais preferivelmente -0,7 ou mais, ainda mais preferivelmente 0 ou mais, ainda muito mais preferivelmente de 0,3 ou mais, e particularmente preferivelmente 0,4 ou mais. O limite superior da hidrofobicidade de REP não é particularmente limitado, pode ser de 1,0 ou menos, e pode ser de 0,7 ou menos.

[0037] No presente relatório descritivo, a “hidrofobicidade de REP” é um valor calculado pelo seguinte método.

[001] Em uma fibroína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, em um caso no qual a soma dos índices de hidropatia de cada resíduo de aminoácido em todas as REPs incluídas em uma sequência (sequência equivalente à “região A” na Fig. 1) excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definida como z, e o número total

20 / 109 de resíduos de aminoácidos em todas as REPs excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio e excluindo, adicionalmente, motivos (A)n é definido como y, a hidrofobicidade de REP é calculada como z/y. Para o cálculo da hidrofobicidade de REP, a “sequência excluindo uma sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio” é usada devido à mesma razão descrita acima.

[0038] A fibroína de ocorrência natural é uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, especificamente, por exemplo, uma fibroína produzida por insetos ou aranhas.

[0039] Exemplos da fibroína produzida por insetos incluem proteínas da seda produzidas por bichos-da-seda como Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea pernyi, Eriogyna pyretorum, Pilosamia Cynthia ricini, Samia cynthia, Caligura japonica, Antheraea mylitta, e Antheraea assama; e proteínas da seda de vespão descarregadas pelas larvas de Vespa simillima xanthoptera.

[0040] Em exemplo mais específico da fibroína produzida por insetos inclui uma cadeia L de fibroína de bicho-da-seda (Nº de Acesso ao GenBank de M76430 (sequência de bases), AAA27840.1 (sequência de aminoácidos)).

[0041] Exemplos da fibroína produzida por aranhas incluem as proteínas da seda de aranhas produzidas pelas aranhas pertencendo ao gênero Araneus como Araneus ventricosus, Araneus diadematus, Araneus pinguis, Araneus pentagrammicus e Araneus nojimai, aranhas pertencendo ao gênero Neoscona como Neoscona scylla, Neoscona nautica, Neoscona adianta e Neoscona scylloides, aranhas pertencendo ao gênero Pronus como Pronous minutes, aranhas pertencendo ao gênero Cyrtarachne como Cyrtarachne

21 / 109 bufo e Cyrtarachne inaequalis, aranhas pertencendo ao gênero Gasteracantha como Gasteracantha kuhli e Gasteracantha mammosa, aranhas pertencendo ao gênero Ordgarius como Ordgarius hobsoni e Ordgarius sexspinosus, aranhas pertencendo ao gênero Argiope como Argiope amoena, Argiope minuta e Argiope bruennich, aranhas pertencendo ao gênero Arachnura como Arachnura logio, aranhas pertencendo ao gênero Acusilas como Acusilas coccineus, aranhas pertencendo ao gênero Cytophora como Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora exanthematica e Cyrtophora unicolor, aranhas pertencendo ao gênero Poltys como Poltys illepidus, aranhas pertencendo ao gênero Cyclosa como Cyclosa octotuberculata, Cyclosa sedeculata, Cyclosa vallata e Cyclosa atrata, e aranhas pertencendo ao gênero Chorizopes como Chorizopes nipponicus; e proteínas da seda de aranhas produzidas pelas aranhas pertencendo ao gênero Tetragnatha como Tetragnatha praedonia, Tetragnatha maxillosa, Tetragnatha extensa e Tetragnatha squamata, aranhas pertencendo ao gênero Leucauge como Leucauge magnifica, Leucauge blanda e Leucauge subblanda, aranhas pertencendo ao gênero Nephila como Nephila clavata e Nephila pilipes, aranhas pertencendo ao gênero Menosira como Menosira ornata, aranhas pertencendo ao gênero Dyschiriognatha como Dyschiriognatha tenera, aranhas pertencendo ao gênero Latrodectus como Latrodectus mactans, Latrodectus hasseltii, Latrodectus geometricus e Latrodectus tredecimguttatus, e aranhas pertencendo à família Tetragnathidae como aranhas pertencendo ao gênero Euprosthenops. Exemplos de proteínas da seda de aranhas incluem as proteínas de fio de tração como MaSp (MaSp1 e MaSp2) e ADF (ADF3 e ADF4), e MiSp (MiSp1 e MiSp2).

[0042] Exemplos mais específicos da fibroína produzida pelas aranhas incluem fibroína-3 (adf-3) [derivada de Araneus diadematus] (Número de Acesso ao GenBank de AAC47010 (sequência de aminoácidos),

22 / 109 U47855 (sequência de bases)), fibroína-4 (adf-4) [derivada de Araneus diadematus] (Número de Acesso ao GenBank de AAC47011 (sequência de aminoácidos), U47856 (sequência de bases)), proteína da seda de linha de segurança espidroína 1 [derivada de Nephila clavipes] (Número de Acesso ao GenBank de AAC04504 (sequência de aminoácidos), U37520 (sequência de bases)), espidroína 1 de glândula ampulada maior [derivada de Latrodectus hesperus] (Número de Acesso ao GenBank de ABR68856 (sequência de aminoácidos), EF595246 (sequência de bases)), proteína da seda de linha de segurança espidroína 2 [derivada de Nephila clavata] (Número de Acesso ao GenBank de AAL32472 (sequência de aminoácidos), AF441245 (sequência de bases)), espidroína 1 de glândula ampulada maior [derivada de Euprosthenops australis] (Número de Acesso ao GenBank de CAJ00428 (sequência de aminoácidos), AJ973155 (sequência de bases)) e espidroína 2 de glândula ampulada maior [Euprosthenops australis] (Número de Acesso ao GenBank de CAM32249.1 (sequência de aminoácidos), AM490169 (sequência de bases)), proteína 1 da seda de glândula ampulada menor [Nephila clavipes] (Número de Acesso ao GenBank de AAC14589.1 (sequência de aminoácidos), proteína 2 da seda de glândula ampulada menor [Nephila clavipes] (Número de Acesso ao GenBank de AAC14591.1 (sequência de aminoácidos)), e proteína tipo espidroína de glândula ampulada menor [Nephilengys cruentata] (Número de Acesso ao GenBank de ABR37278.1 (sequência de aminoácidos)).

[0043] Como um outro exemplo específico de fibroína de ocorrência natural, pode ser mencionada a fibroína cuja informação de sequências está registrada em NCBI GenBank. Por exemplo, as sequências da mesma podem ser confirmadas pela extração de sequências nas quais espidroína, ampulada, fibroína, “seda e polipeptídeo”, ou “seda e proteína” [spidroin, ampullate, fibroin, “silk and polypeptide”, ou “silk and protein”] é descrita como uma palavra-chave em DEFINITION [DEFINIÇÃO] dentre as sequências

23 / 109 contendo INV como DIVISION dentre as informações de sequências registradas em NCBI GenBank, as sequências nas quais uma série de caracteres específica de produtos é descrita a partir de CDS, ou sequências nas quais uma série de caracteres específica é descrita de SOURCE [FONTE] a TISSUE TYPE [TIPO DE TECIDO].

[0044] 663 Tipos de fibroínas (dentre eles, 415 tipos de fibroínas derivadas de aranhas) foram extraídos pela confirmação de fibroínas com informação de sequências de aminoácidos registrada em NCBI GenBank pelo método exemplificado. Dentre todas as fibroínas, houve 129 tipos de fibroína de ocorrência natural incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. Dentre estes, houve seis tipos de fibroína de ocorrência natural cuja taxa de teor de motivo GPGXX calculada pelo método descrito acima é 10% ou mais, como mostrado na Tabela 2 abaixo. A taxa de teor de resíduo de glutamina dos seis tipos de fibroína de ocorrência natural mostrados na Tabela 2 foi de 9,2% ou mais. [Tabela 2] Taxa de teor de motivo Taxa de teor de resíduo Hidrofobicidade de Número de Acesso GPGXX de glutamina REP DQ059135 22,13% 9,27% -1,08 AF350276 22,88% 9,30% -1,08 AF350278 26,28% 13,03% -1,31 NEPFIBPR 22,24% 12,83% -0,29 ADU47855 24,79% 19,21% -1,40 AB829892 14,54% 13,80% -0,11

[0045] A sequência de domínio da fibroína modificada, de acordo com a presente modalidade, pode incluir, adicionalmente, uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, adicionalmente a uma modificação correspondendo a uma modificação na qual um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP são deletados e/ou um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP são substituídos por outros resíduos de

24 / 109 aminoácidos, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. As substituição, deleção, inserção e/ou adição de resíduos de aminoácidos podem ser realizadas por métodos bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica, como mutagênese sítio-direcionada. Especificamente, as modificações podem ser realizadas por um método descrito na literatura como Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), e Methods in Enzymology, 100, 448 (1983).

[0046] A fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode ser obtida, por exemplo, com respeito a uma sequência de gene clonada de fibroína de ocorrência natural, pela deleção de um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP e/ou pela substituição de um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP por outros resíduos de aminoácidos. Além disso, por exemplo, a fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode também ser obtida pelo desenho de uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual com respeito à sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP são deletados e/ou um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP são substituídos por outros resíduos de aminoácidos, e pela síntese química de um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desenhada.

[0047] Um exemplo mais específico da fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser uma fibroína modificada contendo (i) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22, ou (ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22.

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[0048] A fibroína modificada de (i) será descrita.

[0049] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1 (M_PRT410) é uma sequência de aminoácidos modificada obtida pela alteração do número de resíduos de alanina conservativos em motivo (A)n para cinco, ou semelhantes, de modo a aprimorar a produtividade, baseado na sequência de bases e na sequência de aminoácidos de Nephila clavipes (Número de Acesso ao GenBank de: P46804.1, GI: 1174415) que é fibroína de ocorrência natural. Entretanto, visto que M_PRT410 não tem modificação de resíduo de glutamina (Q), a taxa de teor de resíduo de glutamina da mesma é igual ao teor de resíduo de glutamina de fibroína de ocorrência natural.

[0050] A sequência de aminoácidos (M_PRT888) apresentada em SEQ ID NO: 2 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VL.

[0051] A sequência de aminoácidos (M_PRT965) apresentada em SEQ ID NO: 3 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por TS e substituição de Q restante por A.

[0052] A sequência de aminoácidos (M_PRT889) apresentada em SEQ ID NO: 4 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VL e substituição de Q restante por I.

[0053] A sequência de aminoácidos (M_PRT916) apresentada em SEQ ID NO: 5 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VI e substituição de Q restante por L.

[0054] A sequência de aminoácidos (M_PRT918) apresentada em SEQ ID NO: 6 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VF e substituição de Q restante por I.

[0055] A sequência de aminoácidos (M_PRT525) apresentada em SEQ ID NO: 15 é obtida, com respeito à M_PRT410 (SEQ ID NO: 1), pela inserção de dois resíduos de alanina em uma região (A5) na qual os resíduos

26 / 109 de alanina são consecutivos, e pela deleção de duas sequências de domínio no lado terminal-C e substituição de 13 resíduos de glutamina (Q) por resíduo de serina (S) ou resíduo de prolina (P) de modo que o peso molecular da mesma torne-se aproximadamente o mesmo que aquele de M_PRT410.

[0056] A sequência de aminoácidos (M_PRT699) apresentada em SEQ ID NO: 16 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT525 (SEQ ID NO: 15) por VL.

[0057] A sequência de aminoácidos (M_PRT698) apresentada em SEQ ID NO: 17 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT525 (SEQ ID NO: 15) por VL e substituição de Q restante por I.

[0058] A sequência de aminoácidos (M_PRT917) apresentada em SEQ ID NO: 21 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por LI e substituição de Q restante por V.

[0059] A sequência de aminoácidos (M_PRT1028) apresentada em SEQ ID NO: 22 é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por IF e substituição de Q restante por T.

[0060] A taxa de teor de resíduo de glutamina de qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 é 9% ou menos (Tabela 3). [Tabela 3] Taxa de teor de Taxa de teor de Hidrofobicidade de Fibroína modificada resíduo de motivo GPGXX REP glutamina M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) 17,7% 27,9% -1,52 M_PRT888 (SEQ ID NO: 2) 6,3% 27,9% -0,07 M_PRT965 (SEQ ID NO: 3) 0,0% 27,9% -0,65 M_PRT889 (SEQ ID NO: 4) 0,0% 27,9% 0,35 M_PRT916 (SEQ ID NO: 5) 0,0% 27,9% 0,47 M_PRT918 (SEQ ID NO: 6) 0,0% 27,9% 0,45 M_PRT525 (SEQ ID NO: 15) 13,7% 26,4% -1,24 M_PRT699 (SEQ ID NO: 16) 3,6% 26,4% -0,78 M_PRT598 (SEQ ID NO: 17) 0,0% 26,4% -0,03 M_PRT917 (SEQ ID NO: 21) 0,0% 27,9% 0,46 M_PRT1028 (SEQ ID NO: 22) 0,0% 28,1% 0,05

[0061] A fibroína modificada de (i) pode consistir na sequência de

27 / 109 aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22.

[0062] A fibroína modificada de (ii) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22. A fibroína modificada de (ii) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

[0063] A fibroína modificada de (ii) preferivelmente tem a taxa de teor de resíduo de glutamina de 9% ou menos. Além disso, a fibroína modificada de (ii) preferivelmente tem a taxa de teor de motivo GPGXX de 10% ou mais.

[0064] A fibroína modificada descrita acima pode incluir uma sequência de etiqueta em qualquer um de ou ambos de o terminal-N e o terminal-C. Isto torna possível isolar, imobilizar, detectar e visualizar a fibroína modificada.

[0065] A sequência de etiqueta pode, por exemplo, ser uma etiqueta de afinidade que utiliza afinidade específica (afinidade, propriedade de ligação) com outra molécula. Como um exemplo específico da etiqueta de afinidade, pode ser mencionada uma etiqueta de histidina (etiqueta His). A etiqueta His é um peptídeo curto no qual cerca de 4 a 10 resíduos de histidina estão dispostos e tem uma propriedade de especificamente se ligar a um íon de metal, de modo que ela pode ser usada para isolamento de fibroína modificada por cromatografia de quelação de metal. Um exemplo específico da sequência de etiqueta pode ser uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 (sequência de aminoácidos incluindo a etiqueta His).

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[0066] Além disso, pode ser também usada uma sequência de etiqueta como glutationa-S-transferase (GST) que especificamente se liga à glutationa ou uma proteína de ligação à maltose (MBP, Maltose Binding Protein) que especificamente se liga à maltose.

[0067] Além disso, pode também ser usada uma “etiqueta de epítopo” que utiliza uma reação de antígeno-anticorpo. Pela adição de um peptídeo (epítopo) que mostra antigenicidade como uma sequência de etiqueta, pode ser ligado um anticorpo contra o epítopo. Exemplos da etiqueta de epítopo incluem uma etiqueta HA (sequência de peptídeo de hemaglutinina de vírus da influenza), uma etiqueta myc, e uma etiqueta FLAG. A fibroína modificada pode ser facilmente purificada com alta especificidade pela utilização de uma etiqueta de epítopo.

[0068] Também é possível usar uma sequência de etiqueta que pode ser clivada com uma protease específica. Pelo tratamento, com protease, de uma proteína adsorvida mediante uma sequência de etiqueta, também é possível recuperar a fibroína modificada clivada da sequência de etiqueta.

[0069] Um exemplo mais específico da fibroína modificada tendo uma sequência de etiqueta pode ser uma fibroína modificada contendo (iii) uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24, ou (iv) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO: 24.

[0070] As sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 são respectivamente sequências de aminoácidos obtidas pela adição da sequência

29 / 109 de aminoácidos (incluindo a etiqueta His) apresentada em SEQ ID NO: 7 ao terminal-N das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22. Visto que apenas uma sequência de etiqueta é adicionada ao terminal-N, a taxa de teor de resíduo de glutamina não é alterada, e qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 tem a taxa de teor de resíduo de glutamina de 9% ou menos (Tabela 4). [Tabela 4] Taxa de teor de Taxa de teor de Hidrofobicidade de Fibroína modificada resíduo de motivo GPGXX REP glutamina PRT888 (SEQ ID NO: 9) 6,3% 27,9% -0,07 M_PRT965 (SEQ ID NO: 10) 0,0% 27,9% -0,65 M_PRT889 (SEQ ID NO: 11) 0,0% 27,9% 0,45 M_PRT916 (SEQ ID NO: 12) 0,0% 27,9% 0,47 M_PRT918 (SEQ ID NO: 13) 0,0% 27,9% 0,35 M_PRT699 (SEQ ID NO: 19) 3,6% 26,4% -0,78 M_PRT698 (SEQ ID NO: 20) 0,0% 26,4% -0,03 M_PRT917 (SEQ ID NO: 23) 0,0% 27,9% 0,46 M_PRT1028 (SEQ ID NO: 24) 0,0% 28,1% 0,05

[0071] A fibroína modificada de (iii) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.

[0072] A fibroína modificada de (iv) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24. A fibroína modificada de (iv) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

30 / 109

[0073] A fibroína modificada de (iv) preferivelmente tem a taxa de teor de resíduo de glutamina de 9% ou menos. Além disso, a fibroína modificada de (iv) preferivelmente tem a taxa de teor de motivo GPGXX de 10% ou mais.

[0074] A fibroína modificada, mencionada acima, pode incluir um sinal secretório para liberação da proteína produzida no sistema de produção de proteínas recombinantes para fora de um hospedeiros. A sequência do sinal secretório pode ser apropriadamente definida dependendo do tipo do hospedeiro. [Ácido nucleico]

[0075] O ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, codifica a fibroína modificada de acordo com a presente invenção. Exemplos específicos do ácido nucleico incluem ácidos nucleicos que codificam uma fibroína modificada incluindo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22, ou uma proteína ou semelhantes tendo uma sequência de aminoácidos (sequência de etiqueta) apresentada em SEQ ID NO: 7 ligada a qualquer um de ou ambos de o terminal-N e o terminal-C destas sequências de aminoácidos.

[0076] O ácido nucleico, de acordo com uma modalidade, é um ácido nucleico que hibridiza com uma fita complementar do ácido nucleico que codifica a fibroína modificada de acordo com a presente invenção sob condições estringentes e que codifica uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. A fibroína modificada codificada pelo ácido nucleico preferivelmente tem a taxa de teor de resíduo de glutamina de 9% ou menos. Além disso, a fibroína modificada codificada pelo ácido nucleico preferivelmente tem a taxa de teor de motivo GPGXX de

31 / 109 10% ou mais.

[0077] O termo “condições estringentes” refere-se às condições sob as quais um denominado híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. As “condições estringentes” podem ser qualquer uma de condições estringentes baixas, condições moderadamente estringentes e condições elevadamente estringentes. As condições estringentes baixas significam que a hibridização ocorre apena no caso no qual há pelo menos 85% ou mais de identidade entre as sequências, e incluem, por exemplo, condições de hibridização a 42°C usando SSC5× contendo 0,5% de SDS. As condições moderadamente estringentes significam que a hibridização ocorre apena no caso no qual há pelo menos 90% ou mais de identidade entre as sequências, e incluem, por exemplo, condições de hibridização a 50°C usando SSC5× contendo 0,5% de SDS. As condições elevadamente estringentes significam que a hibridização ocorre apena no caso no qual há pelo menos 95% ou mais de identidade entre as sequências, e incluem, por exemplo, condições de hibridização a 60°C usando SSC5× contendo 0,5% de SDS.

[0078] O ácido nucleico de acordo com outra modalidade é um ácido nucleico tendo 90% ou mais de identidade de sequência com o ácido nucleico que codifica a fibroína modificada de acordo com a presente invenção e que codifica uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n. A fibroína modificada codificada pelo ácido nucleico preferivelmente tem a taxa de teor de resíduo de glutamina de 9% ou menos. Além disso, a fibroína modificada codificada pelo ácido nucleico preferivelmente tem a taxa de teor de motivo GPGXX de 10% ou mais. [Hospedeiro e vetor de expressão]

[0079] Um vetor de expressão, de acordo com a presente invenção,

32 / 109 tem uma sequência de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, e uma ou uma pluralidade de sequências regulatórias funcionalmente ligadas à mesma. A sequência regulatória é uma sequência (por exemplo, um promotor, um intensificador, uma sítio de ligação ao ribossomo, ou uma sequência de terminação de transcrição) que controla a expressão de uma proteína recombinante em um hospedeiro, e pode ser apropriadamente selecionada dependendo do tipo do hospedeiro. O tipo do vetor de expressão como um vetor plasmidial, um vetor viral, um vetor cosmidial, um vetor fosmidial, ou um vetor cromossômico artificial, pode ser apropriadamente selecionado dependendo do tipo do hospedeiro.

[0080] O hospedeiro, de acordo com a presente invenção, é um hospedeiro que tem sido transformado com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção. Ambos procariotos e eucariotos como levedura, fungos filamentosos, células de inseto, células de mamíferos, e células de plantas podem ser adequadamente usados como hospedeiros.

[0081] Como o vetor de expressão, é adequadamente usado um vetor de expressão que pode replicar-se autonomamente em uma célula hospedeira ou que pode ser incorporado em um cromossomo de um hospedeiro que contém um promotor em uma posição capaz de transcrição do ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[0082] Em um caso no qual um procarioto como uma bactéria é usado como um hospedeiro, o vetor de expressão, de acordo com a presente invenção, é preferivelmente um vetor que é capaz de replicação autônoma no procarioto e ao mesmo tempo inclui um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção e uma sequência de terminação de transcrição. Um gene que controla um promotor pode ser incluído.

[0083] Exemplos do procarioto incluem micro-organismos pertencendo aos gêneros Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus,

33 / 109 Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium e Pseudomonas.

[0084] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Escherichia incluem Escherichia coli BL21 (Novagen, Inc.), Escherichia coli BL21 (DE3) (Life Technologies Corporation), Escherichia coli BLR (DE3) (Merck KGaA), Escherichia coli DH1, Escherichia coli GI698, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109, Escherichia coli K5 (ATCC 23506), Escherichia coli KY3276, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Escherichia coli No. 49, Escherichia coli Rosetta (DE3) (Novagen, Inc.), Escherichia coli TB1, Escherichia coli Tuner (Novagen, Inc.), Escherichia coli Tuner (DE3) (Novagen, Inc.), Escherichia coli W1485, Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli XL1-Blue, e Escherichia coli XL2-Blue.

[0085] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Brevibacillus incluem Brevibacillus agri, Brevibacillus borstelensis, Brevibacillus centrosporus, Brevibacillus formosus, Brevibacillus invocatus, Brevibacillus laterosporus, Brevibacillus limnophilus, Brevibacillus parabrevis, Brevibacillus reuszeri, Brevibacillus thermoruber, Brevibacillus brevis 47 (FERM BP-1223), Brevibacillus brevis 47K (FERM BP-2308), Brevibacillus brevis 47-5 (FERM BP-1664), Brevibacillus brevis 47-5Q (JCM 8975), Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087), Brevibacillus choshinensis HPD31-S (FERM BP-6623), Brevibacillus choshinensis HPD31-OK (FERM BP-4573), e a cepa Brevibacillus choshinensis SP3 (fabricada pela Takara Bio, Inc.).

[0086] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Serratia incluem Serratia liquefacience ATCC 14460, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia proteamaculans, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, e Serratia rubidaea.

[0087] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero

34 / 109 Bacillus incluem Bacillus subtilis e Bacillus amyloliquefaciens.

[0088] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Microbacterium incluem Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354.

[0089] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Brevibacterium incluem Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum ATCC 14067) ATCC 13826, ATCC 14067, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) ATCC 13665, ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium tiogenitalis ATCC 19240, Brevibacterium album ATCC 15111, e Brevibacterium cerinum ATCC 15112.

[0090] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Corynebacterium incluem Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium·acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539), e Corynebacterium herculis ATCC 13868.

[0091] Exemplos de micro-organismos pertencendo ao gênero Pseudomonas incluem Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas fulva, e Pseudomonas sp. D-0110.

[0092] Como um método para introdução de um vetor de expressão na célula hospedeira mencionada acima, pode ser usado qualquer método desde que ele introduza DNA na célula hospedeira. Exemplos dos mesmos

35 / 109 incluem um método que usa íons cálcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], um método de protoplasto (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº S63-248394), ou um método descrito em Gene, 17, 107 (1982) ou Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).

[0093] A transformação de micro-organismos pertencendo ao gênero Brevibacillus pode ser realizada, por exemplo, pelo método de Takahashi et al. (J. Bacteriol., 1983, 156: 1130-1134), o método de Takagi et al. (Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 3099-3100), ou o método de Okamoto et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61: 202-203).

[0094] Exemplos do vetor no qual é introduzido o ácido nucleico de acordo com a presente invenção (doravante, simplesmente chamado de “vetor”), incluem pBTrp2, pBTac1, e pBTac2 (todos comercialmente disponíveis junto à Boehringer Mannheim GmbH), pKK233-2 (fabricado pela Pharmacia Corporation), pSE280 (fabricado pela Invitrogen Corporation), pGEMEX-1 (fabricado pela Promega Corporation), pQE-8 (fabricado pela QIAGEN Corporation), pKYP10 (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº S58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(-) (fabricado pela Stratagene Corporation), pTrs30 [construído a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [construído a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [construído a partir de Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400), Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº S60-221091], pGKA2 [construído a partir de Escherichia coli IGKA 2 (FERM BP-6798), Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 60-221091], pTerm2 (US 4686191, US 4939094, US 5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (fabricado pela Pharmacia Corporation), e pET Systems (fabricado pela Novagen, Inc.).

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[0095] No caso no qual Escherichia coli é usada como um hospedeiro, pUC18, pBluescriptII, pSupex, pET22b, pCold, ou semelhantes podem ser mencionados como um vetor adequado.

[0096] Exemplos específicos de vetores adequados para micro-organismos pertencendo ao gênero Brevibacillus incluem pUB110 ou pHY500 (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H2-31682), pNY700 (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H4-278091), pHY4831 (J. Bacteriol., 1987, 1239-1245), pNU200 (UDAKA Shigezou, Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, 1987, 61: 669-676), pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30: 75-80), pNU211 (J. Biochem., 1992, 112: 488-491), pNU211R2L5 (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H7-170984), pNH301 (Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58: 525-531), pNH326, pNH400 (J. Bacteriol., 1995, 177: 745-749), e pHT210 (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H6-133782), pHT110R2L5 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42: 358-363), que são conhecidos como vetores de Bacillus subtilis; e pNCO2 (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 2002-238569) que é um vetor bifuncional entre Escherichia coli e um micro-organismo pertencendo ao gênero Brevibacillus.

[0097] O promotor não é limitado desde que ele funcione em uma célula hospedeira. Exemplos do mesmo incluem promotores derivados de Escherichia coli ou de fago como um promotor trp (Ptrp), um promotor lac, um promotor PL, um promotor PR, e um promotor T7. Também, podem ser usados promotores artificialmente desenhados e modificados, como um promotor (Ptrp × 2) no qual dois Ptrps estão conectados em série, um promotor tac, um promotor lacT7, e um promotor let I.

[0098] É preferível usar um plasmídeo no qual a distância entre a sequência Shine-Dalgarno, que é um sítio de ligação ao ribossomo, e o códon de iniciação é ajustada para uma distância apropriada (por exemplo, 6 a 18

37 / 109 bases). No vetor de expressão de acordo com a presente invenção, uma sequência de terminação de transcrição não é necessariamente requerida para a expressão do ácido nucleico de acordo com a presente invenção, mas é preferível posicionar uma sequência de terminação de transcrição imediatamente abaixo de um gene estrutural.

[0099] Exemplos de hospedeiros eucarióticos incluem levedura, fungos filamentosos (bolores e semelhantes), e células de inseto.

[00100] Exemplos da levedura incluem leveduras pertencendo aos gêneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Candida, Yarrowia, Hansenula, e semelhantes. Exemplos mais específicos da levedura incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Schwanniomyces occidentalis, Candida utilis, Pichia pastoris, Pichia angusta, Pichia methanolica, Pichia polymorpha, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, e Hansenula polymorpha.

[00101] É preferível que o vetor de expressão, no caso no qual levedura é usada como uma célula hospedeira, habitualmente inclua uma origem de replicação (no caso no qual é requerida amplificação em um hospedeiro), um marcador de seleção para propagação do vetor em Escherichia coli, um promotor e um terminador para expressão de proteína recombinante em levedura, e um marcador de seleção para levedura.

[00102] No caso no qual o vetor de expressão é um vetor não integrado, é preferível adicionalmente incluir uma sequência de replicação autônoma (ARS, Autonomously Replicating Sequence). Isto torna possível aprimorar a estabilidade dos vetores de expressão em células (Myers, A. M., et al. (1986) Gene 45: 299-310).

[00103] Exemplos do vetor, no caso no qual levedura é usada como hospedeiro, incluem YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50

38 / 109 (ATCC 37419), YIp, pHS19, pHS15, pA0804, pHIL3Ol, pHIL-S1, pPIC9K, pPICZα, pGAPZα, e pPICZ B.

[00104] O promotor não é limitado desde que ele possa ser expressado em levedura. Exemplos do promotor incluem um promotor de genes glicolíticos como hexose-cinase, um promotor PHO5, um promotor PGK, um promotor GAP, um promotor ADH, um promotor gal 1, um promotor gal 10, um promotor polipeptídeo de choque térmico, um promotor MFα1, um promotor CUP 1, um promotor pGAP, um promotor pGCW14, um promotor AOX1, e um promotor MOX.

[00105] Como um método para introdução de um vetor de expressão em levedura, qualquer método pode ser usado desde que ele introduza DNA em levedura. Exemplos do mesmo incluem um método de eletroporação (Methods Enzymol., 194, 182 (1990)), um método de esferoplasto (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)), um método de acetato de lítio (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)), e um método descrito em Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).

[00106] Exemplos de fungos filamentos incluem fungos pertencendo aos gêneros Acremonium, Aspergillus, Ustilago, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Penicillium, Myceliophtora, Botryts, Magnaporthe, Mucor, Metarhizium, Monascus, Rhizopus, e Rhizomucor.

[00107] Exemplos específicos de fungos filamentos incluem Acremonium alabamense, Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sake, Aspergillus sojae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ficuum, Aspergillus phoeicus, Aspergillus foetidus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum, Trichoderma reseei, Chrysosporium lucknowense, Thermoascus, Sporotrichum, Sporotrichum cellulophilum, Talaromyces, Thielavia terrestris, Thielavia, Neurospora

39 / 109 crassa, Fusarium oxysporus, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Penicillium chrysogenum, Penicillium camemberti, Penicillium canescens, Penicillium emersonii, Penicillium funiculosum, Penicillium griseoroseum, Penicillium purpurogenum, Penicillium roqueforti, Myceliophtaora thermophilum, Mucor ambiguus, Mucor circinelloides, Mucor fragilis, Mucor hiemalis, Mucor inaequisporus, Mucor oblongiellipticus, Mucor racemosus, Mucor recurvus, Mocor saturninus, Mocor subtilissmus, Ogataea polymorpha, Phanerochaete chrysosporium, Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, e Rhizopus arrhizus.

[00108] O promotor no caso no qual o hospedeiro é um fungo filamento pode ser qualquer um de um gene relacionado a um sistema glicolítico, um gene relacionado à expressão constitutiva, um gene de enzima relacionada à hidrólise, e semelhantes. Exemplos específicos dos mesmos incluem amyB, glaA, agdA, glaB, TEF1, gene tanase xynF1, No. 8AN, gpdA, pgkA, enoA, melO, sodM, catA, e catB.

[00109] A introdução do vetor de expressão em fungos filamentos pode ser realizada por um método convencionalmente conhecido. Exemplos do mesmo incluem o método de Cohen et al. (método de cloreto de cálcio) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)], um método de protoplasto [Mol. Gen. Genet., 168:111 (1979)], um método competente [J. Mol. Biol., 56: 209 (1971)], e um método de eletroporação.

[00110] Células de inseto incluem, por exemplo, células de inseto lepidóptero, mais especificamente células de inseto derivadas de Spodoptera frugiperda como Sf9 e Sf21, e células de inseto derivadas de Trichoplusia ni como High 5.

[00111] Exemplos do vetor no caso no qual uma célula de inseto é usada como hospedeiro incluem baculovírus como vírus de poliedrose nuclear de Autographa Californica que é a vírus que infecta insetos pertencendo a família Noctuidae (“Baculovirus Expression Vectors, A

40 / 109 Laboratory Manual”, W. H. Freeman and Company, New York, EUA (1992)).

[00112] No caso no qual uma célula de inseto é usada como hospedeiro, um polipeptídeo pode ser expressado pelo método descrito, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, “Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual”, W. H. Freeman and Company, New York (1992), EUA, ou Bio/Technology, 6, 47 (1988). Isto é, um vetor de transferência de gene recombinante e um baculovírus são cointroduzidos em uma célula de inseto para obter um vírus recombinante (vetor de expressão) em um sobrenadante de cultura de células de inseto, e então o vírus recombinante é adicionalmente infectado para dentro de uma célula de inseto, por meio do qual o polipeptídeo pode ser expressado. Exemplos do vetor de transferência de gene usado no método acima incluem pVL1392, pVL1393, e pBlueBacIII (todos fabricados pela Invitrogen Corporation).

[00113] Como um método para cointrodução de um vetor de transferência de gene recombinante e um baculovírus para dentro de uma célula de inseto para construção do vírus recombinante, podem ser mencionados, por exemplo, um método de fosfato de cálcio (Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H2-227075), um método de lipofecção (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)), ou semelhantes.

[00114] O vetor recombinante, de acordo com a presente invenção, preferivelmente contém, adicionalmente, um gene marcador de seleção para a seleção de um transformante. Por exemplo, em Escherichia coli, genes de resistência a vários fármacos como tetraciclina, ampicilina, e canamicina, podem ser usados como genes marcadores de seleção. Também pode ser usado um gene marcador de seleção recessivo capaz de complementar uma mutação genética envolvida em auxotrofia, ou também pode ser usado um marcador de seleção como LEU2, URA3, TRP1, ou HIS3. Exemplos do gene marcador de seleção para fungos filamentos incluem um gene marcador

41 / 109 selecionado do grupo consistindo em niaD (Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1795-1797 (1995)), argB (Enzyme Microbiol. Technol., 6, 386-389, (1984)), sC (Gene, 84, 329-334, (1989)), ptrA (Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000)), pyrG (Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 284-289, (1983)), amdS (Gene, 26, 205-221, (1983)), gene de resistência à aureobasidina (Mol. Gen. Genet., 261, 290-296, (1999)), gene de resistência a benomil (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4869-4873, (1986)) e gene de resistência à higromicina (Gene, 57, 21-26, (1987)), e um gene de complementação de auxotrofia para leucina. Além disso, no caso no qual o hospedeiro é uma cepa mutante auxotrófica, um gene de tipo selvagem de complementação de auxotrofia também pode ser usado como um gene marcador de seleção.

[00115] A seleção do hospedeiro transformado com o vetor de expressão, de acordo com a presente invenção, pode ser realizada hibridização de placa e hibridização de colônia usando uma sonda que seletivamente se liga ao ácido nucleico, de acordo com a presente invenção. Como a sonda, é possível usar uma sonda obtida pela modificação de um fragmento parcial de DNA amplificado por um método de PCR baseado em informação de sequência do ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, com um radioisótopo ou uma digoxigenina. [Produção de fibroína modificada]

[00116] No hospedeiro transformado com o vetor de expressão, de acordo com a presente invenção, a fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser produzida pela expressão do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Quanto ao método de expressão, produção secretória, expressão de proteína de fusão, ou semelhantes, adicionalmente à expressão direta, podem ser realizados de acordo com o método descrito em “Molecular Cloning”, 2ª edição. No caso no qual ela é expressada por levedura, uma célula animal, ou uma célula de inseto, uma fibroína

42 / 109 modificada pode ser obtida como um polipeptídeo ao qual um açúcar ou uma cadeia de açúcar é adicionado(a).

[00117] A fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser produzida, por exemplo, por cultura de um hospedeiro transformado com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção em um meio de cultura, produção e acumulação da fibroína modificada de acordo com a presente invenção no meio de cultura, e então coleta da fibroína modificada do meio de cultura. O método para a cultura do hospedeiro de acordo com a presente invenção em um meio de cultura pode ser realizado de acordo com um método comumente usado para a cultura de um hospedeiro.

[00118] No caso no qual o hospedeiro de acordo com a presente invenção é um procarioto como Escherichia coli ou um eucarioto como levedura, qualquer um de um meio natural e um meio sintético pode ser usado como um meio de cultura do hospedeiro de acordo com a presente invenção desde que ele contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais inorgânicos e semelhantes que possam ser assimilados pelo hospedeiro e ele seja capaz de eficientemente cultivar o hospedeiro.

[00119] Como a fonte de carbono, pode ser usada qualquer fonte de carbono que pode ser assimilada pelo hospedeiro. Exemplos da fonte de carbono que podem ser usados incluem carboidratos como glicose, frutose, sacarose, e melaço, amido e hidrolisados de amido contendo-os, ácidos orgânicos como ácido acético e ácido propiônico, e álcoois como etanol.

[00120] Exemplos da fonte de nitrogênio que podem ser usados incluem sais de amônio de ácidos inorgânicos ou de ácidos orgânicos como amônia, cloreto de amônio, sulfato de amônio, acetato de amônio e fosfato de amônio, outros compostos contendo nitrogênio, peptona, extrato de carne, extrato de levedura, soro de macerado de milho, hidrolisado de caseína, torta de feijão-soja e hidrolisado de torta de feijão-soja, várias células microbianas fermentadas e produtos digeridos das mesmas.

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[00121] Exemplos do sal inorgânico que podem ser usados incluem di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato de dipotássio, fosfato de magnésio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, sulfato de cobre, e carbonato de cálcio.

[00122] A cultura de um procarioto como Escherichia coli ou de um eucarioto como levedura pode ser realizada sob condições aeróbicas como cultura agitada ou cultura com agitação por aeração profunda. A temperatura de cultura é, por exemplo, de 15°C a 40°C. O tempo de cultura é habitualmente de 16 horas a 7 dias. É preferível manter o pH do meio de cultura durante a cultura em 3,0 a 9,0. O pH do meio de cultura pode ser ajustado usando um ácido inorgânico, um ácido orgânico, uma solução de álcali, ureia, carbonato de cálcio, amônia, ou semelhantes.

[00123] Além disso, antibióticos como ampicilina e tetraciclina podem ser adicionados ao meio de cultura, conforme a necessidade, durante a cultura. No caso de cultura de um micro-organismo transformado com um vetor de expressão usando um promotor induzível como um promotor, um agente indutor pode ser adicionado ao meio conforme a necessidade. Por exemplo, no caso de cultura de um micro-organismo transformado com um vetor de expressão usando um promotor lac, é usado isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo ou semelhantes, e no caso de cultura de um micro-organismo transformado com um vetor de expressão usando um promotor trp, ácido indol-acrílico ou semelhantes pode ser adicionado ao meio de cultura.

[00124] Como um meio de cultura para células de inseto, podem ser usados o meio TNM-FH comumente usado (fabricado pela Pharmingen Inc.), o meio Sf-900 II SFM (fabricado pela Life Technologies Corporation), ExCell 400 e ExCell 405 (ambos fabricados pela JRH Biosciences Inc.), Meio de Cultura de Células de Inseto de Grace (Nature, 195, 788 (1962)), e semelhantes.

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[00125] A cultura de células de inserto pode ser realizada, por exemplo, durante um tempo de cultura de 1 dia a 5 dias sob condições como pH de 6 a 7 de meio de cultura e temperatura de cultura de 25°C a 30°C. Além disso, um antibiótico como gentamicina pode ser adicionado ao meio de cultura conforme a necessidade durante a cultura.

[00126] No caso no qual o hospedeiro é uma célula de planta, a célula de planta transformada pode ser diretamente cultivada, ou ela pode ser diferenciada em um órgão de planta e então cultivada. Como o meio de cultura para a cultura de uma célula de planta, pode ser usado, por exemplo o meio de Murashige e Skoog (MS) comumente usado, meio White, ou um meio no qual um hormônio de planta como auxina ou citocinina é adicionado a estes meios.

[00127] A cultura de células animais pode ser realizada, por exemplo, durante um tempo de cultura de 3 dias a 60 dias sob condições como pH de 5 a 9 do meio de cultura e temperatura de cultura de 20°C a 40°C. Além disso, um antibiótico como canamicina ou higromicina pode ser adicionado ao meio conforme a necessidade durante a cultura.

[00128] Como um método para a produção de uma fibroína modificada usando um hospedeiro transformado com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, há um método para a produção da fibroína modificada em uma célula hospedeira, um método para a secreção da fibroína modificada para fora da célula hospedeira, e um método para a produção da fibroína modificada sobre a membrana externa da célula hospedeira. Cada um destes métodos pode ser selecionado dependendo da célula hospedeira a ser usada e da estrutura da fibroína modificada a ser produzida.

[00129] Por exemplo, no caso no qual uma fibroína modificada é produzida na célula hospedeira ou sobre a membrana externa da célula hospedeira, o método de produção pode ser alterado para ativamente secretar

45 / 109 a fibroína modificada para fora da célula hospedeira de acordo com o método de Paulson et al. (J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)), o método de Lowe et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)), ou os métodos descritos na Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº H5-336963, Publicação Internacional nº WO 94/23021, e semelhantes. Isto é, a fibroína modificada pode ser seletivamente secretada para fora da célula hospedeira pela expressão da fibroína modificada em uma forma na qual um peptídeo de sinal é adicionado a um polipeptídeo contendo um sítio ativo de uma fibroína modificada usando um técnica de recombinação de gene.

[00130] A fibroína modificada produzida pelo hospedeiro transformado com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção pode ser isolada e purificada por um método comumente usado para isolamento e purificação de proteínas. Por exemplo, no caso no qual a fibroína modificada é expressada em um estado dissolvido em células, as células hospedeiras são recuperadas por centrifugação após a completitude da cultura, suspensas em uma solução tamponante aquosa, e então rompidas usando um ultrassonicador, uma prensa French, um homogeneizador Manton-Gaulin, um moinho Dyno-Mill, ou semelhantes para obter um extrato isento de células. A partir do sobrenadante obtido por centrifugação do extrato isento de células, uma preparação purificada pode ser obtida por um método comumente usado para o isolamento e a purificação de proteínas, isto é, um método de extração com solvente, um método de separação por salgação usando sulfato de amônio ou semelhantes, um método de dessalinização, um método de precipitação usando um solvente orgânico, um método de cromatografia de troca aniônica usando uma resina como DiEtilAminoEtil(DEAE)-Sepharose ou DIAION HPA-75 (fabricada pela Mitsubishi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha), uma método de cromatografia de troca catiônica usando uma resina como S-Sepharose FF (Pharmacia

46 / 109 Corporation), um método de cromatografia hidrofóbica usando uma resina como Butil-Sepharose ou Fenil-Sepharose, um método de filtração em gel usando uma peneira molecular, um método de cromatografia de afinidade, um método de cromatofocalização, um método de eletroforese como focalização isoelétrica ou semelhantes, sozinho ou em combinação dos mesmos.

[00131] Como a cromatografia, é preferivelmente usada a cromatografia em coluna usando Phenyl-TOYOPEARL (disponível junto à Tosoh Corporation), DEAE-TOYOPEARL (disponível junto à Tosoh Corporation), e Sephadex G-150 (disponível junto à Pharmacia Biotech Inc.).

[00132] No caso no qual a fibroína modificada é expressada pela formação de uma matéria insolúvel na célula, as células hospedeiras são recuperadas, rompidas e centrifugadas para recuperar a matéria insolúvel da fibroína modificada como uma fração precipitada. A matéria insolúvel recuperada da fibroína modificada pode ser solubilizada com um agente desnaturante de proteína. Após esta operação, uma preparação purificada de fibroína modificada pode ser obtida pelo mesmo método de isolamento e purificação como descrito acima.

[00133] No caso no qual uma fibroína modificada ou um derivado no qual uma cadeia de açúcar tem estado adicionada à fibroína modificada é secretada extracelularmente, a fibroína modificada ou o derivado da mesma pode ser recuperado(a) do sobrenadante de cultura. Isto é, um sobrenadante de cultura é obtido pelo tratamento da cultura por uma técnica como centrifugação, e uma preparação purificada pode ser obtida do sobrenadante de cultura pelo uso do mesmo método de isolamento e purificação como descrito acima. [Fiação]

[00134] A fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser produzida e purificada como descrito acima, e então fiada por um

47 / 109 método habitualmente usado para fiação de fibroína. Por exemplo, uma fibra formada com a fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser obtida por fiação de um líquido de fiação (doping liquid) no qual a fibroína modificada de acordo com a presente invenção é dissolvida em um solvente.

[00135] O líquido de fiação é preparado pela adição de um solvente à fibroína modificada e pelo ajuste da viscosidade do mesmo para permitir a fiação. Qualquer solvente pode ser usado desde que ele possa dissolver a fibroína modificada. Exemplos do solvente incluem uma solução aquosa ou semelhantes, contendo hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoroacetona (HFA), sulfóxido dimetílico (DMSO), N,N-dimetilformamida (DMF), ácido fórmico, ureia, guanidina, dodecilsulfato de sódio (SDS), brometo de lítio, cloreto de cálcio, tiocianato de lítio.

[00136] Um sal inorgânico pode ser adicionado ao líquido de fiação conforme a necessidade. Os sais inorgânicos incluem, por exemplo, sais inorgânicos consistindo nos(as) seguintes ácidos de Lewis e bases de Lewis. Exemplos da base de Lewis incluem um íon de oxoácido (como um íon nitrato e um íon perclorato), um íon de oxoácido de metal (como um íon permanganato), um íon haleto, um íon tiocianato, um íon cianato, e semelhantes. Exemplos do ácido de Lewis incluem íons metálicos como um íon de metal alcalino e um íon de metal alcalinoterroso, um íon poliatômico como um íon amônio, e um íon complexo. Exemplos específicos dos sais inorgânicos consistindo em um ácido de Lewis e uma base de Lewis incluem: sais de lítio como cloreto de lítio, brometo de lítio, iodeto de lítio, nitrato de lítio, perclorato de lítio, e tiocianato de lítio; sais de cálcio como cloreto de cálcio, brometo de cálcio, iodeto de cálcio, nitrato de cálcio, perclorato de cálcio e tiocianato de cálcio; sais de ferro como cloreto de ferro, brometo de ferro, iodeto de ferro, nitrato de ferro, perclorato de ferro, e tiocianato de ferro; sais de alumínio como cloreto de alumínio, brometo de

48 / 109 alumínio, iodeto de alumínio, nitrato de alumínio, perclorato de alumínio, e tiocianato de alumínio; sais de potássio como cloreto de potássio, brometo de potássio, iodeto de potássio, nitrato de potássio, perclorato de potássio, e tiocianato de potássio; sais de sódio como cloreto de sódio, brometo de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, perclorato de sódio, e tiocianato de potássio; sais de zinco como cloreto de zinco, brometo de zinco, iodeto de zinco, nitrato de zinco, perclorato de zinco, e tiocianato de zinco; sais de magnésio como cloreto de magnésio, brometo de magnésio, iodeto de magnésio, nitrato de magnésio, perclorato de magnésio, e tiocianato de magnésio; sais de bário como cloreto de bário, brometo de bário, iodeto de bário, nitrato de bário, perclorato de bário, e tiocianato de bário; e sais de estrôncio como cloreto de estrôncio, brometo de estrôncio, iodeto de estrôncio, nitrato de estrôncio, perclorato de estrôncio, e tiocianato de estrôncio.

[00137] A viscosidade do líquido de fiação pode ser adequadamente ajustada de acordo com o método de fiação e pode ser, por exemplo, de 100 a

15.000 cP (centipoise) (mPa.s) a 35°C. A viscosidade do líquido de fiação pode ser medida usando, por exemplo, um viscosímetro “EMS Viscometer” (nome comercial) fabricado pela Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd.

[00138] O método de fiação não é particularmente limitado desde que seja um método capaz de fiação da fibroína modificada de acordo com a presente invenção, e exemplos do mesmo incluem fiação seca, fiação por fusão, e fiação úmida. Um método de fiação preferido é fiação úmida.

[00139] Na fiação úmida, um fio não estirado com um formato de fio pode ser obtido por extrusão, a partir de uma fiandeira (bocal), um solvente no qual uma fibroína modificada é dissolvida em um líquido de coagulação (banho de líquido de coagulação) no qual a fibroína modificada é solidificada. O líquido de coagulação pode ser qualquer solução que pode ser dessolvatada, e exemplos do mesmo incluem álcoois inferiores tendo 1 a 5

49 / 109 átomos de carbono como metanol, etanol e 2-propanol, e acetona. Água pode ser apropriadamente adicionada ao líquido de coagulação. A temperatura do líquido de coagulação é preferivelmente de 0°C a 30°C. Em um caso no qual uma bomba de seringa tendo um bocal com um diâmetro de 0,1 mm a 0,6 mm é usada como a fiandeira, a velocidade de extrusão é preferivelmente de 0,2 mL/h por orifício a 6,0 mL/h por orifício e mais preferivelmente de 1,4 mL/h por orifício a 4,0 mL/h por orifício. O comprimento do banho de líquido de coagulação não é limitado desde que a dessolvatação possa ser eficientemente realizada, e é, por exemplo, de 200 mm a 500 mm. A velocidade de retirada do fio não estirado pode ser, por exemplo, de 1 mm/min a 20 m/min e preferivelmente de 1 mm/min a 3 m/min. O tempo de residência pode ser, por exemplo, de 0,01 minuto a 3 minutos e preferivelmente de 0,05 minuto a 0,15 minuto. Além disso, o estiramento (pré-estiramento) pode ser realizado no líquido de coagulação. Com o propósito de suprimir a evaporação do álcool inferior, o líquido de coagulação pode ser mantido a uma temperatura baixa, e o fio pode ser retirado em um estado não estirado. O banho de líquido de coagulação pode ser provido com múltiplos estágios, e o estiramento pode ser realizado em cada estágio ou em um estágio específico conforme a necessidade.

[00140] O fio não estirado (ou o fio pré-estirado) obtido pelo método descrito acima pode ser transformado em um fio estirado (fibra de fibroína) mediante uma etapa de estiramento. Exemplos do método de estiramento incluem estiramento a quente-úmido e estiramento a quente-seco.

[00141] O estiramento a quente-úmido pode ser realizado em água quente, em uma solução obtida pela adição de um solvente orgânico ou semelhantes à água quente, ou em vapor de água aquecido. A temperatura pode ser, por exemplo, de 50°C a 90°C e preferivelmente de 75°C a 85°C. No estiramento a quente-úmido, o fio não estirado (ou fio pré-estirado) pode ser estirado, por exemplo, por 1 a 10 vezes e preferivelmente por 2 a 8 vezes.

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[00142] O estiramento a quente-seco pode ser realizado usando um forno tubular elétrico, uma placa de aquecimento a seco, ou semelhantes. A temperatura pode ser, por exemplo, de 140°C a 270°C e preferivelmente de 160°C a 230°C. No estiramento a quente-seco, o fio não estirado (ou fio pré-estirado) pode ser estirado, por exemplo, por 0,5 a 8 vezes e preferivelmente por 1 a 4 vezes.

[00143] O estiramento a quente-úmido e o estiramento a quente-seco podem ser realizado independentemente ou em combinação, ou podem ser realizados em múltiplos estágios. Isto é, o estiramento a quente-úmido e o estiramento a quente-seco podem ser realizados em combinação adequada, por exemplo, em uma maneira na qual um estiramento de primeiro estágio é realizado pelo estiramento a quente-úmido e um estiramento de segundo estágio é realizado pelo estiramento a quente-seco, ou em uma maneira na qual o estiramento de primeiro estágio é realizado pelo estiramento a quente-úmido, o estiramento de segundo estágio é realizado pelo estiramento a quente-úmido, e um estiramento de terceiro estágio é realizado pelo estiramento a quente-seco.

[00144] A razão de estiramento final na etapa de estiramento é, por exemplo, de 5 a 20 vezes e preferivelmente de 6 a 11 vezes com respeito ao fio não estirado (ou ao fio pré-estirado).

[00145] A fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser estirada em uma fibra de fibroína e então quimicamente reticulada entre moléculas de polipeptídeo na fibra de fibroína. Exemplos de grupos funcionais que podem ser reticulados incluem um grupo amino, um grupo carboxila, um grupo tiol, e um grupo hidroxila. Por exemplo, um grupo amino de uma cadeia lateral de lisina contida no polipeptídeo pode ser reticulado mediante uma ligação amida por condensação por desidratação com um grupo carboxila de uma cadeia lateral de ácido glutâmico ou de ácido aspártico. A reticulação pode ser realizada pela realização de uma

51 / 109 razão de condensação por desidratação sob aquecimento em vácuo, ou por um agente de condensação por desidratação como carbodi-imidas.

[00146] A reticulação entre as moléculas de polipeptídeo pode ser realizada usando um agente reticulante como carbodi-imidas ou glutaraldeído, ou pode ser realizada usando uma enzima como transglutaminase. Carbodi-imidas são compostos representados pela fórmula geral R1N=C=NR2 (onde cada R1 e R2, independentemente, representam um grupo orgânico contendo um grupo alquila tendo de 1 a 6 átomos de carbono ou um grupo cicloalquila). Exemplos específicos de carbodi-imidas incluem cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC), N,N′-diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC), 1-ciclo-hexil-3-(2-morfolinoetil)carbodi-imida, e di-isopropilcarbodi-imida (DIC). Dentre estas, EDC e DIC são preferíveis porque elas têm uma alta capacidade para formar uma ligação amida entre moléculas de polipeptídeo e facilmente realizar uma reação de reticulação.

[00147] O tratamento de reticulação é preferivelmente realizado pela aplicação de um agente reticulante na fibra de fibroína e realização de reticulação com aquecimento e secagem sob vácuo. Como o agente reticulante, um produto puro pode ser aplicado na fibra de fibroína, ou um produto diluído com um álcool inferior tendo de 1 a 5 átomos de carbono, uma solução tamponante, ou semelhantes para uma concentração de 0,005% em massa a 10% em massa pode ser aplicado na fibra de fibroína. O tratamento de reticulação é preferivelmente realizado a uma temperatura de 20°C a 45°C durante 3 horas a 42 horas. Tensão (resistência) mais alta pode ser concedida à fibra de fibroína pelo tratamento de reticulação. [Avaliação da capacidade de encolhimento da fibra de fibroína]

[00148] A Fig. 2 é um gráfico que mostra um exemplo de uma alteração no comprimento de uma fibra de fibroína devido ao contato com a água ou semelhantes. A fibra de fibroína tem a propriedade de se encolher

52 / 109 (primeiro encolhimento) pelo contato (umedecimento) com a água abaixo do ponto de ebulição. Após o primeiro encolhimento, a fibra de fibroína encolhe-se ainda mais quando secada (segundo encolhimento). Após o segundo encolhimento, a fibra de fibroína alonga-se de novo para o comprimento antes do segundo encolhimento pelo contato com a água abaixo do ponto de ebulição, e então repete o encolhimento e o alongamento em uma faixa de comprimento (“taxa de estiramento” na Fig. 2) similar à faixa de comprimento no segundo encolhimento em um caso de repetição subsequente de secagem e umedecimento (Fig. 2). Para a fibra de fibroína, quanto menor for o encolhimento, melhor ela será. Em particular, em um produto como um tecido feito de fibra de fibroína, é preferível que este segundo encolhimento seja pequeno.

[00149] O segundo encolhimento pode ser avaliado usando uma segunda taxa de encolhimento obtida pelo seguinte método como um índice. <Segunda taxa de encolhimento>

[00150] Uma pluralidade de fibras de fibroína tendo um comprimento de cerca de 30 cm são enfeixadas para formar um feixe de fibras tendo uma finura de 150 denier. Com peso de chumbo de 0,8 g sendo preso a este feixe de fibras, o feixe de fibras é deixado imerso em água a 40°C durante 10 minutos para causar o primeiro encolhimento, e o comprimento do feixe de fibras é medido na água.

[00151] O feixe de fibras encolhido pelo primeiro encolhimento é retirado da água e secado à temperatura ambiente durante 2 horas com o peso de chumbo de 0,8 g preso. Após a secagem, o comprimento do feixe de fibras é medido. De novo, o umedecimento e a secagem são repetidos pelo menos três vezes, e um comprimento médio quando umedecido (Cúmido) e um comprimento médio quando secado (Cseco) são determinados. A segunda taxa de encolhimento é calculada de acordo com a seguinte expressão. Expressão: segunda taxa de encolhimento (%) = (1− (Cseco/Cúmido)) * 100

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[00152] Uma fibra de fibroína estirada de fibroína de ocorrência natural habitualmente tem uma segunda taxa de encolhimento de 11% a 20%, enquanto que a fibra de fibroína estirada da fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ter um segunda taxa de encolhimento reduzida de 8% ou menos. [Filme]

[00153] O filme de acordo com a presente invenção pode ser obtido pela preparação de um líquido de fiação no qual a fibroína modificada de acordo com a presente invenção é dissolvida em um solvente, moldagem por vazamento do líquido de fiação sobre a superfície de um material base, e secagem e/ou dessolvatação.

[00154] Exemplos do solvente incluem os mesmos solventes que aqueles exemplificados para o líquido de fiação (doping liquid). O solvente é preferivelmente um solvente polar como ácido fórmico, hexafluoro-2-propanol (HFIP), ou sulfóxido dimetílico. Um sal inorgânico pode ser adicionado ao líquido de fiação conforme a necessidade. Exemplos do sal inorgânico incluem os mesmos sais que aqueles exemplificados para o líquido de fiação (doping liquid).

[00155] A viscosidade do líquido de fiação é preferivelmente de 15 cP a 80 cP (centipoise) (mPa.s) e mais preferivelmente de 20 cP a 70 cP (mPa.s).

[00156] A concentração da fibroína modificada de acordo com a presente invenção é preferivelmente de 3% em massa a 50% em massa, mais preferivelmente de 3,5% em massa a 35% em massa, e ainda mais preferivelmente de 4,2% em massa a 15,8% em massa em um caso no qual o líquido de fiação é ajustado para 100% em massa.

[00157] Quando se prepara o líquido de fiação, aquecimento pode ser realizado a de 30°C a 60°C. Vascolejamento e agitação podem ser realizados para favorecer a dissolução.

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[00158] O material base pode ser um substrato de resina, um substrato de vidro, um substrato de metal, ou semelhantes. O material base é preferivelmente um substrato de resina a partir do ponto de vista de que o filme após a moldagem por vazamento possa ser facilmente desprendido do molde. O substrato de resina pode ser, por exemplo, um filme de poli(tereftalato de etileno) (PET, PolyEthylene Terephthalate), um filme de fluororresina como politetrafluoroetileno, um filme de polipropileno (PP), ou um filme removível no qual um composto de silicone é imobilizado sobre a superfície destes filmes. É mais preferível que o material base seja estável com respeito ao solvente como HFIP e DMSO, seja estavelmente moldado por vazamento com o líquido de fiação, e do ponto de vista de que o filme após a moldagem possa ser facilmente desprendido do molde, seja um filme removível no qual o composto de silicone é imobilizado no filme de PET ou sobre a superfície do filme de PET.

[00159] O procedimento específico é como segue. Primeiro, o líquido de fiação é vazado sobre a superfície do material base, e um filme úmido tendo uma espessura predeterminada (por exemplo, uma espessura de 1 µm a

1.000 µm após a secagem e/ou a dessolvatação) é produzido usando um meio de controle de espessura de filme como um aplicador, um revestidor de faca, e um revestidor de barra.

[00160] A secagem e/ou a dessolvatação podem ser realizadas por um método a seco ou por um método a úmido. Exemplos do método a seco incluem secagem a vácuo, secagem com ar quente, e secagem com ar. Exemplos do método a úmido incluem um método no qual um filme vazado é imerso em um líquido de dessolvatação (também chamado de um líquido de coagulação) para remover o solvente. Exemplos do líquido de dessolvatação incluem água, líquidos alcoólicos como álcoois inferiores tendo de 1 a 5 átomos de carbono incluindo metanol, etanol, e 2-propanol, e um líquido misto de água e o álcool. A temperatura do líquido de

55 / 109 dessolvatação (líquido de coagulação) é preferivelmente de 0°C a 90°C.

[00161] O filme não estirado após a secagem e/ou a dessolvatação pode ser uniaxial ou biaxialmente estirado em água. O estiramento biaxial pode ser estiramento sequencial ou estiramento biaxial simultâneo. Estiramento de multiestágios de dois ou mais estágios pode ser realizado. A razão de estiramento é preferivelmente de 1,01 a 6 vezes e mais preferivelmente de 1,05 a 4 vezes tanto no comprimento quanto na largura. Dentro desta faixa, é fácil equilibrar a tensão com a deformação. O estiramento em água é preferivelmente realizado a uma temperatura da água de 20°C a 90°C. O filme estirado é preferivelmente termicamente fixado por um calor seco a de 50°C a 200°C durante 5 segundos a 600 segundos. Esta fixação térmica provê estabilidade dimensional ao filme à temperatura ambiente. Um filme uniaxialmente estirado torna-se um filme uniaxialmente alinhado, e um filme biaxialmente estirado torna-se um filme biaxialmente alinhado. [Avaliação da impermeabilidade à água do filme]

[00162] A impermeabilidade à água do filme pode ser avaliada pela medição do grau de absorção de umidade sob alto grau de umidade usando um método de sal saturado usando uma solução aquosa saturada de sais.

[00163] Exemplos dos sais incluem sulfato de potássio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, brometo de sódio, carbonato de potássio, e cloreto de magnésio.

[00164] A impermeabilidade à agua do filme pode ser avaliada, por exemplo, posicionando um filme, cortado em um tamanho adequado de modo que o filme não permaneça imerso na solução aquosa, dentro de um recipiente impermeável ao ar, como um tubo Falcon®, contendo uma solução aquosa saturada de sulfato de potássio, e, por exemplo, deixando o filme durante 20 horas a 48 horas em ar equilibrado em alto grau de umidade como umidade relativa de 98%, e pela medição do peso e do teor de umidade

56 / 109 do filme para determinar a taxa de teor de umidade a partir do teor de umidade em peso. [Produto]

[00165] A fibra de fibroína formada da fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode ser aplicada em um tecido de tecelagem, um tecido de malha, um tecido debruado, um tecido de não tecelagem, e semelhantes, como uma fibra (como uma fibra longa, uma fibra curta, um multifilamento, e um monofilamento) ou um fio (como um fio fiado, um fio retorcido, um fio falso-retorcido, um fio processado, um fio mesclado, e um fio mesclado fiado). Esta fibra de fibroína pode também ser aplicada em aplicações de alta resistência como uma corda, uma sutura cirúrgica, um interruptor flexível para componentes elétricos, e um material fisiologicamente ativo para implantação (por exemplo, ligamento artificial e banda aórtica).

[00166] Adicionalmente ao filme, a fibroína modificada de acordo com a presente invenção pode também ser aplicada em uma espuma, um grão, uma nanofibrila, um gel (como um hidrogel), uma resina e equivalentes dos mesmos, que podem ser produzidos com o método descrito na Publicação de Patente Japonesa Não Examinada nº 2009-505668, na Patente Japonesa nº 5678283, na Patente Japonesa nº 4638735, ou semelhantes. [Fibra de fibroína artificialmente modificada]

[00167] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade inclui uma fibroína modificada, que se alonga quando umedecida, e se encolhe quando secada a partir do estado umedecido (corresponde ao estiramento após o “segundo encolhimento” na Fig. 2).

[00168] A fibroína modificada na fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade não é limitada à fibroína modificada tendo uma sequência de aminoácidos com um teor reduzido de resíduo de glutamina, desde que ela caia dentro da fibroína modificada

57 / 109 definida acima. A fibroína modificada pode ser uma fibroína da seda modificada (uma proteína da seda modificada obtida pela modificação de uma sequência de aminoácidos de uma proteína da seda produzida pelo bicho-da-seda) e uma fibroína modificada da seda de aranha (uma proteína da seda de aranha modificada obtida pela modificação de uma sequência de aminoácidos de uma proteína da seda de aranha produzida por aranhas). A fibroína modificada é preferivelmente uma fibroína modificada da seda de aranha. Exemplos específicos da fibroína modificada incluem: uma fibroína modificada derivada de uma proteína da seda bookmark (marcadora) de esfíncter grande produzida em uma glândula ampulada maior de aranha (primeira fibroína modificada); uma fibroína modificada tendo a sequência de domínio com um teor reduzido de resíduo de glicina (segunda fibroína modificada); uma fibroína modificada tendo a sequência de domínio com um teor reduzido de motivo (A)n (terceira fibroína modificada); uma fibroína modificada tendo a sequência de domínio com um teor reduzido de resíduo de glicina e com um teor reduzido de motivo (A)n (quarta fibroína modificada); uma fibroína modificada tendo a sequência de domínio incluindo uma região localmente tendo um alto índice de hidropatia (quinta fibroína modificada); e uma fibroína modificada tendo a sequência de domínio com um teor reduzido de resíduo de glutamina (sexta fibroína modificada).

[00169] A primeira fibroína modificada inclui uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. Na primeira fibroína modificada, o número de resíduos de aminoácidos de motivo (A)n é preferivelmente um número inteiro de 3 a 20, mais preferivelmente um número inteiro de 4 a 20, ainda mais preferivelmente um número inteiro de 8 a 20, ainda bem mais preferivelmente um número inteiro de 10 a 20, muito mais preferivelmente um número inteiro de 4 a 16, particularmente preferivelmente um número inteiro de 8 a 16, e com a

58 / 109 máxima preferência um número inteiro de 10 a 16. Na primeira fibroína modificada, o número de resíduos de aminoácidos constituindo REP na Fórmula 1 é preferivelmente de 10 a 200 resíduos, mais preferivelmente de 10 a 150 resíduos, e ainda mais preferivelmente de 20 a 100 resíduos, e muito mais preferivelmente de 20 a 75 resíduos. Na primeira fibroína modificada, o número total de resíduos de glicina, resíduos de serina, e resíduos de alanina contidos na sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m é preferivelmente de 40% ou mais, mais preferivelmente de 60% ou mais, e ainda mais preferivelmente de 70% ou mais com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos.

[00170] A primeira fibroína modificada pode ser um polipeptídeo incluindo uma unidade de sequência de aminoácidos representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, e incluindo a sequência terminal-C que é a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27 ou a sequência terminal-C que é uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de homologia com a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 27.

[00171] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 25 é idêntica à sequência de aminoácidos consistindo em 50 resíduos de aminoácidos no terminal-C da sequência de aminoácidos de ADF3 (GI: 1263287, NCBI). A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 26 é idêntica à sequência de aminoácidos obtida pela remoção de 20 resíduos do terminal-C da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 25. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 27 é idêntica à sequência de aminoácidos obtida pela remoção de 29 resíduos do terminal-C da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 25.

[00172] Exemplos mais específicos da primeira fibroína modificada podem incluir uma fibroína modificada incluindo (1-i) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 (proteína recombinante da seda

59 / 109 de aranha ADF3KaiLargeNRSH1) e (1-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 28. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

[00173] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 é uma sequência de aminoácidos obtida por aproximadamente duplicação das regiões de repetição desde a primeira região de repetição até a 13ª região de repetição e realização de mutação de modo que a tradução seja terminada no 1154º resíduo de aminoácido em uma sequência de aminoácidos obtida pela adição da sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) consistindo em um códon de iniciação, uma etiqueta His10, e um sítio de reconhecimento para protease HRV3C (protease de rinovírus humano 3C) até o terminal-N de ADF3. A sequência de aminoácidos de terminal-C da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28 é idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 27.

[00174] A fibroína modificada de (1-i) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 28.

[00175] A sequência de domínio da segunda fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos com um teor reduzido de resíduo de glicina, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. Pode ser dito que a segunda fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual pelo menos um ou uma pluralidade de resíduos de glicina em REP são substituídos por outros resíduos de aminoácidos, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00176] A sequência de domínio da segunda fibroína modificada pode ter uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um resíduo de glicina em pelo menos uma ou na pluralidade de sequências de motivo, pelo menos uma das quais é selecionada dentre GGX e GPGXX (onde G represente um resíduo de glicina,

60 / 109 P representa um resíduo de prolina, e X representa um resíduo de aminoácido diferente de glicina) em REP, é substituído por outro resíduo de aminoácido, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00177] Na segunda fibroína modificada, a proporção das sequências de motivo nas quais o resíduo de glicina descrito acima é substituído por outro resíduo de aminoácido pode ser 10% ou mais com respeito às sequências de motivo inteiras.

[00178] A segunda fibroína modificada pode incluir uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m e tem uma sequência de aminoácidos na qual z/w é 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, ou 50,9% ou mais, em um caso no qual o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo em XGX (onde X representa um resíduo de aminoácido diferente de glicina) em todas REPs em uma sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como z, e o número total de resíduos de aminoácidos na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como w. O número de resíduos de alanina é 83% ou mais com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n, preferivelmente 86% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, e ainda muito mais preferivelmente 100% (o que significa que o motivo (A)n consiste apenas em resíduos de alanina).

[00179] Na segunda fibroína modificada, a proporção de teor de uma sequência de aminoácidos consistindo em XGX é preferivelmente aumentada pela substituição de um resíduo de glicina em motivo GGX por outro resíduo de aminoácido. Na segunda fibroína modificada, a proporção de teor de uma sequência de aminoácidos consistindo em GGX na sequência de domínio é preferivelmente 30% ou menos, mais preferivelmente 20% ou menos, ainda

61 / 109 mais preferivelmente 10% ou menos, ainda muito mais preferivelmente 6% ou menos, ainda bem mais preferivelmente 4% ou menos, e particularmente preferivelmente 2% ou menos. A proporção de teor de uma sequência de aminoácidos consistindo em GGX na sequência de domínio pode ser calculada pelo mesmo método que o método para o cálculo da razão de teor (z/w) da sequência de aminoácidos consistindo em XGX.

[00180] Na segunda fibroína modificada, z/w é preferivelmente 50,9% ou mais, mais preferivelmente 56,1% ou mais, ainda mais preferivelmente 58,7% ou mais, ainda muito mais preferivelmente 70% ou mais, e com a máxima preferência 80% ou mais. O limite superior de z/w não é particularmente limitado, mas pode ser, por exemplo, 95% ou menos.

[00181] A segunda fibroína modificada pode ser obtida, por exemplo, pela modificação de sequência de gene de fibroína de ocorrência natural clonada de modo que pelo menos parte da sequência de bases que codifica um resíduo de glicina seja substituída por outro resíduo de aminoácido para codificar o outro resíduo de aminoácido. Ao mesmo tempo, um resíduo de glicina em motivo GGX e motivo GPGXX pode ser selecionado como o resíduo de glicina a ser modificado, ou pode ser substituído de modo que z/w seja 50,9% ou mais. Alternativamente, a segunda fibroína modificada de acordo com a presente modalidade pode também ser obtida, por exemplo, pelo desenho de uma sequência de aminoácidos que satisfaz o aspecto descrito acima sobre a sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural e pela síntese química de um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desenhada. Em qualquer caso, com respeito à sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, adicionalmente à modificação equivalente à substituição de resíduo de glicina em REP por outro resíduo de aminoácido, pode ser realizada modificação adicional de sequência de aminoácidos equivalente às substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos.

62 / 109

[00182] O outro resíduo de aminoácido descrito acima não é particularmente limitado desde que ele seja um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de glicina, mas seja preferivelmente um resíduo de aminoácido hidrofóbico como resíduo de valina (V), resíduo de leucina (L), resíduo de isoleucina (I), resíduo de metionina (M), resíduo de prolina (P), resíduo de fenilalanina (F), e resíduo de triptofano (W), ou um resíduo de aminoácido hidrofílico como resíduo de glutamina (Q), resíduo de asparagina (N), resíduo de serina (S), resíduo de lisina (K), e resíduo de ácido glutâmico (E), mais preferivelmente resíduo de valina (V), resíduo de leucina (L), resíduo de isoleucina (I), resíduo de fenilalanina (F), e resíduo de glutamina (Q), e ainda mais preferivelmente resíduo de glutamina (Q).

[00183] Exemplos mais específicos da segunda fibroína modificada podem incluir uma fibroína modificada incluindo (2-i) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT525), ou SEQ ID NO: 33 (Met-PRT799), e (2-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33.

[00184] A fibroína modificada de (2-i) será descrita. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30 é obtida pela substituição de todos GGXs em REP da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 (Met-PRT313) equivalente à fibroína de ocorrência natural com GQX. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 é obtida pela deleção de um de cada dois motivos (A)n do lado terminal-N ao lado terminal-C na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30 e inserção adicional de um [motivo (A)n-REP] imediatamente antes da sequência terminal-C. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 32 é obtida pela inserção de dois resíduos de alanina no lado terminal-C de cada motivo (A)n da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID

63 / 109 NO: 31, e substituição adicional de uma parte dos resíduos de glutamina (Q) por resíduos de serina (S) e deleção de uma parte de aminoácidos no lado terminal-C de modo que o peso molecular da mesma torne-se aproximadamente o mesmo que aquele de SEQ ID NO: 31. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 33 é uma sequência de aminoácidos obtida pela adição de uma sequência de dobradiça predeterminada e uma sequência de etiqueta His ao terminal-C de uma sequência obtida pela repetição de quatro vezes de uma região de 20 sequências de domínio (onde vários resíduos de aminoácidos no lado terminal-C da região são substituídos) presente na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31.

[00185] O valor de z/w na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 (equivalente à fibroína de ocorrência natural) é 46,8%. Os valores de z/w na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30, na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31, na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 32, e na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 33 são respectivamente 58,7%, 70,1%, 66,1%, e 70,0%. Além disso, os valores de x/y com uma razão Giza (descrita adiante) de 1:1,8 a 11,3 nas sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33 são respectivamente 15,0%, 15,0%, 93,4%, 92,7%, e 89,8%.

[00186] A fibroína modificada de (2-i) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33.

[00187] A fibroína modificada de (2-ii) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33. A fibroína modificada de (2-ii) é também uma

64 / 109 proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

[00188] A fibroína modificada de (2-ii) preferivelmente tem 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33, e em um caso no qual o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo em XGX (onde X representa um resíduo de aminoácido diferente de glicina) incluído em REP é z, e o número total de resíduos de aminoácidos em REP na sequência de domínio é w, z/w é preferivelmente 50,9% ou mais.

[00189] A segunda fibroína modificada pode incluir uma sequência de etiqueta em qualquer um de ou ambos de o terminal-N e o terminal-C. Isto torna possível isolar, imobilizar, detectar, e visualizar a fibroína modificada.

[00190] A sequência de etiqueta pode ser, por exemplo, uma etiqueta de afinidade que utiliza afinidade específica (afinidade, propriedade de ligação) com outra molécula. Como um exemplo específico da etiqueta de afinidade, pode ser mencionada uma etiqueta de histidina (etiqueta His). A etiqueta His é um peptídeo curto no qual cerca de 4 a 10 resíduos de histidina estão dispostos e tem uma propriedade de especificamente se ligar a um íon de metal como níquel, de modo que ela pode ser usada para isolamento de fibroína modificada por cromatografia de quelação de metal. Um exemplo específico da sequência de etiqueta pode incluir a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 35 (sequência de aminoácidos incluindo uma sequência de etiqueta His e uma sequência de dobradiça).

[00191] Além disso, pode ser usada uma sequência de etiqueta como glutationa-S-transferase (GST) que especificamente se liga à glutationa ou uma proteína de ligação à maltose (MBP) que especificamente se liga à maltose.

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[00192] Além disso, pode também ser usada uma “etiqueta de epítopo” que utiliza uma reação de antígeno-anticorpo. Pela adição de um peptídeo (epítopo) que mostra antigenicidade como uma sequência de etiqueta, pode ser ligado um anticorpo contra o epítopo. Exemplos da etiqueta de epítopo incluem uma etiqueta HA (sequência de peptídeo de hemaglutinina do vírus da influenza), uma etiqueta myc, e um etiqueta FLAG. A fibroína modificada pode ser facilmente purificada com especificidade alta pela utilização de uma etiqueta de epítopo.

[00193] Também é possível usar uma sequência de etiqueta que pode ser clivada com uma protease específica. Pelo tratamento, com protease, de uma proteína adsorvida mediante a sequência de etiqueta, é também possível recuperar a fibroína modificada clivada da sequência de etiqueta.

[00194] Um exemplo mais específico da fibroína modificada incluindo uma sequência de etiqueta pode ser uma fibroína modificada incluindo (2-iii) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36 (PRT380), SEQ ID NO: 37 (PRT410), SEQ ID NO: 38 (PRT525), ou SEQ ID NO: 39 (PRT799), ou (2-iv) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39.

[00195] As sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 40 (PRT313), SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, e SEQ ID NO: 39 são respectivamente sequências de aminoácidos obtidas pela adição da sequência de aminoácidos (incluindo uma sequência de etiqueta His e uma sequência de dobradiça) apresentada em SEQ ID NO: 35 ao terminal-N das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, e SEQ ID NO: 33.

[00196] A fibroína modificada de (2-iii) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID

66 / 109 NO: 38, ou SEQ ID NO: 39.

[00197] A fibroína modificada de (2-iv) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39. A fibroína modificada de (2-iv) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

[00198] A fibroína modificada de (2-iv) preferivelmente tem 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39, e em um caso no qual o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo em XGX (onde X representa um resíduo de aminoácido diferente de glicina) incluído em REP é z, e o número total de resíduos de aminoácidos em REP na sequência de domínio é w, z/w é preferivelmente 50,9% ou mais.

[00199] A segunda fibroína modificada pode incluir um sinal secretório para liberação da proteína produzida no sistema de produção de proteína recombinante para fora de um hospedeiro. A sequência do sinal secretório pode ser apropriadamente definida dependendo do tipo do hospedeiro.

[00200] A sequência de domínio da terceira fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos na qual o teor de motivo (A)n é reduzido, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. Pode ser dito que a sequência de domínio da terceira fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual pelo menos um ou uma pluralidade de motivos (A)n são deletados, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00201] A terceira fibroína modificada pode ter uma sequência de

67 / 109 aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual 10% a 40% dos motivos (A)n são deletados da fibroína de ocorrência natural.

[00202] A sequência de domínio da terceira fibroína modificada pode ter uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos obtida pela deleção de um de cada um a três motivos (A)n em pelo menos um de o lado terminal-N e o lado terminal-C, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00203] A sequência de domínio da terceira fibroína modificada pode ter uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos obtida pela deleção repetida de pelo menos dois motivos (A)n consecutivos e deleção de um motivo (A)n na ordem de a partir do lado terminal-N até o lado terminal-C, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00204] A sequência de domínio da terceira fibroína modificada pode ter uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos obtida pela deleção de um de cada dois motivos (A)n em pelo menos um de o lado terminal-N e o lado terminal-C.

[00205] A terceira fibroína modificada pode incluir uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m, e ter uma sequência de aminoácidos em um caso no qual o número de resíduos de aminoácidos de duas unidades [motivo (A)n-REP] mutuamente adjacentes é sequencialmente comparada a partir do lado terminal-N para o lado terminal-C, então o número de resíduos de aminoácidos de REP tendo um número pequeno de resíduos de aminoácidos é definido como 1, o valor total máximo do número de resíduos de aminoácidos de duas unidades [motivo (A)n-REP] mutuamente adjacentes, em que a razão (razão Gaza) do número de resíduos de aminoácidos da outra REP é 1,8 a 11,3, é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de domínio é definido como y, x/y pode ser 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, ou 50% ou

68 / 109 mais. O número de resíduos de alanina é 83% ou mais com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n, preferivelmente 86% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, e ainda muito mais preferivelmente 100% (o que significa que o motivo (A)n consiste apenas em resíduos de alanina).

[00206] Na terceira fibroína modificada, x/y é preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 60% ou mais, ainda mais preferivelmente 65% ou mais, ainda bem mais preferivelmente 70% ou mais, ainda muito mais preferivelmente 75% ou mais, e particularmente preferivelmente 80% ou mais. O limite superior de x/y não é particularmente limitado, mas pode ser, por exemplo, 100% ou menos. Em um caso no qual a razão Giza é 1:1,9 a 11,3, x/y é preferivelmente 89,6% ou mais. Em um caso no qual a razão Giza é 1:1,8 a 3,4, x/y é mais preferivelmente 77,1% ou mais. Em um caso no qual a razão Giza é 1:1,9 a 8,4, x/y é ainda mais preferivelmente 75,9% ou mais. Em um caso no qual a razão Giza é 1:1,9 a 4,1, x/y é muito mais preferivelmente 64,2% ou mais.

[00207] Em um caso no qual a terceira fibroína modificada é uma fibroína modificada na qual pelo menos sete dos múltiplos motivos (A)n presentes na sequência de domínio são compostos de apenas resíduos de alanina, x/y é preferivelmente 46,4% ou mais, mais preferivelmente 50% ou mais, ainda mais preferivelmente 55% ou mais, ainda bem mais preferivelmente 60% ou mais, ainda muito mais preferivelmente 70% ou mais, e particularmente preferivelmente 80% ou mais. O limite superior de x/y não é particularmente limitado desde que ele seja 100% ou menos.

[00208] A terceira fibroína modificada, por exemplo, pode ser obtida pela deleção de uma ou uma pluralidade de sequências que codificam o motivo (A)n a partir de uma sequência de gene clonada de fibroína de ocorrência natural de modo que x/y seja 64,2% ou mais. Alternativamente, a terceira fibroína modificada pode também ser obtida, por exemplo, pelo

69 / 109 desenho de uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos obtida pela deleção de um ou uma pluralidade de motivos (A)n de modo que x/y seja 64,2% ou mais baseado na sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural e pela síntese química de um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desenhada. Em qualquer caso, com respeito à sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, adicionalmente à modificação equivalente à deleção de motivo (A)n, pode ser realizada modificação adicional de sequência de aminoácidos equivalente às substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos.

[00209] Exemplos mais específicos da terceira fibroína modificada podem incluir uma fibroína modificada incluindo (3-i) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 41 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT525), ou SEQ ID NO: 33 (Met-PRT799), e (3-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33.

[00210] A fibroína modificada de (3-i) será descrita. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 41 é obtida pela deleção de um de cada dois motivos (A)n a partir do lado terminal-N até o lado terminal-C na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 (Met-PRT313) equivalente à fibroína de ocorrência natural e pela inserção adicional de um [motivo (A)n-REP] imediatamente antes da sequência terminal-C. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33 é como descrita na segunda fibroína modificada.

[00211] O valor de x/y com uma razão Giza de 1:1,8 a 11,3 na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 (equivalente à fibroína de ocorrência natural) é 15,0%. Tanto o valor de x/y na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 41 quanto o valor de x/y na

70 / 109 sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 são 93,4%. O valor de x/y na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 32 é 92,7%. O valor de x/y na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 33 é 89,8%. Os valores de z/w nas sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, e SEQ ID NO: 33 são respectivamente 46,8%, 56,2%, 70,1%, 66,1%, e 70,0%.

[00212] A fibroína modificada de (3-i) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33.

[00213] A fibroína modificada de (3-ii) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33. A fibroína modificada de (3-ii) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

[00214] A fibroína modificada de (3-ii) preferivelmente tem 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 33, e em um caso no qual o número de resíduos de aminoácidos de duas unidades [motivo (A)n-REP] mutuamente adjacentes é sequencialmente comparado a partir do lado terminal-N até o lado terminal-C, então o número de resíduos de aminoácidos de uma REP tendo um número pequeno de resíduos de aminoácidos é definido como 1, o valor total máximo do número de resíduos de aminoácidos de duas unidades [motivo (A)n-REP] mutuamente adjacentes, em que a razão (1:1,8 a 11,3 como uma razão Giza) do número de resíduos de aminoácidos da outra REP é 1,8 a 11,3, é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de

71 / 109 domínio é definido como y, x/y é preferivelmente de 64,2% ou mais.

[00215] A terceira fibroína modificada pode incluir uma sequência de etiqueta descrita acima em qualquer um dos ou em ambos o terminal-N e o terminal-C.

[00216] Um exemplo mais específico da fibroína modificada incluindo uma sequência de etiqueta pode ser uma fibroína modificada incluindo (3-iii) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42 (PRT399), SEQ ID NO: 37 (PRT410), SEQ ID NO: 38 (PRT525), ou SEQ ID NO: 39 (PRT799), ou (3-iv) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39.

[00217] As sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, e SEQ ID NO: 39 são respectivamente sequências de aminoácidos obtidas pela adição da sequência de aminoácidos (incluindo uma sequência de etiqueta His e uma sequência de dobradiça) apresentada em SEQ ID NO: 35 ao terminal-N das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, e SEQ ID NO: 33.

[00218] A fibroína modificada de (3-iii) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39.

[00219] A fibroína modificada de (3-iv) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39. A fibroína modificada de (3-iv) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

72 / 109

[00220] A fibroína modificada de (3-iv) preferivelmente tem 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39, e em um caso no qual o número de resíduos de aminoácidos de duas unidades [motivo (A)n-REP] mutuamente adjacentes é sequencialmente comparado a partir do lado terminal-N até o lado terminal-C, então o número de resíduos de aminoácidos de uma REP tendo um número pequeno de resíduos de aminoácidos é definido como 1, o valor total máximo do número de resíduos de aminoácidos de duas unidades [motivo (A)n-REP] mutuamente adjacentes, em que a razão de o número de resíduos de aminoácidos da outra REP é 1,8 a 11,3, é definido como x, e o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de domínio é definido como y, x/y é preferivelmente de 64,2% ou mais.

[00221] A terceira fibroína modificada pode incluir um sinal secretório para liberação da proteína produzida no sistema de produção de proteína recombinante para fora de um hospedeiro. A sequência do sinal secretório pode ser apropriadamente definida dependendo do tipo do hospedeiro.

[00222] A sequência de domínio da quarta fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos com não penas um teor reduzido de motivo (A)n mas também um teor reduzido de resíduo de glicina, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. Pode ser dito que a sequência de domínio da quarta fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual pelo menos um ou uma pluralidade de motivos (A)n são deletados e pelo menos um ou uma pluralidade de resíduos de glicina em REP são adicionalmente substituídos por outros resíduos de aminoácidos, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. Isto é, a quarta fibroína modificada é uma fibroína modificada tendo as características da segunda fibroína modificada e a

73 / 109 terceira fibroína modificada descrita acima. Aspectos específicos e semelhantes da quarta fibroína modificada são como descritos na segunda fibroína modificada e na terceira fibroína modificada.

[00223] Exemplos mais específicos da quarta fibroína modificada podem incluir uma fibroína modificada incluindo (4-i) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT525), SEQ ID NO: 33 (Met-PRT799), SEQ ID NO: 37 (PRT410), SEQ ID NO: 38 (PRT525), ou SEQ ID NO: 39 (PRT799),e (4-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38,ou SEQ ID NO: 39. Aspectos específicos da fibroína modificada incluindo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 39 são como descritos acima.

[00224] A sequência de domínio da quinta fibroína modificada pode incluir a sequência de domínio tendo uma sequência de aminoácidos localmente contendo uma região com um alto índice de hidropatia equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos em REP são substituídos por resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia e/ou um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia são inseridos em REP, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00225] É preferível que a região localmente tendo alto índice de hidropatia seja constituída de dois a quatro resíduos de aminoácidos.

[00226] É mais preferível que os resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia sejam selecionados dentre isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), e alanina (A).

[00227] A quinta fibroína modificada pode adicionalmente incluir

74 / 109 uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, em comparação com a fibroína de ocorrência natural, adicionalmente à modificação correspondendo a uma modificação na qual um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos em REP são substituídos por resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia e/ou um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia são inseridos em REP, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

[00228] A quinta fibroína modificada pode ser obtida por, com respeito a uma sequência de gene clonada de fibroína de ocorrência natural, substituição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofílicos em REP (por exemplo, resíduos de aminoácidos tendo um índice de hidropatia negativo) por um resíduo de aminoácido hidrofóbico (por exemplo, resíduos de aminoácidos tendo um índice de hidropatia positivo), e/ou inserção de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em REP. Além disso, por exemplo, a quinta fibroína modificada pode também ser obtida pelo desenho de uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual com respeito à sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural, um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofílicos em REP são substituídos por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e/ou um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos são inseridos em REP, e pela síntese química de um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desenhada. Em qualquer caso, com respeito à sequência de aminoácidos fibroína de ocorrência natural, adicionalmente à modificação equivalente à substituição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofílicos em REP com resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e/ou à inserção de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos

75 / 109 em REP, pode ser realizada modificação adicional de sequência de aminoácidos equivalente às substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos.

[00229] A quinta fibroína modificada pode incluir uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m e ter uma sequência de aminoácidos na qual p/q é 6,2% ou mais, em um caso no qual em todas as REPs incluídas em uma sequência excluindo uma sequência de um motivo (A)n localizado no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio da sequência de domínio, o número total de resíduos de aminoácidos contido em uma região onde um valor médio de índices de hidropatia de quatro resíduos de aminoácidos consecutivos é 2,6 ou mais é definido como p, e o número total de resíduos de aminoácidos contidos na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como q.

[00230] Com relação ao índice de hidropatia de resíduos de aminoácidos, podem ser usados como referências índices conhecidos (“Hydropathy Index”: Kyte J, & Doolittle R (1982) de “A simple method for displaying the hydropathic character of a protein”, J. Mol. Biol., 157, pp. 105-132). Especificamente, o índice de hidropatia (doravante também chamado de “IH”) de cada aminoácido é conforme mostrado na Tabela 1 acima.

[00231] O método de cálculo de p/q será descrito em mais detalhe. No cálculo, é usada a sequência (doravante também chamada de “sequência A”) excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. Primeiro, em todas REPs incluído na sequência A, são calculados os valores médios de índices de hidropatia de quatro resíduos de aminoácidos consecutivos. O valor médio

76 / 109 dos índices de hidropatia é obtido pela divisão da soma total de IH de cada um dos resíduos de aminoácidos contidos nos quatro resíduos de aminoácidos consecutivos por 4 (o número de resíduos de aminoácidos). O valor médio dos índices de hidropatia é obtido para todos os quatro resíduos de aminoácidos consecutivos (cada um dos resíduos de aminoácidos é usado 1 a 4 vezes para o cálculo do valor médio). A seguir, é especificada uma região na qual o valor médio dose índices de hidropatia dos quatro resíduos de aminoácidos consecutivos é 2,6 ou mais. Mesmo se é determinado que uma pluralidade de um determinado resíduo de aminoácido corresponde aos “quatro resíduos de aminoácidos consecutivos tendo um valor médio dos índices de hidropatia de 2,6 ou mais”, o resíduo de aminoácido é contado como um resíduo de aminoácido na região. O número total de resíduos de aminoácidos incluídos na região é definido como p. O número total de resíduos de aminoácidos incluídos na sequência A é definido como q.

[00232] Por exemplo, em um caso no qual a característica “quatro resíduos de aminoácidos consecutivos cujo valor médio dos índices de hidropatia é 2,6 ou mais” é extraída de 20 lugares (sem sobreposição), na região na qual o valor médio dos índices de hidropatia de quatro resíduos de aminoácidos consecutivos é 2,6 ou mais, o número dos quatro resíduos de aminoácidos consecutivos (sem sobreposição) é 20, e por conseguinte p é 20 × 4 = 80. Além disso, por exemplo, quando dois dos “quatro resíduos de aminoácidos consecutivos tendo um valor médio dos índices de hidropatia de 2,6 ou mais” sobrepõem por um resíduo de aminoácido, na região na qual o valor médio dos índices de hidropatia dos quatro resíduos de aminoácidos consecutivos é 2,6 ou mais, o número de resíduos de aminoácidos sendo incluídos é 7 [p = (2 × 4) − 1 = 7]. “− 1” é a dedução de sobreposição).

[00233] Na quinta fibroína modificada, p/q é preferivelmente 6,2% ou mais, mais preferivelmente 7% ou mais, ainda mais preferivelmente 10% ou mais, ainda bem mais preferivelmente 20% ou mais, e ainda muito mais

77 / 109 preferivelmente 30% ou mais. O limite superior de p/q não é particularmente limitado, mas pode ser 45% ou menos, por exemplo.

[00234] A quinta fibroína modificada pode ser obtida, por exemplo, pela modificação de uma sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural clonada em uma sequência de aminoácidos contendo uma região localmente tendo um alto índice de hidropatia pela substituição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofílicos em REP (por exemplo, resíduos de aminoácidos tendo um índice de hidropatia negativo) por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, resíduos de aminoácidos tendo um índice de hidropatia positivo), e/ou inserção de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em REP, de modo que a condição p/q seja satisfeita. Alternativamente, a quinta fibroína modificada pode também ser obtida, por exemplo, pelo desenho de uma sequência de aminoácidos que satisfaz a condição p/q baseado na sequência de aminoácidos de fibroína de ocorrência natural e pela síntese química de um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos desenhada. Em qualquer caso, adicionalmente à modificação equivalente à substituição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos em REP com resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia e/ou à inserção de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia em REP, em comparação com a fibroína de ocorrência natural, pode ser realizada modificação adicional equivalente às substituição, deleção, inserção, e/ou adição de um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos.

[00235] Os resíduos de aminoácidos com um alto índice de hidropatia são preferivelmente isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), e alanina (A), e mais preferivelmente valina (V), leucina (L), e isoleucina (I), mas não particularmente se referem aos mesmos.

[00236] Exemplos mais específicos da quinta fibroína modificada podem incluir uma fibroína modificada incluindo (5-i) a sequência de

78 / 109 aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 43 (Met-PRT720), SEQ ID NO: 44 (Met-PRT665), ou SEQ ID NO: 45 (Met-PRT666), e (5-ii) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 45.

[00237] A fibroína modificada de (5-i) será descrita. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 43 é obtida pela inserção de uma sequência de aminoácidos consistindo em três resíduos de aminoácidos (VLI) em dois sítios de cada REP com respeito à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 31 (Met-PRT410), exceto a sequência de domínio na extremidade do lado terminal-C, e adicionalmente substituição de uma parte de resíduos de glutamina (Q) por resíduos de serina (S) e deleção de aminoácidos no lado terminal-C. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 44 é obtida pela inserção de uma sequência de aminoácidos consistindo em três resíduos de aminoácidos (VLI) em um sítio de cada REP com respeito à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42 (Met-PRT525). A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 45 é obtida pela inserção de uma sequência de aminoácidos consistindo em três resíduos de aminoácidos (VLI) em dois sítios de cada REP com respeito à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 32.

[00238] A fibroína modificada de (5-i) pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 45.

[00239] A fibroína modificada de (5-ii) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:43, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 45. A fibroína modificada de (5-ii) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

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[00240] A fibroína modificada de (5-ii) preferivelmente tem 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 45, e preferivelmente tem uma sequência de aminoácidos na qual p/q é 6,2% ou mais, em um caso no qual em todas as REPs incluídas em uma sequência excluindo uma sequência de um motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio, o número total de resíduos de aminoácidos contidos em uma região onde um valor médio de índices de hidropatia de quatro resíduos de aminoácidos consecutivos é 2,6 ou mais é definido como p, e o número total de resíduos de aminoácidos contidos na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como q.

[00241] A quinta fibroína modificada pode incluir uma sequência de etiqueta em qualquer um de ou ambos de o terminal-N e o terminal-C.

[00242] Um exemplo mais específico da fibroína modificada incluindo uma sequência de etiqueta pode ser uma fibroína modificada incluindo (5-iii) a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 46 (PRT720), SEQ ID NO: 47 (PRT665), ou SEQ ID NO: 48 (PRT666), ou (5-iv) uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 48.

[00243] As sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, e SEQ ID NO: 48 são respectivamente sequências de aminoácidos obtidas pela adição da sequência de aminoácidos (incluindo uma etiqueta His e uma sequência de dobradiça) apresentada em SEQ ID NO: 35 ao terminal-N das sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, e SEQ ID NO: 45.

[00244] A fibroína modificada de (5-iii) pode consistir na sequência

80 / 109 de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 48.

[00245] A fibroína modificada de (5-iv) inclui uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 48. A fibroína modificada de (5-iv) é também uma proteína incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m. A identidade de sequência é preferivelmente 95% ou mais.

[00246] A fibroína modificada de (5-iv) preferivelmente tem 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 48, e preferivelmente tem uma sequência de aminoácidos na qual p/q é 6,2% ou mais, em um caso no qual em todas as REPs incluídas em uma sequência excluindo uma sequência de um motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio, o número total de resíduos de aminoácidos contidos em uma região onde um valor médio de índices de hidropatia de quatro resíduos de aminoácidos consecutivos é 2,6 ou mais é definido como p, e o número total de resíduos de aminoácidos contidos na sequência excluindo a sequência do motivo (A)n localizada no lado mais terminal-C ao terminal-C da sequência de domínio a partir da sequência de domínio é definido como q.

[00247] A quinta fibroína modificada pode incluir um sinal secretório para liberação da proteína produzida no sistema de produção de proteína recombinante para fora de um hospedeiro. A sequência do sinal secretório pode ser apropriadamente definida dependendo do tipo do hospedeiro.

[00248] A sexta fibroína modificada tem uma sequência de aminoácidos com um teor reduzido de resíduo de glutamina, em comparação com a fibroína de ocorrência natural. Aspectos preferidos e semelhantes da sexta fibroína modificada são como descritos acima.

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[00249] Como a fibroína modificada na fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade, a sexta fibroína modificada é preferível devido ao fato de que, quando a dimensão altera-se (alongamento e encolhimento) devido ao contato com a água e subsequente secagem, o grau de alongamento é aproximadamente igual ao grau de encolhimento (taxa de restauração é próxima de 100%) e a sexta fibroína modificada tem a característica de ser capaz de se restaurar para o comprimento original da mesma, e é reduzida a alteração dimensional da sexta fibroína modificada devido ao contato com a água e à subsequente secagem.

[00250] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade pode ser obtida por um método de produção incluindo uma etapa de encolhimento de encolher uma fibra crua obtida pela fiação da fibroína modificada com água. A etapa de encolhimento pode incluir, por exemplo, uma etapa (etapa de contato) de irreversivelmente encolher a fibra crua (a fibra crua antes do contato com a água após a fiação) ao se colocar a fibra crua em contato com a água. A etapa de encolhimento pode incluir uma etapa (etapa de secagem) de secar e adicionalmente encolher a fibra após a etapa de contato.

[00251] A fibra crua pode ser produzida usando um método de fiação conhecido. Especificamente, por exemplo, a fibra crua pode ser produzida de acordo com o método de fiação de fibra de fibroína descrito acima.

[00252] A Fig. 3 é uma vista ilustrativa esquematicamente mostrando um exemplo de um dispositivo de fiação para a produção da fibra crua. Um dispositivo de fiação 10 mostrado na Fig. 3 é um exemplo de um dispositivo de fiação para fiação a seco-úmido, e inclui um dispositivo de extrusão 1, um dispositivo de produção de fio não estirado 2, um dispositivo de estiramento a quente-úmido 3, e um dispositivo de secagem 4.

[00253] Um método de fiação usando o dispositivo de fiação 10 será

82 / 109 descrito. Primeiro, um líquido de fiação 6 armazenado em um tanque de armazenamento 7 é extraído a partir de uma fiandeira 9 por uma bomba de rodas dentadas 8. Na escala de laboratório, o líquido de fiação pode ser adicionado a um cilindro até enchê-lo e extrusado a partir de um bocal usando uma bomba de seringa. A seguir, o líquido de fiação extrusado 6 é fornecido para dentro de um líquido de coagulação 11 em um banho de líquido de coagulação 20 via uma distância 19, o solvente é removido, a fibroína modificada é coagulada, e um coágulo fibroso é formado. Então, o coagulado fibroso é fornecido para dentro de uma água quente 12 em um banho de estiramento 21 e é estirado. Uma razão de estiramento é determinada de acordo com uma razão de velocidade entre um cilindro prensor de fornecimento 13 e um cilindro prensor de remoção 14. Depois, o coagulado fibroso estirado é fornecido a um dispositivo de secagem 4 e secado em um trajeto de fio 22, e a fibra crua é obtida como um corpo de fio bobinado 5. Os números de referência 18a a 18g indicam as guias de fio.

[00254] O líquido de coagulação 11 pode ser qualquer solvente que pode ser dessolvatado, e exemplos do mesmo incluem álcoois inferiores tendo de 1 a 5 átomos de carbono como metanol, etanol, e 2-propanol, e acetona. O líquido de coagulação 11 pode apropriadamente conter água. A temperatura do líquido de coagulação 11 é preferivelmente de 0°C a 30°C. Em um caso no qual uma bomba de seringa tendo um bocal com um diâmetro de 0,1 mm a 0,6 mm é usada como a fiandeira 9, a velocidade de extrusão é preferivelmente de 0,2 mL/h por orifício a 6,0 mL/h por orifício e mais preferivelmente de 1,4 mL/h por orifício a 4,0 mL/h por orifício. A distância que a proteína coagulada passa através do líquido de coagulação 11 (substancialmente, a distância desde a guia de fio 18a até a guia de fio 18b) pode ser um comprimento que permite a dessolvatação, por exemplo, de 200 mm a 500 mm. A velocidade de remoção do fio não estirado pode ser, por exemplo, de 1 m/min a 20 m/min e preferivelmente de 1 m/min a 3 m/min. O

83 / 109 tempo de residência no líquido de coagulação 11 pode ser, por exemplo, de 0,01 minuto a 3 minutos e preferivelmente de 0,05 minuto 0,15 minuto. Além disso, o estiramento (pré-estiramento) pode ser realizado no líquido de coagulação 11. O líquido de coagulação 20 pode ser provido em múltiplos estágios, e o estiramento pode ser realizado em cada estágio ou em um estágio específico conforme a necessidade.

[00255] Como o estiramento realizado quando se obtém a fibra crua, por exemplo, são utilizados um pré-estiramento realizado no banho de líquido de coagulação 20 e um estiramento a quente-úmido realizado no banho de estiramento 21, e é também utilizado um estiramento a quente-seco.

[00256] O estiramento a quente-úmido pode ser realizado em água quente, em uma solução obtida pela adição de um solvente orgânico ou semelhantes à água quente, ou em vapor de água aquecido. A temperatura pode ser, por exemplo, de 50°C a 90°C e preferivelmente de 75°C a 85°C. No estiramento a quente-úmido, o fio não estirado (ou o fio pré-estirado) pode ser estirado, por exemplo por 1 a 10 vezes e preferivelmente por 2 a 8 vezes.

[00257] O estiramento a quente-seco pode ser realizado usando um forno tubular elétrico, uma placa de aquecimento a seco, , ou semelhantes. A temperatura pode ser, por exemplo, de 140°C a 270°C e preferivelmente de 160°C a 230°C. No estiramento a quente-seco, o fio não estirado (ou o fio pré-estirado) pode ser estirado, por exemplo, por 0,5 a 8 vezes e preferivelmente por 1 a 4 vezes.

[00258] O estiramento a quente-úmido e o estiramento a quente-seco podem ser realizados independentemente ou em combinação, ou podem ser realizados em múltiplos estágios. Isto é, o estiramento a quente-úmido e o estiramento a quente-seco podem ser realizados em uma combinação adequada, por exemplo, em uma maneira na qual um estiramento de primeiro

84 / 109 estágio é realizado pelo estiramento a quente-úmido e um estiramento de segundo estágio é realizado pelo estiramento a quente-seco ou em uma maneira na qual o estiramento de primeiro estágio é realizado pelo estiramento a quente-úmido, o estiramento de segundo estágio é realizado pelo estiramento a quente-úmido, e um estiramento de terceiro estágio é realizado pelo estiramento a quente-seco.

[00259] O valor de limite inferior da razão de estiramento final com respeito ao fio não estirado (ou ao fio pré-estirado) é preferivelmente qualquer um maior que 1 vez, 2 vezes ou mais, 3 vezes ou mais, 4 vezes ou mais, 5 vezes ou mais, 6 vezes ou mais, 7 vezes ou mais, 8 vezes ou mais, ou 9 vezes ou mais, e o valor de limite superior é preferivelmente de 40 vezes ou menos, 30 vezes ou menos, 20 vezes ou menos, 15 vezes ou menos, 14 vezes ou menos, 13 vezes ou menos 12 vezes ou menos, 11 vezes ou menos, ou 10 vezes ou menos. Em um caso no qual a fibra crua é uma fibra fiada em uma razão de estiramento de 2 vezes ou mais, a taxa de encolhimento, quando a fibra crua é umedecida ao ser colocada em contado com a água, torna-se mais alta.

[00260] Como mostrado na Fig. 2, a fibra crua (fibra contendo a fibroína modificada) tem uma característica de encolhimento (alteração no comprimento indicada pelo “primeiro encolhimento” na Fig. 2) pelo contato (umedecimento) com a água. Após o primeiro encolhimento, a fibra crua encolhe-se ainda mais quando secada (alteração no comprimento indicada pelo “segundo encolhimento” na Fig. 2). Após o segundo encolhimento, a fibra de fibroína alonga-se de novo para o comprimento igual ou similar ao comprimento antes do segundo encolhimento pelo contato com a água, e então repete o encolhimento e o alongamento em uma faixa de comprimento (indicada pela “taxa de estiramento” na Fig. 2) similar à faixa de comprimento no segundo encolhimento em um caso de repetição subsequente de secagem e umedecimento. Consequentemente, a fibra de

85 / 109 fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade pode ser obtida por um método de produção incluindo uma etapa de encolhimento incluindo pelo menos uma etapa de contato.

[00261] É considerado que ocorre o encolhimento irreversível (“primeiro encolhimento” na Fig. 2) da fibra crua (da fibra contendo a fibroína modificada) na etapa de contato, por exemplo, devido às seguintes razões. Isto é, é considerada uma razão devido à estrutura secundária e à estrutura terciária da fibra crua (da fibra contendo fibroína modificada). É considerada outra razão que, por exemplo, na fibra crua (na fibra contendo fibroína modificada) tendo uma tensão residual devido ao estiramento ou semelhantes no processo de produção, a tensão residual é relaxada pela entrada da água entre as fibras ou para dentro da fibra. Consequentemente, é considerado que é possível livremente controlar a taxa de encolhimento da fibra crua (da fibra contendo fibroína modificada) na etapa de encolhimento, por exemplo, de acordo com o tamanho da razão de estiramento no processo de fabricação da fibra crua (da fibra contendo fibroína modificada) descrito acima.

[00262] Na etapa de contato, a fibra crua antes do contato com a água e após a fiação é colocada em contato com a água para tornar umedecida a fibra crua. O estado umedecido significa um estado no qual pelo menos uma parte da fibra crua é umedecida com a água. Como resultado, a fibra crua pode ser encolhida sem força externa. Este encolhimento é irreversível (corresponde ao “primeiro encolhimento” na Fig. 2).

[00263] A temperatura da água contatada com a fibra crua na etapa de contato pode ser mais baixa que o ponto de ebulição. Como resultado, são aprimoradas a manuseabilidade e aplicabilidade na etapa de encolhimento. Além disso, a partir do ponto de vista de encurtamento do tempo de encolhimento, o valor de limite inferior da temperatura da água é preferivelmente 10°C ou mais alto, mais preferivelmente 40°C ou mais alto,

86 / 109 e ainda mais preferivelmente 70°C ou mais alto. O valor de limite superior da temperatura da água é preferivelmente 90°C ou mais baixo.

[00264] Na etapa de contato, o método de colocar a água em contato com a fibra crua não é particularmente limitado. Exemplos do método do mesmo incluem um método de imersão da fibra crua em água, um método de aspersão de água sobre a fibra crua à temperatura ambiente, um método de exposição da fibra crua ao vapor de água aquecido, ou semelhantes, e um método de exposição da fibra crua a um ambiente de alta umidade cheio de vapor de água. Dentre estes métodos, o método de imersão da fibra crua em água é preferível na etapa de contato, porque o tempo de encolhimento pode ser efetivamente encurtado e o equipamento de processamento pode ser simplificado.

[00265] Em um caso no qual a fibra crua é colocada em contato com a água em um estado relaxado na etapa de contato, a fibra crua pode não apenas ser encolhida mas também ser encrespada para se tornar ondulada. Com o propósito de prevenir a ocorrência de encrespamento, por exemplo, a etapa de contato pode ser realizada em um estado no qual a fibra crua não está relaxada, por exemplo em um estado no qual a fibra crua é colocada em contato com a água enquanto estiver sendo tensionada (puxada) em uma direção axial da fibra.

[00266] O método para a produção da fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade pode incluir, adicionalmente, a etapa de secagem. A etapa de secagem é uma etapa de secagem e adicionalmente encolhe a fibra crua (ou a fibra de fibroína artificialmente modificada obtida mediante a etapa de contato) que tem passado pela etapa de contato (corresponde ao “segundo encolhimento” na Fig. 2). A secagem pode ser, por exemplo, uma secagem natural ou uma secagem forçada usando um equipamento de secagem. Como o equipamento de secagem, qualquer equipamento de secagem conhecido do tipo com

87 / 109 contato ou do tipo sem contato pode ser usado. Além disso, a temperatura de secagem não é limitada desde que ela seja mais baixa que a temperatura na qual a proteína contida na fibra crua é degrada ou a fibra crua é termicamente danificada. Em geral, a temperatura está na faixa de 20°C a 150°C, e a temperatura está preferivelmente na faixa de 50°C a 100°C. Com a temperatura nesta faixa, a fibra é secada mais rápida e eficazmente sem dano térmico na fibra ou sem degradação da proteína contida na fibra. O tempo de secagem é apropriadamente ajustado de acordo com a temperatura de secagem ou semelhantes, e por exemplo, é utilizado um tempo durante o qual pode ser eliminada tanto quanto possível a influência sobre a qualidade e as propriedades físicas da fibra de fibroína artificialmente modificada devido à secagem excessiva.

[00267] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade é obtida, por exemplo, pelo método de produção descrito acima, e portanto substancialmente não contém tensão residual gerada pelo estiramento no processo de fiação.

[00268] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade pode ter uma taxa de restauração definida pela Expressão (1) de 95% ou mais. Expressão (1): taxa de restauração = (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) × 100 (%)

[00269] Pode ser dito que quanto mais alta a taxa de restauração definida pela Expressão (1), mais a fibra de fibroína artificialmente modificada pode restaurar-se para o comprimento original quando umedecida/secada. Na fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade, a taxa de restauração definida pela Expressão (1) é preferivelmente 96% ou mais, mais preferivelmente 97% ou mais, ainda

88 / 109 mais preferivelmente 98% ou mais, e ainda muito mais preferivelmente 99% ou mais.

[00270] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade pode ter uma taxa de alongamento definida pela Expressão (4) de 17% ou menos. A taxa de alongamento definida pela Expressão (4) é um índice de alongabilidade quando a fibra de fibroína artificialmente modificada está em um estado umedecido. Expressão (4): taxa de alongamento = {(comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) − 1} × 100 (%)

[00271] O limite superior da taxa de alongamento definida pela Expressão (4) é, por exemplo, 15% ou menos, 13% ou menos, 10% ou menos, ou 5% ou menos, e o limite inferior é, por exemplo, mais que 0%, 1% ou mais, 2% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, ou 13% ou mais. A taxa de alongamento definida pela Expressão (4) pode ser, por exemplo, mais que 0% e 17% ou menos, mais que 0% e 15% ou menos, 2% ou mais e 15% ou menos, 5% ou mais e 15% ou menos, 5% ou mais e 13% ou menos, 5% ou mais e 10% ou menos, mais que 0% e 10% ou menos, ou mais que 0% e 5% ou menos.

[00272] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade pode ter uma taxa de encolhimento C definida pela Expressão (5) de 17% ou menos. A taxa de encolhimento C definida pela Expressão (5) é um índice de capacidade de encolhimento quando a fibra de fibroína artificialmente modificada é secada a partir de um estado umedecido. Expressão (5): taxa de encolhimento C = {1 − (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente

89 / 109 modificada quando umedecida)} × 100 (%)

[00273] O limite superior da taxa de encolhimento C definida pela Expressão (5) é, por exemplo, 15% ou menos, 13% ou menos, 10% ou menos, ou 5% ou menos, e o limite inferior é, por exemplo, mais que 0%, 1% ou mais, 2% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, ou 13% ou mais. A taxa de encolhimento C definida pela Expressão (5) pode ser, por exemplo, mais que 0% e 17% ou menos, mais que 0% e 15% ou menos, 2% ou mais e 15% ou menos, 5% ou mais e 15% ou menos, 5% ou mais e 13% ou menos, 5% ou mais e 10% ou menos, mais que 0% e 10% ou menos, ou mais que 0% e 5% ou menos.

[00274] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade é preferivelmente de uma fibra tendo uma história de encolhimento de irreversivelmente sendo encolhida pelo contato com a água após a fiação e uma taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) de 2% ou mais. A taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) é um índice que indica as características relacionadas com o primeiro encolhimento da fibra crua (consulte a Fig. 2). Em um caso no qual a taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) é 2% ou mais, a taxa de restauração definida pela Expressão (1) torna-se mais alta. Expressão (2): taxa de encolhimento A = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%)

[00275] A taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) pode ser 2,5% ou mais, 3% ou mais, 3,5% ou mais, 4% ou mais, 4,5% ou mais, 5% ou mais, 5,5% ou mais, 6% ou mais, 10% ou mais, 15% ou mais, 20% ou mais, ou 25% ou mais. O limite superior da taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) não é particularmente limitado, mas é 80% ou menos, 60% ou menos, 40% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 7% ou

90 / 109 menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, ou 3% ou menos.

[00276] A fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a presente modalidade é preferivelmente de uma fibra tendo uma história de encolhimento de irreversivelmente sendo encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente sendo encolhida pela secagem e uma taxa de encolhimento B definida pela Expressão (3) de 7% ou mais. A taxa de encolhimento B definida pela Expressão (3) é um índice que indica as características relacionadas com o primeiro encolhimento e o segundo encolhimento da fibra crua (consulte a Fig. 2). Em um caso no qual a taxa de encolhimento B definida pela Expressão (3) é mais que 7%, a taxa de restauração definida pela Expressão (1) torna-se mais alta. Expressão (3): taxa de encolhimento B = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente encolhida pela secagem/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%)

[00277] A taxa de encolhimento B definida pela Expressão (3) pode ser 10% ou mais, 15% ou mais, mais que 25%, 32% ou mais, 40% ou mais, 48% ou mais, 56% ou mais, 64% ou mais, ou 72% ou mais. O limite superior da taxa de encolhimento B definida pela Fórmula (3) não é particularmente limitado, mas é habitualmente 80% ou menos.

EXEMPLOS

[00278] Doravante, a presente invenção será descrita mais especificamente baseada nos Exemplos. Entretanto, a presente invenção não é limitada aos seguintes Exemplos. [Exemplo de Teste 1] [(1) Síntese de ácido nucleico que codifica a fibroína modificada e construção de vetor de expressão]

[00279] Baseado na sequência de bases e na sequência de aminoácidos de Nephila clavipes (Número de Acesso ao GenBank de:

91 / 109 P46804.1, GI: 1174415) que é fibroína de ocorrência natural, foram desenhadas fibroínas e fibroínas modificadas tendo sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 8 a 14 e 18 a 20.

[00280] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8 (PRT410: Exemplo de Teste 1-1) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1 (M_PRT410). M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) é uma sequência de aminoácidos modificada obtida pela alteração do número de resíduos de alanina consecutivos em motivo (A)n para cinco, ou semelhantes, de modo a aprimorar a produtividade, baseado na sequência de bases e na sequência de aminoácidos de Nephila clavipes (Número de Acesso ao GenBank de: P46804.1, GI: 1174415) que é fibroína de ocorrência natural. Entretanto, visto que M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) não tem modificação de resíduo de glutamina (Q), a taxa de teor de resíduo de glutamina da mesma é a mesma que o teor de resíduo de glutamina de fibroína de ocorrência natural.

[00281] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9 (PRT888: Exemplo de Teste 1-2) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 (M_PRT888). M_PRT888 (SEQ ID NO: 2) é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VL.

[00282] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 (PRT965: Exemplo de Teste 1-3) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3 (M_PRT965). M_PRT965 (SEQ ID NO: 3) é

92 / 109 obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por TS e substituição de Q restante por A.

[00283] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11 (PRT889: Exemplo de Teste 1-4) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 (M_PRT889). M_PRT889 (SEQ ID NO: 4) é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VL e substituição de Q restante por I.

[00284] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12 (PRT916: Exemplo de Teste 1-5) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5 (M_PRT916). M_PRT916 (SEQ ID NO: 5) é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VI e substituição de Q restante por L.

[00285] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13 (PRT918: Exemplo de Teste 1-6) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 (M_PRT918). M_PRT918 (SEQ ID NO: 6) é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT410 (SEQ ID NO: 1) por VF e substituição de Q restante por I.

[00286] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14 (PRT720: Exemplo de Teste 1-7) é obtida pela inserção de uma sequência de aminoácidos consistindo em três resíduos de aminoácidos (VLI) em dois sítios de cada REP com respeito a PRT410 (SEQ ID NO: 8), e pela deleção de uma parte dos aminoácidos no lado terminal-N da mesma de modo que o peso molecular da mesma seja ajustado para aproximadamente o mesmo que

93 / 109 aquele de PRT410 (SEQ ID NO: 8).

[00287] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 18 (PRT525: Exemplo de Teste 1-8) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 15 (M_PRT525). M_PRT525 (SEQ ID NO: 15) é obtida, com respeito à M_PRT410 (SEQ ID NO: 1), pela inserção de dois resíduos de alanina em uma região (A5) na qual os resíduos de alanina são consecutivos, e pela deleção de duas sequências de domínio no lado terminal-C e pela substituição de 13 resíduos de glutamina (Q) por resíduo de serina (S) ou resíduo de prolina (P) de modo que o peso molecular da mesma torne-se o mesmo que aquele de M_PRT410.

[00288] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 19 (PRT699: Exemplo de Teste 1-9) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16 (M_PRT699). M_PRT699 (SEQ ID NO: 16) é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT525 (SEQ ID NO: 15) por VL.

[00289] A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 20 (PRT698: Exemplo de Teste 1-10) é obtida pela adição da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7 (sequência de etiqueta e sequência de dobradiça) ao terminal-N da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 17 (M_PRT698). M_PRT698 (SEQ ID NO: 17) é obtida pela substituição de todas QQs em M_PRT525 (SEQ ID NO: 15) por VL e substituição de Q restante por I.

[00290] Foram sintetizados cada um dos ácidos nucleicos desenhados para codificar proteínas tendo sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 8 a 14 e SEQ ID NOs: 18 a 20. No ácido nucleico, um sítio

94 / 109 NdeI foi adicionado à extremidade 5′ e um sítio EcoRI foi adicionado a jusante do códon de terminação. Estes cinco tipos de ácidos nucleicos foram clonados em um vetor de clonagem (pUC118). Depois, o ácido nucleico foi enzimaticamente clicado pelo tratamento com NdeI e EcoRI, e então foi recombinado em um vetor de expressão de proteína pET-22b(+) para obter um vetor de expressão. [(2) Expressão de proteína]

[00291] Escherichia coli BLR (DE3) foi transformada com um vetor de expressão pET22b(+) incluindo cada um dos ácidos nucleicos que codificam proteínas tendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NOs: 8 a 14 e SEQ ID NOs: 18 a 20. A Escherichia coli transformada foi cultivada em 2 mL de um meio LB contendo ampicilina durante 15 horas. A solução de cultura foi adicionada a 100 mL de um meio de cultura semente (Tabela 5) contendo ampicilina de modo que a DO600 fosse 0,005. Enquanto se mantinha a temperatura da solução de cultura a 30°C, a cultura em frasco foi realizada (durante cerca de 15 horas) até que a DO600 alcançasse 5, obtendo, assim, uma solução de cultura semente. [Tabela 5] Meio de cultura semente (por 1 L no momento do início da cultura) Glicose 5g KH2PO4 4g K2HPO4 10g Extrato de Levedura 6g

[00292] A solução de cultura semente foi adicionada a um fermentador de vaso contendo 500 mL de um meio de produção (Tabela 6) de modo que a Escherichia coli transformada fosse inoculada à DO600 de 0,05. A cultura foi realizada enquanto se mantinha a temperatura da solução de cultura a 37°C e se controlava o pH constante em 6,9. Além disso, a concentração de oxigênio dissolvido na solução de cultura foi mantida em 20% da concentração de saturação de oxigênio dissolvido.

95 / 109 [Tabela 6] Meio de produção (por 1 L no momento do início da cultura) Glicose 12g KH2PO4 9g MgSO4⋅7H2O 2,4g Extrato de Levedura 15g FeSO4⋅7H2O 40mg MnSO4⋅5H2O 40mg CaCl2⋅2H2O 40mg GD-113 (agente antiespumante) 0,1mL

[00293] Imediatamente após o consumo completo da glicose no meio de produção, uma solução de alimentação (455 g/1L de glicose e 120 g/1L de Extrato de Levedura) foi adicionada a uma taxa de 1 mL/min. A cultura foi realizada enquanto se mantinha a temperatura da solução de cultura a 37°C e se controlava o pH constante em 6,9. Além disso, a concentração de oxigênio dissolvido na solução de cultura foi mantida em 20% da concentração de saturação de oxigênio dissolvido, e a cultura foi realizada durante 20 horas. Depois, isopropil-β-tiogalactopiranosídeo (IPTG) 1 M foi adicionado à solução de cultura para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão da proteína alvo. 20 Horas após a adição de IPTG, a solução de cultura foi centrifugada para recuperar o pélete de células bacterianas. SDS-PAGE foi realizada usando péletes de células bacterianas preparados a partir da solução de cultura antes da adição de IPTG e após a adição de IPTG, e a expressão da proteína alvo foi checada pelo surgimento, dependente da adição de IPTG, de uma banda equivalente a um tamanho da proteína alvo. [(3) Purificação de proteína]

[00294] Os péletes de células bacterianas recuperados 2 horas após a adição de IPTG foram lavados com solução tamponante Tris-HCl 20 mM (pH 7,4). Os péletes de células bacterianas após a lavagem foram suspensos em solução tamponante Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) contendo PMSF 1 mM, e as células na suspensão foram rompidas com um homogeneizador de alta pressão (disponível junto à GEA Niro Soavi SpA). As células rompidas foram centrifugadas para obter um precipitado. O precipitado obtido foi

96 / 109 lavado com solução tamponante Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) até que o precipitado obtido se tornasse elevadamente puro. O precipitado após a lavagem foi suspenso em solução tamponante de guanidina 8 M (cloridrato de guanidina 8 M, di-hidrogenofosfato de sódio 10 mM, NaCl 20 mM, Tris-HCl 1 mM, pH 7,0) de modo que a concentração da suspensão fosse 100 mg/mL, e dissolvido por agitação com um agitador a 60°C durante 30 minutos. Após a dissolução, diálise foi realizada em água usando um tubo de diálise (tubo de celulose 36/32 fabricado pela Sanko Junyaku Co., Ltd.). O agregado de proteína branco obtido após a diálise foi recuperado por centrifugação, o conteúdo de água foi removido com um liofilizador, e o pó liofilizado foi recuperado. [(4) Preparação de líquido de fiação (doping liquid)]

[00295] Usando como solvente DMSO contendo 4% em massa de cloreto de lítio dissolvido, o pó de proteína liofilizado de PRT410 (SEQ ID NO: 8: Exemplo de Teste 1-1), PRT888 (SEQ ID NO: 9: Exemplo de Teste 1-2), PRT965 (SEQ ID NO: 10: Exemplo de Teste 1-3), PRT889 (SEQ ID NO: 11: Exemplo de Teste 1-4), PRT916 (SEQ ID NO: 12: Exemplo de Teste 1-5), PRT918 (SEQ ID NO: 13: Exemplo de Teste 1-6), ou PRT720 (SEQ ID NO: 14: Exemplo de Teste 1-7) foi adicionado ao solvente de modo que a concentração do mesmo fosse 24% em massa. Após a dissolução com um aquecedor de bloco de alumínio a 90°C durante 1 hora, materiais insolúveis e bolhas foram removidos para obter um líquido de fiação (doping liquid). [(5) Fiação]

[00296] O líquido de fiação foi adicionado a um tanque reserva até enchê-lo e foi descarregado a partir de um bocal de orifício único, tendo um diâmetro de 0,1 mm ou 0,2 mm, para dentro de um banho de coagulação contendo metanol 100% em massa usando uma bomba de rodas dentadas. A taxa de descarga foi ajustada em de 0,01 mL/min a 0,08 mL/min. Após a

97 / 109 coagulação, lavagem e estiramento foram realizados no banho de coagulação contendo metanol 100% em massa. Após a lavagem e o estiramento, o fio cru obtido (a fibra de fibroína crua obtida) foi secado usando uma placa de aquecimento a seco e foi enrolado em uma bobina.. [(6) Avaliação da capacidade de encolhimento da fibra de fibroína]

[00297] O fio cru obtido foi arranjado para ter um comprimento de cerca de 30 cm e enfeixado para formar um feixe de fibras de fibroína tendo uma finura de 150 denier. Com peso de chumbo de 0,8 g estando preso a cada feixe de fibras de fibroína, o feixe de fibras foi deixado imerso em água a 40°C durante 10 minutos para causar o primeiro encolhimento, e o comprimento do feixe de fibras de fibroína foi medido na água. O feixe de fibras de fibroína encolhido pelo primeiro encolhimento foi retirado da água e secado à temperatura ambiente durante 2 horas com o peso de chumbo de 0,8 g estando preso. Após a secagem, foi medido o comprimento de cada feixe de fibras de fibroína. Esta operação de umedecimento e de secagem foi repetida três vezes, e então o comprimento médio quando umedecido (Cúmido: unidade cm) e o comprimento médio quando secado (Cseco: unidade cm) foram determinados para calcular a segunda taxa de encolhimento de acordo com a seguinte expressão. Os resultados são mostrados na Tabela. 7. Segunda taxa de encolhimento (%) = {1 − (Cseco/Cúmido)} * 100 [Tabela 7] Taxa de teor de Segunda taxa de Hidrofobicidade de Proteína resíduo de encolhimento

REP glutamina (%) Exemplo de PRT410 (SEQ ID NO: 8) 17,7% -1,52 12,0 Teste 1-1 Exemplo de PRT888 (SEQ ID NO: 9) 6,3% -0,07 8,0 Teste 1-2 Exemplo de PRT965 (SEQ ID NO: 0,0% -0,65 8,2 Teste 1-3 10) Exemplo de PRT889 (SEQ ID NO: 0,0% 0,45 5,6 Teste 1-4 11) Exemplo de PRT916 (SEQ ID NO: 0,0% 0,47 4,2 Teste 1-5 12) Exemplo de PRT918 (SEQ ID NO: 0,0% 0,35 4,6 Teste 1-6 13) Exemplo de PRT720 (SEQ ID NO: 15,0% -0,10 12,0

98 / 109 Teste 1-7 14)

[00298] PRT720 (Exemplo de Teste 1-7) tem a sequência de aminoácidos obtida pela inserção de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos em PRT410 (Exemplo de Teste 1-1). Devido à inserção de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, o teor de resíduo de glutamina de PRT720 (Exemplo de Teste 1-7) é levemente baixo e a hidrofobicidade de REP é notavelmente aumentada em comparação com PRT410 (Exemplo de Teste 1-1). Entretanto, não houve diferença na segunda taxa de encolhimento entre a fibra fiada de proteína PRT720 (Exemplo de Teste 1-7) e a fibra fiada de proteína PRT410 (Exemplo de Teste 1-1) (Exemplo de Teste 1-1 e Exemplo de Teste 1-7 na Tabela 7). A partir deste resultado, verificou-se que não se pode supor que a segunda taxa de encolhimento seja reduzida em um caso no qual apenas a hidrofobicidade é aumentada.

[00299] Por outro lado, em PRT888 (SEQ ID NO: 9) na qual REP foi desenhada para ter aproximadamente a mesma hidrofobicidade que de REP em PRT720 (Exemplo de Teste 1-7) pela substituição de resíduo de glutamina (Q) no domínio por outro resíduo de aminoácido de modo que o teor de resíduo de glutamina fosse reduzido (6,3%), foi observado um efeito notável de redução da segunda taxa de encolhimento (Exemplo de Teste 1-2 na Tabela 7). Este efeito de redução da segunda taxa de encolhimento foi observado mesmo em um caso no qual a hidrofobicidade de REP não foi aumentada como no caso de PRT888, pela redução adicional do teor de resíduo de glutamina (0%) (Exemplo de Teste 1-3 na Tabela 7). Além disso, o efeito de redução da segunda taxa de encolhimento foi mais notável no caso de redução adicional do teor de resíduo de glutamina (0%) e substituição de resíduo de glutamina por um resíduo de aminoácido tendo hidrofobicidade mais alta (Exemplo de Teste 1-4 a Exemplo de Teste 1-6 na Tabela 7). [(7) Preparação de líquido de fiação para a produção de filme]

99 / 109

[00300] O pó de proteína liofilizado de PRT410 (SEQ ID NO: 8: Exemplo de Teste 1-1), PRT525 (SEQ ID NO: 18: Exemplo de Teste 1-8), PRT699 (SEQ ID NO: 19: Exemplo de Teste 1-9), ou PRT698 (SEQ ID NO: 20: Exemplo de Teste 1-10) foi adicionado a hexafluoro-2-propanol (HFIP) 99% para uma concentração de 10% em massa, agitado a 400 rpm e a 55°C durante 20 minutos, e dissolvido para obter um líquido de fiação. [(8) Moldagem por vazamento de filme]

[00301] Foi usado como um substrato um filme removível (fabricado pela Mitsui Chemicals, Inc., número de produto “SP-PET-01-75-BU”) tendo um composto de silicone imobilizado sobre a superfície de um filme de poli(tereftalato de etileno) (PET) tendo uma espessura de 75 μm. Usando uma máquina de revestimento em batelada (fabricada pela Imoto Seisakusho), o líquido de fiação preparado acima foi moldado por vazamento sobre a superfície do substrato sob condições de uma velocidade de alimentação de 20 mm/s e uma largura de fenda de 0,18 mm para preparar um filme úmido. [(9) Secagem e dessolvatação]

[00302] O filme úmido moldado foi permitido ser deixado durante 12 horas em uma câmara termostática (fabricada pela ESPEC CORP.) a 55°C e secado. Depois, o filme secado foi removido do substrato e deixado imerso em metanol durante 12 horas. O filme úmido moldado foi de novo permitido ser deixado durante 12 horas em uma câmara termostática (fabricada pela ESPEC CORP.) a 60°C e secado. O filme obtido foi cortado em quadrado de 33 mm e submetido à seguinte avaliação de impermeabilidade à agua. [(10) Avaliação de impermeabilidade à agua do filme]

[00303] O filme cortado em quadrado de 30 mm foi colocado dentro de tubo Falcon® contendo uma solução aquosa saturada de sulfato de potássio (K2SO4·H2O) de modo a não ser imerso dentro da solução aquosa, e foi permitido ser deixado à umidade alta de 98% durante 48 horas. Então, o teor de umidade do filme foi determinado como uma taxa de teor de umidade,

100 / 109 (%) pela medição do grau de absorção de umidade com um instrumento medidor de umidade pelo método de Karl Fischer (fabricado pela Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.). Os resultados são mostrados na Tabela. 8. [Tabela 8] Taxa de teor de Hidrofobicidade de Taxa de teor de Proteína resíduo de REP umidade glutamina Exemplo de Teste PRT410 (SEQ ID NO: 17,7% -1,52 23,31% 1-1 8) Exemplo de Teste PRT525 (SEQ ID NO: 13,7% -1,24 22,39% 1-8 18) Exemplo de Teste PRT699 (SEQ ID NO: 3,6% -0,78 18,18% 1-9 19) Exemplo de Teste PRT698 (SEQ ID NO: 0,0% -0,03 16,24% 1-10 20)

[00304] Verificou-se que a absorbância de água do filme é reduzida quando o teor de resíduo de glutamina é reduzido e a impermeabilidade à agua é aprimorada. [Exemplo de Teste 2] [(1) Produção de fibroína modificada]

[00305] O pó liofilizado da fibroína modificada foi obtido no mesmo procedimento que no Exemplo de Teste 1 exceto que foram desenhadas uma fibroína modificada tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 23 (PRT917) e uma fibroína modificada tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 24 (PRT1028) como a fibroína modificada. [(2) Produção de fibra crua]

[00306] Usando como solvente DMSO contendo 4% em massa de cloreto de lítio dissolvido, o pó liofilizado de fibroína modificada foi adicionado ao solvente de modo que a concentração do mesmo fosse 24% em massa. Após a dissolução com um aquecedor de bloco de alumínio a 90°C durante 1 hora, materiais insolúveis e bolhas foram removidos para obter um líquido de fiação (líquido de fiação de fibra crua).

[00307] O líquido de fiação foi adicionado a um tanque reserva até

101 / 109 enchê-lo e descarregado de um bocal de orifício único tendo um diâmetro de 0,3 mm para dentro de um banho de coagulação (temperatura do banho de coagulação de 12°C) contendo metanol 100% em massa usando uma bomba de rodas dentadas. Após a coagulação, lavagem e estiramento foram realizados no banho de coagulação contendo metanol 100% em massa. Após a lavagem e o estiramento, o fio cru obtido (a fibra crua obtida) foi secado usando uma placa de aquecimento a seco (temperatura de secagem de 80°C) e enrolado em bobina. A razão de estiramento foi de 6 vezes. [(3) Produção de fibra de fibroína artificialmente modificada]

[00308] Cada fibra crua foi arranjada para ter um comprimento de cerca de 30 cm e enfeixada para formar um feixe de fibras cruas tendo uma finura de 150 denier. Com um peso de chumbo de 0,8 g estando preso em cada feixe de fibras cruas, o feixe de fibras cruas foi deixado imerso em água a 40°C durante 10 minutos para ser encolhido (etapa de contato) e foi retirado da água. Com o peso de chumbo de 0,8 g estando preso em cada feixe de fibras cruas, o feixe de fibras cruas foi secado à temperatura ambiente durante 2 horas (etapa de secagem) para obter fibras de fibroína artificialmente modificada no Exemplo de Teste 2-1 e no Exemplo de Teste 2-2, cada uma das quais teve tipos diferentes de proteínas. [(4) Avaliação da fibra de fibroína artificialmente modificada (alongabilidade em água)]

[00309] Foram medidos os comprimentos das fibras de fibroína artificialmente modificada quando umedecidas (comprimentos de fibras de fibroínas artificialmente modificadas antes de serem umedecidas) no Exemplo de Teste 2-1 e no Exemplo de Teste 2-2 obtidas em (3). Com peso de chumbo de 0,8 g estando preso em cada fibra de fibroína artificialmente modificada, o feixe de fibras cruas foi deixado imerso em água a 4°C durante 10 minutos. Depois, foi medido o comprimento de cada fibra de fibroína artificialmente modificada (comprimento da fibra de fibroína artificialmente

102 / 109 modificada quando umedecida). A medição do comprimento de cada fibra de fibroína artificialmente modificada foi realizada em água com o peso de chumbo de 0,8 g estando preso na fibra de fibroína artificialmente modificada com o propósito de eliminar encrespamento de cada fibra de fibroína artificialmente modificada.

A seguir, cada fibra de fibroína artificialmente modificada retirada da água foi secada à temperatura ambiente durante 2 horas com um peso de chumbo de 0,8 g estando preso na mesma.

Após a secagem, foi medido o comprimento de cada fibra de fibroína artificialmente modificada (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido). A taxa de restauração, a taxa de alongamento, e taxa de encolhimento C de cada fibra de fibroína artificialmente modificada foram calculadas a partir dos valores medidos obtidos de acordo com a Expressão (1), a Expressão (4), e a Expressão (5). Os resultados são mostrados na Tabela. 9. Expressão (1): taxa de restauração = (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) × 100 (%) Expressão (4): taxa de alongamento = {(comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) − 1} × 100 (%) Expressão (5): taxa de encolhimento C = {1 − (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida)} × 100 (%) [Tabela 9] Taxa de Taxa de Taxa de restauração alongamento (%) encolhimento C (%) (%)

103 / 109 Exemplo de Teste 2-1 PRT917 2,3 4 98,2 Exemplo de Teste 2-2 PRT1028 4,9 5,6 99

[00310] Como mostrado na Tabela 9, a fibra de fibroína artificialmente modificada incluindo a fibroína modificada tendo um teor reduzido de resíduos de glutamina (Exemplo de Teste 2-1 e Exemplo de Teste 2-2) tem a característica de que ela se alonga quando umedecida e então restaura-se para o comprimento original quando secada (taxa de restauração é de 98,2% a 99%). Além disso, a fibra de fibroína artificialmente modificada (Exemplo de Teste 2-1 e Exemplo de Teste 2-2) tem tanto uma baixa taxa de alongamento quanto uma baixa taxa de encolhimento C, e é suprimida uma alteração dimensional devido ao contato com a água (e secagem subsequente). [Exemplo de Teste 3] [(1) Produção de fibroína modificada]

[00311] O pó liofilizado da fibroína modificada foi obtido no mesmo procedimento que no Exemplo de Teste 1 exceto que foram desenhadas uma fibroína modificada tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42 (PRT399), uma fibroína modificada tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36 (PRT380), uma fibroína modificada tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 37 (PRT410), e uma fibroína modificada tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 39 (PRT799) como a fibroína modificada. [(2) Produção de fibra crua]

[00312] Usando como um solvente DMSO contendo 4,0% em massa de cloreto de lítio dissolvido, o pó liofilizado de fibroína modificada foi adicionado ao solvente de modo que a concentração do mesmo fosse 18% em massa ou 24% em massa (consulte a Tabela 10), e dissolvido durante 3 horas usando um agitador. Depois, materiais insolúveis e bolhas foram removidos para obter um líquido de fibroína modificada.

[00313] Usando o líquido de fibroína modificada obtido como um

104 / 109 líquido de fiação (líquido de fiação de fibra crua), as fibras cruas e estiradas foram produzidas por fiação a seco-úmido usando um dispositivo de fiação correspondendo ao dispositivo de fiação 10 mostrado na Fig. 3 O dispositivo de fiação usado é um dispositivo de fiação 10 mostrado na Fig. 3 adicionalmente provido com um segundo dispositivo de produção de fio não estirado (segundo banho) entre um dispositivo de produção de fio não estirado 2 (primeiro banho) e um dispositivo de estiramento a quente-úmido 3 (terceiro banho). As condições de fiação a seco-úmido são como segue. - Diâmetro do bocal de extrusão: 0,2mm - Líquido e temperatura nos primeiro até terceiro banhos: consulte a Tabela 10 - Razão de estiramento total: consulte a Tabela 10 - Temperatura de secagem: 60°C

105 / 109

[Tabela 10] Líquido de fiação Primeiro banho Segundo banho Terceiro banho Razão de Fibroína Concentração Temperatura Temperatura Temperatura estiramento Líquido Líquido Líquido modificada (% massa) (°C) (°C) (°C) total (vezes) Exemplo de Produção 1 1 Exemplo de Produção 2 2 24 Exemplo de Produção 3 3 Exemplo de Produção 4 4 PRT799 -5 16 Exemplo de Produção 5 1 Exemplo de Produção 6 2 18 Exemplo de Produção 7 3 Exemplo de Produção 8 4 Exemplo de Produção 9 1 Metanol Metanol Exemplo de Produção 10 Água 17 2 PRT410 100% 100% Exemplo de Produção 11 3 Exemplo de Produção 12 14 4

105 / 109 Exemplo de Produção 13 1 Exemplo de Produção 14 PRT399 24 -11 2 Exemplo de Produção 15 3 Exemplo de Produção 16 1 Exemplo de Produção 17 2 PRT380 11 Exemplo de Produção 18 3 Exemplo de Produção 19 4

106 / 109 [(3) Produção de fibra de fibroína artificialmente modificada e avaliação da taxa de encolhimento A e da taxa de encolhimento B]

[00314] A fibra de fibroína artificialmente modificada foi produzida ao se submeter cada fibra crua obtida nos Exemplos de Produção 1 a 19 à etapa de contato de colocar a fibra crua em contato com a água, ou à etapa de secagem de secar a fibra crua à temperatura ambiente após a completitude da etapa de contato. <Avaliação da taxa de encolhimento A na etapa de contato>

[00315] Uma pluralidade de fibras cruas cada um tendo um comprimento de 30 cm foram cortadas das fibras cruas bobinadas obtidas nos Exemplos de Produção 1 a 19. A pluralidade de fibras cruas foram enfeixadas para formar um feixe de fibras cruas tendo uma finura de 150 denier. Com um peso de chumbo de 0,8 g estando preso em cada feixe de fibras cruas, cada feixe de fibras cruas foi deixado imerso em água durante 10 minutos a uma temperatura mostrada nas Tabelas 11 a 14 (etapa de contato). Depois, foi medido o comprimento de cada feixe de fibras cruas em água. A medição do comprimento do feixe de fibras cruas em água foi realizado com peso de chumbo de 0,8 g estando preso no feixe de fibras cruas com o propósito de eliminar o encrespamento do feixe de fibras cruas. A seguir, a taxa de encolhimento A (%) de cada fibra crua foi calculada de acordo com a Expressão (2). Na Expressão (2), C0 representa o comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação, e aqui C0 é 30 cm. Similarmente, na Expressão (2), Cúmido representa o comprimento da fibra irreversivelmente encolhida devido ao contato com a água após a fiação, e aqui C0 é o comprimento de cada feixe de fibras cruas medido em água. Expressão (2): taxa de encolhimento A = {1− (Cúmido/C0)} × 100 (%) <Avaliação da taxa de encolhimento B na etapa de secagem >

[00316] Após a completitude da etapa de contato, o feixe de fibras cruas foi retirado da água. O feixe de fibras cruas retirado da água foi secado

107 / 109 à temperatura ambiente durante 2 horas com peso de chumbo de 0,8 g estando preso (etapa de secagem) para obter a fibra de fibroína artificialmente modificada. Após a secagem, foi medido o comprimento de cada deixe de fibras de fibroína artificialmente modificada. A seguir, a taxa de encolhimento B (%) de cada fibra de fibroína artificialmente modificada foi calculada de acordo com Expressão (3). Na Expressão (3), C0 representa o comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação, e aqui C0 é 30 cm. Similarmente, na Expressão (3), Cúmido representa o comprimento da fibra irreversivelmente encolhida devido ao contato com a água após a fiação e então adicionalmente encolhida pela secagem, e aqui C0 é o comprimento de cada fibra de fibroína artificialmente modificada medido após a secagem. Expressão (3): taxa de encolhimento B = {1− (Lúmido/L0)} × 100 (%)

[00317] Os resultados são mostrados nas Tabelas 11 a 14.

[Tabela 11] Taxa de Taxa de Fibra crua/Fibra de fibroína Temperatura da encolhimento A encolhimento B artificialmente modificada água (°C) (%) (%) Exemplo de 24%p PRT799 x1 0,0 7,8 Produção 1 Exemplo de 24%p PRT799 x2 -1,2 10,3 Produção 2 Exemplo de 24%p PRT799 x3 7,2 21,2 Produção 3 Exemplo de 24%p PRT799 x4 20 13,5 26,3 Produção 4 Exemplo de 18%p PRT799 x2 -2,3 9,5 Produção 6 Exemplo de 18%p PRT799 x3 6,0 19,7 Produção 7 Exemplo de 18%p PRT799 x4 14,3 27,5 Produção 8 Exemplo de 24%p PRT799 x2 -5,3 7,2 Produção 2 Exemplo de 24%p PRT799 x3 8,7 21,3 Produção 3 Exemplo de 24%p PRT799 x4 40 14,5 26,0 Produção 4 Exemplo de 18%p PRT799 x2 -4,3 7,3 Produção 6 Exemplo de 18%p PRT799 x3 6,2 18,3 Produção 7

108 / 109 Exemplo de 18%p PRT799 x4 16,0 28,7 Produção 8 Exemplo de 24%p PRT799 x3 6,8 21,0 Produção 3 Exemplo de 24%p PRT799 x4 15,0 27,5 Produção 4 Exemplo de 18%p PRT799 x2 60 -1,5 10,7 Produção 6 Exemplo de 18%p PRT799 x3 3,3 18,2 Produção 7 Exemplo de 18%p PRT799 x4 16,2 29,0 Produção 8

[Tabela 12] Taxa de Fibra crua/Fibra de fibroína Temperatura da Taxa de encolhimento B artificialmente modificada água (°C) encolhimento A (%) (%) Exemplo de 24%p PRT410 -2,3 8,7 Produção 10 x2 Exemplo de 24%p PRT410 20 4,7 16,7 Produção 11 x3 Exemplo de 24%p PRT410 10,3 22,3 Produção 12 x4 Exemplo de 24%p PRT410 4,7 17,5 Produção 11 x3 40 Exemplo de 24%p PRT410 11,5 24,0 Produção 12 x4 Exemplo de 24%p PRT410 2,0 16,5 Produção 11 x3 60 Exemplo de 24%p PRT410 10,8 25,0 Produção 12 x4

[Tabela 13] Fibra crua/Fibra de fibroína Temperatura da Taxa de Taxa de artificialmente modificada água (°C) encolhimento A (%) encolhimento B (%) Exemplo de 24%p -3,5 7,6 Produção 13 PRT399 x1 Exemplo de 24%p 20 3,7 12,5 Produção 14 PRT399 x2 Exemplo de 24%p 7,0 16,8 Produção 15 PRT399 x3 Exemplo de 24%p 3,0 12,7 Produção 14 PRT399 x2 40 Exemplo de 24%p 7,3 16,7 Produção 15 PRT399 x3 Exemplo de 24%p 3,3 9,3 Produção 14 PRT399 x2 60 Exemplo de 24%p 6,8 14,2 Produção 15 PRT399 x3

[Tabela 14] Taxa de Taxa de Fibra crua/Fibra de fibroína Temperatura da encolhimento A encolhimento B artificialmente modificada água (°C) (%) (%) Exemplo de 24%p PRT380 x1 -1,1 9,4 Produção 16 20 Exemplo de 24%p PRT380 x2 2,7 13,3 Produção 17

109 / 109 Exemplo de 24%p PRT380 x3 7,0 17,7 Produção 18 Exemplo de 24%p PRT380 x4 10,0 20,2 Produção 19 Exemplo de 24%p PRT380 x2 3,3 14,2 Produção 17 Exemplo de 24%p PRT380 x3 40 7,7 19,0 Produção 18 Exemplo de 24%p PRT380 x4 12,0 22,0 Produção 19 Exemplo de 24%p PRT380 x2 2,7 14,3 Produção 17 Exemplo de 24%p PRT380 x3 60 8,2 20,3 Produção 18 Exemplo de 24%p PRT380 x4 12,0 23,2 Produção 19 LISTA DE NÚMEROS DE REFERÊNCIA NA FIGURA 3

[00318] 1…dispositivo de extrusão, 2…dispositivo de produção de fio não estirado, 3…dispositivo de estiramento a quente-úmido, 4...dispositivo de secagem, 6...líquido de fiação, 10...dispositivo de fiação, 20...banho de líquido de coagulação, 21...banho de estiramento, 36...fibra crua

Claims (40)

REIVINDICAÇÕES

1. Fibroína modificada, caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, sendo que a sequência de domínio tem uma sequência de aminoácidos com um teor reduzido de um resíduo de glutamina equivalente a um aminoácido em que um ou uma pluralidade de resíduos de glutamina em REP estão deletados ou substituídos por outros resíduos de aminoácidos, em comparação com a fibroína de ocorrência natural, em que na Fórmula 1 e na Fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos e o número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é de 80% ou mais, REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos, m representa um número inteiro de 10 a 300, uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos, e uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.

2. Fibroína modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a REP contém um motivo GPGXX (onde X representa um resíduo de aminoácido diferente de um resíduo de glicina) e tem um teor de motivo GPGXX de 10% ou mais.

3. Fibroína modificada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que uma taxa de teor de resíduo de glutamina é de 9% ou menos.

4. Fibroína modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os outros resíduos de aminoácidos são resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em isoleucina (I), valina (V), leucina (L), fenilalanina (F), cisteína (C), metionina (M), alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S), triptofano (W), tirosina (Y), prolina (P) e histidina (H).

5. Fibroína modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que uma hidrofobicidade da REP é de -0,8 ou mais.

6. Fibroína modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente: uma sequência de aminoácidos equivalente a uma sequência de aminoácidos na qual um ou uma pluralidade de resíduos de aminoácidos estão substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, em comparação com a fibroína de ocorrência natural.

7. Fibroína modificada de acordo com a reivindicação 6, caracterizara pelo fato de que a fibroína de ocorrência natural é uma fibroína derivada de insetos ou aranhas.

8. Fibroína modificada de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a fibroína de ocorrência natural é uma proteína araneídea de glândula ampulada maior (MaSp) de aranhas ou uma proteína araneídea de glândula ampulada menor (MiSp) de aranhas.

9. Fibroína modificada, caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 17; ou uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, ou SEQ ID NO: 17.

10. Fibroína modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente: uma sequência de etiqueta em qualquer um ou em ambos de um terminal-N e um terminal-C.

11. Fibroína modificada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de etiqueta inclui uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7.

12. Fibroína modificada, caracterizada pelo fato de que compreende: uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 20; ou uma sequência de aminoácidos tendo 90% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO: 20.

13. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a fibroína modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

12.

14. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que hibridiza com uma fita complementar do ácido nucleico como definido na reivindicação 13 sob condições estringentes, e codifica uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, em que na Fórmula 1 e na Fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos e o número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é de 80% ou mais, REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos, m representa um número inteiro de 10 a 300, uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos, e uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.

15. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que tem 90% ou mais de identidade de sequência com o ácido nucleico, como definido na reivindicação 13, e codifica uma fibroína modificada incluindo uma sequência de domínio representada pela Fórmula 1: [motivo (A)n-REP]m ou Fórmula 2: [motivo (A)n-REP]m-motivo (A)n, em que na Fórmula 1 e na Fórmula 2, o motivo (A)n representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 4 a 27 resíduos de aminoácidos e o número de resíduos de alanina com respeito ao número total de resíduos de aminoácidos no motivo (A)n é de 80% ou mais, REP representa uma sequência de aminoácidos consistindo em 10 a 200 resíduos de aminoácidos, m representa um número inteiro de 10 a 300, uma pluralidade de motivos (A)n pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos, e uma pluralidade de REPs pode ser a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos.

16. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende: a sequência de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 15; e uma ou uma pluralidade de sequências regulatórias funcionalmente ligadas à sequência de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 13 a 15.

17. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser um vetor plasmidial ou um vetor viral.

18. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de estar transformado com o vetor de expressão como definido na reivindicação 16 ou 17.

19. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser um procarioto.

20. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o procarioto é um micro-organismo pertencendo a um gênero selecionado do grupo consistindo em Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium e Pseudomonas.

21. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser um eucarioto.

22. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o eucarioto é uma levedura, um fungo filamentoso, ou uma célula de inseto.

23. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a levedura é uma levedura pertencendo a um gênero selecionado do grupo consistindo em Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichia, Candida, Yarrowia, e Hansenula.

24. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a levedura pertencendo a um gênero Saccharomyces é Saccharomyces cerevisiae, a levedura pertencendo a um gênero Schizosaccharomyces ser Schizosaccharomyces pombe, a levedura pertencendo a um gênero Kluyveromyces é Kluyveromyces lactis, a levedura pertencendo a um gênero Trichosporon é Trichosporon pullulans, a levedura pertencendo a um gênero Schwanniomyces é Schwanniomyces alluvius, a levedura pertencendo a um gênero Pichia é Pichia pastoris, a levedura pertencendo a um gênero Candida é Candida albicans, a levedura pertencendo a um gênero Yarrowia é Yarrowia lipolytica, e a levedura pertencendo a um gênero Hansenula é Hansenula polymorpha.

25. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o fungo filamentoso é um fungo filamentoso pertencendo a um gênero selecionado do grupo consistindo em Aspergillus, Penicillium, e Mucor.

26. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o fungo filamentoso pertencendo a um gênero Aspergillus é Aspergillus oryzae, o fungo filamentoso pertencendo a um gênero Penicillium é Penicillium chrysogenum, e o fungo filamentoso pertencendo a um gênero Mucor é Mucor fragilis.

27. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula de inseto é uma célula de inseto lepidóptero.

28. Hospedeiro de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a célula de inseto é uma célula de inseto derivada de Spodoptera frugiperda ou uma célula de inseto derivada de Trichoplusia ni.

29. Produto compreendendo a fibroína modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, o produto caracterizado pelo fato de que ser selecionado do grupo consistindo em uma fibra, um fio, um filme, uma espuma, um grão, uma nanofibrila, um gel, e uma resina.

30. Fibra de fibroína artificialmente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma fibroína modificada, sendo que a fibra de fibroína artificialmente modificada alonga-se quando umedecida e encolhe quando secada a partir do estado umedecido.

31. Fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que uma taxa de restauração definida pela Expressão (1) é de 95% ou mais, em que taxa de restauração = (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) × 100 (%) --- (1).

32. Fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada pelo fato de que a fibra de fibroína artificialmente modificada é uma fibra tendo uma história de encolhimento de irreversivelmente sendo encolhida pelo contato com a água após a fiação, e uma taxa de encolhimento A definida pela Expressão (2) de 2% ou mais, em que taxa de encolhimento A = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (2).

33. Fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizada pelo fato de que a fibra de fibroína artificialmente modificada é uma fibra tendo uma história de encolhimento de irreversivelmente sendo encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente sendo encolhida pela secagem, e uma taxa de encolhimento B definida pela Expressão (3) de maior que 7%, em que taxa de encolhimento B = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente encolhida pela secagem/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (3).

34. Fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que a fibroína modificada é a fibroína modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

35. Fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada pelo fato de que uma taxa de alongamento definida pela Expressão (4) é de 17% ou menos, em que taxa de alongamento = {(comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada antes de ser umedecida) - 1} × 100 (%) --- (4).

36. Fibra de fibroína artificialmente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizada pelo fato de que uma taxa de encolhimento C definida pela Expressão (5) é de 17% ou menos, em que taxa de encolhimento C = {1 - (comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando secada a partir do estado umedecido/comprimento da fibra de fibroína artificialmente modificada quando umedecida)} × 100 (%) --- (5).

37. Método para a produção de uma fibra de fibroína artificialmente modificada, o método caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de encolhimento de colocar uma fibra crua, antes do contato com a água e após a fiação, em contato com a água para causar encolhimento irreversível, e então secar a fibra crua para causar encolhimento adicional, sendo que a fibra crua inclui uma fibroína modificada.

38. Método de produção de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por uma taxa de encolhimento A da fibra crua definida pela Expressão (2) ser de 2% ou mais, em que taxa de encolhimento A = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (2).

39. Método de produção de acordo com a reivindicação 37 ou

38, caracterizado pelo fato de que uma taxa de encolhimento B da fibra crua definida pela Expressão (3) ser maior que 7%, em que taxa de encolhimento B = {1 − (comprimento da fibra irreversivelmente encolhida pelo contato com a água após a fiação e então adicionalmente encolhida pela secagem/comprimento da fibra antes do contato com a água e após a fiação)} × 100 (%) --- (3).

40. Método de produção de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a fibroína modificada é a fibroína modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

12.